ES2349129T3 - Polinucleótido que contiene un mimético de fosfato. - Google Patents

Abstract

Oligonucleótido que contiene la estructura siguiente por lo menos una vez: **(Ver fórmula)** 5  en la que A representa el extremo 5' de un nucleótido o de una cadena de nucleótidos, B representa el extremo 3' de un nucleótido o de una cadena de nucleótidos, D es OH o CH3, y Acc es un aceptor de electrones o un aceptor de electrones sustituido con un residuo R, y R es cualquier sustituyente orgánico, y Acc se selecciona de entre un grupo que consiste de: (i) -CN, (ii) -SO2-R', en la que R' contiene por lo menos un alquilo amino-sustituido, un arilo opcionalmente sustituido o un heterociclo opcionalmente sustituido, (iii) un N+-heterociclo de seis elementos con por lo menos un átomo de N alquilado en posición orto o para, seleccionando dicho heterociclo de entre un grupo que consiste de piridinio, pirimidinio y quinolinio.

Description

La presente invención se refiere a nuevas sustancias y a procedimientos para la producción de las mismas en el campo de la química de los nucleótidos. Estas sustancias se denominan miméticos de fosfato, en los que se sustituye un grupo hidroxilo por un mimético correspondiente.

En particular, la presente invención se refiere a una nueva clase de oligonucleótidos modificados y a procedimientos para la producción de los mismos. Estado de la técnica

Ya han sido descritos anteriormente diversos procedimientos para producir nucleótidos u oligonucléotidos con un residuo fosfato modificado

Los (desoxi)oligonucleótidos sintéticos habitualmente se preparan en una fase sólida con ayuda de química de fosforamidita. Habitualmente se utilizan perlas de vidrio con poro de un tamaño definido a modo de fase sólida (abreviadas en lo sucesivo como "vidrio de poro controlado"). El primer monómero se une al soporte mediante un grupo escindible, de manera que el oligonucleótido libre pueda escindirse tras completarse la síntesis en fase sólida. Además del primer monómero contiene un grupo hidroxilo protegido, en cuyo caso habitualmente se utiliza dimetoxitritilo (DMT) como el grupo protector. El grupo protector puede eliminarse mediante tratamiento con ácido. A continuación, en el extremo 5' se acoplan sucesivamente

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derivados 3' fosforamidita de (desoxi)ribonucleósidos también dotados de un grupo protector DMT, con el grupo reactivo liberado en cada caso de grupo protector DMT en un procedimiento cíclico. Alternativamente, se utilizan 5' fosforamiditas protegidas con 3'-dimetoxitritilo en la síntesis de oligonucleótidos inversos. La estrategia de Hfosfonato también se utiliza en particular para introducir modificaciones en el esqueleto de fosfatos, por ejemplo para preparar los fosforotioatos marcados radioactivamente. También ya son conocidas diversas estrategias para preparar oligonucleótidos modificados o marcados: se utilizan materiales de soporte trifuncionales según la técnica anterior para preparar oligonucleótidos marcados en el extremo 3' (patentes US nº 5.290.925 y nº 5.401.837). Las fosforamiditas marcadas en las que el grupo de marcaje se une a la fosforamidita mediante un línker C3-12 habitualmente se utilizan para preparar oligonucléotidos marcados en el extremo 5' (patentes US nº 4.997.928 y nº 5.231.191). Además, pueden introducirse modificaciones en oligonucleótidos en las bases individuales (patentes US nº 5.241.060, nº 5.260.433 y nº 5.668.266) o mediante la introducción de línkers no nucleósidos internos (patentes US nº 5.656.744 y nº 6.130.323).

Alternativamente, puede marcarse un fosfato entre nucleósidos mediante marcaje post-sintético de fosforotioatos (Hodges R.R. et al., Biochemistry 28:261-7, 1989) o mediante post-marcaje de una fosforamidita funcionalizada (Agrawal S., Methods in Mol. Biology 26,

1993, Protocols for Oligonucleotide Conjugates, Humana

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Press, Totowa, NJ, capítulo 3). Sin embargo, estos métodos no han obtenido aceptación debido a la inestabilidad de las fosforamiditas y de los tioésteres de ácido fosfórico.

También ya es conocido a partir de la técnica anterior que pueden introducirse modificaciones en el residuo fosfato entre nucleósidos de los oligonucleótidos. En los casos más prominentes estos son fosfotioatos (Burgers P.M. y Eckstein F., Biochemistry 18:592-6, 1979), metilfosfonatos (Miller

P.S. et al., Biochemistry 18:5134-43, 1979) o boranofosfatos (patente WO nº 91/08213). Deben sintetizarse monómeros especiales con el fin de preparar oligonucleótidos metilfosfonato. En contraste, pueden utilizarse fosforamiditas convencionales o H-fosfonatos para sintetizar fosforotioatos y boranofosfatos, en cuyo caso la modificación borano o tio puede introducirse directamente durante o también después de la síntesis de oligonucleótidos mediante la utilización de reactivos especiales que reaccionan con el H-fosfonato trivalente o con el triéster de ácido fosfónico. Aunque todos dichos métodos conducen a oligonucleótidos modificados, los requisitos de la química de síntesis utilizada para ello no permite marcajes que puedan detectarse de esta manera o la introducción directa de grupos funcionales en el esqueleto de fosfatos de la cadena oligonucleótida durante la síntesis de oligonucleótidos.

Baschang G. y Kvita V., Angewandte Chemie 85(1):43-44, 1973, describen la reacción de un triéster de ácido fosfórico de nucleótido con azidas, tal como azida de

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metilsulfonilo, para preparar tri-alquil(aril)imidofosfatos que son, sin embargo, inestables y se descomponen.

Nielsen J. y Caruthers M.H., J. Am. Chem. Soc. 110:6275-6276, 1973, describen la reacción de fosfitos de desoxinucleósidos con un grupo protector 2-ciano-1,1dimetiletilo en presencia de azida de alquilo. Además, los autores sugieren que este principio resulta adecuado para preparar nucleótidos que se modifican en el residuo fosfato sin elucidar qué tipos de modificaciones preparadas con ayuda del método dado a conocer podrían presentar ventajas particulares. En particular, los autores sugieren la introducción de residuos alquilo.

La patente WO nº 89/091221 da a conocer fosforamiditas de N-alquilo u oligonucleótidos sustituidos con N-alquilo en por lo menos un residuo fosfato que se preparan mediante oxidación de fosfitos de nucleósido (dotados de un grupo protector) con yodo en presencia de alquilaminas adecuadas.

La patente WO nº 03/02587 da a conocer la preparación de oligonucleótidos modificados en los que se convierten Hfosfatos mediante aminación en fosforamidatos.

De esta manera, todas dichas publicaciones describen la preparación de moléculas que contienen un fosforamidato en lugar de un residuo fosfato. Sin embargo, las moléculas que contienen fosforamidato son susceptibles a la hidrólisis debido a que el grupo amina se encuentra protonado en un ambiente ácido y después se sustituye con agua.

Además, la patente WO nº 01/14401 propone bloques de construcción nucleótidos u oligonucleótidos en los que se

sustituye un residuo fosfato por N-ClO3, N-NO2 o N-SO2R.

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Según la enseñanza de la patente WO nº 01/14401, dichas sustancias pueden prepararse mediante reacción del grupo hidroxilo libre de un desoxinucleósido con cloruro de amidofosfonilo en presencia de piridina. Sin embargo, este

5  tipo de preparación es complicado, laborioso e inadecuado para la síntesis rutinaria de nucleótidos o de oligonucleótidos.

El objetivo técnico que forma la base de la presente invención fue, de esta manera, preparar oligonucleótidos 10 marcados mejorados y proporcionar un procedimiento simple

para la preparación de los mismos.

Breve descripción de la invención

Por lo tanto, la presente invención se refiere a un compuesto químico, que preferentemente es un oligonucleótido 15 que contiene la estructura siguiente por lo menos una vez:

imagen1

en la que A representa el extremo 5' de un nucleótido o de una cadena de nucleótidos, y B representa el extremo 3' de un nucleótido o de una

20 cadena de nucleótidos, D es OH o CH3, y Acc es un aceptor de electrones o un aceptor de

electrones sustituido con un residuo R, y R es cualquier sustituyente orgánico. 25 El aceptor de electrones Acc preferentemente se selecciona de entre un grupo que comprende:

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- -CN, --SO2-R', en la que R' contiene por lo menos un alquilo amino-sustituido, un arilo opcionalmente sustituido

o un heterociclo opcionalmente sustituido,

5 -un N+-heterociclo de seis elementos en el que por lo menos un átomo de nitrógeno se encuentra alquilado y se encuentra localizado en la posición orto o para y en el que dicho heterociclo es piridinio, pirimidinio o quinolinio.

Son particularmente preferentes los oligonucleótidos en

10  lo que R o R' solo o en combinación con el aceptor de electrones contienen una unidad detectable o un grupo funcional.

Estos oligonucleótidos se preparan según la invención mediante procedimientos que se caracterizan porque un 15 derivado de fósforo trivalente de la estructura química

siguiente:

imagen1

en la que E representa un grupo metilo o un grupo hidroxilo protegido, 20 en la que A representa el extremo 5' de un nucleótido o de una fase nucleótida, y en la que B representa el extremo 3' de un nucleótido o de una cadena nucleótida se hace reaccionar con una azida que presenta la 25 estructura siguiente: N = N = N - Acc

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en la que Acc es un aceptor de electrones o un aceptor de electrones sustituido con un residuo R, y R es cualquier sustituyente orgánico.

El aceptor de electrones Acc se selecciona de entre el grupo que comprende:

- -CN, -SO2-R,

-un N+-heterociclo de seis elementos en el que por lo menos un átomo de nitrógeno se encuentra alquilado y se encuentra localizado en la posición orto o para, en el que dicho heterociclo es piridinio, pirimidinio o quinolinio.

