BR112020022684A2

BR112020022684A2 - corantes de fosforamidita de sulforodamina

Info

Publication number: BR112020022684A2
Application number: BR112020022684-0A
Authority: BR
Inventors: Kevin P. Lund; Dmitri Sergueev; Maher N. Qabar; Alexander Gall
Original assignee: Cepheid
Priority date: 2018-05-07
Filing date: 2019-05-07
Publication date: 2021-02-17
Also published as: AU2019266218A1; EP3790931A1; WO2019217470A1; JP2021523268A; US20240067824A1; KR20210035079A; ES2967690T3; CN112533998B; MX2020011378A; CA3099701A1; EP3790931B1; CN112533998A; JP7399882B2

Abstract

São fornecidos compostos de fosforamidita de corante sulforodamina compatíveis com a síntese de oligonucleotídeo automático e polinucleotídeos rotulados que incorporam esses corantes.

Description

CORANTES DE FOSFORAMIDITA DE SULFORODAMINA

[001]A invenção fornece novos compostos de corante de fosforamidita de sulforodamina úteis como corantes vermelhos compatíveis com a síntese automática de oligonucleotídeos.

[002]Os corantes fluorescentes estão entre as etiquetas mais comumente usadas para modificar oligonucleotídeos porque oferecem detecção sensível em uma ampla variedade de aplicações que variam de PCR a sequenciamento. Os corantes de rodamina são amplamente usados na rotulação de oligonucleotídeos porque oferecem um máximo de emissão de comprimento de onda mais longo do que outros corantes, tais como fluoresceínas, e fornecem oportunidades para rotulação e coloração multicoloridas. Adicionalmente, as rodaminas exibem maior fotoestabilidade do que as fluoresceínas e cumarinas.

[003]A preparação de polinucleotídeos rotulados com corante fluorescente é tipicamente feita por conjugação pós- sintética, por exemplo, pela reação de um intermediário de corante ativado com um derivado amino de um polinucleotídeo. Essa abordagem sofre de certas desvantagens, incluindo baixos rendimentos de conjugação e a necessidade de purificação adicional do produto conjugado. A incorporação de corantes fluorescentes em polinucleotídeos sintéticos por meio da síntese automática de fosforamidita oferece uma abordagem mais conveniente. No entanto, alguns derivados de fosforamidita de corantes fluorescentes que permitem que o corante fluorescente seja adicionado ao polinucleotídeo como parte da síntese automática em fase sólida estão comercialmente disponíveis.

[004]Um exemplo de um corante de rotulação de oligonucleotídeo popular é o cloreto de sulfonila Sulforodamina 101 (corante Texas Red®). No entanto, o corante Texas Red® só pode ser introduzido em um oligonucleotídeo por meio de acoplamento pós-sintético, pois nenhum derivado de fosforamidita do corante Texas Red® é conhecido. Como o corante Texas Red® é instável, ele dá rendimentos de acoplamento muito mais baixos do que os corantes de carboxirrodamina (tal como 5-TAMRA, SE), o que aumenta os custos associados à preparação de oligonucleotídeos rotulados com Texas Red®.

[005]Para ser uma alternativa viável ao corante Texas Red® para síntese automática de oligonucleotídeos, um fluoróforo deve ter características espectrais próximas às do corante Texas Red®. Esse fluoróforo deve ser estável a condições de síntese de oligonucleotídeos padrão (por exemplo, tratamento com iodo, capeamento e condições de desproteção a ácido) e passível de incorporação em qualquer posição no oligonucleotídeo. Adicionalmente, para aplicações de PCR, o brilho de tal fluoróforo deve ser insensível a mudanças na faixa de pH biologicamente relevante, e o corante precisa ser bem extinto para produzir alta Fluorescência em Ponto Final (EPF), que é medida como uma diferença entre a fluorescência de uma sonda extinta e uma sonda clivada ou uma sonda não extinta (por exemplo, uma sonda hibridizada).

[006]Alternativas previamente conhecidas de corante Texas Red® que são compatíveis com a síntese de oligo têm certas desvantagens. Por exemplo, o corante CAL Fluor Red® 610 é um fosforamidita que fluoresce na região laranja- vermelho do espectro visível e pode ser usado para a rotulação 5’ de sondas fluorogênicas, tais como sondas usadas em ensaios de nuclease 5’, sinalizadores moleculares, e ensaios de detecção similares. No entanto, esse corante não contém um grupo hidroxila protegido e, assim, só pode ser adicionado ao terminal 5’ de um oligonucleotídeo, limitando suas aplicações. Outra família de corantes, AquaPhluor®, inclui um corante vermelho que é altamente fluorescente com um máximo de absorção em 593 nm e um máximo de emissão em 613 nm. No entanto, devido às suas limitações estruturais, esse corante só pode ser incorporado na extremidade 5’ ou na extremidade 3’ de um oligonucleotídeo.

[007]Assim, ainda existe uma necessidade de que corantes fluorescentes vermelhos que sejam compatíveis com as condições de síntese automática de oligonucleotídeos de fosforamidita, possam ser incorporados em qualquer posição de um polinucleotídeo, ter máximos de emissão e absorção compatíveis com a instrumentação de PCR existente, e fornecer um sinal fluorescência em ponto final forte em aplicações de PCR.

SUMÁRIO

[008]Em um aspecto, é fornecido nesse documento um composto com uma estrutura representada pela Fórmula I: ou um estereoisômero, tautômero ou sal do mesmo, em que: R1 é alquila C1-C6 ou L1-X; R2 é halogênio ou SO2NH2,

R3 é H ou halogênio; R4, R7, R8 e R11 quando considerados sozinhos são independentemente H, halogênio ou alquila C1-C6 opcionalmente substituído, R5, R6, R9 e R10 quando considerados sozinhos são independentemente H ou alquila C1-C6 opcionalmente substituído; R4 e R5 quando considerados em conjunto são uma cadeia de alquileno C2-C3 opcionalmente substituído conectando os átomos aos quais R4 e R5 são ligados; R6 e R7 quando considerados em conjunto são uma cadeia de alquileno C2-C3 opcionalmente substituído conectando os átomos aos quais R6 e R7 são ligados; R8 e R9 quando considerados em conjunto são uma cadeia de alquileno C2-C3 opcionalmente substituído conectando os átomos aos quais R8 e R9 são ligados; R10 e R11 quando considerados em conjunto são uma cadeia de alquileno C2-C3 opcionalmente substituído conectando os átomos aos quais R10 e R11 são ligados; R5 e R6, quando considerados em conjunto com o átomo de nitrogênio ao qual R5 e R6 são ligados, formam um anel insaturado de 5 ou 6 membros; R9 e R10, quando considerados em conjunto com o átomo de nitrogênio ao qual R9 e R10 são ligados, formam um anel insaturado de 5 ou 6 membros; L1 é um alquileno C2-C10 opcionalmente substituído ou um heteroalquileno C2-C20 opcionalmente substituído; X é um éster ativado, N3, propinila, maleimido ou –O- P(OCH2CH2CN)NR12R13 ou X é:

em que L3 e L4 são independentemente um alquileno C2-C10 opcionalmente substituído ou heteroalquileno C2-C30 opcionalmente substituído; Q é um grupo protetor de hidroxila; Z é CH, N, NHC(O)N, ou OC(O)N; e R12 e R13 são independentemente alquila C1-C6 opcionalmente substituído.

[009]Em algumas modalidades, R2 é Cl e R3 é H. Em algumas modalidades, X é -OP(OCH2CH2CN)N(i-Pr)2. Em algumas modalidades, L1 é um ligante PEG2-10. Em certas modalidades, L1 é -CH2CH2OCH2CH2.

[0010]Em algumas modalidades, R4 e R5 considerados em conjunto são uma cadeia de alquileno C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais R4 e R5 são ligados; R10 e R11 considerados em conjunto são uma cadeia de alquileno C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais R10 e R11 são ligados; R6 e R7 considerados em conjunto são uma cadeia de alquileno C3 opcionalmente substituído que liga os átomos aos quais R6 e R7 são ligados; e R8 e R9 em conjunto são uma cadeia de alquileno C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais R8 e R9 são ligados. Em algumas modalidades, R4 e R5 considerados em conjunto são uma cadeia de propileno que conecta os átomos aos quais R4 e R5 são ligados; R10 e R11 considerados em conjunto são uma cadeia de propileno que conecta os átomos aos quais R10 e R11 são ligados; R6 e R7 considerados em conjunto são uma cadeia de propileno que conecta os átomos aos quais R6 e R7 são ligados; e R8 e R9 considerados em conjunto são uma cadeia de propileno que conecta os átomos aos quais R8 e R9 são ligados. Em algumas modalidades, cada um de R5, R6, R9 e R10 é metila.

[0011]Em algumas modalidades, Q é um grupo protetor de hidroxila instável em ácido. Em algumas modalidades, Q é um grupo tritila ou dimetoxitritila.

[0012]Em algumas modalidades, alquileno C2-C6 ou - (OCH2CH2)m-, em que m é um número inteiro que varia de 2 a 6. Em algumas modalidades, L3 e L4 são -CH2CH2-. Em algumas modalidades, X é:

[0013]Em algumas modalidades, o composto tem uma estrutura representada pela Fórmula IA:

ou um estereoisômero, tautômero ou sal do mesmo, em que R1 é L1X e R3 é H ou halogênio. Em algumas modalidades, X é -OP(OCH2CH2CN)N(i-Pr)2.

[0014]Em algumas modalidades, o composto é:

[0015]Em um segundo aspecto, é fornecido nesse documento um composto representado pela Fórmula II: ou um estereoisômero, tautômero ou sal do mesmo, em que: R1 é alquila C1-C6; R2 é H, halogênio ou SO2NH2, R3 é H ou halogênio; R14 e R16 quando considerados sozinhos são independentemente H, halogênio ou alquila C1-C6 opcionalmente substituído; R15 e R17 quando considerados sozinhos são independentemente H ou alquila C1-C6 opcionalmente substituído; R14 e R15 quando considerados em conjunto formam uma cadeia de alquileno C2-C3 opcionalmente substituído, conectando os átomos aos quais R14 e R15 se ligam; R16 e R17 quando considerados em conjunto formam uma cadeia de alquileno C2-C3 opcionalmente substituído conectando os átomos aos quais R16 e R17 são ligados; Q é um grupo protetor de hidroxila; e L1 e L2 são independentemente um alquileno C2-C10 opcionalmente substituído ou heteroalquileno C2-C20 opcionalmente substituído.

[0016]Em algumas modalidades, R3 é H. Em algumas modalidades, R2 é H. Em algumas modalidades, R2 é Cl.

[0017]Em algumas modalidades, o composto é representado pela Fórmula (IIA): ou um estereoisômero, tautômero ou sal do mesmo, em que: R1 é alquila C1-C6; R2 é H, halogênio ou SO2NH2; e R3 é H ou halogênio.

[0018]Em algumas modalidades, o composto é:

[0019]Em um terceiro aspecto, é fornecido nesse documento um composto com uma estrutura de Fórmula (III):

ou um estereoisômero, tautômero ou sal do mesmo, em que: R2 é H, halogênio ou SO2NH2; R3 é halogênio ou H; R4, R7, R8 e R11 quando considerados sozinhos são independentemente H, halogênio ou alquila C1-C6 opcionalmente substituído, R5, R6, R9 e R10 quando considerados sozinhos são independentemente H ou alquila C1-C6 opcionalmente substituído; R4 e R5 quando considerados em conjunto são uma cadeia de alquileno C2-C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais R4 e R5 são ligados; R6 e R7 quando considerados em conjunto são uma cadeia de alquileno C2-C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais R6 e R7 são ligados; R8 e R9 quando considerados em conjunto são uma cadeia de alquileno C2-C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais R8 e R9 são ligados;

R10 e R11 quando considerados em conjunto são uma cadeia de alquileno C2-C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais R10 e R11 são ligados; R5 e R6, quando considerados em conjunto com o átomo de nitrogênio ao qual R5 e R6 são ligados, formam um anel insaturado de 5 ou 6 membros; R9 e R10, quando considerados em conjunto com o átomo de nitrogênio ao qual R9 e R10 são ligados, formam um anel insaturado de 5 ou 6 membros; n é um número inteiro de 1 a 9; Y é: em que: Q é um grupo protetor de hidroxila; e R12 e R13 são independentemente alquila C1-C6 opcionalmente substituído.

[0020]Em algumas modalidades, R2 é Cl e R3 é H.

[0021]Em algumas modalidades, R4 e R5 considerados em conjunto são uma cadeia de alquileno C3 opcionalmente substituída que conecta os átomos aos quais R4 e R5 são ligados; R10 e R11 considerados em conjunto são uma cadeia de alquileno C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais R10 e R11 são ligados; R6 e R7 considerados em conjunto são uma cadeia de alquileno C3 opcionalmente substituído que liga os átomos aos quais R6 e R7 são ligados; e R8 e R9 considerados em conjunto são uma cadeia de alquileno C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais R8 e R9 são ligados. Em algumas modalidades, R4 e R5 considerados em conjunto são uma cadeia de propileno que conecta os átomos aos quais R4 e R5 são ligados; R10 e R11 considerados em conjunto são uma cadeia de propileno que conecta os átomos aos quais R10 e R11 são ligados; R6 e R7 considerados em conjunto são uma cadeia de propileno que conecta os átomos aos quais R6 e R7 são ligados; e R8 e R9 em conjunto são uma cadeia de propileno que conecta os átomos aos quais R8 e R9 são ligados.

[0022]Em algumas modalidades, Q é um grupo protetor de hidroxila instável em ácido. Em algumas modalidades, Q é um grupo tritila ou dimetoxitritila. Em ainda outras modalidades, cada um de R12 e R13 é isopropila.

[0023]Em algumas modalidades, o composto é:

[0024]Em um quarto aspecto, é fornecido nesse documento um composto representado pela Fórmula VI:

ou um estereoisômero, tautômero ou sal do mesmo, em que: R1 é L1-X; R2, R3, R4 e R5 são independentemente H, halogênio, alquila C1-C6 ou SO2NH2; R6 e R9 são independentemente H ou alquila C1-C6 opcionalmente substituído; R7, R8, R10, R11, R14 e R15 são independentemente H ou alquila C1-C6 opcionalmente substituído; L1 é um alquileno C2-C10 opcionalmente substituído ou um heteroalquileno C2-C20 opcionalmente substituído; X é um éster ativado, N3, propinila, maleimido ou –O- P(OCH2CH2CN)NR12R13, ou X é:

[0025]Em algumas modalidades da Fórmula VI, R7, R8, R10, R11, R14 e R15 são metila. Em certas modalidades, X é - OP(OCH2CH2CN)N(i-Pr)2. Em algumas modalidades, L1 é um ligante PEG2-10 e, em outras modalidades, L1 é -CH2CH2OCH2CH2-. Em certas modalidades, R2, R3, R4 e R5 são H.

[0026]Em algumas modalidades, R6 é um alquila C1-C6 opcionalmente substituído com OH ou aciloxi C1-C6, por exemplo, R6 é um etila substituído com OH ou OAc. Em algumas modalidades, R9 é um alquila C1-C6 opcionalmente substituído com OH ou aciloxi C1-C6, por exemplo, R9 é um etila substituído com OH ou OAc.

[0027]Em algumas modalidades da Fórmula VI, o composto é: ou um estereoisômero, tautômero ou sal do mesmo, em que: R1, R2, R3, R4 e R5 são como descritos acima para a Fórmula VI; e Q1 e Q2 são independentemente H ou acila C1-C6.

[0028]Em algumas modalidades, R2, R3, R4 e R5 são H. Em algumas modalidades, Q1 e Q2 são acetila.

[0029]Em algumas modalidades da Fórmula VI, o composto é:

em que R1 é como definido acima para a Fórmula VI.

[0030]Em algumas modalidades da Fórmula VI, o composto é:

[0031]Em um quinto aspecto, é fornecido nesse documento um polinucleotídeo rotulado compreendendo um composto de fórmula IV: ou um estereoisômero, tautômero ou sal do mesmo, em que: R2 é halogênio ou SO2NH2; R3 é H ou halogênio; R4, R7, R8 e R11 quando considerados sozinhos são independentemente H, halogênio ou alquila C1-C6 opcionalmente substituído, R5, R6, R9 e R10 quando considerados sozinhos são independentemente H ou alquila C1-C6 opcionalmente substituído; R4 e R5 quando considerados em conjunto são uma cadeia de alquileno C2-C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais R4 e R5 são ligados; R6 e R7 quando considerados em conjunto são uma cadeia de alquileno C2-C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais R6 e R7 são ligados; R8 e R9 quando considerados em conjunto são uma cadeia de alquileno C2-C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais R8 e R9 são ligados; R10 e R11 quando considerados em conjunto são uma cadeia de alquileno C2-C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais R10 e R11 são ligados; R5 e R6, quando considerados em conjunto com o átomo de nitrogênio ao qual R5 e R6 são ligados, formam um anel insaturado de 5 ou 6 membros; R9 e R10, quando considerados em conjunto com o átomo de nitrogênio ao qual R9 e R10 são ligados, formam um anel insaturado de 5 ou 6 membros; n é um número inteiro de 1 a 9; Y é:

em que: a linha ondulada é o ponto de ligação à Fórmula III; R12 e R13 são independentemente alquila C1-C6 opcionalmente substituído; W é H ou L4-O-Z2; L3, L4 e L5 são independentemente um alquileno C2-C10 opcionalmente substituído ou heteroalquileno C2-C30 opcionalmente substituído; Z é CH, N, NHC(O)N, ou OC(O)N; Z1 é um nucleotídeo ou oligonucleotídeo; e Z2 é um nucleotídeo, oligonucleotídeo ou H.

[0032]Em algumas modalidades, R2 é Cl e R3 é H. Em outras modalidades, R4 e R5 são uma cadeia de alquileno C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais R4 e R5 são ligados; R10 e R11 são uma cadeia de alquileno C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais R10 e R11 são ligados; R6 e R7 são uma cadeia de alquileno C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais R6 e R7 são ligados; e R8 e R9 são uma cadeia de alquileno C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais R8 e R9 são ligados.

[0033]Em algumas modalidades, o polinucleotídeo rotulado é uma sonda de PCR de 5’-nuclease. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo rotulado compreende adicionalmente um extintor fluorescente. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo rotulado é afixado a um suporte sólido. Em algumas modalidades, o suporte sólido é um grânulo de vidro de poro controlado, grânulo de poliestireno, grânulo magnético ou placa de micropoços.

[0034]Em um quinto aspecto, é fornecido nesse documento um método para preparar um conjugado rotulado de um ligante compreendendo contactar um ligante com um composto divulgado nesse documento em um solvente adequado sob condições suficientes para ligar covalentemente o composto ao ligante, formando assim o conjugado rotulado.

[0035]Em algumas modalidades, o ligante é um polinucleotídeo, uma proteína, um peptídeo, um polissacarídeo, um polímero com uma estrutura principal etilênica ou um suporte sólido. Em algumas modalidades, o ligante é um polinucleotídeo. Em outras modalidades, as condições suficientes para afixar covalentemente o composto ao ligante são condições de síntese automática de oligonucleotídeos de fosforamidita.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0036]Os aspectos anteriores e muitas das vantagens associadas dessa invenção serão mais facilmente reconhecidos à medida que os mesmos se tornam mais bem compreendidos por referência à seguinte descrição detalhada, quando considerada em conjunto com os desenhos anexos, em que: A FIGURA 1A é o espectro de excitação e emissão de um polinucleotídeo de exemplo de SEQ ID NO: 1 rotulada com corante Texas Red®: (Tx Red)-TCAGAGTACCTGAAACA; (Oligo A) Ex/Em max = 598 nm/616 nm. Nessa figura, o eixo x é nm e o eixo y é unidade de fluorescência.

[0037]A FIGURA 1B é o espectro de excitação e emissão de um polinucleotídeo de exemplo de SEQ ID NO: 1 rotulada com o corante S7: (S7)-TCAGAGTACCTGAAACA (Oligo B); Ex/Em = 598 nm/616 nm. Nessa figura, o eixo x é nm e o eixo y é unidade de fluorescência.

