JP4372341B2 - リニアービーコン（ＬｉｎｅａｒＢｅａｃｏｎｓ）に関する方法、キットおよび組成物 - Google Patents

Description

【０００１】
（背景）
１．技術分野
本発明は、プローブに基づく核酸配列検出、分析および定量の分野に関する。さらに具体的には、本発明は、リニアービーコン（Linear Beacons）に関する新規な方法、キットおよび組成物に関する。
【０００２】
２．背景技術
蛍光シグナルの消光は、蛍光共鳴エネルギー移動（Fluorescence Resonance Energy Transfer）「ＦＲＥＴ」（非放射性エネルギー移動としても知られている；ヤロン（Yaron）ら, Analytical Biochemistry 95: 228-235 (1979) p.232, 第1欄, 32-39行を参照）または非ＦＲＥＴ相互作用（無放射エネルギー移動としても知られている；ヤロン（Yaron）ら, Analytical Biochemistry 95: p.229, 第２欄, 7-13行を参照）のいずれかにより起こりうる。ＦＲＥＴと非ＦＲＥＴ消光の間の決定的に重要な識別因子は、非ＦＲＥＴ消光が、「衝突」または「接触」による短距離相互作用を必要とし、このためドナーとアクセプター対の残基の間にスペクトルの重複を必要としないことである（ヤロン（Yaron）ら, Analytical Biochemistry 95: p.229, 第１欄, 22-42行を参照）。逆に、ＦＲＥＴ消光は、ドナーとアクセプター残基間のスペクトルの重複を必要とし、消光の効率は、ＦＲＥＴ対のドナーとアクセプター残基間の距離に比例する（ヤロン（Yaron）ら, Analytical Biochemistry 95: p.232, 第１欄, 46行から第２欄, 29行を参照）。ＦＲＥＴ現象の詳細な総説は、クレッグ，アール・エム（Clegg, R.M.）, Methods Enzymol., 221: 353-388 (1992)およびセルビン、ピー・アール（Selvin, P.R.）, Methods Enzymol., 246: 300-334 (1995)に記載されている。ヤロン（Yaron）らもまた、そこに記載される原理が、オリゴヌクレオチドの加水分解にも適用されることを示唆した（ヤロン（Yaron）ら, Analytical Biochemistry 95: p.234, 第２欄, 14-18行を参照）。
【０００３】
ＦＲＥＴ現象は、検出前に標識核酸ハイブリダイゼーションプローブまたはプライマーをハイブリダイゼーション複合体から分離する必要のない、核酸標的配列の直接検出に利用されてきた（リバック（Livak）ら, US 5,538,848参照）。閉管形式のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅核酸を分析するためのＦＲＥＴを利用する１つの方法は、パーキン・エルマー（Perkin Elmer）から市販されている。タックマン（TaqMan）（登録商標）測定法は、完全なプローブ内の蛍光の消光を引き起こす配置で、蛍光レポーターと消光物質残基により標識されている核酸ハイブリダイゼーションプローブを利用する。ＰＣＲ増幅中、プローブ配列は増幅核酸に特異的にハイブリダイズする。ハイブリダイズすると、Ｔａｑポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性が、プローブを分解し、これによって完全なプローブにより維持された分子内消光が排除される。プローブは増幅核酸に特異的にハイブリダイズするように設計されるため、プローブの酵素分解により引き起こされる試料の蛍光強度の上昇は、増幅プロセスの活性と相関しうる。
【０００４】
それにもかかわらず、本方法は好ましくは、蛍光物質と消光物質残基のそれぞれが、最適なシグナル対ノイズ比が達成されるように、プローブの３’および５’末端に位置することを必要とする（ナザレンコ（Nazarenko）ら, Nucl. Acids Res. 25: 2516-2521 (1997) p.2516, 第２欄, 27-35行を参照）。しかし、蛍光物質と消光物質残基が空間で分離しており、エネルギーの移動はこれらが接近しているときに最も効率的であるため、この配向では必然的に最適な蛍光消光には至らない。従って、非ハイブリダイズプローブからのバックグラウンド蛍光は、タックマン（TaqMan）（登録商標）測定法ではかなり高いものになりうる（ナザレンコ（Nazarenko）ら, Nucl. Acids Res. 25: p.2516, 第２欄, 36-40行を参照）。
【０００５】
核酸分子ビーコン（Molecular Beacon）は、標的核酸配列を検出するためにＦＲＥＴ現象を利用する別の作製体である（ティアギ（Tyagi）ら, Nature Biotechnology, 14: 303-308 (1996)を参照）。核酸分子ビーコンは、２つの相補的アーム配列中に埋め込まれたプローブ用配列を含んでなる（ティアギ（Tyagi）ら, Nature Biotechnology, 14: p.303, 第１欄, 22-30行を参照）。プローブ用配列の各末端に、蛍光物質または消光物質残基のいずれかの１つを結合させる。核酸標的の非存在下では、アーム配列は、相互にアニーリングすることにより、蛍光物質と消光物質を結合させるループとヘアピンステム構造を形成する（ティアギ（Tyagi）ら, Nature Biotechnology, 14: p.304, 第２欄, 14-25行を参照）。標的核酸と接触すると、相補的プローブ用配列と標的配列はハイブリダイズする。ヘアピンステムは、ハイブリダイゼーションにより形成される強固な二重らせんと共存しえないため、生じるコンホメーション変化が、アーム配列を分離させ、蛍光物質と消光物質の分離を引き起こす（ティアギ（Tyagi）ら, Nature Biotechnology, 14: p.303, 第２欄, 1-17行を参照）。蛍光物質と消光物質が分離されると、ドナー蛍光物質のエネルギーは、アクセプター残基に移動せず、そして蛍光シグナルが検出可能になる。非ハイブリダイズ「分子ビーコン」は、非蛍光性であるため、測定系から過剰プローブをすべて除去する必要がない。従って、ティアギ（Tyagi）らは、分子ビーコンが、均一測定系および生存細胞における標的核酸の検出のために使用できることを述べている。（ティアギ（Tyagi）ら, Nature Biotechnology, 14: p.303, 第２欄, 15-77行を参照）。
【０００６】
開示された核酸分子ビーコン作製体のアーム配列は、プローブ用配列に関係しない（ティアギ（Tyagi）ら, Nature Biotechnology, 14: p.303, 第１欄, 30行を参照）。ティアギ（Tyagi）らの分子ビーコンは核酸分子を含むため、適正なステム形成および安定性は、ステムの長さ、アーム配列のＧ：Ｃ含量、溶解される塩の濃度、およびプローブが溶解されるマグネシウムの有無に依存する（ティアギ（Tyagi）ら, Nature Biotechnology, 14: p.305, 第１欄, 1-16行を参照）。さらに、ティアギ（Tyagi）らの核酸分子ビーコンは、エンドヌクレアーゼとエキソヌクレアーゼによる分解に感受性である。
【０００７】
ドナーとアクセプター残基が接近してもはや保持されないため、プローブ分解によりバックグラウンド蛍光シグナルは上昇する。従って、ヌクレアーゼ活性を有することが知られている酵素を利用する測定法は、核酸分子ビーコンが分解されるにつれてバックグラウンド蛍光の連続的上昇を示す（ティアギ（Tyagi）らの図７を参照：（○）と（□）と関連したデータは、プローブ分解により引き起こされたと考えられる蛍光バックグラウンドが、各増幅サイクルと共に上昇することを証明している）。さらに分子ビーコンはまた、少なくとも部分的には、細胞がヌクレアーゼ活性を含有するため、生存細胞中で分解される。
【０００８】
ティアギ（Tyagi）らにより報告された作製体は、WO 95/13399（本明細書では以後「ティアギ２（Tyagi2）ら」と呼ぶ）により広く開示されているが、ティアギ２（Tyagi2）らはまた、核酸分子ビーコンが二分子｛ここで彼らは、二分子とは、２つの分子（例えば、オリゴヌクレオチド）を含む本発明の単一プローブと定義している｝であってもよいことも開示している（ここで、標的相補配列の半分またはおよそ半分、親和性対の１つのメンバーおよび標識対の１つのメンバーが各分子に存在する）（ティアギ２（Tyagi2）ら, p.8, 25行からp.9, 3行を参照）。しかしティアギ２（Tyagi2）らは、ＰＣＲ反応において使用するための単一プローブを設計する際に、ＰＣＲプライマーの１つに相補的でない標的相補配列を当然ながら選択するであろうことを特に述べている（ティアギ２（Tyagi2）ら, p.41, 27行を参照）。本発明の測定法は、核酸合成反応の特異的な１本鎖または二本鎖産物の即時および終点の検出を含むが、もし単一プローブが融解または他の変性に付されるならば、このプローブは単分子である必要がある（ティアギ２（Tyagi2）ら, p.37, 1-9行を参照）。さらにティアギ２（Tyagi2）らは、本発明の単一プローブは、増幅または他の核酸合成反応と共に使用することができるが、二分子プローブ（ティアギ２（Tyagi2）らに定義されるようなもの）は、親和性対が標的に独立に分離されるような任意の反応（例えばＰＣＲ）において使用するのに適していないことを明記している（ティアギ２（Tyagi2）ら, p.13, 9-12行）。また、ティアギ（Tyagi）らもティアギ２（Tyagi2）らも、ＰＮＡに関しては何も開示、示唆または教示していない。
【０００９】
さらに最近の開示において、ティアギ（Tyagi）らの核酸分子ビーコンに類似しているが、ポリメラーゼ伸長用のプライマーとして適している、修飾ヘアピン作製体が開示されている（ナザレンコ（Nazarenko）ら, Nucleic Acids Res. 25: 2516-2521 (1997)を参照）。閉鎖系でのＰＣＲ増幅ＤＮＡの直接検出に適した方法もまた開示されている。この方法により、ナザレンコ（Nazarenko）らのプライマー作製体は、ＰＣＲ法の操作により、増幅産物に組み込まれる。ＰＣＲ増幅産物への組み込みによって、ドナーとアクセプター残基を分離する配置に変化が生じる。従って、この測定法における蛍光シグナルの強度の上昇は、ＰＣＲ増幅産物に組み込まれるプライマーの量に直接相関しうる。著者らは、この方法が、閉管形式中のＰＣＲ増幅核酸の分析に特に適していると結論する。
【００１０】
ナザレンコ（Nazarenko）らのプライマー作製体は核酸であるため、実際ヌクレアーゼ消化を受けやすく、そのためＰＣＲ法のバックグラウンドシグナルの上昇を引き起こす（ナザレンコ（Nazarenko）ら, Nucleic Acids Res. 25: p.2519, 第１欄, 28-39行を参照）。この方法のさらなる欠点は、プライマー作製体のような分子ビーコンは、増幅中に線状化する必要があることである（ナザレンコ（Nazarenko）ら, Nucleic Acids Res. 25: p.2519, 第１欄, 7-8行を参照）。従って、蛍光シグナルを生成しようとすれば、ポリメラーゼは、プライマー作製体のようなヘアピン修飾分子ビーコンのステムを読んで、これを解離させる必要がある。ナザレンコ（Nazarenko）らは、ＰＮＡに関して何も示唆、教示または開示していない。
【００１１】
標的核酸配列検出へのＦＲＥＴのさらに別の適用では、エキソヌクレアーゼ消化に対して抵抗性にした二重に標識した蛍光オリゴヌクレオチドプローブもまた、ＰＣＲ反応およびイン・サイツＰＣＲにおいて標的核酸を検出するために使用されている（メイランド（Mayrand）, US 5,691,146を参照）。メイランド（Mayrand）のオリゴヌクレオチドプローブは、オリゴヌクレオチドの第１末端に結合した蛍光物質（レポーター）分子およびオリゴヌクレオチドの反対側末端に結合した消光物質分子を含む（メイランド（Mayrand）、要約（Abstract）を参照）。メイランド（Mayrand）は、先行技術が、蛍光物質と消光物質の間の距離が重要な特性であり、これを最小化する必要があり、従ってＤＮＡプローブのレポーターと消光物質残基間の好適な間隔は、６〜１６ヌクレオチドであるはずであることを教示していると示唆している（第７欄, 8-24行を参照）。しかしメイランド（Mayrand）は、レポーター分子と消光物質残基が、最適なシグナル対ノイズ比を達成するために、好ましくは１８ヌクレオチド（第３欄, 35-36行を参照）または２０塩基（第７欄, 25-46行を参照）の距離に位置することを教示している。従って、メイランド（Mayrand）とそこに引用されている先行技術は、蛍光物質と消光物質を含む核酸プローブ（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の検出可能な性質は、プローブの長さに強く依存することを教示している。
【００１２】
ヌクレアーゼ消化に対する抵抗もまた、本発明の重要な側面であり（US5,691,146, 第６欄, 42-64行を参照）、このためメイランド（Mayrand）は、オリゴヌクレオチドの５’末端が、オリゴヌクレオチドプローブの５’末端へ１つまたはそれ以上の修飾ヌクレオチド間結合を含めることにより、ヌクレアーゼ消化に抵抗性になると示唆している（US 5,691,146, 第６欄, 45-50行を参照）。さらにメイランド（Mayrand）は、ポリアミド核酸（ＰＮＡ）またはペプチドをヌクレアーゼ抵抗性結合として使用し、それによって本発明のオリゴヌクレオチドプローブの５’末端を修飾し、ヌクレアーゼ消化に抵抗性にすることができることを示唆している（US 5,691,146, 第６欄, 53-64行を参照）。しかしメイランド（Mayrand）は、その存在を明らかに知っていたにもかかわらず、ＰＮＡプローブ作製体が、本発明の実施のための適切な代用品であることは、開示、示唆または教示していない。さらにメイランド（Mayrand）は、蛍光物質または消光物質残基によりどのようにＰＮＡを調製および／または標識するかを当業者に教示していない。
【００１３】
オリゴヌクレオチドの長さ（距離）により影響されるドナーとアクセプター残基間のエネルギー移動の効率は、さらに検討され、特に蛍光核酸配列決定に適用されている（マシーズ（Mathies）ら, US 5,707,804を参照）。マシーズ（Mathies）らは、２つの蛍光物質が、２つの蛍光物質の距の離が変化しうる基本骨格または鎖により結合されることを述べている（US 5,707,804, 第４欄, 1-3行を参照）。すなわち、この距離は、周知のフォアスター（Foerster）機作によるドナーからアクセプターへのエネルギー移動を提供するように選択する必要がある（US 5,707,804, 第４欄, 7-9行を参照）。好ましくは約３〜１０ヌクレオチドが、１本鎖核酸の蛍光物質を分離する（US 5,707,804, 第７欄, 21-25行を参照）。マシーズ（Mathies）らは、ＰＮＡに関して何も示唆、教示または開示していない。
【００１４】
２本鎖ＤＮＡの分析から、１：ＦＥＴ（または本明細書で定義されるＦＲＥＴ）の効率は、オリゴヌクレオチドの核塩基配列に幾らか依存すると考えられること；２：ドナーの蛍光は、色素−ＤＮＡ相互作用がＦＥＴの効率に影響することを示唆するように変化すること；および３：フォースター（Forster）式は、観察されるエネルギー移動を定量的に説明せず、このためオリゴヌクレオチドに結合したドナーとアクセプター残基間の長さは、定性的には使用できるが、定量できないことが観察されている（プロミセル（Promisel）ら, Biochemistry, 29: 9261-9268 (1990)を参照）。プロミセル（Promisel）らは、非フォースター（non-Forster）効果が、観察されたが本来は説明不能な結果の一部を説明しうることを示唆している（プロミセル（Promisel）ら, Biochemistry, 29: p.9267, 第１欄, 43行からp.9268, 第１欄, 13行を参照）。プロミセル（Promisel）らの結果は、ＦＲＥＴ現象は、核酸において利用するとき完全には予測できず、また充分に理解もされてないことを示唆している。プロミセル（Promisel）らは、ＰＮＡに関して何も示唆、教示または開示しておらず、実際その書類はＰＮＡの発明より先である。
【００１５】
これまで考察したバックグラウンドは、ドナーとアクセプター残基の対が直接結合しているＰＮＡオリゴマーに関して何も開示、示唆または教示していない。実際、核酸の検出に適用されるＦＲＥＴ現象は、標的核酸配列に相補的なプローブの一部が、それ自体単に核酸からなる作製体の調製に限定されていると考えられる。
【００１６】
ＦＲＥＴはまたペプチドの分野においても利用されている。（ヤロン（Yaron）ら, Analytical Biochemistry 95, p.232, 第２欄, 30行からp.234, 第１欄, 30行を参照）。確かに酵素基質として適切に標識したペプチドは、ドナーとアクセプター対で標識されたペプチドの主要な利用法であると考えられる（ツィンマーマン（Zimmerman）ら, Analytical Biochemistry, 70: 258-262 (1976)、カーメル（Carmel）ら, Eur. J. Biochem., 73: 617-625 (1977)、ウング（Ng）ら, Analytical Biochemistry, 183: 50-56 (1989)、ワン（Wang）ら, Tett. Lett., 31: 6493-6496 (1990)、およびメルダル（Meldal）ら, Analytical Biochemistry, 195: 141-147 (1991)を参照）。初期の研究は、ドナーとアクセプター対の消光効率が、ペプチドの長さに依存することを示唆した（ヤロン（Yaron）ら, Analytical Biochemistry 95, p.233, 第２欄, 36-40行）。しかし後の研究では、効率的な消光はペプチドの長さに依存しないことを示唆した（ウング（Ng）ら, Analytical Biochemistry, 183: p. 54, 第２欄23行からp. 55, 第１欄12行；ワン（Wang）ら, Tett. Lett., 31（ここで、ペプチドは長さが８アミノ酸である）；およびメルダル（Meldal）ら, Analytical Biochemistry, 195, p.144, 第１欄, 33-37行を参照）。ウング（Ng）らにより、長いペプチドにおいて観察された消光が、未だ決定されていない機作により起こることが示唆された（ウング（Ng）ら, Analytical Biochemistry 183, p.55, 第１欄, 13行から第２欄, 7行を参照）。
【００１７】
その名称にもかかわらず、ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、ペプチドでも核酸でもなく、さらに酸でさえない。ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、配列特異的に核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）にハイブリダイズしうる非天然のポリアミド（偽ペプチド）である（米国特許第5,539,082号およびエグホルム（Egholm）ら, Nature 365: 566-568 (1993)を参照）。ＰＮＡは、現在市販されている形式で標準的ペプチド合成法の適応して合成される。（ＰＮＡモノマーおよびオリゴマーの調製の総説については、デュエホルム（Dueholm）ら, New J. Chem., 21: 19-31 (1997)またはハイラップ（Hyrup）ら, Bioorganic & Med. Chem. 4: 5-23 (1996)を参照）。あるいは、標識および非標識ＰＮＡオリゴマーは購入することができる（パーセプティブ・バイオシステムズの宣伝用文献（PerSeptive Biosystems Promotional Literature）：BioConcepts, Publication No.NL612, Practical PNA, Review and Practical PNA, Vol.1, Iss.2を参照）。
【００１８】
非天然の分子であるため、ＰＮＡは、ペプチドまたは核酸を分解することが知られている酵素の基質であることは知られていない。従って、ＰＮＡは生物学的試料中で安定であり、さらに長い貯蔵寿命を持つ。イオン強度に非常に依存性である核酸ハイブリダイゼーションとは異なり、ＰＮＡと核酸とのハイブリダイゼーションは、イオン強度からはかなり独立性であり、かつ核酸に対する核酸のハイブリダイゼーションにはまるで適さない低イオン強度条件でも好都合である（エグホルム（Egholm）ら, Nature, p.567）。ＰＮＡ複合体の安定性とコンホメーションに及ぼすイオン強度の効果は、多数研究されている（トマック（Tomac）ら, J. Am. Chem. Soc. 118: 5544-5552 (1996)）。配列の識別は、ＤＮＡがＤＮＡを認識するよりもＰＮＡがＤＮＡを認識する方がより効率的である（エグホルム（Egholm）ら, Nature, p.566）。しかし、ハイブリダイゼーション測定法において、ＤＮＡプローブと比較したとき、ＰＮＡプローブによる点変異識別における利点は、多少配列依存性であると考えられる（ニールセン（Nielsen）ら, Anti-Cancer Drug Design 8: 53-65, (1993)）。さらなる利点として、ＰＮＡは、平行と逆平行の向きの両方で核酸にハイブリダイズするが、逆平行の向きが好ましい（エグホルム（Egholm）ら, Nature, p.566を参照）。
【００１９】
配列特異的に核酸にハイブリダイズする能力にもかかわらず、ＰＮＡプローブと標準的な核酸プローブの間には多くの相違点がある。これらの相違点は、便宜上、生物学的、構造的、および物理化学的相違点に分類することができる。以下でさらに詳細に考察するように、これらの生物学的、構造的、および物理化学的相違点によって、典型的には核酸が利用される応用においてＰＮＡプローブの使用を試みると、予測不能な結果を招きうる。異なる組成のこの不等性は、化学においてしばしば観察される。
【００２０】
生物学的相違点に関して、核酸は、遺伝子の伝達と発現の物質として生存種の生命において中心的役割を担う生物学的物質である。これらのインビボの性質は、充分に理解されている。これに反してＰＮＡは、最近になって開発された全く人工の分子であり、化学者の頭で理解されるものであり、そして合成有機化学を用いて作られるものである。既知の生物学的機能を持たない（すなわち、未変性（未修飾）ＰＮＡは、どのポリメラーゼ、リガーゼ、ヌクレアーゼまたはプロテアーゼの基質であるとも知られていない）。
【００２１】
構造的には、ＰＮＡはまた、核酸とは劇的に異なる。両方とも普通の核塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、およびＵ）を利用しうるが、これらの分子の基本骨格は構造的に別種である。ＲＮＡとＤＮＡの基本骨格は、反復ホスホジエステルリボースおよび２−デオキシリボース単位から構成される。これに対して、最も普通のＰＮＡの基本骨格は、Ｎ−［２−（アミノエチル）］グリシンサブユニットに基づいて構成される。さらにＰＮＡにおいて核塩基は、追加のメチレンカルボニル残基により基本骨格に結合される。
【００２２】
ＰＮＡは酸ではなく、このためＤＮＡやＲＮＡに存在するような荷電酸性基を含まない。ＰＮＡは形式電荷を欠いているため、一般にこれらの同等な核酸分子よりも疎水性が高い。ＰＮＡの疎水性によって、核酸では観察されない非特異的（疎水性／疎水性相互作用）相互作用の可能性が生じる。さらに、ＰＮＡはアキラルであることによって、同等なものがＲＮＡ／ＤＮＡ領域には存在しない、構造的コンホメーションをとる能力が与えられる。
【００２３】
ＰＮＡのユニークな構造的特色によって、溶液中で高度に組織化されたポリマー、特に高プリンポリマーが生じる（デュエホルム（Dueholm）ら, New J. Chem., 21: 19-31 (1997) p.27, 第２欄, 6-30行を参照）。逆に、１本鎖核酸は、二次構造をほとんど示さないランダムコイルである。ＰＮＡは高度に組織化されているため、代替の二次構造（例えば、ヘアピンステムおよび／またはループ）をとることには抵抗が高いはずである。
【００２４】
ＰＮＡとＤＮＡまたはＲＮＡとの間の物理／化学的相違点もまた大きい。ＰＮＡは、その相補的核酸に、核酸プローブが同じ標的配列に結合するよりも、より迅速に結合する。この作用は、少なくとも部分的には、ＰＮＡがその基本骨格に電荷を欠いているという事実によるものと考えられる。さらに、最近の刊行物は、ＰＮＡへの正に荷電した基の組み込みが、ハイブリダイゼーションの速度論を改善することを証明している（アイヤー（Iyer）ら, J. Biol. Chem. 270: 14712-14717 (1995)を参照）。ＰＮＡは基本骨格に電荷を欠いているため、ＰＮＡ／核酸複合体の安定性は、類似したＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡ複合体のそれよりも高い。ある状況では、ＰＮＡは、「鎖置換」と呼ばれるプロセスにより非常に安定な三重らせん複合体を形成する。同等な鎖置換プロセスまたは構造は、ＤＮＡ／ＲＮＡ世界では知られていない。
【００２５】
最近、「ペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴマーアレイ上のスクリーニングに基づくハイブリダイゼーション」が、報告されているが、ここでは、個々の配列の数千個のＰＮＡオリゴマーのアレイがポリマー膜上で合成された（ワイラー（Weiler）ら, Nucl. Acids Res. 25: 2792-2799 (1997)を参照）。アレイは、明確な組成の多くのプローブに対する、特異的配列または試料に関する親和性結合（ハイブリダイゼーション）情報を作成するために、一般に単一測定法で使用する。すなわち、ＰＮＡアレイは、診断応用において、または治療上有用性を示すリード化合物のライブラリーをスクリーニングするために、有用であろう。しかしワイラー（Weiler）らは、固定化ＰＮＡオリゴマーへのＤＮＡハイブリダイゼーションの親和性と特異性が、予測される以上にハイブリダイゼーション条件に依存したことに注目している。さらに、低いイオン強度では非特異的結合に向かう傾向が見られた。さらに、より厳密な洗浄条件により排除することができない、ある種の非常に強力な結合ミスマッチが同定された。これらの予想外の結果は、これら新しく発見された分子（すなわちＰＮＡ）の完全な理解の欠如していることを例示している。
【００２６】
要約すると、ＰＮＡは、配列特異的に核酸にハイブリダイズするため、プローブに基づくハイブリダイズ測定法を開発するとき、代用プローブとして、研究のための有用な候補である。しかしＰＮＡプローブは、構造または機能の両方において核酸プローブの同等物ではない。その結果、ＰＮＡのユニークな生物学的、構造的、および物理化学的性質によって、普通は核酸プローブが利用される応用において、ＰＮＡが適しているかどうかを検討するためには、実験を行うことが必要である。
【００２７】
（発明の開示）
１．要約
ＰＮＡ分子ビーコンを調製するために、多くのＰＮＡポリマーを検討した。本出願人らは、ポリマーの反対側末端に位置するドナーとアクセプター残基を含有する検討した全てのＰＮＡオリゴマーが、低い固有バックグラウンドと、標的配列へのプローブの結合によるシグナルの検出可能な上昇を示すことを測定した。非常に驚くべきことに、核酸分子ビーコンのこれらの特性は、ＰＮＡオリゴマーが、核塩基配列の設計と釣り合って、ヘアピンステムおよびループ構造をとるのに適しているかどうかにかかわらず観察された。例えば、ハイブリダイゼーション測定分析において、ヘアピンを作るのに適した任意のアームセグメントを持たないＰＮＡオリゴマー（元々対照オリゴマーとして設計された）は、自己相補的核塩基配列を含むＰＮＡについて観察される比の約半分のシグナル（標的配列に結合したＰＮＡオリゴマー）対ノイズ（標的配列が存在しない）比を示した。
【００２８】
本発明は、リニアービーコンに関する。リニアービーコンは、自己相補的核塩基配列を含るか含まないように設計しても、標的配列の非存在下でプローブに結合したドナーとアクセプター残基の間で、効率的にエネルギーを移動させる。標的配列へのハイブリダイゼーションにより、リニアービーコンのドナーとアクセプター残基間のエネルギー移動の効率は、少なくとも１つの残基からの検出可能なシグナルが、ハイブリダイゼーション事象の発生を追跡または定量するのに使用できるように改変される。我々は、核酸分子ビーコンに典型的に関連するヘアピン構造からこれらを識別するために、これらのプローブをリニアービーコンと呼ぶ。それにもかかわらず、文献では、ＰＮＡは溶液中で高度に組織化しうることが教示されているため、出願人らは、これらのプローブが二次構造を欠いていることを暗示しようというものではない（デュエホルム（Dueholm）ら, New J. Chem., 21: 19-31 (1997) p.27, 第２欄, 6-30行を参照）。
【００２９】
本願発明のリニアービーコンは、新規であり、属性として断定できない幾つかの性質を有する。例えば、出願人は、同じノイズ（本明細書の例１７を参照）とシグナル対ノイズ比（本明細書の例１８を参照）が必然的に、長さで１１−１７サブユニットのオリゴマーとして観察されたことから、リニアービーコンのドナーとアクセプター残基間のエネルギー移動の効率が、本質的に長さに依存していないことを実証する。この事実は、安定に標識された核酸オリゴマーの分子内消光がプローブの長さにかなり依存していることから（本明細書の背景および例１７に表されるデータを参照）、非常に驚くべきことであった。
【００３０】
さらに出願人らは、リニアービーコンの消光の効率が、配列依存性でも、またドナーとアクセプター残基のスペクトル重複に実質的に依存性でもないことを証明した（本明細書の例１７、１８および２１を参照）。具体的には、調製したＰＮＡプローブの大部分は、フルオレセインドナー残基とダブシル（dabcyl）消光物質（アクセプター）残基を含む。このドナー／アクセプターの組合せは、ドナーフルオレセイン残基の発光が、アクセプターのダブシル残基の吸収との高度のスペクトル重複を持たないため、理想的ＦＲＥＴ対ではないが、それにもかかわらず本出願人らが観察した消光は全ての作製体において大きい。さらに、それぞれＣｙ３／ダブシルのドナー／アクセプター対を含むリニアービーコンは、Ｃｙ３とダブシルの間で実質的にスペクトル重複が小さいにもかかわらず、フルオレセイン／ダブシル系で見られるのと同様な、ノイズとシグナル対ノイズ比の両方を示すことが観察された（本明細書の例１７、１８および２１を参照）。従って本出願人らにより集められたデータは驚くべきことに、リニアービーコンが機能するためには、最適なＦＲＥＴ対を含む必要がないことを証明している。従ってデータは、スペクトル重複が、ＦＲＥＴには必要条件であるが非ＦＲＥＴエネルギー移動には必要でないため、直接接触が、本来の様式ではあるが、エネルギー移動の唯一の様式ではなさそうであることを示唆している。さらにデータは、プローブの長さにかかわらず、リニアービーコンの蛍光物質と消光物質残基は、これによってプローブの長さまたは核塩基配列これはかなり独立している程度の消光を達成するために同様な立場にあることを示唆している。
【００３１】
出願人らは同様に、イオン強度を変化させる効果、そして特にマグネシウムの存在または非存在がプローブのノイズとシグナル対ノイズ比に及ぼす効果を調査した。再度、ＰＮＡはイオン強度またはマグネシウムの存在もしくは非存在における相違点これは実質的に独立な、ノイズとシグナル対ノイズ比を示すことが見い出されたが、一方同様な長さと標識配置のＤＮＡプローブの性質は、イオン強度の変化に依存性であり、かつ／またはマグネシウムの存在もしくは非存在に非常に依存性であった。
【００３２】
要約すると、本出願人らはまた、リニアービーコンのノイズとシグナル対ノイズ比が、ドナーとアクセプター残基を分離するサブユニットの長さ、周囲環境のイオン強度またはマグネシウムの存在もしくは非存在からは実質的に独立していることを観察した。全体として考えると、これらの結果は、先行技術の教示するところに照らして非常に予想外であった。従って本出願人らのデータは、同様な長さと標識配置の核酸とＰＮＡプローブの間の、構造と機能性の明白な非同等性を証明している。従って本発明の新規な方法、キットおよび組成物は、ユニークかつ驚くべき性質を有するリニアービーコンを含む。
【００３３】
１つの実施態様において、本発明はリニアービーコンに関する。一般に、リニアービーコンは、最低限少なくとも１つの結合ドナー残基と少なくとも１つの結合アクセプター残基を含んでなるポリマーであり、ここで、該ドナーおよびアクセプター残基は、少なくとも一部のプローブ用核塩基配列により分離されており、このプローブ用核塩基配列は、適切なハイブリダイゼーション条件下で、相補的または実質的に相補的な標的配列へのハイブリダイゼーションに適している。設計によりリニアービーコンはヘアピンステムを形成しない。リニアービーコンはさらに、該ドナーとアクセプター残基間のエネルギー移動の効率が、このポリマーが水溶液に溶媒和するときに、ドナーとアクセプター残基を分離するサブユニットの長さ、ドナー残基とアクセプター残基のスペクトル重複、水溶液中のマグネシウムの存在または非存在および水溶液のイオン強度よりなる群から選択される少なくとも２つの可変要素から実質的に独立していることを特徴とする。好ましくはリニアービーコンはさらに、該ドナーとアクセプター残基間のエネルギー移動の効率が、少なくとも３つの可変要素に実質的に独立であり、そして最も好ましくは４つ全ての可変要素から実質的に独立していることを特徴とする。
【００３４】
好適な実施態様において、リニアービーコンは、少なくとも第１および第２の末端を有するプローブ用核塩基配列からなる、ＰＮＡサブユニットを含むポリマーである。プローブ用核塩基配列は、目的の標的配列に相補的または実質的に相補的である。少なくとも１つのドナー残基は、プローブ用核塩基配列の第１または第２の末端の一方に結合し；そして少なくとも１つのアクセプター残基は、プローブ用核塩基配列の第１または第２の末端のもう一方に結合している。１つまたはそれ以上のスペーサーまたはリンカー残基を使用して、ドナーとアクセプター残基をプローブ用核塩基配列のそれぞれの末端に結合させることができる。
【００３５】
別の実施態様において、本発明は、試料中の標的配列の検出、同定または定量のための方法に関する。本方法は、試料をリニアービーコンに接触させ、次にプローブの少なくとも１つのドナーまたはアクセプター残基に関連する検出可能なシグナルの変化を検出、同定または定量することを含んでなるが、これによって検出可能なシグナルの変化は、目的の試料中に存在する標的配列の存在、非存在または量を測定するために使用される。出願人らが、ドナーとアクセプター残基間のエネルギー移動の効率は、適切なハイブリダイゼーション条件下で目的とする標的配列へのリニアービーコンのハイブリダイゼーションにより改変されることを証明したため、プローブの少なくとも１つのドナーまたはアクセプター残基の検出可能なシグナルの測定可能な変化を、目的の試料中に存在する標的配列の存在、非存在または量を測定するために使用することができる。正確な定量は、任意のハイブリダイズしないリニアービーコンにより生成されるシグナルに対する補正によって達成することができる。従って、本発明のリニアービーコンは、閉管測定法、そして特に非対象ＰＣＲ測定法における標的配列の検出、同定または定量に特に適している（本明細書の例１９を参照）。リニアービーコンは酵素により分解されることが知られていないため、リニアービーコンはまた、生存しているか否かにかかわらず、細胞、組織または生体中の標的配列の検出、同定または定量に特に適している（本明細書の例２０を参照）。
【００３６】
さらに別の実施態様において、本発明は、試料中の標的配列の存在、非存在または数を検出する測定法を実施するのに適したキットに関する。本発明のキットは、１つまたはそれ以上のリニアービーコンと、測定法を実施するために、またはそうでなければ測定法の実施を単純にするために選択される、他の試薬または組成物を含む。
【００３７】
また別の実施態様において、本発明はまた、目的の標的配列を検出、同定または定量するのに適した、リニアービーコンに結合した２つまたはそれ以上の支持体を含むアレイに関する。リニアービーコンのアレイは、二次検出系を使用することなく、即時に目的の１つまたはそれ以上の標的配列の存在に関して、多くの試料を迅速に調べる手段を提供するため便利である。
【００３８】
本発明の方法、キットおよび組成物は、食物、飲料、水、医薬品、個人の健康管理製品、乳製品または環境試料中に見いだしうる生物の標的配列の検出に特に有用である。好適な飲料の分析は、ソーダ水、瓶詰めの水、フルーツジュース、ビール、ワインまたは酒類を含む。さらに本方法、キットおよび組成物は、食物、飲料、水、医薬品、個人の健康管理製品、乳製品または環境試料の製造または貯蔵に使用される原材料、器具、製品または製造法の分析に特に有用であろう。
【００３９】
支持体に結合していようと溶液中であろうと、本発明の方法、キットおよび組成物は、臨床的環境において見い出されうる生物に特異的な標的配列の、迅速で、高感度で、信頼性の高い、用途の広い検出のために特に有用である。従って、本発明の方法、キットおよび組成物は、臨床的検体またはヒトもしくは動物を治療するために使用される、器具、備品および製品の分析に特に有用であろう。例えば、本測定法は、遺伝に基づく疾患に特異的な、または遺伝に基づく疾患の素因に特異的な標的配列を検出するために使用することができる。疾患の非限定例としては、βサラセミア、鎌状赤血球貧血、第Ｖ因子ライデン（Leiden）、嚢胞性線維症および癌関連標的（ｐ５３、ｐ１０、ＢＲＣ−１およびＢＲＣ−２など）を含む。
【００４０】
さらに別の実施態様において、標的配列は、染色体ＤＮＡに関するものであり、ここで標的配列の検出、同定または定量は、出生前スクリーニング、実父確定検査、身元確認または犯罪捜査のような法医学的手法に関して使用することができる。
【００４１】
２．好適な実施態様の説明：
Ｉ．定義：
ａ．本明細書において使用されるとき、「核塩基」という用語は、核酸技術を利用するかまたはペプチド核酸技術を利用することにより、核酸に配列特異的に結合しうるポリマーを作成する当業者には一般に知られている、天然のおよび非天然の複素環残基を含む。
【００４２】
ｂ．本明細書において使用されるとき、「核塩基配列」という用語は、核塩基含有サブユニットを含むポリマーの任意のセグメントである。適切なポリマーまたはポリマーセグメントの非限定例として、オリゴヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド、ペプチド核酸およびこれらの類似体またはキメラを含む。
【００４３】
ｃ．本明細書において使用されるとき、「標的配列」という用語は、検出しようと探索されるポリマーにおける核塩基の任意の配列である。「標的配列」は、ポリマー全体を含むか、または目的のポリマーにユニークな核塩基配列のサブ配列であってもよい。限定はしないが、「標的配列」を含むポリマーは、本発明のリニアービーコンが配列特異的に結合しうる、核酸、ペプチド核酸、キメラ、結合ポリマー、結合体または置換基を含む任意の他のポリマー（例えば、核塩基）であってよい。
【００４４】
ｄ．本明細書において使用されるとき、「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」という用語は、米国特許第5,539,082号、5,527,675号、5,623,049号、5,714,331号、5,736,336号、5,773,571号または5,786,571号（これら全ては、参照することより本明細書の一部とする）にペプチド核酸として参照されているかまたは特許請求されている任意の化合物を含む、２つまたはそれ以上のＰＮＡサブユニット（残基）を含む、任意のオリゴマー、結合ポリマーまたはキメラオリゴマーとして定義される。「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」という用語はまた、以下の刊行物に記載される核酸擬似物にも適用される：ディダリッシェン（Diderichsen）ら, Tett. Lett. 37: 475-478 (1996)；フジイ（Fujii）ら, Bioorg. Med. Chem. Lett. 7: 637-627 (1997)；ジョーダン（Jordan）ら, Bioorg. Med. Chem. Lett. 7: 687-690 (1997)；クロッツ（Krotz）ら, Tett. Lett. 36: 6941-6944 (1995)；ラグリフォウル（Lagriffoul）ら, Bioorg. Med. Chem. Lett. 4: 1081-1082 (1994)；ロウ（Lowe）ら, J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, (1997) 1: 539-546；ロウ（Lowe）ら, J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 1: 547-554 (1997)；ロウ（Lowe）ら, J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 1: 555-560 (1997)；およびピーターセン（Petersen）ら, Bioorg. Med. Chem. Lett. 6: 793-796 (1996)。
【００４５】
好適な実施態様において、ＰＮＡは、式：
【化２】

