JP2021523268A - スルホローダミンホスホラミダイト色素 - Google Patents
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Abstract
Description
R1は、C1-C6アルキル又はL1-Xであり、
R2は、ハロゲン又はSO2NH2であり、
R3は、H又はハロゲンであり、
R4、R7、R8、及びR11は、単独である場合、独立して、H、ハロゲン、又は任意に置換されたC1-C6アルキルであり、
R5、R6、R9、及びR10は、単独である場合、独立して、H又は任意に置換されたC1-C6アルキルであり、
R4及びR5は、一緒の場合、R4及びR5が結合している原子を連結する任意に置換されたC2-C3アルキレン鎖であり、
R6及びR7は、一緒の場合、R6及びR7が結合している原子を連結する任意に置換されたC2-C3アルキレン鎖であり、
R8及びR9は、一緒の場合、R8及びR9が結合している原子を連結する任意に置換されたC2-C3アルキレン鎖であり、
R10及びR11は、一緒の場合、R10及びR11が結合している原子を連結する任意に置換されたC2-C3アルキレン鎖であり、
R5及びR6は、R5及びR6が結合している窒素原子と一緒の場合、5員又は6員の不飽和環を形成し、
R9及びR10は、R9及びR10が結合している窒素原子と一緒の場合、5員又は6員不飽和環を形成し、
L1は、任意に置換されたC2-C10アルキレン又は任意に置換されたC2-C20ヘテロアルキレンであり、
Xは、活性エステル、N3、プロピニル、マレイミド、又は-O-P(OCH2CH2CN)NR12R13、又はXは、
L3及びL4は、独立して、任意に置換されたC2-C10アルキレン、又は任意に置換されたC2-C30ヘテロアルキレンであり、
Qは、ヒドロキシル保護基であり、
Zは、CH、N、NHC(O)N、又はOC(O)Nであり、及び
R12及びR13は、独立して、任意に置換されたC1-C6アルキルである。
R1はC1-C6アルキルであり、
R2は、H、ハロゲン、又はSO2NH2であり、
R3は、H又はハロゲンであり、
R14及びR16は、単独である場合、独立して、H、ハロゲン、又は任意に置換されたC1-C6アルキルであり、
R15及びR17は、単独である場合、独立して、H又は任意に置換されたC1-C6アルキルであり、
R14及びR15は、一緒の場合、R14及びR15が結合している原子を連結する任意に置換されたC2-C3アルキレン鎖を形成し、
R16及びR17は、一緒の場合、R16及びR17が結合している原子を連結する任意に置換されたC2-C3アルキレン鎖を形成し、
Qは、ヒドロキシル保護基であり、
L1及びL2は、独立して、任意に置換されたC2-C10アルキレン、又は任意に置換されたC2-C20ヘテロアルキレンである。
R2は、H、ハロゲン又はSO2NH2であり、
R3は、ハロゲン又はHであり、
R4、R7、R8、及びR11は、単独である場合、独立して、H、ハロゲン、又は任意に置換されたC1-C6アルキルであり、
R5、R6、R9、及びR10は、単独である場合、独立して、H又は任意に置換されたC1-C6アルキルであり、
R4及びR5は、一緒の場合、R4及びR5が結合している原子を連結する任意に置換されたC2-C3アルキレン鎖であり、
R6及びR7は、一緒の場合、R6及びR7が結合している原子を連結する任意に置換されたC2-C3アルキレン鎖であり、
R8及びR9は、一緒の場合、R8及びR9が結合している原子を連結する任意に置換されたC2-C3アルキレン鎖であり、
R10及びR11は、一緒の場合、R10及びR11が結合している原子を連結する任意に置換されたC2-C3アルキレン鎖であり、
R5及びR6は、R5及びR6が結合している窒素原子と一緒の場合、5員又は6員の不飽和環を形成し、
R9及びR10は、R9及びR10が結合している窒素原子と一緒の場合、5員又は6員不飽和環を形成し、
Nは、1〜9の整数であり、
Yは、
Qはヒドロキシル保護基であり、及び
R12及びR13は、独立して、任意に置換されたC1-C6アルキルである。
R1は、L1-Xであり、
R2、R3、R4、及びR5は、独立して、H、ハロゲン、C1-C6アルキル、又はSO2NH2であり
R6及びR9は、独立して、H又は任意に置換されたC1-C6アルキルであり、
R7、R8、R10、R11、R14、及びR15は、独立して、H又は任意に置換されたC1-C6アルキルであり、
L1は、任意に置換されたC2-C10アルキレン、又は任意に置換されたC2-C20ヘテロアルキレンであり、
Xは、活性エステル、N3、プロピニル、マレイミド、又は-O-P(OCH2CH2CN)NR12R13、又はXは、
L3及びL4は、独立して、任意に置換されたC2-C10アルキレン、又は任意に置換されたC2-C30ヘテロアルキレンであり、
Qは、ヒドロキシル保護基であり、
Zは、CH、N、NHC(O)N、又はOC(O)Nであり、及び
R12及びR13は、独立して、任意に置換されたC1-C6アルキルである。
R2は、ハロゲン又はSO2NH2であり、
R3は、H又はハロゲンであり、
R4、R7、R8、及びR11は、単独である場合、独立して、H、ハロゲン、又は任意に置換されたC1-C6アルキルであり、
R5、R6、R9、及びR10は、単独である場合、独立して、H又は任意に置換されたC1-C6アルキルであり、
R4及びR5は、一緒の場合、R4及びR5が結合している原子を連結する任意に置換されたC2-C3アルキレン鎖であり、
R6及びR7は、一緒の場合、R6及びR7が結合している原子を連結する任意に置換されたC2-C3アルキレン鎖であり、
R8及びR9は、一緒の場合、R8及びR9が結合している原子を連結する任意に置換されたC2-C3アルキレン鎖であり、
R10及びR11は、一緒の場合、R10及びR11が結合している原子を連結する任意に置換されたC2-C3アルキレン鎖であり、
R5及びR6は、R5及びR6が結合している窒素原子と一緒の場合、5員又は6員の不飽和環を形成し、
R9及びR10は、R9及びR10が結合している窒素原子と一緒の場合、5員又は6員不飽和環を形成し、
Nは、1〜9の整数であり、
Yは、
波線は、式IIIへの結合点であり、
R12及びR13は、独立して、任意に置換されたC1-C6アルキルであり、
Wは、H又はL4-O-Z2であり、
L3、L4、及びL5は、独立して、任意に置換されたC2-C10アルキレン、又は任意に置換されたC2-C30ヘテロアルキレンであり、
Zは、CH、N、NHC(O)N、又はOC(O)Nであり、
Z1は、ヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドであり、及び
Z2は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、又はHである。
一態様において、本明細書に提供されるのは、一つ以上の反応性基、例えば、ホスホラミダイト基を含むスルホローダミン色素である。
R1は、C1-C6アルキル又はL1-Xであり、
R2は、ハロゲン又はSO2NH2であり、
R3は、H又はハロゲンであり、
R4、R7、R8、及びR11は、単独である場合、独立して、H、ハロゲン、又は任意に置換されたC1-C6アルキルであり、
R5、R6、R9、及びR10は、単独である場合、独立して、H又は任意に置換されたC1-C6アルキルであり、
R4及びR5は、一緒の場合、R4及びR5が結合している原子を連結する任意に置換されたC2-C3アルキレン鎖であり、
R6及びR7は、一緒の場合、R6及びR7が結合している原子を連結する任意に置換されたC2-C3アルキレン鎖であり、
R8及びR9は、一緒の場合、R8及びR9が結合している原子を連結する任意に置換されたC2-C3アルキレン鎖であり、
R10及びR11は、一緒の場合、R10及びR11が結合している原子を連結する任意に置換されたC2-C3アルキレン鎖であり、
R5及びR6は、R5及びR6が結合している窒素原子と一緒の場合、5員又は6員の不飽和環を形成し、
R9及びR10は、R9及びR10が結合している窒素原子と一緒の場合、5員又は6員不飽和環を形成し、
L1は、任意に置換されたC2-C10アルキレン又は任意に置換されたC2-C20ヘテロアルキレンであり、
Xは、活性エステル、N3、プロピニル、マレイミド、又は-O-P(OCH2CH2CN)NR12R13、又はXは、
L3及びL4は、独立して、任意に置換されたC2-C10アルキレン、又は任意に置換されたC2-C30ヘテロアルキレンであり、
Qは、ヒドロキシル保護基であり、
Zは、CH、N、NHC(O)N、又はOC(O)Nであり、及び
R12及びR13は、独立して、任意に置換されたC1-C6アルキルである。
R1はC1-C6アルキルであり、
R2は、H、ハロゲン、又はSO2NH2であり、
R3は、H又はハロゲンであり、
R14及びR16は、単独で、独立して、H、ハロゲン、又は任意に置換されたC1-C6アルキルであり、
R15及びR17は、単独で、独立して、H又は任意に置換されたC1-C6アルキルであり、
R14及びR15は、一緒になって、R14及びR15が結合している原子を連結する任意に置換されたC2-C3アルキレン鎖を形成し、
R16及びR17は、一緒になって、R16及びR17が結合している原子を連結する任意に置換されたC2-C3アルキレン鎖を形成し、
Qは、ヒドロキシル保護基であり、
L1及びL2は、独立して、任意に置換されたC2-C10アルキレン、又は任意に置換されたC2-C20ヘテロアルキレンである。
R2は、H、ハロゲン又はSO2NH2であり、
R3は、ハロゲン又はHであり、
R4、R7、R8、及びR11は、単独である場合、独立して、H、ハロゲン、又は任意に置換されたC1-C6アルキルであり、
R5、R6、R9、及びR10は、単独である場合、独立して、H又は任意に置換されたC1-C6アルキルであり、
R4及びR5は、一緒の場合、R4及びR5が結合している原子を連結する任意に置換されたC2-C3アルキレン鎖であり、
R6及びR7は、一緒の場合、R6及びR7が結合している原子を連結する任意に置換されたC2-C3アルキレン鎖であり、
