JP4454218B2 - ポリヌクレオチド誘導体及びその利用 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、塩基配列中の特定部位の塩基の種類の決定に用いられるポリヌクレオチド誘導体、その中間体であるヌクレオシド又はヌクレオチド誘導体及び塩基化合物、並びに、その利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、ハイブリダイゼーションを利用した核酸塩基決定は、プローブとしてのポリヌクレオチドを、蛍光ラベルされた標的核酸とハイブリダイズさせ、その融解温度を測定することにより行っている。詳述すれば、プローブの所定位置の塩基が標的核酸の対応塩基と塩基対を形成する場合としない場合とで、２本鎖の融解温度が若干異なることを利用して、塩基の同定を行っている。
【０００３】
しかし、この場合は、対合する塩基が塩基対を形成する場合としない場合との融解温度の差ができるだけ大きくなるような条件設定を、個々の標的核酸ごとに行う必要がある。また、塩基間の非特異的な吸着や塩基対形成の不安定性などによる検出エラーが生じ易い。さらに、標的核酸のラベル量を少なくせざるを得ない場合や、長時間の操作により蛍光が退色する場合には、検出誤差が大きくなる。
【０００４】
なお、標的核酸配列を検出するために蛍光ラベルしたプローブを用いることも提案されている（例えば特許文献１、２、３及び４）。しかし、これらの蛍光プローブは、標的核酸と塩基対を形成することにより標的核酸を標識するものにすぎず、標的核酸中の特定塩基を同定することはできない。
【０００５】
【特許文献１】
特公平3-71437号公報（第４欄一般式（Ｉ）、第５欄第5-9行）
【０００６】
【特許文献２】
特表平9-505556号公報（請求項１、第15頁第11-19行）
【０００７】
【特許文献３】
特開平6-135991号公報（請求項１、段落0004、段落0005）
【０００８】
【特許文献４】
特開昭62-059293号公報（請求項１、第２頁右下欄第5-8行）
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、簡便かつ正確に核酸塩基の同定を行えるポリヌクレオチド誘導体、その中間体として使用できるヌクレオシド又はヌクレオチド誘導体及び塩基化合物、DNAチップ、並びに、標的核酸中のヌクレオチドの同定方法を提供することを主目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために本発明者は研究を重ね、以下の知見を見出した。
▲１▼ １又は２以上のヌクレオチドが以下の一般式（５）で表されるヌクレオチド誘導体で置換されているポリヌクレオチド誘導体は蛍光を発する。このポリヌクレオチド誘導体をプローブとして用いて標的核酸とのハイブリダイゼーションを行うと、相補鎖中の当該ヌクレオチド誘導体と対合するヌクレオチドの種類によって蛍光が増大したり、消光したり、蛍光発光波長がシフトしたりする。
【００１１】
【化７】
【００１２】
（式中、R1、R2、R3、R4は同一又は互いに異なって、水素原子、アミノ基、モノ−（低級アルキル）アミノ基、ジ−（低級アルキル）アミノ基、水酸基、アルキル基、低級アルコキシ基、低級アルキルチオ基、アルキルチオ基、アシルオキシ基、ハロゲン原子、シアノ基、チオール基又は置換基を有していてよいフェニル基を表し、R1、R2、R3及びR4が同時に水素原子であることはない。R1とR2、R2とR3、R3とR4とが結合してフェニル基を形成していてもよい。R5は水素原子又は水酸基を表す。）
▲２▼ 例えば、上記一般式（５）において、R1とR2とが結合してベンゾ環を形成し、R3、R4及びR5が水素原子である場合には、相補鎖中の当該ヌクレオチド誘導体と対合するヌクレオチドがアデニル酸である場合には発光極大波長における蛍光強度が増大し、グアニル酸である場合に消光する。
▲３▼ 標的核酸に相補的なポリヌクレオチドの所定位置のヌクレオチドに代えてこのヌクレオチド誘導体を導入したものをプローブとして用いることにより、標的核酸の所定位置の塩基を簡単かつ正確に同定できる。
【００１３】
前期知見に基づき、本発明は以下の化合物、ヌクレオシド又はヌクレオチド誘導体、ポリヌクレオチド誘導体、DNAチップ及び標的核酸中のヌクレオチドの同定方法を提供する。
【００１４】
項１． 以下の一般式（１）で表される化合物。
【００１５】
【化８】
【００１６】
（式中、R1、R2、R3、R4は同一又は互いに異なって、水素原子、アミノ基、モノ−（低級アルキル）アミノ基、ジ−（低級アルキル）アミノ基、水酸基、アルキル基、低級アルコキシ基、低級アルキルチオ基、アルキルチオ基、アシルオキシ基、ハロゲン原子、シアノ基、チオール基又は置換基を有していてよいフェニル基を表し、R1、R2、R3及びR4が同時に水素原子であることはない。R1とR2、R2とR3、R3とR4とが結合してフェニル基を形成していてもよい。）
項２． 以下の一般式（２）で表される項１に記載の化合物。
【００１７】
【化９】
【００１８】
項３． 以下の一般式（３）で表されるヌクレオシド又はヌクレオチド誘導体。
【００１９】
【化１０】
【００２０】
（式中、R1、R2、R3、R4は同一又は互いに異なって、水素原子、アミノ基、モノ−（低級アルキル）アミノ基、ジ−（低級アルキル）アミノ基、水酸基、アルキル基、低級アルコキシ基、低級アルキルチオ基、アルキルチオ基、アシルオキシ基、ハロゲン原子、シアノ基、チオール基又は置換基を有していてよいフェニル基を表し、R1、R2、R3及びR4が同時に水素原子であることはない。R1とR2、R2とR3、R3とR4とが結合してフェニル基を形成していてもよい。R5は水素原子又は水酸基を表す。nは０、１、２又は３を示す。）
項４． 以下の一般式（４）で表される項３に記載のヌクレオシド又はヌクレオチド誘導体。
【００２１】
【化１１】
【００２２】
項５． ポリヌクレオチドにおいて、１又は２以上のヌクレオチドが以下の一般式（５）で表されるヌクレオチド誘導体で置換されているポリヌクレオチド誘導体。
【００２３】
【化１２】
【００２４】
（式中、R1、R2、R3、R4は同一又は互いに異なって、水素原子、アミノ基、モノ−（低級アルキル）アミノ基、ジ−（低級アルキル）アミノ基、水酸基、アルキル基、低級アルコキシ基、低級アルキルチオ基、アルキルチオ基、アシルオキシ基、ハロゲン原子、シアノ基、チオール基又は置換基を有していてよいフェニル基を表し、R1、R2、R3及びR4が同時に水素原子であることはない。R1とR2、R2とR3、R3とR4とが結合してフェニル基を形成していてもよい。R5は水素原子又は水酸基を表す。）
項６． 以下の一般式（６）で表される項５に記載のポリヌクレオチド誘導体。
【００２５】
【化１３】
【００２６】
項７． プローブとして用いるための項５又は６に記載のポリヌクレオチド誘導体。
【００２７】
項８． 基体上に１又は複数の項５又は６に記載のポリヌクレオチド誘導体が固定又は吸着されたDNAチップ。
【００２８】
項９． 項５又は６に記載のポリヌクレオチド誘導体を試料中の標的核酸とハイブリダイズさせる工程と；
ハイブリダイズ産物の蛍光スペクトルを測定する工程と；
この蛍光スペクトルをハイブリダイズ前の項５又は６に記載のポリヌクレオチド誘導体の蛍光スペクトルと比較することにより、標的核酸の特定位置のヌクレオチドの種類を同定する工程と
を含む標的核酸中のヌクレオチドの同定方法。
【００２９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の化合物
＜塩基化合物＞
本発明の化合物は、文献未記載の新規化合物であり、以下の一般式（１）で表される。
【００３０】
【化１４】
【００３１】
（式中、R1、R2、R3、R4は同一又は互いに異なって、水素原子、アミノ基、モノ−（低級アルキル）アミノ基、ジ−（低級アルキル）アミノ基、水酸基、アルキル基、低級アルコキシ基、低級アルキルチオ基、アルキルチオ基、アシルオキシ基、ハロゲン原子、シアノ基、チオール基又は置換基を有していてよいフェニル基を表し、R1、R2、R3及びR4が同時に水素原子であることはない。R1とR2、R2とR3、R3とR4とが結合してフェニル基を形成していてもよい。）
本明細書において、低級アルキル基、モノ−（低級アルキル）アミノ基、ジ−（低級アルキル）アミノ基及びアルキルチオ基の低級アルキルとしては、例えばメチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、sec-ブチル、tert-ブチル等の炭素数１〜４個程度の直鎖又は分岐状のアルキルが挙げられる。
