BR112020020670A2 - composição de oligonucleotídeo, composição farmacêutica, método para alterar o splicing de uma transcrição alvo, método para tratar distrofia muscular, método para preparar um oligonucleotídeo ou uma composição de oligonucleotídeo do mesmo e oligonucleotídeo - Google Patents

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Abstract

COMPOSIÇÃO DE OLIGONUCLEOTÍDEO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, MÉTODO PARA ALTERAR O SPLICING DE UMA TRANSCRIÇÃO ALVO, MÉTODO PARA TRATAR DISTROFIA MUSCULAR, MÉTODO PARA PREPARAR UM OLIGONUCLEOTÍDEO OU UMA COMPOSIÇÃO DE OLIGONUCLEOTÍDEO DO MESMO E OLIGONUCLEOTÍDEO. Entre outros fatores, a presente revelação fornece oligonucleotídeos projetados, composições e métodos de uso dos mesmos. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece tecnologias úteis para reduzir os níveis de transcrições. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece tecnologias úteis para modular splicing de transcrição. Em algumas modalidades, as tecnologias fornecidas podem alterar o splicing de uma transcrição de distrofina (DMD). Em algumas modalidades, a presente revelação fornece métodos para tratar doenças, tal como distrofia muscular de Duchenne, distrofia muscular de Becker, etc.

Description

COMPOSIÇÃO DE OLIGONUCLEOTÍDEO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, MÉTODO PARA ALTERAR O SPLICING DE UMA TRANSCRIÇÃO ALVO, MÉTODO PARA TRATAR DISTROFIA MUSCULAR, MÉTODO PARA PREPARAR UM OLIGONUCLEOTÍDEO OU UMA COMPOSIÇÃO DE OLIGONUCLEOTÍDEO DO MESMO E OLIGONUCLEOTÍDEO REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] Este pedido reivindica a prioridade dos pedidos provisórios números U.S. 62/656.949, depositado em 12 de abril de 2018, 62/670.709, depositado em 11 de maio de 2018, 62/715.684, depositado em 07 de agosto de 2018, 62/723.375, depositado em 27 de agosto de 2018, e 62/776.432, depositado em 6 de dezembro de 2018, cuja totalidade está incorporada ao presente documento a título de referência.
ANTECEDENTES
[0002] Os oligonucleotídeos são úteis em aplicações terapêuticas, de diagnóstico, pesquisa e nanomateriais. O uso de ácidos nucleicos de ocorrência natural (por exemplo, DNA ou RNA não modificado) para terapêutica pode ser limitado, por exemplo, devido à sua instabilidade contra nucleases extra e intracelulares e/ou à sua penetração e distribuição celular insatisfatória. Existe uma necessidade de oligonucleotídeos e composições de oligonucleotídeo novos e aprimorados, tais como, por exemplo, oligonucleotídeos e composições de oligonucleotídeo novos e com capacidade de modular o salto de éxon de Distrofina para tratamento de distrofia muscular.
SUMÁRIO
[0003] Entre outros fatores, a presente revelação abrange o reconhecimento de que elementos estruturais de oligonucleotídeos, tais como sequência de base, modificações químicas (por exemplo, modificações de açúcar, base e/ou ligações internucleotídicas, e padrões das mesmas), e/ou estereoquímica (por exemplo, estereoquímica de centros quirais de cadeia principal (ligações internucleotídicas quirais), e/ou padrões das mesmas), podem ter impacto significativo sobre as propriedades de oligonucleotídeo, por exemplo, atividades, toxicidades, por exemplo, à medida que podem ser mediadas pelas características de ligação de proteína, estabilidade, capacidades de alteração de splicing, etc. Em algumas modalidades, a presente revelação demonstra que composições de oligonucleotídeo que compreendem oligonucleotídeos com elementos estruturais controlados, por exemplo, modificação química controlada e/ou padrões estereoquímicos de cadeia principal controlados, fornecem propriedades inesperadas, que incluem, porém sem limitação certas atividades, toxicidades, etc. Em algumas modalidades, a presente revelação demonstra que as propriedades de oligonucleotídeo, por exemplo, atividades, toxicidades, etc., podem ser moduladas por modificações químicas (por exemplo, modificações de açúcares, bases, ligações internucleotídicas, etc.), estruturas quirais (por exemplo, estereoquímica de ligações internucleotídicas quirais e padrões das mesmas, etc.), e/ou combinações dos mesmas.
[0004] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece um oligonucleotídeo ou uma composição de oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo ou uma composição de oligonucleotídeo é um oligonucleotídeo DMD ou uma composição de oligonucleotídeo DMD. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo DMD ou uma composição de oligonucleotídeo DMD é um oligonucleotídeo ou uma composição de oligonucleotídeo que tem capacidade para modular o salto de um ou mais éxons do gene alvo Distrofina (DMD). Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo DMD ou uma composição de oligonucleotídeo DMD é útil para o tratamento de distrofia muscular. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo ou composição de oligonucleotídeo é um oligonucleotídeo ou composição de oligonucleotídeo que compreende uma ligação internucleotídica não negativamente carregada. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo ou composição de oligonucleotídeo que compreende uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem capacidade para modular a expressão, nível e/ou atividade de um gene alvo ou um produto de gene do mesmo, incluindo, porém sem limitação, aumentar ou diminuir a expressão, nível e/ou atividade de um gene alvo ou produto de gene do mesmo por meio de qualquer mecanismo, incluindo, porém sem limitação: um mecanismo dependente de RNase H, impedimento estérico, interferência de RNA, modulação de salto de um ou mais éxons, etc. Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a um oligonucleotídeo ou composição de oligonucleotídeo que compreende uma ligação internucleotídica não negativamente carregada, em combinação com qualquer outra estrutura ou porção química descrita no presente documento. Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a um oligonucleotídeo DMD ou composição de oligonucleotídeo DMD que compreende uma ligação internucleotídica não negativamente carregada.
[0005] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece tecnologias relacionadas a um oligonucleotídeo ou uma composição de oligonucleotídeo para reduzir níveis de uma transcrição e/ou uma proteína codificada desse modo. Em algumas modalidades, conforme demonstrado pelos dados de exemplo descritos no presente documento, as tecnologias fornecidas são particularmente úteis para reduzir os níveis de mRNA e/ou proteínas codificadas desse modo.
[0006] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece tecnologias, por exemplo, oligonucleotídeos, composições e métodos, etc., para alterar a expressão de genes, níveis e/ou splicing de transcrições. Em algumas modalidades, uma transcrição é a Distrofina (DMD). O splicing de uma transcrição, tal como pré-mRNA, é uma etapa essencial para que a transcrição realize suas funções biológicas em muitos eucariotas superiores. Em algumas modalidades, a presente revelação reconhece que o splicing de alvejamento, especialmente através de composições que compreendem oligonucleotídeos que têm sequências de base e/ou modificações químicas e/ou padrões estereoquímicos (e/ou padrões dos mesmos) descritos nesta revelação, pode corrigir eficazmente as mutações associadas à doença e/ou splicing aberrante, e/ou introduzir e/ou melhorar o splicing benéfico que leva aos produtos desejados, por exemplo, mRNA, proteínas, etc. que podem reparar, restaurar ou adicionar novas funções biológicas desejadas, por exemplo, uma ou mais funções da Distrofina.
[0007] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece composições e métodos para alterar o splicing de transcrições DMD, em que o splicing alterado deleta ou compensa um éxon (ou éxons) que compreende uma mutação associada à doença.
[0008] Por exemplo, em algumas modalidades, um gene da Distrofina pode compreender um éxon que compreende uma ou mais mutações associadas a uma doença, por exemplo,
distrofia muscular (que inclui, porém sem limitação distrofia muscular de Duchenne (Duchenne) (DMD) e distrofia muscular de Becker (Becker) (BMD)). Em algumas modalidades, um éxon associado à doença compreende uma mutação (por exemplo, uma mutação com troca de sentido, uma mutação de deslocamento de quadro, uma mutação sem sentido, um códon de parada prematura, etc.) em um éxon. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece composições e métodos para saltar eficazmente um éxon (ou éxons) Distrofina associado à doença e/ou um éxon (ou éxons) diferente ou adjacente, enquanto mantém ou restaura o quadro de leitura, de modo que uma distrofina mais curta (por exemplo, internamente truncada), porém parcialmente funcional possa ser produzida. Uma pessoa de habilidade comum na técnica observa que as tecnologias fornecidas (oligonucleotídeos, composições, métodos, etc.) também podem ser utilizadas para salto de outros éxons, por exemplo, aqueles descritos no documento WO 2017/062862 e incorporados no presente documento a título de referência, de acordo com a presente revelação para tratar uma doença e/ou afecção.
[0009] Entre outros fatores, a presente revelação demonstra que modificações químicas e/ou estereoquímica podem ser usadas para modular o splicing de transcrição por composições de oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece combinações de modificações químicas e estereoquímica para aprimorar as propriedades dos oligonucleotídeos, por exemplo, sua capacidade de alterar o splicing de transcrições. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece composições de oligonucleotídeo quiralmente controladas que, quando comparadas a uma condição de referência (por exemplo, ausência da composição, presença de uma composição de referência (por exemplo, uma composição de oligonucleotídeos estereoaleatória que tem a mesma constituição (conforme entendido por aqueles versados na técnica, a menos que indicado de outro modo, a constituição se refere geralmente à descrição da identidade e conectividade (e multiplicidades de ligação correspondentes) dos átomos em uma entidade molecular, porém que omite qualquer distinção que se origine de sua disposição espacial), uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada diferente, etc.), combinações das mesmas, etc.), fornece splicing alterado que pode entregar um ou mais efeitos biológicos desejados, por exemplo, aumentar a produção de proteínas desejadas, knockdown de um gene por meio da produção de mRNA com mutações de deslocamento de quadro e/ou códons de para prematura, knockdown de um gene que expressa um mRNA com uma mutação de deslocamento de quadro e/ou códon de parada prematura, etc. Em algumas modalidades, em comparação com uma condição de referência, as composições de oligonucleotídeo quiralmente controladas fornecidas são surpreendentemente eficazes. Em algumas modalidades, os efeitos biológicos desejados (por exemplo, conforme medidos por níveis aumentados de mRNA, proteínas desejados, etc., níveis diminuídos de mRNA, proteínas indesejados, etc.) podem ser aumentados em mais de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 ou 100 vezes.
[0010] A presente revelação reconhece os desafios do fornecimento de composições de oligonucleotídeo de baixa toxicidade e métodos de uso das mesmas. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece composições de oligonucleotídeo e métodos com toxicidade reduzida. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece composições de oligonucleotídeo e métodos com respostas imunes reduzidas. Em algumas modalidades, a presente revelação reconhece que várias toxicidades induzidas por oligonucleotídeos estão relacionadas à ativação de citocina e/ou complemento. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece composições de oligonucleotídeo e métodos com ativação de citocina e/ou complemento reduzida. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece composições de oligonucleotídeo e métodos com ativação de complemento reduzida através da via alternativa. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece composições de oligonucleotídeo e métodos com ativação de complemento reduzida através da via clássica. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece composições de oligonucleotídeo e métodos com lesão vascular induzida por fármaco reduzida. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece composições de oligonucleotídeo e métodos com inflamação de sítio de injeção reduzida. Em algumas modalidades, a toxicidade reduzida pode ser avaliada através de um ou mais ensaios amplamente conhecidos e praticados por uma pessoa de habilidade comum na técnica, por exemplo, avaliação dos níveis de produto de ativação completa, ligação de proteína, etc.
[0011] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece oligonucleotídeos com antagonismo intensificado de atividade de hTLR9. Em algumas modalidades, determinadas doenças, por exemplo, DMD, são associadas à inflamação, por exemplo, em tecidos musculares. Em algumas modalidades, as tecnologias fornecidas (por exemplo, oligonucleotídeos, composições, métodos, etc.) fornecem tanto atividades intensificadas (por exemplo, atividades de salto de éxon) como atividades antagonistas de hTLR9 que podem ser benéficas para uma ou mais afecções e/ou doenças associadas à inflamação.
Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos e/ou composições dos mesmos fornecem tanto capacidades de salto de éxon como níveis diminuídos de toxicidade e/ou inflamação.
Em algumas modalidades, a presente revelação fornece um oligonucleotídeo que compreende uma ou mais ligações internucleotídicas não negativamente carregadas, em que o oligonucleotídeo agoniza a atividade de TLR9 menos do que o outro oligonucleotídeo que não compreende uma ligação internucleotídica não negativamente carregada ou que compreende menos ligações internucleotídicas não negativamente carregadas e que é, de outro modo, idêntico.
Em algumas modalidades, a presente revelação fornece um oligonucleotídeo que compreende uma ou mais ligações internucleotídicas não negativamente carregadas, em que o oligonucleotídeo agoniza a atividade de TLR9 menos do que um oligonucleotídeo, de outro modo, idêntico, que não compreende uma ligação internucleotídica não negativamente carregada ou que compreende menos ligações internucleotídicas não negativamente carregadas.
Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a um oligonucleotídeo que compreende pelo menos uma ligação internucleotídica não negativamente carregada.
Em algumas modalidades, a ligação internucleotídica não negativamente carregada é selecionada dentre: n001, n002, n003, n004, n005, n006, n007, n008, n009 ou n010, ou um estereoisômero quiralmente controlado de n001, n002, n003, n004, n005, n006, n007, n008, n009 ou n010. Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a um oligonucleotídeo que compreende pelo menos duas ligações internucleotídicas não negativamente carregadas, em que as ligações são diferentes uma da outra. Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a um oligonucleotídeo que compreende uma motivo de CpG, em que pelo menos uma ligação internucleotídica no CpG (por exemplo, o p em CpG) ou imediatamente a montante do CpG (em direção à extremidade 5' do oligonucleotídeo) ou imediatamente a montante do CpG (em direção à extremidade 3' do oligonucleotídeo) é uma ligação internucleotídica não negativamente carregada. Em algumas modalidades, TLR9 é um TLR9 humano. Em algumas modalidades, TLR9 é um TLR9 de camundongo.
[0012] Em algumas modalidades, a presente revelação demonstra que as propriedades de oligonucleotídeo, por exemplo, atividades, toxicidades, etc., podem ser moduladas através de modificações químicas. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição de oligonucleotídeo que compreende uma pluralidade de oligonucleotídeos que têm uma sequência de base comum, e compreende uma ou mais ligações internucleotídicas modificadas (ou “ligações internucleotídicas não naturais”, ligações que não são, mas podem ser utilizadas no lugar de uma ligação internucleotídica fosfato natural (−OP(O)(OH)O−, que pode existir como uma forma de sal (−OP(O)(O−)O−) a um pH fisiológico) encontrada no DNA e RNA naturais), uma ou mais porções químicas de açúcar modificadas e/ou uma ou mais ligações fosfato naturais. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos podem compreender dois ou mais tipos de ligações internucleotídicas modificadas. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido compreende uma ligação internucleotídica não negativamente carregada. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada é uma ligação internucleotídica neutra.
Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica neutra compreende uma porção química de triazol, alcino ou guanidina (por exemplo, guanidina cíclica). Tais porções químicas são opcionalmente substituídas.
Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido compreende a ligação internucleotídica neutra e outra ligação internucleotídica que não é uma cadeia principal neutra.
Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido compreende uma ligação internucleotídica neutra e uma ligação internucleotídica fosforotioato.
Em algumas modalidades, as composições de oligonucleotídeo fornecidas que compreendem uma pluralidade de oligonucleotídeos são quiralmente controlados e o nível da pluralidade de oligonucleotídeos na composição é controlado ou predeterminado, e os oligonucleotídeos da pluralidade compartilham uma configuração estereoquímica comum em uma ou mais ligações internucleotídicas quirais.
Por exemplo, em algumas modalidades, os oligonucleotídeos de uma pluralidade compartilham uma configuração estereoquímica comum em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50 ou mais ligações internucleotídicas quirais, cada um dos quais é independentemente Rp ou Sp; em algumas modalidades, os oligonucleotídeos de uma pluralidade compartilham uma configuração estereoquímica comum em cada ligação internucleotídica quiral.
Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica quiral em que um nível controlado de oligonucleotídeos de uma composição compartilham uma configuração estereoquímica comum (independentemente na configuração Rp ou Sp) é denominada como uma ligação internucleotídica quiralmente controlada.
[0013] Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica modificada é uma ligação internucleotídica não negativamente carregada (neutra ou catiônica) pelo fato de que a um pH, (por exemplo, pH fisiológico humano (~ 7,4), pH de um sítio de entrega (por exemplo, uma organela, célula, tecido, órgão, organismo, etc.), etc.), a mesma existe principalmente (por exemplo, pelo menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, etc.; em algumas modalidades, pelo menos 30%; em algumas modalidades, pelo menos 40%; em algumas modalidades, pelo menos 50%; em algumas modalidades, pelo menos 60%; em algumas modalidades, pelo menos 70%; em algumas modalidades, pelo menos 80%; em algumas modalidades, pelo menos 90%; em algumas modalidades, pelo menos 99%; etc.;) como uma forma neutra ou catiônica (em comparação com uma forma aniônica (por exemplo, −O−P(O)(O−)−O− (a forma aniônica da ligação fosfato natural), −O−P(O)(S−)−O− (a forma aniônica da ligação fosforotioato), etc.)), respectivamente. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica modificada é uma ligação internucleotídica neutra pelo fato de que a um pH, a mesma existe principalmente como uma forma neutra. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica modificada é uma ligação internucleotídica catiônica pelo fato de que a um pH, a mesma existe principalmente como uma forma catiônica. Em algumas modalidades, um pH é o pH fisiológico humano (~ 7,4). Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica modificada é uma ligação internucleotídica neutra pelo fato de que a pH 7,4 em uma solução aquosa, pelo menos 90% da ligação internucleotídica existe como sua forma neutra. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica modificada é uma ligação internucleotídica neutra pelo fato de que em uma solução aquosa do oligonucleotídeo, pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 99% da ligação internucleotídica existe em sua forma neutra. Em algumas modalidades, a porcentagem é pelo menos 90%. Em algumas modalidades, a porcentagem é pelo menos 95%. Em algumas modalidades, a porcentagem é pelo menos 99%. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada, por exemplo, uma ligação internucleotídica neutra, quando em sua forma neutra não tem porção química com uma pKa que sejam menor que 8, 9, 10, 11. 12, 13 ou 14. Em algumas modalidades, a pKa de uma ligação internucleotídica na presente revelação pode ser representada pela pKa de CH3−a ligação internucleotídica−CH3 (isto é, que substitui as duas unidades de nucleosídeo conectadas pela ligação internucleotídica a dois grupos −CH3). Sem o desejo de se ater a nenhuma teoria particular, em pelo menos alguns casos, uma ligação internucleotídica neutra em um oligonucleotídeo pode fornecer propriedades e/ou atividades aprimoradas, por exemplo, entrega aprimorada, resistência aprimorada a exonucleases e endonucleases, absorção celular aprimorada, escape endossomal aprimorado e/ou absorção nuclear aprimorada, etc., em comparação com um ácido nucleico comparável que não compreende uma ligação internucleotídica neutra.
[0014] Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura, por exemplo, da fórmula I-n-1, I-n-2, I-n-3, I-n-4, II, II-a- 1, II-a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, II-d-2, etc. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada compreende uma porção química de triazol ou alcino. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada compreende uma porção química de guanidina. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada compreende uma porção química de guanidina cíclica. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica modificada que compreende uma porção química de guanidina cíclica tem a estrutura de: . Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica neutra que compreende uma porção química de guanidina cíclica é quiralmente controlada. Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a uma composição que compreende um oligonucleotídeo que compreende pelo menos uma ligação internucleotídica neutra e pelo menos uma ligação internucleotídica fosforotioato.
[0015] Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada é n001, n002, n003, n004, n005, n006, n007 ou n008. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada é quiralmente controlada, por exemplo, n001R, n002R, n003R, n004R, n005R, n006R, n007R, n008R, n009R, n001S, n002S, n003S, n004S, n005S, n006S, n007S, n008S, n009S, etc.
[0016] Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a uma composição que compreende um oligonucleotídeo que compreende pelo menos uma ligação internucleotídica neutra e pelo menos uma ligação internucleotídica fosforotioato, em que a ligação internucleotídica fosforotioato é uma ligação internucleotídica quiralmente controlada na configuração Sp.
[0017] Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a uma composição que compreende um oligonucleotídeo que compreende pelo menos uma ligação internucleotídica neutra e pelo menos uma ligação internucleotídica fosforotioato, em que a ligação internucleotídica fosforotioato é uma ligação internucleotídica quiralmente controlada na configuração Rp.
[0018] Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a uma composição que compreende um oligonucleotídeo que compreende pelo menos uma ligação internucleotídica neutra selecionada dentre uma ligação internucleotídica neutra que compreende um grupo triazolila opcionalmente substituído, uma ligação internucleotídica neutra que compreende um grupo alquinila opcionalmente substituído, e uma ligação internucleotídica neutra que compreende uma porção química , e pelo menos uma ligação internucleotídica fosforotioato. Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a uma composição que compreende um oligonucleotídeo que compreende pelo menos uma ligação internucleotídica neutra selecionada dentre uma ligação internucleotídica neutra que compreende um grupo triazolila opcionalmente substituído, a ligação internucleotídica neutra que compreende um grupo alquinila opcionalmente substituído, e uma ligação internucleotídica neutra que compreende um grupo Tmg ( ), e pelo menos uma ligação internucleotídica fosforotioato. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo compreende pelo menos uma ligação internucleotídica não negativamente carregada e pelo menos uma ligação internucleotídica fosforotioato. Em algumas modalidades, a ligação internucleotídica não negativamente carregada é n001. Em algumas modalidades, a ligação internucleotídica não negativamente carregada e a ligação internucleotídica fosforotioato são quiralmente controladas de modo independente. Em algumas modalidades, cada uma dentre a ligação internucleotídica não negativamente carregada e as ligações internucleotídicas fosforotioato é quiralmente controlada de modo independente.
[0019] Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a uma composição que compreende um oligonucleotídeo que compreende pelo menos uma ligação internucleotídica neutra selecionada dentre uma ligação internucleotídica neutra que compreende um grupo triazolila opcionalmente substituído, uma ligação internucleotídica neutra que compreende um grupo alquinila opcionalmente substituído, e uma ligação internucleotídica neutra que compreende um grupo Tmg, e pelo menos um fosforotioato, em que o fosforotioato é uma ligação internucleotídica quiralmente controlada na configuração Sp.
[0020] Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a uma composição que compreende um oligonucleotídeo que compreende pelo menos uma ligação internucleotídica neutra selecionada dentre uma ligação internucleotídica neutra que compreende um grupo triazolila opcionalmente substituído, uma ligação internucleotídica neutra que compreende um grupo alquinila opcionalmente substituído, e uma ligação internucleotídica neutra que compreende um grupo Tmg, e pelo menos um fosforotioato, em que o fosforotioato é uma ligação internucleotídica quiralmente controlada na configuração Rp.
[0021] Vários tipos de ligações internucleotídicas diferem em propriedades. Sem o desejo de se ater a nenhuma teoria, a presente revelação observa que uma ligação fosfato natural (ligação internucleotídica fosfodiéster) é aniônica e pode ser instável quando propriamente usada sem outras modificações químicas in vivo; uma ligação internucleotídica fosforotioato é aniônica, geralmente mais estável in vivo do que uma ligação fosfato natural, e geralmente mais hidrofóbica; uma ligação internucleotídica neutra, tal como aquela exemplificada na presente revelação que compreende uma porção química de guanidina cíclica é neutra a pH fisiológico, pode ser mais estável in vivo do que uma ligação fosfato natural, e mais hidrofóbica.
[0022] Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica (por exemplo, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada, uma ligação internucleotídica quiralmente controlada não negativamente carregada, etc.) é neutra a pH fisiológico, quiralmente controlada, estável in vivo, hidrofóbica, e pode aumentar o escape endossomal.
[0023] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo ou composição de oligonucleotídeo é: um oligonucleotídeo DMD ou composição de oligonucleotídeo; um oligonucleotídeo ou composição de oligonucleotídeo que compreende uma ligação internucleotídica não negativamente carregada; ou um oligonucleotídeo DMD que compreende uma ligação internucleotídica não negativamente carregada.
[0024] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo tem, como exemplos não limitantes, uma estrutura flanco-núcleo-flanco, flanco-núcleo, núcleo-flanco, flanco-flanco-núcleo-flanco-flanco, flanco-flanco-núcleo- flanco, ou flanco-núcleo-flanco-flanco (em algumas modalidades, uma estrutura flanco-flanco compreende ou consiste em um primeiro flanco e um segundo flanco, em que o primeiro flanco é diferente do segundo flanco, e o primeiro e o segundo flancos são diferentes do núcleo). Um flanco ou núcleo pode ser definido por quaisquer elementos estruturais e/ou padrões e/ou combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, um flanco e o núcleo são definidos por modificações de nucleosídeo, modificações de açúcar e/ou ligações internucleotídicas, em que um flanco compreende uma modificação de nucleosídeo, modificação de açúcar e/ou ligação internucleotídica e/ou padrão e/ou combinação dos mesmos, que a região de núcleo não tem, ou vice-versa. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos da presente revelação compreendem ou consistem em uma região de extremidade 5', uma região intermediária e uma região de extremidade 3'. Em algumas modalidades, uma região de extremidade 5’ é uma região de flanco 5'. Em algumas modalidades, uma região de flanco 5’ é uma região de extremidade 5'. Em algumas modalidades, uma região de extremidade 3’ é uma região de flanco 3'. Em algumas modalidades, uma região de flanco 3’ é uma região de extremidade 3'. Em algumas modalidades, uma região de núcleo é uma região intermediária.
[0025] Em algumas modalidades, cada região de flanco (ou cada uma dentre a extremidade 5’ e regiões de extremidade 3’) compreende independentemente uma ou mais ligações fosfato modificadas e nenhuma ligação fosfato natural, e a região de núcleo (a região intermediária) compreende uma ou mais ligações internucleotídicas modificadas e uma ou mais mais ligações fosfato naturais. Em algumas modalidades, cada região de flanco (ou cada uma dentre extremidade 5’ e as regiões de extremidade 3’) compreende independentemente uma ou mais ligações fosfato naturais e opcionalmente uma ou mais ligações internucleotídicas modificadas, e o núcleo (ou a região intermediária) compreende uma ou mais ligações internucleotídicas modificadas e opcionalmente uma ou mais ligações fosfato naturais. Em algumas modalidades, um flanco (ou uma extremidade 5’ ou região de extremidade 3') compreende porções químicas de açúcar modificadas. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica modificada é uma ligação internucleotídica fosforotioato.
[0026] Entre outros fatores, a presente revelação abrange o reconhecimento de que preparações de oligonucleotídeo estereoaleatórias contêm uma pluralidade de entidades químicas distintas que diferem umas das outras, por exemplo, na estrutura estereoquímica de individual centros quirais de cadeia principal dentro da cadeia de oligonucleotídeos. Sem controle de estereoquímica de centros quirais de cadeia principal, as preparações de oligonucleotídeo estereoaleatórias fornecem composições não controladas (ou estereoaleatórias) que compreendem níveis indeterminados de estereoisômeros de oligonucleotídeo.
Mesmo que esses estereoisômeros possam ter a mesma sequência de base e/ou modificações químicas, eles são entidades químicas diferentes pelo menos devido à sua estereoquímica de cadeia principal diferente, e eles podem ter, conforme demonstrado no presente documento, propriedades diferentes, por exemplo, atividades, toxicidades, distribuição, etc.
Entre outros fatores, a presente revelação fornece composições quiralmente controladas que são ou contêm estereoisômeros particulares de oligonucleotídeos de interesse; em contraste com composições quiralmente não controladas, composições quiralmente controladas que compreendem níveis controlados de estereoisômeros de oligonucleotídeos particulares.
Em algumas modalidades, um estereoisômero particular pode ser definido, por exemplo, por sua sequência de base, seu padrão de ligações de cadeia principal, seu padrão de centros quirais de cadeia principal, e padrão de modificações de fósforo de cadeia principal, etc.
Conforme é entendido na técnica, em algumas modalidades, a sequência de base pode se referir exclusivamente à sequência de bases e/ou à identidade e/ou situação de modificação de resíduos de nucleosídeo (por exemplo, de açúcar e/ou componentes de base, em relação aos nucleotídeos de ocorrência natural padrão, tais como adenina, citosina, guanosina, timina e uracila) em um oligonucleotídeo e/ou ao caráter de hibridização (isto é, a capacidade de se hibridizar com resíduos complementares particulares) de tais resíduos.
Em algumas modalidades, a presente revelação demonstra que aprimoramentos de propriedade (por exemplo, atividades aprimoradas, toxicidades mais baixas, etc.) obtidos através da inclusão e/ou localização de estruturas quirais particulares dentro de um oligonucleotídeo podem ser comparáveis a, ou ainda melhores que aqueles obtidos através do uso de modificações químicas, por exemplo, ligações de cadeia principal particulares, modificações de resíduo, etc. (por exemplo, através do uso de determinados tipos de fosfatos modificados [por exemplo, fosforotioato, fosforotioato substituído, etc.], modificações de açúcar [por exemplo, modificações 2', etc.], e/ou modificações de base [por exemplo, metilação, etc.]). Em algumas modalidades, a presente revelação demonstra que composições de oligonucleotídeo quiralmente controladas de oligonucleotídeos que compreendem determinadas modificações químicas (por exemplo, 2'-F, 2'-OMe, ligações internucleotídicas fosforotioato, conjugação lipídica, etc.) demonstram eficiência de salto de éxon inesperadamente alta.
[0027] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos são blockmers. Em algumas modalidades, um blockmer é um oligonucleotídeo que compreende um ou mais blocos.
[0028] Em algumas modalidades, um bloco é uma porção de um oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, um bloco é um flanco ou um núcleo. Em algumas modalidades, um blockmer compreende um ou mais blocos. Em algumas modalidades, um bloco 5’ é uma região de extremidade 5' ou flanco 5'. Em algumas modalidades, um bloco 3’ é uma região de extremidade 3' ou flanco 3'.
[0029] Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo fornecido são altmers. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos são altmers que compreendem blocos alternados. Em algumas modalidades, um blockmer ou um altmer pode ser definido por modificações químicas (incluindo presença ou ausência), por exemplo, modificações de base, modificação de açúcar, modificações de ligação internucleotídica, estereoquímica, etc.
[0030] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos compreendem blocos que compreendem ligações internucleotídicas diferentes. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos compreendem blocos que compreendem ligações internucleotídicas modificadas e/ou ligações fosfato naturais.
[0031] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos compreendem blocos que compreendem modificações de açúcar. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos compreendem um ou mais blocos que compreendem uma ou mais modificações 2'-F (blocos 2'-F). Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos compreendem blocos que compreendem modificações 2'-F consecutivas. Em algumas modalidades, um bloco compreende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais modificações 2'-F consecutivas.
[0032] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos compreendem um ou mais blocos que compreendem uma ou mais modificações 2'-OR1 (blocos 2'-OR1), em que R1 é independentemente conforme definido e descrito no presente documento e abaixo. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos compreendem tanto blocos 2'-F como 2'-OR1. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos compreendem blocos 2'-F e 2'-OR1 alternados. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos compreendem um primeiro bloco 2'-F na extremidade 5', e um segundo bloco 2'-F na extremidade 3', cada cada um dos quais compreende independentemente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais modificações 2'-F consecutivas.
[0033] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos compreendem um bloco 5' em que cada porção química de açúcar do bloco 5' compreende uma modificação 2'-F. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos compreendem um bloco 3' em que cada porção química de açúcar do bloco 3' compreende uma modificação 2'-F. Em algumas modalidades, tais oligonucleotídeos fornecidos compreendem um ou mais blocos 2'-OR1, e opcionalmente um ou mais blocos 2'-F, entre os blocos 2'-F 5' e 3’. Em algumas modalidades, tais oligonucleotídeos fornecidos compreendem um ou mais blocos 2'-OR1, e um ou mais blocos 2'-F, entre os blocos 2'-F 5' e 3' (por exemplo, WV-3047, WV-3048, etc.).
[0034] Em algumas modalidades, um bloco é um bloco de estereoquímica. Em algumas modalidades, um bloco é um bloco Rp pelo fato de que cada ligação internucleotídica do bloco é Rp. Em algumas modalidades, um bloco 5' é um bloco Rp. Em algumas modalidades, um bloco 3' é um bloco Rp. Em algumas modalidades, um bloco é um bloco Sp pelo fato de que cada ligação internucleotídica do bloco é Sp. Em algumas modalidades, um bloco 5' é um bloco Sp. Em algumas modalidades, um bloco 3' é um bloco Sp. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos compreendem tanto blocos Rp como Sp. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos compreendem um ou mais blocos Rp, porém nenhum bloco Sp. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos compreendem um ou mais blocos Sp, porém nenhum bloco Rp.
[0035] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos compreendem um ou mais blocos PO em que cada ligação internucleotídica é uma ligação fosfato natural.
[0036] Em algumas modalidades, um bloco 5' é um bloco Sp em que cada porção química de açúcar compreende uma modificação 2'-F. Em algumas modalidades, um bloco 5' é um bloco Sp em que cada ligação internucleotídica é uma ligação internucleotídica modificada e cada porção química de açúcar compreende uma modificação 2'-F. Em algumas modalidades, um bloco 5' é um bloco Sp em que cada ligação internucleotídica é uma ligação fosforotioato e cada porção química de açúcar compreende uma modificação 2'-F. Em algumas modalidades, um bloco 5' compreende 4 ou mais unidades de nucleosídeo.
[0037] Em algumas modalidades, um bloco 3' é um bloco Sp em que cada porção química de açúcar compreende uma modificação 2'-F. Em algumas modalidades, um bloco 3' é um bloco Sp em que cada ligação internucleotídica é uma ligação internucleotídica modificada e cada porção química de açúcar compreende uma modificação 2'-F. Em algumas modalidades, um bloco 3' é um bloco Sp em que cada ligação internucleotídica é uma ligação fosforotioato e cada porção química de açúcar compreende uma modificação 2'-F. Em algumas modalidades, um bloco 3' compreende 4 ou mais unidades de nucleosídeo.
[0038] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos compreendem blocos alternados que compreendem porções químicas de açúcar modificadas diferentes e/ou porções químicas de açúcar não modificadas. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos compreendem blocos alternados que compreendem porções químicas de açúcar modificadas diferentes e porções químicas de açúcar não modificadas. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos compreendem blocos alternados que compreendem porções químicas de açúcar modificadas diferentes. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos compreendem blocos alternados que compreendem porções químicas de açúcar modificadas diferentes, em que as porções químicas de açúcar modificadas compreendem modificações 2’ diferentes. Por exemplo, em algumas modalidades, o oligonucleotídeo fornecido compreende blocos alternados que compreendem 2'-OMe e 2'-F, respectivamente.
[0039] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição de oligonucleotídeo que compreende uma pluralidade de oligonucleotídeos que: 1) têm uma sequência de base comum complementar a uma sequência alvo em uma transcrição; e 2) compreendem uma ou mais porções químicas de açúcar modificadas e ligações internucleotídicas modificadas.
[0040] Em algumas modalidades, uma composição de oligonucleotídeo fornecida é caracterizada pelo fato de que, quando entra em contato com a transcrição em um sistema de splicing de transcrição, o splicing da transcrição é alterado em relação àquele observado sob uma condição de referência selecionada dentre o grupo que consiste na ausência da composição, presença de uma composição de referência, e combinações dos mesmos.
[0041] Em algumas modalidades, uma condição de referência é a ausência da composição. Em algumas modalidades, uma condição de referência é a presença de uma composição de referência. As composições de referência exemplificativas que compreendem uma pluralidade de oligonucleotídeos de referência são extensivamente descritas nesta revelação. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos da pluralidade de referência têm elementos estruturais diferentes (modificações químicas, estereoquímica, etc.) em comparação com os oligonucleotídeos da pluralidade em uma composição fornecida. Em algumas modalidades, uma composição de referência é uma preparação estereoaleatória de oligonucleotídeos que têm as mesmas modificações químicas. Em algumas modalidades, uma composição de referência é uma mistura de estereoisômeros enquanto uma composição fornecida é uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada de um estereoisômero. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos da pluralidade de referência têm a mesma sequência de base, mesmas modificações de açúcar, mesmas modificações de base, mesmas modificações de ligação internucleotídica, e/ou mesma estereoquímica as oligonucleotídeo da pluralidade em uma composição fornecida, porém modificações químicas diferentes, por exemplo, modificação de base, modificação de açúcar, modificações de ligação internucleotídica, etc.
[0042] Os sistemas de splicing exemplificativos são amplamente conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, um sistema de splicing é um sistema in vivo ou in vitro que inclui componentes suficientes para obter o splicing de uma transcrição alvo relevante. Em algumas modalidades, um sistema de splicing é ou compreende um spliceossoma (por exemplo, proteína e/ou componentes de RNA da mesma). Em algumas modalidades, um sistema de splicing é ou compreende uma membrana organelar (por exemplo, uma membrana nuclear) e/ou uma organela (por exemplo, um núcleo). Em algumas modalidades, um sistema de splicing é ou compreende um célula ou população da mesma. Em algumas modalidades, um sistema de splicing é ou compreende um tecido. Em algumas modalidades, um sistema de splicing é ou compreende um organismo, por exemplo, um animal, por exemplo, um mamífero, tal como um camundongo, rato, macaco, cão, ser humano, etc.
[0043] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição de oligonucleotídeo que compreende uma pluralidade de oligonucleotídeos que: 1) têm uma sequência de base comum complementar a uma sequência alvo em uma transcrição; e 2) compreendem uma ou mais porções químicas de açúcar modificadas e ligações internucleotídicas modificadas, sendo que a composição de oligonucleotídeo é caracterizada pelo fato de que, quando entra em contato com a transcrição em um sistema de splicing de transcrição, o splicing da transcrição é alterado em relação àquele observado sob condições de referência selecionadas dentre o grupo que consiste na ausência da composição, presença de uma composição de referência, e combinações dos mesmos.
[0044] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição de oligonucleotídeo que compreende uma pluralidade de oligonucleotídeos de um tipo de oligonucleotídeo particular definido por: 1) sequência de base; 2) padrão de ligações de cadeia principal; 3) padrão de centros quirais de cadeia principal; e 4) padrão de modificações de fósforo de cadeia principal.
[0045] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição de oligonucleotídeo que compreende uma pluralidade de oligonucleotídeos de um tipo de oligonucleotídeo particular definido por: 1) sequência de base; 2) padrão de ligações de cadeia principal; 3) padrão de centros quirais de cadeia principal; e 4) padrão de modificações de fósforo de cadeia principal, cuja composição é quiralmente controlada e é enriquecida, em relação a uma preparação substancialmente racêmica de oligonucleotídeos tendo a mesma sequência de base, para oligonucleotídeos do tipo de oligonucleotídeo particular, sendo que a composição de oligonucleotídeo é caracterizada pelo fato de que, quando entra em contato com a transcrição em um sistema de splicing de transcrição, o splicing da transcrição é alterado em relação àquele observado sob condições de referência selecionadas dentre o grupo que consiste na ausência da composição, presença de uma composição de referência, e combinações dos mesmos.
[0046] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada que compreende oligonucleotídeos de um tipo de oligonucleotídeo particular caracterizado por: 1) sequência de base; 2) padrão de ligações de cadeia principal; 3) padrão de centros quirais de cadeia principal; e 4) padrão de modificações de fósforo de cadeia principal, cuja composição é uma preparação substancialmente pura de um único oligonucleotídeo em que pelo menos cerca de 10% dos oligonucleotídeos na composição têm a sequência e comprimento de base comuns, o padrão comum das ligações de cadeia principal, e o padrão comum dos centros quirais de cadeia principal.
[0047] Em algumas modalidades, cada região (por exemplo, um bloco, flanco, núcleo, extremidade 5', extremidade 3', ou região intermediária, etc.) de um oligonucleotídeo compreende independentemente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais bases. Em algumas modalidades, cada região compreende independentemente 3 ou mais bases. Em algumas modalidades, cada região compreende independentemente 4 ou mais bases. Em algumas modalidades, cada região compreende independentemente 5 ou mais bases. Em algumas modalidades, cada região compreende independentemente 6 ou mais bases. Em algumas modalidades, cada porção química de açúcar em uma região é modificada. Em algumas modalidades, uma modificação é uma modificação 2’. Em algumas modalidades, cada modificação é uma modificação 2'. Em algumas modalidades, uma modificação é 2'-F. Em algumas modalidades, cada modificação é 2'-F. Em algumas modalidades, uma modificação é 2'-OR1. Em algumas modalidades, cada modificação é 2'-OR1. Em algumas modalidades, uma modificação é 2'-OR1. Em algumas modalidades, cada modificação é 2'-OMe. Em algumas modalidades, cada modificação é 2'-OMe. Em algumas modalidades, cada modificação é 2'-MOE. Em algumas modalidades, cada modificação é 2'-MOE. Em algumas modalidades, uma modificação é uma modificação de açúcar LNA. Em algumas modalidades, cada modificação é uma modificação de açúcar LNA. Em algumas modalidades, cada ligação internucleotídica em uma região é uma ligação internucleotídica quiral. Em algumas modalidades, cada ligação internucleotídica em um flanco, ou extremidade 5’ ou região de extremidade 3', é uma ligação internucleotídica quiral Sp. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica quiral é uma ligação fosforotioato. Em algumas modalidades, um núcleo ou região intermediária compreende uma ou mais ligações fosfato naturais e uma ou mais ligações internucleotídicas modificadas. Em algumas modalidades, um núcleo ou região intermediária compreende uma ou mais ligações fosfato naturais e uma ou mais ligações internucleotídicas quirais. Em algumas modalidades, um região de núcleo compreende uma ou mais ligações fosfato naturais e uma ou mais ligações internucleotídicas quirais Sp. Em algumas modalidades, um núcleo ou região intermediária compreende uma ou mais ligações fosfato naturais e uma ou mais ligações fosforotioato Sp.
[0048] Em algumas modalidades, a região (por exemplo, um bloco, flanco, núcleo, extremidade 5', extremidade 3', região intermediária, etc.) de um oligonucleotídeo compreende uma ligação internucleotídica não negativamente carregada, por exemplo, da fórmula I-n-1, I-n-2, I-n-3, I-n- 4, II, II-a-1, II-a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d- 1, II-d-2, etc. Em algumas modalidades, uma região compreende uma ligação internucleotídica neutra. Em algumas modalidades, uma região compreende uma ligação internucleotídica que compreende uma porção química de triazol ou alcino. Em algumas modalidades, uma região compreende uma ligação internucleotídica que compreende uma porção química de guanidina cíclica. Em algumas modalidades, uma região compreende uma ligação internucleotídica que compreende uma porção química de guanidina cíclica. Em algumas modalidades, uma região compreende uma ligação internucleotídica que tem a estrutura de . Em algumas modalidades, tais ligações internucleotídicas são quiralmente controladas.
[0049] Em algumas modalidades, a sequência de base de um oligonucleotídeo, por exemplo, a sequência de base de uma pluralidade de oligonucleotídeos de um tipo de oligonucleotídeo particular, é ou compreende uma sequência de base revelada no presente documento (por exemplo, uma sequência de base de um oligonucleotídeo exemplificativo (por exemplo, aqueles listados nas tabelas, exemplos, etc.), uma sequência alvo, etc.) (ou uma porção da mesma que tem pelo menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 bases de comprimento). Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido tem uma sequência de base que compreende a sequência de base de quaisquer oligonucleotídeos exemplificativos ou outra sequência de base revelada no presente documento, e um comprimento de até 30 bases. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido tem uma sequência de base que compreende a sequência de base de quaisquer oligonucleotídeos exemplificativos ou outra sequência de base revelada no presente documento, e um comprimento de até 40 bases. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido tem uma sequência de base que compreende a sequência de base de quaisquer oligonucleotídeos exemplificativos ou outra sequência de base revelada no presente documento, e um comprimento de até 50 bases. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido tem uma sequência de base que compreende pelo menos 15 bases contíguas da sequência de base de um oligonucleotídeo exemplificativo ou outra sequência revelada no presente documento, e um comprimento de até 30 bases. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido tem uma sequência de base que compreende pelo menos 15 bases contíguas da sequência de base de um oligonucleotídeo exemplificativo ou outra sequência revelada no presente documento, e um comprimento de até 40 bases. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido tem uma sequência de base que compreende pelo menos 15 bases contíguas da sequência de base de um oligonucleotídeo exemplificativo ou outra sequência revelada no presente documento, e um comprimento de até 50 bases. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido tem uma sequência de base que compreende uma sequência que não tem mais de 5 disparidades da sequência de base de um oligonucleotídeo exemplificativo ou outra sequência revelada no presente documento, e um comprimento de até 30 bases. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido tem uma sequência de base que compreende uma sequência que não tem mais de 5 disparidades da sequência de base de um oligonucleotídeo exemplificativo ou outra sequência revelada no presente documento, e um comprimento de até 40 bases. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido tem uma sequência de base que compreende uma sequência que não tem mais de 5 disparidades da sequência de base de um oligonucleotídeo exemplificativo ou outra sequência revelada no presente documento, e um comprimento de até 50 bases.
[0050] Em algumas modalidades, a sequência de base de um oligonucleotídeo fornecido é a sequência de base de um oligonucleotídeo exemplificativo ou outra sequência revelada no presente documento, e um padrão de centros quirais de cadeia principal compreende pelo menos um centro quiralmente controlado que é um fósforo de ligação Sp de uma ligação fosforotioato. Em algumas modalidades, a sequência de base de um oligonucleotídeo fornecido é a sequência de base de um oligonucleotídeo exemplificativo ou outra sequência revelada no presente documento, o oligonucleotídeo tem um comprimento de até 30 bases, e um padrão de centros quirais de cadeia principal compreende pelo menos um centro quiralmente controlado que é um fósforo de ligação Sp de uma ligação fosforotioato. Em algumas modalidades, a sequência de base de um oligonucleotídeo fornecido é a sequência de base de um oligonucleotídeo exemplificativo ou outra sequência revelada no presente documento, o oligonucleotídeo tem um comprimento de até 40 bases, e um padrão de centros quirais de cadeia principal compreende pelo menos um centro quiralmente controlado que é um fósforo de ligação Sp de uma ligação fosforotioato. Em algumas modalidades, a sequência de base de um oligonucleotídeo fornecido compreende pelo menos 15 bases contíguas de quaisquer oligonucleotídeos exemplificativos ou outra sequência revelada no presente documento, o oligonucleotídeo tem um comprimento de até 30, 40 ou 50 bases, e um padrão de centros quirais de cadeia principal compreende pelo menos um centro quiralmente controlado que é um fósforo de ligação Sp de uma ligação fosforotioato.
[0051] Em algumas modalidades, uma disparidade é uma diferença entre a sequência de base ou comprimento quando duas sequências são maximamente alinhadas e comparadas. Como um exemplo não limitante, uma disparidade é contada se existir uma diferença entre a base em uma localização particular em uma sequência e a base na posição correspondente em outra sequência. Desse modo, uma disparidade é contada, por exemplo, se uma posição em uma sequência tiver uma base particular (por exemplo, A), e a posição correspondente na outra sequência tiver uma base diferente (por exemplo, G, C ou U). Uma disparidade também é contada, por exemplo, se uma posição em uma sequência tiver uma base (por exemplo, A), e a posição correspondente na outra sequência não tiver base (por exemplo, essa posição é um nucleotídeo abásico que compreende uma cadeia principal de fosfato-açúcar, porém sem base) ou essa posição é ignorada. Um nick de fita simples em qualquer sequência (ou na fita senso ou antissenso) pode não ser contada como disparidade, por exemplo, nenhuma disparidade pode ser contada se uma sequência compreender a sequência 5'-AG-3', porém a outra sequência compreender a sequência 5'-AG-3' com um nick de fita simples entre a A e a G. Uma modificação de base geralmente não é considerada uma disparidade, por exemplo, se uma sequência compreender uma C, e a outra sequência compreender uma C modificada (por exemplo, com uma modificação 2') na mesma posição, nenhuma disparidade pode ser contada.
[0052] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos de um tipo particular são quimicamente idênticos pelo fato de que eles têm a mesma sequência de base (incluindo comprimento), o mesmo padrão de modificações químicas para porções químicas de açúcar e de base, o mesmo padrão de ligações de cadeia principal (por exemplo, padrão de ligações fosfato naturais, ligações fosforotioato, ligações triéster de fosforotioato, ligações não negativamente carregadas, e combinações dos mesmos), o mesmo padrão de centros quirais de cadeia principal (por exemplo, padrão de estereoquímica (Rp/Sp) de ligações internucleotídicas quirais), e o mesmo padrão de modificações de fósforo de cadeia principal (por exemplo, padrão de modificações no átomo de fósforo internucleotídico, tais como −S−, e −L−R1 da fórmula I).
[0053] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece composições de oligonucleotídeo quiralmente controladas de oligonucleotídeos que compreendem múltiplas (por exemplo, mais de 5, 6, 7, 8, 9 ou 10) ligações internucleotídicas, e particularmente para oligonucleotídeos que compreendem múltiplas (por exemplo, mais de 5, 6, 7, 8, 9 ou 10) ligações internucleotídicas quirais, em que os oligonucleotídeos compreendem pelo menos uma e, em algumas modalidades, mais de 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ligações internucleotídicas quiralmente controladas. Em algumas modalidades, em uma composição de oligonucleotídeos quiralmente controlada cada ligação internucleotídica quiral dos oligonucleotídeos é independentemente uma ligação internucleotídica quiralmente controlada. Em algumas modalidades, em uma composição de oligonucleotídeos estereoaleatória ou racêmica, cada ligação internucleotídica quiral é formada com menos de 90:10, 95:5, 96:4, 97:3 ou 98:2 diastereosseletividade. Em algumas modalidades, em uma composição de oligonucleotídeos quiralmente controlada ou estereosseletiva, cada ligação internucleotídica quiralmente controlada dos oligonucleotídeos tem independentemente uma diastereopureza de pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% em seu fósforo de ligação quiral (Rp ou Sp). Entre outros fatores, a presente revelação fornece tecnologias para preparar oligonucleotídeos de alta diastereopureza. Em algumas modalidades, a diastereopureza de uma ligação internucleotídica quiral em um oligonucleotídeo pode ser medida através de uma reação modelo, por exemplo formação de um dímero essencialmente sob as mesmas condições ou comparáveis, em que o dímero tem a mesma ligação internucleotídica que a ligação internucleotídica quiral, o nucleosídeo 5’ do dímero é igual ao nucleosídeo para a extremidade 5' da ligação internucleotídica quiral, e o nucleosídeo 3' do dímero é igual ao nucleosídeo para a extremidade 3' da ligação internucleotídica quiral.
[0054] Conforme descrito no presente documento, as composições e métodos fornecidos têm capacidade de alterar o splicing das transcrições. Em algumas modalidades, as composições e métodos fornecidos fornecem padrões de splicing aprimorados de transcrições em comparação com as condições de referência selecionadas dentre o grupo que consiste na ausência da composição, presença de uma composição de referência, e combinações dos mesmos. Um aprimoramento pode ser um aprimoramento de quaisquer funções biológicas desejadas. Em algumas modalidades, por exemplo, na DMD, um aprimoramento na produção de um mRNA a partir do qual uma proteína distrofina com atividades biológicas aprimoradas é produzido.
[0055] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece um método para alterar o splicing de uma transcrição alvo, que compreende administrar uma composição fornecida, em que o splicing da transcrição alvo é alterado em relação às condições de referência selecionadas dentre o grupo que consiste na ausência da composição, presença de uma composição de referência, e combinações dos mesmos.
[0056] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece um método para gerar um conjunto de produtos submetidos a splicing a partir de uma transcrição alvo, sendo que o método compreende as etapas de: colocar um sistema de splicing que contém a transcrição alvo em contato com uma composição de oligonucleotídeo que compreende uma pluralidade de oligonucleotídeos (por exemplo, uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada fornecida), em uma quantidade, por um período, e sob condições suficientes para que um conjunto de produtos submetidos a splicing seja gerado, que seja diferente de um conjunto gerado sob condições de referência selecionadas dentre o grupo que consiste na ausência da composição, presença de uma composição de referência, e combinações dos mesmos.
[0057] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece um método para tratar ou prevenir uma doença, que compreende administra a um indivíduo uma composição de oligonucleotídeo descrita no presente documento.
[0058] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece um método para tratar ou prevenir uma doença, que compreende administrar a um indivíduo uma composição de oligonucleotídeo que compreende uma pluralidade de oligonucleotídeos, que: 1) têm uma sequência de base comum complementar a uma sequência alvo em uma transcrição; e 2) compreendem uma ou mais porções químicas de açúcar modificadas e ligações internucleotídicas modificadas, sendo que a composição de oligonucleotídeo é caracterizada pelo fato de que, quando entra em contato com a transcrição em um sistema de splicing de transcrição, o splicing da transcrição é alterado em relação àquele observado sob condições de referência selecionadas dentre o grupo que consiste na ausência da composição, presença de uma composição de referência, e combinações dos mesmos.
[0059] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece um método para tratar ou prevenir uma doença, que compreende administrar a um indivíduo uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada que compreende uma pluralidade de oligonucleotídeos de um tipo de oligonucleotídeo particular definido por: 1) sequência de base; 2) padrão de ligações de cadeia principal; 3) padrão de centros quirais de cadeia principal; e 4) padrão de modificações de fósforo de cadeia principal, cuja composição é quiralmente controlada e é enriquecida, em relação a uma preparação substancialmente racêmica de oligonucleotídeos tendo a mesma sequência de base, para oligonucleotídeos do tipo de oligonucleotídeo particular, em que: a composição de oligonucleotídeo é caracterizada pelo fato de que, quando entra em contato com a transcrição em um sistema de splicing de transcrição, o splicing da transcrição é alterado em relação àquele observado sob condições de referência selecionadas dentre o grupo que consiste na ausência da composição, presença de uma composição de referência, e combinações dos mesmos.
[0060] Em algumas modalidades, uma doença é uma em que, após administrar uma composição fornecida, uma ou mais transcrições submetidas a splicing reparam, restauram ou introduzem uma nova função benéfica. Por exemplo, na DMD, após saltar um ou mais éxons, as funções de distrofina podem ser restauradas, ou parcialmente restauradas através de uma versão truncada porém (pelo menos parcialmente) ativa. Em algumas modalidades, uma doença é uma em que, após administrar uma composição fornecida, uma ou mais transcrições submetidas a splicing se reparam, um gene é eficazmente submetido a knockdown alterando-se o splicing da transcrição de gene.
[0061] Em algumas modalidades, uma doença é distrofia muscular, que inclui, porém sem limitação distrofia muscular de Duchenne (Duchenne) (DMD) e distrofia muscular de Becker (Becker) (BMD).
[0062] Em algumas modalidades, uma transcrição é do gene da Distrofina ou uma variante do mesmo.
[0063] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece um método para tratar uma doença administrando-se uma composição que compreende uma pluralidade de oligonucleotídeos que compartilham uma sequência de base comum que compreende uma sequência de nucleotídeos, cuja sequência de nucleotídeos é complementar a uma sequência alvo na transcrição alvo, o aprimoramento que compreende usar como a composição de oligonucleotídeo uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada caracterizada pelo fato de que, quando entra em contato com a transcrição em um sistema de splicing de transcrição, o splicing da transcrição é alterado em relação àquele observado sob condições de referência selecionadas dentre o grupo que consiste na ausência da composição, presença de uma composição de referência, e combinações dos mesmos.
[0064] Em algumas modalidades, uma sequência comum compreende uma sequência (ou pelo menos uma porção de 15 bases de comprimento da mesma) de qualquer oligonucleotídeo na Tabela A1.
[0065] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece um método para administrar uma composição de oligonucleotídeo que compreende uma pluralidade de oligonucleotídeos que têm uma sequência de nucleotídeos comum, sendo que o aprimoramento compreende: administrar uma composição de oligonucleotídeo que compreende a pluralidade de oligonucleotídeos, cada um dos quais compreende independentemente uma ou mais ligações internucleotídicas negativamente carregadas e uma ou mais ligações internucleotídicas não negativamente carregadas, em que a composição de oligonucleotídeo é quiralmente controlada de modo opcional.
[0066] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece um método para administrar uma composição de oligonucleotídeo que compreende uma pluralidade de oligonucleotídeos que têm uma sequência de nucleotídeos comum, sendo que o aprimoramento compreende: administrar uma composição de oligonucleotídeo que compreende a pluralidade de oligonucleotídeos que é quiralmente controlada e que é caracterizada pela toxicidade reduzida em relação a uma composição de oligonucleotídeo de referência da mesma sequência de nucleotídeos comum.
[0067] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece um método para administrar uma composição de oligonucleotídeo que compreende uma pluralidade de oligonucleotídeos que têm uma sequência de nucleotídeos comum,
sendo que o aprimoramento compreende: administrar uma composição de oligonucleotídeo em que cada oligonucleotídeo na pluralidade inclui uma ou mais ligações fosfato naturais e uma ou mais ligações fosfato modificadas; em que a composição de oligonucleotídeo é caracterizada pela toxicidade reduzida quando testada em pelo menos um ensaio que é observado com uma composição de referência comparável de outro modo, cujos oligonucleotídeos não compreendem ligações fosfato naturais.
[0068] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos podem elicitar as respostas pró- inflamatórias. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece composições e métodos para reduzir a inflamação. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece composições e métodos para reduzir as respostas pró-inflamatórias. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece métodos para reduzir a inflamação no sítio de injeção com o uso das composições fornecidas. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece métodos para reduzir a lesão vascular induzida por fármaco com o uso das composições fornecidas.
[0069] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece um método, que compreende administrar uma composição que compreende uma pluralidade de oligonucleotídeos de uma sequência de base comum, cuja composição exibe inflamação reduzida no sítio de injeção em comparação com uma composição de referência que compreende uma pluralidade de oligonucleotídeos, cada dos quais também tem a sequência de base comum, porém que difere estruturalmente dos oligonucleotídeos da pluralidade pelo fato de que:
os oligonucleotídeos individuais dentro da pluralidade de referência diferem uns dos outros na estrutura estereoquímica; e/ou pelo menos alguns oligonucleotídeos dentro da pluralidade de referência têm uma estrutura diferente de uma estrutura representada pela pluralidade de oligonucleotídeos da composição; e/ou pelo menos alguns oligonucleotídeos dentro da pluralidade de referência não compreendem uma região de flanco e uma região de núcleo.
[0070] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece um método, que compreende administrar uma composição que compreende uma pluralidade de oligonucleotídeos de uma sequência de base comum, cuja composição exibe ligação de proteína alterada em comparação com uma composição de referência que compreende uma pluralidade de oligonucleotídeos, cada um dos quais também tem a sequência de base comum, porém que difere estruturalmente dos oligonucleotídeos da pluralidade pelo fato de que: os oligonucleotídeos individuais dentro da pluralidade de referência diferem uns dos outros na estrutura estereoquímica; e/ou pelo menos alguns oligonucleotídeos dentro da pluralidade de referência têm uma estrutura diferente de uma estrutura representada pela pluralidade de oligonucleotídeos da composição; e/ou pelo menos alguns oligonucleotídeos dentro da pluralidade de referência não compreendem uma região de flanco e uma região de núcleo.
[0071] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece um método para administrar uma composição de oligonucleotídeo que compreende uma pluralidade de oligonucleotídeos que têm uma sequência de nucleotídeos comum, sendo que o aprimoramento compreende: administrar uma composição de oligonucleotídeo que compreende uma pluralidade de oligonucleotídeos que é caracterizada pela ligação de proteína alterada em relação a uma composição de oligonucleotídeo de referência da mesma sequência de nucleotídeos comum.
[0072] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece um método que compreende administrar uma composição que compreende uma pluralidade de oligonucleotídeos de uma sequência de base comum, cuja composição exibe entrega aprimorada em comparação com uma composição de referência que compreende uma pluralidade de referência de oligonucleotídeos, cada dos quais tem a sequência de base comum, porém que difere estruturalmente dos oligonucleotídeos da pluralidade pelo fato de que: os oligonucleotídeos individuais dentro da pluralidade de referência diferem uns dos outros na estrutura estereoquímica; e/ou pelo menos alguns oligonucleotídeos dentro da pluralidade de referência têm uma estrutura diferente de uma estrutura representada pela pluralidade de oligonucleotídeos da composição; e/ou pelo menos alguns oligonucleotídeos dentro da pluralidade de referência não compreendem uma região de flanco e uma região de núcleo.
[0073] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece um método para administrar uma composição de oligonucleotídeo que compreende uma pluralidade de oligonucleotídeos que têm uma sequência de nucleotídeos comum, sendo que o aprimoramento compreende: administrar um oligonucleotídeo que compreende uma pluralidade de oligonucleotídeos que é caracterizada pela entregar aprimorada em relação a uma composição de oligonucleotídeo de referência da mesma sequência de nucleotídeos comum.
[0074] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição que compreende qualquer oligonucleotídeo revelado no presente documento. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição que compreende qualquer oligonucleotídeo quiralmente controlado revelado no presente documento.
[0075] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição que compreende um oligonucleotídeo revelado no presente documento que tem capacidade para mediar o salto do éxon 45 de Distrofina. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição que compreende um oligonucleotídeo revelado no presente documento que tem capacidade para mediar o salto do éxon 51 de Distrofina. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição que compreende um oligonucleotídeo revelado no presente documento que tem capacidade para mediar o salto do éxon 53 de Distrofina. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição que compreende um oligonucleotídeo (ou oligonucleotídeos) revelado no presente documento que tem capacidade para mediar o salto de múltiplos éxons de Distrofina. Em algumas modalidades, tal composição é uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada.
[0076] Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a um oligonucleotídeo ou uma composição de oligonucleotídeo que tem capacidade para mediar o salto de um éxon de DMD ou múltiplos éxons de DMD. Em algumas modalidades, um éxon de DMD é o éxon 51. Em algumas modalidades, um éxon de DMD é o éxon 53. Em algumas modalidades, um éxon de DMD é o éxon 45. Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a uma composição de oligonucleotídeo que tem capacidade para mediar o salto de um éxon 53 de DMD, em que a composição de oligonucleotídeo compreende pelo menos uma ligação internucleotídica quiralmente controlada.
[0077] Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada, em que o oligonucleotídeo tem capacidade para mediar o salto do éxon 45 de DMD. Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a uma composição de oligonucleotídeo que tem capacidade para mediar o salto do éxon 45 de DMD, em que a composição de oligonucleotídeo compreende pelo menos uma ligação internucleotídica quiralmente controlada e compreende pelo menos uma ligação internucleotídica não negativamente carregada. Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada, em que o oligonucleotídeo tem capacidade para mediar o salto do éxon 45 de DMD e compreende pelo menos uma ligação internucleotídica não negativamente carregada.
[0078] Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a uma composição de oligonucleotídeo que tem capacidade para mediar o salto do éxon 45 de DMD, em que a composição de oligonucleotídeo compreende pelo menos uma ligação internucleotídica não negativamente carregada. Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada, em que o oligonucleotídeo tem capacidade para mediar o salto do éxon 45 de DMD e compreende pelo menos uma ligação internucleotídica não negativamente carregada.
[0079] Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada, em que o oligonucleotídeo tem capacidade para mediar o salto do éxon 51 de DMD. Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a uma composição de oligonucleotídeo que tem capacidade para mediar o salto do éxon 51 de DMD, em que a composição de oligonucleotídeo compreende pelo menos uma ligação internucleotídica quiralmente controlada e compreende pelo menos uma ligação internucleotídica não negativamente carregada. Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada, em que o oligonucleotídeo tem capacidade para mediar o salto do éxon 51 de DMD e compreende pelo menos uma ligação internucleotídica não negativamente carregada.
[0080] Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a uma composição de oligonucleotídeo que tem capacidade para mediar o salto do éxon 51 de DMD, em que a composição de oligonucleotídeo compreende pelo menos uma ligação internucleotídica não negativamente carregada. Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada, em que o oligonucleotídeo tem capacidade para mediar o salto do éxon
51 de DMD e compreende pelo menos uma ligação internucleotídica não negativamente carregada.
[0081] Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada, em que o oligonucleotídeo tem capacidade para mediar o salto do éxon 53 de DMD. Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a uma composição de oligonucleotídeo que tem capacidade para mediar o salto do éxon 53 de DMD, em que a composição de oligonucleotídeo compreende pelo menos uma ligação internucleotídica quiralmente controlada e compreende pelo menos uma ligação internucleotídica não negativamente carregada. Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada, em que o oligonucleotídeo tem capacidade para mediar o salto do éxon 53 de DMD e compreende pelo menos uma ligação internucleotídica não negativamente carregada.
[0082] Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a uma composição de oligonucleotídeo que tem capacidade para mediar o salto do éxon 53 de DMD, em que a composição de oligonucleotídeo compreende pelo menos uma ligação internucleotídica não negativamente carregada. Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada, em que o oligonucleotídeo tem capacidade para mediar o salto do éxon 53 de DMD e compreende pelo menos uma ligação internucleotídica não negativamente carregada.
[0083] Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada, em que o oligonucleotídeo tem capacidade para mediar o salto de múltiplos éxons de DMD. Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a uma composição de oligonucleotídeo que tem capacidade para mediar o salto de múltiplos éxons de DMD, em que a composição de oligonucleotídeo compreende pelo menos uma ligação internucleotídica quiralmente controlada e compreende pelo menos uma ligação internucleotídica não negativamente carregada. Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada, em que o oligonucleotídeo tem capacidade para mediar o salto de múltiplos éxons de DMD e compreende pelo menos uma ligação internucleotídica não negativamente carregada.
[0084] Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a uma composição de oligonucleotídeo que tem capacidade para mediar o salto de um éxon de DMD, em que a composição de oligonucleotídeo compreende pelo menos uma ligação internucleotídica não negativamente carregada. Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada, em que o oligonucleotídeo tem capacidade para mediar o salto de um éxon de DMD e compreende pelo menos uma ligação internucleotídica não negativamente carregada. Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada, em que o oligonucleotídeo tem capacidade para mediar o salto de múltiplos éxons de DMD. Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a uma composição de oligonucleotídeo que tem capacidade para mediar o salto de múltiplos éxons de DMD, em que a composição de oligonucleotídeo compreende pelo menos uma ligação internucleotídica quiralmente controlada e compreende pelo menos uma ligação internucleotídica não negativamente carregada. Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada, em que o oligonucleotídeo tem capacidade para mediar o salto de múltiplos éxons de DMD e compreende pelo menos uma ligação internucleotídica não negativamente carregada. Em algumas modalidades, um éxon de DMD é qualquer éxon de DMD revelado no presente documento, que inclui, porém sem limitação éxon 45, éxon 51, éxon 52, éxon 53, éxon 55, éxon 56 e éxon 57.
[0085] Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a uma composição de oligonucleotídeo que tem capacidade para mediar o salto de múltiplos éxons de DMD, em que a composição de oligonucleotídeo compreende pelo menos uma ligação internucleotídica não negativamente carregada. Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada, em que o oligonucleotídeo tem capacidade para mediar o salto de múltiplos éxons de DMD e compreende pelo menos uma ligação internucleotídica não negativamente carregada.
[0086] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição quiralmente controlada de um oligonucleotídeo que tem capacidade para mediar o salto do éxon 51 de Distrofina. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição quiralmente controlada de um oligonucleotídeo que tem capacidade para mediar o salto do éxon 51 de Distrofina e revelada no presente documento.
