KR20210104125A

KR20210104125A - 비대칭 로다민 염료 및 생물학적 분석에서의 그 용도

Info

Publication number: KR20210104125A
Application number: KR1020217022566A
Authority: KR
Inventors: 브라이언 에반스; 스캇 벤슨
Original assignee: 라이프 테크놀로지스 코포레이션
Priority date: 2018-12-20
Filing date: 2019-12-20
Publication date: 2021-08-24
Also published as: WO2020132607A1; AU2019404556A1; EP3898841A1; JP2022515153A; MX2021007492A; BR112021012154A2; US20220380845A1; WO2020132607A9; SG11202106121SA; CA3124361A1; CN113195639A

Abstract

본 개시내용은 N-보호된 NH-로다민 염료 및 핵산 검출에서의 그의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 개시내용은 N-보호된 NH-로다민 염료의 제조 방법, 및 N-보호된 NH-로다민 염료의 사용 방법(예를 들어, 인간 식별)에 관한 것이다. 본원에서 제공되는 특정 염료는 기존 염료 세트의 것들을 보완하는 고유한 스펙트럼 특성을 가지며 HID 적용 및 기타 생물학적 분석에 포함될 수 있는 리포터 염료의 수를 확장하는 데 사용될 수 있다. 이러한 형광 화합물은 합성 올리고뉴클레오티드를 표지하는 데 유용하다. 화학식 (I).

Description

비대칭 로다민 염료 및 생물학적 분석에서의 그 용도

1. 배경

검출 표지(label)로서 형광 로다민 염료를 사용하는 것은 분자 생물학, 세포 생물학 및 분자 유전학에서 광범위한 용도를 발견했다. 예를 들어, 형광 표지된 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것은 이제 폴리뉴클레오티드 시퀀싱, 형광 현장 혼성화법(fluorescence in situ hybridization, FISH), 핵산 어레이에 대한 혼성화 분석, 형광 편광 연구, 및 형광 프로브 및/또는 프라이머로 수행되는 폴리머라제(polymerase) 연쇄 증폭 분석을 포함하는 핵산 증폭 분석을 비롯한 다양한 분석에서 널리 퍼져 있다.

형광 염료를 사용하는 다양한 멀티플렉스(multiplex) 분석 시스템이 설명되었다. 예를 들어, 로다민 염료는 인간 식별 분석(HID)에 사용하기 위해 국제공개 WO 2012/067901호에 기재된 것과 같은 멀티플렉스 분석 시스템에서 사용하기 위해 설명되었다. 불행하게도, 로다민 염료를 포함하는 기존 염료 세트의 스펙트럼 특성은 6개 초과의 염료를 조합하여 사용하는 확고하고 민감한 분석 시스템을 개발하는 능력을 제한했다. 이러한 더 높은-플렉스(plex) 시스템을 가능하게 하기 위해, 그러한 대안적 멀티플렉스 염료 세트의 생성에 고유하게 적합화된 스펙트럼 특성을 갖는 새로운 로다민 염료의 개발이 필요하다.

2. 발명의 내용

합성 올리고뉴클레오티드를 표지하는 데 사용될 수 있는 형광 화합물이 설명된다. 일 실시형태에서, 화합물은 화학식 (I)을 가지며

상기 식에서, R¹, R², R³, R⁶, R⁷, R⁸, R¹¹, R¹², R¹³, 및 R¹⁴는 단독으로 취해질 때 각각 서로 독립적으로 수소, 저급 알킬, (C6-C14) 아릴, (C7-C20) 아릴알킬, 5-14원 헤테로아릴, 6-20원 헤테로아릴알킬, -R^b, 또는 -(CH₂)_n-R^b 중에서 선택되거나; 또는 대안적으로, R¹과 R² 및/또는 R⁶과 R⁷은 이들이 결합된 탄소 원자와 함께 취해져 선택적으로 치환된 벤조기를 형성하며;

R⁴는 단독으로 취해질 때 수소, 저급 알킬, (C6-C14) 아릴, (C7-C20) 아릴알킬, 5-14원 헤테로아릴, 6-20원 헤테로아릴알킬 중에서 선택되거나; 또는 R⁴와 R² 또는 R³ 중 하나는 이들이 결합된 원자와 함께 취해져 선택적으로 치환된 헤테로시클로알킬기, 선택적으로 치환된 헤테로시클로알케닐기, 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴기를 형성하며;

R⁵는 H 또는 보호기이며;

R⁹는 단독으로 취해질 때 수소, 저급 알킬, (C6-C14) 아릴, (C7-C20) 아릴알킬, 5-14원 헤테로아릴, 6-20원 헤테로아릴알킬 중에서 선택되거나; 또는 R⁷과 R⁹는 이들이 결합된 원자와 함께 취해져 선택적으로 치환된 헤테로시클로알킬기, 선택적으로 치환된 헤테로시클로알케닐기, 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴기를 형성하며;

R¹⁰은 H 또는 보호기이거나; 또는 R⁸과 R¹⁰은 이들이 결합된 원자와 함께 취해져 선택적으로 치환된 헤테로시클로알킬기, 선택적으로 치환된 헤테로시클로알케닐기, 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴기를 형성하며;

R⁷과 R⁹ 또는 R⁸과 R¹⁰ 중 적어도 하나는 이들이 결합된 원자와 함께 취해져 선택적으로 치환된 헤테로시클로알킬기, 선택적으로 치환된 헤테로시클로 알케닐기 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴기를 형성하고, 선택적으로 R⁴와 R² 또는 R³ 중 하나는 이들이 결합된 원자와 함께 취해져 선택적으로 치환된 헤테로시클로알킬기, 선택적으로 치환된 헤테로시클로알케닐기, 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴기를 형성하며; 단, 화합물은 다음 화학식으로 이루어지지 않으며;

각각의 R^a는 저급 알킬, (C6-C14) 아릴, (C7-C20) 아릴알킬, 5-14원 헤테로아릴, -CX₃ 및 6-20원 헤테로아릴알킬 중에서 독립적으로 선택되며;

각각의 R^b는 -X, -OH, -OR^a, -SH, -SR^a -NH₂, -NHR^a, NR^cR^c, N⁺R^cR^cR^c, 퍼할로 저급 알킬, 트리할로메틸, 트리플루오로메틸, -P(O)(OH)₂, P(O)(OR^a)₂, P(O)(OH)(OR^a), -OP(O)(OH)₂, OP(O)(OR^a)₂, -OP(O)(OR^a)(OH), -S(O)₂OH, S(O)₂R^a, -C(O)H, C(O)R^a, -C(S)X, -C(O)OR^a, -C(O)OH, -C(O)NH₂, -C(O)NHR^a, C(O)NR^cR^c, C(S)NH₂, C(O)NHR^a, -C(O)NR^cR^c, -C(NH)NH₂, -C(NH)NHR^a, 및 C(NH)NR^cR^c 중에서 독립적으로 선택되며,

각각의 R^c는 독립적으로 R^a이거나, 또는 대안적으로 동일한 질소 원자에 결합된 2개의 R^c는 그 질소 원자와 함께 취해져, 전형적으로 O, N 및 S 중에서 선택되는 동일하거나 상이한 고리 헤테로원자들 중 하나 이상을 선택적으로 포함할 수 있는 5- 내지 8-원 포화 또는 불포화 고리를 형성할 수 있으며;

각각의 R^d 및 R^e는 단독으로 취해질 때 수소, 저급 알킬, (C6-C14) 아릴, (C7-C20) 아릴알킬, 5-14원 헤테로아릴, 6-20원 헤테로아릴알킬, -R^b, 또는 -(CH₂)_n-R^b 중에서 독립적으로 선택되며;

n은 1 내지 10 범위의 정수이다.

다른 양태에서, 본 개시내용은 고체 지지체에 부착된 올리고뉴클레오티드를 다음 화학식의 구조를 갖는 시약과 반응시킴으로써 생성된 표지 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 기술한다:

LM-L-PEP

상기 식에서, PEP는 포스페이트 에스테르 전구체 기이고, L은 표지 모이어티를 PEP 기에 연결하는 선택적 링커(linker)이며, LM은 화학식 (I)의 N-보호된 NH-로다민 모이어티를 포함하며,

상기 식에서, R¹, R², R³, R⁶, R⁷, R⁸, R¹¹, R¹², R¹³, 및 R¹⁴는 단독으로 취해질 때 각각 서로 독립적으로 수소, 저급 알킬, (C6-C14) 아릴, (C7-C20) 아릴알킬, 5-14원 헤테로아릴, 6-20원 헤테로아릴알킬, -R^b, 또는 -(CH₂)_n-R^b 중에서 선택되거나; 또는 대안적으로, R¹과 R² 및/또는 R⁶과 R⁷은 이들이 결합된 탄소 원자와 함께 취해져 선택적으로 치환된 벤조기를 형성하며; R², R³, R⁷, R⁸, R¹², 또는 R¹³ 중 하나는 화학식 -Y-의 기를 포함하며, 여기서 Y는 -C(O)-, -S(O)₂-, -S- 및 -NH-로 구성된 군으로부터 선택되며;

R⁵는 H 또는 보호기이며;

각각의 R^b는 -X, -OH, -OR^a, -SH, -SR^a -NH₂, -NHR^a, NR^cR^c, N⁺R^cR^cR^c, 퍼할로 저급 알킬, 트리할로메틸, 트리플루오로메틸, -P(O)(OH)₂, P(O)(OR^a)₂, P(O)(OH)(OR^a), -OP(O)(OH)₂, OP(O)(OR^a)₂, -OP(O)(OR^a)(OH), -S(O)₂OH, S(O)₂R^a, -C(O)H, C(O)R^a, -C(S)X, -C(O)OR^a, -C(O)OH, -C(O)NH₂, -C(O)NHR^a, C(O)NR^cR^c, C(S)NH₂, C(O)NHR^a, -C(O)NR^cR^c, -C(NH)NH₂, -C(NH)NHR^a, 및 C(NH)NR^cR^c 중에서 독립적으로 선택되며;

n은 1 내지 10 범위의 정수이다.

다른 양태에서, 올리고뉴클레오티드를 표지하는데 유용한 시약으로서, 다음 구조식에 따른 화합물이며:

LM-L-PEP

상기 식에서, LM은 N-보호된 NH-로다민 모이어티를 포함하는 표지 모이어티를 나타내고, PEP는 포스포라미다이트기 또는 H-포스포네이트기를 포함하는 포스페이트 에스테르 전구체 기이며, L은 표지 모이어티를 포스페이트 에스테르 전구체 기에 연결하는 선택적 링커이며, 여기서 구조식 (I)의 N-보호된 NH-로다민 모이어티

상기 식에서, R¹, R², R³, R⁶, R⁷, R⁸, R¹¹, R¹², R¹³, 및 R¹⁴는 단독으로 취해질 때 각각 서로 독립적으로 수소, 저급 알킬, (C6-C14) 아릴, (C7-C20) 아릴알킬, 5-14원 헤테로아릴, 6-20원 헤테로아릴알킬, -R^b, 또는 -(CH₂)_n-R^b 중에서 선택되고, R⁵는 보호기이고, R⁴, R⁹ 및 R¹⁰의 각각은 단독으로 취해질 때 독립적으로 수소, 저급 알킬, (C6-C14) 아릴, (C7-C20) 아릴알킬, 5-14원 헤테로아릴, 6-20원 헤테로아릴알킬, -P(O)(OH)₂, P(O)(OR^a)₂, P(O)(OH)(OR^a), -OP(O)(OH)₂, OP(O)(OR^a)₂, -OP(O)(OR^a)(OH), -S(O)₂OH, S(O)₂R^a, -C(O)H, C(O)R^a, -C(S)X, -C(O)OR^a, -C(O)OH, -C(O)NH₂, -C(O)NHR^a, C(O)NR^cR^c, C(S)NH₂, C(O)NHR^a, -C(O)NR^cR^c, -C(NH)NH₂, -C(NH)NHR^a, 및 C(NH)NR^cR^c이고, 여기서 X는 할로이며, 대안적으로 R¹과 R² 및/또는 R⁶과 R⁷은 이들이 결합된 탄소 원자와 함께 취해져 선택적으로 치환된 벤조기를 형성하고/하거나, R⁷과 R⁹ 및/또는 R⁸과 R¹⁰ 및/또는 R⁴와 R² 또는 R³ 중 하나는 이들이 결합된 탄소 원자와 함께 취해져 선택적으로 치환된 헤테로시클로알킬기, 선택적으로 치환된 헤테로시클로알케닐기, 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴 기를 형성하며;

n은 1 내지 10 범위의 정수이며;

R^b는 독립적으로 -X, -OH, -OR^a, -SH, -SR^a -NH₂, -NHR^a, NR^cR^c, N⁺R^cR^cR^c, 퍼할로 저급 알킬, 트리할로메틸, 트리플루오로메틸, -P(O)(OH)₂, P(O)(OR^a)₂, P(O)(OH)(OR^a), -OP(O)(OH)₂, OP(O)(OR^a)₂, -OP(O)(OR^a)(OH), -S(O)₂OH, S(O)₂R^a, -C(O)H, C(O)R^a, -C(S)X, -C(O)OR^a, -C(O)OH, -C(O)NH₂, -C(O)NHR^a, C(O)NR^cR^c, C(S)NH₂, C(O)NHR^a, -C(O)NR^cR^c, -C(NH)NH₂, -C(NH)NHR^a, 및 C(NH)NR^cR^c 중에서 선택되고, 각각의 R^a는 다른 것들과 독립적으로 저급 알킬, (C6-C14) 아릴, (C7-C20) 아릴알킬, 5-14원 헤테로아릴, -CX₃ 및 6-20원 헤테로아릴알킬 중에서 선택되고, 각각의 R^c는 다른 것들과 독립적으로 R^a이거나, 또는 대안적으로 동일한 질소 원자에 결합된 2개의 R^c는 그 질소 원자와 함께 취해져, 전형적으로 O, N 및 S 중에서 선택되는 동일하거나 상이한 고리 헤테로원자들 중 하나 이상을 선택적으로 포함할 수 있는 5- 내지 8-원 포화 또는 불포화 고리를 형성할 수 있으며;

단, 화학식 LM-L-PEP의 화합물의 R², R³, R⁷, R⁸, R¹² 또는 R¹³ 중 적어도 하나는 화학식 -Y-의 기를 포함하며, 여기서 Y는 -C(O)-, -S(O)₂-, -S- 및 -NH-로 구성된 군으로부터 선택된다.

다른 양태에서, 방법은

핵산 샘플을 복수의 증폭 프라이머 쌍들로 공-증폭하여 복수의 증폭 생성물들을 형성하는 것을 포함하며, 여기서 프라이머 쌍들의 각각의 적어도 하나는 구조식 LM-L-PEP를 갖는 표지된 뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 증폭 생성물들의 각각은 상이한 유전자 자리를 포함한다.

3. 도면의 간단한 설명
도 1은 본원에 기재된 시약을 포함하는 다양한 상이한 모이어티를 서로 연결하는데 사용될 수 있는 예시적인 링커를 제공하며;
도 2는 합성 핸들을 포함하지 않는 비-뉴클레오시드(non-nucleosidic) 합성 시약의 예시적인 실시형태를 제공하며;
도 3은 합성 핸들을 포함하지 않는 뉴클레오시드 합성 시약의 예시적인 실시형태를 제공하며;
도 4는 합성 핸들을 포함하는 비-뉴클레오시드 합성 시약의 예시적인 실시형태를 제공하며;
도 5는 합성 핸들을 포함하는 뉴클레오시드 합성 시약의 예시적인 실시형태를 제공하며;
도 6은 비-뉴클레오시드 고체 지지체 시약의 예시적인 실시형태를 제공하며;
도 7은 뉴클레오시드 고체 지지체 시약의 예시적인 실시형태를 제공하며;
도 8a는 5'-히드록실에서 NH-로다민 염료로 표지된 올리고뉴클레오티드를 합성하기 위해 합성 시약의 특정 실시형태를 사용하는 것을 예시하며;
도 8b는 5'-말단에서 에너지 전달 염료로 표지된 올리고뉴클레오티드를 현장(in situ) 합성하기 위해 링커 포스포라미다이트 및 합성 시약의 특정 실시형태를 사용하는 것을 예시하며,
도 9는 3-히드록실에서 에너지 전달 염료로 표지된 올리고뉴클레오티드를 합성하기 위해 합성 시약의 특정 실시형태를 사용하는 것을 예시한다.
도 10은 멀티플렉스 분석에 사용하기 위해 제안된 염료 세트의 스펙트럼을 예시한다. 화합물 A, 국제출원 PCT/US2019/67925호에 기재된 바와 같은 비대칭 로다민; 화합물 B, 구조 D.1에 나타낸 비대칭 로다민.

4. 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용

전술한 일반적인 설명 및 다음의 상세한 설명은 단지 예시적이고 설명적인 것이며, 본원에 기술된 조성물 및 방법을 제한하려는 의도가 아님이 이해되어야 한다. 본 개시내용에서, "또는"의 사용은 달리 언급되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 유사하게, "포함한다" 및 "포함하는"(영문 "comprise," "comprises," "comprising," "include," "includes" 및 "including"에 대응)이라는 표현은 제한하려는 의도가 아니다.

본원 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 단수 형태(영문 "a", "an" 및 "the"에 대응)는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수 대상을 포함한다. 또한 청구범위는 임의의 선택적 요소를 배제하도록 작성될 수 있음에 유의한다. 이와 같이, 이러한 언급은 청구항 요소의 기재 또는 "부정적" 한정의 사용과 관련하여 "오직", "~만" 등과 같은 배타적 용어의 사용에 대한 선행 근거로서 역할을 하도록 의도된다.

본원에서 사용되는 용어 "포함하는(including, comprising)", "함유하는(containing)"은 개방적이고 비제한적인 의미로 사용된다.

보다 간결한 설명을 제공하기 위해, 본원에서 제공되는 정량적 표현의 일부는 용어 "약"으로 수식되지 않는다. 용어 "약"이 명시적으로 사용되는지 여부에 관계없이, 본원에서 제공되는 모든 양은 실제 주어진 값을 지칭하도록 의도되며, 또한 이러한 주어진 값에 대한 실험 및/또는 측정 조건으로 인한 등가치 및 근사치를 포함하여 당업계의 통상적인 기술에 기초하여 합리적으로 추론될 그러한 주어진 값에 대한 근사치를 지칭하도록 의도된다는 것이 이해된다. 수율이 백분율로 제공될 때마다, 이러한 수율은 특정 화학양론적 조건 하에 얻어질 수 있는 동일한 실체(entity)의 최대 양에 대해 수율이 주어지는 실체의 질량을 지칭한다. 백분율로 주어지는 농도는 다르게 지시되지 않는 한 질량 비율을 지칭한다.

4.1 정의

본원에서 사용되는 다음 용어 및 어구는 다음 의미를 갖는 것으로 의도된다.

그 자체로 또는 다른 치환기의 일부로서 "알킬"은 모 알칸, 알켄 또는 알킨의 단일 탄소 원자로부터 하나의 수소 원자를 제거함으로써 유도되는, 언급된 수의 탄소 원자(즉, C1-C6은 1 내지 6개의 탄소 원자를 의미함)를 갖는 포화 또는 불포화된 분지형, 직쇄 또는 환형 1가 탄화수소 라디칼을 지칭한다. 전형적인 알킬기는 메틸; 에틸, 예컨대 에타닐, 에테닐, 에티닐; 프로필, 예컨대 프로판-1-일, 프로판-2-일, 시클로프로판-1-일, 프로프-1-엔-1-일, 프로프-1-엔-2-일, 프로프-2-엔-1-일, 시클로프로프-1-엔-1-일; 시클로프로프-2-엔-1-일, 프로프-1-인-1-일, 프로프-2-인-1-일 등; 부틸, 예컨대 부탄-1-일, 부탄-2-일, 2-메틸-프로판-1-일, 2-메틸-프로판-2-일, 시클로부탄-1-일, 부트-1-엔-1-일, 부트-1-엔-2-일, 2-메틸-프로프-1-엔-1-일, 부트-2-엔-1-일, 부트-2-엔-2-일, 부타-1,3-디엔-1-일, 부타-1,3-디엔-2-일, 시클로부트-1-엔-1-일, 시클로부트-1-엔-3-일, 시클로부타-1,3-디엔-1-일, 부트-1-인-1-일, 부트-1-인-3-일, 부트-3-인-1-일 등; 기타를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 수준의 포화가 의도되는 경우, 명명법 "알카닐", "알케닐" 및/또는 "알키닐"이 아래에 정의된 바와 같이 사용된다. 본원에서 사용되는 "저급 알킬"은 (C1-C8) 알킬을 의미한다.

그 자체로 또는 다른 치환기의 일부로서 "알카닐"은 모 알칸의 단일 탄소 원자로부터 하나의 수소 원자를 제거함으로써 유도되는 포화된 분지형 직쇄 또는 환형 알킬을 지칭한다. 전형적인 알카닐기는 메탄일; 에탄일; 프로판일, 예컨대 프로판-1-일, 프로판-2-일(이소프로필), 시클로프로판-1-일 등; 부탄일, 예컨대 부탄-1-일, 부탄-2-일(sec-부틸), 2-메틸-프로판-1-일(이소부틸), 2-메틸-프로판-2-일(t-부틸), 시클로부탄-1-일 등; 기타를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본원에서 사용되는 "저급 알카닐"은 (C1-C8) 알카닐을 의미한다.

그 자체로 또는 다른 치환기의 일부로서 "알케닐"은 모 알켄의 단일 탄소 원자로부터 하나의 수소 원자를 제거함으로써 유도되는 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 불포화된 분지형 직쇄 또는 환형 알킬을 지칭한다. 기는 이중 결합(들)에 대해 시스 또는 트랜스 형태일 수 있다. 전형적인 알케닐기는 에테닐; 프로페닐, 예컨대 프로프-1-엔-1-일, 프로프-1-엔-2-일, 프로프-2-엔-1-일, 프로프-2-엔-2-일, 시클로프로프-1-엔-1-일; 시클로프로프-2-엔-1-일; 부테닐, 예컨대 부트-1-엔-1-일, 부트-1-엔-2-일, 2-메틸-프로프-1-엔-1-일, 부트-2-엔-1-일, 부트-2-엔-2-일, 부타-1,3-디엔-1-일, 부타-1,3-디엔-2-일, 시클로부트-1-엔-1-일, 시클로부트-1-엔-3-일, 시클로 부타-1,3-디엔-1-일 등; 기타를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본원에서 사용되는 "저급 알케닐"은 (C2-C8) 알케닐을 의미한다.

그 자체로 또는 다른 치환기의 일부로서 "알키닐"은 모 알킨의 단일 탄소 원자로부터 하나의 수소 원자를 제거함으로써 유도되는 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 불포화된 분지형 직쇄 또는 환형 알킬을 지칭한다. 전형적인 알키닐기는 에티닐; 프로피닐, 예컨대 프로프-1-인-1-일, 프로프-2-인-1-일 등; 부티닐, 예컨대 부트-1-인-1-일, 부트-1-인-3-일, 부트-3-인-1-일 등; 기타를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본원에서 사용되는 "저급 알키닐"은 (C2-C8) 알키닐을 의미한다.

그 자체로 또는 다른 치환기의 일부로서 "알킬디일"은 모 알칸, 알켄 또는 알킨의 2개의 상이한 탄소 원자들의 각각으로부터 하나의 수소 원자를 제거하거나 모 알칸, 알켄 또는 알킨의 단일 탄소 원자로부터 2개의 수소 원자를 제거함으로써 유도되는, 언급된 수의 탄소 원자(즉, C1-C6은 1 내지 6개의 탄소 원자를 의미함)를 갖는 포화 또는 불포화된 분지형, 직쇄 또는 환형 2가 탄화수소기를 지칭한다. 2개의 1가 라디칼 중심 또는 2가 라디칼 중심의 각 원자가는 동일하거나 상이한 원자와 결합을 형성할 수 있다. 전형적인 알킬디일기는 메탄디일; 에틸디일, 예컨대 에탄-1,1-디일, 에탄-1.2-디일, 에텐-1,1-디일, 에텐-1,2-디일; 프로필디일. 예컨대 프로판-1,1-디일, 프로판-1,2-디일, 프로판-2,2-디일, 프로판-1,3-디일, 시클로프로판-1,1-디일, 시클로프로판-1,2-디일, 프로프-1-엔-1,1-디일, 프로프-1-엔-1,2-디일, 프로프-2-엔-1,2-디일, 프로프-1-엔-1,3-디일, 시클로프로프-1-엔-1,2-디일, 시클로프로프-2-엔-1,2-디일, 시클로프로프-2-엔-1,1-디일, 프로프-1-인-1,3-디일 등; 부틸디일, 예컨대 부탄-1-디일, 부탄-1,2-디일, 부탄-1,3-디일, 부탄-1,4-디일, 부탄-2,2-디일, 2-메틸-프로판-1,1-디일, 2-메틸-프로판-1,2-디일, 시클로부탄-1,1-디일; 시클로부탄-1,2-디일, 시클로부탄-1,3-디일, 부트-1-엔-1,1-디일, 부트-1-엔-1,2-디일, 부트-1-엔-1,3-디일, 부트-1-엔-1,4-디일, 2-메틸-프로프-1-엔-1,1-디일, 2-메타닐리덴-프로판-1,1-디일, 부타-1,3-디엔-1,1-디일, 부타-1,3-디엔-1,2-디일, 부타-1,3-디엔-1,3-디일, 부타-1,3-디엔-1,4-디일, 시클로부트-1-엔-1,2-디일, 시클로부트-1-엔-1.3-디일, 시클로부트-2-엔-1,2-디일, 시클로부타-1,3-디엔-1,2-디일, 시클로부타-1,3-디엔-1,3-디일, 부트-1-인-1,3-디일, 부트-1-인-1,4-디일, 부타-1,3-디인-1,4-디일 등; 기타를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 수준의 포화가 의도되는 경우, 명명법 알카닐디일, 알케닐디일 및/또는 알키닐디일이 사용된다. 두 원자가가 동일한 탄소 원자 상에 있다는 것이 특별히 의도되는 경우, 명명법 "알킬리덴"이 사용된다. 일부 실시형태에서, 알킬디일기는 (C1-C8) 알킬디일이다. 특정 실시형태는 라디칼 중심이 말단 탄소에 있는 포화된 비환형 알카닐디일기, 예를 들어 메탄디일(메타노); 에탄-1,2-디일(에타노); 프로판-1,3-디일(프로파노); 부탄-1,4-디일(부타노); 등을 포함한다(아래에 정의된 알킬레노스라고도 함). 본원에서 사용되는 "저급 알킬디일"은 (C1-C8) 알킬디일을 의미한다.

그 자체로 또는 다른 치환기의 일부로서 "알킬렌"은 직쇄 또는 분지형 모 알칸, 알켄 또는 알킨의 2개의 말단 탄소 원자들의 각각으로부터 하나의 수소 원자를 제거함으로써, 또는 모 시클로알킬의 2개의 상이한 고리 원자들의 각각으로부터 하나의 수소 원자를 제거함으로써 유도되는 2개의 말단 1가 라디칼 중심을 갖는 직쇄 포화 또는 불포화 알킬디일기를 지칭한다. 존재하는 경우 특정 알킬렌에서의 이중 결합 또는 삼중 결합의 위치는 대괄호로 표시된다. 전형적인 알킬렌기는 메틸렌(메타노); 에틸렌, 예컨대 에타노, 에테노, 에티노; 프로필렌, 예컨대 프로파노, 프로프[1]에노, 프로파[1,2]디에노, 프로프[1]이노 등; 부틸렌, 예컨대 부타노, 부트[1]에노, 부트[2]에노, 부타[1,3]디에노, 부트[1]이노, 부트[2]이노, 부타[1,3]디이노 등; 기타를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 수준의 포화가 의도되는 경우, 명명법 알카노, 알케노 및/또는 알키노가 사용된다. 일부 실시형태에서, 알킬렌기는 (C1-C8) 또는(C1-C3) 알킬렌이다. 특정 실시형태는 직쇄 포화 알카노기, 예를 들어, 메타노, 에타노, 프로파노, 부타노 등을 포함한다. 본원에서 사용되는 "저급 알킬렌"은 (C1-C8) 알킬렌을 의미한다.

그 자체로 또는 다른 치환기의 일부로서 "헤테로알킬", "헤테로알카닐", "헤테로알케닐", "헤테로알키닐", "헤테로알킬디일" 및 "헤테로알킬렌"은 각각 알킬, 알카닐, 알케닐, 알키닐, 알킬디일 및 알킬렌 기를 지칭하며, 여기서 탄소 원자들 중 하나 이상은 각각 독립적으로 동일하거나 상이한 헤테로원자 또는 헤테로원자기로 대체된다. 탄소 원자를 대체할 수 있는 전형적인 헤테로원자 및/또는 헤테로원자기는 -O-, -S-, -S-O-, -NR′-, -PH-, -S(O)-, -SO2-, -S(O)NR′-, -SO2NR′- 등, 이들의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않으며, R'는 수소 또는 치환기, 예를 들어 (C1-C8) 알킬, (C6-C14) 아릴 또는 (C7-C20) 아릴알킬이다.

그 자체로 또는 다른 치환기의 일부로서 "시클로알킬" 및 "헤테로시클로알킬"은 각각 "알킬" 및 "헤테로알킬"기의 환형 버전을 지칭한다. 헤테로알킬기의 경우, 헤테로원자는 분자의 나머지 부분에 부착된 위치를 차지할 수 있다. 전형적인 시클로알킬기는 시클로프로필; 시클로부틸, 예컨대 시클로부타닐 및 시클로부테닐; 시클로펜틸, 예컨대 시클로펜타닐 및 시클로펜테닐; 시클로헥실, 예컨대 시클로헥사닐 및 시클로헥세닐; 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 전형적인 헤테로시클로알킬기는 테트라하이드로푸라닐(예를 들어, 테트라하이드로푸란-2-일, 테트라하이드로푸란-3-일 등), 피페리디닐(예를 들어, 피페리딘-1-일, 피페리딘-2-일 등), 모르폴리닐(예를 들어, 모르폴린-3-일, 모르폴린-4-일 등), 피페라지닐(예를 들어, 피페라진-1-일, 피페라진-2-일 등) 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

"모 방향족 고리 시스템"은 공액 π 전자 시스템을 갖는 불포화된 환형 또는 다환형 고리 시스템을 지칭한다. "모 방향족 고리 시스템"의 정의에는, 고리들 중 하나 이상이 방향족이고 고리들 중 하나 이상이 포화 또는 불포화된 융합 고리 시스템, 예를 들어 플루오렌, 인단, 인덴, 페날렌, 테트라하이드로나프탈렌 등이 특히 포함된다. 전형적인 모 방향족 고리 시스템은 아세안트릴렌, 아세나프틸렌, 아세페난트릴렌, 안트라센, 아줄렌, 벤젠, 크리센, 코로넨, 플루오란텐, 플루오렌, 헥사센, 헥사펜, 헥실렌, 인다센, s-인다센, 인단, 인덴, 나프탈렌, 옥타센, 옥타펜, 옥타렌, 오발렌, 펜타센, 펜탈렌, 펜타펜, 페릴렌, 페날렌, 페난트렌, 피센, 플레이아덴, 피렌, 피란트렌, 루비센, 테트라하이드로나프탈렌, 트리페닐렌, 트리나프탈렌 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

그 자체로 또는 다른 치환기의 일부로서 "아릴"은 모 방향족 고리 시스템의 단일 탄소 원자로부터 하나의 수소 원자를 제거함으로써 유도되는 언급된 수의 탄소 원자(즉, C6-C14는 6 내지 14개의 탄소 원자를 의미함)를 갖는 1가 방향족 탄화수소기를 지칭한다. 전형적인 아릴기는 아세안트릴렌, 아세나프틸렌, 아세페난트릴렌, 안트라센, 아줄렌, 벤젠, 크리센, 코로넨, 플루오란텐, 플루오렌, 헥사센, 헥사펜, 헥실렌, as-인다센, s-인다센, 인단, 인덴, 나프탈렌, 옥타센, 옥타펜, 옥타렌, 오발렌, 펜타센, 펜탈렌, 펜타펜, 페릴렌, 페날렌, 페난트렌, 피센, 플레이아덴, 피렌, 피란트렌, 루비센, 트리페닐렌, 트리나프탈렌 등, 또한 이들의 다양한 하이드로 이성질체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특정의 예시적인 아릴은 페닐 및 나프틸을 포함한다.

그 자체로 또는 다른 치환기의 일부로서 "아릴알킬"은 탄소 원자, 일부 실시형태에서 말단 또는 sp3 탄소 원자에 결합된 수소 원자들 중 하나가 아릴기로 대체된 비환형 알킬기를 지칭한다. 전형적인 아릴알킬기는 벤질, 2-페닐에탄-1-일, 2-페닐에텐-1-일, 나프틸메틸, 2-나프틸에탄-1-일, 2-나프틸레텐-1-일, 나프토벤질, 2-나프토페닐에탄-1-일 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 특정 포화도를 갖는 알킬 모이어티가 의도되는 경우, 명명법 아릴알카닐, 아릴알케닐 및/또는 아릴알키닐이 사용된다. 예를 들어 (C7-C20) 아릴알킬과 같이 정의된 수의 탄소 원자가 언급될 때, 그 수는 아릴알킬기를 이루는 탄소 원자의 총 수를 지칭한다.