【００３２】
また、低級アルコキシ基としては、例えばメトキシ基、エトキシ、n-プロポキシ基、イソプロポキシ基、n-ブトキシ基、sec-ブトキシ基、tert-ブトキシ基等の炭素数１〜４個程度の直鎖又は分岐状のアルコキシ基が挙げられる。
【００３３】
またアシルオキシ基としては、以下の一般式（７）において、Rが例えば低級アルキル基、置換基を有していてよいフェニル基、ハロゲン原子等である置換基が挙げられる
【００３４】
【化１５】
【００３５】
また、ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。
【００３６】
また、アリール基としては、フェニル基、ナフチル基等が挙げられる。これらのアリール基は、例えばアミノ基、モノ−（低級アルキル）アミノ基、ジ−（低級アルキル）アミノ基、水酸基、アルキル基、低級アルコキシ基、低級アルキルチオ基、アシルオキシ基、ハロゲン原子、シアノ基、チオール基等の置換基を有していてもよい。
【００３７】
R1、R2、R3及びR4の好適な組み合わせとしては、例えばR1及びR2が結合してベンゾ環を形成しR3及びR4が水素原子である組み合わせ；R1〜R4がフッ素原子である組み合わせ；R3がニトロ基でありR1、R2及びR4が水素原子である組み合わせ；R3がアミノ基でありR1、R2及びR4が水素原子である組み合わせ；R3がジアルキルアミノ基でありR1、R2及びR4が水素原子である組み合わせ等が挙げられる。
【００３８】
特に、R1〜R4が電子供与基又はベンゾ環である化合物が好ましく、中でもR1及びR2が結合してベンゾ環を形成している化合物がより好ましい。最も好ましいのは、R1及びR2が結合してベンゾ環を形成しR3及びR4が水素原子である化合物である。
＜ヌクレオシド又はヌクレオチド誘導体＞
本発明のヌクレオシド又はヌクレオチド誘導体は、文献未記載の新規化合物であって、以下の一般式（３）で表される化合物である。
【００３９】
【化１６】
【００４０】
（式中、R1、R2、R3、R4は同一又は互いに異なって、水素原子、アミノ基、モノ−（低級アルキル）アミノ基、ジ−（低級アルキル）アミノ基、水酸基、アルキル基、低級アルコキシ基、低級アルキルチオ基、アルキルチオ基、アシルオキシ基、ハロゲン原子、シアノ基、チオール基又は置換基を有していてよいフェニル基を表し、R1、R2、R3及びR4が同時に水素原子であることはない。R1とR2、R2とR3、R3とR4とが結合してフェニル基を形成していてもよい。R5は水素原子又は水酸基を表す。nは０、１、２又は３を示す。）
R1、R2、R3及びR4については前述した通りである。
【００４１】
R5が水素原子である場合には、上記化合物はデオキシリボヌクレオシド又はデオキシリボヌクレオチド誘導体であり、R5が水酸基である場合には、上記化合物はリボヌクレオシド又はリボヌクレオチド誘導体である。
【００４２】
また、nが０である場合すなわちリン酸基が存在しない場合には、上記化合物はヌクレオシド誘導体であり、nが１、２又は３である場合には、上記化合物はヌクレオチド誘導体である。
＜ポリヌクレオチド誘導体＞
本発明のポリヌクレオチド誘導体は、ポリヌクレオチドにおいて、１又は２以上のヌクレオチドが以下の一般式（５）で表されるヌクレオチド誘導体で置換されているポリヌクレオチド誘導体である。
【００４３】
【化１７】
【００４４】
（式中、R1、R2、R3、R4は同一又は互いに異なって、水素原子、アミノ基、モノ−（低級アルキル）アミノ基、ジ−（低級アルキル）アミノ基、水酸基、アルキル基、低級アルコキシ基、低級アルキルチオ基、アルキルチオ基、アシルオキシ基、ハロゲン原子、シアノ基、チオール基又は置換基を有していてよいフェニル基を表し、R1、R2、R3及びR4が同時に水素原子であることはない。R1とR2、R2とR3、R3とR4とが結合してフェニル基を形成していてもよい。R5は水素原子又は水酸基を表す。）
R1、R2、R3、R4及びR5については前述した通りである。
【００４５】
本発明のポリヌクレオチド誘導体はDNAであってもよく、RNAであってもよい。
【００４６】
本発明のポリヌクレオチド誘導体のヌクレオチド数は特に限定されないが、例えば、最大100個程度、好ましくは最大50個程度、より好ましくは最大30個程度、さらにより好ましくは最大20個程度のヌクレオチドからなるものが挙げられる。すなわち、本発明のポリヌクレオチドにはオリゴヌクレオチドも含まれる。
【００４７】
本発明のポリヌクレオチド誘導体は、全体のヌクレオチド数により異なるが、上記ヌクレオチド誘導体を２０個程度まで有していてよい。より好ましくは５個程度までである。上記ヌクレオチド誘導体が余りに多いと塩基間相互作用により蛍光波長が移動してしまう可能性がある。本発明の範囲であればこのような問題は生じない。
化合物の製造方法
＜塩基化合物＞
＜ヌクレオシド又はヌクレオチド誘導体＞
本発明のヌクレオシド誘導体は、例えば以下の方法で合成できる。５−ヨードデオキシシチジンを適当な溶媒に溶解させた溶液に対して、tert-ブチルジメチルシリルクロライド及びイミダゾールを添加し、室温下で攪拌する。次いで、得られた化合物をピリジンに溶解し、ベンゾ環の各炭素原子にそれぞれＲ１〜Ｒ４が結合した塩化ベンゾイルを添加して室温下で攪拌する。
【００４８】
次いで、得られた化合物を適当な溶媒に溶解し、プロピレンオキシドを添加し、光を照射した。得られた化合物をアンモニア水／メタノール／クロロホルムに溶解し攪拌する。
【００４９】
次いで、得られた化合物を適当な溶媒に溶解し、同溶媒に溶解させたテトラブチルアンモニウムを添加し、室温下で攪拌する。これにより本発明のヌクレオシド誘導体が得られる。
【００５０】
ヌクレオチド誘導体は当該ヌクレオシド誘導体から常法により得ることができる。すなわち、POCl3及びリン酸トリメチルを添加することにより、ヌクレオチド（n=1）が得られる。さらに、ピロリン酸トリブチルアンモニウム塩を添加することにより、三リン酸体が得られる。
＜ポリヌクレオチド誘導体＞
本発明のポリヌクレオチド誘導体は、例えば核酸自動合成機を用いたフォスフォロアミダイト法による化学合成方法において、特定ヌクレオシドに代えて本発明のヌクレオシド誘導体を用いることにより合成できる。
用途
本発明の塩基化合物、及び、ヌクレオシド又はヌクレオチド誘導体は、ポリヌクレオチド誘導体の合成に供することができる。
【００５１】
本発明の化合物及びヌクレオシド又はヌクレオチド誘導体は蛍光を発するところ、これを含む本発明のポリヌクレオチド誘導体は、標的核酸とハイブリダイズさせると、１本鎖の場合に比べて、対合するヌクレオチドの種類によって蛍光の発光強度が増大したり、低減したり、発光波長がシフトしたりする。
【００５２】
例えば、一般式（５）において、R1及びR2が結合してベンゾ環を形成し、R3、R4及びR5が水素原子である場合には（ナフトピリドピリミジン(NPP)含有オリゴデオキシリボヌクレオチド）、NPP含有ヌクレオチドに対合するヌクレオチドがアデニル酸である場合には蛍光の発光強度が増大し、グアニル酸である場合に蛍光が消光する。本発明のポリヌクレオチド誘導体は、この現象を利用して以下の用途に使用できる。
i) 標的核酸と相補的なポリヌクレオチド誘導体は、プローブとして用いることにより、標的核酸の特定位置のヌクレオチドの種類を決定できる。同様の方法で１塩基多型の検出に利用できる。
ii) DNAチップにおいて、ポリヌクレオチドに代えて基板上に固定ないしは吸着させることにより、特定核酸配列を有するか否かを確認できる。特に、標的核酸の特定位置のヌクレオチドの種類を決定できる。
iii) アンチセンスポリヌクレオチドに代えて使用する場合には、通常のポリヌクレオチドとは異なるために、核酸分解酵素（例えば制限酵素）や核酸結合タンパク質（例えば転写因子）等の標的核酸への結合を阻害できる。このことから、これらの作用を利用した実験用試薬として利用できる。
iv) それ自体蛍光を発するため、核酸の蛍光ラベルに使用できる。
v) DNA複製において、複製されるDNAと相補的なプローブとして使用することによりDNA複製のリアルタイム検出ができる。同様に、RNAへの転写において、転写されるRNAと相補的なプローブとして使用することによりRNA転写のリアルタイム検出ができる。
vi) 相補的配列とハイブリダイズすることにより蛍光波長のシフトが起こるようなポリヌクレオチド誘導体である場合は、蛍光波長のシフトにより当該ポリヌクレオチド誘導体の酸化還元電位が変化する。このため、電極上に本発明のポリヌクレオチド誘導体を固定しておき、被験ポリヌクレオチドをこの電極に作用させて酸化還元電位を測定する方法で、核酸配列応答性のバイオセンサーとして利用できる。
