CN112533998B - 磺酰罗丹明亚磷酰胺染料 - Google Patents
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Abstract
提供了与自动化的寡核苷酸合成相容的磺酰罗丹明染料亚磷酰胺化合物和掺入这些染料的标记的多核苷酸。
Description
本发明提供了用作与自动化的寡核苷酸合成相容的红色染料的新颖的磺酰罗丹明染料亚磷酰胺化合物。
荧光染料是用于修饰寡核苷酸的最常用的标签之一,因为它们在从PCR到测序的广泛应用中提供灵敏的检测。罗丹明染料被广泛用于寡核苷酸标记,因为它们提供比其他染料,如荧光素更长的波长发射最大值,并且为多色标记和染色提供了机会。此外,罗丹明比荧光素和香豆素表现出更高的光稳定性。
荧光染料标记的多核苷酸的制备通常通过合成后的缀合,例如通过使活化的染料中间体与多核苷酸的氨基衍生物反应来完成。这种方法具有某些缺点,包括低的缀合产率和对缀合产物的额外纯化的需要。通过自动化的亚磷酰胺合成将荧光染料掺入合成的多核苷酸提供了一种更方便的方法。然而,很少有允许将荧光染料作为自动化的固相合成的一部分添加至多核苷酸的荧光染料的亚磷酰胺衍生物是可商购的。
流行的寡核苷酸标记染料的一个实例是磺酰罗丹明101磺酰氯(Texas染料)。但是,Texas/>染料只能通过合成后偶联被引入寡核苷酸,因为尚无已知的Texas染料的亚磷酰胺衍生物。由于Texas/>染料是不稳定的,因此与羧基罗丹明染料(如5-TAMRA,SE)相比,它的偶联收率要低得多,这会增加与制备Texas/>标记的寡核苷酸相关的成本。
要成为用于自动化的寡核苷酸合成的Texas染料的可行替代品,荧光团应具有接近Texas/>染料的光谱特征。这样的荧光团应对标准寡核苷酸合成条件(例如,碘处理、封端和酸脱保护条件)稳定,并可以在寡核苷酸中的任何位置掺入。此外,对于PCR应用而言,这样的荧光团的亮度应对生物学相关pH范围的变化不敏感,并且需要充分淬灭染料以产生高终点荧光(EPF),该终点荧光以淬灭探针和裂解探针或未淬灭探针(例如,杂交探针)的荧光之间的差异来测量。
与寡核苷酸合成相容的Texas染料的先前已知的替代品具有某些缺点。例如,CAL/>610染料是一种亚磷酰胺,其在可见光谱的橙-红色区域发出荧光,可用于荧光探针的5'标记,所述荧光探针如用于5'核酸酶检测、分子信标和类似的检测分析的探针。但是,这种染料不含有受保护的羟基,因此只能添加到寡核苷酸的5'末端,限制了其应用。另一类染料/>包括一种高荧光的红色染料,其在593nm处具有吸收最大值,在613nm处具有发射最大值。但是,由于其结构限制,这种染料只能掺入寡核苷酸的5'端或3'端。
因此,仍然需要与自动化的亚磷酰胺寡核苷酸合成的条件相容,可以掺入到多核苷酸的任何位置,具有与现有PCR仪器兼容的发射和吸收最大值,并在PCR应用中提供高终点荧光信号的红色荧光染料。
概述
一方面,本文提供了一种具有式I表示的结构的化合物:
或其立体异构体、互变异构体或盐,其中:
R1是C1-C6烷基或L1-X;
R2是卤素或SO2NH2,
R3是H或卤素;
当单独存在时,R4、R7、R8和R11独立地是H、卤素、或任选取代的C1-C6烷基,
当单独存在时,R5、R6、R9和R10独立地是H或任选取代的C1-C6烷基;
当合在一起时,R4和R5是连接R4和R5所结合的原子的任选取代的C2-C3亚烷基链;
当合在一起时,R6和R7是连接R6和R7所结合的原子的任选取代的C2-C3亚烷基链;
当合在一起时,R8和R9是连接R8和R9所结合的原子的任选取代的C2-C3亚烷基链;
当合在一起时,R10和R11是连接R10和R11所结合的原子的任选取代的C2-C3亚烷基链;
当R5和R6与R5和R6所结合的氮原子合在一起时,形成5元或6元不饱和环;
当R9和R10与R9和R10所结合的氮原子合在一起时,形成5元或6元不饱和环;
L1是任选取代的C2-C10亚烷基或任选取代的C2-C20杂亚烷基;
X是活化的酯、N3、丙炔基、马来酰亚胺基、或-O-P(OCH2CH2CN)NR12R13,或X是:
L3和L4独立地是任选取代的C2-C10亚烷基或任选取代的C2-C30杂亚烷基;
Q是羟基保护基;
Z是CH、N、NHC(O)N或OC(O)N;和
R12和R13独立地是任选取代的C1-C6烷基。
在一些实施方案中,R2是Cl并且R3是H。在一些实施方案中,X是-OP(OCH2CH2CN)N(i-Pr)2。在一些实施方案中,L1是PEG2-10连接基团。在某些实施方案中,L1是-CH2CH2OCH2CH2-。
在一些实施方案中,R4和R5合在一起是连接R4和R5所结合的原子的任选取代的C3亚烷基链;R10和R11合在一起是连接R10和R11所结合的原子的任选取代的C3亚烷基链;R6和R7合在一起是连接R6和R7所结合的原子的任选取代的C3亚烷基链;并且R8和R9合在一起是连接R8和R9所结合的原子的任选取代的C3亚烷基链。在一些实施方案中,R4和R5合在一起是连接R4和R5所结合的原子的亚丙基链;R10和R11合在一起是连接R10和R11所结合的原子的亚丙基链;R6和R7合在一起是连接R6和R7所结合的原子的亚丙基链;并且R8和R9合在一起是连接R8和R9所结合的原子的亚丙基链。在一些实施方案中,R5、R6、R9和R10各自是甲基。
在一些实施方案中,Q是酸不稳定的羟基保护基。在一些实施方案中,Q是三苯甲基或二甲氧基三苯甲基。
在一些实施方案中,C2-C6亚烷基或-(OCH2CH2)m-,其中m是2至6的整数。在一些实施方案中,L3和L4是-CH2CH2-。在一些实施方案中,X是:
在一些实施方案中,所述化合物具有式IA表示的结构:
或其立体异构体、互变异构体或其盐,其中R1是L1X并且R3是H或卤素。在一些实施方案中,X是-OP(OCH2CH2CN)N(i-Pr)2。
在一些实施方案中,所述化合物是:
第二方面,本文提供了一种式II表示的化合物:
或其立体异构体、互变异构体或盐,其中:
R1是C1-C6烷基;
R2是H、卤素或SO2NH2,
R3是H或卤素;
当单独存在时,R14和R16独立地是H、卤素、或任选取代的C1-C6烷基,
当单独存在时,R15和R17独立地是H或任选取代的C1-C6烷基;
当合在一起时,R14和R15形成连接R14和R15所结合的原子的任选取代的C2-C3亚烷基链;
当合在一起时,R16和R17形成连接R16和R17所结合的原子的任选取代的C2-C3亚烷基链;
Q是羟基保护基;和
L1和L2独立地是任选取代的C2-C10亚烷基或任选取代的C2-C20杂亚烷基。
在一些实施方案中,R3是H。在一些实施方案中,R2是H。在一些实施方案中,R2是Cl。
在一些实施方案中,所述化合物由式(IIA)表示:
或其立体异构体、互变异构体或盐,其中:
R1是C1-C6烷基;
R2是H、卤素或SO2NH2;和
R3是H或卤素。
在一些实施方案中,所述化合物是:
第三方面,本文提供了一种具有式(III)结构的化合物:
或其立体异构体、互变异构体或盐,其中:
R2是H、卤素或SO2NH2;
R3是卤素或H;
当单独存在时,R4、R7、R8和R11独立地是H、卤素、或任选取代的C1-C6烷基,
当单独存在时,R5、R6、R9和R10独立地是H或任选取代的C1-C6烷基;
当合在一起时,R4和R5是连接R4和R5所结合的原子的任选取代的C2-C3亚烷基链;
当合在一起时,R6和R7是连接R6和R7所结合的原子的任选取代的C2-C3亚烷基链;
当合在一起时,R8和R9是连接R8和R9所结合的原子的任选取代的C2-C3亚烷基链;
当合在一起时,R10和R11是连接R10和R11所结合的原子的任选取代的C2-C3亚烷基链;
当R5和R6与R5和R6所结合的氮原子合在一起时,形成5元或6元不饱和环;
当R9和R10与R9和R10所结合的氮原子合在一起时,形成5元或6元不饱和环;
n是1至9的整数;
Y是:
其中:
Q是羟基保护基;和
R12和R13独立地是任选取代的C1-C6烷基。
在一些实施方案中,R2是Cl,并且R3是H。
在一些实施方案中,R4和R5合在一起是连接R4和R5所结合的原子的任选取代的C3亚烷基链;R10和R11合在一起是连接R10和R11所结合的原子的任选取代的C3亚烷基链;R6和R7合在一起是连接R6和R7所结合的原子的任选取代的C3亚烷基链;并且R8和R9合在一起是连接R8和R9所结合的原子的任选取代的C3亚烷基链。在一些实施方案中,R4和R5合在一起是连接R4和R5所结合的原子的亚丙基链;R10和R11合在一起是连接R10和R11所结合的原子的亚丙基链;R6和R7合在一起是连接R6和R7所结合的原子的亚丙基链;并且R8和R9合在一起是连接R8和R9所结合的原子的亚丙基链。
在一些实施方案中,Q是酸不稳定的羟基保护基。在一些实施方案中,Q是三苯甲基或二甲氧基三苯甲基。在其他实施方案中,R12和R13各自是异丙基。
在一些实施方案中,所述化合物是:
第四方面,本文提供了一种式VI表示的化合物:
或其立体异构体、互变异构体或盐,其中:
R1是L1-X;
R2、R3、R4和R5独立地是H、卤素、C1-C6烷基或SO2NH2;
R6和R9独立地是H或任选取代的C1-C6烷基;
R7、R8、R10、R11、R14和R15独立地是H或任选取代的C1-C6烷基;
L1是任选取代的C2-C10亚烷基或任选取代的C2-C20杂亚烷基;
X是活化的酯、N3、丙炔基、马来酰亚胺基、或–O-P(OCH2CH2CN)NR12R13,或X是:
其中
L3和L4独立地是任选取代的C2-C10亚烷基或任选取代的C2-C30杂亚烷基;
Q是羟基保护基;
Z是CH、N、NHC(O)N或OC(O)N;和
R12和R13独立地是任选取代的C1-C6烷基。
在一些式VI的实施方案中,R7、R8、R10、R11、R14和R15是甲基。在某些实施方案中,X是-OP(OCH2CH2CN)N(i-Pr)2。在一些实施方案中,L1是PEG2-10连接基团,在其他实施方案中,L1是-CH2CH2OCH2CH2-。在某些实施方案中,R2、R3、R4和R5是H。
在一些实施方案中,R6是任选被OH或C1-C6酰氧基取代的C1-C6烷基,例如,R6是被OH或OAc取代的乙基。在一些实施方案中,R9是任选被OH或C1-C6酰氧基取代的C1-C6烷基,例如,R9是被OH或OAc取代的乙基。
在一些式VI的实施方案中,所述化合物是:
或其立体异构体、互变异构体或盐,其中:
R1、R2、R3、R4和R5如上针对式VI所描述;和
Q1和Q2独立地是H或C1-C6酰基。
在一些实施方案中,R2、R3、R4和R5是H。在一些实施方案中,Q1和Q2是乙酰基。
在一些式VI的实施方案中,所述化合物是:
其中R1如上针对式VI所定义。
在一些式VI的实施方案中,所述化合物是:
第五方面,本文提供了一种标记的多核苷酸,其包含式IV的化合物:
或其立体异构体、互变异构体或盐,其中:
R2是卤素或SO2NH2;
R3是H或卤素;
当单独存在时,R4、R7、R8和R11独立地是H、卤素、或任选取代的C1-C6烷基,
当单独存在时,R5、R6、R9和R10独立地是H或任选取代的C1-C6烷基;
当合在一起时,R4和R5是连接R4和R5所结合的原子的任选取代的C2-C3亚烷基链;
当合在一起时,R6和R7是连接R6和R7所结合的原子的任选取代的C2-C3亚烷基链;
当合在一起时,R8和R9是连接R8和R9所结合的原子的任选取代的C2-C3亚烷基链;
当合在一起时,R10和R11是连接R10和R11所结合的原子的任选取代的C2-C3亚烷基链;
当R5和R6与R5和R6所结合的氮原子合在一起时,形成5元或6元不饱和环;
当R9和R10与R9和R10所结合的氮原子合在一起时,形成5元或6元不饱和环;
n是1至9的整数;
Y是:
其中:
波浪线是结合至式III的点;
R12和R13独立地是任选取代的C1-C6烷基;
W是H或L4-O-Z2;
L3、L4和L5独立地是任选取代的C2-C10亚烷基或任选取代的C2-C30杂亚烷基;
Z是CH、N、NHC(O)N或OC(O)N;
Z1是核苷酸或寡核苷酸;和
Z2是核苷酸、寡核苷酸或H。
在一些实施方案中,R2是Cl,并且R3是H。在其他实施方案中,R4和R5是连接R4和R5所结合的原子的任选取代的C3亚烷基链;R10和R11是连接R10和R11所结合的原子的任选取代的C3亚烷基链;R6和R7是连接R6和R7所结合的原子的任选取代的C3亚烷基链;并且R8和R9是连接R8和R9所结合的原子的任选取代的C3亚烷基链。
在一些实施方案中,所述标记的多核苷酸是5'-核酸酶PCR探针。在一些实施方案中,所述标记的多核苷酸还包含荧光淬灭剂。在一些实施方案中,所述标记的多核苷酸结合到固体支持物。在一些实施方案中,所述固体支持物是受控的孔玻璃珠、聚苯乙烯珠、磁珠或微孔板。
第五方面,本文提供了一种用于制备配体的标记的缀合物的方法,所述方法包括在足以使本文公开的化合物共价结合到所述配体从而形成所述标记的缀合物的条件下,在适当的溶剂中使所述配体与所述化合物接触。
在一些实施方案中,所述配体是多核苷酸、蛋白质、肽、多糖、具有烯键骨架的聚合物或固体支持物。在一些实施方案中,所述配体是多核苷酸。在其他实施方案中,所述足以使所述化合物共价结合到所述配体的条件是自动化的亚磷酰胺寡核苷酸合成条件。
附图描述
当结合附图时,本发明的前述方面和许多附带的优点将变得更加容易理解,因为通过参考以下的详细描述,可以更好地理解相同的内容,其中:
图1A是用Texas染料:(Tx Red)-TCAGAGTACCTGAAACA标记的示例性多核苷酸SEQ ID NO:1的激发和发射光谱;(Oligo A)Ex/Em最大值=598nm/616nm。在该图中,x轴为nm,y轴为荧光单位。
图1B是用染料S7:(S7)-TCAGAGTACCTGAAACA(Oligo B)标记的示例性多核苷酸SEQID NO:1的激发和发射光谱;Ex/Em=598nm/616nm。在该图中,x轴为nm,y轴为荧光单位。
图1C描绘了用磺酰罗丹明染料S6:(S6)-TCAGAGTACCTGAAACA(Oligo C)标记的示例性多核苷酸SEQ ID NO:1的激发和发射光谱;Ex/Em最大值=568/589nm。在该图中,x轴为nm,y轴为荧光单位。
图1D描绘了用磺酰罗丹明染料S10a 5'标记的示例性多核苷酸SEQ ID NO:1的激发和发射光谱;Ex/Em最大值=568/587nm。
图2A显示比较在使用引物SEQ ID NO:4和5的模型PCR反应中,具有用Texas染料(Oligo D)标记的SEQ ID NO:2的探针和具有用示例性染料(Oligo E)标记的SEQ IDNO:2的探针的性能的PCR曲线。在该图中,x轴是Ct,y轴是荧光单位。
图2B显示比较在使用引物SEQ ID NO:6和7的模型PCR反应中,具有用Texas染料(Oligo F)标记的SEQ ID NO:3的Texas/>染料标记的探针和具有用示例性染料(Oligo G)标记的SEQ ID NO:3的探针的性能的PCR曲线。在该图中,x轴是Ct,y轴是荧光单位。
图3A和3B是用外消旋的示例性化合物S10(3A)及其异构体S10a(3B)标记的示例性寡核苷酸的HPLC迹线。在该图中,x轴为分钟,y轴为260nm处的吸光度。
