KR20230056685A - 염료를 사용한 생물학적 분석을 위한 조성물, 시스템 및 방법 - Google Patents
염료를 사용한 생물학적 분석을 위한 조성물, 시스템 및 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20230056685A KR20230056685A KR1020237006509A KR20237006509A KR20230056685A KR 20230056685 A KR20230056685 A KR 20230056685A KR 1020237006509 A KR1020237006509 A KR 1020237006509A KR 20237006509 A KR20237006509 A KR 20237006509A KR 20230056685 A KR20230056685 A KR 20230056685A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- emission
- dye
- sample
- wavelength
- dyes
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
- G01N21/6452—Individual samples arranged in a regular 2D-array, e.g. multiwell plates
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6486—Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N2021/6417—Spectrofluorimetric devices
- G01N2021/6419—Excitation at two or more wavelengths
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N2021/6417—Spectrofluorimetric devices
- G01N2021/6421—Measuring at two or more wavelengths
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
- G01N2021/6432—Quenching
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
- G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks
- G01N2021/6441—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks with two or more labels
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Abstract
링커를 통해 억셉터 염료(acceptor dye)에 공유 부착된 도너 염료(donor dye)를 포함하는 에너지 전달 염료 쌍, 예를 들어, 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR) 및 디지털 중합효소 연쇄 반응(dPCR)과 같은 증폭 검정을 포함하는 생물학적 응용 분야를 위한, 예를 들어, 소광제 및 분석물(예를 들어, 올리고뉴클레오티드)에 공유 부착된 에너지 전달 염료 쌍의 접합체에서의 에너지 전달 염료 쌍의 용도. 시스템 및 방법은 (1) 2개의 염료가 동일한 여기 파장 범위를 가지거나, 상이한 방출 파장 범위를 갖고, 그리고/또는 (2) 2개의 염료가 동일한 방출 파장 범위를 가지지만, 상이한 여기 파장 범위를 갖는 것을 포함한다.
Description
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2020년 7월 23일자로 출원된 미국 임시 출원 제62/705,935호의 35 U.S.C. §119(e) 하의 이익을 주장하며, 이의 개시내용은 완전히 제시된 바와 같이 참조에 의해 본원에 원용된다.
기술분야
본 개시내용은 일반적으로 억셉터 염료(acceptor dye)에 공유 부착된 도너 염료(donor dye)를 포함하는 에너지 전달 염료 접합체 쌍에 관한 것이다. 본 개시내용은 추가로 예를 들어, 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR: quantitative polymerase chain reaction) 및 디지털 PCR(dPCR: digital PCR)을 비롯한 생물학적 응용 분야에서 예를 들어, 소광제 모이어티와 함께 또는 소광제 모이어티 없이 분석물에 공유 부착된 에너지 전달 염료 접합체 리포터 모이어티로서의 에너지 전달 염료 접합체 쌍의 용도에 관한 것이다. 본 개시내용은 추가로 qPCR에 의해서 하나 이상의 생물학적 샘플을 관찰, 시험 및/또는 분석하기 위한 시스템, 장치 및 방법에 관한 것이며, 보다 구체적으로는 본 명세서에 개시된 에너지 전달 염료 접합체 쌍을 사용하여 qPCR에 의해서 하나 이상의 생물학적 샘플을 관찰, 시험 및/또는 분석하기 위한 광학 시스템을 포함하는 시스템, 장치 및 방법에 관한 것이다.
현재의 세포 및 조직 기능성 분석에는 종종 제한되는 물질로부터 가능한 한 많은 정보를 추출해야 한다. 예를 들어, 종양 생검과 같은 샘플은 수집하기 어렵고, 일반적으로 소량의 사용가능한 핵산만을 수득한다. 단일의 표적 분석물의 PCR 검출 및 측정은 단일 플렉스 검정으로 지칭되며, 핵산 수준에서 임상 연구 샘플을 분석하기 위한 골드 표준이었고, 사반세기 이상 동안 생물학적 지식의 한계를 확장하는 데 매우 귀중한 것이었다.
그러나 임상 연구 표본으로부터 얻은 제한된 양의 핵산으로 인해 이러한 소중한 샘플을 가장 잘 활용하는 방법에 대해 선택하도록 종종 강요된다. 또한 샘플이 제한되어 있으면, 분석될 수 있는 유전자 자리의 수도 제한되어 샘플로부터 추출될 수 있는 정보의 양이 감소된다. 마지막으로, 다수의 단일 검정 반응을 설정하는 데 필요한 추가적인 시간과 재료는 복잡한 프로젝트의 비용을 상당히 증가시킬 수 있다.
정량적 PCR(qPCR)을 위한 실시간 시스템은 세포 및 조직 샘플에 대한 검정을 수행하는 데 자주 사용된다. 실시간 중합효소 연쇄 반응과 같은 핵산 검출/증폭 방법은 특정 유전자 서열 또는 발현된 메신저 RNA 서열과 같은 표적 핵산을 검출 및/또는 정량하기 위해 이중 표지된 프로브를 자주 사용한다. 이러한 방법에 사용하기 위한 형광 프로브는 종종 리포터와 소광제 모이어티로 표지된다. 이러한 경우에, 리포터로부터의 형광은 2개의 모이어티가 핵산 주형에 대한 올리고뉴클레오티드 프로브의 혼성화를 통해 그리고/또는 올리고뉴클레오티드 프로브로부터 소광제 또는 리포터 모이어티 성분 중 하나를 제거하는 뉴클레아제 활성을 통해 물리적으로 분리될 때 소광되지 않는다.
이중 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브 내의 형광 공명 에너지 전달(FRET: fluorescence resonance energy transfer)은 유전자 분석을 위한 분석에서 널리 사용된다. FRET는 DNA 혼성화 및 증폭, 단백질 폴딩의 역학, 단백질 분해 및 다른 생체 분자들 간의 상호 작용을 연구하는 데 활용되어 왔다. FRET는 리포터 기와 소광제 기 사이에서 발생할 수 있으며 상이한 에너지 전달 모드(ET)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 에너지 전달은 도너와 억셉터 사이에 상호작용이 존재하는 경우 여기 전자가 비방사 경로를 통해 도너 분자에서 억셉터 분자로 전달될 수 있는 형광 소광 메커니즘을 포함할 수 있다. FRET는 또한 여기가 광자의 방출 없이 도너 분자로부터 억셉터 분자로 전달될 때 두 염료 분자 사이에서도 발생할 수 있다.
단일 샘플 분취량으로부터 하나 초과의 표적을 증폭하고 정량화하는 전략인 핵산의 멀티플렉스 PCR 분석은 다수의 단일 플렉스 검정을 실행하는 것과 연관된 문제에 대한 매력적인 해법이다. 멀티플렉스 PCR에서는, 단일 PCR 반응으로 형광 염료를 포함하는 다수의 프로브를 사용하여 샘플 분취량이 조사된다. 이것은 해당 샘플로부터 추출될 수 있는 정보의 양을 증가시킨다. 멀티플렉스 PCR을 사용하면, 샘플 및 재료를 상당히 절약할 수 있다. 이러한 방법의 유용성을 증가시키기 위해 여러 쌍의 유전자 특이적 프라이머와 프로브를 사용하여 복수의 표적 서열을 동시에 증폭시키고 측정하는 멀티플렉스화된 PCR이 개발되어 왔다. 멀티플렉스화 PCR은 다음의 장점을 제공한다: 1) 효율성: 멀티플렉스 PCR은 여러 PCR 검정법을 단일 반응 내에 조합시킴으로써 샘플 물질을 보존하고 웰들 간의 변동을 방지하도록 돕는다. 멀티플렉스화는 민감도를 저하시키지 않고 복수의 분량으로 분할될 수 없는 희귀한 표적을 보유하는 샘플과 같이 제한된 샘플을 더욱 효율적인 사용을 가능하게 한다. 2) 경제성: 표적이 일제히 증폭되더라도, 이들의 형광 신호에 기반하는 증폭을 구별하는 데 독특한 리포터 염료를 갖는 유전자 특이적 프로브를 사용하여 각각의 표적이 독립적으로 검출된다. 일단 최적화되면, 멀티플렉스화된 검정법은 독립적으로 증폭된 동일한 검정법보다 비용 효율적이다.
그러나, 현재 단일한 멀티플렉스 PCR 검정법으로 분석될 수 있는 표적의 수에는 제한이 있다. 멀티플렉스 PCR을 위한 실험적 설계는 단일 반응보다 더 복잡하다. 개별적인 표적을 검출하는 데 사용되는 프로브는 고유한 스펙트럼을 가진 독특한 리포터 모이어티를 포함해야 한다. 실시간 검출 시스템의 여기 및 방출 필터의 설정은 제조사마다 달라지고, 따라서 실험 최적화 공정의 일부로 각각의 염료 모이어티에 대해 기기를 보정해야 한다. 따라서, 멀티플렉스 PCR 검정법의 개발에서 하나의 제한사항은 단일 반응에서 효율적으로 측정될 수 있는 형광단 및 이에 따른 프로브의 수이다. 멀티플렉스화된 PCR의 또 다른 제한은 정량화를 손상시키거나 위양성 또는 부정확한 정량화를 유발할 수 있는 상이한 형광 리포터들 간의 신호 간섭("혼선(cross-talk)")으로 인한 것이다. 따라서 종래의 시스템을 사용하면 스펙트럼 중첩이 최소화된 형광단을 선택하는 것이 중요하다. 따라서 멀티플렉스화된 반응을 설계하는 경우 가능한 혼선 문제를 피하기 위해 여기 및/또는 방출 프로파일이 중첩하는 것을 피하는 형광단으로 상이한 표적에 표지해야 한다. 또한 형광단의 방출 및 여기 스펙트럼은 사용될 PCR 기기, 특히 각각의 필터 세트에 대한 대역 통과 사양과 호환되어야 한다.
신호 혼선은 또한 양호하게 소광시키는 프로브를 사용함으로써 최소화될 수 있다. 형광 프로브를 설계하는 경우, 소정의 검출 화학 유형을 고려하여 리포터와 소광제 모이어티가 호환되는 것을 보장하는 것이 필요하다. 이전에는, TaqMan 프로브에 대한 가장 일반적인 염료/소광제 조합은 TAMRA 소광제를 갖는 FAM 형광단이다. 그러나 최근에는 "다크 소광제", 예컨대, Dabcyl 및 Black Hole Quencher(BHQ)가 TAMRA와 같은 형광 소광제를 대체하였다. 다크 소광제는 형광단에서 흡수한 에너지를 다른 파장의 광이 아닌 열로 방출한다. "다크 소광제"는 배경이 더 낮은 결과를 제공하는 경향이 있으며, 리포터 염료 중 하나와 혼선 신호를 생성하는 소광제에서 방출된 광을 피하는 것이 중요한 멀티플렉스 반응에서 특히 유용하다. 따라서 고효율 "다크 소광제"는 형광단 및 소광제 모이어티로부터 배경 형광을 상당히 감소시켜 감도 및 종점 신호를 증가시킨다. 이는 동일한 튜브에 여러 개의 형광단이 있으면 배경 형광이 더 높아지기 때문에 멀티플렉스 반응에 특히 유용하다.
일반적으로, 멀티플렉스 PCR 반응은 예를 들어, 단일 반응 혼합물 내에 다수의 상이한 프로브가 존재할 때 도입되는 화학의 복잡성으로 인해 제한되어 왔다. 예를 들어 듀플렉스 반응에서 가장 널리 사용되는 조합은 FAM과 HEX(JOE/VIC®)이고, 트리플렉스 반응에서는 FAM, HEX(JOE/VIC®), NED 또는 Cy5와 같은 염료가 전형적으로 사용되고, 쿼드리플렉스 반응에서는 FAM, HEX (JOE/VIC®), Texas Red® 및 Cy5 염료와 같은 염료가 전형적으로 사용된다. 최근까지 가장 일반적인 멀티플렉스 PCR 기기는 4개의 고유한 염료-소광제 쌍만 이용할 수 있었다. 그러나 특정 상용 기기는 더 높은 수준의 멀티플렉싱, 예를 들어 6-플렉스 PCR, 8-플렉스 PCR, 10-플렉스 PCR, 20-플렉스 PCR 등을 수행할 수 있는 광학 능력을 갖는다.
화학적 복잡성에도 불구하고, 고-플렉스 qPCR 검정은 기기 성능 또는 기존 기기가 활용되는 방식에 의해 제한되었다. 현재 사용 가능한 qPCR 기기는 광범위한 여기 및 방출 스펙트럼을 상응하는 염료 또는 프로브 세트의 여기/방출 스펙트럼과 상용성인 별개의 스펙트럼(EX/EM "채널")으로 나눈다. 예를 들어, EX/EM 채널의 매칭된 세트는 전형적으로 상기에 논의된 바와 같은 쿼드리플렉스 반응을 수용하는 데 사용되었다. 그러나, 적어도 부분적으로는 적합한 프로브를 사용할 수 없기 때문에, 일반적인 샘플에서 4개 초과의 표적을 정량화할 수 있는 검정을 제공하기 위해 더 많은 범위의 EX/EM 채널 조합이 아직 활용되지 않았다.
따라서, 일부 상용 기기에서 이미 이용 가능한 추가 스펙트럼 채널을 통해 증가된 멀티플렉스 반응 및 검출을 가능하게 하는 고유한 형광단/소광제 조합을 포함하는 추가 프로브를 제공할 필요가 있다. 또한, 추가 채널 및 다른 관련 하드웨어 및 소프트웨어가 개선된 기기가 입수 가능하면 훨씬 더 높은 차수의 멀티플렉싱을 용이하게 할 수 있는 고유한 광학 특성을 갖는 새로운 형광단 및 형광단/소광제 조합이 필요하다.
일 양태에서, 본 개시내용은 i. 제1 파장의 광을 흡수하여 이에 반응하여 여기 에너지를 방출할 수 있는 도너 염료; ii. 도너 염료에 의해서 방출되는 여기 에너지를 흡수하여, 이에 반응하여 제2 파장의 광을 방출할 수 있는 억셉터 염료; 및 iii. 도너 염료를 억셉터 염료에 공유 부착하는 링커를 포함하는 에너지 전달 형광 염료 접합체를 제공하며, 여기서 링커는 알킬 부분, 아미노-알킬 부분, 옥시-알킬렌 부분, 아미노-알킬렌-디알콕시 부분, 알케닐렌 부분, 알키닐렌 부분, 폴리에테르 부분, 아릴렌 부분, 아미드 부분 또는 포스포디에스테르 부분 중 하나 이상을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본원에 기재된 에너지 전달 염료 접합체는 분석물에 연결될 수 있고, 하기 중 하나로부터 선택된 기본 구조를 가질 수 있다:
상기 식에서, L1은 제1 링커이고, L1은 공유 결합을 통해 또는 하나 이상의 개재 원자(intervening atom)를 포함하는 스페이서를 통해 D1, D2 및 A에 부착되어 있고;
L2는 제2 링커이고, L2는 공유 결합을 통해 또는 하나 이상의 개재 원자를 포함하는 스페이서를 통해 D2 및 D3 각각에 부착되어 있고;
L3은 제3 링커이고, L3은 공유 결합을 통해 또는 하나 이상의 개재 원자를 포함하는 스페이서를 통해 각각의 PO4H 및 D1에 부착되어 있고;
L4는 제4 링커이고, L4는 공유 결합을 통해 또는 하나 이상의 개재 원자를 포함하는 스페이서를 통해 PO4H 및 D2에 부착되어 있고;
A는 분석물이고;
D1, D2, 및 D3 각각은 상호 교환 가능하게 도너 염료 또는 억셉터 염료이고;
LI 및 LIII에서 D1과 D2의 조합 및 LII에서 D2와 D3의 조합은 에너지 전달 염료 쌍을 형성한다.
도너 염료의 대표적인 예는 비제한적으로 잔텐 염료, 시아닌 염료, BODIPY 염료, 피렌 염료, 피로닌 염료 및 쿠마린 염료를 포함한다. 억셉터 염료의 대표적인 예는 비제한적으로 플루오레세인 염료, 시아닌 염료, 로다민 염료, BODIPY 염료, 피렌 염료, 피로닌 염료 및 쿠마린 염료를 포함한다.
또 다른 양태에서, i. 올리고뉴클레오티드; 및 ii. 올리고뉴클레오티드에 공유 부착된 본원에 기재된 바와 같은 에너지 전달 염료 접합체를 포함하는 올리고뉴클레오티드 프로브가 기재된다.
추가의 또 다른 양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 에너지 전달 염료 접합체에 공유 부착된 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하는 형광-표지된 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하는 조성물이 기재된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 에너지 전달 염료 접합체에 부착된 올리고뉴클레오티드 프로브 및 수성 매질, 예컨대, 완충제, 마스터 믹스 또는 반응 혼합물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 에너지 전달 염료 접합체에 부착된 올리고뉴클레오티드 프로브 및 비-수성 매질, 예컨대, 동결건조 또는 냉동 건조된 완충제, 마스터 믹스 또는 반응 혼합물을 포함한다.
또 다른 양태에서, 샘플에서 표적 핵산 분자를 검출 또는 정량화하는 방법이 기재되어 있는데, 이 방법은,
(i) 하나 이상의 표적 핵산 분자를 포함하는 샘플을, 표적 핵산 분자에 적어도 부분적으로 상보적인 서열을 갖는 본원에 개시된 바와 같은 적어도 1개의 올리고뉴클레오티드 프로브와 접촉시키는 단계이되, 적어도 1개의 프로브는 하나 이상의 표적 핵산 분자에 대한 혼성화 시 형광의 검출 가능한 변화를 나타내는, 단계; 및
(ii) 프로브의 형광을 측정함으로써 표적 핵산 분자의 존재 또는 부재를 검출하거나 또는 이의 양을 정량화하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해서 샘플에서 표적 핵산 분자를 검출 또는 정량화하는 방법이 기재되어 있는데, 이 방법은,
(i) 하나 이상의 표적 핵산 분자를 포함하는 샘플을, a) 표적 핵산 분자에 적어도 부분적으로 상보적인 서열을 갖는 본원에 개시된 바와 같은 적어도 1개의 올리고뉴클레오티드 프로브 - 적어도 1개의 프로브는 하나 이상의 표적 핵산 분자의 증폭 시 형광의 검출 가능한 변화를 거침 -; 및 b) 적어도 1개의 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍과 접촉시키는 단계;
(ii) 하나 이상의 표적 핵산 분자를 증폭시키기에 충분한 조건 하에서 단계 (i)의 혼합물을 DNA 중합효소와 함께 인큐베이션시키는 단계; 및
(iii) 프로브의 형광을 측정함으로써 증폭된 표적 핵산 분자의 존재 또는 부재를 검출하거나 또는 이의 양을 정량화하는 단계를 포함한다.
추가의 또 다른 양태에서, i. 하나 이상의 완충제, 핵산 합성 효소; 및 ii. 본원에 기재된 바와 같은 올리고뉴클레오티드 프로브; 및 iii. PCR 검정을 수행하기 위한 지침서, 및 선택적으로 정제 매질 또는 유기 용매를 포함하는 중합효소 연쇄 반응(PCR)용 키트가 기재된다.
추가의 또 다른 양태에서, 조성물이 본원에 제공된다. 예를 들어, 조성물은 a) 본원에 기재된 바와 같은 에너지 전달 염료 접합체를 포함하는 제1 표지된 올리고뉴클레오티드; 및 b) 중합효소를 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 조성물은 a) 본원에 개시된 바와 같은 형광 에너지 전달 염료 접합체; 및 b) 핵산 분자를 포함할 수 있다. 추가의 또 다른 실시형태에서, 조성물은 a) 본원에 개시된 바와 같은 형광 에너지 전달 염료 접합체; 및 b) 효소를 포함할 수 있다. 추가의 또 다른 실시형태에서, 조성물은 a) 본원에 개시된 바와 같은 형광 에너지 전달 염료 접합체; 및 b) 에너지 전달 염료 접합체 내의 도너 염료의 여기 파장의 20 nm 이내 또는 에너지 전달 염료 접합체 내의 억셉터 염료의 방출 파장의 20 nm 이내의 여기 파장을 갖는 형광단을 포함할 수 있다.
추가의 또 다른 양태에서, 시스템은 제1 방사원(radiant source), 선택적인 제2 방사원, 검출기, 제1 방출 스펙트럼 요소, 및 선택적인 제2 방출 스펙트럼 요소를 포함한다. 시스템은 명령어를 포함하는 적어도 하나의 메모리를 포함하는 적어도 하나의 프로세서를 추가로 포함할 수 있다. 제1 방사원은 제1 평균 여기 파장을 특징으로 하며, 존재하는 경우 제2 방사원은 제1 평균 여기 파장과 상이한 제2 평균 여기 파장을 특징으로 한다. 샘플은 방사원(들)으로부터의 방사선을 수신하도록 배치되고, 샘플은 제1 염료, 제2 염료 및 선택적인 제3 염료를 포함한다. 검출기는 샘플로부터의 방출을 측정하도록 구성된다. 제1 방출 스펙트럼 요소는 제1 평균 방출 파장을 특징으로 하고, 선택적인 제2 방출 스펙트럼 요소는 제1 평균 방출 파장과 상이한 제2 평균 방출 파장을 특징으로 한다. 메모리는 제1 방사원으로 샘플을 조명하고, 이에 대한 응답으로, (1) 검출기 및 제1 방출 스펙트럼 요소를 사용하여 샘플로부터의 방출을 측정하고, (2) 선택적으로 검출기 및 제2 방출 스펙트럼 요소를 사용하여 샘플로부터의 방출을 측정하도록 하는 명령어를 포함한다. 존재하는 경우, 메모리는 또한 샘플을 제2 방사원으로 조명하고, 이에 대한 응답으로, 검출기 및 제2 방출 스펙트럼 요소를 사용하여 샘플로부터의 방출을 측정하도록 하는 명령어를 또한 포함한다. 염료는 제1 최대 흡수 파장을 포함하는 제1 흡수 스펙트럼을 포함하고, 제2 염료는 제1 최대 흡수 파장과 동일하거나 실질적으로 동일한 제2 최대 흡수 파장을 포함하는 제2 방출 스펙트럼을 포함한다. 추가로 또는 대안적으로, 제2 염료는 제2 최대 방출 파장을 포함하는 제2 방출 스펙트럼을 포함하고, 제3 염료는 제2 최대 방출 파장과 동일하거나 실질적으로 동일한 제3 최대 방출 파장을 포함하는 제3 방출 스펙트럼을 포함한다.
본 개시내용의 추가적인 실시형태, 특징 및 이점은 하기 상세한 설명으로부터 그리고 본 개시내용의 실시를 통해 명백해질 것이다. 본원에 기재된 임의의 실시형태는 실시형태가 서로 모순되지 않는 정도로 본원에 기재된 임의의 다른 실시형태와 관련하여 사용될 수 있음을 이해할 것이다.
본 개시내용의 실시형태는 첨부된 도면과 함께 읽을 때 다음의 상세한 설명으로부터 더 잘 이해될 수 있다. 단지 예시적인 목적을 위한 이러한 실시형태는 본 개시내용의 신규하고 자명하지 않은 측면을 묘사한다. 도면은 다음 도면을 포함한다.
도 1은 본 개시내용의 일 실시형태에 따른 시스템의 개략도이다.
도 2는 본 개시내용의 일 실시형태에 따른 또 다른 시스템의 개략도이다.
도 3은 본 개시내용의 일 실시형태에 따른 또 다른 시스템의 개략도이다.
도 4는 본 개시내용의 일 실시형태에 따른 시스템의 투시도이다.
도 5는 도 1 내지 도 4에 예시된 시스템 중 임의의 것을 포함할 수 있는 본 개시내용의 실시형태에 따른 시스템의 개략도이다.
도 6은 본 개시내용의 일 실시형태에 따른 ex-em 채널 및 염료 세트의 표이다.
도 7은 본 개시내용의 실시형태에 따른 방법이다.
도 8은 본 개시내용의 실시형태에 따른 한 쌍의 염료에 대한 흡수 또는 여기 스펙트럼 및 관련 방출 스펙트럼이다.
도 9는 도 8에 도시된 염료를 포함하는 본 개시내용의 실시형태에 따른 ex-em 채널 및 염료 세트의 표이다.
도 10은 도 8에 도시된 염료의 ex-em 채널 공간의 그래프이다.
도 11은 본 개시내용의 실시형태에 따른 방법이다.
도 12는 본 개시내용의 실시형태에 따른 3개의 염료에 대한 흡수 또는 여기 스펙트럼 및 관련 방출 스펙트럼이다.
도 13은 도 12에 도시된 염료를 포함하는 본 개시내용의 실시형태에 따른 ex-em 채널 및 염료 세트의 표이다.
도 14는 도 12에 도시된 염료의 ex-em 채널 공간의 그래프이다.
도 15는 본 개시내용의 실시형태에 따른 3개의 염료에 대한 흡수 또는 여기 스펙트럼 및 관련 방출 스펙트럼이다.
도 16은 본 개시내용의 실시형태에 따른 5개의 염료에 대한 흡수 또는 여기 스펙트럼 및 관련 방출 스펙트럼이다.
도 17은 도 16에 도시된 염료를 포함하는 본 개시내용의 실시형태에 따른 ex-em 채널 및 염료 세트의 표이다.
도 18은 도 16에 도시된 염료의 ex-em 채널 공간의 그래프이다.
도 19는 10개 염료 세트를 포함하는 본 개시내용의 일 실시형태에 따른 ex-em 채널 및 염료 세트의 표이다.
도 20은 본 개시내용의 실시형태에 따른 방법이다
도 21은 링커 L1을 갖는 에너지 전달 염료 접합체를 제조하기 위한 반응식(반응식 1)이며, 여기서 D1 및 D2는 각각 염료 1 및 염료 2를 나타낸다.
도 22는 링커 L2를 갖는 에너지 전달 염료 접합체를 제조하기 위한 반응식(반응식 2)이며, 여기서 D2 및 D3은 각각 염료 2 및 염료 3를 나타낸다.
도 23은 2개의 링커 L3 및 L4를 갖는 에너지 전달 염료 접합체를 제조하기 위한 반응식(반응식 3)이며, 여기서 D1 및 D2는 각각 염료 1 및 염료 2를 나타낸다.
도 24는 링커를 함유하는 전구체 및 각각의 유형의 전구체를 사용하여 제조된 에너지 전달 염료 접합체의 목록이다.
도 25는 올리고뉴클레오티드 프로브에 부착된 에너지 전달 접합체의 다이어그램이다.
도 26a는 올리고뉴클레오티드 프로브에 부착된 에너지 전달 접합체의 다이어그램이며, 여기서 프로브는 소광제에 부착되어 있다.
도 26b는 qPCR 반응 동안 올리고뉴클레오티드 프로브의 변위 및 절단 후 도 26a의 에너지 전달 접합체의 다이어그램이다.
도 1은 본 개시내용의 일 실시형태에 따른 시스템의 개략도이다.
도 2는 본 개시내용의 일 실시형태에 따른 또 다른 시스템의 개략도이다.
도 3은 본 개시내용의 일 실시형태에 따른 또 다른 시스템의 개략도이다.
도 4는 본 개시내용의 일 실시형태에 따른 시스템의 투시도이다.
도 5는 도 1 내지 도 4에 예시된 시스템 중 임의의 것을 포함할 수 있는 본 개시내용의 실시형태에 따른 시스템의 개략도이다.
도 6은 본 개시내용의 일 실시형태에 따른 ex-em 채널 및 염료 세트의 표이다.
도 7은 본 개시내용의 실시형태에 따른 방법이다.
도 8은 본 개시내용의 실시형태에 따른 한 쌍의 염료에 대한 흡수 또는 여기 스펙트럼 및 관련 방출 스펙트럼이다.
도 9는 도 8에 도시된 염료를 포함하는 본 개시내용의 실시형태에 따른 ex-em 채널 및 염료 세트의 표이다.
도 10은 도 8에 도시된 염료의 ex-em 채널 공간의 그래프이다.
도 11은 본 개시내용의 실시형태에 따른 방법이다.
도 12는 본 개시내용의 실시형태에 따른 3개의 염료에 대한 흡수 또는 여기 스펙트럼 및 관련 방출 스펙트럼이다.
도 13은 도 12에 도시된 염료를 포함하는 본 개시내용의 실시형태에 따른 ex-em 채널 및 염료 세트의 표이다.
도 14는 도 12에 도시된 염료의 ex-em 채널 공간의 그래프이다.
도 15는 본 개시내용의 실시형태에 따른 3개의 염료에 대한 흡수 또는 여기 스펙트럼 및 관련 방출 스펙트럼이다.
도 16은 본 개시내용의 실시형태에 따른 5개의 염료에 대한 흡수 또는 여기 스펙트럼 및 관련 방출 스펙트럼이다.
도 17은 도 16에 도시된 염료를 포함하는 본 개시내용의 실시형태에 따른 ex-em 채널 및 염료 세트의 표이다.
도 18은 도 16에 도시된 염료의 ex-em 채널 공간의 그래프이다.
도 19는 10개 염료 세트를 포함하는 본 개시내용의 일 실시형태에 따른 ex-em 채널 및 염료 세트의 표이다.
도 20은 본 개시내용의 실시형태에 따른 방법이다
도 21은 링커 L1을 갖는 에너지 전달 염료 접합체를 제조하기 위한 반응식(반응식 1)이며, 여기서 D1 및 D2는 각각 염료 1 및 염료 2를 나타낸다.
도 22는 링커 L2를 갖는 에너지 전달 염료 접합체를 제조하기 위한 반응식(반응식 2)이며, 여기서 D2 및 D3은 각각 염료 2 및 염료 3를 나타낸다.
도 23은 2개의 링커 L3 및 L4를 갖는 에너지 전달 염료 접합체를 제조하기 위한 반응식(반응식 3)이며, 여기서 D1 및 D2는 각각 염료 1 및 염료 2를 나타낸다.
도 24는 링커를 함유하는 전구체 및 각각의 유형의 전구체를 사용하여 제조된 에너지 전달 염료 접합체의 목록이다.
도 25는 올리고뉴클레오티드 프로브에 부착된 에너지 전달 접합체의 다이어그램이다.
도 26a는 올리고뉴클레오티드 프로브에 부착된 에너지 전달 접합체의 다이어그램이며, 여기서 프로브는 소광제에 부착되어 있다.
도 26b는 qPCR 반응 동안 올리고뉴클레오티드 프로브의 변위 및 절단 후 도 26a의 에너지 전달 접합체의 다이어그램이다.
이제 본 개시내용의 특정 실시형태를 상세히 참조할 것이며, 그 예는 첨부된 도면에 도시되어 있다. 본원에 논의된 실시형태의 일반적인 설명 및 상세한 설명 둘 다는 일반적으로 핵산 합성에 사용되는 장치, 시스템, 조성물 및 방법, 예컨대, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 장치, 시스템, 조성물 및 방법, 예를 들어, 실시간 PCR(qPCR) 장치, 시스템, 조성물 및 방법 및 종점 PCR 장치, 시스템, 조성물 및 방법, 예컨대, 비제한적으로 디지털 PCR(dPCR) 또는 용융 곡선 분석 장치, 시스템, 조성물 또는 방법에 관한 것이라고 이해될 것이다. 본 명세서에 제공된 일반적인 설명과 상세한 설명은 모두 단지 예시적이고 설명을 위한 것이며 교시 내용을 제한하지 않는다는 것을 이해해야 한다. 본 개시내용은 예시된 실시형태와 함께 설명되지만, 본 개시내용을 이들 실시형태로 제한하려는 의도가 아님을 이해할 것이다. 반대로, 본 개시내용은 첨부된 청구범위에 의해 정의된 바와 같은 본 개시내용에 포함될 수 있는 모든 대안, 변형 및 등가물을 포함하도록 의도된다.
본원의 해석 목적을 위해, 다음 정의가 적용될 것이며, 적절할 때마다, 단수로 사용된 용어는 또한 복수를 포함할 것이며 그 역도 마찬가지이다. 아래에 제시된 임의의 의가 본원에 참조에 의해 포함된 모든 문서를 포함하여 임의의 다른 문서에서 해당 단어의 사용과 충돌하는 경우, 아래에 제시된 정의는 (예를 들어, 해당 용어가 원래 사용된 문서에서) 상반되는 의미가 명확히 의도되지 않는 한 본원 및 이의 관련 청구범위를 해석할 목적으로 항상 우선한다. 본원 및 첨부된 청구범위에 사용된 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 하나의 지시 대상으로 명백하고 명백하게 제한되지 않는 한 복수 지시 대상을 포함한다는 점에 유의해야 한다. 달리 명시되지 않는 한 "또는"의 사용은 "및/또는"을 의미한다. "포함하다" 및 "포함하는"(comprise, comprises, comprising, include, includes 및 including)의 사용은 상호 교환 가능하며 제한하려는 의도가 아니다. 또한, 하나 이상의 실시형태의 설명이 "포함하는"이라는 용어를 사용하는 경우, 당업자는 일부 특정한 경우에 실시형태 또는 실시형태들이 "본질적으로 이루어진" 및 "이루어진"이라는 언어를 사용하여 대안적으로 기술될 수 있음을 이해할 것이다.
본원 및 첨부된 청구범위의 목적을 위해, 달리 나타내지 않는 한, 명세서 및 청구범위에 사용된 양, 백분율 또는 비율을 나타내는 모든 숫자 및 기타 수치는 모든 경우에 용어 "약"에 의해 이미 그렇게 변형되지 않은 정도까지 변형되도록 사용된다. "약"은 기재된 주제의 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 범위, 예를 들어 10%, 5%, 2% 또는 1% 이내의 변동 정도를 나타낸다. 따라서, 달리 나타내지 않는 한, 하기 명세서 및 첨부된 청구범위에 기재된 수치 파라미터는 얻고자 하는 원하는 특성에 따라 변할 수 있는 근사치이다. 최소한, 청구범위의 범주에 대한 등가 원칙의 적용을 제한하려는 시도가 아니라, 각각의 수치 매개변수는 적어도 보고된 유효 숫자의 수를 고려하고 일반적인 반올림 기술을 적용하여 해석되어야 한다.
본원에서 사용된 섹션 제목은 구성 목적만을 위한 것이며 어떤 식으로든 원하는 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 참조에 의해 포함된 임의의 문헌이 본원에 정의된 용어와 모순되는 경우 본원이 우선한다. 본 교시가 다양한 실시형태와 관련하여 설명되지만, 본 교시가 그러한 실시형태로 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 반대로, 본 교시는 당업자가 이해할 수 있는 바와 같이 다양한 대안, 변형 및 등가물을 포함한다.
정의
본 개시내용의 이해를 용이하게 하기 위해, 다수의 용어가 아래에 정의된다. 달리 명시되지 않는 한, 본원에 사용된 다음 용어 및 어구는 다음 의미를 갖는 것으로 의도된다.
본원에서 사용된 "에너지 전달(ET)"은 FRET 또는 덱스터(Dexter) 에너지 전달을 지칭한다. 본원에서 사용된 "FRET"(형광 공명 에너지 전달 또는 F
rster 공명 에너지 전달이라고도 함)는 도너 분자와 억셉터 분자 사이에 에너지가 비방사적으로 통과되는 분자 에너지 전달(MET)의 형태를 지칭한다. 이론에 얽매이지 않고, 여기 및 방출 스펙트럼이 중첩되는 2개의 형광단이 매우 근접할 때, 하나의 형광단의 여기로 인해 제1 형광단이 흡수된 에너지를 제2 형광단으로 전달하여 제2 형광단이 차례로 형광을 발생하게 할 수 있다고 여겨진다. 달리 말하면, 제1(도너) 형광단의 여기 상태 에너지는 때때로 공명 유도 쌍극자-쌍극자 상호작용이라고 지칭되는 과정에 의해 이웃하는 제2(억셉터) 형광단으로 전달된다. 그 결과, 도너 분자의 수명이 감소하고 이의 형광이 소광되는 반면, 억셉터 분자의 형광 강도는 향상되고 탈분극된다. 도너의 여기 상태 에너지가 비-형광체 억셉터, 예컨대, 소광제로 전달될 때, 도너의 형광은 억셉터에 의한 후속 형광 방출 없이 소광된다. ET에 참여할 수 있는 분자 쌍을 ET 쌍이라고 지칭한다. 에너지 전달이 일어나기 위해서는, 도너 및 억셉터 분자가 전형적으로 근접해 있어야 한다(예를 들어, 최대 70 내지 100 옹스트롬). 본원에서 사용되는 "덱스터 에너지 전달"은 여기 전자가 비-방사성 경로를 통해 도너 분자에서 억셉터 분자로 전달될 수 있는 형광 소광 메커니즘을 지칭한다. 덱스터 에너지 전달은 도너와 억셉터 사이에 상호 작용이 존재할 때 발생할 수 있다. 일부 실시형태에서, 덱스터 에너지 전달은 약 10옹스트롬 이하의 도너와 억셉터 사이의 거리에서 발생할 수 있다. 일부 실시형태에서, 덱스터 에너지 전달에서 여기 상태는 단일 단계에서 교환될 수 있다. 일부 실시형태에서, 덱스터 에너지 전달에서, 여기 상태는 2개의 개별 단계에서 교환될 수 있다.
핵산 증폭 생성물을 검출하기 위해 일반적으로 사용되는 방법은 증폭된 생성물(즉, 앰플리콘)이 미반응 프라이머로부터 분리되는 것을 필요로 한다. 이는 종종 크기 차이를 기준으로 프라이머로부터 증폭 산물을 분리하는 겔 전기영동을 사용하거나 유리 프라이머를 세척하는 산물의 고정화를 통해 달성된다. 실시간 검출에 대해서와 같이 앰플리콘으로부터 프라이머를 분리하지 않고 증폭 과정을 모니터링하는 다른 방법이 기재되어 있다. 일부 예는 TaqMan® 프로브(Roche Molecular Systems), 분자 비콘, 이중-가닥 인터칼레이터 염료, 예컨대, SYBR® GREEN 인디케이터 염료(Life Technologies Corporation), LUX 프라이머 등을 포함한다. SYBR® GREEN 인디케이터 염료를 사용하는 것과 같은 인터칼레이터 기반 PCR 산물 축적 검출의 주요 단점은 특이적 및 비특이적 산물 모두 신호를 생성한다는 것이다. 전형적으로, 인터칼레이터는 단일 플렉스 검출 검정에 사용되며 다중 검출에 사용하기에는 적합하지 않다.
정량적 PCR(qPCR)을 위한 실시간 시스템은 세포 및 조직 샘플(예를 들어, 혈액, 타액, 정액, 소변)에 대한 검정을 수행하는 데 자주 사용된다. 프로브 기반의 정량적 PCR 분석은 인터칼레이터 기반 PCR 제품 검출에 비해 상당한 개선을 제공한다. 프라이머로부터 분리하지 않고 증폭 산물을 검출하기 위한 프로브 기반 방법 중 하나는 5' 뉴클레아제 PCR 검정(TaqMan® 검정 또는 가수분해 프로브 검정이라고도 함)이다. 이러한 대체 방법은 특정 증폭 산물만 검출하기 위한 실시간 방법을 제공한다. 증폭 동안, 때때로 "TaqMan 프로브"(예를 들어, 5'뉴클레아제 프로브) 또는 가수분해 프로브라고도 지칭되는 검출기 프로브를 표적 서열에 어닐링하면 효소가 상류 프라이머에서 프로브의 영역으로 확장되는 경우에 DNA 중합효소, 예컨대, Thermus aquaticus(Taq) DNA 중합효소의 5' 뉴클레아제 활성에 의해 절단되는 기질을 생성한다. 중합에 대한 이러한 의존성은 표적 서열이 증폭될 경우에만 프로브의 절단이 발생하도록 한다.
용어 "리포터", "리포터 기" 또는 "리포터 모이어티"는 본원에서 넓은 의미로 사용되며 임의의 식별 가능한 태그, 표지 또는 모이어티를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 리포터는 형광 리포터 모이어티 또는 염료이다.
일반적으로, TaqMan 검출기 프로브는 형광 리포터 모이어티 또는 염료 및 소광제 모이어티 또는 염료에 공유적으로 부착된 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 리포터 및 소광제 염료는 근접하여 소광제가 FRET에 의해 리포터 염료에 의해 방출되는 형광을 크게 감소시킨다. 5' 단부에 리포터가 있고 3' 단부에 소광제가 있는 프로브에 대해 적절한 소광이 전형적으로 관찰된다는 발견으로 프로브 설계 및 합성이 단순화되었다.
PCR의 연장 단계 동안, 표적 서열이 존재하는 경우, 검출기 프로브는 프라이머 부위 중 하나로부터 하류로 어닐링되고 이러한 활성을 보유하는 DNA 중합효소의 5' 뉴클레아제 활성에 의해 절단되는데, 이는 이 프라이머가 연장되기 때문이다. 프로브의 절단은 리포터 염료를 소광제 염료로부터 분리하여 이를 용액으로 방출함으로써 리포터 염료 신호를 증가시킨다. 절단은 표적 가닥으로부터 프로브를 추가로 제거하여 프라이머 연장이 주형 가닥의 단부까지 계속되도록 한다. 따라서, 프로브의 포함은 전체 PCR 과정을 저해하지 않는다. 추가 리포터 염료 분자는 각각의 주기마다 각각의 프로브로부터 절단되어 생성된 앰플리콘의 양에 비례하여 형광 강도를 증가시킨다.
SYBR GREEN®과 같은 DNA 결합 염료에 비해 형광 검출기 프로브의 장점은 형광 신호를 생성하기 위해 프로브와 표적 간의 특이적 혼성화가 필요하다는 것이다. 따라서 형광 검출기 프로브를 사용하면 잘못된 프라이밍 또는 프라이머-이량체 아티팩트로 인한 비특이적 증폭이 신호를 생성하지 않는다. 형광 프로브의 또 다른 장점은 그것이 구별 가능한 다른 리포터 염료로 표지될 수 있다는 것이다. 상이한 리포터로 표지된 검출기 프로브를 사용함으로써, 종종 멀티플렉스 검정으로 지칭되는 단일 PCR 반응에서 다수의 구별되는 서열의 증폭이 검출될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "프로브" 또는 "검출기 프로브"는 일반적으로 "올리고뉴클레오티드 프로브"와 같이 증폭을 나타내는 다양한 신호 분자 중 임의의 것을 지칭한다. 본원에서 사용되는, "올리고뉴클레오티드 프로브"는 설계 또는 선택에 의해 정의된 엄격성 하에서 표적 핵산 서열에 특이적으로(즉, 우선적으로) 혼성화할 수 있는 특정 뉴클레오티드 서열을 함유하는 합성 또는 생물학적으로 생산된 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA 또는 DNA/RNA 혼성체)의 올리고머를 지칭한다. 따라서, 일부 프로브 또는 검출기 프로브는 예를 들어, 5' 뉴클레아제 프로브와 같은 서열 기반("서열 특이적 검출기 프로브"라고도 지칭됨)일 수 있다. 다양한 검출기 프로브, 예를 들어 (본원에 기재된 TaqMan® 프로브(또한 미국 특허 제5,538,848호 참조) 다양한 줄기-루프 분자 비콘(예를 들어, 미국 특허 제6,103,476호 및 제5,925,517호 및 문헌[Tyagi and Kramer, 1996, Nature Biotechnology 14:303-308] 참조), 무줄기(stemless) 또는 선형 비콘(예를 들어, 국제공개 WO 99/21881호 참조), PNA Molecular Beacons™(예를 들어, 미국 특허 제6,355,421호 및 제6,593,091호 참조), 선형 PNA 비콘(예를 들어, 문헌[Kubista et al., 2001, SPIE 4264:53-58] 참조), 비-FRET 프로브(예를 들어, 미국 특허 제6,150,097호 참조), Sunrise®/Amplifluor® 프로브(미국 특허 제6,548,250호), 줄기-루프 및 듀플렉스 Scorpion™ 프로브(문헌[Solinas et al., 2001, Nucleic Acids Research 29:E96] 및 미국 특허 제6,589,743호), 벌지 루프 프로브(미국 특허 제6,590,091호), 슈도 노트(pseudo knot) 프로브(미국 특허 제6,589,250호), 시클리콘(미국 특허 제6,383,752호), MGB Eclipse™ 프로브(Epoch Biosciences), 헤어핀 프로브(미국 특허 제6,596,490호), 펩티드 핵산(PNA) 라이트-업 프로브, 자가 조립 나노입자 프로브 및 예를 들어, 미국 특허 제6,485,901호; 문헌[Mhlanga et al., 2001, Methods 25:463-471]; 문헌[Whitcombe et al., 1999, Nature Biotechnology. 17:804-807]; 문헌[Isacsson et al., 2000, Molecular Cell Probes. 14:321-328]; 문헌[Svanvik et al., 2000, Anal Biochem. 281:26-35]; 문헌[Wolffs et al., 2001, Biotechniques 766:769-771]; 문헌[Tsourkas et al., 2002, Nucleic Acids Research. 30:4208-4215]; 문헌[Riccelli et al., 2002, Nucleic Acids Research 30:4088-4093]; 문헌[Zhang et al., 2002 Shanghai. 34:329-332]; 문헌[Maxwell et al., 2002, J. Am. Chem. Soc. 124:9606-9612;] 문헌[Broude et al., 2002, Trends Biotechnol. 20:249-56]; 문헌[Huang et al., 2002, Chem Res. Toxicol. 15:118-126]; 및 문헌[Yu et al., 2001, J. Am. Chem. Soc 14:11155-11161]에 기재된 페로센-변형된 프로브가 당업계에 알려져 있다. 검출기 프로브는 리포터 염료, 예를 들어 본원에 기재된 신규 염료뿐만 아니라 6-카르복시플루오레세인(6-FAM) 또는 테트라클로로플루오레신(TET) 및 당업자에게 알려진 다른 염료를 포함할 수 있다. 검출기 프로브는 또한 소광제 모이어티, 예컨대, 본원에 기재된 것뿐만 아니라 테트라메틸로다민(TAMRA), Black Hole Quencher(Biosearch), Iowa Black(IDT), QSY 소광제(Molecular Probes) 및 Dabsyl 및 Dabcyl 설포네이트/카르복실레이트 Quencher(Epoch)를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 검출기 프로브는 또한 2개의 프로브의 조합을 포함할 수 있으며, 여기서 예를 들어 플루오르가 하나의 프로브 상에 있고 소광제가 다른 프로브 상에 있고, 표적 상에서 함께 2개의 프로브의 혼성화가 신호를 소광하거나, 표적 상의 혼성화가 형광의 변화를 통해 신호 시그니처를 변경한다.
본원에서 사용되는, "프라이머"는 하나 초과의 프라이머를 지칭할 수 있고, 자연 발생이든 합성 생성이든 상관없이 올리고뉴클레오티드를 지칭하는데, 이것은 핵산 가닥에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건 하에 놓이는 경우, 즉, 뉴클레오티드 및 중합을 위한 작용제, 예컨대, DNA 중합효소의 존재 하에서 적합한 온도에서 충분한 시간 동안 그리고 완충제의 존재 하에 놓이는 경우 합성의 개시 시점으로서 작용할 수 있다. 이러한 조건은 예를 들어, 적합한 완충제("완충제"는 보조인자이거나 pH, 이온 강도 등에 영향을 미치는 치환체를 포함함) 및 적합한 온도에서 적어도 4개의 상이한 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트(예컨대, G, C, A, 및 T) 및 중합 유도제, 예컨대, DNA 중합효소 또는 역전사효소의 존재를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 프라이머는 증폭에서 최대 효율을 위해 단일 가닥일 수 있다. 본원에서 프라이머는 증폭될 각각의 특정 서열의 상이한 가닥에 실질적으로 상보적이도록 선택된다. 이는 프라이머가 각각의 가닥과 혼성화하기에 충분히 상보적이어야 함을 의미한다. 비상보적인 뉴클레오티드 단편은 프라이머의 5'-단부에 부착될 수 있으며(예: "꼬리"를 가짐), 프라이머 서열의 나머지는 표적 핵산의 표적 영역에 상보적이거나 부분적으로 상보적이다. 일반적으로 프라이머는 비상보적인 뉴클레오티드가 기재된 바와 같은 프라이머 말단과 같은 미리 결정된 서열 또는 서열 범위 위치에 존재할 수 있는 경우를 제외하고는 상보적이다. 일부 실시형태에서, 이러한 비상보적인 "꼬리"는 보편적인 서열, 예를 들어, 하나 이상의 올리고뉴클레오티드에 공통적인 서열을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 비상보적 단편 또는 꼬리는 예를 들어, 폴리아데닐화 올리고뉴클레오티드 또는 서열에 혼성화하기 위한 폴리(T) 서열과 같은 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는, "샘플"은 하나 이상의 생체분자(예를 들어, 하나 이상의 핵산 및/또는 단백질 표적 분자)를 함유하거나 함유하는 것으로 추정되는 임의의 물질을 지칭하며, 세포, 조직 또는 개체 또는 개체들로부터 추출 및/또는 단리된 하나 초과의 유체를 포함할 수 있다. 샘플은 포유동물 또는 비-포유동물 유기체(예를 들어, 식물, 바이러스, 박테리오파지, 박테리아 및/또는 진균을 포함하지만 이들로 제한되지 않음)로부터 유래될 수 있다. 본원에서 사용된, 샘플은 개별 용액, 용기, 바이알 및/또는 반응 부위에 함유된 물질을 지칭할 수 있거나 일련의 용액, 용기, 바이알 및/또는 반응 부위 사이에 분배된 물질(예를 들어, dPCR 검정에 사용하기 위해 예를 들어, 일련의 마이크로타이터 플레이트 바이알 또는 일련의 관통 구멍 또는 샘플 플레이트의 반응 영역 위에 분배된 물질)을 지칭할 수 있다. 일부 실시형태에서, 샘플은 미정제(crude) 샘플일 수 있다. 예를 들어, 샘플은 임의의 추가 샘플 제조 또는 단리를 거치지 않은 미정제 생물학적 샘플일 수 있다. 일부 실시형태에서, 샘플은 관심 분석물(들)을 추가로 단리하고/하거나 샘플로부터 다른 파편 또는 오염물을 제거하기 위해 추가 처리 단계를 거친 처리된 샘플일 수 있다.
본원에서 사용되는, 용어 "표적", "표적 분자", "표적 생체분자", "표적 분석물", "표적 서열", "표적 핵산 분자" 등은 하나 이상의 다른 "표적", "표적 분자", "표적 생체분자", "표적 분석물", "표적 서열", "표적 핵산 분자" 등과 구별되는 특정 화학 구조를 갖는 분자를 지칭한다. 일반적으로 각각의 "표적", "표적 분자", "표적 생체 분자", "표적 분석물", "표적 서열", "표적 핵산 분자" 등은 나머지 것은 임의의 구조 또는 서열과 구별되고 샘플 또는 샘플 용액에 함유된 특정 프로브 또는 염료에 부착되어 사용될 수 있는 구조 또는 서열을 함유한다.
본원에서 사용되는, 용어 "증폭" 또는 "증폭시키다"는 하나 이상의 표적 생체분자의 양 또는 수가, 예를 들어, 하나 이상의 표적 생체분자의 검출 및/또는 정량화를 허용하는 양만큼 증가하는 검정을 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 표적 생체분자를 증폭시키기 위해 PCR 검정이 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는, "중합효소 연쇄 반응" 또는 "PCR"은 달리 구체적으로 정의되지 않는 한 싱글플렉스 또는 멀티플렉스 PCR 검정을 지칭하며, 실시간 또는 정량적 PCR(여기서 검출은 증폭 중에 발생함) 또는 종점 PCR (검출이 PCR 종료 시 또는 증폭 후에 발생하는 경우, 예를 들어, dPCR 분석)일 수 있다. 예를 들어, 등온 핵산 증폭과 같은 다른 유형의 검정 및 증폭 또는 증폭 방법이 또한 예상되며 당업자에 의해 쉽게 이해된다.
본원에서 사용되는, "핵산", "폴리뉴클레오티드" 및 "올리고뉴클레오티드"라는 용어는 프라이머, 프로브, 검출될 올리고머 단편, 올리고머 대조군 - 표지되거나 표지되지 않음, 및 표지되지 않은 차단 올리고머를 지칭할 수 있으며, 폴리데옥시리보뉴클레오티드(2-데옥시-D-리보스 함유), 폴리리보뉴클레오티드(D-리보스 함유), 및 퓨린 또는 피리미딘 염기, 또는 변형된 퓨린 또는 피리미딘 염기의 N-글리코시드인 폴리뉴클레오티드의 임의의 다른 유형에 대한 일반적인 용어일 수 있다. 용어 "핵산", "폴리뉴클레오티드" 및 "올리고뉴클레오티드" 사이에는 의도된 길이의 구별이 없으며 이들 용어는 상호 교환적으로 사용될 것이다. "핵산", "DNA", "RNA" 및 유사 용어는 핵산 유사체도 포함할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 올리고뉴클레오티드는 임의의 기존 또는 자연 서열로부터 반드시 물리적으로 유래되는 것은 아니지만 화학적 합성, DNA 복제, 역전사 또는 이들의 조합을 포함하는 임의의 방식으로 생성될 수 있다.
용어 "유사체(analog, analogue)"는 변형된 염기 모이어티, 변형된 당 모이어티 및/또는 변형된 포스페이트 에스테르 모이어티를 갖는 합성 유사체를 포함한다. 본원에서 사용되는, 용어 "변형된 염기"는 일반적으로 자연 발생 핵산에서 발견되는 것과 구조가 상이한 핵산에서 염기의 임의의 변형 또는 염기의 화학적 연결을 지칭한다. 이러한 변형은 염기의 화학 구조 또는 핵산 내 염기의 화학적 연결 또는 핵산의 골격 구조의 변화를 포함할 수 있다. (예를 들어, 문헌[Latorra, D. et al., Hum Mut 2003, 2:79-85], 문헌[Nakiandwe, J. et al., plant Method 2007, 3:2] 참조)
본원에 기재된 올리고뉴클레오티드, 특히 프로브 및/또는 프라이머로 기능하는 것은 자연 발생 염기인 아데닌, 시토신, 구아닌, 티민 및 우라실(각각 A, C, G, T 및 U로서 표현됨) 이외의 하나 이상의 변형된 염기를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 염기(들)는 일치된 표적 서열과 불일치된 표적 서열 사이의 Tm 차이를 증가시키고/시키거나 불일치 프라이밍 효율을 감소시켜 검정 특이성뿐만 아니라 선택성도 향상시킬 수 있다. 변형된 염기는 하나 이상의 작용기의 첨가 또는 결실, 헤테로사이클릭 고리 구조의 차이(즉, 헤테로원자를 탄소로 치환하거나 그 반대로) 및/또는 염기에 대한 하나 이상의 링커 아암 구조의 부착에 의해 자연 발생 염기와 상이한 염기일 수 있다. 이러한 변형된 염기(들)는 예를 들어 8-아자-7-데아자-dA(ppA), 8-아자-7-데아자-dG(ppG), 잠금 핵산(LNA) 또는 2'-O,4'-C-에틸렌 핵산(ENA) 염기를 포함할 수 있다. 변형된 염기의 다른 예는 일반 부류의 염기 유사체 7-데아자퓨린 및 이의 유도체 및 피라졸로피리미딘 및 이의 유도체(예를 들어, 본원에 참조에 의해 포함된 PCT WO 90/14353호에 기재된 바와 같음)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 이러한 염기 유사체는 올리고뉴클레오티드에 존재하는 경우 혼성화를 강화하고 불일치 식별을 개선할 수 있다. 자연 발생 염기, 변형된 염기 및 염기 유사체의 모든 호변이성질체 형태가 포함될 수 있다. 변형된 뉴클레오티드간 연결은 또한 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드에 존재할 수 있다. 이러한 변형된 연결은 펩티드, 포스페이트, 포스포디에스테르, 포스포트리에스테르, 알킬포스페이트, 알칸포스포네이트, 티오포스페이트, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 메틸포스포네이트, 포스포르아미데이트, 치환된 포스포르아미데이트 등을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 프로브 및/또는 프라이머 역할을 하는 올리고뉴클레오티드에서의 사용과 호환되는 염기, 당 및/또는 뉴클레오티드간 연결의 몇 가지 추가 변형은 당업자에게 명백할 것이다.
일부 실시형태에서, 변형된 염기는 (a) 3'-단부 (b) 5'-단부, (c) 내부 위치 또는 올리고뉴클레오티드 프로브 및/또는 프라이머 내의 (a), (b) 및/또는 (c)의 임의의 조합에 위치된다.
일부 실시형태에서 본원에 개시된 바와 같은 프라이머 및/또는 프로브는 단일 가닥인 올리고머로서 설계된다. 일부 실시형태에서, 프라이머 및/또는 프로브는 선형이다. 다른 실시형태에서, 프라이머 및/또는 프로브는 이중 가닥이거나 이중 가닥 분절을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 프라이머 및/또는 프로브는 루프 부분 및 줄기 부분을 포함하는 줄기-루프 구조를 형성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 프라이머 및/또는 프로브는 길이가 100개 뉴클레오티드 이하, 보다 바람직하게는 50개 뉴클레오티드 이하, 보다 더 바람직하게는 30개 뉴클레오티드 이하, 가장 바람직하게는 20개 뉴클레오티드 이하인 짧은 올리고뉴클레오티드이며, 하한은 대략 3 내지 5개 뉴클레오티드이다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 바와 같은 프라이머 및/또는 프로브는 5 내지 35개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 바와 같은 프라이머 및/또는 프로브는 10, 15, 20, 25, 30, 또는 10 내지 30개 뉴클레오티드 길이의 임의의 길이이다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 바와 같은 프라이머 및/또는 프로브는 5 내지 35개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 바와 같은 프라이머 및/또는 프로브는 10, 15, 20, 25, 30, 또는 10 내지 30개 뉴클레오티드 길이의 임의의 길이이다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 프라이머 및/또는 프로브의 Tm은 약 50℃ 내지 약 75℃ 범위이다. 일부 실시형태에서, 프라이머 및/또는 프로브는 약 55℃ 내지 약 65℃이다. 일부 실시형태에서, 프라이머 및/또는 프로브는 약 60℃ 내지 70℃이다. 예를 들어, 본원에 개시된 프라이머 및/또는 프로브의 Tm은 56℃, 57℃, 58℃, 60℃, 61℃, 62℃, 63℃, 64℃, 65℃, 66℃ 등일 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 프라이머 및/또는 프로브의 Tm은 56℃ 내지 63℃, 58℃ 내지 68℃ 61℃ 내지 69℃, 62℃ 내지 68℃, 63℃ 내지 67℃, 64℃ 내지 66℃ 또는 그 사이의 임의의 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, 프라이머의 Tm은 본원에 사용된 바와 같은 프로브의 Tm보다 낮다. 일부 실시형태에서, 본원에서 사용되는 바와 같은 프라이머의 Tm은 약 55℃ 내지 약 65℃이고, 본원에서 사용되는 바와 같은 프로브의 Tm은 약 60℃ 내지 약 70℃이다. 일부 실시형태에서, PCR에 사용되는 프라이머의 Tm 범위는 동일한 PCR에 사용되는 프로브의 Tm 범위보다 약 5℃ 내지 15℃ 낮다. 또 다른 실시형태에서, 프라이머 및/또는 프로브의 Tm은 증폭 동안 사용된 PCR 순환 조건에서 어닐링/연장 온도보다 약 3℃ 내지 6℃ 더 높다.
일부 실시형태에서, 프로브는 3'-단부에 연장 가능하지 않은 차단제 모이어티를 포함한다. 일부 실시형태에서, 프로브는 이의 3'-단부, 5'-단부 및/또는 그 사이의 임의의 내부 위치에 다른 모이어티(동일하거나 상이한 추가적인 연장 가능하지 않은 차단제 모이어티, 소광제 모이어티, 형광 모이어티 등을 포함하지만 이에 제한되지 않음)를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 연장 가능하지 않은 차단제 모이어티는 아민(NH2), 비오틴, PEG, DPI3 또는 PO4일 수 있지만 이들로 제한되지 않는다. 일부 바람직한 실시형태에서, 차단제 모이어티는 마이너 그루브 결합제(MGB: minor groove binder) 모이어티이다.
본원에서 사용되는, 용어 "MGB", "MGB 기", "MGB 화합물" 또는 "MBG 모이어티"는 이중 가닥 DNA의 마이너 그루브 내에 결합하는 분자를 지칭한다. 올리고뉴클레오티드의 3' 단부에 접합되는 경우, MGB 기는 연장 가능하지 않은 차단제 모이어티로 기능할 수 있다. MGB 모이어티는 또한 올리고뉴클레오티드 프로브 및/또는 프라이머의 특이성을 증가시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 바와 같은 프로브와 같은 올리고뉴클레오티드의 Tm은 MGB 모이어티의 포함에 의해 감소될 수 있다. 예를 들어, MGB 모이어티를 포함하는 본원에 개시된 바와 같은 프로브의 Tm은 약 45℃ 내지 55℃ 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, 프로브의 Tm은 동일한 프로브에 MGB 모이어티를 포함하여 약 10℃ 내지 20℃ 감소된다.
모든 알려진 MGB 화합물에 대한 일반적인 화학식은 이러한 화합물이 매우 다양한 화학 구조를 가지기 때문에 제공될 수 없지만, 일반적으로 말하면, DNA의 마이너 그루브에서 결합할 수 있는 화합물은 초승달 형상의 3차원 구조를 갖는다. 대부분의 MGB 모이어티는 B 형태의 이중 가닥 DNA의 A-T(아데닌 및 티민)가 풍부한 영역을 강력하게 선호한다. 그럼에도 불구하고, C-G(시토신 및 구아닌)가 풍부한 영역을 선호하는 MGB 화합물도 이론적으로 가능하다. 따라서, C-G 영역을 선호하는 마이너 그루브 결합제 분자로부터 유도된 라디칼 또는 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오티드도 본 발명의 범주 내에 있다.
일부 MGB는 103M-1 이상의 회합 상수로 이중 가닥 DNA의 마이너 그루브 내에서 결합할 수 있다. 이러한 유형의 결합은 자외선(UV) 및 핵 자기 공명(NMR) 분광법과 같은 잘 확립된 분광광도계 방법 및 겔 전기영동에 의해서도 검출될 수 있다. "Nuclear Overhauser"(NOESY) 효과를 활용한 NMR 분광법 및 마이너 그루브 결합제 분자의 결합 시 UV 스펙트럼의 이동은 이러한 목적에 특히 잘 알려져 있고 유용한 기술이다. 겔 전기영동은 이중 가닥 DNA 또는 이의 단편에 대한 MGB의 결합을 검출하는 데, 이는 이러한 결합 시 이중 가닥 DNA의 이동성이 변하기 때문이다.
다양한 적합한 마이너 그루브 결합제가 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, Kutyavin, 등의 미국 특허 제5,801,155호; 문헌[Wemmer, D. E., and Dervan P. B., Current Opinion in Structural Biology, 7:355-361 (1997)]; 문헌[Walker, W. L., Kopka, J. L. and Goodsell, D. S., Biopolymers, 44:323-334 (1997)]; 문헌[Zimmer, C.& Wahnert, U. Prog. Biophys. Molec. Bio. 47:31-112 (1986)] 및 문헌[Reddy, B. S. P., Dondhi, S. M., and Lown, J. W., Pharmacol. Therap., 84:1-111 (1999)](이의 개시내용은 전문이 참조에 의해 본원에 포함됨) 참조. 본 개시내용에 따른 바람직한 MGB는 DPI3이다. 이러한 MGB의 합성 방법 및/또는 공급원(이들 중 일부는 상업적으로 이용 가능할 수 있음)도 당업계에 잘 알려져 있다. (예를 들어, 다음을 참조: 미국 특허 제5,801,155호; 제6,492,346호; 제6,084,102호; 및 제6,727,356호, 이의 개시내용은 전문이 참조에 의해 본원에 포함됨).
본원에서 사용되는, "MGB 차단제 프로브", "MBG 차단제" 또는 "MGB 프로브"라는 용어는 3' 및/또는 5'단부에서 마이너 그루브 결합제 모이어티에 추가로 부착된 올리고뉴클레오티드 서열 및/또는 프로브이다. MGB 모이어티에 접합된 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥 및 이중 가닥 DNA 표적과 함께 매우 안정적인 듀플렉스를 형성하므로 혼성화 기반 검정에 사용될 더 짧은 프로브를 사용할 수 있다. 변형되지 않은 DNA와 비교하여, MGB 프로브는 융점(Tm)이 더 높고 특히 불일치가 혼성화 듀플렉스의 MGB 영역 근처에 있을 때 특이성이 증가한다. (예를 들어, 문헌[Kutyavin, I. V., et al., Nucleic Acids Research, 2000, Vol. 28, No. 2: 655-661] 참조).
일부 실시형태에서, 프로브로서 작용하는 올리고뉴클레오티드에 혼입되는 뉴클레오티드 단위는 마이너 그루브 결합제(MGB) 모이어티를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 MGB 모이어티는 연결 아암을 통해 염기 중 하나 이상에 공유 결합된 가교 기능(알킬화제)을 가질 수 있다. 유사하게, 변형된 당 또는 당 유사체는 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 뉴클레오티드 소단위에 존재할 수 있다. 당 변형은 당의 2', 3' 및/또는 4' 탄소 원자에 대한 치환체의 부착, 당의 상이한 에피머 형태, 글리코시드의 결합의 알파- 또는 베타-배위의 차이 및 다른 애노머 변화를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 당 모이어티는 펜토스, 데옥시펜토스, 헥소스, 데옥시헥소스, 리보스, 데옥시리보스, 글루코스, 아라비노스, 펜토푸라노스, 자일로스, 릭소스 및 사이클로펜틸을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 예를 들어 MGB 모이어티를 포함하는 프로브로서 작용하는 올리고뉴클레오티드의 일부 실시형태의 당 또는 글리코시드 부분은 데옥시리보스, 리보스, 2-플루오로리보스, 2-0 알킬 또는 알케닐리보스를 포함할 수 있으며, 여기서 알킬 기는 1 내지 6개 탄소를 그리고 알케닐 기 2개 내지 6개 탄소를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 자연 발생 뉴클레오티드 및 본원에 기재된 변형 및 유사체에서 데옥시리보스 또는 리보스 모이어티는 푸라노스 고리를 형성할 수 있고, 퓨린 염기는 9-위치를 통해 당 모이어티에 부착될 수 있고, 피리미딘은 I-위치를 통해 그리고 피라졸로피리미딘은 I-위치를 통해 당 모이어티에 부착될 수 있다. 일부 실시형태에서, 특히 프로브로서 작용하는 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 제3 및/또는 제6 올리고뉴클레오티드, 표적 부위-특이적 프로브)에서, 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 단위는 "당업계에 잘 알려진 바와 같이 포스페이트" 골격에 의해 상호 연결될 수 있고/있거나 "자연" 포스포디에스테르 연결 이외에, 포스포로티오트 및 메틸포스포네이트를 포함할 수 있다. 다른 유형의 변형된 올리고뉴클레오티드 또는 변형된 염기도 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 본원에서 고려된다.
2개의 상이한 비-중첩(또는 부분적으로 중첩) 올리고뉴클레오티드가 동일한 선형 상보적 핵산 서열의 상이한 영역에 어닐링하고, 하나의 올리고뉴클레오티드의 3' 단부가 다른 올리고뉴클레오티드의 5' 단부를 향할 때, 전자는 "상류" 올리고뉴클레오티드로 불리고 후자는 "하류" 올리고뉴클레오티드로 불릴 수 있다.
본원에서 사용되는, 용어 "표적 서열", "표적 핵산", "표적 핵산 서열" 및 "관심 핵산"은 상호 교환적으로 사용되며, 증폭되거나, 검출되거나 또는 둘 다인 핵산 분자의 원하는 영역을 지칭한다.