[0038]A FIGURA 1C representa os espectros de excitação e emissão de um polinucleotídeo de exemplo de SEQ ID NO: 1 rotulada com corante sulforodamina S6: (S6)- TCAGAGTACCTGAAACA (Oligo C); Ex/Em máx = 568/589 nm. Nessa figura, o eixo x é nm e o eixo y é unidade de fluorescência.

[0039]A FIGURA 1D representa os espectros de excitação e emissão de um polinucleotídeo de exemplo de SEQ ID NO: 1

5’ rotulada com corante sulforodamina S10a; Ex/Em max = 568/587 nm.

[0040]A FIGURA 2A mostra curvas de PCR comparando o desempenho da sonda tendo SEQ. ID NO: 2 rotulada com corante Texas Red® (Oligo D) e sonda tendo SEQ ID NO: 2 rotulada com um corante de exemplo (Oligo E) em uma reação de PCR modelo usando iniciadores de SEQ ID NOS: 4 e 5. Nessa Figura, o eixo x é Ct, e o eixo y é unidade de fluorescência.

[0041]A FIGURA 2B mostra curvas de PCR comparando o desempenho da sonda rotulada com corante Texas Red® tendo SEQ ID NO: 3 rotulada com corante Texas Red® (Oligo F) e a sonda tendo SEQ. ID NO: 3 rotulada com um corante de exemplo (Oligo G) em uma reação de PCR modelo usando iniciadores de SEQ ID NOS: 6 e 7. Nessa figura, o eixo x é Ct, e o eixo y é unidade de fluorescência.

[0042]As FIGURAS 3A e 3B são traços de HPLC de oligonucleotídeos de exemplo rotulados com o composto de exemplo racêmico S10 (3A) e seu isômero S10a (3B). Nessa figura, o eixo x é minuto, e o eixo y é absorbância em 260 nm.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0043]São fornecidos nesse documento fosforamiditas de corante sulforodamina que podem ser incorporados em oligonucleotídeos por meio de síntese de oligonucleotídeos automática padrão. Adicionalmente, são fornecidos corantes sulforodamina compreendendo outros grupos reativos.

[0044]Ao longo do presente relatório descritivo e das reivindicações anexas, as palavras “compreende” e “inclui” e variações das mesmas, tais como, “compreende”, “compreendendo”, “inclui” e “incluindo” destinam-se a transmitir a possível inclusão de outros elementos ou inteiros não recitados especificamente, onde o contexto permite. Tal como usado nesse documento, o termo “consistindo em” pretende significar incluindo e limitado a tudo o que segue a frase “consistindo em”. Assim, a frase “consistindo em” indica que os elementos listados são necessários ou obrigatórios e que nenhum outro elemento pode estar presente. O termo “consistindo essencialmente em” significa que a composição, método ou estrutura pode incluir ingredientes, etapas e/ou partes adicionais, mas apenas se os ingredientes, etapas e/ou partes adicionais não alteram materialmente as características básicas e novas da(o) composição, método ou estrutura reivindicada(o).

[0045]Os termos “um” e “uma” e “o” e termos semelhantes devem ser interpretados para abranger o singular e o plural, a menos que indicado de outra forma nesse documento ou claramente contradito pelo contexto.

[0046]Todos os métodos descritos nesse documento podem ser realizados em qualquer ordem adequada, a menos que indicado de outra forma nesse documento ou claramente contradito pelo contexto. O uso de todo e qualquer exemplo ou linguagem de exemplo (por exemplo, “tal como”) fornecido nesse documento se destina apenas a iluminar melhor a invenção e não representa uma limitação ao escopo da invenção reivindicada de outra forma.

[0047]Os agrupamentos de elementos alternativos ou modalidades da invenção divulgados nesse documento não devem ser interpretados como limitações. Cada membro do grupo pode ser referido e reivindicado individualmente ou em qualquer combinação com outros membros do grupo ou outros elementos encontrados nesse documento. Antecipa-se que um ou mais de membros de um grupo pode(m) ser incluído(s) ou excluído(s) de um grupo por razões de conveniência e/ou patenteabilidade. Quando ocorre qualquer inclusão ou exclusão, o relatório descritivo é considerado nesse documento como contendo o grupo modificado, cumprindo assim a descrição escrita de todos os grupos Markush usados nas reivindicações anexas.

[0048]Salvo indicação em contrário, os ácidos nucleicos ou oligonucleotídeos são escritos da esquerda para a direita na orientação 5’ para 3’.

[0049]Como usado nesse documento, o termo “amplificação” refere-se a qualquer meio pelo qual pelo menos uma sequência parcial de pelo menos um ácido nucleico alvo ou seu complemento de sequência é produzida, tipicamente de uma forma dependente do modelo, incluindo, sem limitação, uma ampla faixa de técnicas para amplificar sequências de ácido nucleico, linear ou exponencialmente. Métodos de amplificação exemplificativos não limitativos incluem reação em cadeia da polimerase (PCR), PCR-transcriptase reversa, PCR em tempo real, PCR aninhada, PCR multiplex, PCR quantitativa (Q-PCR), amplificação baseada em sequência de ácidos nucleicos (NASBA), amplificação mediada por transcrição (TMA), reação em cadeia da ligase (LCR), amplificação por círculo rolante (RCA), amplificação por deslocamento de fita (SDA), reação de detecção de ligase (LDR), amplificação multiplex de sonda dependente de ligação (MLPA), ligação seguida de amplificação de Q-replicase, extensão de iniciador, amplificação por deslocamento de fita (SDA), amplificação por deslocamento de fita hiper- ramificada, amplificação por deslocamento múltiplo (MDA),

amplificação baseada em fita de ácido nucleico (NASBA), amplificações multiplexadas em duas etapas, amplificação digital e semelhantes. Descrições dessas técnicas podem ser encontradas em, entre outras fontes, Ausubel et al.; PCR Primer: A Laboratory Manual, Diffenbach, Ed., Cold Spring Harbor Press (1995); The Electronic Protocol Book, Chang Bioscience (2002); The Nucleic Acid Protocols Handbook, R. Rapley, ed., Humana Press, Totowa, N.J. (2002); e Innis et al, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990).

[0050]Como usado nesse documento, o termo “base” significa uma porção heterocíclica contendo nitrogênio capaz de formar ligações de hidrogênio, por exemplo, ligações de hidrogênio do tipo Watson-Crick, com uma base de nucleotídeo complementar ou análogo de base de nucleotídeo, por exemplo, uma purina, uma 7-deazapurina ou uma pirimidina. As bases típicas são as bases de ocorrência natural adenina, citosina, guanina, timina e uracila. As bases também incluem análogos de bases de ocorrência natural, tais como, deaza-adenina, 7- deaza-8-aza-adenina, 7-deazaguanina, 7-deaza-8-azaguanina, inosina, nebularina, nitropirrol, nitroindol, 2-amino- purina, 2,6- diamino-purina, hipoxantina, 5-metilcitosina, isocitosina, pseudoisocitosina, 5-bromouracila, 5- propiniluracila, 6-aminopurina, 2-cloro-6-aminopurina, xantina, hipoxantina, etc.

[0051]Como usado nesse documento, o termo “complementar” refere-se à capacidade das sequências de polinucleotídeos de hibridizarem para e a partir de pares de bases umas com as outras. Os pares de bases são tipicamente formados por ligações de hidrogênio entre unidades de nucleotídeos em fitas de polinucleotídeos antiparalelas. Cadeias de polinucleotídeos complementares podem emparelhar de maneira Watson-Crick (por exemplo, A T, A U, C a G), ou de qualquer outra maneira que permita a formação de duplexes. A percentagem de “complementaridade” de uma sequência de sonda para uma sequência alvo é a “identidade” de percentagem da sequência de sonda para a sequência do alvo ou para o complemento da sequência do alvo. Na determinação do grau de “complementaridade” entre uma sonda e uma sequência alvo, o grau de “complementaridade” é expressado como a porcentagem de identidade entre a sequência da sonda e a sequência da sequência alvo ou o complemento da sequência da sequência alvo que melhor se alinha com a mesma. Uma sonda de exemplo é um polinucleotídeo como descrito nesse documento.

[0052]Como usado nesse documento, o termo “duplex” refere-se a um complexo de hibridização de fita dupla formado por anelamento (hibridização) de polinucleotídeos de fita simples complementares (ou parcialmente complementares), por exemplo, DNA, RNA, LNA ou ácido nucleico de peptídeo (PNA).

[0053]Como usado nesse documento, “extinção de fluorescência” refere-se a qualquer processo que diminui a intensidade de fluorescência de uma amostra fluorescente, isto é, uma sonda de polinucleotídeo fluorescente. Uma variedade de interações moleculares pode resultar em extinção. Exemplos não limitativos incluem reações de estado excitado, rearranjos moleculares, transferência de energia, formação de complexo de estado fundamental e extinção por colisão.

[0054]Como usado nesse documento, “halogênio” significa F, Cl, Br ou I.

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[0055]Os termos “hibridizar” e “hibridização” são usados nesse documento com referência à “hibridização específica” que é a ligação, duplicação ou anelamento de uma molécula de ácido nucleico, de preferência, a uma sequência de nucleotídeos particular, em algumas modalidades, sob condições rigorosas.

O termo “condições estringentes” refere-se a condições sob as quais uma sonda hibridizará, de preferência, com sua sequência alvo, e em menor extensão com, ou não com outras sequências. “Hibridização estringente” e “condições estringentes de lavagem e hibridização” no contexto da hibridização de ácido nucleico são dependentes da sequência e são diferentes sob diferentes parâmetros ambientais.

Um guia extenso para a hibridização de ácidos nucleicos é encontrado em, por exemplo, Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes part I, Cap. 2, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays," Elsevier, NY.

O grau de hibridização de um polinucleotídeo para uma sequência alvo, também conhecido como força de hibridização, é determinado por métodos que são bem conhecidos na técnica.

Um método preferido é determinar a Tm de um dado duplex híbrido.

Isso pode ser realizado submetendo um duplex formado em solução a um aumento gradual da temperatura e monitorando a desnaturação do duplex, por exemplo, por absorbância de luz ultravioleta, que aumenta com o desempilhamento de pares de bases que acompanha a desnaturação.

Tm é geralmente definida como a temperatura na qual metade das fitas de DNA estão no estado de fita simples (ssDNA). Tm depende de vários parâmetros, tais como, o comprimento da sequência da fita complementar hibridizada, suas sequências de nucleotídeos específicas, composições de bases, modificações de bases e as concentrações das fitas complementares.

[0056]Como usado nesse documento, os termos “rótulo” e “rótulo detectável” são usados indistintamente e se referem a uma porção que, quando ligada a uma biomolécula, um nucleosídeo, um nucleotídeo ou um polinucleotídeo, torna essa biomolécula, nucleosídeo, nucleotídeo ou polinucleotídeo detectável por meios de detecção adequados. Rótulos de exemplo incluem fluoróforos, cromóforos, radioisótopos, rótulos de rotação, rótulos de enzima, rótulos quimioluminescentes, compostos eletroquimioluminescentes, rótulos magnéticos, microesferas, metal coloidal, rótulos imunológicos, ligantes, enzimas e semelhantes.

[0057]Como usado nesse documento, os termos “base de nucleotídeo modificada” ou “base modificada” referem-se a uma base que não tem a estrutura de uma base de ocorrência natural e, portanto, de ocorrência não natural. Como usado nesse documento, os termos “açúcar modificado” referem-se a um açúcar ou análogo de açúcar que não tem a estrutura de um açúcar de ocorrência natural, por exemplo, açúcar ribose ou desoxirribose e, portanto, de ocorrência não natural.

[0058]Como usado nesse documento, o termo “de ocorrência natural” no contexto de moléculas de ácido nucleico refere- se a uma molécula de RNA ou DNA (fita simples ou fita dupla) tendo uma sequência de nucleotídeos que ocorre na natureza e compreendendo apenas componentes, tais como, bases, açúcares, nucleosídeos e nucleotídeos que ocorrem na natureza.

[0059]Como usado nesse documento, o termo “nucleosídeo” refere-se a uma molécula que consiste em uma base nitrogenada do tipo mencionado nesse documento que é ligada a um açúcar dos tipos mencionados nesse documento, por exemplo, a açúcar ribose ou desoxirribose por meio de uma ligação beta- glicosídica. Exemplos de nucleosídeos incluem adenosina, citidina, guanosina, timidina, uridina e inosina.

[0060]Como usado nesse documento, o termo “nucleotídeo” significa um éster de fosfato de um nucleosídeo, seja como um monômero independente ou como uma subunidade dentro de um polinucleotídeo. Monômeros de nucleotídeo incluem, por exemplo, nucleotídeo 5’-monofosfato, 5’-difosfato, 5’- trifosfato e 3’-monofosfato. Os trifosfatos de nucleotídeos são algumas vezes indicados como “NTP”, “dNTP” (2’- desoxipentose) ou “ddNTP” (2’,3’-didesoxipentose) para apontar particularmente as características estruturais do açúcar ribose. “Nucleotídeo 5’-trifosfato” refere-se a um nucleotídeo com um grupo éster trifosfato na posição 5’. O grupo éster trifosfato pode incluir substituições de enxofre para um ou mais de átomos de oxigênio fosfato, por exemplo, alfa-tionucleotídeo 5’-trifosfatos. Um monofosfato, difosfato ou trifosfato de nucleotídeo pode servir como substrato para uma enzima de processamento de ácido nucleico que catalisa modificações de ácidos nucleicos ou intermediários de ácido nucleico.

[0061]Como usado nesse documento, o termo “oligonucleotídeo” refere-se amplamente a uma cadeia de fita simples composta principalmente ou inteiramente por cerca de 2 a cerca de 300 unidades de monômero de nucleotídeo de ocorrência natural ou modificadas, por exemplo, de anéis de açúcar desoxirribose ou ribose substituídos com bases A, C, G, T ou U e que estão ligadas por porções de estrutura principal de fosfato convencionais. Mais particularmente, o termo refere-se a uma cadeia simples de desoxirribonucleotídeos, na faixa de tamanho descrita acima. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo pode compreender um(a) ou mais de bases e/ou açúcares modificada(o)s. Além das unidades de monômero de nucleotídeo, um oligonucleotídeo pode incorporar um ou mais de rótulos detectáveis e/ou um ou mais grupos reativos.

[0062]Como usado nesse documento, o termo “pluralidade” significa mais de um.

[0063]Como usado nesse documento, o termo “polinucleotídeo” geralmente se refere a um oligonucleotídeo que compreende cerca de 10 a cerca de 300 unidades de monômero de nucleotídeo. Além das unidades de monômero de nucleotídeo, um polinucleotídeo pode incorporar um ou mais de rótulos detectáveis e/ou um ou mais grupos reativos.

[0064]Como usado nesse documento, o termo “iniciador” refere-se a um polinucleotídeo ou polinucleotídeo modificado que é eficaz como ponto de partida para sintetizar uma cadeia de polinucleotídeo que é complementar a uma cadeia de ácido nucleico alvo. Por exemplo, os iniciadores para uso em PCR compreendem um iniciador direto e reverso, em que o iniciador direto contém uma sequência complementar a uma região de uma fita de ácido nucleico alvo e orienta a síntese de uma fita complementar. Um iniciador reverso contém uma sequência complementar à fita oposta e orienta a síntese ao longo da fita oposta da fita de ácido nucleico alvo.

[0065]Como usado nesse documento, o termo “sonda”

refere-se a um oligonucleotídeo rotulado ou oligonucleotídeo modificado rotulado contendo uma sequência complementar a uma região de uma sequência de ácidos nucleicos alvo, permitindo que a sonda forme um duplex com a sequência alvo e gere um sinal detectável indicando a presença da região da sequência alvo. Um sinal detectável é gerado por ou após a hibridização, direta ou indiretamente. Em algumas aplicações, como durante a extensão do iniciador em PCR de 5’-nuclease, as sondas carecem de um grupo hidroxila 3’ extensível para evitar a extensão da sonda mediada por polimerase. Em certas modalidades, as sondas incluem sondas TaqMan®, sondas TaqMan MGB®, sondas Pleiades®, sinalizadores moleculares (por exemplo, aqueles divulgados em Tyagi, Sanjay & Kramer, Fred. (2012) Molecular Beacons in Diagnostics. F1000 medicine reports. 4. 10 . 10.3410/M4-10) e semelhantes.

[0066]Como usado nesse documento, os termos “grupo de proteção”, “grupo protetor” ou “forma protegida” referem-se a uma modificação química instável de um grupo funcional (por exemplo, hidroxila) destinada a preservar sua funcionalidade e/ou obter quimiosseletividade em uma reação química. Um grupo de proteção é removido do produto final por um tratamento desprotetor (por exemplo, tratamento com ácido).

[0067]Como usado nesse documento, o termo “suporte sólido” refere-se a qualquer material insolúvel incluindo partículas (por exemplo, grânulos), fibras, monolitos, membranas, filtros, tiras de plástico, matrizes, placas de micropoços e semelhantes. Em algumas modalidades, os suportes sólidos são suportes sólidos adequados para a síntese automática de oligonucleotídeos de fosforamidita, tais como, poliestireno e vidro de poro controlado (CPG). Corantes Sulforodamina e Fosforamiditas dos mesmos

[0068]Em um aspecto, são fornecidos nesse documento corantes sulforodamina compreendendo um ou mais de grupos reativos, por exemplo, um grupo fosforamidita.

[0069]Em certas modalidades, os corantes divulgados nesse documento compreendem uma porção sultam. Em algumas modalidades, os corantes divulgados nesse documento podem existir na forma aberta ou fechada, como mostrado abaixo para um composto de exemplo:

[0070]Na sua forma cíclica ou “fechada”, os corantes sulforodamina da divulgação e os fosforamiditas dos mesmos são incolores e não fluorescentes. No entanto, após a protonação, por exemplo, exposição a condições ácidas, a forma cíclica pode se converter na forma “aberta” que é fluorescente. Como usado nesse documento, quando se refere aos corantes divulgados nesse documento, o termo “corante sulforodamina” inclui ambas as formas fluorescentes abertas e as suas formas fechadas correspondentes, embora apenas as formas abertas sejam fluorescentes.

[0071]Tal fenômeno da transição de cor para incolor que está associado com a interconversão reversível aberta para fechada, dependente do pH de sultams derivados de corantes sulforodamina é conhecido na técnica (Ver, por exemplo, Corrie JET e Munasinghe V.R. Dyes and Pigments 79 (2008): 76-82.) Certos derivados reativos de corantes sulforodamina usados para rotular moléculas biológicas, tal como cloreto de sulforodamina B, estão geralmente disponíveis em fornecedores comerciais como uma mistura de dois isômeros de cloreto de sulfonila, isômeros orto e para, mas apenas os isômero com seu cloreto de sulfonila orto ao sistema de xantílio pode formar um composto de sulfonamida cíclico (sultam) que sofre o processo de cadeia em anel mostrado acima. Assim, foi relatado que os isômeros orto de tais corantes geralmente não são desejáveis para aplicações biológicas porque a fluorescência dos isômeros orto é dependente do pH (ver, por exemplo, Corrie JET et al. Bioconjugate Chem. 12 (2001): 186-194.). Surpreendentemente, verificou-se que os conjugados de polinucleotídeos dos corantes da presente divulgação, ao contrário do conjugado dos corantes divulgados na técnica, têm fluorescência que não é dependente do pH na faixa de pH relevante para aplicações de PCR, por exemplo, de cerca de 6,5 a cerca de 8,5, e pode ser bem extinto com extintores convencionais, tal como o extintor BHQ-2 (Biosearch), para produzir fluorescência em ponto final alta (EPF). Como usado nesse documento, a fluorescência em ponto final é uma diferença entre a fluorescência de uma sonda extinta e uma sonda clivada ou uma diferença entre a fluorescência de uma sonda extinta e uma sonda hibridizada.

[0072]Em certas modalidades, a forma “aberta” dos corantes sulforodamina divulgados nesse documento surpreendentemente tem propriedades espectrais, tais como, máximos de emissão e absorção, comparáveis a ou correspondentes aos do corante Sulforodamina 101 ou um corante TAMRA. No entanto, ao contrário dos corantes do tipo Sulforodamina 101 que compreendem grupos de ácido sulfônico polares e, portanto, não podem ser preparados na forma de reagentes de fosforamidita, os corantes sulforodamina divulgados nesse documento são não polares em sua forma fechada (sultam) e facilmente dissolvem em solventes orgânicos compatíveis com síntese automática de fosforamidita e/ou condições de bioconjugação. Essa propriedade vantajosa dos corantes divulgados nesse documento também permite facilidade de purificação por técnicas convencionais de laboratório, tal como cromatografia em coluna de gel de sílica.