En una realización especial para producir un oligonucleótido según la invención,

a) una fosforamidita 3' se hace reaccionar en primer lugar con el extremo 5' OH de una cadena oligonucleótida naciente y posteriormente:

b)

se hace reaccionar una azida de la estructura

siguiente:

N = N = N - Acc

en la que Acc es un aceptor de electrones o un aceptor de electrones sustituido con el residuo R y R es cualquier sustituyente orgánico.

Resultan particularmente preferentes procedimientos en los que R contiene una unidad detectable o un grupo funcional.

Los oligonucleótidos según la invención que se producen de esta manera pueden utilizarse para todas las aplicaciones en las que resultan necesarias parejas de hibridación en cualquier forma y en particular parejas de hibridación

derivatizadas o marcadas.

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En particular, pueden utilizarse estos oligonucleótidos como sondas de hibridación para detectar determinadas secuencias diana.

Otro uso potencial se refiere a la utilización de oligonucleótidos modificados según la invención para inactivar la expresión génica en forma de oligonucleótidos antisentido o de ARNip. Descripción detallada de la invención Idea fundamental de la invención

El objetivo de la presente invención es producir

nucleótidos

y oligonucleótidos de una manera simple que

contengan

residuos de fosfato modificados y que de esta

manera

también contengan preferentemente marcajes

detectables.

La idea central de la presente invención es, en el presente contexto, partiendo de un átomo de fósforo trivalente hacer que reaccione con un reactivo de manera que se forme un mimético estable de fosfato. Según la invención, un átomo de fósforo que contiene por lo menos un residuo hidroxilo que se proporciona con un grupo protector se hace reaccionar con este fin con una azida que presenta la estructura N=N=N-Acc, en la que Acc es un aceptor de electrones o un aceptor de electrones sustituido con un residuo R y R es cualquier sustituyente orgánico. Esto resulta en la formación de un átomo de fósforo pentavalente al que se une covalentemente mediante un átomo de N un grupo aceptor de electrones fuertemente atractor de electrones. Este grupo garantiza que los compuestos producidos de esta

manera se encuentren estabilizados por resonancia y no sean

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susceptibles a hidrólisis, en contraste con los compuestos fosforamidato conocidos a partir de la técnica anterior.

Esta idea subyacente a la invención puede aplicarse a todos los procedimientos en los que se forma un fósforo trivalente como intermediario.

Durante la síntesis convencional de oligonucleótidos utilizando fosforamiditas, se forman triésteres de ácido fosfónico con un átomo de fósforo trivalente a modo de productos intermediarios. El primer y segundo enlaces éster representan el enlace entre nucleósidos. El átomo de fósforo se une a un grupo hidroxilo protegido, tal como, por ejemplo, a un grupo beta-cianoetiloxi mediante el tercer enlace éster. En lugar de una oxidación con yodo, el oligonucleótido naciente seguidamente puede hacerse reaccionar según la invención con una azida apropiada, durante cuyo procedimiento el átomo de fósforo trivalente se oxida formando un átomo pentavalente mediante la unión covalente de -N-Acc al átomo de fósforo durante la escisión del nitrógeno.

A continuación, puede continuarse seguidamente la síntesis de oligonucleótidos tal como es conocido de la técnica anterior. Se obtienen oligonucleótidos estables a modo de producto final que se modifican de prácticamente

cualquiera

manera en uno o más residuos fosfato entre

nucleótidos.

Definiciones

Comprendidos

dentro del alcance de la presente

invención se definen algunos de los términos utilizados, de

la manera siguiente:

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La expresión "grupo reactivo" se refiere a grupos de una molécula que son capaces de reaccionar bajo condiciones adecuadas con otra molécula, formando simultáneamente un enlace covalente. Son ejemplos de grupos reactivos, grupos hidroxilo, grupos amino, tiol, hidrazino, hidroxilamino, dieno, alquino y grupos de ácido carboxílico.

La expresión "grupo protector" se refiere a moléculas que reaccionan con uno o más grupos reactivos de una molécula, de manera que, como parte de una reacción de síntesis multietapa, únicamente un grupo reactivo no protegido particular puede reaccionar con la pareja de reacción deseada. Son ejemplos de grupos protectores utilizados frecuentemente para proteger grupos hidroxilo, beta-ciano-etilo, trialquilsililo y alilo. Son grupos protectores para proteger grupos amino, trifluoroacetilo y Fmoc. Otros grupos protectores posibles se resumen en libros de texto estándares (Greene T.W., Protective groups in organic synthesis, Wiley Interscience Publications, John Wiley & Sons, New York, Chichester, Brisbane, Toronto, 1981; Souveaux, E., Methods in Mol. Biology vol. 26, Protocols for Oligonucleotide Conjugates, Humana Press, Totowa, NJ, capítulo 1, editor S. Agrawal, 1994).

Los línkers se refieren a cadenas de carbonos que presentan una longitud de entre 1 y 30 átomos de C. Dichas cadenas línkers también puede presentar adicionalmente uno o más átomos internos de nitrógeno, oxígeno, azufre y/o fósforo. Los línkers también pueden ser ramificados, por ejemplo también pueden ser dendríticos. Los línkers

interconectan un nucleótido o una cadena de nucleótidos con

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una unidad detectable o con un grupo reactivo que se protege opcionalmente con un grupo protector.

Se entiende que una unidad detectable se refiere a sustancias que pueden detectarse con ayuda de métodos analíticos. Pueden ser, por ejemplo, unidades que puedan

detectarse

mediante espectroscopía de masas,

inmunológicamente

o con ayuda de RMN. Las unidades

detectables

también son, en particular, sustancias que

pueden detectarse mediante métodos ópticos, tales como fluorescencia y espectroscopía de UV/VIS, tales como fluoresceínas, rodaminas y partículas de oro. Entre ellos también se incluyen intercalantes y ligantes de surco menor que también pueden presentar un efecto sobre el comportamiento de fusión y cuya fluorescencia resulta modificada por la hibridación.

El término "fosforamiditas" se refiere a moléculas que contienen un átomo de fósforo trivalente que puede acoplarse al extremo 5' terminal de un nucleósido o derivado de nucleósido. De esta manera, las fosforamiditas pueden utilizarse en la síntesis de oligonucleótidos. Además de las (desoxi)ribonucleótido fosforamiditas que se utilizan para la extensión de cadena, también existen fosforamiditas derivatizadas con un marcaje que puede utilizarse en procedimientos similares durante o al final de la síntesis de oligonucleótidos para marcar el oligonucleótido (Beaucage S.L., Methods in Molecular Biology 20:33-61, 1993, editor S. Agrawal; Wojczewski C. et al., Synlett 10:1667-1678, 1999).

En la presente invención, el término "oligonucleótidos"

comprende no sólido (desoxi)oligorribonucleótidos, sino

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también oligonucleótidos que contienen uno o más análogos de nucleótidos con modificaciones en el esqueleto de fosfatos (tal como, por ejemplo, metilfosfonatos, fosfotioatos), en el azúcar (tal como derivados 2'-O-alquilo, 3' y/o 5' aminorribosa, LNA, HNA, TCA) o bases modificadas, tales como 7-deazapurina. A este respecto, la invención también comprende conjugados y quimeras que contienen análogos no nucleosídicos, tales como APNs u otros biopolímeros, por ejemplo péptidos. Además, los oligonucleótidos según la invención también pueden contener una o más unidades no nucleosídicas, tales como espaciadores en cada posición, por ejemplo espaciadores hexaetilenglicol o Cn (n=3,6).

La expresión "aceptor de electrones" comprende estructuras atómicas que presentan la tendencia a unirse a parejas de electrones libres. Una medida de ello es la constante de Hammett. La presente invención se refiere en particular a realizaciones en las que la constante de Hammett σp excede un determinado valor de 0,30, preferentemente 0,45, y en particular preferentemente 0,60.

El aceptor de electrones adicionalmente debe ser compatible con todas las reacciones químicas en la síntesis de oligonucleótidos, es decir:

-no debe resultar oxidado por el yodo,

-

debe ser inerte frente al ácido dicloroacético y el ácido tricloroacético, y

-

debe ser inerte frente a bases y en particular frente a amonio, y

-no debe reaccionar con fosforamidatos trivalentes.

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Son ejemplos de aceptores de electrones que satisfacen dichas condiciones:

-NO2, SO2-R, -CN, -CO-R, pirinidinilo, piridinilo, piridazinilo, hexafluorofenilo, benzotriazolilo (Hansch C. et al., Chem. Reviews 91:165-195, 1991). Además, estos aceptores pueden unirse al átomo de nitrógeno de una manera viníloga o feníloga.

El término "sustituido" se refiere a que la estructura a la que se hace referencia como sustituida contiene otro residuo en cualquier posición con la condición de que esta posición no se encuentre definida en mayor detalle. La expresión "opcionalmente sustituido" se refiere a que la estructura a la que se hace referencia de esta manera comprende realizaciones con y sin un residuo adicional.

La expresión "alquilo amino-sustituido" comprende alquilo C1-C30 lineal o ramificado que contiene por lo menos un grupo amino en el que dicho grupo amino se encuentra

protegido

o se encuentra unido a una unidad detectable

mediante un línker.

La

expresión "N+-heterociclo de seis elementos"

comprende N-heterociclos que se encuentran alquilados en un nitrógeno sp2, de manera que la carga global del heterociclo es positiva. Son ejemplos de ello, piridinio, pirimidinio y quinolinio. Dichos heterociclos es conocidos de la técnica que son deficientes en electrones.

La expresión "cadena de nucleótidos" se entiende que es una molécula o una parte de una molécula que contiene por lo menos dos residuos nucleósidos que se encuentran 5'-3' interconectados por un grupo fosfato.