详细描述
本文提供了磺酰罗丹明染料亚磷酰胺,其可以通过标准的自动化的寡核苷酸合成掺入寡核苷酸中。另外,提供了包含其他反应性基团的磺酰罗丹明染料。
在整个说明书和所附权利要求书中,词语“包含(comprise)”和“包括(include)”及其变体,如“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”和“包括(including)”,旨在上下文允许的情况下传达可能包括的未特别说明的其他要素或整数。如本文所用,术语“由……组成”旨在表示包括并且限于短语“由……组成”之后的任何内容。因此,短语“由...组成”表示所列出的元素是必需或强制性的,并且不会存在其他元素。术语“基本上由……组成”是指所述组合物、方法或结构可以包括另外的成分、步骤和/或部分,但前提是另外的成分、步骤和/或部分不会实质性改变所要求保护的组合物、方法或结构的基本和新颖的特征。
除非本文另外指出或与上下文明显矛盾,否则术语“一(a)”和“一(an)”以及“该(the)”和类似术语被解释为涵盖单数和复数。
除非本文另外指出或与上下文明显矛盾,否则本文描述的所有方法可以以任何合适的顺序进行。本文提供的任何和所有示例或示例性语言(例如,“如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明,并且不对以其他方式要求保护的本发明的范围构成限制。
本文公开的本发明的供选择的要素或实施方案的分组不应解释为限制。每个组成员可以单独引用和要求保护,或与该组的其他成员或本文找到的其他要素任意组合。预期出于方便和/或可专利性的原因,组中的一个或多个成员可以包括在组中或从中删除。当发生任何这样的包括或删除时,说明书在本文中视为含有经修饰的基团,从而满足所附权利要求中使用的所有马库什基团的书面描述。
除非另有说明,否则核酸或寡核苷酸以5'至3'的方向从左至右书写。
如本文所用,术语“扩增”是指通常以模板依赖性方式产生至少一种靶核酸的至少部分序列或其序列互补物的任何方式,包括但不限于用于线性或指数扩增核酸序列的广泛技术。非限制性示例性扩增方法包括聚合酶链反应(PCR)、逆转录酶PCR、实时PCR、巢式PCR、多重PCR、定量PCR(Q-PCR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链反应(LCR)、滚环扩增(RCA)、链置换扩增(SDA)、连接酶检测反应(LDR)、多重连接依赖性探针扩增(MLPA)、连接后Q复制酶扩增、引物延伸、链置换扩增(SDA)、超支链置换扩增、多置换扩增(MDA)、基于核酸链的扩增(NASBA)、两步多路扩增、数字扩增等。此类技术的说明可以在其他来源中找到,Ausubel等人;PCR Primer:A Laboratory Manual,Diffenbach编辑,Cold Spring Harbor Press(1995);The Electronic Protocol Book,Chang Bioscience(2002);The Nucleic Acid Protocols Handbook,R.Rapley,编辑,Humana Press,Totowa,N.J.(2002);和Innis等人,PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications,Academic Press(1990)。
如本文所用,术语“碱基”是指能够与互补的核苷酸碱基或核苷酸碱基类似物例如嘌呤、7-脱氮嘌呤或嘧啶形成氢键(例如Watson-Crick型氢键)的含氮杂环部分。典型的碱基是天然存在的碱基腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶。碱基还包括天然存在的碱基的类似物,如脱氮腺嘌呤、7-脱氮-8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮-8-氮杂鸟嘌呤、肌苷、水粉蕈素、硝基吡咯、硝基吲哚、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、次黄嘌呤、5-甲基胞嘧啶、异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氯-6-氨基嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤等。
如本文所用,术语“互补的”是指多核苷酸序列彼此杂交并从碱基对杂交的能力。碱基对通常由反平行多核苷酸链中核苷酸单元之间的氢键形成。互补的多核苷酸链可以以Watson-Crick方式(例如,A至T,A至U,C至G)或以允许形成双链体的任何其他方式碱基配对。探针序列与靶序列的“互补性”百分比是探针序列与靶序列或与靶序列的互补序列的“同一性”百分比。在确定探针与靶序列之间的“互补性”程度时,“互补性”程度表示为探针序列与靶序列的序列或与之最匹配的靶序列的互补序列之间的百分比同一性。示例性探针是本文描述的多核苷酸。
如本文所用,术语“双链体”是指通过退火(杂交)互补(或部分互补)单链多核苷酸,例如DNA、RNA、LNA或肽核酸(PNA)而形成的双链杂交复合体。
如本文所用,“荧光淬灭”是指降低荧光样品即荧光多核苷酸探针的荧光强度的任何过程。多种分子相互作用可导致淬灭。非限制性实例包括激发态反应、分子重排、能量转移、基态复合体形成和碰撞淬灭。
如本文所用,“卤素”是指F、Cl、Br或I。
本文中使用的术语“杂交(hybridize)”和“杂交(hybridization)”是指“特异性杂交”,在一些实施方案中,在严格条件下,其是优先于特定核苷酸序列的核酸分子的结合、形成双链体或退火。术语“严格条件”是指探针将优先于其靶序列杂交的条件,而在较小程度上与其他序列杂交或根本不杂交。在核酸杂交的上下文中,“严格杂交”和“严格杂交洗涤条件”是序列依赖性的,并且在不同的环境参数下是不同的。在例如Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridizationwith Nucleic Acid Probes第I部分,第二章,"Overview of principles ofhybridization and the strategy of nucleic acid probe assays,"Elsevier,NY中找到大量的核酸杂交指南。多核苷酸与靶序列的杂交程度,也称为杂交强度,是通过本领域众所周知的方法确定的。一种优选的方法是确定给定杂交双链体的Tm。这可以通过使形成的双链体在溶液中经受逐渐升高温度并监测双链体的变性来实现,例如通过紫外线的吸收,其随变性伴随的碱基对的解叠而增加。Tm通常定义为一半DNA链处于单链(ssDNA)状态的温度。Tm取决于各种参数,如杂交的互补链序列的长度、其特异性核苷酸序列、碱基组成、碱基修饰和互补链的浓度。
如本文所用,术语“标记”和“可检测标记”可互换使用,并且是指当结合到生物分子、核苷、核苷酸或多核苷酸时,使得这种生物分子、核苷、核苷酸或多核苷酸可通过合适的检测手段检测的部分。示例性标记包括荧光团、发色团、放射性同位素、自旋标记、酶标记、化学发光标记、电化学发光化合物、磁性标记、微球、胶体金属、免疫标记、配体、酶等。
如本文所用,术语“修饰的核苷酸碱基”或“修饰的碱基”是指不具有天然存在的碱基的结构并且因此是非天然存在的碱基。如本文所用,术语“修饰的糖”是指不具有天然存在的糖的结构的糖或糖类似物,例如核糖或脱氧核糖,因此是非天然存在的。
如本文所用,在核酸分子的上下文中,术语“天然存在的”是指具有天然存在的核苷酸序列并且仅包含天然存在的组分(如碱基、糖、核苷和核苷酸)的RNA或DNA分子(单链或双链)。
如本文所用,术语“核苷”是指由本文所提及类型的含氮碱基组成的分子,其通过β-糖苷键与本文所提及类型的糖,例如核糖或脱氧核糖结合。核苷的实例包括腺苷、胞苷、鸟苷、胸苷、尿苷和肌苷。
如本文所用,术语“核苷酸”是指作为独立单体或作为多核苷酸内的亚单位的核苷的磷酸酯。核苷酸单体包括例如核苷酸5'-单磷酸酯、5'-二磷酸酯、5'-三磷酸酯和3'-单磷酸酯。核苷酸三磷酸酯有时表示为“NTP”,“dNTP”(2'-脱氧戊糖)或“ddNTP”(2',3'-二脱氧戊糖),以特别指出核糖的结构特征。“核苷酸5'-三磷酸酯”是指在5'位置具有三磷酸酯基团的核苷酸。三磷酸酯基可包括一个或多个磷酸酯氧原子的硫取代,例如α-硫核苷酸5'-三磷酸酯。核苷酸单磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯可以用作核酸加工酶的底物,所述酶催化核酸或核酸中间体的修饰。
如本文所用,术语“寡核苷酸”广泛地指主要或完全由约2至约300个天然存在或修饰的核苷酸单体单元组成的单链,例如被A、C、G、T或U碱基取代的脱氧核糖或核糖糖环,并通过常规的磷酸酯骨架部分连接。更具体地,该术语是指在上述大小范围内的脱氧核糖核苷酸的单链。在一些实施方案中,寡核苷酸可包含一种或多种修饰的碱基和/或糖。除核苷酸单体单元外,寡核苷酸可掺入一种或多种可检测的标记和/或一种或多种反应性基团。
如本文所用,术语“多种”是指多于一种。
如本文所用,术语“多核苷酸”通常是指包含约10至约300个核苷酸单体单元的寡核苷酸。除核苷酸单体单元外,多核苷酸可掺入一种或多种可检测的标记和/或一种或多种反应性基团。
如本文所用,术语“引物”是指有效作为合成与靶核酸链互补的多核苷酸链的起点的多核苷酸或修饰的多核苷酸。例如,用于PCR的引物包括正向和反向引物,其中正向引物含有与靶核酸链的区域互补的序列并引导互补链的合成。反向引物含有与反向链互补的序列,并引导沿着靶核酸链的反向链的合成。
如本文所用,术语“探针”是指标记的寡核苷酸或标记的修饰的寡核苷酸,其含有与靶核酸序列的区域互补的序列,使探针与靶序列形成双链体并产生指示靶序列区域的存在的可检测信号。在杂交期间或之后,直接或间接产生可检测的信号。在某些应用中,如在5'-核酸酶PCR的引物延伸中,探针缺少可延伸的3'羟基以防止聚合酶介导的探针延伸。在某些实施方案中,探针包括探针,TaqMan />探针,/>探针,分子信标(例如,在Tyagi,Sanjay&Kramer,Fred.(2012)Matical Beacons inDiagnostics.F1000medical report.4.10 10.3410/M4-10中公开的那些)等。
如本文所用,术语“保护基(protecting group)”、“保护基(protective group)”或“被保护的形式”是指官能团(例如羟基)的不稳定的化学修饰,意在保留其功能和/或在随后的化学反应中获得化学选择性。通过脱保护处理(例如,用酸处理)从最终产物中除去保护基。
如本文所用,术语“固体支持物”是指任何不溶性材料,包括颗粒(例如,珠)、纤维、整料、膜、过滤器、塑料条、阵列、微孔板等。在一些实施方案中,固体支持物是适合于自动化的亚磷酰胺寡核苷酸合成的固体支持物,如聚苯乙烯和受控的孔玻璃(CPG)。
磺酰罗丹明染料及其亚磷酰胺
一方面,本文提供了包含一种或多种反应性基团,例如亚磷酰胺基团的磺酰罗丹明染料。
在某些实施方案中,本文公开的染料包含磺内酰胺(sultam)部分。在一些实施方案中,本文公开的染料可以以开放或封闭的形式存在,如以下一种示例性化合物所示:
“封闭”(螺环)形式“开放”形式。
在其环状或“封闭”形式下,本发明的磺酰罗丹明染料及其亚磷酰胺是无色且无荧光的。然而,在质子化时,例如暴露于酸性条件下,环状形式可以转化为有荧光的“开放”形式。如本文所用,当提及本文所公开的染料时,即使仅开放形式是有荧光的,术语“磺酰罗丹明染料”也包括开放荧光形式和它们相应的封闭形式。
这种与衍生自磺酰罗丹明染料的磺内酰胺的可逆的开到关,pH依赖的相互转化有关的由有色至无色过渡的现象是本领域已知的(参见例如Corrie J.E.T.和MunasingheV.R.Dyes and Pigments 79(2008):76-82)。用于标记生物分子的磺酰罗丹明染料的某些反应性衍生物,如磺酰罗丹明B氯化物,通常可以从商业供应者处以两种磺酰氯异构体(邻位异构体和对位异构体)的混合物获得,但只有其磺酰氯邻位于呫吨鎓体系的异构体才能形成经历上面显示的环-链过程的环状磺酰胺(磺内酰胺)化合物。因此,据报道,此类染料的邻位异构体通常对于生物学应用而言是不期望的,因为邻位异构体的荧光是pH依赖性的(参见例如Corrie J.E.T.等人.Bioconjugate Chem.12(2001):186-194)。令人惊讶地,发明人发现,与本领域中公开的染料的缀合物不同,本发明的染料的多核苷酸缀合物具有在与PCR应用有关的pH范围(例如,约6.5至约8.5)中不依赖pH的荧光,并可以用常规淬灭剂(如BHQ-2淬灭剂(Biosearch))很好地淬灭以产生高终点荧光(EPF)。如本文所用,终点荧光是淬灭的探针和裂解的探针的荧光之间的差异或淬灭的探针和杂交的探针的荧光之间的差异。
在某些实施方案中,本文公开的磺酰罗丹明染料的“开放”形式令人惊奇地具有与磺酰罗丹明101染料或TAMRA染料的光谱特性相当或匹配的光谱特性,如发射和吸收最大值。但是,与包含极性磺酸基团的磺酰罗丹明101型染料不同,并且因此不能以亚磷酰胺试剂的形式制备,本文公开的磺酰罗丹明染料在其封闭(磺内酰胺)形式是非极性的,并易溶于与自动化的亚磷酰胺合成和/或生物缀合条件相容的有机溶剂中。本文公开的染料的这种有利性质还允许通过常规实验室技术如硅胶柱色谱法容易地纯化。
在一些实施方案中,所述染料具有式I表示的结构:
或其立体异构体、互变异构体或盐,其中:
R1是C1-C6烷基或L1-X;
R2是卤素或SO2NH2,
R3是H或卤素;
当单独存在时,R4、R7、R8和R11独立地是H、卤素、或任选取代的C1-C6烷基,
当单独存在时,R5、R6、R9和R10独立地是H或任选取代的C1-C6烷基;
当合在一起时,R4和R5是连接R4和R5所结合的原子的任选取代的C2-C3亚烷基链;
当合在一起时,R6和R7是连接R6和R7所结合的原子的任选取代的C2-C3亚烷基链;
当合在一起时,R8和R9是连接R8和R9所结合的原子的任选取代的C2-C3亚烷基链;
当合在一起时,R10和R11是连接R10和R11所结合的原子的任选取代的C2-C3亚烷基链;
当R5和R6与R5和R6所结合的氮原子合在一起时,形成5元或6元不饱和环;
当R9和R10与R9和R10所结合的氮原子合在一起时,形成5元或6元不饱和环;
L1是任选取代的C2-C10亚烷基或任选取代的C2-C20杂亚烷基;
X是活化的酯、N3、丙炔基、马来酰亚胺基、或-O-P(OCH2CH2CN)NR12R13,或X是:
L3和L4独立地是任选取代的C2-C10亚烷基或任选取代的C2-C30杂亚烷基;
Q是羟基保护基;
Z是CH、N、NHC(O)N或OC(O)N;和
R12和R13独立地是任选取代的C1-C6烷基。
在一些实施方案中,式I包含一个反应性基团。在其他实施方案中,式I包含两个正交反应性基团。在其他实施方案中,除了反应性基团如亚磷酰胺基,式I还包含被酸不稳定的保护基团如三苯甲基或二甲氧基三苯甲基保护的羟基。