[0073]Em algumas modalidades, os corantes têm uma estrutura representada pela Fórmula I: ou um estereoisômero, tautômero ou sal do mesmo, em que: R1 é alquila C1-C6 ou L1-X; R2 é halogênio ou SO2NH2, R3 é H ou halogênio; R4, R7, R8 e R11 quando considerados sozinhos são independentemente H, halogênio ou alquila C1-C6 opcionalmente substituído,

R5, R6, R9 e R10 quando considerados sozinhos são independentemente H ou alquila C1-C6 opcionalmente substituído; R4 e R5 quando considerados em conjunto são uma cadeia de alquileno C2-C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais R4 e R5 são ligados; R6 e R7 quando considerados em conjunto são uma cadeia de alquileno C2-C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais R6 e R7 são ligados; R8 e R9 quando considerados em conjunto são uma cadeia de alquileno C2-C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais R8 e R9 são ligados; R10 e R11 quando considerados em conjunto são uma cadeia de alquileno C2-C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais R10 e R11 são ligados; R5 e R6, quando considerados em conjunto com o átomo de nitrogênio ao qual R5 e R6 são ligados, formam um anel insaturado de 5 ou 6 membros; R9 e R10, quando considerados em conjunto com o átomo de nitrogênio ao qual R9 e R10 são ligados, formam um anel insaturado de 5 ou 6 membros; L1 é um alquileno C2-C10 opcionalmente substituído ou um heteroalquileno C2-C20 opcionalmente substituído; X é um éster ativado, N3, propinila, maleimido ou –O- P(OCH2CH2CN)NR12R13 ou X é:

em que L3 e L4 são independentemente um alquileno C2-C10 opcionalmente substituído ou heteroalquileno C2-C30 opcionalmente substituído; Q é um grupo de proteção de hidroxila; Z é CH, N, NHC(O)N, ou OC(O)N; e R12 e R13 são independentemente alquila C1-C6 opcionalmente substituído.

[0074]Em algumas modalidades, a Fórmula I compreende um grupo reativo. Em outras modalidades, a Fórmula I compreende dois grupos reativos ortogonalmente. Em ainda outras modalidades, além de um grupo reativo, tal como o grupo fosforamidita, a Fórmula I compreende um grupo hidroxila protegido com um grupo protetor instável em ácido, tal como o grupo tritila ou dimetoxitritila.

[0075]Em certas modalidades da Fórmula I, R2 é Cl e R3 é H. Em outras modalidades, R4 e R5 formam uma cadeia de alquileno C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais R4 e R5 são ligados; R11 e R10 formam uma cadeia de alquileno C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais R11 e R10 são ligados; R6 e R7 formam uma cadeia de alquileno C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais R6 e R7 são ligados; e R8 e R9 formam uma cadeia de alquileno C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais R8 e R9 são ligados. Em algumas modalidades, R1 é L1X. Em outras modalidades, R1 é metila ou etila. Em algumas modalidades, o alquileno C3 é propileno.

[0076]Quando a porção reativa é uma fosforamidita, X é OP(OCH2CH2CN)N(i-Pr)2. L1 pode compreender um ou mais de heteroátomos selecionados de N, O, S, P e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, L1 é um ligante PEG2-10. Em outras modalidades, L1 é -CH2CH2OCH2CH2-.

[0077]Em certas modalidades, R5, R6, R9 e R10 são alquila C1-C3, por exemplo, metila.

[0078]Em algumas modalidades, L3 e L4 são independentemente alquileno C2-C6 ou -(OCH2CH2)m-, em que m é um número inteiro que varia de 2 a 6. Em outras modalidades, L3 e L4 são -CH2CH2-.

[0079]Em certas modalidades, X é: Nas Fórmulas mostradas nesse documento, Q indica um grupo protetor de hidroxila. Exemplos de tais grupos de proteção são conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Peter G. M. Wuts, Greene's protective groups in organic synthesis (2006)). Os grupos protetores de hidroxila adequados incluem grupos instáveis em bases e instáveis em ácido. Em algumas modalidades, Q é um grupo protetor de hidroxila que é compatível com as condições de síntese de oligonucleotídeos de fosforamidita automáticas, tal como um grupo tritila ou dimetoxitritila.

[0080]Corantes sulforodamina compreendendo outras frações ou grupos reativa(o)s também estão dentro do escopo dessa divulgação; por exemplo, grupos reativos que podem formar ligações químicas com aminas primárias. Estes incluem isotiocianatos, isocianatos, acilazidas, ésteres NHS,

cloretos de sulfonila, aldeídos, glioxais, epóxidos, oxiranos, carbonatos, haletos de arila, imidoésteres, carbodiimidas, anidridos, ésteres nitrofenílicos e ésteres fluorofenílicos. De preferência, o grupo reativo é um éster ativado. Como usado nesse documento, um “éster ativado” é um éster de um ácido carboxílico que pode reagir com um grupo amino com a formação de uma amida. Os ésteres ativados incluem ésteres de N-hidroxisuccinimida (NHS), ésteres pentafluorofenílicos, ésteres tetrafluorofenílicos e ésteres p-nitrofenílicos. Ésteres ativados que são gerados in situ (por exemplo, por adição de um agente de ativação, tal como uma carbodiimida a um ácido carboxílico), também estão incluídos nesse documento.

[0081]Em algumas modalidades, o corante sulforodamina tem uma estrutura representada pela Fórmula IA: ou um estereoisômero, tautômero ou sal do mesmo, em que R1 é L1X e R3 é H ou halogênio. Em algumas modalidades da Fórmula IA, R1 é CH2CH2OCH2CH2OP(OCH2CH2CN)N(i-Pr)2.

[0082]Em algumas modalidades, a fosforamidita de corante sulforodamina é representada pela Fórmula II:

em que: R1 é alquila C1-C6; R2 é H, halogênio ou SO2NH2, R3 é H ou halogênio; R14 e R16, considerados sozinhos, são independentemente H, halogênio ou alquila C1-C6 opcionalmente substituído; R15 e R17, considerados sozinhos, são independentemente H ou alquila C1-C6 opcionalmente substituído; ou R14 e R15, considerados em conjunto, formam uma cadeia de alquileno C2-C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais R14 e R15 são ligados; R16 e R17, considerados em conjunto, formam uma cadeia de alquileno C2-C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais R16 e R1 são ligados; Q é um grupo de proteção de hidroxila; e L1 e L2 são independentemente um alquileno C2-C10 opcionalmente substituído ou heteroalquileno C2-C20 opcionalmente substituído.

[0083]Em algumas modalidades da Fórmula II, R3 é H. Em outras modalidades, R2 é H. Em ainda outras modalidades, R2 é Cl.

[0084]Em outras modalidades, R14 e R15 formam uma cadeia de alquileno C2, opcionalmente substituída com 1, 2 ou 3 grupos metila, que conecta os átomos aos quais R14 e R15 são ligados; e ainda outras modalidades, R16 e R17 formam uma cadeia de alquileno C2, opcionalmente substituída com 1, 2 ou 3 grupos metila, que conecta os átomos aos quais R16 e R17 são ligados. Em certas modalidades, R14 e R15 formam uma cadeia de etileno substituída com 3 grupos metila e R16 e R17 formam uma cadeia de etileno substituída com 3 grupos metila.

[0085]Em certas modalidades, R14 e R15 considerados em conjunto e R16 e R17, considerados em conjunto são: em que * indica o ponto de ligação ao átomo de nitrogênio e ** indica o ponto de ligação ao átomo de carbono aromático.

[0086]Em certas modalidades, o composto é representado pela Fórmula (IIA): ou um estereoisômero, tautômero ou sal do mesmo.

[0087]Em modalidades particulares, o composto é:

[0088]Em algumas modalidades, as fosforamiditas de corante sulforodamina são compostos representados pela Fórmula (III):

ou um estereoisômero, tautômero ou sal do mesmo, em que: R2 é H, halogênio ou SO2NH2; R3 é halogênio ou H; R4, R7, R8 e R11 quando considerados sozinhos são independentemente H, halogênio ou alquila C1-C6 opcionalmente substituído, R5, R6, R9 e R10 quando considerados sozinhos são independentemente H ou alquila C1-C6 opcionalmente substituído; R4 e R5 quando considerados em conjunto são uma cadeia de alquileno C2-C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais R4 e R5 são ligados; R6 e R7 quando considerados em conjunto são uma cadeia de alquileno C2-C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais R6 e R7 são ligados; R8 e R9 quando considerados em conjunto são uma cadeia de alquileno C2-C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais R8 e R9 são ligados; R10 e R11 quando considerados em conjunto são uma cadeia de alquileno C2-C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais R10 e R11 são ligados; R5 e R6, quando considerados em conjunto com o átomo de nitrogênio ao qual R5 e R6 são ligados, formam um anel insaturado de 5 ou 6 membros; R9 e R10, quando considerados em conjunto com o átomo de nitrogênio ao qual R9 e R10 são ligados, formam um anel insaturado de 5 ou 6 membros; n é um número inteiro de 1 a 9; Y é:

em que: Q é um grupo de proteção de hidroxila; e R12 e R13 são independentemente alquila C1-C6 opcionalmente substituído.

[0089]Em certas modalidades, R2 é Cl e R3 é H. Em algumas modalidades, R4 e R5 formam uma cadeia de alquileno C3 opcionalmente substituída que conecta os átomos aos quais cada um está ligado; R11 e R10 formam uma cadeia de alquileno C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais cada um está ligado; R6 e R7 formam uma cadeia de alquileno C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais cada um está ligado; e R8 e R9 formam uma cadeia de alquileno C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais cada um está ligado.

[0090]Em certas modalidades, o composto é:

[0091]Em algumas modalidades, o corante sulforodamina é um composto representado pela Fórmula VI:

em que L3 e L4 são independentemente um alquileno C2-C10 opcionalmente substituído ou heteroalquileno C2-C30 opcionalmente substituído; Q é um grupo de proteção de hidroxila; Z é CH, N, NHC(O)N, ou OC(O)N; e

R12 e R13 são independentemente alquila C1-C6 opcionalmente substituído.

[0092]Em algumas modalidades da Fórmula VI, R7, R8, R10, R11, R14 e R15 são metila. Em certas modalidades da Fórmula VI, X é -OP(OCH2CH2CN)N(i-Pr)2.

[0093]Em algumas modalidades da Fórmula VI, L1 é um ligante PEG2-10. Em outras modalidades da Fórmula VI, L1 é - CH2CH2OCH2CH2-.

[0094]Em algumas modalidades da Fórmula VI, R2, R3, R4 e R5 são H. Em modalidades particulares da Fórmula VI, R6 é um alquila C1-C6 opcionalmente substituído com OH ou aciloxi C1- C6. Em certas modalidades da Fórmula VI, R9 é um alquila C1- C6 opcionalmente substituído com OH ou aciloxi C1-C6.

[0095]Em certas modalidades da Fórmula VI, R6 é um etila substituído com OH ou OAc. Em algumas modalidades da Fórmula VI, R9 é um etila substituído com OH ou OAc.

[0096]Em algumas modalidades da Fórmula VI, o composto é: ou um estereoisômero, tautômero ou sal do mesmo, em que: R1, R2, R3, R4 e R5 são como descritos para o composto de Fórmula VI; e Q1 e Q2 são independentemente H ou acila C1-C6.

[0097]Em algumas modalidades, o composto é:

em que R1 é como definido para o composto de Fórmula VI.

[0098]Em modalidades particulares, o composto é:

[0099]Como usado nesse documento, os termos “alquila”, “alquenila” e “alquinila” incluem radicais hidrocarbila monovalentes de cadeia linear, de cadeia ramificada e cíclica, e combinações desses, que contêm apenas C e H quando não são substituídos. Os exemplos incluem metila, etila, isobutila, ciclo-hexila, ciclopentiletila, 2-propenila, 3- butinila e semelhantes. O número total de átomos de carbono em cada um desses grupos é algumas vezes descrito nesse documento, por exemplo, quando o grupo pode conter até dez átomos de carbono, pode ser representado como 1-10C, como C1-C10, C-C10 ou C1-10.

[00100]Os termos “heteroalquila”, “heteroalquenila” e “heteroalquinila”, como usados nesse documento, significam os hidrocarbonetos correspondentes em que um ou mais de átomos de carbono da cadeia foram substituídos por um heteroátomo. Heteroátomos exemplificativos incluem N, O, S e P. Quando os heteroátomos são autorizados a substituir átomos de carbono, por exemplo, em grupos heteroalquila, os números que descrevem o grupo, embora ainda escritos como, por exemplo, C3-C10, representam a soma do número de átomos de carbono no(a) ciclo ou cadeia e o número de tais heteroátomos que estão incluídos como substituições para átomos de carbono no(a) ciclo ou cadeia que está sendo descrito(a).

[00101]Tipicamente, os substituintes alquila, alquenila e alquinila contêm 1-10 átomos de carbono (alquila) ou 2-10 átomos de carbono (alquenila ou alquinila). De preferência, eles contêm 1-8 átomos de carbono (alquila) ou 2-8 átomos de carbono (alquenila ou alquinila). Às vezes, eles se referem como “alquila inferior”, o que significa que eles contêm 1- 6 átomos de carbono (alquila) ou 2-6 átomos de carbono (alquenila ou alquinila). Um único grupo pode incluir mais de um tipo de ligação múltipla ou mais de uma ligação múltipla; tais grupos estão incluídos na definição do termo “alquenila” quando contêm pelo menos uma ligação dupla carbono-carbono e estão incluídos no termo “alquinila” quando contêm pelo menos uma ligação tripla carbono-carbono.

[00102]Como usado nesse documento, os termos “alquileno”, “alquenileno” e “alquinileno” incluem radicais hidrocarbila divalentes de cadeia linear, de cadeia ramificada e cíclicos e combinações dos mesmos.

[00103]Os grupos alquila, alquenila e alquinila podem ser opcionalmente substituídos na medida em que tal substituição faça sentido quimicamente. Substituintes típicos incluem, mas não estão limitados a, halogênios (F, Cl, Br, I), =O, =N-CN, =N-OR, =NR, OR, NR2, SR, SO2R, SO2NR2, NRSO2R, NRCONR2, NRC(O)OR, NRC(O)R, CN, C(O)OR, C(O)NR2, OC(O)R, C(O)R, e NO2, =N-CN, = N-OR, =NR, OR, NR2, SR, SO2R,

SO2NR2, NRSO2R, NRCONR2, NRC(O)OR, NRC(O)R, CN, C(O)OR, C(O)NR2, OC(O)R, C(O)R e NO2, em que cada R é independentemente H, alquila C1-C8, heteroalquila C2-C8, acila C1-C8, heteroacila C2-C8, alquenila C2-C8, heteroalquenila C2-C8, alquinila C2-C8, heteroalquinila C2- C8, arila C6-C10, ou heteroarila C5-C10, e cada R é opcionalmente substituído com halogênios (F, Cl, Br, I), =O, =N-CN, =N-OR’, =NR’, OR’, NR’2, SR’, SO2R’, SO2NR’2, NR’SO2R’, NR’CONR’2, NR’C(O)OR’, NR’C(O)R’, CN, C(O)OR’, C(O)NR’2, OC(O)R’, C(O)R’, e NO2, em que cada R’ é independentemente H, alquila C1-C8, heteroalquila C2-C8, acila C1-C8, heteroacila C2-C8, arila C6-C10, ou heteroarila C5-C10. Os grupos alquila, alquenila e alquinila também podem ser substituídos por acila C1-C8, heteroacila C2-C8, arila C6-C10 ou heteroarila C5-C10, cada um dos quais pode ser substituído pelos substituintes que são apropriados para o grupo particular.

[00104]Embora “alquila”, como usado nesse documento, inclua grupos cicloalquila e cicloalquilalquila, o termo “cicloalquila” é usado nesse documento para descrever um grupo carbocíclico não aromático que está conectado através de um átomo de carbono do anel, e “cicloalquilalquila” é usado para descrever um grupo carbocíclico não grupo aromático que está conectado à molécula por meio de um ligante alquila. De forma similar, “heterociclila” é usado para identificar um grupo cíclico não aromático que contém pelo menos um heteroátomo como um membro do anel e que está conectado à molécula através de um átomo do anel, que pode ser C ou N; e “heterociclilalquila” pode ser usado para descrever um tal grupo que está ligado a outra molécula através de um ligante alquileno. Como usado nesse documento, esses termos também incluem anéis que contêm uma ligação dupla ou duas, desde que o anel não seja aromático.

[00105]Substituinte ou porção “aromático(a)” ou “arila” refere-se a uma porção monocíclica ou bicíclica fundida tendo as características bem conhecidas de aromaticidade; exemplos incluem fenila e naftila. Similarmente, os termos “heteroaromático” e “heteroarila” referem-se a tais sistemas de anel monocíclico ou bicíclico fundido que contêm como membros do anel um ou mais heteroátomo(s). Heteroátomos adequados incluem N, O e S, a inclusão dos quais permite aromaticidade em anéis de 5 membros, bem como em anéis de 6 membros. Sistemas heteroaromáticos típicos incluem grupos aromáticos C5-C6 monocíclicos, tais como, piridila, pirimidila, pirazinila, tienila, furanila, pirrolila, pirazolila, tiazolila, oxazolila e imidazolila, e porções bicíclicas fundidas formadas pela fusão de um desses grupos monocíclicos ou com qualquer um dos grupos monocíclicos heteroaromáticos para formar um grupo bicíclico C8-C10, tais como, indolila, benzimidazolila, indazolila, benzotriazolila, isoquinolila, quinolila, benzotiazolila, benzofuranila, pirazolopiridila, quinazolinila, quinoxalinila, cinolinila, e semelhantes. Qualquer sistema monocíclico ou bicíclico de anel fundido que tenha as características de aromaticidade em termos de distribuição de elétrons ao longo do sistema de anel está incluído nessa definição. Também inclui grupos bicíclicos onde pelo menos o anel que é diretamente ligado ao restante da molécula tem as características de aromaticidade. Tipicamente, os sistemas de anel contêm 5-12 átomos membros do anel. De preferência, os heteroarilas monocíclicos contêm 5-6 átomos membros no anel e os heteroarilas bicíclicos contêm 8-10 membros no anel.

[00106]As porções arila e heteroarila podem ser substituídas por uma variedade de substituintes, incluindo alquila C1-C8, alquenila C2-C8, alquinila C2-C8, arila C5-C12, acila C1-C8 e heteroformas dos mesmos, cada um dos quais pode ser adicionalmente substituído; outros substituintes para as porções arila e heteroarila incluem halogênios (F, Cl, Br, I), OR, NR2, SR, SO2R, SO2NR2, NRSO2R, NRCONR2, NRC(O)OR, NRC(O)R, CN, C(O)OR, C(O)NR2, OC(O)R, C(O)R, e NO2, em que cada R é independentemente H, alquila C1-C8, heteroalquila C2-C8, alquenila C2-C8, heteroalquenila C2-C8 , alquinila C2- C8, heteroalquinila C2-C8, arila C6-C10, heteroarila C5-C10, arilalquila C7-C12 ou heteroarilalquila C6-C12, e cada R é opcionalmente substituído como descrito acima para grupos alquila. Os grupos substituintes em um grupo arila ou heteroarila podem, claro, ser ainda substituídos com os grupos descritos nesse documento como adequados para cada tipo de tais substituintes ou para cada componente do substituinte. Assim, por exemplo, um substituinte arilalquila pode ser substituído na porção arila com substituintes descritos nesse documento como típicos para grupos arila, e pode ser ainda substituído na porção alquila com substituintes descritos nesse documento como típicos ou adequados para grupos alquila.

