BR112021012154A2 - Corante de rodamina assimétrica e uso da mesma em ensaios biológicos - Google Patents

Abstract

corante de rodamina assimétrica e uso da mesma em ensaios biológicos. a presente divulgação se refere a corantes nh-rodamina n-protegida e seu uso na detecção de ácido nucleico. em particular, a divulgação se refere a métodos de produção de corantes nh-rodamina n protegida e métodos de uso de corantes nh-rodamina n-protegida (por exemplo, identificação humana). certos corantes fornecidos neste documento têm propriedades espectrais únicas que complementam aquelas em conjuntos de corantes existentes e podem ser usados para expandir o número de corantes repórter que podem ser incluídos para aplicações hid e outros ensaios biológicos. esses compostos fluorescentes são úteis para marcar oligonucleotídeos sintéticos. fórmula (i).

Description

“CORANTE DE RODAMINA ASSIMÉTRICA E USO DA MESMA EM ENSAIOS BIOLÓGICOS”

1. FUNDAMENTOS

[001] O uso de corantes rodamina fluorescentes como marcadores de detecção encontrou amplo uso em biologia molecular, biologia celular e genética molecular. Por exemplo, o uso de oligonucleotídeos marcados com fluorescência está agora difundido em uma variedade de ensaios diferentes, incluindo sequenciamento de polinucleotídeos, hibridização in situ de fluorescência (FISH), ensaios de hibridização em matrizes de ácido nucleico, estudos de polarização de fluorescência e ensaios de amplificação de ácido nucleico, incluindo ensaios de amplificação de cadeia de polimerase realizados com sondas fluorescentes e/ou iniciadores.

[002] Uma variedade de sistemas de ensaio multiplex foi descrita utilizando corantes fluorescentes. Por exemplo, os corantes de rodamina foram descritos para uso em sistemas de ensaio multiplex, tais como aqueles descritos no documento WO 2012/067901 para uso em ensaios de identificação humana (HID). Infelizmente, as características espectrais dos conjuntos de corantes existentes, incluindo os corantes de rodamina, limitaram a capacidade de desenvolver sistemas de ensaio robustos e sensíveis usando mais de 6 corantes em combinação. Para habilitar tais sistemas de plex superior, há uma necessidade para o desenvolvimento de novos corantes de rodamina com propriedades espectrais exclusivamente adequadas para a criação de tais conjuntos de corantes multiplex alternativos.

2. SUMÁRIO

[003] São descritos compostos fluorescentes que podem ser usados para marcar oligonucleotídeos sintéticos. Em uma modalidade, o composto tem a fórmula (I)

em que R1, R2, R3, R6, R7, R8, R11, R12, R13 e R14, quando tomados sozinhos, são, cada um independentemente entre si, selecionados a partir de hidrogênio, alquila inferior, (C6-C14) arila, (C7-C20)-arilalquila, heteroarila de 5-14 membros, heteroarilalquila de 6-20 membros, -Rb ou -(CH2)n-Rb; ou, alternativamente, R1 e R2 e/ou R6 e R7 são tomados em conjunto com os átomos de carbono aos quais estão ligados para formar um grupo benzo opcionalmente substituído; R4, quando tomado isoladamente, é selecionado a partir de hidrogênio, alquila inferior, (C6-C14) arila, (C7-C20) arilalquila, heteroarila de 5-14 membros, heteroarilalquila de 6-20 membros; ou R4 e um dentre R2 ou R3 são tomados em conjunto com os átomos aos quais estão ligados para formar um grupo heterocicloalquila opcionalmente substituído, um grupo heterocicloalquenila opcionalmente substituído, ou um grupo heteroarila opcionalmente substituído; R5 é H ou um grupo protetor; R9, quando tomado sozinho, é selecionado a partir de hidrogênio, alquila inferior, (C6-C14) arila, (C7-C20) arilalquila, heteroarila de 5-14 membros, heteroarilalquila de 6-20 membros; ou R7 e R9 são tomados em conjunto com os átomos aos quais estão ligados para formar um grupo heterocicloalquila opcionalmente substituído, um grupo heterocicloalquenila opcionalmente substituído ou um grupo heteroarila opcionalmente substituído; R10 é H ou grupo protetor; ou R8 e R10 são tomados em conjunto com os átomos aos quais estão ligados para formar um grupo heterocicloalquila opcionalmente substituído, um grupo heterocicloalquenila opcionalmente substituído ou um grupo heteroarila opcionalmente substituído; pelo menos um dentre R7 e R9 ou R8 e R10 são tomados em conjunto com os átomos aos quais estão ligados para formar um grupo heterocicloalquila opcionalmente substituído, um grupo heterocicloalquenila opcionalmente substituído ou um grupo heteroarila opcionalmente substituído e, opcionalmente, R4 e um dentre R2 ou R3 são tomados em conjunto com os átomos aos quais estão ligados para formar um grupo heterocicloalquila opcionalmente substituído, um grupo heterocicloalquenila opcionalmente substituído ou um grupo heteroarila opcionalmente substituído com a condição de que o composto não seja da fórmula R5 R3 R8 R10 d N O N R e R4 R R2 R1 O R 6 R11 O R12 R14 13 R , ou ; cada Ra é independentemente selecionado a partir de alquila inferior, (C6- C14) arila, (C7-C20) arilalquila, heteroarila de 5-14 membros, -CX3 e heteroarilalquila de 6-20 membros; cada Rb é independentemente selecionado a partir de -X, -OH, -ORa, -SH, - SRa -NH2, -NHRa, -NRcRc, -N+RcRcRc, per-halo alquila inferior, tri-halometila, trifluorometila, -P(O)(OH)2, -P(O)(ORa)2, P(O)(OH)(ORa), -OP(O)(OH)2, - OP(O)(ORa)2, -OP(O)(ORa)(OH), -S(O)2OH, -S(O)2Ra, -C(O)H, -C(O)Ra, -C(S)X, - C(O)ORa, -C(O)OH, -C(O)NH2, -C(O)NHRa, -C(O)NRcRc, -C(S)NH2, C(O)NHRa, - C(O)NRcRc, -C(NH)NH2, -C(NH)NHRa e -C(NH)NRcRc, cada Rc é, independentemente, um Ra, ou, alternativamente, dois Rc ligados ao mesmo átomo nitrôgenio podem ser tomados em conjunto com aquele esse átomo de nitrogênio para formar um anel saturado ou insaturado de 5 a 8 membros que pode opcionalmente incluir um ou mais heteroátomos do mesmo anel ou heteroátomos de um anel diferente, que são tipicamente selecionados a partir de O, N e S; cada Rd e Re, quando tomados isoladamente, são independentemente selecionados a partir de hidrogênio, alquila inferior, (C6-C14) arila, (C7-C20) arilalquila, heteroarila de 5-14 membros, heteroarilalquila de 6-20 membros, -Rb ou - (CH2)n-Rb; e n é um número inteiro que varia de 1 a 10.

[004] Em outro aspecto, a presente divulgação descreve o oligonucleotídeo que compreende uma porção química de marcador produzida pela reação de um oligonucleotídeo ligado a um suporte sólido com um reagente com uma estrutura de fórmula: LM-L-PEP em que PEP é um grupo precursor de éster de fosfato, L é um ligante opcional que liga a porção química de marcador ao grupo PEP, e LM compreende uma porção química de NH-rodamina N-protegida da fórmula (I)

em que R1, R2, R3, R6, R7, R8, R11, R12, R13 e R14, quando tomados isoladamente, são, cada um independentemente entre si, selecionados a partir de hidrogênio, alquila inferior, (C6-C14) arila, (C7-C20) arilalquila, heteroarila de 5-14 membros, heteroarilalquila de 6-20 membros, -Rb ou -(CH2)n-Rb; ou, alternativamente, R1 e R2 e/ou R6 e R7 são tomados em conjunto com os átomos de carbono aos quais estão ligados para formar um grupo benzo opcionalmente substituído; e um dentre R2, R3, R7, R8, R12 ou R13 compreende um grupo da fórmula —Y—, em que Y é selecionado a partir do grupo que consiste em -C(O)-, -S(O)2-, - S- e -NH-; R4, quando tomado isoladamente, é selecionado a partir de hidrogênio, alquila inferior, (C6-C14) arila, (C7-C20) arilalquila, heteroarila de 5-14 membros, heteroarilalquila de 6-20 membros; ou R4 e um dentre R2 ou R3 são tomados em conjunto com os átomos aos quais estão ligados para formar um grupo heterocicloalquila opcionalmente substituído, um grupo heterocicloalquenila opcionalmente substituído, ou um grupo heteroarila opcionalmente substituído; R5 é H ou um grupo protetor; R9, quando tomado sozinho, é selecionado a partir de hidrogênio, alquila inferior, (C6-C14) arila, (C7-C20) arilalquila, heteroarila de 5-14 membros,

heteroarilalquila de 6-20 membros; ou R7 e R9 são tomados em conjunto com os átomos aos quais estão ligados para formar um grupo heterocicloalquila opcionalmente substituído, um grupo heterocicloalquenila opcionalmente substituído ou um grupo heteroarila opcionalmente substituído; R10 é H ou grupo protetor; ou R8 e R10 são tomados em conjunto com os átomos aos quais estão ligados para formar um grupo heterocicloalquila opcionalmente substituído, um grupo heterocicloalquenila opcionalmente substituído ou um grupo heteroarila opcionalmente substituído; pelo menos um dentre R7 e R9 ou R8 e R10 são tomados em conjunto com os átomos aos quais estão ligados para formar um grupo heterocicloalquila opcionalmente substituído, um grupo heterocicloalquenila opcionalmente substituído ou um grupo heteroarila opcionalmente substituído e, opcionalmente, R4 e um dentre R2 ou R3 são tomados em conjunto com os átomos aos quais estão ligados para formar um grupo heterocicloalquila opcionalmente substituído, um grupo heterocicloalquenila opcionalmente substituído ou um grupo heteroarila opcionalmente substituído com a condição de que o composto não seja da fórmula R5 R3 R8 R10 d N O N R e R4 R R2 R1 O R 6

R11 O

R12 R14 13 R , ou ; cada Ra é independentemente selecionado a partir de alquila inferior, (C6- C14) arila, (C7-C20) arilalquila, heteroarila de 5-14 membros, -CX3 e heteroarilalquila de 6-20 membros; cada Rb é independentemente selecionado a partir de -X, -OH, -ORa, -SH, - SRa -NH2, -NHRa, NRcRc, N+RcRcRc, per-halo alquila inferior, tri-halometila, trifluorometila, -P(O)(OH)2, -P(O)(ORa)2, P(O)(OH)(ORa), -OP(O)(OH)2, - OP(O)(ORa)2, -OP(O)(ORa)(OH), -S(O)2OH, -S(O)2Ra, -C(O)H, -C(O)Ra, -C(S)X, - C(O)ORa, -C(O)OH, -C(O)NH2, -C(O)NHRa, -C(O)NRcRc, -C(S)NH2, -C(O)NHRa, - C(O)NRcRc, -C(NH)NH2, -C(NH)NHRa e -C(NH)NRcRc; cada Rc é, independentemente, um Ra, ou, alternativamente, dois Rc ligados ao mesmo átomo nitrôgenio podem ser tomados em conjunto com aquele esse átomo de nitrogênio para formar um anel saturado ou insaturado de 5 a 8 membros que pode opcionalmente incluir um ou mais heteroátomos do mesmo anel ou heteroátomos de um anel diferente, que são tipicamente selecionados a partir de O, N e S; cada Rd e Re, quando tomados isoladamente, são independentemente selecionados a partir de hidrogênio, alquila inferior, (C6-C14) arila, (C7-C20) arilalquila, heteroarila de 5-14 membros, heteroarilalquila de 6-20 membros, -Rb ou - (CH2)n-Rb; e n é um número inteiro que varia de 1 a 10.

[005] Em outro aspecto, um reagente útil para marcar um oligonucleotídeo, que é um composto de acordo com a fórmula estrutural: LM-L-PEP em que LM representa uma porção química de marcador que compreende uma porção química de NH-rodamina N-protegida, PEP é um grupo precursor de éster de fosfato que compreende um grupo fosforamidita ou um grupo de H- fosfonato, e L é um ligante opcional que liga a porção química de marcador ao grupo precursor de éster de fosfato, no qual a porção química de NH-rodamina N-protegida da estrutura (I) em que R1, R2, R3, R6, R7, R8, R11, R12, R13 e R14, quando tomados isoladamente, são, cada um independentemente entre si, selecionados a partir de hidrogênio, alquila inferior, (C6-C14) arila, (C7-C20) arilalquila, heteroarila de 5-14 membros, heteroarilalquila de 6-20 membros, -Rb ou -(CH2)n-Rb, R5 representa um grupo protetor, cada um dentre R4, R9 e R10, quando tomado isoladamente, é independentemente hidrogênio, alquila inferior, (C6-C14) arila, (C7-C20) arilalquila, heteroarila de 5-14 membros, heteroarilalquila de 6-20 membros, -P(O)(OH)2, -

P(O)(ORa)2, P(O)(OH)(ORa), -OP(O)(OH)2, -OP(O)(ORa)2, -OP(O)(ORa)(OH), - S(O)2OH, -S(O)2Ra, -C(O)H, -C(O)Ra, -C(S)X, -C(O)ORa, -C(O)OH, -C(O)NH2, - C(O)NHRa, -C(O)NRcRc, -C(S)NH2, -C(O)NHRa, -C(O)NRcRc, -C(NH)NH2, - C(NH)NHRa e -C(NH)NRcRc, em que X é um halo, alternativamente, R1 e R2 e/ou R6 e R7 são tomados em conjunto com os átomos de carbono aos quais estão ligados para formar um grupo benzo opcionalmente substituído, e/ou R7 e R9 e/ou R8 e R10 e/ou R4 e um dentre R2 ou R3 são tomados em conjunto com os átomos de carbono aos quais estão ligados para formar um grupo heterocicloalquila opcionalmente substituído, um grupo heterocicloalquenila opcionalmente substituído ou um grupo heteroarila opcionalmente substituído; em que n é um número inteiro na faixa de 1 a 10; em que Rb é independentemente selecionado a partir de -X, -OH, -ORa, -SH, -SRa -NH2, -NHRa, -NRcRc, -N+RcRcRc, per-halo alquila inferior, tri-halometila, trifluorometila, -P(O)(OH)2, -P(O)(ORa)2, P(O)(OH)(ORa), -OP(O)(OH)2, - OP(O)(ORa)2, -OP(O)(ORa)(OH), -S(O)2OH, -S(O)2Ra, -C(O)H, -C(O)Ra, -C(S)X, - C(O)ORa, -C(O)OH, -C(O)NH2, -C(O)NHRa, -C(O)NRcRc, -C(S)NH2, -C(O)NHRa, - C(O)NRcRc, -C(NH)NH2, -C(NH)NHRa e -C(NH)NRcRc, cada Ra é, independentemente dos outros, selecionado a partir de alquila inferior, (C6-C14) arila, (C7-C20) arilalquila, heteroarila de 5-14 membros, -CX3 e heteroarilalquila de 6-20 membros, e cada Rc é, independentemente dos outros, um Ra, ou, alternativamente, dois Rc ligados ao mesmo átomo nitrôgenio podem ser tomados em conjunto com aquele ess átomo de nitrogênio para formar um anel saturado ou insaturado de 5 a 8 membros que pode opcionalmente incluir um ou mais heteroátomos do mesmo anel ou heteroátomos de um anel diferente, que são tipicamente selecionados a partir de O, N e S; e com a condição de que pelo menos um dentre R2, R3, R7, R8, R12 ou R13 do composto de fórmula LM-L-PEP compreende um grupo de fórmula —Y—, em que Y é selecionado do grupo que consiste em —C(O)-, —S(O)2 -, —S— e —NH—.

[006] Em outro aspecto, um método compreende:

coamplificar uma amostra de ácido nucleico com uma pluralidade de pares de iniciadores de amplificação para formar uma pluralidade de produtos de amplificação, em que pelo menos um dentre cada um dos pares de iniciadores compreende um nucleotídeo marcado com uma fórmula estrutural LM-L-PEP em que cada uma das amplificações produtos compreende um locus genético diferente.

3. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[007] A Figura 1 fornece ligantes exemplificativos que podem ser usados para ligar as várias porções químicas diferentes que compreendem os reagentes aqui descritos uns aos outros;

[008] A Figura 2 fornece modalidades exemplificativas de reagentes de síntese não nucleosídicos que não incluem alças de síntese;

[009] A Figura 3 fornece modalidades exemplificativas de reagentes de síntese nucleosídicos que não incluem alças de síntese;

[010] A Figura 4 fornece modalidades exemplificativas de reagentes de síntese não nucleosídicos que incluem uma alça de síntese;

[011] A Figura 5 fornece modalidades exemplificativas de reagentes de síntese nucleosídicos que incluem alças de síntese;

[012] A Figura 6 fornece modalidades exemplificativas de reagentes de suporte sólido não nucleosídicos;

[013] A Figura 7 fornece modalidades exemplificativas de reagentes de suporte sólido nucleosídicos;

[014] A Figura 8A ilustra o uso de uma modalidade específica de um reagente de síntese para sintetizar um oligonucleotídeo marcado em seu 5’-hidroxila com um corante NH-rodamina;

[015] A Figura 8B ilustra o uso de um ligante fosforamidita e uma modalidade específica de um reagente de síntese para sintetizar in situ um oligonucleotídeo marcado em seu terminal 5’ com um corante de transferência de energia, e

[016] A Figura 9 ilustra o uso de uma modalidade específica de um reagente de síntese para sintetizar um oligonucleotídeo marcado em sua 3-hidroxila com um corante de transferência de energia.

[017] A Figura 10 ilustra os espectros de um conjunto de corantes proposto para uso em ensaios multiplex. Cmp A, uma rodamina assimétrica conforme descrito no documento PCT/US2019/67925; Cmp B, uma rodamina assimétrica como mostrado na estrutura D.1.

4. DESCRIÇÃO DETALHADA

[018] É para ser compreendido que tanto a descrição geral anterior quanto a descrição detalhada seguinte são exemplificativas e explanatórias apenas e não são destinadas a serem restritivas das composições e métodos descritos neste documento. Nesta divulgação, o uso de "ou" significa "e/ou", a menos que indicado de outra forma. Da mesma forma, as expressões “compreendem", "compreende", “que compreende", “incluem", "inclui" e “que inclui" não se destinam a ser limitantes.

[019] Conforme usado neste documento e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma" e "o/a" incluem referentes plurais, a menos que o contexto dite claramente o contrário. É ainda observado que as reivindicações podem ser elaboradas para excluir qualquer elemento opcional. Como tal, esta declaração se destina a servir como base antecedente para o uso de terminologia exclusiva como "somente", "apenas" e semelhantes em conexão com a recitação de elementos de reivindicação ou uso de uma limitação "negativa".

[020] Conforme usado neste documento, os termos “incluindo”, “contendo” e “compreendendo” são usados em seu sentido aberto e não limitante.

[021] Para fornecer uma descrição mais concisa, algumas das expressões quantitativas fornecidas neste documento não são qualificadas com o termo "cerca de". Entende-se que, quer o termo "cerca de" seja usado explicitamente ou não, cada quantidade aqui indicada se refere ao valor real dado e também se refere à aproximação de tal valor dado que seria razoavelmente inferido com base no habilidade comum na técnica, incluindo equivalentes e aproximações devido às condições experimentais e/ou de medição para tal dado valor. Sempre que um rendimento é dado como uma porcentagem, tal rendimento se refere a uma massa da entidade para a qual o rendimento é dado em relação ao valor máximo da mesma entidade que poderia ser obtido sob as condições estequiométricas particulares. As concentrações que são dadas como percentagens se referem a razões de massa, a menos que indicado de forma diferente.

4.1 DEFINIÇÕES

[022] Conforme usado no presente documento, os seguintes termos e frases devem ter os seguintes significados:

[023] “Alquila”, por si só ou como parte de outro substituinte, se refere a um radical hidrocarboneto monovalente saturado ou insaturado ramificado, de cadeia linear ou cíclica tendo o número declarado de átomos de carbono (isto é, C1-C6 significa um a seis átomos de carbono) que é derivado pela remoção de um átomo de hidrogênio a partir de um único átomo de carbono de um alcano, alceno ou alcino parental. Grupos alquila típicos incluem, porém sem limitação, metila; etilas tais como etanila, etenila, etinila; propilas tais como propan-1-ila, propan-2-ila, ciclopropan-1-ila, prop-1-en-1-ila, prop-1-en-2-ila, prop-2-en-1-ila, cicloprop-1-en-1- ila; cicloprop-2-en-1-ila, prop-1-in-1-ila, prop-2-in-1-ila, etc.; butilas tais como butan- 1-ila, butan-2-ila, 2-metila-propan-1-ila, 2-metila-propan-2-ila, ciclobutan-1-ila, but-1- en-1-ila, but-1-en-2-ila, 2-metila-prop-1-en-1-ila, but-2-en-1-ila, but-2-en-2-ila, buta-1,3-dien-1-ila, buta-1,3-dien-2-ila, ciclobut-1-en-1-ila, ciclobut-1-en-3-ila, ciclobuta-1,3-dien-1-ila, but-1-in-1-ila, but-1-in-3-ila, but-3-in-1-ila, etc.; e similares. Quando níveis específicos de saturação são pretendidos, a nomenclatura “alcanila", “alquenila" e/ou "alquinila" é usada, conforme definido abaixo. Conforme usado neste documento, "alquila inferior" significa (C1-C8) alquila.

[024] “Alcanila", por si só ou como parte de outro substituinte, se refere a uma alquila saturada ramificada, de cadeia linear ou cíclica derivada pela remoção de um átomo de hidrogênio de um único átomo de carbono de um alcano pai. Grupos alquanila típicos incluem, porém sem limitação, metanila; etanila; propanilas tais como propan-1-ila, propan-2-ila (isopropila), ciclopropan-1-ila, etc.; butanilas tais como butan-1-ila, butan-2-ila (sec-butila), 2-metila-propan-1-ila (isobutila), 2-metila- propan-2-ila (t-butila), ciclobutan-1-ila, etc.; e similares. Conforme usado neste documento, “alcanila inferior" significa (C1-C8) alcanila.

[025] “Alquenila", por si só ou como parte de outro substituinte, se refere a uma alquila insaturada ramificada, de cadeia linear ou cíclica com pelo menos uma ligação dupla carbono-carbono derivada da remoção de um átomo de hidrogênio a partir de um único átomo de carbono de um alceno parental. O grupo pode estar na conformação cis ou trans ao redor da ligação (ou ligações) dupla. Grupos alquenila típicos incluem, porém sem limitação, etenila; propenilas tais como prop-1-en-1-ila, prop-1-en-2-ila, prop-2-en-1-ila, prop-2-en-2-ila, cicloprop-1-en-1-ila; cicloprop-2-en- 1-ila; butenilas tais como but-1-en-1-ila, but-1-en-2-ila, 2-metila-prop-1-en-1-ila, but-2-en-1-ila, but-2-en-2-ila, buta-1,3-dien-1-ila, buta-1,3-dien-2-ila, ciclobut-1-en-1- ila, ciclobut-1-en-3-ila, ciclobuta-1,3-dien-1-ila, etc.; e similares. Conforme usado neste documento, "alquenila inferior" significa (C2-C8) alquenila.

[026] “Alquinila", por si só ou como parte de outro substituinte, se refere a uma alquila insaturada ramificada, de cadeia linear ou cíclica com pelo menos uma ligação tripla carbono-carbono derivada da remoção de um átomo de hidrogênio a partir de um único átomo de carbono de um alcino parental. Grupos alquinila típicos incluem, porém sem limitação, etinila; propinilas tais como prop-1-in-1-ila, prop-2-in- 1-ila, etc.; butinilas tais como but-1-in-1-ila, but-1-in-3-ila, but-3-in-1-ila, etc.; e similares. Conforme usado neste documento, "alquinila inferior" significa (C2-C8) alquinila.

[027] “Alquildi-ila", por si só ou como parte de outro substituinte, se refere a um grupo hidrocarboneto divalente saturado ou insaturado, ramificado, de cadeia linear ou cíclico tendo o número declarado de átomos de carbono (isto é, C1-C6 significa de um a seis átomos de carbono) derivado pela remoção de um átomo de hidrogênio a partir de cada um dos dois átomos de carbono diferentes de um alcano, alceno ou alcino parental, ou pela remoção de dois átomos de hidrogênio a partir de um único átomo de carbono de um alcano, alceno ou alcino parental.

Os dois centros radicais monovalentes ou cada valência do centro radical divalente podem formar ligações com átomos iguais ou diferentes.

Grupos alquildi-ila típicos incluem, porém sem limitação, metei-ila; etildi-ilas tais como etan-1,1-di-ila, etan-1,2-di-ila, eten-1,1-di-ila, eten-1,2-di-ila; propildi-ilas tais como propan-1,1-di-ila, propan-1,2-di- ila, propan-2,2-di-ila, propan-1,3-di-ila, ciclopropan-1,1-di-ila, ciclopropan-1,2-di-ila, prop-1-en-1,1-di-ila, prop-1-en-1,2-di-ila, prop-2-en-1,2-di-ila, prop-1-en-1,3-di-ila, cicloprop-1-en-1,2-di-ila, cicloprop-2-en-1,2-di-ila, cicloprop-2-en-1,1-di-ila, prop-1-in- 1,3-di-ila, etc.; butildi-ilas tais como, butan-1-di-ila, butan-1,2-di-ila, butan-1,3-di-ila, butan-1,4-di-ila, butan-2,2-di-ila, 2-metil-propan-1,1-di-ila, 2-metil-propan-1,2-di-ila, ciclobutan-1,1-di-ila; ciclobutan-1,2-di-ila, ciclobutan-1,3-di-ila, but-1-en-1,1-di-ila, but-1-en-1,2-di-ila, but-1-en-1,3-di-ila, but-1-en-1,4-di-ila, 2-metil-prop-1-en-1,1-di-ila, 2-metanilideno-propan-1,1-di-ila, buta-1,3-dien-1,1-di-ila, buta-1,3-dien-1,2-di-ila, buta-1,3-dien-1,3-di-ila, buta-1,3-dien-1,4-di-ila, ciclobut-1-en-1,2-di-ila, ciclobut-1-en- 1,3-di-ila, ciclobut-2-en-1,2-di-ila, ciclobuta-1,3-dien-1,2-di-ila, ciclobuta-1,3-dien-1,3- di-ila, but-1-in-1,3-di-ila, but-1-in-1,4-di-ila, buta-1,3-di-in-1,4-di-ila, etc.; e similares.

Quando níveis específicos de saturação são pretendidos, a nomenclatura alcanildi- ila, alquenildi-ila e/ou alquinildi-ila é usada.

Quando se pretende especificamente que as duas valências estejam no mesmo átomo de carbono, a nomenclatura "alquilideno" é usada.

Em algumas modalidades, o grupo alquildi-ila é (C1-C8) alquildi-ila.

Modalidades específicas incluem grupos alcanildi-ila acíclicos saturados nos quais os centros radicais estão nos carbonos terminais, por exemplo, metandi-ila (metano); etan-1,2-di-ila (etano); propan-1,3-di-ila (propano); butan-1,4-di-ila (butano); e semelhantes (também referidos como alquilenos, infra definido). Tal como aqui utilizado, "alquildi-ila inferior" significa (C1-C8) alquildi-ila.

[028] "Alquileno", por si só ou como parte de outro substituinte, se refere a um grupo alquildi-ila saturado ou insaturado de cadeia linear tendo dois centros radicais monovalentes terminais derivados pela remoção de um átomo de hidrogênio a partir de cada um dos dois átomos de carbono terminais de cadeia linear ou alcano, alceno ou alcino ramificado, ou pela remoção de um átomo de hidrogênio de cada um dos dois átomos de anel diferentes de uma cicloalquila parental. O local de uma ligação dupla ou ligação tripla, se presente, em um alquileno particular é indicado entre colchetes. Grupos alquileno típicos incluem, porém sem limitação, metileno (metano); etilenos tais como etano, eteno, etino; propilenos tais como propano, prop[1]eno, propa[1,2]dieno, prop[1]ino, etc.; butilenos tais como butano, but[1]eno, but[2]eno, buta[1,3]dieno, but[1]ino, but[2]ino, buta[1,3]di-ino, etc.; e similares. Quando níveis específicos de saturação são pretendidos, a nomenclatura alcano, alceno e/ou alquino é usada. Em algumas modalidades, o grupo alquileno é alquileno (C1-C8) ou (C1-C3). Modalidades específicas incluem grupos alcano saturados de cadeia linear, por exemplo, metano, etano, propano, butano e semelhantes. Conforme usado neste documento, "alquileno inferior" significa alquileno (C1-C8).

[029] “Heteroalquila", Heteroalquanila", Heteroalquenila", Heteroalquinila", Heteroalquildi-ila” e “Heteroalquileno", por si só ou como parte de outro substituinte, se refere a grupos alquila, alquanila, alquenila, alquinila, alquildi-ila e alquileno, respectivamente, em que um ou mais dos átomos de carbono são, cada um independentemente, substituídos por heteroátomos ou grupos heteroatômicos iguais ou diferentes. Heteroátomos e/ou grupos heteroatômicos típicos que podem substituir os átomos de carbono incluem, porém sem limitação, —O—, —S—, —S — O—, —NR′—, —PH—, —S (O)-, —SO2—, —S(O)NR′—, —SO2NR′— e semelhantes, incluindo combinações dos mesmos, em que R′ é hidrogênio ou um substituto, tal como, por exemplo, (C1-C8) alquila, (C6-C14) arila ou (C7-C20) arilalquila.

[030] “Cicloalquila" e “Heterocicloalquila", por si próprios ou como parte de outro substituinte, se referem a versões cíclicas de grupos "alquila" e “heteroalquila", respectivamente. Para grupos heteroalquila, um heteroátomo pode ocupar a posição que está ligada ao restante da molécula. Grupos cicloalquila típicos incluem, porém sem limitação, ciclopropila; ciclobutilas tais como ciclobutanila e ciclobutenila; ciclopentilas tais como ciclopentanila e ciclopentenila; ciclo-hexilas tais como ciclo- hexanila e ciclo-hexenila; e similares. Grupos heterocicloalquila típicos incluem, porém sem limitação, tetra-hidrofuranila (por exemplo, tetra-hidrofuran-2-ila, tetra-hidrofuran-3-ila, etc.), piperidinila (por exemplo, piperidin-1-ila, piperidin-2-ila, etc.), morfolinila (por exemplo, morfolin-3-ila, morfolin-4-ila, etc.), piperazinila (por exemplo, piperazin-1-ila, piperazin-2-ila, etc.), e similares.

[031] "Sistema de anel aromático pai" se refere a um sistema de anel cíclico ou policíclico insaturado com um sistema de elétrons π conjugado. Especificamente incluídos na definição de "sistema de anel aromático parental" estão sistemas de anéis fundidos em que um ou mais dos anéis são aromáticos e um ou mais dos anéis são saturados ou insaturados, como, por exemplo, fluoreno, indano, indeno, fenaleno, tetra-hidronaftaleno, etc. Os sistemas de anel aromático parentais típicos incluem, porém sem limitação, aceantrileno, acenaftileno, acefenantrileno, antraceno, azuleno, benzeno, criseno, coroneno, fluoranteno, fluoreno, hexaceno, hexafeneno, hexileno, indaceno, s-indaceno, indano, indeno, naftaleno, octaceno, octafeno, octaleno, ovaleno, pentaceno, pentaleno, pentafeno, perileno, fenaleno, fenantreno, piceno, pleiadeno, pireno, pirantreno, rubiceno, tetra-hidronaftaleno,

trifenileno, trinaftaleno e semelhantes.

[032] “Arila", por si só ou como parte de outro substituinte, se refere a um grupo hidrocarboneto aromático monovalente tendo o número declarado de átomos de carbono (isto é, C6-C14 significa de 6 a 14 átomos de carbono) derivado da remoção de um átomo de hidrogênio a partir de um único átomo de carbono de um sistema de anel aromático parental. Grupos arila típicos incluem, porém sem limitação, derivados de aceantrileno, acenaftileno, acefenantrileno, antraceno, azuleno, benzeno, criseno, coroneno, fluoranteno, fluoreno, hexaceno, hexafeno, hexileno, as-indaceno, s-indaceno, indano, indeno, naftaleno, octaceno, octafeno, octaleno, ovaleno, pentaceno, pentaleno, pentafeno, perileno, fenaleno, fenantreno, piceno, pleiadeno, pireno, pirantreno, rubiceno, trifenileno, trinaftaleno, e similares, bem como os vários isômeros hidro dos mesmos. Arilas exemplificativas específicas incluem fenila e naftila.

[033] “Arilalquila", por si só ou como parte de outro substituinte, se refere a um grupo alquila acíclico no qual um dos átomos de hidrogênio ligados a um átomo de carbono, em algumas modalidades, um terminal ou átomo de carbono sp3, é substituído por um grupo arila. Grupos arilalquila típicos incluem, porém sem limitação, benzila, 2-fenilaetan-1-ila, 2-fenilaeten-1-ila, naftilmetila, 2-naftiletan-1-ila, 2-naftileten-1-ila, naftobenzila, 2-naftofeniletan-1-ila e similares. Quando se pretendem porções químicas alquila tendo um grau de saturação especificado, a nomenclatura arilalcanila, arilalquenila e/ou arilalquinila é usada. Quando um número definido de átomos de carbono é declarado, por exemplo, (C7-C20) arilalquila, o número se refere ao número total de átomos de carbono compreendendo o grupo arilalquila.

[034] "Sistema de anel heteroaromático parental" se refere a um sistema de anel aromático parental no qual um ou mais átomos de carbono são, cada um independentemente, substituídos pelos mesmos ou diferentes heteroátomos ou grupos heteroatômicos. Heteroátomos ou grupos heteroatômicos típicos para substituir os átomos de carbono incluem, porém sem limitação, N, NH, P, O, S, S (O), SO2, Si, etc. Especificamente incluídos na definição de "sistemas de anéis heteroaromáticos parentais” são sistemas de anéis fundidos em que um ou mais dos anéis são aromáticos e um ou mais dos anéis são saturados ou insaturados, tais como, por exemplo, benzodioxano, benzofurano, cromano, cromeno, indol, indolina, xanteno, etc. incluídos na definição de "sistema de anel heteroaromático parental" são aqueles anéis reconhecidos que incluem substituintes comuns, como, por exemplo, benzopirona e 1-metil-1,2,3,4-tetrazol. Sistemas de anéis heteroaromáticos parentais típicos incluem, porém sem limitação, acridina, benzimidazol, benzisoxazol, benzodioxano, benzodioxol, benzofurano, benzopirona, benzotiadiazol, benzotiazol, benzotriazol, benzoxaxina, benzoxazol, benzoxazolina, carbazol, β-carbolina, cromano, cromeno, cinnolina, furano, imidazol, indazol, indol, indolina, indolizina, isobenzofurano, isocromeno, isoindol, isoindolina, isoquinolina, isotiazol, isoxazol, naftiridina, oxadiazol, oxazol, perimidina, fenantridina, fenantrolina, fenazina, ftalazina, pteridina, purina, pirano, pirazina, pirazol, piridazina, piridina, pirimidina, pirrol, pirrolizina, quinazolina, quinolina, quinolizina, quinoxalina, tetrazol, tiadiazol, tiazol, tiofeno, triazol, xanteno, e similares.

