JP2007031388A - ヌクレオチド誘導体及びその利用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ヌクレオチド誘導体として、ヌクレオチド誘導体中の塩基にリンカーを介して2種類の蛍光物質を備え、前記ヌクレオチド誘導体を備えるポリヌクレオチド誘導体が相手鎖とハイブリダイズして特定塩基と相対したとき、前記2種類の蛍光物質がFRETによる蛍光を発光可能となるような誘導体を用いる。
【選択図】図1
Description
本発明のヌクレオチド誘導体は、プリン塩基又はピリミジン塩基を備えているが、具体的には、一般式(1)に表されている。また、本発明のヌクレオチド誘導体において、リン酸エステル基のmは1以上3以下の整数を表している。したがって、本発明のヌクレオチド誘導体は、モノリン酸、ジリン酸又はトリリン酸がエステル結合した化合物を包含している。また、リボースの2’位のR1は、水素原子又は水酸基であり、R1が水素原子のときには、デオキシリボヌクレオチド誘導体であり、同位が水酸基であるときには、リボヌクレオチド誘導体である。
本発明のヌクレオシド誘導体は、ヌクレオシド誘導体中の塩基にリンカーを介して2種類の蛍光物質を備えるか、あるいは、前記リンカーを介して1種類の蛍光物質と蛍光物質を導入可能な官能基又は保護された該官能基とを備えている。蛍光物質についてはヌクレオチド誘導体及びリンカーについてはヌクレオチド誘導体について説明したとおりである。
本発明のポリヌクレオチド誘導体は、上記ヌクレオチド誘導体のリン酸モノエステル体の1種又は2種以上をホスホジエステル結合を介して備えている。こうしたポリヌクレオチド誘導体は、一般式(20)で表されるユニットの1種又は2種以上を備えることとなる。本発明のポリヌクレオチド誘導体を構成する全てのユニットが上記ユニットを備えていてもよいし、一部が上記ユニットであってもよい。本発明のヌクレオチド誘導体は、DNAであってもよいし、RNAであってもよいし、DNAとRNAとのキメラであってもよい。また、一本鎖であってもよいし、二本鎖であってもよい。また、必要に応じてヌクレアーゼ耐性を付与するような修飾がなされていてもよいし、本発明のヌクレオチド誘導体以外のヌクレオチド誘導体を含んでいてもよい。
(2)アンチセンスポリヌクレオチドに代えて使用する場合には、通常のポリヌクレオチドとは異なるために、核酸分解酵素(例えば制限酵素)や核酸結合タンパク質(例えば転写因子)等の標的核酸への結合を阻害できる。このことから、これらの作用を利用した実験用試薬として利用できる。
(3)それ自体蛍光を発するため、核酸の蛍光ラベルに使用できる。
(4)DNA複製において、複製されるDNAと相補的なプローブとして使用することによりDNA複製のリアルタイム検出ができる。同様に、RNAへの転写において、転写されるRNAと相補的なプローブとして使用することによりRNA転写のリアルタイム検出ができる。
(5)相補的配列とハイブリダイズすることにより蛍光波長のシフトが起こるようなポリヌクレオチド誘導体である場合は、蛍光波長のシフトにより当該ポリヌクレオチド誘導体の酸化還元電位が変化する。このため、電極上に本発明のポリヌクレオチド誘導体を固定しておき、被験ポリヌクレオチドをこの電極に作用させて酸化還元電位を測定する方法で、核酸配列応答性のバイオセンサーとして利用できる。
(6)本発明のポリヌクレオチドは、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)に供される蛍光性プローブとして利用できる。