"모 헤테로방향족 고리 시스템"은 하나 이상의 탄소 원자가 각각 독립적으로 동일하거나 상이한 헤테로원자 또는 헤테로원자기로 대체되는 모 방향족 고리 시스템을 지칭한다. 탄소 원자를 대체하기 위한 전형적인 헤테로원자 또는 헤테로원자기는 N, NH, P, O, S, S(O), SO2, Si 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. "모 헤테로방향족 고리 시스템"의 정의에는, 고리들 중 하나 이상이 방향족이고 고리들 중 하나 이상이 포화 또는 불포화된 융합 고리 시스템, 예를 들어 벤조디옥산, 벤조푸란, 크로만, 크로멘, 인돌, 인돌린, 크산텐 등이 특히 포함된다. "모 헤테로방향족 고리 시스템"의 정의에는, 또한 예를 들어 벤조피론 및 1-메틸-1,2,3,4-테트라졸과 같은 일반적인 치환기를 포함하는 고리로 인식되는 것들이 포함된다. 전형적인 모 헤테로방향족 고리 시스템은 아크리딘, 벤즈이미다졸, 벤즈이속사졸, 벤조디옥산, 벤조디옥솔, 벤조푸란, 벤조피론, 벤조티아디아졸, 벤조티아졸, 벤조트리아졸, 벤족사신, 벤족사졸, 벤족사졸린, 카르바졸, β-카르볼린, 크로만, 크로멘, 신놀린, 푸란, 이미다졸, 인다졸, 인돌, 인돌린, 인돌리진, 이소벤조푸란, 이소크로멘, 이소인돌, 이소인돌린, 이소퀴놀린, 이소티아졸, 이속사졸, 나프티리딘, 옥사디아졸, 옥사졸, 페리미딘, 페난트리딘, 페난트롤린, 페나진, 프탈라진, 프테리딘, 퓨린, 피란, 피라진, 피라졸, 피리다진, 피리딘, 피리미딘, 피롤, 피롤리진, 퀴나졸린, 퀴놀린, 퀴놀리진, 퀴녹살린, 테트라졸, 티아디아졸, 티아졸, 티오펜, 트리아졸, 크산텐 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

그 자체로 또는 다른 치환기의 일부로서 "헤테로아릴"은 모 헤테로방향족 고리 시스템의 단일 원자로부터 하나의 수소 원자를 제거함으로써 유도되는 언급된 수의 고리 원자(예를 들어, "5-14원"은 5 내지 14개의 고리 원자를 의미함)를 갖는 1가 헤테로방향족기를 지칭한다. 전형적인 헤테로아릴기는 아크리딘, 벤즈이미다졸, 벤즈이속사졸, 벤조디옥산, 벤조디악솔, 벤조푸란, 벤조피론, 벤조티아디아졸, 벤조티아졸, 벤조트리아졸, 벤족사신, 벤족사졸, 벤족사졸린, 카르바졸, β-카르볼린, 크로만, 크로멘, 신놀린, 푸란, 이미다졸, 인다졸, 인돌, 인돌린, 인돌리진, 이소벤조푸란, 이소크로멘, 이소인돌, 이소인돌린, 이소퀴놀린, 이소티아졸, 이속사졸, 나프티리딘, 옥사디아졸, 옥사졸, 페리미딘, 페난트리딘, 페난트롤린, 페나진, 프탈라진, 프테리딘, 퓨린, 피란, 피라진, 피라졸, 피리다진, 피리딘, 피리미딘, 피롤, 피롤리진, 퀴나졸린, 퀴놀린, 퀴놀리진, 퀴녹살린, 테트라졸, 티아디아졸, 티아졸, 티오펜, 트리아졸, 크산텐 등, 또한 이들의 다양한 하이드로 이성질체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

그 자체로 또는 다른 치환기의 일부로서 "헤테로아릴알킬"은 탄소 원자, 일부 실시형태에서 말단 또는 sp3 탄소 원자에 결합된 수소 원자들 중 하나가 헤테로아릴기로 대체된 비환형 알킬기를 지칭한다. 특정 포화도를 갖는 알킬 모이어티가 의도되는 경우, 명명법 헤테로아릴알카닐, 헤테로아릴알케닐 및/또는 헤테로아릴알키닐이 사용된다. 예를 들어 6-20원 헤테로아릴알킬과 같이 정의된 수의 탄소 원자가 언급될 때, 그 수는 아릴알킬기를 이루는 원자의 총 수를 지칭한다.

그 자체로 또는 다른 치환기의 일부로서 "할로알킬"은 수소 원자들 중 하나 이상이 할로겐으로 대체된 알킬기를 지칭한다. 따라서, 용어 "할로알킬"은 모노할로알킬, 디할로알킬, 트리할로알킬 등 퍼할로알킬까지 포함하도록 의도된다. 예를 들어, "(C1-C2) 할로알킬"이라는 표현은 플루오로메틸, 디플루오로메틸, 트리플루오로메틸, 1-플루오로에틸, 1,1-디플루오로에틸, 1,2-디플루오로에틸, 1,1,1-트리플루오로에틸, 퍼플루오로 에틸 등을 포함한다.

위에서 정의된 기는 추가의 잘 알려진 치환기를 생성하기 위해 당업계에서 일반적으로 사용되는 접두사 및/또는 접미사를 포함할 수 있다. 비제한적인 특정 예로서, "알킬옥시" 및/또는 "알콕시"는 화학식 -OR"의 기를 지칭하고, "알킬 아민"은 화학식 -NHR"의 기를 지칭하고, "디알킬아민"은 화학식 -NR"R"의 기를 지칭하며, 여기서 각각의 R"은 알킬이다.

본원에서 사용되는 "DNA"는 게놈 DNA, cDNA, 분리된 핵산 분자, 벡터 DNA 및 염색체 DNA와 같은 당업계에서 이해되는 다양한 형태의 데옥시리보핵산을 지칭한다. "핵산"은 임의의 형태의 DNA 또는 RNA(리보핵산)를 지칭한다. 본원에서 사용되는 용어 "분리된 핵산 분자"는 고유 환경으로부터 제거된 핵산 분자(DNA 또는 RNA)를 지칭한다. 분리된 핵산 분자의 일부 예는 벡터에 함유된 재조합 DNA 분자,

이종 숙주 세포에서 유지되는 재조합 DNA 분자, 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 핵산 분자, 및 합성 DNA 분자이다. "분리된" 핵산은 핵산이 유래된 유기체의 게놈 DNA에서 핵산에 자연적으로 측면 위치하는 서열(즉, 핵산의 5' 및 3' 말단에 위치한 서열)이 없을 수 있다. 더욱이, cDNA 분자와 같은 "분리된" 핵산 분자는 재조합 기술에 의해 생산될 때 다른 세포 물질 또는 배양 배지가 실질적으로 없거나, 화학적으로 합성될 때 화학적 전구체 또는 다른 화학 물질이 실질적으로 없을 수 있다.

"짧은 탠덤(tandem) 반복" 또는 "STR" 유전자 자리는 짧고 반복적인 서열 요소를 함유하는 게놈 DNA의 영역을 지칭한다. 반복되는 서열 요소는 제한되지 않지만 일반적으로 3 내지 7개의 염기쌍 길이이다. 각 시퀀스 요소는 STR 내에서 적어도 1회 반복되며 본원에서 "반복 단위"로 지칭된다. 용어 STR은 또한 하나 초과의 반복 단위가 탠덤으로 또는 개재 염기와 함께 반복되고, 단 서열들 중 적어도 하나가 탠덤으로 적어도 2회 반복되는 게놈 DNA의 영역을 포함한다.

"다형성(Polymorphic) 짧은 탠덤 반복 유전자 자리"는 게놈 DNA의 특정 영역에서 반복적인 서열 요소의 수(및 서열의 순 길이)가 대립유전자에서 대립유전자로, 그리고 개체(individual)에서 개체로 변하는 STR 유전자 자리를 지칭한다.

본원에서 사용되는 "대립유전자 래더(ladder)"는 유전자 자리로부터 증폭된 대립유전자로 구성된 표준 크기 마커를 지칭한다. "대립유전자"는 DNA 세그먼트와 관련된 유전적 변이, 즉, 동일한 유전자 자리를 차지하는 DNA 서열의 2개 이상의 교대(alternate) 형태들 중 하나를 지칭한다.

"생화학적 명명법"은 뉴클레오티드 염기가 아데닌(A), 티민(T), 구아닌(G) 및 시토신(C)으로 지정되는 본원에서 사용되는 표준 생화학적 명명법을 지칭한다. 상응하는 뉴클레오티드는 예를 들어 데옥시구아노신-5'ㆍ 트리포스페이트(dGTP)이다.

"DNA 다형성(polymorphism)"은 DNA 서열에서 2개 이상의 상이한 뉴클레오티드 서열이 동일한 교배 집단에서 공존하는 상태를 지칭한다.

"자리" 또는 "유전자 자리"는 염색체 상의 특정 물리적 위치를 지칭한다. 유전자 자리의 대립유전자는 상동 염색체 상의 동일한 부위에 위치한다.

"자리-특이적 프라이머"는 적어도 자리의 하나의 대립유전자에 대해 언급된 자리 또는 그의 상보적 가닥의 일부와 특이적으로 혼성화하고 증폭 방법에 사용된 조건 하에서 다른 DNA 서열과 효율적으로 혼성화하지 않는 프라이머를 지칭한다.

"폴리머라제 연쇄 반응" 또는 "PCR"은 변성, 프라이머에 의한 어닐링 및 DNA 폴리머라제 효소에 의한 확장의 반복 주기를 사용하여 표적 DNA 서열의 복제 수를 약 10⁶배 이상 증폭시키는 기술을 지칭한다. 핵산 증폭을 위한 PCR 프로세스는 미국 특허 제4,683,195호 및 제4,683,202호에 의해 다루어지며, 이는 프로세스의 설명을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 임의의 PCR을 위한 반응 조건은 반응의 화학적 성분과 그 농도, 반응 사이클에 사용되는 온도, 반응 사이클의 수 및 반응 사이클 단계 지속기간을 포함한다.

본원에서 사용되는 "증폭"은 특정 뉴클레오티드 서열의 양을 효소적으로 증가시키는 프로세스를 지칭한다. 이 증폭은 제한되지 않지만 일반적으로 PCR에 의해 수행된다. 본원에서 사용되는 "변성"은 어닐링된 상태로부터 2개의 상보적 뉴클레오티드 가닥의 분리를 지칭한다. 변성은 예를 들어 완충액의 이온 강도, 온도 또는 염기 쌍 상호작용을 방해하는 화학 물질과 같은 여러 요인에 의해 유도될 수 있다. 본원에서 사용되는 "어닐링"은 뉴클레오티드 가닥들 사이의 특이적 상호작용을 지칭하며, 여기서 가닥은 왁슨-크릭(Watson-Crick) 염기 쌍에 의해 결정되는 가닥들 간의 상보성에 기초하여 실질적으로 서로 결합한다. 어닐링이 발생하기 위해 상보성이 100%일 필요는 없다. 본원에서 사용되는 "확장(extension)"은 프라이머 올리고뉴클레오티드 및 표적 핵산이 어닐링된 후의 증폭 주기를 지칭하며, 여기서 폴리머라제 효소는 복제 주형(template)으로서 표적 핵산을 사용하여 적절한 크기의 단편으로 프라이머 확장을 수행한다.

"프라이머"는 프라이머의 3' 말단이 DNA 폴리머라제를 사용하여 중합 및 확장의 부위로서 작용할 수 있는 방식으로 유전자 자리의 DNA 가닥과 혼성화하는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 또는 DNA 단편을 지칭한다. "프라이머 쌍"은 증폭될 DNA 서열의 한쪽 끝에서 단일 가닥에 혼성화하는 프라이머 1, 및 증폭될 DNA 서열의 상보적 가닥에서 다른 끝과 혼성화하는 프라이머 2를 포함하는 2개의 프라이머를 지칭한다. "프라이머 부위"는 프라이머가 혼성화하는 표적 DNA의 영역을 지칭한다.

"유전적 마커"는 일반적으로 분석에 관심이 있는 특성을 가진 게놈 DNA의 대립유전자, 예컨대 DNA 타이핑이며, 여기서 개체는 DNA의 변이에 기초하여 분화된다. 대부분의 DNA 타이핑 방법은 개체군(population)에서 적어도 두 가지 다른 형태 또는 대립유전자로 나타나는 것으로 알려진 DNA 마커의 하나 이상의 영역의 길이 및/또는 서열 차이를 검출하고 분석하도록 설계된다. 이러한 변이는 "다형성"으로 지칭되며, 이러한 변이가 발생하는 임의의 DNA 영역은 "다형성 유전자 자리"로 지칭된다. DNA 타이핑을 수행하기 위한 하나의 가능한 방법은 PCR 증폭 기술(KB Mullis, 미국 특허 제4,683,202호)과 길이 변이 다형성 분석을 결합하는 것을 포함한다. PCR은 전통적으로 오직 비교적 작은 DNA 세그먼트를 안정적으로 증폭하기 위해, 즉 오직 길이가 3,000 염기 미만인 DNA 세그먼트를 증폭하기 위해 사용될 수 있었다(M. Ponce and L. Micol (1992), NAR 20(3):623; R. Decorte et al. (1990), DNA CELL BIOL 9(6):461 469). 짧은 탠덤 반복(STR), 탠덤 반복의 미니 위성 및 가변 수(VNTR)는 길이 변화 다형성의 일부 예이다. 미니 위성 또는 VNTR을 함유하는 DNA 세그먼트는 일반적으로 PCR에 의해 안정적으로 증폭되기에는 너무 길다. 대조적으로, 약 3 내지 7개의 뉴클레오티드의 반복 단위를 함유하는 STR은 증폭 프로토콜이 DNA의 다른 가변 길이 영역에서 가능한 것보다 더 작은 생성물을 생성하도록 설계될 수 있기 때문에 PCR 적용에서 유전적 마커로서 유용할만큼 충분히 짧다.

본원에서 사용되는 용어 "키트"는 물질을 전달하기 위한 임의의 전달 시스템을 지칭한다. 반응 분석의 맥락에서, 이러한 전달 시스템은 반응 시약(예를 들어, 적절한 용기에 올리고뉴클레오티드, 효소, 프라이머 세트(들) 등) 및/또는 지지 물질(예를 들어, 버퍼, 분석을 수행하기 위한 서면 지침 등)의 한 위치에서 다른 위치로의 저장, 운반 또는 전달을 허용하는 시스템을 포함한다. 예를 들어, 키트는 관련 반응 시약 및/또는 지지 물질을 함유하는 하나 이상의 인클로저(예를 들어, 상자)를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "단편화된(fragmented) 키트"는 각각 전체 키트 구성요소의 하위 부분(subportion)을 포함하는 2개 이상의 별도 용기를 포함하는 전달 시스템을 지칭한다. 용기는 함께 또는 별도로 의도된 수령자(recipient)에게 전달될 수 있다. 예를 들어, 제1 용기는 분석에 사용하기 위한 효소를 함유할 수 있는 한편 제2 용기는 올리고뉴클레오이드를 함유한다. 실제로, 각각 전체 키트 구성요소의 하위 부분을 포함하는 2개 이상의 별도 용기를 포함하는 임의의 전달 시스템은 "단편화된 키트"라는 용어에 포함된다. 대조적으로, "결합된 키트"는 단일 용기(예를 들어, 각각의 원하는 구성요소를 수용하는 단일 박스)에 반응 분석의 모든 구성요소를 함유하는 전달 시스템을 지칭한다. 용어 "키트"는 단편화된 및 결합된 키트 모두를 포함한다.

4.2 예시적인 실시형태

본 개시내용은 로다민 염료를 포함하는 표지 모이어티를 갖는 올리고뉴클레오티드를 화학적으로 합성하는데 사용될 수 있는 시약을 제공한다. 전통적으로, 올리고뉴클레오티드의 단계적 화학적 합성에 일반적으로 사용되는 합성 및/또는 탈보호 조건에 안정적인 로다민 함유 합성 시약의 가용성(availability) 부족에 부분적으로 기인하여, 로다민-표지된 올리고뉴클레오티드를 화학적으로 합성하는 것은 어려웠다. 이제, 아세틸기와 같은 염기-불안정한 보호기로 NH-로다민 염료의 외향고리(exocyclic) 아민기를 보호하면 올리고뉴클레오티드의 고체상 합성에 일반적으로 사용되는 화학 합성 및 탈보호 조건에 안정적인 N-보호된 NH-로다민 염료가 제공된다는 것이 밝혀졌다. 결과적으로, N-보호된 NH-로다민은 로다민 염료를 포함하는 표지 모이어티로 표지된 올리고뉴클레오티드를 합성하는 데 사용될 수 있는 시약에 혼입될 수 있고, 이에 의해 합성 후 표지를 부착할 필요가 없다. 표지는 합성 중에 부착되기 때문에, 생성된 표지된 올리고뉴클레오티드는 HPLC의 사용없이 사용하기 위해 정제될 수 있다.

시약은 올리고뉴클레오티드의 단계적 고체상 합성에 대해 잘 알려진 시약 및 화학의 다양한 특징을 활용하며, 올리고뉴클레오티드 사슬의 단계적 고체상 합성 동안 히드록실기에 결합되는 합성 시약의 형태, 또는 합성 올리고뉴클레오티드를 생성하기 위해 뉴클레오시드 포스포라미다이트 시약 및/또는 선택적으로 다른 시약과 같은 뉴클레오시드 단량체 시약이 단계적 방식으로 결합되는 고체 지지체 시약의 형태일 수 있다.

합성 및 고체 지지체 시약은 뉴클레오시드 모이어티를 포함할 수 있다는 점에서 본질적으로 뉴클레오시드성일 수 있거나, 본질적으로 비-뉴클레오시드성일 수 있다.

본원에 기재된 모든 시약은 N-보호된 NH-로다민 염료 또는 모이어티를 포함하는 표지 모이어티를 포함한다. N-보호된 NH-로다민 염료는 표지 모이어티를 포함하는 유일한 염료일 수 있거나, 또는 대안적으로 더 큰 염료 네트워크를 포함하는 둘 이상의 염료들 중 하나일 수 있다. 고체 지지체 시약은 추가로 고체 지지체 및 추가 기들이 결합될 수 있는 하나 이상의 합성 핸들을 추가로 포함한다. 합성 시약은 시약을 1차 히드록실기에 결합하는 데 유용한 PEP기를 추가로 포함하고 선택적으로 하나 이상의 합성 핸들을 포함할 수 있다. 시약을 포함하는 다양한 모이어티 및 기는 이들이 각각의 기능을 수행하도록 허용하는 임의의 방식 및/또는 배향으로 함께 연결될 수 있다. 이들은 모이어티에 포함된 연결기를 통해 서로 연결될 수 있거나 링커의 도움으로 서로 연결될 수 있다.

본원에 기재된 시약을 포함하는 다양한 모이어티, 기 및 링커는 아래에서 보다 상세히 설명된다.

4.3 링커 및 연결기

본원에 기재된 시약을 포함하는 다양한 기 및 모이어티는 전형적으로 링커에 의해 서로 연결된다. 임의의 특정 링커의 정체성(identity)은 서로 연결된 모이어티의 정체성에 부분적으로 의존한다. 일반적으로, 링커는 포스파이트 트리에스테르 방법에 의해 올리고뉴클레오티드를 합성하는 데 일반적으로 사용되는 조건과 같은 표지된 올리고뉴클레오티드의 합성에 사용되는 합성 조건에 안정한 원자 또는 작용기의 거의 임의의 조합을 포함할 수 있는 간격(spacing) 모이어티를 포함하며, 선형, 분지형 또는 환형 구조이거나 선형, 분지형 및/또는 환형 구조의 조합을 포함할 수 있다. 간격 모이어티는 본질적으로 단량체성일 수 있거나, 본질적으로 중합체성인 영역일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 간격 모이어티는 특정 조건 하에서 절단될 수 있는 능력, 또는 특정 정도의 강성, 유연성, 소수성 및/또는 친수성과 같은 특정 특성을 갖도록 설계될 수 있다.

아래에서 더 상세히 설명되는 바와 같이, 본원에 기재된 시약의 많은 실시형태는 원하는 시약을 생성하기 위해 특정 방식으로 신톤(synthon)을 서로 축합시킴으로써 합성된다. 각각의 신톤은 전형적으로 원하는 연결을 형성하기에 적합한 하나 이상의 연결기를 포함한다. 일반적으로, 연결기는 공유 결합 Y-Z를 생성하기 위해 다른 작용기 F^z와 반응할 수 있거나 반응할 수 있도록 활성화될 수 있는 작용기 F^y를 포함하며, 여기서 Y는 F^y에 의해 기여된 연결의 부분을, Z는 F^z에 의해 기여된 부분을 나타낸다. 이러한 기 F^y 및 F^z는 본원에서 "상보적 작용기"로 지칭된다.

서로 공유 결합을 형성할 수 있는 상보적 작용기 쌍은 당업계에 잘 알려져 있다. 일부 실시형태에서, F^y 또는 F^z 중 하나는 친핵성 기를 포함하고 F^y 또는 F^z 중 다른 하나는 친전자성 기를 포함한다. 다양한 합성 및 기타 조건에 안정한 연결(또는 연결을 형성하도록 적합하게 활성화되거나 활성화될 수 있는 이의 전구체)을 형성하는 데 유용한 상보적인 친핵성 및 친전자성 기는 당업계에 잘 알려져 있다. 본원에 기재된 다양한 시약에서 연결을 수행하는 데 사용될 수 있는 적합한 상보적 친핵성 및 친전자성 기, 및 그로부터 형성된 결과적인 연결의 예는 하기 표 1에 제공된다:

따라서, 링커 신톤은 일반적으로 화학식 LG-Sp-LG로 기술될 수 있으며, 여기서 각 LG는 서로 독립적으로 연결기를 나타내고 Sp는 간격 모이어티를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 링커 신톤은 화학식 F^z-Sp-F^z로 기술될 수 있으며, 여기서 각각의 F^z는 서로 독립적으로 전술한 바와 같은 상보적 친핵성 또는 친전자성 작용기 쌍 중 하나의 구성원을 나타낸다. 특정 실시형태에서, 각각의 F^z는 서로 독립적으로 상기 표 1에 열거된 기들 중에서 선택된다. 이러한 유형의 링커 신톤은 화학식 -Z-Sp-Z-의 링커 모이어티를 형성하며, 여기서 각각의 Z는 서로 독립적으로 전술한 바와 같은 연결의 일부를 나타낸다. 본원에 기재된 시약에서 특정 기 및 모이어티를 서로 연결하기에 적합한 특정 링커는 시약의 예시적 실시형태와 관련하여 더 자세히 논의될 것이다. 본원에 기재된 시약을 포함하는 다양한 기 및 모이어티를 서로 연결하는 데 사용될 수 있는 링커의 비제한적인 예시적 실시형태가 도 2에 예시되어 있다. 도 2에서, Z¹ 및 Z²는 각각 서로 독립적으로 전술한 바와 같이 작용기 F^z에 의해 기여된 연결의 일부를 나타내고, K는 -CH- 및 -N- 중에서 선택된다. 도 2에 예시된 링커의 일부 특정 실시형태에서. Z¹ 또는 Z² 중 하나는 -NH-이고 다른 하나는 -O-, C(O)- 및 -S(O)₂- 중에서 선택된다.

4.4 표지 모이어티

본원에 기재된 시약은 특정 특성을 갖는 보호기에 의해 외향고리 아민기들 중 하나에서 보호되는 NH-로다민 염료를 포함하는 표지 모이어티를 포함할 수 있다. 일반적으로 로다민 염료는 4개의 주요 특징: (1) 모 크산텐 고리; (2) 외향고리 아민 치환기; (3) 외향고리 이미늄 치환기; 및 (4) 오르토 위치에서 카르복실기로 치환된 페닐기를 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 NH-로다민 염료는 일반적으로 화학식 (Ia)로 기술될 수 있다. 일부 실시형태에서, 외향고리 아민 및/또는 이미늄 기는 전형적으로 모 크산텐 고리의 C3' 및 C6' 탄소 원자에 위치하지만, 모 크산텐 고리가 C3'와 C4'탄소 및/또는 C5'와 C6'탄소에 융합된 벤조기를 포함하는 "확장된" 로다민이 또한 알려져 있다. 이러한 확장된 로다민에서 특징적인 외향고리 아민 및 이미늄 기는 확장된 크산텐 고리의 대응 위치에 위치된다.

카르복실-치환된 페닐기는 모 크산텐 고리의 C1 탄소에 부착된다. 오르토 카르복실 치환기의 결과로, 로다민 염료는 2개의 상이한 형태: (1) 개방된 산 형태; 및 (2) 폐쇄된 락톤 형태로 존재할 수 있다. 임의의 작동 이론에 구속되는 것은 아니지만, 본원에 기재된 예시적인 N-보호된 NH-로다민 염료의 NMR 스펙트럼은 염료의 폐쇄된 스피로 락톤 형태와 일치하기 때문에, 본원에 기재된 시약의 표지 모이어티를 포함하는 N-보호된 NH-로다민 염료는 폐쇄된 스피로 락톤 형태인 것으로 믿어진다. 따라서, 다양한 로다민 및 이들의 보호되지 않은 대응물은 본원에서 폐쇄된 스피로 락톤 형태로 예시된다. 그러나, 이것은 단지 편의를 위한 것이며 본원에 기재된 다양한 시약을 염료의 락톤 형태로 제한하려는 것이 아님을 유의해야 한다. 특정 실시형태에서, 화합물의 개방된 산 형태는 화합물의 폐쇄된 스피로 락톤 형태에 비해 형광성이다(또는 형광 증가를 나타낸다). 본원에 기재된 화합물의 아민기는 폐쇄된 스피로 락톤 형태로 보호 가능하며, 핵산의 고수율 및 고순도 표지화를 위해 포스포라미다이트로 만들어지고 이로서 사용될 수 있다. 따라서, 본원에서는 또한 탈보호된 개방 락톤 형태의 화합물을 포함하는 형광 표지된 핵산 프로브 및 프라이머가 제공된다. 아민기의 탈보호 및 고체 지지체로부터 핵산 프로브의 절단 후 개방 락톤 형태의 대표적인 예가 도 8 및 9에 도시되어 있다.

폐쇄된 스피로 락톤 형태에서, 모 크산텐 고리의 A 및 C 고리는 방향족이며 C3'및 C6' 치환기는 모두 아민이다. 본원에 기재된 표지 모이어티에 포함된 로다민 염료의 외향고리 아민기는 비치환되거나 단일 치환되어 이들 아민기가 1차 또는 2차 아민이 된다. 이러한 로다민 염료는 본원에서 "NH-로다민"으로 지칭된다. 따라서, 본원에 사용되는 "NH-로다민"은 일반적으로 다음의 모 NH-로다민 고리 구조를 포함한다:

상기 식에서 R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁷, R⁸, R⁹, R¹⁰, R¹¹, R¹², R¹³, 및 R¹⁴의 각각은 본원에서 정의된 바와 같다. 위에 묘사된 모 NH-로다민 고리에서, 다양한 탄소 원자는 로다민 염료의 폐쇄된 스피로 락톤 형태에 일반적으로 사용되는 번호 지정(numbering) 규칙으로부터 채택된 임의의 번호 지정 규칙을 사용하여 번호가 지정된다. 이 번호 지정 시스템은 단지 편의를 위해 사용되며 어떤 식으로든 제한적인 것으로 의도되지 않는다.

본원에 기재된 임의의 실시형태에서, 예시적인 표지 모이어티는 화학식 (II.1), (II.2), (II.3), (II.4)

등일 수 있다.

당업자는 본 개시내용이 화학식 (II.1), (II.2) 및 (II.3)의 것들과 같은 화학식 (I) 내의 다른 표지 모이어티를 설명하며, 여기서 R^f와 R^g사이의 선택적 이중 결합은 대안적으로 R^e와 R^f 사이에 있다는 것을 쉽게 이해할 것이다. 또한 당업자는 R^e와 R^f 사이의 이중 결합이 존재하지 않는 경우, 추가 R^d 기가 R^e 및 R^f 각각에 존재할 수 있거나, R^e 및 R^f 상의 추가 기가 H이라는 것을 쉽게 이해할 것이다. 또한, 당업자는 R^h와 Rⁱ 또는 Rⁱ과 R^j 사이의 선택적 이중 결합이 존재할 수 있는 추가 실시형태를 이해할 것이다.

본원에 기재된 구조식 (Ia) 및 다른 식들의 NH-로다민 고리에서, R⁵는 R⁵가 부착된 외향고리 아민을 치환하는 수소 또는 치환기를 나타낸다. 일부 실시형태에서, R⁵는 치환 또는 비치환된 알킬아릴 또는 아릴알킬 기일 수 있다. 일부 실시형태에서, R⁵는 보호기일 수 있다.

일부 실시형태에서, R⁴, R⁹, 및/또는 R¹⁰은 예시된 질소 원자가 5- 또는 6-고리 원자를 함유하는 고리에 포함되도록 인접한 탄소 원자에 가교되는 치환기를 포함할 수 있다. 고리는 포화되거나 불포화될 수 있고, 고리 원자들 중 하나 이상은 치환될 수 있다. 고리 원자(들)가 치환될 때, 치환기는 전형적으로 서로 독립적으로 저급 알킬, C6-C14 아릴 및 C7-C20 아릴알킬 기 중에서 선택된다.

대안적으로, 2개의 인접한 고리 원자는 벤조 또는 나프토 기와 같은 아릴 가교(bridge )에 포함될 수 있다. R⁴, R⁹, 및/또는 R¹⁰ 기가 수소 또는 저급 알킬기인 구조식 (Ia)에 따른 모 NH-로다민 고리를 포함하거나 인접 탄소 원자를 갖는 선택적으로 치환된 고리에 포함되는 로다민 염료의 비제한적인 예시적 실시형태. 구조식 (Ia)에 따른 모 NH 로다민 고리의 C1, C4, C5, C6, C7, C1', C2', C4', C5', C7'및 C8' 위치에서 탄소원자들 중 하나 이상은 서로 독립적으로 비치환되거나 본원에 정의된 치환기로 치환될 수 있다. 그리고, 이들 위치에서 로다민 염료를 대체하는데 유용한 기들은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 미국 특허 제4,622.400호. 미국 특허 제5,750,409호, 미국 특허 제5,847,162호, 미국 특허 제6,017,712호, 미국 특허 제6,080,852호, 미국 특허 제6,184,379호 및 미국 특허 제6,248,884호에 기재되어 있는데, 이들의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.

일부 실시형태에서, 치환기는 서로 독립적으로 저급 알킬, (C6-C14) 아릴, (C7-C20) 아릴알킬, 5-14원 헤테로아릴, 6-20원 헤테로아릴알킬, R^b 및 -(CH₂)_xR^b 중에서 선택되며, 여기서 x는 1 내지 10 범위의 정수이고, R^b는 독립적으로 -X, -OH, -OR^a, -SH, -SR^a -NH₂, -NHR^a, NR^cR^c, N⁺R^cR^cR^c, 퍼할로 저급 알킬, 트리할로메틸, 트리플루오로메틸, -P(O)(OH)₂, P(O)(OR^a)₂, P(O)(OH)(OR^a), -OP(O)(OH)₂, OP(O)(OR^a)₂, -OP(O)(OR^a)(OH), -S(O)₂OH, S(O)₂R^a, -C(O)H, C(O)R^a, -C(S)X, -C(O)OR^a, -C(O)OH, -C(O)NH₂, -C(O)NHR^a, C(O)NR^cR^c, C(S)NH₂, C(O)NHR^a, -C(O)NR^cR^c, -C(NH)NH₂, -C(NH)NHR^a, 및 C(NH)NR^cR^c 중에서 선택되고, 여기서 X는 할로(바람직하게는 플루오로 또는 클로로)이고, 각각의 R^a는 다른 것들과 독립적으로 저급 알킬, (C6-C14) 아릴, (C7-C20) 아릴알킬, 5-14원 헤테로아릴 및 6-20원 헤테로아릴알킬 중에서 선택되고, 각각의 R^c는 다른 것들과 독립적으로 R^a이거나, 또는 대안적으로 동일한 질소 원자에 결합된 2개의 R^c는 그 질소 원자와 함께 취해져, 전형적으로 O, N 및 S 중에서 선택되는 동일하거나 상이한 고리 헤테로원자들 중 하나 이상을 선택적으로 포함할 수 있는 5- 내지 8-원 포화 또는 불포화 고리를 형성할 수 있다. 대안적으로, C1' 및 C2' 치환기, 및/또는 C7' 및 C8' 치환기는 함께 취해져 치환되거나 비치환된 아릴 가교를 형성할 수 있다. 예컨대 벤조 가교, 단, C1' 및 C2' 치환기와 C7' 및 C8' 치환기는 아릴 가교에 동시에 포함되지 않는다. 일부 실시형태에서, C1, C4, C5, C6, C7, C1', C2', C4', C5', C7' 및 C8' 탄소를 대체하는 데 사용되는 기는 로다민 염료의 켄칭(quenching)을 촉진하지 않지만, 일부 실시형태에서 켄칭 치환기가 바람직할 수 있다. 로다민 염료를 켄칭할 수 있는 치환기는 카르보닐, 카르복실레이트, 중금속, 니트로, 브로모 및 요오도를 포함한다. 구조식 (Ia)의 모 NH-로다민 고리의 위치 C4, C5, C6 및 C7의 탄소 원자는 또한 서로 독립적으로 선택적 치환기를 포함할 수 있다. 이들 치환기는 전술한 다양한 치환기들 중에서 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 위치 C4 및 C7의 탄소 원자는 모 NH-로다민 염료가 NH-4,7-디클로로로다민 염료가 되도록 클로로기로 치환된다. 본원에 기재된 시약의 표지 모이어티에 포함될 수 있는 구조식 (Ia)에 따른 모 NH 로다민 고리를 포함하는 수많은 로다민 염료는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 미국 특허 제6,248,884호; 미국 특허 제6,111,116호; 미국 특허 제6,080,852호; 미국 특허 제6,051,719호, 미국 특허 제6,025,505호; 미국 특허 제6,017,712호; 미국 특허 제5,936,087호; 미국 특허 제5,847,162호; 미국 특허 제5,840,999호; 미국 특허 제5,750,409호; 미국 특허 제5,366,860호; 미국 특허 제5,231,191호; 미국 특허 제5,227,487호; 국제공개 WO97/36960호; 국제공개 WO99/27020호; 문헌[Lee et al., 1992, Nucl. Acids Res. 20:2471-2483] 문헌[Arden-Jacob, "Neue Lanwellige Xanthen Farbstoffe fur FluoreszenZSonden und Farbstoff Lauer, Springer-Verlag, Germany, 1993] 문헌[Sauer et al., 1995, Fluorescence 5:247-261] 문헌[Lee et al., 1997, Nucl. Acids Res. 25:2816 2822] 및 문헌[Rosenblum et al., 1997, Nucl. Acids Res. 25:4500 4504]에 기재되어 있으며, 그 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. 외향고리 아민이 본원에 기재된 바와 같은 1차 또는 2차 아민인 이들 참고 문헌에 기재된 임의의 염료, 또는 이러한 NH 로다민 염료의 4,7-디클로로 유사체는 본원에 기재된 시약의 표지 모이어티에 포함될 수 있다.

본원에 기재된 시약은 표지된 올리고뉴클레오티드를 화학적으로 합성하는 데 사용되기 때문에, R⁵는 올리고뉴클레오티드를 합성하는 데 사용되는 유기 합성 조건에 안정한 보호기일 수 있다. 전술한 바와 같이, R⁵는 아미드, 예를 들어 카르복스아미드, 설폰아미드 또는 포스포르아미드 형태의 아민을 보호하는 보호기일 수 있고, 이러한 방식으로 외향고리 아민을 보호하는 것으로서 선택될 수 있으며, 보호된 NH-로다민을 폐쇄된 락톤 형태로 "고정(lock)"시켜 본원에 기재된 시약의 안정성에 기여하는 것으로 믿어진다. 요구되는 것은 아니지만, 합성 올리고뉴클레오티드의 핵 염기의 외향고리 아민을 보호하는 기를 제거하는 데 사용되는 조건 하에서 불안정한 R⁵ 보호기를 사용하여 보호기가 단일 단계로 제거될 수 있도록 하는 것이 편리할 수 있다.

합성 올리고뉴클레오티드의 합성 및 탈보호에 사용되는 조건은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 문헌[Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, Vol. I, Beancage et al., Eds. John Wiley & Sons, 2002]에 기재되어 있으며, 이의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. 간단히 말해서, 포스포라미다이트 시약을 사용하는 합성 방법은 다음의 여러 라운드를 포함한다: (i) 디클로로메탄 중 2.5% 또는 3% 디- 또는 트리-클로로아세트산으로 처리함으로써 수행될 수 있는 유리 히드록실을 나타내기 위한 DMT 탈보호; (ii) 0.45 M 또는 0.5 M 테트라졸을 함유하는 아세토니트릴에서 수행될 수 있는 유리 히드록실에 뉴클레오시드 또는 다른 포스포라미다이트 시약의 커플 링; (iii) I₂/2,6-루티딘/H2O로 처리하여 수행될 수 있는 산화, 및 테트라하이드로푸란(THF) 중 6.5% 아세트산 무수물로 처리한 다음 THF 중 10% 1-메틸이미다졸(MI)로 처리하여 수행될 수 있는 캡핑.