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Compuestos químicos según la invención

La presente invención comprende cualquier compuesto químico que contiene la estructura siguiente por lo menos una vez:

imagen1

5 

en la que: A representa el extremo 5' de un nucleótido o de una cadena de nucleótidos. B representa el extremo 3' de un nucleótido o de una

10  cadena de nucleótidos, y Acc es un aceptor de electrones o un aceptor de electrones sustituido con un residuo R, y R es cualquier sustituyente orgánico. Este residuo debe ser adicionalmente compatible con todas las reacciones químicas que se producen en la síntesis de oligonucleótidos, es

15  decir:

-no debe resultar oxidado por el yodo,

-debe ser inerte frente a los ácidos dicloroacético y tricloroacético, y

-debe ser inerte frente a bases y en particular frente 20 a amonio y

-no debe reaccionar con fosforamidatos trivalentes.

Los residuos que inicialmente son incompatibles per se, sin embargo, pueden convertirse en derivados que se comportan de modo inerte bajo las condiciones químicas de la

25  síntesis de oligonucleótidos mediante la utilización de grupos protectores conocidos por el experto en la materia.

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El experto en la materia también entenderá que los

grupos -OH de los oligonucleótidos habitualmente se

encuentran presentes en un estado desprotonado.

Además, la presente invención también comprende fosfonatos de metilo de la estructura siguiente:

imagen1

con las definiciones proporcionadas anteriormente. En una primera realización preferente, el compuesto químico de la presente invención es un oligonucleótido. En

10  dicho oligonucleótido, A representa el extremo 5' de un nucleótido o de una cadena de nucleótidos y/o B representa el extremo 3' de un nucleótido o de una cadena de nucleótidos. De esta manera, A y B conjuntamente comprenden por lo menos dos residuos nucleótidos.

15 Dependiendo del uso pretendido del oligonucleótido, las estructuras indicadas anteriormente pueden encontrarse una vez, dos veces, muchas veces o incluso en todos los residuos fosfato presentes en el oligonucleótido. Los residuos fosfato dentro del oligonucleótido se denominan fosfatos

20 internucleósido, de manera que: A representa el extremo 5' de un primer nucleósido, y B representa el extremo 3' de un segundo nucleósido dentro de la cadena de nucleótidos. 25 Además, las estructuras según la invención pueden localizarse en el extremo 3' o en el extremo 5' de un

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oligonucleótido. En el caso de que se encuentren presentes en el extremo 5' del oligonucleótido:

A representa el extremo 5' de la cadena de nucleótidos, y

B es un grupo hidroxilo opcionalmente protegido o un línker que opcionalmente puede contener un grupo detectable u otro grupo reactivo, y puede utilizarse para introducir un grupo detectable en el oligonucleótido.

En el caso de que el aceptor de electrones contenga un sustituyente que también representa una unidad detectable, un oligonucleótido se encuentra presente según la invención que puede presentar un marcaje dual en el extremo 5'.

En el caso de que la estructura según la invención se encuentre en el extremo 3' de una cadena de nucleótidos:

B representa el extremo 3' de dicho oligonucleótido, y

A es hidroxilo.

La invención inequívocamente también comprende realizaciones de SO2-R', en la que R' como tal es un alquilo amino-sustituido, un arilo opcionalmente sustituido o un heterociclo opcionalmente sustituido.

La presencia de la totalidad de dichos aceptores de electrones dentro de los oligonucleótidos según la invención resulta en oligonucleótidos modificados que pueden utilizarse para una amplia diversidad de aplicaciones. Sin embargo, todos los aceptores de electrones que pueden contener cualquier residuo orgánico R resultan de particular interés debido a que permiten preparar de un modo simple dentro del alcance de los procedimientos de síntesis

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descritos en la presente solicitud oligonucleótidos modificados que contienen cualquier residuo orgánico.

Por lo tanto, la presente invención también se refiere en particular a oligonucleótidos en los que un aceptor de electrones sustituido con un residuo R contiene una unidad detectable como R, o alternativamente contiene un grupo funcional como R al que puede acoplarse una unidad detectable tras la síntesis de oligonucleótidos mediante marcaje posterior. Alternativamente, la presente invención también comprende realizaciones en las que el aceptor de electrones es un componente de la unidad detectable. Alternativamente, el residuo R mismo puede ser la unidad detectable o el grupo funcional.

Dichos oligonucleótidos marcados pueden utilizarse ventajosamente para numerosas aplicaciones diferentes en biología molecular, tales como la PCR en tiempo real. El marcaje detectable preferentemente es un pigmento fluorescente o una molécula inhibidora fluorescente. Los pigmentos y moléculas correspondientes que pueden actuar como unidad detectable para los oligonucleótidos son bien conocidos para el experto en la materia. Son ejemplos de ellos no limitativos del alcance protector de la presente invención: fluoresceína, rodaminas, cianinas, merocianinas, carbocianinas y compuestos azo y poliazo.

La presente invención también se refiere a sondas de PCR en tiempo real que presentan la estructura indicada anteriormente, en la que por lo menos un marcaje fluorescente se une al átomo de fosfato de la cadena de

oligonucleótidos por medio de una amida/grupo aceptor de

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electrones. Son ejemplos de dichas sondas, las sondas de hibridación FRET (patente WO nº 97/46707) o las denominadas sondas de marcaje único (patente WO nº 02/14555). A este respecto, las sondas oligonucleótidos en las que existe una modificación interna según la invención o un residuo fosfato entre nucleósidos resultan particularmente preferentes.

A este respecto, la presente invención también se refiere particularmente a oligonucleótidos marcados dualmente que presentan dos unidades detectables. Son ejemplos de este tipo de sondas las sondas TaqMan (patente US nº 5.804.375) y las balizas moleculares (patente US nº 5.118.801). A este respecto, la presente invención se refiere a oligonucleótidos de marcaje dual en los que se une un primer marcaje fluorescente a un átomo de fosfato entre nucleósidos de la cadena de oligonucleótidos por medio de una amida/grupo aceptor de electrones y una segunda unidad detectable se encuentra presente terminalmente en el extremo 5' ó 3' del oligonucleótido.

Las moléculas que presentan dichos marcajes y los métodos para la preparación de las mismas son bien conocidas para el experto en la materia. Producción de oligonucleótidos según la invención

La presente invención también se refiere a procedimientos para producir oligonucleótidos modificados y en particular a procedimientos para producir los oligonucleótidos que se han indicado anteriormente.

En general, la presente invención se refiere a procedimientos para producir oligonucleótidos modificados

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que se caracterizan porque un derivado de fósforo trivalente de estructura química:

imagen1

en la que E es un grupo metilo o un hidroxilo 5 protegido, que preferentemente se protege con un grupo betacianoetilo, A representa el extremo 5' de un nucleótido o de una cadena de nucleótidos, y B representa el extremo 3' de un nucleótido o de una 10 cadena de nucleótidos, se hace reaccionar con una azida de la estructura

siguiente: N = N = N - Acc en la que Acc es un aceptor de electrones o un aceptor

15  de electrones sustituido con un residuo R y R es cualquier sustituyente orgánico.

Como grupos protectores resultan particularmente preferentes beta-cianoetilo, metilo, alilo o sililo. Alternativamente, pueden producirse metil-fosfonatos según

20  la invención, en los que E es CH3.

Según la invención, las azidas pueden contener cualquier grupo aceptor de electrones. Estos grupos seguidamente se unen con el átomo de fósforo respectivo. En particular, pueden utilizarse los grupos aceptores de

25 electrones siguientes: a) -CN,

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b) -SO2-R,

c) N+-heterociclos de seis elementos deficientes en electrones, en los que por lo menos un átomo de nitrógeno se encuentra alquilado y se localiza en la posición orto o para, que es piridinio, pirimidinio o quinolinio.

El procedimiento según la invención también puede utilizarse rutinariamente en particular dentro de una síntesis convencional de oligonucleótidos. Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un procedimiento que comprende las etapas siguientes:

a) reacción de una fosforamidita 3' con el extremo 5' OH de una cadena naciente de oligonucleótidos, b) reacción con una azida de la estructura siguiente: N = N = N - Acc,

en la que Acc es un aceptor de electrones o un aceptor de electrones sustituido con un residuo R y R es cualquier sustituyente orgánico.

En este caso, el extremo 5' OH de la cadena naciente de oligonucleótidos puede ser el extremo 5' de un nucleótido 5' terminal o el grupo OH libre de un línker unido a una CPG.

La química convencional de oligonucleótidos se inicia en un material de soporte de fase sólida reactivo. El material de soporte de fase sólida se refiere a sustancias poliméricas que forman una fase sólida que contienen un grupo reactivo en el que pueden inmovilizarse moléculas adicionales. En el caso de la síntesis de oligonucleótidos, el material de soporte habitualmente son perlas de vidrio poroso con un tamaño de poro definido, denominadas

partículas de vidrio de poro controlado (CPG).

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Alternativamente, también resulta posible utilizar residuos poliestireno y otros polímeros y copolímeros orgánicos (Ghosh P.K. et al., J. Indian Chem. Soc. 75:206-218, 1998). En el caso de que los oligonucleótidos deban quedar inmovilizados tras la síntesis sobre el sustrato, puede utilizarse vidrio y también chips semiconductores a modo del material de soporte de fase sólida. Dichos materiales de

soporte

de fase sólida se encuentran disponibles

comercialmente.

El

soporte puede unirse por medio de un denominado

grupo línker, que contiene un enlace escindible unido al residuo hidroxilo reactivo terminal protegido por un grupo protector tal como DMT (dimetoxitritilo). Un grupo línker con un enlace escindible se refiere a aquellos grupos que se encuentran entre el espaciador trifuncional y el material de soporte de fase sólido y pueden escindirse mediante una reacción química simple. Pueden ser succinilo u oxalilo u otros grupos línker que contengan un enlace éster escindible. Otros grupos línker son conocidos para el experto en la materia (Ghosh P.K. et al., J. Indian. Chem. Soc. 75:206-218, 1998).