本発明のプローブは、1種又は2種以上の塩基識別性ヌクレオチド誘導体をホスホジエスエル結合を介して備えるポリヌクレオチド誘導体である。本プローブについては、上記した本発明のポリヌクレオチド誘導体としての各種の態様を適用することができる。また、本プローブにおいて、塩基識別性ヌクレオチド誘導体は、標的ポリヌクレオチドの検出しようとするl個又は2個以上の塩基種に対応して備えられている。これにより、試料中に含まれる標的ポリヌクレオチドの特定位置の塩基種を判定できる。プローブにおけるヌクレオチド数は例えば4〜100個程度、好ましくは10〜30個程度とすることができる。プローブは、DNA、RNA、DNA/RNAキメラのいずれであってもよく、1本鎖又は2本鎖である。さらに、試料が細胞抽出液等のヌクレアーゼを含むものである場合には、ヌクレアーゼにより切断され難いように、ホスホロチオエートDNA又はRNA、H−ホスホネートDNA又はRNA等の修飾核酸であってもよい。
本発明のハイブリダイゼーション方法は、本発明のプローブと標的ポリヌクレオチドとをハイブリダイゼーションさせるハイブリダイゼーション工程と、前記ハイブリダイゼーションのハイブリダイズ産物の蛍光を測定する工程と、ハイブリダイズ産物の蛍光測定結果と使用したプローブが備えるヌクレオチド誘導体の塩基を識別可能な蛍光発光特性とに基づいて標的ポリヌクレオチド中の1個又は2個以上の塩基種を同定する評価工程とを、を備えることを特徴としている。
本発明のSNP検出方法は、上記したハイブリダイゼーション方法を用いて実施する。すなわち、前記既知配列中の特定塩基種を判定する態様である。SNP検出方法においては、プローブを、標的ヌクレオチド配列中のSNP塩基以外の塩基配列と相補的とするとともに、SNP塩基に相対する部位に塩基識別性ヌクレオチド誘導体を備えるようにする。具体的には、SNP塩基部位の塩基種を判定するために、ウラシル誘導体、シトシン誘導体、アデニン誘導体及びグアニン誘導体の1種又は2種以上を備えるようにする。どのヌクレオチド誘導体を用いるかは、SNPのタイプによるが、G/A多型である場合には、G/Gホモ、G/Aへテロ、A/Aホモを検出するために、少なくともグアニン認識ヌクレオチド誘導体(本発明のA誘導体)とアデニン識別ヌクレオチド誘導体(本発明のU誘導体)とをそれぞれ特定部位に備えるプローブを用いる。
また、本発明のハイブリダイゼーション方法は、未知の塩基配列の決定方法に用いることができる。配列決定のためのプローブは、決定しようとする未知配列領域(n=1〜100個程度)の第1位〜第n位についてそれぞれ本発明の各延期に対する塩基識別ヌクレオチド誘導体を有する、4n個のプローブのセットとすることが好ましい。また、既知配列との相同性やそのうちの変異部位の検出方法にも用いることができる。このためのプローブは、例えば、相同性を検出しようとする第1位〜第n位までの個々のヌクレオチド位置に各塩基に対する塩基識別性ヌクレオチドを備える、4n個のプローブのセットとすることが好ましい。標的ヌクレオチド配列が既知配列と完全に相同である場合には、既知配列の塩基を識別する塩基識別性ヌクレオチド誘導体を備えるプローブの全てがその蛍光発光特性により他のヌクレオチド誘導体を有するプローブから区別されることになる。一方、既知配列中に変異を有する場合には、既知配列の塩基でない塩基を識別するヌクレオチド誘導体を含むプローブによるハイブリダイズ産物の蛍光が他のプローブと区別されることになる。
本発明のプローブ固定化体は、本発明のプローブの1種又は2種以上が固相に固定化された固定化体である。こうしたプローブ固定化体は、本発明のハイブリダイゼーション方法等に好ましく用いることができる。
以下、図2を参照しながら、ヌクレオチド誘導体(APyU )の合成法を説明する。なお、化合物の番号は、図2に示す化合物の番号に対応している。
窒素雰囲気下、ピレンカルボン酸(200mg,0.812mmol)を無水N,N’−ジメチルホルムアミド6.0mlに溶解しPyBOP(549.3mg,1.05mmol)を加えた。室温で1時間撹拌し、薄層クロマトグラフィー(TLC)で原料の消失を確認後、化合物(1)(447.8mg,1.05mmol)、ジイソプロピルエチルアミン(317.8mg,1.05mmol)を加え、18時間撹拌した。反応溶媒を減圧留去した後、水を加えクロロホルムで抽出して目的の化合物2を粗精製物として得て、これを用いて化合物3を合成した。