[00107]“Opcionalmente substituído”, como usado nesse documento, indica que o grupo particular a ser descrito pode ter um ou mais de substituintes de hidrogênio substituídos por um substituinte de não hidrogênio. Em alguns(algumas)

grupos ou porções opcionalmente substituído(a)s, todos os substituintes de hidrogênio são substituídos por um substituinte de não hidrogênio, por exemplo, alquila C1-C6, heteroalquila C2-C6, alquinila, halogênios (F, Cl, Br, I), N3, OR, NR2 , SR, SO2R, SO2NR2, NRSO2R, NRCONR2, NRC(O)OR, NRC(O)R, CN, C(O)OR, C(O)NR2, OC(O)R, C(O)R, oxo e NO2, em que cada R é independentemente H, alquila C1-C6 ou heteroalquila C2-C6. Quando um substituinte opcional é ligado por meio de uma ligação dupla, tal como um oxigênio de carbonila ou oxo (=O), o grupo ocupa duas valências disponíveis, de modo que o número total de substituintes que podem ser incluídos é reduzido de acordo com o número de valências disponíveis.

[00108]Sais, estereoisômeros e tautômeros dos compostos de sulforodamina divulgados nesse documento, tais como, compostos de fórmulas I, IA, II, IIA e III, também estão dentro do escopo dessa divulgação. Como usado nesse documento, “estereoisômero” ou “estereoisômeros” refere(m)-se a compostos que diferem na quiralidade de um ou mais de estereocentros. Os estereoisômeros incluem enantiômeros e diastereômeros. Como usado nesse documento, “tautômero” refere-se a formas alternativas de um composto que diferem na posição de um próton, tais como, tautômeros enol-ceto e imina-enamina. Como usado nesse documento, “sal” de um composto refere-se a um íon do composto associado ionicamente a um contraíon. Um sal de um composto pode ser formado pela reação de neutralização de um ácido e uma base. Os sais podem ser derivados de uma variedade de contraíons orgânicos e inorgânicos bem conhecidos na técnica e incluem, a título de exemplo, apenas, sódio,

potássio, cálcio, magnésio, amônio e tetra-alquilamônio; e quando a molécula contém uma funcionalidade básica, sais de ácidos orgânicos ou inorgânicos, tais como, cloridrato, bromidrato, tartarato, mesilato, acetato, maleato e oxalato. Embora as estruturas dos compostos divulgados nesse documento possam ser mostradas em apenas uma forma de ressonância, entende-se que todas as formas de ressonância estão incluídas.

[00109]A síntese dos compostos de sulforodamina divulgados nesse documento, por exemplo, os compostos de Fórmulas I, IA, II, IIA, III e VI podem ser alcançados de qualquer maneira adequada usando técnicas e métodos conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Beija M. et al, Chem. Soc. Rev., (2009): 38, 2410–2433; Kreimerman et al, Current Radiopharmaceuticals, (2017): 10, 212-220; Corrie J.E.T. e Munasinghe V.R. Dyes and Pigments 79 (2008): 76-82; Corrie J.E.T. et al. Bioconjugate Chem. 12 (2001): 186-194. Os exemplos 1-9 mostrados abaixo ilustram a síntese de alguns exemplos de compostos da divulgação. Polinucleotídeos Rotulados

[00110]Em outro aspecto, são fornecidos nesse documento polinucleotídeos rotulados com corante sulforodamina preparados por uma síntese automática de oligonucleotídeos a partir dos fosforamidita de corante sulforodamina divulgados nesse documento. Como usado nesse documento, “polinucleotídeo rotulado com corante sulforodamina” refere- se a um polinucleotídeo que é preparado por uma síntese automática de oligonucleotídeos a partir de fosforamidita de corantes sulforodamina divulgados nesse documento e incorpora uma porção de corante sulforodamina na forma aberta ou fechada.

[00111]Em algumas modalidades, é fornecido nesse documento um polinucleotídeo rotulado compreendendo um composto de fórmula IV: ou um estereoisômero, tautômero ou sal do mesmo, em que: R2 é H, halogênio ou SO2NH2; R3 é H ou halogênio; R4, R7, R8 e R11 quando considerados sozinhos são independentemente H, halogênio ou alquila C1-C6 opcionalmente substituído, R5, R6, R9 e R10 quando considerados sozinhos são independentemente H ou alquila C1-C6 opcionalmente substituído; R4 e R5 quando considerados em conjunto são uma cadeia de alquileno C2-C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais R4 e R5 são ligados; R6 e R7 quando considerados em conjunto são uma cadeia de alquileno C2-C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais R6 e R7 são ligados; R8 e R9 quando considerados em conjunto são uma cadeia de alquileno C2-C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais R8 e R9 são ligados; R10 e R11 quando considerados em conjunto são uma cadeia de alquileno C2-C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais R10 e R11 são ligados;

R5 e R6, quando considerados em conjunto com o átomo de nitrogênio ao qual R5 e R6 são ligados, formam um anel insaturado de 5 ou 6 membros; R9 e R10, quando considerados em conjunto com o átomo de nitrogênio ao qual R9 e R10 são ligados, formam um anel insaturado de 5 ou 6 membros; n é um número inteiro de 1 a 9; Y é: em que: a linha ondulada é o ponto de ligação à Fórmula IV; L3, L4 e L5 são independentemente um alquileno C2-C10 opcionalmente substituído ou heteroalquileno C2-C30 opcionalmente substituído; Z é CH, N, NHC(O)N ou OC(O)N; R12 e R13 são independentemente alquila C1-C6 opcionalmente substituído; W é H ou L4-O-Z2; Z1 é um nucleotídeo ou oligonucleotídeo; e Z2 é um nucleotídeo, oligonucleotídeo ou H.

[00112]Em algumas modalidades, R4 e R5 formam uma cadeia de alquileno C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais cada um está ligada; R11 e R10 formam uma cadeia de alquileno C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais cada um está ligado; R6 e R7 formam uma cadeia de alquileno C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais cada um está ligado; e R8 e R9 formam uma cadeia de alquileno C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais cada um está ligado. Em certas modalidades, R2 é Cl e R3 é H.

[00113]L3 pode compreender um ou mais de heteroátomos selecionados de N, O, S, P e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades da Fórmula IV, L3 é -(OCH2CH2)n-, em que n é um número inteiro de 1 a 5.

[00114]Em algumas modalidades, é fornecido nesse documento um polinucleotídeo rotulado compreendendo um composto de fórmulas VA ou VB: ou um estereoisômero, tautômero ou sal do mesmo, em que: R1 é um alquila C1-C6 opcionalmente substituído; R2 é H, halogênio ou SO2NH2, R3 é H ou halogênio; R14 e R16, quando considerados sozinhos, são independentemente H, halogênio ou alquila C1-C6 opcionalmente substituído; R15 e R17, quando considerados sozinhos, são independentemente H ou alquila C1-C6 opcionalmente substituído; R14 e R15, quando considerados em conjunto, formam uma cadeia de alquileno C2-C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais R14 e R15 são ligados;

R16 e R17, quando considerados em conjunto, formam uma cadeia de alquileno C2-C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais R16 e R17 são ligados; L1 e L2 são independentemente um alquileno C2-C10 opcionalmente substituído ou heteroalquileno C2-C20 opcionalmente substituído; Z1 é um nucleotídeo ou oligonucleotídeo; e Z2 é um nucleotídeo, oligonucleotídeo ou H.

[00115]Em algumas modalidades das fórmulas VA ou VB, R3 é H. Em outras modalidades, R2 é H. Em ainda outras modalidades, R2 é Cl.

[00116]Em outras modalidades das fórmulas VA ou VB, R14 e R15 formam uma cadeia de alquileno C2, opcionalmente substituído com 1, 2 ou 3 grupos metila, conectando os átomos aos quais R14 e R15 são ligados; e ainda outras modalidades, R16 e R17 formam uma cadeia de alquileno C2, opcionalmente substituído com 1, 2 ou 3 grupos metila, que conecta os átomos aos quais R16 e R17 são ligados. Em certas modalidades, R14 e R15 formam uma cadeia de etileno substituída com 3 grupos metila e R16 e R17 formam uma cadeia de etileno substituído com 3 grupos metila.

[00117]Em certas modalidades das fórmulas VA ou VB, R14 e R15 em conjunto e R16 e R17, considerados em conjunto são: em que * indica o ponto de ligação ao átomo de nitrogênio e ** indica o ponto de ligação ao átomo de carbono aromático.

[00118]Os polinucleotídeos rotulados divulgados nesse documento podem compreender um ou mais de compostos adicionais. Em algumas modalidades da presente divulgação, um polinucleotídeo compreende um aglutinante de ranhura menor. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo compreende um intercalador.

[00119]Tipicamente, um polinucleotídeo rotulado com os corantes divulgados nesse documento é um polinucleotídeo em que a estrutura compreende 2’-desoxirribose ou ribose. No entanto, um polinucleotídeo rotulado pode compreender uma ou mais de modificações. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo compreende uma modificação de açúcar, por exemplo, um açúcar modificado. Várias modificações de açúcar são úteis. Algumas modificações de açúcar não limitantes incluem arabinose, d-arabino-hexitol, 2-fluoroarabinose, xilulose, hexose ou um açúcar bicíclico.

[00120]Um polinucleotídeo rotulado da divulgação pode compreender uma ou mais de modificações de estrutura principal. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo compreende uma modificação da estrutura principal. Em algumas modalidades, uma modificação de estrutura principal é selecionada do grupo que consiste em uma estrutura principal de açúcar fosfato modificado, uma estrutura principal de ácido nucleico bloqueado, uma estrutura principal de peptídeo, uma estrutura principal de fosfotriéster, uma estrutura principal de fosfotriéster, uma estrutura principal de fosforamidato, uma estrutura principal de siloxano, uma estrutura principal de carboximetiléster, uma estrutura principal de acetamidato, uma estrutura principal de carbamato, uma estrutura principal de tioéter, uma estrutura principal de metileno fosfonato em ponte, uma estrutura principal de fosforotioato, uma estrutura principal de metilfosfonato, uma estrutura principal de alquilfosfonato, uma estrutura principal de éster de fosfato, uma estrutura principal de alquilfosfonotioato, uma estrutura principal de carbonato, uma estrutura principal de triéster de fosfato, uma estrutura principal de éster carboximetílico, uma estrutura principal de metilfosforotioato, uma estrutura principal de fosforoditioato, uma estrutura principal tendo ligações p- etoxi, e uma combinação de dois ou mais de qualquer um dos anteriores. Em uma modalidade particular da presente divulgação, a modificação da estrutura é uma estrutura principal de açúcar fosfato modificada.

[00121]Os polinucleotídeos rotulados divulgados nesse documento podem compreender uma ou mais de bases modificadas ou não naturais. As bases modificadas incluem bases modificadas de timina e citosina (por exemplo, aquelas divulgadas nas Patentes US 9.598.455 e 9.598.456), bases de 2,6-diaminopurina, bases universais e semelhantes. Os polinucleotídeos rotulados divulgados nesse documento podem compreender segmentos não nucleosídeos ou monômeros não nucleosídeos (por exemplo, ligantes, tais como, ligantes de poli(etilenoglicol)).

[00122]Em algumas modalidades, o polinucleotídeo divulgado nesse documento é uma sonda, por exemplo, uma sonda de PCR de 5’-nuclease. Em certas modalidades, o polinucleotídeo compreende adicionalmente um ou mais de rótulos adicionais, por exemplo, um extintor fluorescente. Como um habilitado comum na técnica reconhecerá, a localização de um rótulo dentro do oligonucleotídeo pode variar e não está limitada à divulgação nesse documento.

[00123]Em algumas modalidades, é fornecido nesse documento um polinucleotídeo modificado que compreende uma porção de corante sulforodamina como um fluoróforo em uma extremidade de sua sequência e um extintor fluorescente na outra extremidade de sua sequência, de modo que o extintor fluorescente suprime o sinal de fluorescência do fluoróforo na sonda intacta (isto é, o oligonucleotídeo sendo usado como uma sonda) por meio de um mecanismo de transferência de energia, tal como transferência de energia por ressonância de fluorescência (“FRET”). Quando uma polimerase estende um iniciador ao longo de um molde ao qual a sonda também hibridizou, a atividade de 5’-nuclease da polimerase cliva a sonda, permitindo assim que o fluoróforo se difunda para longe do extintor fluorescente de modo que o sinal fluorescente seja agora detectado. O sinal aumenta com cada ciclo de PCR proporcionalmente à quantidade de sonda que é clivada e, assim, proporcionalmente à quantidade de produto de amplificação (por exemplo, amplicon, sequência alvo). Isso permite a detecção e a quantificação diretas da sequência de DNA alvo.

[00124]Em algumas modalidades, a porção de corante sulforodamina é ligada a uma base que está pelo menos em uma posição de nucleotídeo longe da extremidade da sequência do polinucleotídeo rotulado e o extintor fluorescente é ligado a uma base que está pelo menos em uma posição de nucleotídeo longe da outra extremidade do polinucleotídeo modificado. Em algumas modalidades, o fluoróforo, por exemplo, a fração de corante sulforodamina e o extintor fluorescente estão localizados internamente dentro de uma sonda. Como um habilitado comum na técnica reconhecerá, a localização do 54 fluoróforo e/ou do extintor fluorescente dentro de uma sonda pode variar e não é limitada.

[00125]Em algumas modalidades, o fluoróforo, por exemplo, a porção de corante sulforodamina e o extintor fluorescente não estão nas extremidades de uma sonda de FRET. Em algumas modalidades, o espectro de emissão do corante sulforodamina se sobrepõe consideravelmente ao espectro de absorção do extintor fluorescente. No entanto, essa sobreposição espectral é menos importante ou não necessária quando a extinção envolve um mecanismo de colisão, ou a sobreposição é aumentada, por exemplo, devido às condições de reação ou à estrutura da sonda.

[00126]Uma grande quantidade de orientações práticas disponíveis na técnica para a seleção de pares fluoróforo- extintor apropriados para sondas específicas. Ver, por exemplo, FLUORESCENCE SPECTROSCOPY (Marcel Dekker, Nova Iorque, 1971). Os extintores úteis para inclusão em sondas divulgadas nesse documento incluem bis-azoextintores (por exemplo, aqueles divulgados na Pat. US 6.790.945), extintores disponíveis na Biosearch Technologies, Inc. (Extintores Black Hole: BHQ-1, BHQ-2, e BHQ-3), TAMRA, carboxitetrametil rodamina, ácido 4-((4- (dimetilamino)fenil)azo)benzoico (Dabcyl), extintor Zen®, extintor Blackberry®, 2,3-Dicloro-5,6-diciano-1,4- benzoquinona (DDQ)-I, e 2-[6-(1,3-dihidro-2H-isoindol-2- il)-9-{2-[(4-[(2,5-dioxopirrolidin-1-il)o-xi]carbonil piperidin-1-il)sulfo-nil]fenil}-3H-xanten-3-ilideno]-2,3- di-hidro-1H-isoindólio)cloreto (QSY 21) e outros extintores conhecidos na técnica.

[00127]Em ainda outro aspecto, é divulgado nesse documento um método para preparar um conjugado rotulado de um ligante, compreendendo o contato de um ligante com compostos de corante sulforodamina fornecidos nesse documento em um solvente adequado sob condições suficientes para ligar covalentemente o composto ao ligante, formando assim o conjugado rotulado com corante. Ligantes adequados incluem biomoléculas (por exemplo, um polinucleotídeo, uma proteína, um anticorpo, um peptídeo ou um polissacarídeo), polímeros sintéticos (por exemplo, um polímero com uma estrutura principal etilênica, tal como ácido poliacrílico) e suportes sólidos (por exemplo, vidro de poro controlado ou poliestireno).

[00128]Em algumas modalidades, o ligante é um polinucleotídeo. Em certas modalidades, as condições suficientes para ligar covalentemente o composto da presente divulgação ao ligante, isto é, oligonucleotídeo ou polinucleotídeo, são condições de síntese automática de oligonucleotídeo de fosforamidita. As condições de síntese automática de oligonucleotídeos de fosforamidita usadas para sintetizar e desproteger oligonucleotídeos sintéticos são bem conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, em Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, Vol. I, Beaucage et al., Eds., John Wiley & Sons, 2002, cuja divulgação é incorporada nesse documento por referência.

[00129]O método de fosforamidita de oligonucleotídeo, por exemplo, síntese de DNA, é considerado como o método de síntese padrão usado na maioria dos sintetizadores automáticos. Os blocos de construção usados para a síntese são comumente referidos como blocos de construção de nucleotídeos, monômeros ou fosforamiditas de nucleosídeo,

que são derivados de nucleosídeos ativados (fosforamiditas). Um grupo protetor clivável com ácido, tipicamente, o grupo dimetoxitritila (DMT), é usado para proteger a extremidade 5’ do nucleosídeo e um grupo β-cianoetila é usado para proteger a porção 3’-fosfito. Um monômero também pode incluir grupos adicionais que servem para proteger outras porções, por exemplo, aminas primárias reativas nas nucleobases. Os grupos de proteção são selecionados para evitar que ocorram ramificações ou outras reações colaterais indesejáveis durante a síntese. Os técnicos habilitados serão prontamente capazes de selecionar grupos de proteção tendo propriedades adequadas para uso em condições de síntese e desproteção e/ou clivagem específicas. Uma grande variedade de grupos de proteção de amina é ensinada, por exemplo, em Greene & Wuts, “Protective Groups In Organic Chemistry,” 3a Edição, John Wiley & Filhos, 1999 (doravante “Green & Wuts”).

[00130]Tipicamente, os oligonucleotídeos são sintetizados em suportes sólidos, por exemplo, vidro de poro de controle (CPG) - ou coluna cheia de poliestireno, uma membrana ou um material similar. Um oligonucleotídeo é usualmente sintetizado da extremidade 3’ para a extremidade 5’. O primeiro bloco de construção de nucleotídeo ou monômero é usualmente ancorado ao suporte, tipicamente, por meio de um ligante, tal como um vidro de poro controlado por alquilamina de cadeia longa (LCAA-CPG).

[00131]Em algumas modalidades, os métodos de síntese que empregam reagentes de fosforamidita envolvem várias rodadas de: (i) desproteção de DMT para revelar uma hidroxila livre, que pode ser efetuada, por exemplo, por tratamento com 2,5% ou 3% de ácido di- ou tri-cloroacético em diclorometano;

(ii) acoplamento de nucleosídeo ou outros reagentes de fosforamidita à hidroxila livre, que pode ser realizado, por exemplo, em acetonitrila contendo tetrazol (por exemplo, tetrazol 0,45 M ou 0,5 M); (iii) oxidação, que pode ser realizada, por exemplo, por tratamento com I2/2,6- lutidina/H2O; e capeamento, que pode ser realizado, por exemplo, por tratamento com 6,5% de anidrido acético em tetra-hidrofurano (THF) ativado com 10% de 1-metilimidazol (NMI) em THF.

[00132]Outras condições para realizar as várias etapas na síntese também são conhecidas na técnica e podem ser utilizadas nesse documento. Por exemplo, o acoplamento de fosforamidita pode ser realizado em acetonitrila contendo 5- etiltio-1H-tetrazol 0,25 M, 4,5-dicianoimidazol 0,25 M (DCI) ou 5-benziltio-1H-tetrazol 0,25 M (BTT). A oxidação pode ser realizada com I2 0,1 M, 0,05 M ou 0,02 M em THF/H2O/piridina (7:2:1). O capeamento pode ser realizado por tratamento com THF/lutidina/anidrido acético seguido de tratamento com 16% de NMI em THF.

[00133]A remoção de quaisquer grupos de proteção e clivagem do reagente de síntese é tipicamente alcançada por tratamento com hidróxido de amônio concentrado a 60°C para 1-12 horas, embora os fosforamiditas de nucleosídeo protegidos com grupos que podem ser removidos sob condições mais suaves, tal como por tratamento com hidróxido de amônio concentrado em temperatura ambiente por 4-17 horas ou tratamento com carbonato de potássio 0,05 M em metanol, ou tratamento com 25% de t-butilamina em água/EtOH, também são conhecidos e podem ser usados.

[00134]O termo “clivagem” em referência à síntese de oligonucleotídeos em fase sólida significa quebrar a ligação que liga um oligonucleotídeo a um suporte em fase sólida. Em algumas modalidades, a clivagem envolve a hidrólise de uma ligação éster de succinato entre o hidroxila 3’ de um oligonucleotídeo ligado e o suporte em fase sólida.