본원에서 사용된 "프라이머"는 하나 초과의 프라이머를 지칭할 수 있고, 자연 발생이든 합성 생성이든 상관없이 올리고뉴클레오티드를 지칭하는데, 이것은 뉴클레오티드 및 중합을 위한 작용제, 예컨대, DNA 중합효소 핵산 가닥에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 적합한 온도에서 충분한 시간 동안 그리고 완충제의 존재 하에 놓이는 경우 합성의 개시 시점으로서 작용할 수 있다. 이러한 조건은 예를 들어, 적합한 완충제("완충제"는 보조인자이거나 pH, 이온 강도 등에 영향을 미치는 치환체를 포함함) 및 적합한 온도에서 적어도 4개의 상이한 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트(예컨대, G, C, A, 및 T) 및 중합 유도제, 예컨대, DNA 중합효소 또는 역전사효소의 존재를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 프라이머는 증폭에서 최대 효율을 위해 단일 가닥일 수 있다. 본원에서 프라이머는 증폭될 각각의 특정 서열의 상이한 가닥에 실질적으로 상보적이도록 선택된다. 이는 프라이머가 각각의 가닥과 혼성화하기에 충분히 상보적이어야 함을 의미한다. 비상보적인 뉴클레오티드 단편은 프라이머의 5'-단부에 부착될 수 있으며(예: "꼬리"를 가짐), 프라이머 서열의 나머지는 표적 핵산의 표적 영역에 상보적이거나 부분적으로 상보적이다. 일반적으로 프라이머는 비상보적인 뉴클레오티드가 기재된 바와 같은 프라이머 말단과 같은 미리 결정된 서열 또는 서열 범위 위치에 존재할 수 있는 경우를 제외하고는 상보적이다. 일부 실시형태에서, 이러한 비상보적인 "꼬리"는 보편적인 서열, 예를 들어, 하나 이상의 올리고뉴클레오티드에 공통적인 서열을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 비상보적 단편 또는 꼬리는 예를 들어, 폴리아데닐화 올리고뉴클레오티드 또는 서열에 혼성화하기 위한 폴리(T) 서열과 같은 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 핵산 서열의 보체는 한 서열의 5' 단부가 다른 서열의 3' 단부와 쌍을 이루도록 핵산 서열과 정렬될 때 "역평행 회합"인 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 상보성이 완벽할 필요는 없고; 안정적인 듀플렉스는 불일치 염기쌍 또는 불일치 염기를 포함할 수 있다.
핵산 듀플렉스의 안정성은 용융 온도 또는 "Tm"으로 측정된다. 명시된 조건 하에서 특정 핵산 듀플렉스의 Tm은 염기쌍의 절반이 해리되는 온도이다.
본원에 사용된, 용어 올리고뉴클레오티드의 "Tm" 또는 "용융 온도"는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 집단에서 분자의 50%가 이들의 상보적인 서열에 혼성화되고, 집단 내의 분자의 50%는 이의 상보적인 서열에 혼성화되지 않는 온도(섭씨 온도)를 지칭한다. 프라이머 또는 프로브의 Tm은 용융 곡선을 통해 경험적으로 결정할 수 있다. 어떤 경우에는, 이것은 당업계에 잘 알려진 공식을 사용하여 계산할 수도 있다(예를 들어, 문헌[Maniatis, T., et al., Molecular cloning: a laboratory manual / Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.: 1982] 참조).
본원에서 사용되는, "감도"라는 용어는 소정의 검정으로 검출될 수 있는 주형의 최소량(카피 수 또는 질량)을 지칭한다. 본원에서 사용되는, "특이성"이라는 용어는 일치하는 주형으로부터의 증폭과 일치하지 않는 주형으로부터의 증폭을 구별하는 검정의 능력을 지칭한다. 종종 특이성은 ΔCt = Ct불일치 - Ct일치로 표현된다. 일부 실시형태에서, 특이성의 개선 또는 "특이성 개선" 또는 "배수 차이"는 2(ΔCt_조건1 - (ΔCt_조건2)로 표현된다.
본원에서 사용되는, "Ct" 또는 "Ct 값"이라는 용어는 역치 주기를 지칭하고, 앰플리콘 생성(예를 들어, 형광)을 나타내는 리포터로부터의 신호가 먼저 배경 수준을 초과하여 검출 가능하게 되는 PCR 증폭 검정의 주기를 의미한다. 일부 실시형태에서, 역치 주기 또는 "Ct"는 PCR 증폭이 지수적으로 되는 주기 수이다.
용어 "상보적인"은 또 다른 특정 뉴클레오티드와 염기 쌍을 이룰 수 있는 뉴클레오티드와 관련하여 본원에서 사용된다. 따라서, 예를 들어 아데노신은 우리딘 또는 티미딘에 상보적이고 구아노신은 시티딘에 상보적이다.
"동일한"이라는 용어는 두 개의 핵산 서열이 동일한 서열 또는 상보적인 서열을 갖는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 "증폭"은 핵산 서열의 혼합물 내에서 특정 핵산 서열의 농도를 증가시키기 위한 임의의 증폭 절차의 사용을 나타낸다.
"중합"은 "핵산 합성"으로도 언급될 수 있으며 중합효소와 주형 핵산을 사용하여 프라이머의 핵산 서열을 연장시키는 과정을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "표지"는 검출 가능하고/하거나 정량화 가능한 신호를 제공하거나 제공하는 것을 돕기 위해 사용될 수 있고, 핵산 또는 단백질과 같은 생체 분자에 부착될 수 있는 임의의 원자 또는 분자를 지칭한다. 표지는 형광, 방사능, 비색법, 중량법, 자성, 효소 활성 등에 의해 검출 가능한 신호를 제공할 수 있다. 형광에 의해 검출가능한 신호를 제공하는 표지는 또한 본원에서 "형광단" 또는 "형광" 또는 "형광 염료"로 지칭된다. 본원에서 사용되는 용어 "염료"는 광 또는 방사선을 흡수하고 광을 방출하거나 방출하지 않을 수 있는 화합물을 지칭한다. "형광 염료"는 관찰 가능한 검출 가능한 신호를 생성하기 위해 흡수된 광을 방출하는 분자를 지칭한다(예를 들어, "억셉터 염료", "도너 염료", "리포터 염료", "큰 염료", "에너지 전달 염료", "축상(on-axis) 염료", "축외(off-axis) 염료" 등). "소광제 염료"는 상응하는 형광 염료로부터 방출을 흡수하도록 설계된 분자를 지칭한다.
일부 실시형태에서, 용어 "형광단", "형광체" 또는 "형광 염료"는 (예를 들어, 도너 염료 또는 억셉터 염료와 함께) 형광 에너지 전달 페어링에 사용되는 형광 염료 분자에 적용될 수 있다. 본원에서 사용되는 "형광 에너지 전달 접합체"는 전형적으로 링커를 통해 공유 부착되고 적절한 조건 하에서 형광 에너지 전달 과정을 거칠 수 있는 2개 이상의 형광단(예를 들어, 도너 염료 및 억셉터 염료)을 포함한다.
용어 "소광제", "소광제 화합물", "소광제 기", "소광제 모이어티" 또는 "소광제 염료"는 본원에서 넓은 의미로 사용되며 리포터 분자, 예컨대, 형광 염료로부터 신호를 억제할 수 있는 분자 또는 모이어티를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "중첩"(올리고뉴클레오티드와 관련하여 사용되는 경우)은 주형 핵산의 상보적 가닥에 2개의 올리고뉴클레오티드가 위치하는 것을 지칭한다. 2개의 올리고뉴클레오티드는 적어도 1개, 예를 들어 1 내지 약 40개의 뉴클레오티드, 예를 들어 약 1 내지 10개의 뉴클레오티드 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 뉴클레오티드 중 임의의 수를 중첩할 수 있다. 즉, 올리고뉴클레오티드에 의해 혼성화된 2개의 주형 영역은 올리고뉴클레오티드 둘 모두에 상보적인 공통 영역을 가질 수 있다.
"열적으로 순환하는", "열 순환하는", "열적 순환" 또는 "열 순환"이라는 용어는 전체 변성 온도에서 어닐링(또는 혼성화) 온도까지, 연장 온도까지 그리고 전체 변성 온도로 회귀하는 온도 변화의 반복되는 주기를 지칭한다. 이 용어는 또한 어닐링 및 연장 온도가 하나의 온도로 조합되는 변성 온도 및 연장 온도의 반복된 주기를 지칭한다. 전체 변성 온도는 모든 이중 가닥 단편을 단일 가닥으로 푼다. 어닐링 온도는 프라이머가 핵산 주형의 분리된 가닥의 상보적 서열에 혼성화하거나 어닐링하도록 한다. 연장 온도는 앰플리콘의 초기 DNA 가닥의 합성을 허용한다. "단일 라운드의 열 순환"이라는 용어는 변성 온도, 어닐링 온도 및 연장 온도의 1회 라운드를 의미한다. 예를 들어, 열 주기의 단일 라운드에서, 어닐링 온도와 연장 온도의 내부 반복 사이클이 존재할 수 있다. 예를 들어, 단일 라운드의 열 순환은 변성 온도, 어닐링 온도(즉, 제1 어닐링 온도), 연장 온도(즉, 제1 연장 온도), 또 다른 어닐링 온도(즉, 제2 어닐링 온도), 및 또 다른 연장 온도(즉, 제2 연장 온도)를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "반응 혼합물", "증폭 혼합물" 또는 "PCR 혼합물"은 핵산 주형으로부터 적어도 하나의 앰플리콘을 증폭시키는 데 필요한 성분의 혼합물을 지칭한다. 혼합물은 뉴클레오티드(dNTP), 열안정성 중합효소, 프라이머 및 복수의 핵산 주형(예를 들어, 표적 핵산)을 포함할 수 있다. 혼합물은 Tris 완충제, 1가 염 및/또는 Mg2+를 추가로 포함할 수 있다. 각각의 성분의 작업 농도 범위는 당업계에 널리 알려져 있으며, 당업자가 필요로 할 때 다른 시약 및/또는 성분을 포함하여 추가로 최적화되거나 제형화될 수 있다.
용어 "증폭된 산물" 또는 "앰플리콘"은 PCR 또는 역전사효소(RT)-PCR과 같은 증폭 방법에서 한 쌍의 프라이머를 사용하여 중합효소에 의해 증폭된 핵산의 단편을 지칭한다.
본원에 정의된 바와 같이, "5'→3' 뉴클레아제 활성" 또는 "5'에서 3'의 뉴클레아제 활성" 또는 "5' 뉴클레아제 활성"은 일부 DNA 중합효소와 전통적으로 연관된 5'에서 3'의 뉴클레아제 활성(이에 의해서 뉴클레오티드가 순차적인 방식으로 올리고뉴클레오티드의 5' 단부로부터 제거되고(즉, 이.콜라이(E. coli) DNA 중합효소 I은 이의 활성을 갖지만, 클레나우(Klenow) 단편은 그렇지 않음)) 또는 5'에서 3′ 엔도뉴클레아제 활성을 포함하는 절단 반응의 활성(여기서 절단은 -5′ 단부로부터 하나 초과의 포스포디에스테르 결합(뉴클레오티드)에 대해서 일어남) 또는 둘 다 또는 상동의 5′-3′ 엑소뉴클레아제의 군(5′ 뉴클레아제라고도 알려짐)(이것은 DNA 복제, 재조합 및 수선 동안 생성된 분지형 DNA 구조인 바이퍼케이티드(bifurcated) 분자를 절단함)을 포함하는 절단 반응의 활성을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 이러한 5' 뉴클레아제는 표적 핵산 서열에 어닐링된 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브의 절단에 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "알킬"은 표시된 탄소 원자의 수를 갖는 선형 또는 분지형 포화 지방족 라디칼을 지칭한다. 예를 들어, C1-C6 알킬은 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 이소 프로필, 이소-부틸, sec-부틸, tert-부틸 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본원에서 사용되는 용어 "알킬렌"은 표시된 탄소 원자의 수를 갖는 선형 또는 분지형 포화 지방족 디라디칼을 지칭한다. 예를 들어, C1-C6 알킬은 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌, 부틸렌, 펜틸렌, 헥실렌 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 알킬 및 알킬렌 기는 알킬 및 알킬렌 기 상의 하나 이상의 수소 원자의 대체에 의해 하나 이상의 치환체로 선택적으로 치환될 수 있음을 이해할 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "알케닐"은 표시된 탄소 원자의 수를 갖고 적어도 하나의 이중 결합을 갖는 직쇄 또는 분지형 탄화수소 라디칼을 지칭한다. 예를 들어, C2-C6 알케닐은 비닐, 프로페닐, 이소프로페닐, 부테닐, 이소부테닐, 부타디에닐, 펜테닐, 헥사디에닐 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본원에서 사용되는 용어 "알케닐렌"은 표시된 탄소 원자의 수를 갖고 적어도 하나의 이중 결합을 갖는 직쇄 또는 분지형 탄화수소 디라디칼을 지칭한다. 예를 들어, C2-C6 알케닐은 비닐, 프로페닐, 이소프로페닐, 부테닐, 이소부테닐, 부타디에닐, 펜테닐, 헥사디에닐 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 알케닐 및 알케닐렌 기는 알케닐 및 알케닐렌 기 상의 하나 이상의 수소 원자의 대체에 의해 하나 이상의 치환체로 선택적으로 치환될 수 있음을 이해할 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "알콕시"는 알킬 쇄 내에 또는 알킬 쇄의 말단에 적어도 하나의 산소 원자를 포함하는 알킬 라디칼, 예를 들어 메톡시, 에톡시 등을 지칭한다. "할로-치환된-알콕시"는 적어도 하나의 수소 원자가 할로겐 원자로 치환된 알콕시를 지칭한다. 예를 들어, 할로-치환된-알콕시는 트리플루오로메톡시 등을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "옥시-알킬렌"은 산소 원자를 포함하는 알킬 디라디칼, 예를 들어 -OCH2, -OCH2CH2-, -OC1-C10 알킬렌-, -C1-C6 알킬렌-O-C1-C6 알킬렌-, 폴리(알킬렌 글리콜), 폴리(에틸렌 글리콜)(또는 PEG) 등을 지칭한다. "할로-치환된-옥시-알킬렌"은 적어도 하나의 수소 원자가 할로겐 원자로 치환된 옥시-알킬렌을 지칭한다. 알콕시 및 옥시 알킬렌 기는 알콕시 및 옥시 알킬렌 기 상의 하나 이상의 수소 원자의 대체에 의해 하나 이상의 치환체로 선택적으로 치환될 수 있음을 이해할 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "알키닐"은 표시된 탄소 원자의 수를 갖고 적어도 하나의 삼중 결합을 갖는 직쇄 또는 분지형 탄화수소 라디칼을 지칭한다. 예를 들어, C2-C6 알키닐은 아세틸레닐, 프로피닐, 부티닐 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본원에서 사용되는 용어 "알키닐렌"은 표시된 탄소 원자의 수를 갖고 적어도 하나의 삼중 결합을 갖는 직쇄 또는 분지형 탄화수소 디라디칼을 지칭한다. 알키닐렌의 예는 -C≡C-, -C≡CCH2-, -C≡CCH2CH2-, - CH2C≡CCH2- 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 알키닐 및 알키닐 기는 알키닐 및 알키닐렌 기 상의 하나 이상의 수소 원자의 대체에 의해 하나 이상의 치환체로 선택적으로 치환될 수 있음을 이해할 것이다.
본원에서 사용되는, 용어 "아릴"은 표시된 탄소 원자의 수를 갖고 완전 공액 π-전자 시스템을 갖는 사이클릭 탄화수소 라디칼을 지칭한다. 예를 들어, C6-C10 아릴은 페닐, 나프틸 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본원에 사용되는, 용어 "아릴렌"은 표시된 수의 탄소 원자를 갖고 완전 공액 π-전자 시스템을 갖는 사이클릭 탄화수소 디라디칼을 지칭한다. 예를 들어, C6-C10 아릴렌아릴렌은 페닐렌, 나프틸렌 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 아릴 및 아릴렌 기는 아릴 및 아릴렌 기 상의 하나 이상의 수소 원자의 대체에 의해 하나 이상의 치환체로 선택적으로 치환될 수 있음을 이해할 것이다.
본원에 사용된, 용어 "포스포디에스테르 부분"은 적어도 하나의 -O-P(O)(OH)-O- 작용기를 포함하는 연결을 지칭한다. 포스포디에스테르 부분은 하나 이상의 -O-P(O)(OH)-O- 작용기에 더하여 다른 기, 예컨대, 알킬, 알킬렌, 알케닐렌, 옥시-알킬렌, 예컨대, PEG를 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 다른 기, 예컨대, 알킬, 알킬렌, 알케닐렌, 옥시-알킬렌, 예컨대 PEG는 기 상의 하나 이상의 수소 원자의 대체에 의해 하나 이상의 치환체로 선택적으로 치환될 수 있음을 이해할 것이다.
본원에서 사용되는, 용어 "설포"는 설폰산 또는 설폰산의 염(설포네이트)을 지칭한다.
본원에서 사용되는, 용어 "카르복시"는 카르복실산 또는 카르복실산의 염을 지칭한다.
본원에서 사용되는, 용어 "포스페이트"는 인산의 에스테르를 지칭하고, 포스페이트의 염을 포함한다.
본원에서 사용되는, 용어 "포스포네이트"는 포스폰산을 지칭하고 포스포네이트의 염을 포함한다.
달리 명시되지 않는 한, 본원에 사용되는 치환체의 알킬 부분, 예컨대, 알킬, 알콕시, 아릴알킬, 알킬아미노, 디알킬아미노, 트리알킬암모늄 또는 퍼플루오로알킬은 선택적으로 포화, 불포화, 선형 또는 분지형이고, 모든 알킬, 알콕시, 알킬아미노, 디알킬아미노 치환체는 카르복시, 설포, 아미노 또는 히드록시에 의해 선택적으로 치환될 수 있다.
본원에서 사용되는 "치환된"은 하나 이상의 수소 원자가 하나 이상의 비-수소 원자, 작용기 또는 모이어티로 대체된 분자를 지칭한다. 예시적인 치환체는 할로겐, 예를 들어, 플루오린 및 염소, C1-C8 알킬, C6-C14 아릴, 헤테로사이클, 설페이트, 설포네이트, 설폰, 아미노, 암모늄, 아미도, 니트릴, 니트로, 저급 알콕시, 페녹시, 방향족, 페닐, 폴리사이클릭 방향족, 헤테로사이클, 수-가용화 기, 연결, 및 연결 모이어티를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 치환체는 -X, -R, -OH, -OR, -SR, -SH, -NH2, -NHR, -NR2, -NR3 +, -N=NR2, -CX3, -CN, -OCN, -SCN, -NCO, -NCS, -NO, -NO2, -N2 +, -N3, -NHC(O)R, -C(O)R, -C(O)NR2, -S(O)2O-, -S(O)2R, -OS(O)2OR, -S(O)2NR, -S(O)R, -OP(O)(OR)2, -P(O)(OR)2, -P(O)(O-)2, -P(O)(OH)2, -C(O)R, -C(O)X, -C(S)R, -C(O)OR, -CO2-, -C(S)OR, -C(O)SR, -C(S)SR, -C(O)NR2, -C(S)NR2, -C(NR)NR2를 포함하지만 이에 제한되지 않고, 각각의 X는 독립적으로 할로겐이고, 각각의 R은 독립적으로 -H, C1-C6 알킬, C6-C14 아릴, 헤테로사이클 또는 연결기이다.
달리 나타내지 않는 한, 본원에 명시적으로 정의되지 않은 치환체의 명명법은 결합 지점을 향한 인접 작용기가 뒤따르는 작용기의 말단 부분을 명명함으로써 달성된다. 예를 들어, 치환체 "아릴알킬옥시카르보닐"은 (아릴)-(알킬)-O-C(O)- 기를 지칭한다.
본원에 개시된 화합물은 비용매화 형태뿐만 아니라 수화된 형태를 비롯한 용매화 형태로 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 화합물은 수성 매질(예를 들어, 물 또는 완충제)에 가용성이다. 예를 들어, 화합물은 화합물을 수성 매질에서 가용성으로 만드는 치환체(예를 들어, 수-가용화 기)를 포함할 수 있다. 수성 매질에 가용성인 화합물은 본원에서 "수용성" 화합물로 지칭된다. 이러한 수용성 화합물은 특히 생물학적 검정에 유용하다. 이러한 화합물은 여러 결정형 또는 무정형 형태로 존재할 수 있다. 일반적으로 모든 물리적 형태는 본원에 기재된 용도에 대해 동등하며 본 개시내용의 범주 내에 있는 것으로 의도된다. 본원에 개시된 화합물은 비대칭 탄소 원자(즉, 키랄 중심) 또는 이중 결합을 가질 수 있으며; 본원에 기재된 화합물의 라세미체, 부분입체이성질체, 기하 이성질체 및 개별 이성질체는 본 개시내용의 범주 내에 있다. 본원에 기재된 화합물은 단일 이성질체 또는 이성질체의 혼합물로서 제조될 수 있다.
치환체기가 이들의 통상적인 화학식에 의해 지정되고 왼쪽에서 오른쪽으로 표기되는 경우, 이들은 화학적으로 동일한 치환체를 동등하게 포함하며, 이는 오른쪽에서 왼쪽으로 구조를 표기함으로써 발생될 수 있으며, 예를 들어 CH2O-는 또한 -OCH2-를 언급하는 것으로 이해될 것이다.
본원에 개시된 화합물을 정의하는 데 사용되는 화학 구조는 각각의 소정의 구조가 나타낼 수 있는 가능한 공명 구조 중 하나를 나타내는 것으로 이해될 것이다. 또한, 정의에 따르면, 공명 구조는 전자 비편재화를 나타내기 위해 당업자가 사용하는 그래픽 표현일 뿐이며, 본 개시내용은 임의의 소정의 특정 공명 구조를 보여줌으로써 어떤 식으로든 제한되지 않는다는 것을 이해할 것이다.
개시된 화합물이 공액 고리 시스템을 포함하는 경우, 공명 안정화는 형식 전자 전하가 전체 분자에 걸쳐 분포되도록 할 수 있다. 특정 전하가 특정 고리 시스템 또는 특정 헤테로원자에 편재화된 것으로 묘사될 수 있지만, 전하가 화합물의 대체 부분에 형식적으로 편재화될 수 있는 대등한 공명 구조가 그려질 수 있다는 것이 일반적으로 이해된다.
본원에서 사용되는 "보호기" 또는 "PG"라는 용어는 후속 화학 반응에서 화학 선택성을 얻기 위해서 반응성 작용기, 예컨대, 아민, 또는 히드록실의 화학적 변형에 의해 분자 내로 도입될 수 있는 당업자에게 일반적으로 알려진 임의의 기를 지칭한다. 그러한 보호기는 합성의 나중 시점에서 작용기로부터 후속적으로 제거되어 그러한 작용기에서의 추가 반응 기회를 제공하거나 최종 생성물의 경우 그러한 작용기를 마스킹 해제할 수 있음을 이해할 것이다. 보호기는 예를 들어 문헌[Wuts, P. G. M., Greene, T. W., Greene, T. W., & John Wiley & Sons. (2006). Greene's protective groups in organic synthesis. Hoboken, N.J: Wiley-Interscience]에 기재되어 있다. 당업자는 그러한 보호기가 작용기에 설치될 수 있는 화학적 공정 조건을 쉽게 이해할 것이다. 본원에 기재된 다양한 실시형태에서, 당업자는 본원에 기재된 에너지 전달 염료 접합체의 제조에 사용되는 보호기의 선택이 당업계에 알려진 다양한 대안으로부터 선택될 수 있음을 이해할 것이다. 사용된 보호기가 직교 보호 전략을 제공하도록 적합한 보호기 방식이 선택될 수 있음을 추가로 이해할 것이다. 본원에서 사용되는, "직교 보호"는 다른 보호된 반응성 작용기 또는 반응성 작용기에 영향을 미치지 않으면서 전용 반응 조건 세트로 하나 이상의 반응성 작용기의 보호 및 탈보호를 허용하는 보호기 전략을 지칭한다.
본원에서 사용되는 "PAG"는 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티를 지칭하며, 여기서 알킬렌은 C2-C6 선형 또는 분지형 알킬렌 쇄일 수 있다. 폴리(알킬렌 글리콜)은 -(C2-C6 알킬렌-O-C2-C6 알킬렌)n-(여기서 n은 1 내지 약 20의 정수임) 또는 화학식 -(C2-C6 알킬렌-O- C2-C6알킬렌)n-(여기서 n은 1 내지 약 100의 정수)으로 표현될 수 있음을 이해할 것이다. O-P 링커 결합과 함께 취해진 적합한 PAG 모이어티는 펜타(에틸렌 글리콜)(일명 PEG), 펜타(프로필렌 글리콜)(일명 PPG), 펜타(1,2-부틸렌 글리콜), 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 "수-가용화 기"는 수용액에서 화합물의 용해도를 증가시키는 모이어티를 지칭한다. 예시적인 수-가용화 기는 본원에 기재된 바와 같은 친수성 기, 폴리에테르, 폴리히드록실, 보로네이트, 폴리에틸렌 글리콜, 에틸렌 옥시드(-(CH2CH2O)-)의 반복 단위 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된, "친수성 기"는 수용액에서 화합물의 용해도를 증가시키는 치환체를 지칭한다. 예시적인 친수성 기는 -OH, -O-Z+, -SH, -S-Z+, -NH2, -NR3 +Z-, -N=NR2 +Z-, -CN, -OCN, -SCN, -NCO, -NCS, -NO, -NO2, -N2 +, -N3, -NHC(O)R, -C(O)R, -C(O)NR2, -S(O)2O-Z+, -S(O)2R, -OS(O)2OR, -S(O)2NR, -S(O)R, -OP(O)(OR)2, -P(O)(OR)2, -P(O)(O-)2Z+, -P(O)(OH)2, -C(O)R, -C(S)R, -C(O)OH, -C(O)OR, -CO2 -Z+, -C(S)OR, -C(S)O-Z+, -C(O)SR, -C(O)S-Z+, -C(S)SR, -C(S)S-Z+, -C(O)NR2, -C(S)NR2, -C(NR)NR2 등을 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 여기서 R은 H, C1-C6 알킬, C1-C6 알킬C6-C10 아릴, 또는 C6-C10 아릴이고, 선택적으로 치환된다.
본원에서 사용된, "반응성 작용기" 또는 "반응성 기"는 상이한 화합물 상의 작용기와 화학적으로 반응하여 공유 연결을 형성할 수 있는, 즉, 적합한 반응 조건 하에서 공유 반응성일 수 있는 화합물 상의 모이어티를 의미하고, 일반적으로 다른 물질에 대한 부착 지점을 나타낸다. 전형적으로 반응성 기는 각각 친핵체 또는 친전자체인 상응하는 작용기에 대한 노출을 통해 공유 연결을 형성할 수 있는 친전자체 또는 친핵체이다. 일부 실시형태에서, "반응성 작용기" 또는 "반응성 기"는 친수성 기, 또는 "반응성 작용기" 또는 "반응성 기"가 되도록 활성화된 친수성 기일 수 있다. 일부 실시형태에서, "반응성 작용기" 또는 "반응성 기"는 C(O)OR 기와 같은 친수성 기일 수 있다. 일부 실시형태에서, -C(O)OH와 같은 친수성 기는 당업계에 알려진 다양한 방법에 의해 활성화되어 예컨대, -C(O)OH 기와 N,N,N′,N′-테트라메틸-O-(N-석신이미딜)우로늄 테트라플루오로보레이트(TSTU)의 반응에 의해 NHS 에스테르 모이어티 -C(O)O-NHS(일명 활성 에스테르)를 제공함으로써 반응성 작용기가 될 수 있다.
대안적으로, 반응성 기는 적절한 파장의 광으로 조명된 후에만 화학적으로 반응하는 광활성화 가능한 기이다.
예시적인 반응성 기는 올레핀, 아세틸렌, 알코올, 페놀, 에테르, 옥시드, 할라이드, 알데히드, 케톤, 카르복실산, 에스테르, 아미드, 시아네이트, 이소시아네이트, 티오시아네이트, 이소티오시아네이트, 아민, 히드라진, 히드라존, 히드라지드, 디아조, 디아조늄, 니트로, 니트릴, 메르캅탄, 설파이드, 디설파이드, 설폭시드, 설폰, 설폰산, 설핀산, 아세탈, 케탈, 무수물, 설페이트, 설펜산 이소니트릴, 아미딘, 이미드, 이미데이트, 니트론, 히드록실아민, 옥심, 히드록삼산 티오히드록삼산, 알렌, 오르토 에스테르, 설파이트, 엔아민, 인아민, 우레아, 슈도우레아, 세미카르바지드, 카르보디이미드, 카르바메이트, 이민, 아지드, 알킨(DIBO 및 DBCO와 같은 변형된 알킨 포함), 아조 화합물, 아족시 화합물, 및 니트로소 화합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 반응성 작용기는 또한 생체접합체를 제조하는 데 사용되는 것, 예를 들어 N-히드록시석신이미드 에스테르(또는 석신이미딜 에스테르(SE)), 말레이미드, 설포디클로로페닐(SDP) 에스테르, 설포테트라플루오로페닐(STP) 에스테르, 테트라플루오로페닐(TFP) 에스테르, 펜타플루오로페닐(PFP) 에스테르, 니트릴로트리아세트산(NTA), 아미노덱스트란, 사이클로옥틴-아민 등을 포함한다. 이들 작용기 각각을 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며 특정 목적을 위한 이들의 적용 또는 변형은 당업자의 능력 내에 있다(예를 들어, 문헌[Sandler and Karo, eds., Organic Functional Group Preparations, Academic Press, San Diego, 1989] 참조). 예시적인 반응기 또는 반응성 리간드는 NHS 에스테르, 포스포르아미다이트, 및 하기 표 1에 열거된 기타 모이어티를 포함한다. 뉴클레오티드, 뉴클레오시드 및 당류(예를 들어, 리보실 및 데옥시리보실)도 적어도 효소 촉매 작용을 통해 포스포디에스테르 결합을 형성하는 능력으로 인해 반응성 리간드로 간주된다. 의심의 여지를 피하기 위해, 포화 알킬 기는 반응성 리간드로 간주되지 않는다.
본원에서 사용되는, "고체 지지체"라는 용어는 액체상에서 실질적으로 불용성이고 관심 분자 또는 입자를 결합할 수 있는 매트릭스 또는 매질을 지칭한다. 본원에서 사용하기에 적합한 고체 지지체는 반고체 지지체를 포함하며 특정 유형의 지지체로 제한되지 않는다. 유용한 고체 지지체는 고체 및 반고체 매트릭스, 예컨대, 에어로겔 및 히드로겔, 수지, 비드, 바이오칩(박막 코팅된 바이오칩 포함), 미세유체 칩, 실리콘 칩, 다중-웰 플레이트(마이크로타이터 플레이트 또는 마이크로플레이트라고도 함), 어레이(예컨대, 마이크로어레이), 막, 전도성 및 비전도성 금속, 유리(현미경 슬라이드 포함) 및 자기 지지체를 포함한다. 유용한 고체 지지체의 보다 구체적인 예는 실리카 겔, 중합체 막, 입자, 유도체화된 플라스틱 필름, 유리 비드, 면, 플라스틱 비드, 알루미나 겔, 다당류, 예컨대, SEPHAROSE(GE Healthcare), 폴리(아크릴레이트), 폴리스티렌, 폴리(아크릴아미드), 폴리올, 아가로스, 한천, 셀룰로스, 덱스트란, 전분, FICOLL(GE Healthcare), 헤파린, 글리코겐, 아밀로펙틴, 만난, 이눌린, 니트로셀룰로스, 디아조셀룰로스, 폴리염화비닐, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌(폴리(에틸렌 글리콜) 포함), 나일론, 라텍스 비드, 자성 비드, 상자성 비드, 초상자성 비드, 전분 등을 포함한다.
가수분해 프로브 검정은 PCR 동안 표지된 프로브를 절단하기 위해 Taq DNA 중합효소와 같은 특정 DNA 중합효소의 5' 뉴클레아제 활성을 이용할 수 있다. 가수분해 프로브의 구체적인 예는 TaqMan 프로브이다. 일부 실시형태에서, 가수분해 프로브는 프로브의 5' 단부에 리포터 염료를 함유하고 프로브의 3' 단부에 소광제 염료를 함유한다. PCR 반응 동안, 프로브의 절단은 리포터 염료와 소광제 염료를 분리하여 리포터의 형광을 증가시킨다. PCR 산물의 축적은 리포터 염료의 형광 증가를 모니터링함으로써 직접 검출된다. 프로브가 손상되지 않은 경우, 리포터 염료와 소광제 염료의 근접성은 주로 F
rster 유형 에너지 전달에 의해 리포터 형광을 억제한다(문헌[F
rster, 1948; Lakowicz, 1983]). PCR 동안, 관심 표적이 존재하는 경우 프로브는 정방향 프라이머 부위와 역방향 프라이머 부위 사이에서 특이적으로 어닐링한다. Taq DNA 중합효소의 5'에서 3'로의 핵분해 활성은 프로브가 표적에 혼성화되는 경우에만 리포터와 소광제 사이의 프로브를 절단한다. 그런 다음 프로브 단편이 표적으로부터 변위되고 가닥의 중합이 계속된다. 일부 실시형태에서, PCR 동안 프로브의 연장을 방지하기 위해 프로브의 3' 단부가 차단된다. 일반적으로 혼성화 및 절단 과정은 순차적인 주기로 발생하며 생성물의 기하급수적 축적을 방해하지 않는다.
이러한 매개변수에 구애받지 않고, TaqMan 프로브 및 프라이머를 설계하기 위한 일반적인 지침은 다음과 같다: 프로브를 중첩하지 않으면서 가능한 가깝게 프라이머를 설계함; 프로브의 Tm은 프라이머의 Tm보다 약 10℃ 높아야 함; 프로브에 G 염기보다 더 많은 C 염기를 제공하는 가닥을 선택함; 프라이머의 3' 단부에 있는 5개의 뉴클레오티드는 2개 이하의 G 및/또는 C 염기를 가져야 함; 그리고 반응은 60℃의 동일한 온도에서 어닐링 및 연장이 있는 2단계 열 프로파일에서 실행되어야 함.
형광 염료, 즉 형광단 및 소광제 화합물의 다음 설명은 본원에 기재된 에너지 전달 접합체 및 프로브의 구성에 관한 일반적인 정보를 제공한다. 본원에 기재된 바와 같이, 형광 염료, 예를 들어, 도너 염료 및 억셉터 염료는 링커를 통해 서로 공유 결합되어 에너지 전달 염료 접합체(예를 들어, 리포터 모이어티)를 형성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 에너지 전달 염료 또는 에너지 전달 염료 접합체 및 소광제 화합물은 분석물을 통해 서로 공유 결합될 수 있다. 일부 실시형태에서 분석물은 올리고뉴클레오티드 프로브와 같은 프로브이다. 본원에 개시된 고유한 형광단/소광제 조합을 포함하는 개시된 FRET 접합체 및 프로브는 일부 상업적 기기에서 이미 이용 가능한 추가 스펙트럼 채널을 통해 증가된 멀티플렉스 반응 및 검출을 가능하게 한다. 또한 새로운 형광단, FRET 접합체, 형광단/소광제 및 프로브 조합은 추가 채널이 있는 기기와 기타 관련 하드웨어 및 소프트웨어 개선 사항을 사용할 수 있게 되면 훨씬 더 높은 차원의 멀티플렉싱을 용이하게 할 수 있는 고유한 광학 특성을 제공한다.
에너지 전달 염료
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 에너지 전달 염료 접합체는 2개 이상의 형광 염료를 포함한다. 2개 이상의 형광 염료는 도너 염료 및 억셉터 염료를 포함한다. 적절한 광학적 및 물리적 특성을 갖는 임의의 형광 염료가 본원에 개시된 염료 접합체의 구성에 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 도너 염료의 방출 스펙트럼은 억셉터 염료의 흡수 스펙트럼과 중첩된다. 일부 실시형태에서, 억셉터 염료는 도너 염료의 방출 최대값보다 더 긴 파장인 방출 최대값을 가질 수 있다. 도너 염료 또는 억셉터 염료의 아이덴티티는 본원에 기재된 에너지 전달 염료 접합체에서 특별히 제한되지 않되, 단, 도너 염료 및 억셉터 염료 쌍 및 링커는 도너 염료가 리포터 염료로 에너지를 전달할 수 있도록 선택된다는 것이 이해될 것이다.
본원에 기재된 바와 같은 에너지 전달 염료 접합체에서 적합한 형광 염료, 즉, 도너 염료 및 억셉터 염료는 독립적으로 잔텐 염료(예를 들어, 플루오레세인 또는 로다민 염료), 실리콘-로다민 염료, 시아닌 염료, 붕소-디피로메텐(본원에서는 "BODIPY"라고 함) 염료, 피렌 염료 또는 쿠마린 염료일 수 있다. 일부 실시형태에서, ET 접합체에 포함된 시아닌 염료는 아자인돌 시아닌 화합물(즉, 적어도 하나의 아자인돌기를 포함하는 시아닌 화합물)이다. 일부 실시형태에서, ET 접합체에 포함된 시아닌 염료는 아자인돌(즉, 피롤로피리딘) 시아닌 화합물(즉, 적어도 하나의 아자인돌기를 포함하는 시아닌 화합물)이다. 본원에서 사용되는, "아자인돌" 및 "피롤로피리딘"은 피리딘 고리에 융합된 피롤 고리를 포함하는 바이사이클릭 구조를 갖는 헤테로사이클릭 방향족 유기 화합물을 지칭하기 위해 상호 교환적으로 사용된다. 본원에서 사용되는, "아자인돌 시아닌" 및 "피롤로피리딘 시아닌"은 적어도 하나의 아자인돌 기를 포함하는 시아닌 화합물을 지칭하기 위해 상호 교환적으로 사용된다. 특정 아자인돌 시아닌 화합물은 1개 또는 2개의 선택적으로 치환된 아자인돌 기를 포함할 수 있다. 2개의 아자인돌 기를 포함하는 화합물의 경우, 아자인돌 기는 동일하거나 상이할 수 있다. 본 개시내용과 함께 사용될 수 있는 염료의 예는 미국 특허 제5,863,727호, 제6,448,407호, 제6,649,769호, 제7,038,063호, 제6,162,931호, 제6,229,055호, 제6,130,101호, 제5,188,934호, 제5,840,999호, 제7,179,906호, 제6,008,379호, 제6,221,604호, 제5,231,191호, 제5,366,860호, 제7,595,162호, 제7,550,570호, 제5,936,087호, 제8,030,096호, 제6,562,632호, 제5,846,737호, 제5,442,045호, 제6,716,994호, 제5,582,977호, 제5,321,130호, 제5,863,753호, 제6,977,305호, 제7,566,790호, 제7,927,830호, 제7,888,136호, 제4,774,339호, 제5,248,782호, 제5,187,288호, 제5,451,663호, 제5,433,896호, 제9,040,674호, 제9,783,560호, 제9,040,674호, 제6,255,476호, 제6,020,481호, 제6,303,775호 및 제6,020,481에 기재된 것을 포함하며, 이들 각각의 개시내용은 이들이 염료 및 염료를 올리고뉴클레오티드에 접합하기 위한 방법과 관련되기 때문에 그 전문이 참조에 의해 본원에 포함된다.
일부 실시형태에서, 도너 염료 또는 억셉터 염료는 시아닌 염료, 예컨대, 미국 특허 제6,974,873호에 기재된 것일 수 있다. 적합한 시아닌은 하기 화학식 (I)을 갖는 것을 포함한다:
상기 식에서,
각각의 R1'는 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이고, C1-C6 알킬에서 각각의 수소 원자는 독립적으로 하나 이상의 친수성 기 또는 친수성 기 함유 모이어티(예를 들어, -C1-C6 알킬OH, -C1-C6 알킬CO2H, 또는 알킬아릴)로 선택적으로 치환되고;
각각의 R2'는 독립적으로 H, C1-C6 알킬, C1-C6 알킬C6-C10 아릴 또는 C6-C10 아릴이고, C1-C6 알킬, C1-C6 알킬C6-C10 아릴, 또는 C6-C10 아릴에서 각각의 수소 원자는 독립적으로 하나 이상의 친수성 기 또는 친수성 기 함유 모이어티(예를 들어, -C1-C6 알킬OH, -C1-C6 알킬CO2H, 또는 알킬아릴)로 선택적으로 치환되고;
각각의 R3', R4', R5', 및 R6'는 독립적으로 H, C1-C6 알킬, C6-C10 아릴, 친수성 기, 친수성 기 함유 모이어티이거나 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 취해진 R3'와 R4', R4'와 R5', 또는 R5'와 R6'는, 독립적으로, 하나 이상의 친수성 기 또는 친수성 기 함유 모이어티로 선택적으로 치환된 융합된 6원 아릴 고리를 선택적으로 형성하고;
각각의 R7' 또는 R8'는 독립적으로 H, C1-C6 알킬, -C1-C6 알킬SO3H, -C1-C6 알킬SO3Z, -C1-C6 알킬OH, 또는 -C1-C6 알킬CO2H이고,
R1', R2', R7' 또는 R8' 중 하나는 본원에 개시된 바와 같은 링커(L1, L2, 또는 L3)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 도너 염료 또는 억셉터 염료는 로다민 염료 또는 이의 유도체, 예컨대, 미국 특허 제9,040,674호 또는 PCT/US2019/067925호(현재 WO 2020/132487호)에 기재된 것; 디클로로로다민(예를 들어, 4, 7-디클로로로다민), 예컨대, 미국 특허 제5,847,162호에 기재된 것; 비대칭 로다민 예컨대, 출원 번호 PCT/US2019/068111호(현재 WO 2020/132607호)에 기재된 것; 또는 규소 로다민, 예컨대, 출원 번호 PCT/US2019/045697호(현재 WO 2020/033681호)에 기재된 것일 수 있다.
도너 염료 또는 억셉터 염료로서 작용할 수 있는 로다민 염료의 대표적인 부류는 하기 화학식 (II)에 도시되어 있다:
상기 식에서,
독립적으로 취해진 R1 내지 R6은 수소, 플루오린, 염소, 저급 알킬, 저급 알켄, 설포네이트 설폰, 아미노 아미도, 니트릴 저급 알콕시, 연결기 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 함께 취해지는 경우 R1과 R6은 벤조이거나 함께 취해지는 경우 R4와 R5는 벤조이고; 개별적으로 취해진 Y1 내지 Y4는 수소 및 저급 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 함께 취해지는 경우, Y1과 R2는 프로파노 또는 프로페닐이고, Y2와 R1은 프로파노 또는 프로페닐이고, 함께 취해지는 경우, Y3과 R3은 프로파노 또는 프로페닐이고, Y4와 R4는 프로파노 또는 프로페닐이고; 개별적으로 취해진 X1 내지 X5는 수소, 염소, 플루오린 저급 알킬, 카르복실레이트, 설폰산, 및 연결기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
X1은 카르복실레이트이고;
X2 및 X3은 연결기이고;
X4 및 X5는 염소이고;
개별적으로 취해진 Y1 내지 Y4는 수소, 메틸 및 에틸로 이루어진 군으로부터 선택되고 함께 취해진 Y2와 R1 및 Y4와 R4는 프로파노 또는 프로페닐임.
일부 실시형태에서, 도너 염료 또는 억셉터 염료는 하기 화학식 (III)의 로다민 염료일 수 있다:
상기 식에서,
Ra, Rb, 및 Rc는 각각 서로 독립적으로 수소, (C1-C4) 알킬, (C6-C14) 아릴, (C7-C20) 아릴알킬, 5 내지 14원 헤테로아릴, 6 내지 20원 헤테로아릴알킬, -Rk, 또는 -(CH2)1-10-Rk로부터 선택되고; (C1-C4) 알킬, (C6-C14) 아릴, (C7-C20) 아릴알킬, 5 내지 14원 헤테로아릴, 6 내지 20원 헤테로아릴알킬에서 각각의 수소 원자는 독립적으로 하나 이상의 친수성 기 또는 친수성 기 함유 모이어티로 선택적으로 치환되고;
단독으로 취해지는 경우 각각의 Rd 및 Re는 수소, (C1-C4) 알킬, (C6-C14) 아릴, (C7-C20) 아릴알킬, 5 내지 14원 헤테로아릴, 6-20원 헤테로아릴알킬, -Rb, 또는 -(CH2)n-Rb로부터 독립적으로 선택되고; (C1-C4) 알킬, (C6-C14) 아릴, (C7-C20) 아릴알킬, 5 내지 14원 헤테로아릴, 6 내지 20원 헤테로아릴알킬에서 각각의 수소 원자는 독립적으로 하나 이상의 친수성 기 또는 친수성 기 함유 모이어티로 선택적으로 치환되고;
단독으로 취해지는 경우 Rf, Rg, Rh, Ri, 및 Rj 각각은 각각, 서로 독립적으로 수소, (C1-C4) 알킬, (C6-C14) 아릴, (C7-C20) 아릴알킬, 5 내지 14원 헤테로아릴, 6 내지 20원 헤테로아릴알킬, -Rb, 또는 -(CH2)n-Rb로부터 선택되고; (C1-C4) 알킬, (C6-C14) 아릴, (C7-C20) 아릴알킬, 5 내지 14원 헤테로아릴, 6 내지 20원 헤테로아릴알킬에서 각각의 수소 원자는 독립적으로 하나 이상의 친수성 기 또는 친수성 기 함유 모이어티로 선택적으로 치환되고;
각각의 Rk는 독립적으로 할로겐, -SRa -NH2, -NH2, 퍼할로 저급 알킬, 트리할로메틸, 트리플루오로메틸, -P(O)(OH)2, -OP(O)(OH)2, -S(O)2OH, -C(O)H, -C(O)OH, -C(O)NH2, -C(S)NH2, 및 -C(NH)NH2로부터 선택되고;
X2 및 X3은 카르복실레이트, 설포네이트, H, 또는 연결기일 수 있음.
일부 실시형태에서, 도너 염료 또는 억셉터 염료는 규소-로다민 염료("실릴 로다민"이라고도 지칭됨)일 수 있다. 규소-로다민 염료에 대한 예시적인 구조는 하기 화학식 (IV)를 갖는다:
상기 식에서,
R1''및 R2''는 각각 독립적으로 적어도 하나의 친수성 기 또는 친수성 기 함유 모이어티, 티오에테르 또는 치환된 티오에테르로 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬이거나; R1''와 R2''는 이들이 부착된 규소와 함께 고리를 형성하고;
R3''는 H, -COOH, -SO3Z, -C(O)NRN3RN4이고,
각각의 RN1은 독립적으로 H, C1-C4 알킬, -C(O)R13''이거나, 이것이 부착된 질소 원자와 함께 취해진 RN1은 R5''및/또는 R7''를 갖는 5 내지 7원 헤테로사이클릭 고리를 형성하고, C1-C4 알킬 또는 5 내지 7원 헤테로사이클릭 고리에서 각각의 수소 원자는 독립적으로 하나 이상의 친수성 기 또는 친수성 기 함유 모이어티로 선택적으로 치환되고;
각각의 RN2은 독립적으로 H, C1-C4 알킬, -C(O)R13''이거나, 이것이 부착된 질소 원자와 함께 취해진 RN2은 R6''및/또는 R8''를 갖는 5 내지 7원 헤테로사이클릭 고리를 형성하고, C1-C4 알킬 또는 5 내지 7원 헤테로사이클릭 고리에서 각각의 수소 원자는 독립적으로 하나 이상의 친수성 기 또는 친수성 기 함유 모이어티로 선택적으로 치환되고;
RN3 및 RN4 각각은 독립적으로 H, C1-C6 알킬이거나, 이들이 부착된 질소 원자와 함께 취해진 RN3과 RN4는 5- 내지 7-원 헤테로사이클릭 기를 형성하고, C1-C4 알킬 또는 5 내지 7원 헤테로사이클릭 고리에서 각각의 수소 원자는 독립적으로 하나 이상의 친수성 기 또는 친수성 기 함유 모이어티로 선택적으로 치환되거나, RN3 및 RN4는 독립적으로 링커이고;
R4''는 H, -SO3Z, C1-C6 알킬, 클로로 또는 링커이고;
E는 H, -SO3Z, C1-C6 알킬, 클로로 또는 링커이고;
R5''는 H, C1-C6 알킬이거나, 이것이 부착된 탄소 원자와 함께 취해진 R5''는 RN1과 함께 5 내지 7원 헤테로사이클릭 고리를 형성하고, C1-C4 알킬 또는 5 내지 7원 헤테로사이클릭 고리에서 각각의 수소 원자는 독립적으로 하나 이상의 친수성 기 또는 친수성 기 함유 모이어티로 선택적으로 치환되고;
R6''는 H, C1-C6 알킬이거나, 이것이 부착된 탄소 원자와 함께 취해진, R6''는 RN2와 함께 5 내지 7원 헤테로사이클릭 고리를 형성하고, C1-C4 알킬 또는 5 내지 7원 헤테로사이클릭 고리에서 각각의 수소 원자는 독립적으로 하나 이상의 친수성 기 또는 친수성 기 함유 모이어티로 선택적으로 치환되고;
R7''는 H, C1-C6 알킬이거나, 이것이 부착된 탄소 원자와 함께 취해진 R7''는 RN1과 함께 5 내지 7원 헤테로사이클릭 고리를 형성하고, C1-C4 알킬 또는 5 내지 7원 헤테로사이클릭 고리에서 각각의 수소 원자는 독립적으로 하나 이상의 친수성 기 또는 친수성 기 함유 모이어티로 선택적으로 치환되고;
R8''는 H, C1-C6 알킬이거나, 이것이 부착된 탄소 원자와 함께 취해진 R8''는 RN2과 함께 5 내지 7원 헤테로사이클릭 고리를 형성하고, C1-C4 알킬 또는 5 내지 7원 헤테로사이클릭 고리에서 각각의 수소 원자는 독립적으로 하나 이상의 친수성 기 또는 친수성 기 함유 모이어티로 선택적으로 치환되고;
R9''는 H, -SO3Z, C1-C6 알킬, 클로로 또는 링커이고;
R10''는 - -CF3 또는 -O-CH2-A1이고, A1은 적어도 하나의 R11''로 선택적으로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴이고;
R11''는 C1-C6 알킬 또는 -OR12''이고;
R12''는 H, 메틸, 아세틸 (Ac), 아세톡시메틸 (AM), -PO3M2, -PO3(R14'')2, 또는 글리코시드이고;
R13''는 
이고;
R14''는 아세톡시메틸이고;
R15''는 -OR'이고, R'는 아세틸 (Ac), AM, PO3M2, PO3(R14)2, 또는 글리코시드임.
전형적으로, R1", R2", 또는 R3"는 도너 또는 억셉터 염료에 대한 링커 구조를 포함한다.
일부 실시형태에서, 도너 염료 또는 억셉터 염료는 플루오레세인 또는 이의 유도체일 수 있다. 플루오레세인 염료에 대한 예시적인 구조는 하기 화학식 (V)를 갖는다:
상기 식에서, 개별적으로 취해진 R1 내지 R6은 수소, 플루오린, 염소, 페닐, 저급 알킬, 저급 알켄, 설포네이트 설폰, 아미노, 아미도, 니트릴 저급 알콕시, 연결기 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 함께 취해지는 경우, R1과 R6은 벤조이거나, 함께 취해지는 경우 R4와 R5는 벤조이고; R7은 아세틸렌, 저급 알킬, 시아노, 페닐, 및 헤테로사이클릭 방향족으로 이루어진 군으로부터 선택됨.
일부 실시형태에서, R7은 페닐이고:
개별적으로 취해진 X1 내지 X5는 수소, 염소, 플루오린, 저급 알킬, 카르복실레이트, 설폰산, 또는 연결기로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 독립적으로, X1은 카르복실레이트이고; X2 또는 X3은 연결기이고; X4 및 X5는 염소이다.
본원에 개시된 형광 염료는 보호 형태 또는 비보호 형태로 제공될 수 있다. 다양한 염료(예를 들어, 로다민)뿐만 아니라 이의 비보호 대응물은 폐쇄된 스피로 락톤 형태로 존재할 수 있다. 특정 실시형태에서, 폐쇄된 스피로락톤 형태의 염료가 제공된다. 특정 실시형태에서, 화합물의 개방된 산 형태의 염료가 제공된다. 본원에 개시된 특정 로다민 염료의 개방된 산 형태는 화합물의 폐쇄된 스피로락톤 형태에 비해서 형광일 수 있다(또는 형광 증가를 나타낼 수 있다). 따라서, 본원에서는 또한 탈보호된 개방 락톤 형태의 화합물을 포함하는 형광 화합물 및 형광 표지된 핵산 프로브 및 프라이머가 제공된다.
본원에 기재된 에너지 전달 염료 접합체는 목적하는 여기 및/또는 방출 프로파일에 따라서 도너 염료와 억셉터 염료의 상이한 조합을 포함할 수 있다. ET 접합체에서 사용될 수 있는 염료의 대표적인 부류는 도너 또는 억셉터 염료가 잔텐 염료 (예를 들어, 플루오레세인 또는 로다민), 시아닌 염료, BODIPY 염료, 피렌 염료, 피로닌 염료 또는 쿠마린 염료인 것을 포함하며, 억셉터 염료는 도너 염료보다 더 긴 파장에서 방출하는 화합물이다. 특정 도너-억셉터 염료 조합이 FRET 접합체의 작제에 적합한 것으로 본원에 기재되어 있지만, 명시적으로 기재되지 않은 도너-억셉터 조합의 많은 다른 예가 본원에 개시된 화학을 사용하여 FRET 접합체를 제공하기 위해 구현될 수 있다.
하나의 적합한 조합은 도너 염료(예를 들어, FAM 또는 VIC)로서 플루오레세인 및 억셉터 염료로서 로다민을 포함한다. 다른 적합한 조합은 도너 염료로서 쿠마린(예를 들어, 쿠마린 343, ATTO 425 또는 퍼시픽 블루) 및 억셉터 염료로서 로다민을 포함한다. 또 다른 적합한 조합은 도너 염료로서 플루오레세인 및 억셉터 염료로서 시아닌을 포함한다. 본원에 개시된 ET 접합체에서 억셉터 염료를 사용하기에 적합한 시아닌 염료의 예는 Thermo Fisher Scientific으로부터 상표명 ALEXA FLUOR로 시판되는 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는다(예를 들어, AF-647, AF-680, AF-700, AF-750). 또 다른 적합한 조합에서, 도너 염료는 로다민이고 억셉터 염료는 시아닌 염료이다. 또 다른 적합한 조합에서, 도너 염료는 로다민이고, 억셉터 염료는 도너 염료보다 더 긴 파장에서 방출하는 로다민, 예를 들어 TAMRA 및 ROX, 실릴 로다민 또는 피로닌 염료이다. 일부 실시형태에서, 도너 염료는 시아닌 염료(예를 들어, AF-647)이고 억셉터 염료는 도너보다 더 긴 파장에서 방출하는 화합물, 예컨대, 실릴 로다민 또는 시아닌이다. 일부 실시형태에서, 억셉터 염료는 시아닌 염료이다. 예를 들어, 도너 염료는 FAM일 수 있고 억셉터 염료는 본원에 기재된 바와 같은 치환체를 갖는 시아닌 염료일 수 있다. 일부 실시형태에서, 억셉터 염료는 본원에 기재된 바와 같이 NH-로다민이다. 예를 들어, 도너 염료는 FAM일 수 있고 억셉터 염료는 NH-로다민일 수 있다. 본원에 기재된 ET 염료 접합체에서 이용될 수 있는 도너-억셉터 염료 쌍의 추가 예는 표 3에 열거되어 있다.
일부 실시형태에서, 도너 염료 또는 억셉터 염료는 본원에 기재된 염료 구조에 나타낸 임의의 위치에서 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 친수성 기를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 도너 염료 또는 억셉터 염료는 본원에 기재된 염료 구조에 나타낸 임의의 위치에서 본원에 기재된 바와 같은 친수성 기 함유 모이어티 중 하나 이상을 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 각각의 염료는 다중 설포네이트 기를 포함하는 구조를 가질 수 있다. 설포네이트 기는 수성 매질에서 염료 화합물의 용해도를 개선시키는 것으로 당업계에 알려져 있다. 일부 실시형태에서, 염료는 염료를 다른 물질에 연결하기 위한 하나 이상의 반응성 작용기 또는 보호된 반응성 작용기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 염료는 당업계에 알려진 바와 같이 자동 핵산 합성 동안 올리고뉴클레오티드와 같은 분자에 염료를 접합시키는 데 사용될 수 있는 포스포르아미다이트 유도체로서 제공된다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 수-가용화 기, 친수성 기, 염료 및 ET 염료는 전체 전자 전하를 갖는다. 그러한 전자 전하가 존재하는 것으로 나타나면 명시적으로 확인되거나 확인되지 않을 수 있는 적절한 반대 이온의 존재에 의해 균형을 이룬다는 것을 이해해야 한다. 본원에 기재된 수-가용화 기, 친수성 기, 염료 또는 ET 염료가 양전하인 경우, 반대이온은 전형적으로 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 설페이트, 알칸설포네이트, 아릴설포네이트, 포스페이트, 퍼클로레이트, 테트라플루오로보레이트, 테트라아릴보라이드, 니트레이트 및 방향족 또는 지방족 카르복실산의 음이온으로부터 선택되지만 이에 제한되지 않는 음전하 모이어티이다. 본원에 기재된 수-가용화 기, 친수성 기, 염료 또는 ET 염료가 음전하인 경우, 반대이온은 전형적으로 비제한적으로 알칼리 금속 이온, 예컨대, Li+, Na+, K+ 등, 암모늄 또는 치환된 암모늄, 예컨대, NMe4 +, Pr2NHEt+ 등 또는 피리디늄 이온으로부터 선택된 양전하 모이어티이다. 일부 실시형태에서, 반대이온은 생물학적으로 상용성이고, 사용 시 독성이 없으며, 생체분자에 실질적으로 유해한 영향을 미치지 않는다. 반대이온은 이온 교환 크로마토그래피 또는 선택적 침전과 같은 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 쉽게 변경된다.
본원에 개시된 바와 같은 염료는 하나 또는 또 다른 특정 전자 공명 구조로 도시되었음을 이해해야 한다. 상기에 논의된 모든 양태는 대상 염료의 전자 전하가 염료 자체 전체에서 비편재화되기 때문에 다른 허용된 공명 구조로 형식적으로 도시된 염료에도 동일하게 적용된다.
링커
일부 실시형태에서, 에너지 전달 염료 접합체는 도너 염료를 억셉터 염료에 공유 부착시키는 링커를 포함한다.
링커의 아이덴티티는 서로 연결된 염료의 아이덴티티에 부분적으로 의존할 것이다. 일반적으로, 링커는 포스파이트 트리에스테르 방법에 의해 올리고뉴클레오티드를 합성하는 데 일반적으로 사용되는 조건과 같은 표지된 생체분자, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드의 합성에 사용되는 합성 조건에 안정한 원자 또는 작용기의 거의 임의의 조합을 포함할 수 있는 간격(spacing) 기를 포함하며, 선형, 분지형 또는 사이클릭 구조일 수 있거나 선형, 분지형 및/또는 사이클릭 구조의 조합을 포함할 수 있다. 간격 기는 본질적으로 단량체성일 수 있거나, 본질적으로 중합체성인 영역일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 간격 기는 특정 조건 하에서 절단될 수 있는 능력, 또는 특정 정도의 강성, 유연성, 소수성 및/또는 친수성과 같은 특정 특성을 갖도록 설계될 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 ET 접합체를 제조하는 데 사용될 수 있는 링커의 대표적인 예는 알킬 부분, 아미노-알킬렌 부분 및 옥시-알킬렌 부분, 및 아미노-알킬렌-디알콕시 부분, 알케닐렌 부분, 알키닐렌 부분, 폴리에테르 부분, 아릴렌 부분, 아미드 부분, 또는 포스포디에스테르 부분 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 대안적으로, 링커는 공유 결합일 수 있다.
도 4는 링커를 통해 억셉터 염료에 결합된 도너 염료를 포함하는 대표적인 유형의 에너지 전달 염료 접합체를 나타낸다. 예를 들어, 도너 염료는 L1 또는 L2와 같은 링커를 통해 억셉터 염료에 결합될 수 있다. 특정 실시형태에서, 염료 접합체는 분석물에 대한 도너 또는 억셉터 염료(예를 들어, D1)에 부착하는 링커(예를 들어, L3)를 포함하고 억셉터 또는 도너 염료(D2)에 부착하기 위한 추가 링커(예를 들어, L4)를 추가로 포함한다. 본원에 기재된 바와 같은 에너지 전달 접합체에 사용될 수 있는 도너 및 억셉터 염료의 예는 잔텐, 시아닌, 로다민, BODIPY, 피렌, 피로닌 및 쿠마린 염료를 포함한다.
일부 실시형태에서, 링커는 하기 구조 중 하나를 갖는다:
상기 식에서, L1은 제1 링커이고, L1은 공유 결합을 통해 또는 하나 이상의 개재 원자를 포함하는 스페이서를 통해 D1, D2 및 A에 부착되어 있고;
L2는 제2 링커이고, L2는 공유 결합을 통해 또는 하나 이상의 개재 원자를 포함하는 스페이서를 통해 D2 및 D3 각각에 부착되어 있고;
L3은 제3 링커이고, L3은 공유 결합을 통해 또는 하나 이상의 개재 원자를 포함하는 스페이서를 통해 각각의 PO4H 및 D1에 부착되어 있고;
L4는 제4 링커이고, L4는 공유 결합을 통해 또는 하나 이상의 개재 원자를 포함하는 스페이서를 통해 PO4H 및 D2에 부착되어 있고;
A는 분석물이고;
D1, D2, 및 D3 각각은 상호 교환 가능하게 도너 염료 또는 억셉터 염료이고, LI 및 LIII에서 D1과 D2의 조합 및 LII에서 D2와 D3은 에너지 전달 염료 쌍을 형성한다.
특정 실시형태에서, L1 링커는 화학식의 아릴렌 부분을 포함한다:
각각의 R1은 독립적으로 -C1-C10 알킬-N(R3)-*, -C2-C10 알케닐- N(R3)-*, -C2-C10 알키닐- N(R3)-*, -OC1-C10 알킬-*, -C1-C10 알킬-O-*, -N(R3)C1-C6 알킬-*, -N(R3)C1-C6 알킬-O-*, -OC1-C6 알킬-N(R3)-*; 또는 -N(R3)-*이고;
각각의 R2는 독립적으로 -C(O)N(R4), -C1-C10 알킬-C(O)N(R4), -C2-C10 알케닐- C(O)N(R4), -C2-C10 알키닐-R4, -C(O)N(R4), - N(R3)-C(O)N(R4), C1-C6 알킬-O-C(O)N(R4), -OC1-C6 알킬-C(O)N(R4), -N(R4), 할로겐, -CO2 -Z+, -SO3R4, 또는 -SO3 -Z+이고;
각각의 R3은 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이고;
각각의 R4는 독립적으로 H, C1-C6 알킬 또는 A에 대한 부착점이고, A에 대한 부착은 공유 결합 또는 하나 이상의 개재 원자를 포함하는 스페이서를 통해서 이루어지고;
각각의 *는 D1 또는 D2에 대한 부착점을 나타내고, D1 또는 D2에 대한 부착은 공유 결합 또는 하나 이상의 개재 원자를 포함하는 스페이서를 통해서 이루어지고;
Z+는 양이온(들)(예를 들어, Na+, K+, 또는 NH4 +)이고;
n은 2, 3 또는 4이고; m은 0, 1, 2, 3, 또는 4이되, 단 n + m = 3 내지 6임.
일부 실시형태에서, L1 링커는 아릴렌 부분, 및 비스-알킬아미노 부분 또는 비스-카르복시아미딜 부분 중 하나 이상을 포함하고, L1 링커는 A에 대한 부착점을 추가로 포함하고, A에 대한 부착은 공유 결합 또는 하나 이상의 개재 원자를 포함하는 스페이서를 통해서 이루어짐.
L2 링커는 하기 화학식의 아릴렌 부분을 포함할 수 있다:
상기 식에서, 각각의 R1은 독립적으로 -C1-C10 알킬-N(R3)-*, -C2-C10 알케닐- N(R3)-*, -C2-C10 알키닐-N(R3)-*, -OC1-C10 알킬-*, -C1-C10 알킬-O-*, -N(R3)C1-C6 알킬*-, -N(R3)C1-C6 알킬-O-*, -OC1-C6 알킬-N(R3)-*; 또는 -N(R3)-*이고;
각각의 R2는 독립적으로 -C(O)N(R3)-*, -C1-C10 알킬-C(O)N(R3)-*, -C2-C10 알케닐- C(O)N(R3)-*, -C2-C10 알키닐-(R3)-*, -C(O)N(R3)-*, -N(R3)-C(O)N(R3)-*, C1-C6 알킬-O-C(O)N(R3)-*, -OC1-C6 알킬-C(O)N(R3)-*, -N(R3)-*, 할로겐, -CO2 -Z+ 또는 -SO3 -Z+이고;
각각의 R3은 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이고;
각각의 *는 D2 또는 D3에 대한 부착점을 나타내고, D2 또는 D3에 대한 부착은 공유 결합 또는 하나 이상의 개재 원자를 포함하는 스페이서를 통해서 이루어지고;
Z+는 양이온(들)(예를 들어, Na+, K+, 또는 NH4 +)이고;
n은 2, 3 또는 4이고; m은 0, 1, 2, 3, 또는 4이되, 단 n + m = 2 내지 6임.
특정 실시형태에서, 링커는 화학식의 단편을 포함한다:
상기 식에서, 각각의 R2, m 및 *는 상기에 정의된 바와 같음.
L3 링커는 하기 화학식의 단편을 포함할 수 있다:
상기 식에서, R5는 H 또는 C1-C6 알킬이고;
n은 2, 3 또는 4이고; X는 O 또는 CH2이고;
L4는 D2에 대한 부착이고, L4는 공유 결합 또는 하나 이상의 개재 원자를 포함하는 스페이서이고;
R7은 PO3H-A에 대한 부착점이고, PO3H-A에 대한 부착은 공유 결합 또는 하나 이상의 개재 원자를 포함하는 스페이서를 통해서 이루어지고;
*는 D1에 대한 부착점을 나타내고, D1에 대한 부착은 공유 결합 또는 하나 이상의 개재 원자를 포함하는 스페이서를 통해서 이루어짐.
상기에 도시된 에너지 전달 염료 접합체에서, L4 링커는 하기 화학식의 포스포디에스테르 부분을 포함할 수 있다:
상기 식에서, Y는 알콕시 부분, 알킬 부분, 아릴렌 부분, 또는 올리고뉴클레오티드 부분 중 하나 이상을 포함하고;
p는 0 내지 10의 정수이고;
D2 또는 A는 산소 원자를 포함하고, 각각의 *는 D2 또는 A에서 산소 원자에 대한 포스포디에스테르 부분의 부착점을 나타내고, D2 또는 A에서 산소 원자에 대한 포스포디에스테르의 부착은 공유 결합 또는 하나 이상의 개재 원자를 포함하는 스페이서를 통해서 이루어짐.
특정 실시형태에서, Y는 C1-C10 알킬 또는 폴리(알킬렌 글리콜)이다.