R8及びR9は、一緒の場合、R8及びR9が結合している原子を連結する任意に置換されたC2-C3アルキレン鎖であり、
R10及びR11は、一緒の場合、R10及びR11が結合している原子を連結する任意に置換されたC2-C3アルキレン鎖であり、
R5及びR6は、R5及びR6が結合している窒素原子と一緒の場合、5員又は6員の不飽和環を形成し、
R9及びR10は、R9及びR10が結合している窒素原子と一緒の場合、5員又は6員不飽和環を形成し、
Nは、1〜9の整数であり、
Yは、
Qはヒドロキシル保護基であり、及び
R12及びR13は、独立して、任意に置換されたC1-C6アルキルである。
R1は、L1-Xであり、
R2、R3、R4、及びR5は、独立して、H、ハロゲン、C1-C6アルキル、又はSO2NH2であり
R6及びR9は、独立して、H又は任意に置換されたC1-C6アルキルであり、
R7、R8、R10、R11、R14、及びR15は、独立して、H又は任意に置換されたC1-C6アルキルであり、
L1は、任意に置換されたC2-C10アルキレン、又は任意に置換されたC2-C20ヘテロアルキレンであり、
Xは、活性エステル、N3、プロピニル、マレイミド、又は-O-P(OCH2CH2CN)NR12R13、又はXは、
L3及びL4は、独立して、任意に置換されたC2-C10アルキレン、又は任意に置換されたC2-C30ヘテロアルキレンであり、
Qは、ヒドロキシル保護基であり、
Zは、CH、N、NHC(O)N、又はOC(O)Nであり、及び
R12及びR13は、独立して、任意に置換されたC1-C6アルキルである。
R1、R2、R3、R4及びR5は、式VIの化合物について記載されている通りであり、及び
Q1及びQ2は、独立して、H又はC1-C6アシルである。
別の態様において、本明細書に提供されるものは、本明細書に開示のホスホラミダイト系スルホローダミン色素からのオリゴヌクレオチド自動合成によって調製されたスルホローダミン色素標識ポリヌクレオチドである。本明細書で使用される「スルホローダミン色素標識ポリヌクレオチド」は、本明細書で開示されるホスホラミダイトスルホローダミン色素からのオリゴヌクレオチド自動合成によって調製されたポリヌクレオチドであって、オープン又はクローズドのいずれかの形態でスルホローダミン色素部分を組み込んでいるポリヌクレオチドを指す。
R2は、H、ハロゲン又はSO2NH2であり、
R3は、H又はハロゲンであり、
R4、R7、R8、及びR11は、単独である場合、独立して、H、ハロゲン、又は任意に置換されたC1-C6アルキルであり、
R5、R6、R9、及びR10は、単独である場合、独立して、H又は任意に置換されたC1-C6アルキルであり、
R4及びR5は、一緒の場合、R4及びR5が結合している原子を連結する任意に置換されたC2-C3アルキレン鎖であり、
R6及びR7は、一緒の場合、R6及びR7が結合している原子を連結する任意に置換されたC2-C3アルキレン鎖であり、
R8及びR9は、一緒の場合、R8及びR9が結合している原子を連結する任意に置換されたC2-C3アルキレン鎖であり、
R10及びR11は、一緒の場合、R10及びR11が結合している原子を連結する任意に置換されたC2-C3アルキレン鎖であり、
R5及びR6は、R5及びR6が結合している窒素原子と一緒の場合、5員又は6員の不飽和環を形成し、
R9及びR10は、R9及びR10が結合している窒素原子と一緒の場合、5員又は6員不飽和環を形成し、
Nは、1〜9の整数であり、
Yは、
波線は、式IVへの結合点であり、
L3、L4、及びL5は、独立して、任意に置換されたC2-C10アルキレン又は任意に置換されたC2-C30ヘテロアルキレンであり、
Zは、CH、N、NHC(O)N、又はOC(O)Nであり、
R12及びR13は、独立して、任意に置換されたC1-C6アルキルであり、
Wは、H又はL4-O-Z2であり、
Z1は、ヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドであり、及び
Z2は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、又はHである。
R1は、任意に置換されたC1-C6アルキルであり、
R2は、H、ハロゲン、又はSO2NH2であり、
R3は、H又はハロゲンであり、
R14及びR16は、単独である場合、独立して、H、ハロゲン、又は任意に置換されたC1-C6アルキルであり、
R15及びR17は、単独である場合、独立して、H又は任意に置換されたC1-C6アルキルであり、
R14及びR15は、一緒の場合、R14及びR15が結合している原子を連結する任意に置換されたC2-C3アルキレン鎖を形成し、
R16及びR17は、一緒の場合、R16及びR17が結合している原子を連結する任意に置換されたC2-C3アルキレン鎖を形成し、
L1及びL2は、独立して、任意に置換されたC2-C10アルキレン又は任意に置換されたC2-C20ヘテロアルキレンであり、
Z1は、ヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドであり、
Z2は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、又はHである。
本実施例は、ホスホラミダイト基を含む例示的なスルホローダミン色素S1の合成を記載する。この色素は、標準的なオリゴヌクレオチド自動合成を介してオリゴヌクレオチドの5'末端に組み込むのに適している。
化合物CFBSA(4.0g、1eq)と8-ヒドロキシジュロリジン(HJ、6.2g、2eq)の乾燥混合物を、132-138℃でマルチポート容器(≧3、使用されていないポートは大気に開放されていた)内の硫酸水溶液(60%、32mL)に少しずつに添加した。反応の進行をHPLCを用いてモニターした。反応が完了したとき(7-16時間)、反応混合物を室温まで冷却し、希釈冷NaOH水溶液(110mL)に注いだ。pHを8.5〜11に調整した後、環化縮合反応の生成物(化合物1)を濾過により単離し、その後45〜50℃の真空オーブンで>16時間乾燥させた。次に、生成物を130mLのジクロロメタン(DCM)に溶解し、溶液を濾過した。DCM層の濃縮により、化合物1(6g、65%)が得られ、これをさらに精製することなく次の工程で使用した。 LCMS: m/z 561.5; [M+H] 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ 7.94 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 7.60 (dd, 1H, J = 8.0, 2.4 Hz), 7.10 (d, 1H, J = 8.0Hz), 6.59 (s, 2H), 3.58 (m, 8H), 2.98 (m, 4H), 2.52 (m, 4H), 1.99 (m, 4H), 1.83 (m, 4H)
化合物1(8g、14.3 mmol)を無水DCM(120mL)に室温(RT)で懸濁し、POCl3(13.1mL、10eq)で一晩処理した。反応の進行/完了にTLC(10%MeOH/DCM)を続けた。反応が完了したら、混合物を真空下で濃縮し、得られたフォームを真空下で40℃で90〜150分間乾燥させた。次に、フォームをアルゴン下で無水ジクロロメタン(150mL)に溶解した。反応溶液を0〜5℃に冷却し、温度を8℃未満に維持しながら、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(DIEA)(25mL、10eq)及び2-アミノエトキシエタノール(AEE)(7.2mL、5eq)で処理した。反応物を、室温まで1〜2時間温めながら撹拌し、次に室温で一晩撹拌した。反応の進行をTLC(10%MeOH/DCM)でモニターした。反応混合物をDCM(250mL)で希釈し、1N HCl(2×185mL)、ブライン(1×200mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥させた。濾過、濃縮、及びシリカゲルカラム精製を使用した精製により、純粋な化合物2(3.74g、40%収率)を得た。
LCMS: m/z 648.5 [M+H]; 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ 8.19 (d, 1H, J = 2.0 Hz), 7.60 (dd, 1H, J = 8.0, 2.0 Hz), 6.95 (1H, d, J = 8 Hz), 6.28 (s, 2H), 4.4 (t, 1H, J = 5.6 Hz), 3.30 (m, 3H), 3.15 (m, 12H), 2.90 (t, 2H, J = 6.8 Hz), 2.82 (m, 4H), 2.51 (m, 4H), 1.96 (m, 4H), 1.81 (m, 4H)
化合物2(2.8g、4.3mmol)を3つ口丸底フラスコに入れ、高真空(≦2mBar)下で少なくとも90分間乾燥させた。次に、乾燥した化合物をアルゴン下で無水DCM(88mL)に溶解した。反応混合物を0〜5℃に冷却し、DIEA(7.5mL、10eq)を加えた後、内部温度を0〜5℃に維持しながら、2-シアノエチルN,N-ジイソプロピルクロロホスホラミダイト(PAM-Cl)(1.2mL、1.4eq)を滴下して加えた。完了するまで(2〜3時間)室温まで温めながら反応を撹拌した。反応物をDCM(88mL)で希釈し、NaHCO3(2×45mL)及びブライン(45mL)で洗浄し、有機層をNa2SO4で乾燥させた。粗生成物の濾過、濃縮、及びシリカゲルカラム精製により、純粋な生成物をピンク色の固体として得た(1.75g、48%収率)。
LCMS: m/z 848.2 [M+H]; 31P NMR (CD3CN, 160 MHz): δ 148.25; 1H NMR (DMSO-d DMSO-d6, 400 MHz): δ 8.18 (d, 1H, J = 2 Hz), 7.59 (dd, 1H, J = 8.4, 2.0 Hz), 6.96 (d, 1H, J = 8 Hz), 6.27 (s, 2H), 3.66 (m, 2H), 3.27 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.20 (t, 1H, J = 6.8 Hz), 3.10-3.20 (m, 8H), 2.90 (t, 2H, 6.8 Hz), 2.82 (t, 4H, J = 6.4Hz), 2.70 (t, 2H, J = 7.0 Hz)), 2.40-2.51 (m, 4H), 1.95 (m, 4H), 1.78 (m, 4H), 1.13 (d, 6H, J = 8 Hz), 1.05 (d, 6H, J = 8 Hz)