在一些式I的实施方案中,R2是Cl并且R3是H。在其他实施方案中,R4和R5形成连接R4和R5所结合的原子的任选取代的C3亚烷基链;R11和R10形成连接R11和R10所结合的原子的任选取代的C3亚烷基链;R6和R7形成连接R6和R7所结合的原子的任选取代的C3亚烷基链;并且R8和R9形成连接R8和R9所结合的原子的任选取代的C3亚烷基链。在一些实施方案中,R1是L1X。在其他实施方案中,R1是甲基或乙基。在一些实施方案中,C3亚烷基是亚丙基。
当反应性部分是亚磷酰胺时,X是OP(OCH2CH2CN)N(i-Pr)2。L1可以包含一个或多个选自N、O、S、P及其组合的杂原子。在一些实施方案中,L1是PEG2-10连接基团。在其他实施方案中,L1是-CH2CH2OCH2CH2-。
在某些实施方案中,R5、R6、R9和R10是C1-C3烷基,例如甲基。
在一些实施方案中,L3和L4独立地是C2-C6亚烷基或-(OCH2CH2)m-,其中m是2至6的整数。在其他实施方案中,L3和L4是-CH2CH2-。
在某些实施方案中,X是:
在本文所示的式中,Q表示羟基保护基。这样的保护基的实例是本领域已知的(参见,例如,Peter G.M.Wuts,Greene's protective groups in organic synthesis(2006))。合适的羟基保护基包括碱不稳定和酸不稳定的基团。在一些实施方案中,Q为与自动化的亚磷酰胺寡核苷酸合成条件相容的羟基保护基,如三苯甲基或二甲氧基三苯甲基。
包含其他反应性部分或基团的磺酰罗丹明染料也在本发明的范围内;例如,可以与伯胺形成化学键的反应性基团。这些包括异硫氰酸酯、异氰酸酯、酰基叠氮化物、NHS酯、磺酰氯、醛、乙二醛、环氧化物、环氧乙烷、碳酸盐、芳基卤化物、亚氨酸酯、碳二亚胺、酸酐、硝基苯基酯和氟苯基酯。优选地,反应性基团是活化的酯。如本文所用,“活化的酯”是可以与氨基反应形成酰胺的羧酸的酯。活化的酯包括N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯、五氟苯基酯、四氟苯基酯和对硝基苯基酯。本文还包括原位产生的活化的酯(例如,通过将活化剂如碳二亚胺添加到羧酸中)。
在一些实施方案中,所述磺酰罗丹明染料具有式IA表示的结构:
或其立体异构体、互变异构体或其盐,其中R1是L1X并且R3是H或卤素。在一些式IA的实施方案中,R1是CH2CH2OCH2CH2OP(OCH2CH2CN)N(i-Pr)2。
在一些实施方案中,所述磺酰罗丹明染料亚磷酰胺由式II表示:
其中:
R1是C1-C6烷基;
R2是H、卤素或SO2NH2,
R3是H或卤素;
单独存在时,R14和R16独立地是H、卤素、或任选取代的C1-C6烷基,
单独存在时,R15和R17独立地是H或任选取代的C1-C6烷基;
或合在一起时,R14和R15形成连接R14和R15所结合的原子的任选取代的C2-C3亚烷基链;
合在一起时,R16和R17形成连接R16和R17所结合的原子的任选取代的C2-C3亚烷基链;
Q是羟基保护基;和
L1和L2独立地是任选取代的C2-C10亚烷基或任选取代的C2-C20杂亚烷基。
在一些式II的实施方案中,R3是H。在其他实施方案中,R2是H。在又一些其他实施方案中,R2是Cl。
在其他实施方案中,R14和R15形成连接R14和R15所连接的原子的任选地被1、2或3个甲基取代的C2亚烷基链;在又一些其他实施方案中,R16和R17形成连接R16和R17所连接的原子的任选地被1、2或3个甲基取代的C2亚烷基链。在某些实施方案中,R14和R15形成被3个甲基取代的乙烯链,并且R16和R17形成被3个甲基取代的乙烯链。在某些实施方案中,R14和R15合在一起并且R16和R17合在一起是:
其中*表示结合至氮原子的点,**表示与结合至芳族碳原子的点。
在某些实施方案中,所述化合物由式(IIA)表示:
或其立体异构体、互变异构体或盐。
在特定的实施方案中,所述化合物是:
在一些实施方案中,所述磺酰罗丹明染料亚磷酰胺是式(III)表示的化合物:
或其立体异构体、互变异构体或盐,其中:
R2是H、卤素或SO2NH2;
R3是卤素或H;
当单独存在时,R4、R7、R8和R11独立地是H、卤素、或任选取代的C1-C6烷基,
当单独存在时,R5、R6、R9和R10独立地是H或任选取代的C1-C6烷基;
当合在一起时,R4和R5是连接R4和R5所结合的原子的任选取代的C2-C3亚烷基链;
当合在一起时,R6和R7是连接R6和R7所结合的原子的任选取代的C2-C3亚烷基链;
当合在一起时,R8和R9是连接R8和R9所结合的原子的任选取代的C2-C3亚烷基链;
当合在一起时,R10和R11是连接R10和R11所结合的原子的任选取代的C2-C3亚烷基链;
当R5和R6与R5和R6所结合的氮原子合在一起时,形成5元或6元不饱和环;
当R9和R10与R9和R10所结合的氮原子合在一起时,形成5元或6元不饱和环;
n是1至9的整数;
Y是:
其中:
Q是羟基保护基;和
R12和R13独立地是任选取代的C1-C6烷基。
在某些实施方案中,R2是Cl,并且R3是H。在一些实施方案中,R4和R5形成连接其各自所结合的原子的任选取代的C3亚烷基链;R11和R10形成连接其各自所结合的原子的任选取代的C3亚烷基链;R6和R7形成连接其各自所结合的原子的任选取代的C3亚烷基链;并且R8和R9形成连接其各自所结合的原子的任选取代的C3亚烷基链。
在某些实施方案中,所述化合物是:
在一些实施方案中,所述磺酰罗丹明染料是式VI表示的化合物:
或其立体异构体、互变异构体或盐,其中:
R1是L1-X;
R2、R3、R4和R5独立地是H、卤素、C1-C6烷基或SO2NH2;
R6和R9独立地是H或任选取代的C1-C6烷基;
R7、R8、R10、R11、R14和R15独立地是H或任选取代的C1-C6烷基;
L1是任选取代的C2-C10亚烷基或任选取代的C2-C20杂亚烷基;
X是活化的酯、N3、丙炔基、马来酰亚胺基、或–O-P(OCH2CH2CN)NR12R13,或X是:
其中L3和L4独立地是任选取代的C2-C10亚烷基或任选取代的C2-C30杂亚烷基;
Q是羟基保护基;
Z是CH、N、NHC(O)N或OC(O)N;和
R12和R13独立地是任选取代的C1-C6烷基。
在一些式VI的实施方案中,R7、R8、R10、R11、R14和R15是甲基。在某些式VI的实施方案中,X是-OP(OCH2CH2CN)N(i-Pr)2。
在一些式VI的实施方案中,L1是PEG2-10连接基团。在其他式VI的实施方案中,L1是-CH2CH2OCH2CH2-。
在某些式VI的实施方案中,R2、R3、R4和R5是H。在特定的式VI的实施方案中,R6是任选被OH或C1-C6酰氧基取代的C1-C6烷基。在某些式VI的实施方案中,R9是任选被OH或C1-C6酰氧基取代的C1-C6烷基。
在某些式VI的实施方案中,R6是被OH或OAc取代的乙基。在一些式VI的实施方案中,R9是被OH或OAc取代的乙基。
在一些式VI的实施方案中,所述化合物是:
或其立体异构体、互变异构体或盐,其中:
R1、R2、R3、R4和R5如针对式VI的化合物所描述;和
Q1和Q2独立地是H或C1-C6酰基。
在一些实施方案中,所述化合物是:
其中R1如针对式VI的化合物所定义。
在特定的实施方案中,所述化合物是:
如本文所用,术语“烷基”、“烯基”和“炔基”包括直链、支链和环状单价烃基基团以及它们的组合,当它们未被取代时仅包含C和H。实例包括甲基、乙基、异丁基、环己基、环戊基乙基、2-丙烯基、3-丁炔基等。在本文中有时描述每个这样的基团中的碳原子总数,例如,当该基团可以含有多达十个碳原子时,其可以表示为1-10C,表示为C1-C10、C-C10或C1-10。
本文所用的术语“杂烷基”、“杂烯基”和“杂炔基”是指其中一个或多个链碳原子已被杂原子取代的相应的烃。示例性的杂原子包括N、O、S和P。当允许杂原子取代碳原子时,例如在杂烷基中,描述该基团的数字尽管仍写为例如C3-C10,但代表环或链中碳原子数与所包括的作为所描述的环或链中碳原子替代物的此类杂原子数之和。
通常,烷基、烯基和炔基取代基含有1-10个碳原子(烷基)或2-10个碳原子(烯基或炔基)。优选地,它们含有1-8个碳原子(烷基)或2-8个碳原子(烯基或炔基)。有时它们被称为“低级烷基”,意味着它们含有1-6个碳原子(烷基)或2-6个碳原子(烯基或炔基)。单个基团可包含多于一种类型的多重键,或多于一个的多重键;当这些基团含有至少一个碳-碳双键时,此类基团被包括在术语“烯基”的定义中,当它们含有至少一个碳-碳三键时,此类基团被包括在术语“炔基”中。
如本文所用,术语“亚烷基”、“亚烯基”和“亚炔基”包括直链、支链和环状二价烃基基团及其组合。
烷基、烯基和炔基可任选地被取代至这种取代在化学上有意义的程度。典型的取代基包括但不限于卤素(F、Cl、Br、I)、=O、=N-CN、=N-OR、=NR、OR、NR2、SR、SO2R、SO2NR2、NRSO2R、NRCONR2、NRC(O)OR、NRC(O)R、CN、C(O)OR、C(O)NR2、OC(O)R、C(O)R和NO2,其中每个R独立地是H、C1-C8烷基、C2-C8杂烷基、C1-C8酰基、C2-C8杂酰基、C2-C8烯基、C2-C8杂烯基、C2-C8炔基、C2-C8杂炔基、C6-C10芳基、或C5-C10杂芳基,并且每个R任选地被卤素(F、Cl、Br、I)、=O、=N-CN、=N-OR'、=NR'、OR'、NR'2、SR'、SO2R'、SO2NR'2、NR'SO2R'、NR'CONR'2、NR'C(O)OR'、NR'C(O)R'、CN、C(O)OR'、C(O)NR'2、OC(O)R'、C(O)R'、和NO2取代,其中每个R'独立地是H、C1-C8烷基、C2-C8杂烷基、C1-C8酰基、C2-C8杂酰基、C6-C10芳基、或C5-C10杂芳基。烷基、烯基和炔基也可以被C1-C8酰基、C2-C8杂酰基、C6-C10芳基或C5-C10杂芳基取代,它们各自可以被适合于特定基团的取代基取代。
尽管本文所用的“烷基”包括环烷基和环烷基烷基基团,但是术语“环烷基”在本文中用于描述经由环碳原子连接的碳环非芳族基团,而“环烷基烷基”用于描述通过烷基连接基团与分子连接的碳环非芳族基团。类似地,“杂环基”用于鉴定含有至少一个作为环成员的杂原子并且通过环原子(其可以是C或N)与分子连接的非芳族环状基团;并且“杂环基烷基”可用于描述通过亚烷基连接基团与另一个分子连接的这种基团。如本文所用,这些术语还包括含有一个或两个双键的环,只要该环不是芳族的。
“芳族”或“芳基”取代基或部分是指具有众所周知的芳香性特征的单环或稠合双环部分;实例包括苯基和萘基。类似地,术语“杂芳族”和“杂芳基”是指这样的单环或稠合双环体系,其含有一个或多个杂原子作为环成员。合适的杂原子包括N、O和S,包括所述杂原子允许在5元环和6元环中具有芳香性。典型的杂芳族体系包括单环C5-C6芳族基团,如吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、噻吩基、呋喃基、吡咯基、吡唑基、噻唑基、恶唑基和咪唑基,以及通过将这些单环基团之一与苯环或与任意杂芳族单环基团稠合形成C8-C10双环基团而形成的稠合双环部分,所述C8-C10双环基团如吲哚基、苯并咪唑基、吲唑基、苯并三唑基、异喹啉基、喹啉基、苯并噻唑基、苯并呋喃基、吡唑并吡啶基、喹唑啉基、喹喔啉基、噌啉基等。在整个环体系中,就电子分布而言,具有芳香性特征的任何单环或稠环双环体系都包括在该定义中。它还包括双环基团,其中至少直接结合到分子其余部分的环具有芳香性特征。通常,环体系含有5-12个环成员原子。优选地,单环杂芳基含有5-6个环成员,双环杂芳基含有8-10个环成员。
芳基和杂芳基部分可以被各种取代基取代,包括C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C5-C12芳基、C1-C8酰基以及它们的杂化形式,其各自本身可以被进一步取代;芳基和杂芳基部分的其他取代基包括卤素(F、Cl、Br、I)、OR、NR2、SR、SO2R、SO2NR2、NRSO2R、NRCONR2、NRC(O)OR、NRC(O)R、CN、C(O)OR、C(O)NR2、OC(O)R、C(O)R和NO2,其中每个R独立地是H、C1-C8烷基、C2-C8杂烷基、C2-C8烯基、C2-C8杂烯基、C2-C8炔基、C2-C8杂炔基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C7-C12芳烷基、或C6-C12杂芳烷基,每个R任选地如上描述被烷基取代。芳基或杂芳基上的取代基当然可以进一步被本文所述的适用于这类取代基的每种类型或取代基的每种组分的基团取代。因此,例如,芳烷基取代基可以在芳基部分上被本文描述的针对芳基典型的取代基取代,并且它可以在烷基部分上被本文描述的针对烷基典型的或适合的取代基进一步取代。
如本文所用,“任选取代的”表示所描述的特定基团可以具有一个或多个被非氢取代基取代的氢取代基。在一些任选取代的基团或部分中,所有氢取代基均被非氢取代基取代,例如,C1-C6烷基、C2-C6杂烷基、炔基、卤素(F、Cl、Br、I)、N3、OR、NR2、SR、SO2R、SO2NR2、NRSO2R、NRCONR2、NRC(O)OR、NRC(O)R、CN、C(O)OR、C(O)NR2、OC(O)R、C(O)R、氧代和NO2,其中每个R独立地是H、C1-C6烷基、或C2-C6杂烷基。在任选的取代基通过双键结合的情况下,如羰基氧或氧代(=O),该基团占据两个可用化合价,因此,根据可用化合价的数量,可以包括的取代基总数减少。
本文公开的磺酰罗丹明化合物的盐、立体异构体和互变异构体,如式I、IA、II、IIA和III的化合物,也在本发明的范围内。如本文所用,“立体异构体(stereoisomer)”或“多个立体异构体(stereoisomers)”是指在一个或多个立体中心的手性上不同的化合物。立体异构体包括对映异构体和非对映异构体。如本文所用,“互变异构体”是指质子位置不同的化合物的替代形式,如烯醇-酮和亚胺-烯胺互变异构体。如本文所用,化合物的“盐”是指与抗衡离子离子缔合的化合物离子。化合物的盐可以通过酸与碱的中和反应形成。盐可以衍生自本领域众所周知的多种有机和无机抗衡离子,并且仅作为示例包括钠、钾、钙、镁、铵和四烷基铵;以及当分子含有碱性官能团时,有机或无机酸的盐,如盐酸盐、氢溴酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、马来酸盐和草酸盐。尽管本文公开的化合物的结构只能以一种共振形式显示,但应理解为包括所有共振形式。
本文公开的磺酰罗丹明化合物,例如式I、IA、II、IIA、III和VI的化合物的合成可以使用本领域已知的技术和方法以任何合适的方式实现。参见,例如,Beija M.等人,Chem.Soc.Rev.,(2009):38,2410–2433;Kreimerman等人,CurrentRadiopharmaceuticals,(2017):10,212-220;Corrie J.E.T.和Munasinghe V.R.Dyes andPigments 79(2008):76-82;Corrie J.E.T.等人.Bioconjugate Chem.12(2001):186-194。下文显示的实施例1-9说明了本发明的一些示例性化合物的合成。
