CN116171308A - 荧光染料 - Google Patents
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Abstract
提供自动化的寡核苷酸合成相容的荧光染料亚磷酰胺化合物、固相支持体和掺入所述化合物的标记的多核苷酸。所述化合物允许荧光标记普遍掺入多核苷酸的任何位置。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年7月16日提交的第63/052，862号美国申请的优先权，其全部内容通过引用明确并入本文。
发明背景
荧光染料是用于修饰寡核苷酸最常用的标记之一，因为它们在从PCR到测序的多种应用中提供灵敏的检测。荧光染料标记的多核苷酸的制备一般通过合成后缀合来完成，例如，通过使活化的染料中间体与多核苷酸的氨基衍生物反应来完成。该方法遭受某些缺点，包括低缀合收率和需要对缀合产物进行另外的纯化。经由自动化的亚磷酰胺合成将荧光染料掺入合成多核苷酸提供更方便的方法。然而，很少有允许将荧光染料添加到多核苷酸作为自动化固相合成的一部分的荧光染料的亚磷酰胺衍生物是可商购的。此外，很少存在这种衍生物，其可以允许在合成多核苷酸的任何位置掺入荧光染料部分。
因此，对于与自动化的亚磷酰胺寡核苷酸合成条件相容、可以掺入多核苷酸的任何位置并在PCR应用中提供高终点荧光信号的荧光染料的需求仍然存在。
概述
提供该概述是为了以简化的形式介绍一些构思，该构思将在下面的详细描述中进一步描述。该概述不意在识别要求保护的主题的关键特征，也不意在用作确定要求保护的主题的范围的帮助。
一方面，本公开内容提供一种由式I表示的化合物或其立体异构体、盐或互变异构体：
其中：
X为H、卤素或C1-C5烷基；R1、R2、R3和R4独立地为H或任选取代的C1-C6烷基；R5、R6、R7、R8和R9独立地为H、卤素或任选取代的C1-C6烷基；L1是任选取代的C2-C10亚烷基或任选取代的C2-C50杂亚烷基；L2和L3独立地是任选取代的C2-C10亚烷基或任选取代的C2-C30杂亚烷基；Q1为羟基保护基团；Z是CH、N、NHC(O)N或OC(O)N；Y为OH、OP(OCH2CH2CN)NR10R11或固相支持体；以及R10和R11独立地是任选取代的C1-C6烷基。
在一些实施方案中，X是Cl、Br或F。在一些实施方案中，X是Cl。在一些实施方案中，X是F。在一些实施方案中，X是任选取代的甲基或任选取代的乙基。在一些实施方案中，X是o-MeC6H4CH2。
在一些实施方案中，固相支持体是可控孔度玻璃或聚苯乙烯。
在一些实施方案中，化合物为式(IA)的化合物或其立体异构体、盐或互变异构体：
在一些实施方案中，R1是H。在一些实施方案中，R2是甲基。在一些实施方案中，R3是甲基。在一些实施方案中，R4是甲基。在一些实施方案中，化合物为式(IB)的化合物或其立体异构体、盐或互变异构体：
在一些实施方案中，L1是C2-C6亚烷基或-(CH2CH2O)mCH2CH2-，其中m是1至10的整数。在一些实施方案中，L1是C2亚烷基。在一些实施方案中，Z是OC(O)N。
在一些实施方案中，化合物为式(IC)的化合物或其立体异构体、盐或互变异构体：
其中m为1至10的整数。
在一些实施方案中，化合物为式(ID)的化合物或其立体异构体、盐或互变异构体：
其中W为NH或O，且L4为任选取代的C2-C10亚烷基或任选取代的C2-C50杂亚烷基。
在一些实施方案中，Q1是三甲基甲硅烷基、TBDMS、乙酰基、二甲氧基三苯甲基或三苯甲基。在一些实施方案中，R10和R11是异丙基。在一些实施方案中，R5是甲基。在一些实施方案中，R7是甲基。在一些实施方案中，R8是甲基。在一些实施方案中，R6和R9是H。
在一些实施方案中，化合物为式(IE)的化合物或其立体异构体、盐或互变异构体：
另一方面，本公开内容提供包含本公开内容化合物的残基的标记的多核苷酸。在一些实施方案中，标记的多核苷酸使用自动化的亚磷酰胺合成制备。在一些实施方案中，标记的多核苷酸还包含荧光猝灭剂。在一些实施方案中，标记的多核苷酸还包含BHQ型荧光猝灭剂。在一些实施方案中，标记的多核苷酸连接至固相支持体。在一些实施方案中，固相支持体是可控孔度玻璃珠、聚苯乙烯珠、磁珠或微孔板。
另一方面，本公开内容提供一种用于制备配体的标记缀合物的方法，其包括在合适的溶剂中，在足以将化合物共价连接至配体的条件下，使配体与权利要求1至权利要求22中任一项的化合物接触，从而形成标记的缀合物，其中Y是OP(OCH2CH2CN)NR10R11并且R10和R11独立地是任选取代的C1-C6烷基。
在一些实施方案中，配体是多核苷酸或固相支持体。在一些实施方案中，配体是多核苷酸。在一些实施方案中，足以将化合物共价连接至配体的条件是自动化的亚磷酰胺寡核苷酸合成条件。
另一方面，本公开内容提供包括本文所公开的标记的多核苷酸的试剂盒，诸如PCR诊断试剂盒。
详述
本文提供荧光染料衍生物，诸如亚磷酰胺，其可以经由标准的自动化的寡核苷酸合成掺入寡核苷酸中。还提供用荧光染料修饰的固相支持体和包含荧光染料的多核苷酸。
在本说明书和所附权利要求书中，词语“包含(comprise)”和“包括(include)”及其变体，诸如“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”和“包括(including)”意在传达在上下文允许的情况下可能包含未具体记载的其他要素或整体。如本文所用，术语“由......组成”意在表示包括并限于短语“由......组成”之后的任何内容。因此，短语“由......组成”表示所列出的要素是必需的或强制性的，并且不存在其他要素。术语“基本上由......组成”是指组合物、方法或结构可以包括另外的成分、步骤和/或部分，但前提是另外的成分、步骤和/或部分不会实质上改变所要求保护的组合物、方法或结构的基本和新颖特征。