この実施例は、ホスホラミダイト基及びジメトキシトリチル基で保護されたヒドロキシル基を含む例示的なスルホローダミン色素S2の合成を記載する。この色素は、標準的なオリゴヌクレオチド自動合成を介してオリゴヌクレオチドの5'末端又は中間位置に組み込むのに適している。
150mLの丸底フラスコ中のトリフルオロメタンスルホン酸(50mL)をアルゴン雰囲気下で0℃に冷却した。8-ヒドロキシジュロリジン(HJ)(15.0g、79.3mmol)を20分かけて少しずつ加え、混合物を室温に温め、次に8-ヒドロキシジュロリジンが完全に溶解するまで室温で撹拌した。2-スルホ安息香酸環状無水物(10.95g、59.5mmol)を一度に加えた。混合物を110℃に加熱し、18時間撹拌し、次に室温に冷却した。反応混合物を3M NaOAc(300mL)と砕いた氷(200mL)の混合物に滴下して加えた。得られた混合物にDCMを加え(500mL)、混合物を分液漏斗に移した。有機層を集め、水とブラインで洗浄した。コンバインした水層をDCMで逆抽出し、全ての有機層を組み合わせた。Na2SO4乾燥させた後、溶液を濾過し、DCMを真空下で除去した。生成物を、2%〜10%の水/アセトニトリル(ACN)を使用するシリカゲル(3"x7"ベッド)でのクロマトグラフィーによって精製した。暗赤色の不純物が溶媒フロントのカラムから出てきた。TLCでの製品のRfは、10%水/ACNで0.4である。生成物含有画分の濃縮により、化合物3(8.34g、40%)を得た。
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ 7.80 (d, 1H, J = 6.8 Hz), 7.60 (t, 1H, J = 7.6 Hz), 7.51 (t, 1H, J =
7.4 Hz), 7.09 (d, 1 H, J = 7.4 Hz) 6.58 (s, 2H), 3.49 (m, 8H), 2.98 (m, 4H), 2.62 (m, 4H), 2.02 (m, 4H), 1.83 (m, 4H); LCMS: m/z 527.5 [M+H].
アルゴン下で、化合物3(6.50g、12.3mmol)を60 mLの無水DCMに溶解し、POCl3(5.00 mL、53.6mmol)を加えた。混合物を室温で24時間撹拌した。DCMを室温減圧下で除去し、次に過剰のPOCl3を60℃減圧下で除去してフォームを生成した。フォームをアルゴン下で150mLの無水DCMに溶解し、溶液を0℃に冷却した。ジイソプロピルエチルアミン(22.0mL、124mmol)を加え、混合物を再び0℃に冷却し、2-(2-アミノエトキシ)エタノール(6.20mL、62.2mmol)を加えた。反応混合物を室温まで温め、2.5時間撹拌した。全ての固体を溶解するのに十分なメタノールを加えることにより、反応を止めた。混合物を飽和NaHCO3、水、及びブラインで洗浄した。有機層をNa2SO4で乾燥させた。生成物をシリカゲル(3"x6")、10%トリエチルアミン(TEA)を含有する30%EtOAc/ヘキサンから60%EtOAc/ヘキサンでクロマトグラフィーに供し、4.56g(60%)の化合物4を得た。
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ 7.94 (dd, 1H, J = 3.6, 2.8 Hz), 7.58 (dd, 2H, J = 5.6, 3.2 Hz), 6.93 (dd, 1H, J = 6.4, 3.2 Hz), 6.27 (s, 2H), 4.4 (t, 1 H, J = 5.6 Hz), 3.31 (m, 2 H), 3.07-3.20 (m, 12H), 2.89 (t, 2H J = 7.2 Hz), 2.83 (t, 4H, J = 6.4 Hz)), 2.45 (m, 4H), 1.95 (m, 4H), 1.79 (m, 4H). LCMS: m/z 614.5 [M+H].
アルゴン下で、化合物4(1.58g、2.57mmol)を50mLの無水DCMに溶解し、TEA(3.60mL、25.8mmol)、続いてp-ニトロフェニルクロロホルメート(777mg、3.85mmol)を加えた。得られた混合物を室温で18時間撹拌した。モノ-DMT-ジエタノールアミン(2.09g、5.13mmol)を加え、室温での撹拌をさらに24時間続けた。混合物を飽和NaHCO3、水、及びブラインで洗浄し、Na2SO4で乾燥させた。シリカゲル、10%TEAを含有する40%EtOAc /ヘキサンから70%EtOAc /ヘキサンでのクロマトグラフィーによる生成物の精製により、1.78g(66%)の化合物5を得た。
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ 7.85 (m, 1H), 7.42 (m, 4H), 7.29 (m, 7H), 6.99 (m, 1H), 6.82 (d, 4H, J = 8.8 Hz), 6.44 (s, 2H), 4.10 (m, 1H), 4.05 (m, 1H), 3.79 (s, 6H), 3.76 (m, 1H), 3.66 (m, 1H), 3.57-3.21 (m, 10H), 3.18-3.02 (m, 11H), 2.89 (t, 4H, J = 6.5 Hz), 2.54 (m, 4H), 2.04 (m, 4H), 1.87 (m, 4H). LCMS: m/z 1047.7 [M+H].
アルゴン下で、化合物5(300mg、0.287mmol)を20mLの無水DCMに溶解した。DIEA(0.500mL、2.87mmol)、続いてPAM-Cl(0.080mL、0.389mmol)を加えた。混合物を室温で4時間撹拌し、次に飽和NaHCO3、水、及びブラインで洗浄した。有機層をNa2SO4で乾燥させた。シリカゲルでのクロマトグラフィー(5%TEAを含有する20%EtOAc/ヘキサンから40%EtOAc/ヘキサン)により、0.213g(60%)の化合物S2を得た。
1H NMR (CD3CN, 400 MHz): δ 7.82 (d, 1H, J = 7.6 Hz), 7.42 (m, 4H), 7.24 (m, 7H), 6.82 (m, 5H), 6.36 (s, 2H), 3.93 (m, 1H), 3.87 (m, 1H), 3.72 (s, 6H), 3.65 (m, 4H), 3.45 (m, 1H), 3.40 (m, 1H), 3.34 (m, 1H), 3.27 (m, 1H), 3.19 (m, 1H), 3.13 (m, 1H), 3.06 (m, 10H), 2.92 (m, 1H), 2.82 (m, 4H), 2.60 (m, 1H), 2.48 (m, 2H), 2.41 (m, 2H), 1.96 (m, 4H), 1.77 (m, 4H), 1.19 (m, 12H). 31P NMR (CD3CN, 160 MHz): δ 147.5
この実施例は、NHSエステルを含む例示的なスルホローダミン色素S3の合成を記載する。この色素は、アミノ基との結合反応を介した、生体分子(例えば、ペプチド)の蛍光標識に適している。
化合物3(2.87g、5.28mmol)をアルゴン下で50mLの無水DCMに溶解し、POCl3(2.5mL、26.8mmol)を加えた。得られた混合物を室温で一晩撹拌した。DCMとPOCl3を真空下で除去し、中間体を無水DCM(100 mL)に再溶解した。溶液をアルゴン下で0℃に冷却した。DIEA(18.5mL、106mmol)を加え、続いてメチル-6-アミノカプロエート-HCl(4.83g、26.6mmol)を加えた。反応混合物を室温に温め、2時間撹拌し、次に水(3x)及びブラインで洗浄した。有機層をNa2SO4で乾燥させた。生成物を、10%TEAを含む40%EtOAc /ヘキサンを使用するシリカゲルでのクロマトグラフィーによって精製した。塩基性条件下で形成される環化形態の生成物は無色である。TEAが蒸発するにつれて、TLCスポットはゆっくりとピンク色に変わった。精製により、1.30g(37%)の化合物6を水色のフォームとして得た。
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 7.87 (d, 1H, J = 6.8 Hz), 7.46 (m, 2H), 7.00 (m, 1H), 6.44 (s, 2H), 3.66 (s, 3H), 3.16 (m, 8H), 2.91 (m, 6H), 2.58 (m, 4H), 2.14 (m, 2H), 2.07 (m, 4H), 1.89 (m, 4H), 1.39 (m, 4H), 1.15 (m, 2H). LCMS: m/z 654.3 [M+H]
化合物6(1.30g、1.99mmol)をアセトニトリル(60mL)、水(15mL)、及び4.5mLの濃HClに溶解した。溶液を80℃で18時間加熱し、次にDCMで希釈し、飽和NaHCO3、水、及びブラインで洗浄した。有機層をNa2SO4で乾燥させて、1.21gの粗化合物7を得て、これをさらに精製することなく次の工程で使用した。
LCMS: m/z 640.3 [M+H]
化合物7(1.21g、1.89mmol)を、アルゴン下で25mlの無水ジメチルホルムアミド(DMF)に溶解した。N-ヒドロキシスクシンイミド(435mg、3.78mmol)及びN-(ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミド(EDC)(725mg、3.78mmol)を加えた。混合物を室温で一晩撹拌し、次にDMFを真空下で除去した。残留物をDCMに溶解し、溶液を1N HCl、水、及びブラインで洗浄した。有機層をNa2SO4で乾燥させた。DCM中の5%HOAc及び1%MeOHから5%MeOHを用いたシリカゲルでのクロマトグラフィーにより、880mg(63%)の化合物S3を得た。