vii) 本発明のポリヌクレオチドは、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)に供される蛍光性プローブとして利用できる。
プローブ
前述したように、本発明のポリヌクレオチド誘導体は、プローブとして使用して試料中に含まれる標的核酸の特定位置の塩基の種類を決定できる。
【００５３】
プローブとして使用する場合は、試料の種類によって異なるが、ヌクレオチド数は例えば４〜100個程度、好ましくは10〜30個程度とすることができる。
【００５４】
試料が細胞抽出液等のヌクレアーゼを含むものである場合には、ヌクレアーゼにより切断され難いように、ホスホロチオエートDNA又はRNA、H-ホスホネートDNA又はRNA等の修飾核酸であってもよい。
【００５５】
ハイブリダイズに際しては、標的核酸を含む試料に対して本発明のポリヌクレオチド誘導体を1nM〜1mM程度、特に1μM〜50μM程度添加することが好ましい。また、ハイブリダイズ条件はポリヌクレオチドの長さによっても異なるが、例えば０〜60℃程度、特に1５〜40℃程度の温度で、例えば５〜60分間程度、特に５〜10分間程度行うことができる。また、ハイブリダイズさせる試料は、例えばpH5.5〜8.0程度、特にpH 6.5〜8.0程度に調整すればよい。
【００５６】
また、試料から抽出及び精製された標的核酸と本発明のポリヌクレオチド誘導体とをハイブリダイズさせる場合には、ポリヌクレオチドの長さによって異なるが、例えば室温（25℃程度）〜50℃程度、10〜48時間程度、２〜６×SSC程度の条件とすることができる。さらに、同程度の濃度のSSC溶液で３〜５回程度洗浄すればよい。
DNA チップ
本発明のDNAチップ（又はDNAアレイ）は、基体上に本発明のポリヌクレオチド誘導体が固定又は吸着されたものである。固定には共有結合などによる結合も含まれる。
【００５７】
基体上へのDNAのスポット径は特に限定されないが、例えば50〜200μm程度とすることができる。またスポットピッチは特に限定されないが、例えば100〜500μm程度とすることができる。
【００５８】
基体の材料は特に限定されず、例えばガラス、シリカ、金等を用いることができる。また、基体の形状は、板状（基板状）、ビーズ状等のどのような形状のものであってもよい。
【００５９】
基体上に本発明のポリヌクレオチド誘導体を結合する場合には、本発明のポリヌクレオチド誘導体の一端を、例えば金属−硫黄結合などの方法を使用して、基体に結合させることができる。
【００６０】
DNAチップに固定等される本発明のポリヌクレオチド誘導体のヌクレオチド数は、試料の種類によって異なるが、例えば10〜200個程度、好ましくは50〜100個程度とすることができる。
【００６１】
試料が細胞抽出液等のヌクレアーゼを含むものである場合には、本発明のポリヌクレオチド誘導体は、ヌクレアーゼにより切断され難いように、ホスホロチオエートDNA又はRNA、H-ホスホネートDNA又はRNA等の修飾核酸であってもよい。
【００６２】
ハイブリダイズに際しては、基体に固定された本発明のポリヌクレオチド誘導体に対して、試料を例えば0.1μM〜100μM程度、特に1μM〜10μM程度添加することができる。また、ハイブリダイズ条件はポリヌクレオチド誘導体の種類によって異なるが、例えば０〜60℃程度、特に20〜40℃程度の温度で、例えば１〜30分間程度、特に１〜５分間程度とすることができる。また、ハイブリダイズさせる試料は例えばpH5.5〜8.0程度、特にpH 6.5〜8.0程度に調整しておくことが好ましい。
【００６３】
ハイブリダイズ後は、チップの種類に適した洗浄液で２〜５回程度洗浄すればよい。
【００６４】
また、試料から抽出及び精製された標的核酸を用いる場合には、標的核酸を例えば２〜６×SSC程度のハイブリダイズ溶液に溶解させたものを本発明のDNAチップに作用させるのが好ましい。温度、時間、洗浄条件については、未精製の標的核酸を用いる場合と同様である。
本発明のヌクレオチドの同定方法
本発明のヌクレオチドの同定方法は、上記説明した本発明のポリヌクレオチド誘導体を試料中の標的核酸とハイブリダイズさせる工程と；
ハイブリダイズ産物の蛍光スペクトルを測定する工程と；
この蛍光スペクトルをハイブリダイズ前の本発明のポリヌクレオチド誘導体の蛍光スペクトルと比較することにより、標的核酸の特定位置のヌクレオチドの種類を同定する工程とを含む方法である。
【００６５】
試料は、核酸を含むものであればよく、細胞抽出液、血液のような体液、PCR産物、オリゴヌクレオチド等が挙げられる。
【００６６】
ハイブリダイズ条件は、プローブ又はDNAチップについて説明した通りである。
【００６７】
蛍光スペクトルは、常法に従い、照射波長250〜600nm程度で測定すればよい。ハイブリダイズ前のポリヌクレオチド誘導体の蛍光スペクトル測定と、ハイブリダイズ産物の蛍光スペクトル測定とは、同じ媒体に溶解又は懸濁させた状態で行うことが好ましい。通常はハイブリダイゼーション溶液に溶解又は懸濁させた状態で測定すればよい。
【００６８】
【発明の効果】
本発明によれば、簡便かつ正確に核酸塩基の同定を行えるポリヌクレオチド誘導体、その中間体として使用できるヌクレオシド又はヌクレオチド誘導体及び塩基化合物が提供される。
【００６９】
また本発明によれば、簡便かつ正確に核酸塩基の同定を行えるDNAチップ及び簡便かつ正確に核酸塩基の同定を行える方法が提供される。
【００７０】
さらにいえば、本発明のヌクレオチド誘導体を含むポリヌクレオチド誘導体は、標的核酸とハイブリダイズさせると、標的核酸における当該ヌクレオチド誘導体と対合するヌクレオチドの種類によって、蛍光強度が増大したり、消光したり、発光波長特に極大波長がシフトしたりする。
【００７１】
従来は、プローブと標的核酸との特定位置における塩基対形成の有無により、２本鎖の融解温度が若干異なることに基づいて塩基の同定を行っていたところ、検出可能な程度に融解温度差を大きくするために、個々の標的核酸ごとにハイブリダイズ条件設定を行う必要があった。これに対して本発明では、蛍光の増大、低減、波長のシフト等により塩基の同定を行うため、このような手間のかかるハイブリダイズ条件設定が不要である。
【００７２】
また、２本鎖の融解によらないため、融解が生じ難いような長いポリヌクレオチド誘導体とすることもできる。
【００７３】
また、塩基間の非特異的な吸着や塩基対形成の不安定性などによる検出エラーが生じ難い。
【００７４】
また、対合するヌクレオチドにより蛍光発光の波長がシフトする場合には、特定ヌクレオチドと対合した場合の蛍光波長に合わせたフィルター（特定の数十nmの波長の光だけを透過するフィルターであり、市販されている）を使用してこのフィルターに蛍光を通すことにより、特定波長の蛍光だけを検出することができ、対合ヌクレオチドの検出感度が増大する。
【００７５】
また、他の長波長蛍光色素を反応系中に添加することにより、蛍光共鳴エネルギ移動（FRET）を利用して検出感度を向上させたり、目で見える色の蛍光に変化させることができる。
【００７６】
【実施例】
以下、本発明を実施例を示してより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１（ＮＰＰ含有ヌクレオシド誘導体の合成）
図１を参照して説明する。５−ヨードデオキシシチジン（ＩＤＣ）（５．０ｇ、１４．２ｍｍｏｌ）（図１化合物（ａ））の７０ｍｌジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液に対して、tert-ブチルジメチルシリルクロライド（ＴＢＤＭＳＣｌ）（４．７ｇ、３１．２ｍｍｏｌ）及びイミダゾール（２．１ｇ、３１．２ｍｍｏｌ）を添加し、室温下９０分間撹拌した
【００７７】
次いで、得られた生成物のうちの3g（5.2mmol）を30mlのピリジンに溶解し、３当量の塩化ナフトイル(2.4ml)を加え、５時間室温下で撹拌した。これにより、図１(b)に示す化合物が得られた。
【００７８】
次いで、化合物(b)のうち300mg（0.36mmol）をベンゼン150mlに溶かし、プロピレンオキシド3mlを加え、高圧水銀灯によって生じる光を７分間照射した。これにより、図１の(c)に示す化合物が得られた。
【００７９】
次いで、これを25%アンモニア水／メタノール／クロロホルム（1:1:1）3mlに溶解し、50℃で20時間撹拌した。
【００８０】