합성에서 다양한 단계를 수행하기 위한 다른 조건이 또한 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 포스포라미다이트 커플링은 0.25 M 5-에틸 티오-1H-테트라 졸, 0.25 M 4,5-디시아노 이미다졸(DCI) 또는 0.25 M 5-벤질티오-1H-테트라졸(BTT)을 함유하는 아세토니트릴에서 수행될 수 있다. 산화는 THF/H₂O/피리딘(7:2:1)에서 0.1 M, 0.05 M 또는 0.02 M I₂에서 수행될 수 있다. 캡핑은 THF/루티딘/아세트산 무수물에 의한 처리에 이어, THF 중 16% NMI로 처리: THF 중 6.5% DMAP로 처리에 이어, THF 중 10% 멜름(melm)으로 처리; 또는 THF 중 10% 멜름으로 처리에 이어, THF 중 16% 멜름으로 처리하여 수행될 수 있다.

합성 시약으로부터 임의의 보호기의 제거 및 절단은 전형적으로 60℃에서 1 내지 12시간 동안 농축 수산화암모늄으로 처리하여 수행될 수 있지만, 실온에서 4 내지 17시간 동안 농축 수산화암모늄에 의한 처리 또는 메탄올 중 0.05 M 탄산칼륨에 의한 처리 또는 HO/EtOH 중 25% t-부틸아민에 의한 처리와 같은 더 온화한 조건에서 제거될 수 있는 기로 보호된 뉴클레오시드 포스포라미다이트 시약이 또한 당업계에 공지되어 있다. 숙련된 기술자는 특정 합성 및 탈보호 및/또는 절단 조건 하에서 사용하기에 적합한 특성을 갖는 보호기를 쉽게 선택할 수 있을 것이다. 다양한 아민 보호기는 예를 들어 문헌[Greene & Wuts, "Protective Groups In Organic Chemistry." 3d Edition, John Wiley & Sons, 1999](이하, "문헌[Green & Wuts]")에 예를 들어 309 내지 405 페이지에 교시되어 있다. 숙련된 기술자는 문헌[Green & Wuts]에 교시된 것들 중에서 적절한 특성을 갖는 보호기 R⁵ 또는 R¹⁰을 쉽게 선택할 수 있다. 일부 실시형태에서, 보호기 R⁵ 또는 R¹⁰은 화학식 -C(O)R¹⁵의 아실기이며, 여기서 R¹⁵는 수소, 저급 알킬, 메틸, -CX₃. -CHX₂. -CH₂X, -CH, O_d, 및 저급 알킬, 메틸, X, OR^d, 시아노 또는 니트로기로 선택적으로 일 치환된 페닐 중에서 선택되며, 여기서 R"는 저급 알킬, 페닐 및 피리딜 중에서 선택되며, 각각의 X는 할로기이고, 전형적으로 플루오로 또는 클로로이다. 일부 실시형태에서, R¹⁵는 메틸이다. 일부 실시형태에서, R¹⁵는 트리플루오로메틸이다. -C(O)R¹⁵에 의해 정의된 것과 같은 아실 보호기는, 당업계에 잘 공지되어 있는 바와 같이 "염기 불안정한" 포스포라미다이트 시약으로 합성된 올리고로부터 보호기를 제거하는 데 사용되는 온화한 조건을 포함하여 다양한 염기성 조건 하에 제거될 수 있다. 일부 실시형태에서, R⁵는 -C(O)R¹⁵이며, 여기서 R¹⁵는 수소, 저급 알킬, -CX₃. -CHX₂. -CH₂X, -CH₂-OR^d, 및 저급 알킬, X, OR^d, 시아노 또는 니트로기로 선택적으로 일 치환된 페닐 중에서 선택되며, 여기서 R^d는 저급 알킬, 페닐 및 피리딜로 구성된 군으로부터 선택되며, 각각의 X는 할로기이다. 사용될 수 있는 예시적인 조건은 위에 명시되어 있다. 이후 섹션에서 더 상세히 설명되는 바와 같이, 표지 모이어티를 포함하는 N-보호된 NH-로다민 모이어티는 다른 기 또는 모이어티에 연결될 수 있다. 예를 들어, N-보호된 NH-로다민은 표지 모이어티를 포함하는 다른 염료, PEP기, 링커, 합성 핸들, 켄칭 모이어티, 염기-쌍 상호작용을 안정화시키는 작용을 하는 모이어티(예를 들어, 삽입(intercalating) 염료 또는 작은-홈-결합(minor-groove-binding) 분자), 또는 다른 모이어티에 연결될 수 있다. 이러한 연결은 전형적으로 시약 합성에 사용되는 N-보호된 NH-로다민 신톤에 부착된 연결기 LG(링커와 관련하여 전술함)를 통해 수행된다.

연결기 LG는 N-보호된 NH-로다민 신톤의 임의의 이용 가능한 탄소 원자 또는 이들 탄소 원자 중 하나에 부착된 치환기에 부착될 수 있다. 연결기의 위치는 N-보호된 NH-로다민 신톤이 부착될 기 또는 모이어티에 부분적으로 의존할 수 있다. 일부 실시형태에서, 연결기는 N-보호된 NH-로다민 신톤의 C1', C2', C4', C5', C7', C8', C5, C6, 또는 C7 위치에서 부착된다. 특정 실시형태에서, 연결기는 C4', C5', C5 또는 C6에서 부착된다.

N-보호된 NH-로다민 신톤은 단일 연결기 LG를 포함할 수 있거나, 하나 초과의 연결기 LG를 포함할 수 있다. 하나 초과의 연결기를 사용하는 실시형태에서, 연결기는 동일하거나 상이할 수 있다. 서로 상이한 다수의 연결기 LG를 포함하는 N-보호된 NH-로다민 신톤은 직교(orthogonal) 화학을 사용하여 모 NH-로다민 고리의 상이한 위치에 부착된 상이한 기 또는 모이어티를 가질 수 있다. 연결기의 정체성은 일부 경우에 모 NH-로다민 고리 상의 위치에 의존할 수 있다. 연결기 LG가 모 NH-로다민 고리의 C4'- 또는 C5'-위치에 부착되는 일부 실시형태에서, 연결기 LG는 화학식 -(CH)_n-F^y의 기이며, 여기서 n은 0 내지 10 범위의 정수이고, F^y는 본원에 기재된 바와 같다. 일부 실시형태에서, n은 1이고 F^y는 -NH이다.

연결기 LG가 모 NH-로다민 고리의 5- 또는 6-위치에서 부착되는 일부 실시형태에서, 연결기 LG는 화학식 (CH₂)_n, -C(O)OR^f의 기이며, 여기서 R^f는 수소 및 양호한 이탈기 중에서 선택되고, n은 이미 정의된 바와 같다. 일부 특정 실시형태에서, 연결기 LG는 NHS 에스테르를 포함한다. 일부 특정 실시형태에서, n은 0이고 R^f는 NHS이다.

전술한 바와 같이, 표지 모이어티는 일단 탈보호되면 N-보호된 NH-로다민이 더 큰 에너지 전달 염료 네트워크의 구성원이 되도록 하나 이상의 추가 염료를 포함할 수 있다. 이러한 에너지 전달 염료 네트워크는 당업계에 잘 알려져 있고, 형광 염료들의 조합을 포함하며, 그들의 스펙트럼 특성이 일치하고/하거나 서로에 대한 상대적 거리가 조정되어, 네트워크의 하나의 형광 염료가 적절한 파장의 입사 조사에 의해 여기될 때 그 여기 에너지를 네트워크의 다른 형광 염료로 전달하고, 이것이 그 다음 그 여기 에너지를 네트워크의 또 다른 형광 염료 등으로 전달하여 네트워크의 최종 수용체 염료에 의한 형광을 발생시킨다. 염료 네트워크는 긴 스토크스 이동(Stoke's shifts)을 갖는 표자 모이어티를 제공한다. 이러한 네트워크에서, 여기 에너지를 네트워크의 다른 형광단으로 전달하거나 기부하는 형광단은 "도너(donor)"로 지칭된다. 다른 형광단으로부터 여기 에너지를 받거나 수용하는 형광단은 "억셉터(acceptor)"로 지칭된다. 단지 2개의 형광 염료를 포함하는 염료 네트워크에서, 하나는 도너 역할을 하고 다른 하나는 억셉터 역할을 한다. 3개 이상의 형광 염료를 포함하는 염료 네트워크에서, 적어도 하나의 염료는 도너와 억셉터 모두의 역할을 한다. 염료 네트워크가 작동하는 방식의 원리, 및 이러한 네트워크를 생성하는 데 적합한 개별 염료를 선택하고 연결하는 기준은 잘 알려져 있으며 예를 들어 문헌[Hung et al., 1997, Anal. Biochem. 252:78-88]에 기재되어 있다.

염료 네트워크를 포함하는 본원에 기재된 표지 모이어티에서, N-보호된 NH-로다민 염료는 일단 탈보호되면 네트워크를 이루는 다른 염료의 정체성 및 원하는 입사 및 형광 파장에 따라 도너 또는 억셉터, 또는 도너와 억셉터 둘 다로서 역할을 할 수 있다. NH-로다민 염료에 대한 도너 및/또는 억셉터로서 사용하기에 적합한 수많은 염료는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 비제한적으로 크산텐 염료(예를 들어, 플루오레세인, 로다민 및 로돌 염료), 피렌 염료, 쿠마린 염료(예를 들어, 히드록시- 및 아미노-쿠마린), 시아닌 염료, 프탈로시아닌 염료 및 란테니드 복합체를 포함한다. 에너지 전달 염료 네트워크의 맥락에서 이러한 염료의 구체적이고 비제한적인 예는 문헌[Hung et al., 1996, Anal. Biochem. 238:165-170] 문헌[Medintz et al., 2004, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 101(26):9612-9617]; 미국 특허 제5,800,996호; 문헌[Sudhaker et al., 2003, Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids 22:1443-1445]; 미국 특허 제 6,358,684호; 문헌[Majumdar et al., 2005, J. Mol. Biol. 351:1123-1145] 문헌[Dietrich et al., 2002, Reviews Mol. Biotechnology. 82(3):211-231] 문헌[Tsuji et al., 2001, Biophysical J. 81(1):501-515] 문헌[Dickson et al., 1995, J. Photochemistry & Photobiology 27(1):3-19] 및 문헌[Kumar et al., 2004, Developments in Nucl. Acid Res. 1:251-274]에 기재되어 있으며, 이들 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 본원에 기재된 원리에 따라 적절하게 보호될 수 있는 임의의 이러한 염료는 염료 네트워크를 이루는 표지 모이어티에서 도너 및 억셉터 염료로서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 네트워크를 이루는 도너 및/또는 억셉터 염료들 중 하나 이상은 본원에 기재된 바와 같은 N-보호된 NH-로다민 염료일 수 있다. 도너 및/또는 억셉터 염료를 로다민 염료에 부착하여 염료 네트워크를 형성하는 특정 위치, 및 이러한 염료를 부착하는 데 유용한 특정 연결 및 링커는 당업계에 잘 알려져 있다. 특정 예는 예를 들어 미국 특허 제6,811,979호; 미국 특허 제6,008,379호; 미국 특허 제5,945,526호; 미국 특허 제5,863,727호; 및 미국 특허 제5,800,996호에 기재되어 있으며, 이의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.

일부 실시형태에서, 도너 및 억셉터 염료를 연결하는 링커는 미국 특허 제6,811,979호에 기재된 바와 같은 음이온성 링커이며, 동 특허의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다(예를 들어, 컬럼 17 25 행 내지 컬럼 18 37 행 및 도 1 내지 17의 개시내용 참조).

본원에 기재된 시약의 일부 실시형태에서, 표지 모이어티는 NH-로다민 염료에 대한 도너 염료를 포함한다. 일부 실시형태에서, 도너 염료는 플루오레세인 또는 로다민 염료, 예를 들어 본원에 기재된 NH-로다민 염료 중 하나이다. 특정 실시형태에서, 도너 염료는 플루오레세인 염료이다. 플루오레세인 염료는 모 크산텐 고리의 3- 및 6-위치(구조식 (Ia)의 NH-로다민 고리의 3'- 및 6'-위치에 대응)가 히드록실기로 치환된 것을 제외하고는 로다민 염료와 구조가 유사하다. 로다민과 마찬가지로, 플루오레세인은 또한 모 크산텐 고리의 위치 C3'과 C4' 및/또는 C5'와 C6'에 있는 탄소 원자가 벤조기와 같은 아릴 가교에 포함되는 확장된 고리 구조를 가질 수 있다. 따라서, 플루오레세인은 일반적으로 하기 구조식 (IVa), (IVb) 및(IVc)에 따른 화합물을 포함한다:

NH-로다민과 마찬가지로, 구조식 (IVa), (IVb) 및 (IVc)의 플루오로에세인 고리의 C1′, C2′, C2″, C4′, C4″, C5′, C5″, C7′, C7″, C8′, C4, C5, C6 및 C7 위치의 탄소는 NH-로다민에 대해 이전에 기술된 것과 같은 다양한 다른 치환기로 치환될 수 있다.

본원에 기재된 표지 모이어티에 포함되는 경우, C3'및 C6' 위치의 히드록실은 위에서 논의된 NH-로다민의 외향고리 아민을 보호하는 기와 동일한 일반 특성을 갖는 보호기로 보호되어야 한다. 따라서, 특정 실시형태에서 보호기는 포스파이트 트리에스테르 방법을 통해 올리고뉴클레오티드를 합성 및 산화시키는 데 사용되는 조건과 같은 올리고뉴클레오티드를 합성하는 데 사용되는 조건에 안정하고, 예를 들어 실온 또는 55℃에서 농축 수산화암모늄에서 배양하는 것과 같은 합성 올리고뉴클레오티드를 합성 수지로부터 탈보호 및/또는 절단하는 데 전형적으로 사용되는 조건 하에서 불안정하다.

C3' 및 C6' 외향고리 히드록실이 보호기를 포함하는 플루오레세인은 본원에서 "O-보호된 플루오레세인"으로 지칭된다. 구조식 (IVa), (IVb) 및 (IVc)의 플루오레세인에 대응하는 O-보호된 플루오레세인은 각각 아래 구조식 (Va), (Vb) 및 (Vc)로 예시되며:

상기 식에서 R⁵는 보호기를 나타낸다.

NH-로다민 모이어티에 대한 도너로서 사용하기 위해 적절하게 보호되고 표지 모이어티에 혼입될 수 있는 다양한 다른 플루오레세인 염료는 당업계에 공지되어 있다. 특정 예시적인 플루오레세인 염료는 예를 들어, 미국 특허 제6,221,604호; 미국 특허 제6,008,379호; 미국 특허 제5,840,999호; 미국 특허 제5,750,409호; 미국 특허 제5,654,441호; 미국 특허 제5,188,934호; 미국 특허 제5,066,580호; 미국 특허 제4,481,136호; 미국 특허 제4,439,356호; 국제공개 WO 99/16832호; 및 유럽 특허출원공개 EP 0 050 684호에 기재되어 있으며, 이들의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. 숙련된 기술자는 특정 NH-로다민의 도너로 사용하기에 적합한 스펙트럼 특성을 가진 플루오레세인을 선택할 수 있을 것이다.

도너 및 N-보호된 NH-로다민 억셉터는 직접 또는 링커의 도움으로 다양한 배향으로 서로 연결될 수 있다. 도너가 O-보호된 플루오레세인 또는 N-보호된 NH-로다민인 일부 실시형태에서, 도너는 C2′-, C2″-, C4′-, C5′-, C7′-, C7″-, C5- 또는 C6-위치를 통해 N-보호된 NH-로다민 억셉터의 C2′-, C4′-, C5′-, C7′-, C5- 또는 C6-위치에 연결된다.

특정 예시적인 연결 배향이 아래 표 2에 제공된다:

표 2의 도너-억셉터 염료 네트워크와 같은 염료 네트워크를 포함하는 표지 모이어티는 임의의 이용 가능한 위치에서 시약의 나머지에 연결될 수 있다. 일부 실시형태에서, 헤드-투-헤드 연결된 억셉터/도너 쌍을 포함하는 표지 모이어티는 도너 또는 억셉터 모이어티의 C5- 또는 C6-위치를 통해 시약의 나머지에 부착된다. 일부 실시형태에서, 헤드-투-테일 연결된 억셉터/도너 쌍을 포함하는 표지 모이어티는 도너 또는 억셉터 모이어티의 이용 가능한 C4'-, C5'-, C5- 또는 C6-위치를 통해 시약의 나머지에 부착된다. 일부 실시형태에서, 테일-투-테일 연결된 억셉터/도너 쌍을 포함하는 표지 모이어티는 도너 또는 억셉터의 C4'- 또는 C5'-위치를 통해 시약의 나머지에 부착된다. 일부 실시형태에서, 사이드-투-사이드 연결된 억셉터/도너 쌍을 포함하는 표지 모이어티는 도너 또는 억셉터의 C4′-, C5′-, C5- 또는 C6--위치를 통해 시약의 나머지에 부착된다. 일부 실시형태에서, 사이드-투-헤드 연결된 억셉터/도너 쌍을 포함하는 표지 모이어티는 도너 또는 억셉터 모이어티의 이용 가능한 C4'-, C5'-, C5- 또는 C6-위치를 통해 시약의 나머지에 부착된다. 일부 실시형태에서, 사이드-투-테일 연결된 억셉터/도너 쌍을 포함하는 표지 모이어티는 도너 또는 억셉터의 이용 가능한 C4'-, C5'-, C5- 또는 C6-위치를 통해 시약의 나머지에 부착된다.

그들의 배향에 관계없이, O-보호된 플루오레세인 또는 N-보호된 NH-로다민 도너와 N-보호된 NH-로다민 억셉터는 전형적으로 링커를 통해 서로 연결된다. 본질적으로 단단하고/하거나 비교적 긴, 예를 들어 약 12 내지 20 옹스트롬 범위의 길이인 링커를 통해 그러한 도너 및 억셉터 염료를 연결하는 것이 유리할 수 있다는 것이 이전에 발견되었다(본원에서 사용되는 링커의 "길이"는 모이어티들 사이의 최단 연속 경로를 정의하는 화학 결합 길이의 합계를 계산하여 결정되는 연결된 모이어티들 사이의 거리를 지칭한다). 작동 이론에 얽매이지는 않지만, 발색단이 서로 접촉하는 것을 허용하지 않고 도너와 억셉터를 서로 아주 가깝게 유지하는 경향이 있는 링커는 적절하게 효율적인 에너지 전달을 산출한다고 믿어진다. 이와 관련하여, 링커의 강성과 길이는 결합된 파라미터들이다. 일반적으로, 더 짧은 링커(예를 들어, 약 5 내지 12 옹스트롬의 길이를 갖는 링커)는 더 큰 정도의 강성을 포함해야 한다. 더 긴 링커(예를 들어, 약 15 내지 30 옹스트롬 범위의 길이를 갖는 링커)는 더 낮은 정도의 강성을 포함하거나 심지어 강성을 포함하지 않을 수 있다. 짧고 단단하지 않은(플로피(floppy)) 링커는 피해야 한다.

강성은 예를 들어 아릴렌 또는 헤테로아릴렌 모이어티 및/또는 이중 및/또는 삼중 결합을 포함하는 알킬렌 모이어티의 사용을 통해 결합에 대해 제한된 회전 각도를 갖는 기의 사용을 통해 달성될 수 있다. 에너지 전달 염료의 맥락에서 로다민 및 플루오레세인 염료를 서로 연결하는 데 유용한 다양한 링커는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 미국 특허 제5,800,996호에 기재되어 있으며, 이의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. O-보호된 플루오레세인 또는 N-보호된 NH-로다민 도너를 본원에 기재된 표지 모이어티에서 N-보호된 NH-로다민 억셉터에 연결하는데 유용한 링커의 특정 예는 예로서 하기 화학식의 기들을 비제한적으로 포함하며:

(L.1) -Z-(CH₂)_a-[(Ar)_b-(CH₂)_a]_c-Z-;

(L.2) -Z-(CH₂)_a-[C≡C-(CH₂)_a]_c-Z-;

(L.3) -Z-(CH₂)_a-[C≡C-(Ar)_b]_c-(CH₂)_a-Z-;

(L.4) -Z-(CH₂)_d-NH-C(O)-[(CH₂)_a-(Ar)-(CH₂)_a-C(O)-NH]_c-(CH₂)_d-Z-; 및

(L.5) -Z-[CH₂(CH₂)_eO]_f-CH₂(CH₂)_eO-,

상기 식에서, 각각의 Z는 전술한 바와 같이 서로 독립적으로 연결기 F^z에 의해 기여된 연결의 부분을 나타내고, 각각의 a는 다른 것들과 독립적으로 0 내지 4 범위의 정수를 나타내고; 각각의 b는 다른 것들과 독립적으로 1 내지 2 범위의 정수를 나타내고; 각각의 c는 다른 것들과 독립적으로 1 내지 5 범위의 정수를 나타내고; 각각의 d는 서로 독립적으로 1 내지 10 범위의 정수를 나타내고; 각각의 e는 다른 것들과 독립적으로 1 내지 4 범위의 정수를 나타내고; 각각의 f는 다른 것과 독립적으로 1 내지 10 범위의 정수를 나타내고; 각각의 Ar은 다른 것들과 독립적으로 선택적으로 치환된 단환 또는 다환 시클로알킬렌, 시클로헤테로알키넨, 아릴렌 또는 헤테로아릴렌 기를 나타낸다. Ar의 비제한적인 예시적 실시형태는 전술한 바와 같이 저급 시클로알칸, 저급 시클로헤테로알칸, 모 방향족 고리 시스템 및 모 헤테로방향족 고리 시스템으로부터 유도된 기를 포함한다. Ar의 구체적이고 비제한적인 예시적 실시형태는 시클로헥산, 피페라진, 벤젠, 나프탈렌, 페놀, 푸란, 피리딘, 피페리딘, 이미다졸, 피롤리딘 및 옥사디졸을 포함한다. 링커의 구체적이고 비제한적인 예시적 실시형태는 도 1에 예시되어 있다. 도 1에서, Z¹ 및 Z²는 각각 서로 독립적으로 전술한 바와 같이 작용기 F^z에 의해 기여된 연결의 부분을 나타내고, K는 -CH- 및 -N- 중에서 선택된다. 도 2에 예시된 링커의 일부 특정 실시형태에서. Z¹ 또는 Z² 중 하나는 -NH-이고 다른 하나는 -O-, C(O)- 및 -S(O)₂- 중에서 선택된다.

일부 실시형태에서, 도너 및 억셉터 염료를 연결하는 링커는 미국 특허 제6,811,979호에 기재된 바와 같은 음이온성 링커이며, 동 특허의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다(예를 들어, 컬럼 17 25 행 내지 컬럼 18 37 행 및 도 1 내지 17의 개시내용 참조). 적합한 음이온성 링커의 구체적이고 비제한적인 예시적 실시형태는 상기 화학식 (L.1) 내지 (L.4)의 링커를 포함하며, 여기서 Ar기들 중 하나 이상은 예를 들어 약 pH 7 내지 약 pH 9 범위의 pH에서와 같은 사용 조건 하에 음전하를 갖는 하나 이상의 치환기로 치환된다. 적합한 치환기의 구체적이고 비제한적인 예는 포스페이트 에스테르, 설페이트 에스테르, 설포네이트 및 카복실레이트 기를 포함한다.

일부 실시형태에서, 표지 모이어티는 화학식 (VI)으로 이루어지며:

A-Z¹-Sp-Z²-D (VI)

상기 식에서, A는 N-보호된 NH-로다민 억셉터를 나타내고, D는 도너, 예를 들어 N-보호된 NH-로다민 또는 O-보호된 플루오레세인 도너를 나타내고, Z¹ 및 Z²는 전술한 바와 같이 작용기 F^z를 포함하는 연결 모이어티에 의해 제공되는 연결 부분을 나타내고, Sp는 전술한 바와 같이 간격 모이어티를 나타낸다. 일부 특정 실시형태에서, A는 본원에 기재된 N-보호된 NH-로다민 모이어티이고, D는 구조식 D.1, D.2, D.3, D.4, D.5, D.6, D.7, D.8, D.9, D.10, D.11 및 D.12를 갖는 모이어티로 구성된 군으로부터 선택되며:

상기 D.1 내지 D.12 각각에서:

R^1′, R^2′, R^2″, R^4′, R^4″, R^5′, R^5″, R^7′, R^7″, 및 R^8′의 각각은 단독으로 취해질 때 독립적으로 수소, 저급 알킬, (C6-C14) 아릴, (C7-C20) 아릴알킬, 5-14원 헤테로아릴, 6-20원 헤테로아릴알킬, R^b 및 -(CH₂)_x-R^b로 구성된 군으로부터 선택되며, 여기서 x는 1 내지 10의 값을 갖는 정수이고, R^b는 -X, -OH, -OR^a, -SH, -SR^a -NH₂, -NHR^a, NR^cR^c, N⁺R^cR^cR^c, 퍼할로 저급 알킬, 트리할로메틸, 트리플루오로메틸, -P(O)(OH)₂, P(O)(OR^a)₂, P(O)(OH)(OR^a), -OP(O)(OH)₂, OP(O)(OR^a)₂, -OP(O)(OR^a)(OH), -S(O)₂OH, S(O)₂R^a, -C(O)H, C(O)R^a, -C(S)X, -C(O)OR^a, -C(O)OH, -C(O)NH₂, -C(O)NHR^a, C(O)NR^cR^c, C(S)NH₂, C(O)NHR^a, -C(O)NR^cR^c, -C(NH)NH₂, -C(NH)NHR^a, 및 C(NH)NR^cR^c로 구성된 군으로부터 선택되고, 여기서 X는 할로이고, 각각의 R^a는 독립적으로 저급 알킬, (C6-C14) 아릴, (C7-C20) 아릴알킬, 5-14원 헤테로아릴 및 6-20원 헤테로아릴알킬로 구성된 군으로부터 선택되고, 각각의 R^c는 독립적으로 R^a이거나, 또는 대안적으로 동일한 질소 원자에 결합된 2개의 R^c는 그 질소 원자와 함께 취해져, O, N 및 S로 구성된 군으로부터 선택되는 동일하거나 상이한 고리 헤테로원자들 중 하나 이상을 선택적으로 포함할 수 있는 5- 내지 8-원 포화 또는 불포화 고리를 형성할 수 있거나;

또는 대안적으로, R^1′와 R^2′ 또는 R^7′와 R^8′는 이들이 결합된 탄소 원자와 함께 취해져 선택적으로 치환된 (C6-C14) 아릴 가교를 형성하고/하거나, R^4′와 R^4″ 및/또는 R^5′와 R^5″는 이들이 결합된 탄소 원자와 함께 취해져 벤조기를 형성하며;

R⁴, R⁵, R⁶, 및 R⁷은 각각 서로 독립적으로 수소, 저급 알킬, (C6-C14) 아릴, (C7-C20) 아릴알킬, 6-14원 헤테로아릴, 7-20원 헤테로아릴알킬, -R^b, 또는 -(CH₂)_x-R^b 중에서 선택되며;

E¹은 -NHR⁹, -NR⁹R¹⁰ 및 -OR^9b로 이루어진 군으로부터 선택되며;

E²는 -NHR⁹, -NR⁹R¹⁰ 및 -OR^9b로 이루어진 군으로부터 선택되며;

R⁹ 및 R¹⁰은 본원에 기재된 바와 같으며;

R^9b는 R⁹이며;

Y^1a, Y^1b, Y^2a, Y^2b, Y^3a 및 Y^3b의 각각은 -O-, -S-, -NH-, -C(O-) 및 -S(O)₂로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되며,

단, 각각의 E¹ 및 E²가 -OR^9b인 경우, R^1′와 R^2′ 및/또는 R^7′와 R^8′은 이들이 결합된 탄소 원자와 함께 취해져 선택적으로 치환된 (C6-C14) 아릴 가교를 형성할 수 있다. 본원에서 사용되는 "비대칭 로다민"은 E1 및 E2가 독립적으로 -NHR9 또는 -NR9R10이고 E1이 E2와 동일하지 않은 화합물이다.

구조식 (VI)에 따른 표지 모이어티의 일부 특정 실시형태에서, Y^1a, Y^2a 및 Y^3a는 -NH-이고; Y^1b, Y^2b 및 Y^3b는 -C(O)- 및 -S(O)₂- 중에서 선택되고; Z1은 -C(O)- 및 -S(O)₂- 중에서 선택되고; Z²는 -NH-이고 Sp는 다음 중에서 선택되는 기이며:

-(CH₂)_a-[(Ar)_b-(CH₂)_a]_c-; (Sp.1)

-(CH₂)_a-[C≡C-(CH₂)_a]_c-; (Sp.2)

-(CH₂)_a-[C≡C-(Ar)_b]_c-(CH₂)_a-; (Sp.3)

-(CH₂)_d-NH-C(O)-[(CH₂)_a-(Ar)-(CH₂)_a-C(O)-NH]_c-(CH₂)_d- (Sp.4); 및

-[CH₂(CH₂)_eO]_f-CH₂(CH₂)-, (Sp.5)

상기 식에서 a, b, c, d, e, f 및 Ar은 전술한 바와 같다.

구조식 (VI)에 따른 표지 모이어티의 일부 특정 실시형태에서, R9는 -C(O)CH₃ 및 C(O)CF₃중에서 선택되고, R^9a는 -C(O)C(CH₃)₃이다.

4.5 PEP기

본원에 기재된 시약의 많은 실시형태는 PEP기("PEP")를 포함한다. 표지된 올리고뉴클레오티드를 합성하기 위해 단계적 합성에 사용되는 경우, PEP기는 임의의 이용 가능한 히드록실기에 결합되며, 이는 초기 합성 올리고뉴클레오티드의 5'-히드록실기일 수 있고, 궁극적으로 임의의 요구되는 산화 및/또는 탈보호 단계 이후에 표지 모이어티를 합성 올리고뉴클레오티드에 결합시키는 결합에 기여한다. 형성된 결합은 당업계에 알려진 바와 같이 포스페이트 에스테르 결합 또는 변형된 포스페이트 에스테르 결합일 수 있다.

포스페이트 에스테르 또는 변형된 포스페이트 에스테르 결합을 생성하기 위해 시약을 1차 히드록실기에 결합하기에 적합한 다양한 상이한 기들은 당업계에 잘 알려져 있다. 특정 예는 비제한적인 예로서 포스포라미다이트기(예를 들어 문헌[Letsinger et al., 1969, J. Am. Chem. Soc. 91:3350-3355] 문헌[Letsinger et al., 1975 J. Am. Chem. Soc. 97:3278] 문헌[Matteucci & Caruthers, 1981, J. Am. Chem. Soc. 103:3185] 문헌[Beaucage & Caruthers, 1981, Tetrahedron Lett. 22:1859] 참고, 이들의 개시내용은 본원에 참고로 포함됨), 2-클로로페닐- 또는 2,5-디클로로페닐-포스페이트 기(예를 들어, 문헌[Sproat & Gait, "Solid Phase Synthesis of Oligonucleotides by the Phosphotriester Method," In: Oligonucleotide Synthesis, A Practical Approach, Gait, Ed., 1984, IRL Press, pages 83-115] 참고, 이들의 개시내용은 본원에 참고로 포함됨), 및 H-포스포네이트 기(예를 들어, 문헌[Garegg et al., 1985, Chem. Scr. 25:280-282; Garegg et al., 1986, Tet. Lett. 27:4051-4054] 문헌[Garegg et al. 1986, Tet. Lett. 27:4055-4058] 문헌[Garegg et al., 1986, Chem. Scr. 26:59-62] 문헌[Froehler & Matteucci, 1986, Tet. Lett. 27:469-472] 문헌[Froehler et al., 1986, Nucl. Acid Res. 14:5399-5407] 참고, 이들의 개시내용은 본원에 참고로 포함됨)를 포함한다. 특정 실시형태에서, PEP기는 화학식 (P.1)의 포스포라미다이트기이며:

상기 식에서, R²⁰은 1 내지 10개의 탄소 원자를 함유하는 선형, 분지형 또는 환형 포화 또는 불포화 알킬, 2-시아노에틸, 6 내지 10개의 고리 탄소 원자를 함유하는 아릴, 및 6 내지 10개의 고리 탄소 원자 및 1 내지 10개의 알킬렌 탄소 원자를 함유하는 아릴알킬 중에서 선택되며;

R²¹ 및 R²²는 각각 서로 독립적으로 1 내지 10개의 탄소 원자를 함유하는 선형, 분지형 또는 환형 포화 또는 불포화 알킬, 6 내지 10개의 고리 탄소 원자를 함유하는 아릴, 및 6 내지 10개의 고리 탄소 원자 및 1 내지 10개의 알킬렌 탄소 원자를 함유하는 아릴알킬 중에서 선택되거나, 또는 대안적으로 R²¹ 및 R²²는 이들이 결합된 질소 원자와 함께 취해져 5 내지 6개의 고리 원자를 포함하는 포화 또는 불포화 고리를 형성하며, 이들 중 1개 또는 2개는 예시된 질소 원자에 더하여 O, N 및 S 중에서 선택된 헤테로원자일 수 있다.

특정 실시형태에서, R²⁰은 2-시아노에틸이고 R²¹ 및 R²²는 각각 이소프로필이다.

4.6 합성 핸들

본원에 기재된 시약의 많은 실시형태는 적절한 탈보호 후, 필요한 경우 합성 표지된 올리고뉴클레오티드에 추가 기 또는 모이어티의 부착에 사용될 수 있는 부위를 제공하는 하나 이상의 합성 핸들을 포함한다. 기는 표지된 올리고뉴클레오티드를 합성하는 동안 합성 핸들에 부착될 수 있거나, 또는 대안적으로 합성 핸들은 추가 기 또는 모이어티가 부착될 수 있는 작용기를 나타내기 위해 합성 후 탈보호될 수 있다. 예를 들어, 합성 핸들은 표지된 올리고뉴클레오티드의 합성을 수행하는 데 사용되는 조건에 안정한 보호기로 보호되는 1차 아민기를 포함할 수 있다. 합성 올리고뉴클레오티드 상의 다양한 다른 보호기의 제거와 동시에 또는 별도로 합성 후 보호기의 제거는 추가 기 및/또는 모이어티가 부착될 수 있는 1차 아미노기를 제공한다.

올리고뉴클레오티드 합성에 사용하기에 적합한 보호기로 보호된 다양한 유형의 반응성 기는 당업계에 공지되어 있으며, 비제한적인 예로서, 아미노기(예를 들어, 트리플루오로아세틸 또는 4-모노메톡시트리틸기로 보호됨), 히드록실기(예를 들어 4,4'-디메톡시트리틸기로 보호됨), 티올기(예를 들어 트리틸 또는 알킬티올기로 보호됨) 및 알데히드기(예를 들어, 아세탈 보호기로 보호됨)를 포함한다. 이러한 모든 보호된 반응성 기는 본원에 기재된 시약의 합성 핸들을 포함할 수 있다.

일부 실시형태에서, 합성 핸들은 화학식 -OR^k의 보호된 1차 히드록실을 포함하고, 여기서 R^k는 올리고뉴클레오티드를 합성하는 동안 선택적으로 제거될 수 있는 산-불안정한 보호기를 나타낸다. 올리고뉴클레오티드 합성과 관련하여 1차 히드록실기를 보호하는 데 적합한 산 불안정한 보호기는 당업계에 공지되어 있으며, 비제한적인 예로서 트리페닐메틸(트리틸), 4-모노메톡시트리틸, 4,4'-디메톡시트리틸, 4,4',4"-트리메톡시트리틸, 비스(p-아니실)페닐메틸, 나프틸디페닐메틸, p-(p'-브로모페나실옥시)페닐디페닐메틸, 9-안트릴, 9-(9-페닐)잔테닐 및 9-(9-페닐-10-옥소)안트릴을 포함한다. 모든 이들 기는 약한 산에 의한 처리, 예컨대 2.5% 또는 3% 디- 또는 트리클로로 산에 의한 처리에 의해 및 디클로로메탄에서 제거될 수 있다. 상기 열거된 산-불안정한 보호기로 1차 히드록실기를 보호하는 방법은 잘 알려져 있다.