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ 7.92 (m, 1H), 7.58 (m, 2H), 6.95 (m, 1H), 6.24 (s, 2H), 3.11 (m, 8H), 2.84 (m, 6H), 2.82 (s, 4H), 2.46 (m, 4H), 1.94 (m, 6H), 1.79 (m, 4H), 1.21 (m, 4H), 1.12 (m, 2H). LCMS: m/z 737.3 [M+H]
化合物1(4.0g、0.0071モル)をアルゴン雰囲気下で無水DCM(60mL)に溶解した。ニートオキシ塩化リン(6.5mL、0.071モル)を一度に加え、反応物を室温で23時間撹拌した。溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、得られたフォームを5mbarで2時間乾燥させた。フォームに、無水DCM(75mL)をアルゴン雰囲気下で加え、反応フラスコを氷/水浴に入れた。N,N-ジイソプロピルエチルアミン(18.5 mL、0.107モル)を0〜5℃でゆっくりと加えた。固体のメチル6-アミノヘキサノエートヒドロクロリド(6.5g、0.0360モル)を10分かけて少しずつ加えた。1時間後、氷浴を取り除き、反応混合物を16時間かけて室温まで撹拌した。反応混合物をDCM(125mL)で希釈し、1N HCl(2×90mL)及びブライン(1×120mL)で洗浄し、次いで硫酸ナトリウムで乾燥させた。濾過、濃縮及びシリカゲルカラム精製(酢酸エチル/ヘプタン/TEA、30:10:60)により、生成物(2.4g、〜49%収率)を金色の固体として得た。
LCMS: m/z 688.5 [M+H] 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 7.83 (d, 1H, J = 1.6 Hz), 7.4 (dd, 1H, J = 8.4, 2.0 Hz), 6.95 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 6.42 (s, 2H), 3.65 (s, 3H), 3.16 (m, 8H), 2.89 (m, 6H), 2.58 (m, 4H), 2.14 (t, 2H, J = 8 Hz), 2.06 (m, 4H), 1.91 (m, 4H), 1.40 (m, 4H), 1.15 (m, 2H)
化合物8(0.60g、0.00087モル)を撹拌しながらアセトニトリル(30mL)に懸濁した。DI(脱イオン)水(7mL)を加え、懸濁液を数分間撹拌した。濃塩酸(3mL)を滴下すると赤/紫色の溶液が得られた。溶液を穏やかな還流で2〜3時間加熱し、次に15時間かけて室温まで撹拌した。反応混合物の体積(紫色)をロータリーエバポレーターでの蒸発により半分にし、反応溶液を室温のDI水(75mL)に注ぐことにより生成物を沈殿させた。懸濁液を濾過し、ケーキを追加のDI水(15mL)で洗浄し、40〜50℃及び<2 mbarの真空で20時間真空オーブンで乾燥させて、0.54g(93%収率)の化合物9が紫色の粉末として得られ、次の工程で使用した
LCMS: m/z 771.6 [M+H] 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ 8.17 (d, 1H, J = 2.0 Hz), 7.60 (dd, 1H, J = 8.4, 2.0 Hz), 6.98 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 6.24 (s, 2H), 3.13 (m, 8H), 2.82 (m, 6H), 2.74 (m, 2H), 2.55 (m, 4H), 2.41 (t, 2H, J = 7.8 Hz), 1.94 (m, 4H), 1.79 (m, 4H), 1.10-1.35 (m, 8 H)
この実施例は、ホスホラミダイト基を含む例示的なスルホローダミン色素S5の合成を記載する。この色素は、標準的なオリゴヌクレオチド自動合成を介してオリゴヌクレオチドの5'末端に組み込むのに適している。
水(27mL)を0℃に冷却し、41mLの濃縮液を加えた。H2SO4をゆっくりと加えた。溶液を160℃に加熱した。十分に予混合した2-ホルミルベンゼンスルホン酸(5.03g、24.2mmol)及び3-(ジメチルアミノ)フェノール(6.63g、48.3mmol)を1分かけて硫酸溶液に少しずつ加えた。溶液を空気下で160℃で8時間撹拌し、次に室温に冷却し、さらに8時間撹拌した。冷水(300mL、約0℃)を100mLの10MNaOHと混合した。粗反応混合物を、温度を25℃未満に保ちながら、NaOH溶液に滴下して加えた。反応混合物を加えたら、pHが約8.5になるまでさらに10M NaOHを加えた。混合物を室温で一晩撹拌した。固体を真空濾過によって収集し、KOHを用いて高真空下で乾燥させて、約50%の無機塩を含む10.6gの粗物質を得た。粗物質の3.57g部分を、MeOH/DCM溶媒勾配(4%から10%MeOH)を使用してシリカゲルカラム(2" x 7")でクロマトグラフィーにかけた。異性体の混合物が生成され、所望の異性体が最初に溶出した。780mg(22%)の化合物10を得た。
LCMS: m/z 423.4 [M+H]
アルゴン下の75mLの無水DCM中の化合物10(740mg、1.75mmol)に、POCl3(1.64mL、6.50mmol)を加え、混合物を室温で18時間撹拌した。DCMを室温減圧下で除去し、次に過剰のPOCl3を60℃減圧下で除去してフォームを生成した。フォームをアルゴン下で125mLの無水DCMに溶解し、溶液を0℃に冷却した。トリエチルアミン(3.10mL、17.8mmol)及び2-(2-アミノエトキシ)エタノール(0.875mL、8.78mmol)を加えた。混合物を室温まで温め、1時間撹拌し、次に水及びブラインで洗浄した。有機層をNa2SO4で乾燥させた。シリカゲル(1"x7")、10%TEAを含む40%EtOAc/ヘキサンから60%EtOAc/ヘキサンでのクロマトグラフィーにより、438mg(49%)の化合物11を得た。
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ 8.00 (m, 1H), 7.61 (m, 2H), 6.96 (m, 1H), 6.71 (s, 1H), 6.69 (s, 1H), 6.53 (m, 2H), 6.43 (d, J = 2.5 Hz, 2H), 4.44 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 3.31 (m, 2H), 3.14 (m, 4H), 2.93 (s, 12H), 2.91 (m, 2H). LCMS: m/z 510.4 [M+H]
化合物11(423mg、0.830mmol)をアルゴン下で25mLの無水DCMに溶解し、DIEA(0.725mL、4.16mmol)、続いてPAM-Cl(0.190mL、0.924mmol)を加えた。混合物を室温で3時間撹拌し、飽和NaHCO3、水、及びブラインで洗浄し、有機層をNa2SO4で乾燥させた。シリカゲル、10%TEAを含む20%EtOAc/ヘキサンから40%EtOAc/ヘキサンでのクロマトグラフィーにより、485mg(82%)の化合物S5を得た。
1H NMR (CD3CN, 400 MHz): δ 7.89 (m, 1H), 7.57 (m, 2H), 6.97 (m, 1H), 6.80 (s, 1H), 6.78 (s, 1H), 6.52 (m, 2H), 6.44 (m, 2H), 3.73 (m,2H), 3.56 (m, 4H), 3.26 (m, 4H), 2.97 (s, 12H), 2.61 (m, 2H), 1.97 (m, 2H), 1.19 (d, J = 6.8 Hz, 6H), 1.12 (d, J = 6.8 Hz, 6H) 31P NMR (CD3CN, 160 MHz): δ 148.1
この実施例は、ホスホラミダイト基及びジメトキシトリチル基で保護されたヒドロキシル基を含む例示的なスルホローダミン色素S6の合成を記載する。この色素は、標準的なオリゴヌクレオチド自動合成を介して、オリゴヌクレオチドの5'末端又は中間位置に組み込むのに適している。
化合物12の合成は、酢酸中のエチレンオキシド2,3,3-トリメチル-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-6-オール(FCHグループ、ラトビア)で処理することにより行った。水(27mL)を約0℃に冷却し、濃H2SO4(41mL)をゆっくりと加えた。得られた溶液を250mLの3つ口丸底フラスコで160℃に加熱した。十分に予混合した2-ホルミルベンゼンスルホン酸(3.21g、15.4mmol)及び化合物12(6.82g、30.8mmol)を1分かけて硫酸溶液に少しずつ加えた。溶液を空気に開放して160℃で6時間加熱し、次に室温に冷却し、300mLの冷5MNaOHにゆっくりと加えた。H2SO4でpHを9に調整した。混合物をDCM(2x)で抽出した。コンバインした有機層をブラインで洗浄し、Na2SO4で乾燥させた。溶媒を真空下で除去し、粗固体をKOHで高真空下で乾燥させて、2.25gの粗物質を得た。ACN /水溶媒システム(5〜8%H2O)を使用したシリカゲルカラム(2" x 6")でのクロマトグラフィーにより、526 mg(6%)の化合物13を得た。
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ□8.03 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.64 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 7.56 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 7.15 (m, 1H), 6.82 (s, 2H), 6.64 (s, 2H), 5.01 (s, 2H), 3.76 (m, 8H), 3.48 (m, 2H), 1.11 (m, 18H). LCMS: m/z 591.5 [M+H]