Dichos grupos línker resultan esenciales para la utilización como el material de soporte para sintetizar oligonucleótidos que se pretende que se encuentren presentes en solución acuosa tras completarse la síntesis. En el caso de que, en contraste, los oligonucleótidos permanezcan sobre la superficie del material de soporte tras la síntesis, tal como durante la producción de matrices de ácidos nucleicos

(patente US nº 5.624.711; Shchepinov M.S. et al., Nucl.

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Acids Res. 25:1155-1161, 1997), no resulta necesario un grupo línker escindible sino que resulta preferente un grupo línker no escindible.

Los detalles de una síntesis de oligonucleótidos para la incorporación de las estructuras según la invención son los siguientes.

Se forma un grupo hidroxilo reactivo desde el que puede producirse una extensión de cadena en la dirección 3' a 5' tras eliminar el grupo protector DMT mediante tratamiento con ácido. A continuación, los derivados 3' fosforamidita de (desoxi)ribonucleósidos que también se encuentran dotados de un grupo protector DMT y los grupos protectores de bases adicionales bien conocidos de la técnica se acoplan sucesivamente en el extremo 5' con cada grupo reactivo liberado del grupo protector DMT en presencia de tetrazol. Se forma un intermediario que contiene un átomo de fósforo trivalente durante este procedimiento en forma de producto intermediario que forma un enlace éster con cada uno de los nucleósidos que se unen entre sí mediante la reacción, y un tercer enlace éster con un grupo hidroxilo protegido que ya se encuentra presente en la fosforamidita utilizada. Este grupo protector, que puede estar formado, por ejemplo, de beta-cianoetilo, metilo, alilo o sililo, seguidamente se corta con amonio tras completarse la síntesis de los oligonucleótidos, durante la que los grupos protectores de bases y el línker con la CPG también resultan escindidos.

En lugar de la oxidación con ayuda de yodo, el oligonucleótido naciente se hace reaccionar según la

invención con un azida que presenta la estructura siguiente:

-23 –

N = N = N - Acc

en las posiciones en las que deben introducirse miméticos de fosfato en la cadena de nucleótidos, en la que Acc es un aceptor de electrones o un aceptor de electrones sustituido con un residuo R y R es cualquier residuo orgánico. La química de síntesis descrita permite la incorporación de básicamente cualquier residuo R y en particular, la incorporación de cualquier tipo de pigmento fluorescente.

La preparación de azidas de Acc, tales como azidas de acilo y azidas de sulfonilo, resulta simple y ha sido conocido desde hace mucho tiempo (revisión: Bräse S. et al., Angewandte Chemie 117:5320-5374, 2005, 3.4 y 3.5.2). Preferentemente se preparan a partir de cloruros de acilo o cloruros de sulfonilo utilizando azidas sódicas o a partir de hidrazidas utilizando ácido nitroso.

También se utilizan, por ejemplo, pigmentos azidas de sulfonilo en los procedimientos de pigmentado (por ejemplo la patente DE nº 19650252). La azida de cianógeno puede producirse de manera simple mediante la reacción de azida sódica con bromocianógeno en acetonitrilo (McMurry J.E. et al., J. Organic Chemistry 38(16):2821-7, 1973). Pueden prepararse azidas de heteroarilo mediante sustitución nucleofílica de un halógeno con azida o a partir de hidrazinas de heteroarilo. Un requisito previo es que el nitrógeno atractor de electrones se encuentre en la posición para u orto respecto al grupo azido, debido a que únicamente en este caso se forma un mimético de fosfato de resonancia estabilizada. Las azidas orto y para de N-alquil-piridinio

-24 –

resultan particularmente adecuadas en este contexto. Algunas azidas de acilo, de sulfonilo y de piridilo también se encuentran disponibles comercialmente.

La presente invención se refiere además a procedimientos tal como se ha descrito anteriormente en los que el residuo R es una unidad detectable. R es preferentemente un pigmento fluorescente o una molécula inhibidora de la fluorescencia.

Determinadas realizaciones de la presente invención se refieren a la preparación de sondas oligonucleótidas de marcaje dual en las que preferentemente se introduce un marcaje en el oligonucleótido según el procedimiento de la invención y se introduce otro marcaje en el oligonucleótido, preferentemente en el extremo 5' ó 3' según un método conocido de la técnica anterior.

En el caso de un marcaje 5' en la posición 5' de la ribosa del nucleótido 5'-terminal, la incorporación se lleva a cabo mediante métodos convencionales utilizando una fosforamidita marcada con pigmento al final de la síntesis del oligonucleótido (Beaucage S.L., Methods in Molecular Biology 20:33-61, 1993; S. Agrawal Publishers).

El marcaje en el extremo 3' se lleva a cabo mediante la utilización de CPG disponible comercialmente como soporte de fase sólido reactivo que ya contiene un marcaje detectable además del grupo hidroxilo tritilado. Tras la escisión del grupo protector DMT, puede iniciarse la síntesis estándar de oligonucleótidos en el grupo hidroxilo que ahora se encuentra libre.

-25 –

Alternativamente, pueden utilizarse métodos conocidos de la técnica anterior para el post-marcaje para un marcaje 5' ó 3' adicional (patentes US nº 5.002.885 y nº 5.401.837).

La invención también se refiere a intermediarios de la síntesis según la invención que pueden prepararse antes de la síntesis estándar de oligonucleótidos. En este caso, resultan preferentes intermediarios que todavía se encuentran unidos a la fase sólida y que todavía no se encuentran desprotegidos y pueden contener grupos espaciadores básicos. Se utilizan preferentemente para la preparación CPGs que resultan familiares para el experto en la materia, tales como CPGs fosfato, debido a que se forma un oligonucleótido 3' fosforilado tras la síntesis del oligonucleótido. Tras la destritilación, se hacen reaccionar dichas CPGs fosfato con un espaciador fosforamidita en presencia de un activador. El intermediario de fósforo trivalente que se forma seguidamente se hace reaccionar con una azida de Acc que contiene una unidad detectable. Estos

intermediarios

de la síntesis pueden almacenarse y

utilizarse

como CPGs trifuncional es para el marcaje 3'

universal.

La presente invención también se refiere a la síntesis de fosforamiditas que contienen un grupo N-Acc protegido en lugar de, por ejemplo, oxígeno protegido con beta-cianoetilo con el fin de permitir la síntesis de miméticos N-Accfosforotioatos o bis-N-Acc-fosfato. Dicha estrategia de síntesis resulta adecuada en casos individuales, por ejemplo para preparar oligonucleótidos que contienen P=N-CN.

-26 –

También se forma un intermediario de fósforo trivalente durante la síntesis de fosfonatos de metilo que pueden hacerse reaccionar con azidas. Las metil-fosforamiditas también se encuentran disponibles comercialmente.

En una estrategia de síntesis inversa (patente EP nº 1.155.027) que se utiliza para oligonucleótidos estándar así como en particular para análogos, por ejemplo para la síntesis de oligonucleótidos N3'>P5', también se forma un intermediario que contiene un fósforo trivalente que puede hacerse reaccionar según la invención con azidas. Las fosforamiditas correspondientes se encuentran disponibles comercialmente. Espectro de aplicaciones:

La estrategia de síntesis según la invención permite preparar una amplia diversidad de oligonucleótidos modificados en el esqueleto de fosfatos. El grado de modificación, la diversidad y la carga de las modificaciones se encuentran determinadas por el uso pretendido

Por ejemplo, los oligonucleótidos según la invención pueden utilizarse para hibridarse con ADN y ARN naturales, por ejemplo para la captura o para la detección. Los oligonucleótidos que contienen miméticos de fosfato de P-N=Acc solos o en forma de quimeras con fosfatos normales también pueden utilizarse con éxito como cebadores en reacciones de amplificación.

Dichas sondas oligonucleótidas son la base para diversas aplicaciones, por ejemplo PCR en tiempo real, FISH y técnicas de transferencia y de secuenciación (Jung P.M. et al., Nucleic Acid Amplification Technologies BioTechniques

-27 –

Books, Div. Eaton Publishing, Editores H.H. Lee, S.A. Morse,

O. Olsvik, 1997; Bustin, Stephen A. y Nolan, Tania. Chemistries. IUL Biotechnology Series 5(A-Z of Quantitative PCR):215-278, 2004).

Los oligonucleótidos marcados según la invención resultan particularmente adecuados como sondas marcadas fluorescentemente en diversos formatos de PCR en tiempo real.

Habitualmente se utilizan sondas marcadas dualmente para el formato de baliza molecular (patente US nº 5.118.801) y para el formato de sonda TaqMan (patentes US nº 5.210.015, nº 5.538.848, nº 5.487.972 y nº 5.804.375), en los que preferentemente se introduce un marcaje internamente y se localiza un segundo marcaje en el extremo 5' ó 3' de la sonda. Resulta especialmente ventajoso marcar internamente las sondas utilizando un procedimiento según la invención como parte de una síntesis de oligonucleótidos basada en la química de fosforamidita. La segunda unidad detectable en el extremo 5' ó 3' de la sonda también puede introducirse en la sonda correspondiente por medio de uno de los procedimientos de la invención descritos o con ayuda de procedimientos conocidos de la técnica anterior.

Habitualmente se utiliza una sonda marcada 5'terminalmente y una sonda marcada 3'-terminalmente para el formato de sonda de hibridación FRET (Matthews J.A. y Kricka L.J., Analytical Biochemistry 169:1-25, 1988) (Bernard P.S. et al., Analytical Biochemistry 255:101-107, 1998). En este caso resulta particularmente ventajoso llevar a cabo el

marcaje 5' de la sonda utilizando un procedimiento según la

-28 –

invención como parte de una síntesis de oligonucleótidos basada en la química de fosforamidita.