[035] “Heteroarila", por si só ou como parte de outro substituinte, se refere a um grupo heteroaromático monovalente com o número declarado de átomos do anel (por exemplo, "5-14 membros" significa de 5 a 14 átomos do anel) derivado da remoção de um átomo de hidrogênio de um único átomo de um sistema de anel heteroaromático parental. Grupos heteroarila típicos incluem, porém sem limitação, derivados de acridina, benzimidazol, benzisoxazol, benzodioxano, benzodiaxol, benzofurano, benzopirona, benzotiadiazol, benzotiazol, benzotriazol, benzoxazina, benzoxazol, benzoxazolina, carbazol, β-carbolina, cromano, cromeno, cinnolina, furano, imidazol, indazol, indol, indolina, indolizina, isobenzofurano, isocromeno,

isoindol, isoindolina, isoquinolina, isotiazol, isoxazol, naftiridina, oxadiazol, oxazol, perimidina, fenantridina, fenantrolina, fenazina, ftalazina, pteridina, purina, pirano, pirazina, pirazol, piridazina, piridina, pirimidina, pirrol, pirrolizina, quinazolina, quinolina, quinolizina, quinoxalina, tetrazol, tiadiazol, tiazol, tiofeno, triazol, xanteno, e similares, bem como os vários isômeros hidro dos mesmos.

[036] “Heteroarilalquila", por si só ou como parte de outro substituinte, se refere a um grupo alquila acíclico no qual um dos átomos de hidrogênio ligados a um átomo de carbono, em algumas modalidades, um terminal ou átomo de carbono sp3, é substituído por um grupo heteroarila. Quando se pretendem porções químicas de alquila tendo um grau de saturação especificado, a nomenclatura heteroarilalcanila, heteroarilalquenila e/ou heteroarilalquinila é usada. Quando um número definido de átomos é declarado, por exemplo, heteroarilalquila de 6-20 membros, o número se refere ao número total de átomos compreendendo o grupo arilalquila.

[037] “Haloalquila", por si só ou como parte de outro substituinte, se refere a um grupo alquila no qual um ou mais dos átomos de hidrogênio são substituídos por um halogênio. Assim, o termo “haloalquila" pretende incluir mono-haloalquila, di- haloalquila, tri-haloalquila, etc. até per-haloalquila. Por exemplo, a expressão "(C1- C2) haloalquila" inclui fluorometila, difluorometila, trifluorometila, 1-fluoroetila, 1,1- difluoroetila, 1,2-difluoroetila, 1,1,1-trifluoroetila, perfluoroetila, etc.

[038] Os grupos definidos acima podem incluir prefixos e/ou sufixos que são comumente usados na técnica para criar grupos substituintes adicionais bem reconhecidos. Como exemplos específicos não limitantes, “alquilóxi” e/ou “alcóxi” se referem a um grupo da fórmula —OR″, “alquilamina” se refere a um grupo da fórmula —NHR″ e “dialquilamina” se refere a um grupo de fórmula —NR″R″, em que cada R″ é uma alquila.

[039] Tal como aqui utilizado, "DNA" se refere ao ácido desoxirribonucleico em suas várias formas conforme entendido na técnica, como DNA genômico, cDNA,

moléculas de ácido nucleico isoladas, DNA de vetor e DNA cromossômico. "Ácido nucleico" se refere a DNA ou RNA (ácido ribonucleico) em qualquer forma. Tal como aqui utilizado, o termo "molécula de ácido nucleico isolada” se refere a uma molécula de ácido nucleico (DNA ou RNA) que foi removida de seu ambiente nativo. Alguns exemplos de moléculas de ácido nucleico isoladas são moléculas de DNA recombinante contidas em um vetor,

[040] Moléculas de DNA mantidas em uma célula hospedeira heteróloga, moléculas de ácido nucleico parcial ou substancialmente purificadas e moléculas de DNA sintéticas. Um ácido nucleico "isolado" pode estar livre de sequências que flanqueiam naturalmente o ácido nucleico (isto é, sequências localizadas nas extremidades 5’ e 3' do ácido nucleico) no DNA genômico do organismo do qual o ácido nucleico é derivado. Além disso, uma molécula de ácido nucleico "isolada", como uma molécula de cDNA, pode ser substancialmente livre de outro material celular ou meio de cultura quando produzida por técnicas recombinantes, ou de precursores químicos ou outros produtos químicos quando quimicamente sintetizados.

[041] Loci de “repetição em tandem curta” ou “STR” se referem a regiões de DNA genômico que contêm elementos de sequência repetitivos curtos. Os elementos de sequência que são repetidos não estão limitados a, mas geralmente têm de três a sete pares de bases de comprimento. Cada elemento de sequência é repetido pelo menos uma vez dentro de um STR e é referido neste documento como uma "unidade de repetição". O termo STR também abrange uma região de DNA genômico em que mais do que uma única unidade de repetição é repetida em tandem ou com bases intervenientes, desde que pelo menos uma das sequências seja repetida pelo menos duas vezes em tandem.

[042] "Loci de repetição em tandem curto polimórfico" se refere a loci STR em que o número de elementos de sequência repetitivos (e comprimento líquido da sequência) em uma região particular do DNA genômico varia de alelo para alelo e de indivíduo para indivíduo.

[043] Conforme usado neste documento, "escada alélica" se refere a um marcador de tamanho padrão que consiste em alelos amplificados do locus. “Alelo” se refere a uma variação genética associada a um segmento de DNA; isto é, uma de duas ou mais formas alternativas de uma sequência de DNA ocupando o mesmo locus.

[044] "Nomenclatura bioquímica" se refere à nomenclatura bioquímica padrão, tal como aqui utilizado, em que as bases de nucleotídeos são designadas como adenina (A), timina (T), guanina (G) e citosina (C). Os nucleotídeos correspondentes são, por exemplo, desoxiguanosina-5'• trifosfato (dGTP).

[045] "Polimorfismo de DNA" se refere à condição na qual duas ou mais sequências de nucleotídeos diferentes em uma sequência de DNA coexistem na mesma população de cruzamento.

[046] “Locus” ou “locus genético” se refere a uma posição física específica em um cromossomo. Os alelos de um locus estão localizados em locais idênticos em cromossomos homólogos.

[047] "Iniciador específico do locus" se refere a um iniciador que hibridiza especificamente com uma porção do locus declarado ou sua fita complementar, pelo menos para um alelo do locus, e não hibridiza eficientemente com outras sequências de DNA nas condições usadas na amplificação método.

[048] "Reação em cadeia da polimerase" ou "PCR" se refere a uma técnica na qual ciclos repetitivos de desnaturação, anelamento com um iniciador e extensão com uma enzima DNA polimerase são usados para amplificar o número de cópias de uma sequência de DNA alvo em aproximadamente 106 vezes ou mais. O processo de PCR para amplificar ácidos nucleicos está coberto pelas Patentes nos US 4.683.195 e 4.683.202, que são incorporadas no presente documento em sua totalidade a título de referência para uma descrição do processo. As condições de reação para qualquer PCR compreendem os componentes químicos da reação e suas concentrações, as temperaturas usadas nos ciclos de reação, o número de ciclos da reação e a duração dos estágios dos ciclos de reação.

[049] Conforme usado neste documento, "amplificar" se refere ao processo de aumentar enzimaticamente a quantidade de uma sequência de nucleotídeos específica. Esta amplificação não está limitada a, mas geralmente é realizada por PCR. Conforme usado neste documento, "desnaturação" se refere à separação de duas fitas de nucleotídeos complementares de um estado anelado. A desnaturação pode ser induzida por uma série de fatores, como, por exemplo, força iônica do tampão, temperatura ou produtos químicos que interrompem as interações de emparelhamento de bases. Conforme usado neste documento, "anelamento" se refere à interação específica entre as fitas de nucleotídeos em que as fitas se ligam umas às outras substancialmente com base na complementaridade entre as fitas, conforme determinado pelo emparelhamento de bases Watson-Crick. Não é necessário que a complementaridade seja de 100% para que ocorra o anelamento. Tal como aqui utilizado, "extensão" se refere ao ciclo de amplificação após o oligonucleotídeo iniciador e o ácido nucleico alvo terem sido anelados, em que a enzima polimerase efetua a extensão do iniciador nos fragmentos de tamanho apropriado usando o ácido nucleico alvo como modelo replicativo.

[050] "Iniciador" se refere a um oligonucleotídeo de fita simples ou fragmento de DNA que hibridiza com uma fita de DNA de um locus de tal maneira que o terminal 3’ do iniciador possa atuar como um local de polimerização e extensão usando uma enzima DNA polimerase. "Par de iniciadores" se refere a dois iniciadores compreendendo um iniciador 1 que hibridiza com uma única fita em uma extremidade da sequência de DNA a ser amplificada e um iniciador 2 que hibridiza com a outra extremidade na fita complementar da sequência de DNA a ser amplificada. "Local do iniciador" se refere à área do DNA alvo com a qual um iniciador hibridiza.

[051] “Marcadores genéticos” geralmente são alelos do DNA genômico com características de interesse para análise, como a tipagem de DNA, em que os indivíduos são diferenciados com base nas variações de seu DNA. A maioria dos métodos de tipagem de DNA são projetados para detectar e analisar diferenças no comprimento e/ou sequência de uma ou mais regiões de marcadores de DNA conhecidos por aparecerem em pelo menos duas formas ou alelos diferentes em uma população. Essa variação é referida como "polimorfismo" e qualquer região do DNA em que tal variação ocorre é referida como um "locus polimórfico". Um método possível de realizar a tipagem de DNA envolve a união da tecnologia de amplificação por PCR (KB Mullis, Patente no US 4.683.202) com a análise de polimorfismos de variação de comprimento. O PCR tradicionalmente só poderia ser usado para amplificar segmentos de DNA relativamente pequenos de forma confiável; isto é, amplificando apenas segmentos de DNA com menos de 3.000 bases de comprimento (M. Ponce e L. Micol (1992), NAR 20 (3): 623; R. Decorte et al. (1990), DNA CELL BIOL 9 (6): 461 469). Repetições curtas em tandem (STRs), minissatélites e número variável de repetições em tandem (VNTRs) são alguns exemplos de polimorfismos de variação de comprimento. Os segmentos de DNA contendo minissatélites ou VNTRs são geralmente muito longos para serem amplificados de forma confiável por PCR. Em contrapartida, os STRs, contendo unidades de repetição de aproximadamente três a sete nucleotídeos, são curtos o suficiente para serem úteis como marcadores genéticos em aplicações de PCR, porque os protocolos de amplificação podem ser projetados para produzir produtos menores do que é possível a partir de outras regiões de comprimento variável do DNA.

[052] Conforme usado neste documento, o termo "kit" se refere a qualquer sistema de entrega para entrega de materiais. No contexto de ensaios de reação, tais sistemas de entrega incluem sistemas que permitem o armazenamento, transporte ou entrega de reagentes de reação (por exemplo, oligonucleotídeos, enzimas, conjunto (ou conjuntos) de iniciadores, etc. nos recipientes apropriados) e/ou materiais de suporte (por exemplo, tampões, instruções escritas para realizar o ensaio, etc.) de um local para outro. Por exemplo, os kits podem incluir um ou mais invólucros (por exemplo, caixas) contendo os reagentes de reação relevantes e/ou materiais de suporte. Conforme usado neste documento, o termo "kit fragmentado" se refere a um sistema de entrega que compreende dois ou mais recipientes separados, cada um contendo uma subporção dos componentes totais do kit. Os recipientes podem ser entregues ao destinatário pretendido juntos ou separadamente. Por exemplo, um primeiro recipiente pode conter uma enzima para uso em um ensaio, enquanto um segundo recipiente contém oligonucleotídeos. Na verdade, qualquer sistema de entrega compreendendo dois ou mais recipientes separados, em que cada um contém uma subporção dos componentes totais do kit, estão incluídos no termo "kit fragmentado". Em contrapartida, um "kit combinado" se refere a um sistema de entrega contendo todos os componentes de um ensaio de reação em um único recipiente (por exemplo, em uma única caixa que abriga cada um dos componentes desejados). O termo “kit” inclui kits fragmentados e combinados.

4.2 MODALIDADES EXEMPLIFICATIVAS

[053] A presente divulgação fornece reagentes que podem ser usados para sintetizar quimicamente oligonucleotídeos contendo porções químicas de marcador que compreendem corantes de rodamina. Tradicionalmente, tem sido difícil sintetizar quimicamente oligonucleotídeos marcados com rodamina devido, em parte, à falta de disponibilidade de reagentes de síntese contendo rodamina que são estáveis às condições de síntese e/ou desproteção comumente empregadas na síntese química passo a passo de oligonucleotídeos. Foi agora descoberto que proteger os grupos amina exocíclicos de corantes NH-rodamina com grupos protetores lábeis em bases, tais como grupos acetila, fornece corantes NH-rodamina N-protegida que são estáveis à síntese química e às condições de desproteção comumente empregadas no síntese em fase sólida de oligonucleotídeos. Como consequência, as NH- rodaminas N-protegidas podem ser incorporadas em reagentes que podem ser usados para sintetizar oligonucleotídeos marcados com porções químicas de marcador que compreendem corantes de rodamina, evitando assim a necessidade de anexar os marcadores pós-síntese. Como os marcadores são fixados durante a síntese, o oligonucleotídeo marcado resultante pode ser purificado para uso sem o uso de HPLC.

[054] Os reagentes tiram vantagem de várias características de reagentes e produtos químicos que são bem conhecidos para a síntese em fase sólida de oligonucleotídeos e podem estar na forma de reagentes de síntese que são acoplados a um grupo hidroxila durante a fase sólida em etapas síntese de uma cadeia de oligonucleotídeo, ou na forma de reagentes de suporte sólido aos quais reagentes de monômero de nucleosídeo, tais como reagentes de fosforamidita de nucleosídeo e/ou opcionalmente outros reagentes, são acoplados em uma forma passo a passo para produzir um oligonucleotídeo sintético.

[055] A síntese e os reagentes de suporte sólido podem ser de natureza nucleosídica em que podem incluir uma porção química de nucleosídeo, ou podem ser de natureza não nucleosídica.

[056] Todos os reagentes aqui descritos incluem uma porção química de marcador que compreende um corante ou porção química de NH-rodamina N- protegida. O corante NH-rodamina N-protegida pode ser o único corante que compreende a porção química de marcador ou, alternativamente, pode ser um dentre dois ou mais corantes que compreendem uma rede de corantes maior. Os reagentes de suporte sólido incluem adicionalmente um suporte sólido e uma ou mais alças de síntese às quais grupos adicionais podem ser acoplados. Os reagentes de síntese incluem adicionalmente um grupo PEP útil para acoplar o reagente a um grupo hidroxila primária e podem opcionalmente incluir uma ou mais alças de síntese. As várias porções químicas e grupos que compreendem os reagentes podem ser ligados entre si de qualquer forma e/ou orientação que lhes permita realizar suas respectivas funções. Eles podem ser ligados uns aos outros através de grupos de ligação incluídos nas porções químicas, ou podem ser ligados uns aos outros com a ajuda de ligantes.

[057] As várias porções químicas, grupos e ligantes que compreendem os reagentes aqui descritos são descritos em mais detalhes abaixo.

4.3 LIGANTES E GRUPOS DE LIGAÇÃO

[058] Os vários grupos e porções químicas que compreendem os reagentes aqui descritos são tipicamente conectados uns aos outros com ligantes. A identidade de qualquer ligante particular dependerá, em parte, das identidades das porções químicas sendo ligadas umas às outras. Em geral, os ligantes incluem uma porção química de espaçamento que pode compreender virtualmente qualquer combinação de átomos ou grupos funcionais estáveis às condições sintéticas usadas para a síntese de oligonucleotídeos marcados, tais como as condições comumente usadas para sintetizar oligonucleotídeos pelo método do triéster de fosfito, e podem ter estrutura linear, ramificada ou cíclica, ou podem incluir combinações de estruturas lineares, ramificadas e/ou cíclicas. A porção química de espaçamento pode ser monomérica por natureza, ou pode ser ou incluir regiões que são poliméricas por natureza. A porção química de espaçamento pode ser projetada para ter propriedades específicas, tais como a capacidade de ser clivada sob condições especificadas, ou graus especificados de rigidez, flexibilidade, hidrofobicidade e/ou hidrofilicidade.

[059] Como será descrito em mais detalhes abaixo, muitas modalidades dos reagentes aqui descritos são sintetizadas condensando-se síntons uns aos outros em formas especificadas para produzir os reagentes desejados. Cada sínton inclui tipicamente um ou mais grupos de ligação adequados para formar as ligações desejadas. Geralmente, o grupo de ligação compreende um grupo funcional Fy que é capaz de reagir com, ou que é capaz de ser ativado de modo a ser capaz de reagir com, outro grupo funcional Fz para produzir uma ligação covalente Y — Z, em que Y representa a parte da ligação contribuída por Fy, e Z, a parte com a contribuição de Fz. Tais grupos Fy e Fz são referidos neste documento como "grupos funcionais complementares".

[060] Pares de grupos funcionais complementares capazes de formar ligações covalentes entre si são bem conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, um dentre Fy ou Fz compreende um grupo nucleofílico e o outro de Fy ou Fz compreende um grupo eletrofílico. Grupos nucleofílicos e eletrofílicos complementares úteis para formar ligações (ou precursores dos mesmos que são ou que podem ser adequadamente ativados de modo a formar ligações) que são estáveis a uma variedade de síntese e outras condições são bem conhecidos na técnica. Exemplos de grupos nucleofílicos e eletrofílicos complementares adequados que podem ser usados para efetuar ligações nos vários reagentes aqui descritos, bem como as ligações resultantes formadas a partir dos mesmos, são fornecidos na Tabela 1, abaixo: Tabela 1 Grupo eletrofílico Grupo nucleofílico Ligação covalente resultante Ésteres ativados* Aminas/anilinas Carboxamidas Acil alzidas ** Aminas/anilinas Carboxamidas Acil haletos Aminas/anilinas Carboxamidas Acil haletos Álcoois/fenóis ésteres Acil nitrilas Álcoois/fenóis ésteres

Acil nitrilas Aminas/anilinas Carboxamidas Aldeídos Aminas/anilinas Carboxamidas Aldeídos ou cetonas Hidrazinas Hidrazonas Aldeídos ou cetonas Hidroxilaminas Oximas Alquil haletos Aminas/anilinas Aminas alquila Alquil haletos Ácidos carboxílicos Ésteres Alquil haletos Tióis Tio éteres Alquil haletos Álcoois/fenóis Éteres Sulfonatos de alquila Tióis Tio éteres Sulfonatos de alquila Ácidos carboxílicos Ésteres Sulfonatos de alquila Álcoois/fenóis Ésteres Anidridos Álcoois/fenóis Ésteres Anidridos Aminas/anilinas Carboxamidas Aril haletos Tióis Tiofenóis Aril haletos Aminas Aril aminas Aziridinas Tióis Tio éteres Boronatos Glicóis Ésteres de boronato Ácidos carboxílicos Aminas/anilinas Carboxamidas Ácidos carboxílicos Álcoois Ésteres Ácidos carboxílicos Hidrazinas Hidrazidas Carbodi-imidas Ácidos carboxílicos N-acilureia ou anidridos Diazoalcanos Ácidos carboxílicos Ésteres Epóxidos Tióis Tioéteres Haloacetamidas Tióis Tioéteres Halotriazinas Aminas/anilinas Aminotriazinas Halotriazinas Álcoois/fenóis Éteres triazinílicos Ésteres de imido Amina/anilinas Amidinas Isocianatos Amina/anilinas Ureias Isocianatos Álcoois/fenóis Uretanos

[061] Assim, os síntons ligantes podem geralmente ser descritos pela fórmula LG-Sp-LG, em que cada LG representa, independentemente um do outro,

um grupo de ligação e Sp representa a porção química de espaçamento. Em algumas modalidades, os síntons ligantes podem ser descritos pela fórmula Fz-Sp- Fz, em que cada Fz representa, independentemente um do outro, um membro de um par de grupos funcionais nucleofílicos ou eletrofílicos complementares, conforme descrito acima. Em modalidades específicas, cada Fz é, independentemente um do outro, selecionado a partir dos grupos listados na Tabela 1, acima. Síntons ligantes deste tipo formam porções químicas ligantes da fórmula —Z-Sp-Z—, em que cada Z representa, independentemente um do outro, uma porção de uma ligação como descrito acima. Ligantes específicos adequados para ligar grupos e porções químicas especificados uns aos outros nos reagentes descritos neste documento serão discutidos em mais detalhes em conexão com modalidades exemplificativas dos reagentes. Modalidades exemplificativas não limitantes de ligantes que podem ser usadas para ligar os vários grupos e porções químicas que compreendem os reagentes aqui descritos uns aos outros são ilustradas na Figura 2. Na Figura 2, Z1 e Z2, cada um, representam, independentemente um do outro, uma porção de uma ligação contribuída por um grupo funcional Fz, como descrito anteriormente, e K é selecionado a partir de —CH— e —N—. Em algumas modalidades específicas dos ligantes ilustrados na Figura 2, um dentre Z1 ou Z2 é —NH— e o outro é selecionado de -O-, C(O)- e -S(O)2-.

4.4 PORÇÃO QUÍMICA DE MARCADOR

[062] Os reagentes aqui descritos podem incluir uma porção química de marcador que compreende um corante NH-rodamina que é protegido em um dos grupos amina exocíclicos com um grupo protetor tendo propriedades especificadas. Geralmente, os corantes de rodamina são caracterizados por quatro características principais: (1) um anel xanteno parental; (2) um substituinte de amina exocíclica; (3) um substituinte de imínio exocíclico; e (4) um grupo fenila substituído na posição orto por um grupo carboxila. Em algumas modalidades, o corante NH-rodamina da divulgação pode ser geralmente descrito pela fórmula (Ia). Em algumas modalidades, os grupos de amina exocíclica e/ou imínio são tipicamente posicionados nos átomos de carbono C3’ e C6' do anel de xanteno parental, embora rodaminas "estendidas" em que o anel de xanteno parental compreende um grupo benzo fundido ao carbonos C3' e C4' e/ou os carbonos C5' e C6' também são conhecidos. Nessas rodaminas estendidas, os grupos de amina e imínio exocíclicos característicos são posicionados nas posições correspondentes do anel de xanteno estendido.

[063] O grupo fenila substituído por carboxila está ligado ao carbono C1 do anel xanteno parental. Como consequência do substituinte orto carboxila, os corantes de rodamina podem existir em duas formas diferentes: (1) a forma ácida aberta; e (2) a forma fechada de lactona. Embora não pretenda estar limitado por qualquer teoria de operação, porque os espectros de RMN de corantes NH- rodamina N-protegida exemplificativos aqui descritos são consistentes com a forma espiro lactona fechada do corante, acredita-se que os corantes NH-rodamina N- protegida compreendendo a porção química de marcador dos reagentes aqui descritos estão na forma fechada de espiro lactona. Assim, as várias rodaminas, bem como suas contrapartes desprotegidas, são ilustradas aqui em sua forma fechada de espirolactona. No entanto, é de notar que isto é apenas por conveniência e não se destina a limitar os vários reagentes aqui descritos à forma lactona dos corantes. Em certas modalidades, a forma ácida aberta do composto é fluorescente (ou exibe um aumento na fluorescência) em relação à forma fechada espirolactona do composto. Os grupos amina dos compostos descritos neste documento podem ser protegidos na forma fechada de espirolactona e podem ser transformados em e usados como fosforamiditas para alto rendimento e marcação de alta pureza de ácidos nucleicos. Assim, também são fornecidos aqui sondas e iniciadores de ácido nucleico marcados com fluorescência que incluem compostos na forma de lactona aberta desprotegida. Exemplos representativos da forma de lactona aberta após a desproteção dos grupos amina e clivagem da sonda de ácido nucleico de um suporte sólido são mostrados nas Figuras 8 e 9.

[064] Na forma fechada, espiro lactona, os anéis A e C do anel xanteno original são aromáticos, e ambos os substituintes C3' e C6' são aminas. Os grupos amina exocíclicos dos corantes rodamina incluídos nas porções químicas de marcador aqui descritas são não substituídos ou monossubstituídos de modo que esses grupos amina sejam aminas primárias ou secundárias. Esses corantes de rodamina são aqui referidos como "NH-rodaminas". Assim, tal como aqui utilizado, uma "NH-rodamina” geralmente compreende a seguinte estrutura de anel de NH- rodamina parental: (Ia) em que cada um dentre R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13 e R14 são como aqui definidos. No anel de NH-rodamina parental representado acima, os vários átomos de carbono são numerados usando uma convenção de numeração arbitrária adotada a partir de uma convenção de numeração comumente usada para a forma fechada espiro lactona de corantes de rodamina. Este sistema de numeração está sendo usado apenas por conveniência e não tem a intenção de ser limitante.

[065] Em qualquer uma das modalidades aqui descritas, porções químicas de marcador exemplificativas podem ser da fórmula (II.1), (II.2), (II.3), (II.4)

(II.1) (II.2) i

R h R5 R Rj R3

N O N R4 R9 R2 R7 R1 O R 6 R11 O R12 R14 R13 (II.3)

Ri R5 3 Rh Rj

R Rd

N O N R4 Re R2 Rf R1 O R 6 Rg R11 O R12 R14 R13 (II.4), e similares.

[066] Um indivíduo versado na técnica apreciará prontamente que a presente divulgação descreve outras porções químicas de marcador dentro da fórmula I, tais como aquelas da fórmula (II.1), (II.2) e (II.3), em que a ligação dupla opcional entre Rf e Rg é alternativamente entre Re e Rf. Além disso, um indivíduo versado na técnica apreciará prontamente que um grupo Rd adicional pode estar presente em cada um dentre Re e Rf, quando a ligação dupla entre Re e Rf não está presente, ou os grupos adicionais em Re e Rf são H. Além disso, um indivíduo versado na técnica apreciará que outras modalidades em que uma ligação dupla opcional entre Rh e Ri ou Ri e Rj podem estar presentes.

[067] Nos anéis de NH-rodaminas de fórmula estrutural (Ia) e outras fórmulas aqui descritos, R5 representa hidrogênio ou grupos substituintes substituindo a amina exocíclica ao qual R5 está ligado. Em algumas modalidades, R5 pode ser alquilarila ou grupo arilalquila substituído ou não substituído. Em algumas modalidades, R5 pode ser um grupo protetor.

[068] Em algumas modalidades, R4, R9 e/ou R10 podem compreender um substituinte que está ligado a um átomo de carbono adjacente de modo que o átomo de nitrogênio ilustrado esteja incluído em um anel que contém 5 ou 6 átomos no anel. O anel pode ser saturado ou insaturado e um ou mais dos átomos do anel podem ser substituídos. Quando o átomo (ou átomos) do anel é substituído, os substituintes são tipicamente, independentemente uns dos outros, selecionados a partir de grupos alquila inferior, C6-C14 arila e C7-C20 arilalquila.

[069] Alternativamente, dois átomos de anel adjacentes podem ser incluídos em uma ponte de arila, como um grupo benzo ou nafto. Modalidades exemplificativas não limitantes de corantes de rodamina que incluem um anel de NH-rodamina parental de acordo com a fórmula estrutural (Ia) em que o grupo R4, R9 e/ou R10 é hidrogênio ou grupos alquila inferior ou estão incluídos em grupos opcionalmente substituídos anéis por átomos de carbono adjacentes. Um ou mais dos átomos de carbono nas posições C1, C4, C5, C6, C7, C1', C2', C4', C5’, C7' e C8' dos anéis de rodamina NH parental de acordo com a fórmula estrutural (Ia) podem ser, independentemente um do outro, não substituídos ou substituídos por grupos substituintes como aqui definidos. E grupos úteis para substituir corantes de rodamina nestas posições são bem conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, na Pat. no US 4.622.400. Patente no US 5.750.409, Patente no US

5.847.162, Pat. no US 6.017.712, Pat. no US 6.080.852, Pat. no US 6.184.379 e Pat. no US 6.248.884, cujas divulgações são incorporadas no presente documento a título de referência.

[070] Em algumas modalidades, os grupos substituintes são, independentemente entre si, selecionados a partir de alquila inferior, (C6-C14) arila, (C7-C20) arilalquila, heteroarila de 5-14 membros, heteroarilalquila de 6-20 membros, Rb e -(CH2)xRb, em que x é um numero inteiro na faixa de 1 a 10 e Rb é independentemente selecionado a partir de -X, -OH, -ORa, -SH, -SRa -NH2, -NHRa, - NRcRc, -N+RcRcRc, per-halo alquila inferior, tri-halometila, trilfluorometila, -P(O)(OH)2, -P(O)(ORa)2, P(O)(OH)(ORa), -OP(O)(OH)2, -OP(O)(ORa)2, -OP(O)(ORa)(OH), - S(O)2OH, -S(O)2Ra, -C(O)H, -C(O)Ra, -C(S)X, -C(O)ORa, -C(O)OH, -C(O)NH2, - C(O)NHRa, -C(O)NRcRc, -C(S)NH2, -C(O)NHRa, -C(O)NRcRc, -C(NH)NH2, - C(NH)NHRa e -C(NH)NRcRc, em que X é um halo (preferencialmente flúor ou cloro), cada Ra é, independentemente dos outros, selecionado a partir de alquila inferior,

(C6-C14) arila, (C7-C20) arilalquila, heteroarirla de 5-14 membros e heteroarilalquila de 6-20 membros, e cada Rc é, independentemente dos outros, um Ra, ou, alternativamente, dois Rc ligados ao mesmo átomo de nitrogênio podem ser tomados em conjunto com esse átomo de nitrogênio para formar um anel saturado ou insaturado de 5 a 8 membros que pode opcionalmente incluir um ou mais dos heteroátomos do mesmo anel ou de anel diferente, que são tipicamente selecionados a partir de O, N e S. Alternativamente, os substituintes de C1' e C2', e/ou os substituintes de C7’ e C8’ podem ser tomados em conjunto para formar pontes de arila substituída ou não substituída. Tal como pontes de benzo, com a condição de que os substituintes de C1' e C2' e os substituintes de C7' e C8' não sejam incluídos simultaneamente em uma ponte de arila. Em algumas modalidades, os grupos usados para substituir os carbonos C1, C4, C5, C6, C7, C1', C2', C4', C5,' C7' e C8' não promovem a extinção do corante rodamina, embora em algumas modalidades substituintes de extinção possam ser desejáveis. Substituintes capazes de extinguir os corantes de rodamina incluem carbonila, carboxilato, metais pesados, nitro, bromo e iodo. Os átomos de carbono nas posições C4, C5, C6 e C7 dos anéis parentais NH-rodamina de fórmula estrutural (Ia) também podem, independentemente um do outro, incluir substituintes opcionais. Estes substituintes podem ser selecionados a partir dos vários substituintes descritos acima. Em algumas modalidades, os átomos de carbono nas posições C4 e C7 são substituídos com grupos cloro de modo que o corante NH-rodamina parental é um corante NH- 4,7-diclororrodamina. Um grande número de corantes de rodamina que incluem anéis de rodamina NH parentais de acordo com a fórmula estrutural (Ia) que podem ser incluídos na porção química de marcador dos reagentes descritos neste documento é conhecido na técnica e é descrito, por exemplo, na Pat. no US.

6.248.884; Pat. no US 6.111.116; Patente no US 6.080.852; Patente no US

6.051.719, Pat. no US 6.025.505; Patente no US 6.017.712; Patente no US

5.936.087; Patente no US 5.847.162; Patente no US 5.840.999; Patente no US

5.750.409: Patente no US 5.366.860; Patente no US 5.231.191; Patente no US

5.227.487; WO97/36960; WO99/27020; Lee et al., 1992, Nucl. Acids Res. 20: 2471- 2483; Arden-Jacob, “Neue Lanwellige Xanthen Farbstoffe für FluoreszenZSonden und Farbstoff Lauer, Springer-Verlag, Alemanha, 1993; Sauer et al., 1995, Fluorescence 5: 247-261; Lee et al., 1997, Nucl. Acids Res. 25: 2816 2822; e Rosenblum et al., 1997, Nucl. Acids Res. 25: 4500 4504, cujas divulgações são incorporadas no presente documento a título de referência. Qualquer um dos corantes descritos nessas referências em que as aminas exocíclicas são aminas primárias ou secundárias como aqui descrito, ou 4,7-dicloro análogos de tais corantes rodamina NH pode ser incluído na porção química de marcador dos reagentes aqui descritos.

[071] Uma vez que os reagentes aqui descritos serão utilizados para sintetizar quimicamente oligonucleidos marcados, R5 pode ser um grupo protetor que é estável para as condições de síntese orgânicos usados para sintetizar oligonucleótidos. Como mencionado acima, R5 pode ser uma proteção que protege a amina na forma de uma amida, por exemplo, uma carboxamida, uma sulfonamida ou uma fosforamida, pode ser selecionada como protegendo a amina exocíclica dessa maneira, e acredita-se que “travar" a NH-rodamina protegida na forma lactona fechada, contribuindo para a estabilidade dos reagentes aqui descritos. Embora não seja necessário, pode ser conveniente utilizar um grupo protetor R5 que é lábil nas condições usadas para remover os grupos que protegem as aminas exocíclicas de uma nucleobase do oligonucleotídeo sintético, de modo que o grupo protetor possa ser removido em uma única etapa.

[072] As condições utilizadas para sintetizar e desproteger oligonucleotídeos sintéticos são bem conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, em Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, Vol. I, Beancage et al., Eds. John Wiley & Sons,

2002, cuja divulgação é incorporada no presente documento a título de referência. Resumidamente, os métodos de síntese que empregam reagentes de fosforamidita envolvem múltiplas rodadas de: (i) desproteção de DMT para revelar uma hidroxila livre, que pode ser efetuada por tratamento com 2,5% ou 3% de ácido di ou tri- cloroacético em diclorometano; (ii) acoplamento de nucleosídeo ou outros reagentes de fosforamidita à hidroxila livre, que pode ser realizado em acetonitrila contendo tetrazol a 0,45 M ou 0,5 M; (iii) oxidação, que pode ser realizada por tratamento com I2/2,6-lutidina/H2O, e capeamento, que pode ser realizado por tratamento com 6,5% de anidrido acético em tetra-hidrofurano (THF) seguido de tratamento com 1- metilimidazol (MI) a 10% em THF.

[073] Outras condições para realizar as várias etapas da síntese também são conhecidas na técnica. Por exemplo, o acoplamento de fosforamidita pode ser realizado em acetonitrila contendo 5-etiltio-1H-tetrazol a 0,25 M, 4,5-dicianoimidazol (DCI) a 0,25 M ou 5-benziltio-1H-tetrazol (BTT) a 0,25 M. A oxidação pode ser levada a cabo em I2 a 0,1 M, 0,05 M ou 0,02 M, em THF/H2O/piridina (7:2:1). O capeamento pode ser realizado por tratamento com THF/lutidina/anidrido acético seguido de tratamento com NMI a 16% em THF: por tratamento com DMAP a 6,5% em THF seguido de tratamento com de Melm a 10% em THF; ou por tratamento com Melm a 10% em THF seguido de tratamento com Melm a 16% em THF.