窒素雰囲気下、先の反応で得られた化合物2の粗精製物を無水N,N’−ジメチルホルムアミド6.0mlに溶解しPyBOP(549.3mg,1.05mmol)を加えた。室温で1時間撹拌し、薄層クロマトグラフィー(TLC)で原料の消失を確認後、プロパルギルアミン(57.8mg,1.05mmol)、ジイソプロピルエチルアミン(317.8mg,1.05mmol)を加え、18時間撹拌した。反応溶媒を減圧留去した後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル、溶出溶媒クロロホルム/メタノール=20/1)により精製して目的の化合物3(152.4mg,0.300mmol,2段階収率37%)を得た。なお、NMRによるデータは以下のとおりであった。
1H NMR(CD3OD,400MHz)d1.55−1.71(m,4H),1.85−1.97(m,2H),2.64(t,1H,J=2.8Hz),3.32−3.35(m,2H),4.02−4.15(m,2H),4.71(t,1H,J=2.8Hz),8.04−8.28(m,8H),8.49(d,1H,J=9.2Hz).
窒素雰囲気下、化合物4(101.2mg,0.154mmol)を無水N,N’−ジメチルホルムアミド2.5mlに溶解し化合物(3)(101.6mg,0.200mmol)、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(0)(17.8mg,0.0154mmol)、トリエチルアミン(85.7μl,0.616mmol)、ヨウ化銅(I)(5.9mg,0.0308mmol)を加えた。室温で5時間撹拌して薄層クロマトグラフィー(TLC)で原料の消失を確認後、反応溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル、溶出溶媒クロロホルム/メタノール=10/1)により精製して目的の化合物(5)を無色固体(123.0mg,0.119mmol,収率77%)として得た。NMRによるデータは以下のとおりであった。
1H NMR(CD3OD,400MHz)d1.49−1.68(m,4H),1.81−1.96(m,2H),2.26(ddd,J=6.4,6.8,13.6Hz),2.36(ddd,1H,J=3.2,6.4,13.6Hz),3.20−3.32(m,4H),3.70(s,6H),4.00−4.02(m,3H),4.45(m,1H),4.71(dd,1H,J=6.0,9.2Hz),6.13(t,1H,J=6.4Hz),6.80−6.85(m,4H),7.16−7.43(m,9H),7.95−8.19(m,9H),8.45 (d, 1H,J=9.6Hz)
窒素雰囲気下、前記で得た化合物(5)(116.2mg,0.094mmol)を無水ジクロロメタン1.0mlに溶解し、1Hテトラゾール無水アセトニトリル溶液(0.45M,314.0μl,0.141mmol)、2−シアノエチル−N,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト(45μl,0.141mmol)を加えた。この溶液を室温で2時間撹拌し、薄層クロマトグラフィー(TLC)で原料の消失を確認後、反応溶媒を減圧留去した。残渣を無水アセトニトリル1.0mlに溶解し、コスモナイスフィルターs(溶媒系、ナカライテスク)でろ過した。ろ液を濃縮し、目的の化合物(6)(APyU)を粗精製物として得た。DNA 合成には化合物6の粗精製物をそのまま用いた。
実施例1で製造したヌクレオチド誘導体(APyU)を用いて、本発明のヌクレオチド誘導体を含有するオリゴデオキシリボヌクレオチドを合成した。オリゴデオキシリボヌクレオチドは、アプライドバイオシステムズ社のDNA自動合成機(3400DNA/RNAシンセサイザー)で通常のホスホロアミダイト法に従って合成した。合成した配列は以下の通りであった。
(ODN(APyU):5’−CGCAATAPyUTAACGC−3’)(配列番号1)
([M−H]−:calcd.:4313.09,found:4313.78.)