La presente invención también permite preparar oligonucleótidos funcionalizados de una manera simple en la que el aceptor de electrones Acc se modifica con un residuo R que contiene un grupo funcional que se protege apropiadamente para la síntesis de oligonucleótidos. En el caso de que este residuo sea un grupo amino o hidroxilamino, pueden utilizarse para, por ejemplo, preparar matrices de oligonucleótidos mediante transferencia por puntos sobre superficies modificadas con epoxi (Seliger H. et al., Current Pharmaceutical Biotechnology 4:379-395, 2003). En contraste, pueden utilizarse grupos tiol para la inmovilización sobre superficies de oro o sobre partículas de oro. En este caso resulta particularmente ventajoso según la invención introducir varios grupos tiol de una manera simple con el fin de obtener una unión estable de una sonda de captura sobre la superficie de oro. En el caso de que se incorpore un grupo OH protegido como el grupo funcional, también pueden prepararse oligonucleótidos ramificados o dendríticos.

Dichos grupos funcionales, y en particular grupos amino particulares también pueden utilizarse para preparar oligonucleótidos marcados haciéndolos reaccionar con el éster activo de un pigmento tras la síntesis de los oligonucleótidos. Sin embargo, resulta más ventajoso introducir la unidad detectable directamente durante la síntesis de oligonucleótidos según el procedimiento

inventivo.

-29 –

Debido a que los oligonucleótidos según la invención son resistentes a nucleasas, también resultan adecuados para la utilización en diversos experimentos de cultivo celular conocidos por el experto en la materia, con el fin de inactivar la expresión génica, es decir, los oligonucleótidos según la invención se utilizan como oligonucleótidos antisentido o como componente de ingredientes activos de ARNip. En este caso, las modificaciones pueden seleccionarse de manera que faciliten la incorporación celular y/o mejoren la unión al ácido nucleico diana. La inactivación de la expresión de un gen diana respectivo puede seguirse posteriormente por medio de análisis de transferencia northern, RT-PCR en tiempo real de una etapa o de dos etapas, o por medio de hibridación sobre micromatrices apropiadas.

Además, los oligonucleótidos según la invención pueden

utilizarse

como línkers hidrofílicos entre una unidad

detectable

y una proteína, o como marcaje de una masa

definida.

Además, pueden construirse bibliotecas de

sustancias

aptámeras, en cuyo caso resulta posible

introducir

diversos residuos R en el fosfato durante la

síntesis mediante la utilización de diferentes azidas de sulfonilo y azidas de acilo o azidas de heteroarilo. A continuación, dichas bibliotecas pueden someterse a ensayo para su unión a proteínas u otras moléculas biológicas. Una ventaja respecto a los aptámeros conocidos de la técnica anterior es que el procedimiento según la invención permite producir un gran número de diferentes modificaciones

adicionales y someterlas a ensayo de un modo sencillo.

-30 –

La invención se describe en mayor detalle mediante los ejemplos, publicaciones y protocolo de secuencia siguientes, el alcance protector de la cual se deriva a partir de las reivindicaciones de patente. Los métodos descritos deben interpretarse como ejemplos que siguen describiendo el objetivo de la invención incluso tras la modificación de los mismos.

Los ejemplos y listado de secuencias siguientes se proporcionan con el fin de ayudar a la comprensión de la presente invención, el alcance real de la cual se proporciona en las reivindicaciones adjuntas. Debe entenderse que resulta posible realizar modificaciones de los procedimientos proporcionados sin por ello apartarse del espíritu de la invención. Ejemplo 1 Síntesis de un dT(P(=NSO2PhNHAc)dT

Se llevó a cabo la síntesis de dímeros a una escala de 10 µmoles en un sintetizador ABI 394. Se utilizó soporte dT-CPG disponible comercialmente como la fase sólida. Todos los compuestos químicos para la síntesis química se obtuvieron de Glen Research.

La solución oxidante convencional que contenía yodo se sustituyó por una solución 0,1 M de fenilsulfonilazida de p-NAc (Sigma Aldrich) en acetonitrilo anhidro. Se extendió el tiempo de oxidación a 16 minutos.

El producto se cortó del soporte durante 2 horas a temperatura ambiente con amonio al 33% y se separó mediante cromatografía de fase inversa en agua, pH 6,8, tampón B:

acetato de trietilamonio 0,1 M en agua/acetonitrilo 1:1,

-31 –

gradiente durante 2 minutos de 0% B a 100% en 45 minutos. Se midió la absorción de UV del eluyente a 260 nm. Se observó una fracción principal que contenía el producto deseado. Se eliminó el solvente en una centrífuga de vacío. Se introdujo el residuo en agua redestilada y se evaporó nuevamente al vacío. Se repitió este procedimiento tres veces. A continuación, se disolvió el residuo en agua redestilada y se liofilizó.

RMN 1H (Bruker DPX 300) en D2O: 7,82 d[2H, arilo], 7,56 d[2H, arilo], 7,47 s[1H, C6-H], 7,40[1H, C6-H], 6,21 m [1H, H1'], 6,07 m[1H, H1'], 4,38 m [1H, H3'],

4,10 [m, 4H, H4', H5'] 2,38-2,24 m [4H, H2'], 2,22[3H, CH3], 2,16 [3H, CH3], 2,14 [3H, CH3]

RMN 31P (Bruker DPX 300) en D2O: 2,14

Espectroscopía de masas (ESI-MS), calculado: 742,66; observado [M-H]: 741,73. Ejemplo 2 Síntesis de un oligonucléotido T(P(=NSO2PhNHAc)T9

Se llevó a cabo la síntesis del oligonucleótido a una escala de 1 µmol en un sintetizador ABI 394. Se utilizó soporte CPG-dT disponible comercialmente como la fase sólida. Todos los compuestos químicos para la síntesis estándar se obtuvieron de Glen Research

En el primer ciclo de síntesis, se sustituyó el oxidante que contenía yodo por una solución 0,1 M de fenilsulfonilazida de p-NAc (Sigma-Aldrich) en acetonitrilo anhidro. Se extendió el tiempo de oxidación a 16 minutos. La unión de las fosforamiditas-dT restantes se llevó a cabo

según protocolos estándares.

-32 –

Se cortó el producto del soporte durante 2 horas a temperatura ambiente con amonio al 33% y se separó mediante cromatografía de fase inversa en una columna Poros Oligo R3 de 4,6x50 mm. Cromatografía, tampón A: acetato de trietilamonio 0,1 M en agua, pH 6,8, tampón B: acetato de trietilamonio 0,1 M en agua/acetonitrilo 1:1, gradiente: 2 minutos de 0% de B a 100% de B en 45 minutos. Se midió la absorción de UV del eluyente a 260 nm. Se observó una fracción principal que contenía el producto deseado. Se eliminó el solvente en una centrífuga de vacío. Se introdujo el residuo en agua redestilada y se evaporó nuevamente al vacío. Se repitió este procedimiento tres veces. A continuación, se disolvió el residuo en agua redestilada y se liofilizó.

Espectroscopía de masas (ESI-MS), calculado: 3.176,25, observado [M-H]: 3.176,0. Ejemplo 3 Síntesis de un oligonucleótido marcado con fluoresceína

5' AAT ACC TGT ATT CCT CGC CTG TC fluoresceína-3' en la que cada P=O se sustituye por P=N-pPh-NAc (SEC ID nº 4).

Se llevó a cabo la síntesis de oligonucleótido a una escala de 1 µmol en un sintetizador ABI 394. Se utilizó fluoresceína-CPG LightCycler disponible comercialmente (Roche Applied Science) como el material de soporte. Todos los compuestos químicos para la síntesis química se obtuvieron de Glen Research. Se utilizaron fosforamiditas con grupos protectores terc-butilfenoxi-acetilo (conocidos como monómeros "tac" o "Expedite") de Proligo.

-33 –

Se utilizó el protocolo estándar para la síntesis, en el que el oxidante que contenía yodo se sustituyó por una solución 0,1 m de fenilsulfonilazida de p-NAc (Sigma-Aldrich) en acetonitrilo anhidro y se extendió el tiempo de oxidación a 16 minutos.

Se cortó el producto del soporte durante 2 horas a temperatura ambiente con amonio al 33% y se separó mediante cromatografía de fase inversa en una columna Poros Oligo R3 de 4,6x50 mm. Cromatografía, tampón A: acetato de trietilamonio 0,1 M en agua, pH 6,8, tampón B: acetato de trietilamonio 0,1 M en agua/acetonitrilo 1:1, gradiente de 2 minutos de 0% B a 100% B en 45 minutos. Se midió la absorción de UV del eluyente a 260 nm. Se observó una fracción principal que contenía el producto deseado. Se eliminó el solvente en una centrífuga de vacío. Se introdujo el residuo en agua redestilada y se evaporó nuevamente al vacío. Se repitió este procedimiento tres veces. A continuación, se disolvió el residuo en agua redestilada y

se liofilizó.

Espectroscopía

de masa (ESI-MS), calculado: 11.839,

observado [M-H]: 11.839,9.

Ejemplo 4

Síntesis de oligonucleótidos quiméricos

en los que P=O ha

sido sustituido por P=N-Acc en posiciones específicas

Las síntesis se llevaron a cabo a una escala de 1 µmol en un sintetizador ABI 394. Con el fin de que no resultase necesario cambiar el oxidante durante la síntesis, se modificó el programa de síntesis de manera que la solución de N3-Acc pudiese unirse en una posición de base adicional.

-34 –

Debido a las limitaciones de la programación, la azida se hizo reaccionar conjuntamente con el activador. Esto no presentó ningún efecto sobre la modificación. El tiempo de reacción de N3-Acc con el intermediario de fósforo

5 trivalente fue de 5 minutos.