[074] A remoção de quaisquer grupos protetores e clivagem do reagente de síntese pode tipicamente ser realizada por tratamento com hidróxido de amônio concentrado a 60 °C por 1-12 h, embora reagentes de fosforamidita de nucleosídeo protegidos com grupos que podem ser removidos em condições mais suaves, como por tratamento com hidróxido de amônio concentrado à temperatura ambiente por 4- 17 horas ou tratamento com carbonato de potássio a 0,05 M em metanol, ou tratamento com t-butilamina a 25% em HO/EtOH, também são conhecidos na técnica. Os artesãos qualificados serão prontamente capazes de selecionar grupos protetores com propriedades adequadas para uso em condições de síntese e desproteção e/ou clivagem específicas.

Uma grande variedade de grupos protetores de amina são ensinados, por exemplo, em Greene & Wuts, "Protective Groups In Organic Chemistry". 3a Edição, John Wiley & Sons, 1999 (doravante “Green & Wuts”) em, por exemplo, páginas 309-405. Os especialistas na matéria podem selecionar facilmente os grupos protetores de R5 ou R10 que têm propriedades adequadas a partir de entre aqueles ensinados em Green & Wuts.

Em algumas modalidades, os grupos protetores R5 ou R10 são grupos acila da fórmula-C(O)R15, em que R15 é selecionado a partir de hidrogênio, alquila inferior, metila, -CX3. -CHX2. -CH2X, -CH, Od e fenila opcionalmente monossubstituída por um grupo alquila inferior, metila, X, ORd, ciano ou nitro, em que R” é selecionado a partir de alquila inferior, fenila e piridila, e cada X é um grupo halo, tipicamente flúor ou cloro.

Em algumas modalidades, R15 é metila.

Em algumas modalidades, R15 é trifluorometila.

Grupos protetores de acila, tais como aqueles definidos por -C(O)R15 podem ser removidos sob uma variedade de condições básicas, incluindo as condições suaves usadas para remover grupos protetores de oligos sintetizados com reagentes de fosforamidita "lábeis em bases", como são bem conhecidos na técnica.

Em algumas modalidades, R5 é -C(O)R15 em que R15 é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, uma alquila inferior, -CX3, -CHX2, CH2X, -CH2-ORd e fenila monossubstituída por uma alquila inferior, -X, Grupo -ORd, ciano ou nitro, em que Rd é selecionado a partir do grupo que consiste em uma alquila inferior, fenila e piridila, e cada X é um grupo halo.

Condições exemplificativas que podem ser usadas são especificadas acima.

Como será descrito em mais detalhes em seções posteriores, a porção química de NH-rodamina N-protegida que compreende a porção química de marcador pode ser ligada a outros grupos ou porções químicas.

Por exemplo, a NH- rodamina N-protegida pode ser ligada a outro corante compreendendo a porção química de marcador, a um grupo PEP, a um ligante, a uma alça de síntese, a uma porção química de extinção, a uma porção química que funciona para estabilizar as interações de emparelhamento de bases (tais como, por exemplo, um corante intercalante ou uma molécula de ligação ao sulco menor) ou a outras porções químicas. Tais ligações são tipicamente efetuadas por meio de grupos de ligação LG (descritos acima em conexão com os ligantes) ligados aos síntons NH-rodamina N- protegida usados para sintetizar os reagentes.

[075] O grupo de ligação LG pode ser ligado a qualquer átomo de carbono disponível do sínton NH-rodamina N-protegida, ou a um grupo Substituinte ligado a um desses átomos de carbono. As posições dos grupos de ligação podem depender, em parte, do grupo ou porção química à qual o sínton NH-rodamina N- protegida será ligado. Em algumas modalidades, o grupo de ligação é anexado na posição C1', C2', C4', C5', C7', C8', C5, C6 ou C7 do sínton NH-rodamina N- protegida. Em uma modalidade específica, o grupo de ligação está ligado em C4', C5'. Posição C5 ou C6.

[076] O sínton NH-rodamina N-protegida pode incluir um único grupo de ligação LG ou pode incluir mais de um grupo de ligação LG. Em modalidades que empregam mais de um grupo de ligação, os grupos de ligação podem ser iguais ou podem ser diferentes. Síntons de NH-rodamina N-protegida que incluem múltiplos grupos de ligação LG que são diferentes uns dos outros podem ter diferentes grupos ou porções químicas ligadas a diferentes posições do anel de NH-rodamina parental usando químicas ortogonais. A identidade de um grupo de ligação pode, em alguns casos, depender de sua localização no anel de NH-rodamina parental. Em algumas modalidades em que o grupo de ligação LG está ligado à posição C4'- C5’- do anel de NH-rodamina parental, o grupo de ligação LG é um grupo de fórmula geral - (CH)n-Fy, em que n é um número inteiro que varia de 0 a 10 e Fy é conforme descrito neste documento. Em algumas modalidades, n é 1 e Fy é —NH.

[077] Em algumas modalidades em que o grupo de ligação LG está ligado na posição 5 ou 6 do anel de NH-rodamina parental, o grupo de ligação LG é um grupo de fórmula -(CH2)n, -C(O)ORf, em que Rf é selecionado a partir de hidrogênio e um bom grupo de saída e n é como definido anteriormente. Em algumas modalidades específicas, o grupo de ligação LG compreende um éster NHS. Em algumas modalidades específicas, n é 0 e Rf é NHS.

[078] Conforme discutido anteriormente, a porção química de marcador pode compreender um ou mais corantes adicionais, de modo que a NH-rodamina N- protegida, uma vez desprotegida, seja um membro de uma rede de corante de transferência de energia maior. Essas redes de corante de transferência de energia são bem conhecidas na técnica e incluem combinações de corantes fluorescentes cujas propriedades espectrais são combinadas e/ou cujas distâncias relativas umas às outras são ajustadas, de modo que um corante fluorescente na rede, quando excitado pela irradiação incidente de um comprimento de onda apropriado transfere sua energia de excitação para outro corante fluorescente na rede, que então transfere sua energia de excitação para outro corante fluorescente na rede, e assim por diante, resultando em fluorescência pelo corante aceitador final na rede. Redes de corante fornecem porções químicas de marcador com longos turnos de Stoke. Nessas redes, os fluoróforos que transferem, ou doam, sua energia de excitação para outro fluoróforo na rede são chamados de "doadores". Os fluoróforos que recebem ou aceitam energia de excitação de outro fluoróforo são chamados de "aceitadores". Em redes de corantes contendo apenas dois corantes fluorescentes, um atua como o doador e o outro como o aceitador. Em redes de corantes contendo três ou mais corantes fluorescentes, pelo menos um corante atua como doador e aceitador. Os princípios de como as redes de corantes funcionam, bem como os critérios para selecionar e ligar corantes individuais adequados para criar tais redes são bem conhecidos e são descritos, por exemplo, em Hung et al., 1997, Anal. Biochem. 252: 78-88.

[079] Nas porções químicas de marcador aqui descritas que compreendem redes de corantes, o corante NH-rodamina N-protegida, uma vez desprotegido, pode atuar como um doador ou um aceitador, ou como um doador e um aceitador, dependendo das identidades dos outros corantes que compreendem a rede e os comprimentos de onda incidentes e fluorescentes desejados.

Numerosos corantes adequados para uso como doadores e/ou aceitadores de corantes NH-rodamina são conhecidos na técnica e incluem, a título de exemplo e não de limitação, corantes de xanteno (tais como, por exemplo, corantes de fluoresceína, rodamina e rodol), corantes de pireno, corantes cumarínicos (por exemplo, hidroxi- e amino-cumarinas), corantes cianina, corantes ftalocianina e complexos de lantenídeo.

Exemplos específicos e não limitantes desses corantes no contexto de redes de corantes de transferência de energia são descritos em Hung et al., 1996, Anal.

Biochem. 238: 165-170; Medintz et al., 2004, Proc.

Nat'l Acad.

Sci.

USA 101 (26): 9612-9617; Patente no US 5.800.996; Sudhaker et al., 2003, Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids 22: 1443-1445; Patente no US 6.358.684; Majumdar et al., 2005, J.

Mol.

Biol. 351: 1123-1145; Dietrich et al., 2002, Reviews Mol.

Biotechnology. 82 (3): 211-231; Tsuji et al., 2001, Biophysical J. 81 (1): 501-515; Dickson et al., 1995, J.

Photochemistry & Photobiology 27 (1): 3-19; e Kumar et al., 2004, Developments in Nucl.

Acid Res. 1: 251-274, cujas divulgações são incorporadas no presente documento a título de referências.

Qualquer um desses corantes que podem ser adequadamente protegidos de acordo com os princípios descritos neste documento pode ser usado como corante doador e aceitador em porções químicas de marcador que compreendem redes de corantes.

Em algumas modalidades, um ou mais dos corantes doadores e/ou aceitadores que compreendem a rede podem ser um corante NH-rodamina N-protegida como descrito neste documento.

Posições específicas para anexar corantes doadores e/ou corantes aceitadores de rodamina para formar redes de corantes, bem como ligações específicas e ligantes úteis para anexar tais corantes, são bem conhecidas na técnica. Exemplos específicos são descritos, por exemplo, na Pat. no 6.811.979; Patente no US 6.008.379; Patente no US 5.945.526; Patente no US 5.863.727; e Pat. no US 5.800.996, cujas divulgações são incorporadas neste documento a título de referência.

[080] Em algumas modalidades, o ligante que liga os corantes doadores e aceitadores é um ligante aniônico, conforme descrito na Patente no US 6.811.979, cuja divulgação é incorporada no presente documento a título de referência (consultar, por exemplo, a divulgação na Col. 17, linha 25 a Col. 18, linha 37 e Figuras 1-17).

[081] Em algumas modalidades dos reagentes aqui descritos, a porção química de marcador inclui um corante doador para o corante NH-rodamina. Em algumas modalidades, o corante doador é um corante de fluoresceína ou rodamina, tal como, por exemplo, um dos corantes NH-rodamina aqui descritos. Em uma modalidade específica, o corante doador é um corante de fluoresceína. Os corantes de fluoresceína são semelhantes em estrutura aos corantes de rodamina, com a exceção de que as posições 3 e 6 do anel de xanteno original (correspondendo às posições 3' e 6' dos anéis NH-rodamina de fórmula estrutural (Ia)), são substituídos por grupos hidroxila. Como as rodaminas, as fluoresceínas também podem ter estruturas de anel estendidas nas quais os átomos de carbono nas posições C3' e C4' e/ou C5' e C6' do anel xanteno parental estão incluídos em pontes de arila, tais como grupos benzo. Assim, as fluoresceínas geralmente incluem compostos de acordo com as fórmulas estruturais (IVa), (IVb) e (IVc), abaixo: (IVa)

(IVb) (IVc)

[082] Como as NH-rodaminas, os carbonos nas posições C1′, C2′, C2″, C4′, C4″, C5′, C5″, C7′, C7″, C8′, C4, C5, C6 e C7 da anéis fluoroesceína de fórmulas estruturais (IVa), (IVb) e (IVc) podem ser substituídos por uma variedade de substituintes diferentes, tais como aqueles descritos anteriormente para as NH- rodaminas.

[083] Quando incluídos nas porções químicas de marcador aqui descritas, as hidroxilas nas posições C3' e C6' devem ser protegidas com grupos protetores tendo as mesmas propriedades gerais que os grupos que protegem as aminas exocíclicas das NH-rodaminas, discutidas acima. Assim, em modalidades específicas, os grupos protetores são estáveis nas condições usadas para sintetizar oligonucleotídeos, tais como as condições usadas para sintetizar e oxidar oligonucleotídeos por meio do método do triéster de fosfito e são instáveis nas condições tipicamente usadas para desproteger e/ou clivar oligonucleotídeos sintéticos da resina de síntese, tal como, por exemplo, incubação em hidróxido de amônio concentrado à temperatura ambiente ou 55 °C.

[084] As fluoresceínas nas quais as hidroxilas exocíclicas C3′ e C6′ incluem grupos protetores são aqui referidas como "fluoresceínas protegidas em O". As fluoresceínas protegidas em O correspondentes às fluoresceínas das fórmulas estruturais (IVa), (IVb) e (IVc), respectivamente, são ilustradas como fórmulas estruturais (Va), (Vb) e (Vc), abaixo: (Va) (Vb) (Vc) em que R5 representa o grupo protetor.

[085] Uma variedade de diferentes corantes de fluoresceína que podem ser adequadamente protegidos e incorporados em porções químicas de etiqueta para uso como doadores para a porção química de NH-rodamina são conhecidos na técnica. Corantes de fluoresceína exemplificativos específicos são descritos, por exemplo, na Pat. no US 6.221.604; Patente no US 6.008.379; Patente no US

5.840.999; Patente no US 5.750.409; Patente no US 5.654.441; Patente no US

5.188.934; Patente no US 5.066.580; Patente no US 4.481.136; Patente no US

4.439.356; o documento WO 99/16832; e o documento EP 0 050 684, cujas divulgações são incorporadas no presente documento a título de referência. Os artesãos qualificados serão capazes de selecionar uma fluoresceína com propriedades espectrais adequadas para uso como um doador para uma NH- rodamina específica.

[086] O doador e o aceitador NH-rodamina N-protegida podem ser ligados um ao outro em uma variedade de orientações, diretamente ou com a ajuda de um ligante. Em algumas modalidades em que o doador é uma fluoresceína O-protegida ou uma NH-rodamina N-protegida, o doador está ligado às posições C2′, C4′, C5′, C7′, C5 ou C6 do aceitador NH-rodamina N-protegida através de sua posição C2′, C2″, C4′, C5′, C7′-, C7″, C5 ou C6.

[087] Orientações de ligação exemplificativas específicas são fornecidas na Tabela 2, abaixo: TABELA 2 Doador/Aceitador Aceitador/Doador Nome C4’ ou C5’ C4’ ou C5’ cabeça a cabeça C4’ ou C5’ C5 ou C6 cabeça a cauda C5 ou C6 C5 ou C6 cauda a cauda C2’ ou C7’ C2’, C2’’, C7’ ou C7’’ lado a lado C2’ ou C7’ C4’ ou C5’ lado a cabeça C2’ ou C7’ C5 ou C6 lado a cauda

[088] As porções químicas de etiqueta compreendendo redes de corantes, tais como as redes de corantes doador-aceitador da Tabela 2, podem ser ligadas ao restante do reagente em qualquer posição disponível. Em algumas modalidades, as porções químicas de marcador compreendendo pares aceitador/doador ligados cabeça a cabeça são ligadas ao restante do reagente por meio da posição C5 ou C6 do doador ou da porção aceitadora. Em algumas modalidades, as porções químicas de marcador compreendendo pares de aceitador/doador ligados de ponta a ponta são anexadas ao restante do reagente por meio de uma posição C4′, C5′, C5 ou C6 disponível do doador ou da porção aceitadora. Em algumas modalidades, as porções químicas de marcador compreendendo pares de aceitador/doador ligados cauda a cauda são anexados ao restante do reagente por meio da posição C4′ ou C5′ do doador ou aceitador. Em algumas modalidades, as porções químicas de marcador compreendendo pares de aceitador/doador ligados lado a lado são anexadas ao restante do reagente por meio da posição C4′, C5′, C5 ou C6 do doador ou aceitador. Em algumas modalidades, porções químicas de marcador compreendendo pares aceitador/doador ligados lado a cabeça são anexadas ao restante do reagente por meio de uma posição C4′, C5′, C5 ou C6 disponível do doador ou aceitador. Em algumas modalidades, as porções químicas de marcador compreendendo pares aceitador/doador ligados lado a cauda são anexadas ao restante do reagente por meio de uma posição C4′, C5′, C5 ou C6 disponível do doador ou aceitador.

[089] Independentemente de sua orientação, a fluoresceína O-protegida ou doador de NH-rodamina N-protegida e o aceitador de NH-rodamina N-protegida estão tipicamente ligados um ao outro por meio de um ligante. Foi descoberto anteriormente que pode ser vantajoso ligar tais corantes doadores e aceitadores por meio de ligantes que são rígidos por natureza e/ou que são relativamente longos, por exemplo, na faixa de aproximadamente 12-20 Angstroms de comprimento (como usado neste documento, o "comprimento" de um ligante se refere à distância entre as porções químicas ligadas conforme determinado pelo cálculo da soma dos comprimentos das ligações químicas que definem o contínuo caminho mais curto entre as metades). Sem a intenção de se limitar a qualquer teoria de operação, acredita-se que os ligantes que tendem a manter o doador e o aceitador próximos um do outro, sem permitir que seus cromóforos se toquem, produzem uma transferência de energia adequadamente eficiente. A este respeito, a rigidez e o comprimento do ligante são parâmetros acoplados. Geralmente, ligantes mais curtos (por exemplo ligantes com um comprimento de cerca de 5 a 12 Angstroms) deve incluir um maior grau de rigidez. Ligantes mais longos (por exemplo, ligantes com um comprimento na faixa de cerca de 15 a 30 Angstroms) podem incluir um grau menor de rigidez ou mesmo nenhuma rigidez. Ligantes curtos e não rígidos (moles) devem ser evitados.

[090] A rigidez pode ser alcançada através do uso de grupos que têm ângulos de rotação restritos em torno de suas ligações, por exemplo através do uso de porções químicas de arileno ou heteroarileno e/ou porções químicas de alquileno que compreendem ligações duplas e/ou triplas. Uma variedade de ligantes úteis para ligar corantes de rodamina e fluoresceína uns aos outros no contexto de corantes de transferência de energia são conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, na Pat. no US 5.800.996, cuja divulgação é incorporada no presente documento a título de referência. Exemplos específicos de ligantes úteis para ligar doadores de fluoresceína O-protegida ou NH-rodamina N-protegida a aceitadores de NH-rodamina N-protegida nas porções químicas de marcador aqui descritas incluem, a título de exemplo e não como limitação, grupos de fórmula: (L.1) -Z-(CH2)a-[(Ar)b—(CH2)a]c-Z-; (L.2) -Z-(CH2)a-[C≡C—(CH2)a]c-Z-; (L.3) -Z-(CH2)a-[C≡C—(Ar)b]c—(CH2)a-Z-; (L.4) -Z-(CH2)d—NH—C(O)—[(CH2)a—(Ar)—(CH2)a—C(O)—NH]c—(CH2)d-Z-; e (L.5) -Z-[CH2(CH2)eO]f—CH2(CH2)eO—,

em que cada Z representa, independentemente dos outros, uma porção de uma ligação contribuída por um grupo de ligação Fz, conforme descrito anteriormente, cada a representa, independentemente dos outros, um número inteiro na faixa de 0 a 4; cada b representa, independentemente dos outros, um número inteiro na faixa de 1 a 2; cada c representa, independentemente dos outros, um número inteiro na faixa de 1 a 5; cada d representa, independentemente dos outros, um número inteiro na faixa de 1 a 10; cada e representa, independentemente dos outros, um número inteiro na faixa de 1 a 4; cada f representa, independentemente dos outros, um número inteiro na faixa de 1 a 10; e cada Ar representa, independentemente dos outros, um grupo policíclico cicloalquileno, ciclo- heteroalquileno, alquileno ou heteroarileno. Modalidades exemplificativas não limitantes de Ar incluem grupos derivados de cicloalcanos inferiores, ciclo- heteroalcanos inferiores, sistemas de anéis aromáticos parentais e sistemas de anéis heteroaromáticos parentais, como descrito anteriormente. Modalidades exemplificativas específicas e não limitantes de Ar incluem ciclo-hexano, piperazina, benzeno, naftaleno, fenol, furano, piridina, piperidina, imidazol, pirrolidina e oxadizol. Modalidades exemplificativas específicas e não limitantes de ligantes são ilustradas na Figura 1. Na Figura 1, Z1 e Z2 representam, cada um independentemente um do outro, uma porção de uma ligação contribuída por um grupo funcional Fz, como descrito anteriormente, e K é selecionado a partir de —CH— e —N—. Em algumas modalidades específicas dos ligantes ilustrados na Figura 2, um dentre Z1 ou Z2 é — NH— e o outro é selecionado de -O-, -C(O)- e S(O)2-.

[091] Em algumas modalidades, o ligante que liga os corantes doadores e aceitadores é um ligante aniônico, conforme descrito na Patente no US 6.811.979, cuja divulgação é incorporada no presente documento a título de referência (consultar, por exemplo, a divulgação na Col. 17, linha 25 a Col. 18, linha 37 e Figuras 1-17). Modalidades exemplificativas específicas não limitantes de ligantes aniônicos adequados incluem os ligantes de fórmulas (L.1) a (L.4), acima, em que um ou mais dos grupos Ar são substituídos por um ou mais grupos substituintes tendo uma carga negativa sob as condições de uso, como, por exemplo, a um pH na faixa de cerca de pH 7 a cerca de pH 9. Exemplos específicos e não limitantes de grupos substituintes adequados incluem ésteres de fosfato, ésteres de sulfato, grupos sulfonato e carboxilato.

[092] Em algumas modalidades, o ligante que liga os corantes doador e aceitador é um ligante aniônico, conforme descrito na Patente no US 6.811.979, cuja divulgação é incorporada no presente documento a título de referência (consultar, por exemplo, a divulgação na Col. 17, linha 25 a Col. 18, linha 37 e Figuras 1-17). Modalidades exemplificativas específicas não limitantes de ligantes aniônicos adequados incluem os ligantes de fórmulas (L.1) a (L.4), acima, em que um ou mais dos grupos Ar são substituídos por um ou mais grupos substituintes tendo uma carga negativa sob as condições de uso, como, por exemplo, a um pH na faixa de cerca de pH 7 a cerca de pH 9. Exemplos específicos e não limitantes de grupos substituintes adequados incluem ésteres de fosfato, ésteres de sulfato, grupos sulfonato e carboxilato.

[093] Em algumas modalidades, a porção química de marcador tem a fórmula (VI): A-Z1-Sp-Z2-D (VI) em que A representa o aceitador de NH-rodamina N-protegida, D representa o doador, por exemplo, um doador de NH-rodamina N-protegida ou fluoresceína O- protegida, Z1 e Z2 representam porções de ligações fornecidas por porções químicas de ligação compreendendo um grupo funcional Fz, como descrito anteriormente, e Sp representa uma porção química de espaçamento, como descrito anteriormente. Em algumas modalidades específicas, A é uma porção química de NH-rodamina N- protegida como aqui descrito, e D é selecionado a partir do grupo que consiste em porções químicas com as fórmulas estruturais D.1, D.2, D.3, D.4, D.5, D.6, D.7, D.8, D.9, D.10, D.11 e D.12:

(D.1)

(D.2)

(D.3)

(D.4)

(D.5)

(D.6)

(D.7)

(D.8)

(D.9)

(D.10)

(D.11)

(D.12)

em que, em cada um dentre D.1 - D.12: cada um dentre R1′, R2′, R2″, R4′, R4″, R5′, R5″, R7′, R7″ e R8′, quando tomados sozinhos, é independentemente selecionado a partir de hidrogênio, uma alquila inferior, uma (C6-C14) arila, uma (C7-C20) arilalquila, uma heteroarila de 5-14 membros, uma heteroarilalquila de 6-20 membros, -Rb ou -(CH2)x-Rb, em que x é um número inteiro que tem um valor entre 1 e 10 e Rb é selecionado a partir de -X, -OH, -ORa, -SH, -SRa -NH2, -NHRa, -NRcRc, -N+RcRcRc, per-halo alquila inferior, tri- halometila, trifluorometila, -P(O)(OH)2, P(O)(ORa)2, P(O)(OH)(ORa), -OP(O)(OH)2, - OP(O)(ORa)2, -OP(O)(ORa)(OH), -S(O)2OH, -S(O)2Ra, -C(O)H, -C(O)Ra, -C(S)X, - C(O)ORa, -C(O)OH, -C(O)NH2, -C(O)NHRa, -C(O)NRcRc, -C(S)NH2, -C(O)NHRa, - C(O)NRcRc, -C(NH)NH2, -C(NH)NHRa e -C(NH)NRcRc, em que X é halo, cada Ra é, independentemente, selecionado a partir de alquila inferior, uma (C6-C14) arila, uma (C7-C20) arilalquila, uma heteroarila de 5-14 membros e uma heteroarilalquila de 6- 20 membros, e cada Rc é, independentemente, um Ra, ou, alternativamente, dois Rc ligados ao mesmo átomo nitrôgenio podem ser tomados em conjunto com esse átomo de nitrogênio para formar um anel saturado ou insaturado de 5 a 8 membros que pode opcionalmente incluir um ou mais heteroátomos do mesmo anel ou heteroátomos de um anel diferente selecionados a partir de O, N e S; ou, alternativamente, R1′ e R2′ ou R7′ e R8′ são tomados em conjunto com os átomos de carbono aos quais estão ligados para formar uma ponte de (C6-C14) arila opcionalmente substituída e/ou R4′ e R4″ e/ou R5′ e R5″ são considerados em conjunto com os átomos de carbono aos quais estão ligados para formar um grupo benzo; e R4, R5, R6 e R7 são, cada um independentemente entre si, selecionados a partir de hidrogênio, alquila inferior, (C6-C14) arila, (C7-C20) arilalquila, heteroarila de 6-14 membros, heteroarilalquila de 7-20 membros, -Rb e -(CH2)x-Rb; E1 é selecionado a partir do grupo que consiste em —NHR9, —NR9R10 e — OR9b; E2 é selecionado a partir do grupo que consiste em —NHR9, —NR9R10 e — OR9b; R9 e R10 são como aqui descritos;

R9b é R9; cada um dentre Y1a, Y1b, Y2a, Y2b, Y3a e Y3b é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em —O—, —S—, —NH—, —C(O—) e — S(O)2, com a condição de que quando cada um dentre E1 e E2 for —OR9b, então R1′ e R2′ e/ou R7′ e R8′ podem apenas ser tomados em conjunto com os átomos de carbono aos quais estão ligados para formar uma ponte de (C6-C14) arila opcionalmente substituída. Conforme usado neste documento, "rodaminas assimétricas" são compostos nos quais E1 e E2 são independentemente —NHR9 ou —NR9R10 e E1 não é igual a E2.

[094] Em algumas modalidades específicas de porções químicas de marcador de acordo com a fórmula estrutural (VI), Y1a, Y2a e Y3a são —NH—; Y1b, Y2b e Y3b são selecionados a partir de —C(O)- e —S(O)2-; Z1 é selecionado a partir de —C(O)- e —S(O)2-; Z2 é —NH— e Sp é um grupo selecionado a partir de: —(CH2)a—[(Ar)b—(CH2)a]c—; (Sp.1) —(CH2)a—[C≡C—(CH2)a]c—; (Sp.2) —(CH2)a—[C≡C—(Ar)b]c—(CH2)a—; (Sp.3) —(CH2)d—NH—C(O)—[(CH2)a—(Ar)—(CH2)a—C(O)—NH]c—(CH2)d— (Sp.4); e —[CH2(CH2)eO]f—CH2(CH2)—, (Sp.5) em que a, b, c, d, e, f e Ar são como definidos anteriormente.

[095] Em algumas modalidades específicas de porções químicas de marcador de acordo com a fórmula estrutural (VI), R9 é selecionado a partir de — C(O)CH3 e C(O)CF3 e R9a é —C(O)C(CH3)3.

4.5 GRUPO PEP

[096] Muitas modalidades dos reagentes aqui descritos incluem um grupo PEP ("PEP"). Quando usado em uma síntese passo a passo para sintetizar um oligonucleotídeo marcado, o grupo PEP é acoplado a qualquer grupo hidroxila disponível, que pode ser o grupo 5’-hidroxila de um oligonucleotídeo sintético nascente, contribuindo em última análise, após quaisquer etapas de oxidação necessária e/ou desproteção, uma ligação que liga a porção química de marcador ao oligonucleótido sintético. A ligação formada pode ser uma ligação éster fosfato ou uma ligação éster fosfato modificada como é conhecido na técnica.

[097] Uma variedade de grupos diferentes adequados para reagentes de acoplamento a grupos hidroxila primários para produzir ligações de éster de fosfato ou éster de fosfato modificadas são bem conhecidas na técnica. Exemplos específicos incluem, a título de exemplo e não de limitação, grupos fosforamidita (consultar, por exemplo, Letsinger et al., 1969, J. Am. Chem. Soc. 91: 3350-3355; Letsinger et al., 1975 J. Am. Chem. Soc. 97: 3278; Matteucci & Caruthers, 1981, J. Am. Chem. Soc. 103: 3185; Beaucage & Caruthers, 1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859; cujas divulgações são incorporadas no presente documento a título de referência), grupos 2-clorofenil- ou 2,5-diclorofenil-fosfato (consultar, por exemplo, Sproat & Gait, "Solid Phase Synthesis of Oligonucleotides by the Phosphotriester Method," In: Oligonucleotide Synthesis, A Practical Approach, Gait, Ed., 1984, IRL Press, páginas 83-115), cujas divulgações são incorporadas no presente documento a título de referência), e grupos H-fosfonato (consultar, por exemplo, Garegg et al., 1985, Chem. Scr. 25: 280-282; Garegg et al., 1986, Tet. Lett. 27: 4051-4054; Garegg et al. 1986, Tet. Lett. 27: 4055-4058; Garegg et al., 1986, Chem. Scr. 26: 59-62; Froehler & Matteucci, 1986, Tet. Lett. 27: 469-472; Froehler et al., 1986, Nucl. Acid Res. 14: 5399-5407, cujas divulgações são incorporadas no presente documento a título de referência). Em uma modalidade específica, o grupo PEP é um grupo fosforamidita da fórmula (P.1):

em que R20 é selecionado a partir de uma alquila linear, ramificada ou cíclica saturada ou insaturada contendo de 1 a 10 átomos de carbono, 2-cianoetila, uma arila contendo de 6 a 10 átomos de carbono no anel e uma arilalquila contendo de 6 a 10 átomos de carbono no anel e de 1 a 10 átomos de carbono de alquileno; e R21 e R22 são, cada um independentemente entre si, selecionados a partir de uma alquila linear, ramificada ou cíclica saturada ou insaturada contendo de 1 a 10 átomos de carbono, uma arila contendo de 6 a 10 átomos de carbono no anel e uma arilalquila contendo de 6 a 10 átomos de carbono do anel e de 1 a 10 átomos de carbono do alquileno, ou, alternativamente, R21 e R22 são tomados em conjunto com o átomo de nitrogênio ao qual estão ligados para formar um anel saturado ou insaturado que contém de 5 a 6 átomos do anel, um ou dois dos quais, além do átomo de nitrogênio ilustrado, podem ser heteroátomos selecionados de O, N e S.

[098] Em uma modalidade específica, R20 é 2-cianoetila e R21 e R22 são, cada um, isopropila.

4.6 ALÇAS DE SÍNTESE

[099] Muitas modalidades dos reagentes aqui descritos incluem uma ou mais alças de síntese que fornecem, após desproteção adequada, se necessário, locais que podem ser usados para a ligação de grupos ou porções químicas adicionais ao oligonucleotídeo marcado sintético. Os grupos podem ser ligados a uma alça de síntese durante o curso da síntese do oligonucleotídeo marcado, ou, alternativamente, a alça de síntese pode ser desprotegida pós-síntese para revelar um grupo funcional ao qual grupos ou porções químicas adicionais podem ser ligados. Por exemplo, uma alça de síntese pode compreender um grupo amina primária que é protegido com um grupo protetor que é estável nas condições usadas para realizar a síntese do oligonucleotídeo marcado. A remoção do grupo protetor após a síntese, simultânea ou separadamente da remoção dos vários outros grupos protetores no oligonucleotídeo sintético, fornece um grupo amino primário ao qual grupos e/ou porções químicas adicionais podem ser ligados.

[0100] Uma variedade de diferentes tipos de grupos reativos protegidos com grupos protetores adequados para uso na síntese de oligonucleotídeos são conhecidos na técnica e incluem, a título de exemplo e não de limitação, grupos amino (protegidos com, por exemplo, grupos trifluoroacetila ou 4-monometoxitritila), grupos hidroxila (protegidos com, por exemplo, grupos 4,4’-dimetoxitritila), grupos tiol (protegidos com, por exemplo, grupos tritila ou alquiltiol) e grupos aldeído (protegidos com, por exemplo, um grupo protetor acetal). Todos esses grupos reativos protegidos podem compreender a alça de síntese dos reagentes aqui descritos.

[0101] Em algumas modalidades, a alça de síntese compreende uma hidroxila primária protegida da fórmula -ORk, em que Rk representa um grupo protetor instável em ácido que pode ser removido seletivamente durante o curso da síntese de um oligonucleotídeo. Grupos protetores lábeis em ácido adequados para proteger grupos hidroxila primária no contexto da síntese de oligonucleotídeos são conhecidos na técnica e incluem, a título de exemplo e não de limitação, trifenilmetila (tritila), 4-monometoxitritila, 4,4′-dimetoxitritila, 4,4′,4″-trimetoxitritila, bis(p-anisil)fenilmetila, naftildifenilmetila, p-(p′-bromofenaciloxi)fenildifenilmetila, 9- antrila, 9-(9-fenil)xantenila e 9-(9-fenil-10-oxo)antrila. Todos esses grupos podem ser removidos por tratamento com ácido suave, como por tratamento com di- ou tricloroácido a 2,5% ou 3% e em diclorometano. Os métodos de proteção de grupos hidroxila primária com os grupos protetores lábeis em ácido listados acima são bem conhecidos.

4.7 SUPORTES SÓLIDOS

[0102] Muitas modalidades dos reagentes aqui descritos compreendem suportes sólidos aos quais as outras porções químicas e/ou grupos estão ligados. Os suportes sólidos são tipicamente ativados com grupos funcionais, tais como grupos amino ou hidroxila, aos quais ligantes contendo grupos de ligação adequados para ligação das outras porções químicas são ligados.

[0103] Uma variedade de materiais que podem ser ativados com grupos funcionais adequados para ligação a uma variedade de porções químicas e ligantes, bem como métodos de ativação dos materiais para incluir os grupos funcionais, são conhecidos na técnica e incluem, a título de exemplo, vidro de poro controlado, poliestireno e copolímeros de enxerto. Qualquer um desses materiais pode ser usado como suporte sólido nos reagentes aqui descritos.

4.8 REGENTES DE SÍNTESE ÚTEIS PARA MARCAÇÃO DE HIDROXILA

TERMINAL

[0104] Algumas modalidades dos reagentes de síntese aqui descritos são descritas pela fórmula estrutural (VII): LM-L-PEP (VII) em que LM representa uma porção química de marcador como aqui descrito, L representa um ligante opcional como aqui descrito e PEP representa um grupo PEP como aqui descrito. Os reagentes podem incluir grupos ou porções químicas adicionais, como alças de síntese. Em algumas modalidades, os reagentes de síntese compreendem uma porção química de marcador e um grupo PEP e não incluem porções químicas ou grupos adicionais. Esses reagentes de síntese podem ser acoplados a um grupo hidroxila durante a síntese em etapas de um oligonucleotídeo e são úteis para, entre outras coisas, anexar uma porção química de marcador a um grupo hidroxila terminal de um oligonucleotídeo sintético, que é comumente a 5'-hidroxila.

[0105] Em algumas modalidades, a porção química de marcador pode ser da fórmula

(III.1)

(III.2)

(III.3) ou

(III.4) em que, R1-R14, Ra-Rj e Y são como aqui definidos.