[0087] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição de um oligonucleotídeo que tem uma sequência de base que é, compreende, ou compreende uma porção de 15 bases da sequência de base de UCAAGGAAGAUGGCAUUUCU, em que cada U pode ser opcional e independentemente substituído por T, e em que a composição é quiralmente controlada de modo opcional.
Em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição de um oligonucleotídeo que tem uma sequência de base que é UCAAGGAAGAUGGCAUUUCU, em que cada U pode ser opcional e independentemente substituído por T, e em que a composição é quiralmente controlada de modo opcional.
Em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição de um oligonucleotídeo que tem uma sequência de base que compreende UCAAGGAAGAUGGCAUUUCU, em que cada U pode ser opcional e independentemente substituído por T, e em que a composição é quiralmente controlada de modo opcional.
Em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição de um oligonucleotídeo que tem uma sequência de base que compreende uma porção de 15 bases da sequência de base de UCAAGGAAGAUGGCAUUUCU, em que cada U pode ser opcional e independentemente substituído por T, e em que a composição é quiralmente controlada de modo opcional.
Em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição de um oligonucleotídeo que tem uma sequência de base que é, compreende, ou compreende uma porção de 15 bases de qualquer um dentre: UCAAGGAAGAUGGCAUUUCU, UCAAGGAAGAUGGCAUUUC, UCAAGGAAGAUGGCAUUU, UCAAGGAAGAUGGCAUU, UCAAGGAAGAUGGCAU, UCAAGGAAGAUGGCA, CAAGGAAGAUGGCAUUUCU, AAGGAAGAUGGCAUUUCU, AGGAAGAUGGCAUUUCU, GGAAGAUGGCAUUUCU, GAAGAUGGCAUUUCU, CAAGGAAGAUGGCAUUUC, CAAGGAAGAUGGCAUUU, AAGGAAGAUGGCAUUUC, AAGGAAGAUGGCAUUU, AGGAAGAUGGCAUUU, ou AAGGAAGAUGGCAUU, em que cada U pode ser opcional e independentemente substituído por T, e em que a composição é quiralmente controlada de modo opcional.
[0088] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição quiralmente controlada de um oligonucleotídeo que tem capacidade para mediar o salto do éxon 53 de Distrofina. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição quiralmente controlada de um oligonucleotídeo que tem capacidade para mediar o salto do éxon 53 de Distrofina e revelada no presente documento.
[0089] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição quiralmente controlada de oligonucleotídeo WV-9517. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição quiralmente controlada de oligonucleotídeo WV-9519. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição quiralmente controlada de oligonucleotídeo WV-9521. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição quiralmente controlada de oligonucleotídeo WV-9524. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição quiralmente controlada de oligonucleotídeo WV-9714. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição quiralmente controlada de oligonucleotídeo WV-9715. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição quiralmente controlada de oligonucleotídeo WV-9747. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição quiralmente controlada de oligonucleotídeo WV-9748. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição quiralmente controlada de oligonucleotídeo WV-9749. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição quiralmente controlada de oligonucleotídeo WV-9897. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição quiralmente controlada de oligonucleotídeo WV-9898. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição quiralmente controlada de oligonucleotídeo WV-9899. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição quiralmente controlada de oligonucleotídeo WV-9900. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição quiralmente controlada de oligonucleotídeo WV-9906. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição quiralmente controlada de oligonucleotídeo WV-9912. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição quiralmente controlada de oligonucleotídeo WV-10670. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição quiralmente controlada de oligonucleotídeo WV-10671. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição quiralmente controlada de oligonucleotídeo WV-10672.
[0090] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição de um oligonucleotídeo que tem uma sequência de base que é, compreende, ou compreende uma porção de 15 bases da sequência de base de CUCCGGUUCUGAAGGUGUUC, em que cada U pode ser opcional e independentemente substituído por T, e em que a composição é quiralmente controlada de modo opcional. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição de um oligonucleotídeo que tem uma sequência de base que é CUCCGGUUCUGAAGGUGUUC, em que cada U pode ser opcional e independentemente substituído por T, e em que a composição é quiralmente controlada de modo opcional. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição de um oligonucleotídeo que tem uma sequência de base que compreende CUCCGGUUCUGAAGGUGUUC, em que cada U pode ser opcional e independentemente substituído por T, e em que a composição é quiralmente controlada de modo opcional.
Em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição de um oligonucleotídeo que tem uma sequência de base que é, compreende, ou compreende uma porção de 15 bases de CUCCGGUUCUGAAGGUGUUC, em que cada U pode ser opcional e independentemente substituído por T, e em que a composição é quiralmente controlada de modo opcional.
Em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição de um oligonucleotídeo que tem uma sequência de base que é ou compreende CUCCGGUUCUGAAGGUGUUCC, UCCGGUUCUGAAGGUGUUC, UCCGGUUCUGAAGGUGUUC, CCGGUUCUGAAGGUGUUC, CGGUUCUGAAGGUGUUC, GGUUCUGAAGGUGUUC, GUUCUGAAGGUGUUC, CUCCGGUUCUGAAGGUGUU, CUCCGGUUCUGAAGGUGU, CUCCGGUUCUGAAGGUG, CUCCGGUUCUGAAGGU, CUCCGGUUCUGAAGG, UCCGGUUCUGAAGGUGUU, CCGGUUCUGAAGGUGUU, UCCGGUUCUGAAGGUGU, CCGGUUCUGAAGGUGU, UCCGGUUCUGAAGGUG, CGGUUCUGAAGGUGU, UCCGGUUCUGAAGGU, CCGGUUCUGAAGGUG, CGGUUCUGAAGGUGUU, UCCGGUUCUGAAGGUGUUC,UCCGGUUCUGAAGGUG,UCCGGUUCUGAAGGU, CGGUUCUGAAGGUGUU, GGUUCUGAAGGUGUU ou GGUUCUGAAGGUGUU, em que cada U pode ser opcional e independentemente substituído por T, e em que a composição é quiralmente controlada de modo opcional.
Em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição de um oligonucleotídeo que tem uma sequência de base que é, compreende, ou compreende uma porção de 15 bases da sequência de base de UUCUGAAGGUGUUCUUGUAC, em que cada U pode ser opcional e independentemente substituído por T, e em que a composição é quiralmente controlada de modo opcional.
Em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição de um oligonucleotídeo que tem uma sequência de base que é UUCUGAAGGUGUUCUUGUAC, em que cada U pode ser opcional e independentemente substituído por T, e em que a composição é quiralmente controlada de modo opcional. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição de um oligonucleotídeo que tem uma sequência de base que compreende UUCUGAAGGUGUUCUUGUAC, em que cada U pode ser opcional e independentemente substituído por T, e em que a composição é quiralmente controlada de modo opcional. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição de um oligonucleotídeo que tem uma sequência de base que compreende uma porção de 15 bases da sequência de base de UUCUGAAGGUGUUCUUGUAC, em que cada U pode ser opcional e independentemente substituído por T, e em que a composição é quiralmente controlada de modo opcional. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição de um oligonucleotídeo que tem uma sequência de base que é ou compreende UUCUGAAGGUGUUCUUGUAC, UCUGAAGGUGUUCUUGUAC, CUGAAGGUGUUCUUGUAC, UGAAGGUGUUCUUGUAC, GAAGGUGUUCUUGUAC, AAGGUGUUCUUGUAC, UUCUGAAGGUGUUCUUGUA, UUCUGAAGGUGUUCUUGU, UUCUGAAGGUGUUCUUG, UUCUGAAGGUGUUCUU, UUCUGAAGGUGUUCU, UCUGAAGGUGUUCUUGUA, UCUGAAGGUGUUCUUGU, UCUGAAGGUGUUCUUG, UCUGAAGGUGUUCUU, CUGAAGGUGUUCUUGUA, CUGAAGGUGUUCUUGU, CUGAAGGUGUUCUUG, UGAAGGUGUUCUUGU ou UGAAGGUGUUCUUGUA, em que cada U pode ser opcional e independentemente substituído por T, e em que a composição é quiralmente controlada de modo opcional.
[0091] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece a composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada de um oligonucleotídeo selecionado dentre qualquer uma das Tabelas. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada de um oligonucleotídeo selecionado dentre qualquer uma das Tabelas, em que o oligonucleotídeo é conjugado com um lipídio ou uma porção química de alvejamento.
[0092] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo tem pelo menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 bases de comprimento, e opcionalmente não mais que 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 ou 60 bases de comprimento. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo tem não mais que 25 bases de comprimento. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo tem não mais que 30 bases de comprimento. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo tem não mais que 35 bases de comprimento. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo tem não mais que 40 bases de comprimento. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo tem não mais que 45 bases de comprimento. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo tem não mais que 50 bases de comprimento. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo tem não mais que 55 bases de comprimento. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo tem não mais que 60 bases de comprimento. Em algumas modalidades, cada base é independentemente A, T, C, G ou U opcionalmente substituído, ou um tautômero opcionalmente substituído de A, T, C, G ou U
[0093] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos compreendem porções químicas adicionais além de suas cadeias de oligonucleotídeo (cadeias principais e bases de oligonucleotídeo), por exemplo, porções químicas de lipídio, porções químicas de alvejamento, etc. Em algumas modalidades, um lipídio é um ácido graxo. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo é conjugado com um ácido graxo. Em algumas modalidades, um ácido graxo compreende 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais átomos de carbono.
[0094] Em algumas modalidades, um lipídio é ácido esteárico ou ácido turbinárico. Em algumas modalidades, um lipídio é ácido esteárico. Em algumas modalidades, um lipídio é ácido turbinárico.
[0095] Em algumas modalidades, um lipídio compreende um grupo alifático saturado ou parcialmente insaturado C10-C80, C10-C60 ou C10-C40 opcionalmente substituído, em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por C1–C6 alquileno, C1–C6 alquenileno, , uma porção química heteroalifática C1– C6, −C(R′)2–, –Cy–, –O–, –S–, –S–S–, −N(R′)–, −C(O)–, –C(S)–, – C(NR′)–, –C(O)N(R′)–, −N(R′)C(O)N(R′)-, –N(R′)C(O)–, –N(R′)C(O)O– , −OC(O)N(R′)-, –S(O)–, –S(O)2–, −S(O)2N(R′)–, −N(R′)S(O)2–, – SC(O)–, –C(O)S–, –OC(O)–, e −C(O)O–, em que cada variável é independentemente conforme definido e descrito no presente documento.
[0096] Em algumas modalidades, um lipídio é selecionado dentre o grupo que consiste em: ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido oleico, ácido linoleico, ácido alfa-linolênico, ácido gama- linolênico, ácido docosa-hexanoico (DHA ou cis-DHA), ácido turbinárico e dilinoleíla.
[0097] Em algumas modalidades, um lipídio é conjugado a uma cadeia de oligonucleotídeo, opcionalmente através de uma ou mais porções químicas de ligante. Em algumas modalidades, um lipídio não é conjugado a uma cadeia de oligonucleotídeo.
[0098] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido é conjugado, opcionalmente através de um ligante, a uma porção química, por exemplo, uma porção química de lipídio, uma porção química de peptídeo, uma porção química de alvejamento, uma porção química de carboidrato, uma porção química de sulfonamida, um anticorpo ou um fragmento do mesmo. Em algumas modalidades, um composto fornecido, por exemplo, um oligonucleotídeo, tem a estrutura de: Ac−[−LLD−(RLD)a]b, Ac−[−LM−(RD)a]b, [(Ac)a−LM]b−RD, (Ac)a−LM−(Ac)b, ou (Ac)a−LM−(RD)b, ou um sal do mesmo, em que: Ac é uma cadeia de oligonucleotídeo (por exemplo, H−Ac, [H]a−Ac ou [H]b−Ac é um oligonucleotídeo); A é 1 a 1.000; b é 1 a 1.000; cada um dentre LLD e LM é independentemente uma porção química de ligante; RLD é uma porção química de lipídio; e cada RD é independentemente uma porção química de lipídio ou uma porção química de alvejamento.
[0099] Em algumas modalidades, um composto fornecido, por exemplo, um oligonucleotídeo, tem a estrutura de: Ac−[−LLD−(RLD)a]b, Ac−[−LM−(RD)a]b, [(Ac)a−LM]b−RD, (Ac)a−LM−(Ac)b, ou (Ac)a−LM−(RD)b, ou um sal do mesmo, em que: Ac é uma cadeia de oligonucleotídeo (por exemplo, H−Ac, [H]a−Ac ou [H]b−Ac é um oligonucleotídeo);
A é 1 a 1.000; b é 1 a 1.000; cada RD é independentemente RLD, RCD ou RTD; RCD é um grupo linear ou ramificado opcionalmente substituído selecionado dentre um grupo alifático C1-100 e um grupo heteroalifático C1-100 tendo 1 a 30 heteroátomos, em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por C1-6 alquileno, C1-6 alquenileno, , um grupo heteroalifático bivalente C1–C6 tendo 1 a 5 heteroátomos, −C(R')2−, −Cy−, −O−, −S−, −S−S−, −N(R')−, −C(O)−, −C(S)−, −C(NR')−, −C(O)N(R')−, −N(R')C(O)N(R')−, −N(R')C(O)O−, −S(O)−, −S(O)2−, −S(O)2N(R')−, −C(O)S−, −C(O)O−, −P(O)(OR')−, −P(O)(SR')−, −P(O)(R')−, −P(O)(NR')−, −P(S)(OR')−, −P(S)(SR')−, −P(S)(R')−, −P(S)(NR')−, −P(R')−, −P(OR')−, −P(SR')−, −P(NR')−, −P(OR')[B(R')3]−, −OP(O)(OR')O−, −OP(O)(SR')O−, −OP(O)(R')O−, −OP(O)(NR')O−, −OP(OR')O−, −OP(SR')O−, −OP(NR')O−, −OP(R')O−, ou −OP(OR')[B(R')3]O−; e um ou mais CH ou átomos de carbono são opcional e independentemente substituídos por CyL; RLD é um grupo alifático C1-100 linear ou ramificado opcionalmente substituído, em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por C1- 6 alquileno, C1-6 alquenileno, , −C(R')2−, −Cy−, −O−, −S−, −S−S−, −N(R')−, −C(O)−, −C(S)−, −C(NR')−, −C(O)N(R')−, −N(R')C(O)N(R')−, −N(R')C(O)O−, −S(O)−, −S(O)2−, −S(O)2N(R')−, −C(O)S−, −C(O)O−, −P(O)(OR')−, −P(O)(SR')−, −P(O)(R')−, −P(O)(NR')−, −P(S)(OR')−, −P(S)(SR')−, −P(S)(R')−, −P(S)(NR')−, −P(R')−, −P(OR')−, −P(SR')−, −P(NR')−, −P(OR')[B(R')3]−, −OP(O)(OR')O−, −OP(O)(SR')O−, −OP(O)(R')O−, −OP(O)(NR')O−, −OP(OR')O−, −OP(SR')O−, −OP(NR')O−, −OP(R')O−,
ou −OP(OR')[B(R')3]O−; e um ou mais CH ou átomos de carbono são opcional e independentemente substituídos por CyL; RTD é uma porção química de alvejamento; cada um dentre LLD e LM é independentemente um grupo de ligação covalente, ou bivalente ou multivalente linear ou ramificado opcionalmente substituído selecionado dentre um grupo alifático C1-100 e um grupo heteroalifático C1-100 tendo 1 a 30 heteroátomos, em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por C1-6 alquileno, C1-6 alquenileno, , um grupo heteroalifático bivalente C1–C6 tendo 1 a 5 heteroátomos, −C(R')2−, −Cy−, −O−, −S−, −S−S−, −N(R')−, −C(O)−, −C(S)−, −C(NR')−, −C(O)N(R')−, −N(R')C(O)N(R')−, −N(R')C(O)O−, −S(O)−, −S(O)2−, −S(O)2N(R')−, −C(O)S−, −C(O)O−, −P(O)(OR')−, −P(O)(SR')−, −P(O)(R')−, −P(O)(NR')−, −P(S)(OR')−, −P(S)(SR')−, −P(S)(R')−, −P(S)(NR')−, −P(R')−, −P(OR')−, −P(SR')−, −P(NR')−, −P(OR')[B(R')3]−, −OP(O)(OR')O−, −OP(O)(SR')O−, −OP(O)(R')O−, −OP(O)(NR')O−, −OP(OR')O−, −OP(SR')O−, −OP(NR')O−, −OP(R')O−, ou −OP(OR')[B(R')3]O−; e um ou mais CH ou átomos de carbono são opcional e independentemente substituídos por CyL; cada −Cy− é independentemente um grupo bivalente opcionalmente substituído selecionado dentre um anel cicloalifático C3-20, um anel C6-20 arila, um anel heteroarila com 5 a 20 membros tendo 1 a 10 heteroátomos, e um anel heterociclila com 3 a 20 membros tendo 1 a 10 heteroátomos; cada CyL é independentemente um grupo trivalente ou tetravalente opcionalmente substituído selecionado dentre um anel cicloalifático C3-20, um anel C6-20 arila, um anel heteroarila com 5 a 20 membros tendo 1 a 10 heteroátomos, e um anel heterociclila com 3 a 20 membros tendo 1 a 10 heteroátomos; cada R' é independentemente −R, −C(O)R, −C(O)OR, ou −S(O)2R; e cada R é independentemente −H, ou um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre C1-30 alifático, C1-30 heteroalifático tendo 1 a 10 heteroátomos, C6-30 arila, C6- 30 arilalifático, C6-30 aril-heteroalifático tendo 1 a 10 heteroátomos, heteroarila com 5 a 30 membros tendo 1 a 10 heteroátomos, e heterociclila com 3 a 30 membros tendo 1 a 10 heteroátomos, ou dois grupos R são opcional e independentemente tomados em conjunto para formar uma ligação covalente, ou dois ou mais grupos R no mesmo átomo são opcional e independentemente tomados em conjunto com o átomo para formar um anel monocíclico, bicíclico ou policíclico com 3 a 30 membros opcionalmente substituído tendo, além do átomo, 0 a 10 heteroátomos, ou dois ou mais grupos R em dois ou mais átomos são opcional e independentemente tomados em conjunto com seus átomos intervenientes para formar um anel monocíclico, bicíclico ou policíclico com 3 a 30 membros opcionalmente substituído tendo, além dos átomos intervenientes, 0 a 10 heteroátomos.
[00100] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição de oligonucleotídeo que compreende uma pluralidade de oligonucleotídeos, cada um tendo a estrutura de: Ac−[−LLD−(RLD)a]b, Ac−[−LM−(RD)a]b, [(Ac)a−LM]b−RD, (Ac)a−LM−(Ac)b, ou (Ac)a−LM−(RD)b, ou um sal do mesmo.
[00101] Em algumas modalidades, [H]b-Ac (em que b é 1 a 1.000) é um oligonucleotídeo de qualquer uma das Tabelas. Em algumas modalidades, [H]b-Ac é um oligonucleotídeo da Tabela A1.
[00102] Em algumas modalidades, a é 1 a 100. Em algumas modalidades, a é 1 a 50. Em algumas modalidades, a é 1 a 40. Em algumas modalidades, a é 1 a 30. Em algumas modalidades, a é 1 a 20. Em algumas modalidades, a é 1 a 15. Em algumas modalidades, a é 1 a 10. Em algumas modalidades, a é 1 a 9. Em algumas modalidades, a é 1 a 8. Em algumas modalidades, a é 1 a 7. Em algumas modalidades, a é 1 a 6. Em algumas modalidades, a é 1 a 5. Em algumas modalidades, a é 1 a 4. Em algumas modalidades, a é 1 a 3. Em algumas modalidades, a é 1 a 2. Em algumas modalidades, a é 1. Em algumas modalidades, a é 2. Em algumas modalidades, a é 3. Em algumas modalidades, a é 4. Em algumas modalidades, a é 5. Em algumas modalidades, a é 6. Em algumas modalidades, a é 7. Em algumas modalidades, a é 8. Em algumas modalidades, a é 9. Em algumas modalidades, a é 10. Em algumas modalidades, a é mais de 10. Em algumas modalidades, b é 1 a 100. Em algumas modalidades, b é 1 a 50. Em algumas modalidades, b é 1 a 40. Em algumas modalidades, b é 1 a 30. Em algumas modalidades, b é 1 a 20. Em algumas modalidades, b é 1 a 15. Em algumas modalidades, b é 1 a 10. Em algumas modalidades, b é 1 a 9. Em algumas modalidades, b é 1 a 8. Em algumas modalidades, b é 1 a 7. Em algumas modalidades, b é 1 a 6. Em algumas modalidades, b é 1 a 5. Em algumas modalidades, b é 1 a 4. Em algumas modalidades, b é 1 a 3. Em algumas modalidades, b é 1 a 2. Em algumas modalidades, b é 1. Em algumas modalidades, b é 2. Em algumas modalidades, b é 3. Em algumas modalidades, b é 4. Em algumas modalidades, b é 5. Em algumas modalidades, b é 6. Em algumas modalidades, b é 7. Em algumas modalidades, b é 8. Em algumas modalidades, b é 9. Em algumas modalidades, b é 10. Em algumas modalidades, b é mais de 10. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo tem a estrutura de Ac−LLD−RLD. Em algumas modalidades, Ac é configurado através de uma ou mais de suas porções químicas de açúcar, de base e/ou ligação internucleotídica. Em algumas modalidades, Ac é conjugado através de seu 5'-OH (5'-O-). Em algumas modalidades, Ac é conjugado através de seu 3'-OH (3'-O-). Em algumas modalidades, antes da conjugação, Ac-(H)b (b é um número inteiro de 1 a
1.000 dependendo da valência de Ac) é um oligonucleotídeo conforme descrito no presente documento, por exemplo, um daqueles descritos em qualquer uma das Tabelas. Em algumas modalidades, LM é −L−. Em algumas modalidades, LM compreende um grupo fosforotioato. Em algumas modalidades, LM é −C(O)NH−(CH2)6−OP(=O)(S−)−O−. Em algumas modalidades, a extremidade −C(O)NH é conectada a RLD, e a extremidade −O− é conectada ao oligonucleotídeo, por exemplo, através da extremidade 5' ou 3'. Em algumas modalidades, RLD é C10, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23, C24, ou C25 a C20, C21, C22, C23, C24, C25, C26, C27, C28, C29, C30, C35, C40, C45, C50, C60, C70, ou C80 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, RLD é C10-80 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, RLD é C20-80 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, RLD é C10-70 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, RLD é C20-70 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, RLD é C10-60 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, RLD é C20-60 alifático opcionalmente substituído.
Em algumas modalidades, RLD é C10-50 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, RLD é C20-50 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, RLD é C10-40 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, RLD é C20-40 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, RLD é C10-30 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, RLD é C20-30 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, RLD é C10, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23, C24, ou C25 a C20, C21, C22, C23, C24, C25, C26, C27, C28, C29, C30, C35, C40, C45, C50, C60, C70, ou C80 alifático não substituído. Em algumas modalidades, RLD é C10-80 alifático não substituído. Em algumas modalidades, RLD é C20-80 alifático não substituído. Em algumas modalidades, RLD é C10-70 alifático não substituído. Em algumas modalidades, RLD é C20-70 alifático não substituído. Em algumas modalidades, RLD é C10-60 alifático não substituído. Em algumas modalidades, RLD é C20-60 alifático não substituído. Em algumas modalidades, RLD é C10-50 alifático não substituído. Em algumas modalidades, RLD é C20-50 alifático não substituído. Em algumas modalidades, RLD é C10-40 alifático não substituído. Em algumas modalidades, RLD é C20-40 alifático não substituído. Em algumas modalidades, RLD é C10-30 alifático não substituído. Em algumas modalidades, RLD é C20-30 alifático não substituído.
[00103] Em algumas modalidades, a incorporação de uma porção química de lipídio em um oligonucleotídeo aprimora pelo menos uma propriedade do oligonucleotídeo em comparação com um oligonucleotídeo idêntico, de outro modo, sem a porção química de lipídio. Em algumas modalidades, as propriedades aprimoradas incluem atividade aumentada (por exemplo, capacidade aumentada para induzir o salto desejável de um éxon prejudicial), toxicidade diminuída e/ou distribuição aprimorada para um tecido. Em algumas modalidades, um tecido é tecido muscular. Em algumas modalidades, um tecido é músculo esquelético, gastrocnêmio, tríceps, coração ou diafragma. Em algumas modalidades, as propriedades aprimoradas incluem atividade agonista de hTLR9 reduzida. Em algumas modalidades, as propriedades aprimoradas incluem atividade antagonista de hTLR9. Em algumas modalidades, as propriedades aprimoradas incluem atividade antagonista de hTLR9 aumentada.
[00104] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo ou composição de oligonucleotídeo é: um oligonucleotídeo DMD ou composição de oligonucleotídeo; um oligonucleotídeo ou composição de oligonucleotídeo que compreende uma ligação internucleotídica não negativamente carregada; ou um oligonucleotídeo DMD que compreende uma ligação internucleotídica não negativamente carregada.
[00105] Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a uma composição que compreende um oligonucleotídeo DMD que compreende pelo menos uma ligação internucleotídica fosforotioato quiralmente controlada na configuração Rp ou Sp, pelo menos uma ligação internucleotídica fosfato natural, e pelo menos uma ligação internucleotídica não negativamente carregada. Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a uma composição que compreende um oligonucleotídeo DMD que compreende pelo menos uma ligação internucleotídica fosforotioato, pelo menos uma ligação internucleotídica fosfato natural, e pelo menos uma ligação internucleotídica não negativamente carregada. Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a uma composição que compreende um oligonucleotídeo DMD que compreende pelo menos uma ligação internucleotídica fosforotioato, pelo menos uma ligação internucleotídica fosfato natural, e pelo menos uma ligação internucleotídica quiralmente controlada não negativamente carregada. Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a uma composição que compreende um oligonucleotídeo DMD que compreende pelo menos uma ligação internucleotídica fosforotioato quiralmente controlada na configuração Rp ou Sp, pelo menos uma ligação internucleotídica fosfato natural, e pelo menos uma ligação internucleotídica quiralmente controlada não negativamente carregada.
[00106] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo DMD (por exemplo, um oligonucleotídeo cuja sequência de base contém não mais que 5, 4, 3, 2 ou 1 disparidades quando se hibridiza com uma porção de uma transcrição DMD ou uma sequência genética DMD que tem o mesmo comprimento) tem capacidade para mediar o salto de um ou mais éxons da transcrição de Distrofina.
[00107] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo DMD tem uma sequência de base que consiste na sequência de base de um oligonucleotídeo exemplificativo revelado no presente documento (por exemplo, um oligonucleotídeo listado em uma Tabela), ou uma sequência de base que compreende uma porção de 15 bases de um nucleotídeo oligonucleotídeo exemplificativo descrito no presente documento. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo DMD tem um comprimento de 15 a 50 bases.
[00108] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo compreende uma modificação de nucleobase, uma modificação de açúcar e/ou uma ligação internucleotídica. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo DMD tem um padrão de modificações de nucleobase, modificações de açúcar, e/ou ligações internucleotídicas de um oligonucleotídeo exemplificativo descrito no presente documento (ou qualquer porção do mesmo que tenha um comprimento de pelo menos 5 bases).
[00109] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo compreende uma modificação de nucleobase que é BrU.
[00110] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo compreende uma modificação de açúcar que é 2'-OMe, 2'-F, 2'-MOE ou LNA.
[00111] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo compreende uma ligação internucleotídica que é uma ligação fosfato natural ou uma ligação internucleotídica fosforotioato. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica fosforotioato não é quiralmente controlada. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica fosforotioato é uma ligação internucleotídica quiralmente controlada (por exemplo, Sp ou Rp).
[00112] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo compreende uma ligação internucleotídica não negativamente carregada. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo DMD compreende uma ligação internucleotídica neutra. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica neutra é ou compreende uma porção química de triazol, alcino ou guanidina cíclica.
[00113] Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica que compreende uma porção química de triazol (por exemplo, um grupo triazolila opcionalmente substituído)
em um oligonucleotídeo fornecido, por exemplo, um oligonucleotídeo DMD, tem a estrutura de: . Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica que compreende uma porção química de triazol tem a fórmula de , em que W é O ou S. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica que compreende uma porção química de alcino (por exemplo, um grupo alquinila opcionalmente substituído) tem a fórmula de: , em que W é O ou S. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica compreende uma porção química de guanidina. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica compreende uma porção química de guanidina cíclica. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica que compreende uma porção química de guanidina cíclica tem a estrutura de: . Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica neutra ou ligação internucleotídica que compreende uma porção química de guanidina cíclica é estereoquimicamente controlada.
[00114] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo DMD compreende uma porção química de lipídio. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica compreende um grupo Tmg ( ). Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica compreende um grupo Tmg e tem a estrutura de (a “ligação internucleotídica Tmg”). Em algumas modalidades, as ligações internucleotídicas neutras incluem ligações internucleotídicas de PNA e PMO, e uma ligação internucleotídica Tmg.
[00115] Em geral, as propriedades das composições de oligonucleotídeo conforme descrito no presente documento podem ser avaliadas com o uso de qualquer ensaio adequado. A toxicidade relativa e/ou propriedades de ligação de proteína para composições diferentes (por exemplo, estereocontroladas versus não estereocontroladas e/ou composições estereocontroladas diferentes) são tipicamente determinadas de modo desejável no mesmo ensaio, em algumas modalidades, de modo substancialmente simultâneo e, em algumas modalidades, com referência aos resultados históricos.
[00116] Aqueles versados na técnica estarão cientes e/ou serão prontamente capazes de desenvolver ensaios adequados para composições de oligonucleotídeo particulares. A presente revelação fornece descrições de determinados ensaios particulares, por exemplo, que podem ser úteis na avaliação de um ou mais recursos do comportamento da composição de oligonucleotídeo, por exemplo, ativação de complemento, inflamação no sítio de injeção, ligação de proteína, etc.
[00117] Por exemplo, determinados ensaios que podem ser úteis na avaliação de toxicidade e/ou propriedades de ligação de proteína das composições de oligonucleotídeo podem incluir qualquer ensaio descrito e/ou exemplificado no presente documento.
[00118] Entre outros fatores, em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição de oligonucleotídeo, que compreende uma pluralidade de oligonucleotídeos de um tipo de oligonucleotídeo particular definido por: 1) sequência de base; 2) padrão de ligações de cadeia principal; 3) padrão de centros quirais de cadeia principal; e 4) padrão de modificações de fósforo de cadeia principal, em que: os oligonucleotídeos da pluralidade compreendem pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 ligações internucleotídicas quiralmente controladas; e sendo que a composição de oligonucleotídeo é caracterizada pelo fato de que, quando entra em contato com uma transcrição em um sistema de splicing de transcrição, o splicing da transcrição é alterado em relação àquele observado sob a condição de referência selecionada dentre o grupo que consiste na ausência da composição, presença de uma composição de referência, e combinações dos mesmos.
[00119] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição que compreende uma pluralidade de oligonucleotídeos de um tipo de oligonucleotídeo particular definido por: 1) sequência de base;
2) padrão de ligações de cadeia principal; 3) padrão de centros quirais de cadeia principal; e 4) padrão de modificações de fósforo de cadeia principal, cuja composição é quiralmente controlada e é enriquecida, em relação a uma preparação substancialmente racêmica de oligonucleotídeos tendo a mesma sequência de base, padrão de ligações de cadeia principal e padrão de modificações de fósforo de cadeia principal, para oligonucleotídeos do tipo de oligonucleotídeo particular, em que: a composição de oligonucleotídeo é caracterizada pelo fato de que, quando entra em contato com uma transcrição in a sistema de splicing de transcrição, o splicing da transcrição é alterado pelo fato de que o nível de salto de um éxon é aumentado em relação àquele observado sob uma condição de referência selecionada dentre o grupo que consiste na ausência da composição, presença de uma composição de referência, e combinações dos mesmos.
[00120] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição que compreende uma pluralidade de oligonucleotídeos de um tipo de oligonucleotídeo particular definido por: 1) sequência de base; 2) padrão de ligações de cadeia principal; e 3) padrão de modificações de fósforo de cadeia principal, em que: os oligonucleotídeos da pluralidade compreendem pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 ligações internucleotídicas não negativamente carregadas; a composição de oligonucleotídeo é caracterizada pelo fato de que, quando entra em contato com uma transcrição in a sistema de splicing de transcrição, o splicing da transcrição é alterado pelo fato de que o nível de salto de um éxon é aumentado em relação àquele observado sob uma condição de referência selecionada dentre o grupo que consiste na ausência da composição, presença de uma composição de referência, e combinações dos mesmos.
[00121] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição que compreende uma pluralidade de oligonucleotídeos de um tipo de oligonucleotídeo particular definido por: 1) sequência de base; 2) padrão de ligações de cadeia principal; e 3) padrão de modificações de fósforo de cadeia principal, em que: os oligonucleotídeos da pluralidade compreendem: 1) uma região de extremidade 5' que compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais unidades de nucleosídeo que compreendem uma porção química de açúcar modificada 2'-F; 2) uma região de extremidade 3' que compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais unidades de nucleosídeo que compreendem uma porção química de açúcar modificada 2'-F; e 3) uma região intermediária entre a região de extremidade 5' e a região 3' que compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais unidades nucleotídicas que compreendem uma ligação fosfodiéster.
[00122] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição que compreende uma pluralidade de oligonucleotídeos de um tipo de oligonucleotídeo particular definido por: 1) sequência de base; 2) padrão de ligações de cadeia principal; 3) padrão de centros quirais de cadeia principal; e 4) padrão de modificações de fósforo de cadeia principal, em que: os oligonucleotídeos da pluralidade compreendem pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 ligações internucleotídicas quiralmente controladas; e os oligonucleotídeos da pluralidade compreendem pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 ligações internucleotídicas não negativamente carregadas.
[00123] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição que compreende uma pluralidade de oligonucleotídeos de um tipo de oligonucleotídeo particular definido por: 1) sequência de base; 2) padrão de ligações de cadeia principal; 3) padrão de centros quirais de cadeia principal; e 4) padrão de modificações de fósforo de cadeia principal, em que: os oligonucleotídeos da pluralidade compreendem colesterol; L-carnitina (ligação amida e carbamato); ácido fólico; lipídio clivável (ligação 1,2-dilaurina e éster);
aglutinante receptor de insulina; ácido gambógico; CPP; glicose (tri e hexantenária); ou manose (tri e hexantenária, alfa e beta).
[00124] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição farmacêutica que compreende um oligonucleotídeo ou uma composição de oligonucleotídeo da presente revelação e um carreador farmaceuticamente aceitável.
[00125] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece um método para alterar o splicing de uma transcrição alvo, que compreende administrar uma composição de oligonucleotídeo da presente revelação. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece um método para reduzir o nível de uma transcrição ou um produto da mesma, que compreende administrar uma composição de oligonucleotídeo da presente revelação. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece um método para aumentar o nível de uma transcrição ou um produto da mesma, que compreende administrar uma composição de oligonucleotídeo da presente revelação. Um método para tratar distrofia muscular, distrofia muscular de Duchenne (Duchenne) (DMD), ou distrofia muscular de Becker (Becker) (BMD), que compreende administrar a um indivíduo suscetível à mesma ou que sofre da mesma, uma composição descrita na presente revelação.
[00126] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece um método para tratar distrofia muscular, distrofia muscular de Duchenne (Duchenne) (DMD), ou distrofia muscular Becker (Becker) (BMD), que compreende administrar a um indivíduo suscetível à mesma ou que sofre da mesma, uma composição que compreende qualquer oligonucleotídeo DMD revelado no presente documento.
[00127] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece um método para tratar distrofia muscular, distrofia muscular de Duchenne (Duchenne) (DMD), ou distrofia muscular de Becker (Becker) (BMD), que compreende (a) administrar a um indivíduo suscetível à mesma ou que sofre da mesma, uma composição que compreende qualquer oligonucleotídeo revelado no presente documento, e (b) administrar ao indivíduo tratamento adicional que tem capacidade para prevenir, tratar, melhorar ou retardar o progresso da distrofia muscular, distrofia muscular de Duchenne (Duchenne) (DMD) ou distrofia muscular de Becker (Becker) (BMD).
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[00128] Figura 1 A Figura 1 mostra um exemplo de salto de múltiplos éxons.
[00129] Figura 2 A Figura 2 mostra um desenho de um método para detectar salto de múltiplos éxons.
[00130] Figura 3 A Figura 3 ilustra várias estratégias para salto de múltiplos éxons. Definições
[00131] Conforme usado no presente documento, as seguintes definições devem se aplicar a menos que indicado de outro modo. Para os propósitos desta revelação, os elementos químicos são identificados de acordo com a Tabela Periódica dos Elementos, versão CAS, Handbook of Chemistry and Physics, 75ª Ed. Adicionalmente, os princípios gerais da química orgânica são descritos em "Organic Chemistry", Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito: 1999, e "March's Advanced Organic Chemistry", 5ª Ed., Ed.: Smith, M.B. and March, J., John Wiley & Sons, New York: 2001.
[00132] Alifático: O termo “alifático” ou
“grupo alifático”, conforme usado no presente documento, significa uma cadeia de hidrocarboneto de cadeia linear (isto é, não ramificada) ou ramificada, substituída ou não substituída que é completamente saturada ou que contém uma ou mais unidades de insaturação, ou um hidrocarboneto monocíclico ou bicíclico ou policíclico que é completamente saturado ou que contém uma ou mais unidades de insaturação, porém que não é aromático (também denominado no presente documento como “carbociclo”, “cicloalifático” ou “cicloalquila”), ou combinações dos mesmos.
Em algumas modalidades, os grupos alifáticos contêm 1 a 100 átomos de carbono alifáticos.
Em algumas modalidades, os grupos alifáticos contêm 1 a 20 átomos de carbono alifáticos.
Em outras modalidades, os grupos alifáticos contêm 1 a 10 átomos de carbono alifáticos.
Em outras modalidades, os grupos alifáticos contêm 1 a 9 átomos de carbono alifáticos.
Em outras modalidades, os grupos alifáticos contêm 1 a 8 átomos de carbono alifáticos.
Em outras modalidades, os grupos alifáticos contêm 1 a 7 átomos de carbono alifáticos.
Em outras modalidades, os grupos alifáticos contêm 1 a 6 átomos de carbono alifáticos.
Em ainda outras modalidades, os grupos alifáticos contêm 1 a 5 átomos de carbono alifáticos e, em ainda outras modalidades, os grupos alifáticos contêm 1, 2, 3 ou 4 átomos de carbono alifáticos.
Em algumas modalidades, “cicloalifático” (ou “carbociclo” ou “cicloalquila) se refere a um hidrocarboneto monocíclico ou bicíclico ou policíclico que é completamente saturado ou que contém uma ou mais unidades de insaturação, porém que não é aromático.
Em algumas modalidades, "cicloalifático" (ou "carbociclo" ou "cicloalquila") se refere a um hidrocarboneto C3–C6 monocíclico que é completamente saturado ou que contém uma ou mais unidades de insaturação, porém que não é aromático. Os grupos alifáticos adequados incluem, porém sem limitação, grupos alquila, alquenila, alquenila lineares ou ramificados, substituídos ou não substituídos e híbridos dos mesmos, tal como (cicloalquil)alquila, (cicloalquenil)alquila ou (cicloalquil)alquenila.
[00133] Alquenila: Conforme usado no presente documento, o termo "alquenila" se refere a um grupo alifático, conforme definido no presente documento, tendo uma ou mais ligações duplas.
[00134] Alquila: Conforme usado no presente documento, ao termo "alquila” é dado seu significado comum na técnica e pode incluir grupos alifáticos saturados, incluindo grupos alquila de cadeia linear, grupos alquila de cadeia ramificada, grupos cicloalquila (alicíclicos), grupos cicloalquila substituídos com alquila e grupos alquila substituídos com cicloalquila. Em algumas modalidades, uma alquila tem 1 a 100 átomos de carbono. Em determinadas modalidades, uma alquila de cadeia linear ou cadeia ramificada tem cerca de 1 a 20 átomos de carbono em sua cadeia principal (por exemplo, C1-C20 para cadeia linear, C2-C20 para cadeia ramificada), e alternativamente, cerca de 1 a 10. Em algumas modalidades, os anéis cicloalquila têm de cerca de 3 a 10 átomos de carbono em sua estrutura de anel, em que tais anéis são monocíclicos, bicíclicos ou policíclicos, e alternativamente cerca de 5, 6 ou 7 carbonos na estrutura de anel. Em algumas modalidades, um grupo alquila pode ser um grupo alquila inferior, em que um grupo alquila inferior compreende 1 a 4 átomos de carbono (por exemplo, C1-C4 para alquilas inferiores de cadeia linear).
[00135] Alquinila: Conforme usado no presente documento, o termo "alquinila" se refere a um grupo alifático, conforme definido no presente documento, tendo uma ou mais ligações triplas.
[00136] Animal: Conforme usado no presente documento, o termo "animal" se refere qualquer membro do reino animal. Em algumas modalidades, "animal" se refere a seres humanos, em qualquer estágio de desenvolvimento. Em algumas modalidades, "animal" se refere a animais não humanos, em qualquer estágio de desenvolvimento. Em determinadas modalidades, o animal não humano é um mamífero (por exemplo, um roedor, um camundongo, um rato, um coelho, um macaco, um cão, um gato, uma ovelha, gado, um primata e/ou um porco). Em algumas modalidades, os animais incluem, porém sem limitação, mamíferos, pássaros, répteis, anfíbios, peixes e/ou vermes. Em algumas modalidades, um animal pode ser um animal transgênico, um animal geneticamente modificado e/ou um clone.
[00137] Aproximadamente: Conforme usado no presente documento, os termos "aproximadamente" ou "cerca de" em referência a um número são geralmente adotados para incluir membros que sejam abrangidos em uma faixa de 5%, 10%, 15%, ou 20% em qualquer direção (maior que ou menor que) do número, a menos que indicado de outro modo ou evidente de outro modo a partir do contexto (exceto quando tal número for menor que 0% ou exceder 100% de um valor possível). Em algumas modalidades, o uso do termo "cerca de" em referência a dosagens significa ± 5 mg/kg/dia.
[00138] Arila: O termo "arila", conforme usado no presente documento, usado sozinho ou como parte de uma porção química maior como em "aralquila", "aralcóxi" ou
"ariloxialquila", se refere a sistemas de anéis monocíclicos, bicíclicos ou policíclicos tendo um total de, por exemplo, cinco a trinta membros de anel, em que pelo menos um anel no sistema é aromático. Em algumas modalidades, um grupo arila é um sistema de anel monocíclico, bicíclico ou policíclico tendo um total de cinco a quatorze membros de anel, em que pelo menos um anel no sistema é aromático, e em que cada anel no sistema contém 3 a 7 membros de anel. Em algumas modalidades, um grupo arila é um grupo biarila. O termo "arila" pode ser usado de forma intercambiável com o termo "anel arila". Em determinadas modalidades da presente revelação, "arila" se refere um sistema de anel aromático que inclui, porém sem limitação, fenila, bifenila, naftila, binaftila, antracila e similares, que podem conter um ou mais substituintes. Também incluído no escopo do termo "arila", conforme usado no presente documento, encontra- se um anel aromático fundido a um ou mais anéis não aromáticos, tais como indanila, ftalimidila, naftimidila, fenantridinila ou tetra-hidronaftila e similares.
[00139] Sequência característica: Uma "sequência característica" é uma sequência que é encontrada em todos os membros de uma família de polipeptídeos ou ácidos nucleicos e, portanto pode ser usada por aqueles de habilidade comum na técnica para definir os membros da família.
[00140] Comparável: O termo "comparável" é usado no presente documento para descrever dois (ou mais) conjuntos de condições ou circunstâncias que são suficientemente similares entre si para permitir a comparação dos resultados obtidos ou fenômenos observados. Em algumas modalidades, conjuntos de condições ou circunstâncias comparáveis são caracterizados por uma pluralidade de recursos substancialmente idênticos e um ou um pequeno número de recursos variados. Aqueles de habilidade comum na técnica irão observar que os conjuntos de condições são comparáveis entre si quando caracterizados por um número suficiente e tipo de recursos substancialmente idênticos para garantir uma conclusão razoável de que as diferenças nos resultados obtidos ou fenômenos observados sob os diferentes conjuntos de condições ou circunstâncias são causadas por ou indicativas da variação desses recursos que são variados.
[00141] Cicloalifático: O termo "cicloalifático”, "carbociclo,” "carbociclila", "radical carbocíclico" e "anel carbocíclico", são usados de forma intercambiável, e conforme usado no presente documento, se referem a sistemas de anéis monocíclicos, bicíclicos ou policíclicos alifáticos cíclicos, porém não aromáticos saturados ou parcialmente insaturados, conforme descrito no presente documento, tendo, a menos que especificado de outro modo, de 3 a 30 membros de anel. Os grupos cicloalifáticos incluem, sem limitação, ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ciclopentenila, ciclo-hexila, ciclo-hexenila, ciclo-heptila, ciclo-heptenila, ciclooctila, ciclooctenila, norbornila, adamantila e ciclooctadienila. Em algumas modalidades, um grupo cicloalifático tem 3 a 6 carbonos. Em algumas modalidades, um grupo cicloalifático é saturado e é cicloalquila. O termo "cicloalifático" também pode incluir anéis alifáticos que são fundidos a um ou mais anéis aromáticos ou não aromáticos, tal como deca-hidronaftila ou 1,2,3,4- tetra-hidronaft-1-ila. Em algumas modalidades, um grupo cicloalifático é bicíclico. Em algumas modalidades, um grupo cicloalifático é tricíclico. Em algumas modalidades, um grupo cicloalifático é policíclico. Em algumas modalidades, "cicloalifático" se refere a C3-C6 hidrocarboneto monocíclico, ou C8-C10 hidrocarboneto bicíclico ou policíclico, que é completamente saturado ou que contém uma ou mais unidades de insaturação, porém que não é aromático, ou um C9-C16 hidrocarboneto policíclico que é completamente saturado ou que contém uma ou mais unidades de insaturação, porém que não é aromático.
[00142] Regime de dosagem: Conforme usado no presente documento, um "regime de dosagem" ou "regime terapêutico" se refere a um conjunto de doses unitárias (tipicamente mais de uma) que são administradas individualmente a um indivíduo, tipicamente separadas por períodos de tempo. Em algumas modalidades, um determinado agente terapêutico tem um regime de dosagem recomendado, que pode envolver uma ou mais doses. Em algumas modalidades, um regime de dosagem compreende uma pluralidade de doses, cada uma das quais são separadas umas das outras por um período de tempo da mesma duração; em algumas modalidades, um regime de dosagem compreende uma pluralidade de doses e pelo menos dois períodos de tempo diferentes separando as doses individuais. Em algumas modalidades, todas as doses dentro de um regime de dosagem têm a mesma quantidade de doses unitárias. Em algumas modalidades, doses diferentes dentro de um regime de dosagem são de quantidades diferentes. Em algumas modalidades, um regime de dosagem compreende uma primeira dose em uma primeira quantidade de dose, seguido de uma ou mais doses adicionais em uma segunda quantidade de dose diferente da primeira quantidade de dose. Em algumas modalidades, um regime de dosagem compreende uma primeira dose em uma primeira quantidade de dose, seguido de uma ou mais doses adicionais em uma segunda quantidade igual à primeira quantidade de dose.
[00143] Heteroalifático: O termo "heteroalifático" se refere um grupo alifático em que uma ou mais unidades selecionadas dentre C, CH, CH2, e CH3 são independentemente substituídas por um ou mais heteroátomos. Em algumas modalidades, um grupo heteroalifático é heteroalquila. Em algumas modalidades, um grupo heteroalifático é heteroalquenila.
[00144] Heteroarila: Os termos "heteroarila" e "heteroar", conforme usado no presente documento, usados sozinhos ou como parte de uma porção química maior, por exemplo, "heteroaralquila", ou "heteroaralcóxi", se referem a sistemas de anel monocíclicos, bicíclicos ou policíclicos tendo um total de, por exemplo, cinco a trinta membros de anel, em que pelo menos um um anel no sistema é aromático e pelo menos um átomo de anel aromático é um heteroátomo. Em algumas modalidades, um grupo heteroarila é um grupo que tem 5 a 10 átomos de anel (isto é, monocíclicos, bicíclicos ou policíclicos), em algumas modalidades 5, 6, 9, ou 10 átomos de anel. Em algumas modalidades, um grupo heteroarila tem 6, 10, ou 14 π elétrons compartilhados em uma matriz cíclica; e que tem, além dos átomos de carbono, de um a cinco heteroátomos. Os grupos heteroarila incluem, sem limitação, tienila, furanila, pirrolila, imidazolila, pirazolila, triazolila, tetrazolila, oxazolila, isoxazolila, oxadiazolila, tiazolila, isotiazolila, tiadiazolila, piridila, piridazinila, pirimidinila, pirazinila, indolizinila, purinila, naftiridinila, e pteridinila. Em algumas modalidades, uma heteroarila é um grupo heterobiarila, tal como bipiridila e similares. Os termos "heteroarila" e "heteroar", conforme usado no presente documento, também incluem grupos em que um anel heteroaromático é fundido a um ou mais anéis arila, cicloalifático ou heterociclila, em que o radical ou ponto de ligação é no anel heteroaromático. Os exemplos não limitantes incluem indolila, isoindolila, benzotienila, benzofuranila, dibenzofuranila, indazolila, benzimidazolila, benztiazolila, quinolila, isoquinolila, cinolinila, ftalazinila, quinazolinila, quinoxalinila, 4H–quinolizinila, carbazolila, acridinila, fenazinila, fenotiazinila, fenoxazinila, tetra- hidroquinolinila, tetra-hidroisoquinolinila, e pirido[2,3–b]– 1,4–oxazin–3(4H)–ona. Um grupo heteroarila pode ser monocíclico, bicíclico ou policíclico. O termo "heteroarila" pode ser usado de forma intercambiável com os termos "anel heteroarila", "grupo heteroarila" ou "heteroaromático", qualquer um dos termos incluem anéis que são opcionalmente substituídos. O termo "heteroaralquila" se refere um grupo alquila substituído por um grupo heteroarila, em que as porções alquila e heteroarila são independentemente opcionalmente substituídas.
[00145] Heteroátomo: O termo "heteroátomo" significa um átomo que não é carbono ou hidrogênio. Em algumas modalidades, um heteroátomo é oxigênio, enxofre, nitrogênio, fósforo, boro ou silício (incluindo qualquer forma oxidada de nitrogênio, enxofre, fósforo, ou silício; a forma quaternizada de qualquer nitrogênio básico ou um nitrogênio substituível de um anel heterocíclico (por exemplo, N como em 3,4-di-hidro-2H- pirrolila), NH (como em pirrolidinila) ou NR+ (como em pirrolidinila N-substituída); etc.). Em algumas modalidades, um heteroátomo é boro, nitrogênio, oxigênio, silício, enxofre,
ou fósforo. Em algumas modalidades, um heteroátomo é nitrogênio, oxigênio, silício, enxofre, ou fósforo. Em algumas modalidades, um heteroátomo é nitrogênio, oxigênio, enxofre, ou fósforo. Em algumas modalidades, um heteroátomo é nitrogênio, oxigênio ou enxofre.
[00146] Heterociclo: Conforme usado no presente documento, os termos "heterociclo", "heterociclila", “radical heterocíclico" e "anel heterocíclico", conforme usado no presente documento, são usados de forma intercambiável e referem a uma porção química de anel monocíclico, bicíclico ou policíclico (por exemplo, 3 a 30 membros) que é saturada ou parcialmente insaturada e tem um ou mais átomos de anel de heteroátomo. Em algumas modalidades, um grupo heterociclila é uma porção química heterocíclica estável monocíclica co, 5 a 7 membros ou bicíclica com 7 a 10 membros que é saturada ou parcialmente insaturada, e que tem, além dos átomos de carbono, um ou mais, de preferência um a quatro, heteroátomos, conforme definido acima. quando usado em referência a um átomo de anel de um heterociclo, o termo "nitrogênio" inclui nitrogênio substituído. Como um exemplo, em um anel saturado ou parcialmente insaturado tendo 0 a 3 heteroátomos selecionados dentre oxigênio, enxofre e nitrogênio, o nitrogênio pode ser N (como em 3,4–di-hidro–2H–pirrolila), NH (como em pirrolidinila) ou +NR (como em pirrolidinila N–substituída). Um anel heterocíclico pode ser ligado ao seu grupo pendente em qualquer heteroátomo ou átomo de carbono que resulte em uma estrutura estável e qualquer um dos átomos de anel pode ser opcionalmente substituído. Exemplos de tais radicais heterocíclicos saturados ou parcialmente insaturados incluem, sem limitação, tetra-hidrofuranila, tetra-hidrotienila,
pirrolidinila, piperidinila, pirrolinila, tetra- hidroquinolinila, tetra-hidroisoquinolinila, deca- hidroquinolinila, oxazolidinila, piperazinila, dioxanila, dioxolanila, diazepinila, oxazepinila, tiazepinila, morfolinila e quinuclidinila. Os termos "heterociclo", "heterociclila", "anel heterociclila", "grupo heterocíclico", “porção química heterocíclica" e “radical heterocíclico", são usados de forma intercambiável no presente documento, e também incluem anéis heterociclila fundidos a um ou mais anéis arila, heteroarila ou cicloalifáticos, tal como indolinila, 3H– indolila, cromanila, fenantridinila, ou tetra- hidroquinolinila. Um grupo heterociclila pode ser monocíclico, bicíclico ou policíclico. O termo "heterociclilalquila" se refere a um grupo alquila substituído por uma heterociclila, em que as porções alquila e heterociclila são independentemente opcionalmente substituídas.
[00147] Intraperitoneal: As expressões "administração intraperitoneal" e "administrado intraperitonealmente" conforme usado no presente documento têm seu significado entendido na técnica que se refere à administração de um composto ou composição no peritônio de um indivíduo.
[00148] In vitro: Conforme usado no presente documento, o termo "in vitro" se refere a eventos que ocorrem em um ambiente artificial, por exemplo, em um tubo de ensaio ou vaso de reação, em cultura celular, etc., em vez de dentro de um organismo (por exemplo, animal, planta e/ou micróbio).
[00149] In vivo: Conforme usado no presente documento, o termo "in vivo" se refere a eventos que ocorrem dentro de um organismo (por exemplo, animal, planta e/ou micróbio).
[00150] Alquila inferior: O termo "alquila inferior" se refere um grupo C1-4 alquila linear ou ramificado. Grupos alquila inferiores exemplificativos são metila, etila, propila, isopropila, butila, isobutila e terc-butila.
[00151] Haloalquila Inferior: O termo "haloalquila inferior" se refere um grupo C1-4 alquila linear ou ramificado que é substituído por um ou mais átomos de halogênio.
[00152] Opcionalmente substituído: Conforme descrito no presente documento, compostos da revelação, por exemplo, oligonucleotídeos, lipídios, carboidratos, etc., podem conter porções químicas "opcionalmente substituídas". Em geral, o termo "substituído", seja precedido pelo termo "opcionalmente" ou não, significa que um ou mais hidrogênios da porção química designada são substituídos por um substituinte adequado. A menos que indicado de outro modo, um grupo "opcionalmente substituído" pode ter um substituinte adequado em cada posição substituível do grupo, e quando não mais de uma posição em qualquer determinada estrutura pode ser substituída por mais de um substituinte selecionado dentre um grupo especificado, o substituinte pode ter igual ou diferente em todas as posições. As combinações de substituintes previstas por esta revelação são, de preferência, aquelas que resultam na formação de compostos estáveis ou quimicamente viáveis. O termo "estável", conforme usado no presente documento, se refere a compostos que não são substancialmente alterados quando submetidos a condições para permitir sua produção, detecção, e, in determinadas modalidades, sua recuperação, purificação, e uso para um ou mais dos propósitos revelados no presente documento.
[00153] Os substituintes monovalentes adequados são halogênio; –(CH2)0–4R°; –(CH2)0–4OR°; −O(CH2)0-4Ro, –O–(CH2)0–4C(O)OR°; –(CH2)0–4CH(OR°)2; –(CH2)0–4Ph, que pode ser substituído por R°; −(CH2)0–4O(CH2)0–1Ph que pode ser substituído por R°; –CH=CHPh, que pode ser substituído por R°; –(CH2)0– 4O(CH2)0–1-piridila que pode ser substituído por R°; –NO2; –CN; –N3; -(CH2)0–4N(R°)2; –(CH2)0–4N(R°)C(O)R°; –N(R°)C(S)R°; –(CH2)0– 4N(R°)C(O)N(R°)2; −N(R°)C(S)N(R°)2; –(CH2)0–4N(R°)C(O)OR°; – N(R°)N(R°)C(O)R°; −N(R°)N(R°)C(O)N(R°)2; −N(R°)N(R°)C(O)OR°; – (CH2)0–4C(O)R°; –C(S)R°; –(CH2)0–4C(O)OR°; –(CH2)0–4C(O)SR°; - (CH2)0–4C(O)OSi(R°)3; –(CH2)0–4OC(O)R°; –OC(O)(CH2)0–4SR°, −SC(S)SR°; −(CH2)0–4SC(O)R°; –(CH2)0–4C(O)N(R°)2; –C(S)N(R°)2; – C(S)SR°; −SC(S)SR°, -(CH2)0–4OC(O)N(R°)2; -C(O)N(OR°)R°; – C(O)C(O)R°; –C(O)CH2C(O)R°; −C(NOR°)R°; -(CH2)0–4SSR°; –(CH2)0– 4S(O)2R°; –(CH2)0–4S(O)2OR°; –(CH2)0–4OS(O)2R°; −S(O)2N(R°)2; - (CH2)0–4S(O)R°; –N(R°)S(O)2N(R°)2; –N(R°)S(O)2R°; –N(OR°)R°; −C(NH)N(R°)2; –Si(R°)3; –OSi(R°)3; −P(R°)2; −P(OR°)2; −P(R°)(OR°); −OP(R°)2; −OP(OR°)2; −OP(R°)(OR°); −P[N(R°)2]2 −P(R°)[N(R°)2]; −P(OR°)[N(R°)2]; −OP[N(R°)2]2; −OP(R°)[N(R°)2]; −OP(OR°)[N(R°)2]; −N(R°)P(R°)2; −N(R°)P(OR°)2; −N(R°)P(R°)(OR°); −N(R°)P[N(R°)2]2; −N(R°)P(R°)[N(R°)2]; −N(R°)P(OR°)[N(R°)2]; −B(R°)2; −B(R°)(OR°); −B(OR°)2; −OB(R°)2; −OB(R°)(OR°); −OB(OR°)2; −P(O)(R°)2; −P(O)(R°)(OR°); −P(O)(R°)(SR°); −P(O)(R°)[N(R°)2]; −P(O)(OR°)2; −P(O)(SR°)2; −P(O)(OR°)[N(R°)2]; −P(O)(SR°)[N(R°)2]; −P(O)(OR°)(SR°); −P(O)[N(R°)2]2; −OP(O)(R°)2; −OP(O)(R°)(OR°); −OP(O)(R°)(SR°); −OP(O)(R°)[N(R°)2]; −OP(O)(OR°)2; −OP(O)(SR°)2;
−OP(O)(OR°)[N(R°)2]; −OP(O)(SR°)[N(R°)2]; −OP(O)(OR°)(SR°); −OP(O)[N(R°)2]2; −SP(O)(R°)2; −SP(O)(R°)(OR°); −SP(O)(R°)(SR°); −SP(O)(R°)[N(R°)2]; −SP(O)(OR°)2; −SP(O)(SR°)2; −SP(O)(OR°)[N(R°)2]; −SP(O)(SR°)[N(R°)2]; −SP(O)(OR°)(SR°); −SP(O)[N(R°)2]2; −N(R°)P(O)(R°)2; −N(R°)P(O)(R°)(OR°); −N(R°)P(O)(R°)(SR°); −N(R°)P(O)(R°)[N(R°)2]; −N(R°)P(O)(OR°)2; −N(R°)P(O)(SR°)2; −N(R°)P(O)(OR°)[N(R°)2]; −N(R°)P(O)(SR°)[N(R°)2]; −N(R°)P(O)(OR°)(SR°); −N(R°)P(O)[N(R°)2]2; −P(R°)2[B(R°)3]; −P(OR°)2[B(R°)3]; −P(NR°)2[B(R°)3]; −P(R°)(OR°)[B(R°)3]; −P(R°)[N(R°)2][B(R°)3]; −P(OR°)[N(R°)2][B(R°)3]; −OP(R°)2[B(R°)3]; −OP(OR°)2[B(R°)3]; −OP(NR°)2[B(R°)3]; −OP(R°)(OR°)[B(R°)3]; −OP(R°)[N(R°)2][B(R°)3]; −OP(OR°)[N(R°)2][B(R°)3]; −N(R°)P(R°)2[B(R°)3]; −N(R°)P(OR°)2[B(R°)3]; −N(R°)P(NR°)2[B(R°)3]; −N(R°)P(R°)(OR°)[B(R°)3]; −N(R°)P(R°)[N(R°)2][B(R°)3]; −N(R°)P(OR°)[N(R°)2][B(R°)3]; −P(OR')[B(R')3]−; –(C1–4 alquileno linear ramificado)O–N(R°)2; ou –(C1–4 alquileno linear ou ramificado)C(O)O–N(R°)2, em que cada R° pode ser substituído conforme definido abaixo e é independentemente hidrogênio, C1– 20 alifático, C1–20 heteroalifático tendo 1 a 5 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, enxofre, silício e fósforo, –CH2−(C6-20 arila), –O(CH2)0–1(C6-20 arila), −CH2-(anel heteroarila com 5 a 20 membros tendo 1 a 5 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, enxofre, silício e fósforo), um anel arila saturado ou parcialmente insaturado monocíclico, bicíclico ou policíclico com 5 a 20 membros tendo 0 a 5 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio,
enxofre, silício e fósforo, ou, apesar da definição acima, duas ocorrências independentes de R°, tomadas em conjunto com seu átomo (ou átomos), formam um anel arila saturado ou parcialmente insaturado monocíclico, bicíclico ou policíclico com 3 a 20 membros tendo 0 a 5 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, enxofre, silício e fósforo, que podem ser substituídos conforme definido abaixo.
[00154] Os substituintes monovalentes adequados em R° (ou o anel formado tomando-se duas ocorrências independentes de R° em conjunto com seus átomos intervenientes), são independentemente halogênio, –(CH2)0–2R , –(haloR ), –(CH2)0–2OH, –(CH2)0–2OR , –(CH2)0–2CH(OR )2; −O(haloR ), –CN, –N3, –(CH2)0–2C(O)R , –(CH2)0–2C(O)OH, –(CH2)0– 2C(O)OR , –(CH2)0–2SR , –(CH2)0–2SH, –(CH2)0–2NH2, –(CH2)0–2NHR , – (CH2)0–2NR 2, –NO2, –SiR 3, −OSiR 3, -C(O)SR , –(C1–4 alquileno linear ou ramificado)C(O)OR , ou –SSR em que cada R é não substituído ou em que precedido por “halo” é substituído apenas por um ou mais halogênios, e é independentemente selecionado dentre C1–4 alifático, –CH2Ph, –O(CH2)0–1Ph, e um anel arila saturado ou parcialmente insaturado com 5 a 6 membros tendo 0 a 4 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio e enxofre. Os substituintes divalentes adequados em um átomo de carbono saturado de R° incluem =O e =S.
[00155] Os substituintes divalentes adequados, por exemplo, em um átomo de carbono, átomo de nitrogênio adequados, são independentemente os seguintes: =O, =S, =CR*2, =NNR*2, =NNHC(O)R*, =NNHC(O)OR*, =NNHS(O)2R*, =NR*, =NOR*, –O(C(R*2))2–3O–, ou –S(C(R*2))2–3S–, em que cada R* pode ser substituído conforme definido abaixo e é independentemente hidrogênio, C1–20 alifático, C1–20 heteroalifático tendo 1 a 5 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, enxofre, silício e fósforo, –CH2−(C6-20 arila), – O(CH2)0–1(C6-20 arila), −CH2-(e heteroarila com 5 a 20 membros tendo 1 a 5 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, enxofre, silício e fósforo), um anel arila saturado ou parcialmente insaturado monocíclico, bicíclico ou policíclico com 5 a 20 membros tendo 0 a 5 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, enxofre, silício e fósforo, ou, apesar da definição acima, duas ocorrências independentes de R*, tomadas em conjunto com seu átomo (ou átomos) interveniente, formam um anel arila saturado ou parcialmente insaturado monocíclico, bicíclico ou policíclico com 3 a 20 membros tendo 0 a 5 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, enxofre, silício e fósforo, que podem ser substituídos conforme definido abaixo. Os substituintes divalentes adequados que são ligados aos átomos substituíveis vicinais de um grupo "opcionalmente substituído" incluem: −O(CR*2)2–3O−.
[00156] Os substituintes monovalentes adequados em R* (ou o anel formado tomando-se duas ocorrências independentes de R* em conjunto com seus átomos intervenientes), são independentemente halogênio, –(CH2)0–2R , –(haloR ), –(CH2)0–2OH, –(CH2)0–2OR , –(CH2)0–2CH(OR )2; −O(haloR ), –CN, –N3, –(CH2)0–2C(O)R , –(CH2)0–2C(O)OH, –(CH2)0– 2C(O)OR , –(CH2)0–2SR , –(CH2)0–2SH, –(CH2)0–2NH2, –(CH2)0–2NHR , – (CH2)0–2NR 2, –NO2, –SiR 3, −OSiR 3, -C(O)SR , –(C1–4 alquileno linear ou ramificado)C(O)OR , ou –SSR em que cada R é não substituído ou quando precedido por "halo” é substituído apenas por um ou mais halogênios, e é independentemente selecionado dentre C1–4 alifático, –CH2Ph, –O(CH2)0–1Ph, e um anel arila saturado ou parcialmente insaturado com 5 a 6 membros tendo 0 a 4 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio e enxofre. Os substituintes divalentes adequados em um átomo de carbono saturado de R* incluem =O e =S.
[00157] Em algumas modalidades, os substituintes adequados em um nitrogênio substituível de um grupo "opcionalmente substituído" incluem −R†, −NR†2, −C(O)R†, −C(O)OR†, −C(O)C(O)R†, −C(O)CH2C(O)R†, −S(O)2R†, -S(O)2NR†2, −C(S)NR†2, −C(NH)NR†2, ou −N(R†)S(O)2R†; em que cada R† é independentemente hidrogênio, C1–6 alifático que pode ser substituído conforme definido abaixo, –OPh não substituído, ou um anel arila saturado ou parcialmente insaturado com 5 a 6 membros não substituído tendo 0 a 4 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio ou enxofre, ou, apesar da definição acima, duas ocorrências independentes de R†, tomadas em conjunto com seu átomo (ou átomos) interveniente formam um anel arila mono ou bicíclico saturado ou parcialmente insaturado com 3 a 12 membros não substituído tendo 0 a 4 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio ou enxofre.
[00158] Em algumas modalidades, os substituintes adequados no grupo alifático de R† são independentemente halogênio, −R , -(haloR ), −OH, −OR , −O(haloR ), −CN, −C(O)OH, −C(O)OR , −NH2, −NHR , −NR 2, ou -NO2, em que cada R é não substituído ou quando precedido por "halo" é substituído apenas por um ou mais halogênios, e é independentemente C1–4alifático, –CH2Ph, –O(CH2)0–1Ph, ou um anela arila saturado ou parcialmente insaturado com 5 a 6 membros tendo 0 a 4 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio ou enxofre.