术语“一(a)”和“一个(an)”和“所述(the)”以及类似术语应被解释为涵盖单数和复数，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。
除非本文另有说明或上下文明显矛盾，否则本文描述的所有方法可以任何合适的顺序进行。本文提供的任何和所有实施例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅意在更好地阐明本发明并且不对另外要求保护的本发明的范围构成限制。
本文公开的本发明的替代要素或实施方案的分组不应被解释为限制。每个组成员都可以单独或与组的其他成员或本文中发现的其他要素的任何组合进行引用和要求保护。预计出于方便和/或可专利性的原因，组的一个或多个成员可以被包括在组中或从组中删除。当出现任何这种包括或删除时，说明书在本文中被视为包含修改后的组，从而满足所附权利要求中使用的所有马库什组的书面描述。
除非另有说明，否则核酸或寡核苷酸以5′至3′方向从左到右书写。
如本文所用，术语“扩增”是指一般以模板依赖性方式产生至少一种靶核酸的至少部分序列或其序列补体的任何方式，包括但不限于用于线性或指数扩增核酸序列的广泛技术。非限制性示例性扩增方法包括聚合酶链式反应(PCR)、逆转录酶PCR、实时PCR、巢式PCR、多重PCR、定量PCR(Q-PCR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、滚环扩增(RCA)、链置换扩增(SDA)、连接酶检测反应(LDR)、多重连接依赖性探针扩增(MLPA)、连接后进行Q-复制酶扩增、引物延伸、链置换扩增(SDA)、超支化链置换扩增、多重置换扩增(MDA)、基于核酸链的扩增(NASBA)、两步多重扩增、数字扩增等。这种技术的描述可见于Ausubel等人的其他资料中；PCR引物：实验室手册(A Laboratory Manual)，Diffenbach编辑，Cold Spring Harbor Press(1995)；电子协议书(The ElectronicProtocol Book)，Chang Bioscience(2002)；核酸方案手册(The Nucleic Acid ProtocolsHandbook)，R.Rapley编辑，Humana Press，Totowa，N.J.(2002)；和Innis等人，PCR协议(PCRProtocols)：方法和应用指南(A Guide to Methods and Applications)，学术出版社(Academic Press)(1990)。
如本文所用，术语“碱基”是指能够与互补的核苷酸碱基或核苷酸碱基类似物，例如嘌呤、7.脱氮嘌呤或嘧啶，形成氢键例如沃森-克里克(Watson-Crick)型氢键的含氮杂环部分。一般的碱基是天然存在的碱基腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶。碱基还包括天然存在的碱基的类似物，诸如脱氮腺嘌呤、7-脱氮-8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮-8-氮杂鸟嘌呤、肌苷、水粉蕈素、硝基吡咯、硝基吲哚、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、次黄嘌呤、5-甲基胞嘧啶、异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氯-6-氨基嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤等。
如本文所用，术语“互补”是指多核苷酸序列彼此杂交到碱基对和从碱基对杂交的能力。碱基对一般由反平行多核苷酸链中核苷酸单元之间的氢键形成。互补多核苷酸链可以沃森-克里克方式(例如，A到T、A到U、C到G)或以允许形成双链体的任何其他方式碱基配对。探针序列与靶序列的“互补性”百分比是探针序列与靶序列或靶序列的补体的“同一性”百分比。在测定探针与靶序列之间的“互补性”程度时，“互补性”程度表示为探针序列与最匹配其的靶序列的序列或该靶序列的序列的补体之间的同一性百分比。示例性探针是本文所述的多核苷酸。
如本文所用，术语“双链体”是指通过退火(杂交)互补(或部分互补)单链多核苷酸，例如DNA、RNA、LNA或肽核酸(PNA)形成的双链杂交复合物。
如本文所用，“荧光猝灭”是指降低荧光样品即荧光多核苷酸探针的荧光强度的任何过程。多种分子相互作用可导致猝灭。非限制性示例包括激发态反应、分子重排、能量转移、基态复合物形成和碰撞猝灭。
如本文所用，“卤素”是指F、Cl、Br或I。
术语“杂交(hybridize)”和“杂交(hybridization)”在本文中用于指代“特异性杂交”，在一些实施方案中，特异性杂交是核酸分子在严格条件下优先结合、双链化或退火至特定核苷酸序列。术语“严格条件”是指探针将优先与其靶序列杂交，并在较小程度上与其他序列杂交或根本不与其他序列杂交的条件。在核酸杂交上下文中的“严格杂交”和“严格杂交洗涤条件”是序列依赖性的并且在不同环境参数下是不同的。核酸杂交的详细指南可见于例如Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Acid Probes part I，Ch.2，“Overview ofprinciples of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays，”Elsevier，NY。多核苷酸与靶序列的杂交程度，也称为杂交强度，通过本领域众所周知的方法测定。一种优选的方法是测定给定杂交双链体的Tm。这可以通过使溶液中形成的双链体经受逐渐升高的温度并监测双链体的变性来实现，例如，通过紫外光的吸收来实现，其随着伴随变性的碱基对的解堆叠而增加。Tm通常定义为一半DNA链处于单链(ssDNA)状态时的温度。Tm取决于各种参数，诸如杂交互补链序列的长度、它们的特定核苷酸序列、碱基组成、碱基修饰和互补链的浓度。