[0106] O grupo PEP pode ser anexado diretamente à porção química de marcador, ou pode ser anexado à porção química de marcador com a ajuda de um ligante. Como os grupos PEP são geralmente ligados a moléculas por acoplamento de reagentes adequados a grupos hidroxila primários, em modalidades em que o grupo PEP está ligado diretamente à porção química de marcador, a porção química de marcador deve incluir um grupo substituinte que compreende um grupo hidroxila primária. Em modalidades em que o grupo PEP está ligado à porção química de marcador com a ajuda de um ligante, o sínton do ligante deve incluir um grupo de ligação adequado para formar uma ligação com um grupo de ligação no sínton da porção química de marcador e um grupo hidroxila primária dequado para ligação para o grupo PEP. Síntons ligantes adequados incluem, porém sem limitação, síntons da fórmula Fz-Sp-OH, em que Fz é um grupo funcional complementar a um grupo funcional no sínton da porção química de marcador e Sp representa uma porção química de espaçamento. A porção química de espaçamento pode compreender qualquer combinação de átomos e/ou grupos funcionais estáveis nas condições que serão usadas para sintetizar e desproteger o oligonucleotídeo sintético marcado. Ligantes exemplificativos não limitantes são ilustrados na Figura 1, em que Z2 é O. Em algumas modalidades, Sp é uma cadeia de alquileno opcionalmente substituída que contém de 1 a 10 átomos de cadeia. Em uma modalidade específica, Sp é uma cadeia de alquileno não substituída contendo de 1 a 9 átomos de carbono.

[0107] Em algumas modalidades, os reagentes de síntese são compostos de acordo com a fórmula estrutural (VII) em que: LM é uma das modalidades de porções químicas de marcador especificamente exemplificadas acima; L é selecionado a partir de -Z-(CH2)3-6—O—, -Z-(CH2)a—[(Ar)b—(CH2)a]c— O—, -Z-(CH2)a—[C≡C—(CH2)a]c—O—, -Z-(CH2)a—[C≡C—(Ar)b]c—(CH2)a—O—, -Z- (CH2)d—NH—C(O)—[(CH2)a—(Ar)—(CH2)a—C(O)—NH]c—(CH2)d—O—, -Z- [CH2(CH2)eO]f—CH2(CH2)eO— e um dos ligantes ilustrados na Figura 1 na qual Z2 é O; e PEP é um grupo fosforamidita, tal como, por exemplo, um grupo fosforamidita de fórmula estrutural P.1, como descrito acima. Em algumas modalidades específicas, Z no ligante L é —NH—.

[0108] Em algumas modalidades, o ligante em reagentes de síntese de acordo com a fórmula estrutural (VII) compreende um nucleosídeo, de modo que o reagente de síntese seja nucleosídico. Em algumas modalidades, os reagentes de síntese nucleosídica são compostos de acordo com a fórmula estrutural (VII.1): em que PEP representa o grupo precursor de éster de fosfato, B representa uma nucleobase, LM representa a porção química de marcador e L2 representa um ligante que liga a nucleobase B ao ligante LM. As características e propriedades da nucleobase B e do ligante L são descritas em mais detalhes, abaixo. Reagentes de síntese nucleosídica exemplificativos não limitantes de acordo com a fórmula estrutural (VII.1) são ilustrados na Figura 3.

[0109] Um esquema exemplificativo para a síntese de modalidades de reagentes de síntese em que o grupo PEP está ligado à porção química de marcador por meio de um ligante opcional é fornecido no Esquema (I), abaixo, em que os vários R, Fy, Fz, Y, Z e Sp os grupos são conforme definidos anteriormente:

[0110] No Esquema (I), o sínton de NH-rodamina parental 100, que inclui um grupo de ligação que compreende o grupo funcional Fy, é acetilado com anidrido 101 para render o sínton de NH-rodamina N-acetil-protegida 102. Sínton 102 é então acoplado ao ligante sínton 103 para produzir o composto 104. Dependendo da identidade de Fy, o sínton 102 pode requerer ativação antes do acoplamento. Por exemplo, se Fy for um grupo carboxila, ele pode ser ativado como um éster, como um éster NHS, antes do acoplamento. No composto 104, -Y-Z- representa a ligação formada pelos grupos funcionais complementares Fy e Fz, em que Y representa a porção contribuída por Fy e Z representa a porção contribuída por Fz, como descrito anteriormente. O composto 104 é então feito reagir com PEP sínton 105, que na modalidade específica ilustrada é uma fosfina, para produzir o reagente de síntese de fosforamidita 106.

4.9 REAGENTES DE SÍNTESE ÚTEIS PARA MARCAÇÃO INTERNA OU EXTREMIDADE 3′

[0111] Os reagentes de síntese aqui descritos podem incluir opcionalmente uma ou mais alças de síntese úteis para a ligação de grupos e/ou porções químicas adicionais. Os reagentes de síntese que incluem uma alça de síntese da fórmula - ORk, em que Rk representa um grupo protetor instável em ácido como descrito anteriormente, fornecem um grupo hidroxila primário ao qual nucleotídeos adicionais podem ser ligados. Como consequência, os reagentes de síntese que incluem uma tal alça de síntese podem ser usados para marcar oligonucleotídeos sintéticos na 5’- hidroxila, na 3’-hidroxila ou em uma ou mais posições internas. Eles também podem ser acoplados uns aos outros, ou a outros reagentes de marcação de fosforamidita, permitindo a síntese de oligonucleotídeos contendo uma pluralidade de porções químicas de marcação.

[0112] A porção química de marcador, o grupo PEP e a alça de síntese -ORk compreendendo o reagente de síntese podem ser ligados entre si de qualquer forma e/ou orientação que lhes permita realizar suas respectivas funções. Como um exemplo específico, o grupo PEP e a alça de síntese podem ser ligados cada um à porção química de marcador, opcionalmente por meio de ligantes. Em algumas modalidades, esses reagentes de síntese são compostos de acordo com a fórmula estrutural (VIII): RkO-L-LM-L-PEP (VIII) em que cada L representa, independentemente um do outro, um ligante opcional, LM representa a porção química de marcador e PEP representa o grupo PEP. Exemplos não limitantes de grupos protetores adequados Rk, ligantes L, porções químicas de marcador LM e grupos PEP incluem aqueles especificamente exemplificados acima.

[0113] Como outro exemplo específico, o grupo PEP e a alça de síntese -

ORk podem ser anexados a um ligante ramificado que é anexado à porção química de marcador. Em algumas modalidades, esses reagentes de síntese são compostos de acordo com a fórmula estrutural (IX): (IX) em que L representa um ligante, LM representa a porção química de marcador e PEP representa o grupo PEP.

[0114] Em uma modalidade específica, os reagentes de síntese de acordo com a fórmula estrutural (IX) são compostos de acordo com a fórmula estrutural (IX.1): (IX.1) em que LM representa a porção química de marcador, -Z- representa uma porção de uma ligação contribuída por um Fz funcional no ligante, Sp1, Sp2 e Sp3, que podem ser iguais ou diferentes, cada um representa porções químicas de espaçamento, G representa CH, N ou um grupo que compreende arileno, fenileno, heteroarileno, cicloalquileno inferior, ciclo-hexileno e/ou ciclo-heteroalquileno inferior e PEP representam o grupo PEP. Em algumas modalidades, LM é uma das modalidades de porções químicas de marcador especificamente exemplificadas acima, Sp1, Sp2 e Sp3 são, cada um independentemente um do outro, selecionados a partir de uma cadeia de alquileno contendo de 1 a 9 átomos de carbono, Sp.1, Sp.2, Sp.3, Sp.4 e Sp.5 (definido acima) e/ou PEP é um grupo fosforamidita de acordo com a fórmula estrutural P.1, acima. Modalidades específicas não limitantes de reagentes de síntese exemplificativos de acordo com a fórmula estrutural (IX.1) são ilustradas nas Figuras 2 e 3.

[0115] Em algumas modalidades, a alça de síntese -ORk é fornecida por um nucleosídeo, de modo que o reagente de síntese seja nucleosídico. Em tais reagentes de síntese nucleosídica, a porção química de marcador é tipicamente ligada à nucleobase do nucleosídeo por meio de um ligante, e quaisquer grupos funcionais exocíclicos na nucleobase que são reativos nas condições usadas para sintetizar o oligonucleotídeo marcado, tal como, por exemplo, aminas exocíclicas, são protegidos. Exemplos são fornecidos na Figura 5.

[0116] O nucleosídeo pode ser qualquer nucleosídeo que pode ser adequadamente protegido para uso na síntese de oligonucleotídeos e pode compreender uma porção química de açúcar 2'-desoxirribose, uma porção química de açúcar 3'-desoxirribose (útil para sintetizar oligonucleotídeos marcados incluindo um ligação internucleotídica 2'-5'), uma porção química de ribose adequadamente protegida, uma versão substituída de qualquer uma dessas porções de ribose, ou mesmo uma porção de açúcar não ribose.

[0117] Em algumas modalidades, esses reagentes de síntese nucleosídica são compostos de acordo com as fórmulas estruturais (IX.2), (IX.3), (IX.4) e (IX.5): (IX.2) (IX.3)

(IX.4) (IX.5) em que LM representa a porção química de marcador, B representa uma nucleobase adequadamente protegida, L2 representa um ligante que liga a porção química de marcador à nucleobase, Rk representa o grupo protetor instável em ácido, PEP representa o grupo PEP, O é um átomo de oxigênio e, na fórmula estrutural (IX.4), R16 representa um grupo protetor de 2'-hidroxila.

[0118] Nos reagentes de síntese de acordo com as fórmulas estruturais (VII.1), (IX.2), (IX.3), (IX.4) e (IX.5), a nucleobase B pode ser virtualmente qualquer heterociclo útil para incorporação em oligonucleotídeos. Por exemplo, a nucleobase pode ser uma das purinas que codificam geneticamente (adenina ou guanina), uma das pirimidinas que codificam geneticamente (citosina, uracila ou timina), anólogos e/ou derivados das purinas e/ou pirimidinas que codificam geneticamente (por exemplo, 7-deazadenina, 7-deazaguanina, 5-metilcitosina), purinas e/ou pirimidinas que não codificam geneticamente (por exemplo, inosina, xanteno e hipoxanteno) ou outros tipos de heterociclos. Uma ampla variedade de heterociclos úteis para incorporação em oligonucleotídeos são conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, em Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, Fasman,

Ed., 1989, CRC Press (consultar, por exemplo, páginas 385-393 e as referências aí citadas), cujas divulgações são incorporadas no presente documento a título de referência. Todos esses vários heterociclos, bem como aqueles que forem descobertos posteriormente, podem ser incluídos nos reagentes de síntese nucleosídica aqui descritos.

[0119] Quando B é uma purina nos reagentes de síntese de acordo com as fórmulas estruturais (VII.1), (IX.2), (IX.3), (IX.4) e (IX.5), a porção química de açúcar ilustrada é tipicamente anexada para a posição N9 da purina, e quando B é uma pirimidina, a porção de açúcar ilustrada é tipicamente ligada na posição NI da pirimidina. Os locais de ligação para outras nucleobases serão evidentes para os especialistas na técnica.

[0120] Qualquer amina exocíclica ou outro grupo (ou grupos) reativo na nucleobase são protegidos com grupos protetores que são estáveis nas condições de síntese usadas para sintetizar o oligonucleotídeo marcado. Uma variedade de grupos que são adequados para proteger os grupos amina exocíclicos de nucleobases de nucleosídeos no contexto da síntese de oligonucleotídeos são bem conhecidos na técnica, assim como os métodos de preparação de tais nucleosídeos protegidos.

[0121] Por exemplo, os grupos que foram usados para proteger a amina exocíclica de adenina incluem benzol (Bz), fenoxiacetila (Pac) e isobutirila (iBu). Grupos que foram usados para proteger a amina exocíclica de cistosina incluem acetila (Ac) e Bz. Os grupos que foram usados para proteger a amina exocíclica de guanina incluem iBu, dimetilformamida (Dmf) e 4-isopropil-fenoxiacetila (iPr-Pac). Todos esses grupos protetores podem ser removidos por tratamento com hidróxido de amônio a 55-65 °C durante 2-3 horas. No entanto, alguns desses grupos protetores podem ser removidos em condições mais suaves. Por exemplo, a clivagem dos grupos protetores de AiBU, APac, CAc e GiPr-Pac pode ser realizada em 4-

17 horas à temperatura ambiente com hidróxido de amônio, ou com carbonato de potássio a 0,05 M em metanol, ou tratamento com t-butilamina a 25% em H2O/EtOH. Como alguns dentre a NH-rodamina e/ou os outros corantes que compreendem os reagentes aqui descritos podem não ser estáveis para as condições de desproteção mais severas exigidas por outros grupos protetores, os reagentes nucleosídicos que utilizam grupos protetores que podem ser removidos sob estas condições de desproteção mais suaves são preferenciais.

[0122] O ligante L2 que liga a porção química de marcador LM à nucleobase B pode ser ligado a qualquer posição da nucleobase. Em algumas modalidades, quando B é uma purina, o ligante é anexado à posição 8 da purina, quando B é uma 7-deazapurina, o ligante é anexado à posição 7 da 7-deazapurina, e quando B é uma pirimidina, o ligante é ligado à posição 5 da pirimidina.

[0123] Em algumas modalidades, ligantes L2 úteis para ligar LM a uma nucleobase compreendem uma ligação acetilênica ou alquênica, tal como, por exemplo, uma ligação seleciona a partir de —C≡C—CH2—NH—, —C≡C—C(O)—, —CH═CH—NH—, —CH═CH—C(O)—, —C≡C—CH2—NH—C(O)—(CH2)1-6—NH—, e —CH═CH—C(O)—NH—(CH2)1-6—NH—C(O)—, uma ligação de propargil-1- etoxiamino, tal como, por exemplo, uma ligação que tem a fórmula —C—CH—CH2— O—CH2CH2—[O—CH2CH2]0-6—NH— ou uma ligação rígida, tal como, por exemplo, uma ligação selecionada a partir de —C≡C—C≡C—CH2—O—CH2CH2—[O— CH2CH2]0-6—NH—, —C≡C—(Ar)1-2—C≡C—CH2—O—CH2CH2—[O—CH2CH2]0-6— NH—, —C≡C—(Ar)1-2—O—CH2CH2—[O—CH2CH2]0-6—NH— e —C≡C—(Ar)1-2— O—CH2CH2—[O—CH2CH2]0-6—NH—, em que Ar é conforme definido anteriormente.

[0124] Em algumas modalidades, os ligantes L2 úteis para anexar LM a uma purina nucleobase compreendem uma alquilamina, tal como, por exemplo, uma ligação da fórmula —NH—(CH2)1-6—NH—.

[0125] Em algumas modalidades, os ligantes L2 úteis para anexar LM a uma nucleobase de purina ou pirimidina são ligantes aniônicos, conforme descrito na Pat. no US 6.811.979, cuja divulgação é incorporada no presente documento a título de referência (consultar, por exemplo, a divulgação na Col. 17, linha 25 a Col. 18, linha 37 e Figuras 1-17).

[0126] Os métodos de síntese de nucleosídeos derivados com ligantes tais como aqueles descritos acima que são adequados para incorporação nos reagentes aqui descritos são descritos, por exemplo, em Hobbs et al., 1989, J. Org. Chem. 54: 3420; Patente no US 5.151.507 de Hobbs et al., Patente no US 5.948.648 de Khan et al.; e Pat. no US 5.821.356 de Khan et al., cujas divulgações são incorporadas no presente documento a título de referência. Os nucleosídeos derivados podem ser usados como síntons para sintetizar reagentes de síntese nucleosídica como será descrito em mais detalhes, abaixo.

[0127] Modalidades exemplificativas específicas de nucleobases derivadas por ligante que podem compreender os reagentes nucleosídicos descritos neste documento são ilustradas abaixo:

[0128] Os reagentes de síntese nucleosídica podem ser preparados a partir de síntons de nucleosídeos derivatizados de ligante, conforme ilustrado no Esquema (II), abaixo:

[0129] No Esquema (II), o sínton de nucleosídeo derivado de ligante 110 é protegido na 5'-hidroxila com um grupo protetor lábil em ácido, que é ilustrado no Esquema com o reagente de cloreto exemplificativo RkCl, em que Rk é como definido anteriormente. O tratamento com base para remover o grupo protetor trifluoroacetila produz o sínton 112. A reação do sínton 112 com o sínton de porção química de marcador 102 (consultar Esquema (I), acima, seguido por tratamento com o sínton PEP 105, que neste exemplo específico ilustrado é uma fosfina (ver Esquema (I), acima) produz o reagente de síntese nucleosídica 114. As condições específicas para realizar as várias etapas sintéticas ilustradas acima são bem conhecidas. Reagentes de síntese não nucleosídicos que incluem uma alça de síntese, como mostrado na Figura 4 ou uma alça de síntese da fórmula —ORk, podem ser preparados por adaptação de rotina do Esquema (II).

4.10 REAGENTES DE SUPORTE SÓLIDO

[0130] Muitas modalidades dos reagentes aqui descritos incluem suportes sólidos. Tais reagentes geralmente compreendem um suporte sólido, uma porção química de marcador como descrito neste documento e uma alça de síntese, e podem incluir grupos ou porções químicas adicionais, tais como porções químicas de marcador adicionais, porções químicas de extinção, alças de síntese e/ou grupos úteis para, entre outras coisas, estabilizar duplexes de oligonucleotídeo, tais como, por exemplo, agentes que intercalam entre pares de bases (agentes intercalantes) e agente que se liga ao sulco menor do duplex (agentes de ligação ao sulco menor, ou MGB). O suporte sólido, a porção química de marcador, a alça de síntese e quaisquer porções químicas adicionais opcionais podem ser ligados uns aos outros de qualquer forma ou orientação que lhes permita desempenhar suas respectivas funções.

[0131] Em algumas modalidades, o suporte sólido é fixado ao restante do reagente por meio de um ligante. Os ligantes que anexam suportes sólidos ao restante do reagente incluem tipicamente ligações que são cliváveis seletivamente sob condições especificadas de modo que, após a síntese, o oligonucleotídeo marcado sintetizado pode ser liberado do suporte sólido. Em algumas modalidades, as ligações são lábeis às condições usadas para desproteger o oligonucleotídeo marcado sintético, de modo que o oligonucleotídeo seja desprotegido e clivado do suporte sólido em uma única etapa. Tais ligantes incluem tipicamente ligações éster, mas podem incluir outras ligações, tais como, por exemplo, ésteres de carbonato, éteres di-isopropilsilóxi, ésteres de fosfatos modificados, etc.

[0132] Uma miríade de ligantes cliváveis seletivamente úteis no contexto da síntese de oligonucleotídeos são conhecidos na técnica, assim como os métodos de derivatização de suportes sólidos com tais ligantes. Todos esses vários ligantes podem ser adaptados para uso nos reagentes de suporte sólidos aqui descritos. Exemplos não limitantes de reagentes de suporte sólido compreendendo ligantes exemplificativos que são cliváveis sob as condições básicas usadas para desproteger oligonucleotídeos sintéticos são ilustrados na Figura 6.

[0133] Como os reagentes de síntese, os reagentes de suporte sólido podem ser de natureza não nucleosídica ou nucleosídica. Modalidades exemplificativas de reagentes de suporte sólido não nucleosídico incluem reagentes de acordo com a fórmula estrutural (X): (X) em que LM representa a porção química de marcador, L representa um ligante clivável seletivamente opcional e -ORk representa a alça de síntese, em que Rk é um grupo protetor lábil em ácido, como descrito anteriormente.

[0134] Em algumas modalidades, os reagentes de síntese de suporte sólido de fórmula estrutural (X) são reagentes não nucleosídicos de acordo com a fórmula estrutural (X.1) (X.1) em que Z, LM, G, Sp1, Sp2 e Rk são como previamente definidos em conexão com a fórmula estrutural (IX.1) e Sp4 representa uma porção química de espaçamento seletivamente clivável. Em algumas modalidades específicas, a porção química de espaçamento seletivamente clivável Sp4 compreende uma ligação éster.

[0135] Em algumas modalidades, os reagentes de síntese de suporte sólido de fórmula estrutural (X) são reagentes nucleosídicos de acordo com as fórmulas estruturais (X.2), (X.3), (X.4) ou (X.5):

(X.2) (X.3) k RO B L2 LM

O O OR16 Sp4 (X.4) k RO B L2 LM

O

O O Sp4 (X.5) em que LM, Rk, B e L2 são como definidos anteriormente para as fórmulas estruturais (X.2), (X.3), (X.4) e/ou (X.5), R16 é como definido anteriormente para a fórmula estrutural (IX.4) e Sp4 representa uma porção química de espaçamento seletivamente clivável, tal como descrito acima, que em algumas modalidades compreende uma ligação éster. Exemplos específicos de (X.2) são mostrados na Figura 7.

4.11 MODALIDADES EXEMPLIFICATIVAS ADICIONAIS

[0136] Deve ser entendido que as modalidades específicas das várias porções químicas, grupos e ligantes descritos ao longo da divulgação podem ser incluídos em todos os reagentes aqui descritos. Além disso, as várias modalidades específicas podem ser combinadas umas com as outras em qualquer combinação, como se a combinação específica tivesse sido especificamente exemplificada. Como um exemplo específico, qualquer uma das modalidades específicas da porção química de marcador LM aqui descritas podem ser incluídas em qualquer uma das modalidades especificamente exemplificadas de suporte sólido não nucleosídico e nucleosídico e reagentes de síntese aqui descritos. Como outro exemplo específico, qualquer uma das modalidades específicas do PEP grupo PEP, tal como o grupo fosforamidita de fórmula estrutural (P.1), acima, pode ser incluída em qualquer um dos reagentes de síntese aqui descritos.

4.12 USOS DOS REAGENTES

[0137] Os vários reagentes aqui descritos podem ser usados na síntese passo a passo de oligonucleotídeos para sintetizar oligonucleotídeos marcados com corantes rodamina diretamente na resina de síntese. Assim, os vários reagentes disponibilizam a capacidade de marcar oligonucleotídeos sinteticamente com uma miríade de rodaminas diferentes, evitando a necessidade de modificações pós- síntese laboriosas. O uso de reagentes de síntese exemplificativos para sintetizar um oligonucleotídeo marcado com um corante NH rodamina é ilustrado na Figura 8A.

[0138] Como será apreciado pelos versados na técnica, devido à disponibilidade de reagentes de fosforamidita que podem atuar como doadores,

aceitadores ou mesmo extintores para corantes NH-rodamina, os reagentes aqui descritos permitem a capacidade de sintetizar oligonucleotídeos marcados com corantes de transferência de energia e/ou pares de corante extintor de NH-rodamina, que são sintetizados in situ. Sínteses exemplificativas de oligonucleotídeos marcados com pares de corantes de transferência de energia NH-rodamina- fluoresceína que ilustram a versatilidade fornecida pelos reagentes aqui descritos são ilustradas nas Figuras 8B e 9. Uma vez que os reagentes descritos neste documento permitem virtualmente qualquer corante NH-rodamina a ser incluído em um suporte sólido e/ou reagente de síntese, os oligonucleotídeos marcados com pares de corantes de transferência de energia com propriedades espectrais que são ajustadas para aplicações especificadas podem ser convenientemente sintetizados in situ, sem a necessidade de modificação pós-síntese. Além disso, os oligonucleotídeos marcados com uma miríade de combinações diferentes de pares de corantes de transferência de energia podem ser sintetizados a partir de reagentes monoméricos individuais, evitando a necessidade de produzir reagentes de síntese contendo pares de corantes especificados. Cada membro do par de corantes pode ser ligado ao oligonucleotídeo nascente de uma forma passo a passo, com ou sem a adição de porções químicas de ligação intervenientes.

[0139] Com referência à Figura 8A, o oligonucleotídeo sintético ligado ao suporte é tratado com ácido para remover o grupo DMT que protege sua 5’-hidroxila, produzindo o oligonucleotídeo ligado ao suporte desprotegido em 5'. O acoplamento do reagente de fosforamidita NH-rodamina N-protegida seguido de oxidação rende o oligonucleotídeo marcado com NH-rodamina ligado ao suporte na forma aberta de lactona. O tratamento com hidróxido de amônio concentrado para remover quaisquer grupos protetores e clivar o oligonucleotídeo sintetizado do suporte sólido (resina) produz um oligonucleotídeo que é marcado com um corante NH-rodamina.

[0140] Com referência à Figura 8B, o oligonucleotídeo ligado ao suporte nascente pode ser marcado com um par de corante NH-rodamina-fluoresceína sintetizado in situ por acoplamento do reagente de síntese de fosforamidita NH- rodamina N-protegida à 5’-hidroxila do oligonucleotídeo, que, após a oxidação, produz oligonucleotídeo marcado com NH-rodamina. A remoção do grupo DMT seguida de acoplamento com uma fosforamidita O-protegida (que no exemplo específico ilustrado é FAM-fosforamidita) produz oligonucleotídeo ligado ao suporte marcado. A clivagem e a desproteção produzem o oligonucleotídeo, que é marcado com um par de corante de transferência de energia NH-rodamina-FAM.

[0141] Com referência à Figura 9, o reagente de suporte sólido, que inclui um par de corante de transferência de energia NH-rodamina-fluoresceína protegido como a porção química de marcador, pode sofrer três ciclos de síntese para produzir o oligonucleotídeo ligado ao suporte marcado. A clivagem do suporte sólido produz um oligonucleotídeo marcado desprotegido.

[0142] O comprimento e o caráter da ligação que liga os corantes doadores e aceitadores também podem ser manipulados por meio do uso de reagentes de ligação de fosforamidita. O acoplamento com FAM-fosforamidita seguido por oxidação, desproteção e clivagem produz um oligonucleotídeo, que é marcado com um par de corante de transferência de energia NH-rodamina-FAM. No ligante fosforamidita, “Sp” é um espaçador, conforme definido anteriormente. Por exemplo, “Sp” poderia representar (Sp1), (Sp2), (Sp3), (Sp4) ou (Sp5), conforme definido anteriormente.

[0143] O comprimento e as propriedades do ligante que liga os corantes NH- rodamina e FAM podem ser ajustados por acoplamento de fosforamiditas de ligante adicionais antes do acoplamento com o FAM-fosforamidita. As fosfosforamitas ligantes podem ser as mesmas ou podem ser diferentes. Desse modo, os oligonucleótidos marcados com pares de corantes de transferência de energia em que os corantes dador e aceitador, bem como o ligante que liga o dador e aceitadores, são adaptados para fins específicos e podem ser prontamente sintetizados in situ.

[0144] O indivíduo versado apreciará que qualquer reagente NH-rodamina N-protegida que atue como um aceitador para FAM pode ser usado. Além disso, outras fluoresceínas O-protegidas podem ser usadas, assim como outros tipos de corantes de fosformidita. Como os corantes são adicionados como monômeros, o número de marcadores de corantes de transferência de energia disponíveis é maior do que o número de reagentes de fosforamidita necessários para sintetizá-los. Por exemplo, os oligonucleotídeos marcados com 9 pares de corantes de transferência de energia diferentes podem ser sintetizados a partir de 3 reagentes de fosforamidita NH-rodamina N-protegida diferentes (reagentes A, B e C) e 3 reagentes de fosforamidita de fluoresceína O-protegida diferentes (reagentes 1, 2 e 3): oligo-A1, oligo-A2, oligo-A3, oligo-B1, oligo-B2, oligo-B3, oligo-C1, oligo-C2 e oligo-C3.

[0145] Análises atuais de funcionalidade de célula e tecido frequentemente exigem extração do máximo de informações possível de materiais que são frequentemente limitados. Por exemplo, amostras, tal como biópsias de tumor, são difíceis de coletar e geralmente rendem apenas uma pequena quantidade de ácido nucleico utilizável. Detecção e medição de PCR de um analito de alvo único, referido como um ensaio singleplex, tem sido o padrão de ouro para analisar amostras de pesquisa clínica no nível de ácido nucleico e tem sido inestimável na extensão dos limites de conhecimento biológico por mais de um quarto de século.

[0146] No entanto, a quantidade limitada de ácido nucléico obtida de amostras de pesquisa clínica muitas vezes obriga que escolhas sejam feitas sobre como melhor utilizar essas amostras preciosas. Além disso, se a amostra for limitada, o número de loci que podem ser analisados também é limitado, reduzindo a quantidade de informações que podem ser extraídas da amostra. Finalmente, o tempo e os materiais adicionais necessários para ajustar múltiplas reações de ensaio único podem aumentar significativamente a despesa de um projeto complexo.

[0147] Análise de PCR multiplex de ácidos nucleicos, uma estratégia em que mais de um alvo é amplificado e quantificado a partir de uma única alíquota de amostra, é uma solução atraente para esses problemas. Em PCR multiplex, uma alíquota de amostra é consultada com múltiplas sondas que contêm corantes fluorescentes em uma única reação de PCR. Isso aumenta a quantidade de informações que podem ser extraídas dessa amostra. Com PCR multiplex, economias significativas em amostra e materiais podem ser atingidas. Para aumentar a utilidade desse método, foi desenvolvida uma PCR multiplexada usando vários pares de iniciadores específicos de genes e sondas para amplificar e medir múltiplas sequências alvo simultaneamente. PCR de multiplexação oferece as seguintes vantagens: 1) Eficiência: PCR multiplexada ajuda a conservar material de amostra e evitar variação poço a poço combinando vários ensaios de PCR em uma única reação. Multiplexação torna mais eficiente o uso de amostras limitadas, tal como aquelas abrigando um alvo raro que não pode ser dividido em múltiplas alíquotas sem comprometer a sensibilidade; 2) Economia: muito embora os alvos sejam amplificados em uníssono, cada um é detectado de forma independente usando uma sonda específica de gene com um corante repórter único para distinguir as amplificações com base em seu sinal fluorescente. Uma vez otimizado, um ensaio multiplexado é mais econômico do que os mesmos ensaios amplificados independentemente.

[0148] No entanto, atualmente existem limitações quanto ao número de alvos que podem ser analisados em um único ensaio de PCR multiplex. O desenho experimental para PCR multiplex é mais complicado do que para reações simples. As sondas usadas para detectar alvos individuais devem conter corantes repórteres únicos com espectros distintos. Os ajustes para filtros de excitação e emissão dos sistemas de detecção em tempo real variam de fabricante para fabricante; portanto, os instrumentos devem ser calibrados para cada corante como parte do processo de otimização de experimento. Assim, uma limitação no desenvolvimento de ensaios de PCR multiplex é o número de fluoróforos e, daí, sondas, que podem ser efetivamente medidos em uma reação simples. Por exemplo, em PCR multiplexada, diafonia de sinal entre diferentes repórteres de fluorescência pode comprometer a quantificação ou causar falsos positivos. Portanto, é essencial selecionar fluoróforos com sobreposição espectral mínima. Adicionalmente, os fluoróforos e, especificamente, seus espectros de emissão e excitação, também devem ser compatíveis com o instrumento de PCR a ser usado e, especificamente, as especificações de passa banda para cada conjunto de filtros.

[0149] Em um aspecto adicional, são fornecidos métodos para realizar PCR simplex ou multiplex, tal como qPCR ou PCR de ponto final, usando as sondas descritas. A PCR de ponto final é a análise após todos os ciclos de PCR estarem completos. Ao contrário de qPCR, que permite quantificação à medida que o modelo está dobrando (fase exponencial), a análise do ponto final é baseada na fase de platô de amplificação.

[0150] Em particular, um método para amplificar e detectar múltiplas sequências de DNA de alvo compreendendo fornecer uma composição ou mistura de reação compreendendo a sonda descrita, submeter a mistura de reação a um protocolo de termociclagem de modo que a amplificação das referidas múltiplas sequências de alvo possa ocorrer e monitorar a amplificação detectando a fluorescência da sonda descrita pelo menos uma vez durante uma pluralidade de ciclos de amplificação.

[0151] O(s) alvo(s) de ácido nucleico do método descrito podem ser qualquer alvo de ácido nucleico conhecido pelo especialista na técnica. Além disso, os alvos podem ser regiões de baixa mutação ou regiões de alta mutação. Por exemplo, um uso particularmente valioso dos métodos aqui divulgados envolve direcionar ácidos nucleicos altamente mutados, tal como genes virais de RNA, ou regiões de alta variabilidade genética, tal como polimorfismos de nucleotídeo simples (SNPs). Em algumas modalidades, os alvos podem ser fragmentados ou degradados, tal como material de amostras forenses e/ou tecidos fixos. Os alvos podem ser de qualquer tamanho passível de amplificação. Um uso particularmente valioso dos métodos e das composições aqui fornecidas envolve a identificação de fragmentos curtos, tal como siRNA e miRNA. Outro uso particularmente valioso é para amostras que podem ter ácido nucleico fragmentado e/ou degradado, tal como amostras fixas ou amostras que foram expostas ao ambiente. Assim, os métodos podem ser usados para tecido de biópsia e DNA forense, por exemplo. Os alvos podem ser purificados ou não purificados. Os alvos podem ser produzidos in vitro (por exemplo, um alvo de cDNA) ou podem ser encontrados em amostras biológicas (por exemplo, um alvo de RNA ou DNA genômico (gDNA)). A amostra biológica pode ser usada sem tratamento ou as amostras biológicas podem ser tratadas para remover substâncias que podem interferir com os métodos aqui divulgados.

[0152] As sondas fornecidas neste documento podem ser usadas em métodos de diagnóstico, por exemplo, detecção de SNP, identificação de biomarcadores específicos, etc., pelo que as sondas são complementares a uma sequência (por exemplo, genômica) de um agente de doença infecciosa, por exemplo, de doença humana incluindo, mas não se limitando a vírus, bactérias, parasitas e fungos, desse modo diagnosticando a presença do agente infeccioso em uma amostra tendo ácido nucleico de um paciente. O ácido nucleico alvo pode ser genômico ou cDNA ou mRNA ou sintético, humano ou animal, ou de um microrganismo, etc. Em outras modalidades, as sondas podem ser usadas para diagnosticar ou prognosticar uma doença ou um distúrbio que não é causado por um agente infeccioso. Por exemplo, as sondas podem ser usadas para diagnosticar ou prognosticar câncer, doenças autoimunes, doenças mentais, distúrbios genéticos, etc., identificando a presença de uma mutação, um polimorfismo ou alelo em uma amostra de um humano ou animal. Em algumas modalidades, a sonda compreende a mutação ou o polimorfismo. Adicionalmente, as sondas podem ser usadas para avaliar ou rastrear progressão de tratamento para uma doença ou um distúrbio.

[0153] Outra área que se beneficia da análise multiplex é o uso de marcadores genéticos no campo da identificação humana. Os marcadores genéticos são geralmente um conjunto de loci polimórficos que têm alelos no DNA genômico com características de interesse para análise, como a tipagem de DNA, em que os indivíduos são diferenciados com base nas variações de seu DNA. A maioria dos métodos de tipagem de DNA são projetados para detectar e analisar diferenças no comprimento e/ou sequência de uma ou mais regiões de marcadores de DNA conhecidos por aparecerem em pelo menos duas formas ou alelos diferentes em uma população. Essa variação é referida como "polimorfismo" e qualquer região do DNA em que essa variação ocorre é referida como um "locus polimórfico". Um método possível de realizar a tipagem de DNA envolve a união da tecnologia de amplificação por PCR (KB Mullis, Patente no US 4.683.202) com a análise de polimorfismos de variação de comprimento. Repetições curtas em tandem (STRs), minissatélites e número variável de repetições em tandem (VNTRs) são alguns exemplos de polimorfismos de variação de comprimento. STRs, contendo unidades de repetição de aproximadamente três a sete nucleotídeos, são curtas o suficiente para serem úteis como marcadores genéticos em aplicações de PCR, porque os protocolos de amplificação podem ser projetados para produzir produtos menores do que é possível a partir de outras regiões de comprimento variável do DNA.