次いで、得られた生成物のうち130mg（0.21mmol）をテトラヒドロフラン(THF)5mlに溶かし、１ＭテトラブチルアンモニウムフルオライドTHF溶液を0.5ml（0.5mmol）加え、室温で２時間撹拌した。これにより、図１(d)に示す本発明の１実施態様である化合物が得られた。この化合物は、塩基としてピリミジン誘導体であるナフトピリドピリミジン（NPP）を有するヌクレオシド誘導体である。
実施例２（ NPP 含有オリゴヌクレオチドの合成）
図１を参照して説明する。実施例１で得られたNPP含有ヌクレオシド誘導体66mg（0.17mmol）のピリジン溶液5mlにジメトキシトリチルクロライド（70mg、0.2mmol）を加え、室温下で10時間撹拌した。
【００８１】
次いで、得られた生成物のうち31mg（45.5mmol）を2mlのアセトニトリルに溶解し、テトラゾール（4mg、54.6μmol）及びN,N,N',N'-テトライソプロピル-2-シアノエチルジフォスフォロアミダイト（18μl、54.6μmol）を加え、２時間室温で撹拌した。これにより図１(e)に示す化合物が得られた。
【００８２】
化合物(e)を用いてアプライドバイオシステム392DNA/RNAシンセサイザーを用いてフォスフォロアミダイト法によりNPP含有オリゴデオキシリボヌクレオチド誘導体5'-CGCAATXTAACGC-3'（配列番号１）（Xは、NPP含有デオキシリボヌクレオチド）を合成した。
＜蛍光分析＞
実施例２により得られたNPP含有オリゴデオキシリボヌクレオチド誘導体を、2.5μMとなるように、0.1M塩化ナトリウムを含む50mMリン酸緩衝液(pH7.0)に溶解させた溶液を調製した。この溶液の蛍光スペクトルを蛍光分光光度計（島津製作所社製RF5300PC）を用いて約25℃で測定したところ、励起波長370nm、発光波長420nmであり、420nmにおける蛍光強度は、1.6であった。
【００８３】
上記溶液に、NPP含有オリゴデオキシリボヌクレオチド誘導体とNPP含有ヌクレオチド以外の部分が相補的な、別途合成したオリゴデオキシリボヌクレオチド（Ａ'）；5'-GCGTTAAATTGCG-3'（配列番号２）及び（Ｇ'）；5'- GCGTTAGATTGCG -3'（配列番号３）をそれぞれ2.5μMとなるように添加し、ボルテックスミキサーにて混合した。
【００８４】
これらの溶液の420nmにおける蛍光強度を蛍光スペクトルを蛍光分光光度計を用いて測定したところ、オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ａ'）を加えた場合には、420nmにおける蛍光強度は3.1であり、オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｇ'）を加えた場合には、420nmにおける蛍光強度は0.2であった。
【００８５】
このように、実施例２により得られたNPP含有オリゴデオキシリボヌクレオチド誘導体は、相補鎖上のNPP含有ヌクレオチドと対合するヌクレオチドがアデニル酸である場合には蛍光が増大し、グアニル酸である場合には蛍光が87%消光した。蛍光スペクトルを図２に示す。
＜熱力学パラメーター＞
実施例２により得られたNPP含有オリゴデオキシリボヌクレオチド誘導体を、2.5μMとなるように、0.1M塩化ナトリウムを含む50mMリン酸緩衝液(pH7.0)に溶解させた溶液に、別途合成したオリゴデオキシリボヌクレオチド（Ａ'）、オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｔ'）5'-GCGTTATATTGCG-3'（配列番号４）、オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｇ'）及びオリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｃ'）5'-GCGTTACATTGCG-3'（配列番号５）をそれぞれ2.5μMとなるように添加し、ボルテックスミキサーにて混合した。
【００８６】
オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ａ'）、（Ｔ'）、（Ｇ'）及び（Ｃ'）を添加した場合のぞれぞれについて、形成された２本鎖の融解温度Tmを、波長260nmにおける吸収スペクトルの変化を測定することにより評価した。また、２本鎖形成によるエンタルピー変化（−ΔH°）及びエントロピー変化（−ΔS°）を、融解温度曲線に対するカーブフィッティング法で測定した。
【００８７】
対照として、NPP含有オリゴデオキシリボヌクレオチド誘導体においてNPP含有ヌクレチドをデオキシシチジル酸としたオリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｃ）について、同様にしてオリゴデオキシリボヌクレオチド（Ａ'）、（Ｇ'）、（Ｃ'）及び（Ｔ'）とそれぞれ２本鎖を形成させ、それぞれTm、−ΔH°及び−ΔS°を測定した。
【００８８】
また、対照として、NPP含有オリゴデオキシリボヌクレオチド誘導体においてNPP含有ヌクレチドをデオキシチミジル酸としたオリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｔ）について、同様にしてオリゴデオキシリボヌクレオチド（Ａ'）と２本鎖を形成させ、それぞれTm、−ΔH°及び−ΔS°を測定した。
【００８９】
結果を以下の表１に示す。
【００９０】
【表１】
【００９１】
表１に示すように、NPP含有オリゴデオキシリボヌクレオチド誘導体ではオリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｇ'）と対合させた場合には、オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｃ）をオリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｇ'）と対合させた場合と同様のTm、−ΔH°、−ΔS°を示した。
【００９２】
また、NPP含有オリゴデオキシリボヌクレオチド誘導体ではオリゴデオキシリボヌクレオチド（Ａ'）と対合させた場合には、オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｔ）をオリゴデオキシリボヌクレオチド（Ａ'）と対合させた場合と同様のTm、−ΔH°、−ΔS°を示した。
【００９３】
このことから、dNPPと対合するヌクレオチドがアデニル酸又はグアニル酸である場合に、ハイブリダイズし易く、安定な２本鎖を形成できることが分かる。
【００９４】
さらに、オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｃ）では、オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｇ'）と２本鎖を形成した場合に、オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ａ'）、（Ｃ'）、（Ｔ'）と２本鎖を形成した場合に比べてTmが高いのに対して、NPP含有オリゴデオキシリボヌクレオチド誘導体では、オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｇ'）、（Ａ'）、（Ｃ'）、（Ｔ'）のいずれと２本鎖を形成した場合にも略同等のTmを示した。
【００９５】
このことから、NPP含有オリゴデオキシリボヌクレオチド誘導体では、NPP含有ヌクレオチド誘導体と対合するのがいずれのヌクレオチドであっても安定な２本鎖を形成することが分かる。NPP含有ヌクレオチド誘導体は、グアニル酸、アデニル酸、シチジル酸、チミジル酸のいずれとも水素結合による塩基対を形成していない可能性が示唆される。
【００９６】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明のヌクレオシド誘導体及びポリヌクレオチド誘導体の１実施態様の合成手順を示す図である。
【図２】 NPP含有オリゴデオキシリボヌクレオチドを各種プローブとハイブリダイズさせた場合の蛍光スペクトルの変化を示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、塩基配列中の特定部位の塩基の種類の決定に用いられるポリヌクレオチド誘導体、その中間体であるヌクレオシド又はヌクレオチド誘導体及び塩基化合物、並びに、その利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、ハイブリダイゼーションを利用した核酸塩基決定は、プローブとしてのポリヌクレオチドを、蛍光ラベルされた標的核酸とハイブリダイズさせ、その融解温度を測定することにより行っている。詳述すれば、プローブの所定位置の塩基が標的核酸の対応塩基と塩基対を形成する場合としない場合とで、２本鎖の融解温度が若干異なることを利用して、塩基の同定を行っている。