标记的多核苷酸
在另一方面,本文提供了磺酰罗丹明染料标记的多核苷酸,该多核苷酸通过自动化的寡核苷酸合成从本文公开的亚磷酰胺磺酰罗丹明染料制备。如本文所用,“磺酰罗丹明染料标记的多核苷酸”是指由本文公开的亚磷酰胺磺酰罗丹明染料通过自动化的寡核苷酸合成制备的并掺入开放或封闭形式的磺酰罗丹明染料部分的多核苷酸。
在一些实施方案中,本文提供了一种包含式IV的化合物的标记的多核苷酸:
或其立体异构体、互变异构体或盐,其中:
R2是H、卤素或SO2NH2;
R3是H或卤素;
当单独存在时,R4、R7、R8和R11独立地是H、卤素、或任选取代的C1-C6烷基,
当单独存在时,R5、R6、R9和R10独立地是H或任选取代的C1-C6烷基;
当合在一起时,R4和R5是连接R4和R5所结合的原子的任选取代的C2-C3亚烷基链;
当合在一起时,R6和R7是连接R6和R7所结合的原子的任选取代的C2-C3亚烷基链;
当合在一起时,R8和R9是连接R8和R9所结合的原子的任选取代的C2-C3亚烷基链;
当合在一起时,R10和R11是连接R10和R11所结合的原子的任选取代的C2-C3亚烷基链;
当R5和R6与R5和R6所结合的氮原子合在一起时,形成5元或6元不饱和环;
当R9和R10与R9和R10所结合的氮原子合在一起时,形成5元或6元不饱和环;
n是1至9的整数;
Y是:
其中:
波浪线是结合至式IV的点;
L3、L4和L5独立地是任选取代的C2-C10亚烷基或任选取代的C2-C30杂亚烷基;
Z是CH、N、NHC(O)N或OC(O)N;
R12和R13独立地是任选取代的C1-C6烷基;
W是H或L4-O-Z2;
Z1是核苷酸或寡核苷酸;和
Z2是核苷酸、寡核苷酸或H。
在一些实施方案中,R4和R5形成连接其各自所结合的原子的任选取代的C3亚烷基链;R11和R10形成连接其各自所结合的原子的任选取代的C3亚烷基链;R6和R7形成连接其各自所结合的原子的任选取代的C3亚烷基链;并且R8和R9形成连接其各自所结合的原子的任选取代的C3亚烷基链。在某些实施方案中,R2是Cl,并且R3是H。
L3可以包含一个或多个选自N、O、S、P及其组合的杂原子。在式IV的一些实施方案中,L3为-(OCH2CH2)n-,其中n为1至5的整数。
在一些实施方案中,本文提供了一种包含式VA或VB的化合物的标记的多核苷酸:
或其立体异构体、互变异构体或盐,其中:
R1是任选取代的C1-C6烷基;
R2是H、卤素或SO2NH2,
R3是H或卤素;
当单独存在时,R14和R16独立地是H、卤素、或任选取代的C1-C6烷基;
当单独存在时,R15和R17独立地是H或任选取代的C1-C6烷基;
当合在一起时,R14和R15形成连接R14和R15所结合的原子的任选取代的C2-C3亚烷基链;
当合在一起时,R16和R17形成连接R16和R17所结合的原子的任选取代的C2-C3亚烷基链;
L1和L2独立地是任选取代的C2-C10亚烷基或任选取代的C2-C20杂亚烷基;
Z1是核苷酸或寡核苷酸;和
Z2是核苷酸、寡核苷酸或H。
在一些式VA或VB的实施方案中,R3是H。在其他实施方案中,R2是H。在又一些其他实施方案中,R2是Cl。
在其他式VA或VB的实施方案中,R14和R15形成连接R14和R15所结合的原子的任选被1、2或3个甲基取代的C2亚烷基链;在又一些其他实施方案中,R16和R17形成连接R16和R17所结合的原子的任选被1、2或3个甲基取代的C2亚烷基链;在某些实施方案中,R14和R15形成被3个甲基取代的乙烯链,并且R16和R17形成被3个甲基取代的乙烯链。
在一些式VA或VB的实施方案中,R14和R15合在一起并且R16和R17合在一起是:
其中*表示结合至氮原子的点,**表示结合至芳族碳原子的点。
本文公开的标记的多核苷酸可以包含一种或多种其他化合物。在本发明的一些实施方案中,多核苷酸包含小沟结合剂。在一些实施方案中,多核苷酸包含嵌入剂。
通常,用本文公开的染料标记的多核苷酸是其中骨架包含2'-脱氧核糖或核糖的多核苷酸。但是,标记的多核苷酸可以包含一种或多种修饰。在一些实施方案中,多核苷酸包含糖修饰,例如修饰的糖。各种糖修饰是有用的。一些非限制性的糖修饰包括阿拉伯糖、d-阿拉伯糖基己糖醇、2-氟阿拉伯糖、木酮糖、己糖或双环糖。
本发明的标记的多核苷酸可以包含一种或多种骨架修饰。在一些实施方案中,多核苷酸包含一种骨架修饰。在一些实施方案中,骨架修饰选自修饰的糖磷酸骨架、锁核酸骨架、肽骨架、磷酸三酯骨架、氨基磷酸酯骨架、硅氧烷骨架、羧甲基酯骨架、乙酰胺酯骨架、氨基甲酸酯骨架、硫醚骨架、桥连的亚甲基膦酸酯骨架、硫代磷酸酯骨架、甲基膦酸酯骨架、烷基膦酸酯骨架、磷酸酯骨架、烷基硫代磷酸酯骨架、二硫代磷酸酯骨架、碳酸酯骨架、磷酸三酯骨架、羧甲基酯骨架、甲基硫代磷酸酯骨架、二硫代磷酸酯骨架、具有对乙氧基键的骨架,以及前述中的任意两个或多个的组合。在本发明的特定实施方案中,骨架修饰是修饰的糖磷酸酯骨架。
本文公开的标记的多核苷酸可以包含一个或多个修饰的或非天然的碱基。修饰的碱基包括修饰的胸腺嘧啶和胞嘧啶碱基(例如,在第9,598,455号和第9,598,456号美国专利中公开的那些)、2,6-二氨基嘌呤碱基、通用碱基等。本文公开的标记的多核苷酸可包含非核苷区段或非核苷单体(例如,诸如聚(乙二醇)连接基团的连接基团)。
在一些实施方案中,本文公开的多核苷酸是探针,例如5'-核酸酶PCR探针。在某些实施方案中,多核苷酸还包含一种或多种另外的标记,例如荧光淬灭剂。如本领域普通技术人员将理解的,在寡核苷酸内的标记的位置可以变化并且不限于本文的公开内容。
在一些实施方案中,本文提供了修饰的多核苷酸,其在其序列的一端包含磺酰罗丹明染料部分作为荧光团,在其序列的另一端包含荧光淬灭剂,从而荧光淬灭剂通过如荧光共振能量转移(“FRET”)的能量转移机制抑制完整探针(即,用作探针的寡核苷酸)中的荧光团的荧光信号。当聚合酶沿着也与探针杂交的模板延伸引物时,聚合酶的5'-核酸酶活性裂解探针,从而使荧光团从荧光淬灭剂中扩散出去,从而检测到荧光信号。信号随着每个PCR周期增加,与裂解的探针的数量成正比,因此与扩增产物(例如,扩增子,靶序列)的数量成正比。这允许直接检测和定量靶DNA序列。
在一些实施方案中,磺酰罗丹明染料部分结合到距标记的多核苷酸的序列的末端至少一个核苷酸位置的碱基,并且荧光淬灭剂结合到距修饰的多核苷酸的另一端至少一个核苷酸位置的碱基。在一些实施方案中,荧光团例如磺酰罗丹明染料部分和荧光淬灭剂位于探针内部。如本领域普通技术人员将理解的,探针中的荧光团和/或荧光淬灭剂的位置可以变化并且不受限制。
在一些实施方案中,荧光团例如磺酰罗丹明染料部分和荧光淬灭剂不在FRET探针的末端。在一些实施方案中,磺酰罗丹明染料的发射光谱与荧光淬灭剂的吸收光谱相当重合。但是,当淬灭涉及碰撞机理时,或由于例如反应条件或探针结构而导致重合增加时,这样的光谱重合不太重要或不需要。
本领域中可获得的大量实用指南用于为特定探针选择合适的荧光淬灭剂对。参见,例如,FLUORESCENCE SPECTROSCOPY(Marcel Dekker,New York,1971)。用于包含在本文公开的探针中的淬灭剂包括双偶氮淬灭剂(例如,在第6,790,945号美国专利中公开的淬灭剂),可从Biosearch Technologies,Inc.获得的淬灭剂(Black HoleTM淬灭剂:BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3)、TAMRA、羧基四甲基罗丹明、4-((4-(二甲基氨基)苯基)偶氮)苯甲酸(Dabcyl)、淬灭剂、/>淬灭剂、2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(DDQ)-I和2-[6-(1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基)-9-{2-[(4-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]羰基哌啶-1-基)磺酰基]苯基}-3H-黄嘌呤-3-亚基]-2,3-二氢-1H-异吲哚鎓氯化物(QSY 21)和其他本领域已知的淬灭剂。
又一方面,本文公开了一种用于制备配体的标记的缀合物的方法,该方法包括在足以将化合物共价结合到配体从而形成染料标记的缀合物的条件下,在合适的溶剂中使所述配体与本文提供的磺酰罗丹明染料化合物接触。合适的配体包括生物分子(例如,多核苷酸、蛋白质、抗体、肽或多糖)、合成的聚合物(例如,具有烯键骨架的聚合物,如聚丙烯酸)和固体支持物(例如,受控的孔玻璃或聚苯乙烯)。
在一些实施方案中,配体是多核苷酸。在某些实施方案中,所述足以将本发明的化合物共价结合到配体,即寡核苷酸或多核苷酸的条件,是自动化的亚磷酰胺寡核苷酸合成条件。用于合成和去保护合成的寡核苷酸的自动化的亚磷酰胺寡核苷酸合成条件在本领域中是众所周知的,并且例如在Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry,第I卷,Beaucage等人,编辑,John Wiley&Sons,2002中进行了描述,其公开内容通过引用并入本文。
寡核苷酸例如DNA的亚磷酰胺合成方法被认为是大多数自动化合成仪中使用的标准合成方法。用于合成的构件通常称为核苷酸构件、单体或核苷亚磷酰胺,其是活化的核苷衍生物(亚磷酰胺)。酸可裂解的保护基团,通常为二甲氧基三苯甲基(DMT)基团,用于保护核苷的5'端,而β-氰基乙基基团用于保护3'-亚磷酸酯部分。单体还可包含用于保护其他部分的其他基团,例如,核碱基中的反应性伯胺。选择保护基团以防止在合成过程中发生分支或其他不希望的副反应。技术人员将能够容易地选择具有适于在特定合成和脱保护和/或裂解条件下使用的性质的保护基团。各种各样的胺保护基被教导,例如在Greene&Wuts,"Protective Groups In Organic Chemistry,"第3版,John Wiley&Sons,1999(以下称为“Green&Wuts”)中。
通常,寡核苷酸在固相支持物上合成,所述固相支持物例如受控的孔玻璃(CPG)或聚苯乙烯填充的柱、膜或类似材料。通常从3'至5'端合成寡核苷酸。通常,典型地通过连接基团,将第一核苷酸构件或单体锚定在支持物,如长链烷基胺控制的孔玻璃(LCAA-CPG)。
在一些实施方案中,采用亚磷酰胺试剂的合成方法涉及多轮:(i)DMT脱保护以暴露游离羟基,其可以例如通过用2.5%或3%的二-或三-氯乙酸的二氯甲烷处理来实现;(ii)将核苷或其他亚磷酰胺试剂与游离羟基偶联,这可以例如在含有四唑(例如0.45M或0.5M四唑)的乙腈中进行;(iii)氧化,其可以例如通过用I2/2,6-二甲基吡啶/H2O处理进行;和封端,其可以例如通过用在THF中的10%的1-甲基咪唑(NMI)活化的四氢呋喃(THF)中的6.5%的乙酸酐处理来进行。
进行合成中各个步骤的其他条件也是本领域已知的,并且可以在本文中使用。例如,亚磷酰胺偶联可以在含有0.25M 5-乙硫基-1H-四唑,0.25M 4,5-二氰基咪唑(DCI)或0.25M 5-苄硫基-1H-四唑(BTT)的乙腈中进行。可以用在THF/H2O/吡啶(7:2:1)中的0.1M,0.05M或0.02M I2进行氧化。封端可以通过用THF/二甲基吡啶/乙酸酐处理,然后用在THF中的16%的NMI处理来进行。
通常通过在60℃下用浓氢氧化铵处理1-12小时来实现去除任何保护基并从合成试剂中裂解,尽管核苷亚磷酰胺的保护基团可以在较温和的条件下去除,如通过在室温下用浓氢氧化铵处理4-17小时,或用在甲醇中的0.05M的碳酸钾处理,或用在水/EtOH中的25%的叔丁胺处理也是已知的并且可以使用。
涉及固相寡核苷酸合成的术语“裂解”是指破坏将寡核苷酸结合到固相支持物的键。在一些实施方案中,裂解涉及在结合的寡核苷酸的3'羟基与固相支持物之间的琥珀酸酯键的水解。
如本文所用,术语“脱保护”是指从寡核苷酸的杂环碱基的环外胺去除保护基。通常,脱保护涉及水解由环外胺和氨基保护基例如苯甲酰基或异丁酰基组成的酰胺部分。脱保护的各种技术和方法是本领域已知的。
尽管本文将本发明的每个要素描述为包含多个实施方案,但是应该理解的是,除非另外指出,否则本发明给定要素的每个实施方案都能够与本发明的其他要素的每个实施方案一起使用,并且每种这样的用途旨在形成本发明的不同实施方案。
本文引用的参考专利、专利申请和科学文献通过引用整体并入,就好像每个单独的出版物、专利或专利申请均被明确地并单独地指出通过引用并入。本文所引用的任何参考文献与本说明书的具体教导之间的任何冲突均应以后者为准。同样,在本领域中对单词或短语的理解的定义与在本说明书中具体教导的单词或短语的定义之间的任何冲突都应以后者为准。
通过以下实施例说明本发明。包括这些实施例仅出于说明的目的,并不旨在限制本发明。
实施例
在Bruker Biospin 400仪器上获得质子(1H,400MHz)和磷(31P,160MHz)核磁共振(NMR)光谱。在DMSO-d6和CD3CN中制备NMR样品,并将残留的质子化溶剂用作内部化学位移标准。LCMS数据是通过在Agilent 1200系列(LC/MSD Trap XCT Plus)和Agilent1260infinity(6130Quadrupole LC/MS)仪器上通过电喷雾电离(ESI)获得的。使用BiotageIsolera LS和Teledyne ISCOCombi Flash仪器在硅胶60上进行自动化的色谱分析。在铝支持的硅胶60F254上进行分析型薄层色谱分析,并在UV灯(254和365nm)下观察板。除非另有说明,否则所有试剂均来自商业来源。
实施例1:磺酰罗丹明染料S1的合成
该实施例描述了包含亚磷酰胺基团的示例性磺酰罗丹明染料S1的合成。这种染料适合通过标准的自动化的寡核苷酸合成掺入寡核苷酸的5'端。
根据方案1中概述的步骤制备化合物S1。
化合物1
在132-138℃下,将化合物CFBSA(4.0g,1当量)和8-羟基久洛里定(HJ,6.2g,2当量)的干燥混合物分批添加到在多口容器(≥3;所有未使用的口均通向大气)中的硫酸水溶液(60%,32mL)中。使用HPLC监测反应进程。当反应完成(7-16小时)时,将反应混合物冷却至室温,然后将其倒入稀冷的NaOH水溶液(110mL)中。在将pH调节至8.5-11之后,通过过滤分离环缩合反应的产物(化合物1),然后在真空烘箱中在45-50℃下干燥>16h。然后将产物溶解在130mL的二氯甲烷(DCM)中,并将溶液过滤。浓缩DCM层,得到化合物1(6g,65%),其无需进一步纯化即可用于下一步。LCMS:m/z 561.5;[M+H]1H NMR(DMSO-d6,400MHz):δ7.94(d,1H,J=2.4Hz),7.60(dd,1H,J=8.0,2.4Hz),7.10(d,1H,J=8.0Hz),6.59(s,2H),3.58(m,8H),2.98(m,4H),2.52(m,4H),1.99(m,4H),1.83(m,4H)。