Todos los compuestos químicos para la síntesis estándar se obtuvieron de Glen Research. Se utilizaron fosforamiditas con grupos protectores terc-butil-fenoxi-acetilo (conocidos como monómeros "tac" o "Expedite") de Proligo. La

10 purificación se llevó a cabo tal como se ha indicado anteriormente. Soporte: fluoresceína-CPG; N3-Acc: fenilsulfonilazida de p-NAc (Sigma-Aldrich). Se sintetizaron las sondas siguientes, cada una con un 15 SEC ID nº 4 idéntico y posteriormente se analizaron mediante espectroscopía de masas:

Modificación (SEC ID nº 4)

Masa calculada Masa observada

5'-AATACCTGTATTCCTCGCCTGTp1C-fluoresceína-3'

7.718 7.718,6

5'-Ap1ATACCTGTATTCCTCGCCTGTC-fluoresceína-3'

7.718 7.718,9

5'-AATACCTGp1TATTCCTCp1GCCTGTC-fluoresceína-3'

7.915 7.914,9

5'-Ap1Ap1Tp1Ap1Cp1Cp1Tp1Gp1Tp1Ap1Tp1 TCCTCGCCTGTC-fluoresceína-3'

9.681 9.681,9

5'-AATACCTGTATTp1Cp1Cp1Tp1Cp1Gp1Cp1 Cp1Tp1Gp1Tp1C-fluoresceína-3'

9.681 9.681,8

5'-Ap1Ap1Tp1ACCTGTATp1Tp1Cp1CtCGCC Tp1Gp1Tp1C-fluoresceína-3'

9.288 9.289,8

p1 es un mimético P=N-pPh-NAc

Ejemplo 5

Marcaje 3'-terminal según la invención 20 a) Preparación de azida de dabsilo

-35 –

Se disolvieron 0,71 g (2,19 mmoles) de cloruro de dabsilo en 10 ml de acetona. Se añadió lentamente gota a gota una solución de 142 mg (2,19 mmoles) de azida sódica en 2 ml de agua bajo enfriamiento en hielo y bajo agitación. Se agitó durante 2 horas a 0ºC y después se agitó durante 2 horas a temperatura ambiente. A continuación, se añadió una solución de 32 mg de azida sódica (0,5 mmoles) en 500 µl de agua y se agitó durante 1 hora a temperatura ambiente (TLC en gel de sílice, CH2Cl2). A continuación, se añadieron 200 ml de cloruro de metileno a la suspensión y se filtró. Se agitó el filtrado dos veces con agua y una vez con solución de hidrogenocarbonato sódico al 5% y después dos veces con agua. La fase orgánica separada se secó sobre sulfato sódico. Se eliminó el solvente mediante destilación en un evaporador rotatorio a una temperatura del baño de <20ºC. El residuo se suspendió en 2 ml de acetonitrilo y se filtró. Este residuo se lavó con éter.

Rendimiento crudo: 280 mg. La azida se utilizó directamente en el sintetizador de ADN o para preparar un soporte sin purificación adicional. b) Preparación de un soporte de dabsilo para la síntesis de oligonucleótidos

CPG-1caa-NHC(=O)-CH2-CH2-C(=O)-O-CH2-CH2-SO2-CH2-CH2-OP(O-CH2-CH2-CN)(=N-SO2-Ph-p-N=N-Ph-p-NMe2)-O-CH2-CH2-CH2-ODMTr

Se introdujeron en una frita de Schlenk 1,2 gramos de carga de CPG Phospholink 49 µmoles/g y se lavaron con acetonitrilo anhidro bajo argón. Después, se lavaron con ácido dicloroacético 0,1 M en cloruro de metileno hasta que el filtrado era incoloro. A continuación, se lavó

-36 –

intensamente con acetonitrilo anhidro. Seguidamente, se lavó con 2 ml de dicianoimidazol 0,25 M en acetonitrilo (activador) y 2 ml de activador, e inmediatamente se añadieron 2 ml de solución 0,1 M del espaciador C3 fosforamidita. A continuación, se dejó reposar la suspensión durante 3 minutos. Se filtró bajo presión de argón. Seguidamente se lavó con 2 ml de activador y nuevamente 2 ml de activador, e inmediatamente se añadieron 2 ml de una solución 0,1 M del espaciador C3 fosforamidita. Seguidamente, se dejó reposar la preparación durante 12 minutos. Se eliminó el solvente mediante filtración bajo presión de argón, se añadieron 2 ml de una solución 0,1 M de azida de dabsilo en cloruro de metileno y la mezcla se dejó reposar durante 15 minutos. Las CPG modificadas se lavaron finalmente con 100 ml de cloruro de metileno y después con 100 ml de acetonitrilo anhidro y se secaron al vacío.

c) Síntesis de oligonucleótidos utilizando el soporte de dabsilo

5' fluoresceína-GCA CCA GAT CCA CGC CCT TGA TGA GC-OCH2-CH2-CH2-O(O2)P(=N-SO2-Ph-p-N=N-Ph-p-NMe2)

Se llevó a cabo la síntesis de oligonucleótidos a una escala de 1 µmol en un sintetizador ABI 394. Se utilizaron las CPG-dabsilo del Ejemplo 5a como un material de soporte. Se utilizó 6-carboxifluoresceína-fosforamidita (Glen Research, nº de informe 10 (GR10-1) (1997) 1-12) para el marcaje 5'.

Todos los demás compuestos químicos para la síntesis

estándar se obtuvieron de Glen Research. Tal como se ha indicado anteriormente, bajo 4), se utilizaron

-37 –

fosforamiditas con grupos protectores tercbutilfenoxiacetilo (conocidos como monómeros "tac" o "Expedite") de Proligo. La síntesis se llevó a cabo según un protocolo estándar. El corte y la purificación también se llevaron a cabo tal como se ha indicado en 4.

Espectroscopía de masas (ESI-MS), calculado: 8.973, observado [M-H]: 8.973,1. Ejemplo 6 PCR en tiempo real y análisis de curvas de fusión

Se llevó a cabo una PCR cuantitativa en tiempo real de ADN del factor V con análisis posterior de la curva de fusión en un instrumento LightCycler 1.2® (Roche Diagnostics GmbH) con el fin de analizar el efecto de los miméticos de fosfato sobre la hibridación. Se utilizaron cebadores en combinación con una pareja de sondas FRET de hibridación fluoresceína/LightCycler Rojo 640. Los cebadores y la sonda 5' LightCycler se mantuvieron constantes. A modo de sondas FRET donadoras se utilizaron las diversas sondas 3' de fluoresceína modificadas en el fosfato y procedentes del Ejemplo 4, y se utilizó la sonda de fluoresceína no modificada como referencia. Se evaluaron el efecto del punto de cruce, que es una medida de la eficiencia de la amplificación, y el efecto sobre el punto de fusión.

Se prepararon 20 µl de una mezcla de reacción de PCR de la manera siguiente para la amplificación de un fragmento de ADN del factor V.

106 copias de un plásmido que contenía el gen de tipo salvaje del factor V y mutantes (nº de acceso de Gene Bank

M_014335),

-38 –

MgCl2 13 mM,

500 nM de cada cebador que presentaba las secuencias SEC ID nº 1 y 2,

200 nM de cada una de las sondas de hibridación FRET que presentaban las secuencias SEC ID nº 3 y nº 4.

Se utilizó el kit de sondas LightCycler DNA Master Hybprobes (Roche Applied Science, nº de cat. 2158825) para todos los demás componentes de la PCR siguiendo las instrucciones del fabricante.

Se utilizaron las secuencias siguientes como cebadores y sondas:

SEC ID nº 1

cebador directo:

5' GAG AGA CAT CGC CTC TGG GCT A

SEC ID nº 2

cebador inverso

5' TGT TAT CAC ACT GGT GCT AA

SEC ID nº 3

sonda FRET aceptora

5'-LC-Rojo 640 AGG GAT CTG CTC TTA CAG ATT AGA AGT AGT CCT ATT

SEC ID nº 4

sonda FRET donadora

5' AAT ACC TGT ATT CCT CGC CTG TC-fluoresceína

Se utilizó el programa de temperaturas siguiente para la amplificación en el LightCycler 1.2 (Roche Applied Science).

T[ºC]

T[s] tasa de captura ciclos

cambio

[ºC/s]

desnaturalización

95 30 20,0 ninguna 1

-39 –

amplificación

95 0 20,0 ninguna

55

10 20,0 una 45

72

10 20,0 ninguna

Se llevó a cabo el seguimiento en tiempo real durante

45 ciclos utilizando el método del umbral de la segunda

derivada en el que se midió la señal de fluorescencia en un

5  canal de detección que es específico para la emisión del LightCycler Rojo 640 (a 640 nm) y se utilizó el modo de corrección aritmética de fondo para normalizar la señal inicial.

Tras la amplificación, se llevó a cabo un análisis de

10  la curva de fusión siguiendo las instrucciones del manual del LightCycler (Roche Applied Sciences). Se utilizó el programa de temperaturas siguiente:

T[ºC] T[s] tasa de Captura ciclos cambio [ºC/s]

curva de fusión 95 0 20,0 Ninguna 1 45 60 20,0 Continua 75 10 0,1 Ninguna 1

enfriamiento 40 30 20,0 Ninguna

Se midieron las señales de fluorescencia absoluta tal

15 como se ha indicado anteriormente en el canal de 640 nm y seguidamente se calculó la primera derivada a partir de las mismas. Se muestran los puntos de cruce en la tabla siguiente, como medida de la eficiencia de amplificación al utilizar

20  diferentes sondas donadoras modificadas. La tabla también muestra las temperaturas de fusión medidas de las diversas sondas donadoras para la secuencia de tipo salvaje del factor V y la secuencia mutante del factor V.