【０００３】
しかし、この場合は、対合する塩基が塩基対を形成する場合としない場合との融解温度の差ができるだけ大きくなるような条件設定を、個々の標的核酸ごとに行う必要がある。また、塩基間の非特異的な吸着や塩基対形成の不安定性などによる検出エラーが生じ易い。さらに、標的核酸のラベル量を少なくせざるを得ない場合や、長時間の操作により蛍光が退色する場合には、検出誤差が大きくなる。
【０００４】
なお、標的核酸配列を検出するために蛍光ラベルしたプローブを用いることも提案されている（例えば特許文献１、２、３及び４）。しかし、これらの蛍光プローブは、標的核酸と塩基対を形成することにより標的核酸を標識するものにすぎず、標的核酸中の特定塩基を同定することはできない。
【０００５】
【特許文献１】
特公平3-71437号公報（第４欄一般式（Ｉ）、第５欄第5-9行）
【０００６】
【特許文献２】
特表平9-505556号公報（請求項１、第15頁第11-19行）
【０００７】
【特許文献３】
特開平6-135991号公報（請求項１、段落0004、段落0005）
【０００８】
【特許文献４】
特開昭62-059293号公報（請求項１、第２頁右下欄第5-8行）
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、簡便かつ正確に核酸塩基の同定を行えるポリヌクレオチド誘導体、その中間体として使用できるヌクレオシド又はヌクレオチド誘導体及び塩基化合物、DNAチップ、並びに、標的核酸中のヌクレオチドの同定方法を提供することを主目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために本発明者は研究を重ね、以下の知見を見出した。
▲１▼ １又は２以上のヌクレオチドが以下の一般式（５）で表されるヌクレオチド誘導体で置換されているポリヌクレオチド誘導体は蛍光を発する。このポリヌクレオチド誘導体をプローブとして用いて標的核酸とのハイブリダイゼーションを行うと、相補鎖中の当該ヌクレオチド誘導体と対合するヌクレオチドの種類によって蛍光が増大したり、消光したり、蛍光発光波長がシフトしたりする。
【００１１】
【化７】
（式中、R1、R2、R3、R4は同一又は互いに異なって、水素原子、アミノ基、モノ−（低級アルキル）アミノ基、ジ−（低級アルキル）アミノ基、水酸基、アルキル基、低級アルコキシ基、低級アルキルチオ基、アルキルチオ基、アシルオキシ基、ハロゲン原子、シアノ基、チオール基又は置換基を有していてよいフェニル基を表し、R1、R2、R3及びR4が同時に水素原子であることはない。R1とR2、R2とR3、R3とR4とが結合してフェニル基を形成していてもよい。R5は水素原子又は水酸基を表す。）
▲２▼ 例えば、上記一般式（５）において、R1とR2とが結合してベンゾ環を形成し、R3、R4及びR5が水素原子である場合には、相補鎖中の当該ヌクレオチド誘導体と対合するヌクレオチドがアデニル酸である場合には発光極大波長における蛍光強度が増大し、グアニル酸である場合に消光する。
▲３▼ 標的核酸に相補的なポリヌクレオチドの所定位置のヌクレオチドに代えてこのヌクレオチド誘導体を導入したものをプローブとして用いることにより、標的核酸の所定位置の塩基を簡単かつ正確に同定できる。
【００１３】
前期知見に基づき、本発明は以下の化合物、ヌクレオシド又はヌクレオチド誘導体、ポリヌクレオチド誘導体、DNAチップ及び標的核酸中のヌクレオチドの同定方法を提供する。
【００１４】
項１． 以下の一般式（１）で表される化合物。
【００１５】
【化８】
（式中、R1、R2、R3、R4は同一又は互いに異なって、水素原子、アミノ基、モノ−（低級アルキル）アミノ基、ジ−（低級アルキル）アミノ基、水酸基、アルキル基、低級アルコキシ基、低級アルキルチオ基、アルキルチオ基、アシルオキシ基、ハロゲン原子、シアノ基、チオール基又は置換基を有していてよいフェニル基を表し、R1、R2、R3及びR4が同時に水素原子であることはない。R1とR2、R2とR3、R3とR4とが結合してフェニル基を形成していてもよい。）
項２． 以下の一般式（２）で表される項１に記載の化合物。
【００１７】
【化９】
項３． 以下の一般式（３）で表されるヌクレオシド又はヌクレオチド誘導体。
【００１９】
【化１０】
（式中、R1、R2、R3、R4は同一又は互いに異なって、水素原子、アミノ基、モノ−（低級アルキル）アミノ基、ジ−（低級アルキル）アミノ基、水酸基、アルキル基、低級アルコキシ基、低級アルキルチオ基、アルキルチオ基、アシルオキシ基、ハロゲン原子、シアノ基、チオール基又は置換基を有していてよいフェニル基を表し、R1、R2、R3及びR4が同時に水素原子であることはない。R1とR2、R2とR3、R3とR4とが結合してフェニル基を形成していてもよい。R5は水素原子又は水酸基を表す。nは０、１、２又は３を示す。）
項４． 以下の一般式（４）で表される項３に記載のヌクレオシド又はヌクレオチド誘導体。
【００２１】
【化１１】
項５． ポリヌクレオチドにおいて、１又は２以上のヌクレオチドが以下の一般式（５）で表されるヌクレオチド誘導体で置換されているポリヌクレオチド誘導体。
【００２３】
【化１２】
（式中、R1、R2、R3、R4は同一又は互いに異なって、水素原子、アミノ基、モノ−（低級アルキル）アミノ基、ジ−（低級アルキル）アミノ基、水酸基、アルキル基、低級アルコキシ基、低級アルキルチオ基、アルキルチオ基、アシルオキシ基、ハロゲン原子、シアノ基、チオール基又は置換基を有していてよいフェニル基を表し、R1、R2、R3及びR4が同時に水素原子であることはない。R1とR2、R2とR3、R3とR4とが結合してフェニル基を形成していてもよい。R5は水素原子又は水酸基を表す。）
項６． 以下の一般式（６）で表される項５に記載のポリヌクレオチド誘導体。
【００２５】
【化１３】
項７． プローブとして用いるための項５又は６に記載のポリヌクレオチド誘導体。
【００２７】
項８． 基体上に１又は複数の項５又は６に記載のポリヌクレオチド誘導体が固定又は吸着されたDNAチップ。
【００２８】
項９． 項５又は６に記載のポリヌクレオチド誘導体を試料中の標的核酸とハイブリダイズさせる工程と；
ハイブリダイズ産物の蛍光スペクトルを測定する工程と；
この蛍光スペクトルをハイブリダイズ前の項５又は６に記載のポリヌクレオチド誘導体の蛍光スペクトルと比較することにより、標的核酸の特定位置のヌクレオチドの種類を同定する工程と
を含む標的核酸中のヌクレオチドの同定方法。
【００２９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の化合物
＜塩基化合物＞
本発明の化合物は、文献未記載の新規化合物であり、以下の一般式（１）で表される。
【００３０】
【化１４】
（式中、R1、R2、R3、R4は同一又は互いに異なって、水素原子、アミノ基、モノ−（低級アルキル）アミノ基、ジ−（低級アルキル）アミノ基、水酸基、アルキル基、低級アルコキシ基、低級アルキルチオ基、アルキルチオ基、アシルオキシ基、ハロゲン原子、シアノ基、チオール基又は置換基を有していてよいフェニル基を表し、R1、R2、R3及びR4が同時に水素原子であることはない。R1とR2、R2とR3、R3とR4とが結合してフェニル基を形成していてもよい。）
本明細書において、低級アルキル基、モノ−（低級アルキル）アミノ基、ジ−（低級アルキル）アミノ基及びアルキルチオ基の低級アルキルとしては、例えばメチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、sec-ブチル、tert-ブチル等の炭素数１〜４個程度の直鎖又は分岐状のアルキルが挙げられる。
【００３２】
また、低級アルコキシ基としては、例えばメトキシ基、エトキシ、n-プロポキシ基、イソプロポキシ基、n-ブトキシ基、sec-ブトキシ基、tert-ブトキシ基等の炭素数１〜４個程度の直鎖又は分岐状のアルコキシ基が挙げられる。
【００３３】
またアシルオキシ基としては、以下の一般式（７）において、Rが例えば低級アルキル基、置換基を有していてよいフェニル基、ハロゲン原子等である置換基が挙げられる
【００３４】