특정 실시형태에서, L3과 L4 링커의 조합은 하기 화학식을 갖는 구조를 포함할 수 있다:
상기 식에서,
R7은 A에 부착된 포스포디에스테르 기를 포함하고, 포스포디에스테르 기는 포스포디에스테르 부분, 알콕시 부분, 아미노-알킬 부분, 알콕시 부분, 알킬 부분, 폴리에테르 부분, 또는 아릴렌 부분 중 하나 이상에 부착되고,
PAG는 폴리(알킬렌 글리콜)이고, 폴리(알킬렌 글리콜)은 C2-C6 선형 또는 분지형 알킬렌 쇄이거나 이를 포함하고; n은 2 내지 6이고; p는 1 내지 4임.
일부 실시형태에서, PAG는 펜타에틸렌 글리콜이다.
상기에 기재된 임의의 링커 구조에서, 분석물(A)은 예를 들어, 핵산 분자, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 및 탄수화물과 같은 생물학적 분자일 수 있다.
본원에서 제공되는 상이한 링커 구조는 각각 특정 이점을 가지며, 적절한 링커 설계의 선택은 ET 접합체를 형성하는 데 사용되는 특정 염료뿐만 아니라 ET 접합체에 커플링될 분석물의 유형에 따라 달라진다. 링커 L1("Y-링커"라고도 함)은 특히 매우 다양한 잠재적 도너 및 억셉터 염료와 조합하여 사용될 수 있는데, 그 이유는 L1이 링커 L2를 사용하는 경우 필요한 분석물 및 이의 ET 파트너에 대한 링크를 형성하기 위해 이중 작용기 함유 염료의 사용을 필요로 하지 않기 때문이다. 링커 L1은 염료가 제2 작용기를 가질 필요가 없기 때문에 염료 NHS 에스테르 쌍은 Y-링커와 함께 연결될 수 있다. Y-링커 구조의 다재성(versatility)은 상이한 도너 및 억셉터 염료의 사용을 보편화하여 상이한 도너-억셉터 쌍 접합체의 방대한 어레이 구성을 용이하게 한다.
링커 L1의 또 다른 이점은 이 링커가 ET 접합체의 구성 후에 프로브 또는 분석물에 부착될 수 있는 제3 작용기를 포함한다는 점이다. 그 결과 ET 접합체는 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 분석물에 첨가하기 전에 제조 및 정제될 수 있다. 프로브 부착 이전의 정제는 L2 링커로도 가능하지만(링커 L3으로는 가능하지 않음), 프로브 부착 이전의 ET 접합체의 정제는 최종 생성물에 대해 수율 및 순도를 크게 향상시킬 수 있다. 그러나, D1 및 D2에 대한 직교 반응성 연결 부위를 갖는 L2 링커는 추가적인 선택적 보호기 유도체화를 사용하지 않고 L1을 사용하여 생성되는 위치이성질체의 형성을 배제한다.
링커 L3은 자동 커플링 화학을 사용하여 ET 접합체를 제조하는 데 쉽게 사용될 수 있다. 그러나 모든 실제적인 목적을 위해, 링커 L3은 적어도 하나의 염료 포스포르아미다이트 결합 단계가 필요하다. 따라서, 링커 L3을 사용한 도너 및 억셉터 염료의 커플링은 적어도 1개의 염료, 바람직하게는 두 염료가 포스포르아미다이트 기로 유도체화될 것을 요구한다. 모든 염료 분자가 쉽게 포스포르아미다이트 유도체로 만들어질 수 있는 것은 아니다. 따라서 링커 L3은 L1에 비해 덜 다재성이다. 보호된 포스포르아미다이트 링커 유도체를 사용하여 염료를 첨가하기 전에 먼저 링커 L3 및 L4를 고체 지지체에 부착하는 것이 가능하지만, 염료는 선택적 탈보호 화학 및 NHS 커플링 화학을 사용하여 2개의 2차 커플링 단계에서 지지체 상의 링커에 별도로 첨가되어야 한다. 이러한 다단계 합성 계획은 ET 접합체의 합성에서 적어도 1개의 염료 포스포르아미다이트를 사용하여 달성할 수 있는 자동화의 이점(예를 들어, 더 적은 수의 단계 및 노동으로 높은 수율 및 순도)을 무효화한다.
에너지 전달 염료의 접합체
일 양태에서, 본 개시내용은 분석물에 공유 부착된 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 에너지 전달 염료를 포함하는 에너지 전달 염료 접합체를 제공한다. 예를 들어, 분석물은 직접 또는 선택적 링커를 통한 올리고뉴클레오티드 프로브일 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 에너지 전달 염료 접합체는 직접적으로 또는 선택적 링커를 통해 소광제 염료(Q)에 추가로 공유 부착될 수 있다. 일부 실시형태에서, 소광제 염료(Q)는 본 개시내용의 에너지 전달 염료 접합체의 올리고뉴클레오티드 부분에 공유 부착된다.
일부 실시형태에서, 에너지 전달 염료 접합체와 분석물 또는 접합될 물질을 형성하기 위한 도너 염료와 억셉터 염료 사이의 접합 반응은 상보적인 Z 및 ZR 기를 통해 도너 및 억셉터 염료 및 접합된 분석물을 부착하는 새로운 연결을 생성한다. 상보적인 반응성 기 및 연결의 적합한 예는 하기 표 1에 나타나 있으며, 여기서 친전자성 기와 친핵성 기의 반응은 공유 결합을 생성한다.
[표 1]
공유 결합은 직접적으로 또는 선택적인 링커 부분을 통해 본원에 기재된 바와 같은 에너지 전달 염료를 형성하기 위해 반응성 기 Z에 결합한다. 분석물, 예컨대, 올리고뉴클레오티드 프로브에 에너지 전달 염료 접합체를 공유 부착하는 선택적인 링커 부분은 구조에 의해 특별히 제한되지 않는다는 것이 이해될 것이다. 선택적인 링커 부분은 단일, 이중, 삼중 또는 방향족 탄소-탄소 결합뿐만 아니라 탄소-질소 결합, 질소-질소 결합, 탄소-산소 결합, 인-산소 결합을 선택적으로 포함하는 안정한 화학 결합의 조합일 수 있다. 선택적인 링커 부분은 에테르, 티오에테르, 카르복사미드, 설폰아미드, 우레아, 우레탄 또는 히드라진 모이어티와 같은 작용성 모이어티를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 선택적인 링커 부분은 C, N, O, P 및 S로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 20개의 비-수소 원자를 포함할 수 있고 에테르, 티오에테르, 아민, 카르복사미드, 설폰아미드, 히드라지드 결합 및 방향족 또는 헤테로방향족 결합의 임의의 조합으로 구성된다. 일부 실시형태에서, 선택적인 링커 부분은 단일 탄소-탄소 결합과 카르복사미드 또는 티오에테르 결합의 조합일 수 있다.
일부 실시형태에서, 에너지 전달 염료 접합체는 에너지 전달 염료의 링커 부분을 통해 올리고뉴클레오티드 프로브와 같은 분석물에 공유 결합된다. 일부 실시형태에서, 에너지 전달 염료 접합체는 분석물에 에너지 전달 염료 링커 부분을 연결하는 추가 링커에 의해 에너지 전달 염료 접합체의 링커 부분을 통해 분석물, 예컨대, 올리고뉴클레오티드 프로브에 공유 부착된다. 일부 실시형태에서, 에너지 전달 염료 접합체는 추가 링커를 통해 분석물을 도너 염료 또는 억셉터 염료에 부착함으로써 분석물, 예컨대, 올리고뉴클레오티드 프로브에 공유 부착된다. 일부 실시형태에서, 에너지 전달 염료 접합체는 도너 염료 또는 억셉터 염료에 대한 분석물의 부착에 의해 분석물, 예컨대, 올리고뉴클레오티드 프로브에 공유 결합된다.
일부 실시형태에서, 에너지 전달 염료 접합체는 분석물 상의 반응성 작용기에 대한 공유 결합으로, 분석물, 예컨대, 올리고뉴클레오티드 프로브에 공유 부착된다.
분석물에 대한 에너지 전달 염료 접합체의 부착에 사용되는 반응성 기의 선택은 접합될 분석물에 존재하는 작용기 및/또는 목적하는 공유 연결의 유형 또는 길이의 함수일 수 있음을 이해할 것이다.
ET 염료를 분석물에 접합시키기 위한 반응기는 당업자에게 널리 알려져 있다. 전형적으로, 반응성 기는 아민, 티올, 알코올, 알데히드 또는 케톤과 반응할 것이다. 일부 실시형태에서, 반응성 기는 아민 또는 티올 작용기와 반응한다. 일부 실시형태에서, 반응성 기는 아크릴아미드, 반응성 아민(카다베린 또는 에틸렌디아민 포함), 카르복실산의 활성화된 에스테르(전형적으로 카르복실산의 석신이미딜 에스테르), 아실 아지드, 아실 니트릴, 알데히드, 알킬 할라이드, 무수물, 아닐린, 아릴 할라이드, 아지드, 아지리딘, 보로네이트, 카르복실산, 디아조알칸, 할로아세트아미드, 할로트리아진, 히드라진(히드라지드 포함), 이미도 에스테르, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 말레이미드, 포스포르아미다이트, 설포닐 할라이드 또는 티올 기이다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 ET 접합체는 핵산 염기, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 또는 에너지 전달 염료 접합체의 부착을 위한 추가 링커 또는 스페이서를 갖도록 변형된 것, 예컨대, 알키닐 연결, 아미노알릴 연결, 또는 헤테로원자-치환된 링커, 또는 기타 연결을 포함하는 핵산 중합체에 부착될 수 있다.
일부 실시형태에서, 에너지 전달 염료 접합체 상의 링커 부분을 통해 또는 도너 염료 또는 억셉터 염료를 통해 에너지 전달 염료 접합체를 분석물과 연결하는 추가 링커 부분은 알킬 부분, 아미노-알킬렌 부분, 및 알콕시 부분, 및 아미노-알킬렌-디알콕시 부분, 알케닐렌 부분, 알키닐렌 부분, 폴리에테르 부분, 아미드 부분 또는 아릴렌 부분 중 하나 이상을 포함한다.
적절한 작용기를 갖는 임의의 도너 염료 및 억셉터 염료가 본원에 개시된 링커에 부착될 수 있다. 그러나, 특정 실시형태에서, 링커가 알킬 부분, 폴리에테르 부분 및 포스포디에스테르 부분을 포함하는 경우 에너지 전달 염료 접합체는 로다민 염료에 공유 결합된 플루오레세인 염료를 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 추가 링커 부분은 치환된 또는 비치환된 폴리메틸렌, 아릴렌, 알킬아릴렌, 아릴렌알킬 또는 아릴티오이다. 일부 실시형태에서, 추가 링커 부분은 하기 화학식의 단편을 포함한다:
상기 식에서,
R6은 H 또는 C1-C6 알킬이고;
각각의 *는 올리고뉴클레오티드 및 에너지 전달 염료 접합체의 나머지 부분에 대한 추가 링커 부분의 부착점을 나타낸다.
일부 실시형태에서, 추가 링커 부분은 화학식 -(CH2)d(CONH(CH2)e)z'-, -(CH2)d(CON(CH2)4NH(CH2)e)z′-, -(CH2)d(CONH(CH2)eNH2)z′-, 또는 -(CH2)d(CONH(CH2)eNHCO)z′-의 단편을 포함하고, 식에서 d는 0 내지 5이고, e는 1 내지 5이고, z′는 0 또는 1이다.
또 다른 실시형태에서, 분석물의 접합 지점은 퓨린 또는 피리미딘 염기를 비(non)사이클릭 스페이서를 통해 포스페이트 또는 폴리포스페이트 모이어티에 연결하는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체일 수 있다.
일부 실시형태에서, 에너지 전달 염료 접합체는 히드록실 기, 티올 또는 아미노 기를 통하는 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드의 탄수화물 부분에 추가로 접합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 접합된 뉴클레오티드는 뉴클레오시드 트리포스페이트 또는 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트 또는 디데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트이다. 메틸렌 모이어티 또는 질소 또는 황 헤테로원자를 포스페이트 또는 폴리포스페이트 모이어티에 혼입시키는 것이 또한 유용할 수 있음이 이해될 것이다. 퓨린 및 피리미딘 비자연 염기, 예컨대 7-데아자퓨린 및 이러한 염기를 함유하는 핵산이 또한 본원에 기재된 바와 같은 에너지 전달 염료 접합체에 커플링될 수 있다. 탈퓨린화된 핵산(예를 들어, 리보스 유도체)과 아민, 히드라지드 또는 히드록실아민 유도체의 반응에 의해 제조된 핵산 부가물은 핵산을 표지하고 검출하는 추가 수단을 제공한다.
일부 실시형태에서, 표지된 핵산 중합체 접합체는 단일-, 이중- 또는 다중-가닥, 자연 또는 합성 DNA 또는 RNA, DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드, 또는 DNA/RNA 혼성체를 포함하거나, 링커, 예컨대, 모르폴린 유도체화 포스페이트(AntiVirals, Inc., 미국 오레곤주 코발리스 소재) 또는 N-(2-아미노에틸)글리신 단위를 포함한다. 핵산이 합성 올리고뉴클레오티드, 예컨대, 올리고뉴클레오티드 프로브인 경우, 올리고뉴클레오티드는 약 5 내지 약 50개의 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드는 약 5 내지 약 25개의 뉴클레오티드를 함유한다. 일부 실시형태에서, 펩티드 핵산(PNA)의 에너지 전달 염료 접합체가 제공된다. 이러한 펩티드 핵산의 에너지 전달 염료 접합체는 일반적으로 더 빠른 혼성화 속도로 인해 일부 응용 분야에 유용할 수 있음이 이해될 것이다.
일부 실시형태에서, 형광 핵산 중합체는 올리고뉴클레오티드-프라이밍된 DNA 중합을 사용하여, 예를 들어, 중합효소 연쇄 반응을 사용하거나, 프라이머 연장을 통해, 또는 핵산 중합체의 3'-단부에 대한 표지된 뉴클레오티드의 말단-트랜스퍼라제 촉매 첨가에 의해 표지된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드로부터 제조될 수 있다. 일부 실시형태에서, 형광 RNA 중합체는 전형적으로 전사에 의해 표지된 뉴클레오티드로부터 제조된다. 일부 실시형태에서, 에너지 전달 염료 접합체는 아미드, 에스테르, 에테르 또는 티오에테르 결합을 통해 하나 이상의 퓨린 또는 피리미딘 염기를 통해 부착되거나; 또는 에스테르, 티오에스테르, 아미드, 에테르 또는 티오에테르인 결합에 의해 포스페이트 또는 탄수화물에 부착된다. 일부 실시형태에서, 에너지 전달 염료 접합체는 합텐, 예컨대, 비오틴 또는 디곡시게닌으로, 또는 효소, 예컨대, 알칼리 포스파타제에 대해 또는 단백질, 예컨대, 항체에 대해 동시에 표지될 수 있다. 일부 실시형태에서, 에너지 전이 염료 뉴클레오티드 접합체는 DNA 중합효소에 의해 혼입될 수 있고 동소 혼성화 및 핵산 시퀀싱에 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 생물학적 중합체, 예컨대, 올리고뉴클레오티드 및 핵산 중합체는 적어도 1개의 에너지 전달 염료 접합체로 표지되어 에너지 전달 프로브를 형성한다. 도 5를 참조하면, 올리고뉴클레오티드(1050)에 부착된 ET 접합체(1010)를 포함하는 올리고뉴클레오티드 프로브(1000)가 도시되며, 여기서 ET 접합체(1010)는 링커(1030)를 통해 억셉터 염료(1040)에 부착된 도너 염료(1020)를 포함한다. 적절한 파장의 광에서 도너 염로(1020)의 여기는 흡수된 에너지를 억셉터 염료(1040)로 전달하고 이어서 다른 파장에서 억셉터 염료에 의한 광의 방출을 초래한다. 접합체 내의 도너 염료 및 억셉터 염료의 물리적 및 광학적 특성에 따라, 링커(1030)의 구조 및 조성(이전에 기술된 L1, L2 및 L3과 관련하여)은 에너지 전달 효율, 양자 수율 및 형광 강도를 최대화하기 위해 고유하게 조정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 생물학적 중합체, 예컨대, 올리고뉴클레오티드 및 핵산 중합체는 적어도 1개의 에너지 전달 염료 접합체 및 적어도 1개의 비-형광 염료로 표지되어 에너지 전달 프로브를 형성한다. 일부 실시형태에서, 비-형광 염료는 소광제이다. 도 6은 도 5에 도시된 바와 같이 ET 접합체(1000)에 결합된 올리고뉴클레오티드 프로브를 도시하며, 여기서 올리고뉴클레오티드(1050)가 소광제 분자 (1060)에 추가로 결합되어 있다. 올리고뉴클레오티드 프로브는 예를 들어, "검출기 프로브"로 지칭될 수 있는 TaqMan 검정에서 사용될 수 있다. 소광제가 ET 접합체(1010)에서 억셉터 염료(1040)에 근접할 때, 적절한 파장의 빛에서 도너 염료(1020)의 여기는 흡수된 에너지(ET1이라고 함)를 억셉터 염료(1040)로 전달하여 억셉터 염료(1040)로부터의 형광 신호의 억제(즉, 소광)를 초래한다.
일부 실시형태에서, 표지된 프로브는 효소 기질로서 기능하고, 효소적 가수분해는 에너지 전달 염료 접합체와 소광제 사이의 에너지 전달을 방해한다. 일부 실시형태에서, 핵산 중합효소의 5'에서 3'의 뉴클레아제 활성은 올리고뉴클레오티드를 절단하여 에너지 전달 염료 접합체 및 소광제를 그들의 근접 위치로부터 방출함으로써 소광제에 의한 에너지 전달 염료 접합체에 의해서 생성된 형광에 대한 소광 효과(ET2라고 함)를 제거하거나 실질적으로 제거한다. 도 7은 올리고뉴클레오티드(1050)의 프로브 변위 및 절단(예를 들어, 중합효소에 의함) 후 도 6에 도시된 올리고뉴클레오티드 프로브를 도시한다. 소광제(1060)가 변위되고 더 이상 ET 접합체(1010)의 억셉터 염료(1040)에 근접하지 않으면, 이전에 의해 억제되었던 억셉터 염료(1040)로부터의 형광 신호가 소광제(1060)가 회복된다.
일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드는 제1 리포터 모이어티에 공유 부착되며, 여기서 리포터 모이어티는 ET 염료 접합체이다. 일부 실시형태에서, ET 염료 접합체는 제1 도너 염료 및 제1 억셉터 염료를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 도너 염료는 제1 형광단이고 억셉터 염료는 제2 형광단이다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드는 제1 형광단, 제2 형광단 및 제1 소광제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 형광단 및 제2 형광단은 본원에 기재된 임의의 링커에 의해 공유 결합된다. 일부 실시형태에서, 제1 형광단과 제2 형광단은 상이하다. 일부 실시형태에서, 제1 도너 염료 및 제1 억셉터 염료를 포함하는 리포터 모이어티는 올리고뉴클레오티드의 한 말단에 위치하고 제1 소광제 모이어티는 반대편 말단에 위치한다. 일부 실시형태에서, 리포터 모이어티는 올리고뉴클레오티드의 한 말단으로부터 약 5개의 뉴클레오티드 내에 위치하고 제1 소광제 모이어티는 올리고뉴클레오티드의 반대편 말단으로부터 5개의 뉴클레오티드 내에 위치한다. 일부 실시형태에서, 리포터 모이어티는 5'-단부로부터 5개의 뉴클레오티드에 또는 그 내에 위치하고, 소광제 모이어티는 올리고뉴클레오티드의 3'-단부로부터 5개의 뉴클레오티드에 또는 그 내에 위치한다. 일부 실시형태에서, 리포터 모이어티는 3'-단부로부터 5개의 뉴클레오티드에 또는 그 내에 위치하고, 소광제 모이어티는 올리고뉴클레오티드의 5'-단부로부터 5개의 뉴클레오티드에 또는 그 내에 위치한다.
소광제
일부 실시형태에서, 소광제는 방향족 또는 헤테로방향족 소광 모이어티 Q에 의해 하나 이상의 아미노 질소 원자에서 치환된 3- 및/또는 6-아미노 잔텐의 유도체이다. 일부 실시형태에서, 소광제는 Dabcyl의 유도체이다. 일부 실시형태에서, 소광제는 Dabcyl이다. 일부 실시형태에서, 소광제는 하기 화학식 (Q1)이다:
일부 실시형태에서, 기재된 소광 화합물은 전형적으로 530 nm 초과의 최대 흡수를 갖고, 관찰 가능한 형광이 거의 또는 전혀 없으며, 본원에 개시된 바와 같은 형광단에 의해 방출되는 것과 같은 광범위한 형광 스펙트럼을 효율적으로 소광한다. 일부 실시형태에서, 소광 화합물은 치환된 로다민이다. 또 다른 실시형태에서, 소광 화합물은 치환된 로돌이다. 또 다른 실시형태에서, 소광제는 화학적 반응성 화합물이다. 화학적 반응성 소광 화합물은 생체분자, 예컨대, 핵산을 포함하여 다양한 물질을 표지하는 데 유용하다. 이러한 표지 물질은 특히 형광단과 조합하여 사용할 때 다양한 에너지 전달 검정 및 응용 분야에 매우 유용하다.
본원에서 사용된, 각각의 소광 모이어티 Q는 단일 공유 결합에 의해 아미노 질소에 부착된 1 내지 4개의 융합된 방향족 또는 헤테로방향족 고리를 갖는 방향족 또는 헤테로방향족 고리 시스템이다. Q 모이어티가 완전히 방향족이고 헤테로원자를 포함하지 않는 경우, Q는 1 내지 4개의 융합된 6원 방향족 고리를 포함한다. Q 모이어티가 헤테로방향족인 경우, Q는 O, N 및 S로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1개 및 최대 4개의 헤테로원자를 임의의 조합으로 함유하는 적어도 하나의 5- 또는 6-원 방향족 헤테로사이클을 혼입하며, 이것은 추가의 6-원 방향족 고리에 선택적으로 융합되거나, O, N 및 S로 이루어진 군으로부터 선택된 헤테로원자를 임의의 조합으로 적어도 1개 내지 최대 3개 함유하는 하나의 5-원 또는 6-원 헤테로방향족 고리에 융합된다.
일부 실시형태에서, 각각의 Q 모이어티는 단일 공유 결합을 통해 3- 또는 6-아미노 질소 원자에서 잔텐 화합물에 결합된다. 일부 실시형태에서, 아미노 질소 치환체는 조합으로 취해져서 피페리딘, 모르폴린, 피롤리딘, 피라진 또는 피페라진인 5- 또는 6-원 헤테로사이클을 형성하고, Q 모이어티는 단일 결합을 통해 아미노 질소에 형식적으로 결합되도록 잔텐 질소에 인접한 생성된 헤테로사이클에 융합된다. Q 모이어티는 방향족 또는 헤테로방향족 고리에서 아미노 질소 원자에 결합될 수 있되, 단 이것은 해당 고리의 탄소 원자에 부착되어 있다.
전형적으로, Q 모이어티는 치환된 또는 비치환된 페닐, 나프틸, 안트라세닐, 벤조티아졸, 벤즈옥사졸 또는 벤즈이미다졸이다. 아미노 질소 치환체가 5- 또는 6-원 헤테로사이클을 형성하고 Q 모이어티가 생성된 헤테로사이클에 융합되는 경우, 헤테로사이클은 전형적으로 피롤리딘 고리이고 Q 모이어티는 전형적으로 융합된 6-원 방향족 고리이다. 일부 실시형태에서, Q는 페닐 또는 치환된 페닐이다.
다양한 실시형태에서, 각각의 Q 모이어티는 선택적으로 그리고 독립적으로 수소, 할로겐, 시아노, 설포, 설포의 알칼리 또는 암모늄 염, 카르복시, 카르복시의 알칼리 또는 암모늄 염, 니트로, 알킬, 퍼플루오로알킬, 알콕시, 알킬티오, 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노 또는 알킬아미도에 의해서 치환된다.
다양한 실시형태에서, 소광 화합물은 하기 화학식 (Q2)를 갖는다:
상기 식에서, K 모이어티는 O 또는 N+R18aR19a임.
본원에 기재된 소광 화합물의 다양한 실시형태에서, R8a, R9a, R18a, 및 R19a 중 적어도 하나는 Q 모이어티이다. 대안적으로, R9a와 조합하여 취해진 R8a 또는 R19a와 조합하여 취해진 R18a는 피페리딘 또는 Q 모이어티에 융합된 피롤리딘인 포화된 5- 또는 6-원 헤테로사이클을 형성한다. 전형적으로 R8a 및 R9a 중 하나 및 R18a 및 R19a 중 하나는 각각 동일하거나 상이한 Q 모이어티이다. 또 다른 실시형태에서, R8a, R9a, R18a 및 R19a 각각은 동일하거나 상이할 수 있는 Q 모이어티이다.
R8a, R9a, R18a, 및 R19a 중 나머지는 독립적으로 H, C1-C6 알킬, C1-C6 카르복시알킬, C1-C6 설포알킬, C1-C6 카르복시알킬의 염 또는 C1-C6 설포알킬의 염이고, 여기서 알킬 부분은 아미노, 히드록시, 카르복실산, 카르복실산의 염 또는 C1-C6 알킬의 카르복실산 에스테르에 의해 선택적으로 치환된다. 대안적으로, R9a와 조합된 R8a 또는 R19a와 조합된 R18a 또는 둘 다는 메틸, 설폰산, 설폰산의 염, 카르복실산, 카르복실산의 염, 또는 C1-C6의 카르복실산 에스테르로 선택적으로 치환된 피페리딘, 모르폴린, 피롤리딘, 피라진 또는 피페라진인 포화 5-원 또는 6-원 헤테로사이클릭 고리를 형성한다. 대안적으로, R2a와 조합된 R8a, R3a와 조합된 R9a 또는 R4a와 조합된 R18a 또는 R5a와 조합된 R19a 중 하나 이상은 포화 또는 불포화되고 하나 이상의 C1-C6 알킬 또는 -CH2SO3Xa에 의해 선택적으로 치환된 5- 또는 6-원 고리를 형성하고, 여기서 Xa는 H 또는 반대이온이다.
일부 실시형태에서, R1a 및 R6a는 H이거나, R2a와 조합된 R1a, 또는 R5a와 조합된 R6a 중 하나 이상은 융합된 6-원 방향족 고리이다.
일부 실시형태에서, 치환체 R2a, R3a, R4a, 및 R5a는 독립적으로 H, F, Cl, Br, I, CN; 또는 C1-C18 알킬, 또는 C1-C18 알콕시이고, 여기서 각각의 알킬 또는 알콕시는 F, Cl, Br, I, 카르복실산, 카르복실산의 염, 또는 C1-C6 알코올의 카르복실산 에스테르; 또는 -SO3Xa에 의해서 선택적으로 추가로 치환된다.
일부 실시형태에서, 펜던트 기 R10a는 H, CN, 카르복실산, 카르복실산의 염, 또는 C1-C6 알코올의 카르복실산 에스테르이다. 대안적으로 R10a는 F, Cl, Br, 카르복실산, 카르복실산의 염, C1-C6 알코올의 카르복실산 에스테르, -SO3Xa, 아미노, 알킬아미노, 또는 디알킬아미노에 의해 1회 이상 선택적으로 치환된 포화된 또는 불포화된, 분지형 또는 비분지형 C1-C18 알킬이고, 이들의 알킬 기는 1 내지 6개의 탄소를 갖는다. 또 다른 실시형태에서, R10a는 하기 화학식을 갖는다:
상기 식에서, R12a, R13a, R14a, R15a 및 R16a는 독립적으로 H, F, Cl, Br, I, -SO3Xa, 카르복실산, 카르복실산의 염, CN, 히드록시, 아미노, 히드라지노, 아지도; 또는 C1-C18 알킬, C1-C18 알콕시, C1-C18 알킬티오, C1-C18 알칸오일아미노, C1-C18 알킬아미노카르보닐, C2-C36 디알킬아미노카르보닐, C1-C18 알킬옥시카르보닐, 또는 C7-C18 아릴카르복스아미도이고, 이들의 알킬 또는 아릴 부분은 F, Cl, Br, I, 히드록시, 카르복실산, 카르복실산의 염, C1-C6 알코올의 카르복실산 에스테르, -SO3Xa, 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노 또는 알콕시에 의해서 1회 이상 선택적으로 치환되고, 각각의 알킬 부분은 1 내지 6개의 탄소를 갖는다. 대안적으로, 조합하여 취해진 인접한 치환체의 쌍 R13a와 R14a, R14a와 R15a, 또는 R15a와 R16a는 카르복실산, 또는 카르복실산의 염에 의해 선택적으로 추가로 치환된 융합된 6-원 방향족 고리를 형성한다.
화합물은 상기에 상세하게 기재된 공유 연결 L에 의해 화합물에 부착된 반응성 기(Rx) 또는 접합된 분석물 또는 물질(Sc)에 의해 선택적으로 치환된다. 전형적으로, 화합물은 R8a, R9a, R12a, R13a, R14a, R15a, R16a, R18a, 또는 R19a 중 하나 이상에서, 예를 들어, R12a 내지 R16a 중 하나에서 또는 R12a, R14a 또는 R15a에서 또는 Q 모이어티 상의 치환체에서 -L-Rx 또는 -L-Sc 모이어티에 의해 치환된다. 대안적으로, -L-Rx 또는 -L-Sc 모이어티는 알킬, 알콕시, 알킬티오 또는 알킬아미노 치환체 상의 치환체로서 존재한다. 일부 실시형태에서, R8a, R9a, R12a, R13a, R14a, R15a, R16a, R18a, 또는 R19a 중 정확히 하나는 -L-Rx 또는 -L-Sc 모이어티이다. 또 다른 실시형태에서, R12a, R13a, R14a, R15a, 또는 R16a 중 정확히 하나는 -L-Rx 또는 -L-Sc 모이어티이다. 일부 실시형태에서, R12a, R14a, 및 R15a 중 하나는 -L-Rx 또는 -L-Sc 모이어티이다.
실시형태에서, K 모이어티가 N+R18aR19a인 경우, 화합물은 로다민이고, 하기 화학식 (Q3)을 갖는다:
상기 식에서, R8a, R9a, R18a 및 R19a 중 적어도 하나는 Q 모이어티이다. 일부 실시형태에서, R8a 및 R9a 중 적어도 하나는 Q 모이어티이고, R18a 및 R19a 중 적어도 하나는 Q 모이어티이며, 이것은 동일하거나 상이할 수 있다.
K 모이어티가 O인 실시형태에서, 화합물은 로다민이고, 하기 화학식 (Q4)를 갖는다:
상기 식에서, R8a 및 R9a 중 적어도 하나는 Q 모이어티임.
일부 실시형태에서, 본 발명의 화합물은 하기 화학식 (Q5)를 갖는다:
상기 식에서, J는 O-R7a 또는 NR18aR19a이고, R1a 내지 R19a 각각은 상기에 정의된 바와 같다.
소광 화합물에 대한 전구체는 전형적으로 고리 시스템의 방향족성이 상기에 기재된 소광 화합물에 대한 것과 같이 회복되지 않는 한 또는 회복될 때까지 소광제로서 기능하지 않는다. 이들 전구체에서 R7a는 H, C1-C6 알킬, C1-C6 카르복시알킬, C1-C6 설포알킬, C1-C6 카르복시알킬의 염, 또는 C1-C6 설포알킬의 염이고, 여기서 알킬 부분은 아미노, 히드록시, 카르복실산, 카르복실산의 염, 또는 C1-C6 알킬의 카르복실산 에스테르에 의해 선택적으로 치환된다. 대안적으로, R7은 카르복실산, 설폰산, 인산 또는 단당류 또는 다당류, 예컨대, 글리코시드로부터 히드록실 기를 제거함으로써 형식적으로 유래되는 1가 라디칼이다.
일부 실시형태에서, R10a는 이전에 정의된 바와 같고, R11a는 H, 히드록시, CN 또는 1 내지 6개의 탄소를 갖는 알콕시이다. 대안적으로, R11a와 조합된 R10a는 5- 또는 6-원 스피로락토 고리를 형성하거나, R12a와 조합된 R11a는 5- 또는 6-원 스피로락토 고리, 또는 5- 또는 6-원 설톤 고리를 형성한다.
이들 전구체 화합물은 화학적, 효소적 또는 광분해적 수단에 의해서 완전히 접합된 소광 화합물로 쉽게 전환된다. 전형적으로, 무색 전구체는 -L-Rx 모이어티에 의해서 치환되거나, 분석물 또는 물질(Sc)에 접합된다.
예시적인 소광제 화합물은 하기를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다:
일부 실시형태에서, 소광제는 하기이다:
일부 실시형태에서, 소광제는 하나 이상의 설포네이트 또는 SO3H 치환체, 예를 들어, 하기를 포함한다:
또한 본원에는 소광제에 추가로 커플링된 본원에 개시된 바와 같은 ET 접합체에 커플링된 올리고뉴클레오티드 프로브가 제공되며, 여기서 소광제는 디벤조잔텐 화합물이다. 특정 실시형태에서, 디벤조잔텐 화합물은 이미노-디벤조잔텐 화합물, 예컨대, 치환된 3-이미노-3H-디벤조[c,h]잔텐-11-아민 화합물이다.
본원에 기재된 ET 접합체에 커플링되는 올리고뉴클레오티드 프로브를 제조하는 데 사용될 수 있는 소광제의 구체적인 예가 표 2에 제공되어 있다.
[표 2]
반응성 화합물의 접합체
일부 실시형태에서, 화합물(소광 화합물 또는 전구체 화합물)은 적어도 하나의 기 -L-Rx로 치환되며, 여기서 Rx는 염료에 대해 상기에 상세히 기재된 바와 같이 공유 연결 L에 의해 화합물에 부착된 반응성 기이다. 반응성 기(Rx)를 갖는 있는 화합물은 적합한 반응성을 가진 작용기를 함유하거나 이를 함유하도록 변형된 다양한 유기 또는 무기 물질을 표지하여 -L-Sc로 표시되는 접합된 분석물 또는 물질(Sc)의 화학적 부착을 초래한다.
일부 실시형태에서, 접합된 분석물 또는 물질(Sc)는 자연 또는 합성 핵산 염기, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 또는 화합물의 부착을 위한 추가 링커 또는 스페이서를 갖도록 보호된 것 또는 변형된 것, 예컨대, 알키닐 연결, 아미노알릴 연결, 또는 기타 연결을 포함하는 핵산 중합체이다. 일부 실시형태에서, 접합된 뉴클레오티드는 뉴클레오시드 트리포스페이트 또는 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트 또는 디데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트이다.
예시적인 핵산 중합체 접합체는 표지된 단일-, 이중- 또는 다중-가닥, 자연 또는 합성 DNA 또는 RNA, DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드, 또는 DNA/RNA 혼성체이거나, 모르폴린 유도체화 포스페이트와 같은 특이한 링커, 또는 N-(2-아미노에틸)글리신 단위와 같은 펩티드 핵산을 포함한다. 핵산이 합성 올리고뉴클레오티드인 경우, 전형적으로 50개 미만의 뉴클레오티드, 더 전형적으로 25개 미만의 뉴클레오티드를 함유한다. 일부 실시형태에서, 더 큰 핵산 중합체는 전형적으로 올리고뉴클레오티드-프라이밍된 DNA 중합을 사용하여, 예를 들어, 중합효소 연쇄 반응을 사용하거나, 프라이머 연장을 통해, 또는 핵산 중합체의 3'-단부에 대한 표지된 뉴클레오티드의 말단-트랜스퍼라제 촉매 첨가에 의해 표지된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드로부터 제조된다. 전형적으로, 이 화합물은 아미드, 에스테르, 에테르 또는 티오에테르 결합을 통해 하나 이상의 퓨린 또는 피리미딘 염기를 통해 부착되거나; 또는 에스테르, 티오에스테르, 아미드, 에테르 또는 티오에테르인 결합에 의해 포스페이트 또는 탄수화물에 부착된다. 대안적으로, 화합물은 백금 시약과 같은 화학적 후변형에 의해 또는 접합된 소랄렌과 같은 광활성화 분자를 사용하여 핵산 중합체에 결합된다. 일부 실시형태에서, 소광 모이어티는 포스포르아미다이트 반응성 기를 통해 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 또는 핵산 중합체에 부착되어 포스포디에스테르 연결을 생성한다.
소광 화합물은 소광 화합물과 형광단이 소광이 일어나기에 충분히 근접하고 형광단의 방출 파장과 소광 화합물의 흡수 밴드 사이에 적어도 일부 스펙트럼 중첩이 발생한다면 다양한 형광단으로부터 에너지를 받아들일 수 있다. 이러한 중첩은 충분한 스펙트럼 중첩이 존재하는 경우 소광 화합물의 최대 흡광도 파장보다 더 낮거나 더 높은 최대 파장 방출에서 발생하는 도너의 방출로 발생할 수 있다. 일부 실시형태에서, 소광 화합물은 희미한 형광성이거나 본질적으로 비형광성이어서 에너지 전달이 형광 방출을 거의 또는 전혀 일으키지 않는다. 일 양태에서, 소광 화합물은 본질적으로 비형광성이며 약 0.05 미만의 형광 양자 수율을 갖는다. 또 다른 양태에서, 소광 화합물은 약 0.01 미만의 형광 양자 수율을 갖는다. 또 다른 양태에서, 소광 화합물은 약 0.005 미만의 형광 양자 수율을 갖는다.
에너지 전달의 정도, 따라서 소광은 리포터 모이어티(예를 들어, 형광단)과 소광 모이어티 사이의 분리 거리에 크게 의존한다는 것을 쉽게 인식해야 한다. 분자 시스템에서, 형광 소광의 변화는 전형적으로 형광단 분자와 소광 화합물 분자 사이의 분리 거리의 변화와 밀접한 관련이 있다. 소광 화합물과 충분한 스펙트럼 중첩 및 근접성을 갖는 형광단은 일반적으로 본원에서 고려되는 다양한 적용을 위한 적합한 도너이다. 중첩 및 근접성 정도가 클수록 전체 소광 가능성이 커진다.
일부 실시형태에서, 기재된 형광단 및 소광제를 포함하는 분자 구조의 분해, 절단 또는 기타 열화는 형광단의 부분적 또는 완전한 형광 복원을 관찰함으로써 검출된다. 일부 실시형태에서, 구조와 관련된 형광단의 초기에 소광된 형광은 분자 구조의 2차 구조에 대한 변화, 분해, 절단 또는 열화에 의해 소광 화합물에 대한 근접성으로부터 제거될 때 탈소광된다. 소광 화합물은 선택적으로 형광단과 동일한 분자 구조와 회합되거나, 도너 및 억셉터는 구조의 인접하지만 별개의 소단위와 회합된다. 다음 시스템은 특히 구조적 분해를 검출 및/또는 정량화하기 위해 기재된 에너지 전달 쌍을 사용하여 분석될 수 있다: 형광 기질을 사용한 프로테아제 활성 검출(예를 들어, HIV 프로테아제 검정); 효소-매개 단백질 변형의 검출(예를 들어, 탄수화물/지방산, 인산염, 보결분자단의 절단); 면역검정(대체/경쟁적 검정을 통해); DNA 듀플렉스 풀림 검출(예를 들어, 헬리카제/토포이소머라제/자이라제 검정); 핵산 가닥 변위; ds DNA 용융; 뉴클레아제 활성; 지질 분포 및 수송; 및 TaqMan 검정.
구조 분해는 전형적으로 접합된 분석물이 분해가 일어나기에 충분한 시간 동안 관심 분해 조건에 노출됨에 따라 형광의 부분적 또는 완전한 회복을 관찰함으로써 검출된다. 형광의 회복은 형광단과 소광 화합물 사이의 분리 거리의 증가 및 이에 따른 접합된 분석물의 분해를 나타낸다. 구조 변화는 생물학적 검정(예를 들어, 중합효소 또는 기타 효소 분해 기전 사용) 동안 모니터링될 수 있으며, 분해 정도는 연구 중인 생물학적 시스템에 대한 귀중한 정보를 제공할 수 있다.
프로브
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 에너지 전달 염료 접합체는 다중 여기 및 다중 방출(즉, 검출) 채널을 구현하는 PCR에서 검출하기 위한 리포터 염료, 예컨대, 약 480 +/- 10 nm(청색)에서의 여기 및 약 587 +/-10 nm(황색/주황색)에서의 검출 채널을 포함하는 것, 약 480 +/- 10 nm(청색)에서의 여기 및 약 623 +/-14 nm(주황색/적색)에서의 검출 채널을 포함하는 것, 약 550 +/- 10 nm(녹색)에서의 여기 및 약 682 +/-14 nm(적색)에서의 검출 채널을 포함하는 것, 또는 약 550 +/- 10 nm(녹색)에서의 여기 및 약 711 +/- 12 nm(적색)에서의 검출 채널을 포함하는 것일 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 에너지 전달 염료 접합체는 제7, 제8, 제9, 제10 등의 리포터 염료를 구현하는 PCR에서 검출을 위한 리포터 염료일 수 있다. 일부 실시형태에서, 추가 리포터 염료, 예컨대, 제7, 제8, 제9, 제10 등의 리포터 염료가 포스포르아미다이트 전구체로서 제공될 수 있다. 리포터 염료의 포스포르아미다이트 전구체가 고품질 및 감소된 비용으로 PCR 프로브의 합성을 용이하게 할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 일부 실시형태에서, 기재된 프로브(들)는 제5, 제6, 제7, 제8 등의 프로브와 같은 더 높은 파장으로서 멀티플렉스 PCR 검정에 포함된다. 일부 실시형태에서, 검정은 또한 염료/소광제 조합을 갖는 프로브를 포함할 수 있으며, 여기서 소광제는 당업자에게 알려진 임의의 것일 수 있고, 예를 들어, Dabcyl, Dabcyl, Eclipse™ 소광제, QSY7, QSY21, 및 Black Hole Quencher 1, 2 및 3(또한 추가 예에 대해서는 표 2 참조)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 기재된 프로브는 프로브의 용융 온도(Tm)를 증가시키고 프로브-표적 혼성체를 안정화시키는 3' 단부에 마이너 그루브 바인더(MGB) 모이어티를 포함한다. 일부 실시형태에서, 프로브에 MGB 또는 잠금 핵산(LNA)을 사용하면 프로브가 전통적인 프로브보다 짧아질 수 있으며, 이는 더 많은 표적을 수용하기 위해 더 양호한 서열 식별 및 유연성을 제공할 수 있다.
일부 실시형태에서, 기재된 프로브는 (형광단으로서) 본원에 기재된 바와 같은 에너지 전달 염료 접합체 중 하나 및 본원에 기재된 소광제 중 하나를 포함하며, 여기서 형광단 및 소광제는 각각 올리고뉴클레오티드에 공유 접합된다. 멀티플렉스 PCR 적용에 적합한 프로브의 예는 다중 여기 및 방출 채널을 포함하는 PCR 기기의 하나 이상의 방출 채널에서 검출하기 위해 스펙트럼 영역에서 방출하는 본원에 기재된 바와 같은 에너지 전달 염료 접합체를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 에너지 전달 염료 접합체를 포함하는 이러한 프로브는 상보성 표적 핵산 분자의 검출에 사용될 수 있는 검출기 프로브이다.
기재된 프로브는 당업계에 알려진 방법에 따라 합성될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 형광단 및 소광제는 상기에 기재된 접합 화학 및 반응성 기를 사용하여 올리고뉴클레오티드의 말단에 공유 접합된다. 또 다른 예에서, 소광제 또는 프로브는 고체 지지체에 접합될 수 있고, 올리고뉴클레오티드는 표준 올리고뉴클레오티드 합성 방법, 예컨대, DNA 합성기를 사용하여 부착된 소광제 또는 프로브로부터 합성된 다음 소광제 또는 프로브 중 나머지 것이 합성된 올리고뉴클레오티드의 말단에 공유 부착된다.
방법 및
키트
에너지 전달 접합체를 만드는 방법 및 이러한 접합체를 생물학적 분자(예를 들어, 올리고뉴클레오티드)에 연결하는 방법이 또한 본원에 제공된다. 링커 L1 내지 L4를 포함하는 에너지 전달 접합체를 제조하기 위한 합성 경로의 예를 도 21, 도 22, 및 도 23에 도시한다. 본 개시내용은 ET 접합체에 연결된 올리고뉴클레오티드를 화학적으로 합성하는 데 사용될 수 있는 시약을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본원에 기재된 고유한 링커 전략은 당업계에 널리 알려져 있고, HPLC를 사용하지 않고 정제될 수 있는 자동화 고체상 합성 기술을 사용하여 올리고뉴클레오티드에 ET 접합체를 부착시키는 것을 허용한다.
또한 생물학적 검정에서 형광 에너지 전달 접합체를 사용하는 방법 및 이러한 검정을 수행하기 위한 키트가 본원에 제공된다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 에너지 전달 염료 접합체는 실시간 및 종점 PCR 분석에 사용될 수 있다. 여기될 수 있고 광범위한 파장에 걸쳐 방출할 수 있는 형광 ET 접합체가 제조될 수 있다. 도너 염료, 억셉터 염료 및 분석물 사이의 링커 유형 및 길이를 조정함으로써, 생성된 접합체의 광학 특성이 조정되어 정확한 여기 및 방출 프로필을 제공할 수 있다. 접합체는 목적하는 여기 및 방출 프로파일에 적합하도록 조정될 수 있기 때문에, 접합체는 단독으로 또는 하나 이상의 다른 형광단과 조합하여 멀티플렉스 생물학적 검정(예를 들어, qPCR 검정)에 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드 프로브의 구성에 특히 유용하다.
따라서, 또 다른 양태에서, 본원에 기재된 ET 전달 염료 접합체는 멀티플렉스 검정의 실시에 사용될 수 있다. 적절한 여기 및 방출 프로파일을 갖는 모든 형광 ET 접합체는 이러한 멀티플렉스 검정의 실행에 사용될 수 있다. 여러 제조업체에서 멀티플렉스 PCR 검정을 검출할 수 있는 기기를 제공한다. 일례로, Thermo Fisher Scientific(미국 매사추세츠주 월탐 소재)은 Thermo Fisher Scientific 기기에서 핵산 표적을 실시간으로 검출하기 위한 4-플렉스 TaqMan 검정, 예컨대, Vii7, Quant Studio 등을 제공하고, 여기서 특정 실시간 qPCR 기기는 최대 6-플렉스 TaqMan 검정을 실행할 수 있는 광학 기능을 갖는다.
본원에 제공된 고유한 ET 접합체는 qPCR 검정이 6-플렉스, 예를 들어, 7-플렉스, 8-플렉스, 9-플렉스, 10-플렉스 등을 초과하게 확장되게 한다.
따라서, 추가의 양태에서, 기재된 ET 접합체를 사용하여 qPCR 또는 종결점 PCR과 같은 단일플렉스 또는 멀티플렉스 PCR을 수행하기 위한 방법이 제공된다. 종결점 PCR은 모든 PCR 순환이 완료된 이후의 분석이다. 주형(template)이 배가되면서 (기하급수적 단계) 정량화를 허용하는 qPCR과 달리, 종결점 분석은 증폭의 정점 유지 단계를 기초로 한다.
구체적으로, 복수의 표적 DNA 서열을 증폭하고, 검출하는 방법은 기술된 프로브를 포함하는 조성물 또는 반응 혼합물을 제공하는 단계, 반응 혼합물을 복수의 표적 서열의 증폭이 일어날 수 있도록 열 순환 프로토콜에 적용하는 단계, 및 기술된 프로브의 형광을 다수의 증폭 순환 동안 적어도 한 번 검출함으로써 증폭을 모니터링하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 기재된 프로브가 제5 및/또는 제6 핵산 표적의 검출을 허용하는 5-플렉스 또는 6-플렉스 멀티플렉스 qPCR 검정을 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 프로브가 제7 및/또는 제8 핵산 표적의 검출을 가능하게 하는 본원에 기재된 ET 리포터를 사용하는 7-플렉스 또는 8-플렉스 멀티플렉스 qPCR 검정을 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 기재된 프로브가 제9 및/또는 제10 핵산 표적의 검출을 허용하는 9-플렉스 또는 10-플렉스 멀티플렉스 qPCR 검정을 포함한다. 본원에 기재된 ET 접합체는 고차 멀티플렉스 검정에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 6 내지 20개(예를 들어, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 20개) 이상의 핵산 표적을 평가하기 위한 멀티플렉스 검정이 본원에 기재된 ET 접합체를 사용하여 촉진될 수 있다. 일부 실시형태에서, 방법은 기재된 프로브가 6개의 핵산 표적의 검출을 허용하는 최대 6-플렉스 멀티플렉스 qPCR 검정을 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 기재된 프로브가 10개의 핵산 표적의 검출을 허용하는 최대 10-플렉스 멀티플렉스 qPCR 검정을 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 기재된 프로브가 20개의 핵산 표적의 검출을 허용하는 최대 20-플렉스 멀티플렉스 qPCR 검정을 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 5-플렉스 내지 30-플렉스 멀티플렉스 qPCR 검정(또는 그 사이의 임의의 플렉스)에 대한 충분한 검정을 포함하며, 여기서 설명된 프로브는 5 내지 30개 또는 그 사이의 임의의 수의 핵산 표적의 검출을 허용하는 방식으로 제공된다.
본원에 기재된 ET 전달 염료 접합체는 멀티플렉스 검정의 실시에 사용될 수 있다. 적절한 여기 및 방출 프로파일을 갖는 모든 형광 ET 접합체는 이러한 멀티플렉스 검정의 실행에 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 도너 염료는 약 450 nm 내지 약 580 nm의 여기 최대를 갖고, 억셉터 염료는 약 580 nm 내지 약 750 nm의 방출 최대를 갖는다. 여기 및 방출 파장과 관련된 멀티플렉스 qPCR 검정의 실시에 사용하기 위해 본원에 기재된 링커를 사용하여 ET 염료 접합체를 제조하는 데 사용될 수 있는 도너 및 리포터의 대표적인 예가 표 3에 제시되어 있다.
[표 3]
도너 염료와 억셉터 염료 사이의 에너지 전달 효율을 최대화하기 위해 적절한 링커를 선택할 수 있다. 특정 실시형태에서, 도너 염료는 구조 (LI)을 갖는 링커를 통해 로다민 억셉터 염료, 피로닌 또는 시아닌 억셉터 염료에 공유 연결된 플루오레세인 또는 로다민 염료이다. 또 다른 실시형태에서, 도너 염료는 구조 (LII)을 갖는 링커를 통해 로다민, 피로닌 또는 시아닌 억셉터 염료에 공유 연결된 플루오레세인 또는 로다민 염료이다. 다른 실시형태에서, 도너 염료는 구조 (LIII)을 갖는 링커를 통해 로다민 억셉터 염료에 공유 연결된 플루오레세인 또는 로다민 염료이다. 특정 실시형태에서, 도너 염료는 구조 (LIII)를 갖는 링커를 통해 로다민, 피로닌 또는 시아닌 억셉터 염료에 공유 연결된 플루오레세인 또는 로다민 염료이다. 임의의 이들 실시형태에서, 링커 (LI), (LII) 또는 (LIII)은 도너일 수 있고 억셉터 염료는 분석물(예를 들어, 올리고뉴클레오티드 또는 단백질)에 추가로 연결될 수 있다.
신호의 검출은 형광단으로부터 형광의 변화를 검출하는 임의의 시약 또는 기구를 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 검출은 임의의 분광광도계 열 순환기를 사용하여 수행될 수 있다. 분광 열 순환기의 예에는 Applied Biosystems (AB) PRISM® 7000, AB 7300 실시간 PCR 시스템, AB 7500 실시간 PCR 시스템, AB PRISM® 7900HT, Bio-Rad Cycler IQTM, Cepheid SmartCycler® II, Corbett Research Rotor-Gene 3000, Idaho Technologies R.A.P.I.D.™, MJ Research Chromo 4™, Roche Applied Science LightCycler®, Roche Applied Science LightCycler®2.0, Stratagene Mx3000P™, 및 Stratagene Mx4000™이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
염료 세트를 10-플렉스를 초과하게 확장하기 위해 사용될 수 있는 염료의 대표적인 예는 비제한적으로 다음을 포함한다: 도너 염료는 쿠마린 343이고 억셉터 염료는 FAM이다. 일부 실시형태에서, 도너 염료는 ATTO 425(ATTO-Tec, GmbH)이고 억셉터 염료는 FAM이다. 일부 실시형태에서, 도너 염료는 Pacific Blue(Thermo Fisher Scientific)이고, 억셉터 염료는 FAM이다. 일부 실시형태에서, 도너 염료는 ATTO 425이고 억셉터 염료는 FAM이다. 일부 실시형태에서, 도너 염료는 ALEXA FLUOR 405이고 억셉터 염료는 FAM이다. 일부 실시형태에서, 도너 염료는 쿠마린 343이고 억셉터 염료는 VIC이다. 일부 실시형태에서, 도너 염료는 ATTO 425이고 억셉터 염료는 VIC이다. 일부 실시형태에서, 도너 염료는 Pacific Blue이고 억셉터 염료는 VIC이다. 일부 실시형태에서, 도너 염료는 ATTO 425이고 억셉터 염료는 VIC이다. 일부 실시형태에서, 도너 염료는 Alexa Fluor 405이고 억셉터 염료는 VIC이다. 마찬가지로 염료 매트릭스는 m6 방출 채널을 초과하여 방출하는 억셉터를 포함하는 리포터 염료, 예컨대, 시아닌 염료, 예컨대, Cy 7(GE Healthcare), 아자인돌 시아닌 염료, Alexa Fluor 750 또는 실릴로다민을 포함하도록 확장될 수 있다. 특정 실시형태에서, 도너 염료는 로다민 또는 시아닌 염료이고, 리포터 염료는 스펙트럼의 원적외선 또는 근적외선 영역에서 방출하는 시아닌 염료(예를 들어, 아자인돌린 시아닌)이다.
기술된 방법의 핵산 표적(들)은 당업자에게 알려진 임의의 핵산 표적일 수 있다. 또한, 표적은 낮은 돌연변이의 영역 또는 높은 돌연변이의 영역일 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 방법의 특히 유용한 용도 중 하나는 RNA 바이러스성 유전자와 같은 심하게 돌연변이된 핵산, 또는 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP: single nucleotide polymorphism)과 같은 유전적 가변성이 높은 영역을 표적화하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적은 법의학 샘플 및/또는 고정된 조직으로부터의 물질과 같이 (예를 들어, 포르말린에 의해서) 단편화되거나 분해될 수 있다. 표적은 증폭에 알맞은 임의의 크기일 수 있다. 본원에 제공된 방법 및 조성물의 특히 유용한 용도 중 하나는 siRNA 및 miRNA와 같은 짧은 단편의 식별을 포함한다. 특히 유용한 또 다른 용도는 고정된 샘플 또는 환경에 노출되었던 샘플과 같이 단편화된 및/또는 분해된 핵산을 갖는 샘플을 위한 것이다. 따라서, 방법은 예를 들어 생검 조직 및 법의학 DNA에 사용될 수 있다. 표적은 정제되거나 정제되지 않을 수 있다. 표적은 시험관내에서 생산되거나 (예를 들어, cDNA 표적), 생물학적 샘플에서 발견될 수 있다 (예를 들어, RNA 또는 게놈 DNA (gDNA) 표적). 생물학적 샘플은 처리 없이 사용될 수 있거나, 생물학적 샘플은 본원에 개시된 방법을 방해할 수 있는 물질을 제거하도록 처리될 수 있다.
핵산 표적이 존재할 수 있는 샘플은 예를 들어, 포유동물 또는 비-포유동물 유기체(식물, 바이러스, 박테리오파지, 박테리아 및/또는 진균을 포함하지만 이들로 제한되지 않음)로부터 얻은 조직, 세포 및/또는 유체(예를 들어, 순환, 건조, 재구성) 샘플을 포함한다. 일부 실시형태에서, 샘플은 예를 들어, 포유동물 타액, 협측 상피 세포, 뺨 조직, 림프, 뇌척수액, 피부, 모발, 혈액, 혈장, 소변, 대변, 정액, 종양 샘플(예를 들어, 암 세포/조직), 배양 세포 및/또는 배양 종양 세포로부터 유래될 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드는 게놈 형태의 DNA일 수 있거나, 그것은 플라스미드, 박테리오파지, 박테리아 인공 염색체(BAC), 효모 인공 염색체(YAC) 및/또는 기타 벡터에 클로닝될 수 있다. 예를 들어, 진단 또는 법의학 검정과 관련될 수 있는 다른 유형의 샘플이 또한 본원에 기재된 방법에 유용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 프로브는 바이러스 DNA 서열의 검출에 사용될 수 있다.
본원에 제공된 프로브는 진단 방법, 예를 들어 SNP 검출, 특이적 바이오마커의 식별 등에 사용될 수 있으며, 이로써 프로브는 예를 들어 바이러스, 박테리아, 기생충 및 진균을 포함하나 이에 한정되지 않는 인간 질환의 감염병 인자의 서열에 상보적이고, 이로써 환자의 핵산을 포함하는 샘플에서 감염원의 존재를 진단한다. 표적 핵산은 게놈 DNA(gDNA), cDNA 또는 RNA, 예컨대, mRNA, siRNA 또는 miRNA; 또는 합성 DNA, 인간 또는 동물; 또는 미생물 등의 것일 수 있다. 다른 실시형태에서, 프로브는 감염원에 의해 유발되지 않는 질환 또는 장애를 진단하거나 예후하는(prognose) 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 프로브는 인간 또는 동물로부터의 샘플에서 감염성 인자, 예컨대, 바이러스 또는 숙주, 돌연변이, 다형성 또는 대립유전자의 존재를 식별함으로써 암, 자가면역 질환, 정신병, 유전병 등을 진단하거나 예후하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 프로브는 돌연변이 또는 다형성을 포함한다. 추가적으로, 프로브는 감염, 질환 또는 장애에 대한 치료의 진행을 평가하거나 추적하는 데 사용될 수 있다.
또한 기술된 프로브를 포함하는 반응 혼합물 또는 마스터 믹스와 같은 조성물이 제공된다. 일부 실시형태에서, 실시간 또는 정량적 PCR 또는 종결점 PCR과 같은 PCR용 조성물은 기재된 프로브들 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 실시형태에서, PCR용 조성물 또는 반응 혼합물 또는 마스터 믹스 (예를 들어, qPCR 또는 종결점 PCR)는 적어도 4개의 표적 핵산의 검출을 허용하는 프로브 및 제5 및/또는 제6 표적 핵산 중 적어도 하나의 검출을 허용하는 기재된 프로브(들)를 포함하고, 각각의 기술된 프로브 중 적어도 하나는 ET 도너 염료 및 ET 억셉터 염료로 이루어지고, 여기서 형광단은 약 650 내지 720 nm의 최대 방출을 갖는다. 본원에 기술된 억셉터의 최대 흡광도는 660 내지 668 nm이다. 본원에 기술된 소광제의 흡광도 범위는 530 내지 730 nm이다. 대안적 실시형태에서, 기재된 형광단 및 소광제를 선택된 올리고뉴클레오티드에 접합시키기 위한 표지화 시약이 제공된다.
또한, 이러한 조성물 또는 반응 혼합물 또는 마스터 믹스는 하기 목록으로부터 선택된 하나 또는 몇몇 화합물 및 시약을 포함할 수 있다: 중합효소 연쇄 반응에 적용 가능한 완충제, 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트(dNTP), 5'에서 3'의 엑소뉴클레아제 활성, 적어도 한 쌍 또는 여러 쌍의 증폭 프라이머 및/또는 추가 프로브를 갖는 DNA 중합효소, 우라실 DNA 글리코실라제, PCR 저해제 차단제(예를 들어, 젤라틴과 알부민 혼합물의 조합), 핫 스타트 성분 및/또는 변형, 적어도 1개의 염, 예컨대, 염화마그네슘 및/또는 염화칼륨, 참조 염료, 및 적어도 하나의 세제. 본원에 개시된 바와 같은 조성물, 반응 혼합물 및 마스터 믹스에 포함시키기에 적합한 다른 화합물 및 시약은 당업자에 의해 고려될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 조성물 또는 마스터 믹스는 동결건조(예를 들어, "라이오-레디(lyo-ready)")에 적합하고, 이미 동결건조된 형태이고/이거나 달리 안정화된(예를 들어, 동결건조), 건조, 또는 증발된 조성물 또는 성분으로 제조된 본원에 기술된 바와 같은 프로브를 포함하는 구성성분들을 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원에 제공된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 혼성화, 연장 및 증폭 반응을 수행하는 데 사용될 수 있는 키트가 제공된다. 바람직한 키트는 본원에 기재된 방법에 사용되는 시약을 함유하도록 구성된 바이알, 튜브 등과 같은 하나 이상의 용기를 포함할 수 있고, 선택적으로 이러한 시약을 사용하기 위한 지침서 또는 프로토콜을 함유할 수 있다. 본원에 기술된 키트는 본원에 기술된 하나 이상의 프로브 및 중합효소를 포함하지만 이에 제한되지 않는 본원에 기재된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 키트는 또한 하나 이상의 프라이머를 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 기재된 프로브(들) 중 적어도 하나를 포함하는 키트가 제공된다. 또한, 키트는 다음 목록에서 선택된 하나 또는 몇몇 다른 화합물 및 시약을 포함할 수 있다: 중합효소 연쇄 반응에 적용 가능한 완충제, 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트(dNTP), 5'에서 3'의 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소, 적어도 하나 또는 여러 쌍의 증폭 프라이머. 키트는 또한 내부 대조군 DNA 또는 표준을 포함할 수 있다. 상기에 개시된 각각의 성분은 단일 저장 용기에 저장되고 개별적으로 또는 함께 포장될 수 있다. 그러나 동일한 용기 내에 보관하기 위한 성분의 모든 조합이 또한 가능하다. 일부 실시형태에서, 키트에 포함된 프로브(들) 및/또는 기타 성분은 동결건조되거나 달리 저장 및/또는 수송을 위해 안정화될 수 있고, 사용자가 원하는 대로 재구성될 수 있다. 키트 사용 지침서가 또한 포함될 수 있다.
본원에서 제공되는 또 다른 양태는 정량적 실시간 중합효소 연쇄반응(qPCR)과 같은 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의해 샘플에서 표적 핵산 분자를 검출 또는 정량화하는 방법이다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 다음을 포함한다: (i) 하나 이상의 표적 핵산 분자를 포함하는 샘플을 a) 표적 핵산 분자에 특이적인 서열인 적어도 1개의 프로브, 예를 들어, 본원에 기재된 프로브 - 여기서 적어도 1개의 프로브는 하나 이상의 표적 핵산 분자의 증폭 시 검출 가능한 형광 변화를 겪음 -; 및 b) 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍과 접촉시키는 단계; (ii) 하나 이상의 표적 핵산 분자를 증폭시키기에 충분한 조건 하에서 단계 (i)의 혼합물을 DNA 중합효소와 함께 인큐베이션시키는 단계; 및 (iii) 프로브의 형광을 측정하여 증폭된 표적 핵산 분자의 존재 또는 부재를 검출하거나 양을 정량화하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 프로브는 TaqMan 프로브와 같은 가수분해 프로브이다.
본원에서 제공되는 또 다른 양태는 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응(qPCR)과 같은 PCR용 키트이다. 일부 실시형태에서 키트는 본원에 기재된 것과 같은 프로브, PCR을 수행하기 위한 지침서, 및 다음 중 하나 이상을 포함한다: 완충제, 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(dNTP), 유기 용매, 효소, 효소 보조인자, 및 효소 저해제. 또 다른 양태에서 PCR에 사용되는 다른 성분과 함께 기재된 프로브를 포함하는 PCR용 "마스터 믹스"와 같은 조성물이 본원에 제공된다. 본원에서 사용되는 용어 "증폭 반응 혼합물" 및/또는 "마스터 믹스"는 표적 핵산을 증폭하는 데 사용되는 다양한(일부 또는 전부) 시약을 포함하는 수용액을 지칭한다. 이러한 반응은 고체 지지체(예를 들어, 어레이)를 사용하여 수행할 수도 있다. 반응은 또한 사용자가 원하는 대로 단일 또는 멀티플렉스 형식으로 수행될 수 있다. 이러한 반응은 전형적으로 효소, 수성 완충액, 염, 증폭 프라이머, 표적 핵산 및 뉴클레오시드 트리포스페이트를 포함한다. 상황에 따라 혼합물은 완전한 또는 불완전한 증폭 반응 혼합물일 수 있다. 표적 핵산을 증폭하기 위해 사용되는 방법은 당업자에게 이용 가능한 임의의 방법일 수 있다. 핵산의 표적 서열의 카피를 증식시키기 위한 임의의 시험관내 수단이 이용될 수 있다. 여기에는 선형, 대수 및/또는 기타 증폭 방법이 포함된다. 본 개시내용은 일반적으로 핵산 증폭 반응으로서 PCR을 논의할 수 있지만, 본원에 기술된 변형된 세제는 다른 유형의 핵산 증폭 반응, 예컨대, 중합효소-매개 증폭 반응(예컨대, 헬리카제-의존적 증폭(HDA), 재조합효소 중합효소 증폭(RPA) 및 롤링 서클 증폭(RCA)), 뿐만 아니라 리가제-매개 증폭 반응(예컨대, 리가제 검출 반응(LDR), 리가제 연쇄 반응(LCR), 및 각각 갭-버전), 및 핵산 증폭 반응의 조합, 예컨대, LDR과 PCR(예를 들어, 미국 특허 제6,797,470호 참조) 둘 다에서 효과적이어야 한다는 것이 예상된다. 예를 들어, 개질된 세제는 예를 들어, PCR 프라이머와 상반되게 결찰 프로브가 사용되는 다양한 결찰-매개 반응에 사용될 수 있다. 추가의 예시적인 방법은 다른 것 중에서 중합효소 연쇄 반응(PCR; 예를 들어, 미국 특허 제4,683,202호; 제4,683,195호; 제4,965,188호; 및/또는 제5,035,996호 참조), 등온 절차(하나 이상의 RNA 중합효소 사용(예를 들어, PCT 공개 WO 2006/081222호 참조), 가닥 변위(예를 들어, 미국 특허 제RE39007E호 참조), 프라이머 분자의 부분적 파괴(예를 들어, PCT 공개 WO 2006/087574호 참조)), 리가제 연쇄 반응(LCR)(예를 들어, 문헌[Wu, et al., Genomics 4: 560-569 (1990)], 및/또는 문헌[Barany, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193 (1991)] 참조), Q~ RNA 리플리카제 시스템(예를 들어, PCT 공개 WO 1994/016108호 참조), RNA 전사-기반 시스템(예를 들어, TAS, 3SR), 롤링 서클 증폭(RCA)(예를 들어, 미국 특허 제5,854, 033호; 미국 특허 출원 공개 2004/265897호; 문헌[Lizardi et al. Nat. Genet. 19: 225-232 (1998)]; 및/또는 문헌[Barrer et al. Nucleic Acid Res., 26: 5073-5078 (1998)] 참조) 및 가닥 변위 증폭(SDA)(문헌[Little, et al. Clin. Chem. 45:777-784 (1999)])을 포함한다. 당업자에게 이용 가능한 많은 다른 시스템과 함께 이들 시스템은 본원에 기술된 바와 같이 사용하기 위한 표적 핵산의 중합 및/또는 증폭에 사용하기에 적합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 마스터 믹스는 PCR에 사용하기 전에 3배 미만의 희석, 예를 들어 2배 희석, 1.5배 희석, 1.2배 희석 등이 필요하도록 제조된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물 또는 마스터 믹스는 안정화 성분을 포함하거나 저장 및/또는 이송을 위한 안정화를 제공하도록 처리될 수 있다. 예를 들어, 마스터 믹스는 -20℃에서 대략 2년 동안; 4℃에서 대략 1년 동안; 실온에서 대략 3 내지 6개월; 및/또는 실온보다 높은 온도에서 대략 1 내지 2개월 동안 안정적인 조성으로 제조될 수 있다. 일부 실시형태에서 본원에 제공된 조성물 또는 마스터 믹스는 건조(예를 들어, 동결건조)되거나 물 또는 TE 완충제 용액 중에 존재한다. 본원에 기재된 키트는 또한 동결건조된 또는 달리 안정화된 조성물의 재구성을 위한 완충제 등을 포함할 수 있다(예를 들어, 물 또는 TE 또는 Tris와 같은 완충제의 첨가에 의함).