化合物2
在室温(RT)下将化合物1(8g,14.3mmol)悬浮在无水DCM(120mL)中,并用POCl3(13.1mL,10当量)处理过夜。通过TLC(10%MeOH/DCM)跟踪反应进程/完成。当反应完成时,将混合物在真空下浓缩,并将得到的泡沫在真空下于40℃干燥90-150分钟。然后在氩气下将泡沫溶解在无水二氯甲烷(150mL)中。将反应溶液冷却至0-5℃,并用N,N-二异丙基乙胺(DIEA)(25mL,10当量)和2-氨基乙氧基乙醇(AEE)(7.2mL,5当量)处理,同时保持温度低于8℃。搅拌反应,同时在1-2小时内升温至RT,然后在RT搅拌过夜。通过TLC(10%MeOH/DCM)监测反应进程。将反应混合物用DCM(250mL)稀释,并用1N HCl(2×185mL)、盐水(1×200mL)洗涤,并经Na2SO4干燥。过滤、浓缩并使用硅胶柱纯化法进行纯化,得到纯的化合物2(3.74g,40%产率)。LCMS:m/z 648.5[M+H];1H NMR(DMSO-d6,400MHz):δ8.19(d,1H,J=2.0Hz),7.60(dd,1H,J=8.0,2.0Hz),6.95(1H,d,J=8Hz),6.28(s,2H),4.4(t,1H,J=5.6Hz),3.30(m,3H),3.15(m,12H),2.90(t,2H,J=6.8Hz),2.82(m,4H),2.51(m,4H),1.96(m,4H),1.81(m,4H)。
化合物S1
将化合物2(2.8g,4.3mmol)置于3颈圆底烧瓶中,并在高真空(≤2mBar)下干燥至少90分钟。然后将干燥的化合物在氩气下溶解在无水DCM(88mL)中。将反应混合物冷却至0-5℃,并加入DIEA(7.5mL,10当量),然后逐滴加入2-氰基乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺(PAM-Cl)(1.2mL,1.4当量),同时将内部温度保持在0-5℃。搅拌反应,同时加热至室温直至完成(2-3小时)。用DCM(88mL)稀释反应,并用NaHCO3(2×45mL)和盐水(45mL)洗涤,有机层经Na2SO4干燥。过滤、浓缩和硅胶柱纯化粗产物得到纯的产物,为粉红色固体(1.75g,48%收率)。LCMS:m/z 848.2[M+H];31P NMR(CD3CN,160MHz):δ148.25;1H NMR(DMSO-d6,400MHz):δ8.18(d,1H,J=2Hz),7.59(dd,1H,J=8.4,2.0Hz),6.96(d,1H,J=8Hz),6.27(s,2H),3.66(m,2H),3.27(t,2H,J=5.2Hz),3.20(t,1H,J=6.8Hz),3.10-3.20(m,8H),2.90(t,2H,6.8Hz),2.82(t,4H,J=6.4Hz),2.70(t,2H,J=7.0Hz)),2.40-2.51(m,4H),1.95(m,4H),1.78(m,4H),1.13(d,6H,J=8Hz),1.05(d,6H,J=8Hz)。
实施例2:磺酰罗丹明染料S2的合成
该实施例描述了示例性的磺酰罗丹明染料S2的合成,该染料包含亚磷酰胺基和被二甲氧基三苯甲基保护的羟基。该染料适合通过标准的自动化的寡核苷酸合成掺入寡核苷酸的5'末端或中间位置。
根据方案2中概述的步骤制备化合物S2。
化合物3
将150mL圆底烧瓶中的三氟甲烷磺酸(50mL)在氩气气氛下冷却至0℃。在20分钟内分批加入8-羟基久洛里定(HJ)(15.0g,79.3mmol),并将混合物升温至RT,然后在RT搅拌直至8-羟基久洛里定完全溶解。一次性加入2-磺基苯甲酸环酐(10.95g,59.5mmol)。将该混合物加热至110℃并搅拌18小时,然后冷却至室温。将反应混合物滴加到3M NaOAc(300mL)和碎冰(200mL)的混合物中。向所得混合物中加入DCM(500mL),并将混合物转移至分液漏斗中。收集有机层,并用水和盐水洗涤。将合并的水层用DCM反萃取,并将所有有机层合并。用Na2SO4干燥后,将溶液过滤,并在真空下除去DCM。产物使用2%至10%的水/乙腈(ACN)通过硅胶色谱法纯化(3″×7″床)。暗红色杂质随着溶剂前沿从色谱柱中移出。在10%水/ACN中,TLC上产物的Rf为0.4。浓缩含产物的级分得到化合物3(8.34g,40%)。1H NMR(DMSO-d6,400MHz):7.80(d,1H,J=6.8Hz),7.60(t,1H,J=7.6Hz),7.51(t,1H,J=7.4Hz),7.09(d,1H,J=7.4Hz)6.58(s,2H),3.49(m,8H),2.98(m,4H),2.62(m,4H),2.02(m,4H),1.83(m,4H);LCMS:m/z 527.5[M+H]。
化合物4
在氩气下,将化合物3(6.50g,12.3mmol)溶解在60mL的无水DCM中,并添加POCl3(5.00mL,53.6mmol)。将混合物在室温搅拌24小时。在室温下减压除去DCM,然后在60℃减压除去过量的POCl3,得到泡沫。在氩气下将泡沫溶解于150mL无水DCM中,并将溶液冷却至0℃。加入二异丙基乙胺(22.0mL,124mmol),将混合物再次冷却至0℃,并加入2-(2-氨基乙氧基)乙醇(6.20mL,62.2mmol)。使反应混合物升温至室温,并搅拌2.5小时。通过添加足够的甲醇以溶解所有固体来淬灭反应。将混合物用饱和NaHCO3、水和盐水洗涤。有机层经Na2SO4干燥。将产物在硅胶(3″×6″)上,用含10%三乙胺(TEA)的30%EtOAc/己烷至60%EtOAc/己烷进行色谱分离,得到4.56g(60%)化合物4。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)7·94(dd,lH,J=3·6,2·8Hz),7·58(dd,2H,J=5·6,3·2Hz),6·93(dd,1H,J=6.4,3.2Hz),6.27(s,2H),4.4(t,1H,J=5.6Hz),3.31(m,2H),3.07-3.20(m,12H),2.89(t,2H J=7.2Hz),2.83(t,4H,J=6.4Hz)),2.45(m,4H),1.95(m,4H),1.79(m,4H)。LCMS:m/z 614.5[M+H]。
化合物5
在氩气下,将化合物4(1.58g,2.57mmol)溶于50mL无水DCM中,并加入TEA(3.60mL,25.8mmol),随后加入对硝基苯基氯甲酸酯(777mg,3.85mmol)。将得到的混合物在室温搅拌18小时。加入单DMT-二乙醇胺(2.09g,5.13mmol),并且在RT下继续搅拌另外24h。将混合物用饱和NaHCO3、水和盐水洗涤,并经Na2SO4干燥。通过在硅胶上用含有10%TEA的40%EtOAc/己烷至70%EtOAc/己烷色谱纯化产物,得到1.78g(66%)的化合物5。1H NMR(DMSO-d6,400MHz):7.85(m,1H),7.42(m,4H),7.29(m,7H),6.99(m,1H),6.82(d,4H,J=8.8Hz),6.44(s,2H),4.10(m,1H),4.05(m,1H),3.79(s,6H),3.76(m,1H),3.66(m,1H),3.57-3.21(m,10H),3.18-3.02(m,11H),2.89(t,4H,J=6.5Hz),2.54(m,4H),2.04(m,4H),1.87(m,4H)。LCMS:m/z 1047.7[M+H]。
化合物S2
在氩气下,将化合物5(300mg,0.287mmol)溶解在20mL的无水DCM中。加入DIEA(0.500mL,2.87mmol),然后加入PAM-Cl(0.080mL,0.389mmol)。将混合物在室温搅拌4h,然后用饱和NaHCO3、水和盐水洗涤。有机层经Na2SO4干燥。在硅胶上色谱分离(含有5%TEA的20%EtOAc/己烷至40%EtOAc/己烷),得到0.213g(60%)化合物S2。1H NMR(CD3CN,400MHz):7.82(d,1H,J=7.6Hz),7.42(m,4H),7.24(m,7H),6.82(m,5H),6.36(s,2H),3.93(m,1H),3.87(m,1H),3.72(s,6H),3.65(m,4H),3.45(m,1H),3.40(m,1H),3.34(m,1H),3.27(m,1H),3.19(m,1H),3.13(m,1H),3.06(m,10H),2.92(m,1H),2.82(m,4H),2.60(m,1H),2.48(m,2H),2.41(m,2H),1.96(m,4H),1.77(m,4H),1.19(m,12H)。31P NMR(CD3CN,160 MHz):147.5。
实施例3:磺酰罗丹明染料S3的合成
该实施例描述了包含NHS酯的示例性磺酰罗丹明染料S3的合成。该染料适合于通过与氨基的缀合反应来荧光标记生物分子,例如肽。
根据方案3中概述的步骤制备化合物S3。
化合物6
在氩气下将化合物3(2.87g,5.28mmol)溶解于50mL无水DCM中,并添加POCl3(2.5mL,26.8mmol)。将得到的混合物在室温搅拌过夜。在真空下除去DCM和POCl3,并将中间体重新溶解在无水DCM(100mL)中。将该溶液在氩气下冷却至0℃。加入DIEA(18.5mL,106mmol),然后加入6-氨基己酸甲酯-HCl(4.83g,26.6mmol)。使反应混合物升温至RT,搅拌2h,然后用水(3x)和盐水洗涤。有机层经Na2SO4干燥。通过色谱法在硅胶上使用含有10%TEA的40%EtOAc/己烷纯化产物。在碱性条件下形成的呈环化形式的产品为无色;随着TEA蒸发,TLC斑点逐渐变成粉红色。纯化得到1.30g(37%)的化合物6,为浅蓝色泡沫。1H NMR(CDCl3,400MHz):7.87(d,1H,J=6.8Hz),7.46(m,2H),7.00(m,1H),6.44(s,2H),3.66(s,3H),3.16(m,8H),2.91(m,6H),2.58(m,4H),2.14(m,2H),2.07(m,4H),1.89(m,4H),1.39(m,4H),1.15(m,2H)。LCMS:m/z 654.3[M+H]。
化合物7
将化合物6(1.30g,1.99mmol)溶解于乙腈(60mL)、水(15mL)和4.5mL浓HCl中。将该溶液在80℃加热18小时,然后用DCM稀释,用饱和NaHCO3、水和盐水洗涤。有机层经Na2SO4干燥,得到1.21g粗化合物7,其无需进一步纯化即用于下一步。LCMS:m/z 640.3[M+H]。
化合物S3
在氩气下将化合物7(1.21g,1.89mmol)溶解于25ml无水二甲基甲酰胺(DMF)中。加入N-羟基琥珀酰亚胺(435mg,3.78mmo1)和N-(二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺(EDC)(725mg,3.78mmol)。将混合物在室温搅拌过夜,然后在真空下除去DMF。将残余物溶解在DCM中,并将溶液用1N HCl、水和盐水洗涤。有机层经Na2SO4干燥。在硅胶上用5%HOAc和1%MeOH至5%MeOH的DCM溶液进行色谱分离,得到880mg(63%)的化合物S3。1H NMR(DMSO-d6,400MHz):7.92(m,1H),7.58(m,2H),6.95(m,1H),6.24(s,2H),3.11(m,8H),2.84(m,6H),2.82(s,4H),2.46(m,4H),1.94(m,6H),1.79(m,4H),1.21(m,4H),1.12(m,2H)。LCMS:m/z737.3[M+H]。
实施例4:磺酰罗丹明染料S4的合成
包含活化的酯衍生物的另一种示例性染料S4可以根据方案4中概述的步骤,使用上述针对化合物S3所述的反应条件容易地制备。
化合物8
在氩气气氛下将化合物1(4.0g,0.0071摩尔)溶解在无水DCM(60mL)中。一次性加入纯净的三氯氧磷(6.5mL,0.071摩尔),并将反应在室温下搅拌23小时。在旋转蒸发仪上除去溶剂,并将所得泡沫在5毫巴下干燥2小时。在氩气气氛下向泡沫中加入无水DCM(75mL),并将反应烧瓶置于冰/水浴中。在0-5℃下缓慢加入N,N-二异丙基乙胺(18.5mL,0.107摩尔)。在10分钟内分批加入固体6-氨基己酸甲酯盐酸盐(6.5g,0.0360摩尔)。1小时后,移去冰浴,并在16小时内将反应混合物搅拌至室温。将反应混合物用DCM(125mL)稀释,并用1NHCl(2×90mL)和盐水(1×120mL)洗涤,然后用硫酸钠干燥。过滤,浓缩和硅胶柱纯化(乙酸乙酯/庚烷/TEA,30:10:60)得到呈金色固体的产物(2.4g,收率)。LCMS:m/z 688.5[M+H]1H NMR(CDCl3,400MHz):δ7.83(d,1H,J=1.6Hz),7.4(dd,1H,J=8.4,2.0Hz),6.95(d,1H,J=8.4Hz),6.42(s,2H),3.65(s,3H),3.16(m,8H),2.89(m,6H),2.58(m,4H),2.14(t,2H,J=8Hz),2.06(m,4H),1.91(m,4H),1.40(m,4H),1.15(m,2H)。
化合物S4
在搅拌下将化合物8(0.60g,0.00087摩尔)悬浮在乙腈(30mL)中。加入DI(去离子)水(7mL),并将悬浮液搅拌几分钟。逐滴加入浓盐酸(3mL),产生红色/紫色溶液。将该溶液在温和回流下加热2-3小时,然后在15小时内搅拌至室温。通过在旋转蒸发仪上蒸发将反应混合物的体积(颜色为紫色)减半,并且通过将反应溶液在室温下倒入去离子水(75mL)中来沉淀产物。将悬浮液过滤,将滤饼用另外的去离子水(15mL)洗涤,并在真空烘箱中在40-50℃和<2毫巴的真空下干燥20h,得到0.54g(93%收率)为紫色粉末的化合物9,直接用于下一步。
将以上获得的化合物9(0.2g,0.000296摩尔)放入10mL圆底烧瓶中,并在氩气气氛下溶解于无水DMF(3.0mL)中。向所得的紫色溶液中,加入N-羟基琥珀酰亚胺(0.04g,0.00034摩尔,1.15当量)和EDC(0.075g,0.00039摩尔,1.3当量),并将该反应在环境温度下搅拌21小时。将反应混合物用DCM(40mL)稀释,并用水(20mL)洗涤,并经Na2SO4干燥。蒸发溶剂,并将残余物通过使用5-15%MeOH/DCM的柱色谱法纯化,得到0.14g(61%收率)的化合物S4。LCMS:m/z 771.6[M+H]1H NMR(DMSO-d6,400MHz):δ8.17(d,1H,J=2.0Hz),7.60(dd,1H,J=8.4,2.0Hz),6.98(d,1H,J=8.4Hz),6.24(s,2H),3.13(m,8H),2.82(m,6H),2.74(m,2H),2.55(m,4H),2.41(t,2H,J=7.8Hz),1.94(m,4H),1.79(m,4H),1.10-1.35(m,8H)。
实施例5:磺酰罗丹明染料S5的合成
该实施例描述了包含亚磷酰胺基团的示例性磺酰罗丹明染料S5的合成。该染料适合通过标准的自动化的寡核苷酸合成掺入寡核苷酸的5'端。