[00135]O termo “desproteção” como usado nesse documento significa remover grupos de proteção das aminas exocíclicas das bases heterocíclicas de um oligonucleotídeo. Usualmente, a desproteção envolve a hidrólise de uma porção amida que consiste em uma amina exocíclica e um grupo de proteção de amino, por exemplo, benzoíla ou isobutirila. Vária(o)s técnicas e métodos de desproteção são conhecidos na técnica.

[00136]Embora cada um dos elementos da presente invenção seja descrito nesse documento como contendo várias modalidades, deve ser entendido que, a menos que indicado de outra forma, cada uma das modalidades de um determinado elemento da presente invenção é capaz de ser usada com cada uma das modalidades dos outros elementos da presente invenção e cada uma desses usos pretendem formar uma modalidade distinta da presente invenção.

[00137]A(O)s patentes, pedidos de patentes e literatura científica referenciados referidos nesse documento são incorporados por referência em sua totalidade como se cada publicação, patente ou pedido de patente individual fosse especificamente e individualmente indicada(o) para ser incorporada(o) por referência. Qualquer conflito entre qualquer referência citada nesse documento e os ensinamentos específicos desse relatório descritivo deve ser resolvido em favor do último. Da mesma forma, qualquer conflito entre uma definição compreendida na técnica de uma palavra ou frase e uma definição da palavra ou frase como especificamente ensinada nesse relatório descritivo deve ser resolvido em favor da última.

[00138]A invenção é ilustrada pelos seguintes exemplos. Esses exemplos são incluídos apenas para fins ilustrativos e não se destinam a limitar a invenção.

EXEMPLOS

[00139]Os espectros de ressonância magnética nuclear (RMN) de próton (1H, 400 MHz) e fósforo (31P, 160 MHz) foram obtidos em um instrumento Bruker Biospin 400. As amostras de RMN foram preparadas em DMSO-d6 e CD3CN e o solvente protonado residual foi usado como um padrão de deslocamento químico interno. Os dados de LCMS foram obtidos por ionização por eletropulverização (ESI) nos instrumentos Agilent 1200 (LC/MSD Trap XCT Plus) e Agilent 1260 infinito (LC/MS Quadrupolo 6130). A cromatografia automática em sílica gel 60 foi realizada usando os instrumentos Combi Flash Biotage Isolera LS e Teledyne ISCO Torrent®. A cromatografia analítica de camada fina foi conduzida em sílica gel 60 F254 com revestimento de alumínio e as placas foram visualizadas sob uma lâmpada UV (254 e 365 nm). Todos os reagentes eram de fontes comerciais a menos que indicado de outra forma. Exemplo 1: Síntese de corante Sulforodamina S1

[00140]Esse exemplo descreve a síntese de um corante sulforodamina S1 de exemplo que compreende um grupo fosforamidita. Esse corante é adequado para incorporação na extremidade 5’ de um oligonucleotídeo através da síntese automática de oligonucleotídeos padrão.

[00141]O composto S1 foi preparado de acordo com o procedimento descrito no Esquema 1.

Composto 1

[00142]Uma mistura seca de compostos CFBSA (4,0 g, 1 eq) e 8-hidroxijulolidina (HJ, 6,2 g, 2 eq) foi adicionada em porções a uma solução aquosa de ácido sulfúrico (60%, 32 mL) em um tanque de multiorifícios (≥ 3; quaisquer orifícios não utilizados estavam abertos para a atmosfera) a 132-138°C. O progresso da reação foi monitorado usando HPLC. Quando a reação foi completada (7-16 h), a mistura reacional foi deixada resfriar até a temperatura ambiente e depois foi vertida em solução aquosa diluída de NaOH (110 mL). Após ajuste de pH para 8,5-11, o produto da reação de ciclocondensação (Composto 1) foi isolado por filtração e, em seguida, foi seco em um forno a vácuo a 45-50°C por >16 h. O produto foi então dissolvido em 130 mL de diclorometano (DCM) e a solução foi filtrada. A concentração da camada de DCM proporcionou o Composto 1 (6g, 65%) que foi usado na próxima etapa sem purificação adicional. LCMS: m/z 561.5; [M+H] RMN 1H (DMSO-d6, 400 MHz): δ 7.94 (d, 1H, J = 2.4 Hz),

7.60 (dd, 1H, J = 8.0, 2.4 Hz), 7.10 (d, 1H, J = 8.0Hz),

6.59 (s, 2H), 3.58 (m, 8H), 2.98 (m, 4H), 2.52 (m, 4H), 1.99 (m, 4H), 1.83 (m, 4H). Composto 2

[00143]O Composto 1 (8g, 14,3 mmol) foi colocado em suspensão em DCM anidro (120 mL) em temperatura ambiente (RT) e tratado com POCl3 (13,1 mL, 10 eq) durante a noite. O(a) progresso/conclusão da reação foi seguido(a) por TLC (10% MeOH/DCM). Quando a reação foi completada, a mistura foi concentrada sob vácuo e a espuma resultante foi seca sob vácuo por 90-150 min a 40°C. A espuma foi então dissolvida em diclorometano anidro (150 mL) sob argônio. A solução de reação foi resfriada a 0-5°C e tratada com N,N- diisopropiletilamina (DIEA) (25 mL, 10 eq) e 2- aminoetoxietanol (AEE) (7,2 mL, 5 eq) enquanto se mantém a temperatura abaixo de 8°C. A reação foi agitada enquanto se deixava aquecer até a TA por 1-2 h, em seguida, agitada em TA durante a noite. O progresso da reação foi monitorado por TLC (10% MeOH/DCM). A mistura reacional foi diluída com DCM (250 mL) e lavada com HCl 1 N (2 x 185 mL), salmoura (1 x 200 mL) e seca sobre Na2SO4. Filtração, concentração e purificação usando purificação em coluna de gel de sílica proporcionaram o Composto 2 puro (3,74 g, rendimento de 40%). LCMS: m/z 648.5 [M+H]; RMN 1H (DMSO-d6, 400 MHz): δ 8.19 (d, 1H, J = 2.0 Hz), 7.60 (dd, 1H, J = 8.0, 2.0 Hz), 6.95 (1H, d, J = 8 Hz), 6.28 (s, 2H), 4.4 (t, 1H, J = 5.6 Hz), 3.30 (m, 3H), 3.15 (m, 12H), 2.90 (t, 2H, J = 6.8 Hz), 2.82 (m, 4H), 2.51 (m, 4H), 1.96 (m, 4H), 1.81 (m, 4H). Composto S1

[00144]O Composto 2 (2,8g, 4,3 mmol) foi colocado em um balão de fundo redondo de 3 gargalos e seco sob alto vácuo

(≤ 2 mBar (200 Pa)) por pelo menos 90 min. O composto seco foi então dissolvido em DCM anidro (88 mL) sob argônio. A mistura reacional foi resfriada a 0-5°C, e DIEA (7,5 mL, 10 eq) foi adicionado seguido pela adição em gotas de N,N- diisopropilclorofosforamidita de 2-cianoetil (PAM-Cl) (1,2 mL, 1,4 eq) enquanto se mantém a temperatura interna a 0- 5°C. A reação foi agitada enquanto permite o aquecimento até a temperatura ambiente até a conclusão (2-3 h). A reação foi diluída com DCM (88 mL) e lavada com NaHCO3 (2 x 45 mL) e salmoura (45 mL), e a camada orgânica foi seca em Na2SO4. Filtração, concentração e purificação em coluna de gel de sílica do produto bruto proporcionou o produto puro como um sólido rosa (1,75 g, 48% de rendimento). LCMS: m/z 848.2 [M+H]; RMN 31P (CD3CN, 160 MHz): δ 148.25; RMN 1H (DMSO-d6, 400 MHz): δ 8.18 (d, 1H, J = 2 Hz), 7.59 (dd, 1H, J = 8.4,

2.0 Hz), 6.96 (d, 1H, J = 8 Hz), 6.27 (s, 2H), 3.66 (m, 2H),

3.27 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.20 (t, 1H, J = 6.8 Hz), 3.10-

3.20 (m, 8H), 2.90 (t, 2H, 6.8 Hz), 2.82 (t, 4H, J = 6.4Hz),

2.70 (t, 2H, J = 7.0 Hz)), 2.40-2.51 (m, 4H), 1.95 (m, 4H),

1.78 (m, 4H), 1.13 (d, 6H, J = 8 Hz), 1.05 (d, 6H, J = 8 Hz). Exemplo 2: Síntese de corante Sulforodamina S2

[00145]Esse exemplo descreve a síntese de um corante sulforodamina de exemplo S2 que compreende um grupo fosforamidita e um grupo hidroxila protegido com grupo dimetoxitritila. Esse corante é adequado para incorporação na extremidade 5’ ou em uma posição intermediária de um oligonucleotídeo por meio de síntese automática de oligonucleotídeo padrão.

[00146]O composto S2 foi preparado de acordo com o procedimento descrito no Esquema 2.

Composto 3

[00147]Ácido trifluorometano sulfônico (50 mL) em um balão de fundo redondo de 150 mL foi resfriado a 0°C sob atmosfera de argônio. 8-Hidroxijulolidina (HJ) (15,0 g, 79,3 mmol) foi adicionado em porções ao longo de 20 minutos, e a mistura foi deixada aquecer até a temperatura ambiente, em seguida, agitada em temperatura ambiente até que a 8-hidroxijulolidina se dissolvesse completamente. Anidrido cíclico de ácido 2-sulfobenzoico (10,95 g, 59,5 mmol) foi adicionado em uma porção. A mistura foi aquecida a 110°C e agitada por 18 h, em seguida, resfriada em temperatura ambiente. A mistura reacional foi adicionada em gotas a uma mistura de NaOAc 3M (300 mL) e gelo picado (200 mL). À mistura resultante, foi adicionado DCM (500 mL) e a mistura foi transferida para um funil de separação. A camada orgânica foi coletada e lavada com água e salmoura. As camadas aquosas combinadas foram extraídas de volta com DCM e todas as camadas orgânicas foram combinadas. Após secagem em Na 2SO 4, a solução foi filtrada e DCM foi removido sob vácuo. O produto foi purificado por cromatografia em sílica gel (leito 3”x7” (7,62x 17,78 cm)) usando 2% a 10% de água/acetonitrila (ACN). Uma impureza vermelho-escura sai da coluna com a frente de solvente. Rf do produto em TLC é 0,4 em 10% de água/ACN. A concentração das frações contendo o produto proporcionou o Composto 3 (8,34 g, 40%). RMN 1H (DMSO-d 6, 400 MHz): δ

7.80 (d, 1H, J = 6.8 Hz), 7.60 (t, 1H, J = 7.6 Hz), 7.51 (t, 1H, J = 7.4 Hz), 7.09 (d, 1 H, J = 7.4 Hz) 6.58 (s, 2H), 3.49 (m, 8H), 2.98 (m, 4H), 2.62 (m, 4H), 2.02 (m, 4H), 1.83 (m, 4H); LCMS: m/z 527.5 [M+H]. Composto 4

[00148]Sob argônio, o Composto 3 (6,50 g, 12,3 mmol) foi dissolvido em 60 mL de DCM anidro e foi adicionado POCl3 (5,00 mL, 53,6 mmol). A mistura foi agitada em TA por 24 h. DCM foi removido sob pressão reduzida em temperatura ambiente e, em seguida, o excesso de POCl3 foi removido sob pressão reduzida a 60°C para produzir uma espuma. A espuma foi dissolvida em 150 mL de DCM anidro sob argônio, e a solução foi resfriada a 0°C. Diisopropiletilamina (22,0 mL, 124 mmol) foi adicionado, a mistura foi novamente resfriada a 0°C, e 2-(2-aminoetoxi)etanol (6,20 mL, 62,2 mmol) foi adicionado. A mistura reacional foi deixada aquecer até a temperatura ambiente e agitada por 2,5 h. A reação foi extinta pela adição de metanol suficiente para dissolver todos os sólidos. A mistura foi lavada com NaHCO3 saturado, água e salmoura. A camada orgânica foi seca em Na2SO4. O produto foi cromatografado em sílica gel (3”x6”) (7,62x 15,24 cm), 30% de EtOAc/hexanos a 60% de EtOAc/hexanos contendo 10% de trietilamina (TEA), para produzir 4,56 g (60%) de Composto 4. RMN 1H (DMSO-d6, 400 MHz): δ 7.94 (dd, 1H, J = 3.6, 2.8 Hz), 7.58 (dd, 2H, J = 5.6, 3.2 Hz),

6.93 (dd, 1H, J = 6.4, 3.2 Hz), 6.27 (s, 2H), 4.4 (t, 1 H, J = 5.6 Hz), 3.31 (m, 2 H), 3.07-3.20 (m, 12H), 2.89 (t, 2H J = 7.2 Hz), 2.83 (t, 4H, J = 6.4 Hz)), 2.45 (m, 4H),

1.95 (m, 4H), 1.79 (m, 4H). LCMS: m/z 614.5 [M+H]. Composto 5

[00149]Sob argônio, o Composto 4 (1,58 g, 2,57 mmol) foi dissolvido em 50 mL de DCM anidro, e TEA (3,60 mL, 25,8 mmol) foi adicionado, seguido por p-nitrofenilclororformiato (777 mg, 3,85 mmol). A mistura resultante foi agitada em TA por 18 h. Mono-DMT-dietanolamina (2,09 g, 5,13 mmol) foi adicionado, e a agitação em TA continuou por mais 24 h. A mistura foi lavada com NaHCO3 saturado, água e salmoura e seca em Na2SO4. A purificação do produto por cromatografia em gel de sílica, 40% de EtOAc/hexanos a 70% de EtOAc/hexanos contendo 10% de TEA, rendeu 1,78 g (66%) de Composto 5. RMN 1H (DMSO-d6, 400 MHz): δ 7.85 (m, 1H), 7.42 (m, 4H), 7.29 (m, 7H), 6.99 (m, 1H), 6.82 (d, 4H, J = 8.8 Hz), 6.44 (s, 2H),

4.10 (m, 1H), 4.05 (m, 1H), 3.79 (s, 6H), 3.76 (m, 1H), 3.66 (m, 1H), 3.57-3.21 (m, 10H), 3.18-3.02 (m, 11H), 2.89 (t, 4H, J = 6.5 Hz), 2.54 (m, 4H), 2.04 (m, 4H), 1.87 (m, 4H). LCMS: m/z 1047.7 [M+H]. Composto S2

[00150]Sob argônio, o Composto 5 (300 mg, 0,287 mmol) foi dissolvido em 20 mL de DCM anidro. DIEA (0,500 mL, 2,87 mmol) foi adicionado, seguido por PAM-Cl (0,080 mL,

0,389 mmol). A mistura foi agitada em temperatura ambiente por 4 h e, em seguida, lavada com NaHCO3 saturado, água e salmoura. A camada orgânica foi seca em Na 2SO 4. A cromatografia em sílica gel (20% de EtOAc/hexanos a 40% EtOAc/hexanos contendo 5% TEA) rendeu 0,213 g (60%) de Composto S2. RMN 1H (CD 3CN, 400 MHz): δ 7.82 (d, 1H, J =

7.6 Hz), 7.42 (m, 4H), 7.24 (m, 7H), 6.82 (m, 5H), 6.36 (s, 2H), 3.93 (m, 1H), 3.87 (m, 1H), 3.72 (s, 6H), 3.65 (m, 4H), 3.45 (m, 1H), 3.40 (m, 1H), 3.34 (m, 1H), 3.27 (m, 1H), 3.19 (m, 1H), 3.13 (m, 1H), 3.06 (m, 10H), 2.92 (m, 1H), 2.82 (m, 4H), 2.60 (m, 1H), 2.48 (m, 2H), 2.41 (m, 2H), 1.96 (m, 4H), 1.77 (m, 4H), 1.19 (m, 12H). RMN 31 P (CD3CN, 160 MHz): δ 147.5. Exemplo 3. Síntese de corante Sulforodamina S3

[00151]Esse exemplo descreve a síntese de um corante sulforodamina de exemplo S3 que compreende um éster NHS. Esse corante é adequado para rotulação fluorescente de biomoléculas, por exemplo, peptídeos, por meio de reação de conjugação com um grupo amino.

[00152]O composto S3 foi preparado de acordo com o procedimento descrito no Esquema 3.

Composto 6

[00153]O Composto 3 (2,87 g, 5,28 mmol) foi dissolvido em 50 mL de DCM anidro sob argônio, e POCl3 (2,5 mL, 26,8 mmol) foi adicionado. A mistura resultante foi agitada em TA durante a noite. DCM e POCl3 foram removidos sob vácuo, e o intermediário foi redissolvido em DCM anidro (100 mL). A solução foi resfriada a 0°C sob argônio. DIEA (18,5 mL, 106 mmol) foi adicionado, seguido por metil-6-aminocaproato-HCl (4,83 g, 26,6 mmol). A mistura reacional foi deixada aquecer até a temperatura ambiente e agitada por 2 h, depois lavada com água (3x) e salmoura. A camada orgânica foi seca em Na2SO4. O produto foi purificado por cromatografia em sílica gel usando 40% de EtOAc/hexanos com 10% de TEA. O produto na forma ciclizada que se forma sob condições básicas é incolor; os pontos de TLC lentamente tornam-se rosa conforme o TEA evapora. A purificação rendeu 1,30 g (37%) do Composto 6 como uma espuma azul claro. RMN 1H (CDCl3, 400 MHz): δ 7.87 (d, 1H, J = 6.8 Hz), 7.46 (m, 2H), 7.00 (m, 1H), 6.44 (s, 2H), 3.66 (s, 3H), 3.16 (m, 8H), 2.91 (m, 6H), 2.58 (m, 4H),

2.14 (m, 2H), 2.07 (m, 4H), 1.89 (m, 4H), 1.39 (m, 4H), 1.15 (m, 2H). LCMS: m/z 654.3 [M+H]. Composto 7

[00154]O Composto 6 (1,30 g, 1,99 mmol) foi dissolvido em acetonitrila (60 mL), água (15 mL) e 4,5 mL de HCl concentrado. A solução foi aquecida a 80°C por 18 h, e então diluída com DCM, lavada com NaHCO3 saturado, água e salmoura. A camada orgânica foi seca em Na2SO4 para render 1,21 g de Composto 7 bruto que foi usado na próxima etapa sem purificação adicional. LCMS: m/z 640.3 [M+H]. Composto S3

[00155]O Composto 7 (1,21 g, 1,89 mmol) foi dissolvido em 25 ml de dimetilformamida anidra (DMF) sob argônio. N- hidroxissuccinimida (435 mg, 3,78 mmol) e N- (dimetilaminopropil)-N’-etilcarbodiimida (EDC) (725 mg, 3,78 mmol) foram adicionados. A mistura foi agitada em TA durante a noite e, em seguida, DMF foi removido sob vácuo. O resíduo foi dissolvido em DCM e a solução foi lavada com HCl 1 N, água e salmoura. A camada orgânica foi seca em Na2SO4. A cromatografia em sílica gel com 5% de HOAc e 1% de MeOH a 5% de MeOH em DCM rendeu 880 mg (63%) de Composto S3. RMN 1H (DMSO-d6, 400 MHz): δ 7.92 (m, 1H), 7.58 (m, 2H), 6.95 (m, 1H), 6.24 (s, 2H), 3.11 (m, 8H), 2.84 (m, 6H), 2.82 (s, 4H),

2.46 (m, 4H), 1.94 (m, 6H), 1.79 (m, 4H), 1.21 (m, 4H), 1.12 (m, 2H). LCMS: m/z 737.3 [M+H]. Exemplo 4: Síntese de corante Sulforodamina S4

[00156]Outro exemplo de corante S4 compreendendo um derivado de éster ativado pode ser prontamente preparado de acordo com o procedimento descrito no Esquema 4 usando as condições de reação descritas acima para o Composto S3.