如本文所用，术语“标记”和“可检测标记”可互换使用，并且是指当连接到生物分子、核苷、核苷酸或多核苷酸时，使这种生物分子、核苷、核苷酸或多核苷酸通过合适的检测方式可检测的部分。示例性标记包括荧光团、发色团、放射性同位素、自旋标记、酶标记、化学发光标记、电化学发光化合物、磁性标记、微球体、胶体金属、免疫标记、配体、酶等。
如本文所用，术语“修饰的核苷酸碱基”或“修饰的碱基”是指不具有天然存在的碱基的结构且因此是非天然存在的碱基。如本文所用，术语“修饰的糖”是指不具有天然存在的糖例如核糖或脱氧核糖糖的结构且因此是非天然存在的糖或糖类似物。
如本文所用，术语“天然存在的”在核酸分子的上下文中是指具有天然存在的核苷酸序列并且仅包含天然存在的组分诸如碱基、糖、核苷和核苷酸的RNA或DNA分子(单链或双链)。
如本文所用，术语“核苷”是指由本文提及类型的由含氮碱基组成的分子，其经由β-糖苷连接结合至本文提及类型的糖，例如结合至核糖或脱氧核糖糖。核苷的实例包括腺苷、胞苷、鸟苷、胸苷、尿苷和肌苷。
如本文所用，术语“核苷酸”是指核苷的磷酸酯，其作为独立的单体或作为多核苷酸内的亚单位。核苷酸单体包括例如核苷酸5′-单磷酸酯、核苷酸5′-二磷酸酯、核苷酸5′-三磷酸酯和核苷酸3′-单磷酸酯。核苷酸三磷酸酯有时表示为“NTP”、“dNTP”(2′-脱氧戊糖)或“ddNTP”(2′，3′-二脱氧戊糖)，以特别指出核糖糖的结构特征。“核苷酸5′-三磷酸酯”是指在5′位置具有三磷酸酯基团的核苷酸。三磷酸酯基团可以包括一个或多个磷酸酯氧原子的硫取代，例如α-硫代核苷酸5′-三磷酸酯。核苷酸单磷酸酯、核苷酸二磷酸酯或核苷酸三磷酸酯可用作核酸加工酶的底物，该核酸加工酶催化核酸或核酸中间体的修饰。
如本文所用，术语“寡核苷酸”广义上指主要或完全由约2至约300个天然存在或修饰的核苷酸单体单元例如由A、C、G、T或U碱基取代的脱氧核糖或核糖糖环组成的单链，并且其通过常规的磷酸酯骨架部分连接。更具体地，该术语是指在上述大小范围内的单链脱氧核糖核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸可包含一个或多个修饰的碱基和/或糖。除了核苷酸单体单元之外，寡核苷酸可以掺入一种或多种可检测标记和/或一种或多种反应性基团。
如本文所用，术语“多个”表示多于一个。
如本文所用，术语“多核苷酸”通常指包含约10至约300个核苷酸单体单元的寡核苷酸。除了核苷酸单体单元之外，多核苷酸可以掺入一种或多种可检测标记和/或一种或多种反应性基团。
如本文所用，术语“引物”是指有效作为合成与靶核酸链互补的多核苷酸链的起始点的多核苷酸或修饰的多核苷酸。例如，用于PCR的引物包括正向和反向引物，其中正向引物含有与靶核酸链的区域互补的序列并指导互补链的合成。反向引物含有与相反链互补的序列，并指导沿着靶核酸链的相反链的合成。
如本文所用，术语“探针”是指含有与靶核酸序列区域互补的序列的标记寡核苷酸或标记修饰寡核苷酸，允许探针与靶序列形成双链体并产生指示靶序列区域存在的可检测信号。在杂交期间或之后直接或间接地产生可检测信号。在某些应用中，诸如在5′-核酸酶PCR的引物延伸过程中，探针缺少可延伸的3′羟基基团以防止聚合酶介导的探针延伸。在某些实施方案中，探针包括
探针、TaqMan/>
探针、/>
探针、分子信标(例如，Tyagi，Sanjay&Kramer，Fred.(2012)Molecular Beacons in Diagnostics.F1000medicine reports.4.10.10.3410/M4-10中公开的那些)等。
如本文所用，术语“保护基团(protecting group)”、“保护基团(protectivegroup)”或“受保护形式”是指官能团(例如，羟基)的不稳定化学修饰，意在保留其官能度和/或在随后的反应中获得化学选择性。通过脱保护处理(例如用酸处理)从最终产物中去除保护基团。
如本文所用，术语“固相支持体”是指任何不溶性材料，包括颗粒(例如珠)、纤维、整料、膜、滤料、塑料条、阵列、微孔板等。在一些实施方案中，固相支持体是适合于自动化的亚磷酰胺寡核苷酸合成的固相支持体，诸如聚苯乙烯和可控孔度玻璃(CPG)。
一方面，本文提供由式I表示的荧光染料化合物或其立体异构体、盐或互变异构体：
其中：
X为H、卤素或任选取代的C1-C5烷基；
R1、R2、R3和R4独立地为H或任选取代的C1-C6烷基；
R5、R6、R7、R8和R9独立地为H、卤素或任选取代的C1-C6烷基；
L1是选自任选取代的C2-C10亚烷基或任选取代的C2-C50杂亚烷基的连接体基团；
L2和L3独立地是选自任选取代的C2-C10亚烷基或任选取代的C2-C30杂亚烷基的连接体基团；
Q1为羟基保护基团，诸如与自动化的寡核苷酸合成相容的保护基团；
Z是CH、N、NHC(O)N或OC(O)N；
Y为OH、OP(OCH2CH2CN)NR10R11或固相支持体；和
R10和R11独立地是任选取代的C1-C6烷基。
在一些实施方案中，式I包含亚磷酰胺基团(即，Y是OP(OCH2CH2CN)NR10R11)和用酸不稳定保护基团诸如三苯甲基或二甲氧基三苯甲基基团保护的羟基基团。在一些实施方案中，Q1是二甲氧基三苯甲基基团。在一些实施方案中，R10和R11是异丙基。