［式中、各Ｊは、同一であるかまたは異なって、Ｈ、Ｒ¹、ＯＲ¹、ＳＲ¹、ＮＨＲ¹、ＮＲ¹ ₂、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩよりなる群から選択される。各Ｋは、同一であるかまたは異なって、Ｏ、Ｓ、ＮＨおよびＮＲ¹よりなる群から選択される。各Ｒ¹は、同一であるかまたは異なって、場合によりヘテロ原子または置換もしくは非置換アリール基を含有してもよい、１〜５個の炭素原子を有するアルキル基である。各Ａは、単結合、式：−（ＣＪ₂）_s−の基および式：−（ＣＪ₂）_sＣ（Ｏ）−の基よりなる群から選択される（ここで、Ｊは、上記と同義であり、そして各ｓは、１〜５の整数である）。整数ｔは、１または２であり、そして整数ｕは、１または２である。各Ｌは、同一であるかまたは異なって、Ｊ、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウリジン、５−メチルシトシン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２，６−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、シュードイソシトシン、２−チオウラシル、２−チオチミジン、他の天然の核塩基類似体、他の非天然の核塩基、置換および非置換芳香族残基、ビオチンおよびフルオレセインよりなる群から独立に選択される。］の２つまたはそれ以上のＰＮＡサブユニットを含むポリマーである。最も好適な実施態様において、ＰＮＡサブユニットは、メチレンカルボニル結合により、Ｎ−［２−（アミノエチル）］グリシン基本骨格のアザ窒素に結合している天然のまたは非天然の核塩基よりなる。
【００４６】
II．詳細な説明
Ａ．総論：
ＰＮＡ合成：
ＰＮＡの化学的組立のための方法は周知である（米国特許第5,539,082号、5,527,675号、5,623,049号、5,714,331号、5,736,336号、5,773,571号または5,786,571号（これら全ては、参照することより本明細書の一部とする）を参照）。ペプチド核酸（Peptide Nucleic Acids）の支持体結合の自動化された化学的組立のための化学物質および器具類は現在市販されている。ＰＮＡの化学的組立は、固相ペプチド合成に類似しており、ここで、組立の各サイクルでオリゴマーは、反応性アルキルアミノ末端を有し、これが、成長するポリマーに付加すべき次のシントン（synthon）と縮合する。標準的ペプチド化学が利用されるため、天然のおよび非天然のアミノ酸がごく普通にＰＮＡオリゴマー中に取り込まれる。ＰＮＡは、ポリアミドであるため、Ｃ末端（カルボキシル末端）とＮ末端（アミノ末端）を有する。標的配列への逆平行の結合（好適な向き）に適したハイブリダイゼーションプローブの設計のためには、ＰＮＡプローブのプローブ用核塩基配列のＮ末端が、同等なＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドの５’−ヒドロキシル末端の同等物である。
【００４７】
標識：
本発明のリニアービーコンに結合する標識物は、少なくとも１つのエネルギードナーと少なくとも１つのエネルギーアクセプター残基を含む１セット（本明細書において以後「ビーコンセット」）のエネルギー移動残基を含む。典型的には、ビーコンセットは、単一のドナー残基と単一のアクセプター残基を含む。それにもかかわらず、ビーコンセットは、１個を超えるドナー残基および／または１個を超えるアクセプター残基を含有してもよい。ドナーとアクセプター残基は、１つまたはそれ以上のアクセプター残基が、１つまたはそれ以上のドナー残基から移動したエネルギーを受け入れるか、そうでなければドナー残基からのシグナルを消滅させるように作用する。
【００４８】
好ましくはドナー残基は、蛍光物質である。好適な蛍光物質は、フルオレセインの誘導体、ボディピー（bodipy）の誘導体、５−（２’−アミノエチル）−アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、ローダミンの誘導体、Ｃｙ２、Ｃｙ３，Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、テキサスレッドおよびその誘導体である。前に列挙した蛍光物質はまたアクセプターとしても作用するが、好ましくはアクセプター残基は、消光物質残基である。好ましくは、消光物質残基は、非蛍光芳香族またはヘテロ芳香族残基である。好適な消光物質残基は、４−（（４−（ジメチルアミノ）フェニル）アゾ）安息香酸（ダブシル（dabcyl））である。
【００４９】
エネルギーの移動は、ビーコンセットの密接に結合した残基の衝突により、または蛍光共鳴エネルギー移動（fluorescence resonance energy transfer）（ＦＲＥＴ）のような非放射性プロセスにより、起こりうる。ＦＲＥＴが起こるには、ビーコンセットのドナーとアクセプター残基間のエネルギーの移動は、残基が距離的に接近しており、かつドナーの発光スペクトルがアクセプターの吸収スペクトルとかなり重複していることを必要とする（ヤロン（Yaron）ら, Analytical Biochemistry 95: 228-235 (1979)、そして特にp.232, 第１欄からp.234, 第１欄を参照）。あるいは、衝突介在性（発光を欠く）エネルギー移動は、ドナー残基の発光スペクトルが、アクセプター残基の吸収スペクトルと大きく重複していようといまいと、非常に密接に結合したドナーとアクセプター残基の間に起こりうる（ヤロン（Yaron）ら, Analytical Biochemistry 95: 228-235 (1979)そして特にp.229, 第１欄からp.232, 第１欄を参照）。このプロセスは、消光が、ドナーとアクセプター残基の直接接触により引き起こされると考えられるため、分子内衝突と呼ばれる（ヤロン（Yaron）らを参照）。出願人らが証明したように、本発明のリニアービーコンに結合したドナーとアクセプター残基は、ドナー残基の発光とアクセプター残基の吸収の間に実質的な重複を必要としない。この仮説に拘泥するわけではないが、このデータは、リニアービーコンでは消光の主な様式として衝突または接触が作用することを示唆している。
【００５０】
エネルギー移動の検出：
ビーコンセットのドナーとアクセプター残基間のエネルギーの衝突介在性および非発光性移動の両方の効率は、ドナーとアクセプター残基が近接するかどうかに直接依存しているため、リニアービーコンと標的配列とのハイブリッド形成の検出は、ビーコンセットの少なくとも１つのメンバーの少なくとも１つの物理的性質（標的配列の非存在下でリニアービーコンが存在するときに比較して、ハイブリダイゼーション複合体が形成される時に異なって検出される）を測定することにより監視することができる。我々は、この現象をリニアービーコンの自己指示性と呼ぶ。検出可能なシグナルのこの変化は、リニアービーコンのハイブリダイゼーションによる生じるドナーとアクセプターの間のエネルギー移動の効率の変化から生じる。好ましくは検出の手段は、ビーコンセットのドナーまたはアクセプター蛍光物質の蛍光の測定を伴う。最も好ましくは、ドナー蛍光物質の蛍光が、ハイブリダイゼーションを検出、同定または定量するために使用されるように、ビーコンセットは少なくとも１つのドナー蛍光物質と少なくとも１つのアクセプター消光物質を含む。
【００５１】
ＰＮＡ標識：
ＰＮＡの化学標識は、ペプチド標識に類似している。組立の合成化学は、本質的に同一であるため、ペプチドを標識するために一般に使用される任意の方法をＰＮＡを標識するために使用することができる。典型的には、ポリマーのＮ末端は、カルボン酸基または活性化カルボン酸基を有する残基との反応により標識される。１つまたはそれ以上のスペーサー残基は、標識残基とオリゴマーのプローブ用核塩基配列の間に、随時導入してもよい。一般に、スペーサー残基は、標識反応を実施する前に組み込まれる。しかしスペーサーは、標識内に埋め込み、そして標識反応中に組み込んでもよい。
【００５２】
典型的にはプローブ用核塩基配列のＣ末端は、最初に標識化残基を、ＰＮＡがその上で組立られる支持体と縮合することにより標識される。次に、プローブ用核塩基配列の最初のシントンを標識化残基と縮合することができる。あるいは、１つまたはそれ以上のスペーサー残基を、標識化残基とオリゴマーの間に導入することができる（例えば、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸）。一旦リニアービーコンが完全に組立および標識されると、支持体から切断され、脱保護されて、標準的方法を使用して精製される。
【００５３】
標識化残基は、ε−アミノ基がドナーまたはアクセプター残基で修飾されているリジン誘導体であってよい。例えば標識物は、５（６）−カルボキシフルオレセインのような蛍光物質、または４−（（４−（ジメチルアミノ）フェニル）アゾ）安息香酸（ダブシル（dabcyl））のような消光物質残基であってよい。リジン誘導体と合成支持体との縮合は、標準的縮合（ペプチド）化学を使用して達成される。次にリジン誘導体のα−アミノ基を脱保護して、プローブ用核塩基配列組立は、最初のＰＮＡシントンとリジンアミノ酸のα−アミノ基との縮合により開始されるであろう。前記したように、プローブ用核塩基配列の最初のＰＮＡシントンの縮合の前に、適切なスペーサー（例えば、Ｆｍｏｃ−８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸）をリジンアミノ酸と縮合することにより、スペーサー残基を、リジンアミノ酸と最初のＰＮＡシントンとの間に、随時挿入することができる。
【００５４】
あるいは、組立られたまたは部分的に組立られたポリマー上の官能基は、なお支持体に結合したままドナーまたはアクセプター残基で標識される。本方法は、適切な保護基がオリゴマー中に組み込むことにより、ドナーまたはアクセプター残基が結合している反応性官能基を得ることが必要とするが、標識物（例えば、ダブシル（dabcyl）または蛍光物質）を、プローブ用核塩基配列中を含むポリマー中の任意の位置に結合させることができるという利点を有する。例えば、リジンのε−アミノ基は、４−メチル−トリフェニルメチル（Ｍｔｔ）、４−メトキシ−トリフェニルメチル（ＭＭＴ）または４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル（ＤＭＴ）保護基で保護することができる。Ｍｔｔ、ＭＭＴまたはＤＭＴ基は、穏やかな酸性条件下で樹脂で処理して、ＰＮＡ（市販のＦｍｏｃ ＰＮＡモノマーとＰＡＬリンカーを有するポリスチレン支持体を使用して組立られる；パーセプティブ・バイオシステムズ社（PerSeptive Biosystems, Inc.）、フレーミングハム、マサチューセッツ州）から脱離することができる。従って、次にドナーまたはアクセプター残基は、リジンアミノ酸のε−アミノ基と縮合することができる。完全な組立および標識後、次にポリマーは支持体から切断し、脱保護して、周知の方法を使用して精製される。
【００５５】
さらに別の方法により、ドナーまたはアクセプター残基は、完全に組立てられて支持体から切断された後に、ポリマーに結合される。この方法は、標識物が、オリゴマーを製造するために一般に使用される切断、脱保護または精製法と両立しない場合に好ましい。この方法により、ポリマー上の官能基と標識上の官能基との反応により、ＰＮＡは一般に溶液中で標識される。結合溶液の組成は、オリゴマーおよびドナーまたはアクセプター残基の性質に依存することを、認識するであろう。溶液は、有機溶媒、水またはこれらの任意の組合せを含んでよい。一般に、有機溶媒は、極性非求核性溶媒であろう。適切な有機溶媒の非限定例として、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、メチルスルホキシドおよびＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドを含む。
【００５６】
一般に標識すべきポリマー上の官能基はアミンであり、標識物上の官能基はカルボン酸または活性化カルボン酸である。活性化カルボン酸官能基の非限定例として、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルを含む。水溶液中で、ＰＮＡまたは標識物のいずれか（選択される成分の性質に依存する）のカルボン酸基は、水溶性カルボジイミドで活性化することができる。試薬、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）は、水性アミド形成縮合反応用に特定して販売されている市販試薬である。
【００５７】
一般に、水溶液のｐＨは、縮合反応中の緩衝液で調節される。好ましくは、縮合中のｐＨは、４〜１０の範囲にある。アリールアミンをカルボン酸と縮合するとき、好ましくはｐＨは４〜７の範囲にある。アルキルアミンをカルボン酸と縮合するとき、好ましくはｐＨは７〜１０の範囲にある。一般に非水性反応の塩基性は、非求核性有機塩基の添加により調節される。適切な塩基の非限定例として、Ｎ−メチルモルホリン、トリエチルアミンおよびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを含む。あるいは、ｐＨは、（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−［２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）または４−モルホリンエタン−スルホン酸（ＭＥＳ）のような生物学的緩衝液、または重炭酸ナトリウムのような無機緩衝液を使用して調節される。
【００５８】
スペーサー／リンカー残基：
一般に、スペーサーは、かさ高い標識試薬が、リニアービーコンのハイブリダイゼーション性に及ぼす有害作用をできるだけ小さくするために使用される。リンカーは典型的には、リニアービーコンに柔軟性と無作為性を誘導するか、さもなければプローブの２つまたはそれ以上の核塩基配列を結合させる。本発明のプローブのための好適なスペーサー／リンカー残基は、１つまたはそれ以上のアミノアルキルカルボン酸（例えば、アミノカプロン酸）、アミノ酸の側鎖（例えば、リジンまたはオルニチンの側鎖）、天然のアミノ酸（例えば、グリシン）、アミノオキシアルキル酸（例えば、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸）、アルキル二酸（例えば、コハク酸）またはアルキルオキシ二酸（例えば、ジグリコール酸）からなる。スペーサー／リンカー残基はまた、リニアービーコンの溶解度を増強するように設計してもよい。
【００５９】
好ましくは、スペーサー／リンカー残基は、式：−Ｙ−（Ｏ_m−（ＣＷ₂）_n）_o−Ｚ−を有する１つまたはそれ以上の結合化合物を含む。Ｙ基は、式：単結合、−（ＣＷ₂）_p−、−Ｃ（Ｏ）（ＣＷ₂）_p−、−Ｃ（Ｓ）（ＣＷ₂）_p−および−Ｓ（Ｏ₂）（ＣＷ₂）_pを有する。Ｚ基は、式：ＮＨ、ＮＲ²、ＳまたはＯを有する。各Ｗは、独立にＨ、Ｒ²、−ＯＲ²、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである（ここで、各Ｒ²は、−ＣＸ₃、−ＣＸ₂ＣＸ₃、−ＣＸ₂ＣＸ₂ＣＸ₃、−ＣＸ₂ＣＸ（ＣＸ₃）₂、および−Ｃ（ＣＸ₃）₃よりなる群から独立に選択される）。各Ｘは、独立にＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである。各ｍは、独立に０または１である。各ｎ、ｏおよびｐは、独立に０〜１０の整数である。
【００６０】
キメラオリゴマー：
キメラオリゴマーは、異なる分類のサブユニットから選択される２つまたはそれ以上のサブユニットを含む。例えば、ＰＮＡ／ＤＮＡキメラは、少なくとも１つの２’−デオキシリボ核酸サブユニットに結合した少なくとも２つのＰＮＡサブユニットを含む（ＰＮＡ／ＤＮＡキメラ調製に関連する方法と組成物についてはWO 96/40709を参照）。キメラオリゴマーの成分サブユニットは、ＰＮＡサブユニット、ＤＮＡサブユニット、ＲＮＡサブユニットおよびこれらの類似体よりなる群から選択される。
【００６１】
結合ポリマー：
結合ポリマーは、リンカーにより結合されている２つまたはそれ以上の核塩基配列を含む。結合することにより結合ポリマーを形成する核塩基配列は、オリゴデオキシヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド、ペプチド核酸およびキメラオリゴマーよりなる群から選択される。本発明のＰＮＡプローブは、プローブ用核塩基配列が、１つまたはそれ以上の追加のオリゴデオキシヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド、ペプチド核酸またはキメラオリゴマーに結合している、結合ポリマーを含む。
【００６２】
ハイブリダイゼーション条件／厳密性：
核酸ハイブリダイゼーション分野の当業者であれば、ハイブリダイゼーションの厳密性を負荷または制御するのに一般に使用される因子には、ホルムアミド濃度（または他の化学変性試薬）、塩濃度（すなわち、イオン強度）、ハイブリダイゼーション温度、界面活性剤濃度、ｐＨおよびカオトロープ（chaotropes）の存在または非存在があることを認識するであろう。プローブ用核塩基配列／標的配列の組合せに最適な厳密性はしばしば、上述の厳密性因子の幾つかを固定して、次に単一の厳密性因子の変化の効果を測定する周知の方法により、見い出される。ＰＮＡのハイブリダイゼーションがイオン強度からはかなり独立していることを除いて、同じ厳密性因子を調節して標的配列へのリニアービーコンのハイブリダイゼーションの厳密性を制御することができる。測定法のための最適な厳密性は、所望の程度に識別できるまで、各厳密性因子を検討して実験的に求めることができる。
【００６３】
プローブ用核塩基配列：
リニアービーコンのプローブ用核塩基配列は、作製体の配列認識部分である。従って、プローブ用核塩基配列は、少なくとも標的配列の一部にハイブリダイズするように設計される。好ましくはプローブ用核塩基配列は、標的配列全体にハイブリダイズする。プローブ用核塩基配列は非ポリヌクレオチドであり、かつ好ましくはプローブ用核塩基配列はＰＮＡサブユニットのみからなる。よってプローブ用核塩基配列のサブユニットの長さは一般に、適切なハイブリダイゼーション条件下で、リニアービーコンと検出すべき標的配列との間に安定な複合体が形成されるように選択される。本発明の実施に適したＰＮＡオリゴマーのプローブ用核塩基配列は、一般に５〜３０個の間のＰＮＡサブユニットの長さを有する。好ましくはプローブ用核塩基配列は、長さが８〜１８サブユニットであろう。最も好ましくはプローブ用核塩基配列は、長さが１１〜１７サブユニットであろう。
【００６４】
リニアービーコンのプローブ核塩基配列は、一般に標的配列に相補的な核塩基配列を有する。あるいは、プローブ用核塩基配列と標的配列の間に単一の点変異（塩基ミスマッチ）が存在するプローブを利用するとき、より大きな配列識別力が得られることが証明されているため、実質的に相補的なプローブ用配列を使用してもよい（グオ（Guo）ら, Nature Biotechnology 15: 331-335 (1997)、グオ（Guo）ら, WO 97/46711；およびグオ（Guo）ら, US 5,780,233を参照、参照することにより本明細書の一部とする）。
【００６５】
ブロッキングプローブ：
ブロッキングプローブは、プローブのプローブ用核塩基配列が、標的配列に無関係かまたは密接に関係しているハイブリダイゼーション部位に結合することを抑制するのに使用することができるＰＮＡまたは核酸プローブである（コウル（Coull）ら, PCT/US97/21845（別名WO 98/24933）を参照）。一般に、ブロッキングプローブは非標的配列にハイブリダイズすることにより、プローブ用核塩基配列と非標的配列の間のハイブリダイゼーションにより形成される複合体よりも熱力学的に安定な複合体を形成するため、ブロッキングプローブは、プローブ用核塩基配列の、密接に関係する非標的配列への結合を抑制する。すなわち、ブロッキングプローブは、典型的にはある測定法において使用されて非特異的シグナルを抑制する非標識プローブである。これらは、通常密接に関係する非標的配列配列にハイブリダイズするように設計されるため、典型的には２つまたはそれ以上のブロッキングプローブのセットが測定法において使用され、それによって、存在して測定法の性能を妨害しうる非標的配列からの非特異的シグナルを抑制する。
【００６６】
Ｂ．発明の好適な実施態様：
リニアービーコンプローブ：
プローブがその標的配列にハイブリダイズしないときドナーとアクセプター残基間のエネルギー移動を促進するのに適した、リニアービーコンが開示される。しかし、その標的配列へのプローブのハイブリダイゼーションは、ドナーとアクセプター残基間のエネルギー移動の効率を変化させ、そのためビーコンセットの少なくとも１つのメンバーに関連したシグナルの測定可能な変化が生じる。