Composto 8

[00157]O Composto 1 (4,0 g, 0,0071 mol) foi dissolvido em DCM anidro (60 mL) sob atmosfera de argônio. Oxicloreto de fósforo puro (6,5 mL, 0,071 mol) foi adicionado em uma porção, e a reação foi agitada em temperatura ambiente por 23 h. Os solventes foram removidos em um evaporador rotativo e a espuma resultante foi seca a 5 mbar (500 Pa) por 2 h. À espuma, DCM anidro (75 mL) foi adicionado sob atmosfera de argônio e o balão de reação foi colocado em um banho de gelo/água. N,N- Diisopropiletilamina (18,5 mL, 0,107 mol) foi adicionado lentamente a 0-5°C. Foi adicionado cloridrato de 6-amino- hexanoato de metila sólido (6,5 g, 0,0360 mol) em porções ao longo de 10 min. Após 1 h, o banho de gelo foi removido, e a mistura reacional foi deixada a agitar em temperatura ambiente ao longo de 16 h. A mistura reacional foi diluída com DCM (125 mL) e foi lavada com HCl 1N (2 x 90 mL) e salmoura (1 x 120 mL) e, em seguida, seca sobre sulfato de sódio. A filtração, a concentração e a purificação em coluna de gel de sílica (acetato de etila/heptano/TEA, 30:10:60) proporcionaram o produto (2,4 g, rendimento de ~ 49%) como um sólido dourado. LCMS: m/z 688.5 [M+H] RMN 1H (CDCl3, 400 MHz): δ 7.83 (d, 1H, J = 1.6 Hz), 7.4 (dd, 1H, J = 8.4, 2.0 Hz), 6.95 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 6.42 (s, 2H), 3.65 (s, 3H), 3.16 (m, 8H), 2.89 (m, 6H), 2.58 (m, 4H),

2.14 (t, 2H, J = 8 Hz), 2.06 (m, 4H), 1.91 (m, 4H), 1.40 (m, 4H), 1.15 (m, 2H). Composto S4

[00158]O Composto 8 (0,60g, 0,00087 mol) foi colocado em suspensão em acetonitrila (30 mL) com agitação. Água DI (deionizada) (7 mL) foi adicionada e a suspensão foi agitada por alguns minutos. Foi adicionado ácido clorídrico concentrado (3 mL) em gotas que produziu uma solução vermelha/púrpura. A solução foi aquecida a refluxo suave por 2-3 h, em seguida, foi deixada a agitar em temperatura ambiente ao longo de 15 h. O volume da mistura reacional (de cor roxa) foi dividido pela metade por evaporação no evaporador rotativo e o produto foi precipitado vertendo a solução de reação em água DI (75 mL) em temperatura ambiente. A suspensão foi filtrada, a torta foi lavada com água DI adicional (15 mL) e foi seca em um forno a vácuo a 40-50°C e vácuo <2 mbar (<200 Pa) por 20 h para dar 0,54 g (93% de rendimento) de Composto 9 como um pó roxo que foi usado como está na próxima etapa.

[00159]O composto 9 obtido acima (0,2 g, 0,000296 mol) foi colocado em um balão de fundo redondo de 10 mL e foi dissolvido em DMF anidro (3,0 mL) sob atmosfera de argônio. Para a solução roxa resultante, N-hidroxissuccinimida (0,04 g, 0,00034 mol, 1,15 eq) e EDC (0,075 g, 0,00039 mol, 1,3 eq) foram adicionados, e a reação foi agitada em temperatura ambiente por 21 h. A mistura reacional foi diluída com DCM (40mL) e lavada com água (20mL) e seca em Na2SO4. O solvente foi evaporado e o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna usando 5-15% de MeOH/DCM para fornecer 0,14 g (61% de rendimento) de Composto S4. LCMS: m/z 771.6 [M+H] RMN 1H (DMSO-d6, 400 MHz): δ 8.17 (d, 1H, J = 2.0 Hz), 7.60 (dd, 1H, J = 8.4, 2.0 Hz), 6.98 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 6.24 (s, 2H), 3.13 (m, 8H), 2.82 (m, 6H), 2.74 (m, 2H), 2.55 (m, 4H), 2.41 (t, 2H, J = 7.8 Hz), 1.94 (m, 4H),

1.79 (m, 4H), 1.10-1.35 (m, 8 H) Exemplo 5: Síntese de corante Sulforodamina S5

[00160]Esse exemplo descreve a síntese de um corante sulforodamina de exemplo S5 que compreende um grupo fosforamidita. Esse corante é adequado para incorporação na extremidade 5’ de um oligonucleotídeo através da síntese automática de oligonucleotídeos padrão.

[00161]O composto S5 foi preparado de acordo com o procedimento descrito no Esquema 5.

Composto 10

[00162]Água (27 mL) foi resfriada a 0°C, e 41 mL de H2SO4 conc. foram adicionados lentamente. A solução foi aquecida a 160°C. Ácido 2-formilbenzenossulfônico (5,03 g, 24,2 mmol) e 3-(dimetilamino)fenol (6,63 g, 48,3 mmol) completamente pré-misturados foram adicionados em porções ao longo de 1 minuto à solução de ácido sulfúrico. A solução foi agitada a 160°C por 8 h sob ar, em seguida, resfriada em temperatura ambiente e agitada por mais 8 h. Água fria (300 mL, ca. 0°C) foi misturada com 100 mL de NaOH 10 M. A mistura reacional bruta foi adicionada em gotas à solução de NaOH, mantendo a temperatura abaixo de 25°C. Uma vez que a mistura reacional foi adicionada, mais NaOH 10 M foi adicionado até o pH ser de cerca de 8,5. A mistura foi agitada em TA durante a noite. Os sólidos foram coletados por filtração a vácuo e secos sob alto vácuo em KOH para render 10,6 g de material bruto que continha aproximadamente 50% de sais inorgânicos. Uma porção de 3,57 g do material bruto foi cromatografada em uma coluna de gel de sílica (2”x7” (5,08 x 17,78 cm) usando um gradiente de solvente MeOH/DCM (4% a 10% de MeOH). Foi produzida uma mistura de isômeros, com o isômero desejado eluindo primeiro. Obtiveram-se 780 mg (22%) de Composto 10. LCMS: m/z 423.4 [M+H]. Composto 11

[00163]Ao Composto 10 (740 mg, 1,75 mmol) em 75 mL de DCM anidro sob argônio, POCl3 (1,64 mL, 6,50 mmol) foi adicionado, e a mistura foi agitada em TA por 18 h. DCM foi removido sob pressão reduzida em temperatura ambiente e, em seguida, o excesso de POCl3 foi removido sob pressão reduzida a 60°C para produzir uma espuma. A espuma foi dissolvida em 125 mL de DCM anidro sob argônio, e a solução foi resfriada a 0°C. Trietilamina (3,10 mL, 17,8 mmol) e 2-(2-aminoetoxi)etanol (0,875 mL, 8,78 mmol) foram adicionados. A mistura foi deixada aquecer até a temperatura ambiente e agitada por 1 h, depois lavada com água e salmoura. A camada orgânica foi seca em Na2SO4. A cromatografia em gel de sílica (1”x7” (2,54x17,78 cm)), 40% de EtOAc/hexanos a 60% de EtOAc/hexanos contendo 10% de TEA, rendeu 438 mg (49%) de Composto 11. RMN 1H (DMSO- d6, 400 MHz): δ 8.00 (m, 1H), 7.61 (m, 2H), 6.96 (m, 1H),

6.71 (s, 1H), 6.69 (s, 1H), 6.53 (m, 2H), 6.43 (d, J = 2.5 Hz, 2H), 4.44 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 3.31 (m, 2H), 3.14 (m, 4H), 2.93 (s, 12H), 2.91 (m, 2H). LCMS: m/z 510.4 [M+H]. Composto S5

[00164]O Composto 11 (423 mg, 0,830 mmol) foi dissolvido em 25 mL de DCM anidro sob argônio, e DIEA (0,725 mL, 4,16 mmol) foi adicionado seguido por PAM-Cl (0,190 mL, 0,924 mmol). A mistura foi agitada em temperatura ambiente por 3 h, lavada com NaHCO3 saturado, água e salmoura, e a camada orgânica foi seca em Na2SO4. A cromatografia em sílica gel, 20% de EtOAc/hexanos a 40% de EtOAc/hexanos contendo 10% de TEA rendeu 485 mg (82%) de Composto S5. RMN 1H (CD3CN, 400 MHz): δ 7.89 (m, 1H), 7.57 (m, 2H), 6.97 (m, 1H), 6.80 (s, 1H), 6.78 (s, 1H), 6.52 (m, 2H), 6.44 (m, 2H), 3.73 (m,2H),

3.56 (m, 4H), 3.26 (m, 4H), 2.97 (s, 12H), 2.61 (m, 2H),

1.97 (m, 2H), 1.19 (d, J = 6.8 Hz, 6H), 1.12 (d, J = 6.8 Hz, 6H) RMN 31P (CD3CN, 160 MHz): δ 148.1. Exemplo 6: Síntese de corante Sulforodamina S6

[00165]Esse exemplo descreve a síntese de um corante sulforodamina S6 de exemplo que compreende um grupo fosforamidita e um grupo hidroxila protegido com o grupo dimetoxitritila. Esse corante é adequado para incorporação na extremidade 5’ ou em uma posição intermediária de um oligonucleotídeo por meio de síntese automática de oligonucleotídeo padrão.

[00166]O Composto S6 foi preparado de acordo com o procedimento do Esquema 6.

Composto 13

[00167]A síntese do Composto 12 foi realizada por tratamento com óxido de etileno 2,3,3-trimetil-2,3-di-hidro- 1H-indol-6-ol em ácido acético (Grupo FCH, Letônia). Água (27 mL) foi resfriada a cerca de 0°C e H2SO4 conc. (41 mL) foi adicionado lentamente. A solução resultante foi aquecida em um balão de fundo redondo de 3 gargalos de 250 mL a 160°C. Ácido 2-formilbenzenossulfônico (3,21 g, 15,4 mmol) e o Composto 12 (6,82 g, 30,8 mmol) completamente pré-misturados foram adicionados em porções ao longo de 1 minuto à solução de ácido sulfúrico. A solução foi aquecida a 160°C por 6 h aberta ao ar, depois resfriada em TA e adicionada lentamente a 300 mL de NaOH 5 M a frio. O pH foi ajustado para 9 com H2SO4. A mistura foi extraída com DCM (2x). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura e secas em Na2SO4. O solvente foi removido sob vácuo e os sólidos brutos foram secos sob alto vácuo em KOH para render 2,25 g de material bruto. A cromatografia em uma coluna de gel de sílica (2”x6” (5,08x15,24 cm) usando um sistema de solvente ACN/água (5 a 8% H2O) rendeu 526 mg (6%) do Composto 13. RMN 1H (DMSO-d6, 400 MHz): δ 8.03 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.64 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 7.56 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 7.15 (m, 1H),

6.82 (s, 2H), 6.64 (s, 2H), 5.01 (s, 2H), 3.76 (m, 8H), 3.48 (m, 2H), 1.11 (m, 18H). LCMS: m/z 591.5 [M+H]. Composto 14

[00168]O composto 13 (525 mg, 0,889 mmol) foi dissolvido em 15 mL de piridina anidra sob argônio. Anidrido acético (0,210 mL, 2,22 mmol) e DMAP (11 mg, 0,090 mmol) foram adicionados, e a mistura foi agitada em TA por 3 h. A piridina foi removida sob vácuo, e o resíduo foi purificado por cromatografia em gel de sílica (1”x7”(2,54x17,78 cm) usando um sistema de solvente MeOH/DCM (2 a 10%) para produzir 531 mg (89%) do Composto 14. RMN 1H (DMSO-d6, 400 MHz): δ 8.03 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.66 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 7.56 (t, J =

7.4 Hz, 1H), 7.18 (m, 1H), 6.94 (s, 2H), 6.69 (s, 2H), 4.31 (m, 4H), 3.96 (m, 2H), 3.78 (m, 2H), 3.71 (m,2H), 1.99 (s, 3H), 1.97 (s, 3H), 1.18 (m, 12H), 0.98 (s, 6H). LCMS: m/z

675.5 [M+H]. Composto 15

[00169]O Composto 14 (520 mg, 0,771 mmol) foi dissolvido em 25 mL de DCM anidro sob argônio, e POCl3 (0,360 mL, 3,68 mmol) foi adicionado. A mistura reacional foi agitada em TA por 5 h, em seguida, metilamina 2,0 M em THF (11,6 mL, 23,1 mmol) foi adicionada, e a mistura foi agitada por 1 h. A mistura foi lavada com água, NaHCO3 saturado e salmoura, e a camada orgânica foi seca em Na2SO4. A cromatografia em gel de sílica (1”x7” (2,54x17,78 cm)), 10% de EtOAc/hexanos a 30% de EtOAc/hexanos contendo 10% de TEA rendeu 437 mg (82%)

de Composto 15. RMN 1H (DMSO-d6, 400 MHz): δ 8.01 (m, 1H),

7.61 (m, 2H), 7.02 (m, 1H), 6.43 (m, 2H), 6.33 (m, 2H), 4.18 (m, 4H), 3.47 (m, 2H), 3.29 (m, 4H), 2.27 (s, 3H), 1.98 (m, 6H), 1.09 (m, 9H), 0.97 (s, 3H), 0.84 (s, 3H), 0.71 (s, 3H). LCMS: m/z 688.5 [M+H]. Composto 16

[00170]O composto 15 foi dissolvido em 20 mL de MeOH, e uma solução de K2CO3 em 5 mL de água foi adicionada. A mistura foi agitada em TA por 1 h. O MeOH foi removido sob vácuo, o resíduo foi lavado com água e salmoura e seco em Na2CO3 e sob alto vácuo para render 336 mg (90%) do Composto 16 que foi usado na próxima etapa sem purificação adicional. RMN 1H (DMSO-d6, 400 MHz): δ 7.99 (m, 1H), 7.60 (m, 2H), 7.01 (m, 1H), 6.41 (s, 2H), 6.24 (m, 2H), 4.71 (t, J = 4.8 Hz, 2H),

3.54 (m, 4H), 3.28 (m, 4H), 3.16 (m, 2H), 2.27 (s, 3H), 1.08 (m, 9H), 0.97 (s, 3H), 0.85 (s, 3H), 0.71 (3H). LCMS: m/z

604.5 [M+H]. Composto 17

[00171]O composto 16 (329 mg, 0,545 mmol) foi seco por evaporação azeotrópica com 12 mL de piridina anidra (2X). O material seco foi dissolvido em 12 mL de piridina anidra e foi adicionado DMTCl (258 mg, 0,761 mmol). A mistura foi agitada em TA por 18 h, e a reação foi extinta com metanol (2 mL). Os solventes foram removidos sob vácuo. A cromatografia em gel de sílica (1”x7” (2,54x17,78 cm)), 30% de EtOAc/hexanos a 40% de EtOAc/hexanos contendo 10% de TEA rendeu 232 mg (47%) do Composto 17. RMN 1H (DMSO-d6, 400 MHz): δ 8.01 (m, 1H), 7.62 (m, 2H), 7.52 (m, 1H), 7.35 (m, 2H), 7.22 (m, 7H), 7.05 (m, 1H), 6.81 (m, 4H), 6.43 (m, 1H),

6.36 (m, 1H), 6.29 (m, 1H), 4.72 (m, 1H), 3.68 (m, 6H), 3.57

(m, 3H), 3.25 (m, 7H), 2.25 (m, 3H), 1.09 (m, 9H), 0.97 (m, 3H), 0.86 (m, 3H), 0.73 (m, 3H). LCMS: m/z 906.8 [M-H]. Composto S6

[00172]A uma solução do composto 17 (227 mg, 0,251 mmol) em 20 mL de DCM anidro sob argônio, DIEA (0,218 mL, 1,25 mmol) foi adicionado, seguido por PAM-Cl (0,075 mL, 0,365 mmol). A mistura foi agitada em TA por 2 h e depois lavada com NaHCO3, água e salmoura. A camada orgânica foi seca em Na2SO4. A cromatografia em sílica gel, 20% de EtOAc/hexanos a 30% de EtOAc/hexanos contendo 10% de TEA, rendeu 212 mg (77%) de Composto S6. RMN 1H (CD3CN, 400 MHz): δ 7.91 (m, 1H), 7.57 (m, 2H), 7.41 (m, 2H), 7.28 (m, 7H), 7.03 (m, 1H),

6.81 (m, 4H), 6.56 (m, 2H), 6.32 (m, 2H), 3.79 (m, 2H),

3.72 (m, 6H), 3.58 (m, 4H), 3.41 (m, 2H), 3.33 (m, 2H), 3.22 (m, 2H), 2.53 (m, 2H), 2.32 (m, 3H), 1.11 (m, 21H), 1.03 (m, 3H), 0.93 (m, 3H), 0.80 (m, 3H). RMN 31P (CD3CN, 160 MHz): δ 147.3.

[00173]O composto S6 foi incorporado na extremidade 5’ de um oligonucleotídeo modelo (SEQ. ID No 1). Os espectros de excitação e emissão do oligonucleotídeo de exemplo são mostrados na FIGURA 3. Exemplo 7: Síntese de corante Sulforodamina S7

[00174]Esse exemplo descreve a síntese de um corante sulforodamina S7 de exemplo que compreende um grupo fosforamidita e um grupo hidroxila protegido com o grupo dimetoxitritila. Esse corante é adequado para incorporação na extremidade 5’ ou em uma posição intermediária de um oligonucleotídeo por meio de síntese automática de oligonucleotídeo padrão.

[00175]O Composto S7 foi preparado de acordo com o procedimento do Esquema 7.

Composto 19

[00176]Uma suspensão do Composto 2 (4,9 g, 7,6 mmol) em DMF anidro (50 mL) foi tratada em TA sob argônio com excesso de TEA (5,3 mL, 5 eq), seguido por carbonato de bis- nitrofenila BNPC (2,8g, 1,2 eq). A suspensão preta foi aquecida a 30-35°C até a formação do intermediário 18 estar completa (1,5-3h após a adição de BNPC). Mono-DMT- dietanolamina (DMT-L) (4,6 g, 1,5 eq) foi adicionado em uma porção, e a mistura reacional foi agitada a 30-35°C (1-3 h), em seguida, em temperatura ambiente (> 2 h) até a conclusão da reação. A mistura reacional foi diluída com EtOAc (530 mL) e foi transferida para um funil de separação. A camada de EtOAc foi lavada com água DI (4 x 380 mL) e salmoura (1 x 380 mL). A camada de EtOAc foi seca em Na2SO4, filtrada e evaporada para resultar no Composto 19 bruto. A purificação em coluna de gel de sílica do produto bruto proporcionou o Composto 19 puro como lavanda a um sólido roxo (7,5 g, 91% de rendimento). LCMS: m/z 1082.0 [M+H]. RMN 1H (DMSO-d6, 400 MHz): δ 8.18 (d, 1H, J = 2 Hz), 7.22 (dd, 1H, J = 8.4, 1.6 Hz), 7.16-7.36 (m, 10H), 6.95 (m, 1H), 6.86 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 6.81 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 6.28 (s, 2H), 4.60 (m, 1H),

3.90 (m, 1H), 3.80 (m, 1H), 3.70 (m, 6H), 3.40 (m, 3H), 3.30 (m, 3H), 3.16 (m, 2H), 3.07 (m, 12H), 2.90 (m, 1H), 2.80 (m, 1H), 2.78 (m, 4H), 2.44 (m, 4H), 1.92 (m, 4H), 1.75 (m, 4H). Composto S7

[00177]O composto 19 (6,5 g, 6 mmol) foi colocado em um balão de fundo redondo de 3 gargalos e foi seco sob alto vácuo a ≤ 2 mBar (200 Pa) por ≥ 90 min. O Composto seco 19 foi então dissolvido em DCM anidro (130 mL) sob argônio. O balão de reação foi resfriado a 0-5°C, e DIEA (10,5 mL, 10 eq) foi adicionado seguido pela adição em gotas de N,N- diisopropil-clorofosforamidita–Cl (PAM-Cl) (1,7 mL, 1,3 eq.), mantendo a temperatura interna a 0-5°C. A reação foi deixada agitar em temperatura ambiente até a conclusão (2-3 h). A reação foi diluída com DCM (130 mL) e lavada com NaHCO3 (2 x 80 mL), salmoura (150 mL) e seca em Na2SO4. A filtração, a concentração e a purificação em coluna de gel de sílica do produto bruto proporcionou o Composto S7 puro como um sólido rosa a lilás (6,07 g, rendimento de 78%). LCMS: m/z 1281.2 [M+H]. RMN 31P (DMSO-d6, 160 MHz): δ 147.57. RMN 1H (DMSO-d6, 400 MHz): δ 7.90 (s, 1H), 7.48 (dd, 1H, J = 8.4, 2.0 Hz),

7.40 (m, 2H), 7.20-7.30 (m, 7H), 6.82 (m, 5H), 6.35 (s, 2H),

3.93 (m, 1H), 3.87 (m, 1H), 3.76 (m, 8 H), 3.62 (m, 4H),

3.46 (m, 2H), 3.41 (m, 1H), 3.33 (m, 1H), 3.25 (m, 1H)3.19 (m, 1H), 3.13 (m, 11H), 2.98 (m, 1H), 2.84-2.91 (m, 5H),

2.64 (m, 2H), 2.40-2.56 (m, 6H), 1.95 (m, 4H), 1.78 (m, 4H),

1.10-1.23 (m, 12H). Exemplo 8: Síntese do Composto S8

[00178]Esse exemplo descreve a síntese de um corante sulforodamina de exemplo S8 que compreende um grupo fosforamidita e um grupo hidroxila protegido com grupo dimetoxitritila. Esse corante é adequado para incorporação na extremidade 5’ ou em uma posição intermediária de um oligonucleotídeo por meio de síntese automática de oligonucleotídeo padrão.