在式I的一些实施方案中，X是Cl、Br或F。在一些实施方案中，X是Cl。
在一些实施方案中，化合物为式(IA)的化合物或其立体异构体、盐或互变异构体：
在一些实施方案中，R1是H。在一些实施方案中，R2是甲基。在一些实施方案中，R3是甲基。在一些实施方案中，R4是甲基。在一些实施方案中，R1是H，且R2、R3和R4中的每一个是甲基。
在式(I)的一些实施方案中，化合物是式(IB)的化合物或其立体异构体、盐或互变异构体：
在本文公开的式中，连接体基团L1可包含一个或多个选自N、O、S、P及其组合的杂原子。在一些实施方案中，L1是PEG2-10连接体。在一些实施方案中，L1是C2-C6亚烷基或-(CH2CH2O)mCH2CH2-，其中m是1至10的整数。在其他实施方案中，L1是任选取代的亚烷基，诸如-CH2CH2-。在一些实施方案中，L1是任选被甲基基团取代的亚烷基。
在一些实施方案中，Z是OC(O)N。
在式(I)、(IA)和(IB)的一些实施方案中，化合物是式(IC)的化合物或其立体异构体、盐或互变异构体：
其中m为1至10的整数。
在式(I)的一些实施方案中，化合物是式(ID)的化合物或其立体异构体、盐或互变异构体：
其中W为NH或O，且L4为任选取代的C2-C10亚烷基或任选取代的C2-C50杂亚烷基。
在本文所示的式中，Q1表示羟基保护基团。这种保护基团的实例是本领域已知的(参见，例如，Peter G.M.Wuts，Greene′s protective groups in organic synthesis(2006))。合适的羟基保护基团包括碱不稳定基团和酸不稳定基团。在一些实施方案中，Q是与自动化的亚磷酰胺寡核苷酸合成条件相容的羟基保护基团，诸如三苯甲基或二甲氧基三苯甲基基团。在一些实施方案中，Q1是三甲基甲硅烷基、TBDMS、乙酰基、二甲氧基三苯甲基或三苯甲基。
在一些实施方案中，R5是甲基或卤素诸如Cl或F。在一些实施方案中，R7是甲基或卤素诸如Cl或F。在一些实施方案中，R8是甲基或卤素诸如Cl或F。在一些实施方案中，R7是H。在一些实施方案中，R6和R9是H。
在一些实施方案中，化合物为式(IE)的化合物或其立体异构体、盐或互变异构体：
在式(I)的一些实施方案中，Y是固相支持体诸如可控孔度玻璃或聚苯乙烯。在式(I)的一些实施方案中，Y任选地包含将可控孔度玻璃或聚苯乙烯与结构的其余部分连接的连接基团。
另一方面，本公开内容提供式II的化合物或其立体异构体、盐或互变异构体：
其中X是H、卤素或任选取代的C1-C5烷基；
R1、R2、R3和R4独立地为H或任选取代的C1-C6烷基；和
R5、R6、R7、R8和R9独立地是H、卤素或任选取代的C1-C6烷基。
在式II的一些实施方案中，X是Cl、Br或F。在一些实施方案中，X是Cl。在一些实施方案中，X是F。
在式II的一些实施方案中，R1是H。在一些实施方案中，R2是甲基。在一些实施方案中，R3是甲基。在一些实施方案中，R4是甲基。在一些实施方案中，R1是H，且R2、R3和R4中的每一个是甲基。
如本文所用，术语“烷基”、“烯基”和“炔基”包括直链、支链和环状单价烃基基团，以及这些的组合，当它们未被取代时，其仅包含C和H。实例包括甲基、乙基、异丁基、环己基、环戊基乙基、2-丙烯基、3-丁炔基等。本文有时描述每个这种基团中的碳原子总数，例如，当该基团可以包含至多十个碳原子时，它可以表示为1-10C、C1-C10、C-C10或C1-10。
本文所用的术语“杂烷基”、“杂烯基”和“杂炔基”是指相应的烃，其中一个或多个链碳原子已被杂原子取代。示例性的杂原子包括N、O、S和P。当允许杂原子取代碳原子时，例如，在杂烷基基团中，尽管仍写为例如C3-C10，但描述该基团的数字代表环或链中的碳原子数和作为所描述的环或链中的碳原子的替代而被包括的这种杂原子的数目的总和。
一般，烷基、烯基和炔基取代基含有1-10个碳原子(烷基)或2-10个碳原子(烯基或炔基)。优选地，它们含有1-8个碳原子(烷基)或2-8个碳原子(烯基或炔基)。有时它们含有1-6个碳原子(烷基)或2-6个碳原子(烯基或炔基)。单个基团可以包括多于一种类型的多重键，或多于一个多重键；当这种基团含有至少一个碳-碳双键时，它们包括在术语“烯基”的定义中，以及当这种基团含有至少一个碳-碳三键时，它们包括在术语“炔基”中。
如本文所用，术语“亚烷基”、“亚烯基”和“亚炔基”包括直链、支链和环状二价烃基基团及其组合。
烷基、烯基和炔基基团可以任选地被取代到这种取代在化学上有意义的程度。一般的取代基包括但不限于卤素(F、Cl、Br、I)、＝O、＝N-CN、＝N-OR、＝NR、OR、NR2、SR、SO2R、SO2NR2、NRSO2R、NRCONR2、NRC(O)OR、NRC(O)R、CN、C(O)OR、C(O)NR2、OC(O)R、C(O)R和NO2，其中每个R独立地为H、C1-C8烷基、C2-C8杂烷基、C1-C8酰基、C2-C8杂酰基、C2-C8烯基、C2-C8杂烯基、C2-C8炔基、C2-C8杂炔基、C6-C10芳基或C5-C10杂芳基，并且每个R任选被卤素(F、Cl、Br、I)、＝O、＝N-CN、＝N-OR′、＝NR′、OR′、NR′2、SR′、SO2R′、SO2NR′2、NR′SO2R′、NR′CONR′2、NR′C(O)OR′、NR′C(O)R′、CN、C(O)OR′、C(O)NR′2、OC(O)R′、C(O)R′和NO2取代，其中每个R′独立地是H、C1-C8烷基、C2-C8杂烷基、C1-C8酰基、C2-C8杂酰基、C6-C10芳基，或C5-C10杂芳基。烷基、烯基和炔基基团也可以被C1-C8酰基、C2-C8杂酰基、C6-C10芳基或C5-C10杂芳基取代，其中每一个都可以被适合于特定基团的取代基取代。