[00159] Oral: As expressões "administração oral" e "administrado oralmente" conforme usado no presente documento têm seu significado entendido na técnica que se refere à administração por via oral de um composto ou composição.
[00160] Parenteral: As expressões "administração parenteral" e "administrado parenteralmente" conforme usado no presente documento têm seu significado entendido na técnica que se refere aos modos de administração diferente s de administração enteral e tópica, geralmente por injeção, e incluem, sem limitação, injeção e infusão intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnoide, intraespinhal e intraesternal.
[00161] Parcialmente insaturado: Conforme usado no presente documento, o termo "parcialmente insaturado" se refere a um porção química de anel que inclui pelo menos uma ligação dupla ou tripla. O termo "parcialmente insaturado" se destina a abranger anéis que têm múltiplos sítios de insaturação, porém não se destina a incluir porções químicas de arila ou heteroarila, conforme definido no presente documento.
[00162] Composição farmacêutica: Conforme usado no presente documento, o termo "composição farmacêutica"
se refere a um agente ativo, formulado em conjunto com um ou mais carreadores farmaceuticamente aceitáveis. Em algumas modalidades, o agente ativo está presente na quantidade de dose unitária adequada para administração em um regime terapêutico que mostra uma probabilidade estatisticamente significativa de obtenção de um efeito terapêutico controlado quando administrado a uma população relevante. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas podem ser especiamente formuladas para administração na forma sólida ou líquida, incluindo aquelas adaptadas para o seguinte: administração oral, por exemplo, drenches (soluções ou suspensões aquosas ou não aquosas), comprimidos, por exemplo, aqueles direcionados para absorção bucal, sublingual e sistêmica, bolus, pós, grânulos, pastas para aplicação na língua; administração parenteral, por exemplo, por injeção subcutânea, intramuscular, intravenosa ou epidural como, por exemplo, uma solução ou suspensão estéril, ou formulação de liberação sustentada; aplicação tópica, por exemplo, como um creme, unguento ou um emplastro de liberação controlada ou aspersão aplicada à pele, pulmões ou cavidade oral; intravaginal ou intrarretalmente, por exemplo, como um pessário, creme ou espuma; sublingualmente; ocularmente; transdermicamente; ou nasalmente, por via pulmonar, e a outras superfícies mucosas.
[00163] Farmaceuticamente aceitável: Conforme usado no presente documento, a expressão "farmaceuticamente aceitável" se refere aqueles compostos, materiais, composições e/ou formas de dosagem que, dentro do escopo do julgamento médico razoável, são adequados para uso em contato com os tecidos de seres humanos e animais sem toxicidade, irritação, resposta alérgica excessiva, ou outro problema ou complicação, proporcional a uma razão benefício/risco razoável.
[00164] Carreador farmaceuticamente aceitável: Conforme usado no presente documento, o termo "carreador farmaceuticamente aceitável" significa um material, composição ou veículo farmaceuticamente aceitável, tal como uma carga líquida ou sólida, diluente, excipiente, ou material de encapsulação de solvente, envolvido no carregamento ou transporte do composto em questão a partir de um órgão, ou parte do corpo, para outro órgão, ou parte do corpo. Cada carreador precisa ser "aceitável" no sentido de ser compatível com outros ingredientes da formulação e não prejudicial para o paciente. Alguns exemplos de materiais que podem servir como carreadores farmaceuticamente aceitáveis incluem: açúcares, tais como lactose, glicose e sacarose; amidos, tais como amido de milho e amido de batata; celulose, e seus derivados, tais como tais como carboximetilcelulose de sódio, etilcelulose e acetato de celulose; tragacanto em pó; malte; gelatina; talco; excipientes, tais como manteiga de cacau e ceras para supositórios; óleos, tais como óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de cártamo, óleo de gergelim, óleo de oliva, óleo de milho e óleo de soja; glicóis, tais como propilenoglicol; polióis, tais como glicerina, sorbitol, manitol e polietilenoglicol; ésteres, tais como oleato de etila e laurato de etila; ágar; agentes de tamponagem, tais como hidróxido de magnésio e hidróxido de alumínio; ácido algínico; água isenta de pirogênio; solução salina isotônica; solução de Ringer; álcool etílico; soluções tamponadas com pH; poliésteres, policarbonatos e/ou polianidridos; e outras substâncias não tóxicas compatíveis empregadas em formulações farmacêuticas.
[00165] Sal farmaceuticamente aceitável: O termo "sal farmaceuticamente aceitável", conforme usado no presente documento, se refere a sais de tais compostos que são adequados para uso em contextos farmacêuticos, isto é, sais que, dentro do escopo do julgamento médico razoável, são adequados para uso em contato com os tecidos de seres humanos e animais inferiores sem toxicidade, irritação, resposta alérgica indevida e similares, e são proporcionais a uma razão benefício/risco razoável. Os sais farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, S. M. Berge, et al. descreve sais farmaceuticamente aceitáveis em detalhes em J. Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19 (1977). Em algumas modalidades, os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, porém sem limitação, sais de adição de ácido não tóxicos, que são sais de um grupo amino formado com ácidos inorgânicos, tais como ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico e ácido perclórico ou com ácidos orgânicos, tais como ácido acético, ácido maleico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido succínico ou ácido malônico ou com o uso de outros métodos usados na técnica, tal como troca iônica. Em algumas modalidades, os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, porém sem limitação, sais adipato, alginato, ascorbato, aspartato, benzenossulfonato, benzoato, bissulfato, borato, butirato, canforato, canforsulfonato, citrato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanossulfonato, formato, fumarato, gluco-heptonato, glicerofosfato, gluconato, hemissulfato, heptanoato, hexanoato, hidroiodeto, 2-hidroxi-etanossulfonato,
lactobionato, lactato, laurato, lauril sulfato, malato, maleato, malonato, metanossulfonato, 2-naftalenossulfonato, nicotinato, nitrato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, estearato, succinato, sulfato, tartrato, tiocianato, p-toluenossulfonato, undecanoato, valerato e similares.
Sais de metais alcalinos ou alcalino terrosos representativos incluem sódio, lítio, potássio, cálcio, magnésio e similares.
Em algumas modalidades, os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, quando adequado, amônio não tóxico, amônio quaternário e cátions de amina formados com o uso de contra-íons, tais como haleto, hidróxido, carboxilato, sulfato, fosfato, nitrato, alquila tendo de 1 a 6 átomos de carbono, sulfonato e sulfonato de arila.
Em algumas modalidades, um composto fornecido compreende um ou mais grupos ácidos, por exemplo, um oligonucleotídeo, e um sal farmaceuticamente aceitável é um sal de metal alcalino ou alcalino terroso, ou amônio (por exemplo, um sal de amônio de N(R)3, em que cada R é independentemente conforme definido e descrito na presente revelação). Sais de metais alcalinos ou alcalino terrosos representativos incluem sais de sódio, lítio, potássio, cálcio, magnésio e similares.
Em algumas modalidades, um sal farmaceuticamente aceitável é um sal de sódio.
Em algumas modalidades, um sal farmaceuticamente aceitável é um sal de potássio.
Em algumas modalidades, um sal farmaceuticamente aceitável é um sal de cálcio.
Em algumas modalidades, os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, quando adequado, amônio não tóxico, amônio quaternário e cátions de amina formados com o uso de contra-íons, tais como haleto, hidróxido, carboxilato, sulfato, fosfato, nitrato,
alquila tendo de 1 a 6 átomos de carbono, sulfonato e sulfonato de arila. Em algumas modalidades, um composto fornecido compreende mais de um grupo ácido, por exemplo, um oligonucleotídeo fornecido pode compreender dois ou mais grupos ácidos (por exemplo, em ligações fosfato naturais e/ou ligações internucleotídicas modificadas). Em algumas modalidades, um sal farmaceuticamente aceitável ou, geralmente um sal, de tal composto compreende dois ou mais cations, que podem ser iguais ou diferentes. Em algumas modalidades, em um sal farmaceuticamente aceitável (ou, geralmente, um sal), cada grupo ácido que tem acidez suficiente existe independentemente como sua forma de sal (por exemplo, em um oligonucleotídeo que compreende ligações fosfato naturais e ligações internucleotídicas fosforotioato, cada uma das ligações fosfato naturais e ligações internucleotídicas fosforotioato existe independentemente como sua forma de sal). Em algumas modalidades, um sal farmaceuticamente aceitável de um oligonucleotídeo é um sal de sódio de um oligonucleotídeo fornecido. Em algumas modalidades, um sal farmaceuticamente aceitável de um oligonucleotídeo é um sal de sódio de um oligonucleotídeo fornecido, em que cada ligação ácida, por exemplo, cada ligação fosfato natural e ligação internucleotídica fosforotioato, existe como uma forma de sal de sódio (todo sal de sódio).
[00166] Grupo protetor: O termo "grupo protetor", conforme usado no presente documento, é bem conhecido na técnica e inclui aqueles descritos em detalhes em Protecting Groups in Organic Synthesis, T. W. Greene e P. G. M. Wuts, 3ª edição, John Wiley & Sons, 1999, cuja totalidade é incorporada ao presente documento a título de referência.
Também são incluídos aqueles grupos protetores especialmente adaptados para química de nucleosídeo e nucleotídeo, por exemplo, aqueles descritos em Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, editado por Serge L.
Beaucage et al. 06/2012, cuja totalidade do Capítulo 2 é incorporada ao presente documento a título de referência.
Os grupos protetores de amino adequados incluem carbamato de metila, carbamato de etila, carbamato de 9–fluorenilmetila (Fmoc), carbamato de 9–(2– sulfo)fluorenilmetila, carbamato de 9–(2,7– dibromo)fluoroenilmetila, carbamato de 2,7–di–t–butil–[9– (10,10–dioxo–10,10,10,10–tetra-hidrotioxantil)]metila (DBD– Tmoc), carbamato de 4–metoxifenacila (Phenoc), carbamato de 2,2,2–tricloroetila (Troc), carbamato de 2–trimetilsililetila (Teoc), carbamato de 2–feniletila (hZ), carbamato de 1–(1– adamantil)–1–metiletila (Adpoc), carbamato de 1,1–dimetil–2– haloetila, carbamato de 1,1–dimetil–2,2–dibromoetila (DB–t– BOC), carbamato de 1,1–dimetil–2,2,2–tricloroetila (TCBOC), carbamato de 1–metil–1–(4–bifenilil)etila (Bpoc), carbamato de 1–(3,5–di–t–butilfenil)–1–metiletila (t–Bumeoc), carbamato de 2–(2'– e 4'–piridil)etila (Pyoc), carbamato de 2–(N,N–diciclo- hexilcarboxamido)etila, carbamato de t–butila (BOC), carbamato de 1–adamantila (Adoc), carbamato de vinila (Voc), carbamato de alila (Alloc), carbamato de 1–isopropilalila (Ipaoc), carbamato de cinamila (Coc), carbamato de 4–nitrocinamila (Noc), carbamato de 8–quinolila, carbamato de N– hidroxipiperidinila, carbamato de alquilditio, carbamato de benzila (Cbz), carbamato de p–metoxibenzila (Moz), carbamato de p–nitobenzila, carbamato de p–bromobenzila, carbamato de p– clorobenzila, carbamato de 2,4–diclorobenzila, carbamato de 4– metilsulfinilbenzila (Msz), carbamato de 9–antrilmetila,
carbamato de difenilmetila, carbamato de 2–metiltioetila, carbamato de 2–metilsulfoniletila, carbamato de 2–(p– toluenossulfonil)etila, carbamato de [2–(1,3–ditianil)]metila (Dmoc), carbamato de 4–metiltiofenila (Mtpc), carbamato de 2,4–dimetiltiofenila (Bmpc), carbamato de 2–fosfonioetila (Peoc), carbamato de 2–trifenilfosfonioisopropila (Ppoc), carbamato de 1,1–dimetil–2–cianoetila, carbamato de m–cloro– p–aciloxibenzila, carbamato de p–(di-hidroxiboril)benzila, carbamato de 5–benzissoxazolilmetila, carbamato de 2– (trifluorometil)–6–cromonilmetila (Tcroc), carbamato de m– nitrofenila, carbamato de 3,5–dimetoxibenzila, carbamato de o– nitrobenzila, carbamato de 3,4–dimetoxi–6–nitrobenzila, carbamato de fenil(o–nitrofenil)metila, derivado de fenotiazinil–(10)–carbonila, derivado de N'–p– toluenossulfonilaminocarbonila, derivado de N'– fenilaminotiocarbonila, carbamato de t–amila, tiocarbamato de S–benzila, carbamato de p–cianobenzila, carbamato de ciclobutila, carbamato de ciclo-hexila, carbamato de ciclopentila, carbamato de ciclopropilmetila, carbamato de p– deciloxibenzila, carbamato de 2,2–dimetoxicarbonilvinila, carbamato de o–(N,N–dimetilcarboxamido)benzila, carbamato de 1,1–dimetil–3–(N,N–dimetilcarboxamido)propila, carbamato de 1,1–dimetilpropinil, carbamato de di(2–piridil)carbamato de metila, carbamato de 2–furanilmetila, carbamato de 2– iodoetila, carbamato de isobornila, carbamato de isobutila, carbamato de isonicotinila, carbamato de p–(p'– metoxifenilazo)benzila, carbamato de 1–metilciclobutila, carbamato de 1–metilciclo-hexila, carbamato de 1–metil–1– ciclopropilmetila, carbamato de 1–metil–1–(3,5– dimetoxifenil)etila, carbamato de 1–metil–1–(p–
fenilazofenil)etila, carbamato de 1–metil–1–feniletila, carbamato de 1–metil–1–(4–piridil)etila, carbamato de fenila, carbamato de p–(fenilazo)benzila, carbamato de 2,4,6–tri–t– butilfenila, carbamato de 4–(trimetilamonio)benzila, carbamato de 2,4,6–trimetilbenzila, formamida, acetamida, cloroacetamida, tricloroacetamida, trifluoroacetamida, fenilacetamida, 3–fenilpropanamida, picolinamida, 3– piridilcarboxamida, derivado de N–benzoilfenilalanila, benzamida, p–fenilbenzamida, o–nitrofenilacetamida, o– nitrofenoxiacetamida, acetoacetamida, (N'– ditiobenziloxicarbonilamino)acetamida, 3–(p– hidroxifenil)propanamida, 3–(o–nitrofenil)propanamida, 2– metil–2–(o–nitrofenoxi)propanamida, 2–metil–2–(o– fenilazofenoxi)propanamida, 4–clorobutanamida, 3–metil–3– nitrobutanamida, o–nitrocinnamida, derivado de N– acetilmetionina, o–nitrobenzamida, o– (benzoiloximetil)benzamida, 4,5–difenil–3–oxazolin–2–ona, N– ftalimida, N–ditiassuccinimida (Dts), N–2,3–difenilmaleimida, N–2,5–dimetilpirrol, aduto de N–1,1,4,4– tetrametildissililazaciclopentano (STABASE), 1,3–dimetil– 1,3,5–triazaciclo-hexan–2–ona 5–substituída, 1,3–dibenzil– 1,3,5–triazaciclo-hexan–2–ona 5–substituída, 3,5–dinitro–4– piridona 1–substituída, N–metilamina, N–alilamina, N–[2– (trimetilsilil)etoxi]metilamina (SEM), N–3– acetoxipropilamina, N–(1–isopropil–4–nitro–2–oxo–3–piroolin– 3–il)amina, sais de amônio quaternário, N–benzilamina, N–di(4– metoxifenil)metilamina, N–5–dibenzossuberilamina, N– trifenilmetilamina (Tr), N–[(4–metoxifenil)difenilmetil]amina (MMTr), N–9–fenilfluorenilamina (PhF), N–2,7–dicloro–9– fluorenilmetilenoamina, N–ferrocenilmetilamino (Fcm), N'–
óxido de N–2–picolilamino, N–1,1–dimetiltiometilenoamina, N– benzilidenoamina, N–p–metoxibenzilidenoamina, N– difenilmetilenoamina, N–[(2–piridil)mesitil]metilenoamina, N– (N',N'–dimetilaminometileno)amina, N,N'– isopropilidenodiamina, N–p–nitrobenzilidenoamina, N– salicilidenoamina, N–5–clorossalicilidenoamina, N–(5–cloro–2– hidroxifenil)fenilmetilenoamina, N–ciclo-hexilidenoamina, N– (5,5–dimetil–3–oxo–1–ciclo-hexenil)amina, derivado de N– borano, derivado de N–difenilborínico, N– [fenil(pentacarbonilcromo– ou tungstênio)carbonil]amina, quelato de N–cobre, quelato de N–zinco, N–nitroamina, N– nitrosoamina, N–óxido de amina, difenilfosfinamida (Dpp), dimetiltiofosfinamida (Mpt), difeniltiofosfinamida (Ppt), fosforamidatos de dialquila, fosforamidato de dibenzila, fosforamidato de difenila, benzenossulfenamida, o– nitrobenzenossulfenamida (Nps), 2,4– dinitrobenzenossulfenamida, pentaclorobenzenossulfenamida, 2– nitro–4–metoxibenzenossulfenamida, trifenilmetilsulfenamida, 3–nitropiridinassulfenamida (Npys), p–toluenossulfonamida (Ts), benzenossulfonamida, 2,3,6,–trimetil–4– metoxibenzenossulfonamida (Mtr), 2,4,6– trimetoxibenzenossulfonamida (Mtb), 2,6–dimetil–4– metoxibenzenossulfonamida (Pme), 2,3,5,6–tetrametil–4– metoxibenzenossulfonamida (Mte), 4–metoxibenzenossulfonamida (Mbs), 2,4,6–trimetilbenzenossulfonamida (Mts), 2,6–dimetoxi– 4–metilbenzenossulfonamida (iMds), 2,2,5,7,8– pentametilcroman–6–sulfonamida (Pmc), metanossulfonamida (Ms), β–trimetilsililetanosulfonamida (SES), 9– antracenossulfonamida, 4–(4',8'– dimetoxinaftilmetil)benzenossulfonamida (DNMBS),
benzilsulfonamida, trifluorometilsulfonamida, e fenacilsulfonamida.
[00167] Os ácidos carboxílicos adequadamente protegidos incluem adicionalmente, porém sem limitação, ácidos carboxílicos protegidos com silila, alquila, alquenila, arila e arilalquila. Os exemplos de grupos silila adequados incluem trimetilsilila, trietilsilila, t–butildimetilsilila, t– butildifenilsilila, triisopropilsilila e similares. Os exemplos de grupos alquila adequados includem metila, benzila, p–metoxibenzila, 3,4–dimetoxibenzila, tritila, t–butila, tetra-hidropiran–2–ila. Os exemplos de grupos alquenila adequados incluem alila. Os exemplos de grupos arila adequados incluem fenila, bifenila ou naftila opcionalmente substituída. Os exemplos de grupos arilalquila adequados incluem benzila opcionalmente substituída (por exemplo, p–metoxibenzila (MPM), 3,4–dimetoxibenzila, O–nitrobenzila, p–nitrobenzila, p– halobenzila, 2,6–diclorobenzila, p–cianobenzila), e 2– e 4– picolila.
[00168] Os grupos protetores de hidroxila adequados incluem metila, metoxilmetila (MOM), metiltiometila (MTM), t–butiltiometila, (fenildimetilsilil)metoximetila (SMOM), benziloximetila (BOM), p–metoxibenziloximetila (PMBM), (4–metoxifenoxi)metil (p–AOM), guaiacolmetil (GUM), t– butoximetil, 4–penteniloximetil (POM), siloximetila, 2– metoxietoximetila (MEM), 2,2,2–tricloroetoximetila, bis(2– cloroetoxi)metila, 2–(trimetilsilil)etoximetila (SEMOR), tetra-hidropiranila (THP), 3–bromotetra-hidropiranila, tetra- hidrotiopiranila, 1–metoxiciclo-hexila, 4–metoxitetra- hidropiranila (MTHP), 4–metoxitetra-hidrotiopiranila, S,S– dióxido de 4–metoxitetra-hidrotiopiranila, 1–[(2–cloro–4–
metil)fenil]–4–metoxipiperidin–4–ila (CTMP), 1,4–dioxan–2– ila, tetra-hidrofuranila, tetra-hidrotiofuranila, 2,3,3a,4,5,6,7,7a–octa-hidro–7,8,8–trimetil–4,7– metanobenzofuran–2–ila, 1–etoxietila, 1–(2–cloroetoxi)etila, 1–metil–1–metoxietila, 1–metil–1–benziloxietila, 1–metil–1– benziloxi–2–fluoroetila, 2,2,2–tricloroetila, 2– trimetilsililetila, 2–(fenilselenil)etila, t–butila, alila, p– clorofenila, p–metoxifenila, 2,4–dinitrofenila, benzila, p– metoxibenzila, 3,4–dimetoxibenzila, o–nitrobenzila, p– nitrobenzila, p–halobenzila, 2,6–diclorobenzila, p– cianobenzila, p–fenilbenzila, 2–picolila, 4–picolila, N–óxido de 3–metil–2–picolila, difenilmetila, p,p'–dinitrobenzidrila, 5–dibenzossuberila, trifenilmetila, α–naftildifenilmetila, p– metoxifenildifenilmetila, di(p–metoxifenil)fenilmetila, tri(p–metoxifenil)metila, 4–(4'– bromofenaciloxifenil)difenilmetila, 4,4',4''–tris(4,5– dicloroftalimidofenil)metila, 4,4',4''– tris(levulinoiloxifenil)metila, 4,4',4''– tris(benzoiloxifenil)metila, 3–(imidazol–1–il)bis(4',4''– dimetoxifenil)metila, 1,1–bis(4–metoxifenil)–1'– pirenilmetila, 9–antrila, 9–(9–fenil)xantenila, 9–(9–fenil– 10–oxo)antrila, 1,3–benzoditiolan–2–ila, S,S–dióxido de benzisotiazolila, trimetilsilila (TMS), trietilsilila (TES), triisopropilsilila (TIPS), dimetilisopropilsilila (IPDMS), dietilisopropilsilila (DEIPS), dimetiltexilsilila, t– butildimetilsilila (TBDMS), t–butildifenilsilila (TBDPS), tribenzilsilila, tri–p–xililsilila, trifenilsilila, difenilmetilsilila (DPMS), t–butilmetoxifenilsilila (TBMPS), formato, benzoilformato, acetato, cloroacetato, dicloroacetato, tricloroacetato, trifluoroacetato,
metoxiacetato, trifenilmetoxiacetato, fenoxiacetato, p– clorofenoxiacetato, 3–fenilpropionato, 4–oxopentanoato (levulinato), 4,4–(etilenoditio)pentanoato (levulinoilditioacetal), pivaloato, adamantoato, crotonato, 4– metoxicrotonato, benzoato, p–fenilbenzoato, 2,4,6– trimetilbenzoato (mesitoato), carbonato de alquil metila, carbonato de 9–fluorenilmetila (Fmoc), carbonato de alqui etila, carbonato de alquil 2,2,2–tricloroetila (Troc), carbonato de 2–(trimetilsilil)etila (TMSEC), carbonato de 2– (fenilsulfonil) etila (Psec), carbonato de 2– (trifenilfosfônio)etila (Peoc), carbonato de alquil isobutila, carbonato de alquil vinila, carbonato alquil alila, carbonato de alquil p–nitrofenila, carbonato de alquil benzila, carbonato de alquil p–metoxibenzila, carbonato de alquil 3,4– dimetoxibenzila, carbonato de alquil o–nitrobenzila, carbonato de alquil p–nitrobenzila, tiocarbonato de alquil S–benzila, carbonato de 4–etoxi–1–naftila, ditiocarbonato de metila, 2– iodobenzoato, 4–azidobutirato, 4–nitro–4–metilpentanoato, o– (dibromometil)benzoato, 2–formilbenzenossulfonato, 2– (metiltiometoxi)etila, 4–(metiltiometoxi)butirato, 2– (metiltiometoximetil)benzoato, 2,6–dicloro–4– metilfenoxiacetato, 2,6–dicloro–4–(1,1,3,3– tetrametilbutil)fenoxiacetato, 2,4–bis(1,1– dimetilpropil)fenoxiacetato, clorodifenilacetato, isobutirato, monosuccinato, (E)–2–metil–2–butenoato, o– (metoxicarbonil)benzoato, α–naftoato, nitrato, N,N,N',N'– tetrametilfosforodiamidato de alquila, N–fenilcarbamato de alquila, borato, dimetilfosfinotioila, 2,4– dinitrofenilsulfenato de alquila, sulfato, metanossulfonato (mesilato), benzilsulfonato, e tosilato (Ts). Para proteger
1,2– ou 1,3–dióis, os grupos protetores incluem metileno acetal, etilideno acetal, 1–t–butiletilideno cetal, 1– feniletilideno cetal, (4–metoxifenil)etilideno acetal, 2,2,2– tricloroetilideno acetal, acetonida, ciclopentilideno cetal, ciclo-hexilideno cetal, ciclo-heptilideno cetal, benzilideno acetal, p–metoxibenzilideno acetal, 2,4–dimetoxibenzilideno cetal, 3,4–dimetoxibenzilideno acetal, 2–nitrobenzilideno acetal, metoximetileno acetal, etoximetileno acetal, dimetoximetileno ortoéster, 1–metoxietilideno ortoéster, 1– etoxietilidina ortoéster, 1,2–dimetoxietilideno ortoéster, α– metoxibenzilideno ortoéster, derivado de 1–(N,N– dimetilamino)etilideno, derivado de α–(N,N'– dimetilamino)benzilideno, 2–oxaciclopentilideno ortoéster, grupo di–t–butilsilileno (DTBS), derivado de 1,3–(1,1,3,3– tetraisopropildissiloxanilideno) (TIPDS), derivado de tetra– t–butoxidissiloxano–1,3–diilideno (TBDS), carbonatos cíclicos, boronatos cíclicos, boronato de etila e boronato de fenila.
[00169] Em algumas modalidades, um grupo protetor de hidroxila é acetila, t-butila, t-butoximetila, metoximetila, tetra-hidropiranila, 1-etoxietila, 1 -(2- cloroetoxi)etila, 2- trimetilsililetila, p-clorofenila, 2,4- dinitrofenila, benzila, benzoíla, p-fenilbenzoíla, 2,6- diclorobenzila, difenilmetila, p-nitrobenzila, trifenilmetila (tritil), 4,4'-dimetoxitritila, trimetilsilila, trietilsilila, t-butildimetilsilila, t-butildifenilsilila, trifenilsilila, triisopropilsilila, benzoilformato, cloroacetila, tricloroacetila, trifiuoroacetila, pivaloíla, 9- carbonato de fluorenilmetila, mesilato, tosilato, triflato, tritila, monometoxitritila (MMTr), 4,4'-dimetoxitritila,
(DMTr) e 4,4',4''-trimetoxitritila (TMTr), 2-cianoetila (CE ou Cne), 2-(trimetilsilil)etila (TSE), 2-(2-nitrofenil)etila, 2- (4-cianofenil)etil 2-(4-nitrofenil)etila (NPE), 2-(4- nitrofenilsulfonil)etila, 3,5-diclorofenila, 2,4- dimetilfenila, 2-nitrofenila, 4-nitrofenila, 2,4,6- trimetilfenila, 2-(2-nitrofenil)etila, butiltiocarbonila, 4,4',4''-tris(benzoiloxi)tritila, difenilcarbamoíla, levulinila, 2-(dibromometil)benzoíla (Dbmb), 2- (isopropiltiometoximetil)benzoíla (Ptmt), 9-fenilxanthen-9- ila (pixil) ou 9-(p-metoxifenil)xantina-9-ila (MOX). Em algumas modalidades, cada um dentre os grupos protetores de hidroxila é, independentemente selecionado dentre acetila, benzila, t-butildimetilsilila, t-butildifenilsilila e 4,4'- dimetoxitritila. Em algumas modalidades, o grupo protetor de hidroxila é selecionado dentre o grupo que consiste em grupo tritila, monometoxitritila e 4,4'-dimetoxitritila.
[00170] Em algumas modalidades, a grupo protetor de fósforo é um grupo ligado à ligação fósforo internucleotídica ao longo da síntese de oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, o grupo protetor de fósforo é ligado ao átomo de enxofre da ligação fosforotioato internucleotídica. Em algumas modalidades, o grupo protetor de fósforo é ligado ao átomo de oxigênio da ligação fosforotioato internucleotídica. Em algumas modalidades, o grupo protetor de fósforo é ligado ao átomo de oxigênio da ligação fosfato internucleotídica. Em algumas modalidades o grupo protetor de fósforo é 2-cianoetila (CE ou Cne), 2-trimetilsililetila, 2- nitroetila, 2-sulfoniletila, metila, benzila, o-nitrobenzila, 2-(p-nitrofenil)etila (NPE ou Npe), 2-feniletila, 3-(N-terc- butilcarboxamido)-1-propila, 4-oxopentila, 4-metiltio-l-
butila, 2-ciano-1,1-dimetiletila, 4-N-metilaminobutila, 3-(2- piridil)-1-propila, 2-[N-metil-N-(2-piridil)]aminoetila, 2- (N-formil,N-metil)aminoetila, 4-[N-metil-N-(2,2,2- trifluoroacetil)amino]butila.
[00171] Proteína: Conforme usado no presente documento, o termo "proteína" se refere a um polipeptídeo (isto é, uma cadeia de pelo menos dois aminoácidos ligados entre si por ligações peptídicas). Em algumas modalidades, as proteínas incluem apenas aminoácidos de ocorrência natural. Em algumas modalidades, as proteínas incluem um ou mais aminoácidos de ocorrência natural (por exemplo, porções químicas que formam uma ou mais ligações de peptídeo com aminoácidos adjacentes). Em algumas modalidades, um ou mais resíduos em uma cadeia de proteínas contêm uma porção química não aminoácido (por exemplo, um glicano, etc). Em algumas modalidades, uma proteína inclui mais de uma cadeia de polipeptídeos, por exemplo ligada por um ou mais ligações dissulfeto ou associadas por outros meios. Em algumas modalidades, as proteínas contêm L- aminoácidos, D-aminoácidos, ou ambos; em algumas modalidades, as proteínas contêm uma ou mais modificações de aminoácidos ou análogos conhecidos na técnica. As modificações úteis incluem, por exemplo, acetilação, amidação, metilação terminal, etc. O termo "peptídeo" é geralmente usado para se referir a um polipeptídeo que tem um comprimento menor que cerca de 100 aminoácidos, menor que cerca de 50 aminoácidos, menor que 20 aminoácidos, ou menor que 10 aminoácidos.
[00172] Indivíduo: Conforme usado no presente documento, o termo "indivíduo" ou "indivíduo de teste" se refere a qualquer organismo ao qual um composto ou composição fornecido é administrado, de acordo com a presente revelação,
por exemplo, para propósitos experimentais, de diagnóstico, profiláticos e/ou terapêuticos. Os indivíduos típicos incluem animais (por exemplo, mamíferos, tais como camundongos, ratos, coelhos, primatas não humanos e humanos; insetos; vermes; etc.) e plantas. Em algumas modalidades, um indivíduo pode ser um que sofre de e/ou é suscetível a uma doença, distúrbio e/ou afecção.
[00173] Substancialmente: Conforme usado no presente documento, o termo "substancialmente" se refere à condição qualitativa de exibir extensão ou grau total ou quase total de uma característica ou propriedade de interesse. Uma pessoa de habilidade comum na técnica biológica irá entender que fenômenos biológicos e químicos raramente, se é que alguma vez, irão chegar à conclusão e/ou prosseguir até a completeza ou alcançar ou evitar um resultado absoluto. O termo "substancialmente" é, portanto usado no presente documento para capturar a falta de completeza potencial inerente a muitos fenômenos biológicos e/ou químicos.
[00174] Sofrendo de: Um indivíduo que está "sofrendo de" uma doença, distúrbio e/ou afecção foi diagnosticado com e/ou apresenta um ou mais sintomas de uma doença, distúrbio e/ou afecção.
[00175] Suscetível a: Um indivíduo que é "suscetível a" uma doença, distúrbio e/ou afecção é aquele que tem um risco mais alto de desenvolver a doença, distúrbio e/ou afecção do que um membro do público geral. Em algumas modalidades, um indivíduo que é suscetível a uma doença, distúrbio e/ou afecção pode não ter sido diagnosticado com a doença, distúrbio e/ou afecção. Em algumas modalidades, um indivíduo que é suscetível a uma doença, distúrbio e/ou afecção pode apresentar sintomas da doença, distúrbio e/ou afecção. Em algumas modalidades, um indivíduo que é suscetível a uma doença, distúrbio e/ou afecção pode não apresentar sintomas da doença, distúrbio e/ou afecção. Em algumas modalidades, um indivíduo que é suscetível a uma doença, distúrbio e/ou afecção irá desenvolver a doença, distúrbio e/ou afecção. Em algumas modalidades, um indivíduo que é suscetível a uma doença, distúrbio e/ou afecção não irá desenvolver a doença, distúrbio e/ou afecção.
[00176] Sistêmico: As expressões “administração sistêmica", "administrado sistemicamente", "administração periférica" e "administrado perifericamente" conforme usado no presente documento têm seu significado entendido na técnica que se refere à administração de um composto ou composição, de modo que o mesmo entre no sistema do receptor.
[00177] Formas tautoméricas: A expressão "formas tautoméricas", conforme usado no presente documento e geralmente entendido na técnica, é usada para descrever diferentes formas isoméricas de compostos orgânicos que têm capacidade de interconversão fácil. Os tautômeros podem ser caracterizados pela migração formal de um átomo ou próton de hidrogênio, acompanhada por uma troca de uma ligação simples e ligação dupla adjacente. Em algumas modalidades, os tautômeros podem resultar de tautomerismo prototrópico (isto é, a realocação de um próton). Em algumas modalidades, os tautômeros podem resultar do tautomerismo de valência (isto é, a reorganização rápida de elétrons de ligação). Todas as formas tautoméricas pretendem ser incluídas no escopo da presente revelação. Em algumas modalidades, as formas tautoméricas de um composto existem em equilíbrio móvel entre si, de modo que tentativas de preparar as substâncias separadas resultem na formação de uma mistura.
Em algumas modalidades, as formas tautoméricas de um composto são compostos separáveis e isoláveis.
Em algumas modalidades da revelação, podem ser fornecidas composições químicas que são ou incluem preparações puras de uma única forma tautomérica de um composto.
Em algumas modalidades da revelação, as composições químicas podem ser fornecidas como misturas de duas ou mais formas tautoméricas de um composto.
Em determinadas modalidades, tais misturas contêm quantidades iguais de formas tautoméricas diferentes; em determinadas modalidades, tais misturas contêm quantidades diferentes de pelo menos duas formas tautoméricas diferentes de um composto.
Em algumas modalidades da revelação, as composições químicas podem conter todas as formas tautoméricas de um composto.
Em algumas modalidades da revelação, as composições químicas podem conter menos do que todas as formas tautoméricas de um composto.
Em algumas modalidades da revelação, as composições químicas podem conter uma ou mais formas tautoméricas de um composto em quantidades que variam ao longo do tempo como resultado da interconversão.
Em algumas modalidades da revelação, o tautomerismo é tautomerismo ceto- enol.
Uma pessoa versada na técnica química irá reconhecer que um tautômero ceto-enol pode ser "aprisionado" (isto é, quimicamente modificado, de modo que permaneça na forma "enol") com o uso de reagente adequado conhecido na técnica química para fornecer um de modo que de enol que pode ser subsequentemente isolado com o uso de uma ou mais técnicas adequadas conhecidas na técnica.
A menos que indicado de outro modo, a presente revelação abrange todas as formas tautoméricas dos compostos relevantes, seja na forma pura ou em mistura por adição entre si.
[00178] Agente terapêutico: Conforme usado no presente documento, a expressão "agente terapêutico" se refere a qualquer agente que, quando administrado a um indivíduo, tenha um efeito terapêutico e/ou elicite um efeito biológico e/ou farmacológico adequado. Em algumas modalidades, um agente terapêutico é qualquer substância que possa ser usada para aliviar, melhorar, atenuar, inibir, prevenir, atrasar o início de, reduzir a gravidade de e/ou reduzir a incidência de um ou mais sintomas ou características de uma doença, distúrbio e/ou afecção.
[00179] Quantidade terapeuticamente eficaz: Conforme usado no presente documento, o termo "quantidade terapeuticamente eficaz" significa uma quantidade de uma substância (por exemplo, um agente, composição e/ou formulação terapêutica) que elicita uma resposta biológica desejada quando administrada como parte de um regime terapêutico. Em algumas modalidades, uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma substância é uma quantidade que é suficiente, quando administrada a um indivíduo que sofre de ou é suscetível a uma doença, distúrbio e/ou afecção, para tratar, diagnosticar, prevenir e/ou atrasar o início da doença, distúrbio e/ou afecção. Conforme será observador por aqueles de habilidade comum na técnica, a quantidade eficaz de uma substância pode variar dependendo de tais fatores como ponto final do teste biológico desejado, a substância a ser entregue, a célula ou tecido alvo, etc. por exemplo, a quantidade eficaz de composto em um formulação para tratar uma doença, distúrbio e/ou afecção é a quantidade que alivia, melhora, atenua, inibe, previne,
atrasa o início de, reduz a gravidade e/ou reduz a incidência de um ou mais sintomas ou características da doença, distúrbio e/ou afecção. Em algumas modalidades, uma quantidade terapeuticamente eficaz é administrada in uma única dose; em algumas modalidades, múltiplas doses unitárias são necessárias para entregar uma quantidade terapeuticamente eficaz.
[00180] Tratar: Conforme usado no presente documento, o termo "tratar", "tratamento" ou "tratando" se refere qualquer método usado para parcial ou completamente aliviar, melhorar, atenuar, inibir, prevenir, atrasar o início de, reduzir a gravidade de e/ou reduzir a incidência de um ou mais sintomas ou características de uma doença, distúrbio e/ou afecção. O tratamento pode ser administrado a um indivíduo que não apresenta sinais de uma doença, distúrbio e/ou afecção. Em algumas modalidades, o tratamento pode ser administrado a um indivíduo que apresenta apenas sinais iniciais da doença, distúrbio e/ou afecção, por exemplo para o propósito de diminuir o risco de desenvolver patologia associada à doença, distúrbio e/ou afecção.
[00181] Dose unitária: A expressão "dose unitária" conforme usado no presente documento se refere a uma quantidade administrada como uma única dose e/ou em uma unidade fisicamente distinta de uma composição farmacêutica. Em muitas modalidades, uma dose unitária contém uma quantidade predeterminada de um agente ativo. Em algumas modalidades, uma dose unitária contém uma dose única inteira do agente. Em algumas modalidades, mais de uma dose unitária é administrada para obter uma dose unitária total. Em algumas modalidades, a administração de múltiplas doses é necessária, ou espera-se que seja necessária, a fim de obter um efeito pretendido. Uma dose unitária pode ser, por exemplo, uma volume de líquido (por exemplo, um carreador aceitável) que contém uma quantidade predeterminada de um ou mais agentes terapêuticos, uma quantidade predeterminada de um ou mais agentes terapêuticos na forma sólida, uma formulação com liberação sustentada ou dispositivo de entrega de fármaco contendo uma quantidade predeterminada de um ou mais agentes terapêuticos, etc.
Será observado que uma dose unitária pode estar presente em uma formulação que inclui qualquer um dentre uma variedade de componentes além do agente (ou agentes) terapêutico.
Por exemplo, os carreadores aceitáveis (por exemplo, carreadores farmaceuticamente aceitáveis), diluentes, estabilizantes, tampões, conservantes, etc., podem ser incluídos, conforme descrito infra.
Será observado por aqueles versados na técnica, em muitas modalidades, uma dosagem diária adequada total de um agente terapêutico particular pode compreender uma porção, ou uma pluralidade, de doses unitárias, e pode ser decidida, por exemplo, pelo médico responsável dentro do escopo do julgamento médico razoável.
Em algumas modalidades, o nível de dose eficaz específico para qualquer indivíduo ou organismo particular pode depender de uma variedade de fatores, incluindo o distúrbio sendo tratado e a gravidade do distúrbio; atividade do composto ativo específico empregado; composição específica empregada; idade, peso corporal, saúde geral, gênero e dieta do indivíduo; tempo de administração, e taxa de excreção do composto ativo específico empregado; duração do tratamento; fármacos e/ou terapias adicionais usados em combinação ou coincidente com o composto (ou compostos) específico empregado, e fatores similares bem conhecidos na técnica médica.
[00182] Insaturado: O termo "insaturado", conforme usado no presente documento, significa que uma porção química tem uma ou mais unidades de insaturação.
[00183] Tipo selvagem: Conforme usado no presente documento, o termo "tipo selvagem" tem seu significado compreendido na técnica que se refere a uma entidade que tem uma estrutura e/ou atividade conforme encontrado na natureza em um estado ou contexto "normal" (em contraste com mutante, doente, alterado, etc). Aqueles de habilidade comum na técnica irão observar que os genes e polipeptídeos do tipo selvagem existem frequentemente em múltiplas formas diferentes (por exemplo, alelos).
[00184] Ácido nucleico: O termo "ácido nucleico" inclui quaisquer nucleotídeos, análogos dos mesmos, e polímeros dos mesmos. O termo "polinucleotídeo" conforme usado no presente documento se refere a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, ribonucleotídeos (RNA) ou desoxirribonucleotídeos (DNA) ou análogos dos mesmos. Esses termos se referem à estrutura primária das moléculas e incluem DNA de fita simples e dupla e RNA de fita dupla . Esses termos incluem, como equivalentes, análogos de RNA ou DNA produzidos a partir de análogos de nucleotídeo e polinucleotídeos modificados, tal como, embora não limitado a nucleotídeos ou polinucleotídeos, metilados, protegidos e/ou capeados. Os termos abrangem poli- ou oligo-ribonucleotídeos (RNA) e poli- ou oligo-desoxiribonucleotídeos (DNA); RNA ou DNA derivado de N-glicosídeos ou C-glicosídeos de nucleobases e/ou nucleobases modificadas; ácidos nucleicos derivados de açúcares e/ou açúcares modificados; e ácidos nucleicos derivados de pontes de fosfato e/ou pontes de átomo de fósforo modificadas (também denominadas no presente documento como "ligações internucleotídicas"). O termo abrange ácidos nucleicos contendo quaisquer combinações de nucleobases, nucleobases modificadas, açúcares, açúcares modificados, ligações internucleotídicas fosfato naturais ou ligações internucleotídicas não naturais. Os exemplos incluem, porém sem limitação, ácidos nucleicos contendo porções químicas de ribose, ácidos nucleicos contendo porções químicas de desoxirribose, ácidos nucleicos contendo tanto porções químicas de ribose como de desoxirribose, ácidos nucleicos contendo porções químicas de ribose e ribose modificada. A menos que especificado de outro modo, o prefixo poli- se refere a um ácido nucleico contendo 2 a cerca de 10,000 unidades de monômero de nucleotídeo, e em que o prefixo oligo- se refere a um ácido nucleico contendo 2 a cerca de 200 unidades de monômero de nucleotídeo.
[00185] Nucleotídeo: O termo "nucleotídeo" conforme usado no presente documento se refere a uma unidade monomérica de um polinucleotídeo que consiste em uma base heterocíclica, um açúcar e um ou mais grupos fosfato ou ligações internucleotídicas contendo fósforo. As bases de ocorrência natural (guanina, (G), adenina, (A), citosina, (C), timina, (T), e uracila (U)) são derivados de purina ou pirimidina, embora deva-se compreender que análogos de base de ocorrência natural e de ocorrência não natural também são incluídos. Os açúcares de ocorrência natural incluem a pentose (açúcar de cinco carbonos) desoxirribose (que é encontrada no DNA natural) ou ribose (que é encontrada no RNA natural), embora deva-se compreender que os análogos de açúcar de ocorrência natural e de ocorrência não natural também são incluídos, tais como açúcares com modificações 2', açúcares no ácido nucleico bloqueado (LNA) e oligômero de morfolino fosforodiamidato (PMO). Os nucleotídeos são ligados por meio de ligações internucleotídicas para formar ácidos nucleicos ou polinucleotídeos. Muitas ligações internucleotídicas são conhecidas na técnica (tais como, porém sem limitação, ligação fosfato natural, ligações fosforotioato, ligações boranofosfato e similares). Os ácidos nucleicos artificiais incluem PNAs (ácidos nucleicos de peptídeo), fosfotriésteres, fosforotionatos, H-fosfonatos, fosforamidatos, boranofosfatos, metilfosfonatos, fosfonoacetatos, tiofosfonoacetatos e outras variantes da cadeia principal de fosfato dos ácidos nucleicos nativos, etc. Em algumas modalidades, um nucleotídeo é um nucleotídeo natural que compreende uma nucleobase de ocorrência natural, um açúcar de ocorrência natural e a ligação fosfato natural. Em algumas modalidades, um nucleotídeo é um nucleotídeo modificado ou um análogo de nucleotídeo, que é um análogo estrutural que pode ser usado no lugar de um nucleotídeo natural.
[00186] Nucleotídeo Modificado: O termo "nucleotídeo modificado" inclui qualquer porção química que difere estruturalmente de um nucleotídeo natural, porém tem capacidade para realizar pelo menos uma função de um nucleotídeo natural. Em algumas modalidades, um nucleotídeo modificado compreende uma modificação em um açúcar, base e/ou ligação internucleotídica. Em algumas modalidades, um nucleotídeo modificado compreende um açúcar modificado, nucleobase modificada e/ou ligação internucleotídica modificada. Em algumas modalidades, um nucleotídeo modificado tem capacidade para pelo menos uma função de um nucleotídeo,
por exemplo, formar uma subunidade em um polímero que tem capacidade de pareamento de bases com um ácido nucleico que compreende pelo menos sequência de bases complementar.
[00187] Análogo: O termo "análogo" inclui qualquer porção química que difere estruturalmente de uma porção química de referência ou classe de porções químicas, porém que tem capacidade para realizar pelo menos uma função de tal porção química de referência ou classe de porções químicas. Como exemplos não limitantes, um análogo de nucleotídeo difere estruturalmente de um nucleotídeo, porém realiza pelo menos uma função de um nucleotídeo; um análogo de nucleobase difere estruturalmente de uma nucleobase, porém realiza pelo menos uma função de uma nucleobase; um análogo de açúcar difere estruturalmente de uma nucleobase, porém realiza pelo menos uma função de um açúcar, etc.
[00188] Nucleosídeo: O termo "nucleosídeo" se refere a uma porção química em que uma nucleobase ou uma nucleobase modificada é covalentemente ligada a um açúcar ou açúcar modificado.
[00189] Nucleosídeo modificado: O termo "nucleosídeo modificado" se refere a uma porção química que é quimicamente distinta de um nucleosídeo natural, mas que tem capacidade para realizar pelo menos uma função de um nucleosídeo. Em algumas modalidades, um nucleosídeo modificado é derivado de ou quimicamente similar a um nucleosídeo natural, porém que compreende uma modificação química que se diferencia de um nucleosídeo natural. Os exemplos não limitantes de nucleosídeos modificados incluem aqueles que compreendem uma modificação na base e/ou no açúcar. Os exemplos não limitantes de nucleosídeos modificados incluem aqueles com uma modificação 2' em um açúcar. Os exemplos não limitantes de nucleosídeos modificados também incluem nucleosídeos abásicos (que não têm uma nucleobase). Em algumas modalidades, um nucleosídeo modificado tem capacidade para pelo menos uma função de um nucleosídeo, por exemplo, formar uma porção química em um polímero que tem capacidade pareamento de base com um ácido nucleico que compreende pelo menos uma sequência de bases complementar.
[00190] Análogo de nucleosídeo: O termo "análogo de nucleosídeo" se refere a uma porção química que é quimicamente distinta de um nucleosídeo natural, mas que tem capacidade para realizar pelo menos uma função de um nucleosídeo. Em algumas modalidades, um análogo de nucleosídeo compreende um análogo de um açúcar e/ou um análogo de uma nucleobase. Em algumas modalidades, um nucleosídeo modificado tem capacidade para pelo menos uma função de um nucleosídeo, por exemplo, formar uma porção química em um polímero que tem capacidade pareamento de base com um ácido nucleico que compreende uma sequência de bases complementar.
[00191] Açúcar: O termo "açúcar" se refere a um monossacarídeo ou polissacarídeo na forma fechada e/ou aberta. Em algumas modalidades, os açúcares são monossacarídeos. Em algumas modalidades, os açúcares são polissacarídeos. Os açúcares incluem, porém sem limitação, porções químicas de ribose, desoxirribose, pentofuranose, pentopiranose e hexopiranose. Conforme usado no presente documento, o termo "açúcar" também abrange análogos estruturais usados no lugar de moléculas de açúcar convencionais, tais como glicol, polímero, cujas formas da cadeia principal do análogo de ácido nucleico, ácido nucleico glicol ("GNA"), etc. Conforme usado no presente documento, o termo "açúcar" também abrange análogos estruturais usados no ligar de nucleotídeos naturais ou de ocorrência natural, tais como açúcares modificados e açúcares de nucleotídeo. Em algumas modalidades, um açúcar é D-2-desoxirribose. Em algumas modalidades, um açúcar é beta-D-desoxirribofuranose. Em algumas modalidades, uma porção química de açúcar é uma porção química de beta-D-desoxirribofuranose. Em algumas modalidades, um açúcar é D-ribose. Em algumas modalidades, um açúcar é beta- D-ribofuranose. Em algumas modalidades, uma porção química de açúcar é uma porção química de beta-D-ribofuranose. Em algumas modalidades, um açúcar é beta-D-desoxirribofuranose ou beta- D-ribofuranose opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, uma porção química de açúcar é uma porção química de beta-D-desoxirribofuranose ou beta-D-ribofuranose opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, uma porção química/unidade de açúcar em um oligonucleotídeo, ácido nucleico, etc. é um açúcar que compreende um ou mais átomos de carbono, cada um, independentemente conectados a uma ligação internucleotídica, por exemplo, beta-D-desoxirribofuranose ou beta-D-ribofuranose opcionalmente substituída, cujo 5'-C e/ou 3'-C são, cada um, independentemente conectados a uma ligação internucleotídica (por exemplo, uma ligação fosfato natural, uma ligação internucleotídica modificada, uma ligação internucleotídica quiralmente controlada, etc.).
[00192] Açúcar modificado: O termo "açúcar modificado" se refere a uma porção química que pode substituir um açúcar. Um açúcar modificado imita a disposição espacial, propriedades eletrônicas ou alguma outra propriedade físico- química de um açúcar. Em algumas modalidades, um açúcar modificado é beta-D-desoxirribofuranose ou beta-D-ribofuranose substituída. Em algumas modalidades, um açúcar modificado compreende uma modificação 2'. Em algumas modalidades, um açúcar modificado compreende um ligante (por exemplo, heteroalifático bivalente opcionalmente substituído) que conecta dois átomos de carbono de açúcar (por exemplo, C2 e C4), por exemplo, conforme encontrado em LNA. Em algumas modalidades, um ligante é −O−CH(R)−, em que R é conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, um ligante é −O−CH(R)−, em que O é conectado a C2, e −CH(R)− é conectado a C4 de um açúcar, e R é conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, R é metila. Em algumas modalidades, R é −H. Em algumas modalidades, −CH(R)− é da configuração S. Em algumas modalidades, −CH(R)− é da configuração R.
[00193] Nucleobase: O termo "nucleobase" se refere às partes de ácidos nucleicos que estão envolvidas na ligação ao hidrogênio que liga uma fita de ácido nucleico à outra fita complementar de uma maneira específica de sequência. As nucleobases de ocorrência natural mais comuns são adenina (A), guanina (G), uracila (U), citosina (C) e timina (T). Em algumas modalidades, uma nucleobase modificada é uma nucleobase substituída cuja nucleobase é selecionada dentre A, T, C, G, U, e tautômeros dos mesmos. Em algumas modalidades, as nucleobases de ocorrência natural são adenina, guanina, uracila, citosina ou timina modificada. Em algumas modalidades, as nucleobases de ocorrência natural são adenina, guanina, uracila, citosina ou timina metilada. Em algumas modalidades, uma nucleobase é uma "nucleobase modificada", por exemplo, uma nucleobase diferente de adenina (A), guanina (G),
uracila (U), citosina (C) e timina (T). Em algumas modalidades, as nucleobases modificadas são adenina, guanina, uracila, citosina, ou timina metilada. Em algumas modalidades, a nucleobase modificada imita a disposição espacial, propriedades eletrônicas, ou alguma outra propriedade físico- química da nucleobase e retém a propriedade de ligação ao hidrogênio que liga uma fita de ácido nucleico à outra de uma maneira específica da sequência. Em algumas modalidades, uma nucleobase modificada pode se emparelhar com todas cinco bases de ocorrência natural (uracila, timina, adenina, citosina ou guanina) sem afetar substancialmente o comportamento de fusão, reconhecimento por enzimas intracelulares ou atividade do duplex de oligonucleotídeo. Conforme usado no presente documento, o termo "nucleobase" também abrange análogos estruturais usados no lugar de nucleotídeos naturais ou de ocorrência natural, tais como nucleobases modificadas e análogos de nucleobase. Em algumas modalidades, uma nucleobase é um A, T, C, G, ou U opcionalmente substituído, ou uma nucleobase substituída cuja nucleobase é selecionada dentre A, T, C, G, U, e tautômeros dos mesmos.
[00194] Nucleobase modificada: Os termos "nucleobase modificada", “base modificada" e similares se referem a uma porção química que é quimicamente distinta de uma nucleobase, porém que tem capacidade para realizar pelo menos uma função de uma nucleobase. Em algumas modalidades, uma nucleobase modificada é uma nucleobase que compreende uma modificação. Em algumas modalidades, uma nucleobase modificada tem capacidade para pelo menos uma função de uma nucleobase, por exemplo, formar uma porção química em um polímero que tem capacidade pareamento de base com um ácido nucleico que compreende pelo menos uma sequência de bases complementar. Em algumas modalidades, uma nucleobase modificada é uma nucleobase substituída cuja nucleobase é selecionada dentre A, T, C, G, U, e tautômeros dos mesmos.
[00195] Aglutinante quiral: O termo "aglutinante quiral" ou "auxiliar quiral" se refere a uma porção química que é quiral e pode ser incorporada em uma reação, de modo que a reação possa ser realizada sem determinada estereosseletividade. Em algumas modalidades, o termo também pode se referir a um composto que compreende tal porção química.
[00196] Grupo de bloqueio: O termo "grupo de bloqueio" se refere a um grupo que mascara a reatividade de um grupo funcional. O grupo funcional pode ser subsequentemente desmascarado por remoção do grupo de bloqueio. Em algumas modalidades, um grupo de bloqueio é um grupo protetor.
[00197] Porção química: O termo "porção química" se refere a um segmento específico ou grupo funcional de uma molécula. As porções químicas são frequentemente entidades químicas reconhecidas incorporadas ou anexadas a uma molécula. Em algumas modalidades, uma porção química de um composto é um grupo monovalente, bivalente ou polivalente formado a partir do composto por remoção de um ou mais −H e/ou equivalentes dos mesmos a partir de um composto. Em algumas modalidades, dependendo do seu contexto, a "porção química" também pode se referir a um composto ou entidade a partir do qual a porção química é derivada.
[00198] Suporte Sólido: O termo "suporte sólido" quando usado no contexto de preparação de ácidos nucleicos, oligonucleotídeos, ou outros compostos se referem qualquer suporte que permita a síntese de ácidos nucleicos, oligonucleotídeos ou outros compostos. Em algumas modalidades, o termo se refere a um vidro ou um polímero, que é insolúvel no meio empregado nas etapas de reação realizada para sintetizar ácidos nucleicos, e é derivatizado para compreender grupos reativos. Em algumas modalidades, o suporte sólido é Poliestireno Altamente Reticulado (HCP) ou Vidro de Poro Controlado (CPG). Em algumas modalidades, o suporte sólido é Vidro de Poro Controlado (CPG). Em algumas modalidades, o suporte sólido é o suporte híbrido do Vidro de Poro Controlado (CPG) e Poliestireno Altamente Reticulado (HCP).
[00199] Fase de leitura: O termo "quadro de leitura" se refere um dos seis quadros de leitura possíveis, três em cada direção, de uma molécula de DNA de fita dupla. O quadro de leitura que é usado determina quais códons são usados para codificar aminoácidos dentro da sequência de codificação de uma molécula de DNA.
[00200] Antissenso: Conforme usado no presente documento, uma molécula de ácido nucleico "antissenso" compreende uma sequência de nucleotídeos que é complementar a um ácido nucleico "senso" que codifica uma proteína, por exemplo, complementar à fita de codificação de uma molécula de cDNA de fita dupla, complementar a uma sequência de mRNA ou complementar à fita de codificação de um gene. Consequentemente, uma molécula de ácido nucleico antissenso pode se associar através de ligações de hidrogênio a uma molécula de ácido nucleico senso. Em algumas modalidades, transcrições podem ser geradas a partir de ambas as fitas. Em algumas modalidades, transcrições podem ou não codificar produtos de proteína. Em algumas modalidades, quando direcionada ou alvejada a uma sequência de ácidos nucleicos particular, uma sequência "antissenso" pode se referir a uma sequência que é complementar à sequência de ácidos nucleicos particular.
[00201] Oligonucleotídeo: o termo "oligonucleotídeo" se refere a um polímero ou oligômero de monômeros de nucleotídeo, contendo qualquer combinação de nucleobases, nucleobases modificadas, açúcares, açúcares modificados, ligações fosfato naturais ou ligações internucleotídicas não naturais.
[00202] Os oligonucleotídeos podem ser de fita simples ou fita dupla. Conforme usado no presente documento, o termo "fita de oligonucleotídeo" abrange um oligonucleotídeo de fita simples. Um oligonucleotídeo de fita simples pode ter regiões de fita dupla e um oligonucleotídeo de fita dupla pode ter regiões de fita simples. Os oligonucleotídeos exemplificativos incluem, porém sem limitação genes estruturais, genes que incluem regiões de controle e terminação, sistemas autorreplicantes, tal como DNA viral ou de plasmídeo, siRNAs de fita simples e fita dupla e outros reagentes de interferência de RNA (agentes RNAi ou agentes iRNA), shRNA, oligonucleotídeos antissenso, ribozimas, microRNAs, simulações de microRNA, supermirs, aptâmeros, antimirs, antagomirs, adaptadores de Ul, oligonucleotídeos formadores de triplex, oligonucleotídeos G-quadruplex, ativadores de RNA, oligonucleotídeos imunoestimulantes e oligonucleotídeos decoy.
[00203] Os oligonucleotídeos de fita dupla e de fita simples que são eficazes na indução de interferência de RNA também podem ser denominados como siRNA, agente de RNAi ou agente de iRNA. Em algumas modalidades, esses oligonucleotídeos de indução de interferência de RNA se associam a um complexo de múltiplas proteínas citoplasmáticas conhecido como complexo de silenciamento induzido por RNAi (RISC). Em muitas modalidades, agentes de RNAi de fita simples e de fita dupla são suficientemente longos, que eles podem ser clivados por ima molécula endógena, por exemplo, por Dicer, para produzir oligonucleotídeos menores que podem entrar no mecanismo RISC e participar da clivagem mediada por RISC de uma sequência alvo, por exemplo um mRNA alvo.
[00204] Os oligonucleosídeos da presente revelação podem ser de vários comprimentos. Em modalidades particulares, os oligonucleosídeos podem se situar na faixa de cerca de 2 a cerca de 200 nucleosídeos de comprimento. Em várias modalidades relacionadas, os oligonucleosídeos, de fita simples, fita dupla e fita tripla podem se situar na faixa de comprimento de cerca de 4 a cerca de 10 nucleosídeos, de cerca de 10 a cerca de 50 nucleosídeos, de cerca de 20 a cerca de 50 nucleosídeos, de cerca de 15 a cerca de 30 nucleosídeos, de cerca de 20 a cerca de 30 nucleosídeos de comprimento. Em algumas modalidades, o oligonucleosídeo tem cerca de 9 a cerca de 39 nucleosídeos de comprimento. Em algumas modalidades, o oligonucleosídeo tem pelo menos 15 nucleosídeos de comprimento. Em algumas modalidades, o oligonucleosídeo tem pelo menos 20 nucleosídeos de comprimento. Em algumas modalidades, o oligonucleosídeo tem pelo menos 25 nucleosídeos de comprimento. Em algumas modalidades, o oligonucleosídeo tem pelo menos 30 nucleosídeos de comprimento. Em algumas modalidades, o oligonucleosídeo é um duplex de fitas complementares de pelo menos 18 nucleosídeos de comprimento.
Em algumas modalidades, o oligonucleosídeo é um duplex de fitas complementares de pelo menos 21 nucleosídeos de comprimento. Em algumas modalidades, para o propósito de comprimentos de oligonucleotídeo, cada nucleosídeo contado compreende independentemente uma nucleobase opcionalmente substituída selecionada dentre A, T, C, G, U e seus tautômeros.
[00205] Ligação Internucleotídica: Conforme usado no presente documento, a expressão "ligação internucleotídica" se refere geralmente a uma ligação, tipicamente uma ligação contendo fósforo, entre unidades de nucleotídeo de um ácido nucleico ou um oligonucleotídeo, e é intercambiável com "ligação inter-açúcar", "ligação internucleosídica" e "ponte de átomo de fósforo" conforme usado acima e no presente documento. Conforme observado por aqueles versados na técnica, DNA e RNA naturais contêm ligações fosfato naturais. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica é uma ligação fosfato natural (−OP(O)(OH)O−, que existe tipicamente como sua forma aniônica −OP(O)(O−)O− a pH por exemplo, ~7,4), conforme encontrado em moléculas de DNA e RNA de ocorrência natural. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica é uma ligação internucleotídica modificada (ou ligação internucleotídica não natural), que é estruturalmente diferente de uma ligação fosfato natural, porém pode ser utilizada no lugar de uma ligação fosfato natural, por exemplo, ligação internucleotídica fosforotioato, ligações PMO, etc. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica é uma ligação internucleotídica modificada em que um ou mais átomos de oxigênio de uma ligação fosfodiéster natural são independentemente substituídos por uma ou mais porções químicas orgânicas ou inorgânicas. Em algumas modalidades, tal porção química orgânica ou inorgânica é selecionada dentre, porém sem limitação =S, =Se, =NR', –SR', –SeR', –N(R')2, B(R')3, –S–, –Se–, e –N(R')–, em que cada R' é independentemente conforme definido e descrito abaixo.
Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica é uma ligação fosfotriéster.
Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica é uma ligação diéster fosforotioato (ligação internucleotídica fosforotioato, , tipicamente existente como sua forma aniônica −OP(O)(S−)O− a pH por exemplo, ~7,4). É entendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica que uma ligação internucleotídica pode existir como um ânion ou cátion a um determinado pH devido à existência de porções químicas de ácido ou base na ligação.
Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica é uma ligação internucleotídica não negativamente carregada a um determinado pH.
Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica é uma ligação internucleotídica neutra a um determinado pH.
Em algumas modalidades, um determinado pH é pH ~7,4. Em algumas modalidades, um determinado pH se situa na faixa de pH de cerca de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 a pH de cerca de 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14. Em algumas modalidades, um determinado pH se situa na faixa de pH 5 a 9. Em algumas modalidades, um determinado pH se situa na faixa de pH 6 a 8. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica tem a estrutura da fórmula I, I-a, I-b, I-c, I-n-1, I-n-2, I-n-3, I-n-4, II, II- a-1, II-a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, II-d-2, etc., conforme descrito na presente revelação.
Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura da fórmula I-n-1, I-n-2, I-n-3, I- n-4, II, II-a-1, II-a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II- d-1, II-d-2, etc., conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica é uma de, por exemplo, ligação PNA (ácido nucleico peptídico) ou PMO (oligômero morfolino fosforodiamidato). Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica compreende um fósforo de ligação quiral. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica é uma ligação internucleotídica quiralmente controlada. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica é selecionada dentre: s (fosforotioato), s1, s2, s3, s4, s5, s6, s7, s8, s9, s10, s11, s12, s13, s14, s15, s16, s17 ou s18, em que cada um dentre s1, s2, s3, s4, s5, s6, s7, s8, s9, s10, s11, s12, s13, s14, s15, s16, s17 e s18 é independentemente conforme descrito no documento WO 2017/062862.
[00206] A menos que especificado de outro modo, as designações Rp/Sp que precedem uma sequência de oligonucleotídeos descrevem as configurações do fósforo de ligação em ligações internucleotídicas quiralmente controladas sequencialmente a partir de 5' para 3' da sequência de oligonucleotídeos. Por exemplo, em (Rp, Sp)–ATsCs1GA, o fósforo na ligação "s" entre T e C tem configuração Rp e o fósforo na ligação "s1" entre C e G tem configuração Sp. Em algumas modalidades, "Todos (Rp)" ou "Todos (Sp)" é usado para indicar que todos os átomos de fósforo de ligação nas ligações internucleotídicas quiralmente controladas têm a mesma configuração Rp ou Sp, respectivamente. Por exemplo, Todos (Rp)-GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC indica que todos os átomos de fósforo de ligação quiral no oligonucleotídeo têm a configuração Rp; Todos (Sp)- GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC indica que todos os átomos de fósforo de ligação quiral no oligonucleotídeo têm configuração Sp.
[00207] Tipo de oligonucleotídeo: Conforme usado no presente documento, a expressão "tipo de oligonucleotídeo" é usada para definir oligonucleotídeos que têm uma sequência de base particular, padrão de ligações de cadeia principal (isto é, padrão de tipos de ligação internucleotídica, por exemplo, ligações fosfato naturais, ligações internucleotídicas fosforotioato, ligações internucleotídicas negativamente carregadas, ligações internucleotídicas neutras etc), padrão de centros quirais de cadeia principal (isto é padrão de estereoquímica de fósforo de ligação (Rp/Sp)), e padrão de modificações de fósforo de cadeia principal (por exemplo, padrão de grupos "−X−L−R1" na fórmula I). Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos de um “tipo” projetado comum são estruturalmente idênticos uns aos outros.
[00208] Uma pessoa versada na técnica irá observar que os métodos sintéticos da presente revelação fornecem um grau de controle durante a síntese de uma fita de oligonucleotídeo, de modo que cada unidade de nucleotídeo da fita de oligonucleotídeo possa ser projetada e/ou selecionada antecipadamente para ter uma estereoquímica particular no fósforo de ligação e/ou uma modificação particular no fósforo de ligação e/ou uma base particular e/ou um açúcar particular. Em algumas modalidades, uma fita de oligonucleotídeo é projetada e/ou selecionada antecipadamente para ter uma combinação particular de estereocentros no fósforo de ligação.
Em algumas modalidades, uma fita de oligonucleotídeo é projetada e/ou determinada para ter uma combinação particular de modificações no fósforo de ligação. Em algumas modalidades, uma fita de oligonucleotídeo é projetada e/ou selecionada para ter uma combinação de bases particular. Em algumas modalidades, uma fita de oligonucleotídeo é projetada e/ou selecionada para ter uma combinação particular de uma ou mais das características estruturais acima. A presente revelação fornece composições que compreendem ou consistem em uma pluralidade de moléculas de oligonucleotídeo (por exemplo, composições de oligonucleotídeo quiralmente controladas). Em algumas modalidades, todas essas moléculas são do mesmo tipo. Em algumas modalidades, todas essas moléculas são estruturalmente idênticas umas às outras. Em algumas modalidades, as composições fornecidas compreendem uma pluralidade de oligonucleotídeos de tipos diferentes, tipicamente em quantidades relativas predeterminadas (não aleatórias).