중합효소
본원에 개시된 바와 같이, 조성물, 반응 혼합물 및 키트는 또한 적어도 1개의 중합효소(예를 들어, DNA 중합효소) 및 적어도 1개의 뉴클레오티드의 공급원(예를 들어, dNTP)을 포함할 수 있다. 중합효소는 5'에서 3'의 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소일 수 있다. 일부 실시형태에서, 중합효소는 "열안정성 중합효소"일 수 있는데, 이는 열-안정적이고, 내열성이고, 그리고/또는 증폭 동안 단일 가닥 핵산의 탈안정화 또는 이중 가닥 핵산의 변성을 초래하는 데 필요한 시간 동안 승온에 적용되는 경우 비가역적으로 불활성화되지 않으며(예를 들어, 증폭에 전형적으로 요구되는 조건(예를 들어, 중합효소 연쇄 반응(PCR)에서)과 같은 조건 하에서 약 90℃ 내지 약 100℃에서 비가역적으로 변성되지 않을 것임), 표적 폴리뉴클레오티드 가닥에 상보적인 프라이머 연장 생성물을 형성하기 위해 데옥시리보뉴클레오티드의 중합을 촉매하는 효소를 지칭한다. 열안정성 중합효소는 예를 들어, 당업자에게 잘 알려진 방법을 사용하여 공개적으로 이용 가능한 다양한 호열성 박테리아(예를 들어, American Type Culture Collection, 미국 미들랜드주 락빌 소재)로부터 얻을 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제6,245,533호 참조). 박테리아 세포는 당업자에게 잘 알려진 특정 종의 활성 배양물을 성장시키기에 적합한 배양 배지 및 인큐베이션 조건을 사용하여 표준 미생물학적 기술에 따라 성장시킬 수 있다(예를 들어, 문헌[Brock, T. D., and Freeze, H., J. Bacteriol. 98(1):289-297 (1969)]; 문헌[Oshima, T., and Imahori, K, Int. J. Syst. Bacteriol. 24(1):102-112 (1974)]). 열안정성 중합효소의 공급원으로 사용하기에 적합한 것은 호열성 박테리아인 써무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus), 써무스 써모필루스(Thermus thermophilus), 써모코쿠스 리토랄리스(Thermococcus litoralis), 파이로코쿠스 푸리오서스(Pyrococcus furiosus), 파이로코쿠스 우시(Pyrococcus woosii) 및 파이로코쿠스속의 다른 종, 바실러스스테로써모필루스(Bacillus sterothermophilus), 설포버스 아시도칼다리우스(Sulfobus acidocaldarius), 써모플라즈마 아시도필럼(Thermoplasma acidophilum), 써무스 플라부스(Thermus flavus), 써무스 루버(Thermus ruber), 써무스 브록키아누스(Thermus brockianus), 써모토가 네아폴리타나(Thermotoga neapolitana), 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima), 및 써모토가속의 다른 종, 및 메타노박테리움 써모오토트로피쿰(Methanobacterium thermoautotrophicum) 및 이들 종 각각의 돌연변이체이다. 예시적인 열안정성 중합효소는 SuperScript, Platinum, TaqMan, MicroAmp, AmpliTaq, 및/또는 융합 중합효소 중 임의의 것을 포함할 수 있지만 이들로 제한되지 않는다. 예시적인 중합효소는 (써무스 아쿠아티쿠스) Taq DNA 중합효소, AmpliTaq™ DNA 중합효소, AmpliTaq™ Gold DNA 중합효소, DreamTaq™ DNA 중합효소, 이. 콜라이에서 발현되는 (써무스 아쿠아티쿠스) Taq DNA 중합효소 유전자의 재조합, 변형된 형태(Thermo Fisher Scientific), iTaq™ (Bio-Rad), Platinum Taq DNA 중합효소 High Fidelity, Platinum™ II Taq™ Hot-Start DNA 중합효소, Platinum SuperFi DNA 중합효소, AccuPrime Taq™ DNA 중합효소 High Fidelity, Tne DNA 중합효소, Tma DNA 중합효소, Phire Hot Start II DNA 중합효소, Phusion U Hot Start DNA 중합효소, Phusion Hot Start II High-Fidelity DNA 중합효소, iProof High Fidelity DNA 중합효소 (Bio-Rad); HotStart Taq 중합효소 (Qiagen)), 예를 들어, 특정 온도, 예컨대, 실온에서 활성을 차단하는 화학적으로 변형된 중합효소 및/또는 이들의 돌연변이체, 유도체 및/또는 단편을 포함할 수 있지만 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드 또는 압타머는 또한 핫 스타트 작용제로서 사용될 수 있고/있거나 핫 스타트 기능은 특정 온도(예를 들어, 실온)에서 이의 활성을 차단하는 중합효소에 대한 화학적 변형으로부터 초래될 수 있다(예를 들어, TaqGold, FlashTaq, Hot-Start Taq). 일부 실시형태에서, 핫 스타트 성분은 혼합물(Thermo Fisher Scientific in에서 입수 가능, 예를 들어, PlatinumTM II Hot-Start Green PCR Master Mix; DreamTaqTM Hot Start Green PCR Master Mix, Phusion U Green Muliplex PCR Master Mix, Phire Green Hot Start II Master Mix, 또는 AmpliTaq® Gold 360 Master Mix(Thermo Fisher Scientific))에서 열안정성 중합효소에 지향되는(즉, 이에 대한 결합 특이성을 갖는) 하나 이상의 항체일 수 있다. 일부 실시형태에서, 이중 핫 스타트 메커니즘이 사용될 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드와 같은 제1 핫 스타트 성분은 하나 이상의 항체와 같은 제2 핫 스타트 성분과 함께 핫 스타트 작용제로서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이중 핫 스타트 메커니즘의 제1 및 제2 핫 스타트 성분은 동일한 유형이거나 상이할 수 있다(올리고-기반, 항체 기반, 화학 기반 등). 일부 실시형태에서, 이중 핫 스타트 메커니즘의 제1 및 제2 핫 스타트 성분은 동일한 중합효소(예를 들어, Taq DNA 중합효소에 지향되는 저해 항체 및 Taq DNA 중합효소에 특이적인 저해 올리고뉴클레오티드를 사용하는 이중 핫 스타트 메커니즘)에 대해 저해성일 수 있다. 일부 실시형태에서, 중합효소는 융합 또는 상이한 공급원으로부터 유래된 상이한 도메인 또는 서열로 구성된 효소 또는 중합효소를 지칭하는 키메라 중합효소일 수 있다. 예를 들어, 융합 중합효소는 단일 또는 이중 가닥 DNA 결합 단백질 도메인과 같은 DNA 결합 도메인과 융합된 써무스 아쿠아티쿠스(Taq) 중합효소 도메인과 같은 중합효소 도메인을 포함할 수 있다. 융합 또는 키메라 중합효소는 예를 들어 당업자에게 잘 알려진 방법(예를 들어, 미국 특허 제8,828,700호 참조)을 사용하여 얻을 수 있고, 이의 개시내용은 전문이 참조에 의해 포함된다. 일부 실시형태에서, 이러한 융합 또는 키메라 중합효소는 열안정적이다. 일부 실시형태에서, 혼합물은 마스터 믹스 및/또는 반응 혼합물의 혼합물(예를 들어, TaqPathTM ProAmpTM Master Mix(Applied BiosystemsTM), TaqPathTM ProAmpTM Multiplex Master Mix(Applied BiosystemsTM), TaqManTM PreAmp Master Mix(Applied BiosystemsTM), TaqManTM Universal Master Mix II, UNG 있음(Applied BiosystemsTM), TaqManTM Universal PCR Master Mix II(UNG 없음)(Applied BiosystemsTM), TaqManTM Gene Expression Master Mix II, UNG 있음(Applied BiosystemsTM), EXPRESS qPCR Supermix, universal(Invitrogen), TaqManTM Fast Advanced Master Mix(Applied BiosystemsTM), TaqManTM Multiplex Master Mix(Applied BiosystemsTM), TaqManTM PreAmp Master Mix Kit(Applied BiosystemsTM), TaqManTM Universal PCR Master Mix, AmpErase™ UNG 없음(Applied BiosystemsTM), PowerUp SYBR Green Master Mix(Applied BiosystemsTM), 또는 FlashTaq HotStart 2X MeanGreen Master Mix(Empirical Biosciences))을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 혼합물은 적어도 하나의 세제; 글리세롤; 젤라틴과 알부민의 조합을 포함하는 PCR 저해제 차단제; 우라실 DNA 글리코실라제(UDG) 및 적어도 하나의 참조 염료(예를 들어, ROXTM, Mustang PurpleTM) 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시형태에서, 반응 혼합물은 표적 폴리뉴클레오티드 가닥의 표적 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, 제1 서열)을 포함하는 앰플리콘(들)을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 혼합물은 제2 폴리뉴클레오티드 가닥(예를 들어, 주요 대립유전자 변이체)의 서열을 포함하는 앰플리콘을 포함하지 않는다.
역전사효소
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 바와 같은 조성물, 반응 혼합물 및 키트는 또한 역전사 PCR(RT-PCR)과 같은 적어도 하나의 역전사효소(RT) 및 관련 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, RNA가 후속 분석을 위한 출발 물질인 경우, RT-PCR은 본원에 기술된 조성물, 반응 혼합물 및 키트를 사용하여 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, RT-PCR은 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 프라이머 및 1개이상의 프로브를 사용하는 1단계 절차일 수 있다. 일부 실시형태에서, RT-PCR은 단일 반응 튜브 또는 반응 용기, 예컨대 1-스텝 또는 1-튜브 RT-PCR에서 수행될 수 있다. 적합한 예시적인 RT는 예를 들어, 몰론 뮤린 백혈병 바이러스(M-MLV: Moloney Murine Leukemia Virus) 역전사효소, SuperScript 역전사효소(Thermo Fisher Scientific), SuperScript IV 역전사효소(Thermo Fisher Scientific) 또는 Maxima 역전사효소(Thermo Fisher Scientific) 또는 임의의 이러한 RT의 변형된 형태를 포함할 수 있다. 조성물, 반응 혼합물 및 키트는 또한 SuperScript IV VILO Master Mix(Thermo Fisher Scientific) 또는 임의의 다른 적합한 RT-PCR 마스터 믹스(상기에서 설명한 것을 포함)에서 찾을 수 있는 것과 같은 이러한 RT-PCR 반응을 수행하는 데 필요한 임의의 다른 성분을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는, "파장 범위", "파장 대역" 등의 용어는 "반치전폭"(FWHM: full width at half maximum) 파장 범위 또는 파장 대역을 의미할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는, 용어 FWHM 파장 범위 또는 FWHM 파장 대역은 광학 요소(예를 들어, 방사선 공급원 또는 스펙트럼 필터, 미러, 빔 스플리터, 격자 등)를 통과하는, 이로부터의 또는 이의 방사선이 해당 요소의 파장 범위 또는 파장 대역 내에서 최대 값의 절반과 같은 최대 파장 값과 최소 파장 값 사이의 차이와 동일한 정도를 갖는 파장 범위 또는 파장 대역을 의미한다.
파장 범위에 걸쳐 스펙트럼 함수(예를 들어, 흡수, 여기 또는 방출 스펙트럼 함수)에 의해 정의된 스펙트럼에 대해, 본원에서 사용되는, "피크 파장" 또는 "최대 파장"(예를 들어, "최대 흡수 파장" ", "최대 여기 파장", "최대 방출 파장")은 최대 또는 피크 파장에 대해 파장이 증가하거나 감소함에 따라 스펙트럼 함수가 감소하는 파장을 의미한다(예를 들어, 파장이 최대 또는 피크 파장으로부터 증가하거나 감소 - 예를 들어, 2나노미터 증가 또는 감소함에 따라 흡수, 여기 또는 방출이 감소함). 본원에서 사용되는, 피크 또는 최대값 파장은 전체 스펙트럼의 미리 결정된 부분에 대한 국소 피크 또는 최대값일 수 있거나 스펙트럼 함수의 값이 스펙트럼 전체에 걸친 임의의 다른 파장보다 큰 "절대 피크" 또는 "절대 최대값"일 수 있다.
본원에서 사용되는, 2개 이상의 스펙트럼(예를 들어, 2개 이상의 염료의 흡수, 여기 또는 방출 스펙트럼)의 피크 또는 최대값은 둘 이상의 스펙트럼의 피크 또는 최대값 사이의 차이가 15나노미터 이하일 때 서로 "동일", "거의" 또는 "실질적으로 동일한" 것으로 간주될 수 있다. 본원에서 사용되는, 스펙트럼(예를 들어, 염료의 흡수, 여기 또는 방출 스펙트럼)의 피크 또는 최대값은 스펙트럼의 피크 또는 최대값이 참조 파장 대역의 최소 또는 최대 한계의 15 나노미터 이내인 경우 (예를 들어, 여기 또는 방출 채널, 스펙트럼 요소 또는 필터의) 참조 파장 대역 "근처"인 것으로 간주될 수 있다. 본원에서 사용되는, 스펙트럼(예를 들어, 염료의 흡수, 여기 또는 방출 스펙트럼)의 피크 또는 최대값은, 참조 파장 대역에 대한 스펙트럼의 통합 값이 사용 가능한 파장 대역 세트의 다른 파장 대역에 대한 스펙트럼의 통합 값보다 큰 경우 사용 가능한 파장 대역(예를 들어, 여기 또는 방출 채널 세트, 스펙트럼 요소 또는 필터의 파장 밴드)의 세트에 속하는 참조 파장 대역에 "가장 가까운" 또는 "가장 근접한" 것으로 간주될 수 있다.
본원에서 사용되는 "방사 발생기" 또는 "발생기"는 전자기 방사선을 생성할 수 있는 공급원을 의미한다. 방사 발생기는 단일 광원, 예를 들어, 백열 램프, 가스 방전 램프(예를 들어, 할로겐 램프, 크세논 램프, 아르곤 램프, 크립톤 램프 등), 발광 다이오드(LED), 백색광 LED, 유기 LED(OLED), 레이저(예를 들어, 화학 레이저, 엑시머 레이저, 반도체 레이저, 고체 레이저, 헬륨 네온 레이저, 아르곤 레이저, 염료 레이저, 다이오드 레이저, 다이오드 펌핑 레이저, 섬유 레이저, 펄스 레이저, 연속 레이저) 등을 포함할 수 있다. 대안적으로, 방사 발생기는 다른 개별 방사 발생기와 중첩되지 않거나 부분적으로 중첩될 수 있는 상이한 파장 범위 또는 대역을 생성하도록 각각 구성된 복수의 개별 방사 발생기(예를 들어, 복수의 LED 또는 레이저)를 포함할 수 있다. 방사 발생기는 주로 가시광 범위(예를 들어, 400 나노미터 내지 700 나노미터 범위 또는 380 나노미터 내지 800 나노미터 범위 내의 파장 내의 전자기 방사선을 방출하는 "광원"), 근적외선 범위, 적외선 범위, 자외선 범위 또는 전자기 스펙트럼 내의 기타 범위 내에 있는 전자기 방사선을 특징으로 할 수 있다. 방사 발생기는 연속 또는 펄스 조명을 제공할 수 있으며 단일 빔 또는 공간적으로 및/또는 시간적으로 분리된 복수의 빔을 포함할 수 있다.
도 1을 참조하면, 특정 실시형태에서 시스템(1000)은 샘플 홀더 또는 용기(112) 내에 또는 그 위에 위치한 핵산 샘플(110)을 조명하도록 구성된 제1 방사원(101a)을 포함하고, 샘플(110)은 제1 방사원(101a)으로부터 방사선을 수신하도록 배치된다. 샘플(110)은 제1 표적 분자에 결합하도록 구성된 제1 염료 및 제2 표적 분자에 결합하도록 구성된 제2 염료를 포함한다. 방사원(101a)은 여기 광학 경로(125)를 따라 샘플(110)로 향하는 여기 빔을 생성하도록 구성된다. 시스템(1000)은 샘플(110)로부터의 방출을 측정하도록 구성된 센서 또는 검출기(115), 제1 평균 방출 파장을 특징으로 하는 제1 방출 스펙트럼 요소(121a), 및 제1 평균 방출 파장과 상이한 제2 평균 방출 파장을 특징으로 하는 제2 방출 스펙트럼 요소(121b)를 추가로 포함한다. 광학 요소 또는 렌즈(123)는 예를 들어, 샘플 홀더(112), 샘플(110) 및/또는 그로부터의 방출을 재영상화하기 위해 검출기(115)와 조합하여 사용될 수 있다. 광학 요소(123)는 샘플 홀더(112) 및/또는 샘플(110)로부터의 광 또는 방사선의 초점을 맞추거나 영상화하도록 구성된 투과 및/또는 반사 광학 요소의 형태일 수 있다.
각각의 방출 스펙트럼 요소(121a, 121b)는 파장 대역 또는 범위에 의해 추가로 특징규명될 수 있다. 방출 스펙트럼 요소(121a, 121b)의 파장 대역 또는 범위는 방출 스펙트럼 요소(121a)의 파장 대역 또는 범위가 방출 스펙트럼 요소(121b)의 파장 대역 또는 범위와 중첩되지 않거나 부분적으로만 중첩하도록 선택될 수 있다. 제1 표적 분자 및/또는 제2 표적 분자가 샘플(110)에 존재할 때, 상응하는 제1 및/또는 제2 염료로부터의 방출은 방출 광학 경로(126)를 따라 샘플(110)에서 검출기(115)로 향한다. 방출 스펙트럼 요소(121a, 121b)는 각각의 염료를 검출 및/또는 측정하기에 적합한 파장 대역을 통과시키거나 반사시키는 각각의 필터를 포함할 수 있다.
시스템(1000)은 샘플(110)에 대해 증폭 검정을 수행하도록 구성될 수 있다. 선택적으로 증폭 검정은 별도의 시스템에서 수행될 수 있으며 시스템(1000)을 사용하여 추가로 처리 및/또는 검사될 수 있다. 시스템(1000)은 또한 적어도 하나의 컴퓨터 또는 샘플(110)에 대한 증폭 검정을 수행하기 위한 명령어를 포함하는 적어도 하나의 메모리(도시되지 않음)를 포함하는 프로세서(130)를 포함할 수 있다. 증폭 검정 동안 및/또는 후에, 시스템(1000)은 방사원(101a)을 사용하여 샘플(110)을 조명하고 방출 스펙트럼 요소(121a, 121b)와 함께 검출기(115)를 사용하여 존재하는 임의의 표적 분자로부터의 방출을 검출 및/또는 측정하도록 구성된다. 프로세서(130)와 연관된 메모리는 증폭 검정 동안 또는 후에 적어도 1회 샘플(110)을 제1 방사원(101a)으로 조명하고, 이에 응답하여, (1) 검출기(115) 및 방출 스펙트럼 요소(121a)를 사용하여 샘플(110)로부터의 방출을 측정하고, (2) 검출기(115) 및 제2 방출 스펙트럼 요소(121b)를 사용하여 샘플(110)로부터 방출을 측정하도록 하는 명령어를 포함할 수 있다. 하기에 더 자세히 논의되는 바와 같이, 메모리는 예를 들어, 제1 및 제2 방출 스펙트럼 요소(121a, 121b)를 사용하여 샘플(110)로부터 측정된 방출을 각각 제1 표적 분자 및 제2 표적 분자의 양과 상관시킴으로써 샘플(110)에 존재하는 임의의 표적 분자의 양을 결정하도록 하는 명령어를 포함할 수 있다.
도 2를 참조하면, 또 다른 실시형태에서, 시스템(2000)은 제1 방사원(101a) 및 제2 방사원(102)을 포함하고, 여기서 제1 방사원(101a)은 제1 평균 여기 파장을 특징으로 하고 제2 방사원(102)은 제1 평균 여기 파장과 상이한 제2 평균 여기 파장을 특징으로 한다. 시스템(1000, 2000)에 대한 방사원(101a, 102)은 각각 파장 대역 또는 범위에 의해 추가로 특징규명될 수 있다. 방사원(101a, 101b)의 파장 대역 또는 범위는 방사원(101a)의 파장 대역 또는 범위가 방사원(101b)의 파장 대역 또는 범위와 중첩되지 않도록 선택될 수 있다. 샘플(110)은 제1 표적 분자에 결합하도록 구성된 제1 염료 및 제2 표적 분자에 결합하도록 구성된 제2 염료를 포함하며, 여기서 염료 중 하나 또는 둘 모두는 시스템(1000)과 관련하여 상기에 논의된 제1 및 제2 염료와 상이할 수 있다. 시스템(2000)은 시스템(1000)에서 사용되는 제1 방출 스펙트럼 요소(121a)와 동일하거나 상이할 수 있는 제1 방출 스펙트럼 요소(121a)를 선택적으로 포함할 수 있다. 시스템(1000, 2000)의 방사원(101a, 101b)은 각각의 여기 스펙트럼 요소(141a, 141b)의 조합으로 방사 방출기 또는 방사 발생기(132)를 포함할 수 있으며, 이것은 예를 들어, 각각의 염료의 여기에 적합한 파장 대역을 통과하거나 반사하는 각각의 여기 필터일 수 있다.
시스템(2000)은 샘플(110)에 대해 증폭 검정을 수행하도록 구성될 수 있다. 선택적으로, 증폭 검정은 별도의 시스템에서 수행될 수 있으며 시스템(2000)을 사용하여 추가로 처리 및/또는 조사될 수 있다. 증폭 검정 동안 및/또는 후에, 시스템(2000)은 방사원(101a, 101b)을 사용하여 샘플(110)을 조명하고 존재하는 경우 제2 방출 스펙트럼 요소(121a)와 함께 검출기(115)를 사용하여 존재하는 임의의 표적 분자로부터의 방출을 검출 및/또는 측정하도록 구성된다. 시스템(2000)에서 프로세서(130)와 연관된 메모리는 샘플(110)에 대해 증폭 검정을 수행하도록 하는 명령어를 포함할 수 있다. 프로세서(130)와 연관된 메모리는 증폭 검정 동안 또는 후에 적어도 1회 (1) 샘플(110)을 제1 방사원(101a)으로 조명하고, 이에 응답하여, 검출기(115) 및 선택적으로 방출 스펙트럼 요소(121a)를 사용하여 샘플(110)로부터의 방출을 측정하고, (2) 샘플(110)을 제2 방사선원(101b)으로 조명하고, 이에 응답하여, 검출기(115) 및 선택적으로 방출 스펙트럼 요소(121a)를 사용하여 샘플(110)로부터의 방출을 측정하도록 하는 명령어를 포함한다. 하기에 더 자세히 논의되는 바와 같이, 메모리는 예를 들어, 제1 및 제2 방사원(101a, 101b)으로 조명할 때, 샘플(110)로부터의 측정된 방출을 각각 제1 및 제2 표적 분자의 양과 상관시킴으로써, 샘플(110)에 존재하는 경우 제1 표적 분자의 양 및/또는 제2 표적 분자의 양을 결정하도록 하는 명령어를 추가로 포함할 수 있다. 적용 가능한 경우, 시스템(2000)은 시스템(1000)과 관련하여 본 명세서에서 상기에 논의된 요소 또는 특징 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 적용 가능한 경우, 프로세서(130) 및 시스템(2000)의 관련 메모리는 시스템(1000)과 관련하여 본 명세서에서 상기에 논의된 프로세서(130)의 요소 또는 특징 중 임의의 것을 포함할 수 있다.
도 3을 참조하면, 일부 실시형태에서, 시스템(3000)은 제1 및 제2 방사원(101a, 101b) 모두와 제1 및 제2 방출 스펙트럼 요소(121a, 121b) 모두를 포함한다. 이러한 실시형태에서, 샘플(110)은 제1 표적 분자에 결합하도록 구성된 제1 염료, 제2 표적 분자에 결합하도록 구성된 제2 염료, 및 제3 표적 분자에 결합하도록 구성된 제3 염료를 포함한다. 상기에 논의된 바와 같이, 제1 방사원(101a)은 제1 평균 여기 파장을 특징으로 하고, 제2 방사원(101b)은 제1 평균 여기 파장과 상이한 제2 평균 여기 파장을 특징으로 하는 반면, 제1 방출 스펙트럼 요소(121a)는 제1 평균 방출 파장 및 제2 방출 스펙트럼 요소(121b)는 제1 평균 방출 파장과 상이한 제2 평균 방출 파장을 특징으로 한다.
시스템(3000)은 샘플(110)에 대해 증폭 검정을 수행하도록 구성될 수 있다. 선택적으로 증폭 검정은 별도의 시스템에서 수행될 수 있으며 시스템(3000)을 사용하여 추가로 처리 및/또는 검사될 수 있다. 증폭 검정 동안 및/또는 후에, 시스템(1000)은 방사원(101a, 101b)을 사용하여 샘플(110)을 조명하고 방출 스펙트럼 요소(121a, 121b)와 함께 검출기(115)를 사용하여 존재하는 임의의 표적 분자로부터의 방출을 검출 및/또는 측정하도록 구성된다. 시스템(3000)은 샘플(110)에 대해 증폭 검정을 수행하도록 구성될 수 있다. 선택적으로 증폭 검정은 별도의 시스템에서 수행될 수 있으며 시스템(3000)을 사용하여 추가로 처리 및/또는 검사될 수 있다. 증폭 검정 동안 및/또는 이후에 시스템(3000)은, 증폭 검정 동안 또는 이후에 적어도 1회, (1) 샘플(110)을 제1 방사원(101a)으로 적어도 1회 조명하고, 이에 응답하여, 검출기(115) 및 제1 방출 스펙트럼 요소(121a)를 사용하여 샘플(110)로부터의 방출을 검출 또는 측정하고, 검출기(115) 및 제2 방출 스펙트럼 요소(121b)를 사용하여 샘플(110)로부터의 방출을 측정하고, (2) 제2 방사원(101b)으로 샘플(110)을 조명하고, 이에 응답하여 검출기(115) 및 제2 방출 스펙트럼 요소(121b)를 사용하여 샘플(110)으로부터의 방출을 검출 또는 측정하도록 구성된다. 하기에 더 자세히 논의되는 바와 같이, 메모리는 예를 들어, 제1 또는 제2 방사원(101a, 101b)으로 조명할 때, 샘플(110)로부터의 측정된 방출을 각각 제1, 제2 및 제3 표적 분자의 양과 각각 상관시킴으로써, 샘플(110)에 존재하는 경우 제1 표적 분자, 제2 표적 분자 및/또는 제3 표적 분자의 양을 결정하도록 하는 명령어를 포함할 수 있다.
적용 가능한 경우, 시스템(3000)은 시스템(1000, 2000)과 관련하여 상기에 논의된 요소 또는 특징 중 임의의 것을 혼입할 수 있다. 적용 가능한 경우, 시스템(3000)의 프로세서(130)는 프로세서(130) 및 시스템(1000, 2000)과 관련하여 상기 본원에 논의된 관련 메모리의 요소 및 특징 중 임의의 것을 혼입할 수 있다. 도 1 및 도 2와 관련하여 상기에 논의된 스펙트럼 요소(121a, 121b, 141a, 141b) 및 공급원(101a, 101b)의 실시형태가 또한 시스템(3000)의 요소 및 공급원에 또한 적용될 수 있다. 시스템(1000, 2000 또는 3000) 중 임의의 것은 예를 들어, 여기 스펙트럼 요소(141a, 141b)를 여기 광학 경로(125) 내부 및 외부로 선택적으로 이동시키기 위해 필터 휠, 병진 단계 등을 포함할 수 있다. 시스템(1000, 2000 또는 3000) 중 임의의 것은 예를 들어, 방출 스펙트럼 요소(121a, 121b)를 방출 광학 경로(126) 내부 및 외부로 선택적으로 이동시키기 위해 필터 휠, 병진 단계 등을 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 시스템(1000, 2000 또는 3000) 중 임의의 것은 방사원(101a, 101b)으로부터 샘플(110)로 방사선을 조정하거나 폴딩하는 적어도 하나의 빔 스티어링 광학 요소(beam steering optical element)(135)를 포함할 수 있다. 대안적으로, 시스템(1000, 2000, 3000) 중 임의의 것은 적어도 하나의 빔 스티어링 광학 요소(135)를 사용하여 샘플(110)로부터의 방출이 조정되거나 검출기(115)로 향하도록 구성될 수 있다. 빔 스티어링 광학 요소(135)를 사용하여, 여기 및 방출 광학 경로(125, 126)는 공통 경로 부분을 포함할 수 있으며, 여기서 광학 경로(125, 126)는 빔 스티어링 광학 요소(135)로부터 샘플(110)까지 중첩된다. 다른 실시형태에서, 여기 및 방출 광학 경로(125, 126)는 중첩되지 않거나 샘플(110)을 제외하고 공통 경로 부분을 갖는다. 예를 들어, 방출 빔 광학 경로(126)는 샘플 홀더(112)의 표면에 수직 또는 직교로 배치될 수 있지만, 여기 광학 경로(125)는 샘플 홀더(112)의 표면에 수직 또는 직교하지 않는 표면으로부터의 축외 각도에 배치될 수 있다. 시스템(1000, 2000, 3000)은 당업계에 알려진 다른 광학 구성을 추가로 또는 대안적으로 혼입할 수 있다. 예를 들어, 여기 및 방출 광학 경로(125, 126)가 샘플 홀더(112)의 공통 측면 또는 표면에 위치하는 도 1 내지 3에 도시된 반사 배열보다는, 여기 및 방출 광학 경로(125, 126)는 여기 광학 경로(125)가 샘플 홀더(112)의 하나의 측면 또는 표면에 위치하고, 방출 광학 경로(126)가 샘플 홀더(112)의 대향 측면 또는 표면에 위치하는 투과 배열로 구성될 수 있다. 시스템(1000, 2000 또는 3000)은 방사원(101a, 101b)으로부터의 방사선 또는 광 및/또는 샘플(112)로부터의 방출을 컨디셔닝하기 위한 다른 광학 요소를 추가로 포함할 수 있다.
도 4를 참조하면, 특정 실시형태에서, 시스템(4000)은 복수의 방사원(401) 및 복수의 방출 스펙트럼 요소(441)(예시된 실시형태에서 441a 내지 441f)를 포함한다. 예시된 실시형태에서, 각각의 방사원(401)은 방사 발생기(132) 및 6개의 여기 스펙트럼 요소(441) 중 하나를 포함한다. 특정 실시형태에서, 각각의 방사원(401)은 각각의 평균 여기 파장을 특징으로 할 수 있으며, 여기서 6개의 평균 여기 파장 중 하나 이상은 나머지 평균 여기 파장과 상이하다. 각각의 방사원(401)은 각각의 여기 파장 대역 또는 범위를 특징으로 할 수 있고, 여기서 여기 파장 대역 또는 범위 중 적어도 일부는 나머지 방사원(401) 중 임의의 것의 여기 파장 대역 또는 범위와 중첩하지 않는다. 특정 실시형태에서, 방사원(401a 내지 f) 중 임의의 것은 여기 스펙트럼 요소(401)와 조합하여(예를 들어, 여기 스펙트럼 요소(401a 내지 f) 각각의 하나와 함께) 하나 이상의 방사 발생기(132)를 포함할 수 있다.
시스템(4000)은 방사원(421a 내지 f)과 조합하여 사용하기 위한 검출기(115) 및 복수의 방출 스펙트럼 요소(421)(예시된 실시형태에서는 421a 내지 421f)를 더 포함한다. 샘플(110)은 시스템(3000)과 관련하여 논의된 바와 같이 3개의 표적 분자와 관련된 3개의 염료를 포함할 수 있다. 추가적인 개수의 방사원(401) 및 방출 스펙트럼 요소(421) 때문에, 시스템(4000)은 3개 초과의 염료를 검출 및/또는 측정하도록 구성된다. 6개의 방사원(401) 및 6개의 연관된 방출 스펙트럼 요소(421)를 사용하여, 종래 기술의 시스템은 최대 6개의 상응하는 표적 분자의 양을 결정하기 위해 최대 6개의 염료만을 검출하고 디콘볼루션할 수 있다. 본 명세서에서 하기에서 더 상세히 논의되는 바와 같이, 시스템(4000)은 6개 초과의 상응하는 표적 분자의 양을 결정하기 위해 6개 초과의 염료를 검출하고 디콘볼루션하도록 구성된다. 특정 실시형태에서, 시스템(4000)은 필드 렌즈(445) 또는 방사 발생기(132)로부터의 방사선 및/또는 샘플(112)로부터의 방출을 컨디셔닝하기에 적합한 다른 광학 요소를 포함할 수 있다.
도 4는 6개의 방사원(401a 내지 401f) 및 6개의 방출 스펙트럼 요소(421a 내지 421f)를 포함하는 시스템(4000)을 도시한다. 시스템(4000)은 6개 미만의 방사원 및/또는 6개 미만의 방출 스펙트럼 요소(예를 들어, 시스템(1000, 2000 또는 3000)과 유사)를 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 특정 실시형태에서, 시스템(4000)은 예를 들어, 시스템(4000)에 의해 검출 또는 측정될 수 있는 표적 분자의 수를 증가시키기 위해 그리고/또는 선택된 수의 표적 분자를 검출 또는 측정하기 위한 시스템(4000)의 정확성 또는 감도를 증가시키기 위해서, 6개 초과의 방사원 및/또는 6개 초과의 방출 스펙트럼 요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 시스템(4000)은 7개, 8개 또는 그 초과의 방사원(401) 및/또는 7개, 8개 또는 그 초과의 방출 스펙트럼 요소(421)를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 각각의 방출 스펙트럼 요소(421)는 색 분산성 요소, 예컨대, 프리즘, 회절 광학 요소, 분광계 또는 샘플 (110)로부터의 방출에 의해 조명되는 분광광도계로부터의 특정 파장 대역 또는 범위를 포함한다. 추가로 또는 대안적으로, 각각의 여기 스펙트럼 요소(441)는 하나 이상의 방사 발생기(132)에 의해서 제공되는 스펙트럼으로부터의 색 분산성 광학 요소 또는 프리즘과 같은 색 분산성 광학 요소로부터의 특정 파장 대역 또는 범위를 포함한다.
적용 가능한 경우, 시스템(4000)의 요소 또는 성분은 시스템(1000, 2000, 3000) 중 임의의 것과 관련하여 상기에 논의된 임의의 해당 요소의 실시형태의 형태를 취할 수 있다. 예를 들어, 방사 발생기(132), 샘플(110), 샘플 홀더(112), 프로세서(들)(130) 및 관련 메모리(들)는 임의의 시스템(1000, 2000, 3000)과 관련하여 상기에 논의된 동일한 요소 또는 성분의 형태를 취할 수 있다. 여기 스펙트럼 요소(441)의 일부 또는 전부는 여기 스펙트럼 요소(141a) 또는 여기 스펙트럼 요소(141b)와 관련하여 상기에 논의된 실시형태 중 임의의 형태를 취할 수 있다. 방출 스펙트럼 요소(421)의 일부 또는 전부는 방출 스펙트럼 요소(121a) 또는 여기 스펙트럼 요소(121b)와 관련하여 상기에 논의된 실시형태 중 임의의 형태를 취할 수 있다. 임의의 또는 모든 방사원(401a 내지 401f)은 방사원(101a) 또는 방사원(101b)과 관련하여 상기에 논의된 실시형태 중 임의의 형태를 취할 수 있다.
시스템(1000, 2000, 3000, 4000)은 생물학적 기기 및 시스템 분야에서 알려진 다른 렌즈, 필터, 미러, 프리즘, 회절 광학 요소 등을 통합할 수 있다. 특정 실시형태에서, 추가 렌즈 또는 다른 영상화 광학 요소가 시스템(1000, 2000, 3000, 4000)의 여기 및 방출 광학 경로(예를 들어, 광학 경로(125, 126))를 따라 포함될 수 있다. 예를 들어, 필드 렌즈는 근위 샘플 홀더(112)(예를 들어, 도 4의 근위 샘플 홀더(112)에 도시된 필드 렌즈(445))에 위치될 수 있다. 일부 실시형태에서, 샘플 홀더(112)와 검출기(115) 사이의 광학 경로를 따라 추가 영상화 광학 장치가 위치하여 영상을 중계하거나 샘플(110)로부터 방출을 달리 컨디셔닝한다. 1000, 2000, 3000, 4000의 실시형태는 US6818437, US2004/0009586, US9702823, 또는 US2016/0230210에 개시된 임의의 광학 요소 또는 구성을 포함할 수 있고, 이들 문헌은 전문이 참조에 의해 본원에 포함된다.
시스템(1000, 2000, 3000, 4000)의 여기 및/또는 방출 광학 경로를 따르는 광학 요소(123) 또는 임의의 다른 영상화 광학 요소는 굴절 렌즈, 미러, 회절 또는 홀로그램 광학 요소 등 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 스펙트럼 요소(121, 141, 421, 441) 중 하나 이상은 유색 기판, 이색성 요소, 예컨대, 필터, 미러 또는 빔 스플리터, 또는 분산성 광학 요소, 예컨대, 프리즘, 회절 격자 또는 홀로그램 격자 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 임의의 시스템(1000, 2000, 3000, 4000)에 대해, 검출기(115)는 광다이오드, 광전자 증배관, 볼로미터, 극저온 검출기, 양자점, 발광 다이오드(LED), 반도체 검출기, HgCdTe 검출기 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 하나 이상의 개별 광검출기를 포함할 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 검출기(115)는 센서 또는 픽셀의 어레이를 포함하는 어레이 센서를 포함할 수 있다. 어레이 센서는 상보성 금속 산화물 반도체 센서(CMOS: complementary metal-oxide-semiconductor sensor), 전하 결합 소자(CCD: charge-coupled device) 센서, 복수의 포토다이오드 검출기, 복수의 광전자 증배관 등 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 검출기(115)는 2개 이상의 어레이 센서를 포함한다.
시스템(4000)은 방사 발생기(132)로부터 샘플(110)까지 여기 광학 경로를 따라 여기 빔을 안내하고/하거나 샘플(110)로부터 검출기(115)로 방출 광학 경로를 따라 방출을 안내하기기 위해 복수의 빔 스티어링 광학 요소(435)를 포함할 수 있다. 예시된 실시형태에서, 각각의 여기 스펙트럼 요소(441)는 회전(449)에 결합되는 경우. 빔 스티어링 광학 요소(135, 435)는 시스템(1000, 2000, 3000)과 관련하여 상기에 논의된 빔 스티어링 광학 요소(135)에 관련하여 상기에 논의된 실시형태 중 임의의 형태를 취할 수 있다. 도 4에 도시된 예시된 실시형태에서, 시스템(4000)은 6개의 여기 스펙트럼 요소(441) 각각에 대해 하나씩, 6개의 빔 스티어링 광학 요소(435)를 포함한다. 빔 스티어링 광학 요소(135, 435) 중 하나 이상은 방사원(401) 중 하나 및/또는 방출 스펙트럼 요소(421) 중 하나의 스펙트럼에 대응하거나 이를 보완하는 스펙트럼을 특징으로 하는 하나 이상의 스펙트럼 선택적 광학 요소(예를 들어, 이색성 거울, 필터 또는 빔 스플리터)를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 빔 스티어링 광학 요소(135, 435) 중 하나 이상은 광대역 파장에 걸쳐 일정한 또는 본질적으로 일정한 투과율(예를 들어, 가시광선, 적외선 및/또는 UV 파장 대역에 걸쳐서, 일부 또는 모든 스펙트럼 요소(421, 441)의 파장 대역에 걸쳐 그리고/또는 방사원(400)의 일부 또는 모든 파장 대역에 걸쳐 일정한 투과율을 가짐)을 갖는 중성 농도 필터(neutral density 필터)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 빔 스티어링 광학 요소(135, 435)는 소정의 파장 대역에서 1%, 5%, 10%, 20%, 25%, 50%, 75%, 80%, 90%, 95% 또는 99%의 투과율을 갖는 하나 이상의 중성 농도 필터를 포함할 수 있다. 예시된 실시형태에서, 빔 스티어링 광학 요소(435)는 필터 휠(449)에 결합된다. 대안적으로, 빔 스티어링 광학 요소(435)는 각각의 빔 스티어링 광학 요소(435)가 방출 스펙트럼 요소(421a 내지 421f)의 각각의 하나에 대응하도록 필터 휠(429)에 결합될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 빔 스티어링 광학 요소(135, 435)는 방사원(401), 여기 스펙트럼 요소(441) 및 방출 스펙트럼 요소(421)와 독립적으로 이동될 수 있다. 빔 스티어링 광학 요소(135, 435)의 수는 예를 들어, 여기 스펙트럼 요소(441)에 의해 제공되는 파장 대역의 수 또는 방출 스펙트럼 요소(421)의 총 수를 증가시키기 위해 방사원(401)의 총 수 또는 방출 스펙트럼 요소(421)의 총 수를 증가시킨다.
도 1 내지 도 4에 도시된 스펙트럼 요소(121(예를 들어, 121a, 121b), 141(예를 들어, 141a, 141b), 421(예를 들어, 421a 내지 421f), 441(예를 들어, 441a 내지 441f))는 스펙트럼 필터를 포함할 수 있고, 각각의 필터는 투과 파장 대역 또는 범위 및/또는 평균 투과 파장을 특징으로 한다. 임의의 스펙트럼 요소(121, 141, 421, 441)는 샘플로부터의 방출을 원하는 또는 미리 결정된 파장 범위 또는 대역으로 필터링하도록 구성된 투과형 또는 반사형 광학 필터를 포함할 수 있다. 예를 들어, 임의의 스펙트럼 요소(121, 141, 421, 441)는 컬러 필터, 이색성 필터, 이색성 미러 또는 이색성 빔 스플리터 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 스펙트럼 요소(121, 141, 421, 441)는 프리즘 또는 회절 격자, 분광계 또는 분광광도계와 같은 분산성 광학 요소를 통과한 샘플(110)로부터의 방출을 포함할 수 있다. 이러한 실시형태에서, 각각의 스펙트럼 요소(121, 141, 421, 441)는 분산성 광학 요소에 의해 생성된 스펙트럼의 상이한 부분을 포함한다. 방출 스펙트럼 요소(121, 421)는 필터 휠(예를 들어, 도 4의 필터 휠(429)) 또는 유사한 이동 장치에 부착되어 요소(121, 421) 중 다른 요소를 검출기(115)와 샘플(110) 사이의 광학 경로 내외로 이동시킬 수 있다.
도 1 내지 도 4에 도시된 방사원(101)(예를 들어, 101a 및/또는 101b) 중 임의의 것인 (401)은 복수의 여기 스펙트럼 요소(141a, 141b)로부터의 각각의 하나와 조합된 하나 이상의 방사 발생기(132)(예를 들어, 하나 이상의 광원 또는 광 및/또는 UV 방사선의 다른 광대역 공급원)를 포함할 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 방사원(101, 401) 중 하나 이상은 각각의 표적 분자와 회합될 수 있는 염료를 여기시키기 위해 선택된 광 또는 다른 전자기 방사선의 스펙트럼 또는 파장 대역을 갖는 유색 또는 협대역 LED, 레이저, 방전관 등과 같이 비교적 좁은 파장 범위 또는 대역을 갖는 방사 발생기(132)를 포함할 수 있다. 이러한 실시형태에서, 예를 들어, 샘플(110)로 안내된 방사선의 스펙트럼을 더욱 좁게 하거나 달리 컨디셔닝하기 위해서 여기 스펙트럼 요소(141(예를 들어, 141a, 141b), 441(예를 들어, 441a 내지 441f 중 임의의 것)) 중 하나 이상이 선택적으로 포함될 수 있다. 도 4에 도시된 바와 같이, 여기 스펙트럼 요소(441)는 방사 발생기(132)와 샘플(110) 사이의 광학 경로 내외로 요소(441) 중 다른 것을 이동시키기 위해 필터 휠(449) 또는 유사한 이동 장치에 부착될 수 있다. 일부 실시형태에서, 방사원(101, 401)은 각각 방사 발생기 및 방사 발생기로부터의 방사선을 투과 또는 반사하도록 구성된 색 분산성 광학 요소를 포함할 수 있고, 각각의 방사원은 색 분산성 광학 요소로부터의 스펙트럼의 상이한 부분을 포함한다.
시스템(1000, 2000, 3000, 4000) 내의 샘플 홀더(112)는 샘플(110)이 샘플 홀더(112) 상에 배치되거나 샘플 홀더(112) 내에, 예를 들어 샘플 웰, 관통 구멍 또는 표면 영역 내에 배치되는 플레이트 또는 표면을 포함할 수 있다. 실시형태에서, 샘플(110)은 복수의 공간적으로 분리된 샘플 부분, 예를 들어 복수의 공간적으로 분리된 샘플 부위, 예컨대, 복수의 샘플 웰, 관통 구멍 또는 표면 영역 내에 분리된 샘플 용액을 포함한다. 각각의 샘플 부분은 동일하거나 실질적으로 동일한 양의 하나 이상의 표적 분자를 포함할 수 있고, 상이한 양 또는 유형의 하나 이상의 표적 분자를 포함하거나, 표적 분자를 포함하지 않을 수 있다(예를 들어, dPCR 샘플 부분). 샘플 홀더(112)는 스트립 또는 마이크로타이터 플레이트(예를 들어, 4, 6 또는 8개의 웰의 스트립 또는 24개의 웰, 48개의 웰, 96개의 웰, 384개의 웰, 1536개의 웰 또는 3456개의 웰을 포함하는 마이크로타이터 플레이트)를 포함할 수 있다. 대안적으로, 샘플 홀더(112)는 각각 샘플(110)의 일부를 포함하는 반응 부위 또는 챔버의 어레이를 포함하는 카드 또는 플레이트(예를 들어, 384 또는 9,216개의 샘플 챔버 또는 반응 부위를 포함하는 카드 또는 플레이트)를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 샘플 홀더(112)는 각각 샘플(110)의 일부를 포함하는 공간적으로 분리된 관통 구멍의 어레이를 포함하는 플레이트 또는 칩(예를 들어, 3,072개의 관통 구멍, 20,000개의 관통 구멍, 50,000개의 관통 구멍, 100,000개의 관통 구멍 또는 100,000개 이상의 관통 구멍을 함유하는 관통 구멍 플레이트 또는 칩)을 포함한다. 특정 실시형태에서, 샘플 홀더(112)는 샘플(110)의 일부 및 선택적으로 액적들 사이에 배치된 비혼화성 유체 또는 오일을 포함하는 복수의 샘플 액적 또는 슬러그를 포함하는 튜브, 채널 또는 모세관을 포함한다. 각각의 액적 부분 또는 슬러그는 동일하거나 실질적으로 동일한 양의 하나 이상의 표적 분자를 포함할 수 있고, 상이한 양 또는 유형의 하나 이상의 표적 분자를 포함하거나, 표적 분자를 포함하지 않을 수 있다(예를 들어, dPCR 샘플 액적 또는 슬러그).
적용 가능한 경우, 프로세서(130) 및 시스템(4000)의 관련 메모리는 시스템(1000, 2000, 3000)과 관련하여 본 명세서에서 상기에 논의된 프로세서(130)의 요소 또는 특징 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 도 4에 나타낸 예시적 실시형태와 같이, 프로세서(130) 및 관련 메모리는 예를 들어, 증폭 검정을 수행하고/하거나 방사원(401a 내지 401f) 중 임의의 것으로 샘플(110)을 조명하고/하거나 방출 스펙트럼 요소(421a 내지 421f) 중 임의의 것으로 샘플(110)로부터의 방출을 검출 또는 측정하는 것에서 도 1 내지 도 3과 관련하여 상기에 논의된 임의의 명령어를 포함하도록 구성될 수 있다. 시스템(1000, 2000, 3000, 4000)의 특정 실시형태에서, 프로세서(130) 및/또는 관련 메모리의 전부 또는 일부는 하우징에 포함될 수 있는 단일 기기에 통합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 프로세서(130) 및/또는 관련 메모리의 전부 또는 일부는 시스템(1000)의 나머지 부분과 별도로 위치할 수 있으며, 여기서 이들은 물리적 케이블, 근거리 통신망, 광역 통신망 등을 통해 서로와 물리적으로 연결된다. 추가로 또는 대안적으로, Wi-Fi 연결, 이들은 블루투스 연결, 클라우드 연결 등을 통해 서로 무선으로 연결될 수 있다.
특정 실시형태에서, 시스템(1000, 2000, 3000, 4000) 중 임의의 것은 하나 이상의 프로세서(130) 및 각각의 시스템에 대해 상기에 논의된 명령어를 포함하는 관련 메모리를 갖는 단일 시스템 또는 기기를 포함할 수 있다. 대안적으로, 시스템(1000, 2000, 3000, 4000) 중 임의의 것은 이들 작업 중 하나 이상을 수행하도록 구성된 제2 시스템 또는 기기를 포함할 수 있다. 이러한 실시형태에서, 시스템(1000, 2000, 3000, 4000)은 이들 작업 중 일부를 각각 수행하는 둘 이상의 시스템 또는 기기를 포함할 수 있다. 각각의 이러한 시스템 또는 기기는 그 자신의 프로세서 및/또는 메모리를 가질 수 있거나, 대안적으로 예를 들어, 클라우드 저장 시스템과 같은 중앙 집중식 저장 시스템 및/또는 집중식 프로세서 또는 프로세서 시스템, 예컨대, 클라우드 컴퓨팅 프로세서 또는 시스템을 사용하여 공통 프로세서 및/또는 메모리를 공유할 수 있다.
시스템(1000, 2000, 3000, 4000)은 증폭 검정, 예컨대, PCR 검정(예를 들어, qPCR 또는 dPCR 시스템 또는 기기 또는 용융 검정을 수행하도록 구성된 시스템 또는 기기)의 결정 후에 샘플(110) 중의 하나 이상의 염료로부터의 방출을 측정하도록 구성된 최종-지점 시스템일 수 있다. 도 5를 참조하면, 특정 실시형태에서, 증폭 시스템(5000)은 시스템(1000, 2000, 3000 또는 4000)의 광학 성분(예를 들어, 방사원, 스펙트럼 요소, 검출기, 빔 스티어링 광학 요소 등), 프로세서(130), 샘플 홀더(112), 및 샘플 홀더(112)를 수용하도록 구성된 열 블록(502) 및 PCR 또는 기타 증폭 검정을 수행하도록 구성된 온도 컨트롤러 또는 열 사이클러(504)를 포함하는 열 컨트롤러 또는 시스템을 포함한다. 시스템(5000)은 열 블록(502) 반대편에 위치하고 샘플 홀더(112) 및/또는 샘플(110)의 온도 및/또는 환경을 추가로 제어하도록 구성된 가열된 커버(도시하지 않음)를 추가로 포함할 수 있다. 프로세서(130)는 증폭 검정의 수행 동안 시스템(5000)을 제어하고 증폭 검정 동안 샘플(100)에 존재하는 하나 이상의 염료로부터의 방출을 1회 이상 검출하거나 측정하기 위해 광학 성분을 작동시키도록 구성된다. 시스템(5000)은 예를 들어, 하나 이상의 염료와 연관된 하나 이상의 분자의 양을 결정하는 데 사용하기 위해서 또는 증폭 검정 후에 수행되는 용융 검정 동안 염료로부터 방출을 검출하거나 측정하기 위해 증폭 검정의 완료 후에 하나 이상의 염료로부터의 방출을 검출하거나 측정하도록 추가로 구성될 수 있다. 특정 실시형태에서, 시스템(5000)은 열 순환을 사용하지 않고 샘플(110)에 대한 증폭 검정을 수행한다. 그러한 실시형태에서, 시스템(5000)은 열 블록(502) 없이 및/또는 열 사이클러(504) 없이 구성될 수 있다.
도 6을 참조하면, 시스템(4000 및/또는 5000)의 실시형태에 따른 방사원(401)(예를 들어, 여기 스펙트럼 요소(441a 내지 441f)와 조합된 방사 발생기(132)) 및 방출 스펙트럼 요소(421)의 선택에 대한 예가 제공된다. "Ex"라고 표시된 열의 각각의 항목은 시스템(4000)의 여기 "채널"이며, 여기에서 각각의 Ex 또는 여기 채널은 샘플(110)의 조명을 위한 파장 범위 또는 대역을 나타낸다. 각각의 여기 채널에 대해 표시된 숫자는 방사원(401a 내지 401f) 중 각각의 하나에 대한 평균 또는 중심 여기 파장이다. 각각의 여기 채널에 대한 파장 대역은 해당 여기 또는 Ex 채널에 대한 평균 또는 중심 투과 파장에 대한 나노미터 단위의 "±" 수치 값으로 표시된다(예를 들어, 예시된 실시형태에서 여기 또는 Ex 채널 x1의 파장 대역은 480±10나노미터 또는 470나노미터 내지 490나노미터임). 특정 실시형태에서, 평균 또는 중심 여기 파장의 선택은 예를 들어, 특정 염료 세트, 표적 분자의 선택 및/또는 검정 화학을 수용하기 위해 도 6에 도시된 것과 다를 수 있다. 예를 들어, Ex 채널 x1-x6에 대한 평균 또는 중심 파장은 도 6의 표에 제시된 값에 대해 ±5 나노미터의 범위 내에 있도록 선택될 수 있다(예를 들어, Ex 채널 x1에 대한 평균 또는 중심 파장은 480 나노미터±5 나노미터로 선택될 수 있고, Ex 채널 x2에 대한 평균 또는 중심 파장은 520 나노미터±5나노미터 등으로 선택될 수 있음). 또한, Ex 채널의 폭은 도 6에 나타낸 폭보다 넓거나 좁을 수 있다. 예를 들어, 임의의 Ex 채널에 대한 폭은 소정의 채널에 대한 평균 또는 중심 값에 대해서 ±5나노미터, ±10나노미터, ±12나노미터, ±15나노미터, ±18나노미터, ±20나노미터보다 작거나 같을 수 있다.
"Em"이라고 표시된 행의 각각의 항목은 시스템(4000)의 방출 "채널"이며, 여기서 각각의 Em 또는 방출 채널은 방출 스펙트럼 요소(421(예를 들어, 421a 내지 421f)) 중 각각의 하나에 의해서 투과, 반사 및/또는 회절된 후 검출기(115)에 의해 수신되는 샘플(110)로부터의 방출(예를 들어, 형광 방출)을 나타낸다. 각각의 방출 채널에 대해 나타낸 숫자는 각각의 방출 스펙트럼 요소(421)에 대한 평균 또는 중심 방출 파장이다. 각각의 방출 채널에 대한 파장 대역은 해당 방출 또는 Ex 채널에 대한 평균 또는 중심 전송 파장에 대한 나노미터 단위의 "±" 수치 값으로 표시된다(예를 들어, 예시된 실시형태에서 방출 또는 Em 채널 m1의 파장 대역은 520±15나노미터 또는 505나노미터 내지 535나노미터임). 특정 실시형태에서, 평균 또는 중심 방출 파장의 선택은 예를 들어, 특정 염료 세트, 표적 분자의 선택 및/또는 검정 화학을 수용하기 위해 도 6에 도시된 것과 다를 수 있다. 예를 들어, Em 채널 m1-m6에 대한 평균 또는 중심 파장은 도 6의 표에 제시된 값에 대해 ±5 나노미터의 범위 내에 있도록 선택될 수 있다(예를 들어, Em 채널 m1에 대한 평균 또는 중심 파장은 480 나노미터±5 나노미터로 선택될 수 있고, Em 채널 m2에 대한 평균 또는 중심 파장은 520 나노미터±5나노미터 등으로 선택될 수 있음). 또한, Em 채널의 폭은 도 6에 나타낸 폭보다 넓거나 좁을 수 있다. 예를 들어, 임의의 Em 채널에 대한 폭은 소정의 채널에 대한 평균 또는 중심 값에 대해서 ±5나노미터, ±10나노미터, ±12나노미터, ±15나노미터, ±18나노미터, ±20나노미터보다 작거나 같을 수 있다.
도 6에서 Ex 열의 우측 및 Em 행 아래에 있는 나머지 요소는 특정 여기 파장 범위에 대해 특정 방출 파장 범위에 걸쳐 샘플(110)의 하나 이상의 염료로부터의 방출을 검출하거나 측정하기에 적합한 다양한 여기/방출 채널 조합 또는 쌍(본 명세서에서는 ex-em 채널 조합 또는 쌍, 또는 단순히 채널 조합 또는 쌍이라고 함)을 나타낸다. 특정 실시형태에서, 채널 조합은 조합의 상응하는 여기 채널의 파장 대역 내에 또는 그 근처에 있는 최대 흡수(또는 여기) 파장과 조합의 상응하는 여기 채널의 방출 채널의 파장 대역 내에 또는 그 근처에 있는 최대 방출 파장을 갖는 염료에 해당할 수 있다. 예를 들어, x1, m1 채널 조합(본 명세서에서 x1/m1로 지정되고 "A1"로 표시됨)은 (1) x1 채널의 480±10 나노미터 파장 대역 내에 있거나 가장 가까운 최대 흡수 파장 및 (2) 해당 m1 채널의 520±15 나노미터 대역 내에 있거나 가장 가까운 최대 방출 파장을 갖는 염료를 검출하거나 측정하는 데 사용될 수 있다. 또 다른 예로서, x1, m3 채널 조합(x1/m3 및 "B13"으로 표시됨)은 (1) x1 채널의 480±10 나노미터 대역 내에 있거나 가까운 최대 흡수 파장 및 (2) 해당 m3 채널의 587±10 나노미터 대역 내에 있거나 가까운 최대 방출 파장을 갖는 임의의 염료를 검출하거나 측정하는 데 사용될 수 있다. 이러한 염료는 용이하게 검출되거나 측정되는 여기/방출 채널에 의해 언급될 수 있다(예를 들어, 현재 실시예에 대해 "A1 염료" 및 "B13 염료"). 소정의 염료는 그 염료가 설계된 여기/방출 채널 조합 외부로 확장되는 흡수 및/또는 방출 스펙트럼을 가질 수 있음을 이해할 것이다.
A1-A6으로 표시된 여기/방출 채널 조합은 "축상 채널" 또는 "축상 채널 조합"으로 지칭될 수 있으며, 여기서 상응하는 최대 여기 파장 및 최대 방출 파장을 갖는 염료는 "축상 염료"로 지칭될 수 있다. 도 6의 축상 채널이 아닌 다른 모든 여기/방출 채널 조합은 "축외 채널" 또는 "축외 채널 조합"으로 지칭될 수 있으며, 여기서 상응하는 최대 여기 파장 및 최대 방출 파장을 갖는 염료는 "축상 염료"로 지칭될 수 있다. 문자 B로 시작하는 축외 채널 조합(즉, B12 내지 B56)은 스톡스 이동을 또한 생성하는 염료에 적합하지만 이러한 염료는 축상 채널 조합과 함께 사용하기에 더 적합한 염료보다 더 큰 스톡스 이동을 가질 수 있다. 따라서, 축외 염료는 일반적으로 축상 염료보다 최대 흡수 파장과 상응하는 최대 방출 파장 사이의 더 큰 이동(예를 들어, 스톡스 이동)을 생성한다. 문자 C로 시작하는 축외 채널(즉, C12 내지 C56)은 소위 "반 스톡스(anti-Stokes)" 또는 "업컨버팅(up-converting)" 형광 염료에 적합한데, 여기서 염료는 최대 흡수 파장 또는 파장 대역보다 작은 최대 방출 파장 또는 파장 대역을 갖는다.
본원에서 사용되는, "축상 채널 조합" 또는 "축상 ex-em 채널 쌍"은 Em 채널의 평균 또는 중심 파장이 상응하는 Ex 채널로부터 60 나노미터 이하인 양만큼 이동된 한 쌍의 ex-em 채널이다. 대안적으로, Ex 및 Em 채널 세트의 경우 "축상 채널 조합" 또는 "축상 ex-em 채널 쌍"은 소정의 Ex 채널의 평균 또는 중심 파장으로부터 가장 작은 평균 또는 중심 파장 이동을 갖는 소정의 Ex 채널 및 Em 채널을 포함한다. 이러한 정의 하에서 "축외 채널 조합" 또는 "축외 ex-em 채널 쌍"은 "축상 채널 조합" 또는 "축상 ex-em 채널 쌍"이 아닌 임의의 ex-em 채널 쌍이다.
달리 언급되지 않는 한, 하나 이상의 축상/축외 채널 조합 및 하나 이상의 축상/축외 ex-em 채널 조합을 포함하는 시스템 또는 기기와 관련하여 본원에서 사용되는, "축외 염료"는 염료의 전체 스펙트럼에 걸쳐 절대 최대값인 제1 최대 흡수 또는 여기 파장을 갖고, 국지 최대값이고 제1 최대 흡수 또는 여기 파장과 적어도 60 나노미터만큼 분리된 제2 최대 흡수 또는 여기 파장을 갖는 염료로서 정의된다(예를 들어, 도 16 참조, 여기서 B13은 약 68 나노미터만큼 분리된 2개의 최대 파장을 갖고 B4는 약 100 나노미터만큼 분리된 2개의 최대 파장을 가짐). 이러한 축외 염료의 정의를 사용하면, "축상 염료"는 축외 염료가 아닌 모든 염료이다.
일부 축상 염료는 "확장된 염료"일 수 있다. 본원에서 사용되는, "확장된 염료"는 염료의 전체 스펙트럼에 걸쳐 절대 최대값인 제1 최대 흡수 또는 여기 파장을 갖고, 국지 최대값이고 제1 최대 흡수 또는 여기 파장과 60 나노미터 미만만큼 분리된 제2 최대 흡수 또는 여기 파장을 갖는 축상 염료로서 정의된다. 확장된 염료는 축상 및 축외 채널 조합의 조합을 사용하여 검출되거나 측정될 수 있는 염료의 수를 늘리기 위해 다른 축상 염료와 조합하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 축상 채널 조합(예를 들어, A1 채널 조합)을 사용하여 최대 신호를 생성하는 제1 축상 염료를 선택하고, 두 염료의 동일한 농도에 대해서 제1 염료에 의해서 생성되는 것보다 인접한 축외 채널 조합(예를 들어, B12 채널 조합)보다 더 높은 신호를 생성하는 제2의 확장된 염료와 조합하여 사용할 수 있다.
특정 실시형태에서, "축외 염료"는 "대형 염료" 또는 "에너지 전달 염료 접합체"를 포함하고, 여기서 축외 염료는 2개의 "축상 염료": 링커를 통해 공유 부착된 "도너 염료" 및 "억셉터 염료"(예를 들어, 미국 특허 US5800996호 참조, 전문이 본원에 참조에 의해 포함됨)를 포함한다. 이러한 정의는 임의의 국소 최대 흡수 또는 여기 파장 쌍 사이의 이동량과 무관할 수 있다. 도너 염료와 억셉터 염료는 링커에 의해 연결되며, 여기서 도너 염료는 제1 파장의 빛을 흡수하여 여기 에너지를 생성할 수 있는 염료이고, 억셉터 염료는 도너 염료에 의해 생성된 여기 에너지의 적어도 일부를 흡수하고 이에 응답하여 억셉터 염료 자체(즉, 도너 염료에 연결되지 않은 경우)의 최대 방출 파장과 동일하거나 실질적으로 동일한 제2 파장에서 형광을 낼 수 있는 염료이다.
특정 실시형태에서, 한 쌍의 염료는 서로 비교하여 이들의 스펙트럼 특징 면에서 "축상 염료" 또는 "축외 염료"로 간주될 수 있다. 예를 들어, 제1 염료와 제2 염료가 동일하거나 거의 동일한 최대 흡수 또는 여기 파장을 갖지만(예를 들어, 흡수 또는 여기 최대값은 서로 5 나노미터 이내이거나 기기 또는 시스템의 공통 여기 채널로부터 최대량의 방사선을 흡수함) 제2 염료의 최대 방출 파장이 제1 염료의 것보다 적어도 50 나노미터 더 클 때(예를 들어, 도 16을 참조하면, 염료 A1, B13 또는 B14는 모두 거의 동일한 최대 흡수 파장을 갖지만, "축외 염료" B13, B14는 각각 최대 방출 파장이 "축상 염료" A1보다 50 나노미터 초과만큼 더 큼) 샘플 내의 제1 염료는 "축상 염료"로 간주될 수 있고 제2 염료는 "축외 염료"로 간주될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 제1 염료와 제2 염료가 동일하거나 거의 동일한 최대 방출 파장(예를 들어, 서로 2나노미터 이내이거나 기기 또는 시스템의 공통 방출 채널의 파장 대역에 걸쳐 최대 방출을 생성하는 방출 최대값)을 갖지만 제2 염료의 최대 흡수 또는 여기 파장이 제1 염료의 최대 흡수 또는 여기 파장의 것보다 적어도 60 나노미터 더 작을 때(예를 들어, 도 16을 참조하면, 염료 쌍 A3, B13 또는 A4, B14의 경우, 각각의 염료 쌍은 거의 동일한 최대 흡수 파장(각각 약 565 나노미터 및 약 600 나노미터)을 갖지만, "축외 염료" B13, B14는 각각 "축상 염료" A1의 것보다 적어도 60 나노미터 더 작은 최대 흡수/여기 파장을 가짐) 샘플 내의 제1 염료는 "축상 염료"이고 제2 염료는 "축외" 염료로 간주될 수 있다.
6개의 여기 채널과 6개의 상응하는 방출 채널의 경우, 도 6에 도시된 바와 같이, 본 발명자들은 샘플로부터(즉, 채널 조합 A1-A6 및 B12-B56에 대해) 21개의 모든 상이한 방출 신호를 얻거나 멀티플렉싱하는 것이 가능하다는 것을 발견하였다. 특정 실시형태에서, 본 발명자들은 샘플로부터 18 내지 20개의 상이한 방출 신호를 얻거나 멀티플렉싱하는 것이 가능하다는 것을 발견하였다(예를 들어, B56을 제외한 모든 채널 조합 및/또는 인접하는 ex 및/또는 em 채널의 중심 파장 사이의 차이가 작은 다른 채널 조합을 사용함; 예를 들어, 차이는 30 나노미터 이하 또는 25 나노미터 이하임). 본 명세서에서 아래에 논의된 바와 같이, 본 발명자들은 단일 PCR 검정 동안 적어도 10개의 염료(예를 들어, 6개의 축상 염료 및 4개의 축외 염료)를 선택하여 동일한 샘플 용액에 함유된 10개의 상이한 표적 분자의 양을 결정하거나 측정할 수 있음을 발견하였다.