化合物13(525mg、0.889mmol)を、アルゴン下で15mLの無水ピリジンに溶解した。無水酢酸(0.210mL、2.22mmol)及びDMAP(11mg、0.090mmol)を加え、混合物を室温で3時間撹拌した。ピリジンを真空下で除去し、残留物を、MeOH/DCM溶媒系(2〜10%)を使用するシリカゲル(1"x7")でのクロマトグラフィーによって精製して、531mg(89%)の化合物14を得た。
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ 8.03 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.66 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 7.56 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 7.18 (m, 1H), 6.94 (s, 2H), 6.69 (s, 2H), 4.31 (m, 4H), 3.96 (m, 2H), 3.78 (m, 2H), 3.71 (m,2H), 1.99 (s, 3H), 1.97 (s, 3H), 1.18 (m, 12H), 0.98 (s, 6H). LCMS: m/z 675.5 [M+H]
化合物14(520mg、0.771mmol)をアルゴン下で25mLの無水DCMに溶解し、POCl3(0.360mL、3.68mmol)を加えた。反応混合物を室温で5時間撹拌し、次にTHF中の2.0Mメチルアミン(11.6mL、23.1mmol)を加え、混合物を1時間撹拌した。混合物を水、飽和NaHCO3、及びブラインで洗浄し、有機層をNa2SO4で乾燥させた。シリカゲル(1"x7")、10%TEAを含有する10%EtOAc /ヘキサンから30%EtOAc/ヘキサンでのクロマトグラフィーで、437mg(82%)の化合物15を得た。
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ 8.01 (m, 1H), 7.61 (m, 2H), 7.02 (m, 1H), 6.43 (m, 2H), 6.33 (m, 2H), 4.18 (m, 4H), 3.47 (m, 2H), 3.29 (m, 4H), 2.27 (s, 3H), 1.98 (m, 6H), 1.09 (m, 9H), 0.97 (s, 3H), 0.84 (s, 3H), 0.71 (s, 3H). LCMS: m/z 688.5 [M+H]
化合物15を20mLのMeOHに溶解し、5mLの水中のK2CO3の溶液を加えた。混合物を室温で1時間撹拌した。MeOHを真空下で除去し、残留物を水及びブラインで洗浄し、Na2CO3及び高真空下で乾燥させて、336mg(90%)の化合物16を得て、これをさらに精製することなく次の工程で使用した。
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ 7.99 (m, 1H), 7.60 (m, 2H), 7.01 (m, 1H), 6.41 (s, 2H), 6.24 (m, 2H), 4.71 (t, J = 4.8 Hz, 2H), 3.54 (m, 4H), 3.28 (m, 4H), 3.16 (m, 2H), 2.27 (s, 3H), 1.08 (m, 9H), 0.97 (s, 3H), 0.85 (s, 3H), 0.71 (3H). LCMS: m/z 604.5 [M+H]
化合物16(329 mg、0.545mmol)を、12mLの無水ピリジン(2X)との共沸蒸発により乾燥させた。乾燥した材料を12mLの無水ピリジンに溶解し、DMTC1(258mg、0.761mmol)を加えた。混合物を室温で18時間撹拌し、反応をメタノール(2mL)で止めた。溶媒を真空下で除去した。シリカゲル(1"x7")、10%TEAを含む30%EtOAc/ヘキサンから40%EtOAc/ヘキサンでのクロマトグラフィーにより、232mg(47%)の化合物17を得た。
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ 8.01 (m, 1H), 7.62 (m, 2H), 7.52 (m, 1H), 7.35 (m, 2H), 7.22 (m, 7H), 7.05 (m, 1H), 6.81 (m, 4H), 6.43 (m, 1H), 6.36 (m, 1H), 6.29 (m, 1H), 4.72 (m, 1H), 3.68 (m, 6H), 3.57 (m, 3H), 3.25 (m, 7H), 2.25 (m, 3H), 1.09 (m, 9H), 0.97 (m, 3H), 0.86 (m, 3H), 0.73 (m, 3H). LCMS: m/z 906.8 [M-H]
アルゴン下の20mLの無水DCM中の化合物17(227mg、0.251mmol)の溶液に、DIEA(0.218mL、1.25mmol)、続いてPAM-Cl(0.075mL、0.365mmol)を加えた。混合物を室温で2時間撹拌し、次にNaHCO3、水、及びブラインで洗浄した。有機層をNa2SO4で乾燥させた。シリカゲル、10%TEAを含有する20%EtOAc/ヘキサンから30%EtOAc/ヘキサンでのクロマトグラフィーにより、212mg(77%)の化合物S6を得た。
1H NMR (CD3CN, 400 MHz): δ 7.91 (m, 1H), 7.57 (m, 2H), 7.41 (m, 2H), 7.28 (m, 7H), 7.03 (m, 1H), 6.81 (m, 4H), 6.56 (m, 2H), 6.32 (m, 2H), 3.79 (m, 2H), 3.72 (m, 6H), 3.58 (m, 4H), 3.41 (m, 2H), 3.33 (m, 2H), 3.22 (m, 2H), 2.53 (m, 2H), 2.32 (m, 3H), 1.11 (m, 21H), 1.03 (m, 3H), 0.93 (m, 3H), 0.80 (m, 3H). 31P NMR (CD3CN, 160 MHz): δ 147.3
この実施例は、ホスホラミダイト基及びジメトキシトリチル基で保護されたヒドロキシル基を含む例示的なスルホローダミン色素S7の合成を記載する。この色素は、標準的なオリゴヌクレオチド自動合成を介して、オリゴヌクレオチドの5'末端又は中間位置に組み込むのに適している。
無水DMF(50mL)中の化合物2(4.9g、7.6mmol)の懸濁液を、アルゴン下、過剰のTEA(5.3mL、5eq)、続いてビス-ニトロフェニルカーボネートBNPC(2.8g、1.2eq)と共に室温で処理した。中間体18の形成が完了するまで(BNPCの添加後1.5〜3時間)、黒色懸濁液を30〜35℃で加熱した。モノ-DMT-ジエタノールアミン(DMT-L)(4.6g、1.5 eq)を一度に加え、反応混合物を30-35℃(1-3時間)、次に室温(>2時間)で反応が完了するまで撹拌した。反応混合物をEtOAc(530mL)で希釈し、分液漏斗に移した。EtOAc層を、DI水(4×380mL)及びブライン(1×380mL)で洗浄した。EtOAc層をNa2SO4で乾燥し、濾過し、蒸発させて、粗化合物19を得た。粗生成物のシリカゲルカラム精製により、純粋な化合物19をラベンダーから紫色の固体として得た(7.5g、91%収率)。
LCMS: m/z 1082.0 [M+H]. 1HNMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ 8.18 (d, 1H, J = 2 Hz), 7.22 (dd, 1H, J = 8.4, 1.6 Hz), 7.16-7.36 (m, 10H), 6.95 (m, 1H), 6.86 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 6.81 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 6.28 (s, 2H), 4.60 (m, 1H), 3.90 (m, 1H), 3.80 (m, 1H), 3.70 (m, 6H), 3.40 (m, 3H), 3.30 (m, 3H), 3.16 (m, 2H), 3.07 (m, 12H), 2.90 (m, 1H), 2.80 (m, 1H), 2.78 (m, 4H), 2.44 (m, 4H), 1.92 (m, 4H), 1.75 (m, 4H)
化合物19(6.5g、6mmol)を3つ口丸底フラスコに入れ、≦2mBarの高真空下で≧90分乾燥させた。次に、乾燥した化合物19をアルゴン下で無水DCM(130mL)に溶解した。反応フラスコを0〜5℃に冷却し、DIEA(10.5mL、10eq)を加えた後、内部温度を0〜5℃に保ちながらN,Nジイソプロピル-クロロホスホラミダイト-Cl(PAM-Cl)(1.7mL、1.3eq)を滴下して加えた。反応が完了するまで(2〜3時間)室温で撹拌した。反応物をDCM(130mL)で希釈し、NaHCO3(2×80mL)、ブライン(150mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥させた。粗生成物の濾過、濃縮及びシリカゲルカラム精製により、純粋な化合物S7をピンクからラベンダーの固体として得た(6.07g、78%収率)。
LCMS: m/z 1281.2 [M+H]. 31P NMR (DMSO-d6, 160 MHz): δ 147.57. 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ 7.90 (s, 1H), 7.48 (dd, 1H,