[0154] Vários desses sistemas contendo múltiplos loci STR foram descritos. Consultar, por exemplo, AMPFLSTR® SGMPLUS™ PCRAMPLIFICATION KIT USER'S MANUAL, Applied Biosystems, pp. i-x e 1-1 a 1-16 (2001); AMPFLSTR®

IDENTIFILER® PCR AMPLIFICATION KIT USER'S MANUAL, Applied Biosystems, pp. i-x e 1-1 a 1-10 (2001); JW Schumm et al., Patente no US 7.008.771.

[0155] Os métodos dos presentes ensinamentos contemplam a seleção de um conjunto apropriado de loci, iniciadores e protocolos de amplificação para gerar alelos amplificados (amplicons) a partir de múltiplos loci coamplificados, cujos amplicons podem ser projetados de modo a não se sobreporem em tamanho, e/ou podem ser marcados de forma a permitir a diferenciação entre alelos de diferentes loci que se sobrepõem em tamanho. Além disso, esses métodos contemplam a seleção de múltiplos loci STR que são compatíveis para uso dentro de um único protocolo de amplificação.

[0156] Combinações bem-sucedidas além daquelas aqui divulgadas podem ser geradas por, por exemplo, tentativa e erro de combinações de locus, por seleção de sequências de pares de iniciadores e por ajuste de concentrações de iniciadores para identificar um equilíbrio no qual todos os loci para análise podem ser amplificados. Uma vez que os métodos e materiais desses ensinamentos são divulgados, vários métodos de seleção de loci, pares de iniciadores e técnicas de amplificação para uso nos métodos e kits desses ensinamentos são provavelmente sugeridos para um indivíduo versado na técnica. Todos esses métodos devem estar dentro do escopo das reivindicações anexas.

[0157] Qualquer uma de uma série de técnicas diferentes pode ser usada para selecionar o conjunto de loci para uso de acordo com os presentes ensinamentos. Independentemente de quais métodos podem ser usados para selecionar os loci analisados pelos métodos do presente ensinamento, os loci selecionados para análise multiplex em várias modalidades compartilham uma ou mais das seguintes características: (1) eles produzem produtos de amplificação suficientes para permitir a avaliação alélica do DNA; (2) eles geram poucos, se houver, artefatos durante a etapa de amplificação multiplex devido à incorporação de bases adicionais durante a extensão de um locus alvo válido ou a produção de amplicons não específicos; e (3) eles geram poucos, se houver, artefatos devido ao término prematuro das reações de amplificação por uma polimerase. Consultar, por exemplo, JW Schumm et al. (1993), FOURTH INTERNATIONAL SYMPOSIUM ON HUMAN lDENTIFICATION, p. 177-187, Promega Corp.

[0158] Geralmente, os iniciadores oligonucleotídicos podem ser sintetizados quimicamente. O projeto e a seleção de iniciador são procedimentos de rotina na otimização de PCR. Um indivíduo versado na técnica pode facilmente projetar iniciadores específicos para amplificar um locus alvo de interesse ou obter conjuntos de iniciadores a partir das referências listadas aqui. Todos esses iniciadores estão dentro do escopo dos presentes ensinamentos.

[0159] Como um exemplo, os iniciadores podem ser selecionados pelo uso de qualquer um dos vários programas de software disponíveis e conhecidos na técnica para o desenvolvimento de sistemas de amplificação e/ou multiplex. Consultar, por exemplo, o software Primer Express® (Applied Biosystems, Foster City, Califórnia). No exemplo do uso de programas software, as informações de sequência da região do local de interesse podem ser importadas para o software. O software então usa vários algoritmos para selecionar iniciadores que melhor atendam às especificações do usuário.

[0160] As amostras de DNA genômico podem ser preparadas para uso nos métodos do presente ensino, usando quaisquer procedimentos para a preparação de amostras que sejam compatíveis com a amplificação subsequente de DNA. Muitos desses procedimentos são conhecidos pelos especialistas na técnica. Alguns exemplos são purificação de DNA por extração de fenol (J. Sambrook et al. (1989), em MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, SEGUNDA EDIÇÃO, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, p. 9.14-9.19), e purificação parcial por precipitação com sal (S. Miller et al. (1988), NUCL. ACIDS REs. 16: 1215)

ou chelex (PS Walsh et al. (1991), BIOTECHNIQUES 10: 506-513; CT Corney et al. (I 994), J. FORENSIC Ser. 39: 1254) e a liberação de material não purificado usando sangue não tratado (J. Burckhardt (1994), PCRMETHODS AND APPLICATIONS 3: 239-243; RBE McCabe (1991), PCR METHODS AND APPLICATIONS 1: 99-106; BY Nordvag (1992), BIOTECHNIQUES 12: 4 p. 490-492).

[0161] Quando a pelo menos uma amostra de DNA a ser analisada usando os métodos desse ensino é o DNA genômico humano, o DNA pode ser preparado a partir de amostras de tecido, como, por exemplo, um ou mais de sangue, sêmen, células vaginais, cabelo, saliva, urina, osso, amostras bucais, líquido amniótico contendo células da placenta ou células fetais, vilosidades coriônicas e/ou misturas de qualquer um desses ou outros tecidos.

[0162] Amostras contendo sangue ou amostras bucais também podem ser processadas diretamente em papel FTA® (Whatman Inc., Piscataway, NJ), Bode Buccal Collector, ou esfregaços. Exemplos de esfregaços incluem, porém sem limitação, esfregaço Copan 4N6 Forensic Flocked Swab (Copan, P/N 3520CS01, Murrieta, CA), esfregaço Omi (Whatman Inc., P/N 10005) e esfregaço Puritan Cotton Swab (Puritan, P/N 25-806 1WC EC, vários fornecedores médicos).

[0163] Uma vez que uma amostra de DNA genômico é preparada, os loci alvo podem ser coamplificados na etapa de amplificação multiplex do presente ensinamento. Qualquer um dentre uma série de métodos de amplificação diferentes pode ser usado para amplificar os loci, como, por exemplo, PCR (RK Saiki et al. (1985), SCIENCE 230: 1350-1354), amplificação baseada na transcrição (DY Kwoh e TJ Kwoh (1990), AMERICAN BIOTECHNOLOGY LABORATORY, outubro, 1990) e amplificação de deslocamento de fita (SDA) (GT Walker et al. (1992), PROC. NATL. ACAD. Ser., USA 89: 392-396). Em algumas modalidades do presente ensinamento, a amplificação multiplex pode ser realizada via PCR, em que a amostra de DNA é submetida à amplificação usando pares de iniciadores específicos para cada locus no multiplex. Os componentes químicos de um PCR padrão geralmente compreendem um solvente, DNA polimerase, desoxirribonucleosídeo trifosfatos ("dNTPs"), oligonucleotídeos iniciadores, um íon de metal divalente e uma amostra de DNA que deve conter o alvo (ou alvos) para amplificação por PCR. A água pode geralmente ser usada como solvente para PCR, tipicamente compreendendo um agente tamponante e sais não tamponantes, como KCL. O agente tamponante pode ser qualquer tampão conhecido na técnica, tal como, porém sem limitação, Tris-HCl, e pode ser variado por experimentação de rotina para otimizar os resultados de PCR. Pessoas ordinariamente versadas na técnica são prontamente capazes de determinar as condições de proteção ideais. Os tampões de PCR podem ser otimizados dependendo da enzima particular usada para a amplificação.

[0164] A enzima que polimeriza os trifosfatos de nucleotídeo nos produtos amplificados na PCR pode ser qualquer DNA polimerase. A DNA polimerase pode ser, por exemplo, qualquer polimerase resistente ao calor conhecida na técnica. Exemplos de algumas polimerases que podem ser usadas neste ensino são DNA polimerases de organismos como Thermus aquaticus, Thermus thermophilus, Thermococcus litoralis, Bacillus stearothermophilus, Thermotoga maritima e Pyrococcus sp. A enzima pode ser adquirida por qualquer um dos vários métodos possíveis; por exemplo, isolado das bactérias de origem, produzido por tecnologia de DNA recombinante ou adquirido a partir de fontes comerciais. Alguns exemplos de tais DNA polimerases comercialmente disponíveis incluem a DNA polimerase AmpliTaq Gold®; a DNA polimerase AmpliTaq®; a DNA polimerase AmpliTaq® DNA Polymerase Stoffel Fragment; a DNA polimerase rTth DNA Polymerase; e a DNA polimerase rTth DNA Polymerase, XL (todas fabricadas por Applied Biosystems, Foster City, Califórnia). Outros exemplos de polimerases adequadas incluem fragmento grande de Tne, Bst DNA polimerase proveniente de Bacillus stearothermophilus, Vent e Vent Exo- de Thermococcus litoralis, Tma de

Thermotoga maritima, Deep Vent e Deep Vent Exo- e Pfu de Pyrococcus sp. e mutantes, variantes e derivados dos anteriores.

[0165] Quando a marcação fluorescente de iniciadores é usada em uma reação multiplex, geralmente pelo menos três marcadores diferentes podem ser usados para marcar os diferentes iniciadores. Quando um marcador de tamanho é usado para avaliar os produtos da reação multiplex, os iniciadores usados para preparar o marcador de tamanho podem ser marcados com um marcador diferente dos iniciadores que amplificam os loci de interesse na reação. Com o advento da imagem e análise fluorescentes automatizadas, a detecção e a análise mais rápidas de produtos de amplificação multiplex podem ser alcançadas.

[0166] Em algumas modalidades do presente ensinamento, um fluoróforo pode ser usado para marcar pelo menos um iniciador da amplificação multiplex, por exemplo, sendo covalentemente ligado ao iniciador, criando assim um iniciador marcado com fluorescência. Em algumas modalidades, os iniciadores para diferentes loci alvo em um multiplex podem ser marcados com diferentes fluoróforos, cada fluoróforo produzindo um produto de cor diferente dependendo do comprimento de onda de emissão do fluoróforo. Esses iniciadores marcados de forma variada podem ser usados na mesma reação multiplex, e seus respectivos produtos de amplificação subsequentemente analisados em conjunto. O iniciador direto ou reverso do par que amplifica um locus específico pode ser marcado, embora o direto possa ser marcado com mais frequência.

[0167] Os produtos de PCR podem ser analisados em meio com ou sem peneiração. Em algumas modalidades desses ensinamentos, por exemplo, os produtos de PCR podem ser analisados por eletroforese; por exemplo, eletroforese capilar, conforme descrito em H. Wenz et al. (1998), GENOME REs. 8: 69-80 (consultar também E. Buel et al. (1998), J. FORENSIC SCI. 43: (1), p. 164-170)), ou eletroforese em gel de placa, como descrito em M. Christensen et al. (1999),

SCAND. J. CLIN. LAB. INVEST. 59 (3): 167-177, ou eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante (consultar, por exemplo, J. Sambrook et al. (1989), em MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, SEGUNDA EDIÇÃO, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, p. 13,45-13,57). A separação de fragmentos de DNA na eletroforese é baseada principalmente no tamanho diferencial do fragmento. Os produtos de amplificação também podem ser analisados por cromatografia; por exemplo, por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC).

[0168] Uma vez que os alelos amplificados são separados, esses alelos e qualquer outro DNA em, por exemplo, o gel ou capilar (por exemplo, um marcador de tamanho de DNA ou uma escada alélica) podem então ser visualizados e analisados. Muitas vezes, o método para detecção de loci multiplex pode ser por fluorescência. Consultar, por exemplo, JW Schumm et al. em PROCEEDINGS

FROM THE EIGHTH INTERNATIONAL SYMPOSIUM ON HUMAN IDENTIFICATION, pub. 1998 pela Promega Corporation, p. 78-84; E. Buel et al. (1998), acima. Quando os iniciadores marcados com fluorescência são usados para detectar cada locus na reação multiplex, a amplificação pode ser seguida pela detecção dos produtos marcados empregando um detector fluorométrico.

[0169] O tamanho dos alelos presentes em cada locus na amostra de DNA pode ser determinado por comparação com um padrão de tamanho em eletroforese, como um marcador de DNA de tamanho conhecido. Os marcadores para avaliação de uma amplificação multiplex contendo dois ou mais loci STR polimórficos também podem compreender uma escada alélica específica de locus ou uma combinação de escadas alélicas para cada um dos loci sendo avaliados. Consultar, por exemplo, C. Puers et al. (1993), AM. J. HUM. GENET. 53: 953-958; C. Puers et al. (1994), GENOMICS 23: 260-264. Consultar, também, Patentes nos US 5.599.666; 5.674.686; e 5.783.406 para descrições de algumas escadas alélicas adequadas para uso na detecção de loci STR e alguns métodos de construção de escada aqui divulgados. Após a construção de escadas alélicas para loci individuais, as escadas podem ser submetidas à eletroforese ao mesmo tempo que os produtos de amplificação. Cada escada alélica comigra com os alelos do locus correspondente.

[0170] Os produtos das reações multiplex dos presentes ensinamentos também podem ser avaliados usando um padrão de pista interno; isto é, um tipo especializado de marcador de tamanho configurado para ser submetido à eletroforese, por exemplo, no mesmo capilar que os produtos de amplificação. O padrão de pista interna pode compreender uma série de fragmentos de comprimento conhecido. O padrão de pista interna também pode ser marcado com um corante fluorescente, que é distinguível de outros corantes na reação de amplificação. O padrão de pista pode ser misturado com a amostra amplificada ou padrões de tamanho/escadas alélicas e submetidos à eletroforese com qualquer um dos mesmos, a fim de comparar a migração em diferentes pistas de eletroforese em gel ou diferentes capilares de eletroforese capilar. A variação na migração do padrão da pista interna pode servir para indicar a variação no desempenho do meio de separação. A quantificação dessa diferença e correlação com as escadas alélicas pode fornecer calibração de eletroforese do produto de amplificação em diferentes vias ou capilares e correção na determinação do tamanho de alelos em amostras desconhecidas.

[0171] Quando os corantes fluorescentes são usados para marcar produtos de amplificação, os produtos submetidos à eletroforese e separados podem ser analisados usando equipamento de detecção de fluorescência, como, por exemplo, o analisador genético ABI PRISM® 310 ou 3130xl, ou um sequenciador de DNA ABI PRISM® 37 (Applied Biosystems, Foster City, Califórnia); ou um Scanner Fluorescente Hitachi FMBIO™ II (Hitachi Software Engineering America, Ltd., South San Francisco, Califórnia). Em várias modalidades dos presentes ensinamentos, os produtos de PCR podem ser analisados por um protocolo de eletroforese em gel capilar em conjunto com tal instrumentação de eletroforese como o analisador genético ABI PRISM® 3130xl (Applied Biosystems), e a análise alélica dos produtos de amplificação por eletroforese pode ser realizada, por exemplo, com GeneMapper® ID Software v3.2, da Applied Biosystems. Em outras modalidades, os produtos de amplificação podem ser separados por eletroforese em, por exemplo, cerca de 4,5%, 29: 1 acrilamida:bis acrilamida, gel de ureia a 8 M, conforme preparado para um sequenciador de DNA de fluorescência automatizado ABI PRISM® 377.

[0172] Os presentes ensinamentos também são direcionados a kits que utilizam os processos descritos acima. Em algumas modalidades, um kit básico pode compreender um recipiente com um ou mais iniciadores específicos para locus. Um kit também pode conter, opcionalmente, instruções de uso. Um kit também pode compreender outros componentes de kit opcionais, como, por exemplo, um ou mais de uma escada alélica direcionada a cada um dos loci especificados, uma quantidade suficiente de enzima para amplificação, tampão de amplificação para facilitar a amplificação, solução de cátion divalente para facilitar a atividade enzimática, dNTPs para extensão da fita durante a amplificação, solução de carga para preparação do material amplificado para eletroforese, DNA genômico como um controle de molde, um marcador de tamanho para garantir que os materiais migrem conforme previsto no meio de separação e um protocolo e manual para educar o usuário e limitar o erro de uso. As quantidades dos vários reagentes nos kits também podem variar dependendo de uma série de fatores, como a sensibilidade ideal do processo. Está dentro do escopo desses ensinamentos fornecer kits de teste para uso em aplicações manuais ou kits de teste para uso com detectores ou analisadores automatizados.

[0173] Em um ambiente clínico, os marcadores STR podem ser usados, por exemplo, para monitorar o grau de enxerto do doador em transplantes de medula óssea. Em hospitais, esses marcadores também podem ser úteis na correspondência e rastreamento de espécimes. Esses marcadores também entraram em outros campos da ciência, como estudos de biologia populacional sobre diferenças raciais e de grupos étnicos humanos (DB Goldstein et al. (1995), PROC. NATL. ACAD. Ser. U.S.A. 92: 6723-6727), evolução e divergência de espécies e variação em taxa de animais e plantas (MW Bruford et al. (1993), CURR. BIOL. 3: 939-943).

[0174] A amplificação de mini-STRs (loci com menos de aproximadamente 200 pares de bases) permite a análise de perfil de DNA altamente degradado, conforme demonstrado em MD Coble (2005), J. FORENSIC SCI. 50 (1): 43-53, que é incorporado no presente documento a título de referência. A Tabela 1 (Consultar o Pedido de Patente no US 61/413.946, depositado em 15 de novembro de 2010, e o Pedido de Patente no 61/526.195, depositado em 22 de agosto de 2011, para a Tabela 1) também fornece loci que podem ser considerados loci mini-STR dependendo do posicionamento dos iniciadores usados para amplificar o marcador STR dentro de um conjunto de amplificação de iniciador.

[0175] As concentrações de DNA podem ser medidas antes do uso no método do presente ensinamento, usando qualquer método padrão de quantificação de DNA conhecido pelos versados na técnica. Tais métodos de quantificação incluem, por exemplo, medição espectrofotométrica, conforme descrito por J. Sambrook et al. (1989), acima, Apêndice E.5; ou metodologia fluorométrica usando uma técnica de medição como a descrita por CF Brunk et al. (1979), ANAL. BIOCHEM. 92: 497-500. A concentração de DNA pode ser medida por comparação da quantidade de hibridização de padrões de DNA com uma sonda específica para humanos, como a descrita por J S Waye et al. (1991), J. FORENSIC SCI. 36: 1198- 1203 (1991). O uso de muito DNA molde nas reações de amplificação pode produzir artefatos de amplificação, que não representariam alelos verdadeiros.

[0176] Quando a marcação fluorescente de iniciadores é usada em uma reação multiplex, geralmente pelo menos três marcadores diferentes, pelo menos quatro marcadores diferentes, pelo menos cinco marcadores diferentes, pelo menos seis marcadores diferentes são usados. Por exemplo, os ensaios comerciais existentes utilizam 6 marcadores de corante exclusivos (VeriFiler™ Plus PCR Amplification Kit, Thermo Fisher Scientific). Os instrumentos usados para a análise de reações baseadas em corantes fluorescentes multiplex são limitados nos comprimentos de onda da luz que podem emitir para excitar os corantes fluorescentes e limitados nos comprimentos de onda da luz emitida pelos corantes que podem detectar. A fim de projetar um ensaio multiplex usando pelo menos 8 marcadores, pelo menos 10 marcadores ou pelo menos 16 marcadores, é necessário que haja uma gama de corantes que tenham propriedades únicas de emissão espectral, de modo que seus picos de emissão de pico sejam bem separados uns dos outros com pouco para nenhuma sobreposição. Além disso, os marcadores de corante fluorescente devem ser todos detectáveis em um instrumento capaz de produzir um conjunto específico de comprimentos de onda de excitação e com uma faixa específica de comprimentos de onda de emissão detectáveis. A classe de derivados de rodamina aqui descritos fornece marcadores de corante com propriedades espectrais únicas que não estão disponíveis com compostos de corante existentes e, portanto, abre a possibilidade de aumentar o número de marcadores de corante fluorescentes usados em reações multiplex com até 8, 10, 12, 16 ou mais etiquetas diferentes usando a tecnologia de laser existente comumente usada para os ensaios multiplex atuais. Prevê-se que, com melhorias nas capacidades instrumentais, ensaios multiplex implementando mais de 8 marcadores (por exemplo, pelo menos 10, pelo menos 12 ou pelo menos 16 marcadores diferentes) poderiam ser usados para marcar os diferentes iniciadores.

Quando um marcador de tamanho é usado para avaliar os produtos da reação multiplex, os iniciadores usados para preparar o marcador de tamanho podem ser marcados com um marcador diferente dos iniciadores que amplificam os loci de interesse na reação. Com o advento da imagem e análise fluorescentes automatizadas, a detecção e a análise mais rápidas de produtos de amplificação multiplex podem ser alcançadas.

[0177] A seguir estão alguns exemplos de possíveis fluoróforos bem conhecidos na técnica e adequados para uso em combinação com os compostos descritos nos presentes ensinamentos para fornecer ensaios usando vários marcadores fluorescentes. A lista pretende ser exemplificativa e não é de forma alguma exaustiva. Alguns fluoróforos possíveis incluem: fluoresceína (FL), que absorve no máximo a 492 nm e emite no máximo a 520 nm; N,N,N',N'-tetrametil-6- carboxirodamina (TAMRA™), que absorve no máximo a 555 nm e emite no máximo a 580 nm; 5-carboxifluoresceína (5-FAM™), que absorve no máximo a 495 nm e emite no máximo a 525 nm; 2′,7'-dimetoxi-4',5'-dicloro-6-carboxifluoresceína (JOE™), que absorve no máximo a 525 nm e emite no máximo a 555 nm; 6-carboxi-X-rodamina (ROX™), que absorve no máximo a 585 nm e emite no máximo a 605 nm; CY3™, que absorve no máximo a 552 nm e emite no máximo a 570 nm; CY5™, que absorve no máximo a 643 nm e emite no máximo a 667 nm; tetracloro-fluoresceína (TET™), que absorve no máximo a 521 nm e emite no máximo a 536 nm; e hexacloro-fluoresceína (HEX™), que absorve no máximo a 535 nm e emite no máximo a 556 nm; NED™ que absorve no máximo a 546 nm e emite no máximo a 575 nm; 6-FAM™, que emite no máximo a aproximadamente 520 nm; VIC® que emite no máximo a aproximadamente 550 nm; PET® que emite no máximo a aproximadamente 590 nm; e LIZ™, que emite no máximo a aproximadamente 650 nm. Consultar SR Coticone et al., Pat. no US 6.780.588; AMPFLSTR® IDENTIFILER™ PCR AMPLIFICATION KIT USER'S MANUAL, p. 1-3,

Applied Biosystems (2001). Observe que os comprimentos de onda de emissão e/ou absorção listados acima são típicos e podem ser usados apenas para fins de orientação geral; os comprimentos de onda de pico reais podem variar para diferentes aplicações e sob diferentes condições.

Fluoróforos adicionais podem ser selecionados para os espectros de absorção e emissão desejados, bem como a cor como é conhecido por um versado na técnica e são fornecidos abaixo: TABELA 3 CORANTES DISPONÍVEIS COMERCIALMENTE Fluoróforo Abs Em Fluoróforo Abs Em (nm) (nm) (nm) (nm) Metoxicumarina 340 405 Dansyl 340 520 Pyrene 345 378 Alexa Fluor® 350 346 442 CPTM 350 347 448 AMCA 349 448 DyLight 350 353 432 Corante Marina Blue® 365 460 Corante Dapoxyl® 373 551 Dialquilamino-coumarino 375 470 - 435 475 Bimane 380 458 SeTau 380 381 480 Hidroxicumarina 385 445 ATTO 390 390 479 Corante Cascade Blue® 400 420 Corante Pacific Orange® 400 551 DyLight® 405 400 420 Alexa Fluor® 405 402 421 SeTau 404 402 518 Corante Cascade Yellow® 402 545 CFTM 405S 404 431 CFTM 405M 408 452 Corante Pacific BlueTM 410 455 PyMPO 415 570 DY-415 415 467 SeTau 425 425 545 Alexa Fluor® 430 434 539 ATTO 425 436 484 ATTO 465 453 508 NBD 465 535 Seta 470 409 521 CFTM 485 470- 513 488 DY-485XL 485 560 CFTM 488A 490 515 DyLight® 488 493 518 DY 496 493 521 Fluoresceína 494 518 ATTO 495 495 527 Alexa Fluor® 488 495 519 Oregon Green® 488 496 524 BODIPY® 493/503 500 506 CAL Fluor® Green 520 500 522 DY-48OXL 500 630 ATTO 488 501 523

Corante Rhodamine 502 527 BODIPY® FL 505 513 Green DY 505 505 530 DY 510XL 509 590 2’,7’-Diclorofluoresceína 510 532 Oregon Green® 514 511 530 DY-481XL 515 650 ATTO 520 516 538 Alexa Fluor® 514 518 540 CAL Fluor® Gold 540 519 537 DY 520XL 520 664 4’,5’-Dicloro-2’,7’-dimetoxi- 522 550 fluoresceína (JOE) DY -521XL. 523 668 Eosina 524 544 Rhodamine 6G 525 555 BODIPY® R6G 528 550 Alexa Fluor® 532 531 554 ATTO 532 532 553 BODIPY ® 530/550 534 554 CAL Fluor® Orange 560 534 556 DY-530 539 561 BODIY® TMR 542 574 DY-555 547 572 DY556 548 573 Quasar® 570 548 570 Cy 3 550 570 CFTM 555 550 570 DY-554 551 572 DY 550 553 578 ATTO 550 554 576 Tetrametil-rodamina 555 570 Alexa Fluor® 555 555 565 (TMR) Seta 555 556 570 Alexa Fluor® 546 556 575 DY-547 557 574 DY-548 558 572 BODIPY® 564/570 558 569 DY-560 559 578 DY 549 560 575 DyLight® 549 562 618 CFTM 568 562 583 ATTO 565 563 592 BODIPY® 564/570 565 571 CAL Fluor® Red 590 566 588 Lissamina rodamina B 570 590 Corante Rhodamine Red 570 590 BODIPY® 576/589 576 590 Alexa Fluor® 568 578 603 X-rhodamine 580 605 DY-590 580 599 BODIPY® 581/591 584 592 CAL Fluor® Red 610 587 608 BODIPY® TR 589 617 Alexa Fluor® 594 590 617 ATTO 590 594 624 CFTM 594 594 614 CAL Fluor® Red 595 615 Corante Texas Red® 595 615 615 Naftofluoresceína 605 675 DY-682 609 709

DY-610 610 630 CAL Fluor® Red 635 611 631 ATTO 611x 611 681 Alexa Fluor® 610 612 628 ATTO 610 615 634 CFTM 620R 617 639 ATTO 620 619 643 DY -615 621 641 BODIPY® 630/650 625 640 ATTO 633 629 657 CFTM 633 630 650 Seta 632 632 641 Alexa Fluor® 633 632 647 Alexa Fluor® 635 633 647 DY-634 635 658 Seta 632 632 641 DY-630 636 657 DY-633 637 657 DY-632 637 657 DyLight® 633 638 658 Seta 640 640 656 CFTM 640R 642 662 ATTO 647N 644 669 Quasar® 670 644 670 ATTO 647 645 669 DY -636 645 671 BODIPY® 650/665 646 660 Seta 646 646 656 DY-635 647 671 Square 635 647 666 Cy 5 649 650/ Alexa Fluor® 647 650 668 670 CFTM 647 650 665 Seta 650 651 671 Square 650 653 671 DY-647 653 672 DY-648 653 674 DY-650 653 674 DyLight® 649 654 673 DY-652 654 675 DY-649 655 676 DY-651 656 672 Square 660 658 677 Seta 660 661 672 Alexa Fluor® 660 663 690 ATTO 655 663 684 Seta 665 667 683 Square 670 667 685 Seta 670 667 686 Dy-675 674 699 DY-677 673 694 DY-676 674 699 Alexa Fluor® 680 679 702 IRDye ® 700DX 680 687 ATTO 680 680 700 CFTM 680R 680 701 CFTM 680 681 698 Square 685 683 703 DY-680 690 709 DY-681 691 708 Dy-Light® 680 692 712 Seta 690 693 714 ATTO 700 700 719 Alexa Fluor® 700 702 723

Seta 750 702 728 ATTO 725 725 752 ATTO 740 740 764 Alexa Fluor® 750 749 775 Seta 750 750 779 DyLight®750 752 778 CFTM 750 755 777 CFTM 770 770 797 DyLight® 800 777 794 IRDYe ®800RS 770 786 IRDye® 800 CW 778 794 Alexa Fluor® 790 782 805 CFTM 790 784 806

[0178] Os compostos de rodamina assimétricos aqui descritos podem ser usados em combinação com um ou mais marcadores fluorescentes adicionais em um ensaio multiplex. Várias modalidades dos presentes ensinamentos podem compreender uma única reação multiplex que compreende pelo menos oito corantes diferentes. Os pelo menos oito corantes podem compreender quaisquer oito dos corantes listados acima. Em certas modalidades, o conjunto de oito corantes inclui um composto de rodamina assimétrico, conforme descrito neste documento, juntamente com um composto de rodamina assimétrico adicional, tal como descrito no documento PCT/US2019/67925. Em outras modalidades, uma única reação multiplex compreendendo pelo menos dez ou pelo menos doze corantes diferentes pode ser usada, ou qualquer número de corantes dentro dessas faixas.

[0179] Também são fornecidas composições, tal como uma mistura de reação ou mistura principal, compreendendo a sonda descrita. Em uma modalidade, a composição para PCR, tal como para PCR em tempo real ou quantitativa, PCR de ponto final ou RT-PCR, compreende pelo menos uma das sondas descritas. Em uma modalidade, a composição ou mistura de reação ou mistura principal para PCR (por exemplo, qPCR, PCR de ponto final ou RT-PCR) compreende sondas para permitir detecção de 4 ácidos nucleicos alvo e a sonda (ou sondas) descrita permitindo detecção de pelo menos um dentre um 5º e/ou 6º ácido nucleico alvo, cada uma das sondas descritas consistindo em uma porção química doadora de FRET, isto é, fluoróforo, e uma porção química aceptora de FRET, isto é, extintora, em que o fluoróforo tem um máximo de emissão entre cerca de 650 e 720 nm. O máximo de absorbância do extintor como aqui descrito está entre 660-668 nm. A faixa de absorbância do extintor conforme descrito aqui é de 530-730 nm. Em uma modalidade alternativa, reagentes de marcação são fornecidos para conjugar o fluoróforo descrito e o extintor a um oligonucleotídeo de escolha.

[0180] Além disso, tal composição ou mistura de reação ou mistura principal pode compreender um ou vários compostos e reagentes selecionados da seguinte lista: Tampão, aplicável para uma reação em cadeia da polimerase, trifosfatos de desoxinucleosídeo (dNTPs), DNA polimerase tendo atividade de exonuclease 5’ a 3’, pelo menos um par ou vários pares de iniciadores de amplificação e/ou sondas adicionais.

[0181] Em algumas modalidades, os métodos fornecidos compreendem ainda a determinação de um genótipo do polinucleotídeo alvo usando o produto de amplificação. Em algumas modalidades, os métodos fornecidos compreendem ainda determinar o número de cópias do polinucleotídeo alvo usando o produto de amplificação.

[0182] As obras de referência, patentes, pedidos de patentes, literatura científica e outras publicações impressas, bem como os números de acesso às sequências de banco de dados do Gen Bank que são aqui referidos e especificamente no documento PCT/US2019/67925, são todos incorporados neste documento a título de referência em sua totalidade.

[0183] Como aqueles versados na técnica irão apreciar, numerosas mudanças e modificações podem ser feitas nas várias modalidades dos presentes ensinamentos sem se afastar do espírito desses ensinamentos. Pretende-se que todas essas variações caiam no escopo desses ensinamentos.

[0184] Exceto quando indicado de outra forma, os métodos e técnicas das presentes modalidades são geralmente realizados de acordo com métodos convencionais bem conhecidos na técnica e conforme descrito em várias referências gerais e mais específicas que são citadas e discutidas ao longo da presente especificação. Consultar, por exemplo, Loudon, Organic Chemistry, Quarta Edição, Nova York: Oxford University Press, 2002, p. 360-361, 1084-1085; Smith e March, Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms and Structure, Quinta Edição, Wiley-Interscience, 2001.

[0185] A nomenclatura química para os compostos aqui descritos foi geralmente derivada usando ACD/Nome 2014 (ACD/Labs) ou ChemBioDraw Ultra

13.0 (Perkin Elmer) disponível no mercado.

[0186] É apreciado que certas características da divulgação, que são, para maior clareza, descritas no contexto de modalidades separadas, também podem ser fornecidas em combinação em uma única modalidade. Por outro lado, várias características da divulgação, que são, por brevidade, descritas no contexto de uma única modalidade, também podem ser fornecidas separadamente ou em qualquer subcombinação. Todas as combinações das modalidades pertencentes aos grupos químicos representados pelas variáveis são especificamente abrangidas pela presente divulgação e são divulgadas aqui, como se cada combinação fosse individual e explicitamente divulgada, na medida em que tais combinações abrangem compostos que são compostos estáveis (isto é, compostos que podem ser isolados, caracterizados e testados quanto à atividade biológica). Além disso, todas as subcombinações dos grupos químicos listados nas modalidades que descrevem tais variáveis também são especificamente abrangidas pela presente divulgação e são divulgadas aqui, como se cada uma dessas subcombinações de grupos químicos fosse individual e explicitamente divulgada neste documento.

SÍNTESE QUÍMICA

[0187] Entidades químicas exemplificativas úteis em métodos da descrição serão agora descritas a título de referência a esquemas sintéticos ilustrativos para sua preparação geral abaixo e os exemplos específicos que se seguem. Os artesãos reconhecerão que, para obter os vários compostos aqui, os materiais de partida podem ser adequadamente selecionados de modo que os substituintes desejados em última instância sejam transportados através do esquema de reação com ou sem proteção conforme apropriado para produzir o produto desejado. Alternativamente, pode ser necessário ou desejável empregar, no lugar do substituinte finalmente desejado, um grupo adequado que pode ser transportado através do esquema de reação e substituído conforme apropriado pelo substituinte desejado. Além disso, um indivíduo versado na técnica reconhecerá que as transformações mostradas nos esquemas abaixo podem ser realizadas em qualquer ordem que seja compatível com a funcionalidade dos grupos pendentes particulares.

[0188] Todos os produtos químicos gerais foram adquiridos de empresas químicas comerciais, como Fisher Scientific, Acros ou Alfa Aesar. Sílica gel (malha 220-400) da Fisher Scientific foi usada para cromatografia flash de fase normal. A cromatografia de fase reversa foi realizada usando sílica gel funcionalizada com octadecila de JT Baker. Todos os gradientes de solvente de cromatografia foram graduais. A cromatografia em camada fina (TLC) foi realizada em lâminas de sílica gel com revestimento de alumínio da EM Science. TLC de fase reversa foi realizada em placas HPTLC RP18F Uniplate da Analtech. Os pontos desenvolvidos foram visualizados com irradiação UV de comprimento de onda curto e longo.