도 6에 도시된 6개의 여기 채널(x1 내지 x6) 및 6개의 방출 채널(m1 내지 m6)의 조합은 본 개시내용의 다양한 실시형태를 설명하기에 적합한 예시적인 실시형태를 제공한다. 각각의 ex/em 채널 x1 내지 x6 및 m1 내지 m6에 대한 중심 파장 및 파장 대역은 예를 들어, 고려되는 특정 세트의 염료 및/또는 프로브 및 표적 분자의 개선된 측정을 제공하기 위해 다양한 시스템 또는 검정 구성을 수용하도록 변형될 수 있다. ex/em 채널의 수는 예를 들어 7, 8 또는 그 초과의 여기 채널 및/또는 7, 8 또는 그 초과의 방출 채널을 사용함으로써 방출 채널의 수 및/또는 방출 채널의 수를 증가시킴으로써 증가될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 여기 채널은 더 넓은 범위의 파장을 포함하도록, 예를 들어, 전자기 스펙트럼의 UV, 근 UV, 적외선 또는 근적외선 파장 대역으로 확장되도록 구성될 수 있다(예를 들어, 중심 파장이 450 또는 500 나노미터 이하인 여기 채널을 포함하거나, 중심 파장이 720 또는 750 나노미터 이상인 여기 채널을 포함함). 추가로 또는 대안적으로, 방출 채널은 더 넓은 범위의 파장을 포함하도록, 예를 들어, 전자기 스펙트럼의 UV, 근 UV, 적외선 또는 근적외선 파장 대역으로 확장되도록 구성될 수 있다(예를 들어, 중심 파장이 400 또는 450 나노미터 이하인 여기 채널을 포함하거나, 중심 파장이 670 또는 700 나노미터 이상인 여기 채널을 포함함). 특정 실시형태에서, 도 6에 도시된 방출 채널과 비교하여, 스펙트럼 분산성 광학 요소, 예컨대, 프리즘, 회절 격자, 분광계 또는 분광광도계를 사용하여 방출 채널의 수가 증가될 수 있고/있거나 인접한 방출 채널 사이의 스펙트럼 거리가 감소될 수 있다. 특정 실시형태에서, 도 6에 도시된 여기 채널과 비교하여, 스펙트럼 분산성 광학 요소, 예컨대, 프리즘 또는 회절 격자를 사용하여 여기 채널의 수가 증가될 수 있고/있거나 인접한 여기 채널 사이의 스펙트럼 거리가 감소될 수 있다.
본 발명자들은 하나 이상의 축외 염료의 양을 검출 및/또는 정량하고, 결과적으로 축상/축이 염료의 각각의 것과 연관된 표적 핵산의 양을 검출 및/또는 정량화할 수 있는 염료의 다양한 조합을 확인하였다. 각각의 샘플에서 또는 샘플 어레이의 각각의 샘플에서 3개의 염료, 5개의 염료 및 10개의 염료를 식별하기 위해 적어도 하나의 축외 염료를 포함하는 다양한 방법 및 염료 조합을 이제 논의할 것이다.
도 7을 참조하면, 특정 실시형태에서, 방법(700)은 제1 축상 염료 및 제2 축외 염료를 포함하는 샘플(110)을 제공하는 것을 포함하는 요소(705)를 포함한다. 방법(700)은 또한 샘플에 대한 검정을 수행하는 것을 포함하는 요소(710)를 포함한다. 방법(700)은 또한 제1 여기 파장 및/또는 파장 대역을 특징으로 하는 제1 방사원으로 샘플을 조명하는 것을 포함하는 요소(715)를 포함한다. 방법(700)은 또한 요소(715)에서의 조명에 응답하여 제1 방출 파장에서 그리고/또는 제1 파장 대역에 걸쳐 샘플로부터 제1 방출 측정값을 작성하는 것을 포함하는 요소(720)를 포함한다. 방법(700)은 또한 제1의 것과 상이한 제2 여기 파장 및/또는 파장 대역을 특징으로 하는 제2 방사원으로 샘플을 조명하는 것을 포함하는 요소(725)를 포함한다. 방법(700)은 또한 요소(725)에서의 조명에 응답하여 제2 방출 파장에서 그리고/또는 제2 파장 대역에 걸쳐 샘플로부터 제2 방출 측정값을 작성하는 것을 포함하는 요소(730)를 포함한다. 방법(700)은 조정된 제2 방출 측정값을 제공하기 위해 제1 방출 측정값에 기초하여 제2 방출 측정값을 조정하는 것을 포함하는 요소(735)를 선택적으로 포함할 수 있다. 방법(700)은 방출 측정값의 적어도 일부에 기초하여 제1 염료 및 제2 염료의 양을 계산하는 것을 포함하는 요소(740)를 선택적으로 포함할 수 있다. 방법(700)은 방출 측정값의 적어도 일부에 기초하여 제2 표적 분자의 양을 결정하는 것을 포함하는 요소(745)를 선택적으로 포함할 수 있다.
시스템(2000, 3000, 4000 또는 5000)은 방법(700)을 수행하는 데 사용될 수 있으며, 이 경우 방사원은 여기 스펙트럼 요소(141 또는 441)와 조합된 방사원(101, 401), 예를 들어, 방사 발생기(132)와 관련하여 본 명세서에서 논의된 임의의 것일 수 있다. 샘플로부터의 제1 및 제2 방출 측정값은 방출 스펙트럼 요소(121 또는 421)와 조합하여 하나 이상의 검출기(115)를 사용하여 수행될 수 있다. 요소(710)를 참조하면, 검정은 PCR 검정, 예컨대, qPCR 검정, dPCR 검정, 사후 PCR 검정, 예컨대, 용융 곡선 분석 등일 수 있다.
도 8은 방법(700)과 함께 사용하기에 적합한 2개의 염료(예를 들어, 염료 A3 및 B13)의 정규화된 흡수 또는 여기 스펙트럼(하단 플롯) 및 정규화된 방출 스펙트럼(상단 플롯)을 나타낸다. 도 8의 플롯과 관련하여 여기에 논의된 특징은 또한 일반적으로 본 명세서에 논의된 다른 염료에 대한 이러한 다른 플롯에 적용된다. 도 8의 플롯은 B13으로 지칭되는 축외 염료 및 A3으로 지칭되는 축상 염료에 대한 정규화된 데이터를 나타낸다. 도 6으로부터의 여기 채널 x1, x3 및 방출 채널 m1, m3에 대한 파장 대역이 또한 두 플롯의 회색 영역에 표시된다. 도 9는 도 6에 도입된 ex-em 채널 쌍 격자 내의 염료 A3 및 B13을 나타낸다. 이들 염료와 연관된 ex-em 채널 조합은 이러한 두 염료의 흡수/여기 최대값 및 방출 최대값에 상응한다. 도 9는 각각의 염료의 양과 개별적으로 상관될 수 있는 ex-em 채널 조합을 나타낸다.
방법(700)을 사용하여 A3 및 B13의 양은 여기 채널 x1, x3 및 방출 채널 m3(즉, 채널 조합 x1/m3 및 x3/m3)을 사용하여 결정될 수 있다. 방법(700)은 또한 공통적이거나 유사한 최대 방출 파장(예를 들어, 서로 동일한 최대 방출 파장이 서로 ±1 나노미터 이내이고, 서로 ±2나노미터 이내, 서로 ±5나노미터 이내, 또는 서로 ±10나노미터 이내)을 갖는 본 명세서에 개시되거나 또는 달리 개시된 바와 같은 다른 2개의 염료 조합 또는 두 염료의 최대 여기 및 방출 파장에 근접하거나 이를 포함하는 스펙트럼 대역폭을 갖는 다른 ex-em 채널 조합과 함께 사용될 수 있다. 현재 예에서, 축외 염료(B13)는 축상 염료(A3)의 최대 방출 파장과 동일하거나 실질적으로 동일한 최대 방출 파장을 포함한다. 일부 실시형태에서, 염료는 서로 2 나노미터 이내, 서로 5 나노미터 이내, 서로 10 나노미터 이내, 또는 서로 15 나노미터 이내인 최대 방출 파장을 포함할 수 있다. 2개 초과의 염료를 갖는 보다 복잡한 샘플 혼합물을 갖는 실시형태에서, 방출 채널 m3의 선택은 m3 채널 대역폭에 걸쳐 2개의 표적 염료 중 하나 또는 둘 모두의 통합 에너지가 x1 채널 및/또는 x3 채널에 의해 조명될 때 샘플 용액 내의 임의의 다른 염료의 에너지보다 더 크도록 선택된다.
도 8에 도시된 공칭 흡수 플롯을 참조하면, 축상 염료는 x3 여기 채널 스펙트럼 대역폭에 근접한 최대 여기 파장을 갖는 것으로 보인다. 그러나, 축외 염료 B13은 2개의 국소 최대 여기 파장을 갖는 것으로 나타났는데, 하나는 여기 채널 x1의 대역폭 근처에 있고 다른 하나는 여기 채널 x3의 대역폭 근처에 있다. 대안적으로, x1 및/또는 x3 채널 대역폭은 2개의 염료의 최대 여기 파장의 일부 또는 전부가 x1 및/또는 x3 여기 채널의 스펙트럼 대역폭 내에 있도록 선택될 수 있다. 2개 초과의 염료를 갖는 보다 복잡한 샘플 혼합물을 갖는 실시형태에서, 여기 채널의 대역폭은 상응하는 ex 채널에 걸친 축상 및/또는 축외 염료의 통합 에너지가 동일한 샘플 내에 포함된 다른 염료에 대한 것보다 더 크도록 선택된다.
도 10은 방법(700)의 현재 예에서 "ex-em 채널 공간" 또는 "ex-em 필터 공간"(본 명세서에서 "ex-em 공간"이라고 함)을 나타내며, 도 8에 나타낸 염료의 스펙트럼 특성 및 도 9에 도시된 각각의 채널에 대한 선택된 여기 및 방출 대역(즉, 채널 x1 내지 x6 및 m1 내지 m6의 경우)에 기초한다. 도 10은 또한 각각의 ex-em 채널 조합에서 개별 염료로부터의 신호의 합산을 나타내며, 이는 "총"으로 표시되어 있다. 플롯의 데이터 지점 각각 사이의 선은 신호가 하나의 ex-em 채널 조합에서 다음 채널 조합으로(예를 들어, x1-m1에서 x1-m2로, x1-m2에서 x1-m3 등) 어떻게 변화되는지를 더 쉽게 알 수 있게 하기 위한 명확성 목적이다. 알 수 있는 바와 같이, 여기 채널의 각각의 세트가 다음 것과 구별될 수 있도록 상이한 여기 채널 사이(예를 들어, x1-m6과 x2m2 사이, x2-m6과 x3-m3 사이 등)의 라인에 단절이 존재한다. 알 수 있는 바와 같이, 각각의 염료는 ex-em 공간에서 고유하고 구별되는 시그니처, 핑거프린트 또는 패턴을 가지며, 본 발명자들은 축외 염료가 축상 염료와 구별되도록 하고/하거나 다수의 염료가 주변 잡음 또는 역치 수준보다 높은 신호를 동시에 생성할 때 염료 간 신호 간섭 또는 혼선의 교정을 가능하게 한다는 것을 발견하였다.
현재 예에서 A1 및 B13 염료에 대해 예시된 ex-em 공간은 이들 염료의 등가량을 함유하고 시스템(4000)과 같이 구성된 기기 및 도시된 선택된 ex-em 채널 대역폭을 사용하는 샘플에 대한 것이다. 방법(700)에서 제1 및 제2 방출 측정값에 대해 검출된 신호는 도 10에서 "총"으로 표시된 값이다. A1 및 B13에 대한 도 10의 데이터는 이 예에 대한 샘플 중의 이러한 염료의 알려진 양 및 각각의 염료에 대한 ex-em 공간의 알려진 고유한 염료 시그니처, 핑거프린트 또는 패턴에 기초한다. 일반적으로, 개별 염료의 일부 또는 전부의 양은 알려져 있지 않으며, 각각의 염료 및 연관된 표적 분자의 양은 방법(700) 또는 방법(700)의 제1 및 제2 방출 측정값에 기초한 다른 디콘볼루션 방법을 사용하여 결정된다.
요소(720, 730, 735)를 참조하고 도 10을 참조하면, 제2 방출 측정값(채널 조합 x3-m3)에서 전체 신호에 대한 기여는 축외 염료 B13 및 축상 염료 A3 둘 다로부터의 중요한 방출 신호를 포함하지만; 제1 방출 측정값(채널 조합 x1-m3)은 거의 전적으로 축외 염료 B13로부터의 방출 신호를 포함한다. 따라서, 제1 방출 측정값은 샘플에 포함된 B13 염료의 양과 양호하게 상관관계가 있고, 샘플에 존재하는 B13의 양에 대한 양호한 추정치를 제공한다. 제1 방출 측정값에서 추정된 B13의 양을 기준으로, 염료 B13이 제2 측정값(총 x3-m3 신호)에 기여하는 정도를 추정할 수 있는데, 그 이유는 이러한 염료의 특징적인 스펙트럼이 도 8에 도시된 ex-em 데이터로부터 알려져 있기 때문이다. 따라서 조정된 제2 측정값은 제2 측정값에서 염료 B13(x3-m3)의 추정 방출량을 차감함으로써 계산할 수 있다. 따라서 조정된 제2 방출 측정값은 B13으로부터 제2 신호의 방출 신호 기여가 제거되었기 때문에 샘플의 A3 염료 양과 상관관계가 있다.
특정 실시형태에서, 조정된 제2 측정값을 사용하여 조정된 제1 측정값을 제공할 수 있는데, 그 이유는 x1-m3 채널에서 염료 A3 신호의 기여가 이제 제1 측정으로부터 근사화되고 차감될 수 있기 때문이다. 예를 들어, 조정된 제1 측정값에 기초하여 추가로 조정된 제2 측정값을 제공하기 위해 추가 반복이 또한 구현될 수 있다. 다른 실시형태에서, 방법(700)은 A3 및 B13 염료 및 연관된 표적 분자의 양을 결정하거나 측정하기 위해 동시에 해결되는 방정식 시스템을 통합하도록 변형될 수 있다. 방법(700)의 이러한 임의의 실시형태에서, 임의의 또는 모든 다른 ex-em 채널 조합으로부터의 ex-em 공간 데이터(도 10)를 통합하여 관련 표적 분자 및 A3 및 B13 염료의 양의 더 정확한 추정치를 제공할 수 있다(예를 들어, 샘플이 x1로 조명되었을 때 m1-m6의 측정값, 샘플이 x2로 조명되었을 때 m2-m6의 측정값, 샘플이 x3로 조명되었을 때 m3-m6의 측정값, 샘플이 x4로 조명되었을 때 m4-m6의 측정값, 샘플이 x5로 조명되었을 때 m5-m6의 측정값, 샘플이 x6로 조명되었을 때 m6의 측정값 중 일부 또는 전부). 선택된 또는 사용 가능한 모든 ex-em 채널 조합의 측정값을 사용하여 연립 방정식을 풀면 샘플에 A3 및 B13 염료만 존재할 때 이들 두 염료의 양을 결정하는 정확도가 높아진다. 선택된 또는 사용 가능한 모든 ex-em 채널 조합의 측정값을 사용하여 연립 방정식을 풀면 샘플에 10개 이상의 염료가 존재할 때 추가 염료의 양을 결정하는 데 또한 사용할 수 있다.
다음 단락은 도 12에 도시된 플롯과 관련하여 본 교시의 이점을 설명한다. 종래 기술 시스템에서, 2개 이상의 축상 염료를 함유하는 샘플은 각각의 염료가 결합하도록 구성된 2개 이상의 상응하는 표적 분자의 양을 정량화하기 위해 멀티플렉싱될 수 있다. 예를 들어, 상기에 논의된 축상 염료 A1, A3은 모두 A1과 A3이 결합하도록 구성된 2개의 상응하는 표적 분자를 포함하는 샘플에 배치될 수 있다(그리고 나중에 방출 신호를 생성하기 위해 방출될 수 있다). 샘플을 채널 x1 조명으로 조명함으로써, 대략적인 많은 에너지가 A1 염료에 의해 흡수된다(x1 여기 채널 대역폭에 걸쳐 도 12에 도시된 A1에 대한 흡수 스펙트럼 하의 큰 적분 면적에 의해 입증됨). 도 12에 도시된 바와 같이, A1 염료의 결과적인 방출 에너지의 대부분은 m1 방출 채널에 포함된다. 대조적으로, x1 채널의 매우 적은 에너지가 A3 염료에 의해 흡수되며, 이 에너지의 대부분은 m1 방출 채널이 아닌 m3 방출 채널에서 다시 방출된다. 따라서 방출 채널 m1에서 신호는 샘플에 존재하는 A1 염료의 양과 높은 상관 관계가 있을 수 있다. 도 12의 플롯의 유사한 검토에 의해, x3 여기 채널과 m3의 조합이 샘플에 존재하는 A3 염료의 양과 높은 상관관계가 있음을 알 수 있다.
그러나, 이러한 상관관계는 정확하지 않다. 예를 들어, A1 염료는 m3 방출 채널에서 작지만 측정 가능한 방출량을 가지므로 A3 염료와의 상관관계를 감소시킬 수 있다. 이러한 유형의 원치 않는 신호 기여를 "혼선" 또는 "신호 간섭"이라고 한다. 본 예에서는 혼선이 비교적 작지만 샘플에 2개 이상의 축상 염료가 존재하는 경우(예를 들어, A1, A2 및 A4, 또는 A1, A2, A3 및 A4) 그리고/또는 특정 검정의 경우 하나의 표적 분자가 많고 다른 표적 분자는 훨씬 적은 경우에는 혼선이 보다 클 수 있다. 이러한 효과는 적절한 검정 설계, 교정 플레이트 사용, 각각의 채널로부터의 원시 방출 데이터 처리를 위한 디콘볼루션 알고리즘을 통해 최소화할 수 있다. 다양한 축외 채널 조합을 사용하여 디콘볼루션을 향상시켜 정확도를 향상시킬 수도 있다.
신호 간섭 또는 혼선 및 다른 이러한 효과를 보상 및/또는 수정하기 위해 교정 플레이트를 사용할 수 있다. 교정 플레이트에는 알려진 양의 여러 염료를 포함한다. 따라서, 하나 이상의 여기 채널로부터의 방사선으로 조명될 때, 각각의 염료로부터의 결과적인 형광 신호가 결정될 수 있고 시스템은 다양한 조명 조건 하에서 염료들 사이의 혼선에 대해 교정될 수 있다. 교정 플레이트는 알려지지 않은 양의 표적 분자의 조합을 함유하는 시험 플레이트의 하나 이상의 반응 부위에 상응하는 하나 이상의 반응 부위(예를 들어, 96 또는 384웰 마이크로타이터 플레이트의 웰 또는 바이알)에 알려진 염료 조합을 포함할 수 있다. 상업적으로 입수 가능한 교정 플레이트의 한 예는 Thermo Fisher 교정 플레이트 A26337이다. A26337은 Applied Biosystems의 QuantStudio™ 3 및 5, 96웰 0.1-mL 실시간 PCR 시스템에서 ABY™, JUN™ 및 MUSTANG PURPLE™ 염료에 대한 순수 염료 스펙트럼 및 다성분 값을 설정한다. 이 플레이트 내의 염료의 제형은 실시간 PCR 실험에서 각각의 프로브의 형광 스펙트럼을 보다 정확하게 나타냄으로써 멀티플렉싱 결과를 개선시킨다.
본 발명자들은 축외 채널이 다중 축상 염료의 정확도를 개선하기 위해 디콘볼루션 알고리즘을 개선하는 데 사용될 수 있을 뿐만 아니라 이러한 축외 채널로부터의 추가된 정보가 여기 또는 방출 채널의 수를 증가시킬 필요 없이 샘플에 추가적인 축외 염료를 포함시키기 위해서 사용될 수 있다는 것을 발견하였다. 예를 들어, 본 명세서에서 논의된 6개의 Ex 채널 x1 내지 x6 및 6개의 Em 채널 m1 내지 m6을 사용하여 샘플에서 6개의 축상 염료를 식별할 수 있다. 6개를 초과하게 검출될 수 있는 축상 염료의 수를 늘리기 위해서, 종래 기술을 사용하는 추가 Ex 및 Em 채널이 필요할 것이다. 이는 시스템 비용 및 복잡성을 증가시킬 뿐만 아니라, 예를 들어, 가시광선 파장 대역 내에서 작동하기에 적합한 광학 성분을 활용하여 제공될 수 있는 파장 대역의 수를 증가시키는 것을 어렵게 만드는 기술적 문제가 있을 수 있다.
본 발명자들은 동일한 세트의 여기 및 방출 채널로 측정될 수 있는 염료 및 상응하는 표적 분자의 수를 증가시키기 위해 추가 축외 염료가 샘플(110)에 포함될 수 있음을 발견하였다. 추가 축외 염료를 도입하면 동일한 샘플에서 다중 축상 염료를 멀티플렉싱하는 것과 관련하여 상기에 논의된 혼선 문제가 증가하기 때문에 이러한 결과는 예상치 못한 것이다. 이해하기 위해 다시 도 12를 참조한다. 예를 들어, 염료 A3과 B13 모두 x3 여기 채널에서 상당한 에너지를 흡수하고 m3 방출 채널에서 이 에너지를 다시 방출하기 때문에 염료 A3과 B13 사이에 많은 양의 혼선이 있음을 알 수 있다. 이러한 관찰에 기초하여, x3, m3 채널 조합의 신호가 각각의 염료 A3, B13에서 얼마나 많이 유래되는 지를 결정하는 것은 불가능해 보인다.
그러나 축상 및 축외 채널 조합 모두로부터의 데이터가 이러한 문제를 완화하는 데 도움이 되도록 사용될 수 있음을 발견하였다. 예를 들어, 본 사례에서, B13 채널 조합은 샘플 110에 존재하는 염료 B13의 양을 결정하는 데 도움이 되도록 사용될 수 있다. 이 정보를 사용하여, A3 채널 조합의 신호에 대한 염료 B13의 기여를 계산하고 이를 사용하여 염료 A3의 양을 결정하기 위해 m3 신호를 수정할 수 있다. 이는 다음과 같이 설명할 수 있다. 도 12의 흡수 플롯에서 볼 수 있는 바와 같이, 염료 B13은 여기 채널 x1 대역에서 상당한 양의 에너지를 흡수하는 반면, 염료 A3은 여기 채널 x1 대역에서 매우 적은 양의 에너지를 흡수한다. 또한 염료 B13이 흡수한 상당량의 x1 에너지가 m3 채널에서 방출된다. 따라서, x1 여기 채널은 m1 방출 채널과 m3 방출 채널에서 각각 신호를 측정하여 A1 및 B13 염료 둘 다의 양을 결정하는 데 사용될 수 있는데, 그 이유는 두 염료가 여기 채널 x1을 사용하여 조명되는 경우 염료 A1은 주로 방출 채널 m1에서 방출하고 염료 B13은 방출 채널 m3에서 주로 방출하기 때문이다. 염료 B13의 양에 대한 이러한 정보를 가지고, 알려진 양의 B13 염료에 대한 m3 방출 신호를 조정함으로써 x3 여기 채널을 사용하여 염료 A3의 양을 결정할 수 있다.
도 11을 참조하면, 특정 실시형태에서, 방법(1100)은 제1 축상 염료 및 제2 축상 염료 및 제3 축외 염료를 포함하는 샘플(110)을 제공하는 것을 포함하는 요소(1105)를 포함한다. 방법(1100)은 또한 샘플에 대한 검정을 수행하는 것을 포함하는 요소(1110)를 포함한다. 방법(1100)은 또한 제1 여기 파장 및/또는 파장 대역을 특징으로 하는 제1 방사원으로 샘플을 조명하는 것을 포함하는 요소(1115)를 포함한다. 방법(1100)은 또한 요소(1115)에서의 조명에 응답하여 제1 방출 파장에서 그리고/또는 제1 파장 대역에 걸쳐 샘플로부터 제1 방출 측정값을 작성하고, 제2 방출 파장에서 그리고/또는 제1 파장 대역에 걸쳐 샘플로부터 제2 방출 측정값을 작성하는 것을 포함하는 요소(1120)를 포함한다. 방법(1100)은 또한 제1의 것과 상이한 제2 여기 파장 및/또는 파장 대역을 특징으로 하는 제2 방사원으로 샘플을 조명하는 것을 포함하는 요소(1125)를 포함한다. 방법(1100)은 또한 요소(1125)에서의 조명에 응답하여 제2 방출 파장에서 그리고/또는 제2 파장 대역에 걸쳐 샘플로부터 제3 방출 측정값을 작성하는 것을 포함하는 요소(1130)를 포함한다. 방법(1100)은 조정된 제2 방출 측정값을 제공하기 위해 제1 방출 측정값에 기초하여 제2 방출 측정값을 조정하는 것을 포함하는 요소(1135)를 선택적으로 포함할 수 있다. 방법(1100)은 선택적으로 제1 방출 측정값, 제2 방출 측정값, 및/또는 조정된 제2 방출 측정값 중 적어도 하나에 기초하는 조정된 제2 방출 측정값을 제공하기 위해 제3 방출 측정값을 조정하는 것을 포함하는 요소(1140)를 포함할 수 있다. 방법(1100)은 방출 측정값의 적어도 일부에 기초하여 제1 염료, 제2 염료 및 제3 염료의 양을 계산하는 것을 포함하는 요소(1145)를 선택적으로 포함할 수 있다. 방법(1100)은 샘플에 존재하는 염료의 양에 기초하여 3개의 표적 분자의 양을 결정하는 것을 포함하는 요소(1145)를 선택적으로 포함할 수 있다.
시스템(2000, 3000, 4000 또는 5000)은 방법(1100)을 수행하는 데 사용될 수 있으며, 이 경우 방사원은 여기 스펙트럼 요소(141 또는 441)와 조합된 방사원(101 또는 401), 예를 들어, 방사 발생기(132)와 관련하여 본 명세서에서 논의된 임의의 것일 수 있다. 샘플로부터의 방출 측정값은 각각 방출 스펙트럼 요소(101a, 101b) 또는 방출 스펙트럼 요소(421a 내지 421f) 중 2개와 조합하여 1개 이상의 검출기(115)를 사용하여 수행될 수 있다. 요소(1110)를 참조하면, 검정은 PCR 검정, 예컨대, qPCR 검정, dPCR 검정, 사후 PCR 검정, 예컨대, 용융 곡선 분석 등일 수 있다. 적절한 경우, 예를 들어, 염료, 방사원, 및/또는 방출 필터링 특징 또는 사용 방법과 관련하여 본 명세서 상기에 논의된 방법(700)의 임의의 양태를 또한 방법(1100)에 적용할 수 있다.
도 12는 방법(1100)과 함께 사용하기에 적합한 3개의 염료(2개의 축상 염료 A1, A3 및 1개의 축외 염료 B13)의 정규화된 흡수 스펙트럼 및 정규화된 방출 스펙트럼을 도시한다. 도 12의 플롯과 관련하여 여기에 논의된 특징은 또한 일반적으로 본 명세서에 논의된 다른 염료에 대한 이러한 다른 플롯에 적용가능하다. 도 12의 플롯은 축외 B13 및 축상 염료 A1 및 A3에 대한 정규화된 데이터를 나타낸다. 이러한 3개의 염료는 도 6에 도시된 ex-em 채널 조합 각각 x1-m3, x1-m1 and x3-m3에 적합하다.
방법(1100)을 사용하여 A1, A3 및 B13의 양은 여기 채널 x1, x3 및 방출 채널 x1, m3(즉, 채널 조합 x1/ m3, x1/m1 및 x3/m3)을 사용하여 결정될 수 있다. 방법(1100)은 또한 본 명세서 또는 다른 곳에 개시된 것과 같은 다른 3개의 염료 조합과 함께 사용될 수 있으며, 여기서 축상 염료 중 하나는 축외 염료와 공통적이거나 유사한 최대 방출 파장을 갖고 다른 축상 염료는 축외 염료와 공통적이거나 유사한 최대 여기 파장을 갖는다. 방법(1100)은 또한 3개의 염료의 최대 방출 파장 및 여기 파장을 포함하거나 이에 근접한 스펙트럼 대역폭을 갖는 다른 ex-em 채널 조합과 함께 사용할 수 있다. 현재 예에서, 축외 염료(B13)는 축상 염료(A3)의 최대 방출 파장과 동일하거나 실질적으로 동일한 최대 방출 파장을 포함한다. 추가로, 축외 염료(B13)는 축상 염료(A1)의 최대 방출 파장과 동일하거나 실질적으로 동일한 최대 여기 파장을 포함한다. 일부 실시형태에서, 염료는 서로 2 나노미터 이내, 서로 5 나노미터 이내, 서로 10 나노미터 이내, 또는 서로 15 나노미터 이내인 최대 방출 파장을 포함할 수 있다. 3개 초과의 염료를 갖는 보다 복잡한 샘플 혼합물을 갖는 실시형태에서, 방출 채널 m1 및 m3의 선택은 x1, x3, m1 및 m3 채널 대역폭 각각에 걸쳐 3개의 표적 염료의 통합 에너지가 x1 채널 및/또는 x3 채널에 의해 조명되고/되거나 m1 및/또는 m3 채널에서 에너지를 방출할 때 샘플 내의 임의의 다른 염료의 에너지보다 더 크도록 선택된다.
도 12에 도시된 공칭 흡수 플롯을 참조하면, A1 축상 염료는 x1 여기 채널 스펙트럼 대역폭에 가까운 최대 여기 파장을 갖는 것으로 보이는 반면, A3 축상 염료는 x3 여기 채널 스펙트럼 대역폭에 가까운 최대 여기 파장을 갖는 것으로 보인다. 그러나, 축외 염료 B13은 2개의 국소 최대 여기 파장을 갖는 것으로 나타났는데, 하나는 여기 채널 x1의 대역폭 근처에 있고 다른 하나는 여기 채널 x3의 대역폭 근처에 있다. 대안적으로, x1 및/또는 x3 채널 대역폭은 3개의 염료의 최대 여기 파장의 일부 또는 전부가 x1 및/또는 x3 여기 채널의 스펙트럼 대역폭 내에 있도록 선택될 수 있다. 3개 초과의 염료를 갖는 보다 복잡한 샘플 혼합물을 갖는 실시형태에서, 여기 채널의 대역폭은 상응하는 ex 채널에 걸친 축상 및/또는 축외 염료의 통합 에너지가 동일한 샘플 내에 포함된 다른 염료에 대한 것보다 더 크도록 선택된다. 도 13은 도 6에 도입된 ex-em 채널 쌍 격자 내의 염료 A1, A3 및 B13을 나타낸다. 이들 염료와 연관된 ex-em 채널 조합은 이러한 3개의 염료의 흡수/여기 최대값 및 방출 최대값에 상응한다. 도 13은 각각의 염료의 양과 개별적으로 상관될 수 있는 ex-em 채널 조합을 나타낸다.
도 14는 방법(1100)의 현재 예에서 사용된 3개의 선택된 염료에 대한 ex-em 채널 공간을 도시하고, 도 12에 나타낸 염료의 스펙트럼 특성 및 도 13에 도시된 각각의 채널에 대한 선택된 여기 및 방출 대역(즉, 채널 x1 내지 x6 및 m1 내지 m6의 경우)에 기초한다. 도 14는 또한 각각의 ex-em 채널 조합에서 개별 염료로부터의 신호의 합산을 나타내며, 이는 "총"으로 표시되어 있다. 알 수 있는 바와 같이, 각각의 염료는 ex-em 공간에서 고유하고 구별되는 시그니처 또는 핑거프린트를 가지며, 본 발명자들은 축외 염료가 축상 염료와 구별되도록 하고/하거나 다수의 염료가 주변 잡음 또는 역치 수준보다 높은 신호를 동시에 생성할 때 염료 간 혼선의 교정을 가능하게 한다는 것을 발견하였다.
현재 예에서 A1, A3 및 B13 염료에 대해 예시된 ex-em 공간은 이들 염료의 등가량을 함유하고 시스템(4000)과 같이 구성된 기기 및 도시된 선택된 ex-em 채널 대역폭을 사용하는 샘플에 대한 것이다. 방법(1100)에서 제1 및 제2 및 제3 측정값에 대해 검출된 신호는 도 14에서 "총"으로 표시된 값이다. A1, A3 및 B13에 대한 도 14의 데이터는 이 예에 대한 샘플 중의 이러한 염료의 알려진 양 및 각각의 염료에 대한 ex-em 공간의 알려진 고유한 염료 시그니처 또는 핑거프린트에 기초한다. 일반적으로, 개별 염료의 일부 또는 전부의 양은 알려져 있지 않으며, 각각의 염료 및 연관된 표적 분자의 양은 방법(1100) 또는 방법(1100)의 제1, 제2 및 제3 측정값에 기초한 다른 디콘볼루션 방법을 사용하여 결정된다. 본 발명자들은 더 많은 수의 축상 염료 및 축외 염료 및 연관된 표적 분자를 갖는 더 복잡한 샘플의 경우, 도 14에 도시된 ex-em 공간에서 각각의 염료의 고유한 시그니처 또는 핑거프린트가 공통 샘플에서 10개 이상의 축상/축외 염료를 동시에 멀티플렉싱하는 데 활용될 수 있다는 것을 발견하였다.
요소(1120, 1130, 1135, 1140)를 참조하고 도 14에서 ex-em 공간 플롯을 참조하면, 제2 방출 측정값(채널 조합 x1-m3)에서 전체 신호에 대한 기여는 축상 염료 A1 및 A3뿐만 아니라 축외 염료 B13 둘 다로부터의 중요한 방출 신호를 포함하지만; 제1 방출 측정값(채널 조합 x1-m1)은 주로 축상 염료 A1로부터의 방출 신호를 포함한다. 따라서, 제1 방출 측정값은 샘플에 포함된 A1 염료의 양과 양호하게 상관관계가 있고, 샘플에 존재하는 A1의 양에 대한 양호한 추정치를 제공한다. 제1 방출 측정값에서 추정된 A1의 양을 기준으로, 염료 A1이 제2 측정값(총 x1-m3 신호)에 기여하는 정도를 추정할 수 있는데, 그 이유는 이러한 염료의 특징적인 스펙트럼이 도 12에 도시된 ex-em 데이터로부터 알려져 있기 때문이다. 따라서 조정된 제2 측정값은 제2 측정값에서 염료 A1(x1-m3)의 추정 방출량을 차감함으로써 계산할 수 있다. 따라서 조정된 제2 방출 측정값은 A3으로부터 제2 신호의 방출 신호 기여가 제거되었기 때문에 샘플의 B13 염료 양과 상관관계가 있다.
유사한 방식으로, 제3 방출 측정값(채널 조합 x3-m3)에서 총 신호에 대한 기여는 축외 염료 B13뿐만 아니라 축상 염료 A3으로부터의 상당한 방출 신호를 포함하지만; 조정된 제2 방출 측정값(채널 조합 x1-m3)은 샘플에 존재하는 B13 염료의 양의 양호한 추정치를 제공한다. 제2 방출 측정값에서 추정된 B13의 양을 기준으로, 염료 B13이 제3 측정값(총 x3-m3 신호)에 기여하는 정도를 추정할 수 있는데, 그 이유는 이러한 염료의 특징적인 스펙트럼이 도 12에 도시된 ex-em 데이터로부터 알려져 있기 때문이다. 따라서 조정된 제3 측정값은 제3 측정값에서 염료 B13(x3-m3)의 추정 방출량을 차감함으로써 계산할 수 있다. 따라서 조정된 제3 방출 측정값은 B13으로부터 제2 신호의 방출 신호 기여가 제거되었기 때문에 샘플의 A3 염료 양과 상관관계가 있다. x3-m3 채널 조합에서 A1 염료의 기여는 본 예에서 유의하지 않기 때문에, 일반적으로 방법(1100)을 또한 사용하여 x3-m3 채널 조합에서 A1 염료 염료로부터의 신호의 양을 차감하여 보다 정확한 조정된 제3 신호를 제공하는데, 이는 A3 염료 및 이것이 연관된 표적 분자의 양에 대한 조정된 제3 신호의 훨씬 더 양호한 상관관계로 이어진다.
특정 실시형태에서, 조정된 제2 측정값 및/또는 조정된 제3 측정값을 사용하여 조정된 제1 측정값을 제공할 수 있는데, 그 이유는 x1-m1 채널에서 B13 염료 신호 및 A3 염료 신호의 기여가 이제 근사화되고 제1 측정값으로부터 차감될 수 있기 때문이다(임의의 방출 채널에서 이들 염료의 특징적인 스펙트럼은 도 12의 데이터로부터 결정될 수 있다). 추가로 또는 대안적으로, 조정된 제3 측정값을 사용하여 더 정확한 조정된 제2 측정값을 제공할 수 있는데, 그 이유는 x1-m3 채널에서 A3 염료 신호의 기여가 이제 근사화되고 제2 측정값으로부터 차감될 수 있기 때문이다(임의의 방출 채널에서 A3의 특징적인 스펙트럼은 도 12의 데이터로부터 결정될 수 있다). 예를 들어, 조정된 제1 및 제2 측정값에 기초하여 추가로 조정된 제3 측정값을 제공하기 위해 추가 반복이 또한 구현될 수 있다. 다른 실시형태에서, 방법(1100)은 A1, A3 및 B13 염료 및 연관된 표적 분자의 양을 결정하거나 측정하기 위해 동시에 해결되는 방정식 시스템을 통합하도록 변형될 수 있다. 방법(1100)의 이러한 임의의 실시형태에서, 임의의 또는 모든 다른 ex-em 채널 조합으로부터의 ex-em 공간 데이터(도 14)를 통합하여 관련 표적 분자 및 A1, A3 및 B13 염료의 양의 더 정확한 추정치를 제공할 수 있다(예를 들어, 샘플이 x1로 조명되었을 때 m1-m6의 측정값, 샘플이 x2로 조명되었을 때 m2-m6의 측정값, 샘플이 x3로 조명되었을 때 m3-m6의 측정값, 샘플이 x4로 조명되었을 때 m4-m6의 측정값, 샘플이 x5로 조명되었을 때 m5-m6의 측정값, 샘플이 x6로 조명되었을 때 m6의 측정값 중 일부 또는 전부). 선택된 또는 사용 가능한 모든 ex-em 채널 조합의 측정값을 사용하여 연립 방정식을 풀면 샘플에 A1, A3 및 B13 염료만 존재할 때 이들 3개의 염료의 양을 결정하는 정확도가 높아진다. 선택된 또는 사용 가능한 모든 ex-em 채널 조합의 측정값을 사용하여 연립 방정식을 풀면 샘플에 10개 이상의 염료가 존재할 때 추가 염료의 양을 결정하는 데 또한 사용할 수 있다.
요소(1150)를 참조하면, 특정 실시형태에서, 제1 및 제2 염료는 상이한 표적 분자, 예컨대 제1 및 제2 표적 폴리뉴클레오티드, 제1 및 제2 단백질 등과 회합하고/하거나 이에 결합하거나 부착하도록 구성된다.
다시 도 2 내지 도 4을 참조하면, 방법(700)은 적어도 제1 염료 및 제2 염료의 양을 측정하기 위해 시스템(3000, 4000, 5000) 중 임의의 것을 사용하여 수행될 수 있다. 방법(700)은 제1 염료에 결합하도록 구성된 제1 표적 분자의 양 및/또는 제2 염료에 결합하도록 구성된 제2 표적 분자의 양을 추가로 측정 또는 계산하는 데 사용될 수 있다. 그러한 실시형태에서, 요소(715, 725)는 방사원(101a, 101b) 또는 방사원(401a 내지 401f) 중 제1 방사원 및 제2 방사원으로 샘플(110)을 조명하는 것을 포함하고, 여기서 2개의 방사원 각각은 서로의 것과 상이한 평균 여기 파장(예를 들어, 적어도 60 나노미터 상이함)을 특징으로 한다. 현재 실시형태에서, 각각의 방출 스펙트럼 요소(121a, 121b) 또는 2개의 방출 스펙트럼 요소(141a 내지 141f)는 나머지 것과 상이한(예를 들어, 적어도 60 나노미터만큼 상이한) 평균 방출 파장을 특징으로 한다. 조명에 응답하여, 방법(700)의 요소(720, 730)는 다음을 포함한다:
특정 실시형태에서, 제1 염료는 제1 최대 방출 파장을 포함하는 제1 방출 스펙트럼을 포함하고, 상기 제2 염료는 제1 최대 방출 파장과 동일하거나 실질적으로 동일한 제2 최대 방출 파장을 포함하는 제2 방출 스펙트럼을 포함한다. 예를 들어, 제1 염료는 축상 염료일 수 있고, 제2 염료는 축외 염료일 수 있고, 여기서 최대 방출 파장은 동일하거나 대략 동일하다(예를 들어, 서로 2 나노미터 또는 서로 5 나노미터 이내).
다시 도 3 내지 도 4을 참조하면, 방법(1100)은 적어도 제1 염료, 제2 염료 및 제3 염료의 양을 측정하기 위해 시스템(3000, 4000, 5000) 중 임의의 것을 사용하여 수행될 수 있다. 방법(700)은 제1 염료에 결합하도록 구성된 제1 표적 분자의 양, 제2 염료에 결합하도록 구성된 제2 표적 분자의 양 및/또는 제3 염료에 결합하도록 구성된 제3 표적 분자의 양을 추가로 측정 또는 계산하는 데 사용될 수 있다. 그러한 실시형태에서, 요소(1115, 1125)는 방사원(101a, 101b) 또는 방사원(401a 내지 401f) 중 제1 방사원 및 제2 방사원으로 샘플(110)을 조명하는 것을 포함하고, 여기서 2개의 방사원 각각은 서로의 것과 상이한 평균 여기 파장(예를 들어, 적어도 60 나노미터 만큼 상이함)을 특징으로 한다. 현재 실시형태에서, 각각의 방출 스펙트럼 요소(121a, 121b) 또는 2개의 방출 스펙트럼 요소(141a 내지 141f)는 나머지 것과 상이한(예를 들어, 적어도 60 나노미터만큼 상이한) 평균 방출 파장을 특징으로 한다. 조명에 응답하여, 방법(1100)의 요소(1120, 1130)는 다음을 포함한다:
특정 실시형태에서:
예를 들어, 제1 염료 및 제3 염료는 시스템 또는 기기의 상이한 여기 채널에 걸쳐 최대 흡수 파장을 갖는 축상 염료일 수 있다.
다양한 실시형태에서, 방법(700) 또는 방법(1100)은 시스템(1000, 2000, 3000, 4000, 5000) 중 임의의 것을 사용하여 샘플(110)에 대해 증폭 검정을 수행하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 실시형태에서, 방법(700, 1100)은 이들 시스템에 대해 본 명세서에서 논의된 다양한 실시형태를 사용하여 수행될 수 있다. 방법(700, 1100)의 실시형태는 증폭 검정 동안 요소(715 내지 70, 1115 내지 1130)를 수행하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 증폭 검정은 샘플(110)이 열 사이클러를 사용하여 다양한 사이클에 걸쳐 가열 및 냉각되는 실시간 중합효소 연쇄 반응(qPCR) 검정일 수 있다. 1회 이상의 사이클 동안 하나 이상의 시점에서, 요소(715 내지 70, 1115 내지 1130) 중 일부 또는 전부가 샘플(110)에 대해 수행될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 방법(700, 1100)은 PCR 또는 다른 증폭 검정의 완료된 후에 수행될 수 있다. 예를 들어, PCR 검정의 마지막 주기 후, 증폭 검정 후 용융 검정 동안 또는 증폭 검정 후 디지털 PCR(dPCR) 평가 동안.
도 15를 참조하면, 염료의 다른 3중 조합(염료 A1, A4 및 B14)의 흡수 또는 여기 스펙트럼 특성 및 방출 스펙트럼 특성을 나타낸다. A4 및 B14의 양은 또한 방법(700 및/또는 1100)을 사용하여 결정 또는 측정될 수 있으며, 여기서 상기에 기재된 것과 동일한 공정이 사용되지만 채널 조합 x1-x3 및 x3-m3을 채널 조합 x1-x4 및 x4-m4로 대체한다. 도 16은 상기에 논의된 모든 5개의 염료(A1, A3, A4, B13, B14)의 조합된 스펙트럼 특성을 보여준다.
도 17는 도 6에 도입된 ex-em 채널 쌍 격자 내의 염료 A1, A3, A4, B13, B14를 나타낸다. 이들 염료와 연관된 ex-em 채널 조합은 이러한 5개의 염료의 흡수/여기 최대값 및 방출 최대값에 상응한다. 도 17는 각각의 염료의 양과 개별적으로 상관될 수 있는 ex-em 채널 조합을 나타낸다. 5개의 염료가 모두 존재하는 경우 혼선으로 인해, 도 18에 도시된 ex-em 공간에 각각의 염료의 시그니처 또는 핑거프린트를 사용하여 혼선의 효과를 줄이거나 제거할 수 있다. 예를 들어, 방법(700) 및 상기에 논의된 변형을 사용하여 샘플에 포함된 염료 A3, B13 및/또는 염료 A4, B14 사이의 혼선을 교정할 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 방법(1100) 및 상기에 논의된 변형을 사용하여 샘플에 포함된 염료 A1, A3, B13 및/또는 염료 A1, A4, B14 사이의 혼선을 교정할 수 있다.
도 18에 도시된 바와 같이, A4 및 B14 염료의 시그니처 또는 패턴은 A3 및 B13 염료의 시그니처 또는 패턴과 상당히 다르다. 예를 들어, A3 및 B13의 전체 신호에 대한 기여는 x1-m4 및 x4-m4 채널 조합에서 낮다. 따라서, 일부 실시형태에서, A1, A4, B14 트리어드(triad)는 A3, B13으로부터의 신호의 기여를 고려하지 않고 방법(1100)을 사용하여 처리될 수 있다. 대안적으로, 상기에 논의된 방법(1100)의 변형과 관련하여 상기에 논의된 바와 같이, A1, A3, A4, B13 및 B14 염료 및 연관된 표적 분자의 양을 동시에 결정하거나 측정하는 방정식 시스템이 통합될 수 있다. 특정 실시형태에서, 방법(1100)은 도 6에 도시된 "A" 및 "B" 채널 조합의 일부 또는 모든 21개의 ex-em 채널 조합을 포함하는 방정식 시스템을 통합하도록 변형될 수 있다. 도 18의 ex-em 공간 데이터의 일부 또는 전부는 모든 5개 염료 및 연관된 표적 분자의 정확한 추정치를 제공하기 위해 통합될 수 있다. 특정 실시형태에서, 염료 A1, A3, A4, B13, B14는 하기 표 A에 나열된 염료의 다양한 조합일 수 있다. 특정 실시형태에서, 수행된 검정은 PCR 검정, 예컨대, qPCR 검정, dPCR 검정, 사후 PCR 검정, 예컨대, 용융 곡선 분석 등일 수 있다.
[표 1]
도 19는 도 6에 도입된 ex-em 채널 쌍 격자 내의 염료 A1 내지 A6, B13, B14, B35 및 B36을 나타낸다. 이들 염료와 연관된 ex-em 채널 조합은 이러한 10개의 염료의 흡수/여기 최대값 및 방출 최대값에 상응한다. 도 19는 각각의 염료의 양과 개별적으로 상관될 수 있는 ex-em 채널 조합을 나타낸다. 본 발명자들은 모든 10개의 염료 및 연관된 표적 분자의 양이 동시에 검출 및/또는 측정될 수 있도록 이들 10개의 ex-em 채널 조합과 함께 사용될 수 있는 다양한 염료 조합을 발견하였다. 하기 표 2는 이러한 10개의 ex-em 조합 각각에 사용될 수 있는 다양한 염료를 나타낸다.
[표 2]
도 19와 도 17을 비교하면, 도 17에 도시된 5개의 염료에 염료 A2, A5, A6, B35 및 B36이 첨가된 것을 알 수 있다. 특정 실시형태에서, 샘플 내의 축상 염료 A2, A5, A6의 양은 축상, ex-em 채널 조합 x2-m2, x5-m5, 및 x6-m6을 사용함으로써 검출기에서 수신된 신호에 대한 상관관계에 의해 적어도 대략적으로 결정되거나 측정될 수 있다. 도 18에 도시된 바와 같이, A1, A3, A4, B13, B14 염료의 시그니처 또는 패턴은 ex-em 채널 조합 x2-m2, x5-m5 및 x6-m6에서 상대적으로 낮은 방출을 갖는다. 따라서 염료 A1, A3, A4, B13, B14로부터의 혼선은 상대적으로 작다. 염료 A1, A3, A4, B13, B14의 양은 이들 염료에 대해 상기에 논의된 방법(700) 및/또는 방법(1100)을 사용하여 결정되거나 측정될 수 있다. 유사하게, 축외 염료 B35 및 B36은 염료 B35 및 A5에 대해 수직 ex-em 채널 조합 x5-m5 및 x3-m5를 사용하고 염료 B36 및 A6에 대해 ex-em 채널 조합 x6-m6 및 x3-m6를 사용하여 방법(700)으로 결정되거나 측정될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 축외 염료 B35 및 B36은 염료 B35 및 A5에 대해 트리어드 ex-em 채널 조합 x3-m3, x5-m5 및 x3-m5를 사용하고 염료 B36 및 A6에 대해 트리어드 ex-em 채널 조합 x3-m3, x6-m6 및 x3-m6을 사용하여 방법(1100)으로 결정되거나 측정될 수 있다. 대안적으로, 상기에 논의된 방법(1100)의 변형과 관련하여 상기에 논의된 바와 같이, A1, A2, A3, A4, A5, A6, B13, B14, B35, 및 B36 염료 및 연관된 표적 분자의 양을 동시에 결정하거나 측정하는 방정식 시스템이 통합될 수 있다. 특정 실시형태에서, 방법(1100)은 표 2에 도시된 "A" 및 "B" 채널 조합의 일부 또는 모든 21개의 ex-em 채널 조합을 포함하는 방정식 시스템을 통합하도록 변형될 수 있다. 도 18의 ex-em 공간 데이터의 일부 또는 전부는 모든 10개 염료 및 이들의 연관된 표적 분자의 정확한 추정치를 제공하기 위해 통합될 수 있다.
본 발명자들은 10개 이상의 염료(예를 들어, 표 2로부터의 6개의 축상 염료 및 4개의 축외 염료의 조합) 및 이들의 연관된 표적 분자를 갖는 보다 복잡한 샘플에 대해, ex-em 공간에서 각각의 염료의 고유한 ex-em 공간 시그니처 또는 핑거프린트를 사용하여 공통 샘플에서 축상/축외 염료 모두를 동시에 멀티플렉싱할 수 있다는 것을 발견하였다. 도 18은 상기에 논의된 각각의 특정 염료 A1, A3, A4, B13, B14의 상이한 ex-em 공간 시그니처 또는 핑거프린트를 도시한다. 이러한 염료에 대한 시그니처 또는 핑거프린트를 비교하여 알 수 있듯이 A1은 x1-m1 채널 조합에서 고유하게 강한 신호를 가지며 x1-m2 채널 조합에서 신호는 x1-m3 채널 조합에서 신호의 약 2/5이다. 대조적으로 A3 및 A4는 x1-m1 또는 x1-m2 채널 조합에서 거의 신호가 없지만 대신 각각 x3-m3 및 x4-m4 채널 조합에서 강한 신호를 갖는다. 염료 B13 및 B14는 또한 각각 x3-m3 및 x4-m4 채널 조합에서 강한 신호를 갖지만, B13 및 B14도 각각 x2-m3 및 x2-m4 채널 조합에서 상대적으로 강한 신호를 갖는다는 점에서 A3 및 A4 염료와 다르다. 도 18에 도시되지 않았지만, 염료 A2, A5, A6, B35 및 B36에 대해 유사하게 구별되는 특성이 존재한다. 염료 A2, A5, A6, B35 및 B36 염료는 일반적으로 방출 채널 m5 및 m6에서 높은 방출을 갖는 반면, 도 18을 다시 참조하면, 염료 A1, A3, A4, B13 및 B14는 특히 x5 또는 x6 채널에 의해 여기될 때 m5 또는 m6 방출 채널에서 방출이 거의 내지 본질적으로 전혀 없다.
본 발명자들은 축상 및 축외 염료(예를 들어, 도 17에 도시된 8개 염료 또는 도 19에 도시된 10개 염료)를 모두 포함하는 검정의 경우, 표준 교정 플레이트, 예컨대 본 명세서 상기에 논의된 Thermo Fisher 교정 플레이트 A26337은 다양한 염료 사이의 신호 간섭 또는 혼선을 적절하게 교정하지 못하므로 샘플에서 각각의 염료 및 상응하는 표적 분자의 양을 결정할 때 정확도가 떨어진다는 것을 발견하였다. 그러한 결정의 정확성을 증가시키기 위해, 본 발명자들은 알고 있는 양의 하나 이상의 축외 염료가 기기의 교정 동안 사용되는 교정 플레이트에 포함되어야 한다는 것을 발견하였다. 예를 들어, 도 19에 도시된 바와 같이 공통 샘플 또는 샘플 용액에서 10개의 염료를 사용하는 실시형태에서, 본 발명자들은 4개의 축상 염료와 2개의 축외 염료 또는 2개의 축상 염료와 4개의 축외 염료를 포함하는 교정 플레이트를 사용하면 10개의 염료 및/또는 이들과 연관된 상응하는 표적 분자 각각의 양을 결정하거나 측정하는 정확도를 향상시킬 수 있음을 발견하였다. 예를 들어, FAM 및 VIC와 4개의 축외 염료를 포함하는 교정 플레이트는 10개의 염료 및/또는 이들이 연관된 상응하는 표적 분자 각각의 양을 결정하거나 측정하는 정확도를 향상시키는 것을 발견하였다. 4개의 축외 염료는 하기를 포함할 수 있다:
시스템(4000 및/또는 5000)을 사용하여 3개의 축상 염료 및 2개의 축외 염료를 포함하는 샘플에 대해 멀티플렉스 검정을 수행하는 10-플렉스 샘플 검정에 대해 본 명세서에 논의된 방법을 수행하고, 결과 데이터를 분석하여 10개 이상의 염료 및 이의 연관된 표적 분자의 양을 동시에 결정하거나 측정할 수 있다. 특정 실시형태에서, 이러한 10-플렉스 또는 고급-플렉스 검정은 PCR 검정, 예컨대, qPCR 검정, dPCR 검정, 사후 PCR 검정, 예컨대, 용융 곡선 분석 등을 포함한다.
도 20을 참조하면, 특정 실시형태에서, 시스템(2000, 3000, 4000, 5000)은 qPCR 검정과 같은 증폭 검정을 수행하는 방법(2100)과 함께 사용될 수 있다. 방법(2100)은 축외 염료 및 축상 염료를 제공하는 것을 포함하는 요소(2105)를 포함한다. 방법(2100)은 또한 샘플에 대한 검정을 수행하는 것을 포함하는 요소(2110)를 포함한다. 방법(2100)은 또한 증폭 검정의 제1 주기 동안, 2개 이상의 여기 채널을 사용하여 샘플의 제1 시리즈의 조명을 수행하는 것을 포함하는 요소(2115)를 포함한다. 방법(2100)은 또한 제1 시리즈의 조명의 각각의 조명에 대한 응답으로, 2개 이상의 방출 채널로부터의 상응하는 제1 시리즈의 방출 신호를 측정하는 것을 포함하는 요소(2120)를 포함한다. 방법(2100)은 또한 증폭 검정의 제2 주기 동안, 2개 이상의 여기 채널을 사용하여 샘플의 제2 시리즈의 조명을 수행하는 것을 포함하는 요소(2125)를 포함한다. 방법(2100)은 또한 제2 시리즈의 조명의 각각의 조명에 대한 응답으로, 2개 이상의 방출 채널로부터의 상응하는 제2 시리즈의 방출 신호를 측정하는 요소(2130)를 포함한다. 방법(2100)은 또한 제1 시리즈의 측정값으로부터의 측정값 중 적어도 하나에 기초하여 축외 염료 또는 축상 염료의 양을 계산하는 것을 포함하는 요소(2135)를 포함한다. 방법(2100)은 또한 제2 시리즈의 측정값으로부터의 측정값 중 적어도 하나에 기초하여 축외 염료 및 축상 염료의 양을 계산하는 것을 포함하는 요소(2140)를 포함한다.
본 발명자들은 본 명세서에서 상기에 논의된 바와 같이 축외 염료의 고유한 시그니처 또는 핑거프린트이 검정(하나 이상의 염료가 동일한 샘플 내의 다른 염료보다 더 적은 주기에서 배경 형광을 초과하는 형광 신호를 생성하는 것(예를 들어, 하나 이상의 염료가 더 낮은 역치 주기(Ct) 또는 교차점(Cp)을 갖는 경우))에서 샘플 중의 다양한 염료 및/또는 이와 연관된 표적 분자의 양을 측정하거나 계산하는 정확도를 증가시키는 데 사용될 수 있음을 발견하였다. 도 10, 도 14 및 도 18에 도시된 ex-em 공간 플롯이 각각의 염료의 동일한 양 또는 농도를 함유하는 샘플로부터의 데이터를 나타낸다는 것이 상기될 것이다. 일부 검정에서는 샘플은 다양한 수 또는 농도의 표적 분자를 함유한다. 따라서 qPCR 또는 관련 증폭 검정 중에, 더 많은 수 또는 농도의 표적 분자와 연관된 염료, 이러한 염료의 신호는 증폭 검정의 초기 주기 동안 검출되므로, 다른 염료에서 생성되는 임의의 검출 가능한 신호 전에, 이러한 덜 풍부한 염료는 더 풍부한 표적 분자로부터 형광 신호를 측정할 때 혼선을 일으키지 않는다.
예를 들어, 도 18을 참고하면, 축외 염료 B13 및/또는 B14 중 하나 또는 둘 다가 축상 염료 A3 및 A4와 연관된 것보다 훨씬 더 풍부한 표적 분자와 연관된 경우, 증폭 검정 내의 초기 주기 동안, 검출된 신호는 x3-m3 채널 조합에서는 주로 B13 염료로부터 유래된 것이며 x4-m4 채널 조합에서는 B14 염료로부터 유래된 것이다. 따라서 x3-m3 및/또는 x4-m4 채널 조합에 의해 생성된 신호는 주로 각각 B13 및/또는 B14 염료에 의해 생성된 신호로부터 유래된 것이고, 이는 초기 주기 동안 용액에 존재하는 B13 및/또는 B14의 양을 계산할 수 있게 한다. B13 및/또는 B14의 이러한 계산된 값에 기초하여, 후기 증폭 주기 동안 존재하는 이들 염료의 양을 또한 후기 주기 동안 계산할 수 있는데, 그 이유는 예를 들어, Ct 또는 Cp의 예측된 값에 기초한 연관된 표적 분자의 성능으로 인한 것이다. 따라서 A3 및/또는 A4와 연관된 분자가 증폭 검정의 후속 주기 동안 형광을 내기 시작하면 B13 및/또는 B14으로부터의 계산된 신호를 x3-m3 및/또는 x4-m4로부터의 검출된 신호에서 차감할 수 있다. 조정된 신호(들)는 A3 및/또는 A4 염료와 연관된 분자의 양을 계산하는 데 사용될 수 있다. 유사한 방식으로, 다른 ex-em 채널 조합 중 하나 이상에서 B13 및/또는 B14의 기여는 추후 증폭 주기에서 A3 및/또는 A4의 양을 보다 정확하게 계산하는 데 사용될 수 있다.
실시예
실시예 1: t-Boc-F-염료 1 NHS 에스테르 (5)의 합성.
플루오레세인 도너 염료를 2,7-디플루오로-설포-플루오레세인 3에 대해서 제시된 반응식 1에서의 일반 절차에 따라서 합성하였다. 레소르시놀 유도체, 예컨대, 1을 메탄설폰산 중의 2-설포-테레프탈산 유도체, 예컨대, 2와 함께 가열하고, 순상 크로마토그래피로 단리하였다. 플루오레세인 염료는 염료 3의 t-BOC 보호된 염료 4로의 전환에 대해서 도시된 바와 같이 O-보호되어 있고, 표준 절차에 의해서 상응하는 NHS 에스테르 5로 전환된다.
반응식 1
단계 1: F-염료 1 (3)의 합성.
메탄설폰산 (5 mL) 중의 4-플루오로레소르시놀 (1, 490 mg, 3.825 mmol) 및 2-설포-테레프탈산 나트륨 염 (2, 513 mg, 1.913 mmol)의 혼합물을 110°에서 6시간 동안 가열시켰다. 반응 혼합물을 실온까지 냉각시키고, 3일 동안 교반을 계속하였다. 얼음-H2O (100 mL)를 첨가하고, 생성된 현탁액을 여과하였다. 여과 케이크를 얼음-H2O의 부분으로 세척하고, 그 다음 5 mL MeOH에 현탁시켰다. 현탁액을 50 mL Et2O로 희석시키고, 여과하였다. 고체 생성물을 Et2O로 세척하고, 진공에서 건조시켜 555 mg (65%)의 3을 황색 고체로서 제공하였다.
단계 2: t-Boc 기를 사용한 3의 보호.
F-염료 1 (3, 184 mg, 0.410 mmol)을 10 mL MeCN에 현탁시키고, 실온에서 3일 동안 디이소프로필에틸아민 (0.644 mL) 및 디-t-부틸 디카르보네이트 (537 mg, 2.46 mmol)로 처리하였다. H2O (0.5 mL)를 첨가하고 30분 동안 교반을 계속하였다. 반응 혼합물을 실리카(Iatrobeads 6RS-8060) 컬럼 (2 x 22 cm)에 직접 로딩하고 컬럼을 10% - 30% MeOH/DCM으로 용리시켰다. 적절한 분획을 증발시켜 216 mg (65%)의 4를 갈색 폼(foam)으로 제공하였다.
단계 3: t-Boc-F-염료 1 NHS 에스테르 (5)의 합성.
DCM (5 mL) 중의 4 (210 mg, 0.260 mmol), N-히드록시석신이미드 (150 mg, 1.3 mmol), 및 디사이클로헥실카르보디이미드 (107 mg, 0.52 mmol)의 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응을 H2O (0.1 mL)로 켄칭하고, 추가로 15분 동안 교반하였다. 생성된 현탁액을 여과하고, 여과액을 실리카(Iatrobeads 6RS-8060) 컬럼 (2 x 15 cm)에 직접 로딩하였다. 컬럼을 1:0:20:80 - 1:30:20:50 AcOH/MeOH/EtOAc/DCM으로 용리시켰다. 목적하는 생성물을 함유하는 분획을 증발시켜 185 mg (92%)의 5를 갈색 폼으로 제공하였다.
실시예 2: 설포-플루오레세인 염료 8 및 9의 합성
플루오로레소르시놀 1로부터의 설포-플루오레세인 3의 합성에 대한 실시예 1의 일반 절차를 사용하여, 레소르시놀 6 및 피리딜 레소르시놀(미국 특허 제6,221,604) 7을 사용하여 설포-테레프탈레이트 2로부터 반응식 2에 도시된 바와 같이 상응하는 설포-플루오레세인 염료 8 및 9를 제조하였다.
반응식 2
화합물 9는 피리딜 치환체의 존재로 인해서 520 nm에서 여기 가능하고 544 nm에서 방출하여, 이 염료를 실시간 PCR 기기의 X2/m2(녹색) 채널에서 사용하기에 호환성으로 만든다. 설포 FAM 및 피리딜 FAM 생성물의 구조를 MS 분석으로 확인하였다(데이터 나타내지 않음)
실시예 3: DPC-디피리딜-디클로로-플루오레세인 NHS 에스테르 (17)의 합성.
디클로로 설포테레프탈레이트 13을 합성하고, 이를 사용하여 설포-플루오레세인 3의 합성에 대한 실시예 1의 일반 절차를 사용하여 반응식 3에 도시된 바와 같이 설포-플루오레세인 15를 제조하였다. 염료 15는 O-보호하고, 이를 NHS 에스테르 17로 전환시켰다.
반응식 3
단계 1: 2,5-디클로로-3,6-디메틸-벤젠설포닐 클로라이드 (11):
17.5 g (0.1 mol)의 2,5-디클로로-p-자일렌 10에 53.2 mL (0.8 mol)의 클로로황산을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 3일 동안 교반하고, 그 다음 350 mL의 DCM으로 희석시켰다. DCM 용액을 350 g의 얼음에 매우 천천히 첨가하고, 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 분별 깔때기로 옮기고, 유기층을 분리하고, 건조시키고(Na2SO4), 증발시키고, 진공에서 건조시켜 25.56 g (93%)의 11을 백색 고체로서 제공하였다. 1H NMR (CDCl3) δ 7.63 (s, 1, 4-H), 2.84, 2.46 (2 x s, 6, 2 x CH3). MS (이온 트랩 MS) m/z 273.0 (계산치 MH+= 272.9).
단계 2: 2,5-디클로로-3,6-디메틸-벤젠설폰산 리튬 염 (12)
200 mL MeOH 중의 15.307 g (60 mmol)의 11의 용액에 75 mL (150 mmol)의 2 N LiOH를 서서히 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 증발시켜 MeOH를 제거하고, H2O 중의 생성물의 생성된 현탁액을 여과하였다. 여과 케이크를 20 mL의 차가운 H2O로 세척하고, 그 다음 공기 건조시켜 14.5 g의 12를 백색 결정질 화합물로서 제공하였다. 생성물의 제2 크롭을 여과액으로부터 단리하였다. 3x의 총 수율은 15.24 g(97%)이었다. 1H NMR (CD3OD) δ 7.42 (s, 1, 4-H), 2.76, 2.38 (2 x s, 6, 2 x CH3). MS m/e 253.0 (계산치 [M-Li]- = 253.0).
단계 3: 2,5-디클로로-3-설포-테레프탈산 (13)
400 mL의 H2O 중의 25.286 g (160 mmol)의 KMnO4의 용액에 5.221 g (20 mmol)의 12를 첨가하였다. 반응 혼합물을 교반하고, 22시간 동안 약한 환류 하에서 가열시켰다. 환류 및 교반을 30분 동안 유지시키면서 100 mL의 MeOH를 서서히 첨가하여 과량의 KMnO4를 파괴하였다. 반응 혼합물을 뜨거운 상태에서 여과하였다. 여과 케이크를 다시 H2O/MeOH (200 mL/50mL)의 혼합물에 현탁시키고, 비등할 때까지 가열시키고, 뜨거운 상태에서 여과하였다. 합한 여과액을 증발 건조시키고, 50 mL H2O에 다시 용해시켰다. H2O 용액을 여과하고, 여과액을 증발시켰다. 잔류물을 Dowex 50W-X8 H+ 컬럼(4 x 34 cm, 450 mL의 수지, 350 mL의 H2O로 용리)에서 정제시켰다. H2O 용액을 증발시켜 4.6 g (73%)의 13을 백색 고체로서 제공하였다. 1H NMR (CD3OD) δ 7.80 (s, 1, 6-H). MS m/e 313.0 (계산치 [M-H]-= 312.9).
단계 4: 염료 화합물 (15)
6 mL의 MeSO3H 중의 473 mg (1.5 mmol)의 13과 561 mg의 피리도-레소르시놀 14의 혼합물을 28시간 동안 170℃ 내지 180℃에서 교반하고, 그 다음 실온까지 냉각시키고, 160 mL의 Et2O에서 침전시켰다. 고체를 원심분리로 수집하고, 그 다음 30 mL의 H2O에 다시 용해시켰다. H2O 용액의 pH 값을 20% NaOH를 사용하여 약 5로 조정하였다. 생성된 현탁액을 원심분리하고, 상청액을 경사분리하였다. 고체를 30 mL의 물에 재현탁시키고, 초음파처리하고, 원심분리하고, H2O 세척 공정을 1회 더 반복하였다. 조 고체 생성물을 20 mL의 MeoH에 재현탁시키고, 초음파처리하고, 40 mL의 EtOAc로 희석시키고, 보텍싱하고, 원심분리하였다. 고체 생성물을 공기 건조시키고, 그 다음 진공에서 건조시켜 502 mg (53%)의 15를 암적색 고체로서 제공하였다. 1H NMR (CD3OD) δ 8.73 (d, 2), 8.46 (dd, 2), 7.96 (m, 2), 7.64 (s, 1), 7.45 (m, 2), 7.17 (s, 2), 6.84 (s, 2). MS m/z 635.0 (계산치 [MH]+= 635.0).