[00209] Controle quiral: Conforme usado no presente documento, "controle quiral" se refere ao controle da designação estereoquímica de um fósforo de ligação quiral em uma ligação internucleotídica quiral dentro de um oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, um controle é obtido através de um elemento quiral que está ausente das porções químicas de açúcar e base de um oligonucleotídeo, por exemplo, em algumas modalidades, um controle é obtido através do uso de um ou mais auxiliares quirais durante a preparação de oligonucleotídeo, conforme exemplificado na presente revelação, cujos auxiliares quirais frequentemente fazem parte das fosforamiditas quirais usadas durante a preparação de oligonucleotídeo. Em contraste com o controle quiral, uma pessoa de habilidade comum na técnica observa que a síntese de oligonucleotídeo convencional que não usa auxiliares quirais não pode controlar a estereoquímica em uma ligação internucleotídica quiral se tal síntese de oligonucleotídeo convencional for usada para formar a ligação internucleotídica quiral. Em algumas modalidades, a designação estereoquímica de cada fósforo de ligação quiral em uma ligação internucleotídica quiral dentro de um oligonucleotídeo é controlada.
[00210] Composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada: Os termos “composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada (estereocontrolada ou estereodefinida)”, “composição de ácido nucleico quiralmente controlada (estereocontrolada ou estereodefinida)", e similares, conforme usado no presente documento, se refere a uma composição que compreende uma pluralidade de oligonucleotídeos (ou ácidos nucleicos, oligonucleotídeos quiralmente controlados ou ácidos nucleicos quiralmente controlado) que compartilham 1) uma sequência de base comum, 2) um padrão comum de ligações de cadeia principal; 3) um padrão comum de centros quirais de cadeia principal, e 4) um padrão comum de modificações de fósforo de cadeia principal (oligonucleotídeos de um tipo particular), em que a pluralidade de oligonucleotídeos (ou ácidos nucleicos) compartilham a mesma estereoquímica em uma ou mais ligações internucleotídicas quirais (ligações internucleotídicas quiralmente controladas, cujo fósforo de ligação quiral é Rp ou Sp, não uma mistura aleatória Rp e Sp como ligações internucleotídicas não quiralmente controladas). O nível da pluralidade de oligonucleotídeos (ou ácidos nucleicos) em uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada é não aleatório (predeterminado, controlado). As composições de oligonucleotídeo quiralmente controladas são tipicamente preparadas através de preparação de oligonucleotídeo quiralmente controlado para formar estereosseletivamente uma ou mais ligações internucleotídicas quirais (por exemplo, com o uso de auxiliares quirais conforme exemplificado na presente revelação, em comparação com a síntese de oligonucleotídeo não quiralmente controlada (esterealeatória, não estereosseletiva, racêmica) tal como a síntese de oligonucleotídeo à base de fosforamidita tradicional que não usa auxiliares quirais ou catalisadores quirais para controlar intencionalmente a estereosseletividade). Uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada é enriquecida, em relação a uma preparação substancialmente racêmica de oligonucleotídeos que têm a sequência de base comum, o padrão comum de ligações de cadeia principal, e o padrão comum de modificações de fósforo de cadeia principal, para oligonucleotídeos da pluralidade.
Em algumas modalidades, uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada compreende uma pluralidade de oligonucleotídeos de um tipo de oligonucleotídeo particular definido por: 1) sequência de base; 2) padrão de ligações de cadeia principal; 3) padrão de centros quirais de cadeia principal; e 4) padrão de modificações de fósforo de cadeia principal, em que a mesma é enriquecida, em relação a uma preparação substancialmente racêmica de oligonucleotídeos que têm a mesma sequência de base, padrão de ligações de cadeia principal, e padrão de modificações de fósforo de cadeia principal, para oligonucleotídeos do tipo de oligonucleotídeo particular.
Conforme uma pessoa de habilidade comum na técnica observa prontamente, tal enriquecimento pode ser caracterizado pelo fato de que em comparação com uma preparação substancialmente racêmica, em cada ligação internucleotídica quiralmente controlada, um nível mais alto do fósforo de ligação tem a configuração desejada. Em algumas modalidades, cada ligação internucleotídica quiralmente controlada tem independentemente uma diastereopureza de pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% em relação ao seu fósforo de ligação quiral. Em algumas modalidades, cada uma independentemente tem uma diastereopureza de pelo menos 90%. Em algumas modalidades, cada uma independentemente tem uma diastereopureza de pelo menos 95%. Em algumas modalidades, cada uma independentemente tem uma diastereopureza de pelo menos 97%. Em algumas modalidades, cada uma independentemente tem uma diastereopureza de pelo menos 98%. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos de uma pluralidade têm a mesma constituição. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos de uma pluralidade têm a mesma constituição e estereoquímica, e são estruturalmente idênticos.
[00211] Em algumas modalidades, a pluralidade de oligonucleotídeos em uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada compartilha a mesma sequência de base, as mesmas, se houver, modificações de nucleobase, açúcar e ligação internucleotídica, e a mesma estereoquímica (Rp ou Sp) independentemente nos centros quirais de fósforo de ligação de uma ou mais ligações internucleotídicas quiralmente controladas, embora a estereoquímica de certos centros quirais de fósforo de ligação possa se diferente. Em algumas modalidades, cerca de 0,1% a 100%, (por exemplo, cerca de 1% a 100%, 5% a 100%, 10% a 100%, 20% a 100%, 30% a 100%, 40% a
100%, 50% a 100%, 60% a 100%, 70% a 100%, 80 a 100%, 90 a 100%, 95 a 100%, 50% a 90%, ou cerca de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99%, ou pelo menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99%) de todos os oligonucleotídeos em uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada são oligonucleotídeos da pluralidade.
Em algumas modalidades, cerca de 0,1% a 100%, (por exemplo, cerca de 1% a 100%, 5% a 100%, 10% a 100%, 20% a 100%, 30% a 100%, 40% a 100%, 50% a 100%, 60% a 100%, 70% a 100%, 80 a 100%, 90 a 100%, 95 a 100%, 50% a 90%, ou cerca de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99%, ou pelo menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99%) de todos os oligonucleotídeos em uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada que compartilham a sequência de base comum são oligonucleotídeos da pluralidade.
Em algumas modalidades, cerca de 0,1% a 100%, (por exemplo, cerca de 1% a 100%, 5% a 100%, 10% a 100%, 20% a 100%, 30% a 100%, 40% a 100%, 50% a 100%, 60% a 100%, 70% a 100%, 80 a 100%, 90 a 100%, 95 a 100%, 50% a 90%, ou cerca de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99%, ou pelo menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99%) de todos os oligonucleotídeos em uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada que compartilham a sequência de base comum, o padrão comum de ligações de cadeia principal, e o padrão comum de modificações de fósforo de cadeia principal são oligonucleotídeos da pluralidade.
Em algumas modalidades, cerca de 0,1% a 100%, (por exemplo, cerca de 1% a 100%, 5% a 100%, 10% a 100%, 20% a 100%, 30% a 100%, 40% a 100%, 50% a 100%, 60% a 100%, 70% a 100%, 80 a 100%, 90 a 100%, 95 a 100%, 50% a 90%, ou cerca de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99%, ou pelo menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99%) de todos os oligonucleotídeos em uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada, ou de todos os oligonucleotídeos em uma composição que compartilham uma sequência de base comum (por exemplo, de uma pluralidade de oligonucleotídeo ou um tipo de oligonucleotídeo), ou de todos os oligonucleotídeos em uma composição que compartilham uma sequência de base comum, um padrão comum de ligações de cadeia principal, e um padrão comum de modificações de fósforo de cadeia principal (por exemplo, de uma pluralidade de oligonucleotídeo ou um tipo de oligonucleotídeo), ou de todos os oligonucleotídeos em uma composição que compartilham uma sequência de base comum, um padrão comum de modificações de base, um padrão comum de modificações de açúcar, um padrão comum de tipos de ligação internucleotídica e/ou um padrão comum de modificações de ligação internucleotídica (por exemplo, de uma pluralidade de oligonucleotídeos ou um tipo de oligonucleotídeo), ou de todos os oligonucleotídeos em uma composição que compartilham a mesma constituição, são oligonucleotídeos da pluralidade.
Em algumas modalidades, uma porcentagem é pelo menos (DP)NCI, em que DP é uma porcentagem selecionada dentre 85% a 100%, e NCI é o número da ligação internucleotídica quiralmente controlada.
Em algumas modalidades, a DP é pelo menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%,
95%, 96%, 97%, 98%, ou 99%. Em algumas modalidades, a DP é pelo menos 85%. Em algumas modalidades, a DP é pelo menos 90%. Em algumas modalidades, a DP é pelo menos 95%. Em algumas modalidades, a DP é pelo menos 96%. Em algumas modalidades, a DP é pelo menos 97%. Em algumas modalidades, a DP é pelo menos 98%. Em algumas modalidades, a DP é pelo menos 99%. Em algumas modalidades, DP reflete a diastereopureza de ligações internucleotídicas quiralmente controladas de centros quirais de fósforo de ligação.
Em algumas modalidades, a diastereopureza de um centro quiral de fósforo de ligação de uma ligação internucleotídica pode ser tipicamente avaliada com o uso de um dímero adequado que compreende tal ligação internucleotídica e as duas unidades de nucleosídeo que são ligadas pela ligação internucleotídica.
Em algumas modalidades, a pluralidade de oligonucleotídeos compartilha a mesma estereoquímica em cerca de 1 a 50 (por exemplo, cerca de 1 a 10, 1 a 20, 5 a 10, 5 a 20, 10 a 15, 10 a 20, 10 a 25, 10 a 30, ou cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20, ou pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20) ligações internucleotídicas quirais.
Em algumas modalidades, a pluralidade de oligonucleotídeos compartilha a mesma estereoquímica em cerca de 0,1% a 100% (por exemplo, cerca de 1% a 100%, 5% a 100%, 10% a 100%, 20% a 100%, 30% a 100%, 40% a 100%, 50% a 100%, 60% a 100%, 70% a 100%, 80 a 100%, 90 a 100%, 95 a 100%, 50% a 90%, cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 100%, ou pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 99%) ligações internucleotídicas quirais.
Em algumas modalidades, cada ligação internucleotídica quiral é uma ligação internucleotídica controlada quiral, e a composição é uma composição de oligonucleotídeo completamente controlada de modo quiral. Em algumas modalidades, nem todas as ligações internucleotídicas quirais são ligações internucleotídicas controladas quirais, e a composição é uma composição de oligonucleotídeo parcialmente controlada de modo quiral. Em algumas modalidades, uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada compreende níveis predeterminados de tipos de oligonucleotídeos ou ácidos nucleicos individuais. Por exemplo, em algumas modalidades uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada compreende um tipo de oligonucleotídeo em um nível predeterminado (por exemplo, conforme descrito acima). Em algumas modalidades, uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada compreende mais de um tipo de oligonucleotídeo, cada um, independentemente em um nível predeterminado. Em algumas modalidades, uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada compreende múltiplos tipos de oligonucleotídeos, cada um, independentemente em um nível predeterminado. Em algumas modalidades, uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada é uma composição de oligonucleotídeos de um tipo de oligonucleotídeo, cuja composição compreende um nível predeterminado de uma pluralidade de oligonucleotídeos do tipo de oligonucleotídeo.
[00212] Quiralmente puro: conforme usado no presente documento, a expressão "quiralmente puro" é usado para descrever um oligonucleotídeo ou composições do mesmo, em que todas ou quase todas (o restante são impurezas) as moléculas de oligonucleotídeo existem em uma única diastereomérica em relação aos átomos de fósforo de ligação. Em muitas modalidades, conforme observado por aqueles versados na técnica, uma composição de oligonucleotídeo quiralmente pura é substancialmente pura pelo fato de que todos oligonucleotídeos na composição são estruturalmente idênticos (sendo o mesmo estereoisômero).
[00213] Fósforo de ligação: conforme definido no presente documento, a expressão "fósforo de ligação" é usada para indicar que o átomo de fósforo particular que denominado como o átomo de fósforo presente em uma ligação internucleotídica, cujo átomo de fósforo corresponde ao átomo de fósforo de uma ligação fosfato natural como ocorre no DNA e RNA de ocorrência natural. Em algumas modalidades, um átomo de fósforo de ligação é em uma ligação internucleotídica modificada. Em algumas modalidades, a átomo de fósforo de ligação é o P de PL da fórmula I. Em algumas modalidades, um átomo de fósforo de ligação é quiral.
[00214] Modificação P: conforme usado no presente documento, o termo "modificação P" se refere a qualquer modificação no fósforo de ligação diferente de uma modificação estereoquímica. Em algumas modalidades, uma modificação P compreende adição, substituição ou remoção de uma porção química pendente covalentemente ligada a um fósforo de ligação. Em algumas modalidades, a "modificação P" é W, Y, Z, ou –X–L–R1 da fórmula I.
[00215] Blockmer: o termo "blockmer", conforme usado no presente documento, se refere a um oligonucleotídeo cujo padrão de características estruturais que caracterizam cada unidade nucleotídica individual é caracterizado pela presença de pelo menos duas unidades de nucleotídeo consecutivas que compartilham uma característica estrutural comum na nucleobase, açúcar e/ou ligação internucleotídica. Característica estrutural comum significa química e/ou estereoquímica comum, por exemplo, modificações comuns nas nucleobases, açúcares e/ou ligações internucleotídicas e estereoquímica comum nos centros quirais de fósforo de ligação. Em algumas modalidades, as pelo menos duas unidades de nucleotídeo consecutivas que compartilham uma característica estrutural comum são denominadas como um "bloco".
[00216] Em algumas modalidades, um blockmer é um "stereoblockmer", por exemplo, pelo menos duas unidades de nucleotídeo consecutivas têm a mesma estereoquímica no fósforo de ligação. Pelo menos duas unidades de nucleotídeo consecutivas formam um "estereobloco.” Por exemplo, (Sp, Sp)- ATsCs1GA é um stereoblockmer pelo fato de que pelo menos duas unidades de nucleotídeo consecutivas, a Ts e a Cs1, têm a mesma estereoquímica no fósforo de ligação (ambas Sp). No mesmo oligonucleotídeo (Sp, Sp)-ATsCs1GA, TsCs1 forma um bloco, e o mesmo é um estereobloco.
[00217] Em algumas modalidades, um blockmer é um “blockmer de modificação P", por exemplo, pelo menos duas unidades de nucleotídeo consecutivas têm a mesma modificação no fósforo de ligação. Pelo menos duas unidades de nucleotídeo consecutivas formam um “bloco de modificação P". Por exemplo, (Rp, Sp)-ATsCsGA é um blockmer de modificação P pelo fato de que pelo menos duas unidades de nucleotídeo consecutivas, a Ts e a Cs, têm a mesma modificação P (isto é, ambas são um diéster de fosforotioato). No mesmo oligonucleotídeo de (Rp, Sp)- ATsCsGA, TsCs forma um bloco, e o mesmo é um bloco de modificação P.
[00218] Em algumas modalidades, um blockmer é um "blockmer de ligação", por exemplo, pelo menos duas unidades de nucleotídeo consecutivas têm estereoquímica idêntica e modificações idênticas no fósforo de ligação. Pelo menos duas unidades de nucleotídeo consecutivas formam um "bloco de ligação". Por exemplo, (Rp, Rp)-ATsCsGA é um blockmer de ligação pelo fato de que pelo menos duas unidades de nucleotídeo consecutivas, a Ts e a Cs, têm a mesma estereoquímica (ambas Rp) e modificação P (ambas fosforotioato). No mesmo oligonucleotídeo de (Rp, Rp)-ATsCsGA, TsCs forma um bloco, e o mesmo é um bloco de ligação.
[00219] Em algumas modalidades, um blockmer é um "blockmer de modificação de açúcar", por exemplo, pelo menos duas unidades de nucleotídeo consecutivas têm modificações de açúcar idênticas. Em algumas modalidades, um blockmer de modificação de açúcar é um blockmer 2'-F em que pelo menos duas unidades de nucleotídeo consecutivas têm modificação 2'-F em seus açúcares. Em algumas modalidades, um blockmer de modificação de açúcar é um blockmer 2'-OR em que pelo menos duas unidades de nucleotídeo consecutivas têm independentemente modificação 2'-OR em seus açúcares, em que cada R é independente conforme descrito na presente revelação. E algumas modalidades, um blockmer de modificação de açúcar é um blockmer 2'-OMe em que pelo menos duas unidades de nucleotídeo consecutivas têm modificação 2'-OMe em seus açúcares. Em algumas modalidades, um blockmer de modificação de açúcar é um blockmer 2'-MOE em que pelo menos duas unidades de nucleotídeo consecutivas têm modificação 2'-MOE em seus açúcares. Em algumas modalidades, um blockmer de modificação de açúcar é um blockmer LNA em que pelo menos duas unidades de nucleotídeo consecutivas têm açúcares LNA.
[00220] Em algumas modalidades, um blockmer compreende um ou mais blocos independentemente selecionados dentre um bloco de modificação de açúcar, um estereobloco, um bloco de modificação P e um bloco de ligação. Em algumas modalidades, um blockmer é um stereoblockmer em relação a um bloco, e/ou um blockmer de modificação P em relação a outro bloco e/ou um blockmer de ligação em relação a ainda outro bloco.
[00221] Altmer: o termo "altmer", conforme usado no presente documento, se refere a um oligonucleotídeo cujo padrão de características estruturais que caracterizam cada unidade nucleotídica individual é caracterizado pelo fato de que nenhuma das duas unidades de nucleotídeo consecutivas do fita de oligonucleotídeo compartilham uma característica estrutural particular na nucleobase, açúcar e/ou a ligação de fósforo internucleotídica. Em algumas modalidades, um n altmer é projetado de modo que o mesmo compreenda um padrão de repetição. Em algumas modalidades, um altmer é projetado de modo que o mesmo não compreenda um padrão de repetição.
[00222] Em algumas modalidades, um altmer é um "stereoaltmer", por exemplo, nenhuma das duas unidades de nucleotídeo consecutivas têm a mesma estereoquímica no fósforo de ligação. Por exemplo, (Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp)- GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC.
[00223] Gapmer: conforme usado no presente documento, o termo "gapmer" se refere a um oligonucleotídeo caracterizado pelo fato de que uma ou mais unidades de nucleotídeo (lacuna) não têm as características estruturais (por exemplo, modificações de nucleobase, modificações de açúcar, modificações de ligação internucleotídica, estereoquímica de fósforo de ligação, etc.) contidas pelas unidades de nucleotídeo que flanqueiam uma ou mais unidades de nucleotídeo em ambas as extremidades. Em algumas modalidades, um gapmer compreende um lacuna de uma ou mais ligações fosfato naturais, independentemente flanqueada em ambas as extremidades por ligações internucleotídicas não naturais. Em algumas modalidades, um gapmer é um gapmer de modificação de açúcar, em que o gapmer compreende uma lacuna de uma ou mais unidades de nucleotídeo que não compreendem modificações de açúcar que o nucleotídeo de flanqueamento contém em ambas as extremidades. Em algumas modalidades, um gapmer compreende uma lacuna, em que cada unidade nucleotídica na região de lacuna não contém modificação 2' que está contida nas unidades de nucleotídeo que flanqueiam a lacuna em ambas as extremidades. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido que compreende uma lacuna, em que cada unidade nucleotídica na região de lacuna não contém modificação 2'-OR, enquanto as unidades de nucleotídeo que flanqueiam a lacuna em cada extremidade compreendem independentemente uma modificação 2'- OR. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido que compreende uma lacuna, em que cada unidade nucleotídica na região de lacuna não contém modificação 2'-F, enquanto as unidades de nucleotídeo que flanqueiam a lacuna em cada extremidade compreendem independentemente uma modificação 2'- F.
[00224] Skipmer: conforme usado no presente documento, o termo "skipmer" se refere a um tipo de gapmer em que todas as outras ligações de fósforo internucleotídicas da fita de oligonucleotídeo são uma ligação diéster de fosfato (uma ligação fosfato natural), por exemplo, tais como aquelas encontradas no DNA ou RNA de ocorrência natural, e todas as outras ligações de fósforo internucleotídicas da fita de oligonucleotídeo são uma ligação internucleotídica modificada (uma ligação internucleotídica não natural).
[00225] Para propósitos desta revelação, os elementos químicos são identificados de acordo com a Tabela Periódica dos Elementos, versão CAS, Handbook of Chemistry e Physics, 67ª Ed., 1986-87, capa interna.
[00226] A menos que especificado de outro modo, os sais, tais como sais de adição de ácido ou base farmaceuticamente aceitáveis, formas estereoisoméricas e formas tautoméricas dos compostos (por exemplo, oligonucleotídeos, agentes, etc.) são incluídos. A menos que especificado de outro modo, as formas singulares "um", "uma", "o" e “a” incluem a referência no plural, a menos que o contexto indique claramente de outro modo (e vice-versa). Desse modo, por exemplo, uma referência a "um composto" pode incluir uma pluralidade de tais compostos.
DESCRIÇÃO DETALHADA DE DETERMINADAS MODALIDADES
[00227] Os oligonucleotídeos sintéticos fornecem ferramentas moleculares úteis em uma ampla variedade de aplicações. Por exemplo, os oligonucleotídeos são úteis em aplicações terapêuticas, de diagnóstico, de pesquisa e novos nanomateriais. O uso de ácidos nucleicos de ocorrência natural (por exemplo, DNA ou RNA não modificado) é limitado, por exemplo, por sua suscetibilidade a endo e exonucleases. Dessa forma, várias contrapartes sintéticas foram desenvolvidas para contornar essas deficiências. Essas incluem oligonucleotídeos sintéticos que contêm modificação química, por exemplo, modificações de base, modificações de açúcar, modificações de cadeia principal, etc., que, entre outros aspectos, tornam essas moléculas menos suscetíveis à degradação e aprimoram outras propriedades de oligonucleotídeos. As modificações químicas também podem levar a certos efeitos indesejados, tal como toxicidades aumentadas, etc. A partir de um ponto de vista estrutural, as modificações para ligações fosfato naturais podem introduzir quiralidade, e certas propriedades de oligonucleotídeos podem ser afetadas pelas configurações dos átomos de fósforo que formam a cadeia principal dos oligonucleotídeos.
[00228] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo ou composição de oligonucleotídeo é: um oligonucleotídeo DMD ou composição de oligonucleotídeo; um oligonucleotídeo ou composição de oligonucleotídeo que compreende uma ligação internucleotídica não negativamente carregada; ou um oligonucleotídeo DMD que compreende uma ligação internucleotídica não negativamente carregada.
[00229] Em algumas modalidades, a quiralidade da cadeia principal (por exemplo, as configurações dos átomos de fósforo) ou inclusão de ligações fosfato naturais ou ligações internucleotídicas não naturais na cadeia principal e/ou modificações de um açúcar e/ou nucleobase, e/ou a adição de porções químicas pode afetar as propriedades e atividades dos oligonucleotídeos, por exemplo, a capacidade de um oligonucleotídeo DMD (por exemplo, um oligonucleotídeo antissenso para uma sequência de transcrição de Distrofina (DMD)) para ignorar um ou mais éxons, e/ou outras propriedades de um oligonucleotídeo DMD, incluindo, porém sem limitação, estabilidade aumentada, farmacocinética aprimorada e/ou imunogenicidade diminuída, etc. Os ensaios adequados para avaliar propriedades e/ou atividades dos compostos fornecidos, por exemplo, oligonucleotídeos, e composições dos mesmos são amplamente conhecidos na técnica e podem ser utilizados de acordo com a presente revelação. Por exemplo, para testar a imunogenicidade, vários oligonucleotídeos DMD foram testados em soro de camundongo in vivo e demonstraram ativação mínima de citocinas , e vários oligonucleotídeos DMD foram testados ex vivo em PBMC humana (células mononucleares do sangue periférico) para atividade de citocina (por exemplo, IL-12p40, IL-12p70, IL-1alfa, IL-1beta, IL-6, MCP-1, MIP-1alfa, MIP- 1beta, e TNF-alfa).
[00230] Em algumas modalidades, as tecnologias (por exemplo, oligonucleotídeos, composições, e métodos de uso dos mesmos) da presente revelação podem ser utilizadas para ter como alvo vários ácidos nucleicos (por exemplo, por meio de hibridização com uma sequência alvo de um ácido nucleico alvo, e/ou fornecimento de redução de nível, degradação, modulação de splicing, supressão de transcrição, etc. do ácido nucleico alvo, etc.) Em algumas modalidades, as tecnologias fornecidas são particularmente úteis para modular o splicing de transcrições, por exemplo, para aumentar o níveis de produtos de splicing desejados e/ou para reduzir os níveis de produtos de splicing indesejados. Em algumas modalidades, as tecnologias fornecidas são particularmente úteis para reduzir os níveis de transcrições, por exemplo, pré-mRNA, RNA, etc., e em muitos casos, reduzir os níveis de produtos que se originam de ou são codificados por tais transcrições, tais como mRNA, proteínas, etc.
[00231] Em algumas modalidades, uma transcrição é pré-mRNA. Em algumas modalidades, um produto de splicing é RNA maduro. Em algumas modalidades, um produto de splicing é mRNA. Em algumas modalidades, a modulação ou alteração de splicing compreende salto de um ou mais éxons. Em algumas modalidades, o splicing de uma transcrição é aprimorado pelo fato de que o salto de éxon aumenta os níveis de mRNA e proteínas que têm atividades benéficas aprimoradas em comparação com a ausência de salto de éxon. Em algumas modalidades, um éxon que causa deslocamento de quadro é ignorado. Em algumas modalidades, um éxon que compreende uma mutação indesejada é ignorado. Em algumas modalidades, um éxon que compreende um códon de parada prematura é ignorado. Uma mutação indesejada pode ser uma mutação que causa alterações nas sequências de proteínas; a mesma também pode ser uma mutação silenciosa. Em algumas modalidades, uma transcrição é uma transcrição de Distrofina (DMD).
[00232] Em algumas modalidades, o splicing de uma transcrição é aprimorado pelo fato de que o salto de éxon reduz os níveis de mRNA e proteínas que têm atividades indesejadas em comparação com a ausência de salto de éxon. Em algumas modalidades, um alvo é submetido a knockdown através do salto de éxon que, ao ignorar um ou mais éxons, causa o códon de parada prematura e/ou mutações de deslocamento de quadro. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos nas composições fornecidas, por exemplo, oligonucleotídeos de uma pluralidade, compreendem modificações de base, modificações de açúcar e/ou modificações de ligação internucleotídica. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos compreendem modificações de base e modificações de açúcar.
Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos compreendem modificações de base e modificações de ligação internucleotídica.
Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos compreendem modificações de açúcar e modificações internucleotídicas.
Em algumas modalidades, as composições fornecidas compreendem modificações de base, modificações de açúcar e modificações de ligação internucleotídica.
As modificações químicas exemplificativas, tais como as modificações de base, modificações de açúcar, modificações de ligação internucleotídica, etc. são amplamente conhecidas na técnica incluindo, porém sem limitação aquelas descritas nesta revelação.
Em algumas modalidades, uma base modificada é A, T, C, G ou U substituído.
Em algumas modalidades, uma modificação de açúcar é a modificação 2'. Em algumas modalidades, uma modificação 2' é a modificação 2-F.
Em algumas modalidades, uma modificação 2' é 2'-OR1, em que R1 não é hidrogênio.
Em algumas modalidades, uma modificação 2' é 2'-OR1, em que R1 é alquila opcionalmente substituída.
Em algumas modalidades, uma modificação 2' é 2'-OMe.
Em algumas modalidades, uma modificação 2' é 2'-MOE.
Em algumas modalidades, uma porção química de açúcar modificada é um anel bicíclico ou policíclico em ponte.
Em algumas modalidades, uma porção química de açúcar modificada é um anel bicíclico ou policíclico em ponte tendo 5 a 20 átomos de anel, em que um ou mais átomos de anel são opcional e independentemente heteroátomos.
As estruturas de anel exemplificativas são amplamente conhecidas na técnica, tais como aquelas encontradas em BNA, LNA, etc.
Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos compreendem tanto uma ou mais ligações internucleotídicas modificadas como uma ou mais ligações fosfato naturais. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos que compreendem tanto ligação internucleotídica modificada como ligação fosfato natural e composições das mesmas, fornecem propriedades aprimoradas, por exemplo, atividades e toxicidades, etc. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica modificada é uma ligação internucleotídica quiral. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica modificada é uma ligação fosforotioato. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica modificada é uma ligação fosforotioato substituída.
[00233] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos compreendem uma ou mais ligações internucleotídicas não negativamente carregadas. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada é uma ligação internucleotídica positivamente carregada. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada é uma ligação internucleotídica neutra. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica modificada (por exemplo, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada) compreende triazolila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica modificada (por exemplo, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada) compreende alquinila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica modificada compreende uma porção química de triazol ou alcino. Em algumas modalidades, uma porção química de triazol, por exemplo, um grupo triazolila, é opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, uma porção química de triazol, por exemplo, um grupo triazolila é substituída. Em algumas modalidades, uma porção química de triazol é não substituída. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica modificada compreende uma porção química de guanidina opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica modificada compreende uma porção química de guanidina cíclica opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica modificada compreende uma porção química de guanidina cíclica opcionalmente substituída e tem a estrutura de: , , ou , em que W é O ou S. Em algumas modalidades, W é O. Em algumas modalidades, W é S. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada é estereoquimicamente controlada.
[00234] Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica que compreende uma porção química de guanidina opcionalmente substituída é uma ligação internucleotídica da fórmula I-n-2, I-n-3, I-n-4, II-a-2, II- b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, ou II-d-2 conforme descrito no presente documento. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica que compreende uma porção química de guanidina cíclica opcionalmente substituída é uma ligação internucleotídica da fórmula II-a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, ou II-d-2.
[00235] Entre outros fatores, a presente revelação abrange o reconhecimento de que preparações de oligonucleotídeo estereoaleatórias contêm uma pluralidade de entidades químicas distintas que diferem umas das outras, por exemplo, na estrutura estereoquímica de individual centros quirais de fósforo de ligação de cadeia principal dentro da cadeia de oligonucleotídeo. Sem controle de estereoquímica de centros quirais de cadeia principal, as preparações de oligonucleotídeo estereoaleatórias fornecem composições não controladas que compreendem níveis indeterminados de estereoisômeros de oligonucleotídeo em relação aos centros quirais não controlados, por exemplo, fósforo de ligação quiral. Mesmo que esses estereoisômeros possam ter a mesma sequência de base, eles são entidades químicas diferentes pelo menos devido à sua estereoquímica de cadeia principal diferente, e eles podem ter, conforme demonstrado no presente documento, propriedades diferentes, por exemplo, atividades, toxicidades, etc. Entre outros fatores, a presente revelação fornece novas composições de oligonucleotídeo em que a estereoquímica de um ou mais centros quirais de fósforo de ligação é independentemente controlada (por exemplo, in ligações internucleotídicas quiralmente controladas). Em algumas modalidades, a presente revelação fornece composições de oligonucleotídeo quiralmente controladas que são ou contêm estereoisômeros particulares de oligonucleotídeos de interesse.
[00236] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos contêm níveis aumentados de um ou mais isótopos. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos são identificados, por exemplo, por um ou mais isótopos de um ou mais elementos, por exemplo, hidrogênio, carbono, nitrogênio, etc. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos nas composições fornecidas, por exemplo, os oligonucleotídeos de uma pluralidade, compreendem modificações de base, modificações de açúcar e/ou modificações de ligação internucleotídica, em que os oligonucleotídeos contêm um nível enriquecido de deutério. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos são identificados com deutério (substituindo −1H por −2H) em uma ou mais posições. Em algumas modalidades, um ou mais 1H de um oligonucleotídeo ou qualquer porção química conjugada ao oligonucleotídeo (por exemplo, uma porção química de alvejamento, lipídio, etc.) são substituídos 2H. Tais oligonucleotídeos podem ser usados em qualquer composição ou método descrito no presente documento.
[00237] Em algumas modalidades, em um oligonucleotídeo, um padrão de centros quirais de cadeia principal pode fornecer atividade (ou atividades) ou característica (características) aprimorada, incluindo, porém sem limitação: salto aprimorado de um ou mais éxons, estabilidade aumentada, atividade aumentada, estabilidade e atividade aumentadas, baixa toxicidade, baixa resposta imune, perfil de ligação de proteína aprimorado, ligação aumentada a determinadas proteínas e/ou entrega melhorada.
[00238] Em algumas modalidades, um padrão de centros quirais de cadeia principal é ou compreende S, SS, SSS, SSSS, SSSSS, SSSSSS, SSSSSSS, SOS, SSOSS, SSSOSSS, SSSSOSSSS, SSSSSOSSSSS, SSSSSSOSSSSSS, SSSSSSSOSSSSSSS, SSSSSSSSOSSSSSSSS, SSSSSSSSSOSSSSSSSSS, SOSOSOSOS, SSOSOSOSOSS, SSSOSOSOSOSSS, SSSSOSOSOSOSSSS, SSSSSOSOSOSOSSSSS, SSSSSSOSOSOSOSSSSSS, SOSOSSOOS,
SSOSOSSOOSS, SSSOSOSSOOSSS, SSSSOSOSSOOSSSS, SSSSSOSOSSOOSSSSS, SSSSSSOSOSSOOSSSSSS, SOSOOSOOS, SSOSOOSOOSS, SSSOSOOSOOSSS, SSSSOSOOSOOSSSS, SSSSSOSOOSOOSSSSS, SSSSSSOSOOSOOSSSSSS, SOSOSSOOS, SSOSOSSOOSO, SSSOSOSSOOSOS, SSSSOSOSSOOSOSS, SSSSSOSOSSOOSOSSS, SSSSSSOSOSSOOSOSSSS, SOSOOSOOSO, SSOSOOSOOSOS, SSSOSOOSOOSOS, SSSSOSOOSOOSOSS, SSSSSOSOOSOOSOSSS, SSSSSSOSOOSOOSOSSSS, SSOSOSSOO, SSSOSOSSOOS, SSSSOSOSSOOS, SSSSSOSOSSOOSS, SSSSSSOSOSSOOSSS, OSSSSSSOSOSSOOSSS, OOSSSSSSOSOSSOOS, OOSSSSSSOSOSSOOSS, OOSSSSSSOSOSSOOSSS, OOSSSSSSOSOSSOOSSSS, OOSSSSSSOSOSSOOSSSSS, e/ou OOSSSSSSOSOSSOOSSSSSS, RS, SR, SRS, SRSS, SSRS, RR, RRR, RRRR, RRRRR, SRR, RRS, SRRS, SSRRS, SRRSS, SRRR, RRRS, SRRRS, SSRRRS, SSRRRS, RSRRR, SRRRSR, SSSRSSS, SSSSRSSSS, SSSSSRSSSSS, SSSSSSRSSSSSS, SSSSSSSRSSSSSSS, SSSSSSSSRSSSSSSSS, SSSSSSSSSRSSSSSSSSS, SRSRSRSRS, SSRSRSRSRSS, SSSRSRSRSRSSS, SSSSRSRSRSRSSSS, SSSSSRSRSRSRSSSSS, SSSSSSRSRSRSRSSSSSS, SRSRSSRRS, SSRSRSSRRSS, SSSRSRSSRRSSS, SSSSRSRSSRRSSSS, SSSSSRSRSSRRSSSSS, SSSSSSRSRSSRRSSSSSS, SRSRRSRRS, SSRSRRSRRSS, SSSRSRRSRRSSS, SSSSRSRRSRRSSSS, SSSSSRSRRSRRSSSSS, SSSSSSRSRRSRRSSSSSS, SRSRSSRRS, SSRSRSSRRSR, SSSRSRSSRRSRS, SSSSRSRSSRRSRSS, SSSSSRSRSSRRSRSSS, SSSSSSRSRSSRRSRSSSS, SRSRRSRRSR, SSRSRRSRRSRS, SSSRSRRSRRSRS, SSSSRSRRSRRSRSS, SSSSSRSRRSRRSRSSS, SSSSSSRSRRSRRSRSSSS, SSRSRSSRR, SSSRSRSSRRS, SSSSRSRSSRRS, SSSSSRSRSSRRSS, SSSSSSRSRSSRRSSS, RSSSSSSRSRSSRRSSS, RRSSSSSSRSRSSRRS, RRSSSSSSRSRSSRRSS, RRSSSSSSRSRSSRRSSS, RRSSSSSSRSRSSRRSSSS, RRSSSSSSRSRSSRRSSSSS, (R)n(S)m, (S)t(R)n, (O)t(R)n(S)m, (S)t(O)m,
(O)m(S)t, (S)t(R)n(S)m, (S)t(O)m(S)n, (S)t(O)m, em que t, m e n são independentemente 1 a 20, O é uma ligação internucleotídica não quiral, R é uma ligação internucleotídica quiral Rp, e S é uma ligação internucleotídica quiral Sp. Em algumas modalidades, o centro não quiral é uma ligação fosfodiéster. Em algumas modalidades, o centro quiral em uma configuração Sp é uma ligação fosforotioato.
[00239] Em algumas modalidades, a região de extremidade 5' dos oligonucleotídeos fornecidos, por exemplo, um flanco 5', compreende um padrão de estereoquímica de S, SS, SSS, SSSS, SSSSS, SSSSSS, ou SSSSSS. Em algumas modalidades, cada S é ou representa uma ligação internucleotídica fosforotioato Sp. Em algumas modalidades, a região de extremidade 5' dos oligonucleotídeos fornecidos, por exemplo, um flanco 5', compreende um padrão de estereoquímica de S, SS, SSS, SSSS, SSSSS, SSSSSS, ou SSSSSS, em que o primeiro S representa a primeira (a extremidade 5') ligação internucleotídica de um oligonucleotídeo fornecido. Em algumas modalidades, uma ou mais unidades nucleotídicas que compreendem uma ligação internucleotídica Sp na região de extremidade 5' compreendem independentemente −F. Em algumas modalidades, cada unidade nucleotídica que compreende uma ligação internucleotídica Sp na região de extremidade 5' compreende independentemente −F. Em algumas modalidades, uma ou mais unidades nucleotídicas que compreendem uma ligação internucleotídica Sp na região de extremidade 5' compreendem independentemente uma modificação de açúcar. Em algumas modalidades, cada unidade nucleotídica que compreende uma ligação internucleotídica Sp na região de extremidade 5' compreende independentemente uma modificação de açúcar. Em algumas modalidades, cada modificação 2' é igual.
Em algumas modalidades, uma modificação de açúcar é uma modificação 2'. Em algumas modalidades, uma modificação 2' é 2'-OR1. Em algumas modalidades, uma modificação 2' é 2'-F.
Em algumas modalidades, a região de extremidade 3' de oligonucleotídeos fornecidos, por exemplo, um flanco 3’, compreende uma padrão de estereoquímica de S, SS, SSS, SSSS, SSSSS, SSSSSS, ou SSSSSS.
Em algumas modalidades, cada S é ou representa uma ligação internucleotídica fosforotioato Sp.
Em algumas modalidades, a região de extremidade 3' dos oligonucleotídeos fornecidos, por exemplo, um flanco 3', compreende um padrão de estereoquímica de S, SS, SSS, SSSS, SSSSS, SSSSSS, ou SSSSSS, em que o último S representa a última (a extremidade 3') ligação internucleotídica de um oligonucleotídeo fornecido.
Em algumas modalidades, cada S representa uma ligação internucleotídica fosforotioato Sp.
Em algumas modalidades, uma ou mais unidades nucleotídicas que compreendem uma ligação internucleotídica Sp na região de extremidade 3' compreendem independentemente −F.
Em algumas modalidades, cada unidade nucleotídica que compreende uma ligação internucleotídica Sp na região de extremidade 3' compreende independentemente −F.
Em algumas modalidades, uma ou mais unidades nucleotídicas que compreendem uma ligação internucleotídica Sp na região de extremidade 3' compreendem independentemente uma modificação de açúcar.
Em algumas modalidades, cada unidade nucleotídica que compreende uma ligação internucleotídica Sp na região de extremidade 3' compreende independentemente uma modificação de açúcar.
Em algumas modalidades, cada modificação 2' é igual.
Em algumas modalidades, uma modificação de açúcar é uma modificação 2'. Em algumas modalidades, uma modificação 2' é
2'-OR1. Em algumas modalidades, uma modificação 2' é 2'-F.
Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos compreendem tanto uma região de extremidade 5', por exemplo, um flanco 5', como uma região de extremidade 3', por exemplo, um flanco de extremidade 3', conforme descrito no presente documento.
Em algumas modalidades, a região de extremidade 5' compreende um padrão de estereoquímica de SS, em que o primeiro S representa a primeira ligação internucleotídica de um oligonucleotídeo fornecido, a região de extremidade 3' compreende um padrão de estereoquímica de SS, em que uma ou mais unidades nucleotídicas que compreendem uma ligação internucleotídica Sp na ou região de extremidade 5' ou 3' compreendem −F.
Em algumas modalidades, a região de extremidade 5' compreende um padrão de estereoquímica de SS, em que o primeiro S representa a primeira ligação internucleotídica de um oligonucleotídeo fornecido, a região de extremidade 3' compreende um padrão de estereoquímica de SS, em que uma ou mais unidades nucleotídicas que compreendem uma ligação internucleotídica Sp na região de extremidade 5’ ou 3' compreendem uma modificação de açúcar 2'-F.
Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos compreendem adicionalmente uma região intermediária entre as regiões de extremidade 5' e 3', por exemplo, uma região de núcleo, que compreende uma ou mais ligações fosfato naturais.
Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos compreendem adicionalmente uma região intermediária entre as regiões de extremidade 5' e extremidade 3', por exemplo, uma região de núcleo, que compreende uma ou mais ligações fosfato naturais e uma ou mais ligações internucleotídicas.
Em algumas modalidades, uma região intermediária compreende uma ou mais porções químicas de açúcar, em que cada porção química de açúcar compreende independentemente uma modificação 2'-OR1. Em algumas modalidades, uma região intermediária compreende uma ou mais porções químicas de açúcar que não compreendem modificação 2'-F. Em algumas modalidades, uma região intermediária compreende uma ou mais ligações internucleotídicas Sp. Em algumas modalidades, uma região intermediária compreende uma ou mais ligações internucleotídicas Sp e uma ou mais ligações fosfato naturais. Em algumas modalidades, uma região intermediária compreende uma ou mais ligações internucleotídicas Rp. Em algumas modalidades, uma região intermediária compreende uma ou mais ligações internucleotídicas Rp e uma ou mais ligações fosfato naturais. Em algumas modalidades, uma região intermediária compreende uma ou mais ligações internucleotídicas Rp e uma ou mais ligações internucleotídicas Sp.
[00240] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos compreendem uma ou mais ligações internucleotídicas modificadas. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos compreendem uma ou mais ligações internucleotídicas modificadas quirais. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos compreendem uma ou mais ligações internucleotídicas modificadas quirais quiralmente controladas. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos compreendem uma ou mais ligações fosfato naturais. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos compreendem uma ou mais ligações internucleotídicas modificadas e uma ou mais ligações fosfato naturais. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica modificada é uma ligação fosforotioato. Em algumas modalidades, cada ligação internucleotídica modificada é uma ligação fosforotioato. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica modificada compreende um triazol, triazol substituído, alcino ou Tmg.
[00241] Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a um ácido nucleico que compreende uma ligação internucleotídica modificada que compreende uma porção química de triazol ou alcino. Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a um ácido nucleico que compreende uma ligação internucleotídica modificada que compreende uma triazolila ou alquinila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, tal ácido nucleico é um siRNA, siRNA de fita dupla, siRNA de fita simples, oligonucleotídeo, gapmer, skipmer, blockmer, oligonucleotídeo antissenso, antagomir, microRNA, pré-microRNA, antimir, supermir, ribozima, adaptador de Ul, ativador de RNA, agente de RNAi, oligonucleotídeo decoy, oligonucleotídeo formador de triplex, aptâmero ou adjuvante. Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a um oligonucleotídeo que compreende uma ligação internucleotídica modificada que compreende uma porção química de triazol ou alcino. Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a um oligonucleotídeo DMD que compreende uma ligação internucleotídica modificada que compreende uma porção química de triazol ou alcino. Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a um ácido nucleico que compreende uma ligação internucleotídica modificada que compreende uma porção química de triazol. Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a um ácido nucleico que compreende uma ligação internucleotídica modificada que compreende triazolila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a um ácido nucleico que compreende uma ligação internucleotídica modificada que compreende uma porção química de triazol opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a um ácido nucleico que compreende uma ligação internucleotídica modificada que compreende uma porção química de alcino. Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a um ácido nucleico ou oligonucleotídeo que compreende, em uma extremidade 5', uma estrutura da fórmula: , , ou , em que W é O ou S. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo é um siRNA de fita simples que compreende, em uma extremidade 5', uma estrutura da fórmula: , , ou , em que W é O ou S. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica modificada é qualquer ligação internucleotídica modificada descrita em Krishna et al. 2012 J. Am. Chem. Soc. 134: 11618-11631.
[00242] Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a um ácido nucleico que compreende uma ligação internucleotídica modificada que compreende uma porção química de guanidina. Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a um ácido nucleico que compreende uma ligação internucleotídica modificada que compreende uma porção química de guanidina cíclica.
Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a um ácido nucleico que compreende uma ligação internucleotídica modificada que compreende uma porção química de guanidina cíclica e tem a estrutura de:
, em que W é O ou S.
Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica neutra ou ligação internucleotídica que compreende uma guanidina cíclica é quiralmente controlada.
Em algumas modalidades, um ácido nucleico que compreende uma ligação internucleotídica não negativamente carregada ou uma ligação internucleotídica modificada que compreende uma porção química de guanidina cíclica é um siRNA, siRNA de fita dupla, siRNA de fita simples, oligonucleotídeo, gapmer, skipmer, blockmer, oligonucleotídeo antissenso, antagomir, microRNA, pré-microRNA, antimir, supermir, ribozima, adaptador de Ul, ativador de RNA, agente de RNAi, oligonucleotídeo decoy, oligonucleotídeo formador de triplex, aptâmero ou adjuvante.
Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a um oligonucleotídeo que compreende uma ligação internucleotídica modificada que compreende uma porção química de guanidina cíclica.
Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a um oligonucleotídeo que compreende uma ligação internucleotídica modificada que tem a estrutura de:
, em que W é O ou S.
Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica neutra ou ligação internucleotídica que compreende uma porção química de guanidina cíclica é quiralmente controlada.
Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a um oligonucleotídeo DMD que compreende uma ligação internucleotídica modificada que compreende uma porção química de guanidina cíclica.
Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a um oligonucleotídeo DMD que compreende uma ligação internucleotídica modificada que tem a estrutura de: , em que W é O ou S.
Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica neutra ou ligação internucleotídica que compreende uma porção química de guanidina cíclica é quiralmente controlada.
Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a um ácido nucleico que compreende uma ligação internucleotídica modificada que compreende uma porção química de guanidina cíclica.
Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a um ácido nucleico que compreende uma ligação internucleotídica modificada que tem a estrutura de: , em que W é O ou S.
Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a um ácido nucleico ou oligonucleotídeo que compreende, em uma extremidade 5', uma estrutura que compreende uma porção química de guanidina cíclica.
Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a um ácido nucleico ou oligonucleotídeo que compreende, em uma extremidade 5', uma estrutura da fórmula: , em que W é O ou S. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo é um siRNA de fita simples que compreende, em uma extremidade 5', uma estrutura que compreende uma porção química de guanidina cíclica. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo é a siRNA de fita simples que compreende, em uma extremidade 5', uma estrutura da fórmula: , em que W é O ou S. Em algumas modalidades, a ligação internucleotídica compreende (em que W é O ou S) e é quiralmente controlada.
[00243] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos podem se ligar a uma transcrição, e alterar o padrão de splicing da transcrição. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos fornecem salto de éxon de um éxon, com eficiência maior que um oligonucleotídeo comparável sob uma ou mais condições adequadas, por exemplo, conforme descrito no presente documento. Em algumas modalidades, uma eficiência de salto fornecida é pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% maior que, ou 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50 ou mais vezes do que aquela de um oligonucleotídeo comparável sob uma ou mais condições adequadas, por exemplo,
conforme descrito no presente documento. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo comparável é um oligonucleotídeo que tem menos ou nenhuma ligação internucleotídica quiralmente controlada e/ou menos ou nenhuma ligação internucleotídica não negativamente carregada, porém é, de outro modo, idêntico.
[00244] Em algumas modalidades, a presente revelação demonstra que modificações 2'-F, entre outros aspectos, pode aprimorar a eficiência de salto de éxon. Em algumas modalidades, a presente revelação demonstra que ligações internucleotídicas Sp, entre outros aspectos, nas extremidades 5’ e 3’ podem aprimorar a estabilidade de oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, a presente revelação demonstra que, entre outros aspectos, as ligações fosfato naturais e/ou ligações internucleotídicas Rp podem aprimorar a remoção de oligonucleotídeos de um sistema. Conforme observado por uma pessoa de habilidade comum na técnica, vários ensaios conhecidos na técnica podem ser utilizados para avaliar tais propriedades de acordo com a presente revelação.
[00245] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos compreendem uma ou mais porções químicas de açúcar modificadas. Em algumas modalidades, uma porção química de açúcar modificada compreende uma modificação 2'. Em algumas modalidades, uma porção química de açúcar modificada compreende uma modificação 2'. Em algumas modalidades, uma modificação 2' é 2'-OR1. Em algumas modalidades, uma modificação 2' é um 2'-OMe. Em algumas modalidades, uma modificação 2' é um 2'-MOE. Em algumas modalidades, uma modificação 2' é uma modificação de açúcar LNA. Em algumas modalidades, uma modificação 2' é 2'-F. Em algumas modalidades, cada modificação de açúcar é independentemente uma modificação 2'. Em algumas modalidades, cada modificação de açúcar é independentemente 2'-OR1 ou 2'-F. Em algumas modalidades, cada modificação de açúcar é independentemente 2'-OR1 ou 2'-F, em que R1 é C1-6 alquila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, cada modificação de açúcar é independentemente 2'-OR1 ou 2'-F, em que pelo menos um é 2'-F. Em algumas modalidades, cada modificação de açúcar é independentemente 2'-OR1 ou 2'-F, em que R1 é C1-6 alquila opcionalmente substituída, e em que pelo menos um é 2'-OR1. Em algumas modalidades, cada modificação de açúcar é independentemente 2'-OR1 ou 2'-F, em que pelo menos um é 2'-F, e pelo menos um é 2'-OR1. Em algumas modalidades, cada modificação de açúcar é independentemente 2'-OR1 ou 2'-F, em que R1 é C1-6 alquila opcionalmente substituída, e em que pelo menos um é 2'-F, e pelo menos um é 2'-OR1.
[00246] Em algumas modalidades, 5% ou mais das porções químicas de açúcar de oligonucleotídeos fornecidos são modificadas. Em algumas modalidades, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou mais das porções químicas de açúcar de oligonucleotídeos fornecidos são modificadas. Em algumas modalidades, cada porção química de açúcar de oligonucleotídeos fornecidos é modificada. Em algumas modalidades, uma porção química de açúcar modificada compreende uma modificação 2'. Em algumas modalidades, uma porção química de açúcar modificada compreende uma modificação 2'. Em algumas modalidades, uma modificação 2' é 2'-OR1. Em algumas modalidades, uma modificação 2' é um 2'-OMe. Em algumas modalidades, uma modificação 2' é um 2'-MOE. Em algumas modalidades, uma modificação 2' é uma modificação de açúcar
LNA. Em algumas modalidades, uma modificação 2' é 2'-F. Em algumas modalidades, cada modificação de açúcar é independentemente uma modificação 2'. Em algumas modalidades, cada modificação de açúcar é independentemente 2'-OR1 ou 2'-F. Em algumas modalidades, cada modificação de açúcar é independentemente 2'-OR1 ou 2'-F, em que R1 é C1-6 alquila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, cada modificação de açúcar é independentemente 2'-OR1 ou 2'-F, em que pelo menos um é 2'-F. Em algumas modalidades, cada modificação de açúcar é independentemente 2'-OR1 ou 2'-F, em que R1 é C1-6 alquila opcionalmente substituída, e em que pelo menos um é 2'-OR1. Em algumas modalidades, cada modificação de açúcar é independentemente 2'-OR1 ou 2'-F, em que pelo menos um é 2'-F, e pelo menos um é 2'-OR1. Em algumas modalidades, cada modificação de açúcar é independentemente 2'-OR1 ou 2'-F, em que R1 é C1-6 alquila opcionalmente substituída, e em que pelo menos um é 2'-F, e pelo menos um é 2'-OR1.
[00247] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos compreendem um ou mais 2'-F. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos compreendem dois ou mais 2'-F.
[00248] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos compreendem porções químicas de açúcar modificadas 2'-F alternadas e porções químicas de açúcar modificadas 2'-OR1. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos compreendem porções químicas de açúcar modificadas 2'-F alternadas e porções químicas de açúcar modificadas 2'-OMe, por exemplo, [(2'-F)(2'-OMe)]x, [(2'- OMe)(2'-F)]x, etc., em que x é 1 a 50. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos compreendem pelo menos dois pares de modificações 2'-F e 2'-OMe alternadas. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos compreendem ligações internucleotídicas fosfodiéster e fosforotioato alternadas, por exemplo, [(PO)(PS)]x, [(PS)(PO)]x, etc., em que x é 1 a 50. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos compreendem pelo menos dois pares de ligações internucleotídicas fosfodiéster e fosforotioato alternadas.
[00249] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos compreendem uma ou mais ligações fosfato naturais e uma ou mais ligações internucleotídicas modificadas. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos compreendem uma ou mais ligações fosfato naturais e uma ou mais ligações internucleotídicas modificadas e uma ou mais ligações internucleotídicas não negativamente carregadas.
[00250] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição de oligonucleotídeo que compreende uma pluralidade de oligonucleotídeos, em que: oligonucleotídeos da pluralidade têm a mesma sequência de base; e oligonucleotídeos da pluralidade compreendem uma ou mais porções químicas de açúcar modificadas, ou compreendem uma ou mais ligações fosfato naturais e uma ou mais ligações internucleotídicas modificadas.
[00251] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos de uma pluralidade compreendem uma ou mais porções químicas de açúcar modificadas. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos compreendem uma ou mais porções químicas de açúcar modificadas. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos compreendem 2 ou mais porções químicas de açúcar modificadas. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos compreendem 3 ou mais porções químicas de açúcar modificadas.
[00252] Em algumas modalidades, as composições fornecidas alteram o splicing de transcrição, de modo que uma função alvo e/ou biológica indesejada seja suprimida.
[00253] Em algumas modalidades, as composições fornecidas alteram o splicing de transcrição, de modo que uma função alvo e/ou biológica desejada seja melhorada.
[00254] Em algumas modalidades, cada oligonucleotídeo de uma pluralidade compreende uma ou mais porções químicas de açúcar modificadas e ligações internucleotídicas modificadas.
[00255] Em algumas modalidades, cada oligonucleotídeo de uma pluralidade compreende não mais que cerca de 25 porções químicas de açúcar não modificadas consecutivas
[00256] Em algumas modalidades, cada oligonucleotídeo de uma pluralidade compreende não mais que cerca de 95% porções químicas de açúcar não modificadas. Em algumas modalidades, cada oligonucleotídeo de uma pluralidade compreende não mais que cerca de 90% porções químicas de açúcar não modificadas. Em algumas modalidades, cada oligonucleotídeo de uma pluralidade compreende não mais que cerca de 85% porções químicas de açúcar não modificadas. Em algumas modalidades, cada oligonucleotídeo de uma pluralidade compreende não mais que cerca de 15 porções químicas de açúcar não modificadas consecutivas.
[00257] Em algumas modalidades, cada oligonucleotídeo de uma pluralidade compreende não mais que cerca de 95% porções químicas de açúcar não modificadas.
[00258] Em algumas modalidades, cada oligonucleotídeo de uma pluralidade compreende duas ou mais ligações internucleotídicas modificadas.
[00259] Em algumas modalidades, cerca de 5% das ligações internucleotídicas em cada oligonucleotídeo de uma pluralidade são ligações internucleotídicas modificadas.
[00260] Em algumas modalidades, cada oligonucleotídeo de uma pluralidade compreende não mais que cerca de 25 ligações fosfato naturais consecutivas. Em algumas modalidades, cada oligonucleotídeo de uma pluralidade compreende não mais que cerca de 20 ligações fosfato naturais.
[00261] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos de uma pluralidade não compreendem unidades de nucleotídeo de DNA natural. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos de uma pluralidade compreendem não mais que 30 nucleotídeos de DNA natural. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos de uma pluralidade compreendem não mais que 30 nucleotídeos de DNA consecutivos.
[00262] Em algumas modalidades, em comparação com uma condição de referência, as composições de oligonucleotídeo quiralmente controladas fornecidas são surpreendentemente eficazes. Em algumas modalidades, os efeitos biológicos desejados (por exemplo, conforme medidos por níveis aumentados de mRNA, proteínas desejados, etc., níveis diminuídos de mRNA, proteínas indesejados, etc.) podem ser aumentados em mais de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 ou 100 vezes. Em algumas modalidades, uma alteração é medida pelo aumento de um nível de mRNA desejado em comparação com uma condição de referência. Em algumas modalidades, uma alteração é medida pela diminuição de um nível de mRNA indesejado em comparação com uma condição de referência. Em algumas modalidades, uma condição de referência é a ausência de tratamento com oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, uma condição de referência é uma composição de oligonucleotídeos estereoaleatória que tem a mesma sequência de base e modificações químicas.
[00263] Em algumas modalidades, um efeito biológico desejado é: salto aprimorado de um ou mais éxons, estabilidade aumentada, atividade aumentada, estabilidade e atividade aumentadas, baixa toxicidade, baixa resposta imune, perfil de ligação de proteína aprimorado, ligação aumentada a determinadas proteínas e/ou entrega melhorada. Em algumas modalidades, um efeito biológico desejado é melhorado em mais de 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 11 vezes, 12 vezes, 13 vezes, 14 vezes, 15 vezes, 20 vezes, 25 vezes, 30 vezes, 35 vezes, 40 vezes, 45 vezes, 50 vezes, 60 vezes, 70 vezes, 80 vezes, 90 vezes, 100 vezes, 200 vezes ou 500 vezes.
[00264] Em algumas modalidades, a estrutura de um oligonucleotídeo DMD é ou compreende uma estrutura de flanco-núcleo-flanco, flanco-núcleo ou núcleo-flanco. Em algumas modalidades, um flanco 5' é uma região de extremidade 5'. Em algumas modalidades, um flanco 3' é uma região de extremidade 3'. Em algumas modalidades, um núcleo é uma região intermediária. Em algumas modalidades, uma região de extremidade 5’ é uma região de flanco 5'. Em algumas modalidades, uma região de extremidade 3’ é uma região de flanco 3'. Em algumas modalidades, uma região intermediária é uma região de núcleo.
[00265] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo que tem uma estrutura de flanco-núcleo-flanco é designado como um gapmer. Em algumas modalidades, um gapmer é assimétrico, pelo fato de que a química de um flanco é diferente da química do outro flanco. Em algumas modalidades, um gapmer é assimétrico, pelo fato de que a química de um flanco é diferente da química do outro flanco, em que os flancos diferem nas modificações de açúcar e/ou ligações internucleotídicas, ou padrões das mesmas. Em algumas modalidades, um gapmer é assimétrico, pelo fato de que a química de um flanco é diferente da química do outro flanco, em que os flancos diferem nas modificações de açúcar, em que um flanco compreende uma modificação de açúcar não presente no outro flanco; ou ambos os flancos, cada um, compreendem uma modificação de açúcar não encontrada no outro flanco; ou ambos os flancos compreendem padrões diferentes dos mesmos tipos de modificações de açúcar; ou um flanco compreende apenas um tipo de modificação de açúcar, enquanto o outro flanco compreende dois tipos de modificações de açúcar; etc.
[00266] Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica entre uma região de flanco e uma região de núcleo é considerada como parte da região de flanco. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica entre uma região de flanco 5' e uma região de núcleo é considerada como parte da região de flanco. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica entre uma região de flanco 3' e uma região de núcleo é considerada como parte da região de flanco. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica entre uma região de flanco e uma região de núcleo é considerada como parte da região de núcleo. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica entre uma região de flanco 5' e uma região de núcleo é considerada como parte da região de núcleo. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica entre uma região de flanco 3' e uma região de núcleo é considerada como parte da região de núcleo.
[00267] Em algumas modalidades, uma região (por exemplo, uma região de flanco, uma região de núcleo, uma região de extremidade 5', uma região intermediária, uma região de extremidade 3', etc.) compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, ou mais unidades de nucleosídeo.
[00268] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos compreendem duas regiões de flanco e uma de núcleo. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos compreendem uma estrutura de flanco 5'-núcleo-flanco-3'. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos são de uma estrutura de gapmer de flanco 5'-núcleo-flanco-3’. Em algumas modalidades, as duas regiões de flanco são idênticas. Em algumas modalidades, as duas regiões de flanco são diferentes. Em algumas modalidades, as duas regiões de flanco são idênticas em modificações químicas. Em algumas modalidades, as duas regiões de flanco são idênticas em modificações 2'. Em algumas modalidades, as duas regiões de flanco são idênticas em modificações de ligação internucleotídica. Em algumas modalidades, as duas regiões de flanco são idênticas em padrões de centros quirais de cadeia principal. Em algumas modalidades, as duas regiões de flanco são idênticas em padrão de ligações de cadeia principal. Em algumas modalidades, as duas regiões de flanco são idênticas em padrão de tipos de ligação de cadeia principal. Em algumas modalidades, as duas regiões de flanco são idênticas em padrão de modificações de fósforo de cadeia principal.
[00269] Uma região de flanco pode ser diferenciada de uma região de núcleo pelo fato de que uma região de flanco contém uma característica de estrutura diferente de uma região de núcleo. Por exemplo, em algumas modalidades, uma região de flanco difere de uma região de núcleo pelo fato de que elas têm modificações de açúcar, modificações de base, ligações internucleotídicas, ligação internucleotídica estereoquímica diferentes, etc. Em algumas modalidades, uma região de flanco difere de uma região de núcleo pelo fato de que elas têm modificações 2’ diferentes dos açúcares.
[00270] Em algumas modalidades, uma região (por exemplo, uma região de flanco, uma região de núcleo, uma região de extremidade 5', uma região intermediária, uma região de extremidade 3', etc.) compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, ou mais ligações internucleotídicas modificadas. Em algumas modalidades, uma região compreende 2 ou mais ligações internucleotídicas modificadas. Em algumas modalidades, uma região compreende 3 ou mais ligações internucleotídicas modificadas. Em algumas modalidades, uma região compreende 4 ou mais ligações internucleotídicas modificadas. Em algumas modalidades, uma região compreende 5 ou mais ligações internucleotídicas modificadas. Em algumas modalidades, uma região compreende 6 ou mais ligações internucleotídicas modificadas. Em algumas modalidades, uma região compreende 7 ou mais ligações internucleotídicas modificadas. Em algumas modalidades, uma região compreende 8 ou mais ligações internucleotídicas modificadas. Em algumas modalidades, uma região compreende 9 ou mais ligações internucleotídicas modificadas. Em algumas modalidades, uma região compreende 10 ou mais ligações internucleotídicas modificadas.
[00271] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos compreendem unidades de nucleosídeo consecutivas cada uma das quais que não compreende modificações 2'-OR1 (em que R1 não é hidrogênio). Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos compreendem unidades de nucleosídeo consecutivas cujas posições 2’ são independentemente não substituídas ou substituídas por 2'-F. Em algumas modalidades, tal oligonucleotídeo é um oligonucleotídeo DMD. Em algumas modalidades, cada uma das unidades de nucleosídeo consecutivas é independentemente precedida e/ou seguida por uma ligação internucleotídica modificada. Em algumas modalidades, cada das unidades de nucleosídeo consecutivas é independentemente precedida e/ou seguida por uma ligação fosforotioato. Em algumas modalidades, cada uma das unidades de nucleosídeo consecutivas é independentemente precedida e/ou seguida por uma ligação internucleotídica quiralmente controlada modificada. Em algumas modalidades, cada uma das unidades de nucleosídeo consecutivas é independentemente precedida e/ou seguida por uma ligação fosforotioato quiralmente controlada.
[00272] Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica modificada tem a estrutura da fórmula I, I- a, I-b, I-c, I-n-1, I-n-2, I-n-3, I-n-4, II, II-a-1, II-a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, II-d-2, III, etc., ou uma forma de sal da mesma. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica modificada tem uma estrutura da fórmula I ou uma forma de sal da mesma. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica modificada tem uma estrutura da fórmula I-a ou uma forma de sal da mesma.
[00273] Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica modificada é uma ligação internucleotídica não negativamente carregada. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica modificada é uma ligação internucleotídica positivamente carregada. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica modificada é uma ligação internucleotídica neutra. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura da fórmula I, I-a, I-b, I-c, I-n-1, I-n-2, I-n-3, I- n-4, II, II-a-1, II-a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II- d-1, II-d-2, etc., ou uma forma de sal da mesma. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada compreende um grupo heterociclila ou heteroarila com 3 a 20 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 10 heteroátomos. Em algumas modalidades, a ligação internucleotídica não negativamente carregada compreende um grupo heterociclila ou heteroarila com 3 a 20 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 10 heteroátomos, em que pelo menos um heteroátomo é nitrogênio. Em algumas modalidades, tal grupo heterociclila ou heteroarila é de um anel com 5 membros. Em algumas modalidades, tal grupo heterociclila ou heteroarila é de um anel com 6 membros.
[00274] Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada compreende um grupo heteroarila com 5 a 20 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 10 heteroátomos. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada compreende um grupo heteroarila com 5 a 20 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 10 heteroátomos, em que pelo menos um heteroátomo é nitrogênio. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada compreende um grupo heteroarila com 5 a 6 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 4 heteroátomos, em que pelo menos um heteroátomo é nitrogênio. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada compreende um grupo heteroarila com 5 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 4 heteroátomos, em que pelo menos um heteroátomo é nitrogênio. Em algumas modalidades, um grupo heteroarila é diretamente ligado a um fósforo de ligação. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada compreende um grupo triazolila opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada compreende um grupo triazolila não substituído, por exemplo, . Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada compreende um grupo triazolila substituído, por exemplo, .
[00275] Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada compreende um grupo heterociclila com 5 a 20 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 10 heteroátomos. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada compreende um grupo heterociclila com 5 a 20 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 10 heteroátomos, em que pelo menos um heteroátomo é nitrogênio.
Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada compreende um grupo heterociclila com 5 a 6 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 4 heteroátomos, em que pelo menos um heteroátomo é nitrogênio.
Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada compreende um grupo heterociclila com 5 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 4 heteroátomos, em que pelo menos um heteroátomo é nitrogênio.
Em algumas modalidades, pelo menos dois heteroátomos são nitrogênio.
Em algumas modalidades, um grupo heterociclila é diretamente ligado a um fósforo de ligação.
Em algumas modalidades, um grupo heterociclila é ligado a um fósforo de ligação através de um ligante, por exemplo, =N− quando o grupo heterociclila faz parte de uma porção química de guanidina que se ligou diretamente a um fósforo de ligação através de seu =N−. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada compreende um grupo opcionalmente substituído.
Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada compreende um grupo opcionalmente substituído.
Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada compreende um grupo substituído.
Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada compreende um grupo . Em algumas modalidades, cada R1 é independentemente C1-20 alquila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, cada R1 é independentemente C1-6 alquila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, cada R1 é independentemente metila. Em algumas modalidades, os dois grupos R1 são diferentes; por exemplo, em algumas modalidades, um R1 é metila, e o outro é −CH2(CH2)10CH3.
[00276] Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica modificada, por exemplo, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada, compreende uma porção química de triazol ou alcino, cada um dos quais é opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica modificada compreende uma porção química de triazol. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica modificada compreende uma porção química de triazol não substituída. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica modificada compreende uma porção química de triazol opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica modificada compreende uma porção química de alquila. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica modificada compreende um grupo alquinila opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica modificada compreende um grupo alquinila não substituído. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica modificada compreende um grupo alquinila substituído. Em algumas modalidades, um grupo alquinila é diretamente ligado a um fósforo de ligação.
[00277] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo que compreende uma ligação internucleotídica não negativamente carregada pode compreender qualquer estrutura, formato ou porção do mesmo descrita no presente documento. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo que compreende uma ligação internucleotídica não negativamente carregada pode compreender qualquer estrutura, formato, ou porção do mesmo descrita no presente documento como sendo um componente de um oligonucleotídeo DMD. Em algumas modalidades, qualquer estrutura, formato, ou porção do mesmo descrita como sendo um componente de qualquer oligonucleotídeo DMD pode ser usado em qualquer oligonucleotídeo que compreende uma ligação internucleotídica não negativamente carregada, quer esse oligonucleotídeo tenha como alvo DMD ou não, ou quer o oligonucleotídeo tenha capacidade para mediar o salto de um éxon DMD ou não. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo que compreende uma ligação internucleotídica não negativamente carregada é de fita dupla ou fita simples.
[00278] Em algumas modalidades, uma composição de oligonucleotídeo fornecida é caracterizada pelo fato de que, quando entra em contato com a transcrição em um sistema de splicing de transcrição, o splicing da transcrição é alterado em relação àquele observado sob condições de referência selecionadas dentre o grupo que consiste na ausência da composição, presença de uma composição de referência, e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, um produto de splicing desejado é aumento em 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, ou 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500,
600, 700, 800, 900, 1.000 vezes ou mais. Em algumas modalidades, uma referência de splicing desejada é ausente (por exemplo, não pode ser detectada de maneira confiável por PCR quantitativa) sob condições de referência. Em algumas modalidades, conforme exemplificado na presente revelação, os níveis da pluralidade de oligonucleotídeos, por exemplo, uma pluralidade de oligonucleotídeos, nas composições fornecidas são predeterminados.
[00279] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos, por exemplo, oligonucleotídeos de uma pluralidade em uma composição fornecida, compreendem duas ou mais regiões. Em algumas modalidades, os oligonucletotídeos fornecidos compreendem uma região de extremidade 5', uma região de extremidade 3’ e uma região intermediária entre eles. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos têm duas regiões de flanco e uma de núcleo. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos são de uma estrutura de flanco-núcleo-flanco. Em algumas modalidades, as duas regiões de flanco são idênticas. Em algumas modalidades, as duas regiões de flanco são diferentes. Em algumas modalidades, uma região de extremidade 5’ é uma região de flanco 5'. Em algumas modalidades, uma região de flanco 5’ é uma região de extremidade 5'. Em algumas modalidades, uma região de extremidade 3’ é uma região de flanco 3'. Em algumas modalidades, uma região de flanco 3’ é uma região de extremidade 3'. Em algumas modalidades, uma região de núcleo é uma região intermediária.
[00280] Em algumas modalidades, uma região (por exemplo, uma região de flanco 5', um flanco 3’, uma região de núcleo, uma região de extremidade 5', uma região intermediária, etc.) compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, ou mais unidades de nucleosídeo. Em algumas modalidades, uma região compreende 2 ou mais unidades de nucleosídeo. Em algumas modalidades, uma região compreende 3 ou mais unidades de nucleosídeo. Em algumas modalidades, uma região compreende 4 ou mais unidades de nucleosídeo. Em algumas modalidades, uma região compreende 5 ou mais unidades de nucleosídeo. Em algumas modalidades, uma região compreende 6 ou mais unidades de nucleosídeo. Em algumas modalidades, uma região compreende 7 ou mais unidades de nucleosídeo. Em algumas modalidades, uma região compreende 8 ou mais unidades de nucleosídeo. Em algumas modalidades, uma região compreende 9 ou mais unidades de nucleosídeo. Em algumas modalidades, uma região compreende 10 ou mais unidades de nucleosídeo.
[00281] Em algumas modalidades, uma região (por exemplo, uma região de flanco 5', um flanco 3’, uma região de núcleo, uma região de extremidade 5', uma região intermediária, etc.) compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, ou mais ligações internucleotídicas modificadas. Em algumas modalidades, uma região compreende 2 ou mais ligações internucleotídicas modificadas. Em algumas modalidades, a uma ou mais ligações internucleotídicas modificadas são consecutivas. Em algumas modalidades, uma região compreende 2 ou mais ligações internucleotídicas modificadas consecutivas. Em algumas modalidades, cada ligação internucleotídica em uma região é independentemente uma ligação internucleotídica modificada, em que cada ligação internucleotídica quiral é opcional e independentemente quiralmente controlada. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica quiral ou uma ligação internucleotídica modificada tem a estrutura da fórmula I ou uma forma de sal da mesma. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica quiral ou uma ligação internucleotídica modificada é uma ligação internucleotídica fosforotioato. Em algumas modalidades, cada ligação internucleotídica quiral ou uma ligação internucleotídica modificada tem independentemente a estrutura da fórmula I ou uma forma de sal da mesma. Em algumas modalidades, cada ligação internucleotídica quiral ou uma ligação internucleotídica modificada é uma ligação internucleotídica fosforotioato. Em algumas modalidades, uma região compreende 3 ou ligações internucleotídicas modificadas consecutivas.
[00282] Em algumas modalidades, uma região de flanco compreende uma ou mais ligações fosfato naturais. Em algumas modalidades, uma região de núcleo compreende uma ou mais ligações fosfato naturais. Em algumas modalidades, uma região de extremidade 5' compreende uma ou mais ligações fosfato naturais. Em algumas modalidades, uma região de extremidade 3' compreende uma ou mais ligações fosfato naturais. Em algumas modalidades, uma região intermediária compreende uma ou mais ligações fosfato naturais. Em algumas modalidades, a uma ou mais ligações fosfato naturais são consecutivas.
[00283] Em algumas modalidades, uma ligação fosfato natural segue (por exemplo, conectada a uma posição 3’ de uma porção química de açúcar) ou precede (por exemplo, conectada a uma posição 5’ de uma porção química de açúcar) uma unidade de nucleosídeo cuja porção química de açúcar compreende uma modificação 2'-OR1, em que R1 não é hidrogênio.
Em algumas modalidades, R1 é C1-6 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica modificada segue (por exemplo, conectada a uma posição 3' de uma porção química de açúcar) ou precede (por exemplo, conectada a uma posição 5' de uma porção química de açúcar) todas ou a maior parte das (por exemplo, mais de 55%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, etc.) unidades de nucleosídeo cuja porção química de açúcar não compreende modificação 2'- OR1, em que R1 não é hidrogênio (por exemplo, aquelas tendo dois 2'-H na posição 2', aquelas tendo um 2'-H e um 2'-F na posição 2' (2'-F modificada), etc.).
[00284] Em algumas modalidades, uma região compreende uma ou mais unidades de nucleosídeo que compreendem modificações de açúcar, por exemplo, 2'-F, 2'-OR1, modificações de açúcar LNA, etc. Em algumas modalidades, cada açúcar em uma região é independentemente modificado. Em algumas modalidades, cada porção química de açúcar em um flanco, uma região de extremidade 5' e/ou uma região de extremidade 3' é modificada. Em algumas modalidades, uma modificação é uma modificação 2’. Em algumas modalidades, uma modificação pode aumentar a estabilidade, por exemplo, 2'-OR1 em que R1 não é −H (por exemplo, é C1-6 alifático opcionalmente substituído), modificações de açúcar LNA, etc. Em algumas modalidades, uma região, por exemplo, uma região de núcleo ou uma região intermediária, não compreende modificações de açúcar (ou nenhuma modificação de açúcar 2'-OR1/modificação LNA, etc.). Em algumas modalidades, tal região de núcleo/intermediária pode formar um duplex com um RNA para reconhecimento/ligação de uma proteína, por exemplo, RNase H, para que a proteína realize um ou mais de suas funções (por exemplo, no caso de
RNase H, sua ligação e clivagem de duplex de DNA/RNA).
[00285] Uma região e/ou um oligonucleotídeo fornecido pode ter vários padrões de centros quirais de cadeia principal. Em algumas modalidades, cada ligação internucleotídica em uma região é uma ligação internucleotídica quiralmente controlada e é Sp. Em algumas modalidades, a ligação internucleotídica de extremidade 5' e/ou extremidade 3’ é uma ligação internucleotídica quiralmente controlada e é Sp. Em algumas modalidades, o padrão de centros quirais de cadeia principal de uma região de flanco, uma região de extremidade 5' e/ou uma região de extremidade 3' é ou compreende uma ligação internucleotídica de extremidade 5' e/ou extremidade 3' que é uma ligação internucleotídica quiralmente controlada e é Sp, com as outras ligações internucleotídicas na região independentemente que é uma ligação fosfato natural, uma ligação internucleotídica modificada ou uma ligação internucleotídica quiralmente controlada (Sp ou Rp). Em algumas modalidades, tais padrões fornecem estabilidade. Muitos padrões exemplificativos de centros quirais de cadeia principal são descritos na presente revelação.
[00286] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada que compreende uma pluralidade de oligonucleotídeos definidos por ter: 1) uma sequência de base comum; 2) um padrão comum de ligações de cadeia principal; e 3) um padrão comum de centros quirais de cadeia principal, cuja composição é uma preparação substancialmente pura de um único oligonucleotídeo em que um nível controlado dos oligonucleotídeos na composição tem a sequência e comprimento de base comuns, o padrão comum de ligações de cadeia principal, e o padrão comum de centros quirais de cadeia principal.
[00287] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos que têm uma sequência de base comum podem ter o mesmo padrão de modificações de nucleosídeo, por exemplo¸ modificações de açúcar, modificações de base, etc. Em algumas modalidades, um padrão de modificações de nucleosídeo pode ser representado por uma combinação de localizações e modificações. Em algumas modalidades, todas as ligações não quirais (por exemplo, PO) podem ser omitidas. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos que têm a mesma sequência de base têm a mesma constituição.
[00288] Conforme entendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica, uma preparação estereoaleatória ou racêmica de oligonucleotídeos é preparada por acoplamento não estereosseletivo e/ou estereosseletivo baixo de monômeros de nucleotídeo, tipicamente sem o uso de quaisquer auxiliares quirais, reagentes de modificação quirais e/ou catalisadores quirais. Em algumas modalidades, em uma preparação substancialmente racêmica (ou quiralmente não controlada) de oligonucleotídeos, todas ou a maioria das etapas de acoplamento não são quiralmente controladas pelo fato de que as etapas de acoplamento não são especificamente conduzidas para fornecer estereosseletividade melhorada. Uma preparação substancialmente racêmica exemplificativa de oligonucleotídeos é a preparação de oligonucleotídeos de fosforotioato através da sulfurização de triésteres de fosfito a partir da síntese de oligonucleotídeo de fosforamidita comumente usada com dissulfeto de tetraetiltiuram ou (TETD) ou 3H-1, 2- bensoditiol-3-ona 1, 1-dióxido (BDTD), um processo bem conhecido na técnica.
Em algumas modalidades, a preparação substancialmente racêmica de oligonucleotídeos fornece composições de oligonucleotídeo substancialmente racêmicas (ou composições de oligonucleotídeo quiralmente não controladas). Em algumas modalidades, pelo menos um acoplamento de um monômero de nucleotídeo tem uma diastereosseletividade menor que cerca de 60:40, 70:30, 80:20, 85:15, 90:10, 91:9, 92:8, 97:3, 98:2, ou 99:1. Em algumas modalidades, cada ligação internucleotídica tem independentemente uma diastereosseletividade menor que cerca de 60:40, 70:30, 80:20, 85:15, 90:10, 91:9, 92:8, 97:3, 98:2, ou 99:1. Em algumas modalidades, uma diastereosseletividade é menor que cerca de 60:40. Em algumas modalidades, uma diastereosseletividade é menor que cerca de 70:30. Em algumas modalidades, uma diastereosseletividade é menor que cerca de 80:20. Em algumas modalidades, uma diastereosseletividade é menor que cerca de 90:10. Em algumas modalidades, uma diastereosseletividade é menor que cerca de 91:9. Em algumas modalidades, pelo menos uma ligação internucleotídica tem uma diastereosseletividade menor que cerca de 90:10. Em algumas modalidades, pelo menos duas ligações internucleotídicas têm uma diastereosseletividade menor que cerca de 90:10. Em algumas modalidades, pelo menos três ligações internucleotídicas têm uma diastereosseletividade menor que cerca de 90:10. Em algumas modalidades, pelo menos quatro ligações internucleotídicas têm uma diastereosseletividade menor que cerca de 90:10. Em algumas modalidades, pelo menos cinco ligações internucleotídicas têm uma diastereosseletividade menor que cerca de 90:10. Em algumas modalidades, cada ligação internucleotídica tem independentemente uma diastereosseletividade menor que cerca de 90:10. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não quiralmente controlada tem uma pureza diastereomérica não superior a 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, ou 55%. Em algumas modalidades, a pureza não é superior a 90%. Em algumas modalidades, a pureza não é superior a 85%. Em algumas modalidades, a pureza não é superior a 80%.
[00289] Em contrapartida, na composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada, pelo menos uma e, tipicamente cada ligação internucleotídica quiralmente controlada, tais como aquelas de oligonucleotídeos de composições de oligonucleotídeo quiralmente controladas, tem independentemente uma pureza diastereomérica de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais em relação ao fósforo de ligação quiral. Em algumas modalidades, uma pureza diastereomérica é de 95% ou mais. Em algumas modalidades, uma pureza diastereomérica é de 96% ou mais. Em algumas modalidades, uma pureza diastereomérica é de 97% ou mais. Em algumas modalidades, uma pureza diastereomérica é de 98% ou mais. Em algumas modalidades, uma pureza diastereomérica é de 99% ou mais. Entre outros fatores, as tecnologias da presente revelação fornecem rotineiramente ligações internucleotídicas quiralmente controladas com alta pureza diastereomérica.
[00290] Conforme observado por uma pessoa de habilidade comum na técnica, a diastereosseletividade de um acoplamento ou pureza diastereomérica (diastereopureza) de uma ligação internucleotídica pode ser avaliada através da diastereosseletividade de uma formação de dímero/pureza diastereomérica da ligação internucleotídica de um dímero formado sob as mesmas condições ou comparáveis, em que o dímero tem os mesmos nucleosídeos 5' e 3' e ligação internucleotídica.
[00291] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece composições de oligonucleotídeo quiralmente controladas (e/ou estereoquimicamente puras) que compreendem uma pluralidade de oligonucleotídeos definidos por ter: 1) uma sequência de base comum; 2) um padrão comum de ligações de cadeia principal; e 3) um padrão comum de centros quirais de cadeia principal, cuja composição é uma preparação substancialmente pura de um único oligonucleotídeo em que pelo menos cerca de 10% dos oligonucleotídeos na composição têm a sequência e comprimento de base comuns, o padrão comum de ligações de cadeia principal, e o padrão comum de centros quirais de cadeia principal.
[00292] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece a composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada de uma pluralidade de oligonucleotídeos, em que a composição é enriquecida, em relação a uma preparação substancialmente racêmica dos mesmos oligonucleotídeos, para oligonucleotídeos de um único tipo de oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece a composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada de uma pluralidade de oligonucleotídeos, em que a composição é enriquecida, em relação a uma preparação substancialmente racêmica dos mesmos oligonucleotídeos, para oligonucleotídeos de um único tipo de oligonucleotídeo definido por. 1) sequência de base;
2) padrão de ligações de cadeia principal; 3) padrão de centros quirais de cadeia principal; e 4) padrão de modificações de fósforo de cadeia principal.
[00293] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada que compreende uma pluralidade de oligonucleotídeos de um tipo de oligonucleotídeo particular definido por: 1) sequência de base; 2) padrão de ligações de cadeia principal; 3) padrão de centros quirais de cadeia principal; e 4) padrão de modificações de fósforo de cadeia principal. em que a composição é enriquecida, em relação a uma preparação substancialmente racêmica de oligonucleotídeos que têm a mesma sequência de base e comprimento, para oligonucleotídeos do tipo de oligonucleotídeo particular.
[00294] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos que têm uma sequência de base comum, um padrão comum de ligações de cadeia principal, e um padrão comum de centros quirais de cadeia principal têm um padrão comum de modificações de fósforo de cadeia principal e um padrão comum de modificações de base. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos que têm uma sequência de base comum, um padrão comum de ligações de cadeia principal, e um padrão comum de centros quirais de cadeia principal têm um padrão comum de modificações de fósforo de cadeia principal e um padrão comum de modificações de nucleosídeo. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos que têm uma sequência de base comum, um padrão comum de ligações de cadeia principal, e um padrão comum de centros quirais de cadeia principal têm estruturas idênticas.
[00295] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos de um tipo de oligonucleotídeo têm um padrão comum de modificações de fósforo de cadeia principal e um padrão comum de modificações de açúcar. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos de um tipo de oligonucleotídeo têm um padrão comum de modificações de fósforo de cadeia principal e um padrão comum de modificações de base. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos de um tipo de oligonucleotídeo têm um padrão comum de modificações de fósforo de cadeia principal e um padrão comum de modificações de nucleosídeo. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos de um tipo particular têm a mesma constituição. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos de um tipo de oligonucleotídeo são idênticos.
[00296] Em algumas modalidades, uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada é uma preparação substancialmente pura de um tipo de oligonucleotídeo em que os oligonucleotídeos na composição que não são do tipo de oligonucleotídeo são impurezas do processo de preparação do dito tipo de oligonucleotídeo, em alguns casos, após determinados procedimentos de purificação.
[00297] Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou 95% dos oligonucleotídeos na composição têm uma sequência de base comum, um padrão comum de ligações de cadeia principal e um padrão comum de centros quirais de cadeia principal.
[00298] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos que têm uma sequência de base comum, um padrão comum de ligações de cadeia principal e um padrão comum de centros quirais de cadeia principal têm um padrão comum de modificações de fósforo de cadeia principal. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos que têm uma sequência de base comum, um padrão comum de ligações de cadeia principal, e um padrão comum de centros quirais de cadeia principal têm um padrão comum de modificações de fósforo de cadeia principal e um padrão comum de modificações de nucleosídeo. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos que têm uma sequência de base comum, um padrão comum de ligações de cadeia principal, e um padrão comum de centros quirais de cadeia principal têm um padrão comum de modificações de fósforo de cadeia principal e um padrão comum de modificações de açúcar. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos que têm uma sequência de base comum, um padrão comum de ligações de cadeia principal, e um padrão comum de centros quirais de cadeia principal têm um padrão comum de modificações de fósforo de cadeia principal e um padrão comum de modificações de base. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos que têm uma sequência de base comum, um padrão comum de ligações de cadeia principal e um padrão comum de centros quirais de cadeia principal são idênticos.
[00299] Em algumas modalidades, a pureza de uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada de um tipo de oligonucleotídeo é expressa como a porcentagem de oligonucleotídeos na composição que são do tipo de oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 10% dos oligonucleotídeos em uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada são do tipo de oligonucleotídeo.
Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 20% dos oligonucleotídeos em uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada são do tipo de oligonucleotídeo.
Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 30% dos oligonucleotídeos em uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada são do tipo de oligonucleotídeo.
Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 40% dos oligonucleotídeos em uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada são do tipo de oligonucleotídeo.
Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 50% dos oligonucleotídeos em uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada são do tipo de oligonucleotídeo.
Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 60% dos oligonucleotídeos em uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada são do tipo de oligonucleotídeo.
Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 70% dos oligonucleotídeos em uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada são do tipo de oligonucleotídeo.
Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 80% dos oligonucleotídeos em uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada são do tipo de oligonucleotídeo.
Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 90% dos oligonucleotídeos em uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada são do tipo de oligonucleotídeo.
Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 92% dos oligonucleotídeos em uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada são do tipo de oligonucleotídeo.
Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 94% dos oligonucleotídeos em uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada são do tipo de oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 95% dos oligonucleotídeos em uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada são do tipo de oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 96% dos oligonucleotídeos em uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada são do mesmo tipo de oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 97% dos oligonucleotídeos em uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada são do tipo de oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 98% dos oligonucleotídeos em uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada são do tipo de oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 99% dos oligonucleotídeos em uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada são do tipo de oligonucleotídeo.
[00300] Em algumas modalidades, a pureza de uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada pode ser controlada por estereosseletividade de cada etapa de acoplamento em seu processo de preparação. Em algumas modalidades, uma etapa de acoplamento tem uma estereosseletividade (por exemplo, diastereosseletividade) de 60% (60% da nova ligação internucleotídica formada a partir da etapa de acoplamento tem a estereoquímica pretendida). Após tal etapa de acoplamento, a nova ligação internucleotídica formada pode ser denominada como tendo uma pureza de 60%. Em algumas modalidades, cada etapa de acoplamento tem uma estereosseletividade de pelo menos 60%. Em algumas modalidades, cada etapa de acoplamento tem uma estereosseletividade de pelo menos 70%. Em algumas modalidades, cada etapa de acoplamento tem uma estereosseletividade de pelo menos 80%. Em algumas modalidades, cada etapa de acoplamento tem uma estereosseletividade de pelo menos 85%. Em algumas modalidades, cada etapa de acoplamento tem uma estereosseletividade de pelo menos 90%. Em algumas modalidades, cada etapa de acoplamento tem uma estereosseletividade de pelo menos 91%. Em algumas modalidades, cada etapa de acoplamento tem uma estereosseletividade de pelo menos 92%. Em algumas modalidades, cada etapa de acoplamento tem uma estereosseletividade de pelo menos 93%. Em algumas modalidades, cada etapa de acoplamento tem uma estereosseletividade de pelo menos 94%. Em algumas modalidades, cada etapa de acoplamento tem uma estereosseletividade de pelo menos 95%. Em algumas modalidades, cada etapa de acoplamento tem uma estereosseletividade de pelo menos 96%. Em algumas modalidades, cada etapa de acoplamento tem uma estereosseletividade de pelo menos 97%. Em algumas modalidades, cada etapa de acoplamento tem uma estereosseletividade de pelo menos 98%. Em algumas modalidades, cada etapa de acoplamento tem uma estereosseletividade de pelo menos 99%. Em algumas modalidades, cada etapa de acoplamento tem uma estereosseletividade de pelo menos 99,5%. Em algumas modalidades, cada etapa de acoplamento tem uma estereosseletividade virtualmente de 100%. Em algumas modalidades, uma etapa de acoplamento tem uma estereosseletividade de virtualmente 100% pelo fato de que todo produto detectável da etapa de acoplamento por um método analítico (por exemplo, NMR, HPLC, uso de uma nuclease cuja estereosseletividade cliva fosforotioatos, etc) tem a estereosseletividade pretendida. Em algumas modalidades, a estereosseletividade de uma ligação internucleotídica quiral em um oligonucleotídeo pode ser medida através de uma reação modelo, por exemplo formação de um dímero essencialmente sob as mesmas condições ou comparáveis, em que o dímero tem a mesma ligação internucleotídica que a ligação internucleotídica quiral, o nucleosídeo 5’ do dímero é igual ao nucleosídeo para a extremidade 5' da ligação internucleotídica quiral, e o nucleosídeo 3' do dímero é igual ao nucleosídeo para a extremidade 3' da ligação internucleotídica quiral (por exemplo, para fU*SfU*SfC*SfU, através do dímero de fU*SfC).. Conforme observado por uma pessoa de habilidade comum na técnica, a porcentagem de oligonucleotídeos de um tipo particular que tem n ligações internucleotídicas quiralmente controladas em uma preparação pode ser calculada como DP1*DP 2*DP3*…DPn, em que cada um dentre DP1, DP2, DP3, … , e DPn é independentemente a pureza diastereomérica da 1ª, 2ª, 3ª, …, e nª ligação internucleotídica quiralmente controlada. Em algumas modalidades, cada uma dentre DP1, DP2, DP3, … , e DPn é independentemente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 97% ou 99% ou mais. . Em algumas modalidades, cada uma dentre DP1, DP2, DP3, … , e DPn é independentemente 95% ou mais.
[00301] Em algumas modalidades, nas composições fornecidas, pelo menos 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 97% ou 99% dos oligonucleotídeos que têm a sequência de base de um tipo de oligonucleotídeo particular (definido por 1) sequência de base; 2) padrão de ligações de cadeia principal; 3) padrão de centros quirais de cadeia principal; e 4) padrão de modificações de fósforo de cadeia principal) são oligonucleotídeos do tipo de oligonucleotídeo particular. Em algumas modalidades, pelo menos 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 97% ou 99% dos oligonucleotídeos que têm a sequência de base, o padrão de ligações de cadeia principal, e o padrão de modificações de fósforo de cadeia principal de um tipo de oligonucleotídeo particular são oligonucleotídeos do tipo de oligonucleotídeo particular.
[00302] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos de um tipo particular em uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada são enriquecidos pelo menos 5 vezes (oligonucleotídeos do tipo particular têm uma fração de 5*(1/2n) de oligonucleotídeos que têm a sequência de base, o padrão de ligações de cadeia principal, e o padrão de modificações de fósforo de cadeia principal do tipo de oligonucleotídeo particular, em que n é o número de ligações internucleotídicas quirais; ou oligonucleotídeos que têm a sequência de base, o padrão de ligações de cadeia principal, e o padrão de modificações de fósforo de cadeia principal do tipo de oligonucleotídeo particular, porém não são do tipo de oligonucleotídeo particular não são mais que [1-(1/2n)]/5 dos oligonucleotídeos que têm a sequência de base, o padrão de ligações de cadeia principal, e o padrão de modificações de fósforo de cadeia principal do tipo de oligonucleotídeo particular) em comparação com uma preparação estereoaleatória dos oligonucleotídeos (oligonucleotídeos do tipo particular são tipicamente considerados como tendo uma fração de 1/2n de oligonucleotídeos que têm a sequência de base, o padrão de ligações de cadeia principal, e o padrão de modificações de fósforo de cadeia principal do tipo de oligonucleotídeo particular, em que n é o número of ligações internucleotídicas quirais, e oligonucleotídeos que têm a sequência de base, o padrão de ligações de cadeia principal, e o padrão de modificações de fósforo de cadeia principal do tipo de oligonucleotídeo particular, porém não são do tipo de oligonucleotídeo particular são tipicamente considerados como tendo uma fração de [1-(1/2n)] de oligonucleotídeos que têm a sequência de base, o padrão de ligações de cadeia principal, e o padrão de modificações de fósforo de cadeia principal do tipo de oligonucleotídeo particular). Em algumas modalidades, o enriquecimento é de pelo menos 20 vezes.
Em algumas modalidades, o enriquecimento é de pelo menos 30 vezes.
Em algumas modalidades, o enriquecimento é de pelo menos 40 vezes.
Em algumas modalidades, o enriquecimento é de pelo menos 50 vezes.
Em algumas modalidades, o enriquecimento é de pelo menos 60 vezes.
Em algumas modalidades, o enriquecimento é de pelo menos 70 vezes.
Em algumas modalidades, o enriquecimento é de pelo menos 80 vezes.
Em algumas modalidades, o enriquecimento é de pelo menos 90 vezes.
Em algumas modalidades, o enriquecimento é de pelo menos 100 vezes.
Em algumas modalidades, o enriquecimento é de pelo menos 20.000 vezes.
Em algumas modalidades, o enriquecimento é de pelo menos (1,5)n.
Em algumas modalidades, o enriquecimento é de pelo menos (1,6)n.
Em algumas modalidades, o enriquecimento é de pelo menos (1,7)n.
Em algumas modalidades, o enriquecimento é de pelo menos (1,1)n.
Em algumas modalidades, o enriquecimento é de pelo menos (1,8)n.
Em algumas modalidades, o enriquecimento é de pelo menos (1,9)n.
Em algumas modalidades, o enriquecimento é de pelo menos 2n.
Em algumas modalidades, o enriquecimento é de pelo menos 3n.
Em algumas modalidades, o enriquecimento é de pelo menos 4n.
Em algumas modalidades, o enriquecimento é de pelo menos 5n.
Em algumas modalidades, o enriquecimento é de pelo menos 6n.
Em algumas modalidades, o enriquecimento é de pelo menos 7n.
Em algumas modalidades, o enriquecimento é de pelo menos 8n.
Em algumas modalidades, o enriquecimento é de pelo menos 9n.
Em algumas modalidades, o enriquecimento é de pelo menos 10n.
Em algumas modalidades, o enriquecimento é de pelo menos 15n.
Em algumas modalidades, o enriquecimento é de pelo menos 20n.
Em algumas modalidades, o enriquecimento é de pelo menos 25n.
Em algumas modalidades, o enriquecimento é de pelo menos 30n.
Em algumas modalidades, o enriquecimento é de pelo menos 40n.
Em algumas modalidades, o enriquecimento é de pelo menos 50n.
Em algumas modalidades, o enriquecimento é de pelo menos 100n.
Em algumas modalidades, o enriquecimento é medido pelo aumento da fração de oligonucleotídeos do tipo de oligonucleotídeo particular em oligonucleotídeos que têm a sequência de base, o padrão de ligações de cadeia principal, e o padrão de modificações de fósforo de cadeia principal do tipo de oligonucleotídeo particular.
Em algumas modalidades, um enriquecimento é medido pela diminuição da fração de oligonucleotídeos que têm a sequência de base, o padrão de ligações de cadeia principal, e o padrão de modificações de fósforo de cadeia principal do tipo de oligonucleotídeo particular, porém não são do tipo de oligonucleotídeo particular em oligonucleotídeos que têm a sequência de base, o padrão de ligações de cadeia principal, e o padrão de modificações de fósforo de cadeia principal do tipo de oligonucleotídeo particular.
[00303] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos são oligonucleotídeos antissenso. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos são oligonucleotídeos siRNA. Em algumas modalidades, uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada fornecida é de oligonucleotídeos que podem ser oligonucleotídeo antissenso, antagomir, microRNA, pré- microRNA, antimir, supermir, ribozima, adaptador de Ul, ativador de RNA, agente de RNAi, oligonucleotídeo decoy, oligonucleotídeo formador de triplex, aptâmero ou adjuvante. Em algumas modalidades, uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada é de oligonucleotídeos antissenso. Em algumas modalidades, uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada é oligonucleotídeos siRNA. Em algumas modalidades, uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada é oligonucleotídeos antagomir. Em algumas modalidades, uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada é de oligonucleotídeos microRNA. Em algumas modalidades, uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada é de oligonucleotídeos pré-microRNA. Em algumas modalidades, uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada é de oligonucleotídeos antimir. Em algumas modalidades, uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada é de oligonucleotídeos supermir. Em algumas modalidades, uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada é de oligonucleotídeos ribozima. Em algumas modalidades, uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada é de oligonucleotídeos adaptadores de UI. Em algumas modalidades, uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada é de oligonucleotídeos ativadores de RNA. Em algumas modalidades, uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada é de oligonucleotídeos de agente de RNAi. Em algumas modalidades, uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada é de oligonucleotídeos decoy. Em algumas modalidades, uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada é de oligonucleotídeos formadores de triplex. Em algumas modalidades, uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada é de oligonucleotídeos aptâmero. Em algumas modalidades, uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada é de oligonucleotídeos adjuvantes.
[00304] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido compreende uma ou mais ligações fosfato modificadas quirais. Em algumas modalidades, as preparações quiralmente controladas fornecidas (e/ou estereoquimicamente puras) são de oligonucleotídeos que incluem um ou mais ligações de cadeia principal modificadas, bases e/ou açúcares.
[00305] Em algumas modalidades, as preparações quiralmente controladas fornecidas (e/ou estereoquimicamente puras) são de uma pureza estereoquímica maior que cerca de 80%. Em algumas modalidades, as preparações quiralmente controladas fornecidas (e/ou estereoquimicamente puras) são de uma pureza estereoquímica maior que cerca de 85%. Em algumas modalidades, as preparações quiralmente controladas fornecidas (e/ou estereoquimicamente puras) são de uma pureza estereoquímica maior que cerca de 90%. Em algumas modalidades, as preparações quiralmente controladas fornecidas (e/ou estereoquimicamente puras) são de uma pureza estereoquímica maior que cerca de 91%. Em algumas modalidades, as preparações quiralmente controladas fornecidas (e/ou estereoquimicamente puras) são de uma pureza estereoquímica maior que cerca de 92%. Em algumas modalidades, as preparações quiralmente controladas fornecidas (e/ou estereoquimicamente puras) são de uma pureza estereoquímica maior que cerca de 93%. Em algumas modalidades, as preparações quiralmente controladas fornecidas (e/ou estereoquimicamente puras) são de uma pureza estereoquímica maior que cerca de 94%. Em algumas modalidades, as preparações quiralmente controladas fornecidas (e/ou estereoquimicamente puras) são de uma pureza estereoquímica maior que cerca de 95%. Em algumas modalidades, as preparações quiralmente controladas fornecidas (e/ou estereoquimicamente puras) são de uma pureza estereoquímica maior que cerca de 96%. Em algumas modalidades, as preparações quiralmente controladas fornecidas (e/ou estereoquimicamente puras) são de uma pureza estereoquímica maior que cerca de 97%. Em algumas modalidades, as preparações quiralmente controladas fornecidas (e/ou estereoquimicamente puras) são de uma pureza estereoquímica maior que cerca de 98%. Em algumas modalidades, as preparações quiralmente controladas fornecidas (e/ou estereoquimicamente puras) são de uma pureza estereoquímica maior que cerca de 99%.
[00306] Em algumas modalidades, pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 100% das ligações internucleotídicas de um oligonucleotídeo são independentemente ligações internucleotídicas quirais. Em algumas modalidades, todas as ligações internucleotídicas modificadas quirais são ligações internucleotídicas fosforotioato quirais. Em algumas modalidades, todas as ligações internucleotídicas modificadas quirais, exceto as ligações internucleotídicas não negativamente carregadas são ligações internucleotídicas fosforotioato quirais. Em algumas modalidades, cada ligação internucleotídica quiral é quiralmente controlada. Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, ou 90% das ligações internucleotídicas quirais de um oligonucleotídeo são quiralmente controladas e são da conformação Sp. Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, ou 90% das ligações internucleotídicas fosforotioato de um oligonucleotídeo são quiralmente controladas e são da conformação Sp. Em algumas modalidades, a porcentagem é de pelo menos cerca de 10%. Em algumas modalidades, a porcentagem é de pelo menos cerca de 20%. Em algumas modalidades, a porcentagem é de pelo menos cerca de 30%. Em algumas modalidades, a porcentagem é de pelo menos cerca de 40%. Em algumas modalidades, a porcentagem é de pelo menos cerca de 50%. Em algumas modalidades, a porcentagem é de pelo menos cerca de 60%. Em algumas modalidades, a porcentagem é de pelo menos cerca de 70%. Em algumas modalidades, a porcentagem é de pelo menos cerca de 80%. Em algumas modalidades, a porcentagem é de pelo menos cerca de 90%.
[00307] Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, ou 90% das ligações internucleotídicas quirais de um oligonucleotídeo são quiralmente controladas e são da conformação Rp. Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70,
80, ou 90% das ligações internucleotídicas fosforotioato quirais de um oligonucleotídeo são quiralmente controladas e são da conformação Rp. Em algumas modalidades, a porcentagem é de pelo menos cerca de 10%. Em algumas modalidades, a porcentagem é de pelo menos cerca de 20%. Em algumas modalidades, a porcentagem é de pelo menos cerca de 30%. Em algumas modalidades, não mais que 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, ou 90% das ligações internucleotídicas quirais de um oligonucleotídeo são quiralmente controladas e são da conformação Rp. Em algumas modalidades, não mais que 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, ou 90% das ligações internucleotídicas fosforotioato de um oligonucleotídeo são da conformação Rp. Em algumas modalidades, a porcentagem não é superior a 10%. Em algumas modalidades, a porcentagem não é superior a 20%. Em algumas modalidades, a porcentagem não é superior a 30%.
[00308] Em algumas modalidades, as composições quiralmente controladas fornecidas (e/ou estereoquimicamente puras) são de oligonucleotídeos que contêm uma ou mais bases modificadas. Em algumas modalidades, as composições quiralmente controladas fornecidas (e/ou estereoquimicamente puras) são de oligonucleotídeos que não contêm bases modificadas. Conforme observado por aqueles versados na técnica, muitos tipos de bases modificadas podem ser utilizados de acordo com a presente revelação. As bases modificadas exemplificativas são descritas no presente documento.
[00309] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos das composições fornecidas compreendem pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ligações fosfato naturais. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos das composições fornecidas compreendem pelo menos uma ligação fosfato natural. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos das composições fornecidas compreendem pelo menos duas ligações fosfato naturais. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos das composições fornecidas compreendem pelo menos três ligações fosfato naturais.
[00310] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos das composições fornecidas compreendem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ligações fosfato naturais. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos das composições fornecidas compreendem uma ligação fosfato natural. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos das composições fornecidas compreendem duas ligações fosfato naturais. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos das composições fornecidas compreendem três ligações fosfato naturais. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos das composições fornecidas compreendem quatro ligações fosfato naturais. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos das composições fornecidas compreendem cinco ligações fosfato naturais. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos das composições fornecidas compreendem seis ligações fosfato naturais. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos das composições fornecidas compreendem sete ligações fosfato naturais. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos das composições fornecidas compreendem oito ligações fosfato naturais. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos das composições fornecidas compreendem nove ligações fosfato naturais. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos das composições fornecidas compreendem dez ligações fosfato naturais.
[00311] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos das composições fornecidas compreendem pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ligações fosfato naturais consecutivas. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos das composições fornecidas compreendem pelo menos duas ligações fosfato naturais consecutivas. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos das composições fornecidas compreendem pelo menos três ligações fosfato naturais consecutivas.
[00312] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos da presente revelação têm pelo menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, ou 75 nucleobases de comprimento. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos da presente revelação compreende pelo menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, ou 75 nucleobases de comprimento, em que cada nucleobase é independentemente A, T, C, G, U opcionalmente substituído, ou um tautômero dos mesmos.
[00313] Em algumas modalidades, as composições fornecidas compreendem oligonucleotídeos que contêm um ou mais resíduos que são modificados na porção química de açúcar. Em algumas modalidades, as composições fornecidas compreendem oligonucleotídeos contendo um ou mais resíduos que são modificados na posição 2' da porção química de açúcar (denominada no presente documento como uma "modificação 2'"). Exemplos de tais modificações são descritos no presente documento e incluem, porém sem limitação, 2'-OMe, 2'-MOE, 2'-LNA, 2'-F, FRNA, FANA, S-cEt, etc. Em algumas modalidades, as composições fornecidas compreendem oligonucleotídeos contendo um ou mais resíduos que são modificados por 2'. Por exemplo, em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos contêm um ou mais resíduos que são resíduos modificados por 2'-O-metoxietil (2'-MOE). Em algumas modalidades, as composições fornecidas compreendem oligonucleotídeos que não contêm nenhuma modificação 2'. Em algumas modalidades, as composições fornecidas são oligonucleotídeos que não contêm nenhum resíduo 2'-MOE. Ou seja, em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos não são modificados por MOE. As modificações de açúcar exemplificativas adicionais são descritas na presente revelação.
[00314] Em algumas modalidades, "um ou mais" consiste em um. Em algumas modalidades, "um ou mais" consiste em dois. Em algumas modalidades, "um ou mais" consiste em três. Em algumas modalidades, "um ou mais" consiste em quatro. Em algumas modalidades, "um ou mais" consiste em cinco. Em algumas modalidades, "um ou mais" consiste em seis. Em algumas modalidades, "um ou mais" consiste em sete. Em algumas modalidades, "um ou mais" consiste em oito. Em algumas modalidades, "um ou mais" consiste em nove. Em algumas modalidades, "um ou mais" consiste em dez. Em algumas modalidades, "um ou mais" consiste em pelo menos um. Em algumas modalidades, "um ou mais" consiste em pelo menos dois. Em algumas modalidades, "um ou mais" consiste em pelo menos três. Em algumas modalidades, "um ou mais" consiste em pelo menos quatro. Em algumas modalidades, "um ou mais" consiste em pelo menos cinco. Em algumas modalidades, "um ou mais" consiste em pelo menos seis. Em algumas modalidades, "um ou mais" consiste em pelo menos sete. Em algumas modalidades, "um ou mais" consiste em pelo menos oito. Em algumas modalidades, "um ou mais" consiste em pelo menos nove. Em algumas modalidades, "um ou mais" consiste em pelo menos dez.
[00315] Em algumas modalidades, uma sequência de base, por exemplo, uma sequência de base comum de uma pluralidade de oligonucleotídeo, uma sequência de base de um tipo de oligonucleotídeo particular, etc., compreende ou é uma sequência complementar a um gene ou transcrição (por exemplo, de Distrofina ou DMD). Em algumas modalidades, uma sequência de base comum compreende ou é uma sequência 100% complementar a um gene. Em algumas modalidades, uma sequência de base comum compreende ou é uma sequência complementar a um elemento de sequência característica de um gene, cujas sequências características diferenciam o gene de uma sequência similar que compartilha homologia com o gene. Em algumas modalidades, uma sequência de base comum compreende ou é uma sequência 100% complementar a um elemento de sequência característica de um gene, cujas sequências características diferenciam o gene de outro alelo do gene. Em algumas modalidades, uma sequência de base comum compreende ou é uma sequência 100% complementar a um elemento de sequência característica de um gene, cujas sequências características diferenciam o gene de uma sequência similar que compartilha homologia com o gene. Em algumas modalidades, uma sequência de base comum compreende ou é uma sequência complementar a um elemento de sequência característica de um gene alvo, cujas sequências características compreendem uma mutação que não é encontrada em outras cópias do gene, por exemplo¸ a cópia do tipo selvagem do gene, outra cópia mutante do gene, etc. Em algumas modalidades, uma sequência de base comum compreende ou é uma sequência 100% complementar ao elemento de sequência característica de um gene alvo, cujas sequências características compreendem uma mutação que não é encontrada em outras cópias do gene, por exemplo¸ a cópia do tipo selvagem do gene, outra cópia mutante do gene, etc. Em algumas modalidades, uma sequência de base comum compreende ou é uma sequência 100% complementar a um elemento de sequência característica de um gene, cujas sequências características diferenciam o gene de outro alelo do gene. Em algumas modalidades, um elemento de sequência característica é uma mutação. Em algumas modalidades, um elemento de sequência característica é um SNP.
[00316] Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica quiral tem a estrutura da fórmula I, I-a, I- b, I-c, I-n-1, I-n-2, I-n-3, I-n-4, II, II-a-1, II-a-2, II-b- 1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, II-d-2, III, etc., ou uma forma de sal da mesma. Em algumas modalidades, os fósforos de ligação de ligações internucleotídicas quirais são quiralmente controlados. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica quiral é uma ligação internucleotídica fosforotioato. Em algumas modalidades, cada ligação internucleotídica quiral em um oligonucleotídeo de uma composição fornecida tem independentemente a estrutura da fórmula I. Em algumas modalidades, cada ligação internucleotídica quiral em um oligonucleotídeo de uma composição fornecida tem independentemente a estrutura da fórmula II. Em algumas modalidades, cada ligação internucleotídica quiral em um oligonucleotídeo de uma composição fornecida tem independentemente a estrutura da fórmula III. Em algumas modalidades, cada ligação internucleotídica quiral em um oligonucleotídeo de uma composição fornecida é uma ligação internucleotídica fosforotioato.
[00317] Conforme observado por aqueles versados na técnica, as ligações internucleotídicas, por exemplo, aquelas da fórmula I, ligações fosfato naturais, ligações internucleotídicas fosforotioato, etc. podem existir em suas formas de sal dependendo do pH de seu ambiente. A menos que indicado de outro modo, tais formas de sal são incluídas no presente pedido quando tais ligações internucleotídicas forem citadas.
[00318] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos da presente revelação compreendem uma ou mais porções químicas de açúcar modificadas. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos da presente revelação compreendem uma ou mais porções químicas de base modificadas. Conforme é conhecido por uma pessoa de habilidade comum na técnica e descrito na revelação, várias modificações podem ser introduzidas nas porções químicas de açúcar e de base. Por exemplo, em algumas modalidades, uma modificação é uma modificação descrita nos documentos US9006198, WO2014/012081, WO/2015/107425, e WO/2017/062862, as modificações de açúcar e de base de cada um dos quais são incorporadas ao presente documento a título de referência.
[00319] Em algumas modalidades, uma modificação de açúcar é uma modificação 2'. As modificações 2’ comumente usadas incluem, porém sem limitação 2'–OR1, em que R1 não é hidrogênio. Em algumas modalidades, uma modificação é 2'−OR, em que R é alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, uma modificação é 2'−OMe. Em algumas modalidades, uma modificação é 2'-O-MOE. Em algumas modalidades, a presente revelação demonstra que a inclusão e/ou localização de ligações internucleotídicas quiralmente puras particulares pode fornecer aprimoramentos de estabilidade comparáveis ou melhores que aqueles obtidos através do uso de ligações de cadeia principal modificadas, bases e/ou açúcares. Em algumas modalidades, um único oligonucleotídeo fornecido de uma composição fornecida não tem modificações nos açúcares. Em algumas modalidades, um único oligonucleotídeo fornecido de uma composição fornecida não tem modificações nas posições 2’ dos açúcares (isto é, os dois grupos na posição 2' são −H/−H ou −H/−OH). Em algumas modalidades, um único oligonucleotídeo fornecido de uma composição fornecida não tem nenhuma modificação 2'-MOE.
[00320] Em algumas modalidades, uma modificação 2' é −O−L− ou −L− que conecta o carbono 2’ de uma porção química de açúcar a outro carbono de uma porção química de açúcar. Em algumas modalidades, uma modificação 2' é −O−L− ou −L− que conecta o carbono 2’ de uma porção química de açúcar ao carbono 4’ de uma porção química de açúcar. Em algumas modalidades, uma modificação 2' é S-cEt. Em algumas modalidades, uma porção química de açúcar modificada é uma porção química de açúcar LNA.
[00321] Em algumas modalidades, uma modificação 2' é −F. Em algumas modalidades, uma modificação 2' é FANA. Em algumas modalidades, uma modificação 2' é FRNA.
[00322] Em algumas modalidades, uma modificação de açúcar é uma modificação 5'. Em algumas modalidades, uma modificação é 5'-R1, em que R1 não é hidrogênio. Em algumas modalidades, uma modificação de açúcar é 5'-R, em que R não é hidrogênio e é, de outro modo, conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, uma modificação de açúcar é 5'-R, em que R é C1-6 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, uma modificação de açúcar é 5'-R, em que R é C1-6 alquila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, uma modificação de açúcar é 5'-R, em que R é metila opcionalmente substituída.. Em algumas modalidades, uma modificação de açúcar é 5'-R, em que R é metila opcionalmente substituída, em que nenhum substituinte do grupo metila compreende um átomo de carbono. Em algumas modalidades, uma modificação 5’ é metila. Em algumas modalidades, cada substituinte é independentemente halogênio. Em algumas modalidades, um carbono 5’ substituído é diastereomericamente puro. Em algumas modalidades, um carbono 5’ substituído tem a configuração R. Em algumas modalidades, um carbono 5’ substituído tem a configuração S. Em algumas modalidades, uma modificação 5’ é 5'-(R)-Me. Em algumas modalidades, uma modificação 5’ é 5'-(S)-Me.
[00323] Em algumas modalidades, uma porção química de açúcar tem uma e não mais que uma modificação em uma posição, por exemplo, uma posição 2', posição 5', etc. Em algumas modalidades, uma modificação 2' assume a posição que corresponde à posição do 2'-OH em uma porção química de açúcar de RNA natural. Em algumas modalidades, uma modificação 2' assume a posição que corresponde à do 2'-H em uma porção química de açúcar de RNA natural.
[00324] Em algumas modalidades, uma modificação de açúcar altera o tamanho do anel de açúcar. Em algumas modalidades, uma modificação de açúcar altera a conformação do anel de açúcar. Em algumas modalidades, uma modificação de açúcar é a porção química de açúcar em FHNA.
[00325] Em algumas modalidades, uma modificação de açúcar substitui uma porção química de açúcar por outra porção química cíclica ou acíclica. Os exemplos de tais porções químicas são amplamente conhecidos na técnica, incluindo, porém sem limitação aqueles usados em Morfolino, ácidos nucleicos de glicol, etc. Certas Modalidades de Ligações Internucleotídicas, Oligonucleotídeos Quiralmente Controlados e Composições de Oligonucleotídeo Quiralmente Controladas
[00326] Entre outros fatores, a presente revelação fornece oligonucleotídeos quiralmente controlados e composições de oligonucleotídeo quiralmente controladas. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece oligonucleotídeos quiralmente controlados e composições de oligonucleotídeo quiralmente controladas que são de alta pureza bruta. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece oligonucleotídeos quiralmente controlados, e composições de oligonucleotídeo quiralmente controladas que são de alta pureza diastereomérica. Os oligonucleotídeos quiralmente controlados são oligonucleotídeos que compreendem uma ou mais ligações internucleotídicas quiralmente controladas, tais como oligonucleotídeos de uma pluralidade em composições de oligonucleotídeo quiralmente controladas. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos quiralmente controlados compreendem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais ligações internucleotídicas quiralmente controladas. Em algumas modalidades, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou mais ligações internucleotídicas quirais de um oligonucleotídeo quiralmente controlado são independentemente ligações internucleotídicas quiralmente controladas. Em algumas modalidades, cada ligação internucleotídica quiral em um oligonucleotídeo quiralmente controlado é uma ligação internucleotídica quiralmente controlada, e um oligonucleotídeo quiralmente controlado é diastereomericamente puro.
[00327] Em algumas modalidades, uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada é uma composição substancialmente pura de um tipo de oligonucleotídeo em que os oligonucleotídeos na composição que não são do tipo de oligonucleotídeo são impurezas. Em algumas modalidades, tais impurezas são formadas durante o processo de preparação de oligonucleotídeos do dito tipo de oligonucleotídeo, em alguns casos, após certos procedimentos de purificação.
[00328] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece oligonucleotídeos que compreendem uma ou mais ligações internucleotídicas diastereomericamente puras em relação ao fósforo de ligação quiral (por exemplo, fósforo de ligação de ligações internucleotídicas quiralmente controladas). Em algumas modalidades, a presente revelação fornece oligonucleotídeos que compreendem uma ou mais ligações internucleotídicas diastereomericamente puras que têm a estrutura da fórmula I, I-a, I-b, I-c, I-n-1, I-n-2, I-n-3, I- n-4, II, II-a-1, II-a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II- d-1, II-d-2, III, etc., ou uma forma de sal da mesma. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece oligonucleotídeos que compreendem uma ou mais ligações internucleotídicas diastereomericamente puras em relação ao fósforo de ligação quiral, e uma ou mais ligações fosfato naturais (a menos que indicado de outro modo, a referência no presente pedido às ligações internucleotídicas, tais como ligações fosfato naturais e outros tipos de ligações internucleotídicas, quando aplicável, inclui formas de sal de tais ligações). Desse modo, as ligações internucleotídicas diastereomericamente puras aqui incluem formas de sal de ligações internucleotídicas diastereomericamente puras; as ligações fosfato naturais aqui incluem formas de sal de ligações fosfato naturais. Uma pessoa de habilidade comum na técnica observa que muitas ligações internucleotídicas, tais como ligações fosfato naturais, existem como formas de sal quando um pH fisiológico, em muitos tampões (por exemplo, tampões PBS tendo um pH de aproximadamente 7, por exemplo, PH 7,4), etc.). Em algumas modalidades, a presente revelação fornece oligonucleotídeos que compreendem uma ou mais ligações internucleotídicas diastereomericamente puras que têm a estrutura da fórmula I, I-a, I-b, I-c, I-n-1, I-n-2, I-n-3, I- n-4, II, II-a-1, II-a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II- d-1, II-d-2, III, etc., ou uma forma de sal da mesma, e uma ou mais ligações fosfato naturais. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece oligonucleotídeos que compreendem uma ou mais ligações internucleotídicas diastereomericamente puras que têm a estrutura da fórmula I-c, e uma ou mais ligações diéster de fosfato. Em algumas modalidades, tais oligonucleotídeos são preparados com o uso de síntese de oligonucleotídeo estereosseletiva, conforme descrito neste pedido, para formar ligações internucleotídicas diastereomericamente puras projetadas em relação ao fósforo de ligação quiral.
[00329] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo da presente revelação compreende pelo menos uma ligação internucleotídica, por exemplo, uma ligação internucleotídica modificada (não natural) (por exemplo, ligação internucleotídica não negativamente carregada) dentro ou na terminação (por exemplo 5' ou 3') do oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo compreende uma porção química de modificação P dentro ou na terminação (por exemplo 5' ou 3') do oligonucleotídeo.
[00330] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo da presente revelação compreende pelo menos uma ligação internucleotídica quiralmente controlada dentro do oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo da presente revelação compreende pelo menos uma ligação internucleotídica quiralmente controlada dentro do oligonucleotídeo, e pelo menos uma ligação fosfato natural. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo da presente revelação compreende pelo menos uma ligação internucleotídica quiralmente controlada dentro do oligonucleotídeo, pelo menos uma ligação fosfato natural, e pelo menos uma ligação internucleotídica fosforotioato. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo da presente revelação compreende pelo menos uma ligação internucleotídica quiralmente controlada dentro do oligonucleotídeo, e pelo menos uma ligação internucleotídica triéster de fosforotioato. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo da presente revelação compreende pelo menos uma ligação internucleotídica quiralmente controlada dentro do oligonucleotídeo, pelo menos uma ligação fosfato natural, e pelo menos uma ligação internucleotídica triéster de fosforotioato.
[00331] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo da presente revelação compreende pelo menos duas ligações internucleotídicas quiralmente controladas dentro do oligonucleotídeo que têm estereoquímica diferente e/ou modificações P diferentes uma em relação à outra. Em algumas modalidades, pelo menos duas ligações internucleotídicas têm estereoquímica diferente. Em algumas modalidades, pelo menos duas ligações internucleotídicas têm modificações P diferentes. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo da presente revelação compreende pelo menos duas ligações internucleotídicas quiralmente controladas dentro do oligonucleotídeo que têm modificações P diferentes uma em relação à outra, e pelo menos uma ligação fosfato natural. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo da presente revelação compreende pelo menos duas ligações internucleotídicas quiralmente controladas dentro do oligonucleotídeo que têm modificações P diferentes uma em relação à outra, pelo menos uma ligação fosfato natural, e pelo menos uma ligação internucleotídica fosforotioato. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo da presente revelação compreende pelo menos duas ligações internucleotídicas quiralmente controladas dentro do oligonucleotídeo que têm modificações P diferentes uma em relação à outra, e pelo menos uma ligação internucleotídica triéster de fosforotioato. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo da presente revelação compreende pelo menos duas ligações internucleotídicas quiralmente controladas dentro do oligonucleotídeo que têm modificações P diferentes uma em relação à outra, pelo menos uma ligação fosfato natural, e pelo menos uma ligação internucleotídica triéster de fosforotioato.
[00332] Em determinadas modalidades, uma ligação internucleotídica (por exemplo, uma ligação internucleotídica modificada (não natural) quando a fórmula I não é uma ligação fosfato natural) tem a estrutura da fórmula I: ,
I ou uma forma de sal do mesmo, em que: PL é P(=W), P, ou P→B(R')3; W é O, N(–L–R5), S ou Se; cada um dentre R1 e R5 é independentemente −H, −L−R', halogênio, −CN, −NO2, −L−Si(R')3, −OR', −SR', ou −N(R')2; cada um dentre X, Y e Z é independentemente –O–, – S–, –N(–L–R5)–, ou L; cada L é independentemente um grupo de ligação covalente, ou bivalente, linear ou ramificado opcionalmente substituído selecionado dentre um grupo alifático C1-30 e um grupo heteroalifático C1-30 tendo 1 a 10 heteroátomos, em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por C1-6 alquileno, C1-6 alquenileno, , um grupo heteroalifático C1–C6 bivalente tendo 1 a 5 heteroátomos, −C(R')2−, −Cy−, −O−, −S−, −S−S−, −N(R')−, −C(O)−, −C(S)−, −C(NR')−, −C(O)N(R')−, −N(R')C(O)N(R')−, −N(R')C(O)O−, −S(O)−, −S(O)2−, −S(O)2N(R')−, −C(O)S−, −C(O)O−, −P(O)(OR')−, −P(O)(SR')−, −P(O)(R')−, −P(O)(NR')−, −P(S)(OR')−, −P(S)(SR')−, −P(S)(R')−, −P(S)(NR')−, −P(R')−, −P(OR')−, −P(SR')−, −P(NR')−, −P(OR')[B(R')3]−, −OP(O)(OR')O−, −OP(O)(SR')O−, −OP(O)(R')O−, −OP(O)(NR')O−, −OP(OR')O−, −OP(SR')O−, −OP(NR')O−, −OP(R')O−, ou −OP(OR')[B(R')3]O−, e um ou mais CH ou átomos de carbono são opcional e independentemente substituídos por CyL;
cada −Cy− é independentemente um grupo bivalente opcionalmente substituído selecionado dentre um anel cicloalifático C3-20, um anel C6-20 arila, um anel heteroarila com 5 a 20 membros tendo 1 a 10 heteroátomos, e um anel heterociclila com 3 a 20 membros tendo 1 a 10 heteroátomos; cada CyL é independentemente um grupo trivalente ou tetravalente opcionalmente substituído selecionado dentre um anel cicloalifático C3-20, um anel C6-20 arila, um anel heteroarila com 5 a 20 membros tendo 1 a 10 heteroátomos, e um anel heterociclila com 3 a 20 membros tendo 1 a 10 heteroátomos; cada R' é independentemente −R, −C(O)R, −C(O)OR, ou −S(O)2R; cada R é independentemente −H, ou um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre C1-30 alifático, C1-30 heteroalifático tendo 1 a 10 heteroátomos, C6-30 arila, C6- 30 arilalifático, C6-30 aril-heteroalifático tendo 1 a 10 heteroátomos, heteroarila com 5 a 30 membros tendo 1 a 10 heteroátomos, e heterociclila com 3 a 30 membros tendo 1 a 10 heteroátomos, ou dois grupos R são opcional e independentemente tomados em conjunto para formar uma ligação covalente, ou dois ou mais grupos R no mesmo átomo são opcional e independentemente tomados em conjunto com o átomo para formar um anel monocíclico, bicíclico ou policíclico com 3 a 30 membros opcionalmente substituído tendo, além do átomo, 0 a 10 heteroátomos, ou dois ou mais grupos R em dois ou mais átomos são opcional e independentemente tomados em conjunto com seus átomos intervenientes para formar um anel monocíclico,
bicíclico ou policíclico com 3 a 30 membros opcionalmente substituído tendo, além dos átomos intervenientes, 0 a 10 heteroátomos.
[00333] Em algumas modalidades, uma ligação da fórmula I é quiral no fósforo de ligação (P em PL). Em algumas modalidades, a presente revelação fornece um oligonucleotídeo quiralmente controlado que compreende uma ou mais ligações internucleotídicas modificadas da fórmula I. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece um oligonucleotídeo quiralmente controlado que compreende uma ou mais ligações internucleotídicas modificadas da fórmula I, e em que ligações internucleotídicas individuais da fórmula I dentro do oligonucleotídeo têm modificações P diferentes uma em relação à outra. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece um oligonucleotídeo quiralmente controlado que compreende uma ou mais ligações internucleotídicas modificadas da fórmula I, e em que ligações internucleotídicas individuais da fórmula I dentro do oligonucleotídeo têm –X–L– R1 diferentes uma em relação à outra. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece um oligonucleotídeo quiralmente controlado que compreende uma ou mais ligações internucleotídicas modificadas da fórmula I, e em que ligações internucleotídicas individuais da fórmula I dentro do oligonucleotídeo têm X diferentes uma em relação à outra. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece um oligonucleotídeo quiralmente controlado que compreende uma ou mais ligações internucleotídicas modificadas da fórmula I, e em que ligações internucleotídicas individuais da fórmula I dentro do oligonucleotídeo têm –L–R1 diferentes uma em relação à outra. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo quiralmente controlado é um oligonucleotídeo em uma composição fornecida que é do tipo de oligonucleotídeo particular. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo quiralmente controlado é um oligonucleotídeo em uma composição fornecida que tem a sequência e comprimento de base comuns, o padrão comum de ligações de cadeia principal, e o padrão comum de centros quirais de cadeia principal.
[00334] Conforme extensivamente descrito no presente documento, em algumas modalidades, –X–L–R1 é uma porção química útil para preparação de oligonucleotídeo. Por exemplo, em algumas modalidades, –X–L–R1 é −OCH2CH2CN (por exemplo, em ligações internucleotídicas não quiralmente controladas); em algumas modalidades, –X–L–R1 é de tal estrutura em que H–X–L–R1 é um auxiliar quiral, opcionalmente com cap, conforme descrito no presente documento (por exemplo, DPSE, PSM, etc.; particularmente em ligações internucleotídicas quiralmente controladas, embora também possa em ligações internucleotídicas não quiralmente controladas (por exemplo, precursores de ligações fosfato naturais)).
[00335] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo quiralmente controlado é um oligonucleotídeo em uma composição quiralmente controlada que é de um tipo de oligonucleotídeo particular, e o oligonucleotídeo quiralmente controlado é do tipo. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo quiralmente controlado é um oligonucleotídeo em uma composição fornecida que compreende um nível controlado de uma pluralidade de oligonucleotídeos que compartilham uma sequência de base comum, um padrão comum de ligações de cadeia principal, um padrão comum de centros quirais de cadeia principal, e um padrão comum de modificações de fósforo de cadeia principal, e o oligonucleotídeo quiralmente controlado compartilha a sequência de base comum, o padrão comum de ligações de cadeia principal, o padrão comum de centros quirais de cadeia principal, e o padrão comum de modificações de fósforo de cadeia principal.
[00336] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece um oligonucleotídeo quiralmente controlado, em que pelo menos duas ligações internucleotídicas quiralmente controladas dentro do oligonucleotídeo têm modificações P diferentes uma em relação à outra, pelo fato de que elas têm átomos X diferentes em suas porções químicas –XLR1, e/ou pelo fato de que elas têm grupos L diferentes em suas porções químicas –XLR1 e/ou pelo fato de que elas têm átomos R1 diferentes em suas porções químicas –XLR1 e/ou in pelo fato de que elas têm porções químicas –XLR1 diferentes.
[00337] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece um oligonucleotídeo quiralmente controlado, em que pelo menos duas das ligações internucleotídicas individuais dentro do oligonucleotídeo têm estereoquímica diferente e/ou modificações P diferentes uma em relação à outra e o oligonucleotídeo tem uma estrutura representada pela seguinte fórmula: [SBn1RBn2SBn3RBn4...SBnxRBny] em que: cada RB independentemente representa um bloco de unidades de nucleotídeo tendo a configuração R no fósforo de ligação; cada SB independentemente representa um bloco de unidades de nucleotídeo tendo a configuração S no fósforo de ligação; cada um dentre n1 a ny é zero ou um número inteiro, com o requisito de que pelo menos um n ímpar e pelo menos um n par precisam ser diferentes de zero, de modo que o oligonucleotídeo inclua pelo menos duas ligações internucleotídicas individuais com estereoquímica diferente uma em relação à outra; e em que a soma de n1 a ny se situa entre 2 e 200, e em algumas modalidades se situa entre um limite inferior selecionado dentre o grupo que consiste em 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais e um limite superior selecionado dentre o grupo que consiste em 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, e 200, sendo que o limite superior é maior que o limite inferior.
[00338] Em algumas modalidades, cada n tem o mesmo valor; em algumas modalidades, cada n par tem o mesmo valor que outro n par; em algumas modalidades, cada n ímpar tem o mesmo valor que outro n ímpar; em algumas modalidades, pelo menos dois ns pares têm valores diferentes um do outro; em algumas modalidades, pelo menos ns ímpares têm valores diferentes um do outro.
[00339] Em algumas modalidades, pelo menos dois ns adjacentes são iguais, de modo que um oligonucleotídeo fornecido inclua blocos adjacentes de ligações estereoquímicas S e ligações estereoquímicas R de comprimentos iguais. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos incluem blocos de repetição de ligações estereoquímicas S e R de comprimentos iguais. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos incluem blocos de repetição de ligações estereoquímicas S e R, em que pelo menos dois blocos são de comprimentos diferentes um do outro; em algumas modalidades cada bloco de estereoquímica S é do mesmo comprimento, e é de um comprimento diferente de cada comprimento de estereoquímica R, que pode ser opcionalmente do mesmo comprimento que o outro.
[00340] Em algumas modalidades, pelo menos dois ns adjacentes a salto são iguais, de modo que um oligonucleotídeo fornecido inclua pelo menos dois blocos de ligações de uma primeira estereoquímica que têm comprimentos iguais e são separadas por um bloco de ligações da outra estereoquímica, cujos blocos separados podem ser do mesmo comprimento ou de um comprimento diferente dos blocos da primeira estereoquímica.
[00341] Em algumas modalidades, ns associados aos blocos de ligação nas extremidades de um oligonucleotídeo fornecido são do mesmo comprimento. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos têm blocos terminais da mesma estereoquímica de ligação. Em algumas tais modalidades, os blocos terminais são separados uns dos outros por um bloco intermediário da outra estereoquímica de ligação.
[00342] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido da fórmula [SBn1RBn2SBn3RBn4...SBnxRBny] é um stereoblockmer. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido da fórmula [SBn1RBn2SBn3RBn4...SBnxRBny] é um stereoskipmer. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido da fórmula [SBn1RBn2SBn3RBn4...SBnxRBny] é um stereoaltmer. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido da fórmula
[SBn1RBn2SBn3RBn4...SBnxRBny] é um gapmer.
[00343] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido da fórmula [SBn1RBn2SBn3RBn4...SBnxRBny] é de qualquer um dos padrões descritos acima e compreende adicionalmente padrões de modificações P. Por exemplo, em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido da fórmula [SBn1RBn2SBn3RBn4...SBnxRBny] e é um stereoskipmer e skipmer de modificação P. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido da fórmula [SBn1RBn2SBn3RBn4...SBnxRBny] e é um stereoblockmer e altmer de modificação P. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido da fórmula [SBn1RBn2SBn3RBn4...SBnxRBny] e é um stereoaltmer e blockmer de modificação P.