4.7 고체 지지체

본원에 기재된 시약의 많은 실시형태는 다른 모이어티 및/또는 기가 부착된 고체 지지체를 포함한다. 고체 지지체는 전형적으로 아미노 또는 히드록실기와 같은 작용기로 활성화되며, 여기에 다른 모이어티의 부착에 적합한 연결기를 보유하는 링커가 부착된다.

다양한 모이어티 및 링커에 부착하기에 적합한 작용기로 활성화될 수 있는 다양한 물질, 및 작용기를 포함하도록 물질을 활성화하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예로서 제어된 기공 유리, 폴리스티렌 및 그래프트 공중합체를 포함한다. 이들 물질들 중 임의의 것이 본원에 기재된 시약에서 고체 지지체로서 사용된다.

4.8 말단 히드록실 표지화에 유용한 합성 시약

본원에 기재된 합성 시약의 일부 실시형태는 구조식 (VII)에 의해 설명되며:

LM-L-PEP (VII)

상기 식에서 LM은 본원에 기재된 표지 모이어티를 나타내고, L은 본원에 기재된 선택적 링커를 나타내며, PEP는 본원에 기재된 바와 같은 PEP기를 나타낸다. 시약은 합성 핸들과 같은 추가 기 또는 모이어티를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 합성 시약은 표지 모이어티 및 PEP기를 포함하고, 추가 모이어티 또는 기를 포함하지 않는다. 이러한 합성 시약은 올리고뉴클레오티드의 단계적 합성 동안 히드록실기에 결합될 수 있으며, 특히 표지 모이어티를 일반적으로 5'-히드록실인 합성 올리고뉴클레오티드의 말단 히드록실기에 부착하는데 유용하다.

일부 실시형태에서, 표지 모이어티는 다음의 화학식으로 이루어질 수 있으며

상기 식에서, R¹-R¹⁴, R^a-R^j, 및 Y는 본원에서 정의된 바와 같다.

PEP기는 표지 모이어티에 직접 부착될 수 있거나, 링커의 도움으로 표지 모이어티에 부착될 수 있다. PEP기는 일반적으로 적합한 시약을 1차 히드록실기에 결합시킴으로써 분자에 연결되며, PEP기가 표지 모이어티에 직접 부착되는 실시형태에서, 표지 모이어티는 1차 히드록실기를 포함하는 치환기를 포함해야 한다. 링커의 도움으로 PEP기가 표지 모이어티에 연결되는 실시형태에서, 링커 신톤은 표지 모이어티 신톤 상의 연결기 및 PEP기에의 부착에 적합한 1차 히드록실기와의 연결을 형성하기에 적합한 연결기를 포함해야 한다. 적합한 링커 신톤은 화학식 F^z-Sp-OH의 신톤을 포함하지만, 이에 제한되지 않으며, 여기서 F^z는 표지 모이어티 신톤 상의 작용기에 상보적인 작용기이고, Sp는 간격 모이어티를 나타낸다. 간격 모이어티는 표지된 합성 올리고뉴클레오티드를 합성하고 탈보호하는데 사용될 조건에 안정적인 원자 및/또는 작용기의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 비제한적인 예시적 링커가 도 1에 예시되어 있으며, 여기서 Z²는 O이다. 일부 실시형태에서, Sp는 1 내지 10개의 사슬 원자를 함유하는 선택적으로 치환된 알킬렌 사슬이다. 특정 실시형태에서, Sp는 1 내지 9개의 탄소 사슬 원자를 함유하는 비치환된 알킬렌 사슬이다.

일부 실시형태에서, 합성 시약은 구조식 (VII)에 따른 화합물이며, 여기서:

LM은 위에 구체적으로 예시된 표지 모이어티의 실시형태들 중 하나이며;

L은 -Z-(CH₂)_3-6-O-, -Z-(CH₂)_a-[(Ar)_b-(CH₂)_a]_c-O-, -Z-(CH₂)_a-[C≡C-(CH₂)_a]_c-O-, -Z-(CH₂)_a-[C≡C-(Ar)_b]_c-(CH₂)_a-O-, -Z-(CH₂)_d-NH-C(O)-[(CH₂)_a-(Ar)-(CH₂)_a-C(O)-NH]_c-(CH₂)_d-O-, -Z-[CH₂(CH₂)_eO]_f-CH₂(CH₂)_eO- 및 Z₂가 O인 도 1에 예시된 링커들 중 하나로부터 선택되며;

PEP는 전술한 바와 같이 예를 들어 구조식 P.1의 포스포라미다이트기와 같은 포스포라미다이트기이다. 일부 특정 실시형태에서, 링커 L에서 Z는 -NH-이다.

일부 실시형태에서, 구조식 (VII)에 따른 합성 시약의 링커는 합성 시약이 뉴클레오시드가 되도록 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 뉴클레오시드 합성 시약은 구조식 (VII.1)에 따른 화합물이며:

상기 식에서 PEP는 포스페이트 에스테르 전구체 기를 나타내고, B는 핵 염기를 나타내고, LM은 표지 모이어티를 나타내며, L2는 핵 염기 B를 링커 LM에 연결하는 링커를 나타낸다. 핵 염기 B 및 링커 L의 특징 및 특성은 아래에서 더 자세히 설명된다. 구조식 (VII.1)에 따른 비제한적인 예시적 뉴클레오시드 합성 시약은 도 3에 예시되어 있다.

PEP기가 선택적 링커를 통해 표지 모이어티에 연결되는 합성 시약의 실시형태를 합성하기 위한 예시적인 스킴(scheme)은 아래 스킴 (I)에 제공되며, 여기서 다양한 R, F^y, F^z, Y, Z 및 Sp기는 이전에 정의된 바와 같다:

스킴 (I)에서, 작용기 F^y를 포함하는 연결기를 포함하는 모 NH-로다민 신톤(100)은 무수물(101)로 아세틸화되어 N-아세틸-보호된 NH-로다민 신톤(102)을 생성한다. 그 다음 신톤(102)은 링커 신톤(103)에 결합되어 화합물(104)을 생성한다. F^y의 정체성(identity)에 따라, 신톤(102)은 결합 전에 활성화를 요구할 수 있다. 예를 들어, F^y가 카르복실기인 경우, 결합 전에 NHS 에스테르와 같은 에스테르로서 활성화될 수 있다. 화합물(104)에서, -Y-Z-는 상보적 작용기 F^y 및 F^z에 의해 형성된 연결을 나타내고, 여기서 Y는 F^y에 의해 기여된 부분을 나타내고, Z는 이전에 기술된 바와 같이 F^z에 의해 기여된 부분을 나타낸다. 그 다음 화합물(104)은 PEP 신톤(105) - 이는 예시된 특정 실시형태에서 포스핀임 - 과 반응되어 포스포라미다이트 합성 시약(106)을 생성한다.

4.9 내부 또는 3'-말단 표지화에 유용한 합성 시약

본원에 기재된 합성 시약은 추가 기 및/또는 모이어티의 부착에 유용한 하나 이상의 합성 핸들을 선택적으로 포함할 수 있다. 화학식 -OR^k의 합성 핸들을 포함하는 합성 시약 - 여기서 R^k는 전술한 바와 같이 산-불안정한 보호기를 나타냄 - 은 추가 뉴클레오티드가 부착될 수 있는 1차 히드록실기를 제공한다. 결과적으로 이러한 합성 핸들을 포함하는 합성 시약은 5'-히드록실에서, 3'-히드록실에서 또는 하나 이상의 내부 위치에서 합성 올리고뉴클레오티드를 표지화하는 데 사용될 수 있다. 이들은 또한 서로 간에 또는 다른 포스포라미다이트 표지 시약에 결합되어 복수의 표지 모이어티를 함유하는 올리고뉴클레오티드의 합성을 허용할 수 있다.

합성 시약을 포함하는 표지 모이어티, PEP기 및 합성 핸들 -OR^k는 각각의 기능을 수행하도록 허용하는 임의의 방식 및/또는 배향으로 함께 연결될 수 있다. 특정 예로서, PEP기 및 합성 핸들은 각각 선택적으로 링커를 통해 표지 모이어티에 연결될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 합성 시약은 구조식 (VIII)에 따른 화합물이며:

R^kO-L-LM-L-PEP (VIII)

상기 식에서 각각의 L은 서로 독립적으로 선택적 링커를 나타내고, LM은 표지 모이어티를 나타내며 PEP는 PEP기를 나타낸다. 적합한 보호기 R^k, 링커 L, 표지 모이어티 LM 및 PEP 기의 비제한적인 예는 위에서 구체적으로 예시된 것들을 포함한다.

다른 특정 예로서, PEP기 및 합성 핸들 -OR^k는 표지 모이어티에 부착되는 분지형 링커에 부착될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 합성 시약은 구조식 (IX)에 따른 화합물이며:

상기 식에서 L은 링커를 나타내고, LM은 표지 모이어티를 나타내며 PEP는 PEP기를 나타낸다.

특정 실시형태에서, 구조식 (IX)에 따른 합성 시약은 구조식 (IX.1)에 따른 화합물이며:

상기 식에서 LM은 표지 모이어티를 나타내고, -Z-는 링커 상의 작용성 F^z에 의해 기여된 연결 부분을 나타내고, Sp¹, Sp² 및 Sp³은 같거나 다를 수 있고 각각 간격 모이어티를 나타내며, G는 CH, N, 또는 아릴렌, 페닐렌, 헤테로아릴렌, 저급 시클로알킬렌, 시클로헥실렌 및/또는 저급 시클로헤테로알킬렌이며, PEP는 PEP기를 나타낸다. 일부 실시형태에서, LM은 위에 구체적으로 예시된 표지 모이어티의 실시형태들 중 하나이고, Sp¹, Sp² 및 Sp³은 각각 서로 독립적으로 1 내지 9개의 탄소 원자를 포함하는 알킬렌 사슬로부터 선택되며, Sp.1, Sp.2, Sp.3, Sp.4 및 Sp.5(위에 정의됨) 및/또는 PEP는 상기 구조식 P.1에 따른 포스포라미다이트기이다. 구조식 (IX.1)에 따른 예시적인 합성 시약의 비제한적인 특정 실시형태는 도 2 및 3에 예시되어 있다.

일부 실시형태에서, 합성 핸들 -OR^k는 합성 시약이 뉴클레오시드가 되도록 뉴클레오시드에 의해 제공된다. 이러한 뉴클레오시드 합성 시약에서, 표지 모이어티는 전형적으로 링커를 통해 뉴클레오시드의 핵 염기에 연결되며, 예를 들어 외향고리 아민과 같은 표지된 올리고뉴클레오티드를 합성하는 데 사용되는 조건 하에서 반응성인 핵 염기 상의 임의의 외향고리 작용기는 보호된다. 예는 도 5에 제공된다.

뉴클레오시드는 올리고뉴클레오티드의 합성에 사용하기 위해 적절하게 보호될 수 있는 임의의 뉴클레오시드일 수 있으며, 2'-데옥시리보스 당 모이어티, 3'-데옥시리보스 당 모이어티(2'-5'뉴클레오티드 간 연결을 포함하는 표지된 올리고뉴클레오티드를 합성하는 데 유용함), 적절하게 보호된 리보스 모이어티, 이들 리보스 모이어티 중 임의의 치환된 버전, 또는 심지어 비-리보스 당 모이어티를 포함할 수 있다.

일부 실시형태에서, 이러한 뉴클레오시드 합성 시약은 구조식 (IX.2), (IX.3), (IX.4) 및(IX.5)에 따른 화합물이며:

상기 식에서 LM은 표지 모이어티를 나타내고, B는 적절하게 보호된 핵 염기를 나타내고, L²는 표지 모이어티를 핵 염기에 연결하는 링커를 나타내고, R^k는 산 불안정한 보호기를 나타내고, PEP는 PEP기를 나타내고, O는 산소 원자이며, 구조식 (IX.4)에서, R¹⁶은 2'-히드록실 보호기를 나타낸다.

구조식 (VII.1), (IX.2), (IX.3), (IX.4) 및 (IX.5)에 따른 합성 시약에서, 핵 염기 B는 올리고뉴클레오티드로의 혼입에 유용한 사실상 임의의 헤테로사이클일 수 있다. 예를 들어, 핵 염기는 유전적으로 코딩하는 퓨린들 중 하나(아데닌 또는 구아닌), 유전적으로 코딩하는 피리미딘들 중 하나(시토신, 우라실 또는 티민), 유전적으로 코딩하는 퓨린 및/또는 피리미딘의 유사체 및/또는 유도체(예를 들어, 7-데아자데닌, 7-데아자구아닌, 5-메틸시토신), 비유전적으로 코딩하는 퓨린 및/또는 피리미딘(예를 들어, 이노신, 크산텐 및 하이포크산텐) 또는 다른 유형의 헤테로사이클일 수 있다. 올리고뉴클레오티드 내로의 혼입에 유용한 다양한 헤테로사이클은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌[Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, Fasman, Ed., 1989, CRC Press](예를 들어, 페이지 385-393 및 거기에 인용된 참고문헌 참고)에 기재되어 있으며, 그 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 이러한 다양한 헤테로사이클 모두, 및 나중에 발견되는 것들은 본원에 기재된 뉴클레오시드 합성 시약에 포함될 수 있다.

B가 구조식 (VII.1), (IX.2), (IX.3), (IX.4) 및 (IX.5)에 따른 합성 시약에서의 퓨린일 때, 예시된 당 모이어티는 전형적으로 퓨린의 N9 위치에 부착되고, B가 피리미딘일 때, 예시된 당 모이어티는 전형적으로 피리미딘의 NI 위치에 부착된다. 다른 핵 염기에 대한 부착 부위는 당업자에게 명백할 것이다.

핵 염기 상의 임의의 외향고리 아민 또는 기타 반응성 기(들)는 표지된 올리고뉴클레오티드를 합성하는 데 사용되는 합성 조건에 안정한 보호기로 보호된다. 올리고뉴클레오티드 합성과 관련하여 뉴클레오시드 핵 염기의 외향고리 아민기를 보호하기에 적합한 다양한 기들은 당업계에 잘 알려져 있으며, 이러한 보호된 뉴클레오시드를 제조하는 방법도 마찬가지이다.

예를 들어, 아데닌의 외향고리 아민을 보호하기 위해 사용된 기는 벤지올(Bz), 페녹시아세틸(Pac) 및 이소부티릴(iBu)을 포함한다. 시스토신의 외향고리 아민을 보호하기 위해 사용된 기는 아세틸(Ac) 및 Bz를 포함한다. 구아닌의 외향고리 아민을 보호하기 위해 사용된 기는 iBu, 디메틸포름아미드(Dmf) 및 4-이소프로필-페녹시아세틸(iPr-Pac)을 포함한다. 이러한 모든 보호기는 55 내지 65℃에서 2 내지 3시간 동안 수산화암모늄으로 처리하여 제거될 수 있다. 그러나, 이러한 보호기 중 일부는 더 온화한 조건에서 제거될 수 있다. 예를 들어, A^iBU, A^Pac, C^Ac 및 G^iPr-Pac으로부터 보호기의 절단은 실온에서 4 내지 17시간 내에 수산화암모늄으로, 또는 메탄올 중 0.05M 탄산칼륨으로 또는 H₂O/EtOH 중 25% t-부틸아민으로 처리하여 수행될 수 있다. 본원에 기재된 시약을 포함하는 일부 NH-로다민 및/또는 다른 염료는 다른 보호기에 의해 요구되는 더 가혹한 탈보호 조건에 안정하지 않을 수 있으므로, 이러한 더 온화한 탈보호 조건 하에서 제거될 수 있는 보호기를 이용하는 뉴클레오시드 시약이 바람직하다.

표지 모이어티 LM을 핵 염기 B에 연결하는 링커 L²는 핵 염기의 임의의 위치에 부착될 수 있다. 일부 실시형태에서, B가 퓨린인 경우, 링커는 퓨린의 8-위치에 부착되고, B가 7-데아자퓨린인 경우, 링커는 7-데아자퓨린의 7-위치에 부착되며, B가 피리미딘인 경우, 링커는 피리미딘의 5-위치에 부착된다.

일부 실시형태에서, LM을 핵 염기에 부착시키는데 유용한 링커 L²는 아세틸렌 또는 알켄 아미노 연결, 예를 들어 -C≡C-CH₂-NH-, -C≡C-C(O)-, -CH=CH-NH-, -CH=CH-C(O)-, -C≡C-CH₂-NH-C(O)-(CH₂)_1-6-NH-, 및 -CH=CH-C(O)-NH-(CH₂)_1-6-NH-C(O)- 중에서 선택된 연결, 프로파길-1-에톡시아미노 연결, 예를 들어 화학식 -C-CH-CH₂-O-CH₂CH₂-[O-CH₂CH₂]_0-6-NH-를 갖는 연결, 또는 강성 연결, 예를 들어 -C≡C-C≡C-CH₂-O-CH₂CH₂-[O-CH₂CH₂]_0-6-NH-, -C≡C-(Ar)_1-2-C≡C-CH₂-O-CH₂CH₂-[O-CH₂CH₂]_0-6-NH-, -C≡C-(Ar)_1-2-O-CH₂CH₂-[O-CH₂CH₂]_0-6-NH- 및 -C≡C-(Ar)_1-2-O-CH₂CH₂-[O-CH₂CH₂]_0-6-NH- 중에서 선택된 연결을 포함하며, 여기서 Ar은 이전에 정의된 바와 같다.

일부 실시형태에서, LM을 퓨린 핵 염기에 부착시키는 데 유용한 링커 L²는 예를 들어 화학식 -NH-(CH₂)_1-6-NH-의 연결과 같은 알킬아민을 포함한다.

일부 실시형태에서, LM을 퓨린 또는 피리미딘 핵 염기에 부착시키는 데 유용한 링커 L²는 미국 특허 제6,811,979호에 기재된 바와 같은 음이온성 링커이며, 이의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다(예를 들어, 17 컬럼 25 행 내지 18 컬럼 37 행 및 도 1 내지 17의 개시내용 참조).

본원에 기재된 시약에 혼입하기에 적합한 상기 기재된 것과 같은 링커로 유도체화된 뉴클레오시드를 합성하는 방법은 예를 들어 문헌[Hobbs et al., 1989, J. Org. Chem. 54:3420]; 미국 특허 제5,151,507호(Hobbs et al.), 미국 특허 제5,948,648호(Khan et al.); 및 미국 특허 제5,821,356호(Khan et al.)에 기재되어 있으며, 이들의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. 유도체화된 뉴클레오시드는 아래에서 보다 상세히 설명되는 바와 같이 뉴클레오시드 합성 시약을 합성하기 위한 신톤으로서 사용될 수 있다.

본원에 기재된 뉴클레오시드 시약을 포함할 수 있는 링커-유도체화된 핵 염기의 특정 예시적 실시형태는 하기에 예시된다:

뉴클레오시드 합성 시약은 하기 스킴 (II)에 예시된 바와 같이 링커-유도체된 뉴클레오시드 신톤으로부터 제조될 수 있다:

스킴 (II)에서, 링커-유도체화된 뉴클레오시드 신톤(110)은 산-불안정한 보호기로 5'-히드록실에서 보호되며, 이는 예시적인 클로라이드 시약 R^kCl을 사용한 스킴에 예시되어 있으며, 여기서 R^k는 이전에 정의된 바와 같다. 트리플루오로아세틸 보호기를 제거하기 위해 염기로 처리하면 신톤(112)이 생성된다. 신톤(112)과 표지 모이어티 신톤(102)의 반응(상기 스킴 (I) 참조), 이어서 PEP 신톤(105) - 이 예시된 특정 예에서 포스핀임 - 에 의한 처리(상기 스킴 (I) 참조)는 뉴클레오시드 합성 시약(114)을 생성한다. 상기 예시된 다양한 합성 단계를 수행하기 위한 특정 조건은 잘 알려져 있다. 도 4에 도시된 바와 같은 합성 핸들을 포함하는 비-뉴클레오시드 합성 시약 또는 화학식 -OR^k의 합성 핸들은 스킴 (II)의 일상적인 적응에 의해 제조될 수 있다.

4.10 고체 지지체 시약

본원에 기재된 시약의 많은 실시형태는 고체 지지체를 포함한다. 이러한 시약은 일반적으로 고체 지지체, 본원에 기재된 바와 같은 표지 모이어티, 및 합성 핸들을 포함하고, 추가 기 또는 모이어티, 예컨대 추가의 표지 모이어티, 켄칭 모이어티, 합성 핸들, 및/또는 무엇보다도 올리고뉴클레오티드 듀플렉스를 안정화시키는데 유용한 기, 예를 들어 염기 쌍 사이에 삽입되는 약제(삽입 약제) 및 듀플렉스 작은 홈에 결합하는 약제(작은 홈 결합 또는 MGB 약제)를 포함할 수 있다. 고체 지지체, 표지 모이어티, 합성 핸들 및 임의의 선택적 추가 모이어티는 각각의 기능을 수행할 수 있도록 허용하는 임의의 방식 또는 배향으로 서로 연결될 수 있다.

일부 실시형태에서, 고체 지지체는 링커를 통해 시약의 나머지에 부착된다. 고체 지지체를 시약의 나머지에 부착하는 링커는 전형적으로 합성 후에 합성된 표지된 올리고뉴클레오티드가 고체 지지체로부터 방출될 수 있도록 특정 조건 하에 선택적으로 절단 가능한 연결을 포함한다. 일부 실시형태에서, 연결은 합성 표지된 올리고뉴클레오티드를 탈보호하는데 사용되는 조건에 불안정하여 올리고뉴클레오티드가 단일 단계에서 고체 지지체로부터 탈보호되고 절단된다. 이러한 링커는 전형적으로 에스테르 결합을 포함하지만, 예를 들어 카보네이트 에스테르, 디이소프로필실록시 에테르, 개질된 포스페이트 에스테르 등과 같은 다른 결합을 포함할 수 있다.

올리고뉴클레오티드 합성과 관련하여 유용한 수많은 선택적으로 절단 가능한 링커가 당업계에 공지되어 있으며, 이러한 링커로 고체 지지체를 유도체화하는 방법이 알려져 있다. 이들 다양한 링커 모두는 본원에 기재된 고체 지지체 시약에 사용하기 위해 개조될 수 있다. 합성 올리고뉴클레오티드를 탈보호하는데 사용되는 염기성 조건 하에서 절단 가능한 예시적인 링커를 포함하는 고체 지지체 시약의 비제한적인 예가 도 6에 예시되어 있다.

합성 시약과 마찬가지로, 고체 지지체 시약은 본질적으로 비-뉴클레오시드성 또는 뉴클레오시드성일 수 있다. 비-뉴클레오시드 고체 지지체 시약의 예시적인 실시형태는 구조식 (X)에 따른 시약을 포함하며:

상기 식에서 LM은 표지 모이어티를 나타내고, L은 선택적인 선택적 절단 가능한 링커를 나타내고, -OR^k는 합성 핸들을 나타내며, 여기서 R^k는 전술한 바와 같이 산-불안정한 보호기이다.

일부 실시형태에서, 구조식 (X)의 고체 지지체 합성 시약은 구조식 (X.1)에 따른 비-뉴클레오시드 시약이며

상기 식에서 Z, LM, G, Sp¹, Sp² 및 R^k는 구조식 (IX.1)과 관련하여 이전에 정의된 바와 같고, Sp⁴는 선택적으로 절단 가능한 간격 모이어티를 나타낸다. 일부 특정 실시형태에서, 선택적으로 절단 가능한 간격 모이어티 Sp⁴는 에스테르 결합을 포함한다.

일부 실시형태에서, 구조식 (X)의 고체 지지체 합성 시약은 구조식 (X.2), (X.3), (X.4) 또는 (X.5)에 따른 뉴클레오시드 시약이며:

상기 식에서 LM, R^k, B, 및 L²는 구조식 (X.2), (X.3), (X.4) 및/또는 (X.5)에 대해 이전에 정의된 바와 같고, R¹⁶은 구조식 (IX)에 대해 이전에 정의된 바와 같고, Sp⁴는 전술한 바와 같이 선택적으로 절단 가능한 간격 모이어티를 나타내며, 이는 일부 실시형태에서 에스테르 결합을 포함한다. (X.2)의 특정 예가 도 7에 도시되어 있다.

4.11 추가의 예시적 실시형태

본 개시내용 전반에 걸쳐 설명된 다양한 모이어티, 기 및 링커의 특정 실시형태는 본원에 기재된 모든 시약에 포함될 수 있음이 이해되어야 한다. 더욱이, 다양한 특정 실시형태는 특정 조합이 구체적으로 예시된 것처럼 임의의 조합으로 서로 조합될 수 있다. 특정 예로서, 본원에 기재된 표지 모이어티 LM의 특정 실시형태 중 임의의 하나는 본원에 기재된 비-뉴클레오시드 및 뉴클레오시드 고체 지지체 및 합성 시약의 구체적으로 예시된 실시형태 중 임의의 것에 포함될 수 있다. 다른 구체적인 예로서, 상기 구조식 (P.1)의 포스포라미다이트기와 같은 PEP기 PEP의 특정 실시형태 중 임의의 하나가 본원에 기재된 합성 시약들 중 임의의 것에 포함될 수 있다.

4.12 시약의 용도

본원에 기재된 다양한 시약은 합성 수지에 직접 로다민 염료로 표지된 올리고뉴클레오티드를 합성하기 위해 올리고뉴클레오티드의 단계적 합성에 사용될 수 있다. 따라서, 다양한 시약은 수많은 상이한 로다민으로 올리고뉴클레오티드를 합성적으로 표지화할 수 있는 능력을 이용 가능하게 하여 힘든 합성 후 개질의 필요성을 제거한다. 예시적인 합성 시약을 사용하여 NH 로다민 염료로 표지된 올리고뉴클레오티드를 합성하는 것은 도 8a에 예시되어 있다.

숙련된 기술자가 이해할 수 있는 바와 같이, NH-로다민 염료에 대한 도너, 억셉터 또는 심지어 켄쳐(quencher)로서 역할을 할 수 있는 포스포라미다이트 시약의 이용 가능성으로 인해, 본원에 기재된 시약은 현장에서 합성되는 에너지 전달 염료 및/또는 NH-로다민-켄쳐 염료 쌍으로 표지된 올리고뉴클레오티드를 합성하는 능력을 허용한다. 본원에 기재된 시약에 의해 제공되는 다용성을 보여주는 NH-로다민-플루오레세인 에너지 전달 염료 쌍으로 표지된 올리고뉴클레오티드의 예시적인 합성은 도 8B 및 9에 예시되어 있다. 본원에 기재된 시약은 사실상 임의의 NH-로다민 염료가 고체 지지체 및/또는 합성 시약에 포함될 수 있도록 하기 때문에, 특정 용도에 맞게 조정된 스펙트럼 특성을 가진 에너지 전달 염료 쌍으로 표지된 올리고뉴클레오티드는 합성 후 개질의 필요성이 없이 현장에서 편리하게 합성될 수 있다. 또한, 수많은 다양한 에너지 전달 염료 쌍 조합으로 표지화된 올리고뉴클레오티드는 개별 단량체 시약으로부터 합성될 수 있어, 특정 염료 쌍을 포함하는 합성 시약을 만들 필요가 없다. 염료 쌍의 각 구성원은 개재되는 연결 모이어티를 추가하거나 추가하지 않고 단계적 방식으로 초기 올리고뉴클레오티드에 부착될 수 있다.

도 8a를 참조하면, 지지체 결합 합성 올리고뉴클레오티드는 산으로 처리되어 5'-히드록실을 보호하는 DMT기를 제거하여 5'-탈보호된 지지체 결합 올리고뉴클레오티드를 생성한다. N-보호된 NH-로다민 포스포라미다이트 시약의 결합에 이은 산화는 락톤 개방 형태로 지지체-결합된 NH-로다민 표지된 올리고뉴클레오티드를 생성한다. 농축 수산화암모늄으로 처리하여 고체 지지체(수지)로부터 임의의 보호기를 제거하고 합성된 올리고뉴클레오티드를 절단하면 NH-로다민 염료로 표지된 올리고뉴클레오티드가 생성된다.

도 8b를 참조하면, 초기 지지체-결합된 올리고뉴클레오티드는 N-보호된 NH-로다민 포스포라미다이트 합성 시약을 올리고뉴클레오티드의 5'-히드록실에 결합함으로써 현장에서(in situ) 합성된 NH-로다민-플루오레세인 염료 쌍으로 표지될 수 있으며, 이는 산화 후 NH-로다민-표지된 올리고뉴클레오티드를 생성한다. DMT기를 제거한 다음 O-보호된 포스포라미다이트(예시된 특정 예에서 FAM-포스포라미다이트)와의 결합은 표지된 지지체-결합된 올리고뉴클레오티드를 생성한다. 절단 및 탈보호는 NH-로다민-FAM 에너지 전달 염료 쌍으로 표지된 올리고뉴클레오티드를 생성한다.

도 9를 참조하면, 보호된 NH-로다민-플루오레세인 에너지 전달 염료 쌍을 표지 모이어티로서 포함하는 고체 지지체 시약은 3회의 합성 주기를 거쳐 표지된 지지체-결합된 올리고뉴클레오티드를 생성할 수 있다. 고체 지지체로부터의 절단은 탈보호되고 표지된 올리고뉴클레오티드를 생성한다.

도너와 억셉터 염료를 연결하는 연결의 길이 및 특성은 포스포라미다이트 링커 시약을 사용하여 조작될 수도 있다. FAM-포스포라미다이트와의 결합 후 산화, 탈보호 및 절단은 올리고뉴클레오티드를 생성하며, 이는 NH-로다민-FAM 에너지 전달 염료 쌍으로 표지된다. 링커 포스포라미다이트에서 "Sp"는 이전에 정의된 바와 같이 스페이서이다. 예를 들어, "Sp"는 이전에 정의된 바와 같이 (Sp¹), (Sp²), (Sp³), (Sp⁴) 또는 (Sp⁵)를 나타낼 수 있다.

NH-로다민 및 FAM 염료를 연결하는 링커의 길이 및 특성은 FAM-포스포라미다이트와 결합하기 전에 추가 링커 포스포라미다이트를 결합함으로써 조정될 수 있다. 링커 포스포포라마이트는 동일할 수도 있고 상이할 수도 있다. 이러한 방식으로, 도너 및 억셉터 염료뿐만 아니라 도너와 억셉터를 연결하는 링커가 특정 목적에 맞게 조정된 에너지 전달 염료 쌍으로 표지된 올리고뉴클레오티드는 현장에서 쉽게 합성될 수 있다.

숙련된 기술자는 FAM에 대한 억셉터 역할을 하는 임의의 N-보호된 NH-로다민 시약이 사용될 수 있음을 인식할 것이다. 또한 다른 유형의 포스포미다이트 염료와 마찬가지로 다른 O-보호된 플루오레세인이 사용될 수 있다. 염료가 모노머로서 첨가되기 때문에, 이용 가능한 에너지 전달 염료 표지의 수는 합성에 필요한 포스포라미다이트 시약의 수보다 많다. 예를 들어, 9개의 상이한 에너지 전달 염료 쌍으로 표지된 올리고뉴클레오티드는 3개의 상이한 N-보호된 NH-로다민 포스포라미다이트 시약(시약 A, B 및 C) 및 3개의 상이한 O-보호된 플루오레세인 포스포라미다이트 시약(시약 1, 2 및 3): 올리고-A1, 올리고-A2, 올리고-A3, 올리고-B1, 올리고-B2, 올리고-B3, 올리고-C1, 올리고-C2 및 올리고-C3으로부터 함성될 수 있다.

현재의 세포 및 조직 기능성 분석에는 종종 제한되는 물질로부터 가능한 한 많은 정보를 추출해야 한다. 예를 들어, 종양 생검과 같은 샘플은 수집하기 어렵고, 일반적으로 소량의 사용가능한 핵산만을 수득한다. 단일의 표적 분석물의 PCR 검출 및 측정은 단일플렉스 검정법으로 지칭되며, 핵산 수준에서 임상 연구 샘플을 분석하기 위한 골드 표준이었고, 사반세기 이상 동안 생물학적 지식의 한계를 확장하는 데 매우 귀중한 것이었다.

그러나 임상 연구 표본으로부터 얻은 제한된 양의 핵산으로 인해 이러한 소중한 샘플을 가장 잘 활용하는 방법에 대해 선택하도록 종종 강요된다. 또한 샘플이 제한되어 있으면, 분석될 수 있는 유전자 자리의 수도 제한되어 샘플로부터 추출될 수 있는 정보의 양이 감소된다. 마지막으로, 다수의 단일 검정 반응을 설정하는 데 필요한 추가적인 시간과 재료는 복잡한 프로젝트의 비용을 상당히 증가시킬 수 있다.

핵산의 멀티플렉스 PCR 분석은 단일 샘플 분취량으로부터 하나 초과의 표적을 증폭하고 정량화하는 전략은 이러한 문제에 대한 매력적인 해법이다. 멀티플렉스 PCR에서는, 단일 PCR 반응으로 형광 염료를 포함하는 다수의 프로브를 사용하여 샘플 분취량이 조사된다. 이것은 해당 샘플로부터 추출될 수 있는 정보의 양을 증가시킨다. 멀티플렉스 PCR을 사용하면, 샘플 및 재료를 상당히 절약할 수 있다. 이러한 방법의 유용성을 증가시키기 위해 여러 쌍의 유전자 특이적 프라이머와 프로브를 사용하여 복수의 표적 서열을 동시에 증폭시키고 측정하는 멀티플렉스화된 PCR이 개발되어 왔다. 멀티플렉스화 PCR은 다음의 장점을 제공한다: 1) 효율성: 멀티플렉스 PCR은 여러 PCR 검정법을 단일 반응 내에 조합시킴으로써 샘플 물질을 보존하고 웰들 간의 변동을 방지하도록 돕는다. 멀티플렉스화는 민감도를 저하시키지 않고 복수의 분량으로 분할될 수 없는 희귀한 표적을 보유하는 샘플과 같이 제한된 샘플을 더욱 효율적인 사용을 가능하게 한다. 2) 경제성: 표적이 일제히 증폭되더라도, 이들의 형광 신호에 기반하는 증폭을 구별하는데 독특한 리포터 염료를 갖는 유전자 특이적 프로브를 사용하여 각각의 표적이 독립적으로 검출된다. 일단 최적화되면, 멀티플렉스화된 검정법은 독립적으로 증폭된 동일한 검정법보다 비용 효율적이다.