【００６７】
一般に、リニアービーコンは、最低限少なくとも１つの結合ドナー残基と少なくとも１つの結合アクセプター残基を含むポリマーであり、該ドナーおよびアクセプター残基は、少なくとも一部のプローブ用核塩基配列により分離されており、このプローブ用核塩基配列は、適切なハイブリダイゼーション条件下で、相補的または実質的に相補的な標的配列へのハイブリダイゼーションに適している。リニアービーコンはヘアピンステムを形成しないように設計される。好ましくはドナーとアクセプター残基は、プローブ用核塩基配列の反対の末端で結合されている。リニアービーコンはさらに、該ドナーとアクセプター残基間のエネルギー移動の効率が、このポリマーが水溶液に溶媒和するときに、ドナーとアクセプター残基を分離するサブユニットの長さ、ドナー残基とアクセプター残基のスペクトル重複、水溶液中のマグネシウムの存在または非存在および水溶液のイオン強度よりなる群から選択される少なくとも２つの可変要素から実質的に独立していることを特徴とする。好ましくはリニアービーコンはさらに、該ドナーとアクセプター残基間のエネルギー移動の効率が、少なくとも３つの可変要素に実質的に独立であり、そして最も好ましくは４つ全ての可変要素から実質的に独立していることを特徴とする。
【００６８】
好適な実施態様において、リニアービーコンは、少なくとも第１および第２の末端を有するプローブ用核塩基配列からなるポリマーである。プローブ用核塩基配列は、目的の標的配列に相補的または実質的に相補的である。少なくとも１つのドナー残基は、プローブ用核塩基配列の第１または第２の末端の一方に結合し；そして少なくとも１つのアクセプター残基は、プローブ用核塩基配列の第１または第２の末端のもう一方に結合している。１つまたはそれ以上のスペーサーまたはリンカー残基を使用して、ドナーとアクセプター残基をプローブ用核塩基配列のそれぞれの末端に結合させることができる。最も好適な実施態様において、リニアービーコンは、ＰＮＡオリゴマーである。
【００６９】
リニアービーコンは、（本明細書で前記したように）プローブ用核塩基配列とビーコンセットの結合したドナーとアクセプター残基のみからなるか、または場合により追加の結合残基を含んでもよい。追加の結合残基の非限定例として、他の標識物、リンカー、スペーサー、天然のまたは非天然のアミノ酸、ペプチド、タンパク質、核酸、酵素および／またはＰＮＡ、ＤＮＡまたはＲＮＡの１つまたはそれ以上の他のサブユニットを含む。追加の残基は、測定法において機能性であってもまたは非機能性であってもよい。しかし一般には、追加の残基は、リニアービーコンが使用される測定法の設計内で機能性であるように選択される。本発明のリニアービーコンは、場合により表面に固定化される。
【００７０】
非限定的な一例として、本発明のリニアービーコンは、プローブ用核塩基配列に結合した核酸を含んでよく、ここで、核酸は第２の標的配列にハイブリダイズしうる。第２の非限定例として、リニアービーコンは、プローブ用核塩基配列に結合した酵素を含んでよく、ここで、酵素は、第２の検出スキームにおいて使用しうる。リニアービーコンの第３の非限定例は、プローブ用核塩基配列に結合した抗体を含んでよく、ここで、抗体は第２の検出スキームにおいて使用しうる。さらに第４の非限定例として、リニアービーコンは、プローブ用核塩基配列に結合した１つまたはそれ以上のスペーサー残基を含んでよく、ここで、１つまたはそれ以上のスペーサー残基は、リニアービーコンを支持体につなぐのに使用される。
【００７１】
リニアービーコンのユニークな特色：
先行技術の核酸作製体と本発明のリニアービーコンとの間には多くの相違点がある。例えば、核酸作製体は、ポリヌクレオチド基本骨格を含むが、一方本発明のリニアービーコンは、ポリヌクレオチドではないプローブ用核塩基配列を含む。好適な実施態様において、ＰＮＡからなるリニアービーコンは、ヌクレアーゼ分解に対する抵抗、相補的核酸への塩独立配列のハイブリダイゼーション、および極めて迅速なハイブリダイゼーション速度のような、ＰＮＡの好ましい性質の全てを示す。
【００７２】
さらには、リニアービーコン中のドナーとアクセプター残基間のエネルギーの移動は、マグネシウムの存在または非存在、プローブ環境のイオン強度およびプローブの核塩基配列から実質的に独立している（本明細書の例１７、１８および２１を参照）。さらに驚くべきことに、ビーコンセットのドナーとアクセプター残基間のエネルギー移動の効率は、ドナーとアクセプター残基を分離するサブユニットの長さから実質的に独立しているのに対して、同じ核塩基配列と標識配置を有する核酸内の残基間のエネルギー移動は、プローブの長さに実質的に依存している（本明細書の例１７および１８を参照）。
【００７３】
最も驚くべきことに、リニアービーコンは、ドナーとアクセプター残基が、ドナー残基の発光スペクトルとアクセプター残基の吸収スペクトルの実質的な重複を示すかどうかにかかわらず作用する（本明細書の例１７、１８および２１を参照）。この仮説に拘泥するわけではないが、このデータは、ＦＲＥＴがドナーとアクセプター残基間のエネルギー移動の主な起源として報告されている核酸と比較すると、リニアービーコンではエネルギー移動の主な様式として衝突または接触が作用することを示唆している。
【００７４】
リニアービーコンのさらなる利点は、アームセグメントを形成するために追加のサブユニットを含む作製体と比較したときの合成の容易さである。さらに出願人らにより集められたデータは、リニアービーコンが、アームセグメントを形成するために追加のサブユニットを含む作製体よりも速くハイブリダイズすることを証明している（本明細書の例１５および１６を参照）。
【００７５】
プローブセット：
別の実施態様において本発明は、試料中に存在しうる２つまたはそれ以上の異なる標的配列の存在、非存在または量を検出または同定するのに適したリニアービーコンのセットに関する。標的配列の検出、同定または定量に適したリニアービーコンの特徴は、本明細書で前述した。２つまたはそれ以上の標的配列の特異的検出に特徴的なセット内のリニアービーコンの分類は、本発明の好適な実施態様である。
【００７６】
本発明のプローブセットは、少なくとも１つのリニアービーコンを含むが、リニアービーコンだけを含む必要はない。例えば、本発明のプローブセットは、リニアービーコン、他のＰＮＡプローブおよび／または核酸プローブの混合物を含んでよい（但し、セットは、少なくとも１つの本明細書に記載されるリニアービーコンを含む）。好適な実施態様において、セットの少なくとも１つのプローブは、本明細書に定義されるブロッキングプローブである。
【００７７】
表面へのリニアービーコンの固定化：
１つまたはそれ以上のリニアービーコンは、場合により表面に固定化してもよい。１つの実施態様において、プローブは、ＵＶ架橋の周知のプロセスを使用して表面に固定化することができる。あるいはＰＮＡオリゴマーは、脱保護に適しているが合成支持体からの切断には適さない方法で、表面上で合成される。
【００７８】
好ましくはプローブは、プローブと支持体上の適切な官能基との反応により、表面に共有結合される。アミノ基、カルボン酸およびチオールのような官能基は、適切な保護基（例えば、リジン、グルタミン酸およびシスチン）を用いて一方の末端を伸長して、リニアービーコンに組み込むことができる。末端を伸長するとき、リジンのような分岐アミノ酸の１つの官能基を使用して、ポリマー中の適切な位置にドナーまたはアクセプター標識を組み込むことができる（「ＰＮＡ標識」という標題の項を参照）が、一方場合によりさらに分岐のもう一方の官能基が使用してポリマーを伸長し、これを表面に固定化する。
【００７９】
表面へのプローブの結合のための方法は、一般に固定化すべきプローブの求核基（例えば、アミンまたはチオール）と、修飾すべき支持体上の求電子基との反応を伴う。あるいは求核物質は支持体上に、そして求電子物質（例えば、活性化カルボン酸）はリニアービーコン上に存在してもよい。未変性ＰＮＡは、アミノ末端を有するため、ＰＮＡは表面に固定化するために必ずしも修飾する必要はない（レスター（Lester）ら、「ＰＮＡアレイテクノロジー」という標題のポスターを参照）。
【００８０】
表面へのＰＮＡの固定化に適した条件は、一般にＰＮＡの標識に適した条件と同様であろう（「ＰＮＡ標識」という小見出しを参照）。固定化反応は本質的にＰＮＡの標識と同等であり、そこで標識物は、ＰＮＡプローブが共有結合で固定化される表面と置換される。
【００８１】
アミノ基、カルボン酸基、イソシアナート、イソチオシアナートおよびマレイミド基で誘導体化した多くのタイプの表面が市販されている。適切な表面の非限定例として、膜、ガラス、調節多孔ガラス、ポリスチレン粒子（ビーズ）、シリカおよび金ナノ粒子を含む。
【００８２】
表面に固定化されると、ビーコンセットの残基間のエネルギー移動がリニアービーコンで起こる。適切なハイブリダイゼーション条件下での標的配列へのハイブリダイゼーションにより、（既知配列の）リニアービーコンが結合している表面上の位置が、固定化リニアービーコンのビーコンセットの少なくとも１つのメンバーのシグナルの測定可能な変化に基づく検出可能なシグナルを生成する。従って、表面上のシグナルの強度は、リニアービーコンが固定化されている表面に接触する試料中の標的配列の存在または量を検出、同定または定量するために使用することができる。好適な実施態様において、標的配列へのハイブリダイゼーションを検出するために、表面蛍光の検出が使用される。
【００８３】
検出可能および独立に検出可能な残基／多重分析：
本発明の好適な実施態様において、多重ハイブリダイゼーション測定法（multiplex hybridization assay）が実施される。多重測定法では、目的の多くの条件が同時に試験される。多重分析は、測定中または測定が完了した後に、試料成分またはこれらに伴うデータを分類する能力に基づいている。本発明の好適な実施態様では、あるセットの異なるリニアービーコンを標識するために、明確な独立に検出可能な残基が使用される。標的配列へ明確に（独立に）標識されたリニアービーコンのそれぞれのハイブリダイゼーションに相関するデータは、試料中の検出するために探索される標的配列の存在、非存在または量と相関させることができるため、独立に検出可能な残基を区別する能力および／または残基のそれぞれを定量する能力によって、ハイブリダイゼーション測定法を多重化する手段が得られる。従って本発明の多重測定法は、同一測定法で同一試料内に存在しうる１つまたはそれ以上の標的配列の存在、非存在または量を同時に検出するために使用することができる。好ましくは、独立に検出可能な蛍光物質が、リニアービーコンを使用する多重測定法の独立に検出可能な残基として使用される。例えば、２つのリニアービーコンを使用して２つの異なる標的配列のそれぞれを検出することができるが、ここで、フルオレセイン（緑色）で標識したプローブが、２つの標的配列の第１のものを検出するために使用され、ローダミンまたはＣｙ３（赤色）で標識したプローブが、２つの標的配列の第２のものを検出するために使用される。従って、測定法における緑色、赤色、または緑色と赤色のシグナルは、それぞれ第１、第２、および第１と第２の標的配列の存在を意味する。
【００８４】
リニアービーコンのアレイ：
アレイは、目的の２つまたはそれ以上のプローブが所定の位置に固定化されている表面である。核酸とＰＮＡプローブの両方を含むアレイが文献に記載されている。アレイに固定化されるプローブ配列は、目的の１つまたはそれ以上の標的配列を含有するかもしれない試料に応答を要求するように注意深く選択される。各プローブの位置と配列がわかっているため、アレイは、一般に試料中の１つまたはそれ以上の標的配列の存在または量を同時に検出、同定または定量するために使用される。すなわち、ＰＮＡアレイは、診断応用または治療上の有用性を示しうるリード化合物のスクリーニングにおいて有用であろう。
【００８５】
例えば、診断測定法において標的配列は、アレイ表面上の相補的プローブにより捕捉され、次に二次検出系を使用してプローブ／標的配列複合体が検出される。１つの実施態様において、プローブ／標的配列複合体は、目的の標的分子の別の配列にハイブリダイズする第２のプローブを使用して検出される。別の実施態様において、プローブ／標的配列複合体の存在を検出、同定または定量するために、標識抗体が使用される。
【００８６】
リニアービーコンの組成はアレイの表面上の位置でわかっている（ＰＮＡが、アレイ中のこの位置に合成または結合されたため）ため、アレイに生成される検出可能なシグナルの位置を測定することにより、標的配列の組成を直接検出、同定または定量することができる。リニアービーコンの標的配列へのハイブリダイゼーションは自己指示性であるため、リニアービーコンと標的配列との間のハイブリダイゼーションについてアレイを分析するために、二次検出系は必要ではない。
【００８７】
ＰＮＡを含むアレイは、ＰＮＡが非常に安定でありかつ核酸を分解する酵素により分解されることがないというさらなる利点を有する。従って１つの試料からの核酸を第２の試料の導入の前にアレイから除去できれば、ＰＮＡアレイは再使用可能なはずである。ハイブリダイズした標的配列の除去により、リニアービーコンのアレイ上のシグナルは、再びバックグラウンドまで減少するはずである。ＰＮＡは、加熱またはエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼ活性によって分解されないため、リニアービーコンのアレイは、加熱、ヌクレアーゼ、またはホルムアミド、尿素および／または水酸化ナトリウムを含有する水溶液のような化学変性物質を用いる処理による簡便かつ迅速な再生に適しているはずである。
【００８８】
方法：
さらに別の実施態様において、本発明は試料中の標的配列の検出、同定または定量のための方法に関する。本方法は、試料をリニアービーコンに接触させ、次にビーコンセットの少なくとも１つの残基に関連する検出可能なシグナルの変化を検出、同定または定量すること（ここで、リニアービーコンが自己指示性であるため、検出可能なシグナルとハイブリダイゼーションの間の相関が可能である）を含む。リニアービーコンは自己指示性であるため、本方法は、閉管測定法（別名「均一測定法」）で行われる分析に特に適している。閉管測定法とは、測定法の成分が一旦合わせられると、管を開ける必要がないかまたは結果を求めるために測定法の内容物を除去する必要がないことを意味する。管は結果を求めるために開ける必要がなくかつ好ましくは開けられないため、管を開けることなく、または測定法の内容物を除去することなく、発生しかつ観察または定量することができるある種の検出可能なまたは測定可能な変化が必要とされる。すなわち、多くの閉管測定法は、目で観察することができるか、または試料ホルダーとしてこの管を使用する蛍光装置で検出および／または定量することができる蛍光の変化に依存する。このような装置の例としては、アイダホテクノロジーズ（Idaho Technologies）のライトサイクラー（Light Cycler）およびパーキンエルマー（Perkin Elmer）のプリズム（Prism）７７００がある。
【００８９】
本発明の好適な閉管測定法は、測定法の操作により合成または増幅された核酸標的配列の検出を含む。好適な核酸合成または核酸増幅反応の非限定例としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（Strand Displacement Amplification）（ＳＤＡ）、転写介在性増幅（Transcription-Mediated Amplification）（ＴＭＡ）、回転環増幅（Rolling Circle Amplification）（ＲＣＡ）およびＱ−ベータ（Q-beta）レプリカーゼがある。閉管測定法に存在するリニアービーコンは、閉管測定法で起きる核酸合成または核酸増幅反応からの標的配列産生に応じて検出可能なシグナルを生成する。最も好適な実施態様において、本測定法は、非対象ＰＣＲ反応である（本明細書の例１９を参照）。
【００９０】
本発明のリニアービーコンは、細胞中に見い出される酵素に対して安定であるように設計することができるため、本方法は、生存しているか否かにかかわらず細胞、組織または生体中の標的配列を検出するのに特に適している。すなわち、好適な実施態様において、標的生物を検出、同定または定量するための測定法形式として、イン・サイツハイブリダイゼーションが使用される（本明細書の例２０を参照）。最も好ましくは蛍光イン・サイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨまたはＰＮＡ−ＦＩＳＨ）が、測定法形式である。ＰＮＡ−ＦＩＳＨを実施するための典型的な方法は、システッド（Thisted）ら, Cell Vision, 3: 358-363 (1996)またはＷＩＰＯ特許出願WO 97/18325（参照することにより本明細書の一部とする）に見いだすことができる。
【００９１】
本発明のリニアービーコンで処理した生物は、幾つかの典型的な方法により検出することができる。細胞は、スライドに固定して、次に顕微鏡またはレーザー走査装置で可視化することができる。あるいは、細胞を固定し、次にフローサイトメーターで分析することができる（例えば、ランスドープ（Lansdorp）ら；ＷＩＰＯ特許出願；WO 97/14026を参照）スライドスキャナーとフローサイトメーターは、目的の試料中に存在する標的生物の数を迅速に定量するのに特に有用である。
【００９２】
本発明の方法は、プローブに基づくハイブリダイゼーション測定法において使用されるため、本方法は、生物またはウイルスに関連する標的配列の検出により、試料中の生物またはウイルスの存在または量を検出、同定または定量するために使用される測定法を改良するのに有用であろう。（「生物およびウイルスを検出、同定および定量するための方法」という標題の米国特許第5,641,631号を参照）。同様に、本発明はまた、試料中の生物の１つまたはそれ以上の種の検出、同定または定量において使用される測定法においても有用であろう（「生物およびウイルスを検出、同定および定量するための方法」という標題の米国特許第5,288,611号を参照、これは参照することにより本明細書の一部とする）。本発明はまた、試料中の１つまたはそれ以上の微生物の増殖に及ぼす抗菌薬の効果を測定するために使用される測定法においても有用であろう（「リボソーム核酸サブユニット配列特異的プローブを使用する、増殖に及ぼす抗菌薬の効果を測定するための方法」という標題の米国特許第5,612,183号を参照、これは参照することにより本明細書の一部とする）。本発明はまた、試料中の生物の分類群の存在または量を測定するために使用される測定法においても有用であろう（「特異的ｒ−ＲＮＡサブ配列をプローブとして使用する、生物の分類群の存在または量を検出するための方法」という標題の米国特許第5,601,984号を参照、これは参照することにより本明細書の一部とする）。
【００９３】
本発明の方法を実施するときは、測定において１つまたはそれ以上の非標識または独立に検出可能なプロモーターを使用して、非標的配列へのリニアービーコンの結合を抑制することが好ましい。「ブロッキングプローブ」が存在すると測定法の識別力が上昇し、それにより信頼性と感度（シグナル対ノイズ比）を改善させられる。
【００９４】
本発明のある実施態様において、１つの標的配列は、試料の適切な処理により表面に固定化される。核酸の固定化は、試料を膜に適用し次にＵＶ架橋することにより、容易に達成できる。例えば、アレイが１つまたはそれ以上のリニアービーコンに順に応答を求め、それによって各試料が目的の１つまたはそれ以上の標的配列を含有するかどうかを決定できるように、試料をアレイに配置することができる。
【００９５】
さらに別の実施態様において、リニアービーコンは支持体に固定化され、試料は順に応答を求められ、それによって各試料が目的の標的配列を含有するかどうかを決定する。好適な実施態様においてリニアービーコンは、目的の試料と接触するアレイ上に固定化される。従って試料は、目的の多くの標的配列の存在と量について同時に分析することができるが、ここでリニアービーコンの組成は周囲深く選択され、特定の標的配列の存在、非存在または量が明白に決定できるように、表面上の所定の位置に配置される。リニアービーコンのアレイは第２の検出系を必要としないため、特に有用である。その結果本発明はまた、目的の標的配列を検出、同定または定量するのに適した、２つまたはそれ以上の支持体に結合したリニアービーコンを含むアレイに関する。
【００９６】
キット：
さらに別の実施態様において、本発明は、試料中に存在するかもしれない１つまたはそれ以上の標的配列の存在、非存在または量を検出する測定法を実施するのに適したキットに関する。１つまたはそれ以上の標的配列の検出、同定または量の定量に適したリニアービーコンの特徴は、本明細書に前述されている。さらに、試料中に存在するかもしれない１つまたはそれ以上の標的配列を検出、同定または定量するために、キットのリニアービーコン成分を使用するのに適した方法もまた、本明細書に前述されている。