[00344] Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica da fórmula I tem a estrutura de: em que: P* é um átomo de fósforo assimétrico e é Rp ou Sp; W é O, S ou Se; cada um dentre X, Y e Z é independentemente –O–, – S–, –N(–L–R1)–, ou L; L é uma ligação covalente ou um C1–C10 alquileno linear ou ramificado opcionalmente substituído, em que uma ou mais unidades de metileno de L são opcional e independentemente substituídas por C1–C6 alquileno, C1–C6 alquenileno, , uma porção química de C1–C6, −C(R′)2–, –Cy–, –O–, –S–, –S–S–, −N(R′)–, −C(O)–, –C(S)–, −C(NR′)–, –C(O)N(R′)–, −N(R′)C(O)N(R′)-
, −N(R′)C(O)–, –N(R′)C(O)O–, −OC(O)N(R′)−, –S(O)–, –S(O)2–, −S(O)2N(R′)–, −N(R′)S(O)2− –SC(O)–, –C(O)S–, –OC(O)–, e −C(O)O−; R1 é halogênio, R, ou um C1–C50 alifático opcionalmente substituído em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por C1– C6 alquileno, C1–C6 alquenileno, , uma porção química de C1–C6 heteroalifático, −C(R′)2−, –Cy–, –O–, –S–, –S–S–, −N(R′)– , −C(O)–, –C(S)–, –C(NR′)–, –C(O)N(R′)–, −N(R′)C(O)N(R′)-, −N(R′)C(O)–, –N(R′)C(O)O–, −OC(O)N(R′)−, –S(O)–, –S(O)2–, −S(O)2N(R′)–, −N(R′)S(O)2− –SC(O)–, –C(O)S–, –OC(O)–, e −C(O)O– ; cada R′ é independentemente –R, -C(O)R, -CO2R, ou – SO2R, ou: dois R′ são tomados em conjunto com seus átomos intervenientes para formar um anel arila, carbocíclico, heterocíclico ou heteroarila opcionalmente substituído; –Cy– é um anel bivalente opcionalmente substituído selecionado dentre fenileno, carbociclileno, arileno, heteroarileno e heterociclileno; cada R é independentemente hidrogênio, ou um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre C1–C6 alifático, carbociclila, arila, heteroarila e heterociclila; e cada independentemente representa uma conexão a um nucleosídeo.
[00345] Em algumas modalidades, L é uma ligação covalente ou um C1–C10 alquileno linear ou ramificado opcionalmente substituído, em que uma ou mais unidades de metileno de L são opcional e independentemente substituídas por um C1–C6 alquileno opcionalmente substituído, C1–C6 alquenileno, , –C(R′)2–, –Cy–, –O–, –S–, –S–S–, –N(R′)– , –C(O)–, –C(S)–, –C(NR′)–, –C(O)N(R′)–, –N(R′)C(O)N(R′)-, – N(R′)C(O)–, –N(R′)C(O)O–, –OC(O)N(R′)-, –S(O)–, –S(O)2–, – S(O)2N(R′)–, –N(R′)S(O)2–, –SC(O)–, –C(O)S–, –OC(O)–, ou –C(O)O– ; R1 é halogênio, R, ou um C1–C50 alifático opcionalmente substituído em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por um C1–C6 alquileno opcionalmente substituído, C1–C6 alquenileno, , –C(R′)2–, –Cy–, –O–, –S–, –S–S–, –N(R′)–, –C(O)–, – C(S)–, –C(NR′)–, –C(O)N(R′)–, –N(R′)C(O)N(R′)-, –N(R′)C(O)–, – N(R′)C(O)O–, –OC(O)N(R′)-, –S(O)–, –S(O)2–, –S(O)2N(R′)–, – N(R′)S(O)2–, –SC(O)–, –C(O)S–, –OC(O)–, ou –C(O)O–; cada R′ é independentemente –R, -C(O)R, -CO2R, ou – SO2R, ou: dois R′ no mesmo nitrogênio são tomados em conjunto com seus átomos intervenientes para formar um anel heterocíclico ou heteroarila opcionalmente substituído, ou dois R′ no mesmo carbono são tomados em conjunto com seus átomos intervenientes para formar um anel arila, carbocíclico, heterocíclico ou heteroarila opcionalmente substituído; –Cy– é um anel bivalente opcionalmente substituído selecionado dentre fenileno, carbociclileno, arileno, heteroarileno ou heterociclileno; cada R é independentemente hidrogênio, ou um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre C1–C6 alifático, fenila, carbociclila, arila, heteroarila ou heterociclila; e cada independentemente representa uma conexão a um nucleosídeo.
[00346] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo quiralmente controlado compreende uma ou mais ligações internucleotídicas modificadas. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo quiralmente controlado compreende, por exemplo, um fosforotioato ou uma ligação internucleotídica de triéster de fosforotioato. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo quiralmente controlado compreende uma ligação triéster de fosforotioato quiralmente controlada. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo quiralmente controlado compreende pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 ligações internucleotídicas triéster de fosforotioato quiralmente controladas. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo quiralmente controlado compreende pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 ligações internucleotídicas fosforotioato quiralmente controladas (−O−P(O)(SH)−O− ou formas de sal dos mesmos).
[00347] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo compreende tipos diferentes de ligações fósforo internucleotídicas. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo quiralmente controlado compreende pelo menos uma ligação fosfato natural e pelo menos uma ligação internucleotídica modificada (não natural). Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo compreende pelo menos uma ligação fosfato natural e pelo menos um fosforotioato. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo compreende pelo menos uma ligação internucleotídica não negativamente carregada. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo compreende pelo menos uma ligação fosfato natural e pelo menos uma ligação internucleotídica não negativamente carregada. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo compreende pelo menos uma ligação internucleotídica fosforotioato e pelo menos uma ligação internucleotídica não negativamente carregada. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo compreende pelo menos uma ligação internucleotídica fosforotioato, pelo menos uma ligação fosfato natural, e pelo menos uma ligação internucleotídica não negativamente carregada.
[00348] Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica compreende um auxiliar quiral. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica da fórmula I, I-a, I-b, I-c, I-n-1, I-n-2, I-n-3, I-n-4, II, II-a-1, II-a-2, II- b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, II-d-2, etc., compreende um auxiliar quiral, em que PL é P=S. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica da fórmula I, I-a, I-b, I-c, I- n-1, I-n-2, I-n-3, I-n-4, II, II-a-1, II-a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, II-d-2, etc., compreende um auxiliar quiral, em que PL é P=O. Em algumas modalidades, uma ligação triéster de fosforotioato compreende um auxiliar quiral, que, por exemplo, é usada para controlar a estereosseletividade de uma reação. Em algumas modalidades, uma ligação triéster de fosforotioato não compreende um auxiliar quiral. Os auxiliares quirais exemplificativos que podem ser utilizados de acordo com a presente revelação incluem aqueles descritos nos documentos US 9394333, US 9744183, US 9605019, US 20130178612, US 20150211006, US 9598458, US 20170037399, WO 2017/015555, WO 2017/062862, WO 2018/237194, WO 2019/055951, os auxiliares quirais de cada um dos quais são incorporados ao presente documento a título de referência.
Em algumas modalidades, um ou mais −X−L−R1 compreendem independentemente ou são um auxiliar quiral opcionalmente substituído.
Em algumas modalidades, um ou mais −X−L−R1 são, cada um, independentemente de tal estrutura em que H−X−L−R1 é um reagente quiral/auxiliar quiral descrito no presente documento (por exemplo, um que tem a estrutura da fórmula 3-I, fórmula 3-AA, etc.). Em algumas modalidades, H−X−L−R1 é um reagente quiral/auxiliar quiral com cap descrito no presente documento (por exemplo, um que tem a estrutura da fórmula 3-I, fórmula 3-AA, etc.), que capeado pelo fato de que um grupo amino do reagente quiral/auxiliar quiral (por exemplo, H−W1 e H−W2 é ou compreende H−NG5−) é capeado (por exemplo, formando R1−NG5− (por exemplo, R'C(O)−NG5−, RS(O)2−NG5−, etc.)). Em algumas modalidades, R' é C1-6 alquila opcionalmente substituída.
Em algumas modalidades, R' é metila.
Em algumas modalidades, um ou mais −X−L−R1 são, cada um, independentemente de tal estrutura em que H−X−L−R1 é
, , , , ,
, , ou . Em algumas modalidades, um ou mais −X−L−R1 são, cada um, independentemente de tal estrutura em que H−X−L−R1 é , ,
, , , ou . Em algumas modalidades, um ou mais −X−L−R1 são, cada um,
independentemente de tal estrutura em que H−X−L−R1 é , , , ou . Em algumas modalidades, um ou mais −X−L−R1 são, cada um, independentemente de tal estrutura em que H−X−L−R1 é um composto selecionado dentre as Tabelas CA-1, CA-2, CA-3, CA-4, CA-5, CA-6, CA-7, CA-8, CA-9, CA-10, CA-11, CA-12, ou CA-13, ou um diastereômero ou enantiômero relacionado do mesmo (tendo a mesma constituição). Em algumas modalidades, um ou mais −X−L−R1 são, cada um, independentemente de tal estrutura em que H−X−L−R1 é , , , R1
HO N Me , , Ph , , ou . Em algumas modalidades, um ou mais −X−L−R1 são, cada um, independentemente de tal estrutura em que H−X−L−R1 é R1
HO N Me , , , , Ph , ou . Em algumas modalidades, um ou mais −X−L−R1 são,
cada um, independentemente de tal estrutura em que H−X−L−R1 é
, , , ou
. Em algumas modalidades, um ou mais −X−L−R1 são, cada um, independentemente de tal estrutura em que H−X−L−R1 é um composto selecionado dentre as Tabelas CA-1, CA-2, CA-3, CA-4, CA-5, CA-6, CA-7, CA-8, CA-9, CA-10, CA-11, CA-12, ou CA-13, ou um diastereômero ou enantiômero relacionado do mesmo (tendo a mesma constituição), em que o −NH− da pirrolidinila com 5 membros é substituído por −N(R1)−. Em algumas modalidades, um ou mais −X−L−R1 são independentemente
, , , , ,
, ou . Em algumas modalidades, um ou mais −X−L−R1 são independentemente
, , , , , ou
. Em algumas modalidades, um ou mais −X−L−R1 são independentemente , , ou . Em algumas modalidades, um ou mais −X−L−R1 são, cada um, independentemente de tal estrutura em que H−X−L−R1 é um composto selecionado dentre as Tabelas CA-1, CA-2, CA-3, CA-4, CA-5, CA-6, CA-7, CA-8, CA-9, CA-10, CA-11, CA-12, ou CA-13, ou um diastereômero ou enantiômero relacionado do mesmo (tendo a mesma constituição), em que a conexão ao fósforo de ligação ocorre através do grupo álcool hidroxila. Em algumas modalidades, um ou mais −X−L−R1 são independentemente , , , R1
O N Me , , Ph , ou . Em algumas modalidades, um ou mais −X−L−R1 são independentemente , , , R1
O N Me , Ph , ou . Em algumas modalidades, um ou mais −X−L−R1 são independentemente
, , ou . Em algumas modalidades, um ou mais −X−L−R1 são, cada um, independentemente de tal estrutura em que H−X−L−R1 é um composto selecionado dentre as Tabelas CA-1, CA-2, CA-3, CA-4, CA-5, CA-6, CA-7, CA-8, CA-9, CA-10, CA-11, CA-12, ou CA-13, ou um diastereômero ou enantiômero relacionado do mesmo (tendo a mesma constituição), em que o −NH− da pirrolidinila com 5 membros é substituído por −N(R1)−, e em que a conexão ao fósforo de ligação é através do grupo álcool hidroxila. Em algumas modalidades, um ou mais −X−L−R1 são independentemente , , , , , , ou , e um ou mais −X−L−R1 são independentemente , , R1
O N Me , , , Ph , ou . Em algumas modalidades, um ou mais −X−L−R1 são independentemente , , , , , ou , e um ou mais −X−L−R1 são independentemente , , R1
O N Me , , Ph , ou . Em algumas modalidades, um ou mais −X−L−R1 são independentemente , , ou , e um ou mais −X−L−R1 são independentemente , , ou . Em algumas modalidades, R1 é um grupo capping utilizado na síntese de oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, R1 é −C(O)−R'. Em algumas modalidades, R1 é −C(O)−R', em que R' é C1-6 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, R1 é −C(O)CH3.
[00349] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo, por exemplo, um oligonucleotídeo quiralmente controlado, um oligonucleotídeo de uma pluralidade, etc. é ligado a um suporte sólido. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo não é ligado a um suporte sólido.
[00350] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo compreende pelo menos uma ligação fosfato natural e pelo menos duas ligações internucleotídicas modificadas quiralmente controladas consecutivas. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo quiralmente controlado compreende pelo menos uma ligação fosfato natural e pelo menos duas ligações internucleotídicas fosforotioato quiralmente controladas consecutivas.
[00351] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo quiralmente controlado é um blockmer. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo quiralmente controlado é um stereoblockmer. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo quiralmente controlado é um blockmer de modificação P. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo quiralmente controlado é um blockmer de ligação.
[00352] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo quiralmente controlado é um altmer. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo quiralmente controlado é um stereoaltmer. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo quiralmente controlado é um altmer de modificação P. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo quiralmente controlado é um altmer de ligação.
[00353] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo quiralmente controlado é um unimer.
[00354] Em algumas modalidades, em um unimer, todas as unidades de nucleotídeo dentro de uma fita compartilham pelo menos um recurso estrutural comum na ligação fósforo internucleotídica. Em algumas modalidades, um recurso estrutural comum é uma estereoquímica comum no fósforo de ligação ou uma modificação comum no fósforo de ligação. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo quiralmente controlado é um stereounimer. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo quiralmente controlado é um unimer de modificação P. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo quiralmente controlado é um unimer de ligação.
[00355] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo quiralmente controlado é um gapmer.
[00356] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo quiralmente controlado é um skipmer.
[00357] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece oligonucleotídeos que compreendem uma ou mais ligações internucleotídicas modificadas independentemente que têm a estrutura da fórmula I, I-a, I-b, I-c, I-n-1, I-n- 2, I-n-3, I-n-4, II, II-a-1, II-a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, II-d-2, III, ou uma forma de sal da mesma.
[00358] Em algumas modalidades, L é uma ligação covalente ou um C1–C10 alquileno linear ou ramificado opcionalmente substituído, em que uma ou mais unidades de metileno de L são opcional e independentemente substituídas por um C1–C6 alquileno opcionalmente substituído, C1–C6 alquenileno, , –C(R′)2–, –Cy–, –O–, –S–, –S–S–, –N(R′)– , –C(O)–, –C(S)–, –C(NR′)–, –C(O)N(R′)–, –N(R′)C(O)N(R′)-, – N(R′)C(O)–, –N(R′)C(O)O–, –OC(O)N(R′)-, –S(O)–, –S(O)2–, – S(O)2N(R′)–, –N(R′)S(O)2–, –SC(O)–, –C(O)S–, –OC(O)–, ou –C(O)O– ;
R1 é halogênio, R, ou um C1–C50 alifático opcionalmente substituído em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por um C1–C6 alquileno opcionalmente substituído, C1–C6 alquenileno, , –C(R′)2–, –Cy–, –O–, –S–, –S–S–, –N(R′)–, –C(O)–, – C(S)–, –C(NR′)–, –C(O)N(R′)–, –N(R′)C(O)N(R′)-, –N(R′)C(O)–, – N(R′)C(O)O–, –OC(O)N(R′)-, –S(O)–, –S(O)2–, –S(O)2N(R′)–, – N(R′)S(O)2–, –SC(O)–, –C(O)S–, –OC(O)–, ou –C(O)O–; cada R′ é independentemente –R, -C(O)R, -CO2R, ou – SO2R, ou: dois R′ no mesmo nitrogênio são tomados em conjunto com seus átomos intervenientes para formar um anel heterocíclico ou heteroarila opcionalmente substituído, ou dois R′ no mesmo carbono são tomados em conjunto com seus átomos intervenientes para formar um anel arila, carbocíclico, heterocíclico ou heteroarila opcionalmente substituído; –Cy– é um anel bivalente opcionalmente substituído selecionado dentre fenileno, carbociclileno, arileno, heteroarileno ou heterociclileno; cada R é independentemente hidrogênio, ou um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre C1–C6 alifático, fenila, carbociclila, arila, heteroarila ou heterociclila; e cada independentemente representa uma conexão a um nucleosídeo.
[00359] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo quiralmente controlado compreende uma ou mais ligações fósforo internucleotídicas modificadas. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo quiralmente controlado compreende, por exemplo, um fosforotioato ou uma ligação triéster de fosforotioato. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo quiralmente controlado compreende uma ligação triéster de fosforotioato. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo quiralmente controlado compreende pelo menos duas ligações triéster de fosforotioato. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo quiralmente controlado compreende pelo menos três ligações triéster de fosforotioato. As ligações fósforo internucleotídicas modificadas são adicionalmente descritas no presente documento. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo quiralmente controlado compreende ligações fósforo internucleotídicas diferentes. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo quiralmente controlado compreende pelo menos uma ligação internucleotídica diéster de fosfato e pelo menos uma ligação internucleotídica modificada. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo quiralmente controlado compreende pelo menos uma ligação internucleotídica diéster de fosfato e pelo menos uma ligação triéster de fosforotioato. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo quiralmente controlado compreende pelo menos uma ligação internucleotídica diéster de fosfato e pelo menos duas ligações triéster de fosforotioato. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo quiralmente controlado compreende pelo menos uma ligação internucleotídica diéster de fosfato e pelo menos três ligações triéster de fosforotioato.
[00360] Em algumas modalidades, P* é um átomo de fósforo assimétrico e é Rp ou Sp. Em algumas modalidades, P* é Rp. Em outras modalidades, P* é Sp. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo compreende uma ou mais ligações internucleotídicas da fórmula I em que cada P* é independentemente Rp ou Sp. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo compreende uma ou mais ligações internucleotídicas da fórmula I em que cada P* é Rp. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo compreende uma ou mais ligações internucleotídicas da fórmula I em que cada P* é Sp. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo compreende pelo menos uma ligação internucleotídica da fórmula I em que P* é Rp. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo compreende pelo menos uma ligação internucleotídica da fórmula I em que P* é Sp. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo compreende pelo menos uma ligação internucleotídica da fórmula I em que P* é Rp, e pelo menos uma ligação internucleotídica da fórmula I em que P* é Sp.
[00361] Em algumas modalidades, W é O, S, ou Se. Em algumas modalidades, W é O. Em algumas modalidades, W é S. Em algumas modalidades, W é Se. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo compreende pelo menos uma ligação internucleotídica da fórmula I em que W é O. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo compreende pelo menos uma ligação internucleotídica da fórmula I em que W é S. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo compreende pelo menos uma ligação internucleotídica da fórmula I em que W é Se.
[00362] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo compreende pelo menos uma ligação internucleotídica da fórmula I em que W é O. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo compreende pelo menos uma ligação internucleotídica da fórmula I em que W é S.
[00363] Em algumas modalidades, X é –O–. Em algumas modalidades, X é –S–. Em algumas modalidades, X é –O– ou –S–. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo compreende pelo menos uma ligação internucleotídica da fórmula I em que X é –O–. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo compreende pelo menos uma ligação internucleotídica da fórmula I em que X é –S–. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo compreende pelo menos uma ligação internucleotídica da fórmula I em que X é –O–, e pelo menos uma ligação internucleotídica da fórmula I em que X é –S–. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo compreende pelo menos uma ligação internucleotídica da fórmula I em que X é –O–, e pelo menos uma ligação internucleotídica da fórmula I em que X é –S–, e pelo menos uma ligação internucleotídica da fórmula I em que L é um C1–C10 alquileno linear ou ramificado opcionalmente substituído, em que uma ou mais unidades de metileno de L são opcional e independentemente substituídas por um C1–C6 alquileno opcionalmente substituído, C1–C6 alquenileno, , –C(R′)2–, –Cy–, –O–, –S–, –S–S–, – N(R′)–, –C(O)–, –C(S)–, –C(NR′)–, –C(O)N(R′)–, –N(R′)C(O)N(R′)-, –N(R′)C(O)–, –N(R′)C(O)O–, –OC(O)N(R′)-, –S(O)–, –S(O)2–, – S(O)2N(R′)–, –N(R′)S(O)2–, –SC(O)–, –C(O)S–, –OC(O)–, ou –C(O)O– .
[00364] Em algumas modalidades, X é –N(–L– R1)–. Em algumas modalidades, X é –N(R1)–. Em algumas modalidades, X é –N(R')–. Em algumas modalidades, X é –N(R)–. Em algumas modalidades, X é –NH–.
[00365] Em algumas modalidades, X é L. Em algumas modalidades, X é uma ligação covalente. Em algumas modalidades, X é ou um C1–C10 alquileno linear ou ramificado opcionalmente substituído, em que uma ou mais unidades de metileno de L são opcional e independentemente substituídas por um C1–C6 alquileno opcionalmente substituído, C1–C6 alquenileno, , –C(R′)2–, –Cy–, –O–, –S–, –S–S–, –N(R′)– , –C(O)–, –C(S)–, –C(NR′)–, –C(O)N(R′)–, –N(R′)C(O)N(R′)-, – N(R′)C(O)–, –N(R′)C(O)O–, –OC(O)N(R′)-, –S(O)–, –S(O)2–, – S(O)2N(R′)–, –N(R′)S(O)2–, –SC(O)–, –C(O)S–, –OC(O)–, ou –C(O)O– . Em algumas modalidades, X é um C1–C10 alquileno opcionalmente substituído ou C1–C10 alquenileno. Em algumas modalidades, X é metileno.
[00366] Em algumas modalidades, Y é –O–. Em algumas modalidades, Y é –S–.
[00367] Em algumas modalidades, Y é –N(–L– R1)–. Em algumas modalidades, Y é –N(R1)–. Em algumas modalidades, Y é –N(R')–. Em algumas modalidades, Y é –N(R)–. Em algumas modalidades, Y é –NH–.
[00368] Em algumas modalidades, Y é L. Em algumas modalidades, Y é uma ligação covalente. Em algumas modalidades, Y é ou um C1–C10 alquileno linear ou ramificado opcionalmente substituído, em que uma ou mais unidades de metileno de L são opcional e independentemente substituídas por um C1–C6 alquileno opcionalmente substituído, C1–C6 alquenileno, , –C(R′)2–, –Cy–, –O–, –S–, –S–S–, –N(R′)– , –C(O)–, –C(S)–, –C(NR′)–, –C(O)N(R′)–, –N(R′)C(O)N(R′)-, – N(R′)C(O)–, –N(R′)C(O)O–, –OC(O)N(R′)-, –S(O)–, –S(O)2–, – S(O)2N(R′)–, –N(R′)S(O)2–, –SC(O)–, –C(O)S–, –OC(O)–, ou –C(O)O– . Em algumas modalidades, Y é um C1–C10 alquileno opcionalmente substituído ou C1–C10 alquenileno. Em algumas modalidades, Y é metileno.
[00369] Em algumas modalidades, Z é –O–. Em algumas modalidades, Z é –S–.
[00370] Em algumas modalidades, Z é –N(–L–
R1)–. Em algumas modalidades, Z é –N(R1)–. Em algumas modalidades, Z é –N(R')–. Em algumas modalidades, Z é –N(R)–. Em algumas modalidades, Z é –NH–.
[00371] Em algumas modalidades, Z é L. Em algumas modalidades, Z é uma ligação covalente. Em algumas modalidades, Z é ou um C1–C10 alquileno linear ou ramificado opcionalmente substituído, em que uma ou mais unidades de metileno de L são opcional e independentemente substituídas por um C1–C6 alquileno opcionalmente substituído, C1–C6 alquenileno, , –C(R′)2–, –Cy–, –O–, –S–, –S–S–, –N(R′)– , –C(O)–, –C(S)–, –C(NR′)–, –C(O)N(R′)–, –N(R′)C(O)N(R′)-, – N(R′)C(O)–, –N(R′)C(O)O–, –OC(O)N(R′)-, –S(O)–, –S(O)2–, – S(O)2N(R′)–, –N(R′)S(O)2–, –SC(O)–, –C(O)S–, –OC(O)–, ou –C(O)O– . Em algumas modalidades, Z é um C1–C10 alquileno opcionalmente substituído ou C1–C10 alquenileno. Em algumas modalidades, Z é metileno.
[00372] Em algumas modalidades, L é uma ligação covalente ou um C1–C10 alquileno linear ou ramificado opcionalmente substituído, em que uma ou mais unidades de metileno de L são opcional e independentemente substituídas por um C1–C6 alquileno opcionalmente substituído, C1–C6 alquenileno, , –C(R′)2–, –Cy–, –O–, –S–, –S–S–, –N(R′)– , –C(O)–, –C(S)–, –C(NR′)–, –C(O)N(R′)–, –N(R′)C(O)N(R′)-, – N(R′)C(O)–, –N(R′)C(O)O–, –OC(O)N(R′)-, –S(O)–, –S(O)2–, – S(O)2N(R′)–, –N(R′)S(O)2–, –SC(O)–, –C(O)S–, –OC(O)–, ou –C(O)O– .
[00373] Em algumas modalidades, L é uma ligação covalente. Em algumas modalidades, L é um C1–C10 alquileno linear ou ramificado opcionalmente substituído, em que uma ou mais unidades de metileno de L são opcional e independentemente substituídas por um C1–C6 alquileno opcionalmente substituído, C1–C6 alquenileno, , –C(R′)2– , –Cy–, –O–, –S–, –S–S–, –N(R′)–, –C(O)–, –C(S)–, –C(NR′)–, – C(O)N(R′)–, –N(R′)C(O)N(R′)-, –N(R′)C(O)–, –N(R′)C(O)O–, – OC(O)N(R′)-, –S(O)–, –S(O)2–, –S(O)2N(R′)–, –N(R′)S(O)2–, –SC(O)– , –C(O)S–, –OC(O)–, ou –C(O)O–.
[00374] Em algumas modalidades, L tem a estrutura de –L1–V–, em que: L1 é um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre , , , , , , , , , C1 – C6 alquileno, C1-C6 alquenileno, carbociclileno, arileno, C1–C6 heteroalquileno, heterociclileno e heteroarileno; V é selecionado dentre –O–, –S–, –NR'–, C(R')2, –S– S–, –B–S–S–C–, , ou um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre C1–C6 alquileno, arileno, C1–C6 heteroalquileno, heterociclileno e heteroarileno; A é =O, =S, =NR', ou =C(R')2; cada um dentre B e C é independentemente –O–, –S–, –NR'–, –C(R')2–, ou um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre C1–C6 alquileno, carbociclileno, arileno, heterociclileno, ou heteroarileno; e cada R' é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento.
[00375] Em algumas modalidades, L1 é , , , , , , ou .
[00376] Em algumas modalidades, L1 é , em que o Anel Cy' é um arileno, carbociclileno, heteroarileno ou heterociclileno opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, L1 é opcionalmente substituído . Em algumas modalidades, L1 é .
[00377] Em algumas modalidades, L1 é conectado a X. Em algumas modalidades, L1 é um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre , , , , , , , ,e , e o átomo de enxofre é conectado a V. Em algumas modalidades, L1 é um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre ,
, , , , , , ,e , e o átomo de carbono é conectado a X.
[00378] Em algumas modalidades, L tem a estrutura de: , em que: E é –O–, –S–, –NR'– ou –C(R')2–; é uma ligação simples ou dupla; os dois RL1 são tomados em conjunto com os dois átomos de carbono aos quais eles são ligados para formar um anel arila, carbocíclico, heteroarila ou heterocíclico; e cada R' é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento.
[00379] Em algumas modalidades, L tem a estrutura de: , em que: G é –O–, –S–, ou –NR'; é uma ligação simples ou dupla; e os dois RL1 são tomados em conjunto com os dois átomos de carbono aos quais eles são ligados para formar um anel arila, C3-C10 carbocíclico, heteroarila ou heterocíclico opcionalmente substituído.
[00380] Em algumas modalidades, L tem a estrutura de: , em que: E é –O–, –S–, –NR'– ou –C(R')2–; D é =N–, =C(F)–, =C(Cl)–, =C(Br)–, =C(I)–, =C(CN)–, =C(NO2)–, =C(CO2–(C1-C6 alifático))–, ou =C(CF3)–; e cada R' é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento.
[00381] Em algumas modalidades, L tem a estrutura de: , em que: G é –O–, –S–, ou –NR'; D é =N–, =C(F)–, =C(Cl)–, =C(Br)–, =C(I)–, =C(CN)–, =C(NO2)–, =C(CO2–(C1-C6 alifático))–, ou =C(CF3)–.
[00382] Em algumas modalidades, L tem a estrutura de:
, em que: E é –O–, –S–, –NR'– ou –C(R')2–; D é =N–, =C(F)–, =C(Cl)–, =C(Br)–, =C(I)–, =C(CN)–, =C(NO2)–, =C(CO2–(C1-C6 alifático))–, ou =C(CF3)–; e cada R' é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento.
[00383] Em algumas modalidades, L tem a estrutura de: , em que: G é –O–, –S–, ou –NR'; D é =N–, =C(F)–, =C(Cl)–, =C(Br)–, =C(I)–, =C(CN)–, =C(NO2)–, =C(CO2–(C1-C6 alifático))–, ou =C(CF3)–.
[00384] Em algumas modalidades, L tem a estrutura de: , em que: E é –O–, –S–, –NR'– ou –C(R')2–; é uma ligação simples ou dupla; os dois RL1 são tomados em conjunto com os dois átomos de carbono aos quais eles são ligados para formar um anel arila, C3-C10 carbocíclico, heteroarila ou heterocíclico opcionalmente substituído.; e cada R' é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento.
[00385] Em algumas modalidades, L tem a estrutura de: , em que: G é –O–, –S–, ou –NR'; é uma ligação simples ou dupla; os dois RL1 são tomados em conjunto com os dois átomos de carbono aos quais eles são ligados para formar um anel arila, C3-C10 carbocíclico, heteroarila ou heterocíclico opcionalmente substituído.; e cada R' é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento.
[00386] Em algumas modalidades, L tem a estrutura de: , em que: E é –O–, –S–, –NR'– ou –C(R')2–; D é =N–, =C(F)–, =C(Cl)–, =C(Br)–, =C(I)–, =C(CN)–, =C(NO2)–, =C(CO2–(C1-C6 alifático))–, ou =C(CF3)–; e cada R' é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento.
[00387] Em algumas modalidades, L tem a estrutura de: , em que: G é –O–, –S–, ou –NR'; D é =N–, =C(F)–, =C(Cl)–, =C(Br)–, =C(I)–, =C(CN)–, =C(NO2)–, =C(CO2–(C1-C6 alifático))–, ou =C(CF3)–; e cada R' é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento.
[00388] Em algumas modalidades, L tem a estrutura de: , em que: E é –O–, –S–, –NR'– ou –C(R')2–; D é =N–, =C(F)–, =C(Cl)–, =C(Br)–, =C(I)–, =C(CN)–, =C(NO2)–, =C(CO2–(C1-C6 alifático))–, ou =C(CF3)–; e cada R' é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento.
[00389] Em algumas modalidades, L tem a estrutura de: ,
em que: G é –O–, –S–, ou –NR'; D é =N–, =C(F)–, =C(Cl)–, =C(Br)–, =C(I)–, =C(CN)–, =C(NO2)–, =C(CO2–(C1-C6 alifático))–, ou =C(CF3)–; e cada R' é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento.
[00390] Em algumas modalidades, L tem a estrutura de: , em que: E é –O–, –S–, –NR'– ou –C(R')2–; é uma ligação simples ou dupla; os dois RL1 são tomados em conjunto com os dois átomos de carbono aos quais eles são ligados para formar um anel arila, C3-C10 carbocíclico, heteroarila ou heterocíclico opcionalmente substituído; e cada R' é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento.
[00391] Em algumas modalidades, L tem a estrutura de: , em que: G é –O–, –S–, ou –NR'; é uma ligação simples ou dupla; os dois RL1 são tomados em conjunto com os dois átomos de carbono aos quais eles são ligados para formar um anel arila, C3-C10 carbocíclico, heteroarila ou heterocíclico opcionalmente substituído; e cada R' é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento.
[00392] Em algumas modalidades, L tem a estrutura de: , em que: E é –O–, –S–, –NR'– ou –C(R')2–; D é =N–, =C(F)–, =C(Cl)–, =C(Br)–, =C(I)–, =C(CN)–, =C(NO2)–, =C(CO2–(C1-C6 alifático))–, ou =C(CF3)–; e cada R' é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento.
[00393] Em algumas modalidades, L tem a estrutura de: , em que: G é –O–, –S–, ou –NR'; D é =N–, =C(F)–, =C(Cl)–, =C(Br)–, =C(I)–, =C(CN)–, =C(NO2)–, =C(CO2–(C1-C6 alifático))–, ou =C(CF3)–; e R' é conforme definido acima e descrito no presente documento.
[00394] Em algumas modalidades, L tem a estrutura de:
, em que: E é –O–, –S–, –NR'– ou –C(R')2–; D é =N–, =C(F)–, =C(Cl)–, =C(Br)–, =C(I)–, =C(CN)–, =C(NO2)–, =C(CO2–(C1-C6 alifático))–, ou =C(CF3)–; e cada R' é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento.
[00395] Em algumas modalidades, L tem a estrutura de: , em que: G é –O–, –S–, ou –NR'; D é =N–, =C(F)–, =C(Cl)–, =C(Br)–, =C(I)–, =C(CN)–, =C(NO2)–, =C(CO2–(C1-C6 alifático))–, ou =C(CF3)–; e R' é conforme definido acima e descrito no presente documento.
[00396] Em algumas modalidades, L tem a estrutura de: , em que o anel fenila é opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, o anel fenila não é substituído. Em algumas modalidades, o anel fenila é substituído.
[00397] Em algumas modalidades, L tem a estrutura de: , em que o anel fenila é opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, o anel fenila não é substituído. Em algumas modalidades, o anel fenila é substituído.
[00398] Em algumas modalidades, L tem a estrutura de: , em que: é uma ligação simples ou dupla; e os dois RL1 são tomados em conjunto com os dois átomos de carbono aos quais eles são ligados para formar um anel arila, C3-C10 carbocíclico, heteroarila ou heterocíclico opcionalmente substituído.
[00399] Em algumas modalidades, L tem a estrutura de: , em que: G é –O–, –S–, ou –NR'; é uma ligação simples ou dupla; e os dois RL1 são tomados em conjunto com os dois átomos de carbono aos quais eles são ligados para formar um anel arila, C3-C10 carbocíclico, heteroarila ou heterocíclico opcionalmente substituído.
[00400] Em algumas modalidades, E é –O–, –S–, –NR'– ou –C(R')2–, em que cada R' independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento. Em algumas modalidades, E é –O–, –S–, ou –NR'–. Em algumas modalidades, E é –O–, –S–, ou –NH–. Em algumas modalidades, E é –O–. Em algumas modalidades, E é –S–. Em algumas modalidades, E é – NH–.
[00401] Em algumas modalidades, G é –O–, –S–, ou –NR', em que cada R' independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento. Em algumas modalidades, G é –O–, –S–, ou –NH–. Em algumas modalidades, G é –O–. Em algumas modalidades, G é –S–. Em algumas modalidades, G é – NH–.
[00402] Em algumas modalidades, L é –L3–G–, em que: L3 é um C1–C5 alquileno opcionalmente substituído ou alquenileno, em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por –O–, –S–,–N(R')–, –C(O)–, –C(S)–, –C(NR')–, –S(O)–, –S(O)2–, ou ; e em que cada dentre G, R' e Anel Cy' é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento.
[00403] Em algumas modalidades, L é –L3–S–, em que L3 é conforme definido acima e descrito no presente documento. Em algumas modalidades, L é –L3–O–, em que L3 é conforme definido acima e descrito no presente documento. Em algumas modalidades, L é –L3–N(R')–, em que cada um dentre L3 e R' é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento. Em algumas modalidades, L é –L3–NH–, em que cada dentre L3 e R' é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento.
[00404] Em algumas modalidades, L3 é um C5 alquileno opcionalmente substituído ou alquenileno, em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por –O–, –S–,–N(R′)–, –C(O)–, –C(S)–, –C(NR′)–, – S(O)–, –S(O)2–, ou , e cada um dentre R' e Anel Cy' é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento. Em algumas modalidades, L3 é um C5 alquileno opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, –L3–G– é .
[00405] Em algumas modalidades, L3 é um C4 alquileno opcionalmente substituído ou alquenileno, em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por –O–, –S–,–N(R′)–, –C(O)–, –C(S)–, –C(NR′)–, – S(O)–, –S(O)2–, ou , e cada um dentre R' e Cy' é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento.
[00406] Em algumas modalidades, –L3–G– é
, , , , , , ou .
[00407] Em algumas modalidades, L3 é um C3 alquileno opcionalmente substituído ou alquenileno, em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por –O–, –S–,–N(R′)–, –C(O)–, –C(S)–, –C(NR′)–, – S(O)–, –S(O)2–, ou , e cada um dentre R' e Cy' é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento.
[00408] Em algumas modalidades, –L3–G– é , , , , , ou .
[00409] Em algumas modalidades, L é . Em algumas modalidades, L é ou . Em algumas modalidades, L é ou .
[00410] Em algumas modalidades, L3 é um C2 alquileno opcionalmente substituído ou alquenileno, em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por –O–, –S–,–N(R′)–, –C(O)–, –C(S)–, –C(NR′)–, – S(O)–, –S(O)2–, ou , e cada um dentre R' e Cy' é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento.
[00411] Em algumas modalidades, –L3–G– é , em que cada um dentre G e Cy' é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento. Em algumas modalidades, L é .
[00412] Em algumas modalidades, L é –L4–G–, em que L4 é um C1–C2 alquileno opcionalmente substituído; e G é conforme definido acima e descrito no presente documento. Em algumas modalidades, L é –L4–G–, em que L4 é um C1–C2 alquileno opcionalmente substituído; G é conforme definido acima e descrito no presente documento; e G é conectado a R1. Em algumas modalidades, L é –L4–G–, em que L4 é um metileno opcionalmente substituído; G é conforme definido acima e descrito no presente documento; e G é conectado a R1. Em algumas modalidades, L é – L4–G–, em que L4 é metileno; G é conforme definido acima e descrito no presente documento; e G é conectado a R1. Em algumas modalidades, L é –L4–G–, em que L4 é um –(CH2)2– opcionalmente substituído; G é conforme definido acima e descrito no presente documento; e G é conectado a R1. Em algumas modalidades, L é – L4–G–, em que L4 é –(CH2)2–; G é conforme definido acima e descrito no presente documento; e G é conectado a R1.
[00413] Em algumas modalidades, L é , ou , em que G é conforme definido acima e descrito no presente documento, e G é conectado a R1. Em algumas modalidades, L é , em que G é conforme definido acima e descrito no presente documento, e G é conectado a R1. Em algumas modalidades, L é , em que G é conforme definido acima e descrito no presente documento, e G é conectado a R1. Em algumas modalidades, L é , ou , em que o átomo de enxofre é conectado a R1. Em algumas modalidades, L é , ou , em que o átomo de oxigênio é conectado a R1.
[00414] Em algumas modalidades, L é , , ou , em que G é conforme definido acima e descrito no presente documento.
[00415] Em algumas modalidades, L é –S–RL3– ou –S–C(O)–RL3–, em que RL3 é um C1–C9 alquileno linear ou ramificado opcionalmente substituído, em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por um C1–C6 alquileno opcionalmente substituído, C1–C6 alquenileno, , –C(R′)2–, –Cy–, –O–, –S–, –S–S–, – N(R′)–, –C(O)–, –C(S)–, –C(NR′)–, –C(O)N(R′)–, –N(R′)C(O)N(R′)-, –N(R′)C(O)–, –N(R′)C(O)O–, –OC(O)N(R′)-, –S(O)–, –S(O)2–, –
S(O)2N(R′)–, –N(R′)S(O)2–, –SC(O)–, –C(O)S–, –OC(O)–, ou –C(O)O–, em que cada um dentre R' e –Cy– é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento. Em algumas modalidades, L é –S–RL3– ou –S–C(O)–RL3–, em que RL3 é um C1–C6 alquileno opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, L é –S–RL3– ou –S–C(O)–RL3–, em que RL3 é um C1–C6 alquenileno opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, L é –S–RL3– ou –S–C(O)–RL3–, em que RL3 é um C1-C6 alquileno opcionalmente substituído em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por um C1–C6 alquenileno opcionalmente substituído, arileno, ou heteroarileno. Em algumas modalidades, Em algumas modalidades, RL3 é um –S–(C1–C6 alquenileno)– opcionalmente substituído, –S– (C1–C6 alquileno)–, –S–(C1–C6 alquileno)–arileno–(C1–C6 alquileno)–, –S–CO–arileno–(C1–C6 alquileno)–, ou –S–CO–(C1–C6 alquileno)–arileno–(C1–C6 alquileno)–.
[00416] Em algumas modalidades, L é , , , , , , , , ou .
[00417] Em algumas modalidades, L é . Em algumas modalidades, L é . Em algumas modalidades, .
[00418] Em algumas modalidades, o átomo de enxofre nas modalidades de L descritas acima e no presente documento é conectado a X. Em algumas modalidades, o átomo de enxofre nas modalidades de L descritas acima e no presente documento é conectado a R1.
[00419] Em algumas modalidades, R1 é halogênio, R, ou um C1–C50 alifático opcionalmente substituído em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por um C1–C6 alquileno opcionalmente substituído, C1–C6 alquenileno, , –C(R′)2–, –Cy–, –O–, –S–, –S–S–, –N(R′)–, –C(O)–, –C(S)–, –C(NR′)–, – C(O)N(R′)–, –N(R′)C(O)N(R′)-, –N(R′)C(O)–, –N(R′)C(O)O–, – OC(O)N(R′)-, –S(O)–, –S(O)2–, –S(O)2N(R′)–, –N(R′)S(O)2–, –SC(O)–, –C(O)S–, –OC(O)–, ou –C(O)O–, em que cada variável é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento. Em algumas modalidades, R1 é halogênio, R, ou um C1–C10 alifático opcionalmente substituído em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por um C1–C6 alquileno opcionalmente substituído, C1–C6 alquenileno, , –C(R′)2–, –Cy–, –O–, –S–, –S–S–, – N(R′)–, –C(O)–, –C(S)–, –C(NR′)–, –C(O)N(R′)–, –N(R′)C(O)N(R′)-, –N(R′)C(O)–, –N(R′)C(O)O–, –OC(O)N(R′)-, –S(O)–, –S(O)2–, – S(O)2N(R′)–, –N(R′)S(O)2–, –SC(O)–, –C(O)S–, –OC(O)–, ou –C(O)O–, em que cada variável é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento.
[00420] Em algumas modalidades, R1 é hidrogênio. Em algumas modalidades, R1 é halogênio. Em algumas modalidades, R1 é –F. Em algumas modalidades, R1 é –Cl. Em algumas modalidades, R1 é –Br. Em algumas modalidades, R1 é – I.
[00421] Em algumas modalidades, R1 é R em que R é conforme definido acima e descrito no presente documento.
[00422] Em algumas modalidades, R1 é hidrogênio. Em algumas modalidades, R1 é um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre C1–C50 alifático, fenila, carbociclila, arila, heteroarila ou heterociclila.
[00423] Em algumas modalidades, R1 é um C1–C50 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, R1 é um C1–C10 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, R1 é um C1–C6 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, R1 é um C1–C6 alquila opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, R1 é hexila opcionalmente substituída, linear ou ramificada. Em algumas modalidades, R1 é pentila opcionalmente substituída, linear ou ramificada. Em algumas modalidades, R1 é butila opcionalmente substituída, linear ou ramificada. Em algumas modalidades, R1 é propila opcionalmente substituída, linear ou ramificada. Em algumas modalidades, R1 é etila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R1 é metila opcionalmente substituída.
[00424] Em algumas modalidades, R1 é fenila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R1 é fenila substituída. Em algumas modalidades, R1 é fenila.
[00425] Em algumas modalidades, R1 é carbociclila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R1 é C3-C10 carbociclila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R1 é carbociclila monocíclica opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R1 é ciclo-heptila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R1 é ciclo-hexila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R1 é ciclopentila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R1 é ciclobutila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R1 é uma ciclopropila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R1 é carbociclila bicíclica opcionalmente substituída.
[00426] Em algumas modalidades, R1 é um hidrocarboneto C1–C50 policíclico opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, R1 é um hidrocarboneto C1–C50 policíclico opcionalmente substituído em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por um C1–C6 alquileno opcionalmente substituído, C1–C6 alquenileno, , –C(R′)2–, –Cy–, –O–, –S–, –S–S–, –N(R′)–, –C(O)–, – C(S)–, –C(NR′)–, –C(O)N(R′)–, –N(R′)C(O)N(R′)-, –N(R′)C(O)–, – N(R′)C(O)O–, –OC(O)N(R′)-, –S(O)–, –S(O)2–, –S(O)2N(R′)–, – N(R′)S(O)2–, –SC(O)–, –C(O)S–, –OC(O)–, ou –C(O)O–, em que cada variável é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento. Em algumas modalidades, R1 é opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, R1 é . Em algumas modalidades, R1 é opcionalmente substituído.
[00427] Em algumas modalidades, R1 é um C1–C50 alifático opcionalmente substituído que compreende uma ou mais porções químicas de hidrocarboneto policíclico opcionalmente substituídas. Em algumas modalidades, R1 é um C1–C50 alifático opcionalmente substituído que compreende uma ou mais porções químicas de hidrocarboneto policíclico opcionalmente substituídas, em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por um C1–C6 alquileno opcionalmente substituído, C1–C6 alquenileno, , –C(R′)2–, –Cy–, –O–, –S–, –S–S–, –N(R′)–, –C(O)–, – C(S)–, –C(NR′)–, –C(O)N(R′)–, –N(R′)C(O)N(R′)-, –N(R′)C(O)–, – N(R′)C(O)O–, –OC(O)N(R′)-, –S(O)–, –S(O)2–, –S(O)2N(R′)–, – N(R′)S(O)2–, –SC(O)–, –C(O)S–, –OC(O)–, ou –C(O)O–, em que cada variável é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento.
Em algumas modalidades, R1 é um C1–C50 alifático opcionalmente substituído que compreende um ou mais , , , ou opcionalmente substituídos.
Em algumas modalidades, R1 é . Em algumas modalidades, R1 é . Em algumas modalidades, R1 é
. Em algumas modalidades, R1 é . Em algumas modalidades, R1 é .
[00428] Em algumas modalidades, R1 é uma arila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R1 é um anel arila bicíclico opcionalmente substituído.
[00429] Em algumas modalidades, R1 é uma heteroarila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R1 é um anel heteroarila monocíclico com 5 a 6 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 3 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, enxofre ou oxigênio. Em algumas modalidades, R1 é um anel heteroarila monocíclico com 5 a 6 membros substituído tendo 1 a 3 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio ou enxofre. Em algumas modalidades, R1 é um anel heteroarila monocíclico com 5 a 6 membros não substituído tendo 1 a 3 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, enxofre ou oxigênio.
[00430] Em algumas modalidades, R1 é um anel heteroarila monocíclico com 5 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 3 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio ou enxofre. Em algumas modalidades, R1 é um anel heteroarila monocíclico com 6 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 3 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio ou enxofre.
[00431] Em algumas modalidades, R1 é um anel heteroarila monocíclico com 5 membros opcionalmente substituído tendo 1 heteroátomo selecionado dentre nitrogênio, oxigênio ou enxofre. Em algumas modalidades, R1 é selecionado dentre pirrolila, furanila ou tienila.
[00432] Em algumas modalidades, R1 é um anel heteroarila com 5 membros opcionalmente substituído tendo 2 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio ou enxofre. Em determinadas modalidades, R1 é um anel heteroarila com 5 membros opcionalmente substituído tendo 1 átomo de nitrogênio, e um heteroátomo adicional selecionado dentre enxofre ou oxigênio. Os grupos R1 exemplificativos incluem pirazolila, imidazolila, tiazolila, isotiazolila, oxazolila ou isoxazolila opcionalmente substituída.
[00433] Em algumas modalidades, R1 é um anel heteroarila com 6 membros tendo 1 a 3 átomos de nitrogênio. Em outras modalidades, R1 é um anel heteroarila com 6 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 2 átomos de nitrogênio. Em algumas modalidades, R1 é um anel heteroarila com 6 membros opcionalmente substituído tendo 2 átomos de nitrogênio. Em determinadas modalidades, R1 é um anel heteroarila com 6 membros opcionalmente substituído tendo 1 nitrogênio. Os grupos R1 exemplificativos incluem piridinila, pirimidinila, pirazinila, piridazinila, triazinila ou tetrazinila opcionalmente substituída.
[00434] Em determinadas modalidades, R1 é um anel heteroarila bicíclico com 8 a 10 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 4 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio ou enxofre. Em algumas modalidades, R1 é um anel heteroarila fundido com 5,6 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 4 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio ou enxofre. Em outras modalidades, R1 é um anel heteroarila fundido com 5,6 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 2 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio ou enxofre. Em determinadas modalidades, R1 é um anel heteroarila fundido com 5,6 membros opcionalmente substituído tendo 1 heteroátomo independentemente selecionado dentre nitrogênio, oxigênio ou enxofre. Em algumas modalidades, R1 é uma indolila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R1 é um azabiciclo[3.2.1]octanila opcionalmente substituído. Em determinadas modalidades, R1 é um anel heteroarila fundido com 5,6 membros opcionalmente substituído tendo 2 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio ou enxofre. Em algumas modalidades, R1 é uma azaindolila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R1 é uma benzimidazolila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R1 é uma benzotiazolila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R1 é uma benzoxazolila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R1 é uma indazolila opcionalmente substituída. Em determinadas modalidades, R1 é um anel heteroarila fundido com 5,6 membros opcionalmente substituído tendo 3 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio ou enxofre.
[00435] Em determinadas modalidades, R1 é um anel heteroarila fundido com 6,6 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 4 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio ou enxofre. Em algumas modalidades, R1 é um anel heteroarila fundido com 6,6 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 2 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio ou enxofre. Em outras modalidades, R1 é um anel heteroarila fundido com 6,6 membros opcionalmente substituído tendo 1 heteroátomo independentemente selecionado dentre nitrogênio, oxigênio ou enxofre. Em algumas modalidades, R1 é uma quinolinila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R1 é uma isoquinolinila opcionalmente substituída. De acordo com um aspecto, R1 é um anel heteroarila fundido com 6,6 membros opcionalmente substituído tendo 2 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio ou enxofre. Em algumas modalidades, R1 é uma quinazolina ou uma quinoxalina.
[00436] Em algumas modalidades, R1 é uma heterociclila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R1 é um anel heterocíclico saturado ou parcialmente insaturado com 3 a 7 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 2 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio ou enxofre. Em algumas modalidades, R1 é um anel heterocíclico saturado ou parcialmente insaturado com 3 a 7 membros substituído tendo 1 a 2 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio ou enxofre. Em algumas modalidades, R1 é um anel heterocíclico saturado ou parcialmente insaturado com 3 a 7 membros não substituído tendo 1 a 2 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio ou enxofre.
[00437] Em algumas modalidades, R1 é uma heterociclila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R1 é um anel heterocíclico saturado ou parcialmente insaturado com 6 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 2 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio ou enxofre. Em algumas modalidades, R1 é um anel heterocíclico parcialmente insaturado com 6 membros opcionalmente substituído tendo 2 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio ou enxofre. Em algumas modalidades, R1 é um anel heterocíclico parcialmente insaturado com 6 membros opcionalmente substituído tendo 2 átomos de oxigênio.
[00438] Em determinadas modalidades, R1 é um anel heterocíclico saturado ou parcialmente insaturado com 3 a 7 membros tendo 1 a 2 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio ou enxofre. Em determinadas modalidades, R1 é oxiranila, oxetanila, tetra- hidrofuranila, tetra-hidropiranila, oxepaneila, aziridineila, azetidineila, pirrolidinila, piperidinila, azepanila, tiiranila, tietanila, tetra-hidrotiofenila, tetra- hidrotiopiranila, tiepanila, dioxolanila, oxatiolanila, oxazolidinila, imidazolidinila, tiazolidinila, ditiolanila, dioxanila, morfolinila, oxatianila, piperazinila, tiomorfolinila, ditianila, dioxepanila, oxazepanila, oxatiepanila, ditiepanila, diazepanila, di-hidrofuranonila, tetra-hidropiranonila, oxepanonila, pirolidinonila, piperidinonila, azepanonila, di-hidrotiofenonila, tetra- hidrotiopiranonila, tiepanonila, oxazolidinonila, oxazinanonila, oxazopanonila, dioxolanonila, dioxanonila, dioxepanonila, oxatiolinonila, oxatianonila, oxatiepanonila, tiazolidinonila, tiazinanonila, tiazepanonila,
imidazolidinonila, tetra-hidropirimidinonila, diazepanonila, imidazolidinadionila, oxazolidinadionila, tiazolidinadionila, dioxolanodionil, oxatiolanodionila, piperazinadionila, morfolinadionila, tiomorfolinadionila, tetra-hidropiranila, tetra-hidrofuranila, morfolinila, tiomorfolinila, piperidinila, piperazinila, pirrolidinila, tetra- hidrotiofenila ou tetra-hidrotiopiranila. Em algumas modalidades, R1 é um anel heterocíclico saturado ou parcialmente insaturado com 5 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 2 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio ou enxofre.
[00439] Em determinadas modalidades, R1 é um anel monocíclico parcialmente insaturado com 5 a 6 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 2 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio ou enxofre. Em determinadas modalidades, R1 é um grupo tetra- hidropiridinila, di-hidrotiazolila, di-hidrooxazolila ou oxazolinila opcionalmente substituído.
[00440] Em algumas modalidades, R1 é um anel heterocíclico bicíclico saturado ou parcialmente insaturado com 8 a 10 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 4 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio ou enxofre. Em algumas modalidades, R1 é uma indolinila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R1 é uma isoindolinila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R1 é uma 1, 2, 3, 4-tetra-hidroquinolina opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R1 é uma 1, 2, 3, 4-tetra-hidroisoquinolina opcionalmente substituída.
[00441] Em algumas modalidades, R1 é um C1–C10 alifático opcionalmente substituído em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por um C1–C6 alquileno opcionalmente substituído, C1–C6 alquenileno, , –C(R′)2–, –Cy–, –O–, –S–, –S–S–, –N(R′)–, –C(O)–, – C(S)–, –C(NR′)–, –C(O)N(R′)–, –N(R′)C(O)N(R′)-, –N(R′)C(O)–, – N(R′)C(O)O–, –OC(O)N(R′)-, –S(O)–, –S(O)2–, –S(O)2N(R′)–, – N(R′)S(O)2–, –SC(O)–, –C(O)S–, –OC(O)–, ou –C(O)O–, em que cada variável é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento. Em algumas modalidades, R1 é um C1–C10 alifático opcionalmente substituído em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por um –Cy–, –O–, –S–, –S–S–, –N(R′)–, –C(O)–, – C(S)–, –C(NR′)–, –C(O)N(R′)–, –N(R′)C(O)N(R′)-, –N(R′)C(O)–, – N(R′)C(O)O–, –OC(O)N(R′)-, –S(O)–, –S(O)2–, –S(O)2N(R′)–, – N(R′)S(O)2–, –OC(O)–, ou –C(O)O–, em que cada R' é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento. Em algumas modalidades, R1 é um C1–C10 alifático opcionalmente substituído em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por um –Cy–, –O–, –S–, –S–S–, –N(R′)–, –C(O)–, –OC(O)–, ou –C(O)O–, em que cada R' é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento.
[00442] Em algumas modalidades, R1 é , , , ,
, , , ,
, (GalNAc), , ,
, , , ,
, , , ,
, , ,
, ,
, , , ,
, , ,
, , ,
, , , , CH3–, , , , , , , , ou .
[00443] Em algumas modalidades, R1 é CH3–, , , , , , ou .
[00444] Em algumas modalidades, R1 compreende uma porção química –(CH2)2– terminal opcionalmente substituída que é conectada a L. Exemplos de tais grupos R1 são mostrados abaixo: , , , , , , e .
[00445] Em algumas modalidades, R1 compreende uma porção química –(CH2)– terminal opcionalmente substituída que é conectada a L. Exemplos de tais grupos R1 são mostrados abaixo: , ,
, , , , , , , e .
[00446] Em algumas modalidades, R1 é –S–RL2, em que RL2 é um C1–C9 alifático opcionalmente substituído em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por um C1–C6 alquileno opcionalmente substituído, C1–C6 alquenileno, , –C(R')2–, –Cy–, –O–, –S–, –S–S–, –N(R′)–, –C(O)–, –C(S)–, –C(NR′)–, – C(O)N(R′)–, –N(R′)C(O)N(R′)-, –N(R′)C(O)–, –N(R′)C(O)O–, – OC(O)N(R′)-, –S(O)–, –S(O)2–, –S(O)2N(R′)–, –N(R′)S(O)2–, –SC(O)–, –C(O)S–, –OC(O)–, ou –C(O)O–, e cada um dentre R' e –Cy– é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento. Em algumas modalidades, R1 é –S–RL2, em que o átomo de enxofre é conectado ao átomo de enxofre no grupo L.
[00447] Em algumas modalidades, R1 é –C(O)– RL2, em que RL2 é um C1–C9 alifático opcionalmente substituído em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por um C1–C6 alquileno opcionalmente substituído, C1–C6 alquenileno, , –C(R')2–, –Cy–, –O–, –S–, –S–S–, –N(R′)–, –C(O)–, –C(S)–, –C(NR′)–, – C(O)N(R′)–, –N(R′)C(O)N(R′)-, –N(R′)C(O)–, –N(R′)C(O)O–, – OC(O)N(R′)-, –S(O)–, –S(O)2–, –S(O)2N(R′)–, –N(R′)S(O)2–, –SC(O)–, –C(O)S–, –OC(O)–, ou –C(O)O–, e cada um dentre R' e –Cy– é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento. Em algumas modalidades, R1 é –C(O)–RL2, em que o grupo carbonila é conectado a G no grupo L. Em algumas modalidades, R1 é –C(O)–RL2, em que o grupo carbonila é conectado ao átomo de enxofre no grupo L.
[00448] Em algumas modalidades, RL2 é C1–C9 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, RL2 é C1–C9 alquila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, RL2 é C1–C9 alquenila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, RL2 é C1–C9 alquinila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, RL2 é um C1–C9 alifático opcionalmente substituído em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por – Cy– ou –C(O)–. Em algumas modalidades, RL2 é um C1–C9 alifático opcionalmente substituído em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por – Cy–. Em algumas modalidades, RL2 é um C1–C9 alifático opcionalmente substituído em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por um heterociclileno opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, RL2 é um C1–C9 alifático opcionalmente substituído em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por um arileno opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, RL2 é um C1–C9 alifático opcionalmente substituído em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por um heteroarileno opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, RL2 é um C1–C9 alifático opcionalmente substituído em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por um C3-C10 carbociclileno opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, RL2 é um C1– C9 alifático opcionalmente substituído em que duas unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por –
Cy– ou –C(O)–. Em algumas modalidades, RL2 é um C1–C9 alifático opcionalmente substituído em que duas unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por –Cy– ou –C(O)–. OS grupos RL2 exemplificativos são mostrados abaixo: , , , , , e . ,
[00449] Em algumas modalidades, R1 é hidrogênio, ou um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre , , , , , , , –S–(C1–C10 alifático), C1–C10 alifático, arila, C1–C6 heteroalquila, heteroarila e heterociclila. Em algumas modalidades, R1 é , , , , , , , ou –S–(C1–C10 alifático). Em algumas modalidades, R1 é , , , , ,
ou .
[00450] Em algumas modalidades, R1 é um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre –S–(C1-C6 alifático), C1-C10 alifático, C1-C6 heteroalifático, arila, heterociclila e heteroarila.
[00451] Em algumas modalidades, R1 é , , , , , , , , , , , ou .
[00452] Em algumas modalidades, o átomo de enxofre nas modalidades de R1 descritas acima e no presente documento é conectado ao átomo de enxofre, G, E, ou porção química –C(O)– nas modalidades de L descritas acima e no presente documento. Em algumas modalidades, a porção química –C(O)– nas modalidades de R1 descritas acima e no presente documento é conectada ao átomo de enxofre, G, E, ou porção química –C(O)– nas modalidades de L descritas acima e no presente documento.
[00453] Em algumas modalidades, –L–R1 é qualquer combinação das modalidades de L e modalidades de R1 descritas acima e no presente documento.
[00454] Em algumas modalidades, –L–R1 é –L3– G–R1 em que cada variável é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento.
[00455] Em algumas modalidades, –L–R1 é –L4– G–R1 em que cada variável é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento.
[00456] Em algumas modalidades, –L–R1 é –L3– G–S–RL2, em que cada variável é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento.
[00457] Em algumas modalidades, –L–R1 é –L3– G–C(O)–RL2, em que cada variável é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento.
[00458] Em algumas modalidades, –L–R1 é , , , ou , em que RL2 é um C1–C9 alifático opcionalmente substituído em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por um C1–C6 alquileno opcionalmente substituído, C1–C6 alquenileno, , –C(R')2–, –Cy–, –O–, –S–, –S–S–, – N(R′)–, –C(O)–, –C(S)–, –C(NR′)–, –C(O)N(R′)–, –N(R′)C(O)N(R′)-, –N(R′)C(O)–, –N(R′)C(O)O–, –OC(O)N(R′)-, –S(O)–, –S(O)2–, – S(O)2N(R′)–, –N(R′)S(O)2–, –SC(O)–, –C(O)S–, –OC(O)–, ou –C(O)O–, e cada G é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento.
[00459] Em algumas modalidades, –L–R1 é –RL3– S–S–RL2, em que cada variável é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento. Em algumas modalidades, –L–R1 é –RL3–C(O)–S–S–RL2, em que cada variável é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento.
[00460] Em algumas modalidades, –L–R1 tem a estrutura de: , em que cada variável é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento.
[00461] Em algumas modalidades, –L–R1 tem a estrutura de: , em que cada variável é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento.
[00462] Em algumas modalidades, –L–R1 tem a estrutura de: , em que cada variável é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento.
[00463] Em algumas modalidades, –L–R1 tem a estrutura de: ,
em que cada variável é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento.
[00464] Em algumas modalidades, –L–R1 tem a estrutura de: , em que cada variável é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento.
[00465] Em algumas modalidades, –L–R1 tem a estrutura de: , em que cada variável é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento.
[00466] Em algumas modalidades, –L–R1 tem a estrutura de: , em que cada variável é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento.
[00467] Em algumas modalidades, –L–R1 tem a estrutura de:
, em que cada variável é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento.
[00468] Em algumas modalidades, –L–R1 tem a estrutura de: , em que cada variável é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento.
[00469] Em algumas modalidades, –L–R1 tem a estrutura de: , em que cada variável é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento.
[00470] Em algumas modalidades, –L–R1 tem a estrutura de: , em que cada variável é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento.
[00471] Em algumas modalidades, –L–R1 tem a estrutura de: , em que cada variável é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento.
[00472] Em algumas modalidades, –L–R1 tem a estrutura de: , em que cada variável é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento.
[00473] Em algumas modalidades, –L–R1 tem a estrutura de: , em que cada variável é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento.
[00474] Em algumas modalidades, –L–R1 tem a estrutura de: , em que cada variável é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento.
[00475] Em algumas modalidades, –L–R1 tem a estrutura de: , em que cada variável é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento.
[00476] Em algumas modalidades, –L–R1 tem a estrutura de: , em que cada variável é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento.
[00477] Em algumas modalidades, –L–R1 tem a estrutura de: , em que cada variável é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento.
[00478] Em algumas modalidades, –L–R1 tem a estrutura de: ,
em que cada variável é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento.
[00479] Em algumas modalidades, –L–R1 tem a estrutura de: , em que cada variável é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento.
[00480] Em algumas modalidades, –L–R1 tem a estrutura de: , em que cada variável é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento.
[00481] Em algumas modalidades, L tem a estrutura de: , em que cada variável é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento.
[00482] Em algumas modalidades, –X–L–R1 tem a estrutura de:
em que: o anel fenila é opcionalmente substituído, e cada um dentre R1 e X é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento.
[00483] Em algumas modalidades, –L–R1 é , , , , , , , , , (GalNAc), , , , , , , , , , , , , ,
, , , , , , , , , , , , , , , , CH3–, , , , , , , , ou .
[00484] Em algumas modalidades, –L–R1 é: , , ou .
[00485] Em algumas modalidades, –L–R1 é CH3–, , , , ,
, ou . Em algumas modalidades, –L– R1 é , , , , , ou .
[00486] Em algumas modalidades, –L–R1 compreende uma porção química –(CH2)2– terminal opcionalmente substituída que é conectada a X. Em algumas modalidades, –L– R1 compreende uma porção química –(CH2)2– terminal que é conectada a X. Exemplos de tais porções químicas –L–R1 são mostrados abaixo: , , , , , , e .
[00487] Em algumas modalidades, –L–R1 compreende uma porção química –(CH2)– terminal opcionalmente substituída que é conectada a X. Em algumas modalidades, –L– R1 compreende uma porção química –(CH2)– terminal que é conectada a X. Exemplos de tais porções químicas –L–R1 são mostrados abaixo: , ,
, , , , , , , e .
[00488] Em algumas modalidades, –L–R1 é , , ou .
[00489] Em algumas modalidades, –L–R1 é CH3–, , , , , , ,ou ; e X é –S–.
[00490] Em algumas modalidades, –L–R1 é CH3–, , , , ,
, ou , X é –S–, W é O, Y é –O–, e Z é –O–.
[00491] Em algumas modalidades, R1 é , , , , , , , ou –S–(C1–C10 alifático).
[00492] Em algumas modalidades, R1 é , , , , , ou .
[00493] Em algumas modalidades, X é –O– ou – S–, e R1 é , , , , , , , ou –S–(C1–C10 alifático).
[00494] Em algumas modalidades, X é –O– ou – S–, e R1 é , , , , , , , ,
, , , , –S–(C1–C10 alifático) ou –S–(C1–C50 alifático).
[00495] Em algumas modalidades, L é uma ligação covalente e –L–R1 é R1.
[00496] Em algumas modalidades, –L–R1 não é hidrogênio.
[00497] Em algumas modalidades, –X–L–R1 é R1 é , , , , , , , , , , ,
, –S–(C1–C10 alifático) ou –S–(C1–C50 alifático).
[00498] Em algumas modalidades, –X–L–R1 tem a estrutura de , em que a porção química é opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, –X–L–R1 é . Em algumas modalidades, –X–L–R1 é .
Em algumas modalidades, –X–L–R1 é . Em algumas modalidades, –X–L–R1 tem a estrutura de , em que X' é O ou S, Y' é –O–, –S– ou –NR'–, e a porção química é opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, Y' é –O–, –S– ou –NH–. Em algumas modalidades, é . Em algumas modalidades, é . Em algumas modalidades, é
. Em algumas modalidades, –X–L–R1 tem a estrutura de , em que X' é O ou S, e a porção química é opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, é . Em algumas modalidades, –X– L–R1 é , em que o é opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, –X–L–R1 é , em que o é substituído. Em algumas modalidades, –X– L–R1 é , em que o é não substituído.
[00499] Em algumas modalidades, –X–L–R1 é R1– C(O)–S–Lx–S–, em que Lx é um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre , , , , e . Em algumas modalidades, Lx é , , , , e . Em algumas modalidades, –X– L–R1 é (CH3)3C–S–S–Lx–S–. Em algumas modalidades, –X–L–R1 é R1– C(=X')–Y'–C(R)2–S–Lx–S–. Em algumas modalidades, –X–L–R1 é R– C(=X')–Y'–CH2–S–Lx–S–. Em algumas modalidades, –X–L–R1 é
.