단계 5: DPC- 염료 산 (16)
6 mL의 피리딘 중의 64 mg (0.1 mmol)의 15와 46 mg (0.2 mmol)의 Ph2NCOCl의 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. H2O (0.1 mL)를 첨가하고 1시간 동안 교반을 계속하였다. 휘발성 물질을 증발 및 1:50:50 i-Pr2Net/DCM/PhCH3 (2 x)와의 공증발로 제거하였다. 잔류물을 10% MeOH/DCM (25 mL)에 용해시키고, H2O (25 mL)로 세척하였다. H2O 용액을 10% MeOH/DCM (25 mL x 4)으로 추출하였다. 유기층과 추출물을 합하고, 증발시켰다. 잔류물을 용리물로서 0 - 20% H2O/MeCN을 사용하여 실리카(Shell-USA로부터의 Iatrobeads 6RS-8060) 컬럼 크로마토그래피로 정제시켰다. 적절한 분획을 증발시켜 39 mg (47%)의 16을 제공하였다. MS m/z 830.0 (계산치 [MH]+= 830.0).
단계 6: DPC- 염료-NHS 에스테르 (17)
1.5 mL의 DCM 중의 39 mg (0.047 mmol)의 16 및 27 mg (0.235 mmol)의 N-히드록시석신이미드 (NHS)의 용액에 19 mg (0.094 mmol)의 디사이클로헥실카르보디이미드 (DCC)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하고, 그 다음 10% HCl (0.1 mL)로 켄칭하였다. 휘발성 물질을 증발로 제거하고, 잔류물을 5% MeOH/DCM (5 mL)에 용해시키고, 실리카(Shell-USA로부터의 Iatrobeads 6RS-8060) 컬럼 크로마토그래피에 의해서 용리물로서 AcOH/MeOH/DCM의 구배(1:5:95 - 1:30:70)를 사용하여 정제시켰다. 적절한 분획을 증발시켜 31 mg (71%)의 17을 제공하였다.
실시예 4: FRET-링커 (24)의 합성.
L1 타입 에너지 전달 링커 24(본원에서 "Y-링커"라고 지칭)를 제조하기 위한 합성 접근법을 하기 반응식 4에 나타낸다. 메틸 2,5-디메틸벤조에이트 18을 N-브로모석신이미드로 브로민화시켜 디브로마이드 19를 제공하였다. 나트륨 아지드를 사용하여 19를 후속 처리하고 그 다음 중간체 디아지드 20을 비누화시켰다. 생성된 산 21을 N,N,N',N'-테트라메틸-O-(N-석신이미딜)우로늄 테트라플루오로보레이트 (TSTU)로 활성화시키고, 그 다음 다량의 2,2'-(에틸렌디옥시)비스(에틸아민)으로 켄칭하여 아민 유도체 22를 제공하였다. 22와 글루타르산 무수물의 추가 반응은 카르복실산 유도체 23을 제공하였는데, 이것을 라니-니켈의 존재 하에서 수소화에 의해서 목적하는 Y-링커 24로 전환시켰다.
반응식 4
단계 1: 디브로마이드 (19)의 합성.
사염화탄소 (100 mL) 중의 18 (11.5 g, 70 mmol)의 용액에 N-브로모석신이미드 (23.7 g, 133.2 mmol) 및 벤조일 퍼옥시드 (1.7 g, 7 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 80℃에서 6시간 동안 교반하였다. 그것을 실온까지 냉각시키고, 헥산 (50 mL)으로 희석시켰다. 생성된 현탁액을 여과하고, 여과액을 증발시켰다. 잔류물을 헥산으로 분별 재결정화시켜 6.7 g (31%)의 19를 백색 결정질 화합물로서 제공하였다.
단계 2: 디브로마이드 (19)의 대체.
DMF (40 mL) 중의 19 (6.7 g, 20.8 mmol)의 용액을 실온에서 16시간 동안 나트륨 아지드 (6.8 g, 104.0 mmol)로 처리하였다. 반응 혼합물을 DCM (50 mL)으로 여과하였다. 여과액을 증발시키고, 잔류물을 DCM (150 mL)에 다시 용해시켰다. DCM 용액을 H2O (100 mL), 염수 용액 (100 mL)으로 세척하고, 건조시키고(Na2SO4), 여과하였다. 여과액을 증발시키고, 잔류물을 진공에서 건조시켜 5.06 g (99%)의 20을 시럽으로 제공하였다.
단계 3: 화합물 (20)의 비누화.
MeOH (80 mL) 중의 20 (5.05 g, 20.5 mmol)의 용액에 LiOH/H2O (1.72 g, 41.0 mmol)의 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하고, 그 다음 10% HCl (14.8 mL)의 용액으로 산성화시켰다. 휘발성 물질을 증발로 제거하고 잔류물을 DCM (150 mL)에 다시 용해시켰다. DCM 용액을 H2O (100 mL), 염수 용액 (100 mL)으로 세척하고, 건조시키고(Na2SO4), 여과하였다. 여과액을 증발시키고, 잔류물을 EtOAc/헥산으로부터 재결정화시켜 4.17 g (2개의 크롭, 88%)의 21을 백색 결정질 바늘형으로서 제공하였다.
단계 4: 아민 (22)의 합성.
DCM (20 mL) 중의 21 (929 mg, 4.0 mmol), 디이소프로필에틸아민 (1.394 mL, 8.0 mmol), 및 TSTU (1.806 g, 6.0 mmol)의 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 그 다음 이 반응 혼합물을 2,2'-(에틸렌디옥시)비스(에틸아민)/DCM (2.929 mL/20 mL)의 용액에 서서히 첨가하고, 추가로 3시간 동안 교반하였다. DCM (100 mL)을 첨가하고, DCM 용액을 염수 용액 (100 mL x 2)으로 세척하고, 건조시키고(Na2SO4), 여과하였다. 여과액을 증발시키고, 잔류물을 용리물로서 1:10:90 - 1:35:65 Et3N/MeOH/DCM을 사용하여 실리카 (Iatrobeads 6RS-8060) 컬럼 (2.5 x 17 cm)으로 정제시켰다. 적절한 분획을 증발시켜 1.15 g (79%)의 22를 시럽으로서 제공하였다.
단계 5: 산 (23)의 합성.
DCM (15 mL) 중의 22 (1.142 g, 3.151 mmol)의 용액에 디이소프로필에틸아민 (1.098 mL, 6.302 mmol) 및 글루타르산 무수물(0.539 g, 4.727 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 17시간 동안 교반하였다. H2O (0.2 mL)를 첨가하고 15분 동안 교반을 계속하였다. 휘발성 물질을 증발로 제거하고 잔류물을 DCM (120 mL)에 다시 용해시켰다. DCM 용액을 0.1 N HCl (100 mL)로 세척하고, 건조시키고(Na2SO4), 여과하였다. 여과액을 증발시키고, 잔류물을 용리물로서 1:5:95 - 1:10:90 Et3N/MeOH/DCM을 사용하여 실리카 (Iatrobeads 6RS-8060) 컬럼 (2 x 20 cm)으로 정제시켰다. 적절한 분획을 증발시켜 1.43 g (95%)의 23를 시럽으로서 제공하였다.
단계 6: 디메틸아미노-FRET-링커 24의 합성.
MeOH (15 mL) 중의 23 (300 mg, 0.630 mmol) 및 라니-니켈 (약 200 mg, 습식 중량)의 현탁액을 H2 하에서 20시간 동안 교반하였다. 그 다음 반응 혼합물을 셀라이트로 여과하고, 여과액을 증발시켰다. 잔류물을 MeOH과 공증발시키고, 진공에서 건조시켜 260 mg (97%)의 24를 발포체로서 제공하였다.
실시예 5: 염료 링커 중간체의 합성.
염료 링커 중간체의 합성은 t-BOC-보호된 설포-FAM-ET-링커 NHS 에스테르 28의 형성에 대해서 하기 반응식 5에 요약된 일반 절차를 따른다. ET-링커, 예컨대, 24를 t-Boc-보호된 염료 NHS 에스테르, 예컨대, 25와 커플링시켜 염료 링커 중간체, 예컨대, 26을 위치이성질체의 혼합물로서 제공하였다. 실리카 컬럼 정제 후, 순수한 위치이성질체 아미노 기를 단계별 분석 물질 표지에 사용하기 위해 트리플루오로아세틸 기로 보호하거나 ET 염료를 생성하기 위해 제2 Dye NHS로 표지하는 데 직접 사용할 수 있다. 염료-링커 중간체 NHS를 생성하기 위해, 유리 아미노를 하기에 제시된 바와 같이 TFA 기로 보호하고, 카르복실산 기를 활성화시켜 t-Boc-염료-ET-링커 NHS 에스테르 28을 제공하였다.
반응식 5
단계 1: t-Boc-염료 NHS 에스테르 (25)와 링커 (24)의 커플링.
DCM (5 mL) 중의 링커 (24, 130 mg, 0.306 mmol) 및 디이소프로필에틸아민 (0.07 mL)의 혼합물에 t-Boc-염료 NHS 에스테르 (25, 148 mg, 0.2 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 휘발성 물질을 증발로 제거하고, 잔류물을 용리물로서 5% - 20% H2O/MeCN을 사용하여 실리카 (Iatrobeads 6RS-8060) 컬럼 (2 x 26 cm)으로 정제시켰다. 적절한 분획을 증발시켜 80 mg (44%)의 26을 위치이성질체로서 제공하였다.
단계2: 트리플루오로아세틸 기를 사용한 26의 보호.
MeOH (3 mL) 중의 26 (77 mg, 0.084 mmol), 디이소프로필에틸아민 (0.2 mL), 및 에틸 트리플루오로아세테이트 (0.3 mL)의 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 휘발성 물질을 증발로 제거하고, 잔류물을 MeCN 및 DCM과 공증발시켜 카르복실산 27을 제공하였다. 이 물질을 추가로 정제시키지 않고 후속 반응에 직접 사용하였다.
단계 3: t-Boc-염료--링커 NHS 에스테르 (28)의 합성. DCM (10 mL) 중의 27 (이전 반응으로부터)의 용액에 디이소프로필에틸아민 (0.1 mL) 및 TSTU (50 mg, 0.167 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2.5시간 동안 교반하였다. 용매를 증발시키고, 잔류물을 용리물로서 1:5:95 - 1:20:80 AcOH/MeOH/DCM을 사용하여 실리카 (Iatrobeads 6RS-8060) 컬럼 (2 x 16 cm)으로 정제시켰다. 적절한 분획을 증발시켜 81 mg (전체 87%)의 염료-링커 NHS 중간체 28을 고체로서 제공하였다.
실시예 6: 염료 링커 중간체 (32)의 합성.
염료 링커 중간체의 합성은 Cy3-FRET-링커 NHS 에스테르 32의 형성에 대해서 하기 반응식 6에 요약된 일반 절차를 따른다. 링커, 예컨대, 24를 Cy3 염료 NHS 에스테르, 예컨대, 29와 커플링시켜 염료 링커 중간체, 예컨대, 30을 위치이성질체의 혼합물로서 제공하였다. 실리카 컬럼 정제 후, 순수한 위치이성질체 아미노 기를 단계별 분석 물질 표지에 사용하기 위해 트리플루오로아세틸 기로 보호하거나 ET 염료를 제조하기 위해 제2 Dye NHS로 표지하는 데 직접 사용할 수 있다. 염료-링커 중간체 NHS 28을 제조하기 위해서, 26 내의 유리 아미노를 예컨대, 하기에 도시된 바와 같이 TFA 기로 보호하여 27을 제공하고, 카르복실산 기를 Cy3-FRET-링커 NHS 에스테르 28로 활성화시켰다.
반응식 6
단계 1: Cy3 NHS 에스테르 (29)와 ET-링커 (24)의 커플링.
DMF (5 mL) 중의 ET-링커 (24, 130 mg, 0.306 mmol) 및 디이소프로필에틸아민 (0.07 mL)의 혼합물에 Cy3 NHS 에스테르 (29, 0.2 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 20 mL의 디에틸 에테르에 첨가하였다. 모 액체를 생성된 오일 같은 침전물로부터 경사분리하고, 10% MeOH/CH2Cl2에 현탁된 침전물을 10% MeOH/CH2Cl2/1% AcOH로 용리하는 순상 크로마토그래피로 정제시켰다. 적절한 분획을 증발시켜 30을 위치이성질체의 혼합물로서 제공하였다.
단계 2: 트리플루오로아세틸 기를 사용한 30의 보호. MeOH (3 mL) 중의 30 (77 mg), 디이소프로필에틸아민 (0.2 mL), 및 에틸 트리플루오로아세테이트 (0.3 mL)의 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 휘발성 물질을 증발로 제거하고, 잔류물을 MeCN 및 DCM과 공증발시켜 카르복실산 31을 제공하였다. 이 물질을 추가로 정제시키지 않고 후속 반응에 직접 사용하였다.
단계 3: Cy3-ET-링커 NHS 에스테르 (32)의 합성.
DCM (10 mL) 중의 31 (이전 반응으로부터)의 용액에 디이소프로필에틸아민 (0.1 mL) 및 TSTU (50 mg, 0.167 mmol, 2당량)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2.5시간 동안 교반하였다. 용매를 증발로 제거하고, 잔류물을 용리물로서 1:5:95 - 1:20:80 AcOH/MeOH/DCM을 사용하여 실리카 (Iatrobeads 6RS-8060) 컬럼 (2 x 16 cm)으로 정제시켰다. 적절한 분획을 증발시켜 Cy3-링커 NHS 중간체 32를 고체로서 제공하였다.
실시예 7: Cy3-Cy5.5 ET 염료 NHS (35) 합성
순수한 이성질체 Cy3-링커 중간체 30 (10 mgs)을 3 mL의 무수 DMF에 현탁시키고, 6당량의 디이소프로필에틸아민 (11 μL)에 현탁시켰다. 2 mL DMF 중에 현탁된 GE Healthcare로부터의 Cy5.5-NHS 에스테르 33(1.2당량, 12 mg)을 첨가하고, 반응을 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 아세토니트릴/디에틸 에테르를 첨가하여 조 생성물을 단리하고, 침전된 고체를 수집하였다. ET 염료 카르복실산 생성물 34를 용리물로서 5% - 20% H2O/MeCN/1% NEt3를 사용하여 순상 컬럼 크로마토그래피(Iatrobeads 6RS-8060)로 단리하였다. ET 염료 34를 6당량의 DIPEA를 함유한 DMF에 현탁시켰다. 고체 TSTU (3당량)를 첨가하고, 혼합물을 3시간 동안 실온에서 교반하였다. 조 바이크로모포릭 Cy3-Cy5.5 ET 염료 NHS 35를 에틸 아세테이트를 첨가하여 침전시켰다. 생성된 고체 침전물을 수집하고, AcCN에 현탁시키고, 잔류물을 수집하고, 추가로 정제시키지 않고 사용하였다. Cy3 대신 NHS 형태로 제공된 다른 유형의 염료, 예를 들어, AF 555, FAM, BODIPY 530/550, BODIPY R6G, 및 BODIPY TMR - 모두 Thermo Fisher Scientific(미국 매사추세츠주 월탐 소재)로부터 입수 가능 -를 사용하여 반응식 7의 절차를 구현할 수 있다. 반응식 7에서 Cy3 대신 사용될 수 있는 다른 염료는 플루오레세인 및 로다민 염료의 NHS 유도체, 예를 들어, NED, VIC, HEX, 또는 JOE를 포함한다. 반응식 7에서, Cy5.5 대신 사용될 수 있는 NHS 형태의 다른 시아닌 염료는 예를 들어, Thermo Fisher Scientific으로부터 입수 가능한 AF647, AF660, 및 AF680을 포함한다.
반응식 7
실시예 8. ET 염료 합성 및 분석물 표지.
목적하는 표적 분석물의 표지는 목적하는 ET 염료 표지된 분석물을 직접 제공하기 위해 분석물 아민이 미리 형성된 도너/억셉터 ET 염료 NHS 에스테르에 커플링되는 기질에 따라 단일 단계 또는 2단계 표지 절차를 따르거나, 아미노 보호된 염료-링커 중간체 NHS를 제1 단계에서 첨가할 수 있고, 분석물-링커-염료 표지된 중간체를 단리하고, N-탈보호시키고, 후속하여 보색 염료 NHS로 제2 단계에서 표지하여 ET 염료 표지된 분석물을 생성할 수 있다(도 1 참조).
실시예 8a: 분석물의 단일-단계 ET 염료 표지.
아미노 기 유도체화된 올리고뉴클레오티드를 미리 형성된 ET 염료, 예컨대, 염료 35로 표지하기 위한 반응식 9에 요약된 일반 절차에 따라서 단일-단계 올리고뉴클레오티드 표지를 수행하였다. 아미노 기 유도체화된 올리고머 (30,000 pM)를 250 μL의 100 mmolar NaHCO3 탈이온수에 현탁시켰다. 5 μL의 DMSO에 현탁된 3 당량(0.2 mg)의 35를 첨가한다. 반응을 5시간 동안 교반하고, 1x TEAA로 평형화된 LH-20 크기 배제 컬럼에 로딩하고, 빨리 이동시키고, 올리고-염료 표지된 밴드를 수집하였다(40). 순수한 생성물을 1 x TEAA 중의 5 - 60% AcCN으로 용리하는 RP HPLC 정제로 단리하였다.
반응식 9
실시예 8b: 분석물의 2단계 ET 염료 표지
2-단계 표지 공정을 사용하여, 일련의 ET 염료를 합성하였는데, 플루오레세인-링커 NHS 중간체 28 또는 Cy3-링커 NHS 중간체 32를 적절한 리포터 염료 NHS 에스테르와 조합하여 사용하여 하기 반응식 10에 제시된 일련의 ET 염료를 산출하였다. 반응식 10에 도시된 염료-표지된 올리고뉴클레오티드의 제조 방법을 반응식 11에 도시한다.
반응식 10
반응식 11
먼저 기질을 염료-링커 NHS 중간체, 예컨대, Cy3-링커 NHS 중간체 32로 표지하여 염료-링커 표지된 올리고뉴클레오티드 중간체 41을 제공하고, 이것을 역상 HPLC로 정제시키고, 그 다음 DMF 및 DIPEA 중의 Cy5.5 염료 NHS로 표지하여 ET 염료 표지된 올리고뉴클레오티드 42를 제공한다.
실시예 9: 소광제 부착
소광제 화합물을 하기 반응식 12의 반응에 따라서 고체 지지체, 예를 들어, 비드에 부착하여 올리고뉴클레오티드 합성기를 사용한 프로브의 작제를 위한 기질을 제공할 수 있다.
반응식 12
하기 예시적인 합성 절차는 상기에 기재된 임의의 소광제에 대해서 쉽게 일반화될 수 있다.
일부 실시형태에서, 대표적인 유도체화된 소광제 44를 하기 절차에 따라서 합성할 수 있다. 대표적인 소광제 43 NHS 에스테르 (100 mg, 0.123 mmol)를 1 mL의 무수 DCM에 용해시켰다. 1213 μL의 DCM (5% 용액)에 용해된 1-O-DMT-2-(4-아미노부틸)-1,3-프로판디올 (61 mg, 0.14 mmol)을 디이소프로필에틸아민 (32 μL, 0.19 mmol)과 혼합하였다. 이것을 실온에서 대표적인 소광제 43 NHS 에스테르에 적가하고, 질소 하에서 30분 동안 교반하였다. DCM 용액 중의 대표적인 조 소광제 44를 DCM (50 mL)으로 희석시키고, 1% 시트르산, 물 및 그 다음 염수로 세척하였다. 유기 층을 Na2SO4에서 건조시키고, 증발 건조시켰다. 추가로 밤새 고압 건조시켜 125 mg (88% 수율)의 44를 암청색 고체로서 제공하였다. 생성물을 추가로 정제시키지 않고 다음 단계에서 사용하였다. 1H NMR (400 ㎒, CD2Cl2): δ 8.14 (1H, d), 7.83 (2H, m), 7.60 (2H, d), 7.50 - 7.10 (22H, m), 6.80 (4H, m) 4.40 (2H, m), 4.25 (2H, m), 3.75 (6H, s), 3.62 - 3.50 (4H, m), 3.30 (6H, m), 3.05 (2H, m), 2.51 (2H, t), 2.40 (1H, t), 1.72 (2H, d), 1.50 - 1.20 (7H, m). [M+]에 대한 LC/HRMS (ESI+) 계산치 1113.48; 실측치 1113.47. 40 - 100% 아세토니트릴(0.1 M 트리에틸암모늄 아세테이트에 대해)로의 20분 선형 구배로 용리를 수행하였다. 1.0 ml/분 유량. 285 nm 및 655 nm에서의 검출.
또 다른 실시형태에서, 디글리콜 링커 45를 포함하는 대표적인 소광제를 하기 절차에 따라 합성할 수 있다. 대표적인 소광제 44 (125 mg, 0.109 mmol)를 3 mL의 무수 DCM에 용해시켰다. DIPEA (47 μL, 0.27 mmol), 그 다음 디글리콜산 무수물(25 mg, 0.22 mmol)을 첨가하였다. 용액을 30분 동안 질소 하에서 교반하였다. 반응 용액을 농축시키고, 잔류물을 1% TEA/DCM에 재용해시키고, 5 →15% MeOH/DCM/1% TEA 용리액을 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(10% - 1% TEA/DCM에서 사전 평형화)로 정제시켰다. 정제된 풀을 농축시키고, 그 다음 1% 시트르산, 물 및 염수로 세척하였다. 유기 층을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 증발 건조시키고, 그 다음 고압 하에서 추가로 건조시켜 대표적인 소광제 디글리콜 링커 (45) (96 mg, 69% 수율)를 암청색 고체로서 산출하였다. 1H NMR (400 ㎒, CD2Cl2): δ 8.14 (1H, d), 7.85 (2H, m), 7.60 (2H, d), 7.52 - 7.10 (22H, m), 6.79 (4H, d), 4.35 (2H, m), 4.25 (2H, m) 4.05 (3H, s/m), 3.80 (2H, s), 3.72 (6H, s), 3.28 (6H, m), 3.00 (2H, m), 2.90 (2H, m), 2.50 (2H, t), 2.32 (1H, t), 1.65 (2H, m), 1.50 - 1.10 (7H, m). [M+]에 대한 LC/HRMS (ESI+) 계산치 1229.49; 실측치 1229.49. 40 - 100% 아세토니트릴(0.1 M 트리에틸암모늄 아세테이트에 대해)로의 20분 선형 구배로 용리를 수행하였다. 1.0 ml/분 유량. 285 nm 및 655 nm에서의 검출.
대표적인 소광제 45를 하기 절차에 따라 고체 지지체, 예를 들어, 폴리스티렌 비드에 연결하여 46을 제공할 수 있다. 대표적인 소광제 디글리콜 링커 45 (357 mg, 0.20 mmol)를 50 mL의 무수 DMF에 용해시켰다. 이것에 아미노메틸 폴리스티렌(6.77 g, 0.223 mmol, 33 μmol/g 아민), DIPEA (194 μL, 1.12 mol), 및 COMU 또는 1-시아노-2-에톡시-2-옥소에틸리덴아미노옥시)디메틸아미노-모르폴리노-카르베늄 헥사플루오로포스페이트 (287 mg, 0.669 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 3시간 동안 진탕시켰다. 용매를 제거하고, 수지를 각각 50 mL의 DMF, MeCN, 및 DCM으로 3회 세척하였다. 이어서, THF 중의 50 mL의 1-N-메틸이미다졸과 혼합된 THF 중의 50 mL의 아세트산 무수물/피리딘과 반응시켜 수지 상에 남아 있는 임의의 아민 기를 캡핑하고, 1시간 동안 진탕시켰다. 용매를 제거하고 수지를 THF, MeCN 및 DCM으로 각각 3회 세척하였다. 그런 다음 수지를 고진공 하에서 밤새 건조시켜 6.60 g의 담청색 분말의 대표적인 소광제 46을 수득하였다. 수지 지지체를 닌히드린 시험을 사용하여 임의의 잔류 아민 기에 대해 테스트하였고, 0.94 μmol/g의 아민(무시할 수 있음)인 것을 발견하였다. MeCN 중의 0.1 M 톨루엔설폰산의 알려진 부피를 갖는 대표적인 소광제 PS 샘플의 칭량된 분취량의 DMT 기를 절단함으로써 지지체에 결합된 대표적인 소광제의 양을 결정하였다. 498에서 흡광도를 얻었고 흡광 계수(76,500M-1cm-1), 질량 및 부피를 사용하여 폴리스티렌 g당 대표적인 소광제의 로딩은 22 μmol/g인 것을 발견하였다. 이 커플링 조건에서 발견된 전형적인 범위는 20 내지 27 μmol/g이다.
실시예 10: 소광제 고체 지지체 아미노 프로브 합성
소광제 화합물 및 ET 염료는 고체 지지체, 예를 들어, 비드에 부착되어 올리고뉴클레오티드 합성기를 사용하는 프로브의 작제를 위한 기질을 제공하고, L3(즉, 47)-L4(즉, 49) 유형 링커를 이용하는 다음 반응식(도 3 참조)에 따라서 소광제-ET 염료 올리고뉴클레오티드 프로브 작제물을 제공할 수 있다:
QSY21 Bulk Solid Support (22 μmole/g 로딩) 11 mg을 칭량하여 0.25 μmole의 QSY21 3900 컬럼을 패킹하고, 3900 컬럼 본체에 붓는다. 3900 합성 표준 프로토콜에 따라 염료 포스포르아미다이트 50 및 링커 포스포르아미다이트(47 및 49)를 포함한 모든 표준 시약으로 Biolytics 3900 합성기를 준비한다. 3900의 위치 6에 28% DIPA/아세토니트릴 시약을 설치한다. 무수 아세토니트릴에서 0.1 M 농도의 특수 시약을 준비한다. Microsoft Excel에서 3900 Sequence Template를 열고 각각의 올리고뉴클레오티드 서열에 대한 관련 올리고뉴클레오티드 서열 정보를 입력한다. QSY21 컬럼을 합성 페이지에 지정된 컬럼 위치의 각각의 뱅크에 배치하여 DNA 합성기에 로딩한다. 시약 라인을 프라이밍한다. 올리고뉴클레오티드 합성을 시작한다. 올리고뉴클레오티드 합성 단계가 완료되면 QSY 지지체를 완전히 건조시켜 합성 컬럼을 진공 플레이트에 놓고 진공 플레이트를 진공 매니폴드에 놓고 5분 동안 진공을 켜서 임의의 잔류하는 아세토니트릴을 제거한다. 50/50 아민/메탄올/물 분해 용액을 컬럼에 추가하고 10분 동안 기다린다. 세척액을 모두 배출한다. 반복한다. 뚜껑이 있는 컬럼 바이알을 65℃로 설정된 savant 또는 동등한 세트에 넣고 4 내지 5시간 동안 가열한다. 바이알을 꺼내어 냉동실에 10분 동안 넣어 냉각한다. 냉각 후 바이알에서 캡을 제거하고 savant 또는 동등물에 넣고 진공 하에서 올리고뉴클레오티드를 건조시킨다. 에탄올은 에펜도르프 튜브에서 뉴클레아제가 없는 물에 올리고뉴클레오티드를 희석하고 볼텍싱하여 건조된 QSY-염료 표지된 올리고뉴클레오티드 51을 침전시킨다. 에탄올 및 볼텍싱에서 50 mM 아세트산 나트륨을 첨가한다. 올리고뉴클레오티드를 냉동고에 넣어 냉각한다. 튜브를 2500 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 조 생성물을 펠릿화한다. 올리고뉴클레오티드 튜브로부터의 상청액을 폐액 비이커로 제거한다. 3회 반복하고 진공 savant에서 올리고뉴클레오티드 펠릿을 건조시킨다.
건조된 아미노 QSY 올리고뉴클레오티드 52를 savant로부터 제거하고, 볼텍싱 및 온화한 가열과 함께 물(pH 8.5) 중의 0.25 M 중탄산나트륨에 현탁시킨다. 염료 NHS 에스테르 Alexa Fluor 647 (53) 용액의 용액을 DMSO에서 60 mM로 준비한다. 염료 DMSO 용액(5당량)을 올리고뉴클레오티드에 첨가하고 용액을 볼텍싱시킨다. 간헐적으로 교반하면서 실온에서 1 내지 2시간 동안 반응을 실행한다. 반응 혼합물의 질량 스펙트럼을 수집하여 반응을 모니터링하고, 표지된 생성물이 80% 전환율에 도달하면 반응을 중단시키고, 에탄올에 50 mM 아세트산나트륨을 첨가하여 에탄올은 침전시키고, 냉각시키고, 원심분리에 의해 펠릿화된 물질을 수집하고, 진공 하에서 펠릿을 건조시켰다. 순수한 QSY 표지된 프로브 53을 50/50 아세토니트릴/물에서 0.1 M TEAA 및 0.1 M TEAA를 사용하는 역상 HPLC에 의해 단리시킨다.
반응식 13의 절차는 예를 들어, VIC, NED 및 HEX와 같은 FAM 대신 포스포르아미다이트 형태로 제공되는 다른 유형의 염료로 구현될 수 있다. 반응식 13에서 AF647 대신에 사용될 수 있는 다른 염료는 예를 들어, AF660 및 AF680과 같은 시아닌 염료의 NHS 유도체 또는 TAMRA 또는 ROX와 같은 로다민 염료를 포함한다.
반응식 13
실시예 11: L2 링커를 사용한 ET 염료의 제조
ROX 로다민과 같은 로다민 염료와 함께 L2 링커를 사용하는 플루오레세인-로다민 에너지 전달 염료의 제조는 4-아미노메틸벤조산과 4-아미노메틸-5-카르복시플루오레세인의 반응 및 로다민 HNS 에스테르에 대한 후속 접합에 의해 수행되었다(반응식 14)(도 2 참조).
ROX-L2-NHS의 합성
5-ROX-NHS 54 (5 mg, 9 μmol), 4-아미노메틸벤조산 55 (3 mg, 19 μmol), 및 트리에틸아민 (20 μl)의 혼합물을 1.5 ml 에펜도르프 튜브 내의 디메틸포름아미드 (DMF, 200 μl)에 현탁시켰다(반응식 14). 혼합물을 60℃까지 10분 동안 가열하였다. 반응 진행을 디클로로메탄, 메탄올 및 아세트산의 400/30/10 혼합물로 용리시키면서 실리카겔 상의 TLC로 모니터링하였다. 불용성 4-아미노메틸벤조산을 원심분리에 의해 분리하고 DMF 용액을 5% HCl (1 ml)로 경사분리하였다. 불용성 4-아미노메틸벤조산-5-ROX 56을 원심분리로 분리하고, 5% HCl (2 x 1 ml)로 세척하고 진공 원심분리기에서 건조시켰다.
반응식 14
DMF (125 μl), 디이소프로필에틸아민 (10 μl) 및 디석신이미딜카르보네이트(10 mg) 중의 조 4-아미노메틸벤조산-ROX 56의 용액을 1.5 ml 에펜도르프 튜브에서 합하고 60℃까지 가열하였다. 반응 진행을 디클로로메탄, 메탄올 및 아세트산의 600/60/16 혼합물로 용리시키면서 실리카겔 상의 TLC로 모니터링하였다. 5분 후 반응이 완료된 것으로 보였다. 용액을 메틸렌 클로라이드(3 ml)로 희석하고, 250 mM 탄산염/중탄산염 완충액, pH 9 (4 x1 ml)로 세척하고, 유기층을 건조시키고 (Na2SO4), 진공 원심분리기에서 농축 건조시켜 57을 얻었다. 고체를 DMF (100 ul)에 용해시켰다. 수율은 분취량을 pH 9 완충액으로 희석하고 552 nm에서 흡광도를 측정하여 결정하였다. 50,000/cm/M의 흡광 계수를 사용하여 4-아미노메틸벤조산 -5-ROX -NHS 57의 농도는 54로부터 8% 수율에 대해 4.8 mM이었다.
FAM-ROX ET 염료의 합성
4-아미노메틸벤조산 -5ROX NHS 57 (250 μl DMF 중의 1 μmol)의 용액을 1.5 ml 에펜도르프 튜브에서 4-아미노메틸-5-카르복시플루오레세인 58 (100 μl DMSO 중의 19, 2.2 μmol) 및 트리에틸아민 (20 μl)의 용액과 합했다(반응식 15). 0.1 M TEAA에 대해 15 - 35% 아세토니트릴의 용리 구배로 C8 역상 컬럼을 사용하는 HPLC에 의해 반응을 모니터링하였다. HPLC 분석은 57이 소모되었고 과량의 미반응 58이 남았음을 나타냈다. 반응물을 5% HCl(1 ml)로 희석시키고, FAM-ROX ET 염료 산 생성물 59를 원심분리로 분리하여 미반응 58이 수상에 남았다. 고체를 5% HCl(4 x1 ml)로 세척하고 진공 원심분리기에서 건조시키고, DMF (300 μl)에 취하였다. 수율은 정량적이었다.
반응식 15
FAM-ROX ET-NHS의 합성
FAM-ROX ET 염료 59 (100 μ DMF 중의 0.6 μmol), 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 염산염 (DEC, 2 mg) 및 N-히드록시석신이미드 (4 mg)의 용액을 1.5 ml 에펜도르프 튜브에서 합하였다(반응식 16). 혼합물을 간단히 초음파처리하고 60℃까지 가열시켰다. 반응을 디클로로메탄, 메탄올 및 아세트산의 600/60/16 혼합물로 용리시키면서 실리카겔 상의 TLC로 모니터링하였다. 반응은 30분 내에 완료되었고, 5% HCl로 희석시켰다. 침전물 60을 원심분리로 분리하고 진공 원심분리기에서 건조시켰다. 활성화된 FAM-ROX ET Dye NHS 60을 DMF (20 μl)에 용해시켰다.
반응식 16
ET 염료-표지된 올리고뉴클레오티드의 제조
L2 ET ROX-표지된 올리고뉴클레오티드의 대표적인 제제를 하기에 기재한다(반응식 17). 탄산염/중탄산염 완충제 (2 μl, 1 M) 및 ET ROX -NHS 60 (10 μl, 디메틸설폭사이드 중의 12 mM) 중의 5-아미노헥실-작용화 올리고뉴클레오티드(10 μl, 1 mM)의 용액을 합하였다. 실온에서 10분 후, 용액을 Sephadex G-25 상에서 겔 여과하여 유리 염료를 분리하였다. 염료-표지된 올리고뉴클레오티드 및 표지되지 않은 올리고뉴클레오티드를 함유하는 분획을 수집하고 역상 컬럼에서 HPLC 정제를 수행하였다. 표지되지 않은 올리고뉴클레오티드와 염료 표지된 올리고뉴클레오티드의 각각의 염료 이성질체를 0.1 M TEAA에 대해 10 - 30% 아세토니트릴의 용리 구배를 사용하여 분리하였다. 염료-표지된 올리고뉴클레오티드를 함유하는 용액을 진공 원심분리기에서 농축시키고, TE 완충제에 재용해시켰다.
반응식 17
상기 실시형태가 예시 및 예를 통해 상세히 설명되었지만, 하기 조항 및 청구범위에 설명된 바와 같이 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 수많은 변형, 대체 및 변경이 가능하다는 것을 이해해야 한다.
1. 형광 에너지 전달 염료 접합체로서,
i. 제1 파장에서 광을 흡수하고, 이에 반응하여 여기 에너지를 방출할 수 있는 도너 염료;
ii. 도너 염료에 의해서 방출된 여기 에너지를 흡수하고, 이에 반응하여 제2 파장에서 광을 방출할 수 있는 억셉터 염료; 및
iii. 도너 염료를 억셉터 염료에 공유 부착하는 링커를 포함하되, 링커는 알킬 부분, 아미노-알킬 부분, 옥시-알킬렌 부분, 아미노-알킬렌-디알콕시 부분, 알케닐렌 부분, 알키닐렌 부분, 폴리에테르 부분, 아릴렌 부분, 아미드 부분, 또는 포스포디에스테르 부분 중 하나 이상을 포함하는, 형광 에너지 전달 염료 접합체.
2. 조항 1에 있어서, 제2 파장은 제1 파장보다 더 긴, 에너지 전달 염료 접합체.
3. 조항 1 또는 2에 있어서, 도너 염료는 잔텐 염료, 시아닌 염료, BODIPY 염료, 피렌 염료, 피로닌 염료, 및 쿠마린 염료로 이루어진 군으로부터 선택되는, 에너지 전달 염료 접합체.
4. 조항 1 내지 조항 3 중 어느 하나에 있어서, 도너 염료는 플루오레세인 염료 또는 로다민 염료인, 에너지 전달 염료 접합체.
5. 조항 1 내지 조항 4 중 어느 하나에 있어서, 억셉터 염료는 플루오레세인 염료, 시아닌 염료, 로다민 염료, BODIPY 염료, 피렌 염료, 피로닌 염료, 및 쿠마린 염료로 이루어진 군으로부터 선택되는, 에너지 전달 염료 접합체.
6. 조항 1 내지 조항 5 중 어느 하나에 있어서, 접합체는 분석물에 연결되어 있고, 하기 중 하나로부터 선택된 기본 구조를 갖는, 에너지 전달 염료 접합체:
상기 식에서, L1은 제1 링커이고, L1은 공유 결합을 통해 또는 하나 이상의 개재 원자를 포함하는 스페이서를 통해 D1, D2 및 A에 부착되어 있고;
L2는 제2 링커이고, L2는 공유 결합을 통해 또는 하나 이상의 개재 원자를 포함하는 스페이서를 통해 D2 및 D3 각각에 부착되어 있고;
L3은 제3 링커이고, L3은 공유 결합을 통해 또는 하나 이상의 개재 원자를 포함하는 스페이서를 통해 각각의 PO4H 및 D1에 부착되어 있고;
L4는 제4 링커이고, L4는 공유 결합을 통해 또는 하나 이상의 개재 원자를 포함하는 스페이서를 통해 PO4H 및 D2에 부착되어 있고;
A는 분석물이고;
D1, D2, 및 D3 각각은 상호 교환 가능하게 도너 염료 또는 억셉터 염료이고;
LI 및 LIII에서 D1과 D2의 조합 및 LII에서 D2와 D3의 조합은 에너지 전달 염료 쌍을 형성함.
7. 조항 6에 있어서, L1 링커는 하기 화학식의 아릴렌 부분을 포함하는, 에너지 전달 염료 접합체:
상기 식에서,
각각의 R1은 독립적으로 -C1-C10 알킬-N(R3)-*, -C2-C10 알케닐- N(R3)-*, -C2-C10 알키닐-N(R3)-*, -OC1-C10 알킬-*, -C1-C10 알킬-O-*, -N(R3)C1-C6 알킬*-, -N(R3)C1-C6 알킬-O-*, -OC1-C6 알킬-N(R3)-*; 또는 -N(R3)-*이고;
각각의 R2는 독립적으로 -C(O)N(R4), -C1-C10 알킬-C(O)N(R4), -C2-C10 알케닐- C(O)N(R4), -C2-C10 알키닐-R4, -C(O)N(R4), - N(R3)-C(O)N(R4), C1-C6 알킬-O-C(O)N(R4), -OC1-C6 알킬-C(O)N(R4), -N(R4), 할로겐, -CO2 -Z+, -SO3R4, 또는 -SO3 -Z+이고;
각각의 R3은 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이고;
각각의 R4는 독립적으로 H, C1-C6 알킬 또는 A에 대한 부착점이고, A에 대한 부착은 공유 결합 또는 하나 이상의 개재 원자를 포함하는 스페이서를 통해서 이루어지고;
각각의 *는 D1 또는 D2에 대한 부착점을 나타내고, D1 또는 D2에 대한 부착은 공유 결합 또는 하나 이상의 개재 원자를 포함하는 스페이서를 통해서 이루어지고;
Z+는 양이온(들)(예를 들어, Na+, K+, 또는 NH4+)이고;
n은 2, 3 또는 4이고;
m은 0, 1, 2, 3, 또는 4이되, 단 n + m = 3 내지 6임.
8. 조항 6에 있어서, L1 링커는 아릴렌 부분, 및 비스-알킬아미노 부분 또는 비스-카르복시아미딜 부분 중 하나 이상을 포함하고, L1 링커는 A에 대한 부착점을 추가로 포함하고, A에 대한 부착은 공유 결합 또는 하나 이상의 개재 원자를 포함하는 스페이서를 통해서 이루어지는, 에너지 전달 형광 염료 접합체.
9. 조항 6에 있어서, L2 링커는 하기 화학식의 아릴렌 부분을 포함하는, 에너지 전달 염료 접합체:
상기 식에서,
각각의 R1은 독립적으로 -C1-C10 알킬-N(R3)-*, -C2-C10 알케닐- N(R3)-*, -C2-C10 알키닐-N(R3)-*, -OC1-C10 알킬-*, -C1-C10 알킬-O-*, -N(R3)C1-C6 알킬*-, -N(R3)C1-C6 알킬-O-*, -OC1-C6 알킬-N(R3)-*; 또는 -N(R3)-*이고;
각각의 R2는 독립적으로 -C(O)N(R3)-*, -C1-C10 알킬-C(O)N(R3)-*, -C2-C10 알케닐- C(O)N(R3)-*, -C2-C10 알키닐-(R3)-*, -C(O)N(R3)-*, -N(R3)-C(O)N(R3)-*, C1-C6 알킬-O-C(O)N(R3)-*, -OC1-C6 알킬-C(O)N(R3)-*, -N(R3)-*, 할로겐, -CO2 -Z+ 또는 -SO3-Z+이고;
각각의 R3은 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이고;
각각의 *는 D2 또는 D3에 대한 부착점을 나타내고, D2 또는 D3에 대한 부착은 공유 결합 또는 하나 이상의 개재 원자를 포함하는 스페이서를 통해서 이루어지고;
Z+는 양이온(들)(예를 들어, Na+, K+, 또는 NH4 +)이고;
n은 2, 3 또는 4이고;
m은 0, 1, 2, 3, 또는 4이되, 단 n + m = 2 내지 6임.
10. 상기 조항 중 어느 하나에 있어서, 링커는 하기 화학식의 단편을 포함하는, 에너지 전달 염료 접합체:
상기 식에서, 각각의 R2, m 및 *는 상기에 정의된 바와 같음.
11. 조항 6에 있어서, L3 링커는 하기 화학식의 단편을 포함하는, 에너지 전달 염료 접합체:
상기 식에서
R5는 H 또는 C1-C6 알킬이고;
n은 2, 3 또는 4이고;
X는 O 또는 CH2이고;
L4는 D2에 대한 부착이고, L4는 공유 결합 또는 하나 이상의 개재 원자를 포함하는 스페이서이고;
R7은 PO3H-A에 대한 부착점이고, PO3H-A에 대한 부착은 공유 결합 또는 하나 이상의 개재 원자를 포함하는 스페이서를 통해서 이루어지고;
*는 D1에 대한 부착점을 나타내고, D1에 대한 부착은 공유 결합 또는 하나 이상의 개재 원자를 포함하는 스페이서를 통해서 이루어짐.
12. 조항 11에 있어서, L4 링커는 하기 화학식의 포스포디에스테르 부분을 포함하는, 에너지 전달 염료 접합체:
상기 식에서
Y는 알콕시 부분, 알킬 부분, 아릴렌 부분, 또는 올리고뉴클레오티드 부분 중 하나 이상을 포함하고;
p는 0 내지 10의 정수이고;
D2 또는 A는 산소 원자를 포함하고, 각각의 *는 D2 또는 A에서 산소 원자에 대한 포스포디에스테르 부분의 부착점을 나타내고, D2 또는 A에서 산소 원자에 대한 포스포디에스테르의 부착은 공유 결합 또는 하나 이상의 개재 원자를 포함하는 스페이서를 통해서 이루어짐.
13. 조항 12에 있어서, Y는 C1-C10 알킬 또는 폴리(알킬렌 글리콜)인, 에너지 전달 염료 접합체.
14. 조항 6 내지 13 중 어느 하나에 있어서, L3과 L4 링커의 조합은 하기 화학식을 포함하는, 에너지 전달 염료 접합체:
상기 식에서
R7은 A에 부착된 포스포디에스테르 기를 포함하고, 포스포디에스테르 기는 포스포디에스테르 부분, 알콕시 부분, 아미노-알킬 부분, 알콕시 부분, 알킬 부분, 폴리에테르 부분, 또는 아릴렌 부분 중 하나 이상에 부착되고,
PAG는 폴리(알킬렌 글리콜)이고, 폴리(알킬렌 글리콜)은 C2-C6 선형 또는 분지형 알킬렌 쇄이거나 이를 포함하고;
n은 2 내지 6이고;
p는 1 내지 4임.
15. 조항 14에 있어서, PAG는 펜타에틸렌 글리콜인, 에너지 전달 염료 접합체.
16. 조항 6 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 분석물은 핵산 분자, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 및 탄수화물로부터 선택된 생물학적 분자인, 에너지 전달 염료 접합체.
17. 상기 조항 중 어느 하나에 있어서, 에너지 전달 염료 접합체는 (예를 들어, 공유 결합을 통해서 또는 하나 이상의 개재 원자를 포함하는 스페이서를 통해서) 올리고뉴클레오티드에 공유 부착된, 에너지 전달 염료 접합체.
18. 하기를 포함하는 올리고뉴클레오티드 프로브:
i. 올리고뉴클레오티드; 및
ii. (예를 들어, 공유 결합을 통해서 또는 하나 이상의 개재 원자를 포함하는 스페이서를 통해서) 올리고뉴클레오티드에 공유 부착된 조항 1 내지 17 중 어느 하나에 따른 에너지 전달 염료 접합체.
19. 조항 17에 있어서, (예를 들어, 공유 결합을 통해서 또는 하나 이상의 개재 원자를 포함하는 스페이서를 통해서) 올리고뉴클레오티드에 공유 부착된 소광제 염료를 추가로 포함하는, 올리고뉴클레오티드 프로브.
20. 조항 18 또는 19에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 변형을 포함하는, 프로브.
21. 조항 20에 있어서, 변형은 마이너 그루브 결합제(MGB)를 포함하는, 프로브.
22. 조항 21에 있어서, 변형은 잠금 핵산(LNA)을 포함하는, 프로브.
23. 조항 18에 있어서, 형광 에너지 전달 염료 접합체는 올리고뉴클레오티드의 3'-단부에, 내부에 또는 5-단부에 공유 부착된, 프로브.
24. 조항 19에 있어서, 형광 에너지 전달 염료 접합체는 올리고뉴클레오티드의 5'-단부에 공유 부착된, 프로브.
25. 조항 19에 있어서, 소광제 염료는 올리고뉴클레오티드의 3'-단부에 공유 부착된, 프로브.
26. 조항 19에 있어서, 형광 에너지 전달 염료 접합체 및 소광제 염료는 올리고뉴클레오티드의 반대 단부에 공유 부착된, 프로브.
27. 조항 19에 있어서, 형광 에너지 전달 염료 접합체는 올리고뉴클레오티드의 5'-단부에 공유 부착되고, 소광제 염료는 올리고뉴클레오티드 프로브의 3'-단부에 공유 부착된, 프로브.
28. 상기 조항 중 어느 하나에 있어서, 가수분해 프로브인, 프로브.
29. 상기 조항 중 어느 하나에 있어서, 60 내지 75C 범위 내의 Tm을 갖는, 프로브.
30. 상기 조항 중 어느 하나에 있어서, 5 내지 40개 뉴클레오티드 길이인, 프로브.
31. 상기 조항 중 어느 하나에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산 분자에 상보적인 부분을 포함하는, 프로브.
32. 조항 31에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산 분자에 적어도 60% 상보적인, 프로브.
33. 조항 31에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산 분자에 적어도 90% 상보적인, 프로브.
34. 조항 18에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 줄기 루프 구조를 형성하는, 프로브.
35. 조항 18에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 표적-특이적 부분 및 꼬리 부분을 포함하는, 프로브.
36. 조항 35에 있어서, 꼬리 부분은 보편적인 꼬리 부분인, 프로브.
37. 시스템으로서,
평균 여기 파장을 특징으로 하는 방사원;
방사원으로부터 방사선을 수신하도록 배치된 샘플로서:
제1 염료;
제2 염료를 포함하는, 샘플; 및
샘플로부터의 방출을 측정하도록 구성된 검출기;
제1 평균 방출 파장을 특징으로 하는 제1 방출 스펙트럼 요소;
제1 평균 방출 파장과 상이한 제2 평균 방출 파장을 특징으로 하는 제2 방출 스펙트럼 요소;
적어도 하나의 프로세서로서,
방사원으로 샘플을 조명하고, 이에 대한 응답으로, (1) 검출기 및 제1 방출 스펙트럼 요소를 사용하여 샘플로부터의 방출을 측정하고, (2) 검출기 및 제2 방출 스펙트럼 요소를 사용하여 샘플로부터의 방출을 측정하도록 하는 명령어를 포함하는 적어도 하나의 메모리를 포함하는 상기 적어도 하나의 프로세서를 포함하는, 시스템.
38. 조항 37에 있어서, 제1 염료는 제1 형광단이거나 이를 포함하고, 제2 염료는 조항 1 내지 17 중 어느 하나의 형광 에너지 전달 염료 접합체이거나 이를 포함하는, 시스템.
39. 조항 37 또는 38에 있어서, 제1 형광단은 잔텐 염료, 시아닌 염료, BODIPY 염료, 피렌 염료, 피로닌 염료, 및 쿠마린 염료로 이루어진 군으로부터 선택된 염료를 포함하는, 시스템.
40. 조항 37 내지 39 중 어느 하나에 있어서, 제2 염료는 플루오레세인 염료, 로다민 염료, 피로닌 염료, 및 시아닌 염료로 이루어진 군으로부터 선택된 형광단을 포함하는, 시스템.
41. 조항 37 내지 40 중 어느 하나에 있어서, 제1 염료는 제1 프로브에 공유 부착되고, 제2 염료는 제2 프로브에 공유 부착되고, 제1 프로브 및 제2 프로브는 각각 제1 표적 분자 및 제2 표적 분자에 결합하도록 구성된, 시스템.
42. 조항 41에 있어서, 제1 및 제2 프로브는 올리고뉴클레오티드 프로브이고, 제2 프로브는 조항 18 내지 36 중 어느 하나에 따르는, 시스템.
43. 조항 41 또는 42에 있어서, 제1 표적 분자 및 제2 표적 분자는 핵산 분자인, 시스템.
44. 조항 37 내지 43 중 어느 하나에 있어서, 제1 염료는 제1 최대 흡수 파장을 포함하는 제1 흡수 스펙트럼을 포함하고, 제2 염료는 제1 최대 흡수 파장과 동일하거나 실질적으로 동일한 제2 최대 흡수 파장을 포함하는 제2 흡수 스펙트럼을 포함하는, 시스템.
45. 조항 44에 있어서, 제1 최대 흡수 파장 또는 제2 최대 흡수 파장 중 하나 이상은 각각의 흡수 스펙트럼 전체에 걸친 절대 최대값인, 시스템.
46. 조항 37 내지 45 중 어느 하나에 있어서, 제1 염료는 축상 염료이고, 제2 염료는 축외 염료인, 시스템.
47. 조항 37 또는 44 내지 46 중 어느 하나에 있어서,
제1 염료는 5-FAM, 6-FAM, Oregon Green 또는 TET, R110 중 하나 이상을 포함하고;
제2 염료는 FAM-TAMRA, FAM-ABY, 또는 FAM-NED 중 하나 이상을 포함하는, 시스템.
48. 조항 37 또는 44 내지 47 중 어느 하나에 있어서,
제1 방사원의 평균 여기 파장은 480 ±5 나노미터이고/이거나 제1 방사원은 평균 여기 파장에 대해 ±12 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고;
제1 방출 스펙트럼 요소의 제1 평균 방출 파장은 520 ±5 나노미터이고/이거나 제1 방출 스펙트럼 요소는 제1 평균 방출 파장에 대해 ±20 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고;
제2 방출 스펙트럼 요소의 제2 평균 방출 파장은 587 ±5 나노미터이고/이거나 제2 방출 스펙트럼 요소는 제2 평균 방출 파장에 대해 ±12 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하는, 시스템.
49. 조항 37 또는 44 내지 46 중 어느 하나에 있어서,
제1 염료는 5-FAM, 6-FAM, Oregon Green, TET, 또는 R110 중 하나 이상을 포함하고;
제2 염료는 FAM-PET, FAM-ROX, FAM-JUN, FAM-Texas Red, 또는 TET-Alexa Fluor 594 중 하나 이상을 포함하는, 시스템.
50. 조항49에 있어서,
제1 방사원의 평균 여기 파장은 480 ±5 나노미터이고/이거나 제1 방사원은 평균 여기 파장에 대해 ±12 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고;
제1 방출 스펙트럼 요소의 제1 평균 방출 파장은 520 ±5 나노미터이고/이거나 제1 방출 스펙트럼 요소는 제1 평균 방출 파장에 대해 ±18 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고;
제2 방출 스펙트럼 요소의 제2 평균 방출 파장은 623 ±5 나노미터이고/이거나 제2 방출 스펙트럼 요소는 제2 평균 방출 파장에 대해 ±18 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하는, 시스템.
51. 조항 37 또는 44 내지 46 중 어느 하나에 있어서,
제1 염료는 NED, TAMRA, ABY, 또는 DY-555 중 하나 이상을 포함하고;
제2 염료는 ABY-Alexa Fluor 647, NED-Alexa Fluor 647, ABY-Cy5®, ABY-ATTO 647TM, 또는 ABY-DyLight 650 TM 중 하나 이상을 포함하는, 시스템.
52. 조항 51에 있어서,
제1 방사원의 평균 여기 파장은 550 ±5 나노미터이고/이거나 제1 방사원은 평균 여기 파장에 대해 ±14 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고;
제1 방출 스펙트럼 요소의 제1 평균 방출 파장은 587 ±5 나노미터이고/이거나 제1 방출 스펙트럼 요소는 제1 평균 방출 파장에 대해 ±12 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고;
제2 방출 스펙트럼 요소의 제2 평균 방출 파장은 682 ±5 나노미터이고/이거나 제2 방출 스펙트럼 요소는 제2 평균 방출 파장에 대해 ±16 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하는, 시스템.
53. 조항 37 또는 44 내지 46 중 어느 하나에 있어서,
제1 염료는 NED, TAMRA, ABY, 또는 DY-555 중 하나 이상을 포함하고;
제2 염료는 NED-Alexa Fluor 676, NED DyLight 680 TM, NED-Cy5.5®, ABY-Alexa Fluor 676, ABY-DyLight 680 TM, 또는 ABY-Cy5.5® 중 하나 이상을 포함하는, 시스템.
54. 조항53에 있어서,
제1 방사원의 평균 여기 파장은 550 ±5 나노미터이고/이거나 제1 방사원은 평균 여기 파장에 대해 ±14 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고;
제1 방출 스펙트럼 요소의 제1 평균 방출 파장은 587 ±5 나노미터이고/이거나 제1 방출 스펙트럼 요소는 제1 평균 방출 파장에 대해 ±12 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고;
제2 방출 스펙트럼 요소의 제2 평균 방출 파장은 711 ±5 나노미터이고/이거나 제2 방출 스펙트럼 요소는 제2 평균 방출 파장에 대해 ±16 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하는, 시스템.
55. 시스템으로서,
제1 평균 여기 파장을 특징으로 하는 제1 방사원;
제1 평균 여기 파장과 상이한 제2 평균 여기 파장을 특징으로 하는 제2 방사원;
방사원으로부터 방사선을 수신하도록 배치된 샘플로서:
제1 염료;
제2 염료를 포함하는, 샘플; 및
샘플로부터의 방출을 측정하도록 구성된 검출기;
평균 방출 파장을 특징으로 하는 방출 스펙트럼 요소;
적어도 하나의 프로세서로서,
샘플을 제1 방사원으로 조명하고, 이에 대한 응답으로, 검출기 및 방출 스펙트럼 요소를 사용하여 샘플로부터의 방출을 측정하고;
샘플을 제2 방사원으로 조명하고, 이에 대한 응답으로, 검출기 및 방출 스펙트럼 요소를 사용하여 샘플로부터의 방출을 측정하도록 하는 명령어를 포함하는 적어도 하나의 메모리를 포함하는 상기 적어도 하나의 프로세서를 포함하는, 시스템.
56. 조항 55에 있어서, 제1 염료는 제1 형광단이거나 이를 포함하고, 제2 염료는 조항 1 내지 17 중 어느 하나의 형광 에너지 전달 염료 접합체이거나 이를 포함하는, 시스템.
57. 조항 55 또는 56에 있어서, 제1 형광단은 잔텐 염료, 시아닌 염료, BODIPY 염료, 피렌 염료, 피로닌 염료, 및 쿠마린 염료로 이루어진 군으로부터 선택된 염료인, 시스템.
58. 조항 55 내지 57 중 어느 하나에 있어서, 제2 염료는 플루오레세인 염료, 로다민 염료, 피로닌 염료, 및 시아닌 염료로 이루어진 군으로부터 선택된 형광단을 포함하는, 시스템.
59. 조항 55 내지 58 중 어느 하나에 있어서, 제1 염료는 제1 프로브에 공유 부착되고, 제2 염료는 제2 프로브에 공유 부착되고, 제1 프로브 및 제2 프로브는 각각 제1 표적 분자 및 제2 표적 분자에 결합하도록 구성된, 시스템.
60. 조항 59에 있어서, 제1 및 제2 프로브는 올리고뉴클레오티드 프로브이고, 제2 프로브는 조항 18 내지 36 중 어느 하나에 따르는, 시스템.
61. 조항 59 또는 60에 있어서, 제1 표적 분자 및 제2 표적 분자는 핵산 분자인, 시스템.
62. 조항 55 내지 61 중 어느 하나에 있어서, 제1 염료는 제1 최대 방출 파장을 포함하는 제1 방출 스펙트럼을 포함하고, 제2 염료는 제1 최대 방출 파장과 동일하거나 실질적으로 동일한 제2 최대 방출 파장을 포함하는 제2 방출 스펙트럼을 포함하는, 시스템.
63. 조항 62에 있어서, 제1 최대 방출 파장 또는 제2 최대 방출 파장 중 하나 이상은 각각의 흡수 스펙트럼 전체에 걸친 절대 최대값인, 시스템.
64. 조항 55 내지 63 중 어느 하나에 있어서, 제2 염료는 축외 염료인, 시스템.
65. 조항 55 또는 62 내지 64 중 어느 하나에 있어서,
제1 염료는 NED, TAMRA, ABY, 또는 DY-555 중 하나 이상을 포함하고;
제2 염료는 FAM-TAMRA, FAM-ABY, 또는 FAM-NED 중 하나 이상을 포함하는, 시스템.
66. 조항 55 또는 62 내지 64 중 어느 하나에 있어서,
제1 방사원의 제1 평균 여기 파장은 480 ±5 나노미터이고/이거나 제1 방사원은 제1 평균 여기 파장에 대해 ±12 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고;
제2 방사원의 제2 평균 여기 파장은 550 ±5 나노미터이고/이거나 제2 방사원은 제2 평균 여기 파장에 대해 ±12 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고;
제1 방출 스펙트럼 요소의 제1 평균 방출 파장은 587 ±5 나노미터이고/이거나 제2 방출 스펙트럼 요소는 평균 방출 파장에 대해 ±12 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하는, 시스템.
67. 조항 55 또는 62 내지 64 중 어느 하나에 있어서,
제1 염료는 FAM-PET, FAM-ROX, FAM-JUN, FAM-Texas Red, 또는 TET-Alexa Fluor 594 중 하나 이상을 포함하고;
제2 염료는 PET, ROX, JUN, Texas Red, 또는 Alexa Fluor 594 중 하나 이상을 포함하는, 시스템.
68. 조항67에 있어서,
제1 방사원의 제1 평균 여기 파장은 480 ±5 나노미터이고/이거나 제1 방사원은 제1 평균 여기 파장에 대해 ±12 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고;
제2 방사원의 제2 평균 여기 파장은 580 ±5 나노미터이고/이거나 제2 방사원은 제2 평균 여기 파장에 대해 ±12 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고;
제1 방출 스펙트럼 요소의 평균 방출 파장은 623 ±5 나노미터이고/이거나 제2 방출 스펙트럼 요소는 평균 방출 파장에 대해 ±18 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하는, 시스템.
69. 조항 55 또는 62 내지 64 중 어느 하나에 있어서,
제1 염료는 ABY-Alexa Fluor 647, NED-Alexa Fluor 647, ABY-Cy5®, ABY-ATTO 647TM, 또는 ABY-DyLight 650TM 중 하나 이상을 포함하고;
제2 염료는 Alexa Fluor 647, Cy5®, ATTO 647TM, 또는 DyLight 650TM 중 하나 이상을 포함하는, 시스템.
70. 조항 69에 있어서,
제1 방사원의 제1 평균 여기 파장은 550 ±5 나노미터이고/이거나 제1 방사원은 제1 평균 여기 파장에 대해 ±14 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고;
제2 방사원의 제2 평균 여기 파장은 640 ±5 나노미터이고/이거나 제2 방사원은 제2 평균 여기 파장에 대해 ±12 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고;
제1 방출 스펙트럼 요소의 평균 방출 파장은 682 ±5 나노미터이고/이거나 제2 방출 스펙트럼 요소는 평균 방출 파장에 대해 ±16 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하는, 시스템.
71. 조항 55 또는 62 내지 64 중 어느 하나에 있어서,
제1 염료는 NED-Alexa Fluor 676, NED DyLight 680TM, NED-Cy5.5®, ABY-Alexa Fluor 676, ABY-DyLight 680TM, 또는 ABY-Cy5.5® 중 하나 이상을 포함하고;
제2 염료는 Alexa Fluor 676, DyLight 680TM, 또는 Cy5.5® 중 하나 이상을 포함하는, 시스템.
72. 조항 71에 있어서,
제1 방사원의 제1 평균 여기 파장은 550 ±5 나노미터이고/이거나 제1 방사원은 제1 평균 여기 파장에 대해 ±14 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고;
제2 방사원의 제2 평균 여기 파장은 662 ±5 나노미터이고/이거나 제2 방사원은 제2 평균 여기 파장에 대해 ±12 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고;
제1 방출 스펙트럼 요소의 평균 방출 파장은 711 ±5 나노미터이고/이거나 제2 방출 스펙트럼 요소는 평균 방출 파장에 대해 ±16 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하는, 시스템.
73. 시스템으로서,
제1 평균 여기 파장을 특징으로 하는 제1 방사원;
제1 평균 여기 파장과 상이한 제2 평균 여기 파장을 특징으로 하는 제2 방사원;
방사원으로부터 방사선을 수신하도록 배치된 샘플로서:
제1 염료;
제2 염료; 및
제3 염료를 포함하는, 샘플;
샘플로부터의 방출을 측정하도록 구성된 검출기;
제1 평균 방출 파장을 특징으로 하는 제1 방출 스펙트럼 요소;
제1 평균 방출 파장과 상이한 제2 평균 방출 파장을 특징으로 하는 제2 방출 스펙트럼 요소;
적어도 하나의 프로세서로서,
제1 방사원으로 샘플을 조명하고, 이에 대한 응답으로, (1) 검출기 및 제1 방출 스펙트럼 요소를 사용하여 샘플로부터의 방출을 측정하고, (2) 검출기 및 제2 방출 스펙트럼 요소를 사용하여 샘플로부터의 방출을 측정하고;
샘플을 제2 방사원으로 조명하고, 이에 대한 응답으로, 검출기 및 제2 방출 스펙트럼 요소를 사용하여 샘플로부터의 방출을 측정하도록 하는 명령어를 포함하는 적어도 하나의 메모리를 포함하는 상기 적어도 하나의 프로세서를 포함하는, 시스템.
74. 조항 73에 있어서, 제1 염료 및/또는 제3 염료는 제1 형광단이거나 이를 포함하고, 제2 염료는 조항 1 내지 17 중 어느 하나의 형광 에너지 전달 염료 접합체이거나 이를 포함하는, 시스템.
75. 조항 73 또는 74에 있어서, 제1 형광단 및/또는 제3 형광단은 잔텐 염료, 시아닌 염료, BODIPY 염료, 피렌 염료, 피로닌 염료, 및 쿠마린 염료로 이루어진 군으로부터 선택된 염료인, 시스템.
76. 조항 73 내지 75 중 어느 하나에 있어서, 제2 염료는 플루오레세인 염료, 로다민 염료, 피로닌 염료, 및 시아닌 염료로 이루어진 군으로부터 선택된 형광단을 포함하는, 시스템.
77. 조항 73 내지 75 중 어느 하나에 있어서, 제1 염료는 제1 프로브에 공유 부착되고, 제2 염료는 접합체 제2 프로브에 공유 부착되고, 제3 염료는 제3 프로브에 공유 부착되며, 제1 프로브, 제2 프로브 및 제3 프로브는 각각 제1 표적 분자, 제2 표적 분자 및 제3 표적 분자에 결합하도록 구성된, 시스템.
78. 조항 77에 있어서, 제1 프로브, 제2 프로브 및 제3 프로브는 올리고뉴클레오티드 프로브이고, 제2 프로브는 조항 18 내지 36 중 어느 하나에 따르는, 시스템.
79. 조항 77 또는 78에 있어서, 제1 표적 분자, 제2 표적 분자 및 제3 표적 분자는 핵산 분자인, 시스템.
80. 조항 73 내지 79 중 어느 하나에 있어서, (1) 제1 염료는 제1 최대 흡수 파장을 포함하는 제1 흡수 스펙트럼을 포함하고, 제2 염료는 제1 최대 흡수 파장과 동일하거나 실질적으로 동일한 제2 최대 흡수 파장을 포함하는 제2 흡수 스펙트럼을 포함하고, (2) 제2 염료는 제2 최대 방출 파장을 포함하는 제2 방출 스펙트럼을 포함하고, 제3 염료는 제2 최대 방출 파장과 동일하거나 실질적으로 동일한 제3 최대 방출 파장을 포함하는 제3 방출 스펙트럼을 포함하는, 시스템.
81. 조항 80에 있어서, 제1 최대 흡수 파장, 제2 최대 흡수 파장, 제2 최대 방출 파장, 또는 제3 최대 방출 파장 중 하나 이상은 각각의 흡수 스펙트럼 전체에 걸친 절대 최대값인, 시스템.
82. 조항 73 내지 81 중 어느 하나에 있어서, 제2 염료는 축외 염료인, 시스템.
83. 조항 73 또는 80 내지 82 중 어느 하나에 있어서,
제1 염료는 5-FAM, 6-FAM, Oregon Green 또는 TET, R110 중 하나 이상을 포함하고;
제2 염료는 FAM-TAMRA, FAM-ABY, 또는 FAM-NED 중 하나 이상을 포함하고;
제3 염료는 NED, TAMRA, ABY, DY-555 중 하나 이상을 포함하는, 시스템.
84. 조항 73 또는 80 내지 83 중 어느 하나에 있어서,
제1 방사원의 제1 평균 여기 파장은 480 ±5 나노미터이고/이거나 제1 방사원은 제1 평균 여기 파장에 대해 ±12 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고;
제2 방사원의 제2 평균 여기 파장은 550 ±5 나노미터이고/이거나 제2 방사원은 제2 평균 여기 파장에 대해 ±12 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고;
제1 방출 스펙트럼 요소의 제1 평균 방출 파장은 520 ±5 나노미터이고/이거나 제1 방출 스펙트럼 요소는 제1 평균 방출 파장에 대해 ±20 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고;
제2 방출 스펙트럼 요소의 제2 평균 방출 파장은 587 ±5 나노미터이고/이거나 제2 방출 스펙트럼 요소는 제2 평균 방출 파장에 대해 ±12 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하는, 시스템.