[00179]O composto S8 foi preparado de acordo com o procedimento do Esquema 8.

Composto 20

[00180]O Composto 3 (2,80 g, 1 eq) foi dissolvido em diclorometano anidro (50 mL) e POCl3 (6,9 mL, 14 eq) foi adicionado em gotas em temperatura ambiente. Após 4 horas, a mistura reacional foi evaporada até secar para fornecer intermediário bruto como um sólido azul escuro. Etilenodiamina (EDA, 6,0 mL, 17,0 eq) foi dissolvido em diclorometano anidro (40 mL), e a solução foi resfriada a 5ºC. O sólido foi dissolvido em diclorometano anidro (20 mL) e adicionado em gotas à solução de EDA. Após 17 h a 4ºC, a mistura reacional foi lavada com bicarbonato de sódio saturado (2 x 40 mL) e, em seguida, com água DI (40 mL). A camada orgânica foi evaporada até secar para produzir o Composto 20 (3,08 g, 96%) como um sólido azul escuro. LCMS: m/z 569.4 [M+H+]. Calc-d: 569.25. RMN 1H (DMSO-d6, 400 MHz): δ 7.92 (dd, 1H, J = 6.0, 2.8 Hz), 7.54 – 7.56 (m, 2H), 6.90 (dd, 1H, J = 6.4, 2.8 Hz), 6.30 (s, 2H), 3.3 (br., 2H), 3.07 – 3.14 (m, 8H), 2.75 – 2.88 (m, 6H), 2.35 – 2.49 (m, 6H),

1.95 (m, 4H), 1.79 (m, 4H). Composto 21

[00181]O ácido 4-pentinoico (4PA, 0,67 g, 1,1 eq) foi dissolvido em acetonitrila anidro (6,5 mL), e a solução foi resfriada a 5ºC. Diisopropiletilamina (3,3 mL, 3,0 eq) foi adicionada seguida por trifluoroacetato de pentafluorofenila (PFP-TFA, 1,2 mL, 1,1 eq). A mistura reacional foi incubada em temperatura ambiente por 1 h. O composto 20 (3,1 g, 1,0 eq) foi suspenso em uma mistura de 10 mL de N,N- dimetilformamida, 10 mL de diclorometano e 5 mL de sulfóxido de dimetila. A suspensão foi adicionada à solução de ácido 4-pentinoico ativado e incubada em temperatura ambiente por

1 h. A mistura reacional foi diluída com 50 mL de acetato de etila e lavada com bicarbonato de sódio saturado (2 x 30 mL) e então água DI (30 mL). A camada orgânica foi evaporada até secar. O produto bruto foi purificado usando purificação em coluna de gel de sílica para produzir o Composto 21 (2,74 g, rendimento de 68%) como um sólido azul. LCMS: m/z 649.5 [M+H+]. Calc-d: 649.28. RMN 1H (DMSO-d6, 400 MHz): δ 7.93 –

7.96 (m, 1H), 7.65 (t, 1H, J = 5.6 Hz), 7.54 – 7.58 (m, 2H),

6.87 – 6.90 (m, 1H), 6.32 (s, 2H), 3.05-3.16 (m, 8H), 2.97 – 3.04 (m, 2H), 2.79 – 2.88 (m, 6H), 2.72 (t, 1H, J = 2.4 Hz), 2.39 – 2.58 (m, 4H, sobrepõe-se a DMSO-d5), 2.20 – 2.27 (m, 2H), 2.10 (t, 2H, 7.6 Hz), 1.95 (m, 4H), 1.79 (m, 4H). Composto 22

[00182]O composto 21 (2,7 g, 1,0 eq) foi dissolvido em N,N-dimetilformamida (22,0 mL) e foi adicionada trietilamina (1,7 mL, 3,0 eq). A solução preparada foi adicionada sob atmosfera inerte à mistura sólida de 5-iodo-5’- dimetoxitritil-2’-desoxiuridina (2,7 g, 1,0 eq; DMT-I-dU), tetracis(trifenilfosfina)paládio (0) (0,48 g, 0,1 eq) e iodeto de cobre (I) (0,24 g, 0,3 eq), e a mistura reacional foi incubada em temperatura ambiente por 2 h. A mistura reacional foi diluída com acetato de etila (120 mL) e lavada com solução de EDTA 0,1 M (2 x 80 mL). A camada orgânica foi seca com sulfato de sódio anidro (25 g, 18 h), filtrada e evaporada até secar (sólido azul). O produto bruto foi purificado usando purificação em coluna de gel de sílica para render o Composto 22 (4,73 g, 97% de rendimento) como um sólido azul. LCMS: m/z 1177.9 [M+H+]. Calc-d: 1177.47 RMN 1H (DMSO-d6, 400 MHz): δ 7.93 – 7.96 (m, 1H), 7.83 (s, 1H),

7.54 – 7.58 (m, 2H), 7.49 (t, 1H, J = 6.0 Hz), 7.37 – 7.41

(m, 2H), 7.25 – 7.31 (m, 6H), 7.18 – 7.22 (m, 1H), 6.83 –

6.90 (m, 5H), 6.32 (s, 2H), 6.11 (t, 1H, J = 6.8 Hz), 5.33 (s, 1H), 4.27 (m, 1H), 3.91 (m, 1H), 3.71 (s, 6H), 3.21 –

3.26 (m, 2H), 3.05-3.14 (m, 8H), 2.97 – 3.04 (m, 2H), 2.77 – 2.88 (m, 6H), 2.38 – 2.59 (m, 4H, sobrepõe-se a DMSO-d5),

2.14 – 2.28 (m, 4H), 1.98 – 2.03 (m, 2H), 1.93 (m, 4H), 1.77 (m, 4H). Composto S8

[00183]O composto 22 (4,6 g, 1,0 eq) foi dissolvido em diclorometano anidro (27,6 mL) sob argônio. O balão de reação foi resfriado a 0-5°C e diisopropiletilamina (2,0 mL, 3,0 eq) foi adicionada seguida pela adição em gotas de PAM-Cl (1,1 mL, 1,3 eq) enquanto se mantinha a temperatura interna a 0-5°C. A reação foi deixada a agitar em TA por 2 h. A reação foi diluída com acetato de etila (150 mL), lavada com NaHCO3 (2 x 100 mL), salmoura (80 mL), seca sobre sulfato de sódio anidro (46 g, 20 h), filtrada e evaporada até secar (sólido azul). O produto foi dissolvido em 200 mL de diclorometano e purificado por precipitação em mistura igual de éter e hexanos (2 L). Filtração e secagem proporcionaram o produto como um sólido azul (1,92 g, rendimento de 36%). LCMS: m/z 1378.3 [M+H]. RMN 31P (CD3CN, 160 MHz): dois singletos (diastereômeros) δ 147.97 ppm e 148.04 ppm. RMN 1H (CD3CN, 400 MHz): δ 9.2 (br, 1H), 7.94 e 7.97 (s, 1H), 7.85 – 7.89 (m, 1H), 7.53 – 7.59 (m, 2H), 7.42 – 7.47 (m, 2H),

7.30 – 7.37 (m, 4H), 7.19 – 7.29 (m, 3H), 6.80 – 6.92 (m, 5H), 6.35 (s, 2H), 6.13 – 6.21 (m, 1H), 5.36 – 5.41 (m, 1H),

4.55 – 4.64 (m, 1H), 4.08 – 4.15 (m, 1H), 3.73 – 3.75 (m, 6H), 3.55 – 3.70 (m, 4H), 3.25 – 3.40 (m, 2H), 3.05-3.16 (m, 8H), 2.93 – 3.00 (m, 2H), 2.72 – 2.88 (m, 6H), 2.66 (t, 1H,

6.0 Hz), 2.33 – 2.59 (m, 7H), 2.15 – 2.22 (m, 2H), 1.92 –

2.00 (m, 2H), 1.75 – 1.88 (m, 6H), 1.14 – 1.21 (m, 9H), 1.07 e 1.06 (2 x s, 3H). Exemplo 9: Síntese do Composto S9

[00184]Esse exemplo descreve a síntese de um corante sulforodamina de exemplo S9 que compreende um grupo fosforamidita e um grupo hidroxila protegido com o grupo dimetoxitritila. Esse corante é adequado para incorporação na extremidade 5’ ou em uma posição intermediária de um oligonucleotídeo por meio de síntese automática de oligonucleotídeo padrão.

[00185]O Composto S9 é preparado analogamente à preparação do Composto S8 descrito acima de acordo com o Esquema 9.

Exemplo 10: Preparação de polinucleotídeos rotulados com fluorescência de fosforamiditas de corante sulforodamina

[00186]Polinucleotídeos compreendendo corantes sulforodamina foram sintetizados em um sintetizador de oligonucleotídeo MerMade-12 utilizando protocolo de DNA de 200 nmol padrão em ciclos de remoção de DMT - acoplamento - capeamento - oxidação - capeamento. O tempo de acoplamento para os fosforamiditas de corante sulforodamina foi estendido para 6 min.

[00187]Para polinucleotídeos contendo corantes 5’ sulforodamina, a síntese foi completada após o último ciclo de acoplamento de fosforamidita de corante sulforodamina. No caso de incorporação interna de fosforamiditas de corante sulforodamina, mais monômeros de nucleosídeo foram adicionados após o acoplamento do corante. Um grupo DMT final foi deixado no polinucleotídeo.

[00188]Polinucleotídeos totalmente montados foram clivados do suporte sólido e desprotegidos por hidróxido de amônio a 30% a 55°C por 10-12h. Após a remoção da amônia, os oligonucleotídeos foram analisados e purificados por HPLC de fase reversa (RP-HPLC) em coluna C18 Gemini eluindo com um gradiente linear de acetonitrila/bicarbonato de trietilamônio 0,1 M, pH 7. Após a remoção do grupo DMT, os polinucleotídeos foram purificados para a segunda vez.

[00189]Os oligonucleotídeos rotulados com sulforodamina 101 foram preparados por conjugação de amino-C6-oligo com um reagente comercial Texas Red®-X (éster NHS) (isômeros mistos, Thermo Fisher Scientific). Todos os polinucleotídeos purificados foram caracterizados por espectroscopia de massa.

[00190]As sondas de 5’-nuclease compreendendo corantes sulforodamina de exemplo foram preparadas usando o extintor BHQ-2 CPG, coluna Angstrom de Glicolato 500 (BioSearch Technologies). A01 indica 2-amino-dA (ribosídeo 2,6-diamino- 2’-desoxipurina) que foi incorporado usando fosforamidita de 2-Amino-dA-CE comercialmente disponível (Glen Research, número de catálogo do produto: 10-1085).

[00191]Oligonucleotídeos de exemplo que incorporam fosforamiditas de corante sulforodamina e oligonucleotídeos rotulados com Sulforodamina 101 (Tx Red) estão listados na Tabela 1. Tabela 1. Nome Corante 5' Sequência Extintor 3' Oligo A Tx Red SEQ ID NO: 1 N/A Oligo B (S6) SEQ ID NO: 1 N/A Oligo C (S7) SEQ ID NO: 1 N/A Oligo D Tx Red SEQ ID NO: 2 BHQ-2 Oligo E (S7) SEQ ID NO: 2 BHQ-2 Oligo F Tx Red SEQ ID NO: 3 BHQ-2 Oligo G (S7) SEQ ID NO: 3 BHQ-2

[00192]Na Tabela 1, as porções de corante incorporadas na extremidade 5’ dos polinucleotídeos têm as seguintes estruturas: e, e as sequências de oligonucleotídeos são as seguintes: TCA GAG TAC CTG AAA CA (SEQ ID NO: 1), CC(A01) CGG (A01)GC G(A01)G AC(A01) TCT CGG CC (SEQ ID NO: 2), e CC(A01) G(A01)G CAA ACT GGG CGG C(A01) (SEQ ID NO:3), em que A01 indica 2,6-diaminopurina 2’-desoxirribosídeo.

[00193]Os espectros de excitação e emissão de oligonucleotídeos rotulados foram registrados em um fluorímetro Agilent Cary (oligonucleotídeo 200 nM, tampão Tris 0,1 M, pH 8). Como mostrado nas FIGURAS 1A e 1B, a excitação e a emissão máximas de um oligonucleotídeo de exemplo preparado por meio da síntese automática de oligonucleotídeos usando um Composto S7 reagente de fosforamidita de exemplo (Oligo C) corresponde aos valores máximos de excitação e emissão de um oligonucleotídeo compreendendo o corante Texas Red® (Oligo A). Como mostrado na FIGURA 1C, a excitação e a emissão máximas de um oligonucleotídeo de exemplo preparado via síntese de oligonucleotídeo automática usando um Composto S6 reagente de fosforamidita de corante de exemplo (Oligo B), estão próximas da excitação e emissão máximas relatadas pela literatura de oligonucleotídeos rotulados com corante TAMRA. Exemplo 11: Comparação de desempenho de um corante sulforodamina de exemplo e Corante Texas Red® em PCR de 5’- Nuclease

[00194]Nesse exemplo, as reações de PCR de 5’-nuclease foram realizadas usando sondas fluorescentes cliváveis extintas compreendendo os corantes da divulgação e um extintor comercialmente disponível BHQ-2. Os perfis de PCR mostrados nas FIGURAS 2A e 2B demonstram que as sondas compreendendo os corantes da invenção tiveram um desempenho eficiente como sondas de detecção.

[00195]As sondas de PCR de 5’-Nuclease compreendendo os corantes da divulgação foram avaliadas e comparadas com as sondas de PCR compreendendo Texas Red®. O gene de manutenção da beta-globulina do DNA do genoma humano foi usado como o alvo. Os iniciadores direto e reverso tinham as seguintes sequências: AAA CCT CCA GGC CAG AAA GAG AGA GTA (SEQ. ID NO: 4) AAA AGG CAT TCC TGA AGC TGA CAG CAT TC (SEQ. ID NO: 5) AAA ACC TGC CTT CTG CGT GAG ATT CT (SEQ. ID NO: 6) CTG TAC GAA AAG ACC ACA GGG CCC AT (SEQ. ID NO: 7)

[00196]O PCR foi realizado no instrumento GeneXpert® (Cepheid) com 4 módulos (detecção: canal Tx Red, Ex 585 nm, Em 610 nm). Cada curva de PCR é uma média de 4 repetições. O seguinte protocolo de PCR foi usado: Amplicon: comprimento 96 bp, 1.000 cópias/reação; Concentrações de trifosfato de nucleotídeo (NTP) para cada um de ATP, CTP, GTP, TTP: 0,25 mmol; Taq polimerase: 3 unidades/25 uL de reação; Concentrações do iniciador (cada): 200 nM; e Concentração da sonda: 250 nM; Dois ciclos de desnaturação por 35 segundos a 95°C, extensão por anelamento por 30 segundos a 66°C; e 45 ciclos: desnaturação por 8 segundos a 95°C, extensão por anelamento por 30 segundos a 66°C.

[00197]Os dados de PCR resultantes são mostrados nas FIGURAS 2A e 2B. Como demonstrado pelos dados, as sondas de PCR de 5’ nuclease rotuladas com corantes de exemplo da divulgação têm desempenho comparável ao de sondas de PCR rotuladas com Texas Red®. Como pode ser visto a partir dos dados das FIGURAS 2A e 2B, as sondas que compreendem um corante de exemplo S7 demonstram um ponto final similar àqueles demonstrados pelas sondas rotuladas com Texas Red®. Exemplo 12: Síntese dos compostos S10a e S10b

[00198]Esse exemplo descreve a síntese de corantes sulforodamina de exemplo S10a e S10b que compreendem um grupo fosforamidita. Esses corantes são adequados para incorporação na posição da extremidade 5’ de um oligonucleotídeo através da síntese automática de oligonucleotídeos padrão.

[00199]Os corantes sulforodamina, tais como, o composto S10 mostrado abaixo, preparado a partir do intermediário racêmico 12 contêm dois centros quirais que resultam nos corantes finais existentes como uma mistura de 4 diastereômeros.

[00200]Após a incorporação de tais corantes aos polinucleotídeos, por exemplo, por síntese ou conjugação de fosforamidita, é produzida uma mistura diastereomérica de polinucleotídeos rotulados com fluorescência. Embora esses polinucleotídeos tenham propriedades ópticas idênticas, sua purificação por HPLC pode ser difícil devido aos polinucleotídeos eluindo como picos múltiplos ou amplos. O uso de estereoisômeros puros dos corantes pode simplificar a purificação cromatográfica de tais polinucleotídeos rotulados.

[00201]O composto S10a é um exemplo de um corante sulforodamina sintetizado a partir de 12a, um único enantiômero do composto 12, resultando no composto S10a existindo como um único diastereômero. O composto 12a pode ser sintetizado a partir de 2,3,3-trimetil-3H-indol-6-ol

(Grupo FCH, Lativa) por meio de hidrogenação de transferência assimétrica (como descrito em Org. Lett. 2018, 20, 5107- 5111) usando catalisador quiral RuCl(p-cimeno)[(R,R)-Ts- DPEN] (Aldrich cat # 703907). De forma similar, o composto 12b, um estereoisômero de 12a, pode ser sintetizado por um procedimento similar usando RuCl(p-cimeno)[(S,S)-Ts-DPEN] (Aldrich).

Composto 13a

[00202]O sal de sódio do ácido 2- formilbenzenossulfonônico (1,41 g, 6,77 mmol) e um equivalente do composto 12a (1,50 g, 6,77 mmol) foram dissolvidos em 40 mL de 60% de H2SO4. A solução foi aquecida a 60°C por 3 h, e outro equivalente do composto 12a foi adicionado, e a mistura foi aquecida a 100°C. Após 72 h, a mistura reacional foi resfriada em TA, diluída com 40 mL de água, vertida em 500 mL de gelo picado, e agitada por 1,5 horas. Os sólidos resultantes foram coletados por filtração.