虽然本文使用的“烷基”包括环烷基和环烷基烷基基团，但术语“环烷基”在本文中用于描述经由环碳原子连接的碳环非芳族基团，并且“环烷基烷基”用于描述通过烷基连接体连接到分子上的碳环非芳族基团。类似地，“杂环基”用于识别含有至少一个杂原子作为环成员并且经由环原子与分子连接的非芳族环基团，环原子可以是C或N；和“杂环基烷基”可用于描述通过亚烷基连接体连接到另一个分子的这种基团。如本文所用，这些术语还包括含有一个双键或两个双键的环，只要该环不是芳族的。
“芳族”或“芳基”取代基或部分是指具有众所周知的芳香性特征的单环或稠合双环部分；实例包括苯基和萘基。类似地，术语“杂芳族”和“杂芳基”是指含有一个或多个杂原子作为环成员的这种单环或稠合双环环体系。合适的杂原子包括N、O和S，它们的包含允许5元环和6元环中的芳香性。一般杂芳族体系包括单环C5-C6芳族基团，诸如吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、噻吩基、呋喃基、吡咯基、吡唑基、噻唑基、噁唑基和咪唑基，以及通过将这些单环基团之一与苯环或任何杂芳族单环基团稠合以形成C8-C10双环基团而形成的稠合双环部分，诸如吲哚基、苯并咪唑基、吲唑基、苯并三唑基、异喹啉基、喹啉基、苯并噻唑基、苯并呋喃基、吡唑并吡啶基、喹唑啉基、喹喔啉基、噌啉基等。在整个环体系的电子分布方面具有芳香性特征的任何单环或稠环双环体系都包括在该定义中。它还包括双环基团，其中至少直接连接至分子其余部分的环具有芳香性特征。一般，环体系含有5-12个环成员原子。优选地，单环杂芳基含有5-6个环成员，以及双环杂芳基含有8-10个环成员。
芳基和杂芳基部分可以被各种取代基取代，所述取代基包括C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C5-C12芳基、C1-C8酰基，以及这些的杂形式，其中的每一个本身都可以被进一步取代；用于芳基和杂芳基部分的其他取代基包括卤素(F、Cl、Br、I)、OR、NR2、SR、SO2R、SO2NR2、NRSO2R、NRCONR2、NRC(O)OR、NRC(O)R、CN、C(O)OR、C(O)NR2、OC(O)R、C(O)R和NO2，其中每个R独立地为H、C1-C8烷基、C2-C8杂烷基、C2-C8烯基、C2-C8杂烯基、C2-C8炔基、C2-C8杂炔基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C7-C12芳基烷基或C6-C12杂芳基烷基，并且每个R如上文针对烷基基团所描述任选地被取代。芳基或杂芳基基团上的取代基当然可以进一步被本文描述的适合于这种取代基的每种类型或适合于取代基的每种组分的基团取代。因此，例如，芳基烷基取代基可以在芳基部分上被本文描述的对于芳基基团一般的取代基取代，并且它可以在烷基部分上进一步被本文描述的对于烷基基团一般的或适合的取代基取代。
如本文所用，“任选取代的”表示所描述的特定基团可具有一个或多个被非氢取代基取代的氢取代基。在一些任选取代的基团或部分中，所有氢取代基都被非氢取代基取代，所述非氢取代基为例如C1-C6烷基、C2-C6杂烷基、炔基、卤素(F、Cl、Br、I)、N3、OR、NR2、SR、SO2R、SO2NR2、NRSO2R、NRCONR2、NRC(O)OR、NRC(O)R、CN、C(O)OR、C(O)NR2、OC(O)R、C(O)R、氧代和NO2，其中每个R独立地是H、C1-C6烷基或C2-C6杂烷基。当一个任选的取代基经由双键诸如羰基氧或氧代(＝O)连接时，该基团占据两个可获得的化合价，因此可以包括的取代基总数根据可获得的化合价的数目而减少。
本文公开的化合物的盐、立体异构体和互变异构体也在本公开内容的范围内。如本文所用，“立体异构体(stereoisomer)”或“立体异构体(stereoisomers)”是指一种或多种立体中心的手性不同的化合物。立体异构体包括对映体和非对映体。如本文所用，“互变异构体”是指质子位置不同的化合物的替代形式，诸如烯醇-酮和亚胺-烯胺互变异构体。如本文所用，化合物的“盐”是指与抗衡离子离子缔合的化合物的离子。化合物的盐可以通过酸和碱的中和反应形成。盐可以衍生自本领域众所周知的多种有机和无机抗衡离子，并且仅作为示例包括钠、钾、钙、镁、铵和四烷基铵；并且当分子含有碱性官能度时，有机或无机酸的盐，诸如盐酸盐、氢溴酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、马来酸盐和草酸盐。尽管本文公开的化合物的结构可以仅以一种共振形式显示，但应理解包括所有共振形式。
本公开内容的染料可以通过任何合适的方法制备。例如，染料可以根据以下反应方案I和II中所示的方法制备。
另一方面，本文提供荧光染料标记的多核苷酸，其通过使用本文公开的荧光染料亚磷酰胺的自动化的寡核苷酸合成制备。多核苷酸包含衍生自本公开内容的化合物的部分。如本文所用，“荧光染料标记的多核苷酸”或“标记的多核苷酸”是指从本文公开的式的化合物通过自动化的寡核苷酸合成制备的多核苷酸。
本文公开的标记的多核苷酸可包含一个或多个另外的部分。在本公开内容的一些实施方案中，标记的多核苷酸包含小沟结合剂。在一些实施方案中，标记的多核苷酸包含嵌入剂。在一些实施方案中，标记的多核苷酸包含第二荧光团和/或荧光猝灭剂。
一般，用本文公开的染料标记的多核苷酸是其中主链包含2′-脱氧核糖或核糖的多核苷酸。然而，标记的多核苷酸可以包含一个或多个修饰。在一些实施方案中，多核苷酸包含糖修饰，例如修饰的糖。各种糖修饰都是有用的。一些非限制性糖修饰包括阿拉伯糖、d-阿拉伯己糖醇、2-氟阿拉伯糖、木酮糖、己糖或双环糖。