J = 8.4, 2.0 Hz), 7.40 (m, 2H), 7.20-7.30 (m, 7H), 6.82 (m, 5H), 6.35 (s, 2H), 3.93 (m, 1H), 3.87 (m, 1H), 3.76 (m, 8 H), 3.62 (m, 4H), 3.46 (m, 2H), 3.41 (m, 1H), 3.33 (m, 1H), 3.25 (m, 1H)3.19 (m, 1H), 3.13 (m, 11H), 2.98 (m, 1H), 2.84-2.91 (m, 5H), 2.64 (m, 2H), 2.40-2.56 (m, 6H), 1.95 (m, 4H), 1.78 (m, 4H), 1.10-1.23 (m, 12H)
この実施例は、ホスホラミダイト基及びジメトキシトリチル基で保護されたヒドロキシル基を含む例示的なスルホローダミン色素S8の合成を記載する。この色素は、標準的なオリゴヌクレオチド自動合成を介して、オリゴヌクレオチドの5'末端又は中間位置に組み込むのに適している。
化合物3(2.80g、1eq)を無水ジクロロメタン(50mL)に溶解し、POCl3(6.9mL、14eq)を周囲温度で滴下して加えた。4時間後、反応混合物を蒸発乾燥させて、粗中間体を暗青色の固体として得た。エチレンジアミン(EDA、6.0mL、17.0eq)を無水ジクロロメタン(40mL)に溶解し、溶液を5℃に冷却した。固体を無水ジクロロメタン(20mL)に溶解し、EDA溶液に滴下した。4℃で17時間後、反応混合物を飽和重炭酸ナトリウム(2x40mL)で洗浄し、次にDI水(40mL)で洗浄した。有機層を蒸発乾燥させて、化合物20(3.08g、96%)を暗青色の固体として得た。
LCMS: m/z 569.4 [M+H+]. Calc-d: 569.25. 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ 7.92 (dd, 1H, J = 6.0, 2.8 Hz), 7.54 - 7.56 (m, 2H), 6.90 (dd, 1H, J = 6.4, 2.8 Hz), 6.30 (s, 2H), 3.3 (br., 2H), 3.07 - 3.14 (m, 8H),
2.75 - 2.88 (m, 6H), 2.35 - 2.49 (m, 6H), 1.95 (m, 4H), 1.79 (m, 4H)
4-ペンチン酸(4PA、0.67g、1.1 eq)を無水アセトニトリル(6.5mL)に溶解し、溶液を5℃に冷却した。ジイソプロピルエチルアミン(3.3mL、3.0 eq)を加え、続いてペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテート(PFP-TFA、1.2mL、1.1 eq)を加えた。反応混合物を周囲温度で1時間インキュベートした。化合物20(3.1g、1.0 eq)を、10mLのN,N-ジメチルホルムアミド、10mLのジクロロメタン、及び5mLのジメチルスルホキシドの混合物に懸濁した。懸濁液を活性4-ペンチン酸溶液に加え、周囲温度で1時間インキュベートした。反応混合物を50mLの酢酸エチルで希釈し、飽和重炭酸ナトリウム(2×30mL)、次にDI水(30mL)で洗浄した。有機層を蒸発乾燥させた。粗生成物をシリカゲルカラム精製を使用して精製し、化合物21(2.74g、68%収率)を青色の固体として得た。
LCMS: m/z 649.5 [M+H+]. Calc-d: 649.28. 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ 7.93 - 7.96 (m, 1H), 7.65 (t, 1H, J = 5.6 Hz), 7.54 - 7.58 (m, 2H), 6.87 - 6.90 (m, 1H), 6.32 (s, 2H), 3.05-3.16 (m, 8H), 2.97 - 3.04 (m, 2H), 2.79 - 2.88 (m, 6H), 2.72 (t, 1H, J = 2.4 Hz), 2.39 - 2.58 (m, 4H, overlaps with DMSO-d5), 2.20 - 2.27 (m, 2H), 2.10 (t, 2H, 7.6 Hz), 1.95 (m, 4H), 1.79 (m, 4H)
化合物21(2.7g、1.0eq)をN,N-ジメチルホルムアミド(22.0mL)に溶解し、トリエチルアミン(1.7mL、3.0eq)を加えた。調製した溶液を不活性雰囲気下で5-ヨード-5'-ジメトキシトリチル-2'-デオキシウリジン(2.7g、1.0eq、DMT-I-dU)、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)(0.48g、0.1eq)及びヨウ化銅(I)(0.24g、0.3eq)の固体混合物に加え、反応混合物を周囲温度で2時間インキュベートした。反応混合物を酢酸エチル(120mL)で希釈し、0.1MEDTA溶液(2x80mL)で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ(25g、18時間)、濾過し、蒸発乾燥させた(青色の固体)。粗生成物をシリカゲルカラム精製を使用して精製して、化合物22(4.73g、97%収率)を青色の固体として得た。
LCMS: m/z 1177.9 [M+H+]. Calc-d: 1177.47 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ 7.93 - 7.96 (m, 1H), 7.83 (s, 1H), 7.54 - 7.58 (m, 2H), 7.49 (t, 1H, J = 6.0 Hz), 7.37 - 7.41 (m, 2H), 7.25 - 7.31 (m, 6H), 7.18 - 7.22 (m, 1H), 6.83 - 6.90 (m, 5H), 6.32 (s, 2H), 6.11 (t, 1H, J = 6.8 Hz), 5.33 (s, 1H), 4.27 (m, 1H), 3.91 (m, 1H), 3.71 (s, 6H), 3.21 - 3.26 (m, 2H), 3.05-3.14 (m, 8H), 2.97 - 3.04 (m, 2H), 2.77 - 2.88 (m, 6H), 2.38 - 2.59 (m, 4H, overlaps with DMSO-d5), 2.14 - 2.28 (m, 4H), 1.98 - 2.03 (m, 2H), 1.93 (m, 4H), 1.77 (m, 4H)
化合物22(4.6g、1.0eq)をアルゴン下で無水ジクロロメタン(27.6mL)に溶解した。反応フラスコを0〜5℃に冷却し、ジイソプロピルエチルアミン(2.0mL、3.0eq)を加えた後、内部温度を0〜5℃に維持しながら、PAM-Cl(1.1mL、1.3eq)を滴下して加えた。反応物を室温で2時間撹拌した。反応物を酢酸エチル(150mL)で希釈し、NaHCO3(2 x 100mL)、ブライン(80mL)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ(46g、20時間)、濾過し、蒸発乾燥させた(青色の固体)。生成物を200mLのジクロロメタンに溶解し、エーテルとヘキサンの等量混合物(2L)で沈殿させることにより精製した。濾過及び乾燥により、生成物を青色の固体として得た(1.92g、36%収率)。
LCMS: m/z 1378.3 [M+H].31P NMR (CD3CN, 160 MHz): two singlets (diastereomers) δ 147.97 ppm and 148.04 ppm. 1H NMR (CD3CN, 400 MHz): δ 9.2 (br, 1H), 7.94 and 7.97 (s, 1H), 7.85 - 7.89 (m, 1H), 7.53 - 7.59 (m, 2H), 7.42 - 7.47 (m, 2H), 7.30 - 7.37 (m, 4H), 7.19 - 7.29 (m, 3H), 6.80 - 6.92 (m, 5H), 6.35 (s, 2H), 6.13 - 6.21 (m, 1H), 5.36 - 5.41 (m, 1H), 4.55 - 4.64 (m, 1H), 4.08 - 4.15 (m, 1H), 3.73 - 3.75 (m, 6H), 3.55 - 3.70 (m, 4H), 3.25 - 3.40 (m, 2H), 3.05-3.16 (m, 8H), 2.93 - 3.00 (m, 2H), 2.72 - 2.88 (m, 6H), 2.66 (t, 1H, 6.0 Hz), 2.33 - 2.59 (m, 7H), 2.15 - 2.22 (m, 2H), 1.92 - 2.00 (m, 2H), 1.75 - 1.88 (m, 6H), 1.14 - 1.21 (m, 9H), 1.07 and 1.06 (2 x s, 3H)
この実施例は、ホスホラミダイト基及びジメトキシトリチル基で保護されたヒドロキシル基を含む例示的なスルホローダミン色素S9の合成を記載する。この色素は、標準的なオリゴヌクレオチド自動合成を介して、オリゴヌクレオチドの5'末端又は中間位置に組み込むのに適している。
スルホローダミン色素を含むポリヌクレオチドは、DMT除去−カップリング−キャッピング−酸化−キャッピングのサイクルで、標準の200nmol DNAプロトコルを利用してMerMade-12オリゴヌクレオチドシンセサイザーで合成した。スルホローダミン色素ホスホラミダイトのカップリング時間は6分に延長した。
TCA GAG TAC CTG AAA CA (配列番号1)、
CC(A01) CGG (A01)GC G(A01)G AC(A01) TCT CGG CC (配列番号2)、及び
CC(A01) G(A01)G CAA ACT GGG CGG C(A01) (配列番号3)
ここで、A01は2,6-ジアミノプリン2'-デオキシリボシドを示す。
この実施例では、5'-ヌクレアーゼPCR反応は、本明細書の開示の色素及び市販の消光剤BHQ-2を含む開裂可能な消光蛍光プローブを使用して実施した。図2A及び2Bに示されるPCRプロファイルは、本発明の色素を含むプローブが検出プローブとして効率的に機能したことを実証している。
AAA CCT CCA GGC CAG AAA GAG AGA GTA (配列番号4)