[00500] Conforme será observado por uma pessoa versada na técnica, muitos dos grupos –X–L–R1 descritos no presente documento são cliváveis e podem ser convertidos em –X– após a administração a um indivíduo. Em algumas modalidades, –X–L–R1 é clivável. Em algumas modalidades, –X–L–R1 é –S–L–R1, e é convertido em –S– após a administração a um indivíduo. Em algumas modalidades, a conversão é promovida por uma enzima de um indivíduo. Conforme observado por uma pessoa versada na técnica, os métodos para determinar se o grupo –S–L–R1 é convertido em –S– após a administração são amplamente conhecidos e praticados na técnica, inclusive aqueles usados para estudar o metabolismo e a farmacocinética do fármaco.
[00501] Em algumas modalidades, a ligação internucleotídica que tem a estrutura da fórmula I é , , , , , , , ou .
[00502] Em algumas modalidades, a ligação internucleotídica da fórmula I tem a estrutura da fórmula I-
a: (I-a) em que cada variável é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento.
[00503] Em algumas modalidades, a ligação internucleotídica da fórmula I tem a estrutura da fórmula I- b: (I-b) em que cada variável é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento.
[00504] Em algumas modalidades, a ligação internucleotídica da fórmula I é uma ligação fosforotioato triéster que tem a estrutura da fórmula I-c: (I-c) em que R1 não é –H quando L é uma ligação covalente.
[00505] Em algumas modalidades, a ligação internucleotídica que tem a estrutura da fórmula I é , , , , ,
, , , , , , , , , ou .
[00506] Em algumas modalidades, a ligação internucleotídica que tem a estrutura da fórmula I-c é , , , , , , , , , , ,
, , ou .
[00507] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece um oligonucleotídeo quiralmente controlado que compreende uma ou mais ligações fosfato naturais, e uma ou mais ligações internucleotídicas modificadas que têm a fórmula de I-a, I-b, ou I-c.
[00508] Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica modificada tem a estrutura de I. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica modificada tem a estrutura de I-a. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica modificada tem a estrutura de I-b. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica modificada tem a estrutura de I-c.
[00509] Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica modificada é a ligação internucleotídica fosforotioato. Exemplos de ligações internucleotídicas que têm a estrutura da fórmula I que podem ser utilizadas de acordo com a presente revelação incluem aqueles descritos nos documentos US 9394333, US 9744183, US 9605019, US 20130178612, US 20150211006, US 9598458, US 20170037399, WO 2017/015555, WO 2017/062862, as ligações internucleotídicas de cada um dos quais é incorporada ao presente documento a título de referência.
[00510] Os exemplos não limitantes das ligações internucleotídicas que podem ser utilizadas de acordo com a presente revelação também incluem aqueles descritos na técnica, incluindo, porém sem limitação, aqueles descritos em qualquer um dentre: Gryaznov, S.; Chen, J.-K. J. Am. Chem.
Soc. 1994, 116, 3143, Jones et al. J. Org. Chem. 1993, 58, 2983, Koshkin et al. 1998 Tetrahedron 54: 3607-3630, Lauritsen et al. 2002 Chem. Comm. 5 530-531, Lauritsen et al. 2003 Bioo. Med. Chem. Lett. 13: 253-256, Mesmaeker et al. Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 1994, 33, 226, Petersen et al. 2003 TRENDS Biotech. 21: 74-81; Ballas et al. 1996) Nucleic Acids Res. 24: 2966, Ts'o et al. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1988, 507, 220, e Vasseur et al. J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 4006.
[00511] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos compreendem uma ou mais, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais ligações internucleotídicas não negativamente carregadas. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada não é negativamente carregada pelo fato de que a um determinado pH em uma solução aquosa, menos que 50%, 40%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, ou 1% da ligação internucleotídica existe em uma forma de sal negativamente carregada. Em algumas modalidades, um pH é cerca de pH 7,4. Em algumas modalidades, um pH é cerca de 4 a
9. Em algumas modalidades, a porcentagem é inferior a 10%. Em algumas modalidades, a porcentagem é inferior a 5%. Em algumas modalidades, a porcentagem é inferior a 1%. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica é uma ligação internucleotídica não negativamente carregada pelo fato de que a forma neutra da ligação internucleotídica não tem pKa que não seja superior a cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, ou 7 em água. Em algumas modalidades, nenhum pKa é 7 ou menos. Em algumas modalidades, nenhum pKa é 6 ou menos. Em algumas modalidades, nenhum pKa é 5 ou menos. Em algumas modalidades, nenhum pKa é 4 ou menos. Em algumas modalidades, nenhum pKa é 3 ou menos.
Em algumas modalidades, nenhum pKa é 2 ou menos. Em algumas modalidades, nenhum pKa é 1 ou menos. Em algumas modalidades, a pKa da forma neutra de uma ligação internucleotídica pode ser representada pela pKa da forma neutra de um composto que tem a estrutura de CH3− a ligação internucleotídica −CH3. Por exemplo, a pKa da forma neutra de uma ligação internucleotídica que tem a estrutura da fórmula I pode ser representada pela pKa da forma neutra de um composto que tem a estrutura de , a pKa de pode ser representada pela pKa . Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada é uma ligação internucleotídica neutra. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada é uma ligação internucleotídica positivamente carregada. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada compreende uma porção química de guanidina. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada compreende uma porção química de base heteroarila. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada compreende uma porção química de triazol. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada compreende uma porção química de alquinila.
[00512] Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada, por exemplo, uma ligação internucleotídica neutra, compreende −PL(−N=)−, em que PL é conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada, por exemplo, uma ligação internucleotídica neutra, compreende −P(−N=)−. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada, por exemplo, uma ligação internucleotídica neutra, compreende −P(=)(−N=)−. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada, por exemplo, uma ligação internucleotídica neutra, compreende −P(=O)(−N=)−. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada, por exemplo, uma ligação internucleotídica neutra, compreende −P(=S)(−N=)−.
[00513] Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada, por exemplo, uma ligação internucleotídica neutra, compreende ,
PL
N N , , , , , , ou , em que PL é conforme descrito na presente revelação. Por exemplo, em algumas modalidades, PL é P; em algumas modalidades, PL é P(O); em algumas modalidades, PL é P(S); etc. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada, por exemplo, uma ligação internucleotídica neutra, compreende ,
, , , , , , ou .
[00514] Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura da fórmula I, I-a, I-b, I-c, I-n-1, I-n-2, I-n-3, I-n-4, II, II-a-1, II-a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, II-d- 2, ou uma forma de sal da mesma (não negativamente carregada). Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica, por exemplo, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada, tem a estrutura da fórmula I-n-1 ou uma forma de sal da mesma: . I-n-1
[00515] Em algumas modalidades, X é uma ligação covalente e −X−Cy−R1 é −Cy−R1. Em algumas modalidades, −Cy− é um grupo bivalente opcionalmente substituído selecionado dentre um anel heteroarila com 5 a 20 membros tendo 1 a 10 heteroátomos, e um anel heterociclila com 3 a 20 membros tendo 1 a 10 heteroátomos. Em algumas modalidades, −Cy− é um anel heteroarila bivalente opcionalmente substituído com 5 a 20 membros tendo 1 a 10 heteroátomos. Em algumas modalidades, −Cy−R1 é um anel heteroarila com 5 a 20 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 10 heteroátomos, em que pelo menos um heteroátomo é nitrogênio. Em algumas modalidades, −Cy−R1 é um anel heteroarila com 5 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 4 heteroátomos, em que pelo menos um heteroátomo é nitrogênio. Em algumas modalidades, −Cy−R1 é um anel heteroarila com 6 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 4 heteroátomos, em que pelo menos um heteroátomo é nitrogênio. Em algumas modalidades, −Cy−R1 é triazolila opcionalmente substituída.
[00516] Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica, por exemplo, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada, tem a estrutura da fórmula I-n-2 ou uma forma de sal da mesma: . I-n-2
[00517] Em algumas modalidades, R1 é R'. Em algumas modalidades, L é uma ligação covalente. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica, por exemplo, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada, tem a estrutura da fórmula I-n-3 ou uma forma de sal da mesma: . I-n-3
[00518] Em algumas modalidades, dois R' em átomos de nitrogênio diferentes são tomados em conjunto para formar um anel conforme descrito. Em algumas modalidades, um anel formado tem 5 membros. Em algumas modalidades, um anel formado tem 6 membros. Em algumas modalidades, um anel formado é substituído. Em algumas modalidades, os dois grupos R' que não são tomados em conjunto para formar um anel são, cada um, independentemente R. Em algumas modalidades, os dois grupos R' que não são tomados em conjunto para formar um anel são, cada um, independentemente hidrogênio ou um C1-6 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, os dois grupos R' que não são tomados em conjunto para formar um anel são, cada um, independentemente hidrogênio ou uma C1-6 alquila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, os dois grupos R' que não são tomados em conjunto para formar um anel são iguais. Em algumas modalidades, os dois grupos R' que não são tomados em conjunto para formar um anel são diferentes. Em algumas modalidades, ambos são −CH3.
[00519] Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica, por exemplo, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada, tem a estrutura da fórmula I-n-4 ou uma forma de sal da mesma: , I-n-4 em que cada um dentre La e Lb é independentemente L ou −N(R1)−, e cada outra variável é independentemente conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, L é uma ligação covalente, e uma ligação internucleotídica da fórmula I-n-4 tem a estrutura de:
, ou uma forma de sal da mesma, em que cada variável é independentemente conforme descrito na presente revelação.
[00520] Em algumas modalidades, La é −N(R1)−. Em algumas modalidades, La é L conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, La é uma ligação covalente. Em algumas modalidades, La é −N(R')−. Em algumas modalidades, La é −N(R)−. Em algumas modalidades, La é −O−. Em algumas modalidades, La é −S−. Em algumas modalidades, La é −S(O)−. Em algumas modalidades, La é −S(O)2−. Em algumas modalidades, La é −S(O)2N(R')−. Em algumas modalidades, Lb é −N(R1)−. Em algumas modalidades, Lb é L conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, Lb é uma ligação covalente. Em algumas modalidades, Lb é −N(R')−. Em algumas modalidades, Lb é −N(R)−. Em algumas modalidades, Lb é −O−. Em algumas modalidades, Lb é −S−. Em algumas modalidades, Lb é −S(O)−. Em algumas modalidades, Lb é −S(O)2−. Em algumas modalidades, Lb é −S(O)2N(R')−. Em algumas modalidades, La e Lb são iguais. Em algumas modalidades, La e Lb são diferentes. Em algumas modalidades, pelo menos um dentre La e Lb é −N(R1)−. Em algumas modalidades, pelo menos um dentre La e Lb é −O−. Em algumas modalidades, pelo menos um dentre La e Lb é −S−. Em algumas modalidades, pelo menos um dentre La e Lb é uma ligação covalente. Em algumas modalidades, conforme descrito no presente documento, R1 é R. Em algumas modalidades, R1 é −H. Em algumas modalidades, R1 é C1-10 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, R1 é C1-10 alquila opcionalmente substituída.
Em algumas modalidades, uma estrutura da fórmula I-n-4 é uma estrutura da fórmula I-n-2. Em algumas modalidades, uma estrutura da fórmula I-n-4 é uma estrutura da fórmula I-n-3. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada, por exemplo, uma ligação internucleotídica neutra, tem a estrutura da fórmula I.
Em algumas modalidades, X, por exemplo, na fórmula I, II, etc., é −N(−L−R5)−, em que R5 é R conforme descrito no presente documento.
Em algumas modalidades, X é −NH−. Em algumas modalidades, L, por exemplo, em −X−L− da fórmula I, II, etc., compreende −SO2−. Em algumas modalidades, L é −SO2−. Em algumas modalidades, L é uma ligação covalente.
Em algumas modalidades, L é −C(O)O−(C1-4 alquileno)− em que o alquileno é opcionalmente substituído.
Em algumas modalidades, L é – C(O)OCH2−. Em algumas modalidades, R1, por exemplo, na fórmula I, III, etc., compreende um anel opcionalmente substituído.
Em algumas modalidades, R1 é R conforme descrito no presente documento.
Em algumas modalidades, R1 é fenila opcionalmente substituída.
Em algumas modalidades, R1 é 4-metilfenila.
Em algumas modalidades, R1 é 4-metoxifenila.
Em algumas modalidades, R1 é 4-aminofenila.
Em algumas modalidades, R1 é um anel heteroalifático opcionalmente substituído.
Em algumas modalidades, R1 é um anel heteroalifático com 3 a 10 membros opcionalmente substituído (por exemplo, 3, 4, 5, 6, 7, ou 8). Em algumas modalidades, R1 é um anel heteroalifático monocíclico saturado com 5 ou 6 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 3 heteroátomos.
Em algumas modalidades, o anel tem 5 membros.
Em algumas modalidades, o anel tem 6 membros.
Em algumas modalidades, o número de heteroátomo(s) de anel é 1. Em algumas modalidades, o número de heteroátomos de anel é 2. Em algumas modalidades, um heteroátomo é oxigênio.
Em algumas modalidades, R1 é opcionalmente substituído.
Em algumas modalidades, R1 é opcionalmente substituído.
Em algumas modalidades, R1 é . Em algumas modalidades, R1 é C1-30 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, R1 é C1-10 alquila opcionalmente substituída.
[00521] Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica, por exemplo, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada, tem a estrutura da fórmula II ou uma forma de sal da mesma: ,
II ou uma forma de sal da mesma, em que: PL é P(=W), P, ou P→B(R')3; W é O, N(–L–R5), S ou Se; cada um dentre X, Y e Z é independentemente –O–, – S–, –N(–L–R5)–, ou L; R5 é −H, −L−R', halogênio, −CN, −NO2, −L−Si(R')3, −OR', −SR', ou −N(R')2; O anel AL é um anel monocíclico, bicíclico ou policíclico com 3 a 20 membros opcionalmente substituído tendo 0 a 10 heteroátomos;
cada Rs é independentemente −H, halogênio, −CN, −N3, −NO, −NO2, −L−R', −L−Si(R)3, −L−OR', −L−SR', −L−N(R')2, −O−L−R', −O−L−Si(R)3, −O−L−OR', −O−L−SR', ou −O−L−N(R')2; g é 0 a 20; cada L é independentemente um grupo de ligação covalente, ou bivalente, linear ou ramificado opcionalmente substituído selecionado dentre um grupo alifático C1-30 e um grupo heteroalifático C1-30 tendo 1 a 10 heteroátomos, em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por C1-6 alquileno, C1-6 alquenileno, , um grupo heteroalifático C1–C6 bivalente tendo 1 a 5 heteroátomos, −C(R')2−, −Cy−, −O−, −S−, −S−S−, −N(R')−, −C(O)−, −C(S)−, −C(NR')−, −C(O)N(R')−, −N(R')C(O)N(R')−, −N(R')C(O)O−, −S(O)−, −S(O)2−, −S(O)2N(R')−, −C(O)S−, −C(O)O−, −P(O)(OR')−, −P(O)(SR')−, −P(O)(R')−, −P(O)(NR')−, −P(S)(OR')−, −P(S)(SR')−, −P(S)(R')−, −P(S)(NR')−, −P(R')−, −P(OR')−, −P(SR')−, −P(NR')−, −P(OR')[B(R')3]−, −OP(O)(OR')O−, −OP(O)(SR')O−, −OP(O)(R')O−, −OP(O)(NR')O−, −OP(OR')O−, −OP(SR')O−, −OP(NR')O−, −OP(R')O−, ou −OP(OR')[B(R')3]O−, e um ou mais CH ou átomos de carbono são opcional e independentemente substituídos por CyL; cada −Cy− é independentemente um grupo bivalente opcionalmente substituído selecionado dentre um anel cicloalifático C3-20, um anel C6-20 arila, um anel heteroarila com 5 a 20 membros tendo 1 a 10 heteroátomos, e um anel heterociclila com 3 a 20 membros tendo 1 a 10 heteroátomos; cada CyL é independentemente um grupo trivalente ou tetravalente opcionalmente substituído selecionado dentre um anel cicloalifático C3-20, um anel C6-20 arila, um anel heteroarila com 5 a 20 membros tendo 1 a 10 heteroátomos, e um anel heterociclila com 3 a 20 membros tendo 1 a 10 heteroátomos; cada R' é independentemente −R, −C(O)R, −C(O)OR, ou −S(O)2R; cada R é independentemente −H, ou um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre C1-30 alifático, C1-30 heteroalifático tendo 1 a 10 heteroátomos, C6-30 arila, C6- 30 arilalifático, C6-30 aril-heteroalifático tendo 1 a 10 heteroátomos, heteroarila com 5 a 30 membros tendo 1 a 10 heteroátomos, e heterociclila com 3 a 30 membros tendo 1 a 10 heteroátomos, ou dois grupos R são opcional e independentemente tomados em conjunto para formar uma ligação covalente, ou dois ou mais grupos R no mesmo átomo são opcional e independentemente tomados em conjunto para formar um anel monocíclico, bicíclico ou policíclico com 3 a 30 membros opcionalmente substituído tendo, além do átomo, 0 a 10 heteroátomos, ou dois ou mais grupos R em dois ou mais átomos são opcional e independentemente tomados em conjunto com seus átomos intervenientes para formar um anel monocíclico, bicíclico ou policíclico com 3 a 30 membros opcionalmente substituído tendo, além dos átomos intervenientes, 0 a 10 heteroátomos.
[00522] Em algumas modalidades, o Anel AL em várias estruturas da presente revelação é um anel arila opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, o Anel AL é um anel fenila opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, o Anel AL é um anel heteroalifático com 3 a 10 membros (por exemplo, 3, 4, 5, 6, 7, ou 8) opcionalmente substituído.
Em algumas modalidades, o Anel AL é um anel heteroalifático monocíclico saturado com 5 ou 6 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 3 heteroátomos.
Em algumas modalidades, o anel tem 5 membros.
Em algumas modalidades, o anel tem 6 membros.
Em algumas modalidades, o número de heteroátomo(s) de anel é 1. Em algumas modalidades, o número de heteroátomos de anel é 2. Em algumas modalidades, um heteroátomo é oxigênio.
Em algumas modalidades, Rs é grupo C1- C6 alquila opcionalmente substituído.
Em algumas modalidades, Rs é Me.
Em algumas modalidades, Rs é OR, em que R é hidrogênio ou grupo C1-C6 alquila.
Em algumas modalidades, Rs é OH.
Em algumas modalidades, Rs é OMe.
Em algumas modalidades, Rs é −N(R')2. Em algumas modalidades, Rs é −NH2. Em algumas modalidades, é . Em algumas modalidades, é . Em algumas modalidades, é . Em algumas modalidades, é . Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica, por exemplo uma ligação internucleotídica neutra da fórmula I ou II, é n002 (
, que, conforme uma pessoa versada na técnica irá observar, pode existir sob determinadas condições sob a forma de ). Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica, por exemplo uma ligação internucleotídica neutra da fórmula I ou II, é n005 (
, que, conforme uma pessoa versada na técnica irá observar, pode existir sob determinadas condições sob a forma de ). Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica, por exemplo uma ligação internucleotídica neutra da fórmula I ou II, é n006 (
, que, conforme uma pessoa versada na técnica irá observar, pode existir sob determinadas condições sob a forma de ). Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica, por exemplo uma ligação internucleotídica neutra da fórmula I ou II, é n007 ( , que, conforme uma pessoa versada na técnica irá observar, pode existir sob determinadas condições sob uma forma de ).
[00523] Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica, por exemplo, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada da fórmula II, tem a estrutura da fórmula II-a-1 ou uma forma de sal da mesma: , II-a-1 ou uma forma de sal da mesma.
[00524] Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica, por exemplo, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada da fórmula II, tem a estrutura da fórmula II-a-2 ou uma forma de sal da mesma: , II-a-2 ou uma forma de sal da mesma.
[00525] Em algumas modalidades, AL é ligado a −N= ou L através de um átomo de carbono. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica, por exemplo, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada da fórmula II ou II-a-1, II-a-2, tem a estrutura da fórmula II- b-1 ou uma forma de sal da mesma: . II-b-1
[00526] Em algumas modalidades, uma estrutura da fórmula II-a-1 ou II-a-2 pode ser denominada como uma estrutura da fórmula II-a. Em algumas modalidades, uma estrutura da fórmula II-b-1 ou II-b-2 pode ser denominada como uma estrutura da fórmula II-b. Em algumas modalidades, uma estrutura da fórmula II-c-1 ou II-c-2 pode ser denominada como uma estrutura da fórmula II-c. Em algumas modalidades, uma estrutura da fórmula II-d-1 ou II-d-2 pode ser denominada como uma estrutura da fórmula II-d.
[00527] Em algumas modalidades, AL é ligado a −N= ou L através de um átomo de carbono. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica, por exemplo, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada da fórmula II ou II-a-1, II-a-2, tem a estrutura da fórmula II- b-2 ou uma forma de sal da mesma:
. II-b-2
[00528] Em algumas modalidades, o Anel AL é um anel monocíclico com 3 a 20 membros opcionalmente substituído tendo 0 a 10 heteroátomos (além dos dois átomos de nitrogênio para a fórmula II-b). Em algumas modalidades, o Anel AL é um anel saturado monocíclico com 5 membros opcionalmente substituído.
[00529] Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica, por exemplo, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada da fórmula II, II-a, ou II-b, tem a estrutura da fórmula II-c-1 ou uma forma de sal da mesma: . II-c-1
[00530] Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica, por exemplo, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada da fórmula II, II-a, ou II-b, tem a estrutura da fórmula II-c-2 ou uma forma de sal da mesma: . II-c-2
[00531] Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica, por exemplo, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada da fórmula II, II-a, II-b, ou II- c tem a estrutura da fórmula II-d-1 ou uma forma de sal da mesma: . II-d-1
[00532] Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica, por exemplo, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada da fórmula II, II-a, II-b, ou II- c tem a estrutura da fórmula II-d-2 ou uma forma de sal da mesma: . II-d-2
[00533] Em algumas modalidades, cada R' é independentemente C1-6 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, cada R' é independentemente C1-6 alquila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, cada R' é independentemente −CH3. Em algumas modalidades, cada Rs é −H.
[00534] Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura de . Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura de . Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura de . Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura de . Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura de . Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura de . Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura de . Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura de . Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura de . Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura de . Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura de . Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura de . Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura de . Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura de . Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura de . Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura de . Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura de . Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura de . Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura de . Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura de . Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura de . Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura de . Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura de . Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura de . Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura de . Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura de . Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura de . Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura de . Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura de . Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura de . Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura de . Em algumas modalidades, W é O. Em algumas modalidades, W é S. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada é quiralmente controlada. Em algumas modalidades, o fósforo de ligação é Rp. Em algumas modalidades, o fósforo de ligação é Sp.
[00535] Em algumas modalidades, cada ligação internucleotídica não negativamente carregada ou ligação internucleotídica neutra (por exemplo, aquelas da fórmula I- n-1, I-n-2, I-n-3, I-n-4, II, II-a-1, II-a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, ou II-d-2) é independentemente Rp em seu fósforo de ligação. Em algumas modalidades, cada ligação internucleotídica quiral negativamente carregada é Sp em seu fósforo de ligação. Em algumas modalidades, cada ligação internucleotídica fosforotioato é Sp em seu fósforo de ligação.
Em algumas modalidades, cada ligação fosfato natural é independentemente ligada a um açúcar que compreende uma modificação 2'-OR, em que R não é −H. Em algumas modalidades, cada ligação fosfato natural é independentemente ligada a um açúcar que compreende uma modificação 2'-OR, em que R não é −H, em uma posição 3'. Em algumas modalidades, cada açúcar que não contém modificação 2'-OR em que R não é −H é independentemente ligado a pelo menos uma ligação fosfato não natural, em muitos casos, duas ligações fosfato naturais não naturais. Em algumas modalidades, cada açúcar modificado é independentemente ligado a pelo menos uma ligação fosfato natural não natural, em muitos casos, duas ligações fosfato naturais não naturais. Em algumas modalidades, cada ligação fosfato não natural é uma ligação internucleotídica fosforotioato. Em algumas modalidades, cada ligação fosfato não natural é a ligação internucleotídica fosforotioato Sp. Em algumas modalidades, cada açúcar ligado à ligação internucleotídica não negativamente carregada ou ligação internucleotídica neutra (por exemplo, aquelas da fórmula I- n-1, I-n-2, I-n-3, I-n-4, II, II-a-1, II-a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, ou II-d-2) não contém independentemente 2'-OR. Em algumas modalidades, cada açúcar ligado à ligação internucleotídica não negativamente carregada ou ligação internucleotídica neutra (por exemplo, aquelas da fórmula I-n-1, I-n-2, I-n-3, I-n-4, II, II-a-1, II-a-2, II-b- 1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, ou II-d-2) é um açúcar modificado 2'-F.
[00536] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece um composto, por exemplo, um oligonucleotídeo, um oligonucleotídeo quiralmente controlado,
um oligonucleotídeo de uma composição fornecida (por exemplo, de uma pluralidade de oligonucleotídeos), que tem a estrutura da fórmula O-I:
, O-I ou um sal do mesmo, em que: R5s é independentemente R' ou −OR'; cada BA é independentemente um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre C3-30 cicloalifático, C6-30 arila, C5-30 heteroarila tendo 1 a 10 heteroátomos, C3-30 heterociclila tendo 1 a 10 heteroátomos, uma porção química de nucleobase natural, e uma porção química de nucleobase modificada; cada Rs é independentemente −H, halogênio, −CN, −N3, −NO, −NO2, −L−R', −L−Si(R)3, −L−OR', −L−SR', −L−N(R')2, −O−L−R', −O−L−Si(R)3, −O−L−OR', −O−L−SR', ou −O−L−N(R')2; cada s é independentemente 0 a 20; cada Ls é independentemente −C(R5s)2−, ou L; cada L é independentemente um grupo de ligação covalente, ou bivalente, linear ou ramificado opcionalmente substituído selecionado dentre um grupo alifático C1-30 e um grupo heteroalifático C1-30 tendo 1 a 10 heteroátomos, em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por C1-6 alquileno, C1-6 alquenileno, , um grupo heteroalifático C1–C6 bivalente tendo 1 a 5 heteroátomos, −C(R')2−, −Cy−, −O−, −S−, −S−S−, −N(R')−, −C(O)−, −C(S)−, −C(NR')−, −C(O)N(R')−, −N(R')C(O)N(R')−, −N(R')C(O)O−, −S(O)−, −S(O)2−, −S(O)2N(R')−, −C(O)S−, −C(O)O−, −P(O)(OR')−, −P(O)(SR')−, −P(O)(R')−, −P(O)(NR')−, −P(S)(OR')−, −P(S)(SR')−, −P(S)(R')−, −P(S)(NR')−, −P(R')−, −P(OR')−, −P(SR')−, −P(NR')−, −P(OR')[B(R')3]−, −OP(O)(OR')O−, −OP(O)(SR')O−, −OP(O)(R')O−, −OP(O)(NR')O−, −OP(OR')O−, −OP(SR')O−, −OP(NR')O−, −OP(R')O−, ou −OP(OR')[B(R')3]O−, e um ou mais CH ou átomos de carbono são opcional e independentemente substituídos por CyL; cada −Cy− é independentemente um grupo bivalente opcionalmente substituído selecionado dentre um anel cicloalifático C3-20, um anel C6-20 arila, um anel heteroarila com 5 a 20 membros tendo 1 a 10 heteroátomos, e um anel heterociclila com 3 a 20 membros tendo 1 a 10 heteroátomos; cada CyL é independentemente um grupo trivalente ou tetravalente opcionalmente substituído selecionado dentre um anel cicloalifático C3-20, um anel C6-20 arila, um anel heteroarila com 5 a 20 membros tendo 1 a 10 heteroátomos, e um anel heterociclila com 3 a 20 membros tendo 1 a 10 heteroátomos; cada Anel A é independentemente um anel monocíclico, bicíclico ou policíclico com 3 a 20 membros opcionalmente substituído tendo 0 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício; cada LP é independentemente uma ligação internucleotídica; z é 1 a 1.000; L3E é L ou −L−L−;
R3E é −R', −L−R', −OR', ou um suporte sólido; cada R' é independentemente −R, −C(O)R, −C(O)OR, ou −S(O)2R; cada R é independentemente −H, ou um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre C1-30 alifático, C1-30 heteroalifático tendo 1 a 10 heteroátomos, C6-30 arila, C6- 30 arilalifático, C6-30 aril-heteroalifático tendo 1 a 10 heteroátomos, heteroarila com 5 a 30 membros tendo 1 a 10 heteroátomos, e heterociclila com 3 a 30 membros tendo 1 a 10 heteroátomos, ou dois grupos R são opcional e independentemente tomados em conjunto para formar uma ligação covalente, ou dois ou mais grupos R no mesmo átomo são opcional e independentemente tomados em conjunto para formar um anel monocíclico, bicíclico ou policíclico com 3 a 30 membros opcionalmente substituído tendo, além do átomo, 0 a 10 heteroátomos, ou dois ou mais grupos R em dois ou mais átomos são opcional e independentemente tomados em conjunto com seus átomos intervenientes para formar um anel monocíclico, bicíclico ou policíclico com 3 a 30 membros opcionalmente substituído tendo, além dos átomos intervenientes, 0 a 10 heteroátomos.
[00537] Em algumas modalidades, cada LP tem independentemente a estrutura da fórmula I, I-a, I-b, I-c, I- n-1, I-n-2, I-n-3, I-n-4, II, II-a-1, II-a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, II-d-2, III, ou uma forma de sal da mesma. Em algumas modalidades, cada LP tem independentemente a estrutura da fórmula I, I-a, I-b, I-c, I-n-1, I-n-2, I-n-3, I- n-4, II, II-a-1, II-a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-
d-1, II-d-2, ou uma forma de sal da mesma. Em algumas modalidades, cada LP tem independentemente a estrutura da fórmula I, I-a, I-b, I-c, I-n-1, I-n-2, I-n-3, II, II-a-1, II- a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, II-d-2, ou uma forma de sal da mesma. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica tem a estrutura da fórmula I, I-a, I-b, I- c, I-n-1, I-n-2, I-n-3, I-n-4, II, II-a-1, II-a-2, II-b-1, II- b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, II-d-2, III, ou uma forma de sal da mesma. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica tem a estrutura da fórmula I, I-a, I-b, I- c, I-n-1, I-n-2, I-n-3, I-n-4, II, II-a-1, II-a-2, II-b-1, II- b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, II-d-2, ou uma forma de sal da mesma. Em algumas modalidades, cada ligação internucleotídica tem independentemente a estrutura da fórmula I, I-a, I-b, I- c, I-n-1, I-n-2, I-n-3, I-n-4, II, II-a-1, II-a-2, II-b-1, II- b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, II-d-2, III, ou uma forma de sal da mesma. Em algumas modalidades, cada ligação internucleotídica tem independentemente a estrutura da fórmula I, I-a, I-b, I-c, I-n-1, I-n-2, I-n-3, I-n-4, II, II-a-1, II- a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, II-d-2, ou uma forma de sal da mesma. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica tem a estrutura da fórmula I, I-a, I-b, I- c, I-n-1, I-n-2, I-n-3, II, II-a-1, II-a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, II-d-2, ou uma forma de sal da mesma. Em algumas modalidades, cada ligação internucleotídica tem independentemente a estrutura da fórmula I, I-a, I-b, I-c, I- n-1, I-n-2, I-n-3, II, II-a-1, II-a-2, II-b-1, II-b-2, II-c- 1, II-c-2, II-d-1, II-d-2, ou uma forma de sal da mesma.
[00538] Em algumas modalidades, cada BA é independentemente um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre C5-30 heteroarila tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício, e C3-30 heterociclila tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo, boro e silício; cada Anel A é independentemente um anel monocíclico, bicíclico ou policíclico com 3 a 20 membros opcionalmente substituído tendo 0 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício; e cada LP tem independentemente a estrutura da fórmula I, I-a, I-b, I-c, I-n-1, I-n-2, I-n-3, I-n-4, II, II-a-1, II- a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, II-d-2, III, ou uma forma de sal da mesma. Em algumas modalidades, cada LP tem independentemente a estrutura da fórmula I, I-a, I-b, I-c, I- n-1, I-n-2, I-n-3, I-n-4, II, II-a-1, II-a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, II-d-2, ou uma forma de sal da mesma.
[00539] Em algumas modalidades, cada BA é independentemente uma C5-30 heteroarila opcionalmente substituída tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício, em que a heteroarila compreende um ou mais heteroátomos selecionados dentre oxigênio e nitrogênio; cada Anel A é independentemente um anel saturado monocíclico ou bicíclico com 5 a 10 membros opcionalmente substituído tendo 0 a 5 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício, em que o anel compreende pelo menos um átomo de oxigênio; e cada LP tem independentemente a estrutura da fórmula
I, I-a, I-b, I-c, I-n-1, I-n-2, I-n-3, I-n-4, II, II-a-1, II- a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, II-d-2, III, ou uma forma de sal da mesma. Em algumas modalidades, cada LP tem independentemente a estrutura da fórmula I, I-a, I-b, I-c, I- n-1, I-n-2, I-n-3, I-n-4, II, II-a-1, II-a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, II-d-2, ou uma forma de sal da mesma.
[00540] Em algumas modalidades, cada BA é independentemente um A, T, C, G, ou U opcionalmente substituído, ou um tautômero opcionalmente substituído de A, T, C, G, ou U; cada Anel A é independentemente um anel saturado monocíclico ou bicíclico com 5 a 7 membros opcionalmente substituído tendo um ou mais átomos de oxigênio; e cada LP tem independentemente a estrutura da fórmula I, I-a, I-b, I-c, I-n-1, I-n-2, I-n-3, I-n-4, II, II-a-1, II- a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, II-d-2, III, ou uma forma de sal da mesma. Em algumas modalidades, cada LP tem independentemente a estrutura da fórmula I, I-a, I-b, I-c, I- n-1, I-n-2, I-n-3, I-n-4, II, II-a-1, II-a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, II-d-2, ou uma forma de sal da mesma.
[00541] Em algumas modalidades, cada BA é independentemente uma nucleobase protegida ou opcionalmente substituída selecionada dentre adenina, citosina, guanosina, timina e uracila e tautômeros das mesmas; cada Anel A é independentemente um anel saturado monocíclico ou bicíclico com 5 a 7 membros opcionalmente substituído tendo um ou mais átomos de oxigênio; e cada LP tem independentemente a estrutura da fórmula I, I-a, I-b, I-c, I-n-1, I-n-2, I-n-3, I-n-4, II, II-a-1, II- a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, II-d-2, III, ou uma forma de sal da mesma. Em algumas modalidades, cada LP tem independentemente a estrutura da fórmula I, I-a, I-b, I-c, I- n-1, I-n-2, I-n-3, I-n-4, II, II-a-1, II-a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, II-d-2, ou uma forma de sal da mesma.
[00542] Em algumas modalidades, BA é um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre C3-30 cicloalifático, C6-30 arila, C5-30 heteroarila tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício, C3-30 heterociclila tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício, uma porção química de nucleobase natural, e uma porção química de nucleobase modificada. Em algumas modalidades, BA é um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre C5-30 heteroarila tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício, C3-30 heterociclila tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício, uma porção química de nucleobase natural, e uma porção química de nucleobase modificada. Em algumas modalidades, BA é um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre C5-30 heteroarila tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício, uma porção química de nucleobase natural, e uma porção química de nucleobase modificada. Em algumas modalidades, BA é C5-30 heteroarila opcionalmente substituída tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio e enxofre. Em algumas modalidades, BA são nucleobases naturais opcionalmente substituídas e tautômeros das mesmas. Em algumas modalidades, BA são nucleobases naturais protegidas e tautômeros das mesmas. Vários grupos protetores de nucleobase para síntese de oligonucleotídeo são conhecidos e podem ser utilizados de acordo com a presente revelação. Em algumas modalidades, BA é uma nucleobase opcionalmente substituída selecionada dentre adenina, citosina, guanosina, timina e uracila, e tautômeros das mesmas. Em algumas modalidades, BA é uma nucleobase opcionalmente protegida selecionada dentre adenina, citosina, guanosina, timina e uracila, e tautômeros das mesmas.
[00543] Em algumas modalidades, BA é C3-30 cicloalifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, BA é C6-30 arila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, BA é C3-30 heterociclila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, BA é C5-30 heteroarila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, BA é uma porção química de base natural opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, BA é uma porção química de base modificada opcionalmente substituída. BA é um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre C3-30 cicloalifático, C6-30 arila, C3-30 heterociclila, e C5-30 heteroarila. Em algumas modalidades, BA é um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre C3- 30 cicloalifático, C6-30 arila, C3-30 heterociclila, C5-30 heteroarila, e uma porção química de nucleobase natural.
[00544] Em algumas modalidades, BA é conectado através de um anel aromático. Em algumas modalidades, BA é conectado através de um heteroátomo. Em algumas modalidades, BA é conectado através de um heteroátomo de anel de um anel aromático. Em algumas modalidades, BA é conectado através de um átomo de nitrogênio de anel de um anel aromático.
[00545] Em algumas modalidades, BA é uma porção química de nucleobase natural. Em algumas modalidades, BA é uma porção química de nucleobase natural opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, BA é uma porção química de nucleobase natural substituída. Em algumas modalidades, BA é opcionalmente substituído, ou um tautômero opcionalmente substituído de A, T, C, U, ou G. Em algumas modalidades, BA é nucleobase natural A, T, C, U, ou G. Em algumas modalidades, BA é um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre nucleobases naturais A, T, C, U, e G.
[00546] Em algumas modalidades, BA é um resíduo de base de purina opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, BA é um resíduo de base de purina protegido. Em algumas modalidades, BA é um resíduo de adenina opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, BA é um resíduo de adenina protegido. Em algumas modalidades, BA é um resíduo de guanina opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, BA é um resíduo de guanina protegido. Em algumas modalidades, BA é um resíduo de citosina opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, BA é um resíduo de citosina protegido. Em algumas modalidades, BA é um resíduo de timina opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, BA é um resíduo de timina protegido. Em algumas modalidades, BA é um resíduo de uracila opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, BA é um resíduo de uracila protegido. Em algumas modalidades, BA é um resíduo de 5-metilcitosina opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, BA é um resíduo de 5-metilcitosina protegido.
[00547] Em algumas modalidades, BA é um resíduo de base protegido conforme usado na preparação de oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, BA é um resíduo de base ilustrado nos documentos US 2011/0294124, US 2015/0211006, US 2015/0197540, e WO 2015/107425, cada um dos quais é incorporado ao presente documento a título de referência.
[00548] Em algumas modalidades, R5s−Ls− é −CH2OH. Em algumas modalidades, R5s−Ls− é −CH(R5s)−OH, em que R5s é conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, Ls é −CH2−. Em algumas modalidades, Ls é −CH(R5s)− em que R5s não é −H. Em algumas modalidades, Ls é −CH(R5s)− em que R5s não é −H e é, de outro modo R. Em algumas modalidades, R é C1-6 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, R é C1-6 alquila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é metila. Em algumas modalidades, −CH(R5s)− em que R5s não é −H é R. Em algumas modalidades, −CH(R5s)− em que R5s não é −H é S.
[00549] As modalidades exemplificativas para variáveis, por exemplo, variáveis de cada uma das fórmulas, são adicionalmente descritas na presente revelação, e podem ser independente e opcionalmente combinadas.
[00550] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece oligonucleotídeos e composições de oligonucleotídeo que são quiralmente controladas. Por exemplo, em algumas modalidades, uma composição fornecida contém níveis controlados de um ou mais tipos de oligonucleotídeo individuais, em que um tipo de oligonucleotídeo é definido por: 1) sequência de base; 2) padrão de ligações de cadeia principal; 3) padrão de centros quirais de cadeia principal; e 4) padrão de modificações P de cadeia principal. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos do mesmo tipo de oligonucleotídeo são idênticos.
[00551] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido é um altmer. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido é um altmer de modificação P. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido é um stereoaltmer.
[00552] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido é um blockmer. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido é um blockmer de modificação P. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido é um stereoblockmer.
[00553] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido é um gapmer.
[00554] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido é um skipmer.
[00555] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido é um hemimer. Em algumas modalidades, um hemimer é um oligonucleotídeo em que a extremidade 5' ou a extremidade 3' tem uma sequência que tem um recurso estrutural que o restante do oligonucleotídeo não tem. Em algumas modalidades, a extremidade 5' ou a extremidade 3' tem ou compreende 2 a 20 nucleotídeos. Em algumas modalidades, um recurso estrutural é uma modificação de base. Em algumas modalidades, um recurso estrutural é uma modificação de açúcar. Em algumas modalidades, um recurso estrutural é uma modificação P. Em algumas modalidades, um recurso estrutural é a estereoquímica da ligação internucleotídica quiral. Em algumas modalidades, um recurso estrutural é ou compreende uma modificação de base, uma modificação de açúcar, uma modificação P, ou estereoquímica da ligação internucleotídica quiral, ou combinações das mesmas. Em algumas modalidades, um hemimer é um oligonucleotídeo em que cada porção química de açúcar da sequência de extremidade 5' compartilha uma modificação comum.
Em algumas modalidades, um hemimer é um oligonucleotídeo em que cada porção química de açúcar da sequência de extremidade 3' compartilha uma modificação comum.
Em algumas modalidades, uma modificação comum de açúcar da sequência de extremidade 5' ou 3' não é compartilhada por nenhuma outra porção química de açúcar no oligonucleotídeo.
Em algumas modalidades, um hemimer exemplificativo é um oligonucleotídeo que compreende uma sequência de nucleosídeos modificados com açúcar 2'-O-alquila substituído ou não substituído, nucleosídeos modificados com açúcar bicíclico, β-D-ribonucleosídeos ou β-D- desoxirribonucleotídeos (por exemplo nucleosídeos modificados com 2'-MOE, e nucleosídeos modificados com açúcar bicíclico LNA™ ou ENA™) em uma terminação e uma sequência de nucleosídeos com uma porção química de açúcar diferente (tais como nucleosídeos modificados com açúcar 2'-O-alquila substituído ou não substituído, nucleosídeos modificados com açúcar bicíclico ou naturais) na outra terminação.
Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido é uma combinação de um ou mais dentre unimer, altmer, blockmer, gapmer, hemimer e skipmer.
Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido é uma combinação de um ou mais dentre unimer, altmer, blockmer, gapmer e skipmer.
Por exemplo, em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido é tanto um altmer como um gapmer.
Em algumas modalidades, um nucleotídeo fornecido é tanto um gapmer como um skipmer.
Uma pessoa versada na técnica química e sintética irá reconhecer que várias outras combinações de padrões estão disponíveis e se limitam apenas à disponibilidade comercial e/ou acessibilidade sintética de partes constituintes necessárias para sintetizar um oligonucleotídeo fornecido de acordo com os métodos da presente revelação. Em algumas modalidades, uma estrutura de hemimer fornece benefícios vantajosos. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos são hemimers 5’ que compreendem porções químicas de açúcar modificadas em uma sequência de extremidade 5'. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos são hemimers 5’ que compreendem porções químicas de açúcar 2’ modificadas em uma sequência de extremidade 5'.
[00556] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido compreende um ou mais nucleotídeos opcionalmente substituídos. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido compreende um ou mais nucleotídeos modificados. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido compreende um ou mais nucleosídeos opcionalmente substituídos. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido compreende um ou mais nucleosídeos modificados. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido compreende um ou mais nucleosídeos ou açúcares opcionalmente substituídos de LNAs.
[00557] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido compreende uma ou mais nucleobases opcionalmente substituídas. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido compreende uma ou mais nucleobases naturais opcionalmente substituídas. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido compreende uma ou mais nucleobases modificadas opcionalmente substituídas. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido compreende uma ou mais 5-metilcitidina; 5-hidroximetilcitidina, 5- formilcitosina, ou 5-carboxilcitosina. Em algumas modalidades,
um oligonucleotídeo fornecido compreende uma ou mais 5- metilcitidina.
[00558] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido compreende um ou mais açúcares opcionalmente substituídos. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido compreende um ou mais açúcares opcionalmente substituídos encontrados em DNA e RNA de ocorrência natural. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido compreende uma ou mais ribose ou desoxirribose opcionalmente substituídas. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido compreende uma ou mais ribose ou desoxirribose opcionalmente substituídas, em que um ou mais grupos hidroxila da porção química de ribose ou desoxirribose são opcional e independentemente substituídos por halogênio, R', –N(R')2, –OR', ou –SR', em que cada R' é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido compreende uma ou mais desoxirriboses opcionalmente substituídas, em que a posição 2' da desoxirribose é opcional e independentemente substituída por R2s, halogênio, R', –N(R')2, –OR', ou –SR', em que cada R' é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido compreende uma ou mais desoxirriboses opcionalmente substituídas, em que a posição 2' da desoxirribose é opcional e independentemente substituída por halogênio. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido compreende uma ou mais desoxirriboses opcionalmente substituídas, em que a posição 2' da desoxirribose é opcional e independentemente substituída por um ou mais –F. halogênio.
Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido compreende uma ou mais desoxirriboses opcionalmente substituídas, em que a posição 2' da desoxirribose é opcional e independentemente substituída por –OR', em que cada R' é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido compreende uma ou mais desoxirriboses opcionalmente substituídas, em que a posição 2' da desoxirribose é opcional e independentemente substituída por –OR', em que cada R' é independentemente um C1–C6 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido compreende uma ou mais desoxirriboses opcionalmente substituídas, em que a posição 2' da desoxirribose é opcional e independentemente substituída por –OR', em que cada R' é independentemente uma C1–C6 alquila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido compreende uma ou mais desoxirriboses opcionalmente substituídas, em que a posição 2' da desoxirribose é opcional e independentemente substituída por –OMe. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido compreende uma ou mais desoxirriboses opcionalmente substituídas, em que a posição 2' da desoxirribose é opcional e independentemente substituída por –O–metoxietila.
[00559] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido é um oligonucleotídeo de fita simples. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido é uma fita de oligonucleotídeo hibridizada. Em determinadas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido é uma fita de oligonucleotídeo parcialmente hibridizada. Em determinadas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido é uma fita de oligonucleotídeo completamente hibridizada. Em determinadas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido é um oligonucleotídeo de fita dupla. Em determinadas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido é um oligonucleotídeo de fita tripla (por exemplo, um triplex).
[00560] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido é quimérico. Por exemplo, em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido é quimera de DNA-RNA, quimera de DNA-LNA, etc.
[00561] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo é uma variante de oligonucleotídeo quiralmente controlada de um oligonucleotídeo descrito no documento WO2012/030683. Por exemplo, em algumas modalidades, uma variante de oligonucleotídeo quiralmente controlada compreende uma versão quiralmente controlada de uma ligação internucleotídica quiral que não é quiralmente controlada no documento WO2012/030683. Em algumas modalidades, uma variante de oligonucleotídeo quiralmente controlada compreende uma ou mais ligações internucleotídicas quiralmente controladas que substituem independentemente uma ou mais ligações fosfato naturais ou ligações internucleotídicas modificadas não quiralmente controladas no documento WO2012/030683.
[00562] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido é ou compreende uma porção de GNA, LNA, PNA, TNA ou Morfolino.
[00563] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido tem cerca de 15 a cerca de 25 unidades de nucleotídeo de comprimento. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido tem cerca de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,
23, 24, ou 25 unidades de nucleotídeo de comprimento.
[00564] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece oligonucleotídeos que compreendem uma ou mais ligações internucleotídicas modificadas, que podem ser quirais no fósforo de ligação e quiralmente controladas. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo compreende uma ou mais ligações LPO, LPA ou LPB, em que: cada LPO é independentemente , , ou uma forma de sal do mesmo; cada LPA é independentemente uma ligação internucleotídica que tem a estrutura de , , , ou , ou uma forma de sal do mesmo;
cada LPB é independentemente uma ligação internucleotídica que tem a estrutura de , , , ou , ou uma forma de sal do mesmo; Nx é −N(−L−R5)−L−R1, , , , , , ; e WN é =N−L−R5, Q-, Q-, Q- , Q-, ou Q-; em que cada outra variável é independentemente conforme descrito no presente documento.
[00565] Em algumas modalidades, cada LPO é independentemente , , , ou uma forma de sal do mesmo.
[00566] Em algumas modalidades, −O−L−R1 é −OH. Em algumas modalidades, −X−L−R1, por exemplo, em LPO é −OCH2CH2CN. Em algumas modalidades, −S−L−R1 é −SH. Em algumas modalidades, LPA é uma ligação internucleotídica fosforotioato com a estereoquímica especificada. Em algumas modalidades, LPB é uma ligação internucleotídica fosforotioato com a estereoquímica especificada. Em algumas modalidades, X é−O−, e −X−L−R1 é conforme descrito na presente revelação, por exemplo, −X−L−R1 é , , , , , , , , , ou , em que cada variável é independentemente de acordo com a presente revelação, ou H−X−L−R1 é um auxiliar quiral conforme descrito no presente documento. Em algumas modalidades, −X−L−R1 é , ou , em que G4 e G5 são tomados em conjunto para formar um anel opcionalmente substituído conforme descrito no presente documento. Em algumas modalidades, −X−L−R1 é , ou . Em algumas modalidades, G2 é −CH2Si(R)3 conforme descrito no presente documento. Em algumas modalidades, G2 é −CH2Si(Ph)2Me. Em algumas modalidades, G2 compreende um grupo removedor de elétrons conforme descrito no presente documento, por exemplo, em algumas modalidades, G2 é −CH2SO2R conforme descrito no presente documento. Em algumas modalidades, G2 é −CH2SO2Ph.
[00567] Em algumas modalidades, Nx é −N(−L−R5)−L−R1, e uma ligação internucleotídica que tem tal grupo Nx é uma ligação internucleotídica que tem a estrutura da fórmula I em que PL é P=O, Y e Z são −O−, e X é −N(−L−R5)−, em que a estereoquímica de fósforo de ligação é conforme especificado. Em algumas modalidades, Nx é , e uma ligação internucleotídica que tem tal grupo Nx é uma ligação internucleotídica que tem a estrutura da fórmula II, em que PL é P=O, Y e Z são −O−, e X é −N(−L−R5)−, em que a estereoquímica de fósforo de ligação é conforme especificado.
Em algumas modalidades, Nx é . Em algumas modalidades, Nx é . Em algumas modalidades, Nx é . Em algumas modalidades, Nx é. . Em algumas modalidades, Nx é , e uma ligação internucleotídica que tem tal grupo Nx é uma ligação internucleotídica que tem a estrutura da fórmula I-n-3, em que PL é P=O, e Y e Z são −O−, em que a estereoquímica de fósforo de ligação é conforme especificado.
Em algumas modalidades, R1 é alquila opcionalmente substituída.
Em algumas modalidades,
R1 é metila.
Em algumas modalidades, Nx é . Em algumas modalidades, dois R1 no mesmo nitrogênio independentemente são tomados em conjunto para formar um anel opcionalmente substituído conforme descrito no presente documento, por exemplo, um anel com 5 ou 6 membros opcionalmente substituído que além do átomo de nitrogênio, tem 1 a 3 heteroátomos.
Em algumas modalidades, o anel é saturado.
Em algumas modalidades,
o anel é monocíclico. Em algumas modalidades, Nx é .
Em algumas modalidades, Nx é . Em algumas modalidades, Nx é . Aqueles versados na técnica irão observar que dois grupos −N(R1)2, em qualquer, em uma estrutura ou fórmula podem ser iguais ou diferentes. Em algumas modalidades, Nx é , e uma ligação internucleotídica que tem tal grupo Nx é uma ligação internucleotídica que tem a estrutura da fórmula I-n-4, em que PL é P=O, L é uma ligação covalente, e Y e Z são −O−, em que a estereoquímica de fósforo de ligação é conforme especificado. Em algumas modalidades, Nx é , e uma ligação internucleotídica que tem tal grupo Nx é uma ligação internucleotídica que tem a estrutura da fórmula II-a-1, em que PL é P=O, L é uma ligação covalente, e Y e Z são −O−, em que a estereoquímica de fósforo de ligação é conforme especificado. Em algumas modalidades, Nx é , e uma ligação internucleotídica que tem tal grupo
Nx é uma ligação internucleotídica que tem a estrutura da fórmula II-b-1, em que PL é P=O, L é uma ligação covalente, e Y e Z são −O−, em que a estereoquímica de fósforo de ligação é conforme especificado. Em algumas modalidades, Nx é , e uma ligação internucleotídica que tem tal grupo Nx é uma ligação internucleotídica que tem a estrutura da fórmula II- c-1, em que PL é P=O, L é uma ligação covalente, e Y e Z são −O−, em que a estereoquímica de fósforo de ligação é conforme especificado. Em algumas modalidades, Nx é , e uma ligação internucleotídica que tem tal grupo Nx é uma ligação internucleotídica que tem a estrutura da fórmula II-d-1, em que PL é P=O, L é uma ligação covalente, e Y e Z são −O−, em que a estereoquímica de fósforo de ligação é conforme especificado. Em algumas modalidades, R' ou Rs é alquila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R' ou Rs é −CH3. Em algumas modalidades, R' ou Rs é −CH2(CH2)10CH3. Em algumas modalidades, Rs é −H. Em algumas modalidades, Nx é . Em algumas modalidades, Nx é .
[00568] Em algumas modalidades, P=WN é um grupo PN conforme descrito no presente documento. Em algumas modalidades, WN é Q-, Q-, ou Q-, em que cada variável é conforme descrito no presente documento
(por exemplo, em Nx). Em algumas modalidades, WN é Q−. Em algumas modalidades, conforme descrito no presente documento R' ou Rs é alquila opcionalmente substituída ou −H.
Em algumas modalidades, R' é −CH3. Em algumas modalidades, R' é −CH2(CH2)10CH3. Em algumas modalidades, Rs é −H.
Em algumas modalidades, WN é Q−. Em algumas modalidades, WN é
Q−. Em algumas modalidades, WN é =N−L−R5 em que cada variável é conforme descrito no presente documento.
Por exemplo, em algumas modalidades, L é −SO2−. Em algumas modalidades, L é −C(O)OCH2−. Em algumas modalidades, conforme descrito no presente documento, R5 é ou compreende um anel opcionalmente substituído.
Em algumas modalidades, R5 é R conforme descrito no presente documento.
Em algumas modalidades, R5 é fenila opcionalmente substituída.
Em algumas modalidades, R5 é 4-metilfenila.
Em algumas modalidades, R5 é 4-metoxifenila.
Em algumas modalidades, R5 é 4-aminofenila.
Em algumas modalidades, R5 é um anel heteroalifático opcionalmente substituído.
Em algumas modalidades, R5 é um anel heteroalifático com 3 a 10 membros opcionalmente substituído (por exemplo, 3, 4, 5, 6, 7, ou 8). Em algumas modalidades, R5 é um anel heteroalifático monocíclico saturado com 5 ou 6 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 3 heteroátomos.
Em algumas modalidades, o anel tem 5 membros.
Em algumas modalidades, o anel tem 6 membros.
Em algumas modalidades, o número de heteroátomo(s) de anel é 1. Em algumas modalidades, o número de heteroátomos de anel é 2. Em algumas modalidades,
um heteroátomo é oxigênio.
Em algumas modalidades, R5 é opcionalmente substituído.
Em algumas modalidades, R5 é opcionalmente substituído.
Em algumas modalidades, R5 é
. Em algumas modalidades, R5 é C1-30 alifático opcionalmente substituído.
Em algumas modalidades, R5 é C1-10 alquila opcionalmente substituída.
Em algumas modalidades, WN é . Em algumas modalidades, WN é . Em algumas modalidades, WN é . Em algumas modalidades, WN é . Em algumas modalidades, WN é
Q−. Em algumas modalidades, WN é Q−. In Em algumas modalidades, WN é Q−. Em algumas modalidades,
WN é Q−. Em algumas modalidades, WN é Q−. Em algumas modalidades, WN é Q−. Em algumas modalidades, Q− é PF6−.
[00569] Em algumas modalidades, −X−L−R1 em é . Em algumas modalidades, −X−L−R1 em é . Em algumas modalidades, G2 é −CH2Si(R)3 conforme descrito no presente documento. Em algumas modalidades, G2 é −CH2Si(Ph)2Me. Em algumas modalidades, −X−L−R1 em é . Em algumas modalidades, −X−L−R1 em é . Em algumas modalidades, G2 compreende um grupo removedor de elétrons conforme descrito no presente documento. Em algumas modalidades, G2 é −CH2SO2R, em que R não é −H. Em algumas modalidades, R é fenila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, G2 é −CH2SO2Ph. Em algumas modalidades, R é C1-6 alifático opcionalmente substituído, por exemplo, t-butila. Em algumas modalidades, conforme descrito no presente documento, R1 é −C(O)R'. Em algumas modalidades, R1 é −C(O)CH3. Em algumas modalidades, R1 é −H.
[00570] Em algumas modalidades, LPO é uma ligação fosfato natural. Em algumas modalidades, LPA é uma ligação internucleotídica fosforotioato Rp. Em algumas modalidades, LPA é uma ligação internucleotídica não negativamente carregada Rp, por exemplo, n001. Em algumas modalidades, LPB é uma ligação internucleotídica fosforotioato Sp. Em algumas modalidades, LPB é uma ligação internucleotídica não negativamente carregada Sp, por exemplo, n001. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo compreende uma ou mais ligações LPO. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo compreende uma ou mais ligações LPA. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo compreende uma ou mais ligações LPB. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo compreende uma ou mais ligações internucleotídicas independentemente selecionadas dentre LPO, LPA e LPB. Em algumas modalidades, cada ligação internucleotídica é independentemente selecionada dentre LPO, LPA e LPB. Em algumas modalidades, cada ligação internucleotídica é independentemente selecionada dentre LPA e LPB. Em algumas modalidades, pelo menos uma ligação internucleotídica é LPA ou LPB. Em algumas modalidades, cada ligação internucleotídica quiralmente controlada é independentemente selecionada dentre LPA e LPB.
[00571] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece oligonucleotídeos (por exemplo, oligonucleotídeos quiralmente controlados) e composições dos mesmos (por exemplo, composições de oligonucleotídeo quiralmente controladas), em que as ligações internucleotídicas dos oligonucleotídeos ou regiões dos mesmos são ou compreendem as seguintes ligações internucleotídicas (a partir de 5' para 3'): (LPX/LPO)t[(LPA)n(LPB)m]y, (LPX/LPO)t[(LPO)n(LPB)m]y, (LPX/LPO)t[(LPO/LPA)n(LPB)m]y, [(LPA)n(LPB)m]y, [(LPO)n(LPB)m]y, ((LPB)t[(LPA)n(LPB)m]y, (LPB)t[(LPO)n(LPB)m]y, (LPB)t[(LPO/LPA)n(LPB)m]y, [(LPA)n(LPB)m]y, [(LPO)n(LPB)m]y, [(LPO/LPA)n(LPB)m]y, (LPA)t(LPX)n(LPA)m, (LPA)t(LPB)n(LPA)m, (LPA)t[(LPX/LPO)n]y(LPA)m, (LPA)t[(LPB/LPX)n]y(LPA)m, (LPA)t[(LPB/LPO)n]y(LPA)m, (LPX/LPO)t(LPX)n(LPX/LPO)m, (LPX/LPO)t(LPB)n(LPX/LPO)m, (LPX/LPO)t[(LPX/LPO)n]y(LPX/LPO)m, (LPX/LPO)t[(LPB/LPO)n]y(LPX/LPO)m, (LPX/LPO)t[(LPB/LPO)n]y(LPX/LPO)m, (LPA/LPO)t(LPX)n(LPA/LPO)m, (LPA/LPO)t(LPB)n(LPA/LPO)m, (LPA/LPO)t[(LPX/LPO)n]y(LPA/LPO)m, (LPA/LPO)t[(LPB/LPO)n]y(LPA/LPO)m, ou (LPA/LPO)t[(LPB/LPO)n]y(LPA/LPO)m, ou uma combinação dos mesmos, em que: cada LPX é independentemente LPA ou LPB; e cada outra variável é independentemente conforme descrito no presente documento.
[00572] Em algumas modalidades, as ligações internucleotídicas de oligonucleotídeos fornecidos ou regiões dos mesmos compreendem ou são ligações internucleotídicas consecutivas [(LPA)n(LPB)m]y, [(LPO)n(LPB)m]y, (LPB)t[(LPA)n(LPB)m]y, ou (LPB)t[(LPO)n(LPB)m]y. Em algumas modalidades, as ligações internucleotídicas de oligonucleotídeos fornecidos ou regiões dos mesmos compreendem ou são ligações internucleotídicas consecutivas (LPA)(LPB)m. Em algumas modalidades, as ligações internucleotídicas de oligonucleotídeos fornecidos ou regiões dos mesmos compreendem ou são ligações internucleotídicas consecutivas [(LPA)(LPB)m]y. Em algumas modalidades, as ligações internucleotídicas de oligonucleotídeos fornecidos ou regiões dos mesmos compreendem ou são ligações internucleotídicas consecutivas (LPB)t(LPA)(LPB)m. Em algumas modalidades, cada açúcar entre duas das ligações internucleotídicas consecutivas independentemente não contém modificação 2'. Em algumas modalidades, cada açúcar entre as duas ligações internucleotídicas consecutivas é independentemente . Em algumas modalidades, n é 1. Em algumas modalidades, y é
1. Em algumas modalidades, y é 2 a 10. Em algumas modalidades, t é 1. Em algumas modalidades, t é 2 a 10. Em algumas modalidades, t é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10, n é 1, e m é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10. Em algumas modalidades, t é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10, n é 1, e m é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10. Em algumas modalidades, t é 2-10, n é 1 e m é 2 a 10. Em algumas modalidades, cada LPA é independentemente ou , ou uma forma de sal do mesmo. Em algumas modalidades, cada LPB é independentemente ou , ou uma forma de sal do mesmo. Em algumas modalidades, cada LPA é independentemente ou uma forma de sal do mesmo, e cada cada LPB é independentemente ou uma forma de sal do mesmo.
[00573] Em algumas modalidades, as ligações internucleotídicas de oligonucleotídeos fornecidos ou regiões dos mesmos compreendem ou são ligações internucleotídicas consecutivas (a partir de 5' para 3') (LPO)m(LPA/LPB)n, LPO(LPA/LPB)n, (LPO)m(LPB)n, LPO(LPB)n, [(LPO)m(LPA/LPB)n]y, [LPO(LPA/LPB)n]y, [(LPO)m(LPB)n]y, [LPO(LPB)n]y, (LPA/LPB)t(LPO)m(LPA/LPB)n, (LPA/LPB)tLPO(LPA/LPB)n, (LPA/LPB)t(LPO)m(LPB)n, (LPA/LPB)tLPO(LPB)n, (LPA/LPB)t[(LPO)m(LPA/LPB)n]y, (LPA/LPB)t[LPO(LPA/LPB)n]y, (LPA/LPB)t[(LPO)m(LPB)n]y, (LPA/LPB)t[LPO(LPB)n]y, (LPO)m(LPA/LPB)n(LPA/LPB)t, LPO(LPA/LPB)n(LPA/LPB)t, (LPO)m(LPB)n(LPA/LPB)t, LPO(LPB)n(LPA/LPB)t, [(LPO)m(LPA/LPB)n]y(LPA/LPB)t, [LPO(LPA/LPB)n]y(LPA/LPB)t, [(LPO)m(LPB)n]y(LPA/LPB)t, [LPO(LPB)n]y(LPA/LPB)t, (LPA/LPB)t[(LPO)m(LPA/LPB)n]y(LPA/LPB)t,
LPB(LPA/LPB)t[(LPO)m(LPA/LPB)n]y(LPA/LPB)tLPB, (LPA/LPB)t[(LPO)m(LPB)n]y(LPA/LPB)t, LPB(LPA/LPB)t[(LPO)m(LPB)n]y(LPA/LPB)tLPB, (LPA/LPB)t[(LPO)(LPA/LPB)]y(LPA/LPB)t, LPB(LPA/LPB)t[(LPO)(LPA/LPB)]y(LPA/LPB)tLPB, (LPA/LPB)t[(LPO)(LPB)]y(LPA/LPB)t, LPB(LPA/LPB)t[(LPO)(LPB)]y(LPA/LPB)tLPB, ou uma combinação dos mesmos, em que cada variável é independentemente conforme descrito no presente documento.
Em algumas modalidades, pelo menos um LPA/LPB de (LPA/LPB)t é LPA.
Em algumas modalidades, pelo menos um LPA/LPB de (LPA/LPB)t é LPB.
Em algumas modalidades, pelo menos um LPA/LPB de (LPA/LPB)t é LPA, e pelo menos um LPA/LPB of (LPA/LPB)t é LPB.
Em algumas modalidades, pelo menos um LPA/LPB de (LPA/LPB)m é LPA.
Em algumas modalidades, pelo menos um LPA/LPB de (LPA/LPB)m é LPB.
Em algumas modalidades, pelo menos um LPA/LPB de (LPA/LPB)m é LPA, e pelo menos um LPA/LPB de (LPA/LPB)m é LPB.
Em algumas modalidades, cada LPA/LPB de (LPA/LPB)m é LPB.
Em algumas modalidades, um açúcar ligado a uma ligação LPO em seu carbono 3’ compreende uma modificação 2', em que a modificação 2' não é 2'-F.
Em algumas modalidades, um açúcar ligado a uma ligação LPO em seu carbono 3’ é independentemente ou
, em que R2s não é −H ou −OH.
Em algumas modalidades, cada açúcar ligado a uma ligação LPO em seu carbono 3’ é independentemente ou , em que R2s não é −H ou −OH.
Em algumas modalidades, cada açúcar ligado a uma ligação LPO em seu carbono 3’ é independentemente , em que R2s não é −H ou −OH.
Em algumas modalidades, R4s é −H.
Em algumas modalidades, R2s não é −H, −F ou −OH.
Em algumas modalidades, cada açúcar ligado a uma ligação LPO em seu carbono
5 4 O 1 3 2
3’ é independentemente R2s , em que R2s não é −H, −F ou
−OH.
Em algumas modalidades, R2s é −OR, em que R é C1-6 alifático opcionalmente substituído.
Em algumas modalidades, R é C1-6 alquila opcionalmente substituída.
Em algumas modalidades, R2s é −OMe.
Em algumas modalidades, um açúcar de extremidade 5', um açúcar de extremidade 3' e/ou um açúcar entre LPA/LPB e LPA/LPB compreende uma modificação 2'-F.
Em algumas modalidades, um açúcar de extremidade 5', um açúcar de extremidade 3' e/ou um
5 4 O 1 3 2 açúcar entre LPA/LPB e LPA/LPB é R2s , em que R2s é −F.
Em algumas modalidades, cada açúcar compreende um 2'-F é ligado a uma ligação internucleotídica modificada, por exemplo, em seu carbono 3'. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica modificada é LPA ou LPB.
Em algumas modalidades, cada LPA é independentemente ou
, ou uma forma de sal do mesmo.
Em algumas modalidades, cada LPB é independentemente ou
, ou uma forma de sal do mesmo.
Em algumas modalidades, t é 2 a 10. Em algumas modalidades, cada LPA é independentemente ou uma forma de sal do mesmo, e cada LPB é independentemente ou uma forma de sal do mesmo.
Em algumas modalidades, cada ligação internucleotídica modificada em um oligonucleotídeo fornecido é independentemente LPO (em que −X−L−R1 não é −H),
, , ou , ou uma forma de sal do mesmo.