그러나, 현재 단일한 멀티플렉스 PCR 검정법으로 분석될 수 있는 표적의 수에는 제한이 있다. 멀티플렉스 PCR을 위한 실험적 설계는 단일 반응보다 더 복잡하다. 개별적인 표적을 검출하는데 사용되는 프로브는 고유한 스펙트럼을 가진 독특한 리포터 염료를 포함해야 한다. 실시간 검출 시스템의 여기 및 방출 필터의 설정은 제조사마다 달라지고, 따라서 실험 최적화 공정의 일부로 각각의 염료에 대해 기기를 보정해야 한다. 따라서, 멀티플렉스 PCR 검정법의 개발에서 하나의 제한사항은 단일 반응에서 효율적으로 측정될 수 있는 형광단 및 이에 따른 프로브의 수이다. 예를 들어, 멀티플렉스 PCR에서 상이한 형광 리포터 간의 신호 혼선은 정량화를 손상시키거나 위양성(false positive)을 유발할 수 있다. 따라서 스펙트럼 중첩을 최소화하는 형광단을 선택하는 것이 필수적이다. 추가적으로, 형광단, 구체적으로 이들의 방출 및 여기 스펙트럼은 사용할 PCR 기기, 구체적으로 각 필터 세트의 대역 통과 사양과 호환되어야 한다.

추가의 양태에서, 기재된 프로브를 사용하여 qPCR 또는 종결점 PCR과 같은 단일플렉스 또는 멀티플렉스 PCR을 수행하기 위한 방법이 제공된다. 종결점 PCR은 모든 PCR 순환이 완료된 이후의 분석이다. 주형(template)이 배가되면서 (기하급수적 단계) 정량화를 허용하는 qPCR과 달리, 종결점 분석은 증폭의 정점 유지 단계를 기초로 한다.

구체적으로, 복수의 표적 DNA 서열을 증폭하고, 검출하는 방법은 기술된 프로브를 포함하는 조성물 또는 반응 혼합물을 제공하는 단계, 반응 혼합물을 상기 복수의 표적 서열의 증폭이 일어날 수 있도록 열 순환 프로토콜에 적용하는 단계, 및 기술된 프로브의 형광을 다수의 증폭 순환 동안 적어도 한 번 검출함으로써 증폭을 모니터링하는 단계를 포함한다.

기술된 방법의 핵산 표적(들)은 당업자에게 알려진 임의의 핵산 표적일 수 있다. 또한, 표적은 낮은 돌연변이의 영역 또는 높은 돌연변이의 영역일 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 방법의 특히 유용한 용도 중 하나는 RNA 바이러스성 유전자와 같은 높게 돌연변이된 핵산, 또는 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)과 같은 유전적 가변성이 높은 영역을 표적화하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적은 법의학 샘플 및/또는 고정된 조직으로부터의 물질과 같이 단편화되거나 분해될 수 있다. 표적은 증폭에 알맞는 임의의 크기일 수 있다. 본원에 제공된 방법 및 조성물의 특히 유용한 용도 중 하나는 siRNA 및 miRNA와 같은 짧은 단편의 식별을 포함한다. 특히 소중한 또 다른 용도는 고정된 샘플 또는 환경에 노출되었던 샘플과 같이 단편화된 및/또는 분해된 핵산을 갖는 샘플을 위한 것이다. 따라서, 방법은 예를 들어 생검 조직 및 법의학 DNA에 사용될 수 있다. 표적은 정제되거나 정제되지 않을 수 있다. 표적은 시험관내에서 생산되거나 (예를 들어, cDNA 표적), 생물학적 샘플에서 발견될 수 있다 (예를 들어, RNA 또는 게놈 DNA (gDNA) 표적). 생물학적 샘플은 처리 없이 사용될 수 있거나, 생물학적 샘플은 본원에 개시된 방법을 방해할 수 있는 물질을 제거하도록 처리될 수 있다.

본원에 제공된 프로브는 진단 방법, 예를 들어 SNP 검출, 특이적 바이오마커의 식별 등에 사용될 수 있으며, 이로써 프로브는 예를 들어 바이러스, 박테리아, 기생충 및 진균을 포함하나 이에 한정되지 않는 인간 질환의 감염병 인자의 서열에 상보적이고, 이로써 환자의 핵산을 포함하는 샘플에서 감염원의 존재를 진단한다. 표적 핵산은 게놈 또는 cDNA 또는 mRNA 또는 합성, 인간 또는 동물 또는 미생물 등의 것일 수 있다. 다른 실시형태에서, 프로브는 감염원에 의해 유발되지 않는 질환 또는 장애를 진단하거나 예후(prognose)하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 프로브는 인간 또는 동물로부터의 샘플에서 돌연변이, 다형성 또는 대립유전자의 존재를 식별함으로써 암, 자가면역 질환, 정신병, 유전병 등을 진단하거나 예후하는데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 프로브는 돌연변이 또는 다형성을 포함한다. 추가적으로, 프로브는 질환 또는 장애에 대한 치료의 진행을 평가하거나 추적하는데 사용될 수 있다.

멀티플렉스 분석의 혜택을 받는 다른 영역은 인간 식별 분야에서 유전적 마커를 사용하는 것이다. 유전적 마커는 일반적으로 DNA 타이핑과 같은 분석에 관심이 있는 특성을 가진 게놈 DNA의 대립유전자를 갖는 다형성 유전자 자리의 세트이며, 여기서 개체는 그의 DNA의 변이에 기초하여 분화된다. 대부분의 DNA 타이핑 방법은 개체군에서 적어도 두 가지 다른 형태 또는 대립유전자로 나타나는 것으로 알려진 DNA 마커의 하나 이상의 영역의 길이 및/또는 서열 차이를 검출하고 분석하도록 설계된다. 이러한 변이는 "다형성"으로 지칭되며, 이러한 변이가 발생하는 임의의 DNA 영역은 "다형성 유전자 자리"로 지칭된다. DNA 타이핑을 수행하기 위한 하나의 가능한 방법은 PCR 증폭 기술(KB Mullis, 미국 특허 제4,683,202호)과 길이 변이 다형성 분석을 결합하는 것을 포함한다. 짧은 탠덤 반복(STR), 탠덤 반복의 미니 위성 및 가변 수(VNTR)는 길이 변화 다형성의 일부 예이다. 약 3 내지 7개의 뉴클레오티드의 반복 단위를 함유하는 STR은 증폭 프로토콜이 DNA의 다른 가변 길이 영역에서 가능한 것보다 더 작은 생성물을 생성하도록 설계될 수 있기 때문에 PCR 적용에서 유전적 마커로서 유용할만큼 충분히 짧다.

다수의 STR 유전자 자리를 포함하는 이러한 여러 시스템이 설명되었다. 예를 들어, 문헌[AMPFLSTR® SGMPLUS™ PCRAMPLIFICATION KIT USER'S MANUAL, Applied Biosystems, pp. i-x and 1-1 to 1-16 (2001)] 문헌[AMPFLSTR® IDENTIFILER® PCR AMPLIFICATION KIT USER'S MANUAL, Applied Biosystems, pp. i-x and 1-1 to 1-10 (2001)]; 미국 특허 제7,008,771호(JW Schumm et al.) 참조.

본 교시의 방법은 다수의 공-증폭된 유전자 자리로부터 증폭된 대립유전자(앰플리콘(amplicon))를 생성하기 위해 적절한 세트의 유전자 자리, 프라이머 및 증폭 프로토콜을 선택하는 것을 고려하며, 이 앰플리콘은 크기가 겹치지 않도록 설계될 수 있고/있거나, 크기가 겹치는 상이한 유전자 자리로부터의 대립유전자들을 구별할 수 있게 하는 방식으로 표지화될 수 있다. 또한, 이러한 방법은 단일 증폭 프로토콜 내에서 사용하기에 적합한 다수의 STR 유전자 자리의 선택을 고려한다.

본원에 개시된 것들에 더하여 성공적인 조합은, 예를 들어 유전자 자리 조합의 시행 착오, 프라이머 쌍 서열의 선택, 및 분석을 위한 모든 유전자 자리가 증폭될 수 있는 평형을 확인하기 위한 프라이머 농도의 조정에 의해 생성될 수 있다. 이들 교시의 방법 및 물질이 개시되면, 이들 교시의 방법 및 키트에서 사용하기 위한 유전자 자리, 프라이머 쌍 및 증폭 기술을 선택하는 다양한 방법이 당업자에게 제안될 가능성이 있다. 그러한 모든 방법은 첨부된 청구범위의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.

본 교시에 따라 사용하기 위한 유전자 자리의 세트를 선택하기 위해 다수의 상이한 기술들 중 임의의 것이 사용될 수 있다. 본 교시의 방법에 의해 분석된 유전자 자리를 선택하기 위해 어떤 방법이 사용될 수 있는지에 관계없이, 다양한 실시형태에서 멀티플렉스 분석을 위해 선택된 유전자 자리는 다음 특성들 중 하나 이상을 공유한다: (1) 이들은 DNA의 대립유전자 평가를 허용하기에 충분한 증폭 산물을 생성하고; (2) 유효한 표적 유전자 자리의 확장 또는 비특이적 앰플리콘의 생성 동안 추가 염기의 혼입으로 인해 멀티플렉스 증폭 단계 동안 아티팩트(artifact)를 만약 있더라도 거의 생성하지 않으며; (3) 폴리머라제에 의한 증폭 반응의 조기 종료로 인해 아티팩트를 만약 있더라도 거의 생성하지 않는다. 예를 들어, 문헌[JW Schumm et al. (1993), FOURTH INTERNATIONAL SYMPOSIUM ON HUMAN lDENTIFICATION, pp. 177-187, Promega Corp] 참조.

일반적으로, 올리고뉴클레오티드 프라이머는 화학적으로 합성될 수 있다. 프라이머 설계 및 선택은 PCR 최적화에서 일상적인 절차이다. 당업자는 관심 표적 유전자 자리를 증폭하기 위해 특정 프라이머를 쉽게 설계하거나 본원에 나열된 참고문헌으로부터 프라이머 세트를 얻을 수 있다. 모든 이들 프라이머는 본 교시의 범위 내에 있다.

예로서, 프라이머는 증폭 및/또는 멀티플렉스 시스템을 개발하기 위해 이용 가능하고 당업계에 공지된 다양한 소프트웨어 프로그램들 중 임의의 것을 사용하여 선택될 수 있다. 예를 들어, Primer Express® software (문헌[Applied Biosystems, Foster City, Calif.]) 참고. 소프트웨어 프로그램 사용의 예에서, 관심 유전자 자리의 영역으로부터 시퀀스 정보를 소프트웨어로 가져올 수 있다. 그 다음 소프트웨어는 다양한 알고리즘을 사용하여 사용자의 사양에 가장 잘 맞는 프라이머를 선택한다.

게놈 DNA 샘플은 DNA의 후속 증폭과 호환되는 샘플 준비를 위한 임의의 절차를 사용하여 본 교시의 방법에 사용하기 위해 준비될 수 있다. 이러한 많은 절차는 당업자에게 알려져 있다. 일부 예는 페놀 추출에 의한 DNA 정제(J. Sambrook et al. (1989), in MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, SECOND EDITION, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., pp. 9.14-9.19), 및 염 침전에 의한 부분적 정제(S. Miller et al. (1988), NUCL. ACIDS REs. 16:1215) 또는 chelex (PS Walsh et al. (1991), BIOTECHNIQUES 10:506-513; CT Corney et al. (I 994), J. FORENSIC Ser. 39: 1254) 및 처리되지 않은 혈액을 사용한 정제되지 않은 물질의 방출 (J. Burckhardt (1994), PCRMETHODS AND APPLICATIONS 3:239-243; RBE McCabe (1991), PCR METHODS AND APPLICATIONS 1:99-106; BY Nordvag (1992), BIOTECHNIQUES 12:4 pp. 490-492)이다.

본 교시의 방법을 사용하여 분석될 적어도 하나의 DNA 샘플이 인간 게놈 DNA인 경우, DNA는 예를 들어 혈액, 정액, 질 세포, 모발, 타액, 소변, 뼈, 협측 샘플, 태반 세포 또는 태아 세포를 포함하는 양수, 융모막 융모 및/또는 이들 또는 기타 조직들 중 임의의 것의 혼합물 중 하나 이상과 같은 조직 샘플로부터 제조될 수 있다.

혈액 또는 협측 샘플을 포함하는 샘플은 또한 FTA® 페이퍼(Whatman Inc., Piscataway, NJ), Bode Buccal Collector 또는 스와브(swab)로부터 직접 처리될 수 있다. 스와브의 예에는 Copan 4N6 Forensic Flocked Swab (Copan, P/N 3520CS01, Murrieta, CA), Omi Swab (Whatman Inc., P/N 10005) 및 Puritan Cotton Swab (Puritan, P/N 25-806 1WC EC, 다양한 의료 공급업체)가 포함되지만 이에 제한되지 않는다.

일단 게놈 DNA 샘플이 준비되면, 표적 유전자 자리는 본 교시의 멀티플렉스 증폭 단계에서 공-증폭될 수 있다. 예를 들어 PCR(RK Saiki et al. (1985), SCIENCE 230: 1350-1354), 전사 기반 증폭((DY Kwoh and TJ Kwoh (1990), AMERICAN BIOTECHNOLOGY LABORATORY, October, 1990)) 및 가닥 변위 증폭(SDA) (GT Walker et al. (1992), PROC. NATL. ACAD. Ser., U.S.A. 89: 392-396)과 같은 다수의 상이한 증폭 방법들 중 임의의 것을 사용하여 유전자 자리를 증폭시킬 수 있다. 본 교시의 일부 실시형태에서, 멀티플렉스 증폭은 PCR을 통해 수행될 수 있으며, 여기서 DNA 샘플은 멀티플렉스의 각 유전자 자리에 특정한 프라이머 쌍을 사용하여 증폭이 수행된다. 표준 PCR의 화학적 구성요소는 일반적으로 용매, DNA 폴리머라제, 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트("dNTP"), 올리고뉴클레오티드 프라이머, 2가 금속 이온, 및 PCR 증폭을 위한 표적(들)을 포함할 것으로 예상되는 DNA 샘플을 포함한다. 물이 일반적으로 PCR용 용매로서 사용될 수 있으며, 전형적으로 완충제 및 KCL과 같은 비 완충 염을 포함한다. 완충제는 Tris-HCl과 같지만 이에 제한되지 않는 당업계에 알려진 임의의 완충액일 수 있으며, PCR 결과를 최적화하기 위해 일상적인 실험에 따라 변할 수 있다. 당업자는 최적의 완충 조건을 쉽게 결정할 수 있다. PCR 버퍼는 증폭에 사용되는 특정 효소에 따라 최적화될 수 있다.

뉴클레오티드 트리포스페이트를 PCR에서 증폭된 산물로 중합하는 효소는 임의의 DNA 폴리머라제일 수 있다. DNA 폴리머라제는 예를 들어 당업계에 알려진 임의의 내열성 폴리머라제일 수 있다. 본 교시에서 사용할 수 있는 일부 폴리머라제의 예는 테르무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus), 테르무스 테르모필루스(Thermus thermophilus), 테르모코쿠스 리토랄리스(Thermococcus litoralis), 바실루스 스테아로테르모필루스(Bacillus stearothermophilus), 테르모토가 마리티마(Thermotoga maritima) 및 피로코쿠스(Pyrococcus) sp와 같은 유기체로부터의 DNA 폴리머라제이다. 효소는 여러 가능한 방법들 중 임의의 것에 의해 획득할 수 있으며; 예를 들어, 소스(source) 박테리아에서 분리되거나, 재조합 DNA 기술에 의해 생산되거나, 또는 상업적 출처에서 구입할 수 있다. 이러한 상업적으로 입수 가능한 DNA 폴리머라제의 일부 예는 AmpliTaq Gold® DNA 폴리머라제; AmpliTaq® DNA 폴리머라제; AmpliTaq® DNA 폴리머라제 Stoffel Fragment; rTth DNA 폴리머라제; 및 rTth DNA 폴리머라제, XL (모두 Applied Biosystems(Foster City, Calif.)에 의해 제조됨)을 포함한다. 적합한 폴리머라제의 다른 예는 바실루스 스테아로테르모필루스로부터의 Tne, Bst DNA vhfflajfkwp zms eksvus, 테르모코쿠스 리토랄리스로부터의 Vent 및 Vent Exo, 테르모토가 마리티마로부터의 Tma, 피로코쿠스 sp.로부터의 Deep Vent 및 Deep Vent Exo- 및 Pfu, 및 이들의 돌연변이체, 변이체 및 유도체를 포함한다.

프라이머의 형광 표지화가 멀티플렉스 반응에서 사용되는 경우, 일반적으로 적어도 3개의 상이한 표지가 상이한 프라이머를 표지화하는 데 사용될 수 있다. 멀티플렉스 반응의 생성물을 평가하기 위해 크기 마커가 사용되는 경우, 크기 마커를 제조하는 데 사용되는 프라이머는 반응에서 관심있는 유전자 자리를 증폭하는 프라이머와 다른 표지로 표지화될 수 있다. 자동 형광 이미징 및 분석의 출현으로, 멀티플렉스 증폭 제품의 더 빠른 검출 및 분석이 달성될 수 있다.

본 교시의 일부 실시형태에서, 형광단은 예를 들어 프라이머에 공유 결합됨으로써 멀티플렉스 증폭의 적어도 하나의 프라이머를 표지하는 데 사용될 수 있고, 따라서 형광성의 표지된 프라이머를 생성한다. 일부 실시형태에서, 멀티플렉스에서 상이한 표적 유전자 자리에 대한 프라이머는 상이한 형광단으로 표지될 수 있으며, 각각의 형광단은 형광단의 방출 파장에 따라 상이한 착색 생성물을 생성한다. 이러한 다양하게 표지된 프라이머는 동일한 멀티플렉스 반응, 및 이어서 함께 분석되는 각각의 증폭 산물에서 사용될 수 있다. 특정 유전자 자리를 증폭하는 쌍의 정방향(forward) 또는 역방향(reverse) 프라이머가 표지될 수 있지만, 정방향이 더 자주 표지될 수 있다.

PCR 산물은 체질(sieving) 또는 비-체질 배지에서 분석될 수 있다. 이러한 교시의 일부 실시형태에서, 예를 들어, PCR 산물은 전기 영동, 예를 들어 문헌[H. Wenz et al. (1998), GENOME REs. 8 :69-80 (또한 E. Buel et al. (1998), J. FORENSIC SCI. 43 :(1), pp. 164-170 참조)]에 기재된 바와 같은 모세관 전기 영동, 또는 문헌[M. Christensen et al. (1999), SCAND. J. CLIN. LAB. INVEST. 59(3): 167-177]에 기재된 바와 같은 슬래브 겔 전기 영동, 또는 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동(예를 들어 문헌[J. Sambrook et al. (1989), in MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, SECOND EDITION, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., pp. 13.45-13.57] 참조)에 의해 분석될 수 있다. 전기 영동에서 DNA 단편의 분리는 주로 차별적인 단편 크기에 기초한다. 증폭 산물은 또한 크로마토그래피로, 예를 들어 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 분석될 수 있다.

증폭된 대립유전자가 분리되면, 이러한 대립유전자와 예를 들어 겔 또는 모세관에 있는 임의의 다른 DNA(예를 들어, DNA 크기 마커 또는 대립유전자 래더)가 시각화되고 분석될 수 있다. 종종, 멀티플렉스 유전자 자리의 검출 방법은 형광에 의한 것일 수 있다. 예를 들어, 위의 문헌[JW Schumm et al. in PROCEEDINGS FROM THE EIGHTH INTERNATIONAL SYMPOSIUM ON HUMAN IDENTIFICATION, pub. 1998 by Promega Corporation, pp. 78-84; E. Buel et al. (1998)] 참조. 멀티플렉스 반응에서 각 유전자 자리를 검출하기 위해 형광 표지된 프라이머가 사용되는 경우, 증폭 후 형광 검출기를 사용하여 표지된 생성물이 검출될 수 있다.

DNA 샘플의 각 유전자 자리에 존재하는 대립유전자의 크기는 알려진 크기의 DNA 마커와 같은 전기 영동의 크기 표준과 비교하여 결정될 수 있다. 둘 이상의 다형성 STR 유전자 자리를 포함하는 멀티플렉스 증폭의 평가를 위한 마커는 또한 평가되는 유전자 자리 각각에 대한 유전자 자리-특이적 대립유전자 래더 또는 대립유전자 래더의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌[C. Puers et al. (1993), AM. J. HUM. GENET. 53:953-958; C. Puers et al. (1994), GENOMICS 23:260-264] 참조. 또한, STR 유전자 자리의 검출에 사용하기에 적합한 일부 대립유전자 래더, 및 거기에 개시된 래더 구성의 일부 방법에 대한 설명을 위해 미국 특허 제5,599,666호; 제5,674,686호; 및 제5,783,406호를 참조한다. 개별 유전자 자리에 대한 대립유전자 래더를 구성한 후, 래더는 증폭 산물과 동시에 전기 영동될 수 있다. 각 대립유전자 래더는 대응 유전자 자리로부터 대립유전자와 함께 이동한다.

본 교시의 멀티플렉스 반응의 산물은 또한 내부 레인(lane) 표준, 즉 예를 들어 증폭 산물과 동일한 모세관에서 전기 영동되도록 구성된 특수한 유형의 크기 마커를 사용하여 평가될 수 있다. 내부 레인 표준은 알려진 길이의 일련의 단편을 포함할 수 있다. 내부 레인 표준은 또한 증폭 반응에서 다른 염료와 구별 가능한 형광 염료로 표지될 수 있다. 레인 표준은 증폭된 샘플 또는 크기 표준/대립유전자 래더와 혼합되고 겔 전기 영동의 상이한 레인 또는 모세관 전기 영동의 상이한 모세관에서의 이동을 비교하기 위해 둘 중 하나로 전기 영동될 수 있다. 내부 레인 표준의 이동의 변화는 분리 매체의 성능 변화를 나타내는 역할을 할 수 있다. 이 차이의 정량화 및 대립유전자 래더와의 상관 관계는 다른 레인 또는 모세관에서 전기 영동된 증폭 산물의 보정, 및 알려지지 않은 샘플에서 대립유전자의 크기 결정의 정정을 제공할 수 있다.

형광 염료를 사용하여 증폭 산물을 표지화하는 경우, 전기 영동 및 분리된 산물은 형광 검출 장비, 예컨대 ABI PRISM® 310 또는 3 l30xl 유전자 분석기, 또는 ABI PRISM® 37 DNA 시퀀서(Applied Biosystems, Foster City, Calif.); 또는 Hitachi FMBIO™ II 형광 스캐너 (Hitachi Software Engineering America, Ltd., South San Francisco, Calif.)를 사용하여 분석될 수 있다. 본 교시의 다양한 실시형태에서, PCR 산물은 ABI PRISM® 3130xl 유전자 분석기(Applied Biosystems)와 같은 전기 영동 기기와 함께 모세관 겔 전기 영동 프로토콜에 의해 분석될 수 있으며, 전기 영동된 증폭 산물의 대립유전자 분석은 예를 들어 Applied Biosystems의 GeneMapper® ID Software v3.2를 사용하여 수행될 수 있다. 다른 실시형태에서, 증폭 산물은 예를 들어 ABI PRISM® 377 자동 형광 DNA 시퀀서용으로 제조된 바와 같은 약 4.5%, 29:1 아크릴아미드:비스 아크릴아미드, 8M 우레아 겔에서 전기 영동에 의해 분리될 수 있다.

본 교시는 또한 전술한 프로세스를 이용하는 키트에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 기본 키트는 하나 이상의 유전자 자리 특이적 프라이머를 갖는 용기를 포함할 수 있다. 키트는 또한 선택적으로 사용 설명서를 포함할 수 있다. 키트는 또한 다른 선택적 키트 구성요소, 예를 들어 특정 유전자 자리 각각에 대한 하나 이상의 대립유전자 래더, 증폭을 위한 충분한 양의 효소, 증폭을 촉진하기 위한 증폭 완충액, 효소 활성을 촉진하는 2가 양이온 용액, 증폭 중 가닥 확장을 위한 dNTP, 전기 영동을 위한 증폭된 물질의 준비를 위한 로딩 용액, 주형 제어로서의 게놈 DNA, 물질이 분리 매체에서 예상대로 이동하도록 보장하는 크기 마커, 사용자를 교육하고 사용 오류를 제한하기 위한 프로토콜 및 설명서를 포함할 수 있다. 키트에서의 다양한 시약의 양은 프로세스의 최적 감도와 같은 여러 요인에 따라 달라질 수 있다. 수동 용도에 사용하기 위한 시험 키트 또는 자동화된 검출기 또는 분석기와 함께 사용하기 위한 시험 키트를 제공하는 것은 이러한 교시의 범위 내에 있다.

임상 환경(setting)에서, STR 마커는 예를 들어 골수 이식에서 도너 생착 정도를 모니터링하는 데 사용될 수 있다. 병원에서, 이러한 마커는 또한 표본 일치 및 추적에 유용할 수 있다. 이러한 마커는 또한 인간 인종 및 인종 그룹 차이에 대한 인구 생물학 연구(DB Goldstein et al. (1995), PROC. NATL. ACAD. Ser. U.S.A. 92:6723-6727), 진화 및 종 다양성, 및 동식물 분류군의 변이(MW Bruford et al. (1993), CURR. BIOL. 3:939-943)와 같은 다른 과학 분야에도 진출했다.

미니 STR(약 200개 미만의 염기쌍의 유전자 자리)의 증폭은 본원에 참고로 포함되는 문헌[MD Coble (2005), J. FORENSIC SCI. 50(1):43-53]에서 입증되는 바와 같이 고도로 분해된 DNA의 프로파일링 분석을 허용한다. 표 1(표 1에 대한 2010년 11월 15일에 출원된 미국 특허출원 제61/413,946호 및 2011년 8월 22일에 출원된 특허출원 제61/526,195호 참조)은 또한 프라이머 증폭 세트 내에서 STR 마커를 증폭하는 데 사용되는 프라이머의 위치에 따라 미니-STR 유전자 자리로 간주될 수 있는 유전자 자리를 제공한다.

DNA 농도는 당업자에게 공지된 임의의 표준 DNA 정량화 방법을 사용하여 본 교시의 방법에서 사용하기 전에 측정될 수 있다. 이러한 정량화 방법은 예를 들어 위의 문헌[J. Sambrook et al. (1989)] 부록 E.5에 기재된 바와 같은 분광 광도 측정; 또는 문헌[C F Brunk et al. (1979), ANAL. BIOCHEM. 92: 497-500]에 의해 설명된 것과 같은 측정 기술을 사용하는 형광 측정 방법론을 포함한다. DNA 농도는 문헌[J S Waye et al. (1991), J. FORENSIC SCI. 36:1198-1203 (1991)]에 의해 기술된 것과 같은 인간 특이적 프로브와 DNA 표준의 혼성화 양을 비교함으로써 측정될 수 있다. 증폭 반응에서 너무 많은 주형 DNA를 사용하면 증폭 인공물이 생성될 수 있으며, 이는 진정한 대립유전자를 나타내지 않는다.

프라이머의 형광 표지화가 멀티플렉스 반응에서 사용되는 경우, 일반적으로 적어도 3개의 다른 표지, 적어도 4개의 다른 표지, 적어도 5개의 다른 표지, 적어도 6개의 다른 표지가 사용된다. 예를 들어, 기존의 상업적 분석은 6개의 고유한 염료 표지(VeriFiler™ Plus PCR Amplification Kit, Thermo Fisher Scientific)를 사용한다. 멀티플렉스 형광 염료 기반 반응의 분석에 사용되는 기기는 형광 염료를 여기시키기 위해 방출할 수 있는 빛의 파장에 제한이 있으며 검출할 수 있는 염료로부터 방출되는 빛의 파장에 제한이 있다. 적어도 8개 표지, 적어도 10개 표지 또는 적어도 16개 표지를 사용하여 멀티플렉스 분석을 설계하려면, 피크 방출 피크가 거의 또는 전혀 겹치지 않고 서로 잘 분해(resolve)되도록 고유한 스펙트럼 방출 특성을 가진 염료 범위가 필요하다. 또한 형광 염료 표지는 특정 세트의 여기 파장을 생성할 수 있고 특정 범위의 검출 가능한 방출 파장을 갖는 기기에서 모두 검출될 수 있어야 한다. 본원에 기재된 로다민 유도체의 부류는 기존 염료 화합물에서 사용할 수 없는 고유한 스펙트럼 특성을 가진 dy 표지를 제공하며, 따라서 현재 멀티플렉스 분석에 일반적으로 사용되는 기존 레이저 기술을 사용하여 최대 8, 10, 12, 16개 또는 그 이상의 다른 표지로 멀티플렉스 반응에 사용되는 형광 염료 표지의 수를 늘릴 수 있는 가능성을 열어준다. 도구 능력이 개선됨에 따라, 8개 초과의 표지(예를 들어, 적어도 10개, 적어도 12개 또는 적어도 16개의 다른 표지)을 구현하는 멀티플렉스 분석이 다른 프라이머를 표지화하는 데 사용될 수 있다. 멀티플렉스 반응의 생성물을 평가하기 위해 크기 마커가 사용되는 경우, 크기 마커를 제조하는 데 사용되는 프라이머는 반응에서 관심있는 유전자 자리를 증폭하는 프라이머와 다른 표지로 표지화될 수 있다. 자동 형광 이미징 및 분석의 출현으로, 멀티플렉스 증폭 제품의 더 빠른 검출 및 분석이 달성될 수 있다.

다음은 당업계에 잘 알려져 있고 다수의 형광 표지를 사용하는 분석을 제공하기 위해 본 교시에 기재된 화합물과 조합하여 사용하기에 적합한 가능한 형광단의 일부 예이다. 목록은 예시를 위한 것이며 결코 완전한 것이 아니다. 일부 가능한 형광단은, 492 nm에서 최대로 흡수하고 520 nm에서 최대로 방출하는 플루오레세인(FL); 555 nm에서 최대로 흡수하고 580 nm에서 최대로 방출하는 N,N,N',N'-테트라메틸-6-카르복시로다민(TAMRA™); 495 nm에서 최대로 흡수하고 525 nm에서 최대로 방출하는 5-카르복시플루오레세인(5-FAM™); 525 nm에서 최대로 흡수하고 555 nm에서 최대로 방출하는 2', 7'-디메톡시-4',5'-디클로로-6-카르복시플루오레세인(JOE™); 585 nm에서 최대로 흡수하고 605 nm에서 최대로 방출하는 6-카르복시-X-로다민(ROX™), 552 nm에서 최대로 흡수하고 570 nm에서 최대로 방출하는 CY3™; 643 nm에서 최대로 흡수하고 667 nm에서 최대로 방출하는 CY5™; 521 nm에서 최대로 흡수하고 536 nm에서 최대로 방출하는 테트라클로로-플루오레세인(TET™); 및 535 nm에서 최대로 흡수하고 556 nm에서 최대로 방출하는 헥사클로로-플루오레세인(HEX™). 546 nm에서 최대로 흡수하고 575 nm에서 최대로 방출하는 NED™; 대략 520 nm에서 최대로 방출하는 6-FAM™; 약 550 nm에서 최대로 방출하는 VIC®; 약 590 nm에서 최대로 방출되는 PET®; 및 약 650 nm에서 최대로 방출하는 LIZ™을 포함한다. 미국 특허 제6,780,588호(S R Coticone et al.)] 문헌[AMPFLSTR® IDENTIFILER™ PCR AMPLIFICATION KIT USER'S MANUAL, pp. 1-3, Applied Biosystems (2001)] 참고. 위에 나열된 방출 및/또는 흡수 파장은 전형적이며 단지 일반적인 지침 목적으로 사용될 수 있고; 실제 피크 파장은 상이한 용도에 대해 상이한 조건 하에 변할 수 있다. 당업자에게 공지되고 아래에 제공되는 바와 같이 원하는 흡광도 및 방출 스펙트럼 및 색상에 대해 추가 형광단이 선택될 수 있다:

본원에 기재된 비대칭 로다민 화합물은 멀티플렉스 분석에서 하나 이상의 추가 형광 표지와 조합하여 사용될 수 있다. 본 교시의 다양한 실시형태는 적어도 8개의 상이한 염료를 포함하는 단일 멀티플렉스 반응을 포함할 수 있다. 적어도 8개의 염료는 상기 나열된 염료들 중 임의의 8개를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 8개의 염료 세트는 본원에 기재된 바와 같은 비대칭 로다민 화합물과 함께 추가 비대칭 로다민 화합물, 예컨대 국제출원 PCT/US2019/67925호에 기재된 것을 포함한다. 다른 실시형태에서, 적어도 10개 또는 적어도 12개의 상이한 염료를 포함하는 단일 멀티플렉스 반응이 사용될 수 있거나, 이들 범위 내의 임의의 수의 염료가 사용될 수 있다.

또한 기술된 프로브를 포함하는 반응 혼합물 또는 마스터 믹스와 같은 조성물이 제공된다. 일 실시형태에서, 실시간 또는 정량적 PCR 또는 종결점 PCR과 같은 PCR용 조성물은 기재된 프로브들 중 적어도 하나를 포함한다. 일 실시형태에서, PCR용 조성물 또는 반응 혼합물 또는 마스터 믹스 (예를 들어, qPCR 또는 종결점 PCR)는 4차 표적 핵산의 검출을 허용하는 프로브 및 5차 및/또는 6차 표적 핵산 중 적어도 하나의 검출을 허용하는 기재된 프로브(들)를 포함하고, 각각의 기술된 프로브는 FRET 도너 모이어티, 즉 형광단 및 FRET 억셉터 모이어티, 즉 켄쳐로 구성되고, 여기서 형광단은 약 650 내지 720 nm의 최대 방출을 갖는다. 본원에 기술된 켄쳐의 최대 흡광도는 660 내지 668 nm이다. 본원에 기술된 켄쳐의 흡광도 범위는 530 내지 730 nm이다. 대안적 실시형태에서, 기재된 형광단 및 켄쳐를 선택된 올리고뉴클레오티드에 컨쥬게이션하기 위한 표지화 시약이 제공된다.

또한, 이러한 조성물 또는 반응 혼합물 또는 마스터 믹스는 다음의 목록으로부터 선택된 하나 또는 여러 개의 화합물 및 시약을 포함할 수 있다: 폴리머라제 연쇄 반응에 적용가능한 완충액, 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트 (dNTP), 5' 내지 3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 폴리머라제, 적어도 한 쌍 또는 여러 쌍의 증폭 프라이머 및/또는 추가적인 프로브.

일부 실시형태에서, 제공된 방법은 증폭 산물을 사용하여 표적 폴리뉴클레오티드의 유전자형을 결정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제공된 방법은 증폭 산물을 사용하여 표적 폴리뉴클레오티드의 카피(copy) 수를 결정하는 것을 추가로 포함한다.

참고 문헌, 특허, 특허출원, 과학 문헌 및 기타 인쇄된 간행물, 뿐만 아니라 본원에 언급된 Gen Bank 데이터베이스 서열에 대한 수탁 번호, 특히 국제출원 PCT/US2019/67925호는 모두 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.

당업자가 이해하는 바와 같이, 본 교시의 정신을 벗어나지 않고 본 교시의 다양한 실시형태에 대해 수많은 변경 및 수정이 이루어질 수 있다. 그러한 모든 변형은 이러한 교시의 범위 내에 포함되도록 의도된다.

달리 언급된 것을 제외하고, 본 실시형태의 방법 및 기술은 일반적으로 당업계에 잘 알려진 통상적인 방법에 따라 그리고 본 명세서 전반에 걸쳐 인용되고 논의되는 다양한 일반적이고 보다 구체적인 참고 문헌에 기재된 바와 같이 수행된다. 예를 들어, 문헌[Loudon, Organic Chemistry, Fourth Edition, New York: Oxford University Press, 2002, pp. 360-361, 1084-1085]; 문헌[Smith and March, March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, Fifth Edition, Wiley-Interscience, 2001] 참조.