85. 조항 73 또는 80 내지 82 중 어느 하나에 있어서,
제1 염료는 5-FAM, 6-FAM, Oregon Green, TET, 또는 R110 중 하나 이상을 포함하고;
제2 염료는 FAM-PET, FAM-ROX, FAM-JUN, FAM-Texas Red, 또는 TET-Alexa Fluor 594 중 하나 이상을 포함하고;
제3 염료는 PET, ROX, JUN, Texas Red, 또는 Alexa Fluor 594 중 하나 이상을 포함하는, 시스템.
86. 조항 85에 있어서,
제1 방사원의 제1 평균 여기 파장은 480 ±5 나노미터이고/이거나 제1 방사원은 제1 평균 여기 파장에 대해 ±12 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고;
제2 방사원의 제2 평균 여기 파장은 580 ±5 나노미터이고/이거나 제2 방사원은 제2 평균 여기 파장에 대해 ±12 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고;
제1 방출 스펙트럼 요소의 제1 평균 방출 파장은 520 ±5 나노미터이고/이거나 제1 방출 스펙트럼 요소는 제1 평균 방출 파장에 대해 ±18 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고;
제2 방출 스펙트럼 요소의 제2 평균 방출 파장은 623 ±5 나노미터이고/이거나 제2 방출 스펙트럼 요소는 제2 평균 방출 파장에 대해 ±18 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하는, 시스템.
87. 조항 73 또는 80 내지 82 중 어느 하나에 있어서,
제1 염료는 NED, TAMRA, ABY, 또는 DY-555 중 하나 이상을 포함하고;
제2 염료는 ABY-Alexa Fluor 647, NED-Alexa Fluor 647, ABY-Cy5®, ABY-ATTO 647TM, 또는 ABY-DyLight 650TM 중 하나 이상을 포함하고;
제3 염료는 Alexa Fluor 647, Cy5®, ATTO 647TM, 또는 DyLight 650TM 중 하나 이상을 포함하는, 시스템.
88. 조항 87에 있어서,
제1 방사원의 제1 평균 여기 파장은 550 ±5 나노미터이고/이거나 제1 방사원은 제1 평균 여기 파장에 대해 ±14 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고;
제2 방사원의 제2 평균 여기 파장은 640 ±5 나노미터이고/이거나 제2 방사원은 제2 평균 여기 파장에 대해 ±12 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고;
제1 방출 스펙트럼 요소의 제1 평균 방출 파장은 587 ±5 나노미터이고/이거나 제1 방출 스펙트럼 요소는 제1 평균 방출 파장에 대해 ±12 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고;
제2 방출 스펙트럼 요소의 제2 평균 방출 파장은 682 ±5 나노미터이고/이거나 제2 방출 스펙트럼 요소는 제2 평균 방출 파장에 대해 ±16 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하는, 시스템.
89. 조항 73 또는 80 내지 82 중 어느 하나에 있어서,
제1 염료는 NED, TAMRA, ABY, 또는 DY-555 중 하나 이상을 포함하고;
제2 염료는 NED-Alexa Fluor 676, NED DyLight 680TM, NED-Cy5.5®, ABY-Alexa Fluor 676, ABY-DyLight 680TM, 또는 ABY-Cy5.5® 중 하나 이상을 포함하고;
제3 염료는 Alexa Fluor 676, DyLight 680TM, 또는 Cy5.5® 중 하나 이상을 포함하는, 시스템.
90. 조항 89에 있어서,
제1 방사원의 제1 평균 여기 파장은 550 ±5 나노미터이고/이거나 제1 방사원은 제1 평균 여기 파장에 대해 ±14 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고;
제2 방사원의 제2 평균 여기 파장은 662 ±5 나노미터이고/이거나 제2 방사원은 제2 평균 여기 파장에 대해 ±12 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고;
제1 방출 스펙트럼 요소의 제1 평균 방출 파장은 587 ±5 나노미터이고/이거나 제1 방출 스펙트럼 요소는 제1 평균 방출 파장에 대해 ±12 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고;
제2 방출 스펙트럼 요소의 제2 평균 방출 파장은 711 ±5 나노미터이고/이거나 제2 방출 스펙트럼 요소는 제2 평균 방출 파장에 대해 ±16 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하는, 시스템.
91. 조항 73 내지 90 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 메모리는 핵산 합성 검정을 수행하도록 하는 하나 이상의 명령어를 더 포함하고, 조명 및 측정하도록 하는 명령어가 핵산 합성 검정 동안 및/또는 핵산 합성 검정 후에 실행되는, 시스템.
92. 조항 91에 있어서, 핵산 합성 검정은 복수의 온도 주기를 통해 용액을 순환시키는 것을 포함하는 중합효소 연쇄 반응(PCR) 검정을 포함하고, 염료의 방출의 측정은 온도 주기 중 하나 이상 이후에 수행되는, 시스템.
93. 조항 91에 있어서, 핵산 합성 검정은 복수의 온도 주기를 통해 용액을 순환시키는 것을 포함하는 중합효소 연쇄 반응(PCR) 검정을 포함하고, 염료의 방출의 측정은 마지막 온도 주기 이후에 수행되는, 시스템.
94. 조항 73 내지 93 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 메모리는,
증폭 동안 제1 표적 분자로부터 제1 앰플리콘을 생산하고;
증폭 동안 제2 표적 분자로부터 제2 앰플리콘을 생산하고; 및/또는
증폭 동안 제3 표적 분자로부터 제3 앰플리콘을 생산하도록 하는 명령어를 포함하는, 시스템.
95. 조항 94에 있어서, 제1 앰플리콘, 제2 앰플리콘 및/또는 제3 앰플리콘이 동시에 생산되는, 시스템.
96. 조항 73 내지 82 중 어느 하나에 있어서,
시스템은 제3, 제4, 제5, 및 제6 방사원을 더 포함하고, 제3, 제4, 제5, 및 제6 방사원 각각은 각각의 제3, 제4, 제5, 및 제6 평균 여기 파장을 특징으로 하고, 6개의 평균 여기 파장 각각은 나머지 평균 여기 파장과 상이하고;
샘플은 제4, 제5, 제6, 제7, 및 제8 염료를 더 포함하고;
시스템은 샘플로부터의 방출을 통과시키도록 각각 구성된 제3, 제4, 제5, 및 제6 방출 스펙트럼 요소를 더 포함하고, 제3, 제4, 제5, 및 제6 방출 요소 각각은 각각의 제3, 제4, 제5, 및 제6 평균 방출 파장을 특징으로 하며, 파장 공급원 각각의 6개의 평균 방출 파장 각각은 나머지 공급원의 평균 방출 파장과 상이하고;
적어도 하나의 메모리는
샘플을 제3, 제4, 제5, 및 제6 방사원으로 조명하고;
샘플을 제3, 제4, 제5, 및 제6 방사원 각각으로 조명한 것에 응답하여, 방출 스펙트럼 요소 중 하나 이상을 사용하여 샘플로부터 방출을 측정하도록 하는 명령어를 포함하는, 시스템.
97. 조항 96에 있어서, 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 및 제8 염료는 각각의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 및 제8 프로브에 공유 부착되어 있고, 각각의 프로브는 각각의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 및 제8 표적 분자에 결합하도록 구성되고, 적어도 하나의 메모리는 측정된 방출에 기초하여 샘플에 존재하는 표적 분자의 양을 결정하도록 하는 명령어를 더 포함하는, 시스템.
98. 조항 97에 있어서, 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 및/또는 제8 프로브는 소광제 모이어티를 더 포함하는, 시스템.
99. 조항 98에 있어서, 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 및 제8 프로브는 올리고뉴클레오티드 프로브이고, 제2 프로브는 조항 18 내지 36 중 어느 하나에 따르는, 시스템.
100. 조항 99에 있어서, 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 및/ 제8 표적 분자는 핵산 분자인, 시스템.
101. 조항 96 내지 100 중 어느 하나에 있어서, 제2 염료 및 제4 염료는 축외 염료인, 시스템.
102. 조항 96 내지 101 중 어느 하나에 있어서,
제2 염료는 제1 염료의 최대 흡수 파장과 동일하거나 실질적으로 동일한 최대 흡수 파장을 포함하고;
제4 염료는 제1 염료의 최대 흡수 파장과 동일하거나 실질적으로 동일한 최대 흡수 파장을 포함하고;
제2 염료는 제3 염료의 최대 방출 파장과 동일하거나 실질적으로 동일한 최대 방출 파장을 포함하고;
제4 염료는 제5 염료의 최대 방출 파장과 동일하거나 실질적으로 동일한 최대 방출 파장을 포함하는, 시스템.
103. 조항 73 내지 82 중 어느 하나에 있어서,
시스템은 제3, 제4, 제5, 및 제6 방사원을 더 포함하고, 제3, 제4, 제5, 및 제6 방사원 각각은 각각의 제3, 제4, 제5, 및 제6 평균 여기 파장을 특징으로 하고, 6개의 평균 여기 파장 각각은 나머지 평균 여기 파장과 상이하고;
샘플은 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9 및 제10 염료를 더 포함하고;
시스템은 샘플로부터의 방출을 통과시키도록 각각 구성된 제3, 제4, 제5, 및 제6 방출 스펙트럼 요소를 더 포함하고, 제3, 제4, 제5, 및 제6 방출 요소 각각은 각각의 제3, 제4, 제5, 및 제6 평균 방출 파장을 특징으로 하며, 파장 공급원 각각의 6개의 평균 방출 파장 각각은 나머지 공급원의 평균 방출 파장과 상이하고;
적어도 하나의 메모리는
샘플을 제3, 제4, 제5, 및 제6 방사원으로 조명하고;
샘플을 제3, 제4, 제5, 및 제6 방사원 각각으로 조명한 것에 응답하여, 방출 스펙트럼 요소 중 하나 이상을 사용하여 샘플로부터 방출을 측정하도록 하는 명령어를 포함하는, 시스템.
104. 조항 103에 있어서, 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9 및 제10 염료는 각각의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9 및 제10 프로브에 각각 공유 부착되어 있고, 각각의 프로브는 각각의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9 및 제10 표적 분자에 결합하도록 구성되고, 적어도 하나의 메모리는 측정된 방출에 기초하여 샘플에 존재하는 표적 분자의 양을 결정하도록 하는 명령어를 더 포함하는, 시스템.
105. 조항 104에 있어서, 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9 및/또는 제10 프로브는 소광제 모이어티를 더 포함하는, 시스템.
106. 조항 105에 있어서, 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 및 제10 프로브는 올리고뉴클레오티드 프로브이고, 제2 프로브는 조항 18 내지 36 중 어느 하나에 따르는, 시스템.
107. 조항 106에 있어서, 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 및 제10 표적 분자는 핵산 분자인, 시스템.
108. 조항 103 내지 107 중 어느 하나에 있어서, 제2 염료, 제4 염료, 제9 염료, 및 제10 염료는 축외 염료인, 시스템.
109. 조항 103 내지 108 중 어느 하나에 있어서,
제2 염료는 제1 염료의 최대 흡수 파장과 동일하거나 실질적으로 동일한 최대 흡수 파장을 포함하고;
제4 염료는 제1 염료의 최대 흡수 파장과 동일하거나 실질적으로 동일한 최대 흡수 파장을 포함하고;
제9 염료는 제3 염료의 최대 흡수 파장과 동일하거나 실질적으로 동일한 최대 흡수 파장을 포함하고;
제10 염료는 제3 염료의 최대 흡수 파장과 동일하거나 실질적으로 동일한 최대 흡수 파장을 포함하고;
제2 염료는 제3 염료의 최대 방출 파장과 동일하거나 실질적으로 동일한 최대 방출 파장을 포함하고;
제4 염료는 제5 염료의 최대 방출 파장과 동일하거나 실질적으로 동일한 최대 방출 파장을 포함하고;
제9 염료는 제7 염료의 최대 방출 파장과 동일하거나 실질적으로 동일한 최대 방출 파장을 포함하고;
제10 염료는 제10 염료의 최대 방출 파장과 동일하거나 실질적으로 동일한 최대 방출 파장을 포함하는, 시스템.
110. 조항 96 내지 109 중 어느 하나에 있어서,
제1 방사원의 제1 평균 여기 파장은 480 ±5 나노미터이고/이거나 제1 방사원은 제1 평균 여기 파장에 대해 ±12 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고;
제2 방사원의 제2 평균 여기 파장은 520 ±5 나노미터이고/이거나 제2 방사원은 제2 평균 여기 파장에 대해 ±12 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고;
제3 방사원의 제3 평균 여기 파장은 550 ±5 나노미터이고/이거나 제3 방사원은 제3 평균 여기 파장에 대해 ±12 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고;
제4 방사원의 제4 평균 여기 파장은 580 ±5 나노미터이고/이거나 제4 방사원은 제4 평균 여기 파장에 대해 ±12 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고;
제5 방사원의 제5 평균 여기 파장은 640 ±5 나노미터이고/이거나 제5 방사원은 제5 평균 여기 파장에 대해 ±12 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고;
제6 방사원의 제6 평균 여기 파장은 662 ±5 나노미터이고/이거나 제6 방사원은 제6 평균 여기 파장에 대해 ±12 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고;
제1 방출 스펙트럼 요소의 제1 평균 방출 파장은 520 ±5 나노미터이고/이거나 제1 방출 스펙트럼 요소는 제1 평균 방출 파장에 대해 ±18 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고;
제2 방출 스펙트럼 요소의 제2 평균 방출 파장은 558 ±5 나노미터이고/이거나 제2 방출 스펙트럼 요소는 제2 평균 방출 파장에 대해 ±15 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고;
제3 방출 스펙트럼 요소의 제3 평균 방출 파장은 587 ±5 나노미터이고/이거나 제3 방출 스펙트럼 요소는 제3 평균 방출 파장에 대해 ±12 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고;
제4 방출 스펙트럼 요소의 제4 평균 방출 파장은 623 ±5 나노미터이고/이거나 제4 방출 스펙트럼 요소는 제4 평균 방출 파장에 대해 ±16 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고;
제5 방출 스펙트럼 요소의 제5 평균 방출 파장은 682 ±5 나노미터이고/이거나 제5 방출 스펙트럼 요소는 제5 평균 방출 파장에 대해 ±16 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고;
제6 방출 스펙트럼 요소의 제6 평균 방출 파장은 711 ±5 나노미터이고/이거나 제6 방출 스펙트럼 요소는 제6 평균 방출 파장에 대해 ±16 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하는, 시스템.
111. 조항 96 내지 110 중 어느 하나에 있어서,
제1 염료는 5-FAM, 6-FAM, Oregon Green, TET, 또는 R110 중 적어도 하나이고;
제2 염료는 FAM-TAMRA, FAM-ABY, 또는 FAM-NED 중 적어도 하나이고;
제3 염료는 NED, TAMRA, ABY, 또는 DY-555 중 적어도 하나이고;
제4 염료는 FAM-PET, FAM-ROX, FAM-JUN, FAM-Texas Red, 또는 TET-Alexa Fluor 594 중 적어도 하나이고;
제5 염료는 PET, ROX, JUN, Texas Red, 또는 Alexa Fluor 594 중 적어도 하나이고;
제6 염료는 VIC, HEX, JOE, Yakima Yellow, 또는 R6G 중 적어도 하나이고;
제7 염료는 Alexa Fluor 647, Cy5®, ATTO 647 TM, 또는 DyLight 650 TM 중 적어도 하나이고;
제8 염료는 Alexa Fluor 676, DyLight 680TM, 또는 Cy5.5® 중 적어도 하나인, 시스템.
112. 조항 103 내지 111 중 어느 하나에 있어서,
제9 염료는 ABY-Alexa Fluor 647, NED-Alexa Fluor 647, ABY-Cy5®, ABY-ATTO 647 TM, 또는 ABY-DyLight 650 TM 중 적어도 하나이고;
제10 염료는 NED-Alexa Fluor 676, NED DyLight 680 TM, NED-Cy5.5®, ABY-Alexa Fluor 676, ABY-DyLight 680 TM, 또는 ABY-Cy5.5® 중 적어도 하나인, 시스템.
113. 조항 96 내지 112 중 어느 하나에 있어서, 제2 염료 및 제4 염료는 독립적으로 플루오레세인 염료, 로다민 염료, 피로닌 염료, 및 시아닌 염료로 이루어진 군으로부터 선택된 형광단을 포함하는, 시스템.
114. 조항 103 내지 112 중 어느 하나에 있어서, 제2, 제4, 제9, 및 제10 염료는 독립적으로 플루오레세인 염료, 로다민 염료, 피로닌 염료, 및 시아닌 염료로 이루어진 군으로부터 선택된 형광단을 포함하는, 시스템.
115. 조항 37 내지 114 중 어느 하나에 있어서, 방사원 각각은 가시광 스펙트럼 내에 최대 파장 및/또는 평균 파장을 갖는 방사선을 특징으로 하는, 시스템.
116. 조항 37 내지 114 중 어느 하나에 있어서, 방사원 각각은 적외선 파장 대역 및/또는 자외선 파장 대역 내에 최대 파장 및/또는 평균 파장을 갖는 방사선을 특징으로 하는, 시스템.
117. 조항 37 내지 114 중 어느 하나에 있어서, 방사원 중 적어도 하나는 발광 다이오드(LED) 또는 레이저를 포함하는, 시스템.
118. 조항 37 내지 114 중 어느 하나에 있어서, 제1 방사원의 제1 평균 여기 파장 및 제2 방사원의 제2 평균 여기 파장은 적어도 50 나노미터 만큼 또는 적어도 60 나노미터만큼 상이한, 시스템.
119. 조항 37 내지 114 중 어느 하나에 있어서,
제1 방사원은 방사 발생기를 포함하고, 제1 필터가 방사 발생기로부터의 방사선을 필터링하도록 구성되어 있고;
제2 방사원은 방사 발생기를 포함하고, 제2 필터가 방사 발생기로부터의 방사선을 필터링하도록 구성되어 있는, 시스템.
120. 조항 119에 있어서, 필터를 포함하는 필터 휠을 더 포함하는, 시스템.
121. 조항 37 내지 114 중 어느 하나에 있어서, 방사원 각각은 방사 발생기 및 방사 발생기로부터의 방사선을 투과 또는 반사하도록 구성된 색 분산성(chromatically dispersive) 광학 요소를 포함하고, 각각의 방사원은 색 분산성 광학 요소로부터의 스펙트럼의 상이한 부분을 포함하는, 시스템.
122. 조항 37 내지 121 중 어느 하나에 있어서, 방사 발생기는 광원을 포함하는, 시스템.
123. 조항 37 내지 121 중 어느 하나에 있어서, 방사 발생기는 방사선의 가시광 대역의 적어도 일부에 걸쳐 있는 것을 특징으로 하는 백색 광원을 포함하는, 시스템.
124. 조항 37 내지 121 중 어느 하나에 있어서, 방사 발생기는 발광 다이오드 또는 할로겐 램프를 포함하는, 시스템.
125. 조항 37 내지 114 중 어느 하나에 있어서, 검출기는 센서 또는 픽셀의 어레이를 포함하는 어레이 센서를 포함하는, 시스템.
126. 조항 125에 있어서, 어레이 센서는 전하 결합 소자(CCD) 또는 상보성 금속 산화막 반도체(CMOS)를 포함하는, 시스템.
127. 조항 37 내지 114 중 어느 하나에 있어서, 방출 스펙트럼 요소는 제1 광학 경로 및 제2 광학 경로를 따르는 샘플로부터의 방출을 분산시키도록 구성된 분산성 광학 요소를 포함하고, 검출기는 제1 광학 경로를 따르는 방출을 수신하도록 구성된 제1 검출기 및 제2 광학 경로를 따르는 방출을 수신하도록 구성된 제2 검출기를 포함하는, 시스템.
128. 조항 127에 있어서, 제1 검출기는 CCD 검출기 또는 CMOS 검출기 상에 제1 위치를 포함하고, 제2 검출기는 제1 위치로부터 공간적으로 분리된 CCD 검출기 또는 CMOS 검출기 상에 제2 위치를 포함하는, 시스템.
129. 조항 128에 있어서, 제1 위치는 픽셀 또는 픽셀의 군을 포함하고, 제2 위치는 상이한 픽셀 또는 픽셀의 군을 포함하는, 시스템.
130. 조항 37 내지 54 또는 73 내지 129 중 어느 하나에 있어서,
제1 방출 스펙트럼 요소는 제1 스펙트럼 필터를 포함하고;
제2 방출 스펙트럼 요소는 제2 스펙트럼 필터를 포함하는, 시스템.
131. 조항 37 내지 54 또는 73 내지 130 중 어느 하나에 있어서, 제1 평균 방출 파장 및 제2 평균 방출 파장은 적어도 25 나노미터만큼 상이한, 시스템.
132. 조항 37 내지 54 또는 73 내지 131 중 어느 하나에 있어서, 방출 스펙트럼 요소를 포함하는 필터 휠을 더 포함하되, 필터 휠은 샘플로부터의 방출을 측정하기 위해서 방출 스펙트럼 요소를 샘플과 검출기 사이에 광학 경로를 따라서 순차적으로 배치하도록 구성된 것인, 시스템.
133. 조항 37 내지 54 또는 73 내지 132 중 어느 하나에 있어서,
제1 방출 스펙트럼 요소는 제1 방출 파장 대역 내의 방사선을 통과시키도록 구성된 제1 스펙트럼 필터를 포함하고;
제2 방출 스펙트럼 요소는 제1 방출 파장 대역과 중첩하지 않는 제2 방출 파장 대역 내의 방사선을 통과시키도록 구성된 제2 스펙트럼 필터를 포함하는, 시스템.
134. 조항 73 내지 95 또는 115 내지 133 중 어느 하나에 있어서,
제1 방사원의 제1 평균 여기 파장 또는 제2 방사원의 제2 평균 여기 파장과 상이한 제3 평균 여기 파장을 특징으로 하는 제3 방사원을 제공하는 것;
샘플을 제3 방사원으로부터의 방사선으로 조명하고, 이에 대한 응답으로 제1 방출 스펙트럼 요소 또는 제2 방출 스펙트럼 요소 중 하나 이상을 사용하여 샘플로부터의 방출을 측정하는 것을 더 포함하고;
표적 분자 중 하나 이상의 양을 결정하는 것은 샘플을 제3 방사원으로부터의 방사선으로 조명한 것에 응답하여 샘플로부터의 측정된 방출(들)에 기초하는, 시스템.
135. 조항 134에 있어서, 표적 분자 중 하나 이상의 양을 결정하는 것은 제1 방사원 및/또는 제2 방사원으로부터의 방사선으로 샘플을 조명하는 것에 응답하여 샘플로부터의 측정된 방출 중 하나 이상을 조정하는 것을 포함하는, 시스템.
136. 조항 73 내지 135 중 어느 하나에 있어서,
제1 염료는 제1 방출 스펙트럼 시그니처를 특징으로 하고, 제2 염료는 제2 방출 스펙트럼 시그니처를 특징으로 하고, 제3 염료는 제3 방출 스펙트럼 시그니처를 특징으로 하고;
제1 스펙트럼 시그니처는 제1 염료가 방사원 각각에 의해서 개별적으로 조명될 때 방출 파장 대역 각각 내의 방출된 에너지의 양을 포함하고;
제2 스펙트럼 시그니처는 제2 염료가 방사원 각각에 의해서 개별적으로 조명될 때 방출 파장 대역 각각 내의 방출된 에너지의 양을 포함하고;
제3 스펙트럼 시그니처는 제3 염료가 방사원 각각에 의해서 개별적으로 조명될 때 방출 파장 대역 각각 내의 방출된 에너지의 양을 포함하고;
각각의 염료의 스펙트럼 시그니처는 나머지 염료의 스펙트럼 시그니처와 상이한, 시스템.
137. 조항 73 내지 136 중 어느 하나에 있어서, 3개의 염료 각각으로부터의 방출의 측정은 제 시간에 순차적으로 일어나는, 시스템.
138. 조항 73 내지 137 중 어느 하나에 있어서, 3개의 염료로부터의 방출의 측정은 동시에 일어나는, 시스템.
139. 조항 73 내지 138 중 어느 하나에 있어서, 제1 염료는 FAM이고, 제2 염료는 ROX이며, 제3 염료는 FAM-ROX인, 시스템.
140. 조항 73 내지 139 중 어느 하나에 있어서, 제2 최대 방출 파장은 제2 최대 흡수 파장보다 더 큰, 시스템.
141. 조항 73 내지 140 중 어느 하나에 있어서, 제2 최대 방출 파장은 제2 최대 흡수 파장보다 더 작은, 시스템.
142. 조항 73 내지 141 중 어느 하나에 있어서, 제2 염료는 에너지 전달 염료 접합체로서, 에너지 전달 염료 접합체는,
제1 염료의 최대 흡수 파장과 동일하거나 실질적으로 동일한 최대 흡수 파장을 특징으로 하고, 제1 방사원으로부터의 방사선을 흡수하여 이에 응답하여 에너지를 생성하도록 구성된 도너 염료; 및
제3 염료의 최대 방출 파장과 동일하거나 실질적으로 동일한 최대 방출 파장을 특징으로 하는 억셉터 염료를 포함하고, 염료는 도너에 의해서 생성된 에너지 중 적어도 일부를 억셉터 염료로 전달하도록 구성된, 시스템.
143. 조항 142에 있어서, 제1 염료는 제1 형광단을 포함하고, 도너 염료와 제1 형광단은 동일한, 시스템.
144. 조항 142에 있어서, 제3 염료는 제3 형광단을 포함하고, 도너 염료와 제3 형광단은 상이한, 시스템.
145. 조항 142에 있어서, 제1 염료는 제1 스펙트럼 시그니처를 특징으로 하고, 제3 염료는 제3 스펙트럼 시그니처를 특징으로 하고, 도너 염료는 도너 염료 스펙트럼 시그니처를 특징으로 하고, (1) 도너 염료 스펙트럼 시그니처는 제3 방출 스펙트럼 시그니처와 동일하고/하거나 (2) 도너 염료의 최대 방출 파장은 제3 염료의 최대 방출 파장과 동일한, 시스템.
146. 조항 142에 있어서, 도너 염료는 방출 파장 대역을 갖고, 억셉터 염료는 도너 염료 방출 파장 대역과 중첩하지 않는 흡수 파장 대역을 갖는, 시스템.
147. 조항 142에 있어서, 도너 염료는 제1 염료 또는 제3 염료 중 어느 하나와 상이한 화학 구조를 갖는, 시스템.
148. 조항 142에 있어서, 제1 염료는 제1 스펙트럼 시그니처를 특징으로 하고, 제3 염료는 제3 스펙트럼 시그니처를 특징으로 하고, 도너 염료는 도너 염료 스펙트럼 시그니처를 특징으로 하고, (1) 도너 염료 스펙트럼 시그니처는 제3 스펙트럼 시그니처와 상이하고/하거나 (2) 도너 염료 최대 방출 파장은 제3 염료의 최대 방출 파장과 상이한, 시스템.
149. 조항 37 내지 148 중 어느 하나에 있어서, 샘플은 생물학적 샘플인, 시스템.
150. 조항 149에 있어서, 생물학적 샘플은 하나 이상의 표적 분자를 포함하는, 시스템.
151. 조항 150에 있어서, 하나 이상의 표적 분자는 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는, 시스템.
152. 조항 149 내지 151 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 메모리는 측정된 방출에 기초하여 샘플에 존재하는 임의의 표적 분자의 양을 결정하도록 하는 명령어를 포함하는, 시스템.
153. 방법으로서,
제1 염료 및 제2 염료를 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
샘플을 방사원으로 조명하고, 이에 대한 응답으로, 검출기 및 제1 평균 방출 파장을 특징으로 하는 제1 방출 스펙트럼 요소를 사용하여 샘플로부터의 방출을 측정하고, 검출기 및 제1 평균 방출 파장과 상이한 제2 평균 방출 파장을 특징으로 하는 제2 방출 스펙트럼 요소를 사용하여 샘플로부터의 방출을 측정하는 단계를 포함하는, 방법.
154. 조항 153에 있어서, 제1 염료는 제1 형광단이거나 이를 포함하고, 제2 염료는 조항 1 내지 17 중 어느 하나에 따르는 형광 에너지 전달 염료 접합체이거나 이를 포함하는, 방법.
155. 조항 153 또는 154에 있어서, 제1 형광단은 잔텐 염료, 시아닌 염료, BODIPY 염료, 피렌 염료, 피로닌 염료, 및 쿠마린 염료로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
156. 조항 153 내지 155 중 어느 하나에 있어서, 제2 염료는 플루오레세인 염료, 로다민 염료, 피로닌 염료, 및 시아닌 염료로 이루어진 군으로부터 선택된 형광단을 포함하는, 방법.
157. 조항 153 내지 156 중 어느 하나에 있어서, 제1 염료는 제1 프로브에 공유 부착되고, 제2 염료는 제2 프로브에 공유 부착되고, 제1 프로브 및 제2 프로브는 각각 제1 표적 분자 및 제2 표적 분자에 결합하도록 구성된, 방법.
158. 조항 157에 있어서, 제1 및 제2 프로브는 올리고뉴클레오티드 프로브이고, 제2 프로브는 조항 18 내지 36 중 어느 하나에 따르는, 방법.
159. 조항 153 내지 158 중 어느 하나에 있어서, 제1 표적 분자 및 제2 표적 분자는 핵산 분자인, 방법.
160. 조항 153 내지 159 중 어느 하나에 있어서, 제1 염료는 제2 염료의 최대 흡수 파장과 동일하거나 실질적으로 동일한 최대 흡수 파장을 포함하는, 방법.
161. 조항 160에 있어서, 제1 최대 흡수 파장 또는 제2 최대 흡수 파장 중 하나 이상은 각각의 스펙트럼 전체에 걸친 절대 최대값인, 방법.
162. 조항 153 내지 161 중 어느 하나에 있어서, 제1 염료는 축상 염료이고, 제2 염료는 축외 염료인, 방법.
163. 조항 153 내지 162 중 어느 하나에 있어서, 제1 염료는 제1 표적 분자에 결합하도록 구성되고, 제2 염료는 제2 표적 분자에 결합하도록 구성되고, 방법은 측정된 방출에 기초하여 샘플에 존재하는 임의의 표적 분자의 양을 결정하는 단계를 더 포함하는, 방법.
164. 방법으로서,
제1 염료 및 제2 염료를 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
샘플에 대해 증폭 검정을 수행하는 단계;
샘플을 제1 평균 여기 파장을 특징으로 하는 제1 방사원으로 조명하고, 이에 대한 응답으로, 검출기 및 제1 평균 방출 파장을 특징으로 하는 제1 방출 스펙트럼 요소를 사용하여 샘플로부터의 방출을 측정하는 단계; 및
샘플을 제1 평균 여기 파장과 상이한 제2 평균 여기 파장을 특징으로 하는 제2 방사원으로 조명하고, 이에 대한 응답으로, 검출기 및 제2 방출 스펙트럼 요소를 사용하여 샘플로부터의 방출을 측정하는 단계를 포함하는, 방법.
165. 조항 164에 있어서, 제1 염료는 제1 형광단이거나 이를 포함하고, 제2 염료는 조항 1 내지 17 중 어느 하나에 따르는 형광 에너지 전달 염료 접합체이거나 이를 포함하는, 방법.
166. 조항 164 또는 165에 있어서, 제1 형광단은 잔텐 염료, 시아닌 염료, BODIPY 염료, 피렌 염료, 피로닌 염료, 및 쿠마린 염료로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
167. 조항 164 내지 166 중 어느 하나에 있어서, 제2 염료는 플루오레세인 염료, 로다민 염료, 피로닌 염료, 및 시아닌 염료로 이루어진 군으로부터 선택된 형광단을 포함하는, 방법.
168. 조항 164 내지 167 중 어느 하나에 있어서, 제1 염료는 제1 프로브에 공유 부착되고, 제2 염료는 접합체 제2 프로브에 공유 부착되고, 제1 프로브 및 제2 프로브는 각각 제1 표적 분자 및 제2 표적 분자에 결합하도록 구성된, 방법.
169. 조항 168에 있어서, 제1 및 제2 프로브는 올리고뉴클레오티드 프로브이고, 제2 프로브는 조항 18 내지 36 중 어느 하나에 따르는, 방법.
170. 조항 168 또는 169에 있어서, 제1 표적 분자 및 제2 표적 분자는 핵산 분자인, 방법.
171. 조항 164 내지 170 중 어느 하나에 있어서, 제1 염료는 제2 염료의 최대 방출 파장과 동일하거나 실질적으로 동일한 최대 방출 파장을 포함하는, 방법.
172. 조항 171에 있어서, 제1 최대 방출 파장 또는 제2 최대 방출 파장 중 하나 이상은 각각의 스펙트럼 전체에 걸친 절대 최대값인, 방법.
173. 조항 164 내지 172 중 어느 하나에 있어서, 제2 염료는 축외 염료인, 방법.
174. 조항 164 내지 173 중 어느 하나에 있어서, 제1 염료는 제1 표적 분자에 결합하도록 구성되고, 제2 염료는 제2 표적 분자에 결합하도록 구성되고, 방법은 측정된 방출에 기초하여 샘플에 존재하는 임의의 표적 분자의 양을 결정하는 단계를 더 포함하는, 방법.
175. 방법으로서,
제3 표적 분자에 결합하도록 구성된 제1 염료, 제2 염료, 및 제3 염료를 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
샘플을 제1 평균 여기 파장을 특징으로 하는 제1 방사원으로 조명하고, 이에 대한 응답으로, (1) 검출기 및 제1 평균 방출 파장을 특징으로 하는 제1 방출 스펙트럼 요소를 사용하여 샘플로부터의 방출을 측정하고, (2) 검출기 및 제1 평균 방출 파장과 상이한 제2 평균 방출 파장을 특징으로 하는 제2 방출 스펙트럼 요소를 사용하여 샘플로부터의 방출을 측정하는 단계;
샘플을 제1 평균 여기 파장과 상이한 제2 평균 여기 파장을 특징으로 하는 제2 방사원으로 조명하고, 이에 대한 응답으로, 검출기 및 제2 방출 스펙트럼 요소를 사용하여 샘플로부터의 방출을 측정하는 단계를 포함하는, 방법.
176. 조항 175에 있어서, 제1 염료는 제1 형광단이거나 이를 포함하고, 제2 염료는 조항 1 내지 17 중 어느 하나에 따르는 형광 에너지 전달 염료 접합체이거나 이를 포함하는, 방법.
177. 조항 175 내지 186 중 어느 하나에 있어서, 제1 형광단은 잔텐 염료, 시아닌 염료, BODIPY 염료, 피렌 염료, 피로닌 염료, 및 쿠마린 염료로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
178. 조항 175 내지 177 중 어느 하나에 있어서, 제1 염료는 제1 프로브에 공유 부착되고, 제2 염료는 접합체 제2 프로브에 공유 부착되고, 제3 염료는 제3 프로브에 공유 부착되며, 제1 프로브, 제2 프로브 및 제3 프로브는 각각 제1 표적 분자, 제2 표적 분자 및 제3 표적 분자에 결합하도록 구성된, 방법.
179. 조항 178에 있어서, 제1 프로브, 제2 프로브 및 제3 프로브는 올리고뉴클레오티드 프로브이고, 제2 프로브는 조항 18 내지 36 중 어느 하나에 따르는, 시스템.
180. 조항 178 또는 179에 있어서, 제1 표적 분자, 제2 표적 분자 및 제2 표적 분자는 핵산 분자인, 시스템.
181. 조항 175 내지 181 중 어느 하나에 있어서, (1) 제1 염료는 제1 최대 흡수 파장을 포함하는 제1 흡수 스펙트럼을 포함하고, 제2 염료는 제1 최대 흡수 파장과 동일하거나 실질적으로 동일한 제2 최대 흡수 파장을 포함하는 제2 흡수 스펙트럼을 포함하고, (2) 제2 염료는 제2 최대 방출 파장을 포함하는 제2 방출 스펙트럼을 포함하고, 제3 염료는 제2 최대 방출 파장과 동일하거나 실질적으로 동일한 제3 최대 방출 파장을 포함하는 제3 방출 스펙트럼을 포함하는, 방법.
182. 조항 181에 있어서, 제1 최대 흡수 파장, 제2 최대 흡수 파장, 제2 최대 방출 파장, 또는 제3 최대 방출 파장 중 하나 이상은 각각의 스펙트럼 전체에 걸친 절대 최대값인, 방법.
183. 조항 175 내지 182 중 어느 하나에 있어서, 제2 염료는 축외 염료인, 방법.
184. 조항 175 내지 183 중 어느 하나에 있어서, 제1 염료는 제1 표적 분자에 결합하도록 구성되고, 제2 염료는 제2 표적 분자에 결합하도록 구성되고, 방법은 측정된 방출에 기초하여 샘플에 존재하는 표적 분자의 양을 결정하는 단계를 더 포함하는, 방법.
185. 조항 175 내지 184 중 어느 하나에 있어서,
제1 염료는 5-FAM, 6-FAM, Oregon Green 또는 TET, R110 중 하나 이상을 포함하고;
제2 염료는 FAM-TAMRA, FAM-ABY, 또는 FAM-NED 중 하나 이상을 포함하고;
제3 염료는 NED, TAMRA, ABY, DY-555 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
186. 조항 175 내지 185 중 어느 하나에 있어서,
제1 방사원의 제1 평균 여기 파장은 480 ±5 나노미터이고/이거나 제1 방사원은 제1 평균 여기 파장에 대해 ±12 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고;
제2 방사원의 제2 평균 여기 파장은 550 ±5 나노미터이고/이거나 제2 방사원은 제2 평균 여기 파장에 대해 ±12 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고;
제1 방출 스펙트럼 요소의 제1 평균 방출 파장은 520 ±5 나노미터이고/이거나 제1 방출 스펙트럼 요소는 제1 평균 방출 파장에 대해 ±20 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고;
제2 방출 스펙트럼 요소의 제2 평균 방출 파장은 587 ±5 나노미터이고/이거나 제2 방출 스펙트럼 요소는 제2 평균 방출 파장에 대해 ±12 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하는, 방법.
187. 조항 175 내지 184 중 어느 하나에 있어서,
제1 염료는 5-FAM, 6-FAM, Oregon Green, TET, R110 중 하나 이상을 포함하고;
제2 염료는 FAM-PET, FAM-ROX, FAM-JUN, FAM-Texas Red, 또는 TET-Alexa Fluor 594 중 하나 이상을 포함하고;
제3 염료는 PET, ROX, JUN, Texas Red, 또는 Alexa Fluor 594 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
188. 조항 187에 있어서,
제1 방사원의 제1 평균 여기 파장은 480 ±5 나노미터이고/이거나 제1 방사원은 제1 평균 여기 파장에 대해 ±12 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고;
제2 방사원의 제2 평균 여기 파장은 580 ±5 나노미터이고/이거나 제2 방사원은 제2 평균 여기 파장에 대해 ±12 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고;
제1 방출 스펙트럼 요소의 제1 평균 방출 파장은 520 ±5 나노미터이고/이거나 제1 방출 스펙트럼 요소는 제1 평균 방출 파장에 대해 ±18 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고;
제2 방출 스펙트럼 요소의 제2 평균 방출 파장은 623 ±5 나노미터이고/이거나 제2 방출 스펙트럼 요소는 제2 평균 방출 파장에 대해 ±18 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하는, 방법.
189. 조항 175 내지 184 중 어느 하나에 있어서,
제1 염료는 NED, TAMRA, ABY, DY-555 중 하나 이상을 포함하고;
제2 염료는 ABY-Alexa Fluor 647, NED-Alexa Fluor 647, ABY-Cy5®, ABY-ATTO 647TM, 또는 ABY-DyLight 650TM 중 하나 이상을 포함하고;
제3 염료는 Alexa Fluor 647, Cy5®, ATTO 647TM, 또는 DyLight 650TM 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
190. 조항 189에 있어서,
제1 방사원의 제1 평균 여기 파장은 550 ±5 나노미터이고/이거나 제1 방사원은 제1 평균 여기 파장에 대해 ±14 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고;
제2 방사원의 제2 평균 여기 파장은 640 ±5 나노미터이고/이거나 제2 방사원은 제2 평균 여기 파장에 대해 ±12 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고;
제1 방출 스펙트럼 요소의 제1 평균 방출 파장은 587 ±5 나노미터이고/이거나 제1 방출 스펙트럼 요소는 제1 평균 방출 파장에 대해 ±12 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고;
제2 방출 스펙트럼 요소의 제2 평균 방출 파장은 682 ±5 나노미터이고/이거나 제2 방출 스펙트럼 요소는 제2 평균 방출 파장에 대해 ±16 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하는, 방법.
191. 조항 175 내지 184 중 어느 하나에 있어서,
제1 염료는 NED, TAMRA, ABY, DY-555 중 하나 이상을 포함하고;
제2 염료는 NED-Alexa Fluor 676, NED DyLight 680TM, NED-Cy5.5®, ABY-Alexa Fluor 676, ABY-DyLight 680TM, 또는 ABY-Cy5.5® 중 하나 이상을 포함하고;
제3 염료는 Alexa Fluor 676, DyLight 680TM, 또는 Cy5.5® 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
192. 조항 191에 있어서,
제1 방사원의 제1 평균 여기 파장은 550 ±5 나노미터이고/이거나 제1 방사원은 제1 평균 여기 파장에 대해 ±14 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고;
제2 방사원의 제2 평균 여기 파장은 662 ±5 나노미터이고/이거나 제2 방사원은 제2 평균 여기 파장에 대해 ±12 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고;
제1 방출 스펙트럼 요소의 제1 평균 방출 파장은 587 ±5 나노미터이고/이거나 제1 방출 스펙트럼 요소는 제1 평균 방출 파장에 대해 ±12 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고;
제2 방출 스펙트럼 요소의 제2 평균 방출 파장은 711 ±5 나노미터이고/이거나 제2 방출 스펙트럼 요소는 제2 평균 방출 파장에 대해 ±16 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하는, 방법.
193. 조항 175 내지 192 중 어느 하나에 있어서, 핵산 합성 검정을 수행하고, 핵산 합성 검정 동안 그리고/또는 핵산 합성 검정 후에 조명 및 측정하는 단계를 더 포함하는, 방법.
194. 조항 193에 있어서, 핵산 합성 검정은 복수의 온도 주기를 통해 용액을 순환시키는 것을 포함하는 PCR 검정을 포함하고, 염료의 방출의 측정은 온도 주기 중 하나 이상 이후에 수행되는, 방법.
195. 조항 193에 있어서, 핵산 합성 검정은 복수의 온도 주기를 통해 용액을 순환시키는 것을 포함하는 PCR 검정을 포함하고, 염료의 방출의 측정은 마지막 온도 주기 이후에 수행되는, 방법.
196. 조항 178에 있어서,
제1 표적 분자로부터 제1 앰플리콘을 생산하는 단계;
제2 표적 분자로부터 제2 앰플리콘을 생산하는 단계; 및/또는
제3 표적 분자로부터 제3 앰플리콘을 생산하는 단계를 더 포함하는, 방법.
197. 조항 175 내지 184 중 어느 하나에 있어서,
제3, 제4, 제5, 및 제6 방사원을 제공하는 단계로서, 제3, 제4, 제5, 및 제6 방사원 각각은 각각의 제3, 제4, 제5, 및 제6 평균 여기 파장을 특징으로 하고, 6개의 평균 여기 파장 각각은 나머지 평균 여기 파장과 상이한, 제공하는 단계
샘플에 제4, 제5, 제6, 제7, 및 제8 염료를 제공하는 단계;
샘플로부터의 방출을 통과시키도록 각각 구성된 제3, 제4, 제5, 및 제6 방출 스펙트럼 요소를 제공하는 단계로서, 제3, 제4, 제5, 및 제6 방출 요소 각각은 각각의 제3, 제4, 제5, 및 제6 평균 방출 파장을 특징으로 하며, 파장 공급원 각각의 6개의 평균 방출 파장 각각은 나머지 공급원의 평균 방출 파장과 상이한, 제공하는 단계;
샘플을 제3, 제4, 제5, 및 제6 방사원으로 조명하는 단계; 및
샘플을 제3, 제4, 제5, 및 제6 방사원 각각으로 조명한 것에 응답하여, 방출 스펙트럼 요소 중 하나 이상을 사용하여 샘플로부터 방출을 측정하는 단계를 더 포함하는, 방법.
198. 조항 197에 있어서, 제4, 제5, 제6, 제7, 및 제8 염료는 각각의 제4, 제5, 제6, 제7, 및 제8 표적 분자에 결합하도록 구성되고, 방법은 측정된 방출에 기초하여 샘플에 존재하는 표적 분자의 양을 결정하는 단계를 더 포함하는, 방법.
199. 조항 197 또는 198에 있어서, 제2 염료 및 제4 염료는 축외 염료인, 방법.
200. 조항 197 내지 199 중 어느 하나에 있어서,
제2 염료는 제1 염료의 최대 흡수 파장과 동일하거나 실질적으로 동일한 최대 흡수 파장을 포함하고;
제4 염료는 제1 염료의 최대 흡수 파장과 동일하거나 실질적으로 동일한 최대 흡수 파장을 포함하고;
제2 염료는 제3 염료의 최대 방출 파장과 동일하거나 실질적으로 동일한 최대 방출 파장을 포함하고;
제4 염료는 제5 염료의 최대 방출 파장과 동일하거나 실질적으로 동일한 최대 방출 파장을 포함하는, 방법.
201. 조항 175 내지 184 중 어느 하나에 있어서,
제3, 제4, 제5, 및 제6 방사원을 제공하는 단계로서, 제3, 제4, 제5, 및 제6 방사원 각각은 각각의 제3, 제4, 제5, 및 제6 평균 여기 파장을 특징으로 하고, 6개의 평균 여기 파장 각각은 나머지 평균 여기 파장과 상이한, 제공하는 단계;
샘플에 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 및 제10 염료를 제공하는 단계;
샘플로부터의 방출을 통과시키도록 각각 구성된 제3, 제4, 제5, 및 제6 방출 스펙트럼 요소를 제공하는 단계로서, 제3, 제4, 제5, 및 제6 방출 요소 각각은 각각의 제3, 제4, 제5, 및 제6 평균 방출 파장을 특징으로 하며, 파장 공급원 각각의 6개의 평균 방출 파장 각각은 나머지 공급원의 평균 방출 파장과 상이한, 제공하는 단계;
샘플을 제3, 제4, 제5, 및 제6 방사원으로 조명하는 단계;
샘플을 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 및 제6 방사원 각각으로 조명한 것에 응답하여, 방출 스펙트럼 요소를 사용하여 샘플로부터 방출을 측정하는 단계;
측정된 방출에 기초하여 샘플에 존재하는 표적 분자의 양을 결정하는 단계를 더 포함하는, 방법.
202. 조항 201에 있어서, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 및 제10 염료는 각각의 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 및 제10 표적 분자에 결합하도록 구성되고, 방법은 측정된 방출에 기초하여 샘플에 존재하는 표적 분자의 양을 결정하는 단계를 더 포함하는, 방법.
203. 조항 201 또는 202에 있어서, 제2 염료, 제4 염료, 제9 염료, 및 제10 염료는 축외 염료인, 방법.
204. 조항 201 내지 203 중 어느 하나에 있어서,
제2 염료는 제1 염료의 최대 흡수 파장과 동일하거나 실질적으로 동일한 최대 흡수 파장을 포함하고;
제4 염료는 제1 염료의 최대 흡수 파장과 동일하거나 실질적으로 동일한 최대 흡수 파장을 포함하고;
제9 염료는 제3 염료의 최대 흡수 파장과 동일하거나 실질적으로 동일한 최대 흡수 파장을 포함하고;
제10 염료는 제3 염료의 최대 흡수 파장과 동일하거나 실질적으로 동일한 최대 흡수 파장을 포함하고;
제2 염료는 제3 염료의 최대 방출 파장과 동일하거나 실질적으로 동일한 최대 방출 파장을 포함하고;
제4 염료는 제5 염료의 최대 방출 파장과 동일하거나 실질적으로 동일한 최대 방출 파장을 포함하고;
제9 염료는 제7 염료의 최대 방출 파장과 동일하거나 실질적으로 동일한 최대 방출 파장을 포함하고;
제2 염료는 제10 염료의 최대 방출 파장과 동일하거나 실질적으로 동일한 최대 방출 파장을 포함하는, 방법.
205. 조항 197 내지 204 중 어느 하나에 있어서,
제1 방사원의 제1 평균 여기 파장은 480 ±5 나노미터이고/이거나 제1 방사원은 제1 평균 여기 파장에 대해 ±12 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고;
제2 방사원의 제2 평균 여기 파장은 520 ±5 나노미터이고/이거나 제2 방사원은 제2 평균 여기 파장에 대해 ±12 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고;
제3 방사원의 제3 평균 여기 파장은 550 ±5 나노미터이고/이거나 제3 방사원은 제3 평균 여기 파장에 대해 ±12 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고;
제4 방사원의 제4 평균 여기 파장은 580 ±5 나노미터이고/이거나 제4 방사원은 제4 평균 여기 파장에 대해 ±12 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고;
제5 방사원의 제5 평균 여기 파장은 640 ±5 나노미터이고/이거나 제5 방사원은 제5 평균 여기 파장에 대해 ±12 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고;
제6 방사원의 제6 평균 여기 파장은 662 ±5 나노미터이고/이거나 제6 방사원은 제6 평균 여기 파장에 대해 ±12 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고;
제1 방출 스펙트럼 요소의 제1 평균 방출 파장은 520 ±5 나노미터이고/이거나 제1 방출 스펙트럼 요소는 제1 평균 방출 파장에 대해 ±18 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고;
제2 방출 스펙트럼 요소의 제2 평균 방출 파장은 558 ±5 나노미터이고/이거나 제2 방출 스펙트럼 요소는 제2 평균 방출 파장에 대해 ±15 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고;
제3 방출 스펙트럼 요소의 제3 평균 방출 파장은 587 ±5 나노미터이고/이거나 제3 방출 스펙트럼 요소는 제3 평균 방출 파장에 대해 ±12 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고;
제4 방출 스펙트럼 요소의 제4 평균 방출 파장은 623 ±5 나노미터이고/이거나 제4 방출 스펙트럼 요소는 제4 평균 방출 파장에 대해 ±16 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고;
제5 방출 스펙트럼 요소의 제5 평균 방출 파장은 682 ±5 나노미터이고/이거나 제5 방출 스펙트럼 요소는 제5 평균 방출 파장에 대해 ±16 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고;
제6 방출 스펙트럼 요소의 제6 평균 방출 파장은 711 ±5 나노미터이고/이거나 제6 방출 스펙트럼 요소는 제6 평균 방출 파장에 대해 ±16 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하는, 방법.
206. 조항 197 내지 205 중 어느 하나에 있어서,
제1 염료는 5-FAM, 6-FAM, Oregon Green, TET, 또는 R110 중 적어도 하나이고;
제2 염료는 FAM-TAMRA, FAM-ABY, 또는 FAM-NED 중 적어도 하나이고;
제3 염료는 NED, TAMRA, ABY, 또는 DY-555 중 적어도 하나이고;
제4 염료는 FAM-PET, FAM-ROX, FAM-JUN, FAM-Texas Red, 또는 TET-Alexa Fluor 594 중 적어도 하나이고;
제5 염료는 PET, ROX, JUN, Texas Red, 또는 Alexa Fluor 594 중 적어도 하나이고;
제6 염료는 VIC, HEX, JOE, Yakima Yellow, 또는 R6G 중 적어도 하나이고;
제7 염료는 Alexa Fluor 647, Cy5®, ATTO 647 TM, 또는 DyLight 650 TM 중 적어도 하나이고;
제8 염료는 Alexa Fluor 676, DyLight 680, 또는 Cy5.5® 중 적어도 하나인, 방법.
207. 조항 201 내지 206 중 어느 하나에 있어서,
제9 염료는 ABY-Alexa Fluor 647, NED-Alexa Fluor 647, ABY-Cy5®, ABY-ATTO 647 TM, 또는 ABY-DyLight 650 TM 중 적어도 하나이고;
제10 염료는 NED-Alexa Fluor 676, NED DyLight 680 TM, NED-Cy5.5®, ABY-Alexa Fluor 676, ABY-DyLight 680 TM, 또는 ABY-Cy5.5® 중 적어도 하나인, 방법.
208. 조항 197 내지 207 중 어느 하나에 있어서, 제2 염료 및 제4 염료는 독립적으로 플루오레세인 염료, 로다민 염료, 피로닌 염료, 및 시아닌 염료로 이루어진 군으로부터 선택된 형광단을 포함하는, 방법.
209. 조항 201 내지 208 중 어느 하나에 있어서, 제2 염료, 제4 염료, 제9 염료 및 제10 염료는 독립적으로 플루오레세인 염료, 로다민 염료, 피로닌 염료, 및 시아닌 염료로 이루어진 군으로부터 선택된 형광단을 포함하는, 방법.
210. 조항 153 내지 196 중 어느 하나에 있어서, 방사원 각각은 가시광 스펙트럼 내에 최대 파장 및/또는 평균 파장을 갖는 방사선을 특징으로 하는, 방법.
211. 조항 153 내지 196 중 어느 하나에 있어서, 방사원 각각은 적외선 파장 대역 및/또는 자외선 파장 대역 내에 최대 파장 및/또는 평균 파장을 갖는 방사선을 특징으로 하는, 방법.
212. 조항 153 내지 196 중 어느 하나에 있어서, 방사원 중 적어도 하나는 발광 다이오드(LED) 또는 레이저를 포함하는, 방법.
213. 조항 153 내지 196 중 어느 하나에 있어서,
제1 방사원 및 제1 필터는 방사원으로부터 방사선을 필터링하도록 구성되어 있고;
제2 방사원은 방사원을 포함하고, 제2 필터는 방사원으로부터 방사선을 필터링하도록 구성되어 있는, 방법.
214. 조항 153 내지 196 중 어느 하나에 있어서, 제1 방사원의 제1 평균 여기 파장 및 제2 방사원의 제2 평균 여기 파장은 적어도 50 나노미터만큼 또는 적어도 60 나노미터만큼 상이한, 방법.
215. 조항 153 내지 196 중 어느 하나에 있어서, 방사원을 포함하는 필터 휠을 더 포함하는, 방법.
216. 조항 153 내지 196 중 어느 하나에 있어서, 측정은 샘플로부터 방출을 측정하기 위해서 검출기를 사용하는 것을 포함하는, 방법.
217. 조항 216에 있어서, 검출기는 센서 또는 픽셀의 어레이를 포함하는 어레이 센서를 포함하는, 방법.
218. 조항 217에 있어서, 어레이 센서는 전하 결합 소자(CCD) 또는 상보성 금속 산화물 반도체(CMOS)를 포함하는, 방법.
219. 조항 216에 있어서, 방출 스펙트럼 요소는 샘플로부터의 방출을 제1 광학 경로 및 제2 광학 경로를 따라서 분산시키도록 구성된 분산성 광학 요소를 포함하고, 방법은
제1 광학 경로를 따르는 샘플로부터의 방출을 제1 검출기로 안내하고;
제2 광학 경로를 따르는 샘플로부터의 방출을 제2 검출기로 안내하기 위해서 분산성 광학 요소를 사용하는 것을 더 포함하는 방법.
220. 조항 219에 있어서, 제1 검출기는 CCD 검출기 또는 CMOS 검출기 상에 제1 위치를 포함하고, 제2 검출기는 제1 위치로부터 공간적으로 분리된 CCD 검출기 또는 CMOS 검출기 상에 제2 위치를 포함하는, 방법.
221. 조항 220에 있어서, 제1 위치는 픽셀 또는 픽셀의 군을 포함하고, 제2 위치는 상이한 픽셀 또는 픽셀의 군을 포함하는, 방법.
222. 조항 175 내지 221 중 어느 하나에 있어서,
제1 방출 스펙트럼 요소는 제1 스펙트럼 필터를 포함하고;
제2 방출 스펙트럼 요소는 제2 스펙트럼 필터를 포함하고;
측정은 제1 스펙트럼 필터 및 제2 스펙트럼 필터를 샘플과 검출기 사이의 광학 경로를 따라서 순차적으로 배치하는 것을 포함하는, 방법.
223. 조항 148 내지 163 또는 175 내지 222 중 어느 하나에 있어서, 제1 평균 방출 파장 및 제2 평균 방출 파장은 적어도 25 나노미터만큼 상이한, 방법.
224. 조항 175 내지 223 중 어느 하나에 있어서, 방출 스펙트럼 요소를 포함하는 필터 휠을 추가로 포함하고, 샘플을 조명하는 것은 샘플로부터의 방출을 측정하기 위해서 방출 스펙트럼 요소를 샘플과 검출기 사이의 광학 경로를 따라서 순차적으로 배치하기 위해서 필터 휠을 사용하는 것을 포함하는, 방법.
225. 조항 175 내지 224 중 어느 하나에 있어서,
제1 방출 스펙트럼 요소는 제1 방출 파장 대역 내의 방사선을 통과시키도록 구성된 제1 스펙트럼 필터를 포함하고;
제2 방출 스펙트럼 요소는 제1 방출 파장 대역과 중첩하지 않는 제2 방출 파장 대역 내의 방사선을 통과시키도록 구성된 제2 스펙트럼 필터를 포함하는, 방법.
226. 조항 178에 있어서, 제1, 제2 또는 제3 프로브는 소광제 모이어티를 추가로 포함하는, 방법.
227. 조항 175 내지 226 중 어느 하나에 있어서,
제1 방사원의 제1 평균 여기 파장 또는 제2 방사원의 제2 평균 여기 파장과 상이한 제3 평균 여기 파장을 특징으로 하는 제3 방사원을 제공하는 단계;
샘플을 제3 방사원으로부터의 방사선으로 조명하고, 이에 대한 응답으로 제1 방출 스펙트럼 요소 또는 제2 방출 스펙트럼 요소 중 하나 이상을 사용하여 샘플로부터의 방출을 측정하는 단계를 더 포함하고;
표적 분자 중 하나 이상의 양을 결정하는 것은 샘플을 제3 방사원으로부터의 방사선으로 조명한 것에 응답하여 샘플로부터의 측정된 방출(들)에 기초하는, 방법.
228. 조항 227에 있어서, 표적 분자 중 하나 이상의 양을 결정하는 것은 제1 방사원 및/또는 제2 방사원으로부터의 방사선으로 샘플을 조명하는 것에 응답하여 샘플로부터의 측정된 방출 중 하나 이상을 조정하는 것을 포함하는, 방법.
229. 조항 175 내지 228 중 어느 하나에 있어서,
제1 염료는 제1 방출 스펙트럼 시그니처를 특징으로 하고, 제2 염료는 제2 방출 스펙트럼 시그니처를 특징으로 하고, 제3 염료는 제3 방출 스펙트럼 시그니처를 특징으로 하고;
제1 스펙트럼 시그니처는 제1 염료가 방사원 각각에 의해서 개별적으로 조명될 때 방출 파장 대역 각각 내의 방출된 에너지의 양을 포함하고;
제2 스펙트럼 시그니처는 제2 염료가 방사원 각각에 의해서 개별적으로 조명될 때 방출 파장 대역 각각 내의 방출된 에너지의 양을 포함하고;
제3 스펙트럼 시그니처는 제3 염료가 방사원 각각에 의해서 개별적으로 조명될 때 방출 파장 대역 각각 내의 방출된 에너지의 양을 포함하고;
각각의 염료의 스펙트럼 시그니처는 나머지 염료의 스펙트럼 시그니처와 상이한, 방법.
230. 조항 175 내지 229 중 어느 하나에 있어서, 3개의 염료 각각으로부터의 방출의 측정은 제 시간에 순차적으로 일어나는, 방법.
231. 조항 175 내지 230 중 어느 하나에 있어서, 3개의 염료로부터의 방출의 측정은 동시에 일어나는, 방법.
232. 조항 175 내지 231 중 어느 하나에 있어서, 제1 염료는 FAM이고, 제2 염료는 ROX이며, 제3 염료는 FAM-ROX인, 방법.
233. 조항 175 내지 232 중 어느 하나에 있어서, 제2 최대 흡수 파장은 제1 최대 흡수 파장보다 더 큰, 방법.
234. 조항 175 내지 233 중 어느 하나에 있어서, 제2 최대 흡수 파장은 제1 최대 흡수 파장보다 더 작은, 방법.
235. 조항 175 내지 234 중 어느 하나에 있어서, 제2 염료는 에너지 전달 염료 접합체로서, 에너지 전달 염료 접합체는,
제1 염료의 최대 흡수 파장과 동일하거나 실질적으로 동일한 최대 흡수 파장을 특징으로 하고, 제1 방사원으로부터의 방사선을 흡수하여 이에 응답하여 에너지를 생성하도록 구성된 도너 염료; 및
제3 염료의 최대 방출 파장과 동일하거나 실질적으로 동일한 최대 방출 파장을 특징으로 하는 억셉터 염료를 포함하고, 염료는 도너에 의해서 생성된 에너지 중 적어도 일부를 억셉터 염료로 전달하도록 구성된, 방법.
236. 조항 235에 있어서, 제1 염료는 제1 형광단을 포함하고, 도너 염료와 제1 형광단은 동일한, 방법.
237. 조항 235에 있어서, 제3 염료는 제3 형광단을 포함하고, 도너 염료와 제3 형광단은 상이한, 방법.
238. 조항 235에 있어서, 제1 염료는 제1 스펙트럼 시그니처를 특징으로 하고, 제3 염료는 제3 스펙트럼 시그니처를 특징으로 하고, 도너 염료는 도너 염료 스펙트럼 시그니처를 특징으로 하고, (1) 도너 염료 스펙트럼 시그니처는 제3 방출 스펙트럼 시그니처와 동일하고/하거나 (2) 도너 염료의 최대 방출 파장은 제3 염료의 최대 방출 파장과 동일한, 방법.
239. 조항 235에 있어서, 도너 염료는 방출 파장 대역을 갖고, 억셉터 염료는 도너 염료 방출 파장 대역과 중첩하지 않는 흡수 파장 대역을 갖는, 방법.
240. 조항 235에 있어서, 도너 염료는 제1 염료 또는 제3 염료 중 어느 하나와 상이한 화학 구조를 갖는, 방법.
241. 조항 235에 있어서, 제1 염료는 제1 스펙트럼 시그니처를 특징으로 하고, 제3 염료는 제3 스펙트럼 시그니처를 특징으로 하고, 도너 염료는 도너 염료 스펙트럼 시그니처를 특징으로 하고, (1) 도너 염료 스펙트럼 시그니처는 제3 스펙트럼 시그니처와 상이하고/하거나 (2) 도너 염료 최대 방출 파장은 제3 염료의 최대 방출 파장과 상이한, 방법.
242. 조항 235에 있어서, 제1 염료는 제1 스펙트럼 시그니처를 특징으로 하고, 제3 염료는 제3 스펙트럼 시그니처를 특징으로 하고, 도너 염료는 도너 염료 스펙트럼 시그니처를 특징으로 하고, (1) 도너 염료 스펙트럼 시그니처는 제3 스펙트럼 시그니처와 상이하고/하거나 (2) 도너 염료 최대 방출 파장은 제3 염료의 최대 방출 파장과 상이한, 방법.
243. 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR) 검정을 수행하는 방법으로서,
축외 염료 및 축상 염료를 포함하는 생물학적 샘플을 제공하는 단계;
샘플에 대해 qPCR 검정을 수행하는 단계;
qPCR 검정의 제1 주기 동안, 2개 이상의 여기 채널을 사용하여 샘플의 제1 시리즈의 조명을 수행하는 단계;
제1 시리즈의 조명의 각각의 조명에 대한 응답으로, 2개 이상의 방출 채널로부터의 상응하는 제1 시리즈의 방출 신호를 측정하는 단계;
qPCR 검정의 제2 주기 동안, 2개 이상의 여기 채널을 사용하여 샘플의 제2 시리즈의 조명을 수행하는 단계;
제2 시리즈의 조명의 각각의 조명에 대한 응답으로, 2개 이상의 방출 채널로부터의 상응하는 제2 시리즈의 방출 신호를 측정하는 단계;
제1 시리즈의 측정값으로부터의 적어도 하나의 측정값에 기초하여 축외 염료의 양을 계산하는 단계; 및
제2 시리즈의 측정값으로부터의 적어도 하나의 측정값에 기초하여 축상 염료의 양을 계산하는 단계를 포함하는, 방법.
244. 조항 243에 있어서, 제1 시리즈의 측정값으로부터의 적어도 하나의 측정값에 기초하여 제2 시리즈의 측정값 동안 존재하는 축외 염료의 양을 계산하는 단계를 포함하는, 방법.
245. 조항 243에 있어서, 염료 중 적어도 하나의 양을 계산하는 것은 적어도 하나의 염료의 ex-em 공간 시그니처에 적어도 부분적으로 기반하는, 방법.
246. 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR) 검정을 수행하는 방법으로서,
축외 염료 및 축상 염료를 포함하는 생물학적 샘플을 제공하는 단계;
샘플에 대해 qPCR 검정을 수행하는 단계;
qPCR 검정의 제1 주기 동안, 2개 이상의 여기 채널을 사용하여 샘플의 제1 시리즈의 조명을 수행하는 단계;
제1 시리즈의 조명의 각각의 조명에 대한 응답으로, 2개 이상의 방출 채널로부터의 상응하는 제1 시리즈의 방출 신호를 측정하는 단계;
qPCR 검정의 제2 주기 동안, 2개 이상의 여기 채널을 사용하여 샘플의 제2 시리즈의 조명을 수행하는 단계;
제2 시리즈의 조명의 각각의 조명에 대한 응답으로, 2개 이상의 방출 채널로부터의 상응하는 제2 시리즈의 방출 신호를 측정하는 단계;
제1 시리즈의 측정값으로부터의 적어도 하나의 측정값에 기초하여 축상 염료의 양을 계산하는 단계; 및
제2 시리즈의 측정값으로부터의 적어도 하나의 측정값에 기초하여 축외 염료의 양을 계산하는 단계를 포함하는, 방법.
247. 조항 246에 있어서, 제1 시리즈의 측정값으로부터의 적어도 하나의 측정값에 기초하여 제2 시리즈의 측정값 동안 존재하는 축상 염료의 양을 계산하는 단계를 포함하는, 방법.
248. 조항 246에 있어서, 염료 중 적어도 하나의 양을 계산하는 것은 적어도 하나의 염료의 ex-em 공간 시그니처에 적어도 부분적으로 기반하는, 방법.
249. 조항 153 내지 248 중 어느 하나에 있어서, 샘플은 생물학적 샘플인, 방법.
250. 조항 249에 있어서, 생물학적 샘플은 하나 이상의 표적 분자를 포함하는, 방법.
251. 조항 250에 있어서, 하나 이상의 표적 분자는 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는, 방법.
252. 조항 249 내지 251 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 메모리는 측정된 방출에 기초하여 샘플에 존재하는 임의의 표적 분자의 양을 결정하도록 하는 명령어를 포함하는, 방법.
253. 형광-표지된 올리고뉴클레오티드 프로브의 세트를 포함하는 조성물로서, 세트는,
i. 제1 형광단에 공유 부착된 제1 프로브로서, 제1 형광단은 제1 흡수 파장 및 제1 방출 파장을 특징으로 하는, 제1 프로브; 및
ii. 조항 1 내지 17 중 어느 하나의 에너지 전달 염료 접합체에 공유 부착된 제2 프로브를 포함하는, 조성물.
254. 조항 253에 있어서, 접합체의 도너 염료는 제2 흡수 파장을 특징으로 하고, 이에 응답하여 여기 에너지를 방출하는, 조성물.
255. 조항 253에 있어서, 접합체의 억셉터 염료는 도너 염료에 의해서 방출된 여기 에너지를 흡수할 수 있고, 이에 응답하여 제2 방출 파장을 특징으로 하는 방사선을 방출하는, 조성물.