[0189] Os espectros de RMN foram determinados em um Varian 400 MHz NMR referenciado em relação a um pico de solvente. A HPLC foi realizada em um HPLC Agilent 1200 com detector de matriz de diodos e comprimentos de onda de múltiplos canais. As eluições típicas foram executadas a 1 ml/min com um gradiente de acetonitrila e acetato de trietilamônio a 0,1 M (TEAA) através de uma coluna Agilent Pursuit C8 150 x 4,6 mm 5 µ. Os dados de LCMS foram obtidos usando um sistema Agilent 1200 LC acoplado a um espectrômetro de massa PE Sciex API 150 EX. Os dados de MS foram obtidos por infusão direta em um espectrômetro de massa API Sciex 4000.

[0190] Os solventes anidros foram manipulados sob atmosfera de nitrogênio com seringas secas em estufa. Tal como aqui utilizado, o termo "processamento aquoso" se refere a um método de purificação que compreende as seguintes etapas: dissolver ou diluir uma mistura de reação em um solvente orgânico declarado, lavar com uma solução aquosa declarada ou água, lavar a camada orgânica combinada uma vez com saturado NaCl, secando a solução com Na2SO4 anidro, filtrar o agente de secagem e remover o solvente a vácuo. EXEMPLO 1: PREPARAÇÃO DE UM CORANTE DE RODAMINA ASSIMÉTRICA.

ETAPA 1: PREPARAÇÃO DE 10-METOXI-5,5,7-TRIMETIL-2,3-DI-HIDRO- 1H,5H-PIRIDO[3,2,1-IJ]QUINOLINA, 2

[0191] 7-Metoxi-2,2,4-trimetil-1,2-di-hidroquinolina, 1 (8,00 g, 39,4 mmol, A. Rosowsky, E.J. Modest, JOC, 1965, 30, 1832.), foi dissolvido em acetonitrila (125 ml) e misturado com 1-bromo-3-cloropropano (24,8 g, 157 mmol), iodeto de sódio (47,2 g, 315 mmol) e carbonato de sódio (8,35 g, 78,8 mmol). A mistura foi refluxada durante 23 horas. A mistura foi filtrada, o filtrado concentrado, lavado com água em DCM e processado. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia flash sobre sílica gel eluindo com DCM a 20%/hexano para render 2 como um sólido esbranquiçado (8,28 g, 86%). RMN de 1H (400 MHz, CD2Cl2): δ 6,85 (d, 1H), 6,15 (d, 1H), 5,15 (s, 1H), 3,75 (s, 3H), 3,22 (m, 2H), 2,59 (m, 2H), 1,90 (s, 3H), 1,87 (m, 2H), 1,28 (s, 6H). MS: 244,17 calculado, 244,15 observado (MH+). ETAPA 2: PREPARAÇÃO DE 5,5,7-TRIMETIL-2,3-DI-HIDRO-1H,5H- PIRIDO[3,2,1-IJ]QUINOLIN-10-OL, 3

[0192] O Composto 2 (8,28 g, 34,0 mmol) foi submetido a refluxo com ácido bromídrico (50 ml) durante 1 hora. A solução foi neutralizada, em porções, com bicarbonato de sódio. A mistura foi extraída em EtOAc, a camada de EtOAc lavada com água e trabalhada para render 3 como um sólido laranja pálido (7,49 g, 98%). RMN de 1H (400 MHz, CD2Cl2): δ 6,75 (d, 1H), 6,02 (d, 1H), 5,12 (s, 1H), 3,25 (m, 2H), 2,55 (m, 2H), 1,90 (m, 5H), 1,25 (s, 6H). MS: 230,15 calculado, 230,13 observado (MH+). ETAPA 3: PREPARAÇÃO DE 2,2,4-TRIMETIL-1,2-DIHIDROQUINOLIN-7- OL, 4

[0193] 7-Metoxi-2,2,4-trimetil-1,2-di-hidroquinolina, 1 (10,00 g, 49,2 mmol) foi submetida a refluxo com ácido bromídrico (50 ml) durante 6 h. A mistura foi resfriada à temperatura ambiente e depois em banho de gelo. O sólido resultante foi recolhido por filtração com sucção e lavado com água gelada. O sólido foi então misturado com EtOAc a 50%/água e neutralizado com bicarbonato de sódio. A camada orgânica foi retida, a camada aquosa extraída 2 vezes com EtOAc, as camadas de EtOAc combinadas e processadas. O sólido resultante foi purificado a partir de precipitação de DCM/hexano quente seguida por cromatografia flash em gel de sílica eluindo com de EtOAc a 10% - 20%/hexano para produzir 4 (Koelmel, Dominik K. et al., Organic & Biomolecular Chemistry, 2013, 11 (24), 3954-3962) como um sólido esbranquiçado/amarelo pálido (7,45 g, 80%). RMN de 1H (400 MHz, CD2Cl2): δ 6,95 (m, 1H), 6,11 (m, 1H), 5,95 (s, 1H), 5,22 (s, 1H), 1,97 (s, 3H), 1,28 (s, 6H). ETAPA 4: PREPARAÇÃO DE ÁCIDO 3,6-DICLORO-2-(7-HIDROXI-2,2,4- TRIMETIL-1,2-DIHIDROQUINOLINA-6-CARBONIL)-4- (ISOPROPOXICARBONIL)BENZÓICO, 6 E 7

[0194] 2,2,4-Trimetil-1,2-dihidroquinolin-7-ol, 4, (9,37 g, 49,5 mmol) e éster isopropílico de ácido 3,6-diclorotrimelético, 5, (18,01, 59,4 mmol; 5 foi preparado de acordo com os métodos descritos no documento WO 2002/30944, incorporados no presente documento a título de referência para a preparação de 5) foram misturados em tolueno (95 ml) e refluxados durante 3,5 horas. Após resfriamento, o tolueno foi removido e o sólido resultante semipurificado por cromatografia flash em sílica gel eluindo com MeOH a 5% - 10%/DCM. O sólido resultante foi então purificado adicionalmente por cromatografia flash em gel de sílica eluindo com TEA a 2%/EtOAc a 35%/hexano seguido por EtOAc a 100% seguido por MeOH a 10% - 15%/DCM. O sólido resultante foi então dissolvido em DCM e lavado duas vezes com HCl a 1 N e processado para render 6/7 como um sólido verde-amarelo (18,45 g, 71%). RMN de 1H (400 MHz, CD2Cl2): δ 7,90 (d, 1H), 6,68 (d, 1H) 5,89 (s, 1H), 5,25 (m, 2H), 1,75 (d, 3H) 1,40 (m, 6H), 1,33 (s, 6H); MS: 492,10 calculado 492,08 observado (MH+). ETAPA 4: PREPARAÇÃO DE CORANTE DE RODAMINA ASSIMÉTRICA 8

[0195] Os Compostos 6 e 7 (19,79 g. 37,42 mmol) foram dissolvidos em clorofórmio (400 ml) e misturados com oxicloreto de fósforo (10,5 ml, 112 mmol) durante 10 min à temperatura ambiente. O composto 3 (8,58 g, 37,4 mmol) foi dissolvido em clorofórmio (200 ml) e adicionado ao composto 6/7/solução de oxicloreto de fósforo. Uma cor verde-água escura se forma imediatamente. A solução foi então refluxada durante 3,5 horas para dar uma cor azul escura. A solução foi concentrada e o sólido azul escuro foi então refluxado com ácido bromídrico (570 ml) com agitação vigorosa durante 1 hora. A solução quente foi vertida sobre gelo para produzir um sólido azul fino que foi recolhido por centrifugação e filtração e lavado com água. O sólido foi misturado em um grande volume de acetato de trietilamônio a 2 M (TEAA), filtrado para remover insolúveis finos e os isômeros separados carregando em uma grande coluna de cromatografia de fase reversa e eluindo com TEAA a 50 mM seguido por MeOH a 60% - 65% - 70%/TEAA a 50 mM. As frações foram analisadas por HPLC antes da combinação. O pool de corante 8 (segundo corante de eluição por HPLC e RP-TLC) foi diluído com um volume igual de água e dessalinizado em uma almofada de gel C18 para produzir, após concentração e secagem, o corante 8, um sólido preto-azul escuro (8,79 g, 32%) como o sal de TEA. RMN de 1H (400 MHz, CD3OD): δ 7,55 (s, 1H), 6,92 (s, 1H), 6,81 (s, 1H), 6,61 (s, 1H), 5,60 (d, 2H), 3,61 (t, 2H), 3,16 (q, 6H), 2,94 (m, 2H), 2,02 (m, 2H), 1,87 (d, 6H), 1,50 (m, 6H), 1,39 (d, 6H), 1,27 (t, 9H); comprimento máximo de onda de absorvância 610 nm. ETAPA 5: PREPARAÇÃO DE CORANTE DE RODAMINA ASSIMÉTRICA 9

[0196] O corante 8 (5,25 g, 7,05 mmol) foi dissolvido em DCM anidro (300 ml), misturado com TEA (13,8 ml, 98,7 mmol), colocado sob nitrogênio e resfriado em um banho de gelo. Anidrido trifluoroacético (6,86 ml, 49,3 mmol) foi adicionado gota a gota e a solução foi agitada durante 0,5 h. A solução agora incolor foi concentrada, redissolvida em DCM e lavada com bicarbonato de sódio, HCl a 1 N e processada para produzir o composto 9. EXEMPLO 2: PREPARAÇÃO DE CORANTE DE RODAMINA 9

FOSFORAMIDITA

ETAPA 1: PREPARAÇÃO DE CORANTE DE RODAMINA 9 ÉSTER

ATIVADO

[0197] O Composto 9 foi dissolvido em DCM anidro (200 ml), misturado com N-hidroxissuccimida (1,62 g, 14,1 mmol), 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil)carbodi-imida (EDC, 3,38 g, 17,6 mmol), e agitado durante 1 hora. A solução foi diluída com DCM,

lavada com HCl a 1 N e trabalhada até o composto 10. ETAPA 2: PREPARAÇÃO DE CORANTE DE RODAMINA DO LIGANTE DE 6-AMINO-2-DMT HEXAN-1-OL N-PROTEGIDA, 11

[0198] O composto 10 foi dissolvido em DMC anidro (200 ml) e uma solução de 6-amino-2- ((bis(4-metoxifenil)(fenil)metoxi)metil)hexan-1-ol (4,12 g, 9,17 mmol) e trietilamina (1,47 ml, 10,6 mmol; TEA) foi adicionado gota a gota. Agitou-se à temperatura ambiente durante 2 horas. A solução foi diluída com DCM, lavada com água e tratada. O sólido em bruto foi purificado usando cromatografia em coluna de fase reversa eluindo com MeCN a 95% - 100%/água para produzir o composto 11 como um sólido verde (5,91 g, 72%). RMN de 1H (400 MHz, CD2Cl2): δ 7,85 (s, 1H), 7,41 (m, 2H), 7,29 (m, 6H), 7,21 (m, 1H), 6,82 (m, 5H), 6,62 (s, 1H), 6,22 (s, 1H), 6,21 (m, 1H), 5,53 (s, 1H), 5,20 (s, 1H), 3,78 (s, 6H), 3,64 (m, 2H), 3,44 (m, 2H), 3,32 (m, 2H), 3,24 (m, 1H), 3,09 (m, 1H), 2,88 (t, 2H), 2,10 (t amplo, 1H), 1,96 ( m, 2H), 1,85 (d, 3H), 1,79 (m, 1H), 1,72 (d, 3H), 1,55 (m, 6H), 1,25-1,42 (m, 10H); MS: 1170,40 calculado, 1170,34 observado (MH+). ETAPA 3: PREPARAÇÃO DE CORANTE DE RODAMINA 9

FOSFORAMIDITA

[0199] O Composto 11 (5,97 g, 5,10 mmol) e tetrazolamina (0,44 g, 2,54 mmol) foram dissolvidos em DCM anidro (150 ml), agitados e colocados sob nitrogênio. Peneiras moleculares 3A foram adicionadas e posteriormente agitadas 10 min. A isto foi adicionado 2-cianoetil N,N,N',N'-tetraisopropilfosforodiamidita (3,07 g, 10,2 mmol) e a mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 1 hora. As peneiras moleculares foram removidas por filtração e a solução concentrada até um sólido. Este foi purificado por cromatografia em coluna de fase reversa, tratando previamente a coluna com TEA a 20%/MeCN e, em seguida, lavando bem com MeCN. A amostra foi então dissolvida em MeCN e eluída com MeCN. As frações agrupadas contendo o produto foram concentradas e secas para produzir fosforamidita 12 de corante de rodamina assimétrica com NH TFA-N-protegida como um sólido amarelo escuro (6,13 g, 88%). RMN de 1H (400 MHz, CD2Cl2): δ 7,77 (s, 1H), 7,43 (m, 2H), 7,30 (m, 6H), 7,20 (m, 1H), 6,82 (m, 5H), 6,66 (s, 1H), 6,31 (m, 1H), 6,24 (s, 1H), 5,53 (s, 1H), 5,21 (s, 1H), 3,78 – 3,64 (s e m, 10H), 3,57 (m, 2H), 3,43 (q, 2H), 3,32 (t, 2H), 3,11 (m, 2H), 2,89 (t, 2H), 2,54 (q, 2H), 1,97 (m, 2H), 1,92 – 1,84 (m, 4H), 1,73 (s, 3H), 1,61 (m, 2H), 1,51 (d, 6H), 1,45 (m, 2H), 1,40 – 1,28 (s e m, 8H), 1,50 (m, 12H); RMN de 31P (400 MHz, CD2Cl2): δ 147,4 (s, 1P); MS 1370,51 calculado, 1370,57 observado (MH+) EXEMPLO 3: SÍNTESE DE FASE SÓLIDA DE UM OLIGONUCLEOTÍDEO

MARCADO COM RODAMINA ASSIMÉTRICA DE CORANTE GRANDE

[0200] Os oligonucleotídeos marcados com os reagentes de síntese de fosforamidita de rodamina assimétrica N-protegida foram sintetizados em suportes sólidos de poliestireno usando as condições operacionais padrão em um sintetizador de DNA automatizado Biolytic 3900. A fosforamidita de rodamina assimétrica N- protegida 12 foi dissolvida em solvente de acetonitrila para as reações de acoplamento, e os adutos de corante de rodamina assimétrica N-protegida eram estáveis a ciclos de síntese repetidos que empregavam a remoção de DMT com ácido tricloroacético, adição de outros fosforamiditas especiais, tampando com anidrido acético e oxidação com iodo para gerar as ligações fosfodiéster internucleotídeo. Essa classe de rodamina assimétrica também foi considerada estável nas condições usadas para desproteger e clivar o oligonucleotídeo marcado sintetizado do suporte sólido (tratamento com uma solução contendo t-butilamina/metanol/água a 65 °C por cinco horas). O esquema geral usado para sintetizar o oligonucleotídeo marcado é ilustrado no esquema acima. Por este processo, a fosforamidita 12 de rodamina DMT mono TFA assimétrica foi acoplada à 5’-hidroxila de um oligo nucleotídeo ligado a um suporte para dar o intermediário fosfodiéster 13 após oxidação e remoção do grupo DMT. Fosforamidita dímero de PEG foi acoplada à hidroxila livre do intermediário 13 para dar o intermediário 14 após oxidação, cobertura e remoção de DMT. Fosforamidita de fluoresceína (ThermoFisher) foi acoplada à hidroxila livre do intermediário 14. O oligo marcado resultante foi oxidado, tampado, clivado e desprotegido do suporte para produzir o oligonucleotídeo 15 marcado. Oligo 15 foi purificado usando protocolos cromatográficos padrão.

[0201] A divulgação pode ser melhor descrita pelas seguintes cláusulas numeradas.

1. Um composto da fórmula, em que R1, R2, R3, R6, R7, R8, R11, R12, R13 e R14, quando tomados sozinhos,

são, cada um independentemente entre si, selecionados a partir de hidrogênio, alquila inferior, (C6-C14) arila, (C7-C20) arilalquila, heteroarila de 5-14 membros, heteroarilalquila de 6-20 membros, -Rb ou -(CH2)n-Rb; ou, alternativamente, R1 e R2 e/ou R6 e R7 são tomados em conjunto com os átomos de carbono aos quais estão ligados para formar um grupo benzo opcionalmente substituído; R4, quando tomado isoladamente, é selecionado a partir de hidrogênio, alquila inferior, (C6-C14) arila, (C7-C20) arilalquila, heteroarila de 5-14 membros, heteroarilalquila de 6-20 membros; ou R4 e um dentre R2 ou R3 são tomados em conjunto com os átomos aos quais estão ligados para formar um grupo heterocicloalquila opcionalmente substituído, um grupo heterocicloalquenila opcionalmente substituído, ou um grupo heteroarila opcionalmente substituído; R5 é H ou um grupo protetor; R9, quando tomado sozinho, é selecionado a partir de hidrogênio, alquila inferior, (C6-C14) arila, (C7-C20) arilalquila, heteroarila de 5-14 membros, heteroarilalquila de 6-20 membros; ou R7 e R9 são tomados em conjunto com os átomos aos quais estão ligados para formar um grupo heterocicloalquila opcionalmente substituído, um grupo heterocicloalquenila opcionalmente substituído ou um grupo heteroarila opcionalmente substituído; R10 é H ou grupo protetor; ou R8 e R10 são tomados em conjunto com os átomos aos quais estão ligados para formar um grupo heterocicloalquila opcionalmente substituído, um grupo heterocicloalquenila opcionalmente substituído ou um grupo heteroarila opcionalmente substituído; pelo menos um dentre R7 e R9 ou R8 e R10 são tomados em conjunto com os átomos aos quais estão ligados para formar um grupo heterocicloalquila opcionalmente substituído, um grupo heterocicloalquenila opcionalmente substituído ou um grupo heteroarila opcionalmente substituído e, opcionalmente, R4 e um dentre R2 ou R3 são tomados em conjunto com os átomos aos quais estão ligados para formar um grupo heterocicloalquila opcionalmente substituído, um grupo heterocicloalquenila opcionalmente substituído ou um grupo heteroarila opcionalmente substituído com a condição de que o composto não seja da fórmula , ou; cada Ra é independentemente selecionado a partir de alquila inferior, (C6- C14) arila, (C7-C20) arilalquila, heteroarila de 5-14 membros, -CX3 e heteroarilalquila de 6-20 membros; cada Rb é independentemente selecionado a partir de -X, -OH, -ORa, -SH, - SRa -NH2, -NHRa, -NRcRc, -N+RcRcRc, per-halo alquila inferior, tri-halometila, trifluorometila, -P(O)(OH)2, P(O)(ORa)2, P(O)(OH)(ORa), -OP(O)(OH)2, OP(O)(ORa)2, -OP(O)(ORa)(OH), -S(O)2OH, -S(O)2Ra, -C(O)H, -C(O)Ra, -C(S)X, -C(O)ORa, - C(O)OH, -C(O)NH2, -C(O)NHRa, -C(O)NRcRc, -C(S)NH2, -C(O)NHRa, -C(O)NRcRc, - C(NH)NH2, -C(NH)NHRa e -C(NH)NRcRc; cada Rc é, independentemente, um Ra, ou, alternativamente, dois Rc ligados ao mesmo átomo nitrôgenio podem ser tomados em conjunto com esse átomo de nitrogênio para formar um anel saturado ou insaturado de 5 a 8 membros que pode opcionalmente incluir um ou mais heteroátomos do mesmo anel ou heteroátomos de um anel diferente, selecionados a partir de O, N e S; e cada Rd e Re, quando tomados isoladamente, são independentemente selecionados a partir de hidrogênio, alquila inferior, (C6-C14) arila, (C7-C20) arilalquila, heteroarila de 5-14 membros, heteroarilalquila de 6-20 membros, -Rb ou - (CH2)n-Rb; e X é halo; e n é um número inteiro que varia de 1 a 10.

[0202] 2. O composto da cláusula 1, em que o anel de espirolactona está na forma ácida aberta e os grupos amina não estão protegidos. Em certas modalidades, a forma ácida aberta do composto é fluorescente (ou exibe um aumento na fluorescência) em relação à forma fechada espirolactona do composto. Os grupos amina dos compostos descritos neste documento podem ser protegidos na forma fechada de espirolactona e podem ser transformados em e usados como fosforamiditas para alto rendimento e marcação de alta pureza de ácidos nucleicos. Assim, também são fornecidos aqui sondas e iniciadores de ácido nucleico marcados com fluorescência que incluem um composto da cláusula 1 na forma de lactona aberta desprotegida. Exemplos representativos de compostos da cláusula 1 na forma de lactona aberta após a desproteção dos grupos amina e clivagem da sonda de ácido nucleico de um suporte sólido são mostrados nas Figuras 8 e 9.

[0203] A Thermo Fisher Scientific oferece um kit HID que inclui reagentes para marcar ácidos nucléicos com 5 corantes repórter (ou seja, FAM, VIC, TED, TAZ e SID) e um tamanho LIZ padrão (Kit de amplificação de PCR NGM Detect™). Certos corantes fornecidos neste documento têm propriedades espectrais únicas que complementam aquelas no conjunto de corantes existentes e podem ser usados para expandir o número de corantes repórter que podem ser incluídos para aplicações HID. Em particular, verificou-se que certas rodaminas assimétricas descritas na cláusula 1 exibem um comprimento de onda de emissão de pico e uma largura espectral estreita de modo que possam ser separados de outros corantes dentro do conjunto de corante comercial existente. Por exemplo, compostos representativos que exibem um pico de comprimento de onda de emissão (por exemplo, aproximadamente 634 nm) pertencem à classe de compostos de rodamina assimétricos mostrados na estrutura D.1. O requerente descobriu ainda que, substituindo VIC por dois novos corantes, o conjunto de corantes HID existente poderia ser expandido para incluir 7 ou mais corantes repórter. Em certas modalidades, uma rodamina assimétrica tendo uma estrutura conforme descrito no documento PCT/US2019/67925 (Cmpd A) e TET (aproximadamente 536 nm) são usados como um substituto para VIC em um kit que inclui ainda a rodamina assimétrica de estrutura D.1 (Cmpd B) e FAM, TED, TAZ e SID (Figura 10). Tais compostos são bem resolvidos a partir dos picos de emissão vizinhos de SID (aproximadamente 617) e LIZ (aproximadamente 653 nm) no conjunto de corantes proposto. Assim, certos kits fornecidos neste documento podem incluir ácidos nucleicos marcados com (ou reagentes para ácidos nucleicos de marcação) um composto conforme descrito na cláusula 1 (por exemplo, um composto com estrutura D.1) com emissão em aproximadamente 634 nm, FAM, TET, TED, TAZ e SID.

[0204] 3. Um oligonucleotídeo compreendendo uma porção química de marcador produzida pela reação de um oligonucleotídeo ligado a um suporte sólido com um reagente tem uma estrutura de fórmula: LM-L-PEP em que PEP é um grupo precursor de éster de fosfato, L é um ligante opcional que liga a porção química de marcador ao grupo PEP, e LM compreende uma porção química de NH-rodamina N-protegida da fórmula (I), em que R1, R2, R3, R6, R7, R8, R11, R12, R13 e R14, quando tomados isoladamente, são, cada um independentemente entre si, selecionados a partir de hidrogênio, alquila inferior, (C6-C14) arila, (C7-C20) arilalquila, heteroarila de 5-14 membros, heteroarilalquila de 6-20 membros, -Rb ou -(CH2)n-Rb; ou, alternativamente, R1 e R2 e/ou R6 e R7 são tomados em conjunto com os átomos de carbono aos quais estão ligados para formar um grupo benzo opcionalmente substituído; e um dentre R2, R3, R7, R8, R12 ou R13 compreende um grupo da fórmula —Y—, em que Y é selecionado a partir do grupo que consiste em -C(O)-, - S(O)2-, -S- e -NH-; R4, quando tomado isoladamente, é selecionado a partir de hidrogênio, alquila inferior, (C6-C14) arila, (C7-C20) arilalquila, heteroarila de 5-14 membros, heteroarilalquila de 6-20 membros; ou R4 e um dentre R2 ou R3 são tomados em conjunto com os átomos aos quais estão ligados para formar um grupo heterocicloalquila opcionalmente substituído, um grupo heterocicloalquenila opcionalmente substituído, ou um grupo heteroarila opcionalmente substituído; R5 é H ou um grupo protetor; R9, quando tomado sozinho, é selecionado a partir de hidrogênio, alquila inferior, (C6-C14) arila, (C7-C20) arilalquila, heteroarila de 5-14 membros, heteroarilalquila de 6-20 membros; ou R7 e R9 são tomados em conjunto com os átomos aos quais estão ligados para formar um grupo heterocicloalquila opcionalmente substituído, um grupo heterocicloalquenila opcionalmente substituído ou um grupo heteroarila opcionalmente substituído; R10 é H ou grupo protetor; ou R8 e R10 são tomados em conjunto com os átomos aos quais estão ligados para formar um grupo heterocicloalquila opcionalmente substituído, um grupo heterocicloalquenila opcionalmente substituído ou um grupo heteroarila opcionalmente substituído; pelo menos um dentre R7 e R9 ou R8 e R10 são tomados em conjunto com os átomos aos quais estão ligados para formar um grupo heterocicloalquila opcionalmente substituído, um grupo heterocicloalquenila opcionalmente substituído ou um grupo heteroarila opcionalmente substituído e, opcionalmente, R4 e um dentre R2 ou R3 são tomados em conjunto com os átomos aos quais estão ligados para formar um grupo heterocicloalquila opcionalmente substituído, um grupo heterocicloalquenila opcionalmente substituído ou um grupo heteroarila opcionalmente substituído com a condição de que o composto não seja da fórmula , ou; cada Ra é independentemente selecionado a partir de alquila inferior, (C6- C14) arila, (C7-C20) arilalquila, heteroarila de 5-14 membros, -CX3 e heteroarilalquila de 6-20 membros; cada Rb é independentemente selecionado a partir de -X, -OH, -ORa, -SH, - SRa -NH2, -NHRa, NRcRc, N+RcRcRc, per-halo alquila inferior, tri-halometila, trifluorometila, -P(O)(OH)2, -P(O)(ORa)2, P(O)(OH)(ORa), -OP(O)(OH)2, -

OP(O)(ORa)2, -OP(O)(ORa)(OH), -S(O)2OH, -S(O)2Ra, -C(O)H, -C(O)Ra, -C(S)X, - C(O)ORa, -C(O)OH, -C(O)NH2, -C(O)NHRa, -C(O)NRcRc, -C(S)NH2, -C(O)NHRa, - C(O)NRcRc, -C(NH)NH2, --C(NH)NHRa e -C(NH)NRcRc; cada Rc é, independentemente, um Ra, ou, alternativamente, dois Rc ligados ao mesmo átomo nitrôgenio podem ser tomados em conjunto com esse átomo de nitrogênio para formar um anel saturado ou insaturado de 5 a 8 membros que pode opcionalmente incluir um ou mais heteroátomos do mesmo anel ou heteroátomos de um anel diferente, selecionados a partir de O, N e S; e cada Rd e Re, quando tomados isoladamente, são independentemente selecionados a partir de hidrogênio, alquila inferior, (C6-C14) arila, (C7-C20) arilalquila, heteroarila de 5-14 membros, heteroarilalquila de 6-20 membros, -Rb ou - (CH2)n-Rb; e X é halo; e n é um número inteiro que varia de 1 a 10.

[0205] 4. O oligonucleotídeo da cláusula 3, em que o anel de espirolactona está na forma ácida aberta e os grupos amina não estão protegidos.

[0206] 5. Um reagente útil para marcar um oligonucleotídeo, que é um composto de acordo com a fórmula estrutural: LM-L-PEP (XX) em que LM representa uma porção química de marcador que compreende uma porção química de NH-rodamina N-protegida, PEP é um grupo precursor de éster de fosfato que compreende um grupo fosforamidita ou um grupo de H- fosfonato, e L é um ligante opcional que liga a porção química de marcador ao grupo precursor de éster de fosfato, no qual a porção química de NH-rodamina N-protegida da fórmula em que R1, R2, R3, R6, R7, R8, R11, R12, R13 e R14, quando tomados isoladamente, são, cada um independentemente entre si, selecionados a partir de hidrogênio, alquila inferior, (C6-C14) arila, (C7-C20) arilalquila, heteroarila de 5-14 membros, heteroarilalquila de 6-20 membros, -Rb ou -(CH2)n-Rb; ou, alternativamente, R1 e R2 e/ou R6 e R7 são tomados em conjunto com os átomos de carbono aos quais estão ligados para formar um grupo benzo opcionalmente substituído; e um dentre R2, R3, R7, R8, R12 ou R13 compreende um grupo da fórmula —Y—, em que Y é selecionado a partir do grupo que consiste em -C(O)-, S(O)2-, -S- e -NH-; R4, quando tomado isoladamente, é selecionado a partir de hidrogênio, alquila inferior, (C6-C14) arila, (C7-C20) arilalquila, heteroarila de 5-14 membros, heteroarilalquila de 6-20 membros; ou R4 e um dentre R2 ou R3 são tomados em conjunto com os átomos aos quais estão ligados para formar um grupo heterocicloalquila opcionalmente substituído, um grupo heterocicloalquenila opcionalmente substituído, ou um grupo heteroarila opcionalmente substituído; R5 é H ou um grupo protetor; R9, quando tomado sozinho, é selecionado a partir de hidrogênio, alquila inferior, (C6-C14) arila, (C7-C20) arilalquila, heteroarila de 5-14 membros, heteroarilalquila de 6-20 membros; ou R7 e R9 são tomados em conjunto com os átomos aos quais estão ligados para formar um grupo heterocicloalquila opcionalmente substituído, um grupo heterocicloalquenila opcionalmente substituído ou um grupo heteroarila opcionalmente substituído; R10 é H ou grupo protetor; ou R8 e R10 são tomados em conjunto com os átomos aos quais estão ligados para formar um grupo heterocicloalquila opcionalmente substituído, um grupo heterocicloalquenila opcionalmente substituído ou um grupo heteroarila opcionalmente substituído; pelo menos um dentre R7 e R9 ou R8 e R10 são tomados em conjunto com os átomos aos quais estão ligados para formar um grupo heterocicloalquila opcionalmente substituído, um grupo heterocicloalquenila opcionalmente substituído ou um grupo heteroarila opcionalmente substituído e, opcionalmente, R4 e um dentre R2 ou R3 são tomados em conjunto com os átomos aos quais estão ligados para formar um grupo heterocicloalquila opcionalmente substituído, um grupo heterocicloalquenila opcionalmente substituído ou um grupo heteroarila opcionalmente substituído com a condição de que o composto não seja da fórmula , ou; cada Ra é independentemente selecionado a partir de alquila inferior, (C6- C14) arila, (C7-C20) arilalquila, heteroarila de 5-14 membros, -CX3 e heteroarilalquila de 6-20 membros; cada Rb é independentemente selecionado a partir de X, -OH, -ORa, -SH, - SRa -NH2, -NHRa, -NRcRc, -N+RcRcRc, per-halo alquila inferior, tri-halometila, trifluorometila, -P(O)(OH)2, -P(O)(ORa)2, P(O)(OH)(ORa), -OP(O)(OH)2, - OP(O)(ORa)2, -OP(O)(ORa)(OH), -S(O)2OH, -S(O)2Ra, -C(O)H, -C(O)Ra, -C(S)X, - C(O)ORa, -C(O)OH, -C(O)NH2, -C(O)NHRa, -C(O)NRcRc, -C(S)NH2, -C(O)NHRa, - C(O)NRcRc, -C(NH)NH2, -C(NH)NHRa e -C(NH)NRcRc; cada Rc é, independentemente, um Ra, ou, alternativamente, dois Rc ligados ao mesmo átomo nitrôgenio podem ser tomados em conjunto com esse átomo de nitrogênio para formar um anel saturado ou insaturado de 5 a 8 membros que pode opcionalmente incluir um ou mais heteroátomos do mesmo anel ou heteroátomos de um anel diferente, selecionados a partir de O, N e S; e cada Rd e Re, quando tomados isoladamente, são independentemente selecionados a partir de hidrogênio, alquila inferior, (C6-C14) arila, (C7-C20) arilalquila, heteroarila de 5-14 membros, heteroarilalquila de 6-20 membros, -Rb ou - (CH2)n-Rb; X é halo; e n é um número inteiro que varia de 1 a 10.

[0207] 6. Reagente da cláusula 5, em que o anel de espirolactona está na forma ácida aberta e os grupos amina não estão protegidos.

Claims (151)

REIVINDICAÇÕES

1. Composto da fórmula CARACTERIZADO pelo fato de que R1, R2, R3, R6, R7, R8, R11, R12, R13 e R14, quando tomados sozinhos, são, cada um independentemente entre si, selecionados a partir de hidrogênio, alquila inferior, (C6-C14) arila, (C7-C20) arilalquila, heteroarila de 5 a 14 membros, heteroarilalquila de 6-20 membros, -Rb ou -(CH2)n-Rb; ou, alternativamente, R1 e R2 e/ou R6 e R7 são tomados em conjunto com os átomos de carbono aos quais estão ligados para formar um grupo benzo opcionalmente substituído; R4, quando considerado isoladamente, é selecionado a partir de hidrogênio, alquila inferior, (C6-C14) arila, (C7-C20) arilalquila, heteroarila de 5-14 membros, heteroarilalquila de 6-20 membros; ou R4 e um dentre R2 ou R3 são tomados em conjunto com os átomos aos quais estão ligados para formar um grupo heterocicloalquila opcionalmente substituído, um grupo heterocicloalquenila opcionalmente substituído, ou um grupo heteroarila opcionalmente substituído; R5 é H ou um grupo protetor; R9, quando tomado sozinho, é selecionado a partir de hidrogênio, alquila inferior, (C6-C14) arila, (C7-C20) arilalquila, heteroarila de 5 a 14 membros, heteroarilalquila de 6-20 membros; ou R7 e R9 são tomados em conjunto com os átomos aos quais estão ligados para formar um grupo heterocicloalquila opcionalmente substituído, um grupo heterocicloalquenila opcionalmente substituído ou um grupo heteroarila opcionalmente substituído;

R10 é H ou grupo protetor; ou R8 e R10 são tomados em conjunto com os átomos aos quais estão ligados para formar um grupo heterocicloalquila opcionalmente substituído, um grupo heterocicloalquenila opcionalmente substituído ou um grupo heteroarila opcionalmente substituído; pelo menos um dentre R7 e R9 ou R8 e R10 são tomados em conjunto com os átomos aos quais estão ligados para formar um grupo heterocicloalquila opcionalmente substituído, um grupo heterocicloalquenila opcionalmente substituído ou um grupo heteroarila opcionalmente substituído e, opcionalmente, R4 e um dentre R2 ou R3 são tomados em conjunto com os átomos aos quais estão ligados para formar um grupo heterocicloalquila opcionalmente substituído, um grupo heterocicloalquenila opcionalmente substituído ou um grupo heteroarila opcionalmente substituído com a condição de que o composto não seja da fórmula R5 R3 R8 R10 d N O N R e R4 R R2 R1 O R 6

R11 O

R12 R14 13 R , ou ; cada Ra é independentemente selecionado a partir de alquila inferior, (C6- C14) arila, (C7-C20) arilalquila, heteroarila de 5 a 14 membros, -CX3 e heteroarilalquila de 6-20 membros; cada Rb é independentemente selecionado a partir de -X, -OH, -ORa, -SH, - SRa -NH2, -NHRa, -NRcRc, -N+RcRcRc, per-halo alquila inferior, tri-halometila, trifluorometila, -P(O)(OH)2, -P(O)(ORa)2, -P(O)(OH)(ORa), -OP(O)(OH)2, - OP(O)(ORa)2, -OP(O)(ORa)(OH), -S(O)2OH, S(O)2Ra, -C(O)H, C(O)Ra, -C(S)X, - C(O)ORa, -C(O)OH, -C(O)NH2, -C(O)NHRa, -C(O)NRcRc, -C(S)NH2, -C(O)NHRa, - C(O)NRcRc, -C(NH)NH2, -C(NH)NHRa e -C(NH)NRcRc; cada Rc é, independentemente, um Ra, ou, alternativamente, dois Rc ligados ao mesmo átomo nitrôgenio podem ser tomados em conjunto com esse átomo de nitrogênio para formar um anel saturado ou insaturado de 5 a 8 membros que pode opcionalmente incluir um ou mais heteroátomos do mesmo anel ou heteroátomos de um anel diferente, selecionados a partir de O, N e S; e cada Rd e Re, quando tomados isoladamente, são independentemente selecionados a partir de hidrogênio, alquila inferior, (C6-C14) arila, (C7-C20) arilalquila, heteroarila de 5-14 membros, heteroarilalquila de 6-20 membros, -Rb ou - (CH2)n-Rb; X é halo; e n é um número inteiro que varia de 1 a 10.