-

40 –

Modificación (SEC ID nº 4)

Cp Tm tipo salv. Tm mut.

5'AATACCTGTATTCCTCGCCTGTC-fluoresceína-3' (ref.)

22,11 64,92 56,98

5'AATACCTGTATTCCTCGCCTGTpIC-fluoresceína-3'

22,61 64,32 56,26

5'Ap1ATACCTGTATTCCTCGCCTGTC-fluoresceína-3'

22,51 64,80 56,80

5'AATACCTGp1TATTCCTCp1GCCTGTC-fluoresceína-3'

22,26 64,28 55,89

5'Ap1Ap1Tp1Ap1Cp1Cp1Tp1Gp1Tp1Ap1Tp1TCCTCGCCT GTC-fluoresceína-3'

21,40 60,69 52,19

5'AATACCTGTATTp1Cp1Cp1Tp1Cp1Gp1Cp1Cp1Tp1Gp1Tp1Cfluoresceína-3'

21,91 60,74 52,14

5'Ap1Ap1Tp1ACCTGTATp1Tp1Cp1CTCGCCTp1Gp1Tp1Cfluoreceína-3'

22,00 61,40 52,83

p1 es un mimético P=N-pPh-NAc

Tal como se muestra en la tabla, el punto de cruce no resulta significativamente afectado por la introducción de las modificaciones según la invención, es decir, la

5 eficiencia de la PCR no resulta modificada.

Además, no se observa ningún efecto sobre la temperatura de fusión medida en el caso de las sondas modificadas una vez o dos veces. Además, las sondas múltiplemente modificadas únicamente muestran un cambio

10  moderado del punto de fusión, no superior a 4ºC, mientras que se conserva la capacidad de discriminación de desapareamientos. Ejemplo 7 PCR en tiempo real + análisis de curvas de fusión

15  a) Preparación de azida de lisamina (=rodamina B)

Se añadió gota a gota a 0ºC una solución de 195 mg (3,0 mmoles) de azida sódica en 5 ml de agua a una solución de 577 mg (1 mmol) de cloruro de ácido sulforodamina B en 20 ml de acetona. La mezcla se agitó durante 2 horas a 0ºC y 20 después durante 6 horas a temperatura ambiente. La mezcla se transfirió a un embudo de separación y se añadieron 300 ml

-41 –

de agua y 300 ml de cloruro de metileno. Se separó la fase orgánica y se lavó dos veces con 100 ml de agua. La fase orgánica se secó sobre sulfato sódico.

Se eliminó el solvente mediante destilación en un

evaporador rotatorio. El residuo (140 mg)

se utilizó sin

purificación

adicional, para la síntesis de

oligonucleótidos.

b) Síntesis de una sonda FRET aceptora de secuencia SEC ID nº 3 Ap*GG GAT CTG CTC TTA CAG ATT AGA AGT AGT CCT ATT-p p*=P=NS(O)2-rodamina-B

Se llevó a cabo la síntesis de oligonucleótidos a una escala de 1 µmol en un sintetizador ABI 394. Se utilizó Phospholink CPG disponible comercialmente (Glen Research) como el material de soporte. Todos los compuestos químicos para la síntesis estándar se obtuvieron de Glen Research. Se utilizaron fosforamiditas con grupos protectores tercbutilfenoxiacetilo (conocidos como monómeros "tac" o "Expedite") de Proligo.

Se utilizó el protocolo estándar (modo "trityl off") para la síntesis en la que el oxidante en el último ciclo se sustituyó por una solución 0,1 M de azida de lisamina en acetonitrilo anhidro y el tiempo de oxidación se extendió a 16 minutos.

Se cortó el producto del soporte durante 2 horas a temperatura ambiente con amonio al 33% y se separó mediante cromatografía de fase inversa en una columna Poros Oligo R3 de 4,6x50 mm. Cromatografía, tampón A: acetato de trietilamonio 0,1 M en agua, pH 6,8, tampón B: acetato de

trietilamonio 0,1 M en agua/acetonitrilo 1:1, gradiente de 2

-42 –

minutos de 0% B a 100% B en 45 minutos. Se midió la absorción de UV del eluyente a 260 nm. Se observó una fracción principal que contenía el producto deseado. Se eliminó el solvente en una centrífuga de vacío. Se introdujo

5  el residuo en agua redestilada y nuevamente se evaporó al vacío. Se repitió este procedimiento tres veces. A continuación, se disolvió el residuo en agua redestilada y se liofilizó. Espectroscopía de masas (ESI-MS), calculado: 11.710, observado [M-H]: 11.710,5.

10 c) PCR en tiempo real Con el fin de demostrar la conveniencia de la PCR en tiempo real, se llevó a cabo una PCR en tiempo real del ADN del factor V en un LightCycler 2.0. Se utilizaron cebadores en combinación con una pareja de sondas de hibridación

15 fluoresceína/lisamina FRET, en la que la lisamina (rodamina B) actuó como aceptor FRET. Se registraron las curvas de cuantificación y se determinó el valor de cp como función de la concentración del ácido nucleico diana. Se llevó a cabo una PCR en tiempo real y un análisis de

20  la curva de fusión según el Ejemplo 6 para la amplificación de 104 y 106 copias de un fragmento de ADN del factor V. Para ello se utilizó una sonda donadora fluoresceína según el Ejemplo 6 (SEC ID nº 4) que no se modificó adicionalmente y una sonda FRET aceptora según el Ejemplo 7b (SEC ID nº 3).

T[ºC] T[s] tasa de Captura ciclos cambio [ºC/s]

desnaturalización 95 30 20,0 Ninguna 1

amplificación 95 0 20,0 Ninguna 55 10 20,0 Una 45 72 10 20,0 Ninguna

-43 –

Se midió la señal de fluorescencia en el canal de detección de 610 nm. Se utilizó el modo de corrección de fondo 610/530 para normalizar la señal no procesada. Se determinó que el valor de Cp era 22 para 106 copias y se determinó que el valor de Cp era de 26 para 104 copias.

Se determinó que el punto de fusión para el tipo salvaje era de 64,69ºC y se determinó que 56,24ºC era el punto de fusión para el mutante (106 copias). Ejemplo 8 PCR en tiempo real con cebadores modificados

Se llevó a cabo una PCR cuantitativa en tiempo real del ADN del factor V humano en un instrumento LightCycler 1.2® (Roche Diagnostics GmbH) con el fin de analizar el efecto de los miméticos de fosfato sobre el alargamiento de los cebadores. Se introdujo el mimético P=N-pPh-NAc en diferentes posiciones de una pareja de cebadores para la amplificación del ADN del factor V humano. Se sintetizaron los cebadores modificados según el Ejemplo 4. La purificación se realizó mediante cromatografía de fase inversa del Ejemplo 3 en modo tritilo on. La destritilación se llevó a cabo mediante tratamiento con ácido acético al 80% durante 20 minutos.

Dichos cebadores se utilizaron en combinación con una pareja de sondas de hibridación FRET fluoresceína/LightCycler Rojo 640 según el Ejemplo 6. La sonda fluoresceína y la sonda 5' LightCycler Rojo 640 (SEC ID nº 3 y 4) se mantuvieron constantes. Se sometieron a ensayo diversas combinaciones de cebadores modificados y no modificados. A modo de referencia se utilizaron cebadores no

-44 –

modificados. Se evaluó el efecto sobre el punto de cruce, que es una medida de la eficiencia de la amplificación. Se llevó a cabo un seguimiento en tiempo real durante 45 ciclos utilizando el método del umbral de la segunda

5  derivada, en el que se midió la señal de fluorescencia en un canal de detección que es específico para la emisión del LightCycler Rojo 640 (a 640 nm) y se utilizó el modo de corrección aritmética de fondo para normalizar la señal inicial.

10 Se midieron las señales de fluorescencia absoluta tal como se ha indicado anteriormente, en el canal de 640 nm, y posteriormente se calculó la primera derivada a partir de las mismas. Se muestran los puntos de cruce en las tablas siguientes a modo de medida de la eficiencia de la

15 amplificación al utilizar diferentes cebadores modificados.

Combinaciones de cebadores SEC ID nº 1 SEC ID nº 2

Cp

5' GAG AGA CAT CGC CTC TGG GCT A 5' TGT TAT CAC ACT GGT GCT AA

20,36

5' GAG AGA CAT CGC CTC TGG GCT A 5' TGT TAT CAC ACT GGT GCT Ap1A

22,08

5' GAG AGA CAT CGC CTC TGG GCT A 5' TGT TAT CAC ACT GGT Gp1CT AA

22,50

5' GAG AGA CAT CGC CTC TGG GCT A 5' TGT TAT CAC ACT p1GGT GCT AA

21,36

5' GAG AGA CAT CGC CTC TGG GCT p1A 5' TGT TAT CAC ACT GGT GCT AA

20,80

5' GAG AGA CAT CGC CTC TGG p1GCT A 5' TGT TAT CAC ACT GGT GCT AA

20,85

5' GAG AGA CAT CGC CTp1C TGG GCT A 5' TGT TAT CAC ACT GGT GCT AA

20,61

5' GAG AGA CAT CGC CTC TGG GCT p1A 5' TGT TAT CAC ACT GGT GCT Ap1A

21,76

5' GAG AGA CAT CGC CTp1C TGG p1GCT A 5' TGT TAT CAC ACT GGT Gp1CT AA

22,75

5' GAG AGA CAT CGC CTp1C TGG GCT A 5' TGT TAT CAC ACT p1GGT GCT AA

21,36

-45 –

p1 es un mimético P=N-pPh-NAc

Tal como se muestra en la tabla, el punto de cruce no

resultó afectado significativamente por la introducción de

modificaciones según la invención en los cebadores,

5  demostrando que la eficiencia de la PCR no resultó prácticamente modificada.