根据方案5中概述的步骤制备化合物S5。
化合物10
将水(27mL)冷却至0℃,并缓慢加入41mL浓H2SO4。将该溶液加热至160℃。在1分钟内将预先完全混合的2-甲酰基苯磺酸(5.03g,24.2mmol)和3-(二甲基氨基)苯酚(6.63g,48.3mmol)分批加入到硫酸溶液中。将该溶液在空气中在160℃下搅拌8小时,然后冷却至室温并再搅拌8小时。将冷水(300mL,约0℃)与100mL 10M NaOH混合。将粗反应混合物滴加到NaOH溶液中,保持温度低于25℃。一旦添加反应混合物,就添加更多的10M NaOH直到pH为约8.5。将混合物在室温搅拌过夜。通过真空过滤收集固体,并经KOH在高真空下干燥,得到10.6g的含有约50%的无机盐的粗物料。使用MeOH/DCM溶剂梯度(4%至10%MeOH)在硅胶柱(2"x 7")上对一份3.57g的粗物料进行色谱分离。首先洗脱所需的异构体,产生异构体的混合物。获得780mg(22%)的化合物10。LCMS:m/z 423.4[M+H]。
化合物11
在氩气下,向在75mL无水DCM中的化合物10(740mg,1.75mmol)中加入POCl3(1.64mL,6.50mmol),并将混合物在室温搅拌18h。在室温下减压除去DCM,然后在60℃减压除去过量的POCl3,得到泡沫。在氩气下,将泡沫溶解于125mL的无水DCM中,并将溶液冷却至0℃。加入三乙胺(3.10mL,17.8mmol)和2-(2-氨基乙氧基)乙醇(0.875mL,8.78mmol)。使混合物升温至室温并搅拌1小时,然后用水和盐水洗涤。有机层经Na2SO4干燥。在硅胶(1″x7″)上用含10%TEA的40%EtOAc/己烷至60%EtOAc/己烷进行色谱分离,得到438mg(49%)化合物11。1H NMR(DMSO-d6,400MHz):8.00(m,1H),7.61(m,2H),6.96(m,1H),6.71(s,1H),6.69(s,1H),6.53(m,2H),6.43(d,J=2.5Hz,2H),4.44(t,J=5.6Hz,1H),3.31(m,2H),3.14(m,4H),2.93(s,12H),2.91(m,2H)。LCMS:m/z 510.4[M+H]。
化合物S5
在氩气下将化合物11(423mg,0.830mmol)溶解于25mL无水DCM中,并添加DIEA(0.725mL,4.16mmol),随后加入PAM-Cl(0.190mL,0.924mmol)。将混合物在室温搅拌3h,用饱和NaHCO3、水和盐水洗涤,有机层经Na2SO4干燥。在硅胶上用含10%TEA的20%EtOAc/己烷至40%EtOAc/己烷进行色谱分离,得到485mg(82%)化合物S5。1H NMR(CD3CN,400MHz):7.89(m,1H),7.57(m,2H),6.97(m,1H),6.80(s,1H),6.78(s,1H),6.52(m,2H),6.44(m,2H),3.73(m,2H),3.56(m,4H),3.26(m,4H),2.97(s,12H),2.61(m,2H),1.97(m,2H),1.19(d,J=6.8Hz,6H),1.12(d,J=6.8Hz,6H)31P NMR(CD3CN,160MHz):148.1。
实施例6:磺酰罗丹明染料S6的合成
该实施例描述了示例性的磺酰罗丹明染料S6的合成,该染料包含亚磷酰胺基和被二甲氧基三苯甲基保护的羟基。该染料适合通过标准的自动化的寡核苷酸合成掺入寡核苷酸的5′末端或中间位置。
根据方案6的步骤制备化合物S6。
化合物13
化合物12的合成通过在乙酸(FCH Group,Latvia)中用环氧乙烷2,3,3-三甲基-2,3-二氢-1H-吲哚-6-醇处理来进行。将水(27mL)冷却至约0℃,并缓慢加入浓H2SO4(41mL)。将所得溶液在250mL的3颈圆底烧瓶中加热至160℃。在1分钟内将预先完全混合的2-甲酰基苯磺酸(3.21g,15.4mmol)和化合物12(6.82g,30.8mmol)分批加入到硫酸溶液中。将溶液在160℃下暴露在空气中加热6小时,然后冷却至室温,并缓慢加入300mL冷的5M NaOH中。用H2SO4将pH调节至9。将混合物用DCM萃取(2x)。合并的有机层用盐水洗涤,并经Na2SO4干燥。真空除去溶剂,并将粗固体在高真空下用KOH干燥,得到2.25g粗物料。在硅胶柱(2"x6")上使用ACN/水溶剂体系(5至8%的H2O)进行色谱分离,得到526mg(6%)的化合物13。1H NMR(DMSO-d6400MHz)8.03(d,J=7.5Hz,1H),7.64(t,J=7.4Hz,1H),7.56(t,J=7.4Hz,1H),7.15(m,1H),6.82(s,2H),6.64(s,2H),5.01(s,2H),3.76(m,8H),3.48(m,2H),1.11(m,18H)。LCMS:m/z 591.5[M+H]。
化合物14
在氩气下将化合物13(525mg,0.889mmol)溶解于15mL无水吡啶中。加入乙酸酐(0.210mL,2.22mmol)和DMAP(11mg,0.090mmol),并将混合物在室温搅拌3h。在真空下除去吡啶,并将残余物在硅胶(1″x 7″)上使用MeOH/DCM溶剂体系(2至10%)进行色谱分离纯化,得到531mg(89%)化合物14。1H NMR(DMSO-d6,400 MHz):8.03(d,J=7.8Hz,1H),7.66(t,J=7.4Hz,1H),7.56(t,J=7.4Hz,1H),7.18(m,1H),6.94(s,2H),6.69(s,2H),4.31(m,4H),3.96(m,2H),3.78(m,2H),3.71(m,2H),1.99(s,3H),1.97(s,3H),1.18(m,12H),0.98(s,6H)。LCMS:m/z 675.5[M+H]。
化合物15
在氩气下将化合物14(520mg,0.771mmol)溶解于25mL无水DCM中,并添加POCl3(0.360mL,3.68mmol)。将反应混合物在室温搅拌5h,然后加入2.0M甲胺的THF溶液(11.6mL,23.1mmol),并将混合物搅拌1h。混合物用水、饱和NaHCO3和盐水洗涤,有机层经Na2SO4干燥。在硅胶(1″x7″)上用含10%TEA的10%EtOAc/己烷至30%EtOAc/己烷进行色谱分离,得到437mg(82%)化合物15。1H NMR(DMSO-d6,400 MHz):
8.01(m,1H),7.61(m,2H),7.02(m,1H),6.43(m,2H),6.33(m,2H),4.18(m,4H),3.47(m,2H),3.29(m,4H),2.27(s,3H),1.98(m,6H),1.09(m,9H),0.97(s,3H),0.84(s,3H),0.71(s,3H)。LCMS:m/z 688.5[M+H]。
化合物16
将化合物15溶解在20mL的MeOH中,并添加K2CO3在5mL水中的溶液。将混合物在室温搅拌1h。在真空下除去MeOH,将残余物用水和盐水洗涤,并经Na2CO3在高真空下干燥,得到336mg(90%)的化合物16,其无需进一步纯化即用于下一步。1H NMR(DMSO-d6,400MHz):7.99(m,1H),7.60(m,2H),7.01(m,1H),6.41(s,2H),6.24(m,2H),4.71(t,J=4.8Hz,2H),3.54(m,4H),3.28(m,4H),3.16(m,2H),2.27(s,3H),1.08(m,9H),0.97(s,3H),0.85(s,3H),0.71(3H)。LCMS:m/z 604.5[M+H]。
化合物17
通过与12mL的无水吡啶(2X)共沸蒸发来干燥化合物16(329mg,0.545mmol)。将干燥的物料溶解在12mL的无水吡啶中,并添加DMTCl(258mg,0.761mmol)。将混合物在室温搅拌18h,并将反应用甲醇(2mL)淬灭。真空除去溶剂。在硅胶(1″x7″)上用含10%TEA的30%EtOAc/己烷至40%EtOAc/己烷进行色谱分离,得到232mg(47%)化合物17。1H NMR(DMSO-d6,400MHz):8.01(m,1H),7.62(m,2H),7.52(m,1H),7.35(m,2H),7.22(m,7H),7.05(m,1H),6.81(m,4H),6.43(m,1H),6.36(m,1H),6.29(m,1H),4.72(m,1H),3.68(m,6H),3.57(m,3H),3.25(m,7H),2.25(m,3H),1.09(m,9H),0.97(m,3H),0.86(m,3H),0.73(m,3H)。LCMS:m/z906.8[M-H]。
化合物S6
在氩气下向化合物17(227mg,0.251mmol)在20mL无水DCM中的溶液中,加入DIEA(0.218mL,1.25mmol),然后加入PAM-Cl(0.075mL,0.365mmol)。将混合物在室温搅拌2h,然后用NaHCO3、水和盐水洗涤。有机层经Na2SO4干燥。在硅胶上用含10%TEA的20%EtOAc/己烷至30%EtOAc/己烷色谱分离,得到212mg(77%)化合物S6。1H NMR(CD3CN,400MHz):7.91(m,1H),7.57(m,2H),7.41(m,2H),7.28(m,7H),7.03(m,1H),6.81(m,4H),6.56(m,2H),6.32(m,2H),3.79(m,2H),3.72(m,6H),3.58(m,4H),3.41(m,2H),3.33(m,2H),3.22(m,2H),2.53(m,2H),2.32(m,3H),1.11(m,21H),1.03(m,3H),0.93(m,3H),0.80(m,3H)。31PNMR(CD3CN,160MHz):147.3。
将化合物S6掺入模型寡核苷酸(SEQ.ID No1)的5′-末端。示例性寡核苷酸的激发和发射光谱显示在图3中。
实施例7:磺酰罗丹明染料S7的合成
该实施例描述了示例性的磺酰罗丹明染料S7的合成,该染料包括亚磷酰胺基和被二甲氧基三苯甲基保护的羟基。该染料适合通过标准的自动化的寡核苷酸合成掺入寡核苷酸的5′末端或中间位置。
根据方案7的步骤制备化合物S7。
化合物19
在室温,氩气下,用过量的TEA(5.3mL,5当量)处理化合物2(4.9g,7.6mmol)在无水DMF(50mL)中的悬浮液,然后用二(硝基苯)碳酸酯BNPC(2.8g,1.2当量)处理。将黑色悬浮液在30-35℃下加热直至中间体18的形成完成(在添加BNPC后1.5-3h)。一次性添加单DMT-二乙醇胺(DMT-L)(4.6g,1.5当量),并将反应混合物在30-35℃(1-3h)然后在室温(>2h)搅拌直至反应完成。将反应混合物用EtOAc(530mL)稀释,并转移至分液漏斗中。用DI水(4×380mL)和盐水(1×380mL)洗涤EtOAc层。EtOAc层经Na2SO4干燥,过滤,蒸发,得到粗产物19。硅胶柱纯化粗产物,得到纯化合物19,为淡紫色至紫色固体(7.5g,91%收率)。LCMS:m/z1082.0[M+H]。1HNMR(DMSO-d6,400MHz):δ8.18(d,1H,J=2Hz),7.22(dd,1H,J=8.4,1.6Hz),7.16-7.36(m,10H),6.95(m,1H),6.86(d,2H,J=8.8Hz),6.81(d,2H,J=8.8Hz),6.28(s,2H),4.60(m,1H),3.90(m,1H),3.80(m,1H),3.70(m,6H),3.40(m,3H),3.30(m,3H),3.16(m,2H),3.07(m,12H),2.90(m,1H),2.80(m,1H),2.78(m,4H),2.44(m,4H),1.92(m,4H),1.75(m,4H)。
化合物S7
将化合物19(6.5g,6mmol)置于3颈圆底烧瓶中,并在≤2毫巴的高真空下干燥≥90分钟。然后将干燥的化合物19在氩气下溶解在无水DCM(130mL)中。将反应烧瓶冷却至0-5℃,并加入DIEA(10.5mL,10当量),然后逐滴加入N,N-二异丙基-氯代亚磷酰胺-Cl(PAM-Cl)(1.7mL,1.3当量),同时将内部温度保持在0-5℃。将反应在室温搅拌直至完成(2-3小时)。用DCM(130mL)稀释反应,并用NaHCO3(2×80mL)、盐水(150mL)洗涤,并经Na2SO4干燥。粗产物通过过滤、浓缩和硅胶柱纯化得到纯的化合物S7,为粉红色至淡紫色的固体(6.07g,78%收率)。LCMS:m/z 1281.2[M+H]。31P NMR(DMSO-d6,160MHz):δ147.57。1H NMR(DMSO-d6,400MHz):δ7.90(s,1H),7.48(dd,1H,J=8.4,2.0Hz),7.40(m,2H),7.20-7.30(m,7H),6.82(m,5H),6.35(s,2H),3.93(m,1H),3.87(m,1H),3.76(m,8H),3.62(m,4H),3.46(m,2H),3.41(m,1H),3.33(m,1H),3.25(m,1H)3.19(m,1H),3.13(m,11H),2.98(m,1H),2.84-2.91(m,5H),2.64(m,2H),2.40-2.56(m,6H),1.95(m,4H),1.78(m,4H),1.10-1.23(m,12H)。
实施例8:化合物S8的合成
该实施例描述了示例性的磺酰罗丹明染料S8的合成,该染料包含亚磷酰胺基和被二甲氧基三苯甲基保护的羟基。该染料适合通过标准的自动化的寡核苷酸合成掺入寡核苷酸的5'末端或中间位置。‘’
根据方案8的步骤制备化合物S8。
化合物20
将化合物3(2.80g,1当量)溶解在无水二氯甲烷(50mL)中,并在环境温度下逐滴加入POCl3(6.9mL,14当量)。4小时后,将反应混合物蒸发至干,得到粗中间体,为深蓝色固体。将乙二胺(EDA,6.0mL,17.0当量)溶于无水二氯甲烷(40mL)中,并将溶液冷却至5℃。将该固体溶于无水二氯甲烷(20mL)中,并滴加到EDA溶液中。在4℃下放置17小时后,反应混合物用饱和碳酸氢钠(2x 40mL)洗涤,然后用去离子水(40mL)洗涤。将有机层蒸发至干,得到呈深蓝色固体的化合物20(3.08g,96%)。LCMS:m/z569.4[M+H+]。Calc-d:569.25.1H NMR(DMSO-d6,400MHz):7.92(dd,1H,J=6.0,2.8Hz),7.54-7.56(m,2H),6.90(dd,1H,J=6.4,2.8Hz),6.30(s,2H),3.3(宽峰,2H),3.07-3.14(m,8H),2.75-2.88(m,6H),2.35-2.49(m,6H),1.95(m,4H),1.79(m,4H)。
化合物21