【化１５】
また、ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。
【００３６】
また、アリール基としては、フェニル基、ナフチル基等が挙げられる。これらのアリール基は、例えばアミノ基、モノ−（低級アルキル）アミノ基、ジ−（低級アルキル）アミノ基、水酸基、アルキル基、低級アルコキシ基、低級アルキルチオ基、アシルオキシ基、ハロゲン原子、シアノ基、チオール基等の置換基を有していてもよい。
【００３７】
R1、R2、R3及びR4の好適な組み合わせとしては、例えばR1及びR2が結合してベンゾ環を形成しR3及びR4が水素原子である組み合わせ；R1〜R4がフッ素原子である組み合わせ；R3がニトロ基でありR1、R2及びR4が水素原子である組み合わせ；R3がアミノ基でありR1、R2及びR4が水素原子である組み合わせ；R3がジアルキルアミノ基でありR1、R2及びR4が水素原子である組み合わせ等が挙げられる。
【００３８】
特に、R1〜R4が電子供与基又はベンゾ環である化合物が好ましく、中でもR1及びR2が結合してベンゾ環を形成している化合物がより好ましい。最も好ましいのは、R1及びR2が結合してベンゾ環を形成しR3及びR4が水素原子である化合物である。
＜ヌクレオシド又はヌクレオチド誘導体＞
本発明のヌクレオシド又はヌクレオチド誘導体は、文献未記載の新規化合物であって、以下の一般式（３）で表される化合物である。
【００３９】
【化１６】
（式中、R1、R2、R3、R4は同一又は互いに異なって、水素原子、アミノ基、モノ−（低級アルキル）アミノ基、ジ−（低級アルキル）アミノ基、水酸基、アルキル基、低級アルコキシ基、低級アルキルチオ基、アルキルチオ基、アシルオキシ基、ハロゲン原子、シアノ基、チオール基又は置換基を有していてよいフェニル基を表し、R1、R2、R3及びR4が同時に水素原子であることはない。R1とR2、R2とR3、R3とR4とが結合してフェニル基を形成していてもよい。R5は水素原子又は水酸基を表す。nは０、１、２又は３を示す。）
R1、R2、R3及びR4については前述した通りである。
【００４１】
R5が水素原子である場合には、上記化合物はデオキシリボヌクレオシド又はデオキシリボヌクレオチド誘導体であり、R5が水酸基である場合には、上記化合物はリボヌクレオシド又はリボヌクレオチド誘導体である。
【００４２】
また、nが０である場合すなわちリン酸基が存在しない場合には、上記化合物はヌクレオシド誘導体であり、nが１、２又は３である場合には、上記化合物はヌクレオチド誘導体である。
＜ポリヌクレオチド誘導体＞
本発明のポリヌクレオチド誘導体は、ポリヌクレオチドにおいて、１又は２以上のヌクレオチドが以下の一般式（５）で表されるヌクレオチド誘導体で置換されているポリヌクレオチド誘導体である。
【００４３】
【化１７】
（式中、R1、R2、R3、R4は同一又は互いに異なって、水素原子、アミノ基、モノ−（低級アルキル）アミノ基、ジ−（低級アルキル）アミノ基、水酸基、アルキル基、低級アルコキシ基、低級アルキルチオ基、アルキルチオ基、アシルオキシ基、ハロゲン原子、シアノ基、チオール基又は置換基を有していてよいフェニル基を表し、R1、R2、R3及びR4が同時に水素原子であることはない。R1とR2、R2とR3、R3とR4とが結合してフェニル基を形成していてもよい。R5は水素原子又は水酸基を表す。）
R1、R2、R3、R4及びR5については前述した通りである。
【００４５】
本発明のポリヌクレオチド誘導体はDNAであってもよく、RNAであってもよい。
【００４６】
本発明のポリヌクレオチド誘導体のヌクレオチド数は特に限定されないが、例えば、最大100個程度、好ましくは最大50個程度、より好ましくは最大30個程度、さらにより好ましくは最大20個程度のヌクレオチドからなるものが挙げられる。すなわち、本発明のポリヌクレオチドにはオリゴヌクレオチドも含まれる。
【００４７】
本発明のポリヌクレオチド誘導体は、全体のヌクレオチド数により異なるが、上記ヌクレオチド誘導体を２０個程度まで有していてよい。より好ましくは５個程度までである。上記ヌクレオチド誘導体が余りに多いと塩基間相互作用により蛍光波長が移動してしまう可能性がある。本発明の範囲であればこのような問題は生じない。
化合物の製造方法
＜塩基化合物＞
＜ヌクレオシド又はヌクレオチド誘導体＞
本発明のヌクレオシド誘導体は、例えば以下の方法で合成できる。５−ヨードデオキシシチジンを適当な溶媒に溶解させた溶液に対して、tert-ブチルジメチルシリルクロライド及びイミダゾールを添加し、室温下で攪拌する。次いで、得られた化合物をピリジンに溶解し、ベンゾ環の各炭素原子にそれぞれＲ１〜Ｒ４が結合した塩化ベンゾイルを添加して室温下で攪拌する。
【００４８】
次いで、得られた化合物を適当な溶媒に溶解し、プロピレンオキシドを添加し、光を照射した。得られた化合物をアンモニア水／メタノール／クロロホルムに溶解し攪拌する。
【００４９】
次いで、得られた化合物を適当な溶媒に溶解し、同溶媒に溶解させたテトラブチルアンモニウムを添加し、室温下で攪拌する。これにより本発明のヌクレオシド誘導体が得られる。
【００５０】
ヌクレオチド誘導体は当該ヌクレオシド誘導体から常法により得ることができる。すなわち、POCl3及びリン酸トリメチルを添加することにより、ヌクレオチド（n=1）が得られる。さらに、ピロリン酸トリブチルアンモニウム塩を添加することにより、三リン酸体が得られる。
＜ポリヌクレオチド誘導体＞
本発明のポリヌクレオチド誘導体は、例えば核酸自動合成機を用いたフォスフォロアミダイト法による化学合成方法において、特定ヌクレオシドに代えて本発明のヌクレオシド誘導体を用いることにより合成できる。
用途
本発明の塩基化合物、及び、ヌクレオシド又はヌクレオチド誘導体は、ポリヌクレオチド誘導体の合成に供することができる。
【００５１】
本発明の化合物及びヌクレオシド又はヌクレオチド誘導体は蛍光を発するところ、これを含む本発明のポリヌクレオチド誘導体は、標的核酸とハイブリダイズさせると、１本鎖の場合に比べて、対合するヌクレオチドの種類によって蛍光の発光強度が増大したり、低減したり、発光波長がシフトしたりする。
【００５２】
例えば、一般式（５）において、R1及びR2が結合してベンゾ環を形成し、R3、R4及びR5が水素原子である場合には（ナフトピリドピリミジン(NPP)含有オリゴデオキシリボヌクレオチド）、NPP含有ヌクレオチドに対合するヌクレオチドがアデニル酸である場合には蛍光の発光強度が増大し、グアニル酸である場合に蛍光が消光する。本発明のポリヌクレオチド誘導体は、この現象を利用して以下の用途に使用できる。
i) 標的核酸と相補的なポリヌクレオチド誘導体は、プローブとして用いることにより、標的核酸の特定位置のヌクレオチドの種類を決定できる。同様の方法で１塩基多型の検出に利用できる。
ii) DNAチップにおいて、ポリヌクレオチドに代えて基板上に固定ないしは吸着させることにより、特定核酸配列を有するか否かを確認できる。特に、標的核酸の特定位置のヌクレオチドの種類を決定できる。
iii) アンチセンスポリヌクレオチドに代えて使用する場合には、通常のポリヌクレオチドとは異なるために、核酸分解酵素（例えば制限酵素）や核酸結合タンパク質（例えば転写因子）等の標的核酸への結合を阻害できる。このことから、これらの作用を利用した実験用試薬として利用できる。
iv) それ自体蛍光を発するため、核酸の蛍光ラベルに使用できる。
v) DNA複製において、複製されるDNAと相補的なプローブとして使用することによりDNA複製のリアルタイム検出ができる。同様に、RNAへの転写において、転写されるRNAと相補的なプローブとして使用することによりRNA転写のリアルタイム検出ができる。
vi) 相補的配列とハイブリダイズすることにより蛍光波長のシフトが起こるようなポリヌクレオチド誘導体である場合は、蛍光波長のシフトにより当該ポリヌクレオチド誘導体の酸化還元電位が変化する。このため、電極上に本発明のポリヌクレオチド誘導体を固定しておき、被験ポリヌクレオチドをこの電極に作用させて酸化還元電位を測定する方法で、核酸配列応答性のバイオセンサーとして利用できる。
vii) 本発明のポリヌクレオチドは、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)に供される蛍光性プローブとして利用できる。
プローブ
前述したように、本発明のポリヌクレオチド誘導体は、プローブとして使用して試料中に含まれる標的核酸の特定位置の塩基の種類を決定できる。
【００５３】