【００９７】
本発明のキットは、１つまたはそれ以上のリニアービーコンと、測定法を実施するためまたはそうでなければ測定法の実施を簡便にするために選択される他の試薬または組成物を含む。好適なキットは、リニアービーコンのセットを含有し、ここでセットの少なくとも２つのリニアービーコンのそれぞれは、試料中に存在するかもしれない２つまたはそれ以上の異なる標的配列を明瞭に検出し、かつこれらを区別するために使用される。すなわち、セットのリニアービーコンは、好ましくは、２つまたはそれ以上の異なる標的配列のそれぞれが、個別に検出、同定または定量できるように、独立に検出可能な残基で標識される（多重測定法）。
【００９８】
本発明を使用するための典型的な応用：
支持体に結合していようと溶液中であろうと、本発明の方法、キットおよび組成物は、食物、飲料、水、医薬品、個人の健康管理製品、乳製品または環境試料中に見いだしうる生物に特異的な標的配列の迅速で、高感度で、信頼性の高い、用途の広い検出のために特に有用である。好適な飲料の分析は、ソーダ水、瓶詰めの水、フルーツジュース、ビール、ワインまたは酒類を含む。従って、本発明の方法、キットおよび組成物は、食物、飲料、水、医薬品、個人の健康管理製品、乳製品または環境試料の製造または貯蔵に使用される原材料、器具、製品または製造法の分析に特に有用であろう。
【００９９】
支持体に結合していようと溶液中であろうと、本発明の方法、キットおよび組成物は、臨床的環境において見い出されうる生物に特異的な標的配列の、迅速で、高感度で、信頼性の高い、用途の広い検出のために特に有用である。従って、本発明の方法、キットおよび組成物は、臨床的検体またはヒトもしくは動物を治療するために使用される、器具、備品または製品の分析に特に有用であろう。例えば、本測定法は、遺伝に基づく疾患に特異的な、または遺伝に基づく疾患の素因に特異的な標的配列を検出するために使用することができる。疾患の非限定例としては、βサラセミア、鎌状赤血球貧血、第Ｖ因子ライデン（Leiden）、嚢胞性線維症および癌関連標的（ｐ５３、ｐ１０、ＢＲＣ−１およびＢＲＣ−２など）を含む。
【０１００】
さらに別の実施態様において標的配列は、染色体ＤＮＡに関するものであり、ここで標的配列の検出、同定または定量は、出生前スクリーニング、実父確定検査、身元確認または犯罪捜査のような法医学的手法に関して使用することができる。
【０１０１】
（本発明を実施するための方法）
本発明を以下の例により説明するが、これらは決して本発明を限定するものではない。
【０１０２】
例１．Ｎ−α−（Ｆｍｏｃ）−Ｎ−ε−（ＮＨ₂）−Ｌ−リジン−ＯＨの合成
２０mmolのＮ−α−（Ｆｍｏｃ）−Ｎ−ε−（ｔ−ｂｏｃ）−Ｌ−リジン−ＯＨに６０mlの２／１ジクロロメタン（ＤＣＭ）／トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加えた。Ｎ−α−（Ｆｍｏｃ）−Ｎ−ε−（ｔ−ｂｏｃ）−Ｌ−リジン−ＯＨから、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−ｂｏｃ）基が完全に除去されるまで、この溶液を攪拌する。次に溶液を蒸発乾固し、残渣を１５mlのＤＣＭで再溶解する。次に、溶液を３５０mlのエチルエーテルに滴下して、生成物の沈殿を試みる。生成物が溶解したため、エチルエーテルをデカントし、油状物を高真空に入れると白色の泡状物が得られた。白色の泡状物を２５０mlの水に溶解し、飽和リン酸ナトリウム（二塩基性）で溶液をｐＨ４に中和した。白色の固形分が生成し、真空ろ過により集めた。生成物を３５〜４０℃の真空オーブン中で一晩乾燥した。収量１７．６mmol、８８％。
【０１０３】
例２．Ｎ−α−（Ｆｍｏｃ）−Ｎ−ε−（ダバシル）−Ｌ−リジン−ＯＨの合成 １mmolのＮ−α−（Ｆｍｏｃ）−Ｎ−ε−（ＮＨ₂）−Ｌ−リジン−ＯＨ（例１）に、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）５mlと１．１mmolのＴＦＡを加えた。アミノ酸が完全に溶解するまでこの溶液を攪拌した。
【０１０４】
１．１mmolの４−（（４−ジメチルアミノ）フェニル）アゾ）安息香酸、スクシンイミジルエステル（ダバシル−ＮＨＳ；モレキュラープローブズ（Molecular Probes）、Ｐ／Ｎ Ｄ−２２４５）に、４mlのＤＭＦと５mmolのジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を加えた。この攪拌溶液に、上記のように調製したＮ−α−（Ｆｍｏｃ）−Ｎ−ε−（ＮＨ₂）−Ｌ−リジン−ＯＨ溶液を滴下して加えた。反応物を一晩攪拌し、次に処理した。
【０１０５】
溶媒を真空で留去し、残渣を５０mlのＤＣＭと５０mlの１０％クエン酸水溶液に分配した。層を分離し、有機層を重炭酸ナトリウム水溶液で洗浄し、再度１０％クエン酸水溶液で洗浄した。次に有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、溶媒を留去して橙色の泡状物を得た。泡状物をアセトニトリル（ＡＣＮ）から結晶化し、結晶を真空ろ過により集めた。収量０．５２mmol、５２％。
【０１０６】
例３．Ｎ−α−（Ｆｍｏｃ）−Ｎ−ε−（ダバシル）−Ｌ−リジン−ＰＡＬ−Ｐｅｇ／ＰＳ合成支持体の合成
Ｎ−α−（Ｆｍｏｃ）−Ｎ−ε−（ダバシル）−Ｌ−リジン−ＯＨ（例２）を使用して、Ｃ末端ダバシル化ＰＮＡの調製に有用な合成支持体を調製する。フロースルー容器中でＤＣＭ中２０％ピペリジンで３０分処理して、市販のＦｍｏｃ−ＰＡＬ−Ｐｅｇ−ＰＳ合成支持体（パーセプティブバイオシステムズ社（PerSeptive Biosystems, Inc.）；Ｐ／Ｎ ＧＥＮ９１３３８４）０．８２４ｇのフルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基を除去した。次に支持体をＤＣＭで洗浄した。最後に支持体をＤＭＦで洗浄し、アルゴンのフラッシング流で乾燥した。
【０１０７】
試薬を順に混合して、０．３０２ｇのＮ−α−（Ｆｍｏｃ）−Ｎ−ε−（ダバシル）−Ｌ−リジン−ＯＨ、３．２５mlのＤＭＦ、０．１７３ｇの［Ｏ−（７−アザベンゾトリアオール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、０．１０１mlのＤＩＥＡ、および０．０６８mlの２，６−ルチジン（lutidine）を含有する溶液を調製した。次に、洗浄した合成支持体にこの溶液を加え、２時間反応させた。次に容器にアルゴン流で溶液をフラッシュし、支持体を順にＤＭＦ、ＤＣＭおよびＤＭＦで洗浄した。次に樹脂を、アルゴン流で乾燥した。
【０１０８】
支持体を、標準的な市販のＰＮＡキャッピング試薬（パーセプティブバイオシステムズ社（PerSeptive Biosystems, Inc.）；Ｐ／Ｎ ＧＥＮ０６３１０２）５mlで処理した。次にキャッピング試薬を容器からフラッシュし、支持体をＤＭＦとＤＣＭで洗浄した。次に支持体をアルゴン流で乾燥した。最後に合成支持体を高真空で乾燥した。
【０１０９】
約６〜８mgの３つの試料のＦｍｏｃ添加を分析して、支持体の最後の添加量を測定した。分析により、添加量は約０．１４５mmol/gであった。
【０１１０】
必要に応じてこの合成支持体を空のＰＮＡ合成カラムに充填し、これを使用して、Ｃ末端Ｌ−リジンアミノ酸のε−アミノ基を介してＰＮＡオリゴマーに結合したＣ末端ダバシル消光残基を有するＰＮＡオリゴマーを調製した。
【０１１１】
例４．ＰＮＡの合成
パーセプティブバイオシステムズ社（PerSeptive Biosystems, Inc.）から得られる市販の試薬と装置を使用して、ＰＮＡを合成した。粗生成物が許容できる純度であることを確実にするために、しばしば２重カプリングを行った。例３のように調製したダバシル−リジン修飾合成支持体を使用して合成することにより、または例１０に記載のようにＰＮＡを支持体に結合したままＣ末端リジン残基のＮ−ε−アミノ基を標識することにより、Ｃ末端ダバシル残基を有するＰＮＡを調製した。Ｎ末端フルオレセイン残基ならびにＣ末端ダバシル残基の両方を有するすべてのＰＮＡを、適当な標識試薬とリンカー（必要に応じて）で処理した後、合成支持体から切断した。Ｎ末端Ｃｙ３標識（アマシャム（Amersham））を含むＰＮＡを、合成支持体から切断し、ＨＰＬＣ精製した後Ｃｙ３標識した（例１２を参照）。
【０１１２】
例５．Ｆｍｏｃ保護基の好適な除去方法
合成支持体をＤＭＦ中の２５％ピペリジン溶液で室温で５〜１５分処理した。処理後、合成支持体を洗浄し、高真空で乾燥した。次に支持体を適当な標識試薬で処理するか、および／または合成支持体から切断した。
【０１１３】
例６．フルオレセイン−Ｏ−リンカーの合成
１０mlのＤＣＭ中で攪拌している７．５mmolのＮ−（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）−８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸に、５０mmolのＴＦＡを加えた。ｔ−ｂｏｃ基が完全に除去されるまで、溶液を室温で攪拌した。次に真空で溶媒を留去し、生成物を１０mlのＤＣＭで溶解した。
【０１１４】
この攪拌溶液に、７．５mmolのジ−Ｏ−ピバロイル−５（６）−カルボキシフルオレセイン−ＮＨＳエステル、３０mmolのＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）および２０mlのＤＣＭを含有する溶液を加えた。反応を一晩行い、翌朝分液ロートに移した。
【０１１５】
この有機溶液を１０％クエン酸水溶液で２回洗浄し、次に硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、溶媒を留去して褐色の泡状物を得た。生成物をシリカゲルで精製した。ＤＣＭ移動相と段階的メタノール勾配を使用して、固定相から生成物を溶出した。最小量のＤＣＭに溶解しこの溶液にヘキサンを滴下して加えて収量２．８ｇの泡状物。収量２．３２ｇ白色の粉末。生成物の純度は標識には適さず、従ってこの物質の試料についてさらなる逆相クロマトグラフィー分離を行った。
【０１１６】
沈殿生成物１ｇを、４０％アセトニトリルを含有する５０mM酢酸トリエチルアンモニウム水溶液（ｐＨ７）３０mlに溶解した。次にこの溶液を、１０．３mlのアリコートで、あらかじめ平衡化した２ｇのウォーターズセプパックバック（Waters Sep-Pak Vac）１２ｃｃｔＣ１８カートリッジ（Ｐ／Ｎ ＷＡＴ０４３３８０）に加えた。すべての充填溶媒の添加後、４０％アセトニトリルを含有する５０mM酢酸トリエチルアンモニウム水溶液（ｐＨ７）３mlの２つのアリコートを、第１の洗浄液として充填した。６０％アセトニトリルを含有する５０mM酢酸トリエチルアンモニウム水溶液（ｐＨ７）３mlの２つのアリコートを、第２の洗浄液として充填した。最後に３mlのアリコートのアセトニトリルを使用して、カラムに残る物質を溶出した。各アリコートの溶出液を個別に集め、ＨＰＬＣで純度を分析した。アリコートを真空蒸発し、それぞれの質量を測定した。適当な純度の画分をＤＣＭに再溶解し、画分を一緒にし、ヘキサンで沈殿させた。収量０．２３２ｇ。
【０１１７】
例７．フルオレセイン−Ｏ−リンカーによる支持体に結合したＰＮＡのＮ末端標識のための一般的方法
Ｎ末端フルオレセイン標識のために、完全に組み立てたＰＮＡオリゴマーの数種類のアミノ末端フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基をピペリジン処理により除去し、樹脂を洗浄し、真空下で乾燥した。次に、０．０７Ｍフルオレセイン−Ｏ−リンカー、０．０６Ｍ（ＨＡＴＵ）、０．０６７Ｍ ＤＩＥＡおよび０．１Ｍ ２，６−ルチジンを含有する溶液約３００μlで、樹脂を２０〜３０分処理した。処理後樹脂を洗浄し、高真空で乾燥した。次にＰＮＡオリゴマーを切断し、脱保護し、下記のように精製した。
【０１１８】
例８．５（６）カルボキシフルオレセイン−ＮＨＳによる支持体に結合したＰＮＡのＮ末端標識ための一般的方法
この方法は、５（６）−カルボキシフルオレセインでＰＮＡを標識するために、例７に記載の方法の代替法として使用した。この方法は、ＰＮＡオリゴマーのＮ末端をＦｍｏｃ−８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸と反応させた後、標識反応を行って、当量のＰＮＡ作製体を調製することを必要とする。完全に組み立てたＰＮＡオリゴマーのアミノ末端フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基をピペリジン処理で除去し、合成支持体を洗浄し、真空下で乾燥した。次に合成支持体を、０．１Ｍ ５（６）カルボキシフルオレセイン−ＮＨＳ（モレキュラープローブズ（Molecular Probes）、Ｐ／Ｎ Ｃ−１３１１）、０．３Ｍ ＤＩＥＡおよび０．３Ｍ ２，６−ルチジンを含有する溶液約３００μlで、３７℃で４〜５時間処理した。処理後、合成支持体を洗浄し、高真空で乾燥させた。次にＰＮＡオリゴマーを切断し、脱保護し、下記のように精製した。
【０１１９】
さらに好ましくは、次に合成支持体を０．０８Ｍ ５（６）カルボキシフルオレセイン−ＮＨＳ、０．２４Ｍ ＤＩＥＡおよび０．２４Ｍ ２，６−ルチジンを含有する溶液約２５０μlで、３０〜３７℃で２〜５時間処理した。
【０１２０】
例９．支持体に結合したＰＮＡの５（６）カルボキシフルオレセインによる標識ための一般的方法
リンカーと正しく反応させ、末端アミン保護基を除去した後、樹脂を、ＤＭＦ中の０．５Ｍ ５（６）カルボキシフルオレセイン、０．５Ｍ Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、０．５Ｍ １−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）を含有する２５０μlの溶液で処理した（ウェーバー（Weber）ら、Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 8: 597-600 (1998)）を参照）。処理後合成支持体を洗浄し、高真空で乾燥させた。次にＰＮＡオリゴマーを切断し、脱保護し、下記のように精製した。
【０１２１】
フルオレセイン標識についての注意：本明細書に記載のフルオレセイン標識ＰＮＡを、数種類の異なる方法を使用して調製した。異なる方法を発展させて、フルオレセイン標識条件を最適化した。この時点で、ほとんどのフルオレセイン標識操作についてウェーバー（Weber）らの方法を使用することが好ましい。
【０１２２】
例１０．支持体に結合したＬ−リジンのＮ−ε−アミノ基のダバシル標識のための一般的方法
この方法は、ダバシル化ＰＮＡを調製する時に、あらかじめ誘導体化した支持体を使用する代わりに使用した。この方法は、リジン残基（および、従って結合したダバシル残基）を、プローブ結合用核塩基配列内を含むポリマー内の位置に置いてもよいという利点を有する。
【０１２３】
ジクロロメタン中で１％トリフルオロ酢酸、５％トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）を含有する溶液１０mlを用いて、約１５分間カラムに溶液を通過させて、樹脂（まだ合成カラム中にある）を処理した。処理後、合成支持体をＤＭＦで洗浄した。標識試薬で処理する前に、支持体を、ＤＭＦ中に５％ジイソプロピルエチルアミンを含有する溶液約１０mlで処理して中和した。処理後、支持体を、基本的に例８に記載のようにダバシル−ＮＨＳ（方法の５（６）カルボキシフルオレセイン−ＮＨＳの代替物として）で処理した。
【０１２４】
注意：この方法は、Ｆｍｏｃ−ＰＡＬ−ＰＥＧ／ＰＳ（パーセプティブ（PerSeptive）、Ｐ／Ｎ ＧＥＮ９１３３８４）を使用して調製したＰＮＡ上で行った。これは、より酸不安定性のＦｍｏｃ−ＸＡＬ−ＰＥＧ／ＰＳ（パーセプティブ（PerSeptive）、Ｐ／Ｎ ＧＥＮ９１３３９４）では行わなかった。
【０１２５】
例１１：切断、脱保護および精製の一般的方法
合成支持体（Ｆｍｏｃ−ＰＡＬ−ＰＥＧ／ＰＳ；Ｐ／Ｎ、ＧＥＮ９１３３８４）を、合成カートリッジから除去し、ウルトラフリー（Ultrafree）スピンカートリッジ（ミリポア社（Millipore Corp.）、Ｐ／Ｎ ＳＥ３Ｐ２３０Ｊ３）に移し、ＴＦＡ／ｍ−クレゾール溶液（７／３または８／２（好ましい））で１〜３時間処理した。再度溶液を、支持体ベッドを通して遠心分離し、支持体をＴＦＡ／ｍ−クレゾール溶液で１〜３時間処理した。再度溶液を、支持体ベッドを通して遠心分離した。次に、一緒にした溶出液（ＴＦＡ／ｍ−クレゾール）を、約１mlのエチルエーテルを加えて沈殿させた。沈殿物を遠心分離によりペレット化した。次にペレットをエチルエーテルに再懸濁し、さらに２回ペレット化した。次に、乾燥したペレットを、０．１％ＴＦＡを含有する２０％アセトニトリル（ＡＣＮ）水溶液に再懸濁した（ペレットを溶解するために、必要に応じてさらにＡＣＮを加えた）。生成物を分析し、逆相クロマトグラフィー法を使用して精製した。
【０１２６】
注意：パーセプティブバイオシステムズ社（PerSeptive Biosystems, Inc.）から入手できる新しい製品Ｆｍｏｃ−ＸＡＬ−ＰＥＧ／ＰＳ合成支持体（Ｐ／Ｎ ＧＥＮ９１３３９４）を使用して、数種類のＰＮＡを調製した。この支持体は、より迅速にかつより穏和な酸性条件下でＰＮＡを除去することができるという利点を有する。Ｆｍｏｃ−ＸＡＬ−ＰＥＧ／ＰＳを用いて調製したＰＮＡについて、支持体は前記したように処理したが、一般にＴＦＡ／ｍ−クレゾール９／１の溶液を１０〜１５分間使用した（２×）。
【０１２７】
例１２：ＰＮＡのＣｙ３標識
ＰＮＡを含有する精製アミンを１／１ ＤＭＦ／水中に０．０５ＯＤ／μlの濃度で溶解して、ストックＰＮＡ溶液を調製した。ストックから、約３０nmoleのＰＮＡを試験管に加えた。この試験管に１２５μlの０．１Ｍヘペス（ｐＨ８．５）と充分量の１／１ ＤＭＦ／水を加えて、総量を２５０μlにした。この溶液を完全に混合した。Ｃｙ３色素（アマシャム（Amersham））のあらかじめパッケージした試験管に、上記のように調製した２５０μlの溶液すべてを加えた。試験管をよく混合し、周囲温度で１時間反応させた。
【０１２８】
反応後、スピード−バック（speed-vac）中で溶媒を留去した。次にペレットを、３：１の１％ＴＦＡ水溶液／ＡＣＮを含有する溶液４００μlに溶解した。次に随時溶液を５０００MWのウルトラフリー（Ultrafree）（ミリポア社（Millipore Corp.）、Ｐ／Ｎ ＵＦＣ３ＬＣＣ２５）または３０００MW（アミコン(Amicon）、Ｐ／Ｎ４２４０４）フィルターに移して、過剰の色素を除去した。次に、回収した生成物を逆相クロマトグラフィー法を使用して再精製した。
【０１２９】
例１３：ＰＮＡオリゴマーの分析と精製
すべてのＰＮＡプローブを分析し、逆相ＨＰＬＣで精製した。プローブ組成は、理論的計算量と比較して確認した。
【０１３０】
ＨＰＬＣ法：
一般的に、２つの異なる高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）勾配を使用して、ＰＮＡオリゴマーを分析し精製した（勾配ＡとＢ）。分取的精製は、勾配ＡとＢに記載の分析条件に基づいて行った。勾配Ｂは、標準的勾配（勾配Ａ）が満足できるものではなかったため、開発した。実験条件は、下記の通りであるが、一部の精製の間に流出緩衝液に２０％ホルムアミドを添加して精製を改良することを試みた。この方法は、有益な結果を与えないようであるため、やめた。しかし興味深いことに、データを注意深く吟味すると、あるプローブの構造と相関すると従来考えられていたＨＰＬＣアーチファクトが、精製中のホルムアミドのそれぞれと相関することも見いだされた（１９９７年１０月２７日出願の仮特許出願第６０／０６３，２８３号を参照）。従いＰＮＡプローブの構造と精製したオリゴマーについて観察されるＨＰＬＣプロフィールの間には、現在は相関はないと考えられている。
【０１３１】
勾配ＡとＢ
緩衝液Ａ＝水中の０．１％ＴＦＡ
緩衝液Ｂ＝アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡ
流速＝０．２ml／分
カラム温度：６０℃
装置：ウォーターズ２６９０アライアンス（Waters 2690 Alliance）：ウォーターズミレニアム（Waters Millennium）ソフトウェアにより制御
固定相：ウォーターズデルタパック（Waters Delta Pak）Ｃ１８、３００オングストローム、５μm、２×１５０mm（Ｐ／Ｎ ＷＡＴ０２３６５０）
２６０nmで検出
【０１３２】
勾配プロフィールＡ
【表１】