将4-戊炔酸(4PA,0.67g,1.1当量)溶解在无水乙腈(6.5mL)中,并将溶液冷却至5℃。加入二异丙基乙胺(3.3mL,3.0当量),然后加入五氟苯基三氟乙酸酯(PFP-TFA,1.2mL,1.1当量)。将反应混合物在环境温度下孵育1小时。将化合物20(3.1g,1.0当量)悬浮在10mLN,N-二甲基甲酰胺、10mL二氯甲烷和5mL二甲基亚砜的混合物中。将悬浮液加入到活化的4-戊炔酸溶液中,并在环境温度下孵育1小时。将反应混合物用50mL乙酸乙酯稀释,并用饱和碳酸氢钠(2×30mL)洗涤,然后用去离子水(30mL)洗涤。将有机层蒸发至干。使用硅胶柱纯化法纯化粗产物,以得到呈蓝色固体的化合物21(2.74g,68%产率)。LCMS:m/z 649.5[M+H+]。Calc-d:649.28.1H NMR(DMSO-d6,400 MHz):7.93-7.96(m,1H),7.65(t,1H,J=5.6 Hz),7.54-7.58(m,2H),6.87-6.90(m,1H),6.32(s,2H),3.05-3.16(m,8H),2.97-3.04(m,2H),2.79-2.88(m,6H),2.72(t,1H,J=2.4Hz),2.39-2.58(m,4H,与DMSO-d5重叠),2.20-2.27(m,2H),2.10(t,2H,7.6Hz),1.95(m,4H),1.79(m,4H)。
化合物22
将化合物21(2.7g,1.0当量)溶解在N,N-二甲基甲酰胺(22.0mL)中,并加入三乙胺(1.7mL,3.0当量)。在惰性气氛下将制得的溶液添加至5-碘-5′-二甲氧基三苯甲基-2′-脱氧尿苷(2.7g,1.0当量;DMT-1-dU)、四(三苯基膦)钯(0)(0.48g,0.1当量)和碘化亚铜(I)(0.24g,0.3当量)的固体混合物中,将反应混合物在环境温度下孵育2小时。将反应混合物用乙酸乙酯(120mL)稀释,并用0.1M EDTA溶液(2×80mL)洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥(25g,18h),过滤并蒸发至干(蓝色固体)。使用硅胶柱纯化法纯化粗产物,以得到呈蓝色固体的化合物22(4.73g,97%产率)。LCMS:m/z 1177.9[M+H+]。Calc-d:1177.47 1H NMR(DMSO-d6,400MHz):7.93-7.96(m,1H),7.83(s,1H),7.54-7.58(m,2H),7.49(t,1H,J=6.0 Hz),7.37-7.41(m,2H),7.25-7.31(m,6H),7.18-7.22(m,1H),6.83-6.90(m,5H),6.32(s,2H),6.11(t,1H,J=6.8Hz),5.33(s,1H),4.27(m,1H),3.91(m,1H),3.71(s,6H),3.21-3.26(m,2H),3.05-3.14(m,8H),2.97-3.04(m,2H),2.77-2.88(m,6H),2.38-2.59(m,4H,与DMSO-d5重叠),2.14-2.28(m,4H),1.98-2.03(m,2H),1.93(m,4H),1.77(m,4H)。
化合物S8
在氩气下,将化合物22(4.6g,1.0当量)溶解在无水二氯甲烷(27.6mL)中。将反应烧瓶冷却至0-5℃,并添加二异丙基乙胺(2.0mL,3.0当量),然后逐滴添加PAM-Cl(1.1mL,1.3当量),同时将内部温度保持在0-5℃。将反应在室温搅拌2小时。将反应用乙酸乙酯(150mL)稀释,用NaHCO3(2×100mL)、盐水(80mL)洗涤,经无水硫酸钠干燥(46g,20h),过滤并蒸发至干(蓝色固体)。将产物溶于200mL二氯甲烷中,并通过在乙醚和己烷(2L)的相等混合物中沉淀来纯化。过滤并干燥,得到产物,为蓝色固体(1.92g,36%产率)。LCMS:m/z1378.3[M+H]。31P NMR(CD3CN,160MHz):两个单峰(非对映异构体)δ147.97ppm和148.04ppm。1H NMR(CD3CN,400MHz):δ9.2(宽峰,1H),7.94和7.97(s,1H),7.85–7.89(m,1H),7.53–7.59(m,2H),7.42–7.47(m,2H),7.30–7.37(m,4H),7.19–7.29(m,3H),6.80–6.92(m,5H),6.35(s,2H),6.13–6.21(m,1H),5.36–5.41(m,1H),4.55–4.64(m,1H),4.08–4.15(m,1H),3.73–3.75(m,6H),3.55–3.70(m,4H),3.25–3.40(m,2H),3.05-3.16(m,8H),2.93–3.00(m,2H),2.72–2.88(m,6H),2.66(t,1H,6.0Hz),2.33–2.59(m,7H),2.15–2.22(m,2H),1.92–2.00(m,2H),1.75–1.88(m,6H),1.14–1.21(m,9H),1.07和1.06(2x s,3H)。
实施例9:化合物S9的合成
该实施例描述了示例性磺酰罗丹明染料S9的合成,该染料包括亚磷酰胺基和被二甲氧基三苯甲基保护的羟基。该染料适合通过标准的自动化的寡核苷酸合成掺入寡核苷酸的5'末端或中间位置。
根据方案9,类似于上述化合物S8的制备,制备化合物S9。
实施例10:由磺酰罗丹明染料亚磷酰胺制备荧光标记的多核苷酸
在MerMade-12寡核苷酸合成仪上,采用标准的200nmol DNA方案,在DMT去除-偶联-封端-氧化-封端的循环中合成了包含磺酰罗丹明染料的多核苷酸。磺酰罗丹明染料亚磷酰胺的偶联时间延长至6分钟。
对于含有5'磺酰罗丹明染料的多核苷酸,在最后的磺酰罗丹明染料亚磷酰胺偶联循环之后完成合成。在内部掺入磺酰罗丹明染料亚磷酰胺的情况下,在染料偶联后添加更多的核苷单体。最后的DMT基团留在多核苷酸上。
从固体支持物上切下完全组装的多核苷酸,并在55℃下用30%氢氧化铵脱保护10-12h。去除氨后,对寡核苷酸进行分析,并通过反相HPLC(RP-HPLC)在C18 Gemini柱上通过反相HPLC(RP-HPLC)纯化,用乙腈/0.1M三乙基碳酸氢铵(pH 7)的线性梯度洗脱。在除去DMT基团后,第二次纯化多核苷酸。
磺酰罗丹明101标记的寡核苷酸是通过将氨基-C6-寡核苷酸与商业化的Texas-X(NHS酯)试剂(混合异构体,Thermo Fisher Scientific)偶联来制备的。所有纯化的多核苷酸通过质谱表征。
使用可商购的BHQ-2淬灭剂CPG,Glycolate 500Angstrom柱(BioSearchTechnologies)制备包含示例性磺酰罗丹明染料的5'-核酸酶探针。A01表示2-氨基-dA(2,6-二氨基-2'-脱氧嘌呤核糖核苷),其使用可商购的2-氨基-dA-CE亚磷酰胺(GlenResearch,产品目录号:10-1085)掺入。
表1列出了掺入磺酰罗丹明染料亚磷酰胺和磺酰罗丹明101(Tx Red)标记的寡核苷酸的示例性寡核苷酸。
表1
名称 | 5'染料 | 序列 | 3'淬灭剂 |
Oligo A | Tx Red | SEQ ID NO:1 | N/A |
Oligo B | (S6) | SEQ ID NO:1 | N/A |
Oligo C | (S7) | SEQ ID NO:1 | N/A |
Oligo D | Tx Red | SEQ ID NO:2 | BHQ-2 |
Oligo E | (S7) | SEQ ID NO:2 | BHQ-2 |
Oligo F | Tx Red | SEQ ID NO:3 | BHQ-2 |
Oligo G | (S7) | SEQ ID NO:3 | BHQ-2 |
在表1中,掺入多核苷酸5'端的染料部分具有以下结构:
TCA GAG TAC CTG AAA CA(SEQ ID NO:1)、CC(A01)CGG(A01)GC G(A01)G AC(A01)TCT CGG CC(SEQ ID NO:2)和CC(A01)G(A01)G CAA ACT GGG CGG C(A01)(SEQ ID NO:3),其中A01表示2,6-二氨基嘌呤2'-脱氧核糖核苷。
在Agilent Cary荧光计(200nM寡核苷酸,0.1M Tris缓冲液,pH 8)上记录标记的寡核苷酸的激发和发射光谱。如图1A和1B所示,使用示例性染料亚磷酰胺试剂化合物S7(Oligo C)通过自动化的寡核苷酸合成制备的示例性寡核苷酸的激发和发射最大值与包含Texas染料(Oligo A)的寡核苷酸的激发和发射最大值匹配。如图1C所示,使用示例性染料亚磷酰胺试剂化合物S6(Oligo B)通过自动化的寡核苷酸合成制备的示例性寡核苷酸的激发和发射最大值与文献报道的TAMRA染料标记的寡核苷酸的激发和发射最大值接近。
在该实施例中,使用包含本发明的染料和可商购的淬灭剂BHQ-2的可裂解淬灭的荧光探针进行5'-核酸酶PCR反应。图2A和2B所示的PCR图证明,包含本发明染料的探针可有效地用作检测探针。
AAA CCT CCA GGC CAG AAA GAG AGA GTA(SEQ.ID NO:4)
AAA AGG CAT TCC TGA AGC TGA CAG CAT TC(SEQ.ID NO:5)
AAA ACC TGC CTT CTG CGT GAG ATT CT(SEQ.ID NO:6)
CTG TAC GAA AAG ACC ACA GGG CCC AT(SEQ.ID NO:7)
扩增子:长度96bp,1,000拷贝/反应;
ATP、CTP、GTP、TTP各自的核苷三磷酸(NTP)浓度:0.25mmol;
Taq聚合酶:3单位/25uL反应;
引物(每个)浓度:200nM;和
探针浓度:250nM;
以下两个循环:在95℃下变性35秒,在66℃下退火延伸30秒;和以下45个循环:在95℃下变性8秒,在66℃下退火延伸30秒。
所得的PCR数据显示在图2A和2B中。如数据所证明,用本发明的示例性染料标记的5'核酸酶PCR探针具有与用Texas标记的PCR探针可比的性能。从图2A和2B的数据可以看出,包含示例性染料S7的探针显示出与用Texas/>标记的探针显示的相似的终点。
实施例12:化合物S10a与S10b的合成
该实施例描述了包含亚磷酰胺基团的示例性磺酰罗丹明染料S10a和S10b的合成。这些染料适合通过标准的自动化的寡核苷酸合成掺入寡核苷酸的5'-末端位置。
磺酰罗丹明染料,例如由外消旋中间体12制备的下文所示的化合物S10,含有两个手性中心,导致最终的染料以4种非对映异构体的混合物存在。
在例如通过亚磷酰胺合成或缀合将此类染料掺入多核苷酸后,产生了荧光标记的多核苷酸的非对映异构体混合物。尽管这些多核苷酸具有相同的光学性质,但由于多核苷酸洗脱为多个峰或宽峰,因此难以通过HPLC纯化。使用染料的纯立体异构体可以简化此类标记的多核苷酸的色谱纯化。
化合物S10a是由化合物12的单一对映异构体12a合成的磺酰罗丹明染料的实例,导致化合物S10a作为单一非对映异构体存在。可以使用手性催化剂RuCl(对伞花烃)[(R,R)-Ts-DPEN](Aldrich目录号703907)通过不对称转移氢化(如Org.Lett.2018,20,5107-5111中描述)由2,3,3-三甲基-3H-吲哚-6-醇(FCH Group,Lativa)合成化合物12a。类似地,化合物12b,即12a的立体异构体,可以使用RuCl(对伞花烃)[(S,S)-Ts-DPEN](Aldrich)通过类似的步骤合成。
化合物13a
将2-甲酰基苯磺酸钠盐(1.41g,6.77mmol)和一当量的化合物12a(1.50g,6.77mmol)溶解在40mL的60%H2SO4中。将溶液在60℃加热3小时,然后加入另一当量的化合物12a,并将混合物加热到100℃。72小时后,将反应混合物冷却至室温,用40mL水稀释,倒入500mL碎冰中,并搅拌1.5小时。过滤收集所得固体。将盐水(100mL)加入到滤液中,并将滤液用二氯甲烷(2X)萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥,过滤,并真空除去溶剂。合并从有机物中提取的物料和沉淀物,并通过硅胶柱(2"x 7")使用梯度ACN/水体系(4%至10%H2O)进行色谱纯化,得到1.08g(27%)的化合物13A。1H NMR(DMSO-d6500MHz)8·03(d,J=7.8Hz,1H),7.64(t,J=7.5Hz,1H),7.55(t,J=7.5Hz,1H),7.15(d,J=7.5Hz,1H),6.91(m,1H),6.81(d,J=3.6Hz,1H),6.65(m,2H),4.98(m,1H),4.93(m,1H),3.96(m,1H),3.82(m,2H),3.70(m,5H),3.45(m,2H),1.18(m,9H),1.12(s,3H),0.98(s,3H),0.97(s,3H)。LCMS:m/z 591.5[M+H]。
化合物14a
在氩气下,将化合物13a(1.06g,1.79mmol)溶解于25mL无水吡啶中。加入乙酸酐(0.510mL,5.39mmol)和DMAP(22mg,0.180mmol),并将混合物在室温搅拌5h。真空除去吡啶,并将残余物在硅胶柱(1.5″x5″)上使用MeOH/DCM溶剂体系(4至8%MeOH)进行色谱分离,得到475mg(39%)的化合物14a。1H NMR(DMSO-d6,500 MHz):8.03(d,J=7.8Hz,1H),7.65(t,J=7.4 Hz,1H),7.56(t,J=7.4Hz,1H),7.16(d,J=7.3Hz,1H),6.93(d,J=5.3Hz,2H),6.70(s,2H),4.29(m,4H),3.96(m,2H),3.78(m,2H),3.69(m,2H),1.99(s,3H),1.98(s,3H),1.21(d,J=6.7Hz,3H),1.17(d,J=6.6Hz,3H),1.15(s,3H),1.12(s,3H),0.99(s,3H),0.98(s,3H)。LCMS:m/z 675.5[M+H]。
化合物26
在氩气下将化合物14a(455mg,0.674mmol)溶解于25mL无水DCM中,并添加POCl3(0.630mL,6.76mmol)。将混合物在室温搅拌18h,然后真空除去DCM和POCl3。将所得油状物溶于25mL无水DCM中,并将溶液冷却至0℃,并添加DIEA(1.15mL,6.60mmol)和2-(2-氨基乙氧基)乙醇(338uL3.37mmol)。使混合物升温至RT,搅拌2h,然后用饱和NaHCO3萃取。萃取液经Na2SO4干燥。粗产物在硅胶(1″x6″柱)上使用梯度MeOH/DCM(2至6%MeOH)进行色谱分离,得到382mg(74%)的化合物26。1HNMR(DMSO-d6,500MHz):8.00(m,1H),7.60(m,2H),6.99(m,1H),6.43(d,J=1.3 Hz,2H),6.32(d,J=5.6 Hz,2H),4.41(t,J=4.78,1H),4.16(m,4H),3.29(m,2H),3.15(m,6H),3.09(m,4H),2.90(m,2H),1.98(m,6H),1.09(m,9H),0.97(s,3H),0.85(s,3H),0.72(s,3H)。LCMS:m/z 762.6[M+H]。
化合物S10a