プローブとして使用する場合は、試料の種類によって異なるが、ヌクレオチド数は例えば４〜100個程度、好ましくは10〜30個程度とすることができる。
【００５４】
試料が細胞抽出液等のヌクレアーゼを含むものである場合には、ヌクレアーゼにより切断され難いように、ホスホロチオエートDNA又はRNA、H-ホスホネートDNA又はRNA等の修飾核酸であってもよい。
【００５５】
ハイブリダイズに際しては、標的核酸を含む試料に対して本発明のポリヌクレオチド誘導体を1nM〜1mM程度、特に1μM〜50μM程度添加することが好ましい。また、ハイブリダイズ条件はポリヌクレオチドの長さによっても異なるが、例えば０〜60℃程度、特に1５〜40℃程度の温度で、例えば５〜60分間程度、特に５〜10分間程度行うことができる。また、ハイブリダイズさせる試料は、例えばpH5.5〜8.0程度、特にpH 6.5〜8.0程度に調整すればよい。
【００５６】
また、試料から抽出及び精製された標的核酸と本発明のポリヌクレオチド誘導体とをハイブリダイズさせる場合には、ポリヌクレオチドの長さによって異なるが、例えば室温（25℃程度）〜50℃程度、10〜48時間程度、２〜６×SSC程度の条件とすることができる。さらに、同程度の濃度のSSC溶液で３〜５回程度洗浄すればよい。
DNA チップ
本発明のDNAチップ（又はDNAアレイ）は、基体上に本発明のポリヌクレオチド誘導体が固定又は吸着されたものである。固定には共有結合などによる結合も含まれる。
【００５７】
基体上へのDNAのスポット径は特に限定されないが、例えば50〜200μm程度とすることができる。またスポットピッチは特に限定されないが、例えば100〜500μm程度とすることができる。
【００５８】
基体の材料は特に限定されず、例えばガラス、シリカ、金等を用いることができる。また、基体の形状は、板状（基板状）、ビーズ状等のどのような形状のものであってもよい。
【００５９】
基体上に本発明のポリヌクレオチド誘導体を結合する場合には、本発明のポリヌクレオチド誘導体の一端を、例えば金属−硫黄結合などの方法を使用して、基体に結合させることができる。
【００６０】
DNAチップに固定等される本発明のポリヌクレオチド誘導体のヌクレオチド数は、試料の種類によって異なるが、例えば10〜200個程度、好ましくは50〜100個程度とすることができる。
【００６１】
試料が細胞抽出液等のヌクレアーゼを含むものである場合には、本発明のポリヌクレオチド誘導体は、ヌクレアーゼにより切断され難いように、ホスホロチオエートDNA又はRNA、H-ホスホネートDNA又はRNA等の修飾核酸であってもよい。
【００６２】
ハイブリダイズに際しては、基体に固定された本発明のポリヌクレオチド誘導体に対して、試料を例えば0.1μM〜100μM程度、特に1μM〜10μM程度添加することができる。また、ハイブリダイズ条件はポリヌクレオチド誘導体の種類によって異なるが、例えば０〜60℃程度、特に20〜40℃程度の温度で、例えば１〜30分間程度、特に１〜５分間程度とすることができる。また、ハイブリダイズさせる試料は例えばpH5.5〜8.0程度、特にpH 6.5〜8.0程度に調整しておくことが好ましい。
【００６３】
ハイブリダイズ後は、チップの種類に適した洗浄液で２〜５回程度洗浄すればよい。
【００６４】
また、試料から抽出及び精製された標的核酸を用いる場合には、標的核酸を例えば２〜６×SSC程度のハイブリダイズ溶液に溶解させたものを本発明のDNAチップに作用させるのが好ましい。温度、時間、洗浄条件については、未精製の標的核酸を用いる場合と同様である。
本発明のヌクレオチドの同定方法
本発明のヌクレオチドの同定方法は、上記説明した本発明のポリヌクレオチド誘導体を試料中の標的核酸とハイブリダイズさせる工程と；
ハイブリダイズ産物の蛍光スペクトルを測定する工程と；
この蛍光スペクトルをハイブリダイズ前の本発明のポリヌクレオチド誘導体の蛍光スペクトルと比較することにより、標的核酸の特定位置のヌクレオチドの種類を同定する工程とを含む方法である。
【００６５】
試料は、核酸を含むものであればよく、細胞抽出液、血液のような体液、PCR産物、オリゴヌクレオチド等が挙げられる。
【００６６】
ハイブリダイズ条件は、プローブ又はDNAチップについて説明した通りである。
【００６７】
蛍光スペクトルは、常法に従い、照射波長250〜600nm程度で測定すればよい。ハイブリダイズ前のポリヌクレオチド誘導体の蛍光スペクトル測定と、ハイブリダイズ産物の蛍光スペクトル測定とは、同じ媒体に溶解又は懸濁させた状態で行うことが好ましい。通常はハイブリダイゼーション溶液に溶解又は懸濁させた状態で測定すればよい。
【００６８】
【発明の効果】
本発明によれば、簡便かつ正確に核酸塩基の同定を行えるポリヌクレオチド誘導体、その中間体として使用できるヌクレオシド又はヌクレオチド誘導体及び塩基化合物が提供される。
【００６９】
また本発明によれば、簡便かつ正確に核酸塩基の同定を行えるDNAチップ及び簡便かつ正確に核酸塩基の同定を行える方法が提供される。
【００７０】
さらにいえば、本発明のヌクレオチド誘導体を含むポリヌクレオチド誘導体は、標的核酸とハイブリダイズさせると、標的核酸における当該ヌクレオチド誘導体と対合するヌクレオチドの種類によって、蛍光強度が増大したり、消光したり、発光波長特に極大波長がシフトしたりする。
【００７１】
従来は、プローブと標的核酸との特定位置における塩基対形成の有無により、２本鎖の融解温度が若干異なることに基づいて塩基の同定を行っていたところ、検出可能な程度に融解温度差を大きくするために、個々の標的核酸ごとにハイブリダイズ条件設定を行う必要があった。これに対して本発明では、蛍光の増大、低減、波長のシフト等により塩基の同定を行うため、このような手間のかかるハイブリダイズ条件設定が不要である。
【００７２】
また、２本鎖の融解によらないため、融解が生じ難いような長いポリヌクレオチド誘導体とすることもできる。
【００７３】
また、塩基間の非特異的な吸着や塩基対形成の不安定性などによる検出エラーが生じ難い。
【００７４】
また、対合するヌクレオチドにより蛍光発光の波長がシフトする場合には、特定ヌクレオチドと対合した場合の蛍光波長に合わせたフィルター（特定の数十nmの波長の光だけを透過するフィルターであり、市販されている）を使用してこのフィルターに蛍光を通すことにより、特定波長の蛍光だけを検出することができ、対合ヌクレオチドの検出感度が増大する。
【００７５】
また、他の長波長蛍光色素を反応系中に添加することにより、蛍光共鳴エネルギ移動（FRET）を利用して検出感度を向上させたり、目で見える色の蛍光に変化させることができる。
【００７６】
【実施例】
以下、本発明を実施例を示してより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１（ＮＰＰ含有ヌクレオシド誘導体の合成）
図１を参照して説明する。５−ヨードデオキシシチジン（ＩＤＣ）（５．０ｇ、１４．２ｍｍｏｌ）（図１化合物（ａ））の７０ｍｌジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液に対して、tert-ブチルジメチルシリルクロライド（ＴＢＤＭＳＣｌ）（４．７ｇ、３１．２ｍｍｏｌ）及びイミダゾール（２．１ｇ、３１．２ｍｍｏｌ）を添加し、室温下９０分間撹拌した
【００７７】
次いで、得られた生成物のうちの3g（5.2mmol）を30mlのピリジンに溶解し、３当量の塩化ナフトイル(2.4ml)を加え、５時間室温下で撹拌した。これにより、図１(b)に示す化合物が得られた。
【００７８】
次いで、化合物(b)のうち300mg（0.36mmol）をベンゼン150mlに溶かし、プロピレンオキシド3mlを加え、高圧水銀灯によって生じる光を７分間照射した。これにより、図１の(c)に示す化合物が得られた。
【００７９】
次いで、これを25%アンモニア水／メタノール／クロロホルム（1:1:1）3mlに溶解し、50℃で20時間撹拌した。
【００８０】
次いで、得られた生成物のうち130mg（0.21mmol）をテトラヒドロフラン(THF)5mlに溶かし、１ＭテトラブチルアンモニウムフルオライドTHF溶液を0.5ml（0.5mmol）加え、室温で２時間撹拌した。これにより、図１(d)に示す本発明の１実施態様である化合物が得られた。この化合物は、塩基としてピリミジン誘導体であるナフトピリドピリミジン（NPP）を有するヌクレオシド誘導体である。
実施例２（ NPP 含有オリゴヌクレオチドの合成）