Ejemplo 9 Síntesis de un oligonucleótido marcado con fluoresceína que comprende un mimético de fosfato de piridinio

10 Se llevó a cabo la síntesis de un oligonucleótido según la secuencia SEC ID nº 4 a una escala de 1 µmol en un sintetizador ABI 394. Se utilizó fluoresceína-CPG LightCycler (Roche Applied Science) como el material de soporte. Todos los compuestos químicos para la síntesis

15 estándar se obtuvieron de Glen Research. Se utilizaron fosforamiditas con grupos protectores terc-butil-fenoxiacetilo (conocidos como monómeros "tac" o "Expedite") de Proligo. Se utilizó el protocolo del Ejemplo 4) para la

20  síntesis, mientras que durante el segundo ciclo se utilizó como oxidante una solución 0,1 M de 4-azida de 1,2,6trimetil-piridinio (RareChem AQ N6 1054) en acetonitrilo anhidro y el tiempo de oxidación se extendió a 16 minutos. Esto resultó en un intermediario que comprendía la

25  estructura:

-46 –

imagen1

Se cortó el producto del soporte durante 2 horas a temperatura ambiente con amonio al 33% y se separó mediante cromatografía de fase inversa en una columna Poros Oligo R3

5  de 4,6x50 mm. Cromatografía, tampón A: acetato de trietilamonio 0,1 M en agua, pH 6,8, tampón B: acetato de trietilamonio 0,1 M en agua/acetonitrilo 1:1, gradiente de 2 minutos de 0% B a 100% B en 45 minutos. Se midió la absorción de UV del eluyente a 260 nm. Se observó una

10  fracción principal que contenía el producto deseado. Se eliminó el solvente en una centrífuga de vacío. Se introdujo el residuo en agua redestilada y nuevamente se evaporó al vacío. Se repitió este procedimiento tres veces. A continuación, se disolvió el residuo en agua redestilada y

15 se liofilizó. Espectroscopía de masas (Maldi-MS Applied Biosystems Voyager System 6327), calculado: 7.641,32, observado [M-H]: 7.639,59. Ejemplo 10

20 Estabilidad de un dinucleótido dA(P(=NSO2PhNHAc)dT en comparación con un dAdT no modificado a diferentes temperaturas y pHs Se sintetizó dA(P(=NSO2PhNHAc)dT y se purificó según el Ejemplo 1). También se sintetizó dAdT según el Ejemplo 1,

-47 –

aunque se utilizaron oxidantes estándares (yodo 0,02 M en THF). Los dímeros se expusieron durante diferentes tiempos y temperaturas a tampón Tris 10 mM a diferentes valores de pH:

5  7,0, 8,0 y 9,0. Se dejaron las muestras a temperatura ambiente (aproximadamente 24ºC) durante 24 horas o a 95ºC durante 60 minutos ó 16 horas, respectivamente. Se extrajeron alícuotas de 150 µl antes y después del experimento y se inyectaron volúmenes de 100 µl en la HPLC.

10 Se realizó un seguimiento de la descomposición mediante HPLC de fase inversa en una columna analítica X-Bridge (2,5 µm, 4,6x50 mm de d.i.) con un módulo de separación Waters 2690. La detección se llevó a cabo con un detector Waters 2996 PAD (260 nm). Se bombeó una fase móvil de acetato de

15  trietilamonio 0,1 M (pH 6,8) con un gradiente de 95% de acetonitrilo a un caudal de 1,0 ml/minuto. Se evaluó la tasa de destrucción de los dímeros mediante seguimiento del tiempo de retención, tr, de la señal del dímero (Software Millenium, Waters) y determinando si se producían picos

20  adicionales con tiempos de retención diferentes a los del dímero de nucleótidos. Se muestran los resultados en la tabla siguiente:

dAdT

dA(P(=NSO2PhNHAc)dT

pH 7,0

Solución inicial

rtHPLC=2,39 rtHPLC=2,93

24 horas a temperatura amb. (24ºC)

rtHPLC=2,39 rtHPLC=2,93

1 hora a 95ºC (horno seco)

rtHPLC=2,48 rtHPLC=2,99

16 horas a 95ºC (horno seco)

rtHPLC=2,42 1 nuevo pico en t=6,2 rtHPLC=2,99 2 nuevos picos en t=1,2 y 2,0

pH 8,0

-

48 –

Solución inicial

rtHPLC=2,38 rtHPLC=2,96

24 horas a temperatura amb. (24ºC)

rtHPLC=2,38 rtHPLC=2,96

1 hora a 95ºC (horno seco)

rtHPLC=2,42 rtHPLC=2,92

16 horas a 95ºC (horno seco)

rtHPLC=2,41 1 nuevo pico en 6,2 rtHPLC=2,92

pH 9,0

Solución inicial

rtHPLC=2,41 rtHPLC=2,92

24 horas a temperatura amb. (24ºC)

rtHPLC=2,41 rtHPLC=2,92

1 hora a 95ºC (horno seco)

rtHPLC=2,42 rtHPLC=2,95

16 horas a 95ºC (horno seco)

rtHPLC=2,43 rtHPLC=2,95

El dímero no modificado era estable a pH 7,0, 8,0 y 9,0 durante 24 horas a temperatura ambiente, durante 1 hora a 95ºC e iniciaba su descomposición tras 16 horas a pH 7,0 y pH 8,0. El dímero modificado era estable a pH 7,0, 8,0 y 9,0 durante 24 horas a temperatura ambiente, durante 1 hora a 95ºC e iniciaba su descomposición tras 16 horas a 95ºC a pH 7,0.

-49 –

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Roche Diagnostics GmbH F.Hoffmann-La Roche AG

<120> Polinucleótido que contiene un mimético de fosfato

<130> 23428 WO

<150> EP 05025499

<151> 2005-11-23

<160> 4

<170> PatentIn versión 3.2

<210> 1

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 1 gagagacatc gcctctgggc ta 22

<210> 2

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 2 tgttatcaca ctggtetaa 20

<210> 3

<211> 36

<212> ADN

-50 –

<213> Artificial

<220>

<223> sonda

<400> 3

5 

agggatctgc tcttacagat tagaagtagt cctatt 36

<210> 4

<211> 23

<212> ADN

<213> Artificial

10 

<220>

<223> sonda

<400> 4

aatacctgta ttcctcgcct gtc

23

-51 –

Claims (7)

1. Reivindicaciones

   1. Oligonucleótido que contiene la estructura siguiente por lo menos una vez:

   imagen1

   5  en la que A representa el extremo 5' de un nucleótido o de una cadena de nucleótidos, B representa el extremo 3' de un nucleótido o de una cadena de nucleótidos, D es OH o CH3, y

   10  Acc es un aceptor de electrones o un aceptor de electrones sustituido con un residuo R, y R es cualquier sustituyente orgánico, y Acc se selecciona de entre un grupo que consiste de:

   (i) -CN,

   15  (ii) -SO2-R', en la que R' contiene por lo menos un alquilo amino-sustituido, un arilo opcionalmente sustituido o un heterociclo opcionalmente sustituido,

   (iii) un N+-heterociclo de seis elementos con por

   20  lo menos un átomo de N alquilado en posición orto o para, seleccionando dicho heterociclo de entre un grupo que consiste de piridinio, pirimidinio y quinolinio.
2. 2. Oligonucleótido según la reivindicación 1,

   25  caracterizado porque A y B conjuntamente comprenden por lo menos dos residuos nucleótidos.

   -52 –
3. 3. Procedimiento para producir un oligonucleótido modificado según la reivindicación 1, caracterizado porque un derivado de fósforo trivalente que presenta la estructura química siguiente:

   imagen1

   5 

   en la que E representa un grupo metilo o un grupo hidroxilo protegido, en la que A representa el extremo 5' de un nucleótido o de una cadena de nucleótidos, y

   10  en la que B representa el extremo 3' de un nucleótido o de una cadena de nucleótidos, se hace reaccionar con una azida de la estructura siguiente:

   N = N = N - Acc

   15  en la que Acc es un aceptor de electrones o un aceptor de electrones sustituido con un residuo R, y R es cualquier sustituyente orgánico, y Acc se selecciona de entre un grupo que consiste de:

   (i) -CN,

   20  (ii) -SO2-R', en la que R' contiene por lo menos un alquilo amino-sustituido, un arilo opcionalmente sustituido o un heterociclo opcionalmente sustituido,

   (iii) un N+-heterociclo de seis elementos con

   25  por lo menos un átomo de N alquilado en posición orto o para, seleccionando dicho

   -53 –

   heterociclo de entre un grupo que consiste de

   piridinio, pirimidinio y quinolinio.
4. 4. Procedimiento según la reivindicación 3, que comprende

   las etapas siguientes: a) hacer reaccionar una 3' fosforamidita con el extremo 5' OH de una cadena naciente de oligonucleótidos, b) reacción con una azida de la estructura siguiente:

   N = N = N - Acc en la que Acc es un aceptor de electrones o un aceptor de electrones sustituido con un residuo R y R es cualquier sustituyente orgánico, y Acc se selecciona de entre un grupo que consiste de:

   (i)

   -CN,

   (ii)

   -SO2-R', en la que R' contiene por lo menos un alquilo amino-sustituido, un arilo opcionalmente sustituido o un heterociclo opcionalmente sustituido,

   (iii) un N+-heterociclo de seis elementos con por lo menos un átomo de N alquilado en posición orto o para, seleccionando dicho heterociclo de entre un grupo que consiste de piridinio, pirimidinio y quinolinio.

5. 5.

   Utilización de un oligonucleótido según las reivindicaciones 1 a 2 a modo de pareja de hibridación.

6. 6.

   Utilización según la reivindicación 5, a modo de sonda de hibridación.

7. 7.

   Utilización según la reivindicación 5, para inactivar la expresión génica en un experimento de cultivo celular.