2. Composto, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto tem a fórmula (II.1) em que cada um dentre Rf, Rg, Rh, Ri, e Rj, quando tomados isoladamente, são, cada um independentemente entre si, selecionados a partir de hidrogênio, alquila inferior, (C6-C14) arila, (C7-C20) arilalquila, heteroarila de 5-14 membros, heteroarilalquila de 6-20 membros, -Rb ou -(CH2)n-Rb.

3. Composto, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto tem a fórmula (II.2)

em que cada um dentre Rf, Rg, Rh, Ri, e Rj, quando tomados isoladamente, são, cada um independentemente entre si, selecionados a partir de hidrogênio, alquila inferior, (C6-C14) arila, (C7-C20) arilalquila, heteroarila de 5-14 membros, heteroarilalquila de 6-20 membros, -Rb ou -(CH2)n-Rb.

4. Composto, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto tem a fórmula (II.3) em que cada um dentre Rh, Ri, e Rj, quando tomados isoladamente, são, cada um independentemente entre si, selecionados a partir de hidrogênio, alquila inferior, (C6-C14) arila, (C7-C20) arilalquila, heteroarila de 5 a 14 membros, heteroarilalquila de 6-20 membros, -Rb ou -(CH2)n-Rb.

5. Composto, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto tem a fórmula (II.4)

em que cada um dentre Rf, Rg, Rh, Ri, e Rj, quando tomados isoladamente, são, cada um independentemente entre si, selecionados a partir de hidrogênio, alquila inferior, (C6-C14) arila, (C7-C20) arilalquila, heteroarila de 5-14 membros, heteroarilalquila de 6-20 membros, -Rb ou -(CH2)n-Rb.

6. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, CARACTERIZADO pelo fato de que cada um dentre R11 e R14 é halo.

7. Composto, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o halo é flúor ou cloro.

8. Composto, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o halo é cloro.

9. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8, CARACTERIZADO pelo fato de que R13 é -C(O)H, -C(O)Ra -C(S)X, -C(O)O-, - C(O)OH, -C(O)NH2, -C(O)NHRa, -C(O)NRcRc, -C(S)NH2, -C(O)NHRa, -C(O)NRcRc, - C(NH)NH2, -C(NH)NHRa ou -C(NH)NRcRc.

10. Composto, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que R13 é -C(O)O- ou -C(O)OH.

11. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-10, CARACTERIZADO pelo fato de que R5 é um grupo protetor.

12. Composto, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que o grupo protetor é -C(O)R15, em que R15 é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, uma alquila inferior, -CX3, -CHX2, -CH2X, -CH2-ORd e fenila opcionalmente monossubstituída por uma alquila inferior, -X, grupo -ORd,

ciano ou nitro, em que Rd é selecionado a partir do grupo que consiste em uma alquila inferior, fenila e piridila, e cada X é um grupo halo.

13. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-12, CARACTERIZADO pelo fato de que R10, quando presente, é um grupo protetor.

14. Composto, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que o grupo protetor é -C(O)R15 em que R15 é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, uma alquila inferior, -CX3, -CHX2, -CH2X, -CH2-ORd e fenila monossubstituída por uma alquila inferior, -X, grupo -ORd, ciano ou nitro, em que Rd é selecionado a partir do grupo que consiste em uma alquila inferior, fenila e piridila, e cada X é um grupo halo.

15. Composto, de acordo com a reivindicação 12 ou 14, CARACTERIZADO pelo fato de que R15 é -CX3, -CHX2, -CH2X.

16. Composto, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que R15 é -CX3.

17. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12-16, CARACTERIZADO pelo fato de que o X no grupo protetor, quando presente, é flúor ou cloro.

18. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12-16, CARACTERIZADO pelo fato de que o X no grupo protetor, quando presente, é flúor.

19. Composto, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que R1 e R2 são tomados em conjunto com os átomos de carbono aos quais estão ligados para formar um grupo benzo opcionalmente substituído.

20. Composto, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que R6 e R7 são tomados em conjunto com os átomos de carbono aos quais estão ligados para formar um grupo benzo opcionalmente substituído.

21. Composto, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que R7 e R9 são tomados em conjunto com os átomos aos quais estão ligados para formar um grupo heterocicloalquila opcionalmente substituído, um grupo heterocicloalquenila opcionalmente substituído ou um grupo heteroarila opcionalmente substituído.

22. Composto, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que R8 e R10 são tomados em conjunto com os átomos aos quais estão ligados para formar um grupo heterocicloalquila opcionalmente substituído, um grupo heterocicloalquenila opcionalmente substituído ou um grupo heteroarila opcionalmente substituído.

23. Composto, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que R4 e um dentre R2 ou R3 são tomados em conjunto com os átomos aos quais estão ligados para formar um grupo heterocicloalquila opcionalmente substituído, um grupo heterocicloalquenila opcionalmente substituído ou um grupo heteroarila opcionalmente substituído.

24. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 19-23, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição opcional no anel benzo, o grupo heterocicloalquila, heterocicloalquenila ou heteroarila, quando presente, inclui pelo menos um dentre -X, -OH, -ORa, -SH, -SRa -NH2, -NHRa, -NRcRc, N+RcRcRc, per-halo alquila inferior, tri-halometila, trilfluorometila, -P(O)(OH)2, -P(O)(ORa)2, - P(O)(OH)(ORa), -OP(O)(OH)2, OP(O)(ORa)2, -OP(O)(ORa)(OH), -S(O)2OH, -S(O)2Ra, -C(O)H, -C(O)Ra, -C(S)X, -C(O)ORa, -C(O)OH, -C(O)NH2, -C(O)NHRa, -C(O)NRcRc, - C(S)NH2, -C(O)NHRa, -C(O)NRcRc, -C(NH)NH2, -C(NH)NHRa e C(NH)NRcRc, cada Ra é, independentemente dos outros, selecionado a partir de alquila inferior, (C6-C14) arila, (C7-C20) arilalquila, heteroarila de 5-14 membros, -CX3 e heteroarilalquila de 6-20 membros, e cada Rc é, independentemente dos outros, um Ra, ou, alternativamente, dois Rc ligados ao mesmo átomo de nitrogênio podem ser tomados em conjunto com esse átomo de nitrogênio para formar um anel saturado ou insaturado de 5 a 8 membros que podem opcionalmente incluir um ou mais heteroátomos do mesmo anel ou de um anel diferente selecionados a partir de O, N e S.

25. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 19-23, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição opcional no anel benzo, o grupo heterocicloalquila, heterocicloalquenila ou heteroarila, quando presente, inclui pelo menos um dentre -X, -C1-C6 alquila, -C2-C6 alquenila, -C2-C6 alquinila, -OH, -ORa - SH, SRa -NH2, -NHRa -NRcRc, -N-RcRcRc, per-halo alquila inferior, tri-halometila, trilfluorometila, -C(O)H, -C(O)Ra, -C(S)X, -C(O)ORa, -C(O)OH, -C(O)NH2, - C(O)NHRa, -C(O)NRcRC, -C(S)NH2, -C(O)NHRa, -C(O)NRcRc, -C(NH)NH2, - C(NH)NHRa ou -C(NH)NRcRc.

26. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 19-25, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição opcional no anel benzo, o grupo heterocicloalquila, heterocicloalquenila ou heteroarila inclui pelo menos dois dentre - X, -C1-C6 alquila, -C2-C6 alquenila, C2-C6 alquinila, -OH, -ORa -SH, -SRa NH2, NHRa -NRcRc, N+RcRcRc, per-halo alquila inferior, tri-halometila, trifluorometila, - C(O)H, -C(O)Ra, -C(S)X, -C(O)ORa, -C(O)OH, -C(O)NH2, -C(O)NHRa, -C(O)NRcRC, - C(S)NH2, -C(O)NHRa, -C(O)NRcRc, -C(NH)NH2, -C(NH)NHRa ou -C(NH)NRcRc.

27. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 19-26, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição opcional no anel benzo, o grupo heterocicloalquila, heterocicloalquenila ou heteroarila inclui pelo menos dois grupos - C1-C6 alquila.

28. Oligonucleotídeo CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma porção química de marcador produzida pela reação de um oligonucleotídeo ligado a um suporte sólido com um reagente com uma estrutura de fórmula: LM-L-PEP em que PEP é um grupo precursor de éster de fosfato, L é um ligante opcional que liga a porção química de marcador ao grupo PEP, e LM compreende uma porção química de NH-rodamina N-protegida da fórmula (I)

em que R1, R2, R3, R6, R7, R8, R11, R12, R13 e R14, quando tomados isoladamente, são, cada um independentemente entre si, selecionados a partir de hidrogênio, alquila inferior, (C6-C14) arila, (C7-C20) arilalquila, heteroarila de 5-14 membros, heteroarilalquila de 6-20 membros, -Rb ou -(CH2)n-Rb; ou, alternativamente, R1 e R2 e/ou R6 e R7 são tomados em conjunto com os átomos de carbono aos quais estão ligados para formar um grupo benzo opcionalmente substituído; e um dentre R2, R3, R7, R8, R12 ou R13 compreende um grupo da fórmula —Y—, em que Y é selecionado a partir do grupo que consiste em -C(O)-, -S(O)2-, -S- e -NH-; R4, quando considerado isoladamente, é selecionado a partir de hidrogênio, alquila inferior, (C6-C14) arila, (C7-C20) arilalquila, heteroarila de 5-14 membros, heteroarilalquila de 6-20 membros; ou R4 e um dentre R2 ou R3 são tomados em conjunto com os átomos aos quais estão ligados para formar um grupo heterocicloalquila opcionalmente substituído, um grupo heterocicloalquenila opcionalmente substituído, ou um grupo heteroarila opcionalmente substituído; R5 é H ou um grupo protetor; R9, quando tomado sozinho, é selecionado a partir de hidrogênio, alquila inferior, (C6-C14) arila, (C7-C20) arilalquila, heteroarila de 5 a 14 membros, heteroarilalquila de 6-20 membros; ou R7 e R9 são tomados em conjunto com os átomos aos quais estão ligados para formar um grupo heterocicloalquila opcionalmente substituído, um grupo heterocicloalquenila opcionalmente substituído ou um grupo heteroarila opcionalmente substituído; R10 é H ou grupo protetor; ou R8 e R10 são tomados em conjunto com os átomos aos quais estão ligados para formar um grupo heterocicloalquila opcionalmente substituído, um grupo heterocicloalquenila opcionalmente substituído ou um grupo heteroarila opcionalmente substituído; pelo menos um dentre R7 e R9 ou R8 e R10 são tomados em conjunto com os átomos aos quais estão ligados para formar um grupo heterocicloalquila opcionalmente substituído, um grupo heterocicloalquenila opcionalmente substituído ou um grupo heteroarila opcionalmente substituído e, opcionalmente, R4 e um dentre R2 ou R3 são tomados em conjunto com os átomos aos quais estão ligados para formar um grupo heterocicloalquila opcionalmente substituído, um grupo heterocicloalquenila opcionalmente substituído ou um grupo heteroarila opcionalmente substituído com a condição de que o composto não seja da fórmula R5 R3 R8 R10 d N O N R e R4 R

R2 R1 O R 6

R11 O

R12 R14 13 R , ou ; cada Ra é independentemente selecionado a partir de alquila inferior, (C6- C14) arila, (C7-C20) arilalquila, heteroarila de 5-14 membros, -CX3 e heteroarilalquila de 6-20 membros; cada Rb é independentemente selecionado a partir de -X, -OH, -ORa, -SH, - SRa -NH2, -NHRa, -NRcRc, -N+RcRcRc, per-halo alquila inferior, tri-halometila, trifluorometila, -P(O)(OH)2, -P(O)(ORa)2, P(O)(OH)(ORa), -OP(O)(OH)2, - OP(O)(ORa)2, -OP(O)(ORa)(OH), -S(O)2OH, -S(O)2Ra, -C(O)H, -C(O)Ra, -C(S)X, - C(O)ORa, -C(O)OH, -C(O)NH2, -C(O)NHRa, -C(O)NRcRc, -C(S)NH2, -C(O)NHRa, - C(O)NRcRc, -C(NH)NH2, -C(NH)NHRa e -C(NH)NRcRc,

cada Rc é, independentemente, um Ra, ou, alternativamente, dois Rc ligados ao mesmo átomo nitrôgenio podem ser tomados em conjunto com esse átomo de nitrogênio para formar um anel saturado ou insaturado de 5 a 8 membros que pode opcionalmente incluir um ou mais heteroátomos do mesmo anel ou heteroátomos de um anel diferente, selecionados a partir de O, N e S; cada Rd e Re, quando tomados isoladamente, são independentemente selecionados a partir de hidrogênio, alquila inferior, (C6-C14) arila, (C7-C20) arilalquila, heteroarila de 5-14 membros, heteroarilalquila de 6-20 membros, -Rb ou - (CH2)n-Rb; X é halo; e n é um número inteiro que varia de 1 a 10.

29. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção química NH-rodamina N-protegida tem a fórmula (II.1) em que cada um dentre Rf, Rg, Rh, Ri, e Rj, quando tomados isoladamente, são, cada um independentemente entre si, selecionados a partir de hidrogênio, alquila inferior, (C6-C14) arila, (C7-C20) arilalquila, heteroarila de 5-14 membros, heteroarilalquila de 6-20 membros, -Rb ou -(CH2)n-Rb.

30. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção química NH-rodamina N-protegida tem a fórmula (II.2)

em que cada um dentre Rf, Rg, Rh, Ri, e Rj, quando tomados isoladamente, são, cada um independentemente entre si, selecionados a partir de hidrogênio, alquila inferior, (C6-C14) arila, (C7-C20) arilalquila, heteroarila de 5-14 membros, heteroarilalquila de 6-20 membros, -Rb ou -(CH2)n-Rb.

31. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção química NH-rodamina N-protegida tem a fórmula (II.3) em que cada um dentre Rh, Ri, e Rj, quando tomados isoladamente, são, cada um independentemente entre si, selecionados a partir de hidrogênio, alquila inferior, (C6-C14) arila, (C7-C20) arilalquila, heteroarila de 5-14 membros, heteroarilalquila de 6-20 membros, -Rb ou -(CH2)n-Rb.

32. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção química NH-rodamina N-protegida tem a fórmula (II.4)

em que cada um dentre Rf, Rg, Rh, Ri, e Rj, quando tomados isoladamente, são, cada um independentemente entre si, selecionados a partir de hidrogênio, alquila inferior, (C6-C14) arila, (C7-C20) arilalquila, heteroarila de 5-14 membros, heteroarilalquila de 6-20 membros, -Rb ou -(CH2)n-Rb.

33. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28- 32, CARACTERIZADO pelo fato de que cada um dentre R11 e R14 é halo.

34. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 33, CARACTERIZADO pelo fato de que o halo é flúor ou cloro.

35. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 33, CARACTERIZADO pelo fato de que o halo é cloro.

36. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28- 35, CARACTERIZADO pelo fato de que R12 é -C(O)H, -C(O)Ra -C(S)X, C(O)O-, - C(O)OH, -C(O)NH2, -C(O)NHRa, -C(O)NRcRC, -C(S)NH2, -C(O)NHRa, -C(O)NRcRc, - C(NH)NH2, -C(NH)NHRa ou -C(NH)NRcRc.

37. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 36, CARACTERIZADO pelo fato de que R12 é -C(O)O- ou -C(O)OH.

38. Composto, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 28- 37, CARACTERIZADO pelo fato de que R5 é um grupo protetor.

39. Composto, de acordo com a reivindicação 38, CARACTERIZADO pelo fato de que o grupo protetor é -C(O)R10, em que R10 é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, uma alquila inferior, -CX3, -CHX2, -CH2X, -CH2-ORd e fenila monossubstituída por uma alquila inferior, -X, grupo -ORd, ciano ou nitro, em que Rd é selecionado a partir do grupo que consiste em uma alquila inferior, fenila e piridila, e cada X é um grupo halo.

40. Oligonucleotídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 28-39, CARACTERIZADO pelo fato de que R10, quando presente, é um grupo protetor.

41. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 40, CARACTERIZADO pelo fato de que o grupo protetor é -C(O)R15 em que R15 é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, uma alquila inferior, -CX3, -CHX2, -CH2X, -CH2- ORd e fenila monossubstituída por uma alquila inferior, -X, grupo -ORd, ciano ou nitro, em que Rd é selecionado a partir do grupo que consiste em uma alquila inferior, fenila e piridila, e cada X é um grupo halo.

42. Oligonucleotídeo, conforme definido na reivindicação 39 ou 41, CARACTERIZADO pelo fato de que R15 é -CX3, -CHX2, -CH2X.

43. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 42, CARACTERIZADO pelo fato de que R15 é -CX3.

44. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 39- 43, CARACTERIZADO pelo fato de que o X no grupo protetor, quando presente, é flúor ou cloro.

45. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 39- 43, CARACTERIZADO pelo fato de que o X no grupo protetor, quando presente, é flúor.

46. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADO pelo fato de que R1 e R2 são tomados em conjunto com os átomos de carbono aos quais estão ligados para formar um grupo benzo opcionalmente substituído.

47. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADO pelo fato de que R6 e R7 são tomados em conjunto com os átomos de carbono aos quais estão ligados para formar um grupo benzo opcionalmente substituído.

48. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADO pelo fato de que R7 e R9 são tomados em conjunto com os átomos aos quais estão ligados para formar um grupo heterocicloalquila opcionalmente substituído, um grupo heterocicloalquenila opcionalmente substituído ou um grupo heteroarila opcionalmente substituído.

49. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADO pelo fato de que R8 e R10 são tomados em conjunto com os átomos aos quais estão ligados para formar um grupo heterocicloalquila opcionalmente substituído, um grupo heterocicloalquenila opcionalmente substituído ou um grupo heteroarila opcionalmente substituído.

50. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADO pelo fato de que R4 e R2 e R3 são tomados em conjunto com os átomos aos quais estão ligados para formar um grupo heterocicloalquila opcionalmente substituído, um grupo heterocicloalquenila opcionalmente substituído ou um grupo heteroarila opcionalmente substituído.

51. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 ou 46-50, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição opcional no anel benzo, o grupo heterocicloalquila, heterocicloalquenila ou heteroarila, quando presente, inclui pelo menos um dentre Rb é independentemente selecionado a partir de -X, -OH, ORa, -SH, -SRa -NH2, -NHRa, -NRcRc, N+RcRcRc, per-halo alquila inferior, tri- halometila, trilfluorometila, -P(O)(OH)2, P(O)(ORa)2, P(O)(OH)(ORa), -OP(O)(OH)2, OP(O)(ORa)2, OP(O)(ORa)(OH), -S(O)2OH, S(O)2Ra, -C(O)H, C(O)Ra, -C(S)X, - C(O)ORa, -C(O)OH, C(O)NH2, -C(O)NHRa, C(O)NRcRc, C(S)NH2, C(O)NHRa, - C(O)NRcRc, -C(NH)NH2, C(NH)NHRa e C(NH)NRcRc e -C(NH)NRcRc, cada Ra é, independentemente dos outros, selecionado a partir de alquila inferior, (C6-C14) arila, (C7-C20) arilalquila, heteroarila de 5-14 membros, -CX3 e heteroarilalquila de 6-20 membros, e cada Rc é, independentemente dos outros, um Ra, ou,

alternativamente, dois Rc ligados ao mesmo átomo de nitrogênio podem ser tomados em conjunto com esse átomo de nitrogênio para formar um anel saturado ou insaturado de 5 a 8 membros que podem opcionalmente incluir um ou mais heteroátomos do mesmo anel ou de um anel diferente selecionados a partir de O, N e S.

52. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 ou 46-51, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição opcional no anel benzo, o grupo heterocicloalquila, heterocicloalquenila ou heteroarila, quando presente, inclui pelo menos um dentre -X, -C1-C6 alquila, -C2-C6 alquenila, -C2-C6 alquinila, -OH, ORa -SH, SRa -NH2, -NHRa -NRcRc, N+RcRcRc, per-halo alquila inferior, tri-halometila, trilfluorometila, -C(O)H, -C(O)Ra, -C(S)X, C(O)ORa, -C(O)OH, -C(O)NH2, -C(O)NHRa, -C(O)NRcRC, -C(S)NH2, -C(O)NHRa, -C(O)NRcRc, -C(NH)NH2, -C(NH)NHRa ou - C(NH)NRcRc.

53. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 ou 46-52, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição opcional no anel benzo, o grupo heterocicloalquila, heterocicloalquenila ou heteroarila, quando presente, inclui pelo menos um dentre -X, -C1-C6 alquila, -C2-C6 alquenila, -C2-C6 alquinila, -OH, - ORa -SH, SRa -NH2, -NHRa -NRcRc, -N+RcRcRc, per-halo alquila inferior, tri- halometila, trilfluorometila, -C(O)H, -C(O)Ra, -C(S)X, -C(O)ORa, -C(O)OH, -C(O)NH2, -C(O)NHRa, -C(O)NRcRC, -C(S)NH2, -C(O)NHRa, -C(O)NRcRc, -C(NH)NH2, - C(NH)NHRa ou -C(NH)NRcRc.

54. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 ou 46-53, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição opcional no anel benzo, o grupo heterocicloalquila, heterocicloalquenila ou heteroarila inclui pelo menos dois grupos -C1-C6 alquila.

55. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção química NH-rodamina N-protegida tem a fórmula

.

56. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28- 55, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção química de marcador está ligada à 3'- ou 5'-hidroxila do oligonucleotídeo.

57. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28- 56, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção química de marcador está ligada a uma nucleobase do oligonucleotídeo.

58. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28- 57, CARACTERIZADO pelo fato de que o oligonucleotídeo é ainda marcado com uma porção química doadora e/ou aceitadora para a porção química de NH- rodamina N-protegida.

59. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28- 57, CARACTERIZADO pelo fato de que o oligonucleotídeo é ainda marcado com uma porção química supressora.

60. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28- 57, CARACTERIZADO pelo fato de que o oligonucleotídeo é ainda marcado com uma porção química de ligação ao sulco menor.

61. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28- 57, CARACTERIZADO pelo fato de que o oligonucleotídeo é ainda marcado com uma porção química doadora e/ou aceitadora para a porção química de NH- rodamina N-protegida.

62. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 61, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção química de marcador compreende ainda uma porção química doadora para a porção química de NH-rodamina N-protegida.

63. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 62, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção química doadora compreende uma porção química de NH- rodamina N-protegida ou uma porção química de fluoresceína O-protegida.

64. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 63, CARACTERIZADO pelo fato de que a posição 2′, 2″, 4′, 5′, 7′, 7″, 5 ou 6 da porção química doadora está ligada à posição 2′, 2″, 4′, 5′, 7′, 7″, 5 ou 6 da porção química de NH-rodamina N- protegida.

65. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 63, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção química doadora e a porção química de NH-rodamina N- protegida estão ligadas em uma orientação cabeça a cabeça.

66. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 63, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção química doadora e a porção química de NH-rodamina N- protegida estão ligadas em uma orientação de cabeça a cauda.

67. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 63, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção química doadora e a porção química de NH-rodamina N- protegida estão ligadas em uma orientação cauda a cauda.

68. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 63, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção química doadora e a porção química de NH-rodamina N- protegida estão ligadas em uma orientação lado a lado.

69. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 63, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção química doadora e a porção química de NH-rodamina N- protegida estão ligadas em uma orientação lado a cabeça.

70. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 63, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção química doadora e a porção química de NH-rodamina N- protegida estão ligadas em uma orientação lado a cauda.

71. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 63, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção química de marcador tem a fórmula estrutural (VI): A-Z1-Sp-Z2-D (VI) em que A representa a porção química de NH-rodamina N-protegida, D representa a porção química doadora, Z1 e Z2, que podem ser iguais ou diferentes, representam porções de ligações fornecidas por porções químicas de ligação compreendendo um grupo funcional Fz, e Sp representa uma porção de química espaçamento.

72. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 71, CARACTERIZADO pelo fato de que A é a porção química de NH-rodamina N-protegida, e D é selecionado a partir do grupo que consiste em porções químicas com as fórmulas estruturais D.1, D.2, D.3, D.4, D.5, D.6, D.7, D.8, D.9, D.10, D.11 e D.12: (D.1) (D.2)

(D.3)

(D.4)

(D.5)

(D.6)

(D.7)

(D.8)

(D.9)

(D.10)

(D.11)

(D.12) em que, em cada um dentre D.1 - D.12: cada um dentre R1′, R2′, R2″, R4′, R4″, R5′, R5″, R7′, R7″ e R8′, quando tomados isoladamente, é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, uma alquila inferior, uma (C6-C14) arila, uma (C7-C20) arilalquila, uma heteroarila de 5-14 membros, uma heteroarilalquila de 6-20 membros, -Rb ou - (CH2)x-Rb, em que x é um número inteiro que tem um valor entre 1 e 10 e Rb é selecionado a partir de -X, -OH, -ORa, -SH, -SRa -NH2, -NHRa, -NRcRc, -N+RcRcRc, per-halo alquila inferior, tri-halometila, trifluorometila, -P(O)(OH)2, -P(O)(ORa)2, P(O)(OH)(ORa), -OP(O)(OH)2, -OP(O)(ORa)2, -OP(O)(ORa)(OH), -S(O)2OH, - S(O)2Ra, -C(O)H, C(O)Ra, -C(S)X, -C(O)ORa, -C(O)OH, -C(O)NH2, -C(O)NHRa, - C(O)NRcRc, -C(S)NH2, -C(O)NHRa, -C(O)NRcRc, -C(NH)NH2, -C(NH)NHRa e - C(NH)NRcRc, em que X é halo, cada Ra é, independentemente, selecionado a partir do grupo que consiste em alquila inferior, uma (C6-C14) arila, uma (C7-C20) arilalquila, uma heteroarila de 5-14 membros e uma heteroarilalquila de 6-20 membros, e cada Rc é, independentemente, um Ra, ou, alternativamente, dois Rc ligados ao mesmo átomo nitrôgenio podem ser tomados em conjunto com esse átomo de nitrogênio para formar um anel saturado ou insaturado de 5 a 8 membros que pode opcionalmente incluir um ou mais heteroátomos do mesmo anel ou heteroátomos de um anel diferente selecionados a partir de O, N e S;

ou, alternativamente, R1′ e R2′ ou R7′ e R8′ são tomados em conjunto com os átomos de carbono aos quais estão ligados para formar uma ponte de (C6-C14) arila opcionalmente substituída e/ou R4′ e R4″ e/ou R5′ e R5″ são considerados em conjunto com os átomos de carbono aos quais estão ligados para formar um grupo benzo; e R4, R5, R6 e R7 são, cada um independentemente entre si, selecionados a partir de hidrogênio, alquila inferior, (C6-C14) arila, (C7-C20) arilalquila, heteroarila de 6-14 membros, 7-20 heteroarilalquila de membros, -Rb e -(CH2)x-Rb; E1 é selecionado a partir do grupo que consiste em —NHR9, —NR9R10 e — OR9b; E2 é selecionado a partir do grupo que consiste em —NHR9, —NR9R10 e — OR9b; R9, quando tomado sozinho, é selecionado a partir de hidrogênio, alquila inferior, (C6-C14) arila, (C7-C20) arilalquila, heteroarila de 5 a 14 membros, heteroarilalquila de 6-20 membros; ou R7 e R9 são tomados em conjunto com os átomos aos quais estão ligados para formar um grupo heterocicloalquila opcionalmente substituído, um grupo heterocicloalquenila opcionalmente substituído ou um grupo heteroarila opcionalmente substituído; R10 é H ou grupo protetor; ou R8 e R10 são tomados em conjunto com os átomos aos quais estão ligados para formar um grupo heterocicloalquila opcionalmente substituído, um grupo heterocicloalquenila opcionalmente substituído ou um grupo heteroarila opcionalmente substituído; R9b é R9; cada um dentre Y1a, Y1b, Y2a, Y2b, Y3a e Y3b é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em —O—, —S—, —NH—, —C(O—) e — S(O)2, com a condição de que quando cada um dentre E1 e E2 for —OR9b, então R1′ e R2′ e/ou R7′ e R8′ podem apenas ser tomados em conjunto com os átomos de carbono aos quais estão ligados para formar uma ponte de (C6-C14) arila opcionalmente substituída.

73. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADO pelo fato de que o L do reagente é selecionado a partir de -Z-(CH2)3-6—O—, -Z- (CH2)a—[(Ar)b—(CH2)a]c—O—, -Z-(CH2)a—[C≡C—(CH2)a]c—O—, -Z-(CH2)a—[C≡C— (Ar)b]c—(CH2)a—O—, -Z-(CH2)d—NH—C(O)—[(CH2)a—(Ar)—(CH2)a—C(O)—NH]c— (CH2)d—O— e -Z-[CH2(CH2)eO]f—CH2(CH2)eO—, em que: cada Z representa, independentemente dos outros, uma porção de uma ligação contribuída por um grupo funcional Fz; cada a representa, independentemente dos outros, um número inteiro na faixa de 0 a 4; cada b representa, independentemente dos outros, um número inteiro na faixa de 1 a 2; cada c representa, independentemente dos outros, um número inteiro na faixa de 1 a 5; cada d representa, independentemente dos outros, um número inteiro na faixa de 1 a 10; cada e representa, independentemente dos outros, um número inteiro na faixa de 1 a 4; cada f representa, independentemente dos outros, um número inteiro na faixa de 1 a 10; e cada Ar representa, independentemente dos outros, um grupo monocíclico ou policíclico cicloalquileno, ciclo-heteroalquineno, arileno ou heteroarileno opcionalmente substituído.

74. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 73, CARACTERIZADO pelo fato de que cada Ar de L, independentemente dos outros, é um grupo derivado de ciclo-hexano, piperazina, benzeno, naftaleno, fenol, furano, piridina, piperidina,

imidazol, pirrolidina ou oxadizol.

75. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADO pelo fato de que o reagente compreende ainda uma alça de síntese adequadamente protegido compreendendo um grupo reativo selecionado a partir do grupo que consiste em amino, hidroxila, tiol e aldeído e um grupo protetor configurado a) para ser removido para fornecer o grupo reativo para fixação de porções químicas adicionais durante o curso da síntese do oligonucleotídeo ou b) para ser estável durante o curso da síntese do oligonucleotídeo e ser removido após a síntese do oligonucleotídeo para fornecer o grupo reativo para ligação de porções químicas adicionais.

76. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 75, CARACTERIZADO pelo fato de que o reagente é um composto de acordo com a fórmula estrutural (VIII): RkO-L-LM-L-PEP (VIII) em que Rk representa um grupo protetor lábil em ácido, cada L representa, independentemente do outro, um ligante opcional, LM representa a porção química de marcador, e PEP representa o grupo precursor de éster de fosfato.

77. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 75, CARACTERIZADO pelo fato de que o reagente é um composto de acordo com a fórmula estrutural (IX): (IX) em que Rk representa um grupo protetor lábil em ácido.

78. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 77, CARACTERIZADO pelo fato de que o reagente é um composto de acordo com a fórmula estrutural (IX.1):

(IX.1) em que -Z- representa uma porção de uma ligação contribuída por um grupo funcional Fz, Sp1, Sp2 e Sp3, que podem ser iguais ou diferentes, cada um representa porções químicas espaçadoras e G representa CH, N ou um grupo compreendendo um arileno, fenileno, heteroarileno, cicloalquileno inferior, ciclo- hexileno e/ou um ciclo-heteroalquileno inferior.

79. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 78, CARACTERIZADO pelo fato de que Sp1, Sp2 e Sp3 são, cada um independentemente entre si, selecionados a partir de uma cadeia de alquileno que contém 1 a 10 átomos de carbono, (CH2)a[(Ar)b-(CH2)a]c-, -(CH2)a-[C≡C-(CH2)a]c-, -(CH2)a-[C≡C-(Ar)b]c-(CH2)a-, (CH2)dNH-C(O)-[(CH2)a-(Ar)-(CH2)a-C(O)-NH]c-(CH2)d- e -[CH2(CH2)eO]f-CH2(CH2)-, em que cada a representa, independentemente dos outros, um número inteiro na faixa de 0 a 4; cada b representa, independentemente dos outros, um número inteiro na faixa de 1 a 2; cada c representa, independentemente dos outros, um número inteiro na faixa de 1 a 5; cada d representa, independentemente dos outros, um número inteiro na faixa de 1 a 10; cada e representa, independentemente dos outros, um número inteiro na faixa de 1 a 4; cada f representa, independentemente dos outros, um número inteiro na faixa de 1 a 10; e Ar representa, independentemente dos outros, um grupo monocíclico ou policíclico cicloalquileno, ciclo-heteroalquileno, alquileno ou heteroarileno opcionalmente substituído.

80. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 75, CARACTERIZADO pelo fato de que o reagente é um composto de acordo com a fórmula estrutural (IX.2), (IX.3), (IX.4) ou (IX.5):

(IX.2)

(IX.3)

(IX.4)

(IX.5) em que B representa uma base nucleica adequadamente protegida, L2 representa um ligante que liga uma porção química de marcador LM a nucleobase B e, na estrutura (IX.4), R16 representa um grupo protetor; e a nucleobase é selecionada a partir de adenina, 7-deazaguanina, guanina, 7-deazaguanina, citosina, uracila, timina, inosina, xanteno e hipoxanteno.

81. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 80, CARACTERIZADO pelo fato de que B do reagente é selecionado a partir de AiBu, APac, CAc, GiPr-Pac, T e U.

82. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 80, CARACTERIZADO pelo fato de que o L2 do reagente é selecionado a partir de —C≡C—CH2—NH—, — C≡C—C(O)—, —CH═CH—NH—, —CH═CH—C(O)—, —C≡C—CH2—NH—C(O)— (CH2)1-6—NH—, —CH═CH—C(O)—NH—(CH2)1-6—NH—C(O)—, —C═CH—CH2— O—CH2CH2—[O—CH2CH2]0-6—NH—, —C≡C—C≡C—CH2—O—CH2CH2—[O— CH2CH2]0-6—NH—, —C≡C—(Ar)1-2—C≡C—CH2—O—CH2CH2—[O—CH2CH2]0-6— NH—, —C≡C—(Ar)1-2—O—CH2CH2—[O—CH2CH2]0-6—NH— e —C≡C—(Ar)1-2— O—CH2CH2—[O—CH2CH2]0-6—NH—, em que Ar representa, independentemente dos outros, um grupo policíclico cicloalquileno, ciclo-heteroalquileno, alquileno ou heteroarileno.

83. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADO pelo fato de que um grupo fosforamidita compreende um grupo fosforamidita e um grupo H-fosfonato.

84. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 83, CARACTERIZADO pelo fato de que o grupo precursor de éster de fosfato compreende uma fosforamidita de fórmula (P.1): em que: R20 é selecionado a partir de uma alquila linear, ramificada ou cíclica saturada ou insaturada contendo de 1 a 10 átomos de carbono, 2-cianoetila, uma arila contendo de 6 a 10 átomos de carbono no anel e uma arilalquila contendo de 6 a 10 átomos de carbono no anel e de 1 a 10 átomos de carbono de alquileno; e R21 e R22 são, cada um independentemente entre si, selecionados a partir de uma alquila linear, ramificado ou cíclico, saturado ou insaturado contendo de 1 a 10 átomos de carbono, uma arila contendo de 6 a 10 átomos de carbono no anel e uma arilalquila contendo de 6 a 10 átomos de carbono do anel e de 1 a 10 átomos de carbono do alquileno, ou, alternativamente, R21 e R22 são tomados em conjunto com o átomo de nitrogênio ao qual estão ligados para formar um anel saturado ou insaturado que contém de 5 a 6 átomos do anel, um ou dois dos quais, além do átomo de nitrogênio ilustrado, podem ser heteroátomos selecionados de O, N e S.

85. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 83, CARACTERIZADO pelo fato de que R20 é beta-cianoetila e R21 e R22 são, cada um, isopropila.

86. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 85, CARACTERIZADO pelo fato de que a alça de síntese tem a fórmula -ORk, em que Rk é um grupo protetor lábil em ácido.

87. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 86, CARACTERIZADO pelo fato de que o grupo protetor lábil em ácido é selecionado a partir do grupo que consiste em trifenilmetila (tritila), 4-monometoxitritila, 4,4′-dimetoxitritila, 4,4′,4″- trimetoxitritila, bis (p-anisil)fenilmetila, naftildifenilmetila, p-(p’- bromofenaciloxi)fenildifenilmetila, 9-antrila, 9-(9-fenil)xantenila e 9-(9-fenil-10- oxo)antrila.

88. Reagente CARACTERIZADO pelo fato de que é útil para marcar um oligonucleotídeo, que é um composto de acordo com a fórmula estrutural: LM-L-PEP (XX) em que LM representa uma porção química de marcador que compreende uma porção química de NH-rodamina N-protegida, PEP é um grupo precursor de éster de fosfato que compreende um grupo fosforamidita ou um grupo de H-

fosfonato, e L é um ligante opcional que liga a porção química de marcador ao grupo precursor de éster de fosfato, no qual a porção química de NH-rodamina N-protegida da fórmula em que R1, R2, R3, R6, R7, R8, R11, R12, R13 e R14, quando tomados isoladamente, são, cada um independentemente entre si, selecionados a partir de hidrogênio, alquila inferior, (C6-C14) arila, (C7-C20) arilalquila, heteroarila de 5-14 membros, heteroarilalquila de 6-20 membros, -Rb ou -(CH2)n-Rb; ou, alternativamente, R1 e R2 e/ou R6 e R7 são tomados em conjunto com os átomos de carbono aos quais estão ligados para formar um grupo benzo opcionalmente substituído; e um dentre R2, R3, R7, R8, R12 ou R13 compreende um grupo da fórmula —Y—, em que Y é selecionado a partir do grupo que consiste em -C(O)-, -S(O)2-, -S- e -NH-; R4, quando considerado isoladamente, é selecionado a partir de hidrogênio, alquila inferior, (C6-C14) arila, (C7-C20) arilalquila, heteroarila de 5-14 membros, heteroarilalquila de 6-20 membros; ou R4 e um dentre R2 ou R3 são tomados em conjunto com os átomos aos quais estão ligados para formar um grupo heterocicloalquila opcionalmente substituído, um grupo heterocicloalquenila opcionalmente substituído, ou um grupo heteroarila opcionalmente substituído; R5 é H ou um grupo protetor; R9, quando tomado sozinho, é selecionado a partir de hidrogênio, alquila inferior, (C6-C14) arila, (C7-C20) arilalquila, heteroarila de 5 a 14 membros, heteroarilalquila de 6-20 membros; ou R7 e R9 são tomados em conjunto com os átomos aos quais estão ligados para formar um grupo heterocicloalquila opcionalmente substituído, um grupo heterocicloalquenila opcionalmente substituído ou um grupo heteroarila opcionalmente substituído; R10 é H ou grupo protetor; ou R8 e R10 são tomados em conjunto com os átomos aos quais estão ligados para formar um grupo heterocicloalquila opcionalmente substituído, um grupo heterocicloalquenila opcionalmente substituído ou um grupo heteroarila opcionalmente substituído; pelo menos um dentre R7 e R9 ou R8 e R10 são tomados em conjunto com os átomos aos quais estão ligados para formar um grupo heterocicloalquila opcionalmente substituído, um grupo heterocicloalquenila opcionalmente substituído ou um grupo heteroarila opcionalmente substituído e, opcionalmente, R4 e um dentre R2 ou R3 são tomados em conjunto com os átomos aos quais estão ligados para formar um grupo heterocicloalquila opcionalmente substituído, um grupo heterocicloalquenila opcionalmente substituído ou um grupo heteroarila opcionalmente substituído com a condição de que o composto não seja da fórmula R5 R3 R8 R10 d N O N R e R4 R

R2 R1 O R 6

R11 O

R12 R14 13 R , ou ; cada Ra é independentemente selecionado a partir de alquila inferior, (C6- C14) arila, (C7-C20) arilalquila, heteroarila de 5-14 membros, -CX3 e heteroarilalquila de 6-20 membros; cada Rb é independentemente selecionado a partir de X, -OH, -ORa, -SH, - SRa -NH2, -NHRa, -NRcRc, -N+RcRcRc, per-halo alquila inferior, tri-halometila, trifluorometila, -P(O)(OH)2, -P(O)(ORa)2, P(O)(OH)(ORa), -OP(O)(OH)2, - OP(O)(ORa)2, -OP(O)(ORa)(OH), -S(O)2OH, -S(O)2Ra, -C(O)H, -C(O)Ra, -C(S)X, -

C(O)ORa, -C(O)OH, -C(O)NH2, -C(O)NHRa, -C(O)NRcRc, -C(S)NH2, -C(O)NHRa, - C(O)NRcRc, -C(NH)NH2, -C(NH)NHRa e C(NH)NRcRc, cada Rc é, independentemente, um Ra, ou, alternativamente, dois Rc ligados ao mesmo átomo nitrôgenio podem ser tomados em conjunto com esse átomo de nitrogênio para formar um anel saturado ou insaturado de 5 a 8 membros que pode opcionalmente incluir um ou mais heteroátomos do mesmo anel ou heteroátomos de um anel diferente, selecionados a partir de O, N e S; e cada Rd e Re, quando tomados isoladamente, são independentemente selecionados a partir de hidrogênio, alquila inferior, (C6-C14) arila, (C7-C20) arilalquila, heteroarila de 5-14 membros, heteroarilalquila de 6-20 membros, -Rb ou - (CH2)n-Rb; X é halo; e n é um número inteiro que varia de 1 a 10.

89. Reagente, de acordo com a reivindicação 88, CARACTERIZADO pelo fato de que o L do reagente é selecionado a partir de -Z-(CH2)3-6—O—, -Z-(CH2)a— [(Ar)b—(CH2)a]c—O—, -Z-(CH2)a—[C≡C—(CH2)a]c—O—, -Z-(CH2)a—[C≡C—(Ar)b]c— (CH2)a—O—, -Z-(CH2)d—NH—C(O)—[(CH2)a—(Ar)—(CH2)a—C(O)—NH]c—(CH2)d— O— e -Z-[CH2(CH2)eO]f—CH2(CH2)eO—, em que: cada Z representa, independentemente dos outros, uma porção de uma ligação contribuída por um grupo funcional Fz; cada a representa, independentemente dos outros, um número inteiro na faixa de 0 a 4; cada b representa, independentemente dos outros, um número inteiro na faixa de 1 a 2; cada c representa, independentemente dos outros, um número inteiro na faixa de 1 a 5; cada d representa, independentemente dos outros, um número inteiro na faixa de 1 a 10; cada e representa, independentemente dos outros, um número inteiro na faixa de 1 a 4; cada f representa, independentemente dos outros, um número inteiro na faixa de 1 a 10; e cada Ar representa, independentemente dos outros, um grupo monocíclico ou policíclico cicloalquileno, ciclo-heteroalquineno, arileno ou heteroarileno opcionalmente substituído.

90. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 73, CARACTERIZADO pelo fato de que cada Ar de L, independentemente dos outros, é um grupo derivado de ciclo-hexano, piperazina, benzeno, naftaleno, fenol, furano, piridina, piperidina, imidazol, pirrolidina ou oxadizol.

91. Reagente, de acordo com a reivindicação 88, CARACTERIZADO pelo fato de que é um composto de acordo com a fórmula estrutural (VII.1): em que B representa uma nucleobase adequadamente protegida e L2 representa um ligante que liga a nucleobase B à porção química de marcador LM.

92. Reagente, de acordo com a reivindicação 91, CARACTERIZADO pelo fato de que a nucleobase é selecionada a partir de adenina, 7-deazaguanina, guanina, 7-deazaguanina, citosina, uracila, timina, inosina, xanteno e hipoxanteno.

93. Reagente, de acordo com a reivindicação 92, CARACTERIZADO pelo fato de que B é selecionado a partir de AiBu, APac, CAc, GiPr-Pac, T e U.

94. Reagente, de acordo com a reivindicação 91, CARACTERIZADO pelo fato de que o L2 do reagente é selecionado a partir de —C≡C—CH2—NH—, — C≡C—C(O)—, —CH═CH—NH—, —CH═CH—C(O)—, —C≡C—CH2—NH—C(O)— (CH2)1-6—NH—, —CH═CH—C(O)—NH—(CH2)1-6—NH—C(O)—, —C≡CH—CH2— O—CH2CH2-[O—CH2CH2]0-6—NH—, —C≡C—C≡C—CH2—O—CH2CH2-[O—

CH2CH2]0-6—NH—, —C≡C-(Ar)1-2-C≡C—CH2—O—CH2CH2-[O—CH2CH2]0-6—NH—, —C≡C-(Ar)1-2-O—CH2CH2-[O—CH2CH2]0-6—NH— e —C≡C-(Ar)1-2-O—CH2CH2-[O— CH2CH2]0-6—NH—, em que Ar é conforme definido na reivindicação 89.

95. Reagente, de acordo com a reivindicação 91, CARACTERIZADO pelo fato de que –B-L2- é selecionado a partir do grupo que consiste em

.

96. Reagente, de acordo com a reivindicação 89, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda uma alça de síntese adequadamente protegido.

97. Reagente, de acordo com a reivindicação 96, CARACTERIZADO pelo fato de que tem a fórmula (VIII): RkO-L-LM-L-PEP (VIII) em que Rk representa um grupo protetor lábil em ácido, cada L representa, independentemente do outro, um ligante opcional, LM representa a porção química de marcador, e PEP representa o grupo precursor de éster de fosfato.

98. Reagente, de acordo com a reivindicação 96, CARACTERIZADO pelo fato de que o reagente é um composto de acordo com a fórmula estrutural (IX): (IX) em que Rk representa um grupo protetor lábil em ácido.

99. Reagente, de acordo com a reivindicação 98, CARACTERIZADO pelo fato de que o reagente é um composto de acordo com a fórmula estrutural (IX.1): (IX.1) em que -Z- representa uma porção de uma ligação contribuída por um grupo funcional Fz, Sp1, Sp2 e Sp3, que podem ser iguais ou diferentes, cada um representa porções químicas espaçadoras e G representa CH, N ou um grupo compreendendo um arileno, fenileno, heteroarileno, cicloalquileno inferior, ciclo- hexileno e/ou um ciclo-heteroalquileno inferior.

100. Reagente, de acordo com a reivindicação 99, CARACTERIZADO pelo fato de que Sp1, Sp2 e Sp3 são, cada um independentemente entre si, selecionados a partir de uma cadeia de alquileno que contém de 1 a 10 átomos de carbono, — (CH2)a—[(Ar)b—(CH2)a]c—, —(CH2)a—[C≡C—(CH2)a]c—, —(CH2)a—[C≡C—(Ar)b]c— (CH2)a—, —(CH2)d—NH—C(O)—[(CH2)a—(Ar)—(CH2)a—C(O)—NH]c—(CH2)d— e — [CH2(CH2)eO]f—CH2(CH2)—, em que cada a representa, independentemente dos outros, um número inteiro na faixa de 0 a 4;

cada b representa, independentemente dos outros, um número inteiro na faixa de 1 a 2; cada c representa, independentemente dos outros, um número inteiro na faixa de 1 a 5; cada d representa, independentemente dos outros, um número inteiro na faixa de 1 a 10; cada e representa, independentemente dos outros, um número inteiro na faixa de 1 a 4; cada f representa, independentemente dos outros, um número inteiro na faixa de 1 a 10; e Ar representa, independentemente dos outros, um grupo monocíclico ou policíclico cicloalquileno, ciclo-heteroalquileno, alquileno ou heteroarileno opcionalmente substituído.

101. Reagente, de acordo com a reivindicação 98, CARACTERIZADO pelo fato de que o reagente é um composto de acordo com a fórmula estrutural (IX.2), (IX.3), (IX.4) ou (IX.5): (IX.2) (IX.3)

(IX.4) (IX.5) em que B representa uma nucleobase adequadamente protegida, L2 representa um ligante que liga a porção química de marcador LM a nucleobase B e, e na estrutura (IX.4), R16 representa um grupo protetor.

102. Reagente, de acordo com a reivindicação 101, CARACTERIZADO pelo fato de que a nucleobase é selecionada a partir de adenina, 7-desazaguanina, guanina, 7-desazaguanina, citosina, uracila, timina, inosina, xanteno e hipoxanteno.

103. Oligonucleotídeo, conforme definido na reivindicação 102, CARACTERIZADO pelo fato de que B do reagente é selecionado a partir de AiBu, APac, CAc, GiPr-Pac, T e U.

104. Reagente, de acordo com a reivindicação 101, CARACTERIZADO pelo fato de que o L2 do reagente é selecionado a partir de —C≡C—CH2—NH—, — C≡C—C(O)—, —CH═CH—NH—, —CH═CH—C(O)—, —C≡C—CH2—NH—C(O)— (CH2)1-6—NH—, —CH═CH—C(O)—NH—(CH2)1-6—NH—C(O)—, —C═CH—CH2— O—CH2CH2—[O—CH2CH2]0-6—NH—, —C≡C—C≡C—CH2—O—CH2CH2—[O— CH2CH2]0-6—NH—, —C≡C—(Ar)1-2—C≡C—CH2—O—CH2CH2—[O—CH2CH2]0-6— NH—, —C≡C—(Ar)1-2—O—CH2CH2—[O—CH2CH2]0-6—NH— e —C≡C—(Ar)1-2—

O—CH2CH2—[O—CH2CH2]0-6—NH—, em que Ar representa, independentemente dos outros, um grupo policíclico cicloalquileno, ciclo-heteroalquileno, alquileno ou heteroarileno.

105. Reagente, de acordo com a reivindicação 101, CARACTERIZADO pelo fato de que –B-L2- é selecionado a partir do grupo que consiste em

106. Reagente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 89-105, CARACTERIZADO pelo fato de que o grupo precursor de éster de fosfato compreende um grupo fosforamidita e um grupo H-fosfonato.

107. Reagente, de acordo com a reivindicação 106, CARACTERIZADO pelo fato de que o grupo precursor de éster de fosfato compreende uma fosforamidita da fórmula (P.1): em que: R20 é selecionado a partir de uma alquila linear, ramificada ou cíclica saturada ou insaturada contendo de 1 a 10 átomos de carbono, 2-cianoetila, uma arila contendo de 6 a 10 átomos de carbono no anel e uma arilalquila contendo de 6 a 10 átomos de carbono no anel e de 1 a 10 átomos de carbono de alquileno; e R21 e R22 são, cada um independentemente entre si, selecionados a partir de uma alquila linear, ramificada ou cíclica saturada ou insaturada contendo de 1 a 10 átomos de carbono, uma arila contendo de 6 a 10 átomos de carbono no anel e uma arilalquila contendo de 6 a 10 átomos de carbono do anel e de 1 a 10 átomos de carbono do alquileno, ou, alternativamente, R21 e R22 são tomados em conjunto com o átomo de nitrogênio ao qual estão ligados para formar um anel saturado ou insaturado que contém de 5 a 6 átomos do anel, um ou dois dos quais, além do átomo de nitrogênio ilustrado, podem ser heteroátomos selecionados de O, N e S.

108. Reagente, de acordo com a reivindicação 107, CARACTERIZADO pelo fato de que R20 é beta-cianoetila e R21 e R22 são, cada um, isopropila.

109. Reagente, de acordo com a reivindicação 88, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda um suporte sólido e uma alça de síntese adequadamente protegido.

110. Reagente, de acordo com a reivindicação 106, CARACTERIZADO pelo fato de que é um composto de acordo com a fórmula estrutural (X): (X)

em que LM representa a porção química de marcador, L representa um ligante clivável seletivamente opcional e Rk representa um grupo protetor lábil em ácido.

111. Reagente, de acordo com a reivindicação 110, CARACTERIZADO pelo fato de que é um composto de acordo com a fórmula estrutural (X.1): (X.1) em que Z, G, Sp1, Sp2 e W são conforme definido anteriormente na reivindicação 14, e Sp4 representa uma porção química de espaçamento seletivamente clivável.

112. Reagente, de acordo com a reivindicação 106, CARACTERIZADO pelo fato de que Sp1 e Sp2 são, cada um independentemente entre si, selecionados a partir de uma cadeia de alquileno que contém de 1 a 10 átomos de carbono, — (CH2)a—[(Ar)b-(CH2)a]c—, —(CH2)a—[C≡C—(CH2)a]c—, —(CH2)a—[C≡C-(Ar)b]c— (CH2)a—, —(CH2)d—NH—C(O)—[(CH2)a-(Ar)—(CH2)a—C(O)—NH]c—(CH2)d— e [CH2(CH2)eO]f—CH2(CH2)—, em que a, b, c, d, e, f e Ar são conforme definido na reivindicação 4, e Sp4 compreende uma ligação de éster.

113. Reagente, de acordo com a reivindicação 110, CARACTERIZADO pelo fato de que é um composto de acordo com a fórmula estrutural (X.2), (X.3), (X.4) ou (X.5): (X.2)

(X.3) (X.4) (X.5) em que B, L2 e R16 são conforme definido anteriormente na reivindicação 16.

114. Reagente, de acordo com a reivindicação 113, CARACTERIZADO pelo fato de que a nucleobase é selecionada a partir de adenina, 7-deazaguanina, guanina, 7-deazaguanina, citosina, uracila, timina, inosina, xanteno e hipoxanteno.

115. Reagente, de acordo com a reivindicação 113, CARACTERIZADO pelo fato de que B é selecionado a partir de AiBu, APac, CAc, GiPr-Pac e U.

116. Reagente, de acordo com a reivindicação 113, CARACTERIZADO pelo fato de que L2 é selecionado a partir de —C≡C—CH2—NH—, —C≡C—C(O)—, — CH═CH—NH—, —CH═CH—C(O)—, —C≡C—CH2—NH—C(O)—(CH2)1-6—NH—,

—CH═CH—C(O)—NH—(CH2)1-6—NH—C(O)—, —C≡CH—CH2—O—CH2CH2-[O— CH2CH2]0-6—NH—, —C≡C—C≡C—CH2—O—CH2CH2-[O—CH2CH2]0-6—NH—, — C≡C-(Ar)1-2-C≡C—CH2—O—CH2CH2-[O—CH2CH2]0-6—NH—, —C≡C-(Ar)1-2-O— CH2CH2-[O—CH2CH2]0-6—NH— e —C≡C-(Ar)1-2-O—CH2CH2-[O—CH2CH2]0-6— NH—, em que Ar é conforme definido na reivindicação 4.

117. Reagente, de acordo com a reivindicação 113, CARACTERIZADO pelo fato de que —BL2- é selecionado a partir de

118. Reagente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 97-117, CARACTERIZADO pelo fato de que Rk é 4’4”-dimetoxitritila.

119. Reagente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 88-118, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção química de NH-rodamina N-protegida compreende uma estrutura selecionada a partir da fórmula estrutural:

em que cada um dentre Rf, Rg, Rh, Ri, e Rj, quando tomados isoladamente, são, cada um independentemente entre si, selecionados a partir de hidrogênio, alquila inferior, (C6-C14) arila, (C7-C20) arilalquila, heteroarila de 5-14 membros, heteroarilalquila de 6-20 membros, -Rb ou -(CH2)n-RbR’ é selecionado a partir de R3’ e hidrogênio.

120. Reagente, de acordo com a reivindicação 119, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção química de NH-rodamina N-protegida compreende uma estrutura selecionada a partir das fórmulas estruturais (III.1), (III.2), (III.3) e (III.4) (III.1)

(III.2) (III.3) (III.4) em que R1-R14, Ra-Rj e Y são conforme definido anteriormente.

121. Reagente, de acordo com a reivindicação 119 ou 120, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção química de NH-rodamina N-protegida tem uma ou mais características aplicáveis selecionadas a partir de: (i) Y é selecionado a partir de —C(O)-, —S(O)2-, —S— e —NH—;

(ii) R11 e R14 são, cada um, cloro; (iii) R1 e R6 são, cada um, hidrogênio; (iv) R1 e R2 ou R6 e R6 são tomados em conjunto para formar um grupo benzo; (v) R2 e R7 são, cada um, hidrogênio ou alquila inferior; (vi) R5 representa um grupo protetor; e (vii) R4 e R9 são tomados em conjunto com um grupo substituinte em um átomo de carbono adjacente para formar um grupo selecionado a partir de -CH2CH2- , -CH2CH2CH2-, -C(CH3)2CH═C(CH3)-, C(CH3)2CH═CH-, -CH2C(CH3)2- e .

122. Reagente, de acordo com as reivindicações 116-119, CARACTERIZADO pelo fato de que R5 é um grupo acila da fórmula -C(O)R15, em que R10 é selecionado a partir de hidrogênio, alquila inferior, metila, -CX3, -CHX2, CH2X, CH2ORd e fenila opcionalmente monossubstituída por um grupo alquila inferior, metila, -X, -ORd, ciano ou nitro, em que Rd é selecionado a partir de alquila inferior, fenila e piridila, e cada X é um grupo halo.

123. Reagente, de acordo com a reivindicação 122, CARACTERIZADO pelo fato de que R15 é selecionado de metila e trifluorometila.

124. Reagente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 88-123, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção química de marcador compreende ainda uma porção química doadora e/ou aceitadora para a porção química de NH- rodamina N-protegida.

125. Reagente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 88-121, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção química de marcador compreende ainda uma porção química doadora para a porção química de NH-rodamina N- protegida.

126. Reagente, de acordo com a reivindicação 125, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção química doadora compreende uma porção química de NH- rodamina N-protegida ou uma porção química de fluoresceína O-protegida.

127. Reagente, de acordo com a reivindicação 126, CARACTERIZADO pelo fato de que a posição 2′, 2″, 4′, 5′, 7′, 7″, 5 ou 6 da porção química doadora está ligada a R3, R12 ou R13 da porção química de NH-rodamina N-protegida.

128. Reagente, de acordo com a reivindicação 127, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção química doadora e a porção química de NH-rodamina N- protegida estão ligadas em uma orientação cabeça a cabeça.

129. Reagente, de acordo com a reivindicação 127, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção química doadora e a porção química de NH-rodamina N- protegida estão ligadas em uma orientação de cabeça para cauda.

130. Reagente, de acordo com a reivindicação 127, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção química doadora e a porção química de NH-rodamina N- protegida estão ligadas em uma orientação cauda a cauda.

131. Reagente, de acordo com a reivindicação 127, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção química doadora e a porção química de NH-rodamina N- protegida estão ligadas em uma orientação lado a lado.

132. Reagente, de acordo com a reivindicação 127, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção química doadora e a porção química de NH-rodamina N- protegida estão ligadas em uma orientação lado a cabeça.

133. Reagente, de acordo com a reivindicação 127, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção química doadora e a porção química de NH-rodamina N- protegida estão ligadas em uma orientação lado a cauda.

134. Reagente, de acordo com a reivindicação 127, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção química de marcador compreende a fórmula estrutural (VI): A-Z1-Sp-Z2-D (VI)

em que A representa a porção química de NH-rodamina N-protegida, D representa a porção química doadora, Z1 e Z2, que podem ser iguais ou diferentes, representam porções de ligações fornecidas por porções químicas de ligação compreendendo um grupo funcional Fz, e Sp representa uma porção de química espaçamento.

135. Reagente, de acordo com a reivindicação 134, CARACTERIZADO pelo fato de que A é a porção química de NH-rodamina N-protegida e D é selecionado a partir das fórmulas estruturais D.1, D.2, D.3, D.4, D.5, D.6, D.7, D.8, D.9, D.10, D.11 e D.12; (D.1) (D.2)

(D.3)

(D.4)

(D.5)

(D.6)

(D.7)

(D.8)

(D.9)

(D.10)

(D.11)

(D.12) em que, em cada um dentre D.1 - D.12: cada um dentre R1′, R2′, R2″, R4′, R4″, R5′, R5″, R7′, R7″ e R8′, quando tomados sozinhos, é independentemente selecionado a partir de hidrogênio, uma alquila inferior, uma (C6-C14) arila, uma (C7-C20) arilalquila, uma heteroarila de 5-14 membros, uma heteroarilalquila de 6-20 membros, -Rb ou -(CH2)x-Rb, em que x é um número inteiro que tem um valor entre 1 e 10 e Rb é selecionado a partir de -X, -OH, -ORa, -SH, -SRa -NH2, -NHRa, -NRcRc, -N+RcRcRc, per-halo alquila inferior, tri- halometila, trifluorometila, -P(O)(OH)2, -P(O)(ORa)2, P(O)(OH)(ORa), -OP(O)(OH)2, - OP(O)(ORa)2, -OP(O)(ORa)(OH), -S(O)2OH, -S(O)2Ra, -C(O)H, -C(O)Ra, -C(S)X, - C(O)ORa, -C(O)OH, -C(O)NH2, -C(O)NHRa, -C(O)NRcRc, -C(S)NH2, -C(O)NHRa, - C(O)NRcRc, -C(NH)NH2, -C(NH)NHRa e -C(NH)NRcRc, em que X é halo, cada Ra é, independentemente, selecionado a partir de alquila inferior, uma (C6-C14) arila, uma (C7-C20) arilalquila, uma heteroarila de 5-14 membros e uma heteroarilalquila de 6- 20 membros, e cada Rc é, independentemente, um Ra, ou, alternativamente, dois Rc ligados ao mesmo átomo nitrôgenio podem ser tomados em conjunto com esse átomo de nitrogênio para formar um anel saturado ou insaturado de 5 a 8 membros que pode opcionalmente incluir um ou mais heteroátomos do mesmo anel ou heteroátomos de um anel diferente selecionados a partir de O, N e S; ou, alternativamente, R1′ e R2′ ou R7′ e R8′ são tomados em conjunto com os átomos de carbono aos quais estão ligados para formar uma ponte de (C6-C14) arila opcionalmente substituída e/ou R4′ e R4″ e/ou R5′ e R5″ são considerados em conjunto com os átomos de carbono aos quais estão ligados para formar um grupo benzo; e R4, R5, R6 e R7 são, cada um independentemente entre si, selecionados a partir de hidrogênio, alquila inferior, (C6-C14) arila, (C7-C20) arilalquila, heteroarila de 6-14 membros, 7-20 heteroarilalquila de membros, -Rb e -(CH2)x-Rb; E1 é selecionado a partir do grupo que consiste em —NHR9, —NR9R10 e — OR9b; E2 é selecionado a partir do grupo que consiste em —NHR9, —NR9R10 e — OR9b; R9, quando tomado sozinho, é selecionado a partir de hidrogênio, alquila inferior, (C6-C14) arila, (C7-C20) arilalquila, heteroarila de 5 a 14 membros, heteroarilalquila de 6-20 membros; ou R7 e R9 são tomados em conjunto com os átomos aos quais estão ligados para formar um grupo heterocicloalquila opcionalmente substituído, um grupo heterocicloalquenila opcionalmente substituído ou um grupo heteroarila opcionalmente substituído; R10 é H ou grupo protetor; ou R8 e R10 são tomados em conjunto com os átomos aos quais estão ligados para formar um grupo heterocicloalquila opcionalmente substituído, um grupo heterocicloalquenila opcionalmente substituído ou um grupo heteroarila opcionalmente substituído; R9b é R9; cada um dentre Y1a, Y1b, Y2a, Y2b, Y3a e Y3b é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em —O—, —S—, —NH—, —C(O) —e — S(O)2, com a condição de que quando cada um dentre E1 e E2 for —OR9b, então R1′ e R2′ e/ou R7′ e R8′ podem apenas ser tomados em conjunto com os átomos de carbono aos quais estão ligados para formar uma ponte de (C6-C14) arila opcionalmente substituída.

136. Reagente, de acordo com a reivindicação 135, CARACTERIZADO pelo fato de que D.1-D.12 têm uma ou mais características aplicáveis selecionadas a partir de: (i) Y1a, Y2a e Y3a são, cada um, independentemente um do outro, selecionados a partir de -C(O)- e -S(O)2-; Y1b, Y2b e Y3b são —NH—; (iii) R4 e R7 são, cada um, cloro; (iv) R1' e R8 são, cada um, hidrogênio; (v) R1′ e R2′ ou R7′ e R8′ são tomados em conjunto para formar um grupo benzo; e (vi) R2′ e R7′ são, cada um, hidrogênio ou alquila inferior.

137. Reagente, de acordo com a reivindicação 135, CARACTERIZADO pelo fato de que Y1a, Y2a e Y3a são —NH—; Y1b, Y2b e Y3b são selecionados a partir de — C(O)— e —S(O)2—; Z1 é selecionado a partir de —C(O)— e —S(O)2—; Z2 é —NH— e Sp é selecionado a partir de —(CH2)a—[(Ar)b-(CH2)a]c—, —(CH2)a—[C≡C— (CH2)a]c—, —(CH2)a—[C≡C-(Ar)b]c—(CH2)a—, —(CH2)d—NH—C(O)—[(CH2)a-(Ar)— (CH2)a—C(O)—NH]c—(CH2)d—, e —[CH2(CH2)eO]f—CH2(CH2)—, em que a, b, c, d, e, f e Ar são conforme definido anteriormente na reivindicação 4.

138. Reagente, de acordo com as reivindicações 135-137, CARACTERIZADO pelo fato de que nas fórmulas estruturais D.1-D.12, R1′ e R2′ e/ou R7′ e R8′ são tomados em conjunto com os átomos de carbono aos quais estão ligados para formar uma ponte de benzo.

139. Reagente, de acordo com as reivindicações 135-138, CARACTERIZADO pelo fato de que E1 e E2 são, cada um, —OR9b.

140. Reagente, de acordo com a reivindicação 139, CARACTERIZADO pelo fato de que R9b é um grupo acila de fórmula -C(O)R15, em que R15 é alquila inferior.

141. Reagente, de acordo com a reivindicação 140, CARACTERIZADO pelo fato de que R15 é t-butila.

142. Reagente, de acordo com as reivindicações 135-141, CARACTERIZADO pelo fato de que R9 é um grupo acila da fórmula -C(O)R15, em que R15 é selecionado a partir de hidrogênio, alquila inferior, metila, -CX3, -CHX2, - CH2X, CH2ORd e fenila opcionalmente monossubstituída por um grupo alquila inferior, metila, -X, -ORd, ciano ou nitro, em que Rd é selecionado a partir de alquila inferior, fenila e piridila, e cada X é um grupo halo.

143. Reagente, de acordo com a reivindicação 142, CARACTERIZADO pelo fato de que R15 é selecionado a partir de metila e trifluorometila.

144. Método para a amplificação e análise simultâneas de uma pluralidade de loci genéticos CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: amplificar uma amostra de ácido nucleico com uma pluralidade de pares de iniciadores de amplificação para formar uma pluralidade de produtos de amplificação, em que pelo menos um dentre cada um dos pares de iniciadores compreende um nucleotídeo marcado, conforme definido na reivindicação 28, em que cada um dos produtos de amplificação compreende um locus genético diferente.

145. Método, de acordo com a reivindicação 144, CARACTERIZADO pelo fato de que o nucleotídeo marcado, conforme definido na reivindicação 28, é usado para marcar pelo menos três pares de iniciadores.

146. Método, de acordo com a reivindicação 145, CARACTERIZADO pelo fato de que o nucleotídeo marcado, conforme definido na reivindicação 28, é usado para marcar de três a oito pares de iniciadores.

147. Método, de acordo com a reivindicação 144, CARACTERIZADO pelo fato de que a amostra de ácido nucleico é isolada de sangue total, uma biópsia de tecido, linfa, osso, medula óssea, dente, pele, por exemplo células da pele contidas em impressões digitais, osso, dente, líquido amniótico contendo células da placenta,

e líquido amniótico contendo células fetais, cabelo, pele, sêmen, secreções anais, fezes, urina, secreções vaginais, transpiração, saliva, esfregaços bucais, várias amostras ambientais (por exemplo, agrícolas, água e solo), amostras de pesquisa em geral, purificadas amostras em geral e células lisadas.

148. Kit CARACTERIZADO pelo fato de que compreende iniciadores de oligonucleotídeo para coamplificar um conjunto de loci genéticos de pelo menos uma amostra de ácido nucleico a ser analisada; em que o conjunto de loci pode ser coamplificado; em que pelo menos um dos iniciadores compreende um nucleotídeo marcado, conforme definido na reivindicação 28, em que os iniciadores estão em um ou mais recipientes.

149. Kit, de acordo com a reivindicação 148, CARACTERIZADO pelo fato de que todos os iniciadores de oligonucleotídeo no kit estão em um recipiente.

150. Kit, de acordo com a reivindicação 148, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda pelo menos um dentre: reagentes para pelo menos uma reação de amplificação multiplex; e um recipiente com pelo menos um padrão de tamanho.

151. Kit, de acordo com a reivindicação 148, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos um dos iniciadores de oligonucleotídeo compreende um nucleotídeo marcado em que o nucleotídeo marcado tem propriedades espectrais diferentes do nucleotídeo marcado, conforme definido na reivindicação 28.