ポストDNA修飾によりODN(APyU)からODN(FAMPyU)を合成する方法を図3に示す。
1MNaHCO3水溶液75μlに、ODN(APyU)の水溶液(270μM)15μl、フルオレセインDMF溶液(1mg/25μl)15μl、水30μlを加え、37℃で18時間反応させた。反応液にギ酸アンモニウム緩衝液(AF緩衝液)48μlを加えて中和し、高速液体クロマトグラフィーで目的とするオリゴヌクレオチドを分取した。MALDI−TOF MSにより目的とするオリゴヌクレオチドODN(FAMPyU)(配列番号6)が得られたことを確認した。
MALDI−TOF MS([M−H]−:calcd.:,found:.)
実施例2により得られたAPyU含有オリゴデオキシリボヌクレオチドを250nM となるように、0.1M塩化ナトリウムを含む50mMリン酸緩衝液(pH7.0)に溶解させた溶液を調製した。この溶液の蛍光スペクトルを蛍光分光光度計を用いて約25℃で測定したところ、励起波長350nm、蛍光波長407nmであり、407nmにおける蛍光強度は、0.5であった。
実施例3により得られたFAMPyU含有オリゴデオキシリボヌクレオチドを250nMとなるように、0.1M塩化ナトリウムを含む50mMリン酸緩衝液(pH7.0)に溶解させた溶液を調製した。この溶液の蛍光スペクトルを蛍光分光光度計を用いて約25℃で測定したところ、励起波長350nmで蛍光波長は従来より約110nm長い516nmであり、516nmにおける蛍光強度は、0.5であった。
実施例2により得られたAPyU含有オリゴデオキシリボヌクレオチド(配列番号1)および実施例3により得られたFAMPyU含有オリゴデオキシリボヌクレオチド(配列番号6)をキャプチャープローブに用いてDNAマイクロアレイを作製し、その蛍光測定を行った。なお、サンプルDNAはAPyUまたはFAMPyU含有オリゴデオキシリボヌクレオチドとAPyUまたはFAMPyU以外の部分が相補的であって、APyU部位又はFAMPyU部位においてそれぞれA、T、C及びGを備えるように別途合成したオリゴデオキシリボヌクレオチド(配列番号2〜5及び7〜10)を使用した。
これらのオリゴデオキシリボヌクレオチドをアプライドバイオシステム社の392DNA/RNA合成装置を用い、通常のホスホロアミダイド法に従って合成した。なお、配列番号1および6の5’末端はアミノ基修飾した。固相担体からの切り出しおよび脱保護は25%アンモニア中でインキュベーションすることによって行い、その後、高速液体クロマトグラフィーによって精製した。
10%NaOH−60%エタノール水溶液に2時間浸漬し、純水で10回洗浄した76×26×1mmサイズのガラス製スライド(松波硝子工業社製)を10%ポリ−L−リジン水溶液に1時間浸漬した。純水で10回の洗浄後、800rpm、5分間の遠心を行い、水分を除去して室温で乾燥して、固定用基板を調製した。
上記1で調製した配列番号1および6の各々を、最終濃度が50pmol/μlとなるように調整し、上記2で調製した基板に200plをそれぞれスポット(10nmol)した。その後、80℃で1時間乾燥処理し、各スポットに水を添加し、基板上にDNA断片を固定した。この基板を1%BSAブロッキング溶液(50mg/ml)5ml、10%SDS1.25ml)で45分間(42℃)振盪した。その後、95℃純水で1分間、95%エタノールで1分間それぞれ浸漬させ、遠心(800rpm、1分間)し、目的とするDNAマイクロアレイを調製した。
オリゴデオキシリボヌクレオチドからなるサンプルDNA(5nmol/25μl)をサンプルチューブに加え、0.1M塩化ナトリウムを含む50mMリン酸緩衝液(pH7.0)に溶解させた溶液(25μl)を添加した。95℃ヒートブロックで2分間加熱した後、室温で5分間放置し、遠心してサンプル液を調製した(最終濃度:100nM)。