Salmoura (100 mL) foi adicionada ao filtrado, e o filtrado foi extraído com diclorometano (2X). As camadas orgânicas combinadas foram secas em Na2SO4, filtradas, e os solventes foram removidos in vacuo. O material extraído dos compostos orgânicos e o precipitado foram combinados e purificados por cromatografia em uma coluna de gel de sílica (2”x7” (5,08x17,78cm)) usando um gradiente de sistema ACN/água (4% a 10% H2O) para render 1,08 g (27% ) do Composto 13A. RMN 1H (DMSO-d6, 500 MHz): δ 8.03 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.64 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.55 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.15 (d, J=7.5 Hz, 1H), 6.91 (m, 1H), 6.81 (d, J=3.6 Hz, 1H), 6.65 (m, 2H),

4.98 (m, 1H), 4.93 (m, 1H), 3.96 (m, 1H), 3.82 (m, 2H), 3.70 (m, 5H), 3.45 (m, 2H), 1.18 (m, 9H), 1.12 (s, 3H), 0.98 (s, 3H), 0.97 (s, 3H). LCMS: m/z 591.5 [M+H]. Composto 14a

[00203]Sob argônio, o composto 13a (1,06 g, 1,79 mmol) foi dissolvido em 25 mL de piridina anidra. Anidrido acético (0,510 mL, 5,39 mmol) e DMAP (22 mg, 0,180 mmol) foram adicionados, e a mistura foi agitada em TA por 5 h. A piridina foi removida in vacuo, e o resíduo foi cromatografado em uma coluna de gel de sílica (1,5”x5” (3,81x12,7 cm) usando um sistema de solvente MeOH/DCM (4 a 8% de MeOH) para render 475 mg (39%) do composto 14a. RMN 1H (DMSO-d6, 500 MHz): δ

8.03 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.65 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 7.56 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 7.16 (d, J= 7.3 Hz, 1H), 6.93 (d, J=5.3 Hz, 2H), 6.70 (s, 2H), 4.29 (m, 4H), 3.96 (m, 2H), 3.78 (m, 2H),

3.69 (m,2H), 1.99 (s, 3H), 1.98 (s, 3H), 1.21 (d, J=6.7 Hz, 3H), 1.17 (d, J=6.6 Hz, 3H), 1.15 (s, 3H), 1.12 (s, 3H),

0.99 (s, 3H), 0.98 (s, 3H). LCMS: m/z 675.5 [M+H]. Composto 26

[00204]O Composto 14a (455 mg, 0,674 mmol) foi dissolvido em 25 mL de DCM anidro sob argônio, e POCl3 (0,630 mL, 6,76 mmol) foi adicionado. A mistura foi agitada em TA por 18 h, após isso DCM e POCl3 foram removidos in vacuo. O óleo resultante foi dissolvido em 25 mL de DCM anidro, e a solução foi resfriada a 0°C, e DIEA (1,15 mL, 6,60 mmol) e 2-(2- aminoetoxi)etanol (338 uL 3,37 mmol) foram adicionados. A mistura foi deixada aquecer até a temperatura ambiente e agitada por 2 h, em seguida extraída com NaHCO3 saturado. O extrato foi seco em Na2SO4. O produto bruto foi cromatografado em sílica gel (coluna 1”x6” (2,54x15,24 cm)) usando um gradiente de MeOH/DCM (2 a 6% de MeOH) para render 382 mg (74%) do composto 26. RMN 1H (DMSO-d6, 500 MHz): δ

8.00 (m, 1H), 7.60 (m, 2H), 6.99 (m, 1H), 6.43 (d, J=1.3 Hz, 2H), 6.32 (d, J=5.6 Hz, 2H), 4.41 (t, J=4.78, 1H), 4.16 (m, 4H), 3.29 (m, 2H), 3.15 (m, 6H), 3.09 (m, 4H), 2.90 (m, 2H),

1.98 (m, 6H), 1.09 (m, 9H), 0.97 (s, 3H), 0.85 (s, 3H), 0.72 (s, 3H). LCMS: m/z 762.6 [M+H]. Composto S10a

[00205]O Composto 26 (367 mg, 0,481 mmol) foi dissolvido sob argônio em 20 mL de DCM anidro, e DIEA (0,419 mL, 2,41 mmol) foi adicionado, seguido por N,N-diisopropilamino cianoetil fosfonamídico-Cl (0,129 mL, 0,627 mmol). A mistura foi agitada em TA por 3 h, depois extraída com NaHCO3 saturado, água e salmoura. Os extratos foram secos em Na2SO4. A cromatografia em sílica gel (coluna 1”x6” (2,54x15,24 cm)) com 20% de EtOAc/hexanos a 30% de EtOAc/hexanos contendo 10% de TEA rendeu 350 mg (78%) de composto S10a. RMN 1H (CD3CN, 500 MHz): δ 7.91 (m, 1H), 7.59 (m, 2H), 6.97 (m, 1H), 6.54 (d, J=8.2 Hz, 2H), 6.28 (s, 2H), 4.25 (m, 4H), 3.73 (m, 2H),

3.54 (m, 6H), 3.32 (m, 6H), 3.22 (m, 2H), 2.98 (m, 2H),

2.01 (s, 3H), 2.00 (s, 3H), 1.97 (penteto, J=2.5 Hz, 2H),

1.15 (m, 15H), 1.12 (s, 3H), 1.10 (s, 3H), 1.03 (s, 3H),

0.93 (m, 3H), 0.79 (s, 3H). RMN 31P (CD3CN, 500 MHz): δ

148.2. LCMS: m/z 963.0 [M+H].

[00206]O composto S10b pode ser preparado a partir do intermediário 12b de uma maneira similar.

[00207]Polinucleotídeos rotulados de exemplo de SEQ. ID NO: 1 incorporando os corantes S10 e S10a nas extremidades 5’ foram preparados por oligonucleotídeo automático sintetizado como descrito acima. O polinucleotídeo rotulado incorporando o corante S10 foi purificado por HPLC em coluna Phenomenex Gemini (5 µm C18 110Å) eluindo com um gradiente de 16-34% de ACN em tampão de bicarbonato de trietilamônio 0,1 M ao longo de 20 min. O polinucleotídeo rotulado incorporando o corante S10a foi purificado por HPLC em coluna Phenomenex Gemini (5 µm C18 110Å) eluindo com um gradiente de 18-38% de ACN em tampão de bicarbonato de trietilamônio 0,1 M ao longo de 20 min. Os perfis de HPLC dos dois polinucleotídeos rotulados de exemplo são mostrados nas FIGURAS 3A e 3B.

[00208]A FIGURA 1D mostra o espectro de emissão/excitação do oligonucleotídeo rotulado com S10a SEQ. ID NO: 1 demonstrando que S10a pode ser usado como um 94 substituto para o corante TAMRA. Além disso, como mostrado na FIGURA 3B, o polinucleotídeo rotulado com S10a de exemplo produz predominantemente um único pico por HPLC em comparação com os múltiplos picos produzidos pelo polinucleotídeo rotulado com S10 de exemplo (FIGURA 3A), que simplifica a purificação cromatográfica de tais oligonucleotídeos.

[00209]A prática da presente divulgação pode empregar, a menos que indicado de outra forma nesse documento, técnicas convencionais de biologia celular, biologia molecular, microbiologia, virologia, DNA recombinante e assim por diante que estão dentro da habilidade na técnica. Tais técnicas são explicadas por completo na literatura. Ver, por exemplo, Sambrook, Fritsch, e Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição (1989), Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait Ed., 1984), Animal Cell Culture (R. I. Freshney, Ed., 1987), a série Methods In Enzymology (Academic Press, Inc.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. M. Miller e M. P. Calos eds. 1987), Current Protocols In Molecular Biology (F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J. G. Siedman, J. A. Smith, and K. Struhl, eds., 1987).

[00210]Embora modalidades ilustrativas tenham sido ilustradas e descritas, será reconhecido que várias alterações podem ser feitas nas mesmas, sem se afastar do espírito e do escopo da invenção.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composto, caracterizado pelo fato de ser representado pela Fórmula I: ou um estereoisômero, tautômero ou sal do mesmo, em que: R1 é alquila C1-C6 ou L1-X; R2 é halogênio ou SO2NH2, R3 é H ou halogênio; R4, R7, R8 e R11 quando considerados sozinhos são independentemente H, halogênio ou alquila C1-C6 opcionalmente substituído, R5, R6, R9 e R10 quando considerados sozinhos são independentemente H ou alquila C1-C6 opcionalmente substituído; R4 e R5 quando considerados em conjunto são uma cadeia de alquileno C2-C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais R4 e R5 são ligados; R6 e R7 quando considerados em conjunto são uma cadeia de alquileno C2-C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais R6 e R7 são ligados; R8 e R9 quando considerados em conjunto são uma cadeia de alquileno C2-C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais R8 e R9 são ligados; R10 e R11 quando considerados em conjunto são uma cadeia de alquileno C2-C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais R10 e R11 são ligados; R5 e R6, quando considerados em conjunto com o átomo de nitrogênio ao qual R5 e R6 são ligados, formam um anel insaturado de 5 ou 6 membros; R9 e R10, quando considerados em conjunto com o átomo de nitrogênio ao qual R9 e R10 são ligados, formam um anel insaturado de 5 ou 6 membros; L1 é um alquileno C2-C10 opcionalmente substituído ou um heteroalquileno C2-C20 opcionalmente substituído; X é um éster ativado, N3, propinila, maleimido ou -O-P(O CH2CH2CN)NR12R13, ou X é: em que L3 e L4 são independentemente um alquileno C2-C10 opcionalmente substituído ou heteroalquileno C2-C30 opcionalmente substituído; Q é um grupo de proteção de hidroxila; Z é CH, N, NHC(O)N ou OC(O)N; e R12 e R13 são independentemente alquila C1-C6 opcionalmente substituído.

2. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que R2 é Cl e R3 é H.

3. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que X é -OP(OCH2CH2CN)N(i-Pr)2.

4. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que L1 é um ligante PEG2-10.

5. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que L1 é -CH2CH2OCH2CH2-.

6. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que R4 e R5 considerados em conjunto são uma cadeia de alquileno C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais R4 e R5 são ligados; R10 e R11 considerados em conjunto são uma cadeia de alquileno C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais R10 e R11 são ligados; R6 e R7 considerados em conjunto são uma cadeia de alquileno C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais R6 e R7 são ligados; e R8 e R9 em conjunto são uma cadeia de alquileno C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais R8 e R9 são ligados.

7. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que R4 e R5 considerados em conjunto são uma cadeia de propileno que conecta os átomos aos quais R4 e R5 são ligados; R10 e R11 considerados em conjunto são uma cadeia de propileno que conecta os átomos aos quais R10 e R11 são ligados; R6 e R7 considerados em conjunto são uma cadeia de propileno que conecta os átomos aos quais R6 e R7 são ligados; e R8 e R9 em conjunto são uma cadeia de propileno que conecta os átomos aos quais R8 e R9 são ligados.

8. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que cada um de R5, R6, R9 e R10 é metila.

9. Composto, de acordo com a reivindicação 1,

caracterizado pelo fato de que Q é um grupo de proteção de hidroxila instável em ácido.

10. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que Q é um grupo tritila ou dimetoxitritila.

11. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que L3 e L4 são independentemente alquileno C2-C6 ou -(OCH2CH2)m-, em que m é um número inteiro que varia de 2 a 6.

12. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que L3 e L4 são independentemente CH2CH2.

13. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que X é:

14. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o composto é representado pela Fórmula IA: ou um estereoisômero, tautômero ou sal do mesmo, em que R1 é L1X e R3 é H ou halogênio.

15. Composto, de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que X é - OP(OCH2CH2CN)N(i-Pr)2.

16. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o composto é:

17. Composto, caracterizado pelo fato de ser representado pela Fórmula II: ou um estereoisômero, tautômero ou sal do mesmo, em que: R1 é alquila C1-C6; R2 é H, halogênio ou SO2NH2, R3 é H ou halogênio; R14 e R16 quando considerados sozinhos são independentemente H, halogênio ou alquila C1-C6 opcionalmente substituído; R15 e R17 quando considerados sozinhos são independentemente H ou alquila C1-C6 opcionalmente substituídos; R14 e R15 quando considerados em conjunto formam uma cadeia de alquileno C2-C3 opcionalmente substituído, que conecta os átomos aos quais R14 e R15 são ligados; R16 e R17 quando considerados em conjunto formam uma cadeia de alquileno C2-C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais R16 e R17 são ligados; Q é um grupo de proteção de hidroxila; e L1 e L2 são independentemente um alquileno C2-C10 opcionalmente substituído ou heteroalquileno C2-C20 opcionalmente substituído.

18. Composto, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que R3 é H.

19. Composto, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que R2 é H.

20. Composto, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que R2 é Cl.

21. Composto, de acordo com a reivindicação 17, o composto caracterizado pelo fato de ser representado pela Fórmula (IIA):

22. Composto, de acordo com a reivindicação 17, o composto caracterizado pelo fato de ser:

23. Composto, caracterizado pelo fato de ser representado pela Fórmula (III): ou um estereoisômero, tautômero ou sal do mesmo, em que: R2 é H, halogênio ou SO2NH2; R3 é halogênio ou H; R4, R7, R8 e R11 quando considerados sozinhos são independentemente H, halogênio ou alquila C1-C6 opcionalmente substituído, R5, R6, R9 e R10 quando considerados sozinhos são independentemente H ou alquila C1-C6 opcionalmente substituído; R4 e R5 quando considerados em conjunto são uma cadeia de alquileno C2-C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais R4 e R5 são ligados; R6 e R7 quando considerados em conjunto são uma cadeia de alquileno C2-C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais R6 e R7 são ligados; R8 e R9 quando considerados em conjunto são uma cadeia de alquileno C2-C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais R8 e R9 são ligados; R10 e R11 quando considerados em conjunto são uma cadeia de alquileno C2-C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais R10 e R11 são ligados; R5 e R6, quando considerados em conjunto com o átomo de nitrogênio ao qual R5 e R6 são ligados, formam um anel insaturado de 5 ou 6 membros; R9 e R10, quando considerados em conjunto com o átomo de nitrogênio ao qual R9 e R10 são ligados, formam um anel insaturado de 5 ou 6 membros; n é um número inteiro de 1 a 9; Y é: em que: Q é um grupo de proteção de hidroxila; e R12 e R13 são independentemente alquila C1-C6 opcionalmente substituído.

24. Composto, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que R2 é Cl e R3 é H.

25. Composto, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que R4 e R5 considerados em conjunto são uma cadeia de alquileno C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais R4 e R5 são ligados; R10 e R11 considerados em conjunto são uma cadeia de alquileno C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais R10 e R11 são ligados; R6 e R7 considerados em conjunto são uma cadeia de alquileno C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais R6 e R7 são ligados; e R8 e R9 em conjunto são uma cadeia de alquileno C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais R8 e R9 são ligados.

26. Composto, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que R4 e R5 considerados em conjunto são uma cadeia de propileno que conecta os átomos aos quais R4 e R5 são ligados; R10 e R11 considerados em conjunto são uma cadeia de propileno que conecta os átomos aos quais R10 e R11 são ligados; R6 e R7 considerados em conjunto são uma cadeia de propileno que conecta os átomos aos quais R6 e R7 são ligados; e R8 e R9 em conjunto são uma cadeia de propileno que conecta os átomos aos quais R8 e R9 são ligados.

27. Composto, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que Q é um grupo de proteção de hidroxila instável em ácido.

28. Composto, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que Q é um grupo tritila ou dimetoxitritila.

29. Composto, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que cada um de R12 e R13 é isopropila.

30. Composto, de acordo com a reivindicação 23, o composto caracterizado pelo fato de ser:

31. Polinucleotídeo rotulado, caracterizado pelo fato de que compreende um composto de fórmula IV:

ou um estereoisômero, tautômero ou sal do mesmo, em que: R2 é halogênio ou SO2NH2; R3 é H ou halogênio; R4, R7, R8 e R11 quando considerados sozinhos são independentemente H, halogênio ou alquila C1-C6 opcionalmente substituído, R5, R6, R9 e R10 quando considerados sozinhos são independentemente H ou alquila C1-C6 opcionalmente substituído; R4 e R5 quando considerados em conjunto são uma cadeia de alquileno C2-C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais R6 e R7 são ligados;

R6 e R7 quando considerados em conjunto são uma cadeia de alquileno C2-C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais R6 e R7 são ligados; R8 e R9 quando considerados em conjunto são uma cadeia de alquileno C2-C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais R8 e R9 são ligados; R10 e R11 quando considerados em conjunto são uma cadeia de alquileno C2-C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais R10 e R11 são ligados; R5 e R6, quando considerados em conjunto com o átomo de nitrogênio ao qual R5 e R6 são ligados, formam um anel insaturado de 5 ou 6 membros; R9 e R10, quando considerados em conjunto com o átomo de nitrogênio ao qual R9 e R10 são ligados, formam um anel insaturado de 5 ou 6 membros; n é um número inteiro de 1 a 9; Y é:

em que: a linha ondulada é o ponto de ligação à Fórmula III; R12 e R13 são independentemente alquila C1-C6 opcionalmente substituído; W é H ou L4-O-Z2; L3, L4 e L5 são independentemente um alquileno C2-C10 opcionalmente substituído ou heteroalquileno C2-C30 opcionalmente substituído; Z é CH, N, NHC(O)N ou OC(O)N; Z1 é um nucleotídeo ou oligonucleotídeo; e Z2 é um nucleotídeo, oligonucleotídeo ou H.

32. Polinucleotídeo rotulado, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que R2 é Cl e R3 é H.

33. Polinucleotídeo marcado, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que R4 e R5 são uma cadeia de alquileno C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais R4 e R5 são ligados; R10 e R11 são uma cadeia de alquileno C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais R10 e R11 são ligados; R6 e R7 são uma cadeia de alquileno C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais R6 e R7 são ligados; e R8 e R9 são uma cadeia de alquileno C3 opcionalmente substituído que conecta os átomos aos quais R8 e R9 são ligados.

34. Polinucleotídeo rotulado, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo rotulado é uma sonda de PCR de 5’-nuclease.

35. Polinucleotídeo rotulado, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo rotulado compreende adicionalmente um extintor fluorescente.

36. Polinucleotídeo rotulado, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo rotulado está ligado a um suporte sólido.

37. Polinucleotídeo rotulado, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o suporte sólido é um grânulo de vidro de poro controlado, grânulo de poliestireno, grânulo magnético ou placa de micropoços.

38. Composto, caracterizado pelo fato de ser representado pela Fórmula VI: ou um estereoisômero, tautômero ou sal do mesmo, em que: R1 é L1-X; R2, R3, R4 e R5 são independentemente H, halogênio, alquila C1-C6 ou SO2NH2; R6 e R9 são independentemente H ou alquila C1-C6 opcionalmente substituído; R7, R8, R10, R11, R14 e R15 são independentemente H ou alquila C1-C6 opcionalmente substituído; L1 é um alquileno C2-C10 opcionalmente substituído ou um heteroalquileno C2-C20 opcionalmente substituído; X é um éster ativado, N3, propinila, maleimido ou –O- P(OCH2CH2CN)NR12R13, ou X é: em que

L3 e L4 são independentemente um alquileno C2-C10 opcionalmente substituído ou heteroalquileno C2-C30 opcionalmente substituído; Q é um grupo de proteção de hidroxila; Z é CH, N, NHC(O)N ou OC(O)N; e R12 e R13 são independentemente alquila C1-C6 opcionalmente substituído.

39. Composto, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que R7, R8, R10, R11, R14 e R15 são metila.

40. Composto, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que X é -OP(OCH2CH2CN)N(i-Pr)2.

41. Composto, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que L1 é um ligante PEG2-10.

42. Composto, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que L1 é -CH2CH2OCH2CH2-.

43. Composto, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que R2, R3, R4 e R5 são H.

44. Composto, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que R6 é um alquila C1-C6 opcionalmente substituído com OH ou aciloxi C1-C6.

45. Composto, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que R9 é um alquila C1-C6 opcionalmente substituído com OH ou aciloxi C1-C6.

46. Composto, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que R6 é um etila substituída com OH ou OAc.

47. Composto, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que R9 é uma etila substituída com OH ou OAc.

48. Composto, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o composto é: ou um estereoisômero, tautômero ou sal do mesmo, em que: R1, R2, R3, R4 e R5 são como descritos para o Composto conforme definido na reivindicação 43; e Q1 e Q2 são independentemente H ou acila C1-C6.

49. Composto, de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que R2, R3, R4 e R5 são H.

50. Composto, de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que Q1 e Q2 são acetila.

51. Composto, de acordo com a reivindicação 38, o composto caracterizado pelo fato de ser: em que R1 é como definido para o composto como definido na reivindicação 43.

52. Composto, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o composto é:

53. Método para preparar um conjugado rotulado de um ligante, caracterizado pelo fato de que compreende o contato de um ligante com um composto conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 30 ou 38 a 52, em um solvente adequado sob condições suficientes para ligar covalentemente o composto ao ligante, formando assim o conjugado rotulado.

54. Método, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que o ligante é um polinucleotídeo, uma proteína, um peptídeo, um polissacarídeo, um polímero com uma estrutura principal etilênica ou um suporte sólido.

55. Método, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que o ligante é um polinucleotídeo.

56. Método, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que as condições suficientes para ligar covalentemente o composto ao ligante são condições de síntese automática de oligonucleotídeos de fosforamidita.