【０１３３】
勾配プロフィールＢ
【表２】

【０１３４】
質量分析：
線形ボイジャーディレイドエクストラクションマトリックスアシスティッドレーザーデソープションイオニゼーション−タイムオブフライト（Voyager Delayed Extraction Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time Of Flight）（ＤＥ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量スペクトル装置（パーセプティブバイオシステムズ社（PerSeptive Biosystems, Inc.））を使用して、試料を分析した。シニピン酸（sinipinic acid）を試料マトリックスとして使用して、質量軸の較正ための１点としても使用した。ウシインスリンを、質量軸の第２の較正点の内部較正標準物質として使用した。
【０１３５】
一般的に、アセトニトリルと０．１％トリフルオロ酢酸水溶液の１：１混合液中で１０mg/mlの濃度のシニピン酸（sinipinic acid）の溶液をまず調製して、分析ための試料を調製した。次に、１mgのウシインスリン（シグマ（Sigma））を０．１％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解して、インスリン溶液を調製した。最後に、９部のシニピン酸（sinipinic acid）溶液と１部のウシインスリン溶液を混合して、インスリン／マトリックス溶液を調製した。１μlのインスリン／マトリックス溶液をスポットし、次に１μlの希釈試料（約０．１〜１ ＯＤ／ml）を質量スペクトル装置標的上にスポットして、分析ための試料を調製した。装置標的を乾燥してから、質量スペクトル装置に挿入した。
【０１３６】
【表３】

【０１３７】
１．ＣＯＤＥは、ＰＮＡポリマーのアミンおよびカルボキシル末端の相補的な核塩基の長さ、および８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸フレキシブルリンカー単位の数と位置を測定するための簡便な手段である。プローブ結合用核塩基配列は、表に記載したすべてのプローブについて同じである。ＣＯＤＥの第１の桁は、Ｃ末端アームセグメントに相補的なＮ末端アームセグメントの長さである。ＣＯＤＥ中の第２の桁は、Ｎ末端アームをプローブ結合用核塩基配列に結合するフレキシブルリンカー単位の数である。ＣＯＤＥ中の第３の桁は、Ｃ末端アームをプローブ結合用核塩基配列に結合するフレキシブルリンカー単位の数である。ＣＯＤＥ中の第４の桁は、Ｎ末端アームセグメントに相補的なＣ末端アームセグメントの長さである。従って、ＣＯＤＥを使用して、表１に記載した異なるＰＮＡオリゴマーの一般的構造を視覚的に比較することができる。
【０１３８】
２．この作製体では直接比較可能な３塩基対重複の代わりに、アミンおよびカルボキシル末端の核塩基の間に同時に４塩基対の重複が存在する。
【０１３９】
【表４】