上記3で調製したDNAマイクロアレイ上に上記2で調製したサンプル液を25μlずつ1点にスポットし、カバーガラスで密閉してハイブリダイゼーション反応を行った(42℃、16時間)。
反応終了後、バイオチップリーダー(Applied Precision 社製)を使用して、各実験の最適測定条件で各DNAスポットの画像ファイルを取込み、蛍光強度を数値化した。結果を表2に示す。
Claims (21)
- ヌクレオチド誘導体であって、
前記ヌクレオチド誘導体中の塩基にリンカーを介して2種類の蛍光物質を備え、
前記ヌクレオチド誘導体を備えるポリヌクレオチド誘導体が相手鎖とハイブリダイズして特定塩基と相対したとき、前記2種類の蛍光物質がFRETによる蛍光を発光可能である、誘導体。 - 請求項1に記載のヌクレオチド誘導体であって、以下の一般式(1)で表されるヌクレオチド誘導体。
- 前記ヌクレオチド誘導体は、以下の一般式(2)で表される、請求項2に記載のヌクレオチド誘導体。
- 前記ヌクレオチド誘導体は、以下の一般式(3)で表される、請求項2に記載のヌクレオチド誘導体。
- 前記ヌクレオチド誘導体は、以下の一般式(4)で表される、請求項2に記載のヌクレオチド誘導体。
- 前記ヌクレオチド誘導体は、以下の一般式(5)で表される、請求項2に記載のヌクレオチド誘導体。
- ヌクレオシド誘導体であって、
前記ヌクレオシド誘導体中の塩基にリンカーを介して2種類の蛍光物質を備えるか、あるいは、前記リンカーを介して1種類の蛍光物質と蛍光物質を導入可能な官能基又は保護された該官能基とを備える、誘導体。 - 請求項7に記載のヌクレオシド誘導体であって、以下の一般式(6)で表されるヌクレオシド誘導体。
- 前記ヌクレオシド誘導体は、以下の一般式(7)で表される、請求項8に記載のヌクレオシド誘導体。
- 前記ヌクレオシド誘導体は、以下の一般式(8)で表される、請求項8に記載のヌクレオシド誘導体。
- 前記ヌクレオシド誘導体は、以下の一般式(9)で表される、請求項8に記載のヌクレオシド誘導体。
- 前記ヌクレオシド誘導体は、以下の一般式(10)で表される、請求項8に記載のヌクレオシド誘導体。
- 請求項1〜6のいずれかに記載のヌクレオチド誘導体のリン酸モノエステル体の1種又は2種以上をホスホジエステル結合を介して備える、ポリヌクレオチド誘導体。
- 請求項1〜6のいずれかに記載のヌクレオチド誘導体のリン酸モノエステル体の1種又は2種以上をホスホジエステル結合を介して備える、プローブ。
- 前記ヌクレオチド誘導体のリン酸モノエステル体を、標的ポリヌクレオチドの検出しようとするl個又は2個以上の塩基種に対応して備える、請求項14に記載のプローブ。
- 請求項14又は15に記載のプローブの1種又は2種以上が固相に固定化されたプローブ固定化体。
- 前記固相がプレート状である、請求項16に記載のプローブ固定化体。
- 一塩基多型を検出するためのプローブセットが固定化されている、請求項16又は17に記載のプローブ固定化体。
- ハイブリダイゼーション方法であって、
請求項14又は15に記載のプローブと標的ポリヌクレオチドとをハイブリダイゼーションさせる工程と、
前記ハイブリダイゼーションのハイブリダイズ産物の蛍光を測定する工程と、
ハイブリダイズ産物の蛍光測定結果と使用したプローブが備えるヌクレオチド誘導体の特定塩基を識別可能な蛍光発光特性とに基づいて前記標的ポリヌクレオチド中の1個又は2個以上の塩基種を同定する評価工程とを、
を備える、方法。 - 前記ハイブリダイゼーション工程は、上記プローブを固相に固定化したプローブ固定化固相を用いてハイブリダイゼーションさせる工程である、請求項19に記載の方法。
- 前記プローブとして、一塩基多型の検出するためのプローブセットを用いる、請求項19又は20に記載の方法。
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