Em algumas modalidades, cada ligação internucleotídica modificada é independentemente ou , ou uma forma de sal do mesmo.
Em algumas modalidades, cada ligação internucleotídica modificada é independentemente ou , ou uma forma de sal do mesmo.
Em algumas modalidades, m é 1. Em algumas modalidades, cada m é 1. Em algumas modalidades, n é 2 ou mais.
Em algumas modalidades, cada n é 2 ou mais.
Em algumas modalidades, t é 1. Em algumas modalidades, t é 2 ou mais.
Em algumas modalidades, t é 3. Em algumas modalidades, t é 4. Em algumas modalidades, t é 5. Em algumas modalidades, t é 6. Em algumas modalidades, t é 7. Em algumas modalidades, t é 8. Em algumas modalidades, t é 9. Em algumas modalidades, t é 10. Em algumas modalidades, cada t é independentemente 2 ou mais. Em algumas modalidades, cada t é independentemente 3 ou mais. Em algumas modalidades, cada t é independentemente 4 ou mais. Em algumas modalidades, cada t é independentemente 5 ou mais.
[00574] Em algumas modalidades, cada um dentre LPO, LPA e LPB se liga independentemente a um açúcar 5’ através de seu carbono 3', e a um açúcar 3’ através de seu carbono 5', por exemplo, cada LPA é independentemente uma ligação internucleotídica que tem a estrutura de , , , ou , ou uma forma de sal do mesmo; cada LPB é independentemente uma ligação internucleotídica que tem a estrutura de , , , ou , ou uma forma de sal do mesmo. As estruturas de açúcar exemplificativas são descritas no presente documento, por exemplo, em algumas modalidades, cada porção química de açúcar independentemente tem a estrutura de 5 4 O 1 3 2 , , , , ou R2s , em que cada variável é independentemente conforme descrito na presente revelação.
[00575] Em algumas modalidades, LPO tem um padrão, localização, número, porcentagem, etc. conforme descrito no presente documento para uma ligação fosfato natural. Em algumas modalidades, LPA tem um padrão, localização, número, porcentagem, etc. conforme descrito no presente documento para uma ligação internucleotídica Rp. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica Rp é uma ligação internucleotídica fosforotioato Rp. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica Rp é uma ligação internucleotídica não negativamente carregada Rp (por exemplo, n001). Em algumas modalidades, LPB tem um padrão, localização, número, porcentagem, etc. conforme descrito no presente documento para uma ligação internucleotídica Sp. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica Sp é uma ligação internucleotídica fosforotioato Sp. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica Sp é uma ligação internucleotídica não negativamente carregada Sp (por exemplo, n001).
[00576] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece um oligonucleotídeo, em que a primeira ligação internucleotídica a partir da extremidade 5' é uma ligação internucleotídica de O5P, e cada outra ligação internucleotídica é independentemente selecionada dentre OP, *PD, *PDS, *PDR, *N, *NS e *NR, em que:
O5P é , ,
, LPO, LPA, LPB, ou uma forma de sal do mesmo; cada OP é independentemente LPO;
cada *PD é independentemente ,
, , ou uma forma de sal do mesmo;
cada *PDS é independentemente ou uma forma de sal do mesmo;
cada *PDR é independentemente ou uma forma de sal do mesmo; cada *N é independentemente , , , ou uma forma de sal do mesmo; cada *NS é independentemente ou uma forma de sal do mesmo; e cada *NR é independentemente ou uma forma de sal do mesmo; em que cada variável é independentemente conforme descrito no presente documento, em que −X−L−R1 não é −OH.
[00577] Em algumas modalidades, O5P é independentemente , ,
, LPO, LPA, LPB, ou uma forma de sal do mesmo.
Em algumas modalidades, cada OP é independentemente LPO.
Em algumas modalidades, cada *PD é independentemente ou uma forma de sal do mesmo.
Em algumas modalidades, cada *PDS é independentemente ou uma forma de sal do mesmo.
Em algumas modalidades, cada *PDR é independentemente ou uma forma de sal do mesmo.
Em algumas modalidades, cada *N é independentemente ou uma forma de sal do mesmo.
Em algumas modalidades, cada *NS é independentemente ou uma forma de sal do mesmo. Em algumas modalidades, cada *NR é independentemente ou uma forma de sal do mesmo.
[00578] Em algumas modalidades, X é −O−. Em algumas modalidades, −L−R1 contém um grupo removedor de elétrons. Em algumas modalidades, −L−R1 é −CH2G2, em que a unidade de metileno é opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, −L−R1 é −CH(R')G2. Em algumas modalidades, G2 não compreende um elemento quiral, e G2 compreende um grupo removedor de elétrons conforme descrito no presente documento, por exemplo, em algumas modalidades, G2 é −CH2CN (por exemplo, em O5P, OP, *PD, ou *N, em que o fósforo de ligação não é quiralmente controlado). Em algumas modalidades, G2 compreende um elemento quiral, por exemplo, em que o fósforo de ligação é quiralmente controlado. Em algumas modalidades, −X−L−R1 é de tal estrutura em que H−X−L−R1 é um reagente quiral descrito no presente documento, ou um reagente quiral com cap descrito no presente documento, em que um grupo amino do reagente quiral (tipicamente de −W1−H ou −W2−H, que compreende um grupo amino −NHG5−) é capeado, por exemplo, com −C(O)R' (substituindo um −H, por exemplo, −N[−C(O)R']G5−). Em algumas modalidades, −X−L−R1 é , , , ,
, , , , , ou
, em que cada variável é independentemente de acordo com a presente revelação.
Em algumas modalidades, −X−L−R1 é
, , , , ,
, ou , em que cada variável é independentemente de acordo com a presente revelação.
Em algumas modalidades, R1 é −H ou −C(O)R'. Em algumas modalidades, em que R1 é −H, por exemplo, em O5P.
Em algumas modalidades, R1 é −C(O)R' (por exemplo, em O5P, OP, *PDS, *PDR, *NS, *NR, etc.). Em algumas modalidades, R1 é CH3C(O)−. Em algumas modalidades, conforme descrito no presente documento, G2 é Em algumas modalidades, G2 é −C(R)2Si(R)3, em que −C(R)2− é −CH2− opcionalmente substituído, e cada R de −Si(R)3 é independentemente um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre C1-10 alifático, heterociclila, heteroarila e arila.
Em algumas modalidades, G2 é −CH2Si(Me)(Ph)2. Em algumas modalidades, por exemplo, em *PDS, *PDR, etc., G2 é −CH2Si(Me)(Ph)2. Em algumas modalidades, G2 compreende um grupo removedor de elétrons conforme descrito no presente documento.
Em algumas modalidades, G2 é −C(R)2SO2R', em que −C(R)2− é −CH2− opcionalmente substituído, e R' é um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre C1-10 alifático, heterociclila, heteroarila e arila. Em algumas modalidades, R' é fenila. Em algumas modalidades, por exemplo, em *NS, *NR, etc., G2 é −CH2SO2Ph.
[00579] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece um oligonucleotídeo ("um primeiro oligonucleotídeo"), que tem uma estrutura idêntica a de um oligonucleotídeo descrito em uma Tabela no presente documento ou um oligonucleotídeo descrito, por exemplo, nos documentos US 20150211006, US 20170037399, US 20180216107, US 20180216108, US 20190008986, WO 2017/015555, WO 2017/015575, WO 2017/062862, WO 2017/160741, WO 2017/192664, WO 2017/192679, WO 2017/210647, WO 2018/022473, WO 2018/067973, WO 2018/098264, WO 2018/223056, WO 2018/223073, WO 2018/223081, WO 2018/237194, WO 2019/032607, WO 2019/032612, etc., o oligonucleotídeo de cada um dos quais é incorporado ao presente documento a título de referência ("um segundo oligonucleotídeo"), cujo segundo oligonucleotídeo compreende ligações internucleotídicas modificadas, exceto pelo fato de que, em comparação com o segundo oligonucleotídeo, no primeiro oligonucleotídeo: a primeira ligação internucleotídica a partir da extremidade 5' é uma ligação internucleotídica de O5P; e para as ligações restantes: em cada localização em que existe uma ligação fosfato no segundo oligonucleotídeo, existe independentemente uma ligação de OP no primeiro oligonucleotídeo; em cada localização em que existe uma ligação fosforotioato estereoaleatória no segundo oligonucleotídeo,
existe independentemente uma ligação de *PD no primeiro oligonucleotídeo; em cada localização em que existe uma ligação fosforotioato Sp no segundo oligonucleotídeo, existe independentemente uma ligação de *PDS no primeiro oligonucleotídeo; em cada localização em que existe uma ligação fosforotioato Rp no segundo oligonucleotídeo, existe independentemente uma ligação de *PDR no primeiro oligonucleotídeo; em cada localização em que existe uma ligação internucleotídica não negativamente carregada estereoaleatória no segundo oligonucleotídeo, existe independentemente uma ligação de *N no primeiro oligonucleotídeo; em cada localização em que existe uma ligação internucleotídica não negativamente carregada Sp no segundo oligonucleotídeo, existe independentemente uma ligação de *NS no primeiro oligonucleotídeo; em cada localização em que existe uma ligação internucleotídica não negativamente carregada Rp no segundo oligonucleotídeo, existe independentemente uma ligação de *NR no primeiro oligonucleotídeo, e cada nucleobase no primeiro oligonucleotídeo é opcional e independentemente protegida (por exemplo, como na síntese de oligonucleotídeo), e cada porção química adicional, se houver, no primeiro oligonucleotídeo é opcional e independentemente protegida (por exemplo, −OH em uma porção química de carboidrato protegida como −OAc).
[00580] Em algumas modalidades, em cada localização em que existe uma ligação fosfato no segundo oligonucleotídeo, existe independentemente uma ligação de OP no primeiro oligonucleotídeo; em cada localização em que existe uma ligação fosforotioato estereoaleatória no segundo oligonucleotídeo, existe independentemente uma ligação de *PD no primeiro oligonucleotídeo; em cada localização em que existe uma ligação fosforotioato Sp no segundo oligonucleotídeo, existe independentemente uma ligação de *PDS no primeiro oligonucleotídeo; em cada localização em que existe uma ligação fosforotioato Rp no segundo oligonucleotídeo, existe independentemente uma ligação de *PDR no primeiro oligonucleotídeo; em cada localização em que existe uma ligação internucleotídica não negativamente carregada estereoaleatória no segundo oligonucleotídeo, existe independentemente uma ligação de *N no primeiro oligonucleotídeo; em cada localização em que existe uma ligação internucleotídica não negativamente carregada Sp no segundo oligonucleotídeo, existe independentemente uma ligação de *NS no primeiro oligonucleotídeo; em cada localização em que existe uma ligação internucleotídica não negativamente carregada Rp no segundo oligonucleotídeo, existe independentemente uma ligação de *NR no primeiro oligonucleotídeo, e cada nucleobase no primeiro oligonucleotídeo é opcional e independentemente protegida (por exemplo, como na síntese de oligonucleotídeo), e cada porção química adicional, se houver, no primeiro oligonucleotídeo é opcional e independentemente protegida (por exemplo, −OH em uma porção química de carboidrato protegida como −OAc); em que cada um dentre O5P, OP, *PD, *PDS, *PDR, *N, *NS e *NR é independentemente conforme descrito no presente documento.
Em algumas modalidades, tal oligonucleotídeo é ligado a um suporte opcionalmente através de um ligante, por exemplo, um ligante
CNA a CPG. Em algumas modalidades, conforme observado por aqueles versados na técnica, após um processo de remoção de −X−L−R1, uma ligação de O5P, OP, *PD, *PDS, *PDR, *N, *NS ou *NR se torna uma ligação que ela substitui. Em algumas modalidades, tais oligonucleotídeos (por exemplo, primeiro oligonucleotídeos) são intermediários úteis para preparar seus oligonucleotídeos correspondentes (por exemplo, segundos oligonucleotídeos). Em algumas modalidades, a presente revelação fornece a composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada de um primeiro oligonucleotídeo fornecido ou um estereoisômero do mesmo.
[00581] Em algumas modalidades, conforme observado por aqueles versados na técnica, WN tem tal estrutura em que sua porção química N tem os mesmos átomos não hidrogênio e conexões de átomos não hidrogênio que a porção química N da ligação internucleotídica não negativamente carregada que ela substitui (sem considerar a ligação simples, dupla ou tripla, etc.). Por exemplo, em algumas modalidades, PN em *N é (tal *N é n001P), e sua ligação internucleotídica não negativamente carregada correspondente é n001.
[00582] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido tem a mesma "Descrição" que um oligonucleotídeo listado em uma Tabela no presente documento (por exemplo, Tabela A1), exceto pelo fato de que: o oligonucleotídeo compreende pelo menos uma ligação de OP, e/ou em cada localização no oligonucleotídeo onde existe uma ligação fosfato, existe independentemente uma ligação de
OP, em que OP é ; em cada localização em que existe uma ligação fosforotioato estereoaleatória, existe independentemente uma ligação de *PD, em que *PD é ; em cada localização em que existe uma ligação fosforotioato Sp, existe independentemente uma ligação de *PDS,
em que *PDS é ; em cada localização em que existe uma ligação fosforotioato Rp, existe independentemente uma ligação de *PDR,
em que *PDR é ; em cada localização em que existe uma n001 estereoaleatória, existe independentemente uma ligação de *N,
em que *N é (conforme observado por aqueles versados na técnica, é associado a um ânion (por exemplo, Q− tal como PF6− (que pode ser um ânion em uma etapa de modificação))); em cada localização em que existe uma n001 Sp, existe independentemente uma ligação de *NS, em que *NS é
(conforme observado por aqueles versados na técnica, é associado a um ânion (por exemplo, Q− tal como PF6− (que pode ser um ânion em uma etapa de modificação))); e em cada localização em que existe uma n001 Rp, existe independentemente uma ligação de *NR, em que *NR é
(conforme observado por aqueles versados na técnica, é associado a um ânion (por exemplo, Q− tal como PF6− (que pode ser um ânion em uma etapa de modificação))); e o oligonucleotídeo é opcionalmente conectado a um suporte sólido, opcionalmente através de um ligante.
Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo é conectado a um suporte sólido, por exemplo, CPG, suporte de poliestireno, etc.
Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo é conectado a um suporte sólido através de um ligante, por exemplo, um ligante CNA.
Em algumas modalidades, tal um oligonucleotídeo é um oligonucleotídeo da fórmula O-I ou uma forma de sal do mesmo.
Certas Modalidades de Estereoquímica e Padrão de
Centros Quirais de Cadeia Principal
[00583] Entre outros fatores, a presente revelação fornece oligonucleotídeos que compreendem uma ou mais ligações internucleotídicas quiralmente controladas. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece composições de oligonucleotídeo quiralmente controladas. Em algumas modalidades, cada fósforo de ligação quiral dos oligonucleotídeos fornecidos é independentemente quiralmente controlado (estereocontrolado) (por exemplo, cada um tendo independentemente uma estereopureza (diastereopureza) de pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% (por exemplo, conforme tipicamente avaliado com o uso de um dímero adequado que compreende uma ligação internucleotídica que contém o fósforo de ligação, e as duas unidades de nucleosídeo que são ligadas pela ligação internucleotídica)). Em algumas modalidades, uma estereopureza é de pelo menos 90%. Em algumas modalidades, uma estereopureza é de pelo menos 95%. Em algumas modalidades, uma estereopureza é de pelo menos 96%. Em algumas modalidades, uma estereopureza é de pelo menos 97%. Em algumas modalidades, uma estereopureza é de pelo menos 98%. Em algumas modalidades, uma estereopureza é de pelo menos 99%. Com a capacidade de controlar totalmente a estereoquímica e outras modificações (por exemplo, modificações de base, modificações de açúcar, modificações de ligação internucleotídica, etc.), a presente revelação fornece tecnologias de propriedades e/ou atividades aprimoradas em comparação com as tecnologias não quiralmente controladas correspondentes.
[00584] Em algumas modalidades, o padrão de centros quirais de cadeia principal de uma região, particularmente, uma região de núcleo ou uma região intermediária, ou de um oligonucleotídeo (por exemplo, um oligonucleotídeo de uma pluralidade de oligonucleotídeos) é ou compreende (Np/Op)t[(Rp)n(Sp)m]y, (Np/Op)t[(Op)n(Sp)m]y, (Np/Op)t[(Op/Rp)n(Sp)m]y, (Sp)t[(Rp)n(Sp)m]y, (Sp)t[(Op)n(Sp)m]y, (Sp)t[(Op/Rp)n(Sp)m]y, [(Rp)n(Sp)m]y, [(Op)n(Sp)m]y, [(Op/Rp)n(Sp)m]y, (Rp)t(Np)n(Rp)m, (Rp)t(Sp)n(Rp)m, (Rp)t[(Np/Op)n]y(Rp)m, (Rp)t[(Sp/Np)n]y(Rp)m, (Rp)t[(Sp/Op)n]y(Rp)m, (Np/Op)t(Np)n(Np/Op)m, (Np/Op)t(Sp)n(Np/Op)m, (Np/Op)t[(Np/Op)n]y(Np/Op)m, (Np/Op)t[(Sp/Op)n]y(Np/Op)m, (Np/Op)t[(Sp/Op)n]y(Np/Op)m, (Rp/Op)t(Np)n(Rp/Op)m, (Rp/Op)t(Sp)n(Rp/Op)m, (Rp/Op)t[(Np/Op)n]y(Rp/Op)m, (Rp/Op)t[(Sp/Op)n]y(Rp/Op)m, ou (Rp/Op)t[(Sp/Op)n]y(Rp/Op)m (a menos que especificado de outro modo, a descrição dos padrões de modificações e estereoquímica são a partir de 5' para 3', conforme tipicamente usado na técnica), em que Sp indica configuração S de um fósforo de ligação quiral de uma ligação internucleotídica quiral modificada, Rp indica configuração R de um fósforo de ligação quiral de uma ligação internucleotídica quiral modificada, Op indica um fósforo de ligação quiral de uma ligação fosfato natural, cada Np é independentemente Rp, ou Sp, e cada um dentre m, n, t e y é independentemente 1 a 50 conforme descrito na presente revelação.
Em algumas modalidades, um padrão de centros quirais de cadeia principal é ou compreende [(Rp/Op)n(Sp)m]y.
Em algumas modalidades, um padrão de centros quirais de cadeia principal é ou compreende [(Rp)n(Sp)m]y.
Em algumas modalidades, um padrão de centros quirais de cadeia principal é ou compreende [(Op)n(Sp)m]y.
Em algumas modalidades, um padrão de centros quirais de cadeia principal é ou compreende
(Np/Op)t[(Rp/Op)n(Sp)m]y.
Em algumas modalidades, um padrão de centros quirais de cadeia principal é ou compreende (Np/Op)t[(Rp)n(Sp)m]y.
Em algumas modalidades, um padrão de centros quirais de cadeia principal é ou compreende (Np/Op)t[(Op)n(Sp)m]y.
Em algumas modalidades, um padrão de centros quirais de cadeia principal é ou compreende (Sp)t[(Rp/Op)n(Sp)m]y.
Em algumas modalidades, um padrão de centros quirais de cadeia principal é ou compreende (Sp)t[(Rp)n(Sp)m]y.
Em algumas modalidades, um padrão de centros quirais de cadeia principal é ou compreende (Sp)t[(Op)n(Sp)m]y.
Em algumas modalidades, um padrão de centros quirais de cadeia principal é ou compreende (Rp)t(Np)n(Rp)m.
Em algumas modalidades, um padrão de centros quirais de cadeia principal é ou compreende (Rp)t(Sp)n(Rp)m.
Em algumas modalidades, um padrão de centros quirais de cadeia principal é ou compreende (Rp)t[(Np/Op)n]y(Rp)m.
Em algumas modalidades, um padrão de centros quirais de cadeia principal é ou compreende (Rp)t[(Sp/Np)n]y(Rp)m.
Em algumas modalidades, um padrão de centros quirais de cadeia principal é ou compreende (Rp)t[(Sp/Op)n]y(Rp)m.
Em algumas modalidades, um padrão de centros quirais de cadeia principal é ou compreende (Np/Op)t(Np)n(Np/Op)m.
Em algumas modalidades, um padrão de centros quirais de cadeia principal é ou compreende (Np/Op)t(Sp)n(Np/Op)m.
Em algumas modalidades, um padrão de centros quirais de cadeia principal é ou compreende (Np/Op)t[(Np/Op)n]y(Np/Op)m.
Em algumas modalidades, um padrão de centros quirais de cadeia principal é ou compreende (Np/Op)t[(Sp/Op)n]y(Np/Op)m.
Em algumas modalidades, um padrão de centros quirais de cadeia principal é ou compreende (Np/Op)t[(Sp/Op)n]y(Np/Op)m.
Em algumas modalidades, um padrão de centros quirais de cadeia principal é ou compreende (Rp/Op)t(Np)n(Rp/Op)m.
Em algumas modalidades, um padrão de centros quirais de cadeia principal é ou compreende (Rp/Op)t(Sp)n(Rp/Op)m.
Em algumas modalidades, um padrão de centros quirais de cadeia principal é ou compreende (Rp/Op)t[(Np/Op)n]y(Rp/Op)m.
Em algumas modalidades, um padrão de centros quirais de cadeia principal é ou compreende (Rp/Op)t[(Sp/Op)n]y(Rp/Op)m.
Em algumas modalidades, um padrão de centros quirais de cadeia principal é ou compreende (Rp)(Rp/Op)t[(Sp/Op)n]y(Rp/Op)m(Rp). Em algumas modalidades, n é 1. Por exemplo, em algumas modalidades, um padrão de centros quirais de cadeia principal é ou compreende (Sp)t[Op(Sp)m]y; em algumas modalidades, um padrão de centros quirais de cadeia principal é ou compreende (Sp)t[Rp(Sp)m]y.
Em algumas modalidades, y é 1. Em algumas modalidades, m é 2 ou mais.
Em algumas modalidades, t é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10, n é 1, e m é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10. Em algumas modalidades, t é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10, n é 1, e m é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10. Em algumas modalidades, há pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ligações internucleotídicas anteriores, e há pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ligações internucleotídicas após Rp ou Op.
Em algumas modalidades, há pelo menos 2 ligações internucleotídicas anteriores e/ou posteriores.
Em algumas modalidades, há pelo menos 3 ligações internucleotídicas anteriores e/ou posteriores.
Em algumas modalidades, há pelo menos 4 ligações internucleotídicas anteriores e/ou posteriores.
Em algumas modalidades, há pelo menos 5 ligações internucleotídicas anteriores e/ou posteriores.
Em algumas modalidades, há pelo menos 6 ligações internucleotídicas anteriores e/ou posteriores. Em algumas modalidades, há pelo menos 7 ligações internucleotídicas anteriores e/ou posteriores. Em algumas modalidades, há pelo menos 8 ligações internucleotídicas anteriores e/ou posteriores. Em algumas modalidades, há pelo menos 9 ligações internucleotídicas anteriores e/ou posteriores. Em algumas modalidades, há pelo menos 10 ligações internucleotídicas anteriores e/ou posteriores. Em algumas modalidades, y é 1. Em algumas modalidades, y é 2 ou mais. Em algumas modalidades, y é 2, 3, 4, ou 5. Em algumas modalidades, y é 2. Em algumas modalidades, y é 3. Em algumas modalidades, y é 4. Em algumas modalidades, y é 5. Em algumas modalidades, uma região que tem tal um padrão de centros quirais de cadeia principal não contém modificação 2’ em suas porções químicas de açúcar, em que a modificação 2' é 2'-OR1 ou 2'-O−L−, em que R1 não é hidrogênio e L compreende um átomo de carbono e se conecta a outro átomo de carbono da porção química de açúcar. Em algumas modalidades, cada porção química de açúcar de uma região que tem tal padrão de centros quirais de cadeia principal é independentemente uma porção química de açúcar de DNA natural ( . Conforme observado por uma pessoa de habilidade comum na técnica, para uma porção química de açúcar de DNA natural em DNA natural, C1 é conectado a uma base, C3 e C5 são, cada um, independentemente conectados às ligações internucleotídicas ou −OH (quando na extremidade 5' ou 3')). Certos benefícios/vantagens fornecidos por tais padrões de centros quirais de cadeia principal são descritos nos documentos US 20170037399, WO 2017/015555 e WO 2017/062862.
[00585] Em algumas modalidades, y, t, n e m são, cada um, independentemente 1 a 20, conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, y é 1. Em algumas modalidades, y é pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15. Em algumas modalidades, y é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15. Em algumas modalidades, y é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Em algumas modalidades, y é 1. Em algumas modalidades, y é 2. Em algumas modalidades, y é 3. Em algumas modalidades, y é 4. Em algumas modalidades, y é 5. Em algumas modalidades, y é 6. Em algumas modalidades, y é 7. Em algumas modalidades, y é 8. Em algumas modalidades, y é 9. Em algumas modalidades, y é 10.
[00586] Em algumas modalidades, n é 1. Em algumas modalidades, n é pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15. Em algumas modalidades, n é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ou 15. Em algumas modalidades, n é 1 a 10. Em algumas modalidades, n é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8. Em algumas modalidades, n é 1. Em algumas modalidades, n é 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8. Em algumas modalidades, n é 3, 4, 5, 6, 7 ou 8. Em algumas modalidades, n é 4, 5, 6, 7 ou 8. Em algumas modalidades, n é 5, 6, 7 ou 8. Em algumas modalidades, n é 6, 7 ou 8. Em algumas modalidades, n é 7 ou
8. Em algumas modalidades, n é 1. Em algumas modalidades, n é
2. Em algumas modalidades, n é 3. Em algumas modalidades, n é
4. Em algumas modalidades, n é 5. Em algumas modalidades, n é
6. Em algumas modalidades, n é 7. Em algumas modalidades, n é
8. Em algumas modalidades, n é 9. Em algumas modalidades, n é
10.
[00587] Em algumas modalidades, m é 0 a 50. Em algumas modalidades, m é 1 a 50. Em algumas modalidades, m é 1. Em algumas modalidades, m é 2 a 50. Em algumas modalidades,
m é pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ou
15. Em algumas modalidades, m é 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8. Em algumas modalidades, m é 3, 4, 5, 6, 7 ou 8. Em algumas modalidades, m é 4, 5, 6, 7 ou 8. Em algumas modalidades, m é 5, 6, 7 ou 8. Em algumas modalidades, m é 6, 7 ou 8. Em algumas modalidades, m é 7 ou 8. Em algumas modalidades, m é 0. Em algumas modalidades, m é 1. Em algumas modalidades, m é 2. Em algumas modalidades, m é 3. Em algumas modalidades, m é 4. Em algumas modalidades, m é 5. Em algumas modalidades, m é 6. Em algumas modalidades, m é 7. Em algumas modalidades, m é 8. Em algumas modalidades, m é 9. Em algumas modalidades, m é 10. Em algumas modalidades, m é 11. Em algumas modalidades, m é 12. Em algumas modalidades, m é 13. Em algumas modalidades, m é
14. Em algumas modalidades, m é 15. Em algumas modalidades, m é 16. Em algumas modalidades, m é 17. Em algumas modalidades, m é 18. Em algumas modalidades, m é 19. Em algumas modalidades, m é 20. Em algumas modalidades, m é 21. Em algumas modalidades, m é 22. Em algumas modalidades, m é 23. Em algumas modalidades, m é 24. Em algumas modalidades, m é 25. Em algumas modalidades, m é pelo menos 2. Em algumas modalidades, m é pelo menos 3. Em algumas modalidades, m é pelo menos 4. Em algumas modalidades, m é pelo menos 5. Em algumas modalidades, m é pelo menos 6. Em algumas modalidades, m é pelo menos 7. Em algumas modalidades, m é pelo menos 8. Em algumas modalidades, m é pelo menos 9. Em algumas modalidades, m é pelo menos 10. Em algumas modalidades, m é pelo menos 11. Em algumas modalidades, m é pelo menos 12. Em algumas modalidades, m é pelo menos 13. Em algumas modalidades, m é pelo menos 14. Em algumas modalidades, m é pelo menos 15. Em algumas modalidades, m é pelo menos 16. Em algumas modalidades, m é pelo menos 17. Em algumas modalidades,
m é pelo menos 18. Em algumas modalidades, m é pelo menos 19. Em algumas modalidades, m é pelo menos 20. Em algumas modalidades, m é pelo menos 21. Em algumas modalidades, m é pelo menos 22. Em algumas modalidades, m é pelo menos 23. Em algumas modalidades, m é pelo menos 24. Em algumas modalidades, m é pelo menos 25. Em algumas modalidades, m é pelo menos maior que 25.
[00588] Em algumas modalidades, t é 1 a 20. Em algumas modalidades, t é 1. Em algumas modalidades, t é pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ou 15. Em algumas modalidades, t é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ou 15. Em algumas modalidades, t é 1 a 5. Em algumas modalidades, t é 2. Em algumas modalidades, t é 3. Em algumas modalidades, t é 4. Em algumas modalidades, t é 5. Em algumas modalidades, t é 6. Em algumas modalidades, t é 7. Em algumas modalidades, t é 8. Em algumas modalidades, t é 9. Em algumas modalidades, t é 10. Em algumas modalidades, t é 11. Em algumas modalidades, t é 12. Em algumas modalidades, t é
13. Em algumas modalidades, t é 14. Em algumas modalidades, t é 15. Em algumas modalidades, t é 16. Em algumas modalidades, t é 17. Em algumas modalidades, t é 18. Em algumas modalidades, t é 19. Em algumas modalidades, t é 20.
[00589] Em algumas modalidades, cada um dentre t e m é independentemente pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ou 15. Em algumas modalidades, cada um dentre t e m é independentemente pelo menos 3. Em algumas modalidades, cada um dentre t e m é independentemente pelo menos 4. Em algumas modalidades, cada um dentre t e m é independentemente pelo menos 5. Em algumas modalidades, cada um dentre t e m é independentemente pelo menos 6. Em algumas modalidades, cada um dentre t e m é independentemente pelo menos 7. Em algumas modalidades, cada um dentre t e m é independentemente pelo menos 8. Em algumas modalidades, cada um dentre t e m é independentemente pelo menos 9. Em algumas modalidades, cada um dentre t e m é independentemente pelo menos 10.
[00590] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos compreendem um bloco, por exemplo, um primeiro bloco, um flanco 5', etc., que tem um padrão de centros quirais de cadeia principal de ou que compreende uma seção t, por exemplo, (Sp)t, (Rp)t, (Np/Op)t, (Rp/Op)t, etc., um bloco, por exemplo, um segundo bloco, um núcleo, etc., que tem um padrão de centros quirais de cadeia principal de ou que compreende uma seção y ou n, por exemplo, (Np)n, (Sp)n, [(Np/Op)n]y, [(Rp/Op)n]y, [(Sp/Op)n]y, etc., e um bloco, por exemplo, um terceiro bloco, um flanco 3’, etc., que tem um padrão de centros quirais de cadeia principal de ou que compreende uma seção m, por exemplo, (Sp)m, (Rp)m, (Np/Op)m, (Rp/Op)m, etc.
[00591] Em algumas modalidades, uma seção t, y, n ou m que compreende Np ou Rp, por exemplo, (Rp)t, (Np/Op)t, (Rp/Op)t, (Np)n, [(Np/Op)n]y, [(Rp/Op)n]y, (Rp)m, (Np/Op)m, (Rp/Op)m, etc. compreende independentemente pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95%, ou 100% de Rp. Em algumas modalidades, uma seção t ou m que compreende Np ou Rp compreende independentemente pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95%, ou 100% de Rp. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos compreendem pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95%, ou 100% de Rp. Em algumas modalidades, uma porcentagem é pelo menos 10%. Em algumas modalidades, uma porcentagem é pelo menos 20%. Em algumas modalidades, uma porcentagem é pelo menos 30%. Em algumas modalidades, uma porcentagem é pelo menos 40%. Em algumas modalidades, uma porcentagem é pelo menos 50%. Em algumas modalidades, uma porcentagem é pelo menos 60%. Em algumas modalidades, uma porcentagem é pelo menos 70%. Em algumas modalidades, uma porcentagem é pelo menos 75%. Em algumas modalidades, uma porcentagem é pelo menos 80%. Em algumas modalidades, uma porcentagem é pelo menos 85%. Em algumas modalidades, uma porcentagem é pelo menos 90%. Em algumas modalidades, uma porcentagem é pelo menos 95%. Em algumas modalidades, uma porcentagem é 100%.
[00592] Em algumas modalidades, cada porção química de açúcar ligada a um fósforo de ligação Rp ou Op em 3' compreende independentemente uma modificação. Em algumas modalidades, cada porção química de açúcar ligada a um fósforo de ligação Rp ou Op em 5' compreende independentemente uma modificação. Em algumas modalidades, cada porção química de açúcar ligada a um fósforo de ligação Rp em 3' compreende independentemente uma modificação. Em algumas modalidades, cada porção química de açúcar ligada a um fósforo de ligação Rp em 5' compreende independentemente uma modificação. Em algumas modalidades, cada porção química de açúcar ligada um fósforo de ligação Op em 3' compreende independentemente uma modificação. Em algumas modalidades, cada porção química de açúcar ligada um fósforo de ligação Op em 5' compreende independentemente uma modificação. Em algumas modalidades, cada porção química de açúcar ligada a um fósforo de ligação Sp em 3' compreende independentemente uma modificação. Em algumas modalidades, cada porção química de açúcar ligada a um fósforo de ligação Sp em 5' compreende independentemente uma modificação. Em algumas modalidades, cada porção química de açúcar compreende independentemente uma modificação. Em algumas modalidades, uma modificação é uma modificação 2’. Em algumas modalidades, uma modificação é 2'-OR, em que R não é hidrogênio. Em algumas modalidades, uma modificação é 2'-OR, em que R é C1-6 alquila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, uma modificação é 2'-OR, em que R é C1-6 alquila substituída. Em algumas modalidades, uma modificação é 2'-OR, em que R é C2-6 alquila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, uma modificação é 2'-OR, em que R é C2-6 alquila substituída. Em algumas modalidades, R é −CH2CH2OMe. Em algumas modalidades, uma modificação é ou compreende −L− que conecta dois carbonos de açúcar, por exemplo, aqueles encontrados em LNA. Em algumas modalidades, uma modificação é −L− que conecta C2 e C4 de uma porção química de açúcar. Em algumas modalidades, L é −CH2−CH(R)−, em que R é conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, L é −CH2−CH(R)−, em que R é conforme descrito na presente revelação e não é hidrogênio. Em algumas modalidades, L é −CH2−(R)−CH(R)−, em que R é conforme descrito na presente revelação e não é hidrogênio. Em algumas modalidades, L é −CH2−(S)−CH(R)−, em que R é conforme descrito na presente revelação e não é hidrogênio. Em algumas modalidades, um bloco, um flanco, um núcleo, ou um oligonucleotídeo tem modificações de açúcar conforme descrito na presente revelação.
[00593] Em algumas modalidades, um padrão fornecido de centros quirais de cadeia principal é ou compreende (Rp/Sp)-(Todos Rp ou Todos Sp)-(Rp/Sp), em que cada
Rp/Sp é independentemente Rp ou Sp. Em algumas modalidades, um padrão fornecido de centros quirais de cadeia principal é ou compreende (Rp)-(Todos Sp)-(Rp). Em algumas modalidades, um padrão fornecido de centros quirais de cadeia principal é ou compreende (Sp)-(Todos Sp)-(Sp). Em algumas modalidades, um padrão fornecido de centros quirais de cadeia principal é ou compreende (Sp)-(Todos Rp)-(Sp). Em algumas modalidades, um padrão fornecido de centros quirais de cadeia principal é ou compreende (Rp/Sp)-((Sp)m(Rp)n de repetição)-(Rp/Sp). Em algumas modalidades, um padrão fornecido de centros quirais de cadeia principal é ou compreende (Rp/Sp)-(SpSpRp de repetição)-(Rp/Sp). Blocos
[00594] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos compreendem um ou mais blocos, caracterizados por modificações de base, modificações de açúcar, tipos de ligações internucleotídicas, estereoquímica de fósforo de ligação, etc. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos compreendem ou são de uma estrutura de primeiro bloco 5'-segundo bloco-terceiro bloco 3'. Em algumas modalidades, um primeiro bloco é um flanco 5'. Em algumas modalidades, um primeiro bloco é região de extremidade 5'. Em algumas modalidades, um segundo bloco é um núcleo. Em algumas modalidades, um segundo bloco é uma região intermediária entre uma extremidade 5' e uma região de extremidade 3'. Em algumas modalidades, um terceiro bloco é um flanco 3'. Em algumas modalidades, um terceiro bloco é uma região de extremidade 3'. Cada um dentre um flanco 5', região de extremidade 5', núcleo, região intermediária, flanco 3', e região de extremidade 3' pode ser independentemente um bloco.
[00595] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos compreendem ou são de uma estrutura de flanco 5'-núcleo-flanco 3', flanco 5'-núcleo 3' ou núcleo 5'-flanco 3'. Em algumas modalidades, um primeiro bloco, um segundo bloco, um terceiro bloco, um flanco (por exemplo, um flanco 5', um flanco 3') e/ou um núcleo de oligonucleotídeos fornecidos são, cada um, independentemente um bloco ou compreendem um ou mais blocos conforme descrito na presente revelação.
[00596] Vários blocos, flancos 5', flancos 3’ e núcleos podem ser utilizados de acordo com a presente revelação, inclusive aqueles descritos nos documentos US 20150211006, US 20150211006, WO 2017015555, WO 2017015575, WO 2017062862, WO 2017160741, os blocos, flancos 5', flancos 3’ e núcleos de cada um dos quais são incorporados ao presente documento a título de referência.
[00597] Em algumas modalidades, um bloco é um bloco de estereoquímica de fósforo de ligação. por exemplo, em algumas modalidades, um bloco compreende apenas fósforo de ligação Rp, Sp ou Op. Em algumas modalidades, um bloco é um bloco Rp que compreende apenas fósforo de ligação Rp. Em algumas modalidades, um bloco é um bloco Rp/Op que compreende apenas fósforo de ligação Rp/Op. Em algumas modalidades, um bloco é um bloco Sp/Op que compreende apenas fósforo de ligação Sp/Op. Em algumas modalidades, um bloco é um bloco Op. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo, ou uma região do mesmo (um primeiro bloco, um segundo bloco, um terceiro bloco, um flanco, um núcleo, etc.) compreende um ou mais de um bloco Rp, um bloco Sp e/ou um bloco Op. Em algumas modalidades, um bloco compreende um ou mais, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,
8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, ou mais, fósforos de ligação.
[00598] Em algumas modalidades, um bloco é um bloco de modificação de açúcar. Em algumas modalidades, um bloco é um bloco de modificação 2' em que cada porção química de açúcar do bloco compreende independentemente a modificação 2'. Em algumas modalidades, uma modificação 2' é 2'-OR em que R é conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, uma modificação 2' é a 2'-OR em que R não é hidrogênio. Em algumas modalidades, uma modificação 2' é 2'- OMe. Em algumas modalidades, uma modificação 2' é 2'-MOE. Em algumas modalidades, uma modificação é uma modificação LNA. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo, ou uma região do mesmo (um primeiro bloco, um segundo bloco, um terceiro bloco, um flanco, um núcleo, etc.) compreende um ou mais blocos de modificação de açúcar, cada uma independentemente de sua própria modificação de açúcar. Em algumas modalidades, um bloco compreende um ou mais, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, ou mais, porções químicas de açúcar.
[00599] Conforme ilustrado no presente documento, um bloco pode ter vários comprimentos. Em algumas modalidades, um bloco tem 1 a 30, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 nucleobases de comprimento. Em algumas modalidades, um primeiro bloco 5'-segundo bloco-terceiro bloco 3', ou um flanco 5'-núcleo-flanco 3' é de 5-10-5, 3-10-4, 3-10-6, 4-12-4, etc.
[00600] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo ou um bloco ou região do mesmo (por exemplo, uma região de extremidade 5', um flanco 5', uma região intermediária, uma região de núcleo, uma região de extremidade 3', um anel 3', etc.) compreende um ou mais, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais, ligações internucleotídicas não negativamente carregadas conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido compreende duas ou mais, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais, ligações internucleotídicas não negativamente carregadas consecutivas. Em algumas modalidades, um bloco ou região compreende duas ou mais, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais, ligações internucleotídicas não negativamente carregadas consecutivas. Em algumas modalidades, o número é 1. Em algumas modalidades, o número é 2. Em algumas modalidades, o número é 3. Em algumas modalidades, o número é
4. Em algumas modalidades, o número é 5. Em algumas modalidades, o número é 6. Em algumas modalidades, o número é
7. Em algumas modalidades, o número é 8. Em algumas modalidades, o número é 9. Em algumas modalidades, o número é 10 ou mais. Em algumas modalidades, cada ligação internucleotídica entre unidades de nucleosídeo em um bloco, por exemplo, uma região de extremidade 5', um flanco 5', é uma ligação internucleotídica não negativamente carregada, exceto a primeira ligação internucleotídica entre duas unidades de nucleosídeo do bloco a partir da extremidade 5' do bloco. Em algumas modalidades, cada ligação internucleotídica entre unidades de nucleosídeo em um bloco, por exemplo, uma região de extremidade 3', um flanco 3', é uma ligação internucleotídica não negativamente carregada, exceto a primeira ligação internucleotídica entre duas unidades de nucleosídeo do bloco a partir da extremidade 3' do bloco.
Em algumas modalidades, cada ligação internucleotídica entre unidades de nucleosídeo em uma região, por exemplo, uma região de extremidade 5', um flanco 5', é uma ligação internucleotídica não negativamente carregada, exceto a primeira ligação internucleotídica entre duas unidades de nucleosídeo da região a partir da extremidade 5' da região.
Em algumas modalidades, cada ligação internucleotídica entre unidades de nucleosídeo em uma região, por exemplo, uma região de extremidade 3', um flanco 3', é uma ligação internucleotídica não negativamente carregada, exceto a primeira ligação internucleotídica entre duas unidades de nucleosídeo da região a partir da extremidade 3' da região.
Em algumas modalidades, cada ligação internucleotídica em uma região ou bloco, por exemplo, uma região de extremidade 5', um flanco 5', uma região intermediária, uma região de núcleo, uma região de extremidade 3', um anel 3', etc., é independentemente uma ligação internucleotídica não negativamente carregada, uma ligação internucleotídica fosfato natural ou uma ligação internucleotídica quiral Rp.
Em algumas modalidades, cada ligação internucleotídica em uma região ou bloco é independentemente uma ligação internucleotídica não negativamente carregada, uma ligação internucleotídica fosfato natural ou uma ligação internucleotídica fosforotioato Rp.
Em algumas modalidades, cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou mais das ligações internucleotídicas de um oligonucleotídeo ou uma região ou bloco, por exemplo, uma região de extremidade 5', um flanco 5', uma região intermediária, uma região de núcleo, uma região de extremidade 3', um anel 3', etc., é independentemente uma ligação internucleotídica não negativamente carregada, uma ligação internucleotídica fosfato natural ou uma ligação internucleotídica quiral Rp.
Em algumas modalidades, cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou mais das ligações internucleotídicas de um oligonucleotídeo ou uma região ou bloco é independentemente uma ligação internucleotídica não negativamente carregada, uma ligação internucleotídica fosfato natural ou uma ligação internucleotídica fosforotioato Rp.
Em algumas modalidades, cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou mais das ligações internucleotídicas de um oligonucleotídeo ou uma região ou bloco é independentemente uma ligação internucleotídica não negativamente carregada ou uma ligação internucleotídica fosfato natural.
Em algumas modalidades, cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou mais das ligações internucleotídicas de um oligonucleotídeo ou uma região ou bloco é independentemente uma ligação internucleotídica não negativamente carregada.
Em algumas modalidades, a porcentagem é 45% ou mais.
Em algumas modalidades, a porcentagem é 50% ou mais.
Em algumas modalidades, a porcentagem é 60% ou mais.
Em algumas modalidades, a porcentagem é 70% ou mais.
Em algumas modalidades, a porcentagem é 80% ou mais.
Em algumas modalidades, a porcentagem é 90% ou mais.
Em algumas modalidades, uma região ou bloco é um flanco.
Em algumas modalidades, uma região ou bloco é um flanco 5'. Em algumas modalidades, uma região ou bloco é um flanco 3'. Em algumas modalidades, uma região ou bloco é um núcleo.
Conforme descrito no presente documento, uma região ou bloco, por exemplo, um flanco, um núcleo, etc., pode ter vários comprimentos que compreendem, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais nucleobases. Em algumas modalidades, cada nucleobase é independentemente A, T, C, G, U opcionalmente substituído ou um tautômero opcionalmente substituído de A, T, C, G, ou U. Comprimento
[00601] Conforme descrito na presente revelação, os oligonucleotídeos fornecidos podem ser de vários comprimentos, por exemplo, 2 a 200, 10 a 15, 10 a 25, 15 a 20, 15 a 25, 15 a 40, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, nucleobases de comprimento, em que cada nucleobase é independentemente A, T, C, G, ou U opcionalmente substituído, ou um tautômero opcionalmente substituído de A, T, C, G, ou U. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos, por exemplo, o oligonucleotídeo de uma pluralidade nas composições de oligonucleotídeo quiralmente controladas, tem 15 nucleobases de comprimento. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos têm 16 nucleobases de comprimento. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos têm 17 nucleobases de comprimento. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos têm 18 nucleobases de comprimento. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos têm 19 nucleobases de comprimento. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos têm 20 nucleobases de comprimento. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos têm 21 nucleobases de comprimento. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos têm 22 nucleobases de comprimento. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos têm 23 nucleobases de comprimento. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos têm 24 nucleobases de comprimento. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos têm 25 nucleobases de comprimento.
[00602] Conforme descrito na presente revelação, os oligonucleotídeos fornecidos, oligonucleotídeos de uma pluralidade nas composições de oligonucleotídeo quiralmente controladas, podem compreender várias modificações, por exemplo, modificações de base, modificações de açúcar, modificações de ligação internucleotídica, etc. Em algumas modalidades, a composição de oligonucleotídeo compreende pelo menos um nucleotídeo modificado, pelo menos uma porção química de açúcar modificada, pelo menos uma porção química de morfolino, pelo menos um 2'-desoxirribonucleotídeo, pelo menos um nucleotídeo bloqueado e/ou pelo menos um nucleotídeo bicíclico. Nucleobases
[00603] Em algumas modalidades, uma nucleobase é uma nucleobase natural. Em algumas modalidades, uma nucleobase é uma nucleobase modificada (nucleobase não natural). Em algumas modalidades, uma nucleobase, por exemplo, BA, nos oligonucleotídeos fornecidos é uma nucleobase natural (por exemplo, adenina, citosina, guanosina, timina, ou uracila) ou uma nucleobase modificada derivada de uma nucleobase natural, por exemplo, adenina, citosina, guanosina, timina, ou uracila opcionalmente substituída, ou formas tautoméricas das mesmas. Os exemplos incluem, porém sem limitação, uracila, timina, adenina, citosina, e guanina, e formas tautoméricas das mesmas, que têm seus respectivos grupos amino protegidos por grupos protetores, por exemplo, um ou mais dentre −R, −C(O)R, etc. Os grupos protetores exemplificativos, incluindo aqueles úteis para síntese de oligonucleotídeo, são amplamente conhecidos na técnica e podem ser utilizados de acordo com a presente revelação. Em algumas modalidades, uma nucleobase protegida e/ou derivado é selecionado dentre nucleobases com um ou mais grupos protetores de acila, 2-fluorouracila, 2-fluorocitosina, 5-bromouracila, 5-iodouracila, 2,6-diaminopurina, azacitosina, análogos de pirimidina, tais como pseudoisocitosina e pseudouracila e outras nucleobases modificadas, tais como purinas 8- substituídas, xantina ou hipoxantina (as duas últimas sendo os produtos de degradação natural). As nucleobases modificadas exemplificativas também são reveladas em Chiu e Rana, RNA, 2003, 9, 1034-1048, Limbach et al. Nucleic Acids Research, 1994, 22, 2183-2196 e Revankar e Rao, Comprehensive Natural Products Chemistry, vol. 7, 313. Em algumas modalidades, uma nucleobase modificada é uracila, timina, adenina, citosina ou guanina substituída. Em algumas modalidades, uma nucleobase modificada é uma substituição funcional, por exemplo, em termos de ligação ao hidrogênio e/ou pareamento de bases, de uracila, timina, adenina, citosina ou guanina. Em algumas modalidades, uma nucleobase é uracila, timina, adenina, citosina, 5- metilcitosina, ou guanina opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, uma nucleobase é uracila, timina, adenina, citosina, 5-metilcitosina ou guanina.
[00604] Em algumas modalidades, uma base modificada é adenina, citosina, guanina, timina, ou uracila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, uma nucleobase modificada é independentemente adenina, citosina, guanina, timina ou uracila, modificada por uma ou mais modificações pelas quais: (1) uma nucleobase é modificada por um ou mais grupos opcionalmente substituídos independentemente selecionados dentre acila, halogênio, amino, azida, alquila, alquenila, alquinila, arila, heteroalquila, heteroalquenila, heteroalquinila, heterociclila, heteroarila, carboxila, hidroxila, biotina, avidina, estreptavidina, silila substituída, e combinações das mesmas; (2) um ou mais átomos de uma nucleobase são independentemente substituídos por um átomo diferente selecionado dentre carbono, nitrogênio ou enxofre; (3) uma ou mais ligações duplas em uma nucleobase são independentemente hidrogenadas; ou (4) um ou mais anéis arila ou heteroarila opcionalmente substituídos são independentemente inseridos em uma nucleobase.
[00605] As nucleobases modificadas também incluem nucleobases de tamanho expandido em que um ou mais anéis arila, tais como anéis fenila, foram adicionados. As substituições base nucleica descritas no catálogo Glen Research (disponível no site da web Glen Research); Krueger AT et al, Acc. Chem. Res., 2007, 40, 141-150; Kool, ET, Acc. Chem. Res., 2002, 35, 936-943; Benner S.A., et al., Nat. Rev. Genet., 2005, 6, 553-543; Romesberg, F.E., et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 2003, 7, 723-733; Hirao, I., Curr. Opin. Chem. Biol., 2006, 10, 622-627, são contempladas como úteis para oligonucleotídeos da presente revelação.
[00606] Em algumas modalidades, as nucleobases modificadas incluem estruturas tais como, porém sem limitação, anéis derivados de corrina ou porfirina. As substituições de base derivadas de porfirina foram descritas em Morales-Rojas, H e Kool, ET, Org. Lett., 2002, 4, 4377-
4380. Um exemplo de um anel derivado de porfirina que pode ser usado como uma substituição de nucleobase é mostrado abaixo: .
[00607] Em algumas modalidades, uma nucleobase modificada é fluorescente. Os exemplos de tais nucleobases modificadas fluorescentes incluem fenantreno, pireno, estilbeno, isoxantina, isozantopterina, terfenila, tertiofeno, benzotertiofeno, coumarina, lumazina, estilbeno aglutinado, benzo-uracila, e nafto-uracila.
[00608] Em algumas modalidades, uma nucleobase modificada é uma base universal ou uma base degenerada, por exemplo, 3-nitropirrol, 5'-nitroindol, P, K, etc.
[00609] Em algumas modalidades, outros nucleosídeos também podem ser usados nas tecnologias reveladas na presente revelação e incluem nucleosídeos que incorporam nucleobases modificadas, ou nucleobases covalentemente ligadas aos açúcares modificados. Alguns exemplos de nucleosídeos que incorporam nucleobases modificadas incluem 4-acetilcitidina; 5-(carboxi-hidroxilmetil)uridina; 2′-O-metilcitidina; 5-
carboximetilaminometil-2-tiouridina; 5- carboximetilaminometiluridina; di-hidrouridina; 2′-O- metilpseudouridina; beta,D-galactosilqueosina; 2′-O- metilguanosina; N6-isopenteniladenosina; 1-metiladenosina; 1- metilpseudouridina; 1-metilguanosina; l-metilinosina; 2,2- dimetilguanosina; 2-metiladenosina; 2-metilguanosina; N7- metilguanosina; 3-metil-citidina; 5-metilcitidina; 5- hidroximetilcitidina; 5-formilcitosina; 5-carboxilcitosina; N6-metiladenosina; 7-metilguanosina; 5-metilaminoetiluridina; 5-metoxiaminometil-2-tiouridina; beta,D-mannosilqueosina; 5- metoxicarbonilmetiluridina; 5-metoxiuridina; 2-metiltio-N6- isopenteniladenosina; N-((9-beta,D-ribofuranosil-2- metiltiopurina-6-il)carbamoil)treonina; N-((9-beta,D- ribofuranosilpurina-6-il)-N-metilcarbamoil)treonina; metil éster de ácido uridina-5-oxiacético; ácido uridina-5- oxiacético (v); pseudouridina; queosina; 2-tiocitidina; 5- metil-2-tiouridina; 2-tiouridina; 4-tiouridina; 5- metiluridina; 2′-O-metil-5-metiluridina; e 2′-O-metiluridina.
[00610] Em algumas modalidades, uma nucleobase é A, T, C, G ou U opcionalmente substituído, em que um ou mais −NH2 são independente e opcionalmente substituídos por −C(−L−R1)3, um ou mais −NH− são independente e opcionalmente substituídos por −C(−L−R1)2−, um ou mais =N− são independente e opcionalmente substituídos por −C(−L−R1)−, um ou mais =CH− são independente e opcionalmente substituídos por =N−, e um ou mais =O são independente e opcionalmente substituídos por =S, =N(−L−R1), ou =C(−L−R1)2, em que dois ou mais −L−R1 são opcionalmente tomados em conjunto com seus átomos intervenientes para formar um anel bicíclico ou policíclico com 3 a 30 membros tendo 0 a 10 átomos de anel de heteroátomo. Em algumas modalidades, uma nucleobase modificada é A, T, C, G ou U opcionalmente substituído, em que um ou mais −NH2 são independente e opcionalmente substituídos por −C(−L−R1)3, um ou mais −NH− são independente e opcionalmente substituídos por −C(−L−R1)2−, um ou mais =N− são independente e opcionalmente substituídos por −C(−L−R1)−, um ou mais =CH− são independente e opcionalmente substituídos por =N−, e um ou mais =O são independente e opcionalmente substituídos por =S, =N(−L−R1), ou =C(−L−R1)2, em que dois ou mais −L−R1 são opcionalmente tomados em conjunto com seus átomos intervenientes para formar um anel bicíclico ou policíclico com 3 a 30 membros tendo 0 a 10 átomos de anel de heteroátomo, em que a base modificada é diferente do A, T, C, G e U natural. Em algumas modalidades, uma nucleobase é A, T, C, G ou U opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, uma base modificada é A, T, C, G ou U substituído, em que a base modificada é diferente do A, T, C, G e U natural.
[00611] Em algumas modalidades, uma nucleobase modificada pode ser opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, uma nucleobase modificada contém um ou mais, por exemplo, heteroátomos, grupos alquila, ou porções químicas de ligação conectados às porções químicas fluorescentes, porções químicas de biotina ou avidina, ou outras proteínas ou peptídeos. Em algumas modalidades, uma nucleobase ou nucleobase modificada compreende ou é conjugada com uma ou mais porções químicas de ligação à biomolécula, tais como, por exemplo, anticorpos, fragmentos de anticorpos, biotina, avidina, estreptavidina, ligantes receptores ou porções químicas quelantes. Em algumas modalidades, uma nucleobase modificada é modificada por substituição por uma porção química de ligação fluorescente ou à biomolécula. Em algumas modalidades, um substituinte em uma nucleobase ou nucleobase modificada é uma porção química fluorescente. Em algumas modalidades, um substituinte em uma nucleobase ou nucleobase modificada é biotina ou avidina.
[00612] As nucleobases exemplificativas também descritas nos documentos US 20110294124, US 20120316224, US 20140194610, US 20150211006, US 20150197540, WO 2015107425, WO/2017/015555, WO/2017/015575, e WO/2017/062862, as nucleobases de cada um dos quais estão incorporadas ao presente documento a título de referência. Açúcares
[00613] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos compreendem uma ou mais porções químicas de açúcar modificadas além das porções químicas de açúcar natural. Em algumas modalidades, um açúcar é um açúcar natural. Em algumas modalidades, um açúcar é um açúcar modificado (açúcar não natural). Os nucleotídeos de ocorrência natural mais comuns são compreendidos de açúcares de ribose ligados às nucleobases adenosina (A), citosina (C), guanina (G), e timina (T) ou uracila (U). também são incluídos na presente revelação os nucleotídeo modificados em que uma ligação internucleotídica é ligada a várias posições de um açúcar ou açúcar modificado. Como exemplos não limitantes, uma ligação internucleotídica pode ser ligada à posição 2′, 3′, 4′ ou 5′ de um açúcar.
[00614] Em algumas modalidades, uma porção química de açúcar é , em que cada variável é independentemente conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, uma porção química de açúcar é , em que Ls é −C(R5s)2−, em que cada R5s é independentemente conforme descrito na presente revelação.
Em algumas modalidades, uma porção química de açúcar tem a estrutura de
, , , , ou
5 4 O 1 3 2 R2s , em que cada variável é independentemente conforme descrito na presente revelação.
Em algumas modalidades, uma porção química de açúcar tem a estrutura de , em que cada variável é independentemente conforme descrito na presente revelação.
Em algumas modalidades, um açúcar tem ou é derivado da estrutura de , ,
, , , , ou
, em que cada variável é independentemente conforme descrito na presente revelação.
Em algumas modalidades, um nucleosídeo tem a estrutura de , ,
, , , , ou em que cada variável é independentemente conforme descrito na presente revelação.
Em algumas modalidades, uma porção química de nucleosídeo tem ou compreende a estrutura de
, , , ,
, ou , em que cada variável é independentemente conforme descrito na presente revelação.
Em algumas modalidades, Ls é −CH(R)−, em que R é conforme descrito na presente revelação.
Em algumas modalidades, R é −H.
Em algumas modalidades, R não é −H, e Ls é −(R)−CH(R)−. Em algumas modalidades, R não é −H, e Ls é −(S)−CH(R)−. Em algumas modalidades, R, conforme descrito na presente revelação, é C1- 6 alquila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é metila.
[00615] Vários tipos de modificações de açúcar são conhecidos e podem ser utilizados de acordo com a presente revelação. Em algumas modalidades, uma modificação de açúcar é uma modificação 2' (por exemplo R2s (por exemplo, em )). Em algumas modalidades, uma modificação 2' é 2'- F. Em algumas modalidades, uma modificação 2' é 2'-OR, em que R não é hidrogênio. Em algumas modalidades, uma modificação 2' é 2'-OR, em que R é C1-6 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, uma modificação 2' é 2'-OR, em que R é C1-6 alquila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, uma modificação 2' é 2'-OMe. Em algumas modalidades, uma modificação 2' é 2'-MOE. Em algumas modalidades, uma modificação 2' é uma modificação de açúcar LNA (C2−O−CH2−C4). Em algumas modalidades, uma modificação 2' é (C2−O−C(R)2−C4), em que cada R é independentemente conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, uma modificação 2' é (C2−O−CHR−C4), em que R é conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, uma modificação 2' é (C2−O−(R)-CHR−C4), em que R é conforme descrito na presente revelação e não é hidrogênio. Em algumas modalidades, uma modificação 2' é (C2−O−(S)-CHR−C4), em que R é conforme descrito na presente revelação e não é hidrogênio. Em algumas modalidades, R é C1-6 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, R é C1-6 alquila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é C1-6 alquila não substituída.
Em algumas modalidades, R é metila.
Em algumas modalidades, R é etila.
Em algumas modalidades, uma modificação 2' é (C2−O−CHR−C4), em que R é C1-6 alifático opcionalmente substituído.
Em algumas modalidades, uma modificação 2' é (C2−O−CHR−C4), em que R é C1-6 alquila opcionalmente substituída.
Em algumas modalidades, uma modificação 2' é (C2−O−CHR−C4), em que R é metila.
Em algumas modalidades, uma modificação 2' é (C2−O−CHR−C4), em que R é etila.
Em algumas modalidades, uma modificação 2' é (C2−O−(R)-CHR−C4), em que R é C1-6 alifático opcionalmente substituído.
Em algumas modalidades, uma modificação 2' é (C2−O−(R)-CHR−C4), em que R é C1-6 alquila opcionalmente substituída.
Em algumas modalidades, uma modificação 2' é (C2−O−(R)-CHR−C4), em que R é metila.
Em algumas modalidades, uma modificação 2' é (C2−O−(R)-CHR−C4), em que R é etila.
Em algumas modalidades, uma modificação 2' é (C2−O−(S)-CHR−C4), em que R é C1-6 alifático opcionalmente substituída.
Em algumas modalidades, uma modificação 2' é (C2−O−(S)-CHR−C4), em que R é C1-6 alquila opcionalmente substituída.
Em algumas modalidades, uma modificação 2' é (C2−O−(S)-CHR−C4), em que R é metila.
Em algumas modalidades, uma modificação 2' é (C2−O−(S)-CHR−C4), em que R é etila.
Em algumas modalidades, uma modificação 2' é C2−O−(R)-CH(CH2CH3)−C4. Em algumas modalidades, uma modificação 2' é C2−O−(S)-CH(CH2CH3)−C4. Em algumas modalidades, uma porção química de açúcar é uma porção química de açúcar de DNA natural.
Em algumas modalidades, uma porção química de açúcar é uma porção química de açúcar de DNA natural modificada em 2' (modificação 2'). Em algumas modalidades, uma porção química de açúcar é uma porção química de açúcar de DNA natural opcionalmente substituída.
Em algumas modalidades, uma porção química de açúcar é uma porção química de açúcar de DNA natural substituída 2'.
[00616] Muitos açúcares modificados podem ser incorporados nos oligonucleotídeos da presente revelação. Em algumas modalidades, um açúcar modificado contém um ou mais substituintes na posição 2′ incluindo um dos seguintes: –F; –CF3, –CN, –N3, –NO, –NO2, –OR', –SR', ou –N(R')2, em que cada R' é independentemente conforme descrito na presente revelação; –O–(C1–C10 alquila), –S–(C1–C10 alquila), –NH–(C1–C10 alquila), ou –N(C1–C10 alquila)2; –O–(C2–C10 alquenila), –S–(C2– C10 alquenila), –NH–(C2–C10 alquenila), ou –N(C2–C10 alquenila)2; –O–(C2–C10 alquinila), –S–(C2–C10 alquinila), –NH–(C2–C10 alquinila), ou –N(C2–C10 alquinila)2; ou –O––(C1–C10 alquileno)– O––(C1–C10 alquila), –O–(C1–C10 alquileno)–NH–(C1–C10 alquila) ou –O–(C1–C10 alquileno)–NH(C1–C10 alquila)2, –NH–(C1–C10 alquileno)–O–(C1–C10 alquila), ou –N(C1–C10 alquila)–(C1–C10 alquileno)–O–(C1–C10 alquila), em que a alquila, alquileno, alquenila e alquinila podem ser substituídos ou não substituídos. Exemplos de substituintes incluem, porém sem limitação, –O(CH2)nOCH3, e –O(CH2)nNH2, em que n é de 1 a cerca de 10, MOE, DMAOE, e DMAEOE. Certos açúcares modificados são descritos nos documentos WO 2001/088198, WO/2017/062862, e Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504. Em algumas modalidades, um açúcar modificado compreende um ou mais grupos selecionados dentre um grupo silila substituído, um grupo de clivagem de RNA, um grupo repórter, um marcador fluorescente, um intercalador, um grupo para aprimorar as propriedades farmacocinéticas de um oligonucleotídeo, um grupo para aprimorar as propriedades farmacodinâmicas de um oligonucleotídeo, ou outros substituintes que tenham propriedades similares. Em algumas modalidades, as modificações são feitas em uma ou mais das posições 2′, 3′, 4′, 5′ ou 6′ de um açúcar, incluindo a posição 3′ de um açúcar no nucleosídeo terminal 3′ou na posição 5′ do nucleosídeo terminal 5′. Em algumas modalidades, um RNA compreende um açúcar que tem, na posição 2', um 2'-OH, ou 2'-OR1, em que OR1 é alquila opcionalmente substituída, incluindo 2'-OMe.
[00617] Em algumas modalidades, uma modificação 2' é 2'-F.
[00618] Em algumas modalidades, o 2'-OH de uma ribose é substituído por um substituinte (por exemplo, R2s) incluindo um dentre o seguinte: –F; –CF3, –CN, –N3, –NO, –NO2, –OR', –SR', ou –N(R')2, em que cada R' é independentemente conforme conforme definido acima e descrito no presente documento; –O–(C1–C10 alquila), –S–(C1–C10 alquila), –NH–(C1–C10 alquila), ou –N(C1–C10 alquila)2; –O–(C2–C10 alquenila), –S–(C2– C10 alquenila), –NH–(C2–C10 alquenila), ou –N(C2–C10 alquenila)2; –O–(C2–C10 alquinila), –S–(C2–C10 alquinila), –NH–(C2–C10 alquinila), ou –N(C2–C10 alquinila)2; ou –O––(C1–C10 alquileno)– O––(C1–C10 alquila), –O–(C1–C10 alquileno)–NH–(C1–C10 alquila) ou –O–(C1–C10 alquileno)–NH(C1–C10 alquila)2, –NH–(C1–C10 alquileno)–O–(C1–C10 alquila), ou –N(C1–C10 alquila)–(C1–C10 alquileno)–O–(C1–C10 alquila), em que a alquila, alquileno, alquenila e alquinila podem ser substituídos ou não substituídos. Em algumas modalidades, o 2'–OH é substituído por –H (desoxirribose). Em algumas modalidades, o 2'–OH é substituído por –F. Em algumas modalidades, o 2'–OH é substituído por –OR'. Em algumas modalidades, o 2'–OH é substituído por –OMe. Em algumas modalidades, o 2'–OH é substituído por –OCH2CH2OMe.
[00619] Em algumas modalidades, um açúcar modificado é um açúcar nos ácidos nucleicos bloqueados (LNAs). Em algumas modalidades, dois substituintes nos átomos de carbono de açúcar são tomados em conjunto para formar uma porção química bivalente. Em algumas modalidades, dois substituintes são dois átomos de carbono de açúcar diferentes. Em algumas modalidades, uma porção química bivalente formada tem a estrutura de −L− conforme definido no presente documento. Em algumas modalidades, −L− é −O−CH2−, em que −CH2− é opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, −L− é −O−CH2−. Em algumas modalidades, −L− é −O−CH(Me)−. Em algumas modalidades, −L− é −O−CH(Et)−. Em algumas modalidades, −L− se situa entre C2 e C4 de uma porção química de açúcar. Em algumas modalidades, um açúcar de ácido nucleico bloqueado tem a estrutura indicada abaixo, em que R2s é –OCH2C4'–:
[00620] Em algumas modalidades, um açúcar modificado é um açúcar ENA ou açúcar ENA modificado, tais como aqueles descritos, por exemplo, em Seth et al., J Am Chem Soc. 27 de outubro de 2010; 132(42): 14942-14950. Em algumas modalidades, um açúcar modificado é qualquer um daqueles encontrados em um XNA (ácido xenonucleico), por exemplo, arabinose, anidro-hexitol, treose, 2'fluoroarabinose ou ciclo- hexeno.
[00621] Em algumas modalidades, um açúcar modificado é um descrito no documento WO 2017/062862.
[00622] Em algumas modalidades, os açúcares modificados são miméticos de açúcar, tais como porções químicas de ciclobutila ou ciclopentila no