AAA AGG CAT TCC TGA AGC TGA CAG CAT TC (配列番号5)
AAA ACC TGC CTT CTG CGT GAG ATT CT (配列番号6)
CTG TAC GAA AAG ACC ACA GGG CCC AT (配列番号7)
アンプリコン:長さ96 bp、1,000コピー/反応、
ATP、CTP、GTP、TTPのそれぞれのヌクレオシド三リン酸(NTP)濃度:0.25mmol、
Taqポリメラーゼ:3ユニット/25uL反応、
プライマー(各)濃度:200 nM、及び
プローブ濃度:250 nM、
変性を95℃で35秒間、アニーリング-伸長を66℃で30秒間、及び45サイクル:変性を95℃で8秒間、アニーリング-伸長を66℃で30秒間
この実施例は、ホスホラミダイト基を含む例示的なスルホローダミン色素S10a及びS10bの合成を記載する。これらの色素は、標準的なオリゴヌクレオチド自動合成を介してオリゴヌクレオチドの5'末端位置に組み込むのに適している。
2-ホルミルベンゼンスルホン酸ナトリウム塩(1.41g、6.77mmol)及び1eqの化合物12a(1.50g、6.77mmol)を40mLの60%H2SO4に溶解した。溶液を60℃で3時間加熱し、別の同等の化合物12aを加え、混合物を100℃に加熱した。72時間後、反応混合物を室温に冷却し、40mLの水で希釈し、500mLの砕いた氷に注ぎ、1.5時間撹拌した。得られた固形物を濾過により収集した。ブライン(100mL)を濾液に加え、濾液をジクロロメタン(2X)で抽出した。コンバインした有機層をNa2SO4で乾燥し、濾過し、溶媒をin vacuoで除去した。有機物から抽出された物質と沈殿物をコンバインし、ACN/水系(4%〜10%H2O)の勾配を使用するシリカゲルカラム(2" x 7")でのクロマトグラフィーにより精製して、1.08 g(27%)の化合物13Aを得た。
1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz): δ 8.03 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.64 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.55 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.15 (d, J=7.5 Hz, 1H), 6.91 (m, 1H), 6.81 (d, J=3.6 Hz, 1H), 6.65 (m, 2H), 4.98 (m, 1H), 4.93 (m, 1H), 3.96 (m, 1H), 3.82 (m, 2H), 3.70 (m, 5H), 3.45 (m, 2H), 1.18 (m, 9H), 1.12 (s, 3H), 0.98 (s, 3H), 0.97 (s, 3H). LCMS: m/z 591.5 [M+H]
アルゴン下で、化合物13a(1.06g、1.79mmol)を25mLの無水ピリジンに溶解した。無水酢酸(0.510mL、5.39mmol)及びDMAP(22mg、0.180mmol)を加え、混合物を室温で5時間撹拌した。ピリジンをin vacuoで除去し、残留物をMeOH/DCM溶媒系(4〜8%MeOH)を使用したシリカゲルカラム(1.5"x5")でのクロマトグラフィーに供し、475mg(39%)の化合物14aを得た。
1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz): δ 8.03 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.65 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 7.56 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 7.16 (d, J= 7.3 Hz, 1H), 6.93 (d, J=5.3 Hz, 2H), 6.70 (s, 2H), 4.29 (m, 4H), 3.96 (m, 2H), 3.78 (m, 2H), 3.69 (m,2H), 1.99 (s, 3H), 1.98 (s, 3H), 1.21 (d, J=6.7 Hz, 3H), 1.17 (d, J=6.6 Hz, 3H), 1.15 (s, 3H), 1.12 (s, 3H), 0.99 (s, 3H), 0.98 (s, 3H). LCMS: m/z 675.5 [M+H]
化合物14a(455mg、0.674mmol)をアルゴン下で25mLの無水DCMに溶解し、POCl3(0.630mL、6.76mmol)を加えた。混合物を室温で18時間撹拌し、その後、DCM及びPOCl3をin vacuoで除去した。得られたオイルを25mLの無水DCMに溶解し、溶液を0℃に冷却し、DIEA(1.15mL、6.60mmol)及び2-(2-アミノエトキシ)エタノール(338 uL、3.37mmol)を加えた。混合物を室温まで温め、2時間撹拌し、次に飽和NaHCO3で抽出した。抽出物をNa2SO4で乾燥させた。粗生成物を、MeOH/DCM(2〜6%MeOH)の勾配を使用したシリカゲル(1"x6"カラム)でのクロマトグラフィーに供し、382mg(74%)の化合物26を得た。
1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz): δ 8.00 (m, 1H), 7.60 (m, 2H), 6.99 (m, 1H), 6.43 (d, J=1.3 Hz, 2H), 6.32 (d, J=5.6 Hz, 2H), 4.41 (t, J=4.78, 1H), 4.16 (m, 4H), 3.29 (m, 2H), 3.15 (m, 6H), 3.09 (m, 4H), 2.90 (m, 2H), 1.98 (m, 6H), 1.09 (m, 9H), 0.97 (s, 3H), 0.85 (s, 3H), 0.72 (s, 3H). LCMS: m/z 762.6 [M+H]
化合物26(367 mg、0.481mmol)をアルゴン下で20mLの無水DCMに溶解し、DIEA(0.419mL、2.41mmol)を加え、続いてN,N-ジイソプロピルアミノシアノエチルホスホナミド-Cl(0.129mL、0.627mmol)を加えた。混合物を室温で3時間撹拌し、次に飽和NaHCO3、水、及びブラインで抽出した。抽出物をNa2SO4で乾燥させた。10%TEAを含有する20%EtOAc/ヘキサンから30%EtOAc/ヘキサンを用いたシリカゲル(1"x6"カラム)でのクロマトグラフィーにより、350mg(78%)の化合物S10aを得た。
1H NMR (CD3CN, 500 MHz): δ 7.91 (m, 1H), 7.59 (m, 2H), 6.97 (m, 1H), 6.54 (d, J=8.2 Hz, 2H), 6.28 (s, 2H), 4.25 (m, 4H), 3.73 (m, 2H), 3.54 (m, 6H), 3.32 (m, 6H), 3.22 (m, 2H), 2.98 (m, 2H), 2.01 (s, 3H), 2.00 (s, 3H), 1.97 (pentet, J=2.5 Hz, 2H), 1.15 (m, 15H), 1.12 (s, 3H), 1.10 (s, 3H), 1.03 (s, 3H), 0.93 (m, 3H), 0.79 (s, 3H). 31P NMR (CD3CN, 500 MHz): δ 148.2. LCMS: m/z 963.0 [M+H]
Claims (56)
- 式I
R1は、C1-C6アルキル又はL1-Xであり、
R2は、ハロゲン又はSO2NH2であり、
R3は、H又はハロゲンであり、
R4、R7、R8、及びR11は、単独である場合、独立して、H、ハロゲン、又は任意に置換されたC1-C6アルキルであり、
R5、R6、R9、及びR10は、単独である場合、独立して、H又は任意に置換されたC1-C6アルキルであり、
R4及びR5は、一緒の場合、R4及びR5が結合している原子を連結する任意に置換されたC2-C3アルキレン鎖であり、
R6及びR7は、一緒の場合、R6及びR7が結合している原子を連結する任意に置換されたC2-C3アルキレン鎖であり、
R8及びR9は、一緒の場合、R8及びR9が結合している原子を連結する任意に置換されたC2-C3アルキレン鎖であり、
R10及びR11は、一緒の場合、R10及びR11が結合している原子を連結する任意に置換されたC2-C3アルキレン鎖であり、
R5及びR6は、R5及びR6が結合している窒素原子と一緒の場合、5員又は6員の不飽和環を形成し、
R9及びR10は、R9及びR10が結合している窒素原子と一緒の場合、5員又は6員不飽和環を形成し、
L1は、任意に置換されたC2-C10アルキレン又は任意に置換されたC2-C20ヘテロアルキレンであり、
Xは、活性エステル、N3、プロピニル、マレイミド、又は-O-P(OCH2CH2CN)NR12R13、又はXは、
L3及びL4は、独立して、任意に置換されたC2-C10アルキレン、又は任意に置換されたC2-C30ヘテロアルキレンであり、
Qは、ヒドロキシル保護基であり、
Zは、CH、N、NHC(O)N、又はOC(O)Nであり、及び
R12及びR13は、独立して、任意に置換されたC1-C6アルキルである、
化合物。 - R2がClであり、且つR3がHである、請求項1の化合物。
- Xが-OP(OCH2CH2CN)N(i-Pr)2である、請求項1の化合物。
- L1がPEG2-10リンカーである、請求項1の化合物。
- L1が-CH2CH2OCH2CH2-である、請求項1の化合物。
- R4及びR5は、一緒になって、R4及びR5が結合している原子を連結する任意に置換されたC3アルキレン鎖であり、R10及びR11は、一緒になって、R10及びR11が結合している原子を連結する任意に置換されたC3アルキレン鎖であり、R6及びR7は、一緒になって、R6及びR7が結合している原子を連結する任意に置換されたC3アルキレン鎖であり、R8及びR9は、一緒になって、R8及びR9が結合している原子を連結する任意に置換されたC3アルキレン鎖である、請求項1記載の化合物。