図１を参照して説明する。実施例１で得られたNPP含有ヌクレオシド誘導体66mg（0.17mmol）のピリジン溶液5mlにジメトキシトリチルクロライド（70mg、0.2mmol）を加え、室温下で10時間撹拌した。
【００８１】
次いで、得られた生成物のうち31mg（45.5mmol）を2mlのアセトニトリルに溶解し、テトラゾール（4mg、54.6μmol）及びN,N,N',N'-テトライソプロピル-2-シアノエチルジフォスフォロアミダイト（18μl、54.6μmol）を加え、２時間室温で撹拌した。これにより図１(e)に示す化合物が得られた。
【００８２】
化合物(e)を用いてアプライドバイオシステム392DNA/RNAシンセサイザーを用いてフォスフォロアミダイト法によりNPP含有オリゴデオキシリボヌクレオチド誘導体5'-CGCAATXTAACGC-3'（配列番号１）（Xは、NPP含有デオキシリボヌクレオチド）を合成した。
＜蛍光分析＞
実施例２により得られたNPP含有オリゴデオキシリボヌクレオチド誘導体を、2.5μMとなるように、0.1M塩化ナトリウムを含む50mMリン酸緩衝液(pH7.0)に溶解させた溶液を調製した。この溶液の蛍光スペクトルを蛍光分光光度計（島津製作所社製RF5300PC）を用いて約25℃で測定したところ、励起波長370nm、発光波長420nmであり、420nmにおける蛍光強度は、1.6であった。
【００８３】
上記溶液に、NPP含有オリゴデオキシリボヌクレオチド誘導体とNPP含有ヌクレオチド以外の部分が相補的な、別途合成したオリゴデオキシリボヌクレオチド（Ａ'）；5'-GCGTTAAATTGCG-3'（配列番号２）及び（Ｇ'）；5'- GCGTTAGATTGCG -3'（配列番号３）をそれぞれ2.5μMとなるように添加し、ボルテックスミキサーにて混合した。
【００８４】
これらの溶液の420nmにおける蛍光強度を蛍光スペクトルを蛍光分光光度計を用いて測定したところ、オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ａ'）を加えた場合には、420nmにおける蛍光強度は3.1であり、オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｇ'）を加えた場合には、420nmにおける蛍光強度は0.2であった。
【００８５】
このように、実施例２により得られたNPP含有オリゴデオキシリボヌクレオチド誘導体は、相補鎖上のNPP含有ヌクレオチドと対合するヌクレオチドがアデニル酸である場合には蛍光が増大し、グアニル酸である場合には蛍光が87%消光した。蛍光スペクトルを図２に示す。
＜熱力学パラメーター＞
実施例２により得られたNPP含有オリゴデオキシリボヌクレオチド誘導体を、2.5μMとなるように、0.1M塩化ナトリウムを含む50mMリン酸緩衝液(pH7.0)に溶解させた溶液に、別途合成したオリゴデオキシリボヌクレオチド（Ａ'）、オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｔ'）5'-GCGTTATATTGCG-3'（配列番号４）、オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｇ'）及びオリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｃ'）5'-GCGTTACATTGCG-3'（配列番号５）をそれぞれ2.5μMとなるように添加し、ボルテックスミキサーにて混合した。
【００８６】
オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ａ'）、（Ｔ'）、（Ｇ'）及び（Ｃ'）を添加した場合のぞれぞれについて、形成された２本鎖の融解温度Tmを、波長260nmにおける吸収スペクトルの変化を測定することにより評価した。また、２本鎖形成によるエンタルピー変化（−ΔH°）及びエントロピー変化（−ΔS°）を、融解温度曲線に対するカーブフィッティング法で測定した。
【００８７】
対照として、NPP含有オリゴデオキシリボヌクレオチド誘導体においてNPP含有ヌクレチドをデオキシシチジル酸としたオリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｃ）について、同様にしてオリゴデオキシリボヌクレオチド（Ａ'）、（Ｇ'）、（Ｃ'）及び（Ｔ'）とそれぞれ２本鎖を形成させ、それぞれTm、−ΔH°及び−ΔS°を測定した。
【００８８】
また、対照として、NPP含有オリゴデオキシリボヌクレオチド誘導体においてNPP含有ヌクレチドをデオキシチミジル酸としたオリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｔ）について、同様にしてオリゴデオキシリボヌクレオチド（Ａ'）と２本鎖を形成させ、それぞれTm、−ΔH°及び−ΔS°を測定した。
【００８９】
結果を以下の表１に示す。
【００９０】
【表１】
表１に示すように、NPP含有オリゴデオキシリボヌクレオチド誘導体ではオリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｇ'）と対合させた場合には、オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｃ）をオリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｇ'）と対合させた場合と同様のTm、−ΔH°、−ΔS°を示した。
【００９２】
また、NPP含有オリゴデオキシリボヌクレオチド誘導体ではオリゴデオキシリボヌクレオチド（Ａ'）と対合させた場合には、オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｔ）をオリゴデオキシリボヌクレオチド（Ａ'）と対合させた場合と同様のTm、−ΔH°、−ΔS°を示した。
【００９３】
このことから、dNPPと対合するヌクレオチドがアデニル酸又はグアニル酸である場合に、ハイブリダイズし易く、安定な２本鎖を形成できることが分かる。
【００９４】
さらに、オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｃ）では、オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｇ'）と２本鎖を形成した場合に、オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ａ'）、（Ｃ'）、（Ｔ'）と２本鎖を形成した場合に比べてTmが高いのに対して、NPP含有オリゴデオキシリボヌクレオチド誘導体では、オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｇ'）、（Ａ'）、（Ｃ'）、（Ｔ'）のいずれと２本鎖を形成した場合にも略同等のTmを示した。
【００９５】
このことから、NPP含有オリゴデオキシリボヌクレオチド誘導体では、NPP含有ヌクレオチド誘導体と対合するのがいずれのヌクレオチドであっても安定な２本鎖を形成することが分かる。NPP含有ヌクレオチド誘導体は、グアニル酸、アデニル酸、シチジル酸、チミジル酸のいずれとも水素結合による塩基対を形成していない可能性が示唆される。
【００９６】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明のヌクレオシド誘導体及びポリヌクレオチド誘導体の１実施態様の合成手順を示す図である。
【図２】 NPP含有オリゴデオキシリボヌクレオチドを各種プローブとハイブリダイズさせた場合の蛍光スペクトルの変化を示す図である。
Claims (5)
- 以下の一般式（４）で表されるヌクレオシド又はヌクレオチド誘導体。
- １又は２以上のヌクレオチドが以下の一般式（６）で表されるヌクレオチド誘導体で置換されているポリヌクレオチド誘導体。
- プローブとして用いるための請求項２に記載のポリヌクレオチド誘導体。
- 基体上に１又は複数の請求項２に記載のポリヌクレオチド誘導体が固定又は吸着されたＤＮＡチップ。
- 請求項２に記載のポリヌクレオチド誘導体を試料中の標的核酸とハイブリダイズさせる工程と；
ハイブリダイズ産物の蛍光スペクトルを測定する工程と；
この蛍光スペクトルをハイブリダイズ前の請求項２に記載のポリヌクレオチド誘導体の蛍光スペクトルと比較することにより、標的核酸の特定位置のヌクレオチドの種類を同定する工程と
を含む標的核酸中のヌクレオチドの同定方法。
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