【０１４０】
【表５】

【０１４１】
表１Ａ、１Ｂおよび１Ｃについて、すべてのＰＮＡ配列は、アミンからカルボキシル末端に書かれている。略語は：Ｆｌｕ＝５（６）−カルボキシフルオレセイン、ｄａｂｃｙｌ＝４−（４−（ジメチルアミノ）フェニル）アゾ）安息香酸、Ｏ＝８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸；Ｋ＝アミノ酸Ｌ−リジン、およびＣｙ３は、アマシャム（Amersham）から入手できるシアニン３色素である。
【０１４２】
例１４．試験ためのＤＮＡオリゴヌクレオチドの合成
この試験のために、ｋ−ｒａｓＰＮＡプローブのＰＮＡプローブ結合配列に相補的な標的配列を含む核酸として適したビオチン標識ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、市販の試薬および装置を使用して合成したか、または販売業者から入手した。さらに、数種類のリニアビーコンと比較して同等の核塩基長さと標識構造のＤＮＡオリゴマーを、グレンリサーチ（Glen Research）（Ｐ／Ｎ ２０−５９１１）から入手できるｄａｂｃｙｌ合成支持体および他の市販のＤＮＡ試薬と装置を使用して調製した。すべてのＤＮＡの５（６）カルボキシフルオレセイン標識は、フルオレダイトホスホラミダイト（パーセプティブバイオシステムズ社（PerSeptive Biosystems, Inc.）、Ｐ／Ｎ ＧＥＮ０８０１１０）を使用して得た。すべてのＤＮＡは、従来法により精製した。調製したＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列を、表２Ａと２Ｂに示す。合成ＤＮＡの合成と精製ための方法および組成物は、当業者に公知である。
【０１４３】
【表６】

【０１４４】
核酸標的は、５’から３’末端に示す。
【０１４５】
【表７】

【０１４６】
ＰＮＡ分子ビーコン試験のために調製したＰＮＡオリゴマーの詳細な構造分析
【０１４７】
例１５：蛍光熱プロフィールの解析
一般的実験法：
蛍光測定は、水ジャケットセルホルダー（Ｐ／Ｎ２０６−１５４３９、シマズ（Shimadzu））を取り付けたＲＦ−５０００分光蛍光光度計（シマズ（Shimadzu））を使用して、１．６mlの１０mm光路長のキュベット（スタルナセルズインク（Starna Cells, Inc.））を使用して行った。循環水浴（ネスラブ（Neslab））を使用して、キュベット温度を調節した。キュベット内容物の温度は、プローブの先端をキュベット（カスタム製造）上のキャップを通して液体レベルより下に挿入した熱伝対プローブ（バーナント（Barnant）；モデルＮｏ．６００−００００）を直接使用して監視した。
【０１４８】
ＰＮＡを５０％Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）水溶液に溶解して、ＨＰＬＣ精製したＰＮＡオリゴマーのストック溶液を調製した。精製したＰＮＡストックをＨｙｂ．緩衝液（５０mMトリス−塩酸、ｐＨ８．３と１００mM ＮａＣｌ）で連続的に希釈して、各ＰＮＡストックから、それぞれ１．６mlのＨｙｂ．緩衝液中に１０mmolの濃度で調製した。
【０１４９】
試料を４９３nmで励起し、５２１nmで蛍光を測定した。キュベットを加熱し次にキュベットが冷却する時に、多くの温度でデータ点を採取した。一般的に浴温度は連続的に５℃ずつ増加させ、次に平衡化させてから各データ点を記録した。同様に冷却プロフィールを作成するするために、浴温度を連続的に５℃ずつ低下させ平衡化させてから、各データ点を記録した。
【０１５０】
データの考察：
ヘアピン構造を形成する核酸分子ビーコンは、ヘアピンステムの融解とらせんからランダムコイルへのプローブステムの物理的移行に一致して、加熱すると蛍光強度の増加を示すことが推測される。任意の核酸融解イベントに一致して、このプロセスは可逆的であると予測され、こうしてらせん構造の再形成により引き起こされる試料の冷却により、蛍光が低下する。期待される融解現象は、ティアギ（Tyagi）らが記載した核酸である分子ビーコンについて記録されている（ティアギ（Tyagi）ら、Nature Bioctechnology, 14: 303-308(1996、図３)。
【０１５１】
【表８】