本公开内容的标记的多核苷酸可包含一个或多个主链修饰。在一些实施方案中，多核苷酸包含主链修饰。在一些实施方案中，主链修饰选自修饰的糖磷酸酯主链、锁定核酸主链、肽主链、磷酸三酯主链、氨基磷酸酯主链、硅氧烷主链、羧甲酯主链、乙酰胺酯(acetamidate)主链、氨基甲酸酯主链、硫醚主链、桥接亚甲基膦酸酯主链、硫代磷酸酯主链、甲基膦酸酯主链、烷基膦酸酯主链、磷酸酯主链、烷基硫代膦酸酯主链、二硫代磷酸酯主链、碳酸酯主链、磷酸三酯主链、羧甲基酯主链、甲基硫代磷酸酯主链、二硫代磷酸酯主链、具有对乙氧基键的主链，以及前述任意两个或多个的组合。在本公开内容的一个具体实施方案中，主链修饰是修饰的糖磷酸酯主链。
本文公开的标记的多核苷酸可包含一个或多个修饰的或非天然的碱基。修饰的碱基包括修饰的胸腺嘧啶和胞嘧啶碱基(例如，第9,598,455和9,598,456号美国专利中公开的那些)、2，6-二氨基嘌呤碱基、通用碱基等。本文公开的标记的多核苷酸可包含非核苷区段或非核苷单体(例如，连接体诸如聚(乙二醇)连接体)。
在一些实施方案中，本文公开的多核苷酸是探针，例如5′-核酸酶PCR探针。在某些实施方案中，多核苷酸还包含一种或多种另外的标记，例如荧光猝灭剂。如本领域的普通技术人员将理解的，标记在寡核苷酸内的位置可以变化并且不限于本文的公开内容。
在一些实施方案中，本文提供修饰的多核苷酸，其在其序列的一端包含作为荧光团的染料部分和在其序列的另一端的荧光猝灭剂，使得荧光猝灭剂经由能量转移机制诸如荧光共振能量转移(“FRET”)抑制完整探针(即用作探针的寡核苷酸)中荧光团的荧光信号。当聚合酶沿着探针也与之杂交的模板延伸引物时，聚合酶的5′-核酸酶活性切割探针，从而使荧光团扩散离开荧光猝灭剂，使得现在检测到荧光信号。信号随着每个PCR循环与被切割的探针的量成比例地增加，并且因此与扩增产物(例如，扩增子、靶序列)的量成比例地增加。这允许直接检测和定量靶DNA序列。
在一些实施方案中，染料部分距标记的多核苷酸序列末端至少一个核苷酸位置并且荧光猝灭剂连接至距修饰的多核苷酸另一末端至少一个核苷酸位置的碱基。在一些实施方案中，染料部分和荧光猝灭剂位于探针内部。正如本领域普通技术人员将理解的，荧光团和/或荧光猝灭剂在探针内的位置可以变化并且不受限制。
在一些实施方案中，染料部分和荧光猝灭剂不在FRET探针的末端。在一些实施方案中，染料的发射光谱与荧光猝灭剂的吸收光谱显著重叠。然而，当猝灭涉及碰撞机制时，或者例如由于反应条件或探针结构而重叠增加，这种光谱重叠不太重要或不需要。
在本领域中有大量实用指南可用于为特定探针选择合适的荧光团-猝灭剂。参见，例如，FLUORESCENCE SPECTROSCOPY(Marcel Dekker，New York，1971)。可用于包含在本文公开的探针中的猝灭剂包括双偶氮猝灭剂(例如，第6,790,945号美国专利中公开的那些)、可从Biosearch Technologies，Inc.获得的猝灭剂(Black HoleTM猝灭剂：BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3)、TAMRA、羧基四甲基罗丹明、4-((4-(二甲氨基)苯基)偶氮)苯甲酸(Dabcyl)、
猝灭剂、/>
猝灭剂、2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌(DDQ)-I和2-[6-(1，3-二氢-2H-异吲哚-2-基)-9-{2-[(4-[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]羰基哌啶-1-基)磺酰基]苯基}-3H-呫吨-3-亚基]-2，3-二氢-1H-异吲哚鎓氯化物(2-[6-(1，3-dihydro-2H-isoindol-2-y1)-9-{2-[(4-[(2，5-dioxopyrrolidin-1-y1)o-xy]carbonyl piperidin-1-y1)sulfo-nyl]phenyl}-3H-xanthen-3-ylidene]-2，3-dihydro-1H-isoin doliumchloride)(QSY21)和本领域已知的其他猝灭剂。
在又一方面，本文公开一种用于制备配体的标记的缀合物的方法，其包括在合适的溶剂中，在足以将化合物共价连接至配体的条件下，使配体与本文提供的式的化合物接触，从而形成染料-标记的缀合物。合适的配体包括生物分子(例如多核苷酸、寡核苷酸、蛋白质、抗体、肽或多糖)、合成聚合物(例如具有烯属主链的聚合物，例如聚丙烯酸)和固相支持体(例如，可控孔度玻璃或聚苯乙烯)。
在一些实施方案中，配体是多核苷酸。在一些实施方案中，足以将本公开内容的化合物共价连接至配体，即寡核苷酸或多核苷酸的条件是自动化的亚磷酰胺寡核苷酸合成条件。用于合成和脱保护合成寡核苷酸的自动化的亚磷酰胺寡核苷酸合成条件在本领域中是众所周知的，并且例如在核酸化学中的当前方案(Current Protocols in Nucleic AcidChemistry)，卷I，Beaucage等人编辑，John Wiley&Sons，2002中被描述，其公开内容通过引用并入本文。
寡核苷酸如DNA合成的亚磷酰胺方法被认为是大多数自动化的合成仪中使用的标准合成方法。用于合成的结构单元通常称为核苷酸结构单元、单体或核苷亚磷酰胺，其是活化的核苷衍生物(亚磷酰胺)。酸可裂解的保护基团，一般是二甲氧基三苯甲基(DMT)基团，被用于保护核苷的5′-末端，并且β-氰乙基基团被用于保护3′-亚磷酸酯部分。单体还可以包括用于保护其他部分如核碱基中的反应性伯胺的另外的基团。选择保护基团以防止在合成过程中发生支化或其他不需要的副反应。熟练的技术人员将能够容易地选择具有适合在特定合成和脱保护和/或裂解条件下使用的性质的保护基团。例如，在Greene&Wuts，“有机化学中的保护基团(Protective Groups In Organic Chemistry)，”第3版，John Wiley&Sons，1999(以下称为“Green&Wuts”)中教导了多种胺保护基团。