将化合物26(367mg,0.481mmol)在氩气下溶解于20mL无水DCM中,并添加DIEA(0.419mL,2.41mmol),随后加入N,N-二异丙基氨基氰基乙基膦酰胺-Cl(0.129mL,0.627mmol)。将混合物在室温搅拌3h,然后用饱和NaHCO3、水和盐水萃取。萃取物经Na2SO4干燥。用含10%TEA的20%EtOAc/己烷至30%EtOAc/己烷在硅胶(1″x6″柱)上色谱分离,得到350mg(78%)化合物S10a。1H NMR(CD3CN,500MHz):7.91(m,1H),7.59(m,2H),6.97(m,1H),6.54(d,J=8.2Hz,2H),6.28(s,2H),4.25(m,4H),3.73(m,2H),3.54(m,6H),3.32(m,6H),3.22(m,2H),2.98(m,2H),2.01(s,3H),2.00(s,3H),1.97(pentet,J=2.5Hz,2H),1.15(m,15H),1.12(s,3H),1.10(s,3H),1.03(s,3H),0.93(m,3H),0.79(s,3H)。31P NMR(CD3CN,500MHz):
148.2。LCMS:m/z963.0[M+H]。
化合物S10b可以类似的方式由中间体12b制备。
通过如上所述自动化的寡核苷酸合成制备在5'末端掺入染料S10和S10a的SEQ IDNO:1的示例性标记的多核苷酸。将掺入了染料S10的标记的多核苷酸在Phenomenex Gemini柱(5μm C18)上通过HPLC纯化,在20分钟内用16-34%ACN的0.1M三乙基碳酸氢铵缓冲液梯度洗脱。将掺入了染料S10a的标记的多核苷酸在Phenomenex Gemini柱(5μm C18/>)上通过HPLC纯化,在20分钟内用18-38%ACN的0.1M三乙基碳酸氢铵缓冲液梯度洗脱。两个示例性标记的多核苷酸的HPLC图谱显示在图3A和3B中。
图1D显示了S10a标记的寡核苷酸SEQ ID NO:1的发射/激发光谱,表明S10a可以用作TAMRA染料的替代物。此外,如图3B所示,与由示例性S10标记的多核苷酸产生的多个峰相比(图3A),示例性S10a标记的多核苷酸通过HPLC主要产生单个峰,这简化了此类寡核苷酸的色谱纯化。
除非本文另外指出,否则本发明的实践可采用细胞生物学、分子生物学、微生物学、病毒学、重组DNA等的常规技术,其在本领域技术范围内。文献中对这种技术进行了充分的解释。参见,例如Sambrook,Fritsch,和Maniatis,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第二版(1989),Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编辑,1984),Animal CellCulture(R.I.Freshney编辑,1987),the series Methods In Enzymology(AcademicPress,Inc.);Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.M.Miller和M.P.Calos编辑,1987),Current Protocols In Molecular Biology(F.M.Ausubel,R.Brent,R.E.Kingston,D.D.Moore,J.G.Siedman,J.A.Smith,和K.Struhl,编辑,1987)。
尽管已经说明和描述了说明性实施方案,但是应当理解,可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下进行各种改变。
序列表
<110> 塞弗德公司
K·P·伦德
D·塞尔盖耶夫
M·N·卡巴尔
A·高尔
<120> 磺酰罗丹明亚磷酰胺染料
<130> CEPH-1-69367
<150> 62/668,109
<151> 2018-05-07
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> conflict
<222> (1)..(17)
<223> 合成的
<400> 1
tcagagtacc tgaaaca 17
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> conflict
<222> (1)..(23)
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> 2,6-二氨基嘌呤
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> 2,6-二氨基嘌呤
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> 2,6-二氨基嘌呤
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> 2,6-二氨基嘌呤
<400> 2
ccncggngcg ngacntctcg gcc 23
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> conflict
<222> (1)..(20)
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> 2,6-二氨基嘌呤
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> 2,6-二氨基嘌呤
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> 2,6-二氨基嘌呤
<400> 3
ccngngcaaa ctgggcggcn 20
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> conflict
<222> (1)..(27)
<223> 合成的
<400> 4
aaacctccag gccagaaaga gagagta 27
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> conflict
<222> (1)..(29)
<223> 合成的
<400> 5
aaaaggcatt cctgaagctg acagcattc 29
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> conflict
<222> (1)..(26)
<223> 合成的
<400> 6
aaaacctgcc ttctgcgtga gattct 26
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> conflict
<222> (1)..(26)
<223> 合成的
<400> 7
ctgtacgaaa agaccacagg gcccat 26
Claims (52)
1.式I表示的化合物:
或其立体异构体、互变异构体或盐,其中:
R1是L1-X;
R2是卤素或SO2NH2,
R3是H或卤素;
当单独存在时,R4、R7、R8和R11独立地是H、卤素、或任选取代的C1-C6烷基,
当单独存在时,R5、R6、R9和R10独立地是H或任选取代的C1-C6烷基;
当合在一起时,R4和R5是连接R4和R5所结合的原子的任选取代的C2-C3亚烷基链;
当合在一起时,R6和R7是连接R6和R7所结合的原子的任选取代的C2-C3亚烷基链;
当合在一起时,R8和R9是连接R8和R9所结合的原子的任选取代的C2-C3亚烷基链;
当合在一起时,R10和R11是连接R10和R11所结合的原子的任选取代的C2-C3亚烷基链;
当R5和R6与R5和R6所结合的氮原子合在一起时,形成5元或6元不饱和环;
当R9和R10与R9和R10所结合的氮原子合在一起时,形成5元或6元不饱和环;
L1是任选取代的C2-C10亚烷基或任选取代的C2-C20杂亚烷基;
2.权利要求1所述的化合物,其中R2是Cl并且R3是H。
3.权利要求1所述的化合物,其中X是-OP(OCH2CH2CN)N(i-Pr)2。
4.权利要求1所述的化合物,其中L1是PEG2-10连接基团。
5.权利要求1所述的化合物,其中L1是-CH2CH2OCH2CH2-。
6.权利要求1所述的化合物,其中R4和R5合在一起是连接R4和R5所结合的原子的任选取代的C3亚烷基链;R10和R11合在一起是连接R10和R11所结合的原子的任选取代的C3亚烷基链;R6和R7合在一起是连接R6和R7所结合的原子的任选取代的C3亚烷基链;并且R8和R9合在一起是连接R8和R9所结合的原子的任选取代的C3亚烷基链。
7.权利要求1所述的化合物,其中R4和R5合在一起是连接R4和R5所结合的原子的亚丙基链;R10和R11合在一起是连接R10和R11所结合的原子的亚丙基链;R6和R7合在一起是连接R6和R7所结合的原子的亚丙基链;并且R8和R9合在一起是连接R8和R9所结合的原子的亚丙基链。
8.权利要求1所述的化合物,其中R5、R6、R9和R10各自是甲基。
11.权利要求10所述的化合物,其中X是-OP(OCH2CH2CN)N(i-Pr)2。
14.权利要求13所述的化合物,其中R3是H。
15.权利要求13所述的化合物,其中R2是H。
16.权利要求13所述的化合物,其中R2是Cl。
19.式(III)表示的化合物:
或其立体异构体、互变异构体或盐,其中:
R2是H、卤素或SO2NH2;
R3是卤素或H;
当单独存在时,R4、R7、R8和R11独立地是H、卤素、或任选取代的C1-C6烷基;
当单独存在时,R5、R6、R9和R10独立地是H或任选取代的C1-C6烷基;
当合在一起时,R4和R5是连接R4和R5所结合的原子的任选取代的C2-C3亚烷基链;
当合在一起时,R6和R7是连接R6和R7所结合的原子的任选取代的C2-C3亚烷基链;
当合在一起时,R8和R9是连接R8和R9所结合的原子的任选取代的C2-C3亚烷基链;
当合在一起时,R10和R11是连接R10和R11所结合的原子的任选取代的C2-C3亚烷基链;
当R5和R6与R5和R6所结合的氮原子合在一起时,形成5元或6元不饱和环;
当R9和R10与R9和R10所结合的氮原子合在一起时,形成5元或6元不饱和环;
n是1至9的整数;
Y是:
其中:
Q是羟基保护基;和
R12和R13独立地是任选取代的C1-C6烷基。
20.权利要求19所述的化合物,其中R2是Cl,并且R3是H。
21.权利要求19所述的化合物,其中R4和R5合在一起是连接R4和R5所结合的原子的任选取代的C3亚烷基链;R10和R11合在一起是连接R10和R11所结合的原子的任选取代的C3亚烷基链;R6和R7合在一起是连接R6和R7所结合的原子的任选取代的C3亚烷基链;并且R8和R9合在一起是连接R8和R9所结合的原子的任选取代的C3亚烷基链。
22.权利要求19所述的化合物,其中R4和R5合在一起是连接R4和R5所结合的原子的亚丙基链;R10和R11合在一起是连接R10和R11所结合的原子的亚丙基链;R6和R7合在一起是连接R6和R7所结合的原子的亚丙基链;并且R8和R9合在一起是连接R8和R9所结合的原子的亚丙基链。
23.权利要求19所述的化合物,其中Q是酸不稳定的羟基保护基。
24.权利要求19所述的化合物,其中Q是三苯甲基或二甲氧基三苯甲基。
25.权利要求19所述的化合物,其中R12和R13各自是异丙基。
27.一种标记的多核苷酸,其包含式IV的化合物:
或其立体异构体、互变异构体或盐,其中:
R2是卤素或SO2NH2;
R3是H或卤素;
当单独存在时,R4、R7、R8和R11独立地是H、卤素、或任选取代的C1-C6烷基,
当单独存在时,R5、R6、R9和R10独立地是H或任选取代的C1-C6烷基;
当合在一起时,R4和R5是连接R4和R5所结合的原子的任选取代的C2-C3亚烷基链;
当合在一起时,R6和R7是连接R6和R7所结合的原子的任选取代的C2-C3亚烷基链;
当合在一起时,R8和R9是连接R8和R9所结合的原子的任选取代的C2-C3亚烷基链;
当合在一起时,R10和R11是连接R10和R11所结合的原子的任选取代的C2-C3亚烷基链;
当R5和R6与R5和R6所结合的氮原子合在一起时,形成5元或6元不饱和环;
当R9和R10与R9和R10所结合的氮原子合在一起时,形成5元或6元不饱和环;
n是1至9的整数;
Y是:
其中:
波浪线是结合至式IV的点;
W是H或L4-O-Z2;
L3、L4和L5独立地是任选取代的C2-C10亚烷基或任选取代的C2-C30杂亚烷基;
Z是CH、N、NHC(O)N或OC(O)N;
Z1是核苷酸或寡核苷酸;和
Z2是核苷酸或、寡核苷酸或H。
28.权利要求27所述的标记的多核苷酸,其中R2是Cl,并且R3是H。
29.权利要求27所述的标记的多核苷酸,其中R4和R5是连接R4和R5所结合的原子的任选取代的C3亚烷基链;R10和R11是连接R10和R11所结合的原子的任选取代的C3亚烷基链;R6和R7是连接R6和R7所结合的原子的任选取代的C3亚烷基链;并且R8和R9是连接R8和R9所结合的原子的任选取代的C3亚烷基链。
30.权利要求27所述的标记的多核苷酸,其中所述标记的多核苷酸是5'-核酸酶PCR探针。
31.权利要求27所述的标记的多核苷酸,其中所述标记的多核苷酸还包含荧光淬灭剂。
32.权利要求27所述的标记的多核苷酸,其中所述标记的多核苷酸结合到固体支持物。
33.权利要求27所述的标记的多核苷酸,其中所述固体支持物是受控的孔玻璃珠、聚苯乙烯珠、磁珠或微孔板。
35.权利要求34所述的化合物,其中R7、R8、R10、R11、R14和R15是甲基。
36.权利要求34所述的化合物,其中X是-OP(OCH2CH2CN)N(i-Pr)2。
37.权利要求34所述的化合物,其中L1是PEG2-10连接基团。
38.权利要求34所述的化合物,其中L1是-CH2CH2OCH2CH2-。
39.权利要求34所述的化合物,其中R2、R3、R4和R5是H。
40.权利要求34所述的化合物,其中R6是任选被OH或C1-C6酰氧基取代的C1-C6烷基。
41.权利要求34所述的化合物,其中R9是任选被OH或C1-C6酰氧基取代的C1-C6烷基。
42.权利要求34所述的化合物,其中R6是被OH或OAc取代的乙基。
43.权利要求34所述的化合物,其中R9是被OH或OAc取代的乙基。
45.权利要求44所述的化合物,其中R2、R3、R4和R5是H。
46.权利要求44所述的化合物,其中Q1和Q2是乙酰基。
49.一种用于制备配体的标记的缀合物的方法,所述方法包括在足以使权利要求1至26或权利要求34至48中任一项的化合物共价结合到配体从而形成所述标记的缀合物的条件下,在适当的溶剂中使所述配体与所述化合物接触。
50.权利要求49所述的方法,其中所述配体是多核苷酸、蛋白质、肽、多糖、具有烯键骨架的聚合物或固体支持物。
51.权利要求49所述的方法,其中所述配体是多核苷酸。
52.权利要求49所述的方法,其中所述足以使所述化合物共价结合到所述配体的条件是自动化的亚磷酰胺寡核苷酸合成条件。
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