【０１５２】
ＰＮＡオリゴマーの蛍光熱融解分析の結果を、表３に示したデータに要約し、図１Ａ、１Ｂ１、１Ｂ２、１Ｂ３、および１Ｃにグラフで示す。表３に関して、異なる作製体でかつ試験した条件下で観察される３つの異なる一般的熱プロフィールがある。これらを、タイプＡ、ＢおよびＣとして表３に示す。
【０１５３】
蛍光熱プロフィールタイプＡは、加熱（融解）による蛍光強度の上昇と冷却（再アニーリング）による蛍光強度の対応する低下が特徴である。これらの結果は、ループとヘアピンステム構造を形成する核酸分子ビーコンについて公表されたものと同様である。すなわち、タイプＡ蛍光熱プロフィールは、安定なヘアピンステムとループ構造の形成に一致する。従ってこの現象は、ＰＮＡ分子ビーコン中のステムおよびループ構造の融解と再アニーリングに引き起こされると考えられる。しかし他の構造が、観察された現象に関与しているかも知れないため、出願人は、タイプＡ蛍光熱プロフィールは非常に可逆性の蛍光消光を示すとだけ主張する。
【０１５４】
タイプＡ蛍光熱プロフィールの代表を図１Ａに示す。図に示すデータは、ＰＮＡオリゴマー．００１、．００７および．００２についてである。融解（白抜き）と再アニーリング（塗りつぶし）の両方のデータを示す。シグモイド転移は、２本鎖の融解と再アニーリングに一致する。
【０１５５】
蛍光熱プロフィールタイプＢは、加熱（融解）による蛍光強度の上昇が特徴であるが、試料の冷却による対応する蛍光強度の大きな低下はない。すなわち調べた条件下では、最初、蛍光の消光を引き起こす相互作用は、容易に可逆的ではないようである。従ってデータは、タイプＢ蛍光熱プロフィールを示すＰＮＡオリゴマーは、真の分子ビーコンのすべての特徴を示すわけではないことを示唆する。しかしハイブリダイゼーション測定データから明らかなように、タイプＢ蛍光熱プロフィールは、ＰＮＡオリゴマーがＰＮＡビーコンとして機能することを妨害しない。
【０１５６】
タイプＢ蛍光熱プロフィールを、図１Ｂ１、１Ｂ２、および１Ｂ３に示す。各トレースがより明瞭に見えるように、データを３つのセットで示す。図に示すデータは、ＰＮＡオリゴマー．０１０、．００８、．００９（図１Ｂ１）、．０１８、．０１１Ａ、．０１７（図１Ｂ２）、および．００３と．００４（図１Ｂ３）についてのものである。融解（白抜き）と再アニーリング（塗りつぶし）の両方のデータを示す。
【０１５７】
蛍光熱プロフィールタイプＣは、初期の高い蛍光強度が特徴が特徴であり、これは加熱とともに低下し、試料をさらに冷却すると再度低下する。高い初期の蛍光強度は、この作製体が、調べた他のＰＮＡ作製体のほとんどで観察された初期蛍光消光を示さないことを示唆する。冷却による蛍光強度の一定の低下は、周知である。しかしハイブリダイゼーション測定データにより明らかなように、タイプＣ蛍光熱プロフィールは、ＰＮＡオリゴマーがＰＮＡビーコンとして機能することを妨害しない。
【０１５８】
タイプＣ熱プロフィールの代表を、図１Ｃに示す。図１Ｃに示すデータは、ＰＮＡオリゴマー．００５と．００６についてのものである。融解（白抜き）と再アニーリング（塗りつぶし）の両方のデータを示す。
【０１５９】
例１６：ハイブリダイゼーション測定データの解析
一般的実験操作：
すべてのハイブリダイゼーション測定データは、Ｆ４８５ＣＷランプフィルターとＦ５３５蛍光フィルターを取り付けたワラック１４２０ビクター（Wallac 1420 VICTOR）を使用して集めた。ヌンクマキシソープ（NUNC MaxiSorp）（分離型マイクロタイタープレート）を、反応容器として使用した。各マイクロタイタープレートは、あらかじめＨｙｂ．緩衝液で室温で１５分洗浄し、次に反応成分を加えた。総反応容量は、Ｈｙｂ．緩衝液中１００μlであった。
【０１６０】
ＰＮＡを５０％Ｎ，Ｎ’− ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解して、精製ＰＮＡプローブのストック溶液を調製した。このＰＮＡストックから、５０％ＤＭＦ水溶液でＰＮＡストックを連続希釈して各２５pmole/１μlの濃度のＰＮＡの溶液を調製した。
【０１６１】
精製したＤＮＡをＴＥ（１０mMトリス−塩酸、ｐＨ８．０；１．０mM ＥＤＴＡ、シグマケミカル（Sigma Chemical））に溶解して、精製したｗｔ ｋ−ｒａｓ ２ＤＮＡのストック溶液を調製した。このＤＮＡストックから、Ｈｙｂ．緩衝液でＤＮＡを連続希釈して、１００pmol/９９μlの濃度のｗｔ ｋ−ｒａｓ ２ＤＮＡの溶液を調製した。
【０１６２】
分析に使用した各反応試料は、１μlの適当なＰＮＡオリゴマー（２５pmole/μl）に９９μlのｗｔ ｋ−ｒａｓ ２ＤＮＡのストックまたは９９μlのＨｙｂ．緩衝液（対照）を必要に応じて組合せて、１００μlの試料を調製した。
【０１６３】
試料を混合し、ワラックビクター（Wallac VICTOR）装置を使用して、蛍光強度を経時的に追跡した。試料は三重測定を行って再現性のある結果を確保した。反応物を混合後２０〜２５分間データを採取し、次にウェルをシールしプレートをインキュベーター中で３０〜４０分間４２〜５０℃に加熱した。周囲温度に冷却後ウェルのシールを取り、次に約５分間かけてさらに１０個のデータ点を取った。
【０１６４】
データの考察
ヘアピンステムおよびループ構造を形成する核酸分子ビーコンは、プローブ結合配列を相補的な核酸にハイブリダイズさせると、蛍光強度の上昇を示すことが推測される。推測される蛍光強度上昇は、ティアギ（Tyagi）らが記載したＤＮＡ分子ビーコンについて記録されている（ティアギ（Tyagi）ら、Nature Bioctechnology, 14: 303-308(1996)）。
【０１６５】
ＰＮＡオリゴマーのハイブリダイゼーション分析の結果を、表３に要約し、グラフを図２Ａ１、２Ａ２、２Ａ３、２Ｂ、および２Ｃに示す。表３に関して、試験した異なる作製体で観察される３つの異なる一般的ハイブリダイゼーションプロフィールがある。これらを、タイプＡ、ＢおよびＣとして表３に示す。図８に、試験したすべてのプローブについてシグナル対ノイズ比（加熱の前および後）をグラフで示し、図の下に絶対値も示す。
【０１６６】
ハイブリダイゼーションプロフィールタイプＡは、ＰＮＡオリゴマーのみを含有する試料と比較して、相補的な標的ＤＮＡを含有する試料中の蛍光強度の上昇が特徴である。加熱後、標的配列を含有する試料の蛍光強度は上昇するが、対照試料のバックグランド蛍光は大きくは変化しない。ＰＮＡは、固有の蛍光は非常に小さいため、タイプＡハイブリダイゼーションプロフィールを示すプローブは一般に、最も高いシグナル対ノイズ比を有する。タイプＡハイブリダイゼーションプロフィールの代表を図２Ａ１、２Ａ２、および２Ａ３に示す。図に示すデータは、ＰＮＡオリゴマー．００１、．００７および．０１０（図２Ａ１）、．００２、．００８、．００９（図２Ａ２）、および．０１１Ａ、０１７、および．０１８（図２Ａ３）についてである。
【０１６７】
ハイブリダイゼーションプロフィールタイプＢは、ＰＮＡオリゴマーのみを含有する試料と比較して、相補的な標的ＤＮＡを含有する試料中の蛍光強度の急速な上昇が特徴である。蛍光強度は急速にプラトーに達し、これは加熱後大きくは変化（たとえ変化しても）しない。対照試料のバックグランド蛍光は、加熱後でも大きくは変化しない。これは、ハイブリダイゼーションイベントが迅速に進み、抵抗無く、加熱の必要無く結合平衡に達することを示唆する。タイプＢハイブリダイゼーションプロフィールを図２Ｂに示す。図２Ｂに示すデータは、ＰＮＡオリゴマー．０１８、．００３、および．００４についてのものであるが、ＰＮＡオリゴマー．０１８は、タイプＢハイブリダイゼーションプロフィールのすべてを示すわけではない。具体的には、プローブ．０１８のシグナルは、加熱後（タイプＢ）上昇しないようであるが、ハイブリダイゼーション速度は、タイプＡハイブリダイゼーションプロフィールにより似ている。
【０１６８】
対照プローブ．００３と．００４（本明細書においてリニアビーコンと呼ぶ）は、タイプＢハイブリダイゼーションプロフィールを示す。すなわち、タイプＢハイブリダイゼーションプロフィールの急速なハイブリダイゼーション速度は、おそらくヘアピンステムがないことまたは何か別の強い力の結果であり、これは非蛍光性ポリマー型を安定化することができる。しかしこれらのプローブのハイブリダイゼーション測定で観察されるダイナミックレンジ（シグナル対ノイズ比）は典型的には非常に大きく、アームセグメントの相補的な核酸塩基の水素結合以外の力が、ドナーとアクセプター残基間の相互作用を安定化することができることを示唆している。本出願人は、標識物／標識物相互作用が、非常に強く、この驚くべき結果の重要な要因かも知れないことを観察した。
【０１６９】
．００１、．００２、．００７、．００９、および．０１０プローブと比較して、．００３および．００４プローブではバックグランド（ノイズ）が高いが、ハイブリダイゼーション後の蛍光強度は、調べたプローブで観察されたものより高い。バックグランドが高いことの結果として、ＰＮＡオリゴマー．００３と．００４は、非常に好ましいシグナル対ノイズ比を有する。このＳ／Ｎ比は、アームセグメントを有するかどうかに関係なく、調べた他のＰＮＡオリゴマーの任意のものと同様に好ましい。データは、初期の低い蛍光強度と、プローブが標的配列に結合することにより対応する蛍光シグナルの対応する上昇を示すプローブを作成するために、アーム形成セグメントを有する必要がないことを証明している。
【０１７０】
ハイブリダイゼーションプロフィールＣは、ＰＮＡオリゴマーのみを含有する試料と比較して標的ＤＮＡを含有する試料で蛍光強度がわずかに上昇していることが特徴である。蛍光強度は急速にプラトーに達し、これは加熱後大きくは変化（たとえ変化しても）しない。対照試料のバックグランド蛍光は、加熱後でも大きくは変化しない。標的核酸を含有しない対照試料中のバックグランド蛍光は、ハイブリダイゼーションプロフィールタイプＣでは劇的に高いことが主な原因で、ハイブリダイゼーションプロフィールＢとＣは異なる。相補的な核酸を含有する試料について得られたハイブリダイゼーションデータは、ハイブリダイゼーションイベントが迅速に進み、抵抗無く、加熱の必要無く結合平衡に達することを示唆する。しかし、非常に高いバックグランドシグナルは、これらの作製体ではドナーとアクセプター残基を近傍に維持する力が、蛍光シグナルを効果的に消光させるのに充分強くないことを示唆する。標的配列に結合した時の蛍光のわずかな上昇と通常より高い固有の蛍光に従って、タイプＣハイブリダイゼーションプロフィールを示すＰＮＡ分子ビーコンは、非常に低いシグナル対ノイズ比を有する。タイプＣハイブリダイゼーションプロフィールの代表を図２Ｃに示す。図２Ｃに示すデータは、それぞれＰＮＡオリゴマー．００６、および．００５についてのものである。
【０１７１】
例１５〜１６に示すデータの要約
本出願人が実施したすべての実験の最も驚くべき結果は、アーム形成セグメントを持たない対照プローブ．００３と．００４を含む調べたすべてのＰＮＡオリゴマーでは、蛍光強度の上昇と標的配列へのプローブの結合との間に相関があることである。すなわち、非常に低い固有の蛍光を有する作製体を得るためにアーム形成セグメントを有するＰＮＡを設計することは決定的に重要ではなく、これは標的配列にハイブリダイズすると蛍光が強くなる。核酸分子ビーコンに関連する教示の点から、これは非常に驚くべき結果である。従って本発明のリニアビーコンは、検出の前にプローブ／標的配列から過剰のプローブを分離する必要無しで、標的配列を検出、同定または定量するのに使用することができる。
【０１７２】
例１７：リニアビーコンの長さとノイズ（バックグランド蛍光）の相関
この例のために、未変性のプローブのノイズ（ベースラインまたはバックグランド蛍光）に及ぼす長さの変化の影響を測定するために、ＤＮＡとＰＮＡプローブの両方を比較した。比較は、イオン強度（およびｐＨの小さな変化）、ドナー／アクセプター対の性質の変化、およびマグネシウムの有無について行った。
【０１７３】
材料と方法
前記したように、ＰＮＡプローブＰＮＡ００３−１１、ＰＮＡ００３−１３、ＰＮＡ００３−１５、ＰＮＡ００３−１７およびＣｙ３ＰＮＡ００３−．１５（表１Ｂを参照）とＤＮＡプローブＤＮＡ００３−１１、ＤＮＡ００３−１３，ＤＮＡ００３−１５およびＤＮＡ００３−１７（表２Ｂを参照）を調製した。精製したプローブをＴＥ緩衝液（１０mMトリス−塩酸、ｐＨ８．３、１mM ＥＤＴＡ）で２５pmole/μlの濃度に希釈し、次に緩衝液Ａ、ＢまたはＣのうちの１つで２５pmole/１．６mlに希釈した。プローブの試料を三重測定で調製し、各１．６ml試料を、シマズ（Shimadzu）ＲＦ−５０００分光蛍光高度計および１０mmの光路長を使用して分析した。フルオレセイン標識オリゴマーについて、励起波長は４９３nmとし、蛍光５２０nmで記録した。Ｃｙ３標識オリゴマーについて、励起波長は５４５nmとし、データは５６０nmの蛍光で記録した。採取したすべてのデータは、相対的光単位（ＲＬＵ）で記録した。
【０１７４】
各プローブのバックグランドを、緩衝液Ａ、ＢおよびＣのそれぞれについて試験した。三重測定の結果を平均し、得られたデータを図３に、各棒の上に示す平均ＲＬＵの絶対値とともにグラフで示す。図３に関して、データは、試験した各プローブについて緩衝液Ａ、ＢおよびＣに分類される。Ｃｙ３ＰＮＡ００３−１５の場合を除いて、すべてＰＮＡはＮ末端を５（６）カルボキシフルオレセインでＣ末端をダブシル（ｄａｂｃｙｌ）で標識した。Ｃｙ３ＰＮＡ００３−１５プローブは、５（６）カルボキシフルオレセインの代わりにＣｙ３を使用したという点で、ＰＮＡ００３−１５とは異なる。すべてＤＮＡを、５’末端を５（６）カルボキシフルオレセインで３’末端をダブシル（ｄａｂｃｙｌ）で標識した。市販の化学物質を使用して、ＤＮＡおよびＰＮＡプローブの標識タイプと標識スペースは、妥当であることを確認する試みを行った。
【０１７５】
緩衝液組成：
緩衝液Ａ：１０mMリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、５mM ＭｇＣｌ₂。
緩衝液Ｂ：１０mMリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０。
緩衝液Ｃ：５０mMトリス−塩酸、ｐＨ８．３、１００mM ＮａＣｌ。
【０１７６】
結果と考察：
図３に関して、長さが１１、１３、１５および１７サブユニットのフルオレセイン／ダブシル（ｄａｂｃｙｌ）標識ＤＮＡプローブについてのデータを、左に示す。データを簡単にながめると、ＤＮＡオリゴヌクレオチドの長さとノイズ（バックグランド）の量の間に明瞭な相関がある。具体的にかつ緩衝液の本質に無関係に、ＤＮＡオリゴマーの２つのサブユニットがそれぞれ増加する毎にノイズは大幅に上昇した。この観察結果は、メイランド（Mayrand）ら（US 5,691,146、第７欄、８〜２４行を参照）、マシーズ（Mathies）ら（US 5,707,804、第７欄、２１〜２５行を参照）、およびナザレンコ（Nazarenko）ら（Nucl. Acids Res. 25: p.2516, 第２欄、３６〜４０行を参照）の報告と一致する。
【０１７７】
すべてのＤＮＡオリゴマーについて具体的な緩衝液の作用に関して、緩衝液Ａで観察されたノイズは、プローブが緩衝液ＢまたはＣ中にある時に観察されたものより実質的に低い。緩衝液ＡとＢは、同等のイオン強度のため、緩衝液Ａ中のマグネシウムの存在がすべてのプローブのノイズを実質的に低下させたことは明らかである。緩衝液ＢとＣはイオン強度が大きく異なりｐＨがわずかに異なるが、緩衝液Ｂから緩衝液Ｃに変えてもノイズの増加はほんのわずかであった。フルオレセインはより高いｐＨで量子収率が高いため、この変化は、ｐＨの上昇の結果である可能性が高い。従って緩衝液ＢとＣの間で観察されたノイズの上昇がほとんどないことは、イオン強度が上昇したためかも知れない。
【０１７８】
要約すると、マグネシウム含量とオリゴマーの長さが、ＤＮＡプローブのノイズ（バックグランド蛍光）に対して大きな作用を及ぼし、プローブ環境のイオン強度の変化は、ノイズに対してより小さな影響を及ぼすようである。
【０１７９】
図３に関して、長さが１１、１３、１５および１７サブユニットの標識ＰＮＡプローブについてのデータを右に示す。データを簡単にながめると、異なる長さのプローブについて観察されたノイズ（バックグランド）の間の差はほとんどない。さらにＤＮＡと異なり、プローブの長さとノイズ強度の間にも明確な相関は無い。
【０１８０】
具体的な緩衝液作用に関して、最も劇的なのは、緩衝液の性質にもかかわらず、バックグランドが一貫していることである。小さな差はあったが、各３つの緩衝液で測定したノイズ（バックグランド蛍光）の絶対的な差は、ＤＮＡプローブと比較して顕著に小さかった。従ってＰＮＡプローブのノイズは、プローブの長さ、マグネシウムの有無、および緩衝液のイオン強度にはあまり依存しないようであった。再度、緩衝液ＢとＣの間のノイズの小さな上昇は、ｐＨの作用であるようである。
【０１８１】
ドナー蛍光物質（フルオレセインからＣｙ３へ）が異なるのみであるため、ＰＮＡプローブＣｙ３ＰＮＡ００３−１５についてのデータは、ＰＮＡプローブＰＮＡ００３−１５のデータと最もよく一致する。フルオレセインとＣｙ３色素を調べるのに使用された蛍光波長および励起波長は大きく異なるため、ノイズ（バックグランド）の強度は直接相関させることができないが、このリニアビーコンについて調べた３つの緩衝液のそれぞれにノイズの相対的な差はほとんど無い。緩衝液ＢとＣの間に実質的の差が無いことが顕著である。これは、Ｃｙ３の量子収率は、ｐＨの小さな差にあまり影響されないはずなので、フルオレセインプローブについて観察されるノイズの上昇はｐＨの作用である可能性が最も高い。さらにフルオレセインとＣｙ３蛍光物質の両方についての最適な励起および蛍光波長を試験に使用しているため、蛍光物質最適化条件下でのリニアビーコンの比較的低いバックグランドは、両方のプローブについてドナー蛍光物質およびアクセプター消光物質の分光特性に無関係に、蛍光の実質的な消光が起きることを意味する。まとめると、このデータは、ＰＮＡプローブのノイズは、プローブの長さ、イオン強度、マグネシウムの有無、およびビーコンセットの分光特性にはあまり依存しないことを示している。
【０１８２】
要約するとＰＮＡプローブについて、ノイズは、同様の長さと標識位置を有するＤＮＡプローブと比較して、マグネシウムの有無、リガンド長さおよびイオン強度にあまり依存しない。リニアビーコンはまた、ビーコンのセットの分光特性に無関係にエネルギー移動が起きるという特異な性質も有し、従ってエネルギー移動は主に接触によって起きＦＲＥＴを介するのではないことを示している。それにもかかわらず、このデータは、調べたＰＮＡプローブとＤＮＡプローブの間で構造と機能に明瞭な差があることを証明している。
【０１８３】
例１８：ハイブリダイゼーション測定におけるリニアビーコンの長さとシグナル対ノイズとの相関
本例について、長さの変化が未変性のプローブのシグナル対ノイズ比（シグナル対ノイズ比が標的配列の存在下で発生するシグナルに由来する）にどんな作用を及ぼすかを調べるために、ＤＮＡプローブとＰＮＡプローブを比較した。比較は、プローブの長さの変化、イオン強度、ドナー／アクセプター対の性質の変化、およびマグネシウムの有無について行った。このデータは、ハイブリダイゼーション測定法におけるプローブの相対的性能を比較しているため、現実的なレベルで、例１７に示すデータとは異なる。簡単化するために、１１量体と１５量体のＤＮＡとＰＮＡについてのデータのみを示してある。
【０１８４】
材料と方法：
ＰＮＡプローブＰＮＡ００３−１１、ＰＮＡ００３−１５、Ｃｙ３ＰＮＡ００３−１５（表１Ｂを参照）とＤＮＡプローブＤＮＡ００３−１１およびＤＮＡ００３−１５（表２Ｂを参照）を、前記したように調製した。精製したプローブをＴＥ緩衝液（１０mMトリス−塩酸、ｐＨ８．３，１mM ＥＤＴＡ）で２５pmole/μlに希釈し、次に緩衝液Ａ、ＢまたはＣのうちの１つで２５pmole/５０μlに希釈した。緩衝液Ａ、Ｂ、およびＣの組成は、例１７に示した通りである。適当な緩衝液中の各プローブの５０μlの試料を、マイクロタイタープレートの６つのウェルのそれぞれに入れ、各プローブについて、３つのハイブリダイゼーション反応と３つの陰性対照反応（ノイズまたはバックグランド蛍光を測定するために使用した）を行った。各ハイブリダイゼーション反応について、ＴＥ緩衝液で標的ＤＮＡを１００pmole/μlになるように希釈し、次にこのストックを各緩衝液Ａ、ＢまたはＣで２５pmole/μlに希釈して調製した標的ＤＮＡ（ｗｔ ｋ−ｒａｓ、表２Ａ）５０μlを、各反応物に加えた。各対照について、５０μlの緩衝液Ａ、ＢまたはＣを加えた。ウェルの内容物をピペッティングし混合するのに必要な時間のために、すべての試薬は、最初の蛍光を読む前に約１分間混合した。すべてのハイブリダイゼーション反応は、周囲温度で行った。
【０１８５】
ハイブリダイゼーションデータは、ワラック１４２０ビクター（Wallac １４２０ VICTOR）マルチラベルカウンターを使用して採取した。各ウェルの蛍光強度は、０．１秒について測定した。すべての試料について、約３０分の間に４０回測定した。従って、３０分間に採取されたデータから、シグナル対ノイズ比の時間依存性が得られた。対照反応と比較して、３つのハイブリダイゼーション反応の平均から得られたシグナル対ノイズ比を、１）図４Ａと４ＢのＤＮＡとＰＮＡの１１量体、２）図４Ｃと４ＤのＤＮＡとＰＮＡの１５量体、および３）図４Ｅの１５量体プローブＣｙ３ＰＮＡ００３−１５について、示す。
【０１８６】
結果と考察：
図４Ａに関して、緩衝液Ａ、ＢおよびＣのそれぞれのＤＮＡ １１量体について採取したデータの３０分間のシグナル対ノイズ比を示す。シグナル対ノイズ比が１であることはシグナルが無いことを意味するため、最も顕著な結果は、緩衝液Ｂを使用する時のシグナルの欠如である。マグネシウムの添加（緩衝液Ａ）またはイオン強度およびｐＨの上昇（緩衝液Ｃ）を比較すると、シグナル対ノイズが実質的に改良される。さらにシグナル対ノイズの経時的上昇速度はきわめて顕著であり、ハイブリダイゼーション速度を追跡するのに使用することができる。
【０１８７】
すべての緩衝液でＰＮＡ １１量体についてのシグナル対ノイズ比を、図４Ｂに図示する。ＤＮＡ １１量体と比較すると、試験したすべての条件下で１より大きいシグナル対ノイズ比が得られた。さらに試験した３つの緩衝液のそれぞれについて、シグナル対ノイズ比のダイナミックレンジは小さかった（３０分でのＤＮＡ １１量体のＳ／Ｎの範囲は約１〜１４であり、３０分でのＰＮＡ １１量体のＳ／Ｎの範囲は約３〜６であった）。従ってＤＮＡ １１量体と比較すると、ＰＮＡ １１量体のシグナル対ノイズ比は、環境のイオン強度にはほとんど依存しないが、緩衝液ＢとＣの間の変化に帰因する少なくともある程度の上昇がある。さらに、緩衝液ＡとＢのデータは基本的に同じであるため、ＰＮＡ １１量体のシグナル対ノイズ比は、マグネシウムの有無には全く依存しないようである。
【０１８８】
さらにＰＮＡ １１量体についてシグナル対ノイズ比はほとんど経時的上昇を示さない。従ってこのデータは、リニアビーコンＰＮＡ００３．１１のハイブリダイゼーション速度は、調べたすべての緩衝液できわめて迅速であり、ハイブリダイゼーションは最初の数分の反応の間にほとんど平衡に達したことを示唆している。
【０１８９】
図４Ｃと４Ｄに関して、ＤＮＡ １５量体とＰＮＡ １５量体のそれぞれについてのデータをグラフで示す。一般に１５量体について得られたすべてのデータは、１１量体で観察されたものに近似している。具体的には、緩衝液Ｂ中のＤＮＡ １５量体のシグナル対ノイズ比は１であり、従って実験の範囲内でハイブリダイゼーションが検出されないことを意味する。緩衝液ＡとＣでは、ＤＮＡ １５量体は、ハイブリダイゼーションの速度はデータの分析により決定できるように、経時的に上昇するシグナル対ノイズ比を与える。さらに緩衝液ＡとＣでのＤＮＡ １５量体についてシグナル対ノイズ比のダイナミックレンジは６〜１１であり、これと比較するとＰＮＡ １５量体ではシグナル対ノイズ比は約７〜１３である。
【０１９０】
要約すると、緩衝液ＡとＢのデータは基本的に同じであるため、ＰＮＡ １５量体のシグナル対ノイズ比は、マグネシウムの有無には全く依存しないようである。さらにＰＮＡ １５量体についてシグナル対ノイズ比は、ＤＮＡ １５量体と比較して、環境のイオン強度にほとんど依存しないようであるが、緩衝液ＢとＣの間の変化に帰因する少なくともある程度の上昇がある。最後にこのデータは、リニアビーコンＰＮＡ００３−１５のハイブリダイゼーション速度は、調べたすべての緩衝液できわめて迅速であり、ハイブリダイゼーションは最初の数分の反応の間に、ほとんど平衡に達しており、これと比較してＤＮＡ １５量体のハイブリダイゼーション速度は非常に遅いことを示唆している。
【０１９１】
図４Ｅを参照して、Ｃｙ３標識ＰＮＡ １５量体Ｃｙ３ＰＮＡ００３−１５のシグナル対ノイズデータを示す。ドナー蛍光物質（フルオレセイン〜Ｃｙ３）のみが変化したため、このプローブのデータはＰＮＡプローブのデータと最も有効に比較することができる。データを簡単にながめると、再度すべての３つの緩衝液で陽性のシグナル対ノイズ比が得られることを示している。シグナル対ノイズ比のダイナミックレンジは約６〜１１であり、これはＰＮＡ００３−１５のデータとよく一致し、マグネシウムの有無への依存またはイオン強度への依存はほとんど無いことを示している。さらにデータは、ドナー／アクセプター対（ビーコンセット）のフルオレセインまたはＣｙ３ドナー残基の非常に異なるスペクトル特性にもかかわらず、ＰＮＡ００３−１５とＣｙ３ＰＮＡ００３−１５の両方のシグナル対ノイズ比は基本的に同じであるため、ドナー残基の蛍光とアクセプター残基の吸光度の間に大きな重複が無いことが必要であることを示している。
【０１９２】
しかし興味深いことに、ＰＮＡプローブＣｙ３ＰＮＡ００３−１５について、緩衝液ＡとＢは緩衝液Ｃより優れている。この結果は、フルオレセイン標識プローブ（ＤＮＡまたはＰＮＡ）で得られたものとは大きく異なる。従ってこのデータは、標識物または標識対（ビーコンセット）の性質は、異なる緩衝液中の単一のプローブについて観察されたシグナル対ノイズ比のダイナミックレンジに影響を与える最も重要な因子であることを示唆している。このデータは、シグナル対ノイズのダイナミックレンジのほとんどは、標識物の性質に関連し、従って、異なる緩衝液で観察されたダイナミックレンジのほとんどは標識物の性質に帰因し、リニアビーコンの構造または機能には帰因しないため、リニアビーコンの構造と機能は、ＤＮＡプローブと比較してマグネシウムの有無および環境のイオン強度にほとんど依存しないという議論を支持している。比較して、ＤＮＡプローブで観察されたノイズ（例１７を参照）の広いダイナミックレンジおよび長さ依存性およびシグナル対ノイズ比は、環境の組成が、ＤＮＡプローブの構造と機能に大きな影響を与えることを示している。
【０１９３】
例１９：リニアビーコンを使用するＰＣＲアンプリコンの検出
本例について、非対象ＰＣＲは大過剰の１本鎖核酸を与えるため、非対象ＰＣＲを伝統的ＰＣＲと比較して評価した。５’プライマーと３’プライマーの比を注意深く調整することにより、アンプリコンのどの鎖が優先的に増幅されるかを選択することができるため、リニアビーコンがハイブリダイズする標的配列が、非対象ＰＣＲ測定法の過剰に産生された１本鎖核酸内に含有されるように、測定法を設計することができた。
【０１９４】
従ってリニアビーコンを設計して、増幅すべきｄｓＤＮＡの領域の鎖の１つにハイブリダイズさせた。リニアビーコンをＰＣＲカクテルに加えてから熱サイクリングを行った。熱サイクリングの間にリニアビーコンは標的配列にハイブリダイズするかも知れないが、増幅プロセスの顕著な阻害は観察されなかった。従って、ＰＣＲ反応の活性に応答して生成されたリニアビーコンの検出可能な蛍光シグナルを使用して、ＰＣＲ増幅をうまく追跡することができた。示したデータは、伝統的または非対象ＰＣＲが使用されたかどうかに無関係に、閉鎖管（均一）測定法で増幅核酸の検出のために、リニアビーコンを使用する現実性を結論的に証明している。
【０１９５】
材料と方法
パーキン・エルマー（Perkin-Elmer）２４００サーマルサイクラーでミニエッペンドルフ試験管中で、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲプロトコールは、９４℃まで５秒加熱（最初のサイクルのみ）、次に９４℃で５秒変性、５５℃で３０秒アニーリング、そして７４℃で３０秒伸長である。変性−アニーリング−伸長サイクルを４５サイクル繰り返した。サイクル３０、３５、４０および４５の３０秒の伸長工程の最後に、各ＰＣＲ反応物から１０μlの試料を採取した。１０μlの試料すべてを９６ウェルの円錐底のマイクロタイタープレートに入れ、ワラック１４２０ビクター（Wallac １４２０ VICTOR）（登録商標）マルチラベルプレートリーダーを使用して蛍光を追跡した。平均蛍光強度を、１．０秒間の相対的光単位（ＲＬＵ）で記録した（励起フィルター波長４８５nm；蛍光フィルター波長５３５nm）。
【０１９６】
すべてのＰＣＲ反応物は、プラスミド（陽性反応用）またはプラスミド緩衝液（陰性反応用）を加えた単一の「マスターミックス」から得られた。総量５０μl中に、１μlのプラスミドＤＮＡまたは対照としてプラスミド緩衝液（１０mMトリス−塩酸、ｐＨ８．０、１mM ＥＤＴＡ）、５０pmoleの５’プライマー、後述の３’プライマーの可変量、１０pmole/μlリニアビーコン１μl、５０％Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド水溶液中のＰＮＡ００３．ＭＵ（表１Ｂ）、３mM ＭｇＣｌ₂、２５０μM ＡＴＰ、２５０μM ＣＴＰ、２５０μM ＧＴＰ、２５０μM ＴＴＰ、２．８５単位のアンプリタック（AmpliTaq）ＤＮＡポリメラーゼ、５０mM ＫＣｌ、および１０mMトリス−塩酸、ｐＨ８．３を含有するＰＣＲ反応物を調製した。５’プライマーと３’プライマーの比は、１：１（５０pmole ３’プライマー）、１０：１（５pmole ３’プライマー）、または１００：１（０．５pmole ３’プライマー））である。
【０１９７】
ヒトＤＮＡのＰＣＲアンプリコンをｐＣＲ２．１プラスミド（インビトロゲン（InVitrogen））中にクローン化して、プラスミドｐＫＲＡＳＭＵを作成した。ヒトＤＮＡは細胞株Ｃａｌｕ−１から調製し、これはＫ−ｒａｓ遺伝子の塩基１２９で点突然変異を有する。制限断片分析によりクローンをスクリーニングし、配列決定した。プラスミドの大きな調製物を作成し、標準的方法を使用して定量した。増幅した領域はＫ−ｒａｓ突然変異の両側に位置し、１１１基対の長さであった。熱サイクルしなかったＰＣＲ反応物を、蛍光対照として使用した。
【０１９８】
プローブとプライマーと標的：
５’プライマー 5'ATGACTGAATATAAACTTGT3' 配列ＩＤ Ｎｏ．７
３’プライマー 5'CTCTATTGTTGGATCATATT3' 配列ＩＤ Ｎｏ．８
【０１９９】
ｄｓＤＮＡ鋳型（増幅した領域のみ）
＜３’プライマーｈｙｂ．部位＞
５’ GAGATAACAACCTAGTATAAGCAGGTGTTTTACTAAGACTTA...
３’ CTCTATTGTTGGATCATATTCGTCCACAAAATGATTCTGAATT...
＜リニアビーコンＨｙｂ．部位＞
...ATCGACTTAGCAGTTCCGTGAGAACGGATGCGGTGTTCGAGGT
...AGCTGTATCGTCAAGGCACTCTTGCCTACGCCACAAGCTCCAAC
TGATGGTGTTCAAATATAAGTCAGTA 3' 配列ＩＤ Ｎｏ．９
TACCACAAGTTTATATTCAGTCAT 5' 配列ＩＤ Ｎｏ．１０
＜５’プライマーｈｙｂ．部位＞
【０２００】
上記したように、リニアビーコンＰＮＡ００３．ＭＵを、プライマー領域と重複しないように設計した。
【０２０１】
結果と考察：
表４は、サイクル３０、３５、４０、および４５でＰＣＲ反応について記録された蛍光データを示す。考察の便宜上、表の行に番号１〜６を付け、列に追跡Ａ〜Ｇを割り振る。熱サイクリングを受けなかった対照からの平均バックグランドを、表に示したデータから引いた。
【０２０２】
【表９】