一般，寡核苷酸是在固相支持体如可控孔度玻璃(CPG)或聚苯乙烯填充柱、膜或类似材料上合成的。寡核苷酸通常从3′端到5′端合成。第一个核苷酸结构单元或单体一般通常经由连接体诸如长链烷基胺控制的孔度玻璃(LCAA-CPG)固定至支持体上。
在一些实施方案中，采用亚磷酰胺试剂的合成方法涉及多轮：(i)DMT脱保护以显露游离羟基，这可以例如通过用2.5％或3％的在二氯甲烷中的二氯乙酸或三氯乙酸处理来实现；(ii)核苷或其他亚磷酰胺试剂与游离羟基的偶联，这可以例如在含有四唑(例如0.45M或0.5M四唑)的乙腈中进行；(iii)氧化，这可以例如通过用I2/2，6-二甲基吡啶/H2O处理来进行；和封端，这可以例如通过用6.5％的在四氢呋喃(THF)中的乙酸酐来处理、用10％的在THF中的1-甲基咪唑(NMI)来活化而进行。
用于进行合成中的各个步骤的其他条件也是本领域已知的并且可以在本文中使用。例如，亚磷酰胺偶联可在含有0.25M 5-乙硫基-1H-四唑、0.25M 4，5-二氰基咪唑(DCI)或0.25M 5-苄硫基-1H-四唑(BTT)的乙腈中进行。可以使用0.1M、0.05M或0.02M在THF/H2O/吡啶(7∶2∶1)中的I2进行氧化。封端可以通过用THF/二甲基吡啶/乙酸酐处理，然后通过用16％的在THF中的NMI处理来进行。
从合成试剂中去除任何保护基团和裂解一般通过在60℃下用浓氢氧化铵处理1-12小时来实现，尽管用基团保护的核苷亚磷酰胺也是已知的和可以使用的，所述基团可以在较温和条件下诸如通过在室温下用浓氢氧化铵处理4-17小时或用0.05M在甲醇中的碳酸钾处理，或用25％的在水/乙醇中的叔丁胺处理来去除。
关于固相寡核苷酸合成的术语“裂解”是指破坏将寡核苷酸连接至固相支持体上的键。在一些实施方案中，裂解涉及连接的寡核苷酸的3′羟基与固相支持体之间的琥珀酸酯键的水解。
本文所用的术语“脱保护”是指从寡核苷酸的杂环碱基的环外胺中去除保护基团。通常，脱保护涉及由环外胺和氨基保护基团如苯甲酰基或异丁酰基组成的酰胺部分的水解。各种脱保护技术和方法是本领域已知的。
另一方面，本文提供包含标记的多核苷酸或本公开内容的化合物的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒是包含一种或多种本公开内容的多核苷酸的PCR诊断试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒是自动化的分子诊断药盒。
虽然本发明的每个要素在本文中被描述为包含多个实施方案，但是应当理解，除非另有说明，否则本发明的给定要素的每个实施方案能够与本发明的其他要素的每个实施方案一起使用，并且每个这种使用意在形成本发明的不同实施方案。
本文引用的参考专利、专利申请和科学文献通过引用整体并入本文，就好像每个单独的出版物、专利或专利申请都被具体且单独地指示通过引用并入。此处引用的任何参考文献与该说明书的具体教导之间的任何冲突都应以有利于后者的方式解决。同样，本领域理解的词语或短语的定义与该说明书中具体教导的词语或短语的定义之间的任何冲突应以有利于后者的方式解决。
本发明通过以下实施例进行说明。这些实施例仅用于说明的目的而被包括，并不意在限制本发明。
实施例
质子(1H，400MHz)和磷(31P，160MHz)核磁共振(NMR)谱是在Bruker Biospin 400仪器上获得的。NMR样品在DMSO-d6和CD3CN中制备，并且残留的质子化溶剂用作内部化学位移标准。LCMS数据是在Agilent 1200系列(LC/MSD Trap XCT Plus)和Agilent 1260infinity(6130四极杆LC/MS)仪器上通过电喷雾电离(ESI)获得的。使用Biotage IsoleraLS和Teledyne ISCO
Combi Flash仪器在硅胶60上进行自动色谱法。分析薄层色谱法在铝背硅胶60F254上进行，并且板在紫外灯(254和365nm)下可视化。除非另有说明，否则所有试剂均来自商业来源。
包含本公开内容化合物的多核苷酸在MerMade-12寡核苷酸合成仪上使用标准200nmol DNA方案以DMT去除-偶联-封端-氧化-封端循环合成。可以相应地调整本公开内容的染料亚磷酰胺的偶联时间。
对于含有5′染料的多核苷酸，合成在最后一个染料亚磷酰胺偶联循环后完成。在染料亚磷酰胺内部掺入的情况下，在染料偶联后添加更多核苷单体。最后的DMT基团留在多核苷酸上。
完全组装的多核苷酸从固相支持体上裂解，并在55℃下通过30％氢氧化铵脱保护10-12小时。去除氨后，通过反相HPLC(RP-HPLC)在C18Gemini柱上用pH 7的乙腈/0.1M三乙基碳酸氢铵线性梯度洗脱来分析和纯化寡核苷酸。去除DMT基团后，第二次纯化多核苷酸。在Agilent Cary荧光计(200nM寡核苷酸，0.1M Tris缓冲液，pH8)上记录标记的寡核苷酸的激发和发射光谱。
本公开内容的示例性荧光染料亚磷酰胺(例如，化合物D)的示例性合成方法示于反应方案I中。
首先，起始醇化合物A(例如，表I的化合物)在碱存在下原位用双(4-硝基苯基)碳酸酯酰化，然后用仲胺亲核取代4-硝基苯基酯，形成氨基甲酸酯键以产生中间产物C。产物可以通过快速色谱法分离。在排除酸的无水条件下使用标准亚磷酸化将化合物C转化为亚磷酰胺D。保护反应混合物和产物免受光和空气(氧气)的影响。使用硅胶快速色谱法纯化产物。
反应方案I.
醇化合物A，诸如表1的化合物，可以根据反应方案II所示的方法制备。
反应方案II.
表1.