- R4及びR5は、一緒になって、R4及びR5が結合している原子を連結するプロピレン鎖であり、R10及びR11は、R10及びR11は結合している原子を連結するプロピレン鎖であり、R6及びR7は、R6及びR7が結合している原子を連結するプロピレン鎖であり、R8及びR9は、R8及びR9が結合している原子を連結するプロピレン鎖である、請求項1の化合物。
- R5、R6、R9及びR10がそれぞれメチルである、請求項1の化合物。
- Qが酸不安定性ヒドロキシル保護基である、請求項1の化合物。
- Qがトリチル基又はジメトキシトリチル基である、請求項1の化合物。
- L3及びL4が、独立して、C2-C6アルキレン又は-(OCH2CH2)m-であり、mが2〜6の整数である、請求項1の化合物。
- L3及びL4が、独立して、CH2CH2である、請求項1の化合物。
- Xが-OP(OCH2CH2CN)N(i-Pr)2である、請求項1又は14の化合物。
- 式II
R1はC1-C6アルキルであり、
R2は、H、ハロゲン、又はSO2NH2であり、
R3は、H又はハロゲンであり、
R14及びR16は、単独である場合、独立して、H、ハロゲン、又は任意に置換されたC1-C6アルキルであり、
R15及びR17は、単独である場合、独立して、H又は任意に置換されたC1-C6アルキルであり、
R14及びR15は、一緒の場合、R14及びR15が結合している原子を連結する任意に置換されたC2-C3アルキレン鎖を形成し、
R16及びR17は、一緒の場合、R16及びR17が結合している原子を連結する任意に置換されたC2-C3アルキレン鎖を形成し、
Qは、ヒドロキシル保護基であり、
L1及びL2は、独立して、任意に置換されたC2-C10アルキレン、又は任意に置換されたC2-C20ヘテロアルキレンである、
化合物。 - R3がHである、請求項17の化合物。
- R2がHである、請求項17の化合物。
- R2がClである、請求項17の化合物。
- 式III
R2は、H、ハロゲン又はSO2NH2であり、
R3は、ハロゲン又はHであり、
R4、R7、R8、及びR11は、単独である場合、独立して、H、ハロゲン、又は任意に置換されたC1-C6アルキルであり、
R5、R6、R9、及びR10は、単独である場合、独立して、H又は任意に置換されたC1-C6アルキルであり、
R4及びR5は、一緒の場合、R4及びR5が結合している原子を連結する任意に置換されたC2-C3アルキレン鎖であり、
R6及びR7は、一緒の場合、R6及びR7が結合している原子を連結する任意に置換されたC2-C3アルキレン鎖であり、
R8及びR9は、一緒の場合、R8及びR9が結合している原子を連結する任意に置換されたC2-C3アルキレン鎖であり、
R10及びR11は、一緒の場合、R10及びR11が結合している原子を連結する任意に置換されたC2-C3アルキレン鎖であり、
R5及びR6は、R5及びR6が結合している窒素原子と一緒の場合、5員又は6員の不飽和環を形成し、
R9及びR10は、R9及びR10が結合している窒素原子と一緒の場合、5員又は6員不飽和環を形成し、
Nは、1〜9の整数であり、
Yは、
Qはヒドロキシル保護基であり、及び
R12及びR13は、独立して、任意に置換されたC1-C6アルキルである、
化合物。 - R2がClであり、且つR3がHである、請求項23の化合物。
- R4及びR5は、一緒になって、R4及びR5が結合している原子を連結する任意に置換されたC3アルキレン鎖であり、R10及びR11は、一緒になって、R10及びR11が結合している原子を連結する任意に置換されたC3アルキレン鎖であり、R6及びR7は、一緒になって、R6及びR7が結合している原子を連結する任意に置換されたC3アルキレン鎖であり、R8及びR9は、一緒になって、R8及びR9が結合している原子を連結する任意に置換されたC3アルキレン鎖である、請求項23記載の化合物。
- R4及びR5は、一緒になって、R4及びR5が結合している原子を連結するプロピレン鎖であり、R10及びR11は、一緒になって、R10及びR11が結合している原子を連結するプロピレン鎖であり、R6及びR7は、一緒になって、R6及びR7が結合している原子を連結するプロピレン鎖であり、R8及びR9は、一緒になって、R8及びR9が結合している原子を連結するプロピレン鎖である、請求項23に記載の化合物。
- Qが酸不安定性ヒドロキシル保護基である、請求項23の化合物。
- Qがトリチル基又はジメトキシトリチル基である、請求項23の化合物。
- R12及びR13がそれぞれイソプロピルである、請求項23の化合物。
- 式IV
R2は、ハロゲン又はSO2NH2であり、
R3は、H又はハロゲンであり、
R4、R7、R8、及びR11は、単独である場合、独立して、H、ハロゲン、又は任意に置換されたC1-C6アルキルであり、
R5、R6、R9、及びR10は、単独である場合、独立して、H又は任意に置換されたC1-C6アルキルであり、
R4及びR5は、一緒の場合、R6及びR7が結合している原子を連結する任意に置換されたC2-C3アルキレン鎖であり、
R6及びR7は、一緒の場合、R6及びR7が結合している原子を連結する任意に置換されたC2-C3アルキレン鎖であり、
R8及びR9は、一緒の場合、R8及びR9が結合している原子を連結する任意に置換されたC2-C3アルキレン鎖であり、
R10及びR11は、一緒の場合、R10及びR11が結合している原子を連結する任意に置換されたC2-C3アルキレン鎖であり、
R5及びR6は、R5及びR6が結合している窒素原子と一緒の場合、5員又は6員の不飽和環を形成し、
R9及びR10は、R9及びR10が結合している窒素原子と一緒の場合、5員又は6員不飽和環を形成し、
Nは、1〜9の整数であり、
Yは、
波線は、式IIIへの結合点であり、
R12及びR13は、独立して、任意に置換されたC1-C6アルキルであり、
Wは、H又はL4-O-Z2であり、
L3、L4、及びL5は、独立して、任意に置換されたC2-C10アルキレン、又は任意に置換されたC2-C30ヘテロアルキレンであり、
Zは、CH、N、NHC(O)N、又はOC(O)Nであり、
Z1は、ヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドであり、及び
Z2は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、又はHである、
標識ポリヌクレオチド。 - R2がClであり、且つR3がHである、請求項31の標識ポリヌクレオチド。
- R4及びR5は、R4及びR5が結合している原子を連結する任意に置換されたC3アルキレン鎖であり、R10及びR11は、R10及びR11が結合している原子を連結する任意に置換されたC3アルキレン鎖であり、R6及びR7は、R6及びR7が結合している原子を連結する任意に置換されたC3アルキレン鎖であり、R8及びR9は、R8及びR9が結合している原子を連結する任意に置換されたC3アルキレン鎖である、請求項31の標識ポリヌクレオチド。
- 前記標識ポリヌクレオチドが5'-ヌクレアーゼPCRプローブである、請求項31の標識ポリヌクレオチド。
- 前記標識ポリヌクレオチドが蛍光消光剤をさらに含む、請求項31の標識ポリヌクレオチド。
- 前記標識ポリヌクレオチドが固体支持体に結合している、請求項31の標識ポリヌクレオチド。
- 前記固体支持体が、制御ポアガラスビーズ、ポリスチレンビーズ、磁性ビーズ又はマイクロウェルプレートである、請求項31の標識ポリヌクレオチド。
- 式VI
R1は、L1-Xであり、
R2、R3、R4、及びR5は、独立して、H、ハロゲン、C1-C6アルキル、又はSO2NH2であり
R6及びR9は、独立して、H又は任意に置換されたC1-C6アルキルであり、
R7、R8、R10、R11、R14、及びR15は、独立して、H又は任意に置換されたC1-C6アルキルであり、
L1は、任意に置換されたC2-C10アルキレン、又は任意に置換されたC2-C20ヘテロアルキレンであり、
Xは、活性エステル、N3、プロピニル、マレイミド、又は-O-P(OCH2CH2CN)NR12R13、又はXは、
L3及びL4は、独立して、任意に置換されたC2-C10アルキレン、又は任意に置換されたC2-C30ヘテロアルキレンであり、
Qは、ヒドロキシル保護基であり、
Zは、CH、N、NHC(O)N、又はOC(O)Nであり、及び
R12及びR13は、独立して、任意に置換されたC1-C6アルキルである、
化合物。 - R7、R8、R10、R11、R14及びR15がメチルである、請求項38の化合物。
- Xが-OP(OCH2CH2CN)N(i-Pr)2である、請求項38の化合物。
- L1がPEG2-10リンカーである、請求項38の化合物。
- L1が-CH2CH2OCH2CH2-である、請求項38の化合物。
- R2、R3、R4及びR5がHである、請求項38の化合物。
- R6がOH又はC1-C6アシルオキシで任意に置換されたC1-C6アルキルである、請求項38の化合物。
- R9がOH又はC1-C6アシルオキシで任意に置換されたC1-C6アルキルである、請求項38の化合物。
- R6がOH又はOAcで置換されたエチルである、請求項38の化合物。
- R9がOH又はOAcで置換されたエチルである、請求項38の化合物。
- R2、R3、R4及びR5がHである、請求項48の化合物。
- Q1及びQ2がアセチルである、請求項48の化合物。
- リガンドと請求項1〜30又は請求項38〜52のいずれか1項の化合物を、前記化合物を前記リガンドに共有結合させるのに十分な条件下の適切な溶媒中で接触させ、それによって標識コンジュゲートを形成する工程を含む、リガンドの標識コンジュゲートの調整方法。
- 前記リガンドがポリヌクレオチド、蛋白質、ペプチド、ポリサッカライド、エチレン性骨格を有するポリマー、又は固体支持体である、請求項53の方法。
- リガンドがポリヌクレオチドである、請求項53の方法。
- 前記リガンドに前記化合物を共有結合させるのに十分な条件が、ホスホロアミダイトオリゴヌクレオチド自動合成条件である、請求項53の方法。
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