256. 조항 255에 있어서, 제1 흡수 파장과 제2 흡수 파장은 50 나노미터 이상만큼 상이한, 조성물.
257. 조항 255에 있어서, 제1 방출 파장과 제2 방출 파장은 서로 10 나노미터 이내인, 조성물.
258. 조항 255에 있어서,
iii. 제2 형광단에 공유 부착된 제3 프로브로서, 제2 형광단은 제3 흡수 파장 및 제3 방출 파장을 특징으로 하는, 제3 프로브를 추가로 포함하는, 조성물.
259. 조항 258에 있어서, 제1, 제2 및/또는 제3 프로브는 올리고뉴클레오티드 프로브인, 조성물.
260. 조항 258에 있어서, 제1, 제2 및/또는 제3 프로브는 소광제 모이어티를 추가로 포함하는, 조성물.
261. 조항 258에 있어서, 제3 흡수 파장은 제2 흡수 파장과 50 nm 이상만큼 상이한, 조성물.
262. 조항 258에 있어서, 제3 방출 파장은 제2 방출 파장의 20 nm 이내인, 조성물.
263. 조항 258 내지 262 중 어느 하나에 있어서, 제1 형광단 및 제2 형광단은 플루오레세인 염료, 시아닌 염료, 로다민 염료, BODIPY 염료, 피렌 염료, 피로닌 염료 및 쿠마린 염료로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 조성물.
264. 조항 258 내지 263 중 어느 하나에 있어서, 제1 형광단과 도너 염료는 동일한, 조성물.
265. 조항 258 내지 263 중 어느 하나에 있어서, 제2 형광단과 억셉터 염료는 동일한, 조성물.
266. 조항 258 내지 265 중 어느 하나에 있어서,
제1 형광단 및 도너 염료는 플루오레세인 염료 또는 로다민 염료이고;
제2 형광단 및 억셉터 염료는 로다민 염료, 피로닌 염료 또는 시아닌 염료인, 조성물.
267. 조항 258 내지 265 중 어느 하나에 있어서,
제1 형광단 및 도너 염료는 플루오레세인 염료이고;
제2 형광단 및 억셉터 염료는 시아닌 염료 또는 피로닌 염료인, 조성물.
268. 조항 258 내지 265 중 어느 하나에 있어서,
제1 형광단 및 도너 염료는 플루오레세인 염료이고;
제2 형광단 및 억셉터 염료는 로다민 염료인, 조성물.
269. 조항 258 내지 265 중 어느 하나에 있어서,
제1 형광단 및 도너 염료는 로다민 염료이고;
제2 형광단 및 억셉터 염료는 시아닌 또는 피로닌 염료인, 조성물.
270. 형광-표지된 올리고뉴클레오티드 프로브의 세트를 포함하는 조성물로서, 세트는,
i. 제1 형광단에 공유 부착된 제 올리고뉴클레오티드 프로브로서, 제1 형광단은 제1 흡수 파장 및 제1 방출 파장을 특징으로 하는, 제1 올리고뉴클레오티드 프로브; 및
ii. 조항 1 내지 17 중 어느 하나의 에너지 전달 염료 접합체에 공유 부착된 제2 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하고,
a) 도너 염료는 제2 흡수 파장을 특징으로 하고, 이에 응답하여 여기 에너지를 방출하고,
b)억셉터 염료는 도너 염료에 의해 방출된 여기 에너지를 흡수할 수 있고, 이에 응답하여 제2 방출 파장을 특징으로 하는 방사선을 방출하고;
제1 흡수 파장과 제2 흡수 파장은 서로 20 나노미터 이내이고,
제1 방출 파장과 제2 방출 파장은 50 나노미터 초과만큼 상이한, 조성물.
271. 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해서 샘플에서 표적 핵산 분자를 검출 또는 정량화하는 방법으로서,
(i) 하나 이상의 표적 핵산 분자를 포함하는 샘플을, a) 조항 18 내지 36 중 어느 하나의 적어도 1개의 올리고뉴클레오티드 프로브 - 상기 올리고뉴클레오티드 프로브는 표적 핵산 분자에 적어도 부분적으로 상보적인 서열을 갖고, 적어도 1개의 프로브는 하나 이상의 표적 핵산 분자의 증폭 시 형광의 검출 가능한 변화를 거침 -; 및 b) 적어도 1개의 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍과 접촉시키는 단계;
(ii) 하나 이상의 표적 핵산 분자를 증폭시키기에 충분한 조건 하에서 단계 (i)의 혼합물을 DNA 중합효소와 함께 인큐베이션시키는 단계; 및
(iii) 프로브의 형광을 측정함으로써 증폭된 표적 핵산 분자의 존재 또는 부재를 검출하거나 또는 이의 양을 정량화하는 단계를 포함하는, 방법.
272. 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 위한 키트로서,
i. 하나 이상의 완충제, 정제 매질, 유기 용매, 핵산 합성 효소; 및
ii. 조항 18 또는 조항 19의 올리고뉴클레오티드 프로브; 및
iii. PCR 검정을 수행하기 위한 지침서를 포함하는, 키트.
273. 하기를 포함하는 조성물:
a) 조항 1 내지 17 중 어느 하나를 따르는 에너지 전달 염료 접합체를 포함하는 제1 표지된 올리고뉴클레오티드; 및
b) 중합효소.
274. 조항 273에 있어서, 중합효소는 DNA 중합효소인, 조성물.
275. 조항 273에 있어서, 중합효소는 열안정성인, 조성물.
276. 조항 273에 있어서, 역전사효소(RT)를 추가로 포함하는, 조성물.
277. 조항 273에 있어서, 적어도 1개의 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트(dNTP)를 추가로 포함하는, 조성물.
278. 조항 273 내지 277 중 어느 하나에 있어서, 하기 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 조성물:
a) 패시브(passive) 참조 대조군;
b) 글리세롤;
c) 하나 이상의 PCR 저해제 차단제;
d) 우라실 DNA 글리코실라제;
e) 세제;
f) 하나 이상의 염; 및
g) 완충제.
279. 조항 278에 있어서, 하나 이상의 염은 염화마그네슘 및/또는 염화칼륨인, 조성물.
280. 조항 273 내지 279 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 핫 스타트 성분을 추가로 포함하는, 조성물.
281. 조항 280에 있어서, 하나 이상의 핫 스타트 성분은 중합효소에 대한 화학적 변형, 중합효소에 저해성인 올리고뉴클레오티드 및 중합효소에 특이적인 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
282. 조항 273 내지 281 중 어느 하나에 있어서, 하기 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 조성물:
a) 핵산 샘플;
b) 표적 핵산의 증폭에 특이적인 적어도 1개의 프라이머 올리고뉴클레오티드; 또는
c) 증폭된 핵산 산물(즉, 앰플리콘).
283. 조항 282에 있어서, 핵산 샘플은 RNA인, 조성물.
284. 조항 282에 있어서, 핵산 샘플은 DNA인, 조성물.
285. 조항 282에 있어서, 핵산 샘플은 cDNA인, 조성물.
286. 조항 258 내지 271 중 어느 하나에 있어서, 조성물은 조항 1 내지 17 중 어느 하나에 따른 에너지 전달 염료 접합체를 포함하는 제2 표지된 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함하고, 제1 표지된 올리고뉴클레오티드의 에너지 전달 염료 접합체와 제2 표지된 올리고뉴클레오티드의 에너지 전달 염료 접합체는 상이한, 조성물.
287. 조항 258 내지 271 중 어느 하나에 있어서, 제1 표지된 올리고뉴클레오티드 및/또는 제2 표지된 올리고뉴클레오티드는 적어도 1개의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는, 조성물.
288. 조항 287에 있어서, 적어도 1개의 변형된 뉴클레오티드는 잠금 핵산(LNA)을 포함하는, 조성물.
289. 조항 287에 있어서, 적어도 1개의 변형된 뉴클레오티드는 마이너 그루브 결합제(MGB)를 포함하는, 조성물:
조성물은,
a) 조항 273 내지 289 중 어느 하나의 형광 에너지 전달 염료 접합체;
b) 핵산 분자를 포함하고,
조성물은,
a) 조항 273 내지 290 중 어느 하나의 형광 에너지 전달 염료 접합체를 포함하고;
조성물은,
a) 상기 조항 중 어느 하나의 형광 에너지 전달 염료 접합체; 및
b) 에너지 전달 염료 접합체 내의 도너 염료의 여기 파장의 20 nm 이내 또는 에너지 전달 염료 접합체 내의 억셉터 염료의 방출 파장의 20 nm 이내의 여기 파장을 갖는 형광단을 포함함.
조항 59에 있어서, 형광단은 잔텐 염료, 시아닌 염료, BODIPY 염료, 피렌 염료, 피로닌 염료, 및 쿠마린 염료로 이루어진 군으로부터 선택된 염료이거나 이를 포함하는, 조성물.
조항 18 내지 36 중 어느 하나에 있어서, 형광 에너지 전달 염료 접합체는 올리고뉴클레오티드의 5'-단부에 공유 부착되고, 소광제 염료는 올리고뉴클레오티드의 3'-단부에 공유 부착된, 프로브.
조항 18 내지 36 중 어느 하나에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산 분자에 적어도 60% 상보적인, 프로브. 조항 18 내지 36 중 어느 하나에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산 분자에 적어도 90% 상보적인, 프로브.
조항 35 또는 36에 있어서, 꼬리 부분은 보편적인 꼬리 부분인, 프로브.
290. 하기를 포함하는 조성물:
a) 조항 1 내지 17 중 어느 하나의 형광 에너지 전달 염료 접합체; 및
b) 분석물.
291. 조항 290에 있어서, 분석물은 핵산 분자, 단백질 또는 펩티드 및 탄수화물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
292. 조항 290에 있어서, 핵산 분자는 올리고뉴클레오티드인, 조성물.
293. 조항 290에 있어서, 단백질은 항체인, 조성물.
294. 하기를 포함하는 조성물:
a) 조항 1 내지 17 중 어느 하나의 형광 에너지 전달 염료 접합체; 및
b) 효소.
295. 조항 294에 있어서, 효소는 중합효소 및/또는 역전사효소인, 조성물.
296. 샘플에서 표적 핵산 분자를 검출 또는 정량화하는 방법:
(i) 하나 이상의 표적 핵산 분자를 포함하는 샘플을, a) 조항 18 내지 36 중 어느 하나의 적어도 1개의 올리고뉴클레오티드 프로브와 접촉시키는 단계로서, 상기 프로브는 표적 핵산 분자에 적어도 부분적으로 상보적인 서열을 갖는, 단계; 및
(ii) 프로브의 형광을 측정함으로써 표적 핵산 분자의 존재 또는 부재를 검출하거나 또는 이의 양을 정량화하는 단계.
297. 조항 37 내지 252 중 어느 하나에 있어서, 조항 1 내지 17 중 어느 하나의 형광 에너지 전달 염료 접합체를 포함하는, 시스템 또는 방법.
298. 샘플에서 생물학적 분자를 검출하기 위한 키트로서,
i. 조항 18 내지 36 중 어느 하나의 올리고뉴클레오티드 프로브; 및
iii. 생물학적 분자를 검출하기 위한 검정을 수행하기 위한 지침서를 포함하는, 키트.
299. 조항 1 내지 36, 38 내지 54, 56 내지 72, 74 내지 152, 154 내지 163, 165 내지 174, 176 내지 298 중 어느 하나에 있어서, 형광 에너지 전달 염료 접합체는 수용성인, 조성물, 방법, 키트, 또는 시스템.
300. 조항 37 내지 152 중 어느 하나에 있어서, 염료 중 2개 이상 사이의 혼선을 감소시키도록 구성된 교정 플레이트를 더 포함하는, 시스템.
301. 조항 300에 있어서, 교정 플레이트는 4개의 교정 축상 염료 및 2개의 교정 축외 염료를 포함하는, 시스템.
302. 조항 300에 있어서, 교정 플레이트는 2개의 교정 축상 염료 및 4개의 교정 축외 염료를 포함하는, 시스템.
303. 조항 301 또는 302에 있어서, 교정 축외 염료는,
염료 FAM-TAMRA, FAM-ABY, 또는 FAM-NED 중 하나;
염료 FAM-PET, FAM-ROX, FAM-JUN, FAM-Texas Red, 또는 TET-Alexa Fluor 594 중 하나;
염료 ABY-Alexa Fluor 647, NED-Alexa Fluor 647, ABY-Cy5®, ABY-ATTO 647 TM, 또는 ABY-DyLight 650 TM 중 하나; 및/또는
염료 NED-Alexa Fluor 676, NED DyLight 680 TM, NED-Cy5.5®, ABY-Alexa Fluor 676, ABY-DyLight 680 TM, 또는 ABY-Cy5.5® 중 하나 중 하나 이상을 포함하는, 시스템.
304. 조항 301 내지 303 중 어느 하나에 있어서, 교정 축상 염료는 하나 이상의 염료 FAM 또는 VIC를 포함하는, 시스템.
305. 방법으로서,
조항 153 내지 252 또는 271 중 어느 하나의 방법을 수행하기 위한 시스템을 제공하는 단계;
염료 중 2개 이상 사이의 혼선을 감소시키도록 구성된 교정 플레이트를 사용하여 시스템을 교정하는 단계를 포함하는, 방법.
306. 조항 305에 있어서, 교정 플레이트는 4개의 교정 축상 염료 및 2개의 교정 축외 염료를 포함하는, 방법.
307. 조항 305에 있어서, 교정 플레이트는 2개의 교정 축상 염료 및 4개의 교정 축외 염료를 포함하는, 방법.
308. 조항 306 또는 307에 있어서, 교정 축외 염료는,
염료 FAM-TAMRA, FAM-ABY, 또는 FAM-NED 중 하나;
염료 FAM-PET, FAM-ROX, FAM-JUN, FAM-Texas Red, 또는 TET-Alexa Fluor 594 중 하나;
염료 ABY-Alexa Fluor 647, NED-Alexa Fluor 647, ABY-Cy5®, ABY-ATTO 647 TM, 또는 ABY-DyLight 650 TM 중 하나; 및/또는
염료 NED-Alexa Fluor 676, NED DyLight 680 TM, NED-Cy5.5®, ABY-Alexa Fluor 676, ABY-DyLight 680 TM, 또는 ABY-Cy5.5® 중 하나 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
309. 조항 305 내지 308 중 어느 하나에 있어서, 교정 축상 염료는 하나 이상의 염료 FAM 또는 VIC를 포함하는, 방법.
310. 시스템으로서, 2개 이상 염료 사이의 혼선을 감소시키도록 구성된 교정 플레이트를 포함하되, 교정 플레이트는,
4개의 교정 축상 염료 및 2개의 교정 축외 염료; 또는
2개의 교정 축상 염료 및 4개의 교정 축외 염료를 포함하는, 시스템.
311. 조항 310에 있어서, 교정 축외 염료는,
염료 FAM-TAMRA, FAM-ABY, 또는 FAM-NED 중 하나;
염료 FAM-PET, FAM-ROX, FAM-JUN, FAM-Texas Red, 또는 TET-Alexa Fluor 594 중 하나;
염료 ABY-Alexa Fluor 647, NED-Alexa Fluor 647, ABY-Cy5®, ABY-ATTO 647 TM, 또는 ABY-DyLight 650 TM 중 하나; 및/또는
염료 NED-Alexa Fluor 676, NED DyLight 680 TM, NED-Cy5.5®, ABY-Alexa Fluor 676, ABY-DyLight 680 TM, 또는 ABY-Cy5.5® 중 하나 중 하나 이상을 포함하는, 시스템.
312. 조항 310 또는 311에 있어서, 교정 축상 염료는 하나 이상의 염료 FAM 또는 VIC를 포함하는, 시스템.
313. 방법으로서,
조항 153 내지 252 또는 271의 방법을 수행하기 위한 시스템을 제공하는 단계;
염료 중 2개 이상 사이의 혼선을 감소시키도록 구성된 교정 플레이트를 사용하여 시스템을 교정하는 단계를 포함하는, 방법.
314. 조항 313에 있어서, 교정 축외 염료는,
염료 FAM-TAMRA, FAM-ABY, 또는 FAM-NED 중 하나;
염료 FAM-PET, FAM-ROX, FAM-JUN, FAM-Texas Red, 또는 TET-Alexa Fluor 594 중 하나;
염료 ABY-Alexa Fluor 647, NED-Alexa Fluor 647, ABY-Cy5®, ABY-ATTO 647 TM, 또는 ABY-DyLight 650 TM 중 하나; 및/또는
염료 NED-Alexa Fluor 676, NED DyLight 680 TM, NED-Cy5.5®, ABY-Alexa Fluor 676, ABY-DyLight 680 TM, 또는 ABY-Cy5.5® 중 하나 중 하나 이상을 포함하는, 시스템.
315. 조항 301 내지 303 중 어느 하나에 있어서, 교정 축상 염료는 하나 이상의 염료 FAM 또는 VIC를 포함하는, 시스템.
316. 증폭 검정을 수행하는 방법으로서,
복수의 표적 분자를 포함하는 생물학적 샘플, 복수의 표적 분자 중 각각의 하나 이상에 결합하도록 구성된 하나 이상의 축외 염료, 및 복수의 표적 분자 중 각각의 하나 이상에 결합하도록 구성된 하나 이상의 축상 염료를 제공하는 단계;
샘플에서 적어도 1회의 증폭 주기를 수행하는 단계;
적어도 1회의 증폭 주기 동안 또는 증폭 주기 후에, 샘플을 2개 이상의 여기 채널로 조명하는 단계;
조명 각각에 대한 응답으로, 2개 이상의 방출 채널로부터의 방출 신호를 측정하는 단계;
방출 신호에 기초하여 축상 염료 및 축외 염료의 양을 계산하는 단계를 포함하는, 방법.
317. 조항 316에 있어서, 방출 신호에 기초하여 표적 분자 중 하나 이상의 양을 계산하는 단계를 더 포함하는, 방법.
318. 조항 316 또는 317에 있어서, 증폭 검정은 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR) 검정을 포함하는, 방법.
319. 조항 316 또는 317에 있어서, 생물학적 샘플은 복수의 반응 영역으로 분리되고, 증폭 검정은 반응 영역 중 적어도 일부에 대한 디지털 중합효소 연쇄 반응(dPCR) 검정을 포함하는, 방법.
320. 조항 316, 317 및 319 중 어느 하나에 있어서, 반응 영역의 수는 3,000개 이상의 반응 영역인, 방법.
321. 조항 316, 317 및 319 중 어느 하나에 있어서, 반응 영역의 수는 20,000개 이상의 반응 영역인, 방법.
322. 조항 316, 317 및 319 중 어느 하나에 있어서, 반응 영역의 수는 100,000개 이상의 반응 영역인, 방법.
323. 조항 316, 317 및 319 중 어느 하나에 있어서, 반응 영역의 수는 1,000,000개 이상의 반응 영역인, 방법.
324. 조항 316, 317 및 319 내지 323 중 어느 하나에 있어서, 반응 영역 중 적어도 일부는 표적 분자 중 어느 것도 함유하지 않는, 방법.
325. 조항 316, 317 및 319 내지 324 중 어느 하나에 있어서, 반응 영역 중 적어도 일부는 단지 하나의 표적 분자를 함유하는, 방법.
326. 조항 316, 317 및 319 내지 325 중 어느 하나에 있어서, 생물학적 샘플은 적어도 3개의 표적 분자를 포함하는, 방법.
327. 조항 316, 317, 및 319 내지 326 중 어느 하나에 있어서, 반응 영역 중 적어도 일부는 1개 초과의 표적 분자 및 적어도 3개 모두 미만의 표적 분자를 함유하는, 방법.
328. 조항 316 내지 327 중 어느 하나에 있어서, 제1 염료는 제1 형광단이거나 이를 포함하고, 제2 염료는 조항 1 내지 17 중 어느 하나를 따르는 형광 에너지 전달 염료 접합체이거나 이를 포함하는, 방법.
329. 조항 316 내지 328 중 어느 하나에 있어서, 제1 형광단은 잔텐 염료, 시아닌 염료, BODIPY 염료, 피렌 염료, 피로닌 염료, 및 쿠마린 염료로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
330. 조항 316 내지 329 중 어느 하나에 있어서, 제2 염료는 플루오레세인 염료, 로다민 염료, 피로닌 염료, 및 시아닌 염료로 이루어진 군으로부터 선택된 형광단을 포함하는, 방법.
331. 조항 316 내지 330 중 어느 하나에 있어서, 제1 염료는 제1 프로브에 공유 부착되고, 제2 염료는 제2 프로브에 공유 부착되고, 제1 프로브 및 제2 프로브는 각각 제1 표적 분자 및 제2 표적 분자에 결합하도록 구성된, 방법.
332. 조항 331에 있어서, 제1 및 제2 프로브는 올리고뉴클레오티드 프로브이고, 제2 프로브는 조항 18 내지 36 중 어느 하나에 따르는, 방법.
333. 조항 316 내지 332 중 어느 하나에 있어서, 제1 표적 분자 및 제2 표적 분자는 핵산 분자인, 방법.
334. 조항 316 내지 333 중 어느 하나에 있어서, 제1 염료는 제2 염료의 최대 흡수 파장과 동일하거나 실질적으로 동일한 최대 흡수 파장을 포함하는, 방법.
335. 조항 334에 있어서, 제1 최대 흡수 파장 또는 제2 최대 흡수 파장 중 하나 이상은 각각의 스펙트럼 전체에 걸친 절대 최대값인, 방법.
336. 조항 316 내지 335 중 어느 하나에 있어서, 제1 염료는 축상 염료이고, 제2 염료는 축외 염료인, 방법.
337. 조항 316 내지 336 중 어느 하나에 있어서, 제1 염료는 제1 표적 분자에 결합하도록 구성되고, 제2 염료는 제2 표적 분자에 결합하도록 구성되고, 방법은 측정된 방출에 기초하여 샘플에 존재하는 임의의 표적 분자의 양을 결정하는 단계를 더 포함하는, 방법.
338. 방법으로서,
조항 316 내지 337 중 어느 하나의 방법을 수행하기 위한 시스템을 제공하는 단계;
염료 중 2개 이상 사이의 혼선을 감소시키도록 구성된 교정 플레이트를 사용하여 시스템을 교정하는 단계를 포함하는, 방법.
339. 조항 338에 있어서, 교정 플레이트는 4개의 교정 축상 염료 및 2개의 교정 축외 염료를 포함하는, 방법.
340. 조항 338에 있어서, 교정 플레이트는 2개의 교정 축상 염료 및 4개의 교정 축외 염료를 포함하는, 방법.
341. 조항 339 또는 340에 있어서, 교정 축외 염료는,
염료 FAM-TAMRA, FAM-ABY, 또는 FAM-NED 중 하나;
염료 FAM-PET, FAM-ROX, FAM-JUN, FAM-Texas Red, 또는 TET-Alexa Fluor 594 중 하나;
염료 ABY-Alexa Fluor 647, NED-Alexa Fluor 647, ABY-Cy5®, ABY-ATTO 647 TM, 또는 ABY-DyLight 650 TM 중 하나; 및/또는
염료 NED-Alexa Fluor 676, NED DyLight 680 TM, NED-Cy5.5®, ABY-Alexa Fluor 676, ABY-DyLight 680 TM, 또는 ABY-Cy5.5® 중 하나 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
342. 조항 338 내지 341 중 어느 하나에 있어서, 교정 축상 염료는 하나 이상의 염료 FAM 또는 VIC를 포함하는, 방법.
Claims (41)
- 시스템으로서,
제1 평균 여기 파장을 특징으로 하는 제1 방사원(radiant source);
상기 제1 평균 여기 파장과 상이한 제2 평균 여기 파장을 특징으로 하는 제2 방사원;
상기 방사원으로부터 방사선을 수신하도록 배치된 샘플로서:
제1 염료;
제2 염료; 및
제3 염료를 포함하는, 상기 샘플;
상기 샘플로부터의 방출을 측정하도록 구성된 검출기;
제1 평균 방출 파장을 특징으로 하는 제1 방출 스펙트럼 요소;
상기 제1 평균 방출 파장과 상이한 제2 평균 방출 파장을 특징으로 하는 제2 방출 스펙트럼 요소;
적어도 하나의 프로세서로서:
상기 제1 방사원으로 상기 샘플을 조명하고, 이에 대한 응답으로, (1) 상기 검출기 및 상기 제1 방출 스펙트럼 요소를 사용하여 상기 샘플로부터의 방출을 측정하고, (2) 상기 검출기 및 상기 제2 방출 스펙트럼 요소를 사용하여 상기 샘플로부터의 방출을 측정하고;
상기 샘플을 상기 제2 방사원으로 조명하고, 이에 대한 응답으로, 상기 검출기 및 상기 제2 방출 스펙트럼 요소를 사용하여 상기 샘플로부터의 방출을 측정하도록 하는 명령어를 포함하는 적어도 하나의 메모리를 포함하는, 상기 적어도 하나의 프로세서를 포함하며;
(1) 상기 제1 염료는 제1 최대 흡수 파장을 포함하는 제1 흡수 스펙트럼을 포함하고, 상기 제2 염료는 상기 제1 최대 흡수 파장과 동일하거나 실질적으로 동일한 제2 최대 흡수 파장을 포함하는 제2 흡수 스펙트럼을 포함하고, (2) 상기 제2 염료는 제2 최대 방출 파장을 포함하는 제2 방출 스펙트럼을 포함하고, 상기 제3 염료는 상기 제2 최대 방출 파장과 동일하거나 실질적으로 동일한 제3 최대 방출 파장을 포함하는 제3 방출 스펙트럼을 포함하는, 시스템. - 제1항에 있어서, 상기 제1 염료는 제1 최대 방출 파장을 포함하는 제1 방출 스펙트럼을 포함하고, 상기 제2 염료는 상기 제1 최대 방출 파장과 동일하거나 실질적으로 동일한 제2 최대 방출 파장을 포함하는 제2 방출 스펙트럼을 포함하는, 시스템.
- 제1항에 있어서, 상기 염료 중 적어도 하나는 축외(off-axis) 염료인, 시스템.
- 제1항에 있어서,
상기 제1 방사원의 평균 여기 파장은 480 ±5 나노미터이고/이거나 상기 제1 방사원은 상기 평균 여기 파장에 대해 ±12 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고, 상기 제1 방출 스펙트럼 요소의 제1 평균 방출 파장은 520 ±5 나노미터이고/이거나 상기 제1 방출 스펙트럼 요소는 상기 제1 평균 방출 파장에 대해 ±20 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고, 상기 제2 방출 스펙트럼 요소의 제2 평균 방출 파장은 587 ±5 나노미터이고/이거나 상기 제2 방출 스펙트럼 요소는 상기 제2 평균 방출 파장에 대해 ±12 나노미터 이하인 파장 대역 을 특징으로 하거나;
상기 제1 방사원의 평균 여기 파장은 480 ±5 나노미터이고/이거나 상기 제1 방사원은 상기 평균 여기 파장에 대해 ±12 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고, 상기 제1 방출 스펙트럼 요소의 제1 평균 방출 파장은 520 ±5 나노미터이고/이거나 상기 제1 방출 스펙트럼 요소는 상기 제1 평균 방출 파장에 대해 ±18 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고, 상기 제2 방출 스펙트럼 요소의 제2 평균 방출 파장은 623 ±5 나노미터이고/이거나 상기 제2 방출 스펙트럼 요소는 상기 제2 평균 방출 파장에 대해 ±18 나노미터 이하인 방출 대역을 특징으로 하거나;
상기 제1 방사원의 제1 평균 여기 파장은 550 ±5 나노미터이고/이거나 상기 제1 방사원은 상기 제1 평균 여기 파장에 대해 ±14 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고, 상기 제2 방사원의 제2 평균 여기 파장은 640 ±5 나노미터이고/이거나 상기 제2 방사원은 상기 제2 평균 여기 파장에 대해 ±12 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고, 상기 제1 방출 스펙트럼 요소의 평균 방출 파장은 682 ±5 나노미터이고/이거나 상기 제2 방출 스펙트럼 요소는 상기 평균 방출 파장에 대해 ±16 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하거나;
또는
상기 제1 방사원의 제1 평균 여기 파장은 550 ±5 나노미터이고/이거나 상기 제1 방사원은 상기 제1 평균 여기 파장에 대해 ±14 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고, 상기 제2 방사원의 제2 평균 여기 파장은 662 ±5 나노미터이고/이거나 상기 제2 방사원은 상기 제2 평균 여기 파장에 대해 ±12 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하고; 상기 제1 방출 스펙트럼 요소의 평균 방출 파장은 711 ±5 나노미터이고/이거나 상기 제2 방출 스펙트럼 요소는 상기 평균 방출 파장에 대해 ±16 나노미터 이하인 파장 대역을 특징으로 하는, 시스템.
- 제1항에 있어서,
상기 시스템은 제4, 제5, 및 제6 방사원을 더 포함하고, 제4, 제5, 및 제6 방사원 각각은 각각의 제4, 제5, 및 제6 평균 여기 파장을 특징으로 하고, 6개의 평균 여기 파장 각각은 나머지 평균 여기 파장과 상이하고;
상기 샘플은 제4, 제5, 제6, 제7, 및 제8 염료를 더 포함하고;
상기 시스템은 상기 샘플로부터의 방출을 통과시키도록 각각 구성된 제3, 제4, 제5, 및 제6 방출 스펙트럼 요소를 더 포함하고, 제3, 제4, 제5, 및 제6 방출 요소 각각은 각각의 제3, 제4, 제5, 및 제6 평균 방출 파장을 특징으로 하며, 파장 공급원 각각의 6개의 평균 방출 파장 각각은 나머지 공급원의 평균 방출 파장과 상이하고;
상기 적어도 하나의 메모리는
상기 샘플을 제3, 제4, 제5, 및 제6 방사원으로 조명하고;
상기 샘플을 제3, 제4, 제5, 및 제6 방사원 각각으로 조명한 것에 응답하여, 상기 방출 스펙트럼 요소 중 하나 이상을 사용하여 상기 샘플로부터 방출을 측정하도록 하는 명령어를 포함하는, 시스템. - 제5항에 있어서, 상기 제2 염료 및 상기 제4 염료는 축외 염료인, 시스템.
- 제5항에 있어서,
상기 제2 염료는 상기 제1 염료의 최대 흡수 파장과 동일하거나 실질적으로 동일한 최대 흡수 파장을 포함하고;
상기 제4 염료는 상기 제1 염료의 최대 흡수 파장과 동일하거나 실질적으로 동일한 최대 흡수 파장을 포함하고;
상기 제2 염료는 상기 제3 염료의 최대 방출 파장과 동일하거나 실질적으로 동일한 최대 방출 파장을 포함하고;
상기 제4 염료는 상기 제5 염료의 최대 방출 파장과 동일하거나 실질적으로 동일한 최대 방출 파장을 포함하는, 시스템. - 제1항에 있어서, 상기 방출 스펙트럼 요소는 상기 샘플로부터의 방출을 제1 광학 경로 및 제2 광학 경로를 따라서 분산시키도록 구성된 분산성 광학 요소를 포함하고, 상기 검출기는 상기 제1 광학 경로를 따르는 방출을 수신하도록 구성된 제1 검출기 및 상기 제2 광학 경로를 따르는 방출을 수신하도록 구성된 제2 검출기를 포함하고, 선택적으로 상기 제1 검출기는 CCD 검출기 또는 CMOS 검출기 상에 제1 위치를 포함하고, 상기 제2 검출기는 CCD 검출기 또는 CMOS 검출기 상에 제1 위치로부터 공간적으로 분리된 제2 위치를 포함하는, 시스템.
- 제1항에 있어서, 표적 분자 중 하나 이상의 양을 결정하는 것을 포함하고, 상기 제1 방사원 및/또는 상기 제2 방사원으로부터의 방사선으로 상기 샘플을 조명하는 것에 응답하여 상기 샘플로부터의 상기 측정된 방출 중 하나 이상을 조정하는 것을 포함하는, 시스템.
- 제1항에 있어서, 상기 제2 염료는 에너지 전달 염료 접합체로서, 상기 에너지 전달 염료 접합체는,
상기 제1 염료의 최대 흡수 파장과 동일하거나 실질적으로 동일한 최대 흡수 파장을 특징으로 하고, 상기 제1 방사원으로부터의 방사선을 흡수하여 이에 응답하여 에너지를 생성하도록 구성된 도너 염료(donor dye); 및
상기 제3 염료의 최대 방출 파장과 동일하거나 실질적으로 동일한 최대 방출 파장을 특징으로 하는 억셉터 염료(acceptor dye)를 포함하고, 상기 염료는 도너에 의해서 생성된 에너지 중 적어도 일부를 상기 억셉터 염료로 전달하도록 구성된, 시스템. - 제10항에 있어서, 상기 제1 염료는 제1 스펙트럼 시그니처(signature)를 특징으로 하고, 상기 제3 염료는 제3 스펙트럼 시그니처를 특징으로 하고, 상기 도너 염료는 도너 염료 스펙트럼 시그니처를 특징으로 하고, (1) 상기 도너 염료 스펙트럼 시그니처는 상기 제3 방출 스펙트럼 시그니처와 동일하고/하거나 (2) 상기 도너 염료의 최대 방출 파장은 상기 제3 염료의 최대 방출 파장과 동일한, 시스템.
- 제10항에 있어서, 상기 도너 염료는 방출 파장 대역을 갖고, 상기 억셉터 염료는 도너 염료 방출 파장 대역과 중첩하지 않는 흡수 파장 대역을 갖는, 시스템.
- 방법으로서,
제1, 제2 및 제3 표적 분자에 결합하도록 구성된 제1 염료, 제2 염료, 및 제3 염료를 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
상기 샘플을 제1 평균 여기 파장을 특징으로 하는 제1 방사원으로 조명하고, 이에 대한 응답으로, (1) 검출기 및 제1 평균 방출 파장을 특징으로 하는 제1 방출 스펙트럼 요소를 사용하여 상기 샘플로부터의 방출을 측정하고, (2) 상기 검출기 및 상기 제1 평균 방출 파장과 상이한 제2 평균 방출 파장을 특징으로 하는 제2 방출 스펙트럼 요소를 사용하여 상기 샘플로부터의 방출을 측정하는 단계;
상기 샘플을 상기 제1 평균 여기 파장과 상이한 제2 평균 여기 파장을 특징으로 하는 제2 방사원으로 조명하고, 이에 대한 응답으로, 상기 검출기 및 상기 제2 방출 스펙트럼 요소를 사용하여 상기 샘플로부터의 방출을 측정하는 단계를 포함하는, 방법. - 제13항에 있어서, (1) 상기 제1 염료는 제1 최대 흡수 파장을 포함하는 제1 흡수 스펙트럼을 포함하고, 상기 제2 염료는 상기 제1 최대 흡수 파장과 동일하거나 실질적으로 동일한 제2 최대 흡수 파장을 포함하는 제2 흡수 스펙트럼을 포함하고, (2) 상기 제2 염료는 제2 최대 방출 파장을 포함하는 제2 방출 스펙트럼을 포함하고, 상기 제3 염료는 상기 제2 최대 방출 파장과 동일하거나 실질적으로 동일한 제3 최대 방출 파장을 포함하는 제3 방출 스펙트럼을 포함하는, 방법.
- 제1항에 있어서, 복수의 온도 주기를 통해 용액을 순환시키는 것을 포함하는 PCR 검정을 수행하는 단계 및 온도 주기 중 하나 이상 이후에 적어도 1개의 염료의 방출을 측정하는 단계를 포함하는, 방법.
- 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR) 검정을 수행하는 방법으로서,
축외 염료 및 축상(on-axis) 염료를 포함하는 생물학적 샘플을 제공하는 단계;
상기 샘플에 대해 qPCR 검정을 수행하는 단계;
상기 qPCR 검정의 제1 주기 동안, 2개 이상의 여기 채널을 사용하여 상기 샘플의 제1 시리즈의 조명을 수행하는 단계;
상기 제1 시리즈의 조명의 각각의 조명에 대한 응답으로, 2개 이상의 방출 채널로부터의 상응하는 제1 시리즈의 방출 신호를 측정하는 단계;
상기 qPCR 검정의 제2 주기 동안, 상기 2개 이상의 여기 채널을 사용하여 상기 샘플의 제2 시리즈의 조명을 수행하는 단계;
상기 제2 시리즈의 조명의 각각의 조명에 대한 응답으로, 상기 2개 이상의 방출 채널로부터의 상응하는 제2 시리즈의 방출 신호를 측정하는 단계;
상기 제1 시리즈의 측정값으로부터의 적어도 하나의 측정값에 기초하여 상기 축외 염료의 양을 계산하는 단계; 및
상기 제2 시리즈의 측정값으로부터의 적어도 하나의 측정값에 기초하여 상기 축상 염료의 양을 계산하는 단계를 포함하는, 방법. - 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR) 검정을 수행하는 방법으로서,
축외 염료 및 축상 염료를 포함하는 생물학적 샘플을 제공하는 단계;
상기 샘플에 대해 qPCR 검정을 수행하는 단계;
상기 qPCR 검정의 제1 주기 동안, 2개 이상의 여기 채널을 사용하여 상기 샘플의 제1 시리즈의 조명을 수행하는 단계;
상기 제1 시리즈의 조명의 각각의 조명에 대한 응답으로, 2개 이상의 방출 채널로부터의 상응하는 제1 시리즈의 방출 신호를 측정하는 단계;
상기 qPCR 검정의 제2 주기 동안, 상기 2개 이상의 여기 채널을 사용하여 상기 샘플의 제2 시리즈의 조명을 수행하는 단계;
상기 제2 시리즈의 조명의 각각의 조명에 대한 응답으로, 상기 2개 이상의 방출 채널로부터의 상응하는 제2 시리즈의 방출 신호를 측정하는 단계;
상기 제1 시리즈의 측정값으로부터의 적어도 하나의 측정값에 기초하여 상기 축상 염료의 양을 계산하는 단계; 및
상기 제2 시리즈의 측정값으로부터의 적어도 하나의 측정값에 기초하여 상기 축외 염료의 양을 계산하는 단계를 포함하는, 방법. - 형광 에너지 전달 염료 접합체로서,
i. 제1 파장에서 광을 흡수하고, 이에 반응하여 여기 에너지를 방출할 수 있는 도너 염료;
ii. 상기 도너 염료에 의해서 방출된 여기 에너지를 흡수하고, 이에 반응하여 제2 파장에서 광을 방출할 수 있는 억셉터 염료(acceptor dye); 및
iii. 상기 도너 염료를 상기 억셉터 염료에 공유 부착하는 링커를 포함하되, 상기 링커는 알킬 부분, 아미노-알킬 부분, 옥시-알킬렌 부분, 아미노-알킬렌-디알콕시 부분, 알케닐렌 부분, 알키닐렌 부분, 폴리에테르 부분, 아릴렌 부분, 아미드 부분, 또는 포스포디에스테르 부분 중 하나 이상을 포함하는, 형광 에너지 전달 염료 접합체. - 형광-표지된 올리고뉴클레오티드 프로브의 세트를 포함하는 조성물로서, 상기 세트는,
i. 제1 형광단에 공유 부착된 제1 프로브로서, 상기 제1 형광단은 제1 흡수 파장 및 제1 방출 파장을 특징으로 하는, 상기 제1 프로브; 및
ii. 제18항의 에너지 전달 염료 접합체에 공유 부착된 제2 프로브를 포함하는, 조성물. - 하기를 포함하는 올리고뉴클레오티드 프로브:
i. 올리고뉴클레오티드; 및
ii. 상기 올리고뉴클레오티드에 공유 부착된 제18항에 따른 형광 에너지 전달 염료 접합체. - 시스템으로서,
평균 여기 파장을 특징으로 하는 방사원;
상기 방사원으로부터 방사선을 수신하도록 배치된 샘플로서:
제1 염료;
제2 염료를 포함하는, 상기 샘플; 및
상기 샘플로부터의 방출을 측정하도록 구성된 검출기;
제1 평균 방출 파장을 특징으로 하는 제1 방출 스펙트럼 요소;
상기 제1 평균 방출 파장과 상이한 제2 평균 방출 파장을 특징으로 하는 제2 방출 스펙트럼 요소;
적어도 하나의 프로세서로서,
상기 방사원으로 상기 샘플을 조명하고, 이에 대한 응답으로, (1) 상기 검출기 및 상기 제1 방출 스펙트럼 요소를 사용하여 상기 샘플로부터의 방출을 측정하고, (2) 상기 검출기 및 상기 제2 방출 스펙트럼 요소를 사용하여 상기 샘플로부터의 방출을 측정하도록 하는 명령어를 포함하는 적어도 하나의 메모리를 포함하는, 상기 적어도 하나의 프로세서를 포함하는, 시스템. - 시스템으로서,
제1 평균 여기 파장을 특징으로 하는 제1 방사원;
상기 제1 평균 여기 파장과 상이한 제2 평균 여기 파장을 특징으로 하는 제2 방사원;
상기 방사원으로부터 방사선을 수신하도록 배치된 샘플로서:
제1 염료;
제2 염료를 포함하는, 상기 샘플; 및
상기 샘플로부터의 방출을 측정하도록 구성된 검출기;
평균 방출 파장을 특징으로 하는 방출 스펙트럼 요소;
적어도 하나의 프로세서로서,
상기 샘플을 상기 제1 방사원으로 조명하고, 이에 대한 응답으로, 상기 검출기 및 상기 방출 스펙트럼 요소를 사용하여 상기 샘플로부터의 방출을 측정하고;
상기 샘플을 상기 제2 방사원으로 조명하고, 이에 대한 응답으로, 상기 검출기 및 상기 방출 스펙트럼 요소를 사용하여 상기 샘플로부터의 방출을 측정하도록 하는 명령어를 포함하는 적어도 하나의 메모리를 포함하는, 상기 적어도 하나의 프로세서를 포함하는, 시스템. - 시스템으로서,
제1 평균 여기 파장을 특징으로 하는 제1 방사원;
상기 제1 평균 여기 파장과 상이한 제2 평균 여기 파장을 특징으로 하는 제2 방사원;
상기 방사원으로부터 방사선을 수신하도록 배치된 샘플로서:
제1 염료;
제2 염료; 및
제3 염료를 포함하는, 상기 샘플;
상기 샘플로부터의 방출을 측정하도록 구성된 검출기;
제1 평균 방출 파장을 특징으로 하는 제1 방출 스펙트럼 요소;
상기 제1 평균 방출 파장과 상이한 제2 평균 방출 파장을 특징으로 하는 제2 방출 스펙트럼 요소;
적어도 하나의 프로세서로서,
상기 제1 방사원으로 상기 샘플을 조명하고, 이에 대한 응답으로, (1) 상기 검출기 및 상기 제1 방출 스펙트럼 요소를 사용하여 상기 샘플로부터의 방출을 측정하고, (2) 상기 검출기 및 상기 제2 방출 스펙트럼 요소를 사용하여 상기 샘플로부터의 방출을 측정하고;
상기 샘플을 상기 제2 방사원으로 조명하고, 이에 대한 응답으로, 상기 검출기 및 상기 제2 방출 스펙트럼 요소를 사용하여 상기 샘플로부터의 방출을 측정하도록 하는 명령어를 포함하는 적어도 하나의 메모리를 포함하는, 상기 적어도 하나의 프로세서를 포함하는, 시스템. - 방법으로서,
제1 염료 및 제2 염료를 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
상기 샘플을 방사원으로 조명하고, 이에 대한 응답으로, 검출기 및 제1 평균 방출 파장을 특징으로 하는 제1 방출 스펙트럼 요소를 사용하여 상기 샘플로부터의 방출을 측정하고, 검출기 및 상기 제1 평균 방출 파장과 상이한 제2 평균 방출 파장을 특징으로 하는 제2 방출 스펙트럼 요소를 사용하여 상기 샘플로부터의 방출을 측정하는 단계를 포함하는, 방법. - 방법으로서,
제1 염료 및 제2 염료를 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
상기 샘플에 대해 증폭 검정을 수행하는 단계;
상기 샘플을 제1 평균 여기 파장을 특징으로 하는 제1 방사원으로 조명하고, 이에 대한 응답으로, 검출기 및 제1 평균 방출 파장을 특징으로 하는 제1 방출 스펙트럼 요소를 사용하여 상기 샘플로부터의 방출을 측정하는 단계; 및
상기 샘플을 상기 제1 평균 여기 파장과 상이한 제2 평균 여기 파장을 특징으로 하는 제2 방사원으로 조명하고, 이에 대한 응답으로, 상기 검출기 및 상기 제2 방출 스펙트럼 요소를 사용하여 상기 샘플로부터의 방출을 측정하는 단계를 포함하는, 방법. - 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR) 검정을 수행하는 방법으로서,
축외 염료 및 축상 염료를 포함하는 생물학적 샘플을 제공하는 단계;
상기 샘플에 대해 qPCR 검정을 수행하는 단계;
상기 qPCR 검정의 제1 주기 동안, 2개 이상의 여기 채널을 사용하여 샘플의 제1 시리즈의 조명을 수행하는 단계;
상기 제1 시리즈의 조명의 각각의 조명에 대한 응답으로, 2개 이상의 방출 채널로부터의 상응하는 제1 시리즈의 방출 신호를 측정하는 단계;
상기 qPCR 검정의 제2 주기 동안, 상기 2개 이상의 여기 채널을 사용하여 상기 샘플의 제2 시리즈의 조명을 수행하는 단계;
상기 제2 시리즈의 조명의 각각의 조명에 대한 응답으로, 상기 2개 이상의 방출 채널로부터의 상응하는 제2 시리즈의 방출 신호를 측정하는 단계;
상기 제1 시리즈의 측정값으로부터의 적어도 하나의 측정값에 기초하여 축외 염료의 양을 계산하는 단계; 및
상기 제2 시리즈의 측정값으로부터의 적어도 하나의 측정값에 기초하여 축상 염료의 양을 계산하는 단계를 포함하는, 방법. - 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR) 검정을 수행하는 방법으로서,
축외 염료 및 축상 염료를 포함하는 생물학적 샘플을 제공하는 단계;
상기 샘플에 대해 qPCR 검정을 수행하는 단계;
상기 qPCR 검정의 제1 주기 동안, 2개 이상의 여기 채널을 사용하여 상기 샘플의 제1 시리즈의 조명을 수행하는 단계;
상기 제1 시리즈의 조명의 각각의 조명에 대한 응답으로, 2개 이상의 방출 채널로부터의 상응하는 제1 시리즈의 방출 신호를 측정하는 단계;
상기 qPCR 검정의 제2 주기 동안, 상기 2개 이상의 여기 채널을 사용하여 상기 샘플의 제2 시리즈의 조명을 수행하는 단계;
상기 제2 시리즈의 조명의 각각의 조명에 대한 응답으로, 상기 2개 이상의 방출 채널로부터의 상응하는 제2 시리즈의 방출 신호를 측정하는 단계;
상기 제1 시리즈의 측정값으로부터의 적어도 하나의 측정값에 기초하여 상기 축상 염료의 양을 계산하는 단계; 및
상기 제2 시리즈의 측정값으로부터의 적어도 하나의 측정값에 기초하여 상기 축외 염료의 양을 계산하는 단계를 포함하는, 방법. - 형광-표지된 올리고뉴클레오티드 프로브의 세트를 포함하는 조성물로서, 상기 세트는,
i. 제1 형광단에 공유 부착된 제 올리고뉴클레오티드 프로브로서, 상기 제1 형광단은 제1 흡수 파장 및 제1 방출 파장을 특징으로 하는, 상기 제1 올리고뉴클레오티드 프로브; 및
ii. 제18항의 에너지 전달 염료 접합체에 공유 부착된 제2 프로브를 포함하고,
a) 도너 염료는 제2 흡수 파장을 특징으로 하고, 이에 응답하여 여기 에너지를 방출하고,
b) 억셉터 염료는 상기 도너 염료에 의해 방출된 상기 여기 에너지를 흡수할 수 있고, 이에 응답하여 제2 방출 파장을 특징으로 하는 방사선을 방출하고;
상기 제1 흡수 파장과 상기 제2 흡수 파장은 서로 20 나노미터 이내이고,
상기 제1 방출 파장과 상기 제2 방출 파장은 50 나노미터 초과만큼 상이한, 조성물. - 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해서 샘플에서 표적 핵산 분자를 검출 또는 정량화하는 방법으로서,
(i) 하나 이상의 표적 핵산 분자를 포함하는 상기 샘플을, a) 제20항의 적어도 1개의 올리고뉴클레오티드 프로브 - 상기 올리고뉴클레오티드 프로브는 상기 표적 핵산 분자에 적어도 부분적으로 상보적인 서열을 갖고, 상기 적어도 1개의 프로브는 상기 하나 이상의 표적 핵산 분자의 증폭 시 형광의 검출 가능한 변화를 거침 -; 및 b) 적어도 1개의 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍과 접촉시키는 단계;
(ii) 하나 이상의 표적 핵산 분자를 증폭시키기에 충분한 조건 하에서 단계 (i)의 혼합물을 DNA 중합효소와 함께 인큐베이션시키는 단계; 및
(iii) 상기 프로브의 형광을 측정함으로써 증폭된 표적 핵산 분자의 존재 또는 부재를 검출하거나 또는 이의 양을 정량화하는 단계를 포함하는, 방법. - 하기를 포함하는, 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 위한 키트:
i. 하나 이상의 완충제 및 핵산 합성 효소; 및
ii. 제20항의 올리고뉴클레오티드 프로브; 및
iii. PCR 검정을 수행하기 위한 지침서. - 하기를 포함하는 조성물:
a) 제18항에 따른 에너지 전달 염료 접합체를 포함하는 제1 표지된 올리고뉴클레오티드; 및
b) 중합효소. - 하기를 포함하는 조성물:
a) 제18항의 형광 에너지 전달 염료 접합체; 및
b) 분석물 또는 효소. - 샘플에서 표적 핵산 분자를 검출 또는 정량화하는 방법으로서,
(i) 하나 이상의 표적 핵산 분자를 포함하는 상기 샘플을, a) 제20항의 적어도 1개의 올리고뉴클레오티드 프로브와 접촉시키는 단계로서, 상기 프로브는 상기 표적 핵산 분자에 적어도 부분적으로 상보적인 서열을 갖는, 상기 단계; 및
(ii) 상기 프로브의 형광을 측정함으로써 상기 표적 핵산 분자의 존재 또는 부재를 검출하거나 또는 이의 양을 정량화하는 단계를 포함하는, 방법. - 하기를 포함하는, 샘플에서 생물학적 분자를 검출하기 위한 키트:
i. 제20항의 올리고뉴클레오티드 프로브; 및
iii. 상기 생물학적 분자를 검출하기 위한 검정을 수행하기 위한 지침서. - 제1항에 있어서, 상기 염료 중 2개 이상 사이의 혼선(cross-talk)을 감소시키도록 구성된 교정 플레이트를 더 포함하는, 시스템.
- 제35항에 있어서, 상기 교정 플레이트는 4개의 교정 축상 염료 및 2개의 교정 축외 염료; 또는 2개의 교정 축상 염료 및 4개의 교정 축외 염료를 포함하는, 시스템.
- 방법으로서,
제13항의 방법을 수행하기 위한 시스템을 제공하는 단계;
상기 염료 중 2개 이상 사이의 혼선을 감소시키도록 구성된 교정 플레이트를 사용하여 시스템을 교정하는 단계를 포함하는, 방법. - 2개 이상 염료 사이의 혼선을 감소시키도록 구성된 교정 플레이트를 포함하는 시스템으로서, 상기 교정 플레이트는,
4개의 교정 축상 염료 및 2개의 교정 축외 염료; 또는
2개의 교정 축상 염료 및 4개의 교정 축외 염료를 포함하는, 시스템. - 방법으로서,
제13항의 방법을 수행하기 위한 시스템을 제공하는 단계;
상기 염료 중 2개 이상 사이의 혼선을 감소시키도록 구성된 교정 플레이트를 사용하여 시스템을 교정하는 단계를 포함하는, 방법. - 증폭 검정을 수행하는 방법으로서,
복수의 표적 분자를 포함하는 생물학적 샘플, 상기 복수의 표적 분자 중 각각의 하나 이상에 결합하도록 구성된 하나 이상의 축외 염료, 및 상기 복수의 표적 분자 중 각각의 하나 이상에 결합하도록 구성된 하나 이상의 축상 염료를 제공하는 단계;
상기 샘플에서 적어도 1회의 증폭 주기를 수행하는 단계;
상기 적어도 1회의 증폭 주기 동안 또는 증폭 주기 이후에, 상기 샘플을 2개 이상의 여기 채널로 조명하는 단계;
상기 조명 각각에 대한 응답으로, 2개 이상의 방출 채널로부터의 방출 신호를 측정하는 단계;
상기 방출 신호에 기초하여 상기 축상 염료 및 상기 축외 염료의 양을 계산하는 단계를 포함하는, 방법. - 방법으로서,
제13항의 방법을 수행하기 위한 시스템을 제공하는 단계;
상기 염료 중 2개 이상 사이의 혼선을 감소시키도록 구성된 교정 플레이트를 사용하여 시스템을 교정하는 단계를 포함하는, 방법.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US202062705935P | 2020-07-23 | 2020-07-23 | |
| US62/705,935 | 2020-07-23 | ||
| PCT/US2021/043000 WO2022020731A2 (en) | 2020-07-23 | 2021-07-23 | Compositions, systems and methods for biological analysis involving energy transfer dye conjugates and analytes comprising the same |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20230056685A true KR20230056685A (ko) | 2023-04-27 |
Family
ID=77338925
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020237006509A KR20230056685A (ko) | 2020-07-23 | 2021-07-23 | 염료를 사용한 생물학적 분석을 위한 조성물, 시스템 및 방법 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20230304932A1 (ko) |
| EP (1) | EP4185858A2 (ko) |
| KR (1) | KR20230056685A (ko) |
| CN (1) | CN116323965A (ko) |
| CA (1) | CA3186950A1 (ko) |
| WO (1) | WO2022020731A2 (ko) |
Family Cites Families (75)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5854A (en) | 1848-10-17 | Island | ||
| US33A (en) | 1836-09-29 | Cook-stove | ||
| US4965188A (en) | 1986-08-22 | 1990-10-23 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme |
| US4683195A (en) | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
| US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
| US4774339A (en) | 1987-08-10 | 1988-09-27 | Molecular Probes, Inc. | Chemically reactive dipyrrometheneboron difluoride dyes |
| US5231191A (en) | 1987-12-24 | 1993-07-27 | Applied Biosystems, Inc. | Rhodamine phosphoramidite compounds |
| EP0472648A4 (en) | 1989-05-18 | 1992-09-16 | Microprobe Corporation | Crosslinking oligonucleotides |
| US5366860A (en) | 1989-09-29 | 1994-11-22 | Applied Biosystems, Inc. | Spectrally resolvable rhodamine dyes for nucleic acid sequence determination |
| US5188934A (en) | 1989-11-14 | 1993-02-23 | Applied Biosystems, Inc. | 4,7-dichlorofluorescein dyes as molecular probes |
| US5227487A (en) | 1990-04-16 | 1993-07-13 | Molecular Probes, Inc. | Certain tricyclic and pentacyclic-hetero nitrogen rhodol dyes |
| US5433896A (en) | 1994-05-20 | 1995-07-18 | Molecular Probes, Inc. | Dibenzopyrrometheneboron difluoride dyes |
| US5274113A (en) | 1991-11-01 | 1993-12-28 | Molecular Probes, Inc. | Long wavelength chemically reactive dipyrrometheneboron difluoride dyes and conjugates |
| US5248782A (en) | 1990-12-18 | 1993-09-28 | Molecular Probes, Inc. | Long wavelength heteroaryl-substituted dipyrrometheneboron difluoride dyes |
| US5187288A (en) | 1991-05-22 | 1993-02-16 | Molecular Probes, Inc. | Ethenyl-substituted dipyrrometheneboron difluoride dyes and their synthesis |
| CA2119126C (en) | 1991-09-16 | 1996-09-03 | Stephen T. Yue | Dimers of unsymmetrical cyanine dyes |
| US5321130A (en) | 1992-02-10 | 1994-06-14 | Molecular Probes, Inc. | Unsymmetrical cyanine dyes with a cationic side chain |
| WO1994016108A1 (en) | 1993-01-15 | 1994-07-21 | The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. | Sensitive nucleic acid sandwich hybridization assays and kits |
| US5767259A (en) | 1994-12-27 | 1998-06-16 | Naxcor | Oligonucleotides containing base-free linking groups with photoactivatable side chains |
| US5658751A (en) | 1993-04-13 | 1997-08-19 | Molecular Probes, Inc. | Substituted unsymmetrical cyanine dyes with selected permeability |
| US5925517A (en) | 1993-11-12 | 1999-07-20 | The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. | Detectably labeled dual conformation oligonucleotide probes, assays and kits |
| US5538848A (en) | 1994-11-16 | 1996-07-23 | Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. | Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe |
| AU687535B2 (en) | 1994-03-16 | 1998-02-26 | Gen-Probe Incorporated | Isothermal strand displacement nucleic acid amplification |
| US5801155A (en) | 1995-04-03 | 1998-09-01 | Epoch Pharmaceuticals, Inc. | Covalently linked oligonucleotide minor grove binder conjugates |
| US6312894B1 (en) | 1995-04-03 | 2001-11-06 | Epoch Pharmaceuticals, Inc. | Hybridization and mismatch discrimination using oligonucleotides conjugated to minor groove binders |
| US5798276A (en) | 1995-06-07 | 1998-08-25 | Molecular Probes, Inc. | Reactive derivatives of sulforhodamine 101 with enhanced hydrolytic stability |
| US5854033A (en) | 1995-11-21 | 1998-12-29 | Yale University | Rolling circle replication reporter systems |
| US6020481A (en) | 1996-04-01 | 2000-02-01 | The Perkin-Elmer Corporation | Asymmetric benzoxanthene dyes |
| DE69738687D1 (de) | 1996-04-12 | 2008-06-26 | Phri Properties Inc | Sonden, kits und assays |
| US6162931A (en) | 1996-04-12 | 2000-12-19 | Molecular Probes, Inc. | Fluorinated xanthene derivatives |
| US5945526A (en) | 1996-05-03 | 1999-08-31 | Perkin-Elmer Corporation | Energy transfer dyes with enhanced fluorescence |
| US5847162A (en) | 1996-06-27 | 1998-12-08 | The Perkin Elmer Corporation | 4, 7-Dichlororhodamine dyes |
| US5800996A (en) | 1996-05-03 | 1998-09-01 | The Perkin Elmer Corporation | Energy transfer dyes with enchanced fluorescence |
| US5863727A (en) | 1996-05-03 | 1999-01-26 | The Perkin-Elmer Corporation | Energy transfer dyes with enhanced fluorescence |
| EP1736554B1 (en) | 1996-05-29 | 2013-10-09 | Cornell Research Foundation, Inc. | Detection of nucleic acid sequence differences using coupled ligase detection and polymerase chain reactions |
| US7550570B2 (en) | 2000-05-25 | 2009-06-23 | Applied Biosystems, Llc. | 4,7-dichlororhodamine dyes labeled polynucleotides |
| US5846737A (en) | 1996-07-26 | 1998-12-08 | Molecular Probes, Inc. | Conjugates of sulforhodamine fluorophores with enhanced fluorescence |
| US5861295A (en) | 1997-01-02 | 1999-01-19 | Life Technologies, Inc. | Nucleic acid-free thermostable enzymes and methods of production thereof |
| US6130101A (en) | 1997-09-23 | 2000-10-10 | Molecular Probes, Inc. | Sulfonated xanthene derivatives |
| US6008379A (en) | 1997-10-01 | 1999-12-28 | The Perkin-Elmer Corporation | Aromatic-substituted xanthene dyes |
| WO1999022018A2 (en) | 1997-10-27 | 1999-05-06 | Boston Probes, Inc. | Methods, kits and compositions pertaining to pna molecular beacons |
| US6485901B1 (en) | 1997-10-27 | 2002-11-26 | Boston Probes, Inc. | Methods, kits and compositions pertaining to linear beacons |
| US5936087A (en) | 1997-11-25 | 1999-08-10 | The Perkin-Elmer Corporation | Dibenzorhodamine dyes |
| US6818437B1 (en) | 1998-05-16 | 2004-11-16 | Applera Corporation | Instrument for monitoring polymerase chain reaction of DNA |
| US7498164B2 (en) * | 1998-05-16 | 2009-03-03 | Applied Biosystems, Llc | Instrument for monitoring nucleic acid sequence amplification reaction |
| US6255476B1 (en) | 1999-02-22 | 2001-07-03 | Pe Corporation (Ny) | Methods and compositions for synthesis of labelled oligonucleotides and analogs on solid-supports |
| US6383752B1 (en) | 1999-03-31 | 2002-05-07 | Hybridon, Inc. | Pseudo-cyclic oligonucleobases |
| US6528254B1 (en) | 1999-10-29 | 2003-03-04 | Stratagene | Methods for detection of a target nucleic acid sequence |
| US6372907B1 (en) | 1999-11-03 | 2002-04-16 | Apptera Corporation | Water-soluble rhodamine dye peptide conjugates |
| US6727356B1 (en) | 1999-12-08 | 2004-04-27 | Epoch Pharmaceuticals, Inc. | Fluorescent quenching detection reagents and methods |
| US6716994B1 (en) | 2000-01-04 | 2004-04-06 | Applera Corporation | Mobility-Modifying Cyanine Dyes |
| US6221604B1 (en) | 2000-02-07 | 2001-04-24 | Pe Corporation | Electron-deficient nitrogen heterocycle-substituted fluorescein dyes |
| US6596490B2 (en) | 2000-07-14 | 2003-07-22 | Applied Gene Technologies, Inc. | Nucleic acid hairpin probes and uses thereof |
| ATE352586T2 (de) | 2000-09-29 | 2007-02-15 | Molecular Probes Inc | Modifizierte carbocyaninfarbstoffe und deren konjugate |
| US6350580B1 (en) | 2000-10-11 | 2002-02-26 | Stratagene | Methods for detection of a target nucleic acid using a probe comprising secondary structure |
| US6818907B2 (en) * | 2000-10-17 | 2004-11-16 | The President And Fellows Of Harvard College | Surface plasmon enhanced illumination system |
| US6448407B1 (en) | 2000-11-01 | 2002-09-10 | Pe Corporation (Ny) | Atropisomers of asymmetric xanthene fluorescent dyes and methods of DNA sequencing and fragment analysis |
| US6593091B2 (en) | 2001-09-24 | 2003-07-15 | Beckman Coulter, Inc. | Oligonucleotide probes for detecting nucleic acids through changes in flourescence resonance energy transfer |
| US6589250B2 (en) | 2001-11-20 | 2003-07-08 | Stephen A. Schendel | Maxillary distraction device |
| EP1431398A1 (en) * | 2002-12-20 | 2004-06-23 | Evotec OAI AG | A method for detecting in a mixture an amount of analytes |
| US20050074796A1 (en) | 2003-07-31 | 2005-04-07 | Stephen Yue | Unsymmetrical cyanine dimer compounds and their application |
| US8084260B2 (en) * | 2004-11-24 | 2011-12-27 | Applied Biosystems, Llc | Spectral calibration method and system for multiple instruments |
| US7579153B2 (en) | 2005-01-25 | 2009-08-25 | Population Genetics Technologies, Ltd. | Isothermal DNA amplification |
| US7824890B2 (en) | 2005-02-19 | 2010-11-02 | Avacta Group Plc | Isothermal amplification of nucleic acids |
| US20070059713A1 (en) | 2005-09-09 | 2007-03-15 | Lee Jun E | SSB-DNA polymerase fusion proteins |
| CA2647827A1 (en) | 2006-03-31 | 2007-10-11 | Applied Biosystems Inc. | Reagents useful for synthesizing rhodamine-labeled oligonucleotides |
| KR102130856B1 (ko) | 2011-09-30 | 2020-07-08 | 라이프 테크놀로지스 코포레이션 | 생물학적 분석을 위한 광학 시스템 및 방법 |
| US9863880B2 (en) * | 2013-11-17 | 2018-01-09 | Quantum-Si Incorporated | Optical system and assay chip for probing, detecting and analyzing molecules |
| KR20220165282A (ko) * | 2014-08-08 | 2022-12-14 | 퀀텀-에스아이 인코포레이티드 | 분자들을 프로빙, 검출 및 분석하기 위한 광학계 및 검정 칩 |
| RU2708542C2 (ru) | 2015-02-06 | 2019-12-09 | Лайф Текнолоджиз Корпорейшн | Системы и способы оценки биологических проб |
| WO2018085531A2 (en) * | 2016-11-03 | 2018-05-11 | Oregon Health & Science University | Multispectral super resolution microscopy |
| EP3775259A4 (en) * | 2018-03-26 | 2022-01-05 | Ultima Genomics, Inc. | NUCLEIC ACID MOLECULES SEQUENCING PROCESSES |
| CN112566986A (zh) | 2018-08-10 | 2021-03-26 | 生命技术公司 | 经硅取代的罗丹明染料和染料缀合物 |
| BR112021012154A2 (pt) | 2018-12-20 | 2021-09-08 | Life Technologies Corporation | Corante de rodamina assimétrica e uso da mesma em ensaios biológicos |
| KR20210107737A (ko) | 2018-12-20 | 2021-09-01 | 라이프 테크놀로지스 코포레이션 | 개질된 로다민 염료 및 생물학적 분석에서의 그 용도 |
-
2021
- 2021-07-23 US US18/006,559 patent/US20230304932A1/en active Pending
- 2021-07-23 CN CN202180065059.7A patent/CN116323965A/zh active Pending
- 2021-07-23 EP EP21755281.9A patent/EP4185858A2/en active Pending
- 2021-07-23 CA CA3186950A patent/CA3186950A1/en active Pending
- 2021-07-23 KR KR1020237006509A patent/KR20230056685A/ko unknown
- 2021-07-23 WO PCT/US2021/043000 patent/WO2022020731A2/en active Application Filing
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA3186950A1 (en) | 2022-01-27 |
| EP4185858A2 (en) | 2023-05-31 |
| US20230304932A1 (en) | 2023-09-28 |
| WO2022020731A2 (en) | 2022-01-27 |
| CN116323965A (zh) | 2023-06-23 |
| WO2022020731A3 (en) | 2022-02-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3415627B2 (ja) | 均質ｐｃｒハイブリダイゼーション系のための蛍光検出アッセイ | |
| EP3401407B1 (en) | Nucleic acid probe, method for designing nucleic acid probe, and method for detecting target sequence | |
| Ryazantsev et al. | Two-dye and one-or two-quencher DNA probes for real-time PCR assay: synthesis and comparison with a TaqMan™ probe | |
| KR20230056683A (ko) | 생물학적 분석에 사용하기 위한 에너지 전달 염료 접합체 | |
| US20230124451A1 (en) | Novel quencher and reporter dye combinations | |
| KR20230056685A (ko) | 염료를 사용한 생물학적 분석을 위한 조성물, 시스템 및 방법 | |
| Aparin et al. | 1-Phenylethynylpyrene (PEPy) as a novel blue-emitting dye for qPCR assay | |
| KR20230121555A (ko) | 알킬피리디늄 쿠마린 염료 및 서열분석 응용에서의 용도 | |
| RU2795062C2 (ru) | Новые комбинации гасителя и репортерного красителя | |
| EP4373890A1 (en) | Dibenzoxanthene quenchers, uses, and methods of preparation | |
| JP2015104329A (ja) | 核酸プライマー又は核酸プローブの設計方法、およびターゲット配列の検出方法 | |
| CN117529529A (zh) | 氮杂吲哚花菁染料、用途和制备方法 |