前体醇A(化合物19A)的制备。
在干燥、惰性气氛下，将2，3-二氢-2，3，3-三甲基-1-(2-羟乙基)-吲哚-5-醇(根据WO 2019/217470的步骤制备；28.0mmol)和4-氟间苯二酚(56.0mmol)悬浮在50mL甲磺酸中。将溶液在55℃下加热直至变得均匀。向溶液中添加甲磺酸(15mL)中的2，4，5-三甲基苯甲醛(61.6mmol)，并将混合物在55℃下加热1.5小时。将反应烧瓶置于冰浴中，并添加150g碎冰和125ml水。将混合物用THF/CHCl3(1：2)萃取三次，并将合并的有机层用饱和NaHCO3萃取并经无水Na2SO4干燥。使用乙腈/水的硅胶色谱法提供3.67mmol(13％)的染料化合物19A，其激发/发射最大值分别为528nm/546nm。
示例性亚磷酰胺(化合物19D)的制备。
在氩气气氛下，向化合物19A的无水N，N-二甲基甲酰胺中的溶液中添加三乙胺，然后一次性添加BNPC。将反应孵育40分钟。将连接体化合物L1添加到反应混合物中，并将反应混合物在环境温度下孵育2.5h。将反应混合物转移到分液漏斗中，用乙酸乙酯冲洗反应烧瓶。用水萃取该溶液。弃去水层，并且有机层进一步用去离子水和饱和氯化钠水溶液洗涤，并在搅拌下用无水硫酸钠干燥18h。粗产物通过快速色谱法纯化以产生化合物19C。
在氩气下将化合物19C溶解在无水二氯甲烷中，并在搅拌下经由注射器加入无水N，N-二异丙基乙胺。将反应烧瓶置于冰浴中10分钟，以将反应混合物冷却至＜10℃。在1分钟内经由注射器滴加Pam-Cl，并将反应混合物从冰中移出。通过用铝箔包裹烧瓶使反应混合物避光，并使其逐渐升温至室温，用时2.5小时。将反应混合物用乙酸乙酯稀释并在氩气下转移到分液漏斗中。转移后，用10％饱和碳酸氢钠溶液萃取反应混合物。弃去水层，并用饱和氯化钠萃取有机层以去除水。有机层在氩气、避光下经无水硫酸钠干燥。干燥后，过滤溶液，蒸发溶剂，以产生红色泡沫状粗产物。粗产物通过快速色谱法纯化。通过HPLC、LC-MS和NMR分析产物化合物19D。
虽然已经说明和描述了说明性实施方案，但是应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以在其中进行各种改变。
Claims (32)
1.一种式I所示的化合物或其立体异构体、盐或互变异构体：
其中：
X为H、卤素或C1-C5烷基；
R1、R2、R3和R4独立地为H或任选取代的C1-C6烷基；
R5、R6、R7、R8和R9独立地为H、卤素或任选取代的C1-C6烷基；
L1是任选取代的C2-C10亚烷基或任选取代的C2-C50杂亚烷基；
L2和L3独立地是任选取代的C2-C10亚烷基或任选取代的C2-C30杂亚烷基；
Q1为羟基保护基团；
Z是CH、N、NHC(O)N或OC(O)N；
Y为OH、OP(OCH2CH2CN)NR10R11或固相支持体；和
R10和R11独立地是任选取代的C1-C6烷基。
2.权利要求1所述的化合物，其中X是C1、Br或F。
3.权利要求1所述的化合物，其中X是Cl。
4.权利要求1-3中任一项所述的化合物，其中所述固相支持体是可控孔度玻璃或聚苯乙烯。
5.权利要求1-3中任一项所述的化合物，其中所述化合物是式(IA)的化合物或其立体异构体、盐或互变异构体：
6.前述权利要求中任一项所述的化合物，其中R1是H。
7.前述权利要求中任一项所述的化合物，其中R2是甲基。
8.前述权利要求中任一项所述的化合物，其中R3是甲基。
9.前述权利要求中任一项所述的化合物，其中R4是甲基。
10.权利要求1所述的化合物，其中所述化合物为式(IB)的化合物或其立体异构体、盐或互变异构体：
11.前述权利要求中任一项所述的化合物，其中L1是C2-C6亚烷基或-(CH2CH2O)mCH2CH2-，其中m是1至10的整数。
12.前述权利要求中任一项所述的化合物，其中L1是C2亚烷基。
13.前述权利要求中任一项所述的化合物，其中Z是OC(O)N。
14.前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述化合物是式(IC)的化合物或其立体异构体、盐或互变异构体：
其中m为1至10的整数。
15.权利要求1所述的化合物，其中所述化合物是(ID)的化合物或其立体异构体、盐或互变异构体：
其中W为NH或O，且L4为任选取代的C2-C10亚烷基或任选取代的C2-C50杂亚烷基。
16.前述权利要求中任一项所述的化合物，其中Q1是三甲基甲硅烷基、TBDMS、乙酰基、二甲氧基三苯甲基或三苯甲基。
17.前述权利要求中任一项所述的化合物，其中R10和R11是异丙基。
18.前述权利要求中任一项所述的化合物，其中R5是甲基。
19.前述权利要求中任一项所述的化合物，其中R7是甲基。
20.前述权利要求中任一项所述的化合物，其中R8是甲基。
21.前述权利要求中任一项所述的化合物，其中R6和R9是H。
22.权利要求1所述的化合物，其中所述化合物是式(IE)的化合物或其立体异构体、盐或互变异构体：
23.使用自动化的亚磷酰胺合成制备的标记的多核苷酸，其包含权利要求1-22中任一项所述化合物的残基。
24.权利要求23所述的标记的多核苷酸，其中所述标记的多核苷酸还包含荧光猝灭剂。
25.权利要求23所述的标记的多核苷酸，其中所述标记的多核苷酸连接至固相支持体。
26.权利要求25所述的标记的多核苷酸，其中所述固相支持体是可控孔度玻璃珠、聚苯乙烯珠、磁珠或微孔板。
27.一种用于制备配体的标记的缀合物的方法，其包括在合适的溶剂中，在足以将化合物共价连接至配体的条件下，使配体与权利要求1-22中任一项的化合物接触，从而形成标记的缀合物；其中Y是OP(OCH2CH2CN)NR10R11并且R10和R11独立地是任选取代的C1-C6烷基。
28.权利要求27所述的方法，其中所述配体是多核苷酸或固相支持体。
29.权利要求27所述的方法，其中所述配体是多核苷酸。
30.权利要求27所述的方法，其中所述足以将化合物共价连接至配体的条件是自动化的亚磷酰胺寡核苷酸合成条件。
31.一种试剂盒，其包括权利要求23或权利要求24的标记的多核苷酸。
32.权利要求31所述的试剂盒，其中所述试剂盒是PCR诊断试剂盒。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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