【０２０３】
表４に関して、各測定法で使用した５’プライマーと３’プライマーの比をそれぞれ行１に示す。表の行２の記号は、各測定法における１fmoleのｐＫＲＡＳＭＵプラスミド（ＰＣＲ鋳型）の存在（＋）または欠失（−）を示すのに使用された。列Ａの３〜６行は、示したデータを作成するために行ったＰＣＲの総サイクルを示す。
【０２０４】
鋳型を含まない反応物のデータ（列Ｂ、ＤおよびＦ）は、−２８０〜６３６の範囲であり、鋳型を含む反応物のデータ（列Ｃ、Ｅ、およびＧ）は、行３列Ｇを除くすべての場合に有意に高い。さらに鋳型を含む試料の蛍光強度は、プライマーの比とＰＣＲサイクル数の間に相関を示す。例えば、等量の５’プライマーと３’プライマーを使用した標準的ＰＣＲ反応のデータ（列Ｃ）は、データを記録したすべてのサイクルで一貫した蛍光強度を示した。これに対して、５’プライマーと３’プライマーの比が１０：１である非対象ＰＣＲ(列Ｅ）の蛍光は、実質的により強かった。このデータは、５’プライマー対３’プライマーの１０：１の比が、強固な増幅を促進し、これが、標的配列を含有する１本鎖核酸を有意に過剰発現することを示唆する。
【０２０５】
５’プライマー対３’プライマーの比が１００：１である非対象ＰＣＲの蛍光（列Ｇ）は、列Ｇのデータと比較するとそれほど強くなかった。しかし非対象ＰＣＲは、ＰＣＲサイクル数の増加と蛍光強度との間に明瞭な相関を示した。プライマー比１００：１で観察される低い蛍光は、おそらく列Ｅにそのデータを示す試料と比較して、ＰＣＲ増幅反応の最初のサイクルで３’プライマーが１０倍少ないことにより引き起こされる１本鎖核酸を含有する標的配列の総量が少ないことの結果であろう。
【０２０６】
図５は、４５サイクルのＰＣＲ後に試験管３と４に残っている試料（〜１０μl）のデジタル画像である。試験管３（左）は、行６列Ｄに示すデータに対応し、試験管４（右）は、行６列Ｅに示すデータに対応する。写真は、ＵＶトランスイルミネーターを使用して撮った。鋳型を含有する試験管４は、視覚的に見て蛍光を有するが、鋳型を含有しない対照である試験管３は、視覚的に見て蛍光を有さず、従って視覚的判定のみでは陰性の結果であった。
【０２０７】
まとめると、本例に示したデータは、リニアビーコンを使用して、閉鎖管（均一）測定法で増幅されている核酸を検出することができることを証明している。非対象ＰＣＲ反応について、蛍光シグナルの強度は実質的に高いのみではなく、非対象ＰＣＲは、行ったサイクル数とシグナル強度との間で相関を示すことが証明された。すなわち、この方法を使用して、増幅した核酸の定量が可能であった。
【０２０８】
例２０：リニアビーコンを用いるＰＮＡ−ＦＩＳＨ
各３mlの細菌培養物を、トリプチックソイブロス（Tryptic Soy Broth）（ＴＳＢ）中で３０℃で一晩増殖させた。各試料のＯＤ₆₀₀を測定し、各培養物を新鮮なＴＳＢにＯＤ₆₀₀が０．５になるように希釈した。培養物を３〜４回倍加させた後採取した。２０mlの培養物からの細胞を、８０００rpmで５分遠心分離してペレットにし、２０mlのＰＢＳ（７mM Ｎａ₂ＨＰＯ₄；３mM ＮａＨ₂ＰＯ₄；１３０mM ＮａＣｌ）に再懸濁し、再度ペレットにし、固定緩衝液（ＰＢＳ中３％パラホルムアルデヒド）に再懸濁した。細菌を室温で３０〜６０分インキュベート後、再度ペレット（８０００rpmで５分）にし、固定溶液を除去した後、２０mlの５０％エタノール水溶液中に再懸濁した。固定細菌は、周囲温度で３０分インキュベート後使用するか、または−２０℃で数週間保存後使用した。
【０２０９】
各測定について、５０％エタノール水溶液中の１００μlの固定細胞を、１．５mlの微量遠心分離管に移し、８０００rpmで５分遠心分離した。次に、エタノール水溶液を除去し、ペレットを１００μlの無菌ＰＢＳ １００μlに再懸濁し、再度８０００rpmで５分遠心分離してペレットにした。ペレットからＰＢＳを除去し、適当なリニアビーコンを約３０pmol/mlの濃度で含有する１００μlのハイブリダイゼーション緩衝液（２５mMトリス−塩酸、ｐＨ９．０；１００mM ＮａＣｌ；０．５％ＳＤＳ）に細胞を再懸濁した。５０℃で３０分ハイブリダイゼーション反応を行った。リニアビーコンとその標的生物を表１Ｃのリストに示す。シュードモナス（Pseudomonas）プローブは、各ハイブリダイゼーションについて１対１混合物で使用し、ここで各プローブの濃度は各ハイブリダイゼーション反応で３０pmol/mlであった。
【０２１０】
次に、試料を８０００rpmで５分遠心分離した。ハイブリダイゼーション緩衝液を除去し、細胞を１００μlの無菌ＴＥ−９．０（１０mMトリス−塩酸、ｐＨ９．０；１mM ＥＤＴＡ）に再懸濁した。細胞のこの懸濁物２μlのアリコートをガラススライド上に置き、広げ、乾燥させた。最後に２μlのベクタシールド（Vectashield（ベクターラボラトリーズ（Vector Laboratories，Ｐ／Ｎ Ｈ−１０００）を、乾燥した細胞の上にのせ、カバーグラスをのせ、数滴のマニキュア液を使用してその位置を固定した。
【０２１１】
６０×油浸対物レンズ、１０×接眼レンズ（総拡大率は６００倍）およびオメタオプティカル（Omega Optical）から得た光フィルター（ＸＦ２２（緑色）とＸＦ３４（赤色））を取り付けたニコン蛍光顕微鏡を使用して、スライドを観察した。スポットＣＣＤカメラとディアグノスティック・インストルメンツ・インク（Diagnostic Instruments, Inc.）（スターリングハイツ（Sterling Heights）、ミズーリ州、アメリカ合衆国）から得たソフトウェアを使用して、スライドの部分の電子的デジタル画像を作成した。
【０２１２】
得られたデジタル画像を、図６Ａと６Ｂに示す。固定した大腸菌（E. coli）、緑膿菌（P. aeruginosa）、および枯草菌（B. subtilis）細胞のすべてを、前述の緑膿菌（P. aeruginosa）（図６Ａ）または枯草菌（B. subtilis）（図６Ｂ）リニアビーコンとハイブリダイズさせた。図６Ａと６Ｂの両方で、パネルＩ、IIIおよびＶに示す赤色の画像はヨウ化プロピジウムで染色したものであり、これは赤色の顕微鏡フィルターを使用して見ることができる。図６Ａと６Ｂの両方で、パネルII、IVおよびVIに示す緑色の画像は、フルオレセイン標識リニアビーコンをｒＲＮＡ標的配列にハイブリダイズさせて得られる緑色の蛍光であり、これは緑色の顕微鏡フィルターを使用して見ることができる。比較のために、調べた各プローブの赤色と緑色の画像を各スライドの同じセクションにかつ１つずつ図に示す。
【０２１３】
図６Ａに関して、大腸菌（E. coli）、緑膿菌（P. aeruginosa）および枯草菌（B. subtilis）の細胞は、それぞれパネルＩ、IIIおよびＶで赤色の画像で見ることができる。ヨウ化プロピジウムは存在するすべての細菌を染色するため、細胞は赤色である。図６ＡのパネルII、IVおよびVIに関して、パネルIVでのみ緑色の細胞が最も強く見られ、リニアビーコンは標的生物緑膿菌（P. aeruginosa）の存在を特異的に同定するのに使用することができることを確認している。
【０２１４】
図６Ｂに関して、再度大腸菌（E. coli）、緑膿菌（P. aeruginosa）および枯草菌（B. subtilis）の細胞は、それぞれパネルＩ、IIIおよびＶで赤色の画像で見られる。図６ＢのパネルII、IVおよびVIに関して、パネルIVでのみ緑色の細胞が最も強く見られ、リニアビーコンは標的生物枯草菌（B. subtilis）の存在を特異的に同定するのに使用することができることを確認している。
【０２１５】
要約すると、このプロトコールはハイブリダイゼーション反応後に洗浄工程を含まないが、緑膿菌（P. aeruginosa）と枯草菌（B. subtilis）に対するリニアビーコンは、標的生物の確実な検出を可能にする。
【０２１６】
例２１：ノイズおよびシグナル対ノイズと核塩基配列との相関
本例は、本出願人が観察した現象が配列依存性であるかどうかを調べるために行った。従ってＰＮＡプローブＣｙ３ＰＮＡ００３−１５（表１Ｂを参照）の核塩基配列を再編成して、プローブＣｙ３ＳＣＢＬ０３−１５（表１Ｂを参照）を産生した。
【０２１７】
材料と方法
ＰＮＡオリゴマーの調製、標識および精製を記載した。ＤＮＡ標的ＳＣＢＬ−ＤＮＡ（表２Ａを参照）を使用して実質的に本明細書の例１８に記載のように、緩衝液ＢとＣ中でプローブＣｙ３ＳＣＢＬ０３−１５を調べた。得られたデータを、図７Ａと７Ｂにグラフで示す。
【０２１８】
結果と考察
図７Ａに関して、調べた２つの緩衝液について生のシグナルとノイズデータを示す。プローブＣｙ３ＰＮＡ００３−１５について観察されたように、プローブＣｙ３ＳＣＢＬ０３−１５の結果は、実質的に緩衝液に依存せず、従ってイオン強度と最小のｐＨの変化が結果に影響を与えないことを確認している。図７Ｂに関して、標的配列にハイブリダイズするとシグナル対ノイズ比は約６〜８である。これは、プローブＣｙ３ＰＮＡ００３−１５について図４Ｅで示したデータとよく相関する。従ってこのデータは、本出願人により観察された現象は、リニアビーコンの核塩基配列から実質的に独立していることを示している。
【０２１９】
同等物
特に好適な実施態様を参照して本発明を証明かつ説明したが、添付の請求の範囲に規定される本発明の精神と範囲を逸脱することなく、本明細書の形式および詳細を種々変更することができることは、当業者は容易に理解するであろう。通常の実験を使用して、本明細書に記載の本発明の具体的な実施態様の多くの同等物が可能であることを、当業者は理解するであろう。このような同等物は、請求の範囲に包含されると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】 タイプＡ蛍光熱プロフィールを示すＰＮＡプローブの蛍光対温度データのグラフ表示である。
【図１Ｂ】 図１Ｂ１、１Ｂ２、および１Ｂ３は、タイプＢ蛍光熱プロフィールを示すＰＮＡプローブの蛍光対温度データのグラフ表示である。
【図１Ｃ】 タイプＣ蛍光熱プロフィールを示すＰＮＡプローブの蛍光対温度データのグラフ表示である。
【図２Ａ】 図２Ａ１と２Ａ２は、タイプＡハイブリダイゼーションプロフィールを示すＰＮＡプローブの蛍光対時間データのグラフ表示である。
【図２Ｂ】 タイプＢハイブリダイゼーションプロフィールを示すＰＮＡプローブの蛍光対時間データのグラフ表示である。
【図２Ｃ】 タイプＣハイブリダイゼーションプロフィールを示すＰＮＡプローブの蛍光対時間データのグラフ表示である。
【図３】 異なる長さと標識位置を示すＤＮＡとＰＮＡプローブのノイズ（バックグランド蛍光）データのグラフ表示である。
【図４】 図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、および４Ｅは、長さが１１〜１５サブユニットのＰＮＡおよびＤＮＡプローブのシグナル対ノイズデータのグラフ表示である。
【図５】 各々が４５サイクルのＰＣＲを行った反応の内容物とリニアビーコンを含有する２つのエッペンドルフ試験管のデジタル画像である。
【図６】 図６Ａと６Ｂは、リニアビーコンとヨウ化プロピジウムで処理した大腸菌（E. coli）、緑膿菌（P. aeruginosa）、枯草菌（B. subtilis）を含有する試料スライドのデジタル画像である（ここで、リニアビーコンは、緑膿菌（P. aeruginosa）（図６Ａ）又は枯草菌（B. subtilis）（図６Ｂ）に特異的な核酸塩基配列へのプローブ用核塩基配列を含む）。画像は、それぞれ蛍光顕微鏡と、顕微鏡に取り付けた市販の光フィルターとカメラを使用して得られた。両方の図で、パネルＩ、IIIおよびIVは、赤色の顕微鏡とカメラフィルターを使用して得られる赤色の画像であり、ヨウ化プロピジウムで染色した細胞が見られる。両方の図で、パネルII、IVおよびVIは、緑色の顕微鏡とカメラフィルターを使用して得られる赤色の画像である。
【図７】 図７Ａと７Ｂは、ランダムに混合した核塩基配列を有するＣｙ３標識した１５量体ＰＮＡプローブのノイズとシグナル対ノイズ比をまとめたデータのグラフ表示である。
【図８】 表１Ａに示したプローブのハイブリダイゼーション測定法シグナル対ノイズ比のグラフ表示である。
【配列表】

Claims (35)

1. 結合されたエネルギードナー残基および結合されたエネルギーアクセプター残基を含むペプチド核酸（ＰＮＡ）ポリマーであって、該ドナーおよびアクセプター残基は、プローブ用核酸塩基配列の少なくとも一部分により分離されており、かつ該ポリマーは、ステム（stem）およびループヘアピンを形成せず、かつポリマーが水溶液中で溶媒和するときに該ドナーとアクセプター残基間のエネルギー移動の効率が、
   ａ）エネルギードナー残基をエネルギーアクセプター残基から分離する核酸塩基配列の長さ；
   ｂ）結合されたエネルギードナー残基と結合されたエネルギーアクセプター残基のスペクトルの重複；
   ｃ）水溶液中のマグネシウムの存在または非存在；および
   ｄ）水溶液のイオン強度、
   よりなる群から選択される２〜４個の変数とは無関係であることをさらに特徴とする、上記ポリマー。
2. 試料中の標的配列の検出、同定または定量のための方法であって、
   ａ）試料を、結合されたエネルギードナー残基および結合されたエネルギーアクセプター残基を含むペプチド核酸（ＰＮＡ）ポリマーに接触させ、ここで、該ドナーおよびアクセプター残基はプローブ用核酸塩基配列の少なくとも一部分により分離されており、該ポリマーは、ステム（stem）およびループヘアピンを形成せず、かつポリマーが水溶液に溶媒和するときに該ドナーとアクセプター残基間のエネルギー移動の効率が、
   ｉ）エネルギードナー残基をエネルギーアクセプター残基から分離する核酸塩基配列の長さ；
   ii）結合されたエネルギードナー残基と結合されたエネルギーアクセプター残基のスペクトルの重複；
   iii）水溶液中のマグネシウムの存在または非存在；および
   iv）水溶液のイオン強度、
   よりなる群から選択される２〜４個の変数とは無関係であることをさらに特徴とすること、および
   ｂ）適切なハイブリダイゼーション条件下で、標的配列へのポリマーのハイブリダイゼーションを検出、同定または定量し、ここで、試料中に存在する標的配列の存在、非存在または量は、ポリマーのドナーまたはアクセプター残基に関連する検出可能なシグナルの変化と相関すること、
   を含む、上記方法。
3. ポリマーの核酸塩基配列は、プローブ用核酸塩基配列である、請求項２に記載の方法。
4. 複数の支持体結合ペプチド核酸（ＰＮＡ）ポリマーを含むアレイであって、アレイのペプチド核酸（ＰＮＡ）ポリマーは、プローブ用核酸塩基配列の少なくとも一部分により分離されている、結合されたエネルギードナー残基および結合されたエネルギーアクセプター残基を含み、かつ該ポリマーは、ステム（stem）およびループヘアピンを形成せず、かつポリマーが水溶液に溶媒和するときに該ドナーとアクセプター残基間のエネルギー移動の効率が、
   ｉ）エネルギードナー残基をエネルギーアクセプター残基から分離する核酸塩基配列の長さ；
   ii）結合されたエネルギードナー残基と結合されたエネルギーアクセプター残基のスペクトルの重複；
   iii）水溶液中のマグネシウムの存在または非存在；および
   iv）水溶液のイオン強度、
   よりなる群から選択される２〜４個の変数とは無関係であることをさらに特徴とし、かつ該ポリマーは、試料中に存在する標的配列を検出、同定または定量するのに適している、上記アレイ。
5. アレイは、加熱、ヌクレアーゼ酵素、化学変性物質、およびそれらの組合せよりなる群から選択される再生触媒を用いる処理による再生に適している、請求項４に記載のアレイ。
6. 試料中の標的配列の存在、非存在または量を検出する測定法を実施するのに適切なキットであって、
   ａ）プローブ用核酸塩基配列の少なくとも一部分により分離されている結合されたエネルギードナー残基および結合されたエネルギーアクセプター残基を有するペプチド核酸（ＰＮＡ）ポリマーであって、ステム（stem）およびループヘアピンを形成せず、かつポリマーが水溶液に溶媒和するときに該ドナーとアクセプター残基間のエネルギー移動の効率が、
   ｉ）エネルギードナー残基をエネルギーアクセプター残基から分離する核酸塩基配列の長さ；
   ii）結合されたエネルギードナー残基と結合されたエネルギーアクセプター残基のスペクトルの重複；
   iii）水溶液中のマグネシウムの存在または非存在；および
   iv）水溶液のイオン強度、
   よりなる群から選択される２〜４個の変数とは無関係であることをさらに特徴とする該ポリマー；および
   ｂ）測定法を実施するのに必要な他の試薬または組成物、
   を含む、上記キット。
7. キットのポリマーは、長さが１１〜１７サブユニットの範囲であるプローブ用核酸塩基配列を含む、請求項６に記載のキット。
8. 複数のポリマーは、独立に検出可能な残基で標識されている、請求項６に記載のキット。
9. 独立に検出可能な残基は、同一試料中に存在するかもしれない複数の異なる標的配列を、独立に検出、同定または定量するために使用される、請求項８に記載のキット。
10. キットは、イン・サイツ（ｉｎ ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーション測定法において使用される、請求項６に記載のキット。
11. キットは、食物、飲料、水、医薬品、個人の健康管理製品、乳製品または環境試料中の生物を検出するために使用される、請求項６に記載のキット。
12. キットは、原材料、製品または製法を試験するために使用される、請求項６に記載のキット。
13. キットは、ヒトもしくは動物を治療するために使用される臨床上の検体、器具、備品および製品よりなる群から選択される臨床試料を検査するために使用される、請求項６に記載のキット。
14. キットは、遺伝病に特異的であるか、または遺伝病への素因に特異的である、標的配列を検出するために使用される、請求項６に記載のキット。
15. キットは、βサラセミア（Thalassemia）、鎌状赤血球貧血、第Ｖ因子ライデン（Leiden）、嚢胞性線維症および癌関連標的（ｐ５３、ｐ１０、ＢＲＣ−１およびＢＲＣ−２など）よりなる群から選択される疾患に関連する標的配列を検出するために使用される、請求項１４に記載のキット。
16. キットは、出生前スクリーニング、実父確定検査、身元確認および犯罪捜査よりなる群から選択される法医学的手法において、標的配列を検出するために使用される、請求項６に記載のキット。
17. プローブ用核酸塩基配列は、長さが５〜３０サブユニットの範囲である、請求項１に記載のポリマー。
18. プローブ用核酸塩基配列は、長さが８〜１８サブユニットの範囲である、請求項１に記載のポリマー。
19. プローブ用核酸塩基配列は、長さが１１〜１７サブユニットの範囲である、請求項１に記載のポリマー。
20. プローブ用核酸塩基配列のサブユニットは、式：
    

    

    ［式中、
    各Ｊは、同一であるかまたは異なり、かつＨ、Ｒ¹、ＯＲ¹、ＳＲ¹、ＮＨＲ¹、ＮＲ¹ ₂、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩよりなる群から選択され；
    各Ｋは、同一であるかまたは異なり、かつＯ、Ｓ、ＮＨおよびＮＲ¹よりなる群から選択され；
    各Ｒ¹は、同一であるかまたは異なり、かつ場合によりヘテロ原子または置換もしくは非置換アリール基を含有してもよい、１〜５個の炭素原子を有するアルキル基であり；
    各Ａは、単結合、式：−（ＣＪ₂）_s−の基、および式（ＣＪ₂）_sＣ（Ｏ）−の基（ここで、Ｊは、上記と同義であり、そして各ｓは、１〜５の整数である）よりなる群から選択され；
    各ｔは、１または２であり；
    各ｕは、１または２であり；そして
    各Ｌは、同一であるかまたは異なり、かつＪ、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウリジン、５−メチルシトシン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２，６−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、シュードイソシトシン（pseudoisocytosine）、２−チオウラシル、２−チオチミジン、他の天然の核酸塩基類似体、他の非天然の核酸塩基、置換および非置換芳香族残基、ビオチンおよびフルオレセインよりなる群から独立に選択される］を有する、請求項１に記載のポリマー。
21. 各サブユニットは、メチレンカルボニル結合によりＮ−［２−（アミノエチル）］グリシン基本骨格のアザ窒素に結合している天然のまたは非天然の核酸塩基からなる、請求項２０に記載のポリマー。
22. 結合されたドナー残基および結合されたアクセプター残基間のエネルギー移動の効率が、選択された変数のうちの３または４個とは無関係である、請求項１に記載のポリマー。
23. 結合されたドナー残基および結合されたアクセプター残基間のエネルギー移動の効率が、４つの選択された変数のすべてとは無関係である、請求項１に記載のポリマー。
24. エネルギーアクセプター残基は、プローブ用核酸塩基配列のＣ末端に結合され、かつエネルギードナー残基はプローブ用核酸塩基配列のＮ末端に結合されている、請求項１に記載のポリマー。
25. エネルギードナー残基は、５（６）−カルボキシフルオレセイン、５−（２’−アミノエチル）−アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、ボディピー（bodipy）、ローダミン、Ｃｙ２、Ｃｙ３，Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびテキサスレッドよりなる群から選択される蛍光物質である、請求項１に記載のポリマー。
26. エネルギーアクセプター残基は、４−（（４−（ジメチルアミノ）フェニル）アゾ）安息香酸（ダブシル（dabcyl））である、請求項１に記載のポリマー。
27. ポリマーは、支持体に固定化されている、請求項１に記載のポリマー。
28. ポリマーは、アレイの１成分である、請求項１に記載のポリマー。
29. ポリマーのドナー残基およびアクセプター残基間のエネルギー移動の効率が、選択された変数のうちの３または４個とは無関係である、請求項２に記載の方法。
30. ポリマーのドナー残基およびアクセプター残基間のエネルギー移動の効率が、４つの選択された変数のすべてとは無関係である、請求項２に記載の方法。
31. 標的配列は、閉管試験で検出、同定または定量される、請求項２に記載の方法。
32. 検出、同定または定量された標的配列は、閉管試験において起こる反応で合成または増幅される、請求項３１に記載の方法。
33. 標的配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（Strand Displacement Amplification）（ＳＤＡ）、転写介在性増幅（Transcription-Mediated Amplification）（ＴＭＡ）、回転環増幅（Rolling Circle Amplification）（ＲＣＡ）およびＱ−ベータ（Q-beta）レプリカーゼよりなる群から選択されるプロセスを使用して合成または増幅される、請求項３２に記載の方法。
34. 合成または増幅された標的配列は、即時に測定される、請求項３３に記載の方法。
35. ＰＣＲ反応は、非対称的ＰＣＲ反応である、請求項３３に記載の方法。

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