본원에 기재된 화합물에 대한 화학적 명명법은 일반적으로 상업적으로 입수 가능한 ACD/Name 2014(ACD/Labs) 또는 ChemBioDraw Ultra 13.0(Perkin Elmer)을 사용하여 유도되었다.

명확성을 위해 별도의 실시형태의 맥락에서 설명된 본 개시내용의 특정 특징은 또한 단일 실시형태에서 조합되어 제공될 수도 있다는 것이 이해된다. 역으로, 간략화를 위해 단일 실시형태의 문맥에서 설명되어 있는 본 개시내용의 다양한 특징은 개별적으로 또는 임의의 적합한 하위조합으로 제공될 수도 있다. 변수로 표시되는 화학 기에 관한 실시형태의 모든 조합은, 그러한 조합이 안정한 화합물(즉, 분리, 특성화 및 생물학적 활성에 대해 시험될 수 있는 화합물)인 화합물을 포함하는 정도로, 마치 각각 및 모든 조합이 개별적이고 명시적으로 개시되는 것처럼 본 개시내용에 구체적으로 포함되고 본원에 개시된다. 또한, 이러한 변수를 설명하는 실시형태에 열거된 화학 기의 모든 하위 조합은 또한 본 개시내용에 구체적으로 포함되고, 마치 화학 기의 각각 및 모든 그러한 하위 조합이 본원에 개별적이고 명시적으로 개시되는 것처럼 본원에 개시된다.

화학적 합성

이제, 설명의 방법에 유용한 예시적인 화학 물질이 아래의 일반적인 제조를 위한 예시적인 합성 스킴 및 다음의 특정 예를 참조하여 설명될 것이다. 기술자는 본원에서 다양한 화합물을 얻기 위해 출발 물질이 적절하게 선택되어 궁극적으로 원하는 치환기가 원하는 생성물을 생성하기 위해 적절한 보호와 함께 또는 보호없이 반응 스킴을 통해 수행될 수 있음을 인식할 것이다. 대안적으로, 궁극적으로 원하는 치환기 대신에, 반응 스킴을 통해 수행될 수 있고 원하는 치환기로 적절하게 대체될 수 있는 적합한 기를 사용하는 것이 필요하거나 바람직할 수 있다. 또한, 당업자는 특정 펜던트 기의 작용성과 호환되는 임의의 순서로 아래의 스킴에 나타낸 변환이 수행될 수 있음을 인식할 것이다.

모든 일반 화학 물질은 Fisher Scientific, Acros 또는 Alfa Aesar와 같은 상업적 화학 회사에서 구입했다. 순상 플래쉬 크로마토그래피에는 Fisher Scientific의 실리카 겔(220 내지 400 메쉬)이 사용되었다. 역상 크로마토그래피는 JT Baker의 옥타데실 작용화된 실리카 겔을 사용하여 수행되었다. 모든 크로마토그래피 용매 구배는 단계적이었다. 박층 크로마토그래피(TLC)는 EM Science의 알루미늄 지지 실리카겔 슬라이드 상에서 수행되었다. 역상 TLC는 Analtech의 HPTLC RP18F Uniplate 플레이트 상에서 수행되었다. 개발된 스팟은 장파장 및 단파장 UV 조사 모두로 시각화되었다.

NMR 스펙트럼은 용매 피크에 대해 참조된 바리안(Varian) 400 MHz NMR에서 결정되었다. HPLC는 다이오드 어레이 검출기 및 다수의 채널 파장을 갖는 애질런트(Agilent) 1200 HPLC에서 수행되었다. 전형적인 용출은 애질런트 퍼슈트(Agilent Pursuit) C8 150 x 4.6 mm 5 μ 컬럼을 통해 아세토니트릴 및 0.1M 트리에틸암모늄 아세테이트(TEAA)의 구배로 1 ml/분으로 실행되었다. LCMS 데이터는 PE Sciex API 150 EX 질량 분석기에 연결된 애질런트 1200 LC 시스템을 사용하여 얻었다. MS 데이터는 API Sciex 4000 질량 분석기에서 직접 주입에 의해 얻었다.

무수 용매는 오븐 건조 주사기로 질소 분위기 하에서 조작되었다. 본원에서 사용되는 용어 "워크업(workup)"은 다음 단계를 포함하는 정제 방법을 지칭한다: 언급된 유기 용매에 반응 혼합물을 용해 또는 희석하는 단계, 언급된 수용액 또는 물로 세척하는 단계, 조합된 유기층을 포화 NaCl로 1회 세척하는 단계, 무수 Na₂SO₄로 용액을 건조시키는 단계, 건조제를 여과하는 단계, 용매를 진공에서 제거하는 단계.

실시예 1: 비대칭 로다민 염료의 제조.

단계 1: 10-메톡시-5,5,7-트리메틸-2,3-디하이드로-1H,5H-피리도[3,2,1-ij]퀴놀린, 2의 제조

7-메톡시-2,2,4-트리메틸-1,2-디하이드로퀴놀린, 1(8.00 g, 39.4 mmol, A. Rosowsky, E.J. Modest, JOC, 1965, 30, 1832.)을 아세토니트릴(125 ml)에 용해시키고 1-브로모-3-클로로프로판(24.8 g, 157 mmol), 요오드화나트륨(47.2 g, 315 mmol) 및 탄산나트륨(8.35 g, 78.8 mmol)과 혼합하였다. 혼합물을 23시간 동안 환류시켰다. 혼합물을 여과하고, 여액을 농축하고, DCM에서 물로 세척하고, 워크업했다. 조 잔류물을 20% DCM/헥산으로 용출하는 실리카겔 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 회백색 고체로서 2를 수득하였다(8.28 g, 86%). ¹H NMR (400 MHz, CD₂Cl₂): δ 6.85 (d, 1H), 6.15 (d, 1H), 5.15 (s, 1H), 3.75 (s, 3H), 3.22 (m, 2H), 2.59 (m, 2H), 1.90 (s, 3H), 1.87 (m, 2H), 1.28 (s, 6H). MS: 계산치 244.17, 관측치 244.15 (MH⁺).

단계 2: 5,5,7-트리메틸-2,3-디하이드로-1H,5H-피리도[3,2,1-ij]퀴놀린-10-올, 3의 제조

화합물 2(8.28 g, 34.0 mmol)를 브롬화수소산(50 ml)으로 1시간 동안 환류시켰다. 용액을 중탄산나트륨으로 부분적으로 중화시켰다. 혼합물을 EtOAc로 추출하고, EtOAc 층을 물로 세척하고 워크업하여 옅은 오렌지색 고체로서 3을 수득하였다(7.49 g, 98%). ¹H NMR (400 MHz, CD₂Cl₂): δ 6.75 (d, 1H), 6.02 (d, 1H), 5.12 (s, 1H), 3.25 (m, 2H), 2.55 (m, 2H), 1.90 (m, 5H), 1.25 (s, 6H). MS: 계산치 230.15, 관측치 230.13 (MH⁺).

단계 3: 2,2,4-트리메틸-1,2-디하이드로퀴놀린-7-올, 4의 제조

7-메톡시-2,2,4-트리메틸-1,2-디하이드로퀴놀린, 1(10.00 g, 49.2 mmol)을 브롬화 수소산(50 ml)으로 6시간 동안 환류시켰다. 혼합물을 실온으로 냉각시킨 다음 빙욕에서 냉각시켰다. 생성된 고체를 흡입 여과로 수집하고 얼음물로 세척하였다. 그 다음 고체를 50% EtOAc/물과 혼합하고 중탄산 나트륨으로 중화시켰다. 유기 층을 유지하고, 수성 층을 EtOAc로 2회 추출하고, EtOAc 층을 합하고, 워크업하였다. 생성된 고체를 뜨거운 DCM/헥산 침전으로부터 정제한 다음 10% 내지 20% EtOAc/헥산으로 용출하는 실리카겔 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 회백색/담황색 고체로서 4(Koelmel, Dominik K. et al., Organic & Biomolecular Chemistry, 2013, 11(24), 3954-3962)를 수득하였다(7.45 g, 80%). ¹H NMR (400 MHz, CD₂Cl₂): δ 6.95 (m, 1H), 6.11 (m, 1H), 5.95 (s, 1H), 5.22 (s, 1H), 1.97 (s, 3H), 1.28 (s, 6H).

단계 4: 제조 3,6-디클로로-2-(7-히드록시-2,2,4-트리메틸-1,2-디하이드로퀴놀린-6-카르보닐)-4-(이소프로폭시카르보닐)벤조산, 6 및 7

2,2,4-트리메틸-1,2-디하이드로퀴놀린-7-올, 4, (9.37 g, 49.5 mmol) 및 3,6-디클로로트리멜레트산 이소프로필 에스테르, 5, (18.01, 59.4 mmol; 5는 국제공개 WO 2002/30944호 - 5의 제조를 위해 본원에 참고로 포함됨 - 에 기재된 방법에 따라 제조됨)를 톨루엔(95 ml)에서 혼합하고 3.5시간 동안 환류시켰다. 냉각 후, 톨루엔을 제거하고, 생성된 고체를 5% 내지 10% MeOH/DCM으로 용출하는 실리카겔 플래시 크로마토그래피로 반-정제하였다. 이어서 생성된 고체를 2% TEA/35% EtOAc/헥산에 이어 100% EtOAc, 이어서 10% 내지 15% MeOH/DCM으로 용출하는 실리카겔 플래쉬 크로마토그래피로 추가로 정제하였다. 이어서 생성된 고체를 DCM에 용해시키고 1N HCl로 2회 세척하고 워크업하여 6/7을 황색-녹색 고체로서 수득하였다(18.45 g, 71%). ¹H NMR (400 MHz, CD₂Cl₂): δ 7.90 (d, 1H), 6.68 (d, 1H) 5.89 (s, 1H), 5.25 (m, 2H), 1.75 (d, 3H) 1.40 (m, 6H), 1.33 (s, 6H); MS: 계산치 492.10, 관측치 492.08 (MH⁺).

단계 4: 비대칭 로다민 염료 8의 제조

화합물 6 및 7(19.79 g, 37.42 mmol)을 클로로포름(400 ml)에 용해시키고 옥시염화 인(10.5 ml, 112 mmol)과 10분 동안 실온에서 혼합하였다. 화합물 3(8.58 g, 37.4 mmol)을 클로로포름(200 ml)에 용해시키고 화합물 6/7/옥시염화 인 용액에 첨가하였다. 짙은 청록색이 즉시 형성된다. 그 다음 용액을 3.5시간 동안 환류하여 진한 파란색을 얻었다. 용액을 농축한 다음 암청색 고체를 1시간 동안 격렬하게 교반하면서 브롬화 수소산(570 ml)으로 환류시켰다. 뜨거운 용액을 얼음 위에 부어 미세한 청색 고체를 얻었으며, 이는 원심 분리 및 여과에 의해 수집되고 물로 세척되었다. 고체를 다량의 2M 트리에틸암모늄 아세테이트(TEAA)에 혼합하고 여과하여 미세 불용성 물질을 제거하고, 이성질체를 대형 역상 크로마토그래피 컬럼에 로딩하고 50 mM TEAA에 이어 60% - 65% - 70% MeOH/50 mM TEAA로 용출시켜 분리했다. 분획을 결합하기 전에 HPLC로 분석하였다. 염료 8의 풀(HPLC 및 RP-TLC에 의한 제2 용출 염료)을 동일한 부피의 물로 희석하고 C18 겔의 패드 상에서 탈염하여 농축 및 건조 후 염료 8, 진한 흑청색(dark black-blue) 고체를 TEA 염으로서 수득하였다(8.79 g, 32%). ¹H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 7.55 (s, 1H), 6.92 (s, 1H), 6.81 (s, 1H), 6.61 (s, 1H), 5.60 (d, 2H), 3.61 (t, 2H), 3.16 (q, 6H), 2.94 (m, 2H), 2.02 (m, 2H), 1.87 (d, 6H), 1.50 (m, 6H), 1.39 (d, 6H), 1.27 (t, 9H); 최대 흡광도 파장 610 nm.

단계 5: 비대칭 로다민 염료 9의 제조

염료 8(5.25 g, 7.05 mmol)을 무수 DCM(300 ml)에 용해시키고 TEA(13.8 ml, 98.7 mmol)와 혼합하고, 질소 하에 놓고 얼음 욕에서 냉각시켰다. 트리플루오로아세트산 무수물(6.86 ml, 49.3 mmol)을 적가하고 용액을 0.5시간 동안 교반하였다. 이제 무색 용액을 농축하고 DCM에 재용해하고 중탄산 나트륨, 1N HCl로 세척하고 워크업하여 화합물 9를 수득했다.

실시예 2: 로다민 염료 9 포스포라미다이트의 제조

단계 1: 로다민 염료 9 활성 에스테르의 제조

화합물 9를 무수 DCM(200 ml)에 용해시키고, N-히드록시숙시미드(1.62 g, 14.1 mmol), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC, 3.38 g, 17.6 mmol)와 혼합하고 1시간 동안 교반했다. 용액을 DCM으로 희석하고 1N HCl로 세척하고 화합물 10으로 워크업하였다.

단계 2: N-보호된 6-아미노-2-DMT 헥산-1-올 링커 로다민 염료, 11의 제조

화합물 10을 무수 DMC(200 ml)에 용해시키고 6-아미노-2-((비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)메틸)헥산-1-올(4.12 g, 9.17 mmol) 및 트리에틸아민(1.47 ml, 10.6 mmol; TEA)의 용액을 적가하였다. 이를 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 용액을 DCM으로 희석하고 물로 세척하고 워크업했다. 조 고체를 95% - 100% MeCN/물로 용출하는 역상 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 정제하여 화합물 11을 녹색 고체로서 수득하였다(5.91 g, 72%). ¹H NMR (400 MHz, CD₂Cl₂): δ 7.85 (s, 1H), 7.41 (m, 2H), 7.29 (m, 6H), 7.21 (m, 1H), 6.82 (m, 5H), 6.62 (s, 1H), 6.22 (s, 1H), 6.21 (m, 1H), 5.53 (s, 1H), 5.20 (s, 1H), 3.78 (s, 6H), 3.64 (m, 2H), 3.44 (m, 2H), 3.32 (m, 2H), 3.24 (m, 1H), 3.09 (m, 1H), 2.88 (t, 2H), 2.10 (broad t, 1H), 1.96 (m, 2H), 1.85 (d, 3H), 1.79 (m, 1H), 1.72 (d, 3H), 1.55 (m, 6H), 1.25-1.42 (m, 10H); MS: 계산치 1170.40, 관측치 1170.34 (MH⁺).

단계 3: 로다민 염료 9 포스포라미다이트의 제조

화합물 11(5.97 g, 5.10 mmol) 및 테트라졸 아민(0.44 g, 2.54 mmol)을 무수 DCM(150 ml)에 용해시키고 교반하고 질소 하에 두었다. 3A 분자체를 첨가하고 10분 추가로 교반하였다. 여기에 2-시아노에틸 N,N,N',N'-테트라이소프로필포스포로디아미다이트(3.07 g, 10.2 mmol)를 첨가하고 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 분자체를 여과 제거하고 용액을 고체로 농축시켰다. 이것을 20% TEA/MeCN으로 컬럼을 전처리한 다음 MeCN으로 잘 세척하는 역상 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 그 다음 샘플을 MeCN에 용해시키고 MeCN으로 용출시켰다. 풀링된(pooled) 생성물-함유 분획을 농축하고 건조하여 TFA-N-보호된 NH-비대칭 로다민 염료 포스포라미다이트 12를 짙은 황색 고체로 얻었다(6.13 g, 88%). ¹H NMR (400 MHz, CD₂Cl₂): δ 7.77 (s, 1H), 7.43 (m, 2H), 7.30 (m, 6H), 7.20 (m, 1H), 6.82 (m, 5H), 6.66 (s, 1H), 6.31 (m, 1H), 6.24 (s, 1H), 5.53 (s, 1H), 5.21 (s, 1H), 3.78 - 3.64 (s 및 m, 10H), 3.57 (m, 2H), 3.43 (q, 2H), 3.32 (t, 2H), 3.11 (m, 2H), 2.89 (t, 2H), 2.54 (q, 2H), 1.97 (m, 2H), 1.92 - 1.84 (m, 4H), 1.73 (s, 3H), 1.61 (m, 2H), 1.51 (d, 6H), 1.45 (m, 2H), 1.40 - 1.28 (s 및 m, 8H), 1.50 (m, 12H); ³¹P NMR (400 MHz, CD₂Cl₂): δ 147.4 (s, 1P); MS 계산치 1370.51, 관측치 1370.57 (MH⁺).

실시예 3: 큰 염료 비대칭 로다민 표지된 올리고뉴클레오티드의 고체 상 합성

N-보호된 비대칭 로다민 포스포라미다이트 합성 시약으로 표지화된 올리고뉴클레오티드는 바이오리틱(Biolytic) 3900 자동 DNA 합성기에서 표준 작동 조건을 사용하여 폴리스티렌 고체 지지체 상에서 합성되었다. N-보호된 비대칭 로다민 포스포라미다이트 12는 결합 반응을 위해 아세토니트릴 용매에 용해되었고, N-보호된 비대칭 로다민 염료 부가물은, 트리클로로아세트산으로 DMT를 제거하고, 다른 특수 포스포라미다이트를 첨가하고, 아세트산 무수물로 캡핑하고, 요오드로 산화하여 뉴클레오타이드 간 포스포디에스테르 결합을 생성하는 반복된 합성 주기에 안정적이었다. 이 부류의 비대칭 로다민은 또한 고체 지지체로부터 합성된 표지된 올리고뉴클레오티드를 탈보호하고 절단하는 데 사용되는 조건(65℃에서 5시간 동안 t-부틸아민/메탄올/물을 포함하는 용액으로 처리)에 안정적인 것으로 밝혀졌다. 표지된 올리고뉴클레오티드를 합성하는 데 사용되는 전체적인 스킴은 위의 스킴에 예시되어 있다. 이 프로세스에 의해, 모노 TFA-비대칭 로다민 DMT 포스포라미다이트 12는 지지체 결합 올리고뉴클레오티드의 5'-히드록실에 결합되어 DMT기의 산화 및 제거 후 포스포디에스테르 중간체 13을 제공했다. PEG 이량체 포스포라미다이트는 중간체 13의 유리 히드록실에 결합되어 DMT의 산화, 캡핑 및 제거 후에 중간체 14를 제공했다. 플루오레세인 포스포라미다이트(ThermoFisher)는 중간체 14의 유리 히드록실에 결합되었다. 생성된 표지된 올리고를 산화, 캡핑, 절단 및 지지체로부터 탈보호하여 표지된 올리고뉴클레오티드 15를 수득하였다. 올리고 15는 표준 크로마토그래피 프로토콜을 사용하여 정제되었다.

본 개시내용은 다음의 번호 매겨진 조항에 의해 추가로 설명될 수 있다.

1. 화학식의 화합물로서, 상기 식에서

R¹, R², R³, R⁶, R⁷, R⁸, R¹¹, R¹², R¹³, 및 R¹⁴는 단독으로 취해질 때 각각 서로 독립적으로 수소, 저급 알킬, (C6-C14) 아릴, (C7-C20) 아릴알킬, 5-14원 헤테로아릴, 6-20원 헤테로아릴알킬, -R^b, 또는 -(CH₂)_n-R^b 중에서 선택되거나; 또는 대안적으로, R¹과 R² 및/또는 R⁶과 R⁷은 이들이 결합된 탄소 원자와 함께 취해져 선택적으로 치환된 벤조기를 형성하며;

R⁵는 H 또는 보호기이며;

R⁷과 R⁹ 또는 R⁸과 R¹⁰ 중 적어도 하나는 이들이 결합된 원자와 함께 취해져 선택적으로 치환된 헤테로시클로알킬기, 선택적으로 치환된 헤테로시클로 알케닐기 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴기를 형성하고, 선택적으로 R⁴와 R² 또는 R³ 중 하나는 이들이 결합된 원자와 함께 취해져 선택적으로 치환된 헤테로시클로알킬기, 선택적으로 치환된 헤테로시클로알케닐기, 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴기를 형성하며; 단, 화합물은 다음 화학식으로 이루어지지 않으며,

또는;

각각의 R^c는 독립적으로 R^a이거나, 또는 대안적으로 동일한 질소 원자에 결합된 2개의 R^c는 그 질소 원자와 함께 취해져, O, N 및 S 중에서 선택되는 동일하거나 상이한 고리 헤테로원자들 중 하나 이상을 선택적으로 포함할 수 있는 5- 내지 8-원 포화 또는 불포화 고리를 형성할 수 있으며;

X는 할로이며; n은 1 내지 10 범위의 정수인, 화합물.

2. 조항 1에 있어서, 상기 스피로 락톤 고리는 개방된 산 형태이고 아민기는 보호되지 않는, 화합물. 특정 실시형태에서, 화합물의 개방된 산 형태는 화합물의 폐쇄된 스피로 락톤 형태에 비해 형광성이다(또는 형광 증가를 나타낸다). 본원에 기재된 화합물의 아민기는 폐쇄된 스피로 락톤 형태로 보호 가능하며, 핵산의 고수율 및 고순도 표지화를 위해 포스포라미다이트로 만들어지고 이로서 사용될 수 있다. 따라서, 본원에서는 또한 탈보호된 개방 락톤 형태의 조항 1의 화합물을 포함하는 형광 표지된 핵산 프로브 및 프라이머가 제공된다. 아민기의 탈보호 및 고체 지지체로부터 핵산 프로브의 절단 후 개방 락톤 형태의 조항 1의 화합물의 대표적인 예가 도 8 및 9에 도시되어 있다.

Thermo Fisher Scientific은 5개의 리포터 염료(예를 들어, FAM, VIC, TED, TAZ 및 SID)와 크기 표준 LIZ(NGM Detect™ PCR 증폭 키트)로 핵산 표지화를 위한 시약을 포함하는 HID 키트를 제공한다. 본원에서 제공되는 특정 염료는 기존 염료 세트의 염료를 보완하는 고유한 스펙트럼 특성을 가지며 HID 적용을 위해 포함될 수 있는 리포터 염료의 수를 확장하는 데 사용될 수 있다. 특히, 조항 1에 기재된 특정 비대칭 로다민은 기존의 상용 염료 세트 내의 다른 염료로부터 분해될 수 있도록 피크 방출 파장 및 좁은 스펙트럼 폭을 나타낸다는 것이 밝혀졌다. 예를 들어, 피크 방출 파장(예를 들어, ~ 634 nm)을 나타내는 대표적인 화합물은 구조 D.1에 나타낸 비대칭 로다민 화합물의 부류에 속한다. 출원인은 VIC를 2개의 새로운 염료로 대체함으로써 기존 HID 염료 세트가 7 개 이상의 리포터 염료를 포함하도록 확장될 수 있음을 발견했다. 특정 실시형태에서, 국제출원 PCT/US2019/67925호에 기재된 구조(화합물 A) 및 TET(~ 536 nm)를 갖는 비대칭 로다민은 구조 D.1(화합물 B) 및 FAM, TED, TAZ 및 SID(도 10)의 비대칭 로다민을 추가로 포함하는 키트에서 VIC의 대체물로서 사용된다(도 10). 이러한 화합물은 제안된 염료 세트에서 SID(~ 617) 및 LIZ(~ 653 nm)의 인접한 방출 피크로부터 잘 분해된다. 따라서, 본원에서 제공되는 특정 키트는 ~ 634 nm, FAM, TET, TED, TAZ 및 SID에서 방출을 갖는 조항 1에 기재된 화합물(예를 들어, 구조 D.1을 갖는 화합물)로 표지된 핵산(또는 핵산 표지를 위한 시약)을 포함할 수 있다.

3. 고체 지지체에 부착된 올리고뉴클레오티드를 다음 화학식의 구조를 갖는 시약과 반응시킴으로써 생성된 표지 모이어티를 포함하며:

LM-L-PEP

상기 식에서, PEP는 포스페이트 에스테르 전구체 기이고, L은 표지 모이어티를 PEP 기에 연결하는 선택적 링커(linker)이며, LM은 화학식 (I)의 N-보호된 NH-로다민 모이어티를 포함하며, 상기 식에서

R¹, R², R³, R⁶, R⁷, R⁸, R¹¹, R¹², R¹³, 및 R¹⁴는 단독으로 취해질 때 각각 서로 독립적으로 수소, 저급 알킬, (C6-C14) 아릴, (C7-C20) 아릴알킬, 5-14원 헤테로아릴, 6-20원 헤테로아릴알킬, -R^b, 또는 -(CH₂)_n-R^b 중에서 선택되거나; 또는 대안적으로, R¹과 R² 및/또는 R⁶과 R⁷은 이들이 결합된 탄소 원자와 함께 취해져 선택적으로 치환된 벤조기를 형성하며; R², R³, R⁷, R⁸, R¹², 또는 R¹³ 중 하나는 화학식 -Y-의 기를 포함하며, 여기서 Y는 -C(O)-, -S(O)₂-, -S- 및 -NH-로 구성된 군으로부터 선택되며;

R⁵는 H 또는 보호기이며;

또는;

각각의 R^b는 X, -OH, -OR^a -SH, -SR^a NH₂, -NHR^a, NR^cR^c, N⁺R^cR^cR^c, 퍼할로 저급 알킬, 트리할로메틸, 트리플루오로메틸, -P(O)(OH)₂, P(O)(OR^a)₂, P(O)(OH)(OR^a), -OP(O)(OH)₂, OP(O)(OR^a)₂, -OP(O)(OR^a)(OH), -S(O)₂OH, S(O)₂R^a, -C(O)H, C(O)R^a, -C(S)X, -C(O)OR^a, -C(O)OH, -C(O)NH₂, -C(O)NHR^a, C(O)NR^cR^c, C(S)NH₂, C(O)NHR^a, -C(O)NR^cR^c, -C(NH)NH₂, -C(NH)NHR^a, 및 C(NH)NR^cR^c 중에서 독립적으로 선택되며;

X는 할로이며; n은 1 내지 10 범위의 정수인, 올리고뉴클레오티드.

4. 조항 3에 있어서, 상기 스피로 락톤 고리는 개방된 산 형태이고 아민기는 보호되지 않는, 올리고뉴클레오티드.

5. 올리고뉴클레오티드를 표지하는데 유용한 시약으로서, 다음 구조식에 따른 화합물이며:

LM-L-PEP (XX)

상기 식에서, LM은 N-보호된 NH-로다민 모이어티를 포함하는 표지 모이어티를 나타내고, PEP는 포스포라미다이트기 또는 H-포스포네이트기를 포함하는 포스페이트 에스테르 전구체 기이며, L은 표지 모이어티를 포스페이트 에스테르 전구체 기에 연결하는 선택적 링커이며, 여기서 화학식의 N-보호된 NH-로다민 모이어티, 여기에서

R⁵는 H 또는 보호기이며;

또는;

X는 할로이며; n은 1 내지 10 범위의 정수인, 시약.

6. 조항 5에 있어서, 상기 스피로 락톤 고리는 개방된 산 형태이고 아민기는 보호되지 않는, 시약.

Claims

하기 화학식의 화합물:

상기 식에서
R¹, R², R³, R⁶, R⁷, R⁸, R¹¹, R¹², R¹³, 및 R¹⁴는 단독으로 취해질 때 각각 서로 독립적으로 수소, 저급 알킬, (C6-C14) 아릴, (C7-C20) 아릴알킬, 5-14원 헤테로아릴, 6-20원 헤테로아릴알킬, -R^b, 또는 -(CH₂)_n-R^b 중에서 선택되거나; 또는 대안적으로, R¹과 R² 및/또는 R⁶과 R⁷은 이들이 결합된 탄소 원자와 함께 취해져 선택적으로 치환된 벤조기를 형성하며;
R⁴는 단독으로 취해질 때 수소, 저급 알킬, (C6-C14) 아릴, (C7-C20) 아릴알킬, 5-14원 헤테로아릴, 6-20원 헤테로아릴알킬 중에서 선택되거나; 또는 R⁴와 R² 또는 R³ 중 하나는 이들이 결합된 원자와 함께 취해져 선택적으로 치환된 헤테로시클로알킬기, 선택적으로 치환된 헤테로시클로알케닐기, 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴기를 형성하며;
R⁵는 H 또는 보호기이며;
R⁹는 단독으로 취해질 때 수소, 저급 알킬, (C6-C14) 아릴, (C7-C20) 아릴알킬, 5-14원 헤테로아릴, 6-20원 헤테로아릴알킬 중에서 선택되거나; 또는 R⁷과 R⁹는 이들이 결합된 원자와 함께 취해져 선택적으로 치환된 헤테로시클로알킬기, 선택적으로 치환된 헤테로시클로알케닐기, 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴기를 형성하며;
R¹⁰은 H 또는 보호기이거나; 또는 R⁸과 R¹⁰은 이들이 결합된 원자와 함께 취해져 선택적으로 치환된 헤테로시클로알킬기, 선택적으로 치환된 헤테로시클로알케닐기, 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴기를 형성하며;
R⁷과 R⁹ 또는 R⁸과 R¹⁰ 중 적어도 하나는 이들이 결합된 원자와 함께 취해져 선택적으로 치환된 헤테로시클로알킬기, 선택적으로 치환된 헤테로시클로 알케닐기 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴기를 형성하고, 선택적으로 R⁴와 R² 또는 R³ 중 하나는 이들이 결합된 원자와 함께 취해져 선택적으로 치환된 헤테로시클로알킬기, 선택적으로 치환된 헤테로시클로알케닐기, 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴기를 형성하며; 단, 화합물은 하기 화학식의 화합물이 아니며

각각의 R^a는 저급 알킬, (C6-C14) 아릴, (C7-C20) 아릴알킬, 5-14원 헤테로아릴, -CX₃ 및 6-20원 헤테로아릴알킬 중에서 독립적으로 선택되며;
각각의 R^b는 -X, -OH, -OR^a, -SH, -SR^a -NH₂, -NHR^a, NR^cR^c, N⁺R^cR^cR^c, 퍼할로 저급 알킬, 트리할로메틸, 트리플루오로메틸, -P(O)(OH)₂, P(O)(OR^a)₂, P(O)(OH)(OR^a), -OP(O)(OH)₂, OP(O)(OR^a)₂, -OP(O)(OR^a)(OH), -S(O)₂OH, S(O)₂R^a, -C(O)H, C(O)R^a, -C(S)X, -C(O)OR^a, -C(O)OH, -C(O)NH₂, -C(O)NHR^a, C(O)NR^cR^c, C(S)NH₂, C(O)NHR^a, -C(O)NR^cR^c, -C(NH)NH₂, -C(NH)NHR^a, 및 C(NH)NR^cR^c 중에서 독립적으로 선택되며;
각각의 R^c는 독립적으로 R^a이거나, 또는 대안적으로 동일한 질소 원자에 결합된 2개의 R^c는 그 질소 원자와 함께 취해져, O, N 및 S 중에서 선택되는 동일하거나 상이한 고리 헤테로원자들 중 하나 이상을 선택적으로 포함할 수 있는 5- 내지 8-원 포화 또는 불포화 고리를 형성할 수 있으며;
각각의 R^d 및 R^e는 단독으로 취해질 때 수소, 저급 알킬, (C6-C14) 아릴, (C7-C20) 아릴알킬, 5-14원 헤테로아릴, 6-20원 헤테로아릴알킬, -R^b, 또는 -(CH₂)_n-R^b 중에서 독립적으로 선택되며;
X는 할로이며;
n은 1 내지 10 범위의 정수이다.
제1항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식 (II.1)을 갖는 화합물:

상기 식에서, R^f, R^g, R^h, Rⁱ, 및 R^j의 각각은 단독으로 취해질 때 각각 서로 독립적으로 수소, 저급 알킬, (C6-C14) 아릴, (C7-C20) 아릴알킬, 5-14원 헤테로아릴, 6-20원 헤테로아릴알킬, -R^b 또는 -(CH₂)_n-R^b 중에서 선택된다.
제1항에 있어서, 상기 화합물은 화학식 (II.2)을 갖는 화합물:

상기 식에서, R^f, R^g, R^h, Rⁱ, 및 R^j의 각각은 단독으로 취해질 때 각각 서로 독립적으로 수소, 저급 알킬, (C6-C14) 아릴, (C7-C20) 아릴알킬, 5-14원 헤테로아릴, 6-20원 헤테로아릴알킬, -R^b 또는 -(CH₂)_n-R^b 중에서 선택된다.
제1항에 있어서, 상기 화합물은 화학식 (II.3)을 갖는 화합물:

상기 식에서, R^h, Rⁱ, 및 R^j의 각각은 단독으로 취해질 때 각각 서로 독립적으로 수소, 저급 알킬, (C6-C14) 아릴, (C7-C20) 아릴알킬, 5-14원 헤테로아릴, 6-20원 헤테로아릴알킬, -R^b 또는 -(CH₂)_n-R^b 중에서 선택된다.
제1항에 있어서, 상기 화합물은 화학식 (II.4)을 갖는 화합물:

상기 식에서 R^f, R^g, R^h, Rⁱ, 및 R^j의 각각은 단독으로 취해질 때 각각 서로 독립적으로 수소, 저급 알킬, (C6-C14) 아릴, (C7-C20) 아릴알킬, 5-14원 헤테로아릴, 6-20원 헤테로아릴알킬, -R^b 또는 -(CH₂)_n-R^b 중에서 선택된다.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, R¹¹ 및 R¹⁴의 각각은 할로인, 화합물.
제6항에 있어서, 상기 할로는 플루오로 또는 클로로인, 화합물.
제6항에 있어서, 상기 할로는 클로로인, 화합물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, R¹³은 -C(O)H, -C(O)R^a -C(S)X, C(O)O^-, -C(O)OH, -C(O)NH₂, -C(O)NHR^a, -C(O)NR^cR^c, -C(S)NH₂, -C(O)NHR^a, C(O)NR^cR^c, -C(NH)NH₂, -C(NH)NHR^a, 또는 -C(NH)NR^cR^c인, 화합물.
제9항에 있어서, R¹³은 C(O)O^- 또는 -C(O)OH인, 화합물.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, R⁵는 보호기인, 화합물.
제11항에 있어서, 상기 보호기는 -C(O)R¹⁵이며, 여기서 R¹⁵는 수소, 저급 알킬, -CX₃. -CHX₂. -CH₂X, -CH₂-OR^d, 및 저급 알킬, X, OR^d, 시아노 또는 니트로기로 선택적으로 일 치환된 페닐 중에서 선택되며, 여기서 R^d는 저급 알킬, 페닐 및 피리딜로 구성된 군으로부터 선택되며, 각각의 X는 할로기인, 화합물.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, R¹⁰은 존재하는 경우 보호기인, 화합물.
제13항에 있어서, 상기 보호기는 -C(O)R¹⁵이며, 여기서 R¹⁵는 수소, 저급 알킬, -CX₃. -CHX₂. -CH₂X, -CH₂-OR^d, 및 저급 알킬, X, OR^d, 시아노 또는 니트로기로 선택적으로 일 치환된 페닐 중에서 선택되며, 여기서 R^d는 저급 알킬, 페닐 및 피리딜로 구성된 군으로부터 선택되며, 각각의 X는 할로기인, 화합물.
제12항 또는 제14항에 있어서, R¹⁵는 -CX₃, -CHX₂, -CH₂X인, 화합물.
제15항에 있어서, R¹⁵는 -CX₃인, 화합물.
제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 보호기의 X는 존재하는 경우 플루오로 또는 클로로인, 화합물.
제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 보호기의 X는 존재하는 경우 플루오로인, 화합물.
제1항에 있어서, R¹과 R²는 이들이 결합된 탄소 원자와 함께 취해져 선택적으로 치환된 벤조기를 형성하는, 화합물.
제1항에 있어서, R⁶과 R⁷은 이들이 결합된 탄소 원자와 함께 취해져 선택적으로 치환된 벤조기를 형성하는, 화합물.
제1항에 있어서, R⁷과 R⁹는 이들이 결합된 원자와 함께 취해져 선택적으로 치환된 헤테로시클로알킬기, 선택적으로 치환된 헤테로시클로알케닐기, 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴기를 형성하는, 화합물.
제1항에 있어서, R⁸ R¹⁰은 이들이 결합된 원자와 함께 취해져 선택적으로 치환된 헤테로시클로알킬기, 선택적으로 치환된 헤테로시클로알케닐기, 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴기를 형성하는, 화합물.
제1항에 있어서, R⁴와 R² 또는 R³ 중 하나는 이들이 결합된 원자와 함께 취해져 선택적으로 치환된 헤테로시클로알킬기, 선택적으로 치환된 헤테로시클로알케닐기, 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴기를 형성하는, 화합물.
제1항 또는 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벤조 고리, 상기 헤테로시클로알킬, 상기 헤테로시클로알케닐 또는 상기 헤테로아릴 기 상의 선택적 치환은 존재하는 경우 -X, -OH, -OR^a, -SH, -SR^a -NH₂, -NHR^a, NR^cR^c, N⁺R^cR^cR^c, 퍼할로 저급 알킬, 트리할로메틸, 트리플루오로메틸, -P(O)(OH)₂, P(O)(OR^a)₂, P(O)(OH)(OR^a), -OP(O)(OH)₂, OP(O)(OR^a)₂, -OP(O)(OR^a)(OH), -S(O)₂OH, S(O)₂R^a, -C(O)H, C(O)R^a, -C(S)X, -C(O)OR^a, -C(O)OH, -C(O)NH₂, -C(O)NHR^a, C(O)NR^cR^c, C(S)NH₂, C(O)NHR^a, -C(O)NR^cR^c, -C(NH)NH₂, -C(NH)NHR^a, 및 C(NH)NR^cR^c 중 적어도 하나를 포함하고, 각각의 R^a는 다른 것들과 독립적으로 저급 알킬, (C6-C14) 아릴, (C7-C20) 아릴알킬, 5-14원 헤테로아릴, -CX₃ 및 6-20원 헤테로아릴알킬 중에서 선택되고, 각각의 R^c는 다른 것들과 독립적으로 R^a이거나, 또는 대안적으로 동일한 질소 원자에 결합된 2개의 R^c는 그 질소 원자와 함께 취해져, O, N 및 S 중에서 선택되는 동일하거나 상이한 고리 헤테로원자들 중 하나 이상을 선택적으로 포함할 수 있는 5- 내지 8-원 포화 또는 불포화 고리를 형성할 수 있는, 화합물.
제1항 또는 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벤조 고리, 상기 헤테로시클로알킬, 상기 헤테로시클로알케닐 또는 상기 헤테로아릴 기 상의 선택적 치환은 존재하는 경우 -X, -C1-C6 알킬, -C2-C6 알케닐, -C2-C6 알키닐, -OH, OR^a -SH, SR^a -NH₂, -NHR^a -NR^cR^c, N⁺R^cR^cR^c, 퍼할로 저급 알킬, 트리할로메틸, 트리플루오로메틸, C(O)H, -C(O)R^a, -C(S)X, C(O)OR^a, -C(O)OH, -C(O)NH₂, -C(O)NHR^a, C(O)NR^cR^C, C(S)NH₂, -C(O)NHR^a, -C(O)NR^cR^c, -C(NH)NH₂, -C(NH)NHR^a, 또는 C(NH)NR^cR^c 중 적어도 하나를 포함하는, 화합물.
제1항 또는 제19항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벤조 고리, 상기 헤테로시클로알킬, 상기 헤테로시클로알케닐 또는 상기 헤테로아릴 기 상의 선택적 치환은 -X, -C1-C6 알킬, -C2-C6 알케닐, -C2-C6 알키닐, -OH, OR^a -SH, SR^a -NH₂, -NHR^a -NR^cR^c, N⁺R^cR^cR^c, 퍼할로 저급 알킬, 트리할로메틸, 트리플루오로메틸, C(O)H, C(O)R^a, -C(S)X, C(O)OR^a, -C(O)OH, -C(O)NH₂, -C(O)NHR^a, -C(O)NR^cR^C, C(S)NH₂, C(O)NHR^a, -C(O)NR^cR^c, -C(NH)NH₂, -C(NH)NHR^a, 또는 -C(NH)NR^cR^c 중 적어도 둘을 포함하는, 화합물.
제1항 또는 제19항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벤조 고리, 상기 헤테로시클로알킬, 상기 헤테로시클로알케닐 또는 상기 헤테로아릴 기 상의 선택적 치환은 적어도 2개의 -C1-C6 알킬을 포함하는, 화합물.
고체 지지체에 부착된 올리고뉴클레오티드를 다음 화학식의 구조를 갖는 시약과 반응시킴으로써 생성된 표지 모이어티를 포함하는, 올리고뉴클레오티드:
LM-L-PEP
상기 식에서, PEP는 포스페이트 에스테르 전구체 기이고, L은 표지 모이어티를 PEP 기에 연결하는 선택적 링커(linker)이며, LM은 하기 화학식 (I)의 N-보호된 NH-로다민 모이어티를 포함하며,

상기 식에서, R¹, R², R³, R⁶, R⁷, R⁸, R¹¹, R¹², R¹³, 및 R¹⁴는 단독으로 취해질 때 각각 서로 독립적으로 수소, 저급 알킬, (C6-C14) 아릴, (C7-C20) 아릴알킬, 5-14원 헤테로아릴, 6-20원 헤테로아릴알킬, -R^b, 또는 -(CH₂)_n-R^b 중에서 선택되거나; 또는 대안적으로, R¹과 R² 및/또는 R⁶과 R⁷은 이들이 결합된 탄소 원자와 함께 취해져 선택적으로 치환된 벤조기를 형성하며; R², R³, R⁷, R⁸, R¹², 또는 R¹³ 중 하나는 화학식 -Y-의 기를 포함하며, 여기서 Y는 -C(O)-, -S(O)₂-, -S- 및 -NH-로 구성된 군으로부터 선택되며;
R⁴는 단독으로 취해질 때 수소, 저급 알킬, (C6-C14) 아릴, (C7-C20) 아릴알킬, 5-14원 헤테로아릴, 6-20원 헤테로아릴알킬 중에서 선택되거나; 또는 R⁴와 R² 또는 R³ 중 하나는 이들이 결합된 원자와 함께 취해져 선택적으로 치환된 헤테로시클로알킬기, 선택적으로 치환된 헤테로시클로알케닐기, 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴기를 형성하며;
R⁵는 H 또는 보호기이며;
R⁹는 단독으로 취해질 때 수소, 저급 알킬, (C6-C14) 아릴, (C7-C20) 아릴알킬, 5-14원 헤테로아릴, 6-20원 헤테로아릴알킬 중에서 선택되거나; 또는 R⁷과 R⁹는 이들이 결합된 원자와 함께 취해져 선택적으로 치환된 헤테로시클로알킬기, 선택적으로 치환된 헤테로시클로알케닐기, 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴기를 형성하며;
R¹⁰은 H 또는 보호기이거나; 또는 R⁸과 R¹⁰은 이들이 결합된 원자와 함께 취해져 선택적으로 치환된 헤테로시클로알킬기, 선택적으로 치환된 헤테로시클로알케닐기, 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴기를 형성하며;
R⁷과 R⁹ 또는 R⁸과 R¹⁰ 중 적어도 하나는 이들이 결합된 원자와 함께 취해져 선택적으로 치환된 헤테로시클로알킬기, 선택적으로 치환된 헤테로시클로 알케닐기 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴기를 형성하고, 선택적으로 R⁴와 R² 또는 R³ 중 하나는 이들이 결합된 원자와 함께 취해져 선택적으로 치환된 헤테로시클로알킬기, 선택적으로 치환된 헤테로시클로알케닐기, 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴기를 형성하며; 단, 화합물은 다음 하기 화학식의 화합물이 아니며

각각의 R^a는 저급 알킬, (C6-C14) 아릴, (C7-C20) 아릴알킬, 5-14원 헤테로아릴, -CX₃ 및 6-20원 헤테로아릴알킬 중에서 독립적으로 선택되며;
각각의 R^b는 X, -OH, -OR^a -SH, -SR^a NH₂, -NHR^a, NR^cR^c, N⁺R^cR^cR^c, 퍼할로 저급 알킬, 트리할로메틸, 트리플루오로메틸, -P(O)(OH)₂, P(O)(OR^a)₂, P(O)(OH)(OR^a), -OP(O)(OH)₂, OP(O)(OR^a)₂, -OP(O)(OR^a)(OH), -S(O)₂OH, S(O)₂R^a, -C(O)H, C(O)R^a, -C(S)X, -C(O)OR^a, -C(O)OH, -C(O)NH₂, -C(O)NHR^a, C(O)NR^cR^c, C(S)NH₂, C(O)NHR^a, -C(O)NR^cR^c, -C(NH)NH₂, -C(NH)NHR^a, 및 C(NH)NR^cR^c 중에서 독립적으로 선택되며;
각각의 R^c는 독립적으로 R^a이거나, 또는 대안적으로 동일한 질소 원자에 결합된 2개의 R^c는 그 질소 원자와 함께 취해져, O, N 및 S 중에서 선택되는 동일하거나 상이한 고리 헤테로원자들 중 하나 이상을 선택적으로 포함할 수 있는 5- 내지 8-원 포화 또는 불포화 고리를 형성할 수 있으며;
각각의 R^d 및 R^e는 단독으로 취해질 때 수소, 저급 알킬, (C6-C14) 아릴, (C7-C20) 아릴알킬, 5-14원 헤테로아릴, 6-20원 헤테로아릴알킬, -R^b, 또는 -(CH₂)_n-R^b 중에서 독립적으로 선택되며;
X는 할로이며;
n은 1 내지 10 범위의 정수이다.
제28항에 있어서, 상기 N-보호된 NH-로다민 모이어티는 하기 화학식 (II.1)을 갖는, 올리고뉴클레오티드:

상기 식에서, R^f, R^g, R^h, Rⁱ, 및 R^j의 각각은 단독으로 취해질 때 각각 서로 독립적으로 수소, 저급 알킬, (C6-C14) 아릴, (C7-C20) 아릴알킬, 5-14원 헤테로아릴, 6-20원 헤테로아릴알킬, -R^b 또는 -(CH₂)_n-R^b 중에서 선택된다.
제28항에 있어서, 상기 N-보호된 NH-로다민 모이어티는 하기 화학식 (II.2)을 갖는, 올리고뉴클레오티드:

상기 식에서, R^f, R^g, R^h, Rⁱ, 및 R^j의 각각은 단독으로 취해질 때 각각 서로 독립적으로 수소, 저급 알킬, (C6-C14) 아릴, (C7-C20) 아릴알킬, 5-14원 헤테로아릴, 6-20원 헤테로아릴알킬, -R^b 또는 -(CH₂)_n-R^b 중에서 선택된다.
제28항에 있어서, 상기 N-보호된 NH-로다민 모이어티는 화학식 (II.3)을 갖는, 올리고뉴클레오티드:

상기 식에서, R^h, Rⁱ, 및 R^j의 각각은 단독으로 취해질 때 각각 서로 독립적으로 수소, 저급 알킬, (C6-C14) 아릴, (C7-C20) 아릴알킬, 5-14원 헤테로아릴, 6-20원 헤테로아릴알킬, -R^b 또는 -(CH₂)_n-R^b 중에서 선택된다.
제28항에 있어서, 상기 N-보호된 NH-로다민 모이어티는 화학식 (II.4)을 갖는, 올리고뉴클레오티드:

상기 식에서, R^f, R^g, R^h, Rⁱ, 및 R^j의 각각은 단독으로 취해질 때 각각 서로 독립적으로 수소, 저급 알킬, (C6-C14) 아릴, (C7-C20) 아릴알킬, 5-14원 헤테로아릴, 6-20원 헤테로아릴알킬, -R^b 또는 -(CH₂)_n-R^b 중에서 선택된다.
제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, R¹¹ 및 R¹⁴의 각각은 할로인, 올리고뉴클레오티드.
제33항에 있어서, 상기 할로는 플루오로 또는 클로로인, 올리고뉴클레오티드.
제33항에 있어서, 상기 할로는 클로로인, 올리고뉴클레오티드.
제28항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, R¹²는 -C(O)H, -C(O)R^a -C(S)X, C(O)O^-, -C(O)OH, -C(O)NH₂, -C(O)NHR^a, -C(O)NR^cR^C, -C(S)NH₂, -C(O)NHR^a, -C(O)NR^cR^c, -C(NH)NH₂, -C(NH)NHR^a, 또는 -C(NH)NR^cR^c인, 올리고뉴클레오티드.
제36항에 있어서, R¹²는 C(O)O^- 또는 -C(O)OH인, 올리고뉴클레오티드.
제28항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, R⁵는 보호기인, 화합물.
제38항에 있어서, 상기 보호기는 -C(O)R¹⁰이며, 여기서 R¹⁰은 수소, 저급 알킬, -CX₃. -CHX₂. -CH₂X, -CH₂-OR^d, 및 저급 알킬, X, OR^d, 시아노 또는 니트로기로 선택적으로 일 치환된 페닐 중에서 선택되며, 여기서 R^d는 저급 알킬, 페닐 및 피리딜로 구성된 군으로부터 선택되며, 각각의 X는 할로기인, 화합물.
제28항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, R¹⁰은 존재하는 경우 보호기인, 올리고뉴클레오티드.
제40항에 있어서, 상기 보호기는 -C(O)R¹⁵이며, 여기서 R¹⁵는 수소, 저급 알킬, -CX₃. -CHX₂. -CH₂X, -CH₂-OR^d, 및 저급 알킬, X, OR^d, 시아노 또는 니트로기로 선택적으로 일 치환된 페닐 중에서 선택되며, 여기서 R^d는 저급 알킬, 페닐 및 피리딜로 구성된 군으로부터 선택되며, 각각의 X는 할로기인, 올리고뉴클레오티드.
제39항 또는 제41항에 있어서, R¹⁵는 -CX₃, -CHX₂, -CH₂X인, 올리고뉴클레오티드.
제42항에 있어서, R¹⁵는 -CX₃인, 올리고뉴클레오티드.
제39항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 보호기의 X는 존재하는 경우 플루오로 또는 클로로인, 올리고뉴클레오티드.
제39항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 보호기의 X는 존재하는 경우 플루오로인, 올리고뉴클레오티드.
제28항에 있어서, R¹과 R²는 이들이 결합된 탄소 원자와 함께 취해져 선택적으로 치환된 벤조기를 형성하는, 올리고뉴클레오티드.
제28항에 있어서, R⁶과 R⁷은 이들이 결합된 탄소 원자와 함께 취해져 선택적으로 치환된 벤조기를 형성하는, 올리고뉴클레오티드.
제28항에 있어서, R⁷과 R⁹는 이들이 결합된 원자와 함께 취해져 선택적으로 치환된 헤테로시클로알킬기, 선택적으로 치환된 헤테로시클로알케닐기, 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴기를 형성하는, 올리고뉴클레오티드.
제28항에 있어서, R⁸과 R¹⁰은 이들이 결합된 원자와 함께 취해져 선택적으로 치환된 헤테로시클로알킬기, 선택적으로 치환된 헤테로시클로알케닐기, 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴기를 형성하는, 올리고뉴클레오티드.
제28항에 있어서, R⁴와 R² 또는 R³ 중 하나는 이들이 결합된 원자와 함께 취해져 선택적으로 치환된 헤테로시클로알킬기, 선택적으로 치환된 헤테로시클로알케닐기, 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴기를 형성하는, 올리고뉴클레오티드.
제28항 또는 제46항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벤조 고리, 상기 헤테로시클로알킬, 상기 헤테로시클로알케닐 또는 상기 헤테로아릴 기 상의 선택적 치환은 존재하는 경우 적어도 하나의 R^b를 포함하며, R^b는 -X, -OH, -OR^a, -SH, -SR^a -NH₂, -NHR^a, NR^cR^c, N⁺R^cR^cR^c, 퍼할로 저급 알킬, 트리할로메틸, 트리플루오로메틸, -P(O)(OH)₂, P(O)(OR^a)₂, P(O)(OH)(OR^a), -OP(O)(OH)₂, OP(O)(OR^a)₂, -OP(O)(OR^a)(OH), -S(O)₂OH, S(O)₂R^a, -C(O)H, C(O)R^a, -C(S)X, -C(O)OR^a, -C(O)OH, -C(O)NH₂, -C(O)NHR^a, C(O)NR^cR^c, C(S)NH₂, C(O)NHR^a, -C(O)NR^cR^c, -C(NH)NH₂, -C(NH)NHR^a, 및 C(NH)NR^cR^c, 및 -C(NH)NR^cR^c 중 적어도 하나를 포함하고, 각각의 R^a는 다른 것들과 독립적으로 저급 알킬, (C6-C14) 아릴, (C7-C20) 아릴알킬, 5-14원 헤테로아릴, -CX₃ 및 6-20원 헤테로아릴알킬 중에서 선택되고, 각각의 R^c는 다른 것들과 독립적으로 R^a이거나, 또는 대안적으로 동일한 질소 원자에 결합된 2개의 R^c는 그 질소 원자와 함께 취해져, O, N 및 S 중에서 선택되는 동일하거나 상이한 고리 헤테로원자들 중 하나 이상을 선택적으로 포함할 수 있는 5- 내지 8-원 포화 또는 불포화 고리를 형성할 수 있는, 올리고뉴클레오티드.
제28항 또는 제46항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벤조 고리, 상기 헤테로시클로알킬, 상기 헤테로시클로알케닐 또는 상기 헤테로아릴 기 상의 선택적 치환은 존재하는 경우 -X, -C1-C6 알킬, -C2-C6 알케닐, -C2-C6 알키닐, -OH, OR^a -SH, SR^a -NH₂, -NHR^a -NR^cR^c, N⁺R^cR^cR^c, 퍼할로 저급 알킬, 트리할로메틸, 트리플루오로메틸, C(O)H, -C(O)R^a, -C(S)X, C(O)OR^a, -C(O)OH, -C(O)NH₂, -C(O)NHR^a, C(O)NR^cR^C, C(S)NH₂, -C(O)NHR^a, -C(O)NR^cR^c, -C(NH)NH₂, -C(NH)NHR^a, 또는 C(NH)NR^cR^c 중 적어도 하나를 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
제28항 또는 제46항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벤조 고리, 상기 헤테로시클로알킬, 상기 헤테로시클로알케닐 또는 상기 헤테로아릴 기 상의 선택적 치환은 -X, -C1-C6 알킬, -C2-C6 알케닐, -C2-C6 알키닐, -OH, OR^a -SH, SR^a -NH₂, -NHR^a -NR^cR^c, N⁺R^cR^cR^c, 퍼할로 저급 알킬, 트리할로메틸, 트리플루오로메틸, C(O)H, -C(O)R^a, -C(S)X, C(O)OR^a, -C(O)OH, -C(O)NH₂, -C(O)NHR^a, C(O)NR^cR^C, C(S)NH₂, -C(O)NHR^a, -C(O)NR^cR^c, -C(NH)NH₂, -C(NH)NHR^a, 또는 C(NH)NR^cR^c 중 적어도 둘을 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
제28항 또는 제46항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벤조 고리, 상기 헤테로시클로알킬, 상기 헤테로시클로알케닐 또는 상기 헤테로아릴 기 상의 선택적 치환은 적어도 2개의 -C1-C6 알킬을 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
제28항에 있어서, 상기 N-보호된 NH-로다민 모이어티는 하기 화학식을 갖는, 올리고뉴클레오티드:
제28항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표지 모이어티는 올리고뉴클레오티드의 3'- 또는 5'-히드록실에 연결되는, 올리고뉴클레오티드.
제28항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표지 모이어티는 올리고뉴클레오티드의 핵 염기에 연결되는, 올리고뉴클레오티드.
제28항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 N-보호된 NH-로다민 모이어티에 대한 도너(donor) 및/또는 억셉터(acceptor) 모이어티로 추가로 표지되는, 올리고뉴클레오티드.
제28항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 켄쳐(quencher) 모이어티로 추가로 표지되는, 올리고뉴클레오티드.
제28항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 작은 홈 결합(minor groove binding) 모이어티로 추가로 표지되는, 올리고뉴클레오티드.
제28항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표지 모이어티는 N-보호된 NH-로다민 모이어티에 대한 도너 모이어티 또는 억셉터 모이어티를 추가로 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
제61항에 있어서, 상기 표지 모이어티는 N-보호된 NH-로다민 모이어티에 대한 도너 모이어티를 추가로 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
제62항에 있어서, 상기 도너 모이어티는 N-보호된 NH-로다민 모이어티 또는 O-보호된 플루오레세인 모이어티를 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
제63항에 있어서, 상기 도너 모이어티의 2'-, 2"-, 4'-, 5'-, 7'-, 7"-, 5-또는 6-위치가 N-보호된 NH-로다민 모이어티의 2'-, 2"-, 4'-, 5'-, 7'-, 7"-, 5- 또는 6-위치에 연결되는, 올리고뉴클레오티드.
제63항에 있어서, 상기 도너 모이어티 및 상기 N-보호된 NH-로다민 모이어티는 헤드-투-헤드 배향으로 연결되는, 올리고뉴클레오티드.
제63항에 있어서, 상기 도너 모이어티 및 상기 N-보호된 NH-로다민 모이어티는 헤드-투-테일 배향으로 연결되는, 올리고뉴클레오티드.
제63항에 있어서, 상기 도너 모이어티 및 상기 N-보호된 NH-로다민 모이어티는 테일-투-테일 배향으로 연결되는, 올리고뉴클레오티드.
제63항에 있어서, 상기 도너 모이어티 및 상기 N-보호된 NH-로다민 모이어티는 사이드-투-사이드 배향으로 연결되는, 올리고뉴클레오티드.
제63항에 있어서, 상기 도너 모이어티 및 상기 N-보호된 NH-로다민 모이어티는 사이드-투-헤드 배향으로 연결되는, 올리고뉴클레오티드.
제63항에 있어서, 상기 도너 모이어티 및 상기 N-보호된 NH-로다민 모이어티는 사이드-투-테일 배향으로 연결되는, 올리고뉴클레오티드.
제63항에 있어서, 상기 표지 모이어티는 하기 구조식 (VI)을 갖는, 올리고뉴클레오티드:
A-Z¹-Sp-Z²-D (VI)
상기 식에서, A는 N-보호된 NH-로다민 모이어티를 나타내고, D는 도너 모이어티를 나타내고, Z¹ 및 Z²는 동일하거나 상이할 수 있으며 작용기 F^z를 포함하는 연결 모이어티에 의해 제공되는 연결 부분을 나타내고, Sp는 간격 모이어티를 나타낸다.
제71항에 있어서, A는 N-보호된 NH-로다민 모이어티이고, D는 하기 구조식 D.1, D.2, D.3, D.4, D.5, D.6, D.7, D.8, D.9, D.10, D.11 및 D.12를 갖는 모이어티로 구성된 군으로부터 선택되는, 올리고뉴클레오티드:

상기 D.1 내지 D.12 각각에서,
R^1′, R^2′, R^2″, R^4′, R^4″, R^5′, R^5″, R^7′, R^7″, 및 R^8′의 각각은 단독으로 취해질 때 독립적으로 수소, 저급 알킬, (C6-C14) 아릴, (C7-C20) 아릴알킬, 5-14원 헤테로아릴, 6-20원 헤테로아릴알킬, R^b 및 -(CH₂)_x-R^b로 구성된 군으로부터 선택되며, 여기서 x는 1 내지 10의 값을 갖는 정수이고, R^b는 -X, -OH, -OR^a, -SH, -SR^a -NH₂, -NHR^a, NR^cR^c, N⁺R^cR^cR^c, 퍼할로 저급 알킬, 트리할로메틸, 트리플루오로메틸, -P(O)(OH)₂, P(O)(OR^a)₂, P(O)(OH)(OR^a), -OP(O)(OH)₂, OP(O)(OR^a)₂, -OP(O)(OR^a)(OH), -S(O)₂OH, S(O)₂R^a, -C(O)H, C(O)R^a, -C(S)X, -C(O)OR^a, -C(O)OH, -C(O)NH₂, -C(O)NHR^a, C(O)NR^cR^c, C(S)NH₂, C(O)NHR^a, -C(O)NR^cR^c, -C(NH)NH₂, -C(NH)NHR^a, 및 C(NH)NR^cR^c로 구성된 군으로부터 선택되고, 여기서 X는 할로이고, 각각의 R^a는 독립적으로 저급 알킬, (C6-C14) 아릴, (C7-C20) 아릴알킬, 5-14원 헤테로아릴 및 6-20원 헤테로아릴알킬로 구성된 군으로부터 선택되고, 각각의 R^c는 독립적으로 R^a이거나, 또는 대안적으로 동일한 질소 원자에 결합된 2개의 R^c는 그 질소 원자와 함께 취해져, O, N 및 S로 구성된 군으로부터 선택되는 동일하거나 상이한 고리 헤테로원자들 중 하나 이상을 선택적으로 포함할 수 있는 5- 내지 8-원 포화 또는 불포화 고리를 형성할 수 있거나;
또는 대안적으로, R^1′와 R^2′ 또는 R^7′와 R^8′는 이들이 결합된 탄소 원자와 함께 취해져 선택적으로 치환된 (C6-C14) 아릴 가교를 형성하고/하거나, R^4′와 R^4″ 및/또는 R^5′와 R^5″는 이들이 결합된 탄소 원자와 함께 취해져 벤조기를 형성하며;
R⁴, R⁵, R⁶, 및 R⁷은 각각 서로 독립적으로 수소, 저급 알킬, (C6-C14) 아릴, (C7-C20) 아릴알킬, 6-14원 헤테로아릴, 7-20원 헤테로아릴알킬, -R^b, 또는 -(CH₂)_x-R^b 중에서 선택되며;
E¹은 -NHR⁹, -NR⁹R¹⁰ 및 -OR^9b로 이루어진 군으로부터 선택되며;
E²는 -NHR⁹, -NR⁹R¹⁰ 및 -OR^9b로 이루어진 군으로부터 선택되며;
R⁹는 단독으로 취해질 때 수소, 저급 알킬, (C6-C14) 아릴, (C7-C20) 아릴알킬, 5-14원 헤테로아릴, 6-20원 헤테로아릴알킬 중에서 선택되거나; 또는 R⁷과 R⁹는 이들이 결합된 원자와 함께 취해져 선택적으로 치환된 헤테로시클로알킬기, 선택적으로 치환된 헤테로시클로알케닐기, 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴기를 형성하며;
R¹⁰은 H 또는 보호기이거나; 또는 R⁸과 R¹⁰은 이들이 결합된 원자와 함께 취해져 선택적으로 치환된 헤테로시클로알킬기, 선택적으로 치환된 헤테로시클로알케닐기, 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴기를 형성하며;
R^9b는 R⁹이며;
Y^1a, Y^1b, Y^2a, Y^2b, Y^3a 및 Y^3b의 각각은 -O-, -S-, -NH-, -C(O-) 및 -S(O)₂로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되며,
단, 각각의 E¹ 및 E²가 -OR^9b인 경우, R^1′와 R^2′ 및/또는 R^7′와 R^8′은 이들이 결합된 탄소 원자와 함께 취해져 선택적으로 치환된 (C6-C14) 아릴 가교를 형성할 수 있다.
제28항에 있어서, 상기 시약의 L은 -Z-(CH₂)_3-6-O-, -Z-(CH₂)_a-[(Ar)_b-(CH₂)_a]_c-O-, -Z-(CH₂)_a-[C≡C-(CH₂)_a]_c-O-, -Z-(CH₂)_a-[C≡C-(Ar)_b]_c-(CH₂)_a-O-, -Z-(CH₂)_d-NH-C(O)-[(CH₂)_a-(Ar)-(CH₂)_a-C(O)-NH]_c-(CH₂)_d-O-, 및 -Z-[CH₂(CH₂)_eO]_f-CH₂(CH₂)_eO- 중에서 선택되며, 여기서, 각각의 Z는 서로 독립적으로 작용기 F^z에 의해 기여된 연결의 부분을 나타내며;
각각의 a는 다른 것들과 독립적으로 0 내지 4 범위의 정수를 나타내며;
각각의 b는 다른 것들과 독립적으로 1 내지 2 범위의 정수를 나타내며;
각각의 c는 다른 것들과 독립적으로 1 내지 5 범위의 정수를 나타내며;
각각의 d는 다른 것들과 독립적으로 1 내지 10 범위의 정수를 나타내며;
각각의 e는 다른 것들과 독립적으로 1 내지 4 범위의 정수를 나타내며;
각각의 f는 다른 것들과 독립적으로 1 내지 10 범위의 정수를 나타내며;
각각의 Ar은 다른 것들과 독립적으로 선택적으로 치환된 단환 또는 다환 시클로알킬렌, 시클로헤테로알키넨, 아릴렌 또는 헤테로아릴렌 기를 나타내는, 올리고뉴클레오티드.
제73항에 있어서, L의 각각의 Ar은 다른 것들과 독립적으로 시클로헥산, 피페라진, 벤젠, 나프탈렌, 페놀, 푸란, 피리딘, 피페리딘, 이미다졸, 피롤리딘 또는 옥사디졸로부터 유도된 기인, 올리고뉴클레오티드.
제28항에 있어서, 상기 시약은 아미노, 히드록실, 티올 및 알데히드로 구성된 군으로부터 선택된 반응성 기를 포함하는 적절하게 보호된 합성 핸들, 및 a) 올리고뉴클레오타이드의 합성 과정 동안 추가 모이어티의 부착을 위한 반응성 기를 제공하기 위해 제거되거나 b) 올리고뉴클레오타이드의 합성 과정 동안 안정적이고 올리고뉴클레오타이드의 합성 후 제거되어 추가 모이어티의 부착을 위한 반응성 기를 제공하도록 구성된 보호기를 추가로 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
제75항에 있어서, 상기 시약은 구조식 (VIII)에 따른 화합물인, 올리고뉴클레오티드:
R^kO-L-LM-L-PEP (VIII)
상기 식에서, R^k는 산-불안정한 보호기를 나타내고, 각각의 L은 다른 것과 독립적으로 선택적 링커를 나타내고, LM은 표지 모이어티를 나타내며 PEP는 포스페이트 에스테르 전구체 기를 나타낸다.
제75항에 있어서, 상기 시약은 구조식 (IX)에 따른 화합물인, 올리고뉴클레오티드:

상기 식에서, R^k는 산-불안정한 보호기를 나타낸다.
제77항에 있어서, 상기 시약은 구조식 (IX.1)에 따른 화합물인, 올리고뉴클레오티드:

상기 식에서, -Z-는 작용기 F^z에 의해 기여된 연결 부분을 나타내고, Sp¹, Sp² 및 Sp³은 같거나 다를 수 있고 각각 간격 모이어티를 나타내며, G는 CH, N, 또는 아릴렌, 페닐렌, 헤테로아릴렌, 저급 시클로알킬렌, 시클로헥실렌 및/또는 저급 시클로헤테로알킬렌을 포함하는 기를 나타낸다.
제78항에 있어서, Sp¹, Sp² 및 Sp³은 각각 서로 독립적으로 1 내지 10개의 탄소 원자를 함유하는 알킬렌 사슬, (CH₂)_a[(Ar)_b-(CH₂)_a]_c-, -(CH₂)_a-[C≡C-(CH₂)_a]_c-, -(CH₂)_a-[C≡C-(Ar)_b]_c-(CH₂)_a-, (CH₂)_dNH-C(O)-[(CH₂)_a-(Ar)-(CH₂)_a-C(O)-NH]_c-(CH₂)_d- 및 -[CH₂(CH₂)_eO]_f-CH₂(CH₂)- 중에서 선택되고, 여기서 각각의 a는 다른 것들과 독립적으로 0 내지 4 범위의 정수를 나타내며;
각각의 b는 다른 것들과 독립적으로 1 내지 2 범위의 정수를 나타내며;
각각의 c는 다른 것들과 독립적으로 1 내지 5 범위의 정수를 나타내며;
각각의 d는 다른 것들과 독립적으로 1 내지 10 범위의 정수를 나타내며;
각각의 e는 다른 것들과 독립적으로 1 내지 4 범위의 정수를 나타내며;
각각의 f는 다른 것들과 독립적으로 1 내지 10 범위의 정수를 나타내며; 각각의 Ar은 다른 것들과 독립적으로 선택적으로 치환된 단환 또는 다환 시클로알킬렌, 시클로헤테로알킬렌, 아릴렌 또는 헤테로아릴렌 기를 나타내는, 올리고뉴클레오티드.
제75항에 있어서, 상기 시약이 하기 구조식 (IX.2), (IX.3), (IX.4) 또는 (IX.5)에 따른 화합물인, 올리고뉴클레오티드:

상기 식에서, B는 적절하게 보호된 핵 염기를 나타내고, L²는 표지 모이어티 LM을 핵 염기 B에 연결하는 링커를 나타내고, 구조식 (IX.4)에서, R¹⁶은 보호기를 나타내며;
상기 핵 염기는 아데닌, 7-데아자구아닌, 구아닌, 7-데아자구아닌, 시토신, 우라실, 티민, 이노신, 크산텐 및 하이포크산텐 중에서 선택된다.
제80항에 있어서, 상기 시약의 B는 A^iBu, A^Pac, C^Ac, G^iPr-Pac, T 및 U 중에서 선택되는, 올리고뉴클레오티드.
제80항에 있어서, 상기 시약의 L²는 -C≡C-CH₂-NH-, -C≡C-C(O)-, -CH=CH-NH-, -CH=CH-C(O)-, -C≡C-CH₂-NH-C(O)-(CH₂)_1-6-NH-, -CH=CH-C(O)-NH-(CH₂)_1-6-NH-C(O)-, -C=CH-CH₂-O-CH₂CH₂-[O-CH₂CH₂]_0-6-NH-, -C≡C-C≡C-CH₂-O-CH₂CH₂-[O-CH₂CH₂]_0-6-NH-, -C≡C-(Ar)_1-2-C≡C-CH₂-O-CH₂CH₂-[O-CH₂CH₂]_0-6-NH-, -C≡C-(Ar)_1-2-O-CH₂CH₂-[O-CH₂CH₂]_0-6-NH- 및 -C≡C-(Ar)_1-2-O-CH₂CH₂-[O-CH₂CH₂]_0-6-NH- 중에서 선택되고, 여기서 Ar은 다른 것들과 독립적으로 선택적으로 치환된 단환 또는 다환 시클로알킬렌, 시클로헤테로알키넨, 아릴렌 또는 헤테로아릴렌 기를 나타내는, 올리고뉴클레오티드.
제28항에 있어서, 상기 PEP기는 포스포라미다이트기 및 H-포스포네이트기를 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
제83항에 있어서, 상기 포스페이트 에스테르 전구체 기는 하기 화학식 (P.1)의 포스포라미다이트를 포함하는, 올리고뉴클레오티드:

상기 식에서,
R²⁰은 1 내지 10개의 탄소 원자를 함유하는 선형, 분지형 또는 환형 포화 또는 불포화 알킬, 2-시아노에틸, 6 내지 10개의 고리 탄소 원자를 함유하는 아릴, 및 6 내지 10개의 고리 탄소 원자 및 1 내지 10개의 알킬렌 탄소 원자를 함유하는 아릴알킬 중에서 선택되며;
R²¹ 및 R²²는 각각 서로 독립적으로 1 내지 10개의 탄소 원자를 함유하는 선형, 분지형 또는 환형 포화 또는 불포화 알킬, 6 내지 10개의 고리 탄소 원자를 함유하는 아릴, 및 6 내지 10개의 고리 탄소 원자 및 1 내지 10개의 알킬렌 탄소 원자를 함유하는 아릴알킬 중에서 선택되거나, 또는 대안적으로 R²¹ 및 R²²는 이들이 결합된 질소 원자와 함께 취해져 5 내지 6개의 고리 원자를 포함하는 포화 또는 불포화 고리를 형성하며, 이들 중 1개 또는 2개는 예시된 질소 원자에 더하여 O, N 및 S 중에서 선택된 헤테로원자일 수 있다.
제83항에 있어서, R²⁰은 베타-시아노에틸이고, R²¹ 및 R²²는 각각 이소프로필인, 올리고뉴클레오티드.
제85항에 있어서, 상기 합성 핸들은 화학식 -OR^k를 가지며, 여기서 R^k는 산-불안정한 보호기인, 올리고뉴클레오티드.
제86항에 있어서, 상기 산-불안정한 보호기는 트리페닐메틸(트리틸), 4-모노메톡시트리틸, 4,4'-디메톡시트리틸, 4,4',4"-트리메톡시트리틸, 비스(p-아니실)페닐메틸, 나프틸디페닐메틸, p-(p'-브로모페나실옥시)페닐디페닐메틸, 9-안트릴, 9-(9-페닐)크산테닐 및 9-(9-페닐-10 옥소)안트릴로 구성된 군으로부터 선택되는, 올리고뉴클레오티드.
올리고뉴클레오티드를 표지하는데 유용한 시약으로서, 하기 구조식에 따른 화합물인, 시약:
LM-L-PEP (XX)
상기 식에서, LM은 N-보호된 NH-로다민 모이어티를 포함하는 표지 모이어티를 나타내고, PEP는 포스포라미다이트기 또는 H-포스포네이트기를 포함하는 포스페이트 에스테르 전구체 기이며, L은 표지 모이어티를 포스페이트 에스테르 전구체 기에 연결하는 선택적 링커이며, 상기 N-보호된 NH-로다민 모이어티는 하기 화학식을 가지며

상기 식에서, R¹, R², R³, R⁶, R⁷, R⁸, R¹¹, R¹², R¹³, 및 R¹⁴는 단독으로 취해질 때 각각 서로 독립적으로 수소, 저급 알킬, (C6-C14) 아릴, (C7-C20) 아릴알킬, 5-14원 헤테로아릴, 6-20원 헤테로아릴알킬, -R^b, 또는 -(CH₂)_n-R^b 중에서 선택되거나; 또는 대안적으로, R¹과 R² 및/또는 R⁶과 R⁷은 이들이 결합된 탄소 원자와 함께 취해져 선택적으로 치환된 벤조기를 형성하며; R², R³, R⁷, R⁸, R¹², 또는 R¹³ 중 하나는 화학식 -Y-의 기를 포함하며, 여기서 Y는 -C(O)-, -S(O)₂-, -S- 및 -NH-로 구성된 군으로부터 선택되며;
R⁴는 단독으로 취해질 때 수소, 저급 알킬, (C6-C14) 아릴, (C7-C20) 아릴알킬, 5-14원 헤테로아릴, 6-20원 헤테로아릴알킬 중에서 선택되거나; 또는 R⁴와 R² 또는 R³ 중 하나는 이들이 결합된 원자와 함께 취해져 선택적으로 치환된 헤테로시클로알킬기, 선택적으로 치환된 헤테로시클로알케닐기, 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴기를 형성하며;
R⁵는 H 또는 보호기이며;
R⁹는 단독으로 취해질 때 수소, 저급 알킬, (C6-C14) 아릴, (C7-C20) 아릴알킬, 5-14원 헤테로아릴, 6-20원 헤테로아릴알킬 중에서 선택되거나; 또는 R⁷과 R⁹는 이들이 결합된 원자와 함께 취해져 선택적으로 치환된 헤테로시클로알킬기, 선택적으로 치환된 헤테로시클로알케닐기, 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴기를 형성하며;
R¹⁰은 H 또는 보호기이거나; 또는 R⁸과 R¹⁰은 이들이 결합된 원자와 함께 취해져 선택적으로 치환된 헤테로시클로알킬기, 선택적으로 치환된 헤테로시클로알케닐기, 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴기를 형성하며;
R⁷과 R⁹ 또는 R⁸과 R¹⁰ 중 적어도 하나는 이들이 결합된 원자와 함께 취해져 선택적으로 치환된 헤테로시클로알킬기, 선택적으로 치환된 헤테로시클로 알케닐기 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴기를 형성하고, 선택적으로 R⁴와 R² 또는 R³ 중 하나는 이들이 결합된 원자와 함께 취해져 선택적으로 치환된 헤테로시클로알킬기, 선택적으로 치환된 헤테로시클로알케닐기, 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴기를 형성하며; 단, 화합물은 하기 화학식의 화합물이 아니며

각각의 R^a는 저급 알킬, (C6-C14) 아릴, (C7-C20) 아릴알킬, 5-14원 헤테로아릴, -CX₃ 및 6-20원 헤테로아릴알킬 중에서 독립적으로 선택되며;
각각의 R^b는 X, -OH, -OR^a -SH, -SR^a NH₂, -NHR^a, NR^cR^c, N⁺R^cR^cR^c, 퍼할로 저급 알킬, 트리할로메틸, 트리플루오로메틸, -P(O)(OH)₂, P(O)(OR^a)₂, P(O)(OH)(OR^a), -OP(O)(OH)₂, OP(O)(OR^a)₂, -OP(O)(OR^a)(OH), -S(O)₂OH, S(O)₂R^a, -C(O)H, C(O)R^a, -C(S)X, -C(O)OR^a, -C(O)OH, -C(O)NH₂, -C(O)NHR^a, C(O)NR^cR^c, C(S)NH₂, C(O)NHR^a, -C(O)NR^cR^c, -C(NH)NH₂, -C(NH)NHR^a, 및 C(NH)NR^cR^c 중에서 독립적으로 선택되며;
각각의 R^c는 독립적으로 R^a이거나, 또는 대안적으로 동일한 질소 원자에 결합된 2개의 R^c는 그 질소 원자와 함께 취해져, O, N 및 S 중에서 선택되는 동일하거나 상이한 고리 헤테로원자들 중 하나 이상을 선택적으로 포함할 수 있는 5- 내지 8-원 포화 또는 불포화 고리를 형성할 수 있으며;
각각의 R^d 및 R^e는 단독으로 취해질 때 수소, 저급 알킬, (C6-C14) 아릴, (C7-C20) 아릴알킬, 5-14원 헤테로아릴, 6-20원 헤테로아릴알킬, -R^b, 또는 -(CH₂)_n-R^b 중에서 독립적으로 선택되며;
X는 할로이며;
n은 1 내지 10 범위의 정수이다.
제88항에 있어서, 상기 시약의 L은 -Z-(CH₂)_3-6-O-, -Z-(CH₂)_a-[(Ar)_b-(CH₂)_a]_c-O-, -Z-(CH₂)_a-[C≡C-(CH₂)_a]_c-O-, -Z-(CH₂)_a-[C≡C-(Ar)_b]_c-(CH₂)_a-O-, -Z-(CH₂)_d-NH-C(O)-[(CH₂)_a-(Ar)-(CH₂)_a-C(O)-NH]_c-(CH₂)_d-O-, 및 -Z-[CH₂(CH₂)_eO]_f-CH₂(CH₂)_eO- 중에서 선택되며, 여기서, 각각의 Z는 서로 독립적으로 작용기 F^z에 의해 기여된 연결의 부분을 나타내며;
각각의 a는 다른 것들과 독립적으로 0 내지 4 범위의 정수를 나타내며;
각각의 b는 다른 것들과 독립적으로 1 내지 2 범위의 정수를 나타내며;
각각의 c는 다른 것들과 독립적으로 1 내지 5 범위의 정수를 나타내며;
각각의 d는 다른 것들과 독립적으로 1 내지 10 범위의 정수를 나타내며;
각각의 e는 다른 것들과 독립적으로 1 내지 4 범위의 정수를 나타내며;
각각의 f는 다른 것들과 독립적으로 1 내지 10 범위의 정수를 나타내며;
각각의 Ar은 다른 것들과 독립적으로 선택적으로 치환된 단환 또는 다환 시클로알킬렌, 시클로헤테로알키넨, 아릴렌 또는 헤테로아릴렌 기를 나타내는, 시약.
제73항에 있어서, L의 각각의 Ar은 다른 것들과 독립적으로 시클로헥산, 피페라진, 벤젠, 나프탈렌, 페놀, 푸란, 피리딘, 피페리딘, 이미다졸, 피롤리딘 또는 옥사디졸로부터 유도된 기인, 올리고뉴클레오티드.
제88항에 있어서, 하기 구조식 (VII.1)에 따른 화합물인, 시약:

상기 식에서, B는 적절하게 보호된 핵 염기를 나타내고, L²는 핵 염기 B를 표지 모이어티 LM에 연결하는 링커를 나타낸다.
제91항에 있어서, 상기 핵 염기는 아데닌, 7-데아자구아닌, 구아닌, 7-데아자구아닌, 시토신, 우라실, 티민, 이노신, 크산텐 및 하이포크산텐 중에서 선택되는, 시약.
제92항에 있어서, B는 A^iBu, A^Pac, C^Ac, G^iPr-Pac, T 및 U 중에서 선택되는, 시약.
제91항에 있어서, L²는 -C≡C-CH₂-NH-, -C≡C-C(O)-, -CH=CH-NH-, -CH=CH-C(O)-, -C≡C-CH₂-NH-C(O)-(CH₂)_1-6-NH-, -CH=CH-C(O)-NH-(CH₂)_1-6-NH-C(O)-, -C≡CH-CH₂-O-CH₂CH₂-[O-CH₂CH₂]_0-6-NH-, -C≡C-C≡C-CH₂-O-CH₂CH₂-[O-CH₂CH₂]_0-6-NH-, -C≡C-(Ar)_1-2-C≡C-CH₂-O-CH₂CH₂-[O-CH₂CH₂]_0-6-NH-, -C≡C-(Ar)_1-2-O-CH₂CH₂-[O-CH₂CH₂]_0-6-NH- 및 -C≡C-(Ar)_1-2-O-CH₂CH₂-[O-CH₂CH₂]_0-6-NH- 중에서 선택되고, 여기서 Ar은 제86항에 정의된 바와 같은, 시약.
제91항에 있어서, -B-L²-는 하기 화학식으로 구성된 군으로부터 선택되는, 시약:
제89항에 있어서, 적절하게 보호된 합성 핸들을 추가로 포함하는 시약.
제96항에 있어서, 하기 화학식 (VIII)을 갖는, 시약:
R^kO-L-LM-L-PEP (VIII)
상기 식에서, R^k는 산-불안정한 보호기를 나타내고, 각각의 L은 다른 것과 독립적으로 선택적 링커를 나타내고, LM은 표지 모이어티를 나타내며 PEP는 포스페이트 에스테르 전구체 기를 나타낸다.
제96항에 있어서, 상기 시약은 하기 구조식 (IX)에 따른 화합물인, 시약:

상기 식에서, R^k는 산-불안정한 보호기를 나타낸다.
제98항에 있어서, 상기 시약은 하기 구조식 (IX.1)에 따른 화합물인, 시약:

상기 식에서, -Z-는 작용기 F^z에 의해 기여된 연결 부분을 나타내고, Sp¹, Sp² 및 Sp³은 같거나 다를 수 있고 각각 간격 모이어티를 나타내며, G는 CH, N, 또는 아릴렌, 페닐렌, 헤테로아릴렌, 저급 시클로알킬렌, 시클로헥실렌 및/또는 저급 시클로헤테로알킬렌을 포함하는 기를 나타낸다.
제99항에 있어서, Sp¹, Sp² 및 Sp³은 각각 서로 독립적으로 1 내지 10개의 탄소 원자를 함유하는 알킬렌 사슬, -(CH₂)_a-[(Ar)_b-(CH₂)_a]_c-, -(CH₂)_a-[C≡C-(CH₂)_a]_c-, -(CH₂)_a-[C≡C-(Ar)_b]_c-(CH₂)_a-, -(CH₂)_d-NH-C(O)-[(CH₂)_a-(Ar)-(CH₂)_a-C(O)-NH]_c-(CH₂)_d- 및 -[CH₂(CH₂)_eO]_f-CH₂(CH₂)- 중에서 선택되고, 여기서 각각의 a는 다른 것들과 독립적으로 0 내지 4 범위의 정수를 나타내며;
각각의 b는 다른 것들과 독립적으로 1 내지 2 범위의 정수를 나타내며;
각각의 c는 다른 것들과 독립적으로 1 내지 5 범위의 정수를 나타내며;
각각의 d는 다른 것들과 독립적으로 1 내지 10 범위의 정수를 나타내며;
각각의 e는 다른 것들과 독립적으로 1 내지 4 범위의 정수를 나타내며;
각각의 f는 다른 것들과 독립적으로 1 내지 10 범위의 정수를 나타내며; 각각의 Ar은 다른 것들과 독립적으로 선택적으로 치환된 단환 또는 다환 시클로알킬렌, 시클로헤테로알킬렌, 아릴렌 또는 헤테로아릴렌 기를 나타내는, 시약.
제98항에 있어서, 상기 시약은 하기 구조식 (IX.2), (IX.3), (IX.4) 또는 (IX.5)에 따른 화합물인, 시약:

상기 식에서, B는 적절하게 보호된 핵 염기를 나타내고, L²는 표지 모이어티 LM을 핵 염기 B에 연결하는 링커를 나타내고, 구조식 (IX.4)에서, R¹⁶은 보호기를 나타낸다.
제101항에 있어서, 상기 핵 염기는 아데닌, 7-데아자구아닌, 구아닌, 7-데아자구아닌, 시토신, 우라실, 티민, 이노신, 크산텐 및 하이포크산텐 중에서 선택되는, 시약.
제101항에 있어서, 상기 시약의 B는 A^iBu, A^Pac, C^Ac, G^iPr-Pac, T 및 U 중에서 선택되는, 올리고뉴클레오티드.
제101항에 있어서, 상기 시약의 L²는 -C≡C-CH₂-NH-, -C≡C-C(O)-, -CH=CH-NH-, -CH=CH-C(O)-, -C≡C-CH₂-NH-C(O)-(CH₂)_1-6-NH-, -CH=CH-C(O)-NH-(CH₂)_1-6-NH-C(O)-, -C=CH-CH₂-O-CH₂CH₂-[O-CH₂CH₂]_0-6-NH-, -C≡C-C≡C-CH₂-O-CH₂CH₂-[O-CH₂CH₂]_0-6-NH-, -C≡C-(Ar)_1-2-C≡C-CH₂-O-CH₂CH₂-[O-CH₂CH₂]_0-6-NH-, -C≡C-(Ar)_1-2-O-CH₂CH₂-[O-CH₂CH₂]_0-6-NH- 및 -C≡C-(Ar)_1-2-O-CH₂CH₂-[O-CH₂CH₂]_0-6-NH- 중에서 선택되고, 여기서 Ar은 다른 것들과 독립적으로 선택적으로 치환된 단환 또는 다환 시클로알킬렌, 시클로헤테로알키넨, 아릴렌 또는 헤테로아릴렌 기를 나타내는, 시약.
제101항에 있어서, -B-L²-는 하기 화학식으로 구성된 군으로부터 선택되는, 시약:
제89항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포스페이트 에스테르 전구체 기는 포스포라미다이트기 및 H-포스포네이트기를 포함하는, 시약.
제106항에 있어서, 상기 포스페이트 에스테르 전구체 기는 하기 화학식 (P.1)의 포스포라미다이트를 포함하는, 시약:

상기 식에서,
R²⁰은 1 내지 10개의 탄소 원자를 함유하는 선형, 분지형 또는 환형 포화 또는 불포화 알킬, 2-시아노에틸, 6 내지 10개의 고리 탄소 원자를 함유하는 아릴, 및 6 내지 10개의 고리 탄소 원자 및 1 내지 10개의 알킬렌 탄소 원자를 함유하는 아릴알킬 중에서 선택되며;
R²¹ 및 R²²는 각각 서로 독립적으로 1 내지 10개의 탄소 원자를 함유하는 선형, 분지형 또는 환형 포화 또는 불포화 알킬, 6 내지 10개의 고리 탄소 원자를 함유하는 아릴, 및 6 내지 10개의 고리 탄소 원자 및 1 내지 10개의 알킬렌 탄소 원자를 함유하는 아릴알킬 중에서 선택되거나, 또는 대안적으로 R²¹ 및 R²²는 이들이 결합된 질소 원자와 함께 취해져 5 내지 6개의 고리 원자를 포함하는 포화 또는 불포화 고리를 형성하며, 이들 중 1개 또는 2개는 예시된 질소 원자에 더하여 O, N 및 S 중에서 선택된 헤테로원자일 수 있다.
제107항에 있어서, R²⁰은 베타-시아노에틸이고, R²¹ 및 R²²는 각각 이소프로필인, 시약.
제88항에 있어서, 고체 지지체 및 적절하게 보호된 합성 핸들을 추가로 포함하는, 시약.
제106항에 있어서, 하기 구조식 (X)에 따른 화합물인, 시약:

상기 식에서, LM은 표지 모이어티를 나타내고, L은 선택적인 선택적 절단 가능한 링커를 나타내고, R^k는 산-불안정한 보호기를 나타낸다.
제110항에 있어서, 하기 구조식 (X.1)에 따른 화합물인, 시약:

상기 식에서, Z, G, Sp¹, Sp² 및 W는 제14항에서 이미 정의된 바와 같고, Sp⁴는 선택적으로 절단 가능한 간격 모이어티를 나타낸다.
제106항에 있어서, Sp¹ 및 Sp²는 각각 서로 독립적으로 1 내지 10개의 탄소 원자를 함유하는 알킬렌 사슬, -(CH₂)_a-[(Ar)_b-(CH₂)_a]_c-, -(CH₂)_a-[C≡C-(CH₂)_a]_c-, -(CH₂)_a-[C≡C-(Ar)_b]_c-(CH₂)_a-, -(CH₂)_d-NH-C(O)-[(CH₂)_a-(Ar)-(CH₂)_a-C(O)-NH]_c-(CH₂)_d- 및 [CH₂(CH₂)_eO]_f-CH₂(CH₂)- 중에서 선택되고, 여기서 a, b, c, d, e, f 및 Ar은 제4항에서 정의된 바와 같고, Sp⁴는 에스테르 결합을 포함하는, 시약.
제110항에 있어서, 하기 구조식 (X.2), (X.3), (X.4) 또는 (X.5)에 따른 화합물인, 시약:

상기 식에서, B, L² 및 R¹⁶은 제16항에 이미 정의된 바와 같다.
제113항에 있어서, 상기 핵 염기는 아데닌, 7-데아자구아닌, 구아닌, 7-데아자구아닌, 시토신, 우라실, 티민, 이노신, 크산텐 및 하이포크산텐 중에서 선택되는, 시약.
제113항에 있어서, B는 A^iBu, A^Pac, C^Ac, G^iPr-Pac, 및 U 중에서 선택되는, 시약.
제113항에 있어서, L²는 -C≡C-CH₂-NH-, -C≡C-C(O)-, -CH=CH-NH-, -CH=CH-C(O)-, -C≡C-CH₂-NH-C(O)-(CH₂)_1-6-NH-, -CH=CH-C(O)-NH-(CH₂)_1-6-NH-C(O)-, -C≡CH-CH₂-O-CH₂CH₂-[O-CH₂CH₂]_0-6-NH-, -C≡C-C≡C-CH₂-O-CH₂CH₂[O-CH₂CH₂]_0-6-NH-, -C≡C-(Ar)_1-2-C≡C-CH₂-O-CH₂CH₂[O-CH₂CH₂]_0-6-NH-, -C≡C-(Ar)_1-2-O-CH₂CH₂[O-CH₂CH₂]_0-6-NH- 및 -C≡C-(Ar)_1-2-O-CH₂CH₂-[O-CH₂CH₂]_0-6-NH-로 구성된 군으로부터 선택되고, 여기서 Ar은 제4항에 정의된 바와 같은, 시약.
제113항에 있어서, -B-L²-는 하기 화학식 중에서 선택되는, 시약:
제97항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, R^k는 4′,4″-디메톡시트리틸인, 시약.
제88항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N-보호된 NH-로다민 모이어티는 하기 구조식으로부터 선택된 구조를 포함하는, 시약:

상기 식에서, R^f, R^g, R^h, Rⁱ, 및 R^j의 각각은 단독으로 취해질 때 각각 서로 독립적으로 수소, 저급 알킬, (C6-C14) 아릴, (C7-C20) 아릴알킬, 5-14원 헤테로아릴, 6-20원 헤테로아릴알킬, -R^b 중에서 선택되거나, 또는 -(CH₂)_n-R^bR′는 R^3′ 및 수소 중에서 선택된다.
제119항에 있어서, 상기 N-보호된 NH-로다민 모이어티는 하기 구조식 (III.1), (III.2), (III.3), 및 (III.4)로부터 선택된 구조를 포함하는, 시약:

상기 식에서, R¹-R¹⁴, R^a-R^j, 및 Y는 이미 정의된 바와 같다.
제119항 또는 제120항에 있어서, 상기 N-보호된 NH-로다민 모이어티는 다음 중에서 선택된 하나 이상의 적용 가능한 특징을 포함하는, 시약:
(i) Y는 -C(O)-, -S(O)₂-, -S- 및 -NH- 중에서 선택됨;
(ii) R¹¹ 및 R¹⁴는 각각 클로로임;
(iii) R¹ 및 R⁶은 각각 수소임;
(iv) R¹과 R² 또는 R⁶과 R⁶은 함께 취해져 벤조기를 형성함;
(v) R² 및 R⁷은 각각 수소 또는 저급 알킬임;
(vi) R⁵는 보호기임; 및
(vii) R⁴ 및 R⁹는 인접한 탄소 원자 상의 치환기와 함께 취해져 -CH₂CH₂-, -CH₂CH₂CH₂-, -C(CH₃)₂CH=C(CH₃)-, C(CH₃)₂CH=CH-, -CH₂C(CH₃)₂- 및
중에서 선택된 기를 형성함
제116항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, R⁵는 화학식 -C(O)R¹⁵의 아실기이며, 여기서 R¹⁰은 수소, 저급 알킬, 메틸, -CX₃. -CHX₂. -CH₂X, CH₂OR^d, 및 저급 알킬, 메틸, X, OR^d, 시아노 또는 니트로기로 선택적으로 일 치환된 페닐 중에서 선택되며, 여기서 R^d는 저급 알킬, 페닐 및 피리딜 중에서 선택되며, 각각의 X는 할로기인, 시약.
제122항에 있어서, R¹⁵는 메틸 및 트리플루오로메틸 중에서 선택되는, 시약.
제88항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표지 모이어티는 N-보호된 NH-로다민 모이어티에 대한 도너 및/또는 억셉터 모이어티를 추가로 포함하는, 시약.
제88항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표지 모이어티는 N-보호된 NH-로다민 모이어티에 대한 도너 모이어티를 추가로 포함하는, 시약.
제125항에 있어서, 상기 도너 모이어티는 N-보호된 NH-로다민 모이어티 또는 O-보호된 플루오레세인 모이어티를 포함하는, 시약.
제126항에 있어서, 상기 도너 모이어티의 2'-, 2"-, 4'-, 5'-, 7'-, 7"-, 5-또는 6-위치는 N-보호된 NH-로다민 모이어티의 R³, R¹², 또는 R¹³에 연결되는, 시약.
제127항에 있어서, 상기 도너 모이어티 및 상기 N-보호된 NH-로다민 모이어티는 헤드-투-헤드 배향으로 연결되는, 시약.
제127항에 있어서, 상기 도너 모이어티 및 상기 N-보호된 NH-로다민 모이어티는 헤드-투-테일 배향으로 연결되는, 시약.
제127항에 있어서, 상기 도너 모이어티 및 상기 N-보호된 NH-로다민 모이어티는 테일-투-테일 배향으로 연결되는, 시약.
제127항에 있어서, 상기 도너 모이어티 및 상기 N-보호된 NH-로다민 모이어티는 사이드-투-사이드 배향으로 연결되는, 시약.
제127항에 있어서, 상기 도너 모이어티 및 상기 N-보호된 NH-로다민 모이어티는 사이드-투-헤드 배향으로 연결되는, 시약.
제127항에 있어서, 상기 도너 모이어티 및 상기 N-보호된 NH-로다민 모이어티는 사이드-투-테일 배향으로 연결되는, 시약.
제127항에 있어서, 상기 표지 모이어티는 하기 구조식 (VI)를 포함하는, 시약:
A-Z¹-Sp-Z²-D (VI)
상기 식에서, A는 N-보호된 NH-로다민 모이어티를 나타내고, D는 도너 모이어티를 나타내고, Z¹ 및 Z²는 동일하거나 상이할 수 있으며 작용기 F^z를 포함하는 연결 모이어티에 의해 제공되는 연결 부분을 나타내고, Sp는 간격 모이어티를 나타낸다.
제134항에 있어서, A는 N-보호된 NH-로다민 모이어티이고, D는 하기 구조식 D.1, D.2, D.3, D.4, D.5, D.6, D.7, D.8, D.9, D.10, D.11 및 D.12 중에서 선택되는, 시약:

상기 D.1 내지 D.12 각각에서,
R^1′, R^2′, R^2″, R^4′, R^4″, R^5′, R^5″, R^7′, R^7″, 및 R^8′의 각각은 단독으로 취해질 때 독립적으로 수소, 저급 알킬, (C6-C14) 아릴, (C7-C20) 아릴알킬, 5-14원 헤테로아릴, 6-20원 헤테로아릴알킬, R^b 및 -(CH₂)_x-R^b로 구성된 군으로부터 선택되며, 여기서 x는 1 내지 10의 값을 갖는 정수이고, R^b는 -X, -OH, -OR^a, -SH, -SR^a -NH₂, -NHR^a, NR^cR^c, N⁺R^cR^cR^c, 퍼할로 저급 알킬, 트리할로메틸, 트리플루오로메틸, -P(O)(OH)₂, P(O)(OR^a)₂, P(O)(OH)(OR^a), -OP(O)(OH)₂, OP(O)(OR^a)₂, -OP(O)(OR^a)(OH), -S(O)₂OH, S(O)₂R^a, -C(O)H, C(O)R^a, -C(S)X, -C(O)OR^a, -C(O)OH, -C(O)NH₂, -C(O)NHR^a, C(O)NR^cR^c, C(S)NH₂, C(O)NHR^a, -C(O)NR^cR^c, -C(NH)NH₂, -C(NH)NHR^a, 및 C(NH)NR^cR^c로 구성된 군으로부터 선택되고, 여기서 X는 할로이고, 각각의 R^a는 독립적으로 저급 알킬, (C6-C14) 아릴, (C7-C20) 아릴알킬, 5-14원 헤테로아릴 및 6-20원 헤테로아릴알킬로 구성된 군으로부터 선택되고, 각각의 R^c는 독립적으로 R^a이거나, 또는 대안적으로 동일한 질소 원자에 결합된 2개의 R^c는 그 질소 원자와 함께 취해져, O, N 및 S로 구성된 군으로부터 선택되는 동일하거나 상이한 고리 헤테로원자들 중 하나 이상을 선택적으로 포함할 수 있는 5- 내지 8-원 포화 또는 불포화 고리를 형성할 수 있거나;
또는 대안적으로, R^1′와 R^2′ 또는 R^7′와 R^8′는 이들이 결합된 탄소 원자와 함께 취해져 선택적으로 치환된 (C6-C14) 아릴 가교를 형성하고/하거나, R^4′와 R^4″ 및/또는 R^5′와 R^5″는 이들이 결합된 탄소 원자와 함께 취해져 벤조기를 형성하며;
R⁴, R⁵, R⁶, 및 R⁷은 각각 서로 독립적으로 수소, 저급 알킬, (C6-C14) 아릴, (C7-C20) 아릴알킬, 6-14원 헤테로아릴, 7-20원 헤테로아릴알킬, -R^b, 또는 -(CH₂)_x-R^b 중에서 선택되며;
E¹은 -NHR⁹, -NR⁹R¹⁰ 및 -OR^9b로 이루어진 군으로부터 선택되며;
E²는 -NHR⁹, -NR⁹R¹⁰ 및 -OR^9b로 이루어진 군으로부터 선택되며;
R⁹는 단독으로 취해질 때 수소, 저급 알킬, (C6-C14) 아릴, (C7-C20) 아릴알킬, 5-14원 헤테로아릴, 6-20원 헤테로아릴알킬 중에서 선택되거나; 또는 R⁷과 R⁹는 이들이 결합된 원자와 함께 취해져 선택적으로 치환된 헤테로시클로알킬기, 선택적으로 치환된 헤테로시클로알케닐기, 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴기를 형성하며;
R¹⁰은 H 또는 보호기이거나; 또는 R⁸과 R¹⁰은 이들이 결합된 원자와 함께 취해져 선택적으로 치환된 헤테로시클로알킬기, 선택적으로 치환된 헤테로시클로알케닐기, 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴기를 형성하며;
R^9b는 R⁹이며;
Y^1a, Y^1b, Y^2a, Y^2b, Y^3a 및 Y^3b의 각각은 -O-, -S-, -NH-, -C(O)- 및 -S(O)₂로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되며,
단, 각각의 E¹ 및 E²가 -OR^9b인 경우, R^1′와 R^2′ 및/또는 R^7′와 R^8′은 이들이 결합된 탄소 원자와 함께 취해져 선택적으로 치환된 (C6-C14) 아릴 가교를 형성할 수 있다.
제135항에 있어서, D.1 내지 D.12는 다음 중에서 선택된 하나 이상의 적용 가능한 특징을 갖는, 시약:
(i) Y^1a, Y^2a 및 Y^3a는 각각 서로 독립적으로 -C(O)- 및 S(O)₂ 중에서 선택됨;
Y^1b, Y^2b 및 Y^3b는 -NH-임;
(iii) R⁴ 및 R⁷은 각각 클로로임;
(iv) R^1′ 및 R⁸은 각각 수소임;
(v) R^1′와 R^2′ 또는 R^7′와 R^8′은 함께 취해져 벤조기를 형성함; 및
(vi) R^2′ 및 R^7′은 각각 수소 또는 저급 알킬임.
제135항에 있어서, Y^1a, Y^2a 및 Y^3a는 -NH-이고; Y^1b, Y^2b 및 Y^3b는 -C(O)- 및 -S(O)₂- 중에서 선택되고; Z¹은 -C(O)- 및 -S(O)₂- 중에서 선택되고; Z²는 -NH-이고 Sp는 -(CH₂)_a-[(Ar)_b-(CH₂)_a]_c-, -(CH₂)_a-[C≡C-(CH₂)_a]_c-, -(CH₂)_a-[C≡C-(Ar)_b]_c-(CH₂)_a-, -(CH₂)_d-NH-C(O)-[(CH₂)_a-(Ar)-(CH₂)_a-C(O)-NH]_c-(CH₂)_d-, 및 -[CH₂(CH₂)_eO]_f-CH₂(CH₂)- 중에서 선택되며, 여기서 a, b, c, d, e, f 및 Ar은 제4항에서 이미 정의된 바와 같은, 시약.
제135항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 구조식 D.1 내지 D.12에서 R^1′와 R^2′ 및/또는 R^7′와 R^8′은 이들이 결합된 탄소 원자와 함께 취해져 벤조 가교를 형성하는, 시약.
제135항 내지 제138항 중 어느 한 항에 있어서, E¹ 및 E²는 각각 -OR^9b인, 시약.
제139항에 있어서, R^9b는 화학식 -C(O)R¹⁵의 아실기이고, 여기서 R¹⁵는 저급 알킬인, 시약.
제140항에 있어서, R¹⁵는 t-부틸인, 시약.
제135항 내지 제141항 중 어느 한 항에 있어서, R⁹는 화학식 -C(O)R¹⁵의 아실기이며, 여기서 R¹⁵는 수소, 저급 알킬, 메틸, -CX₃. -CHX₂. -CH₂X, CH₂OR^d, 및 저급 알킬, 메틸, X, OR^d, 시아노 또는 니트로기로 선택적으로 일 치환된 페닐 중에서 선택되며, 여기서 R^d는 저급 알킬, 페닐 및 피리딜 중에서 선택되며, 각각의 X는 할로기인, 시약.
제142항에 있어서, R¹⁵는 메틸 및 트리플루오로메틸 중에서 선택되는, 시약.
복수의 유전자 자리의 동시 증폭 및 분석을 위한 방법으로서,
핵산 샘플을 복수의 증폭 프라이머 쌍들로 증폭하여 복수의 증폭 생성물들을 형성하는 것을 포함하며, 여기서 프라이머 쌍들의 각각의 적어도 하나는 제28항의 표지된 뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 증폭 생성물들의 각각은 상이한 유전자 자리를 포함하는, 방법.
제144항에 있어서, 상기 제28항의 표지된 뉴클레오티드는 적어도 3개의 프라이머 쌍을 표지하는 데 사용되는, 방법.
제145항에 있어서, 상기 제28항의 표지된 뉴클레오티드는 3 내지 8개의 프라이머 쌍을 표지하는 데 사용되는, 방법.
제144항에 있어서, 상기 핵산 샘플은 전혈, 조직 생검, 림프, 뼈, 골수, 치아, 피부, 예를 들어 지문에 포함된 피부 세포, 뼈, 치아, 태반 세포를 포함하는 양수, 및 태아 세포를 포함하는 양수, 모발, 피부, 정액, 항문 분비물, 대변, 소변, 질 분비물, 땀, 타액, 구강 면봉(buccal swab), 다양한 환경 샘플(예를 들어, 농업, 물 및 토양), 일반적으로 연구 샘플, 일반적으로 정제된 샘플 및 용해된 세포 중에서 선택되는, 방법.
분석할 적어도 하나의 핵산 샘플의 유전자 자리 세트를 공-증폭하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 키트로서, 상기 유전자 자리 세트는 공-증폭될 수 있고, 상기 프라이머들 중 적어도 하나는 제28항의 표지된 뉴클레오티드를 포함하며, 상기 프라이머는 하나 이상의 용기에 있는, 키트.
제148항에 있어서, 상기 키트 내의 모든 올리고뉴클레오티드 프라이머는 하나의 용기에 있는, 키트.
제148항에 있어서, 다음 중 적어도 하나를 추가로 포함하는 키트:
적어도 하나의 멀티플렉스 증폭 반응을 위한 시약; 및
적어도 하나의 크기 표준을 갖는 용기.
제148항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머들 중 적어도 하나는 표지된 뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 표지된 뉴클레오티드는 제28항의 표지된 뉴클레오티드와 상이한 스펙트럼 특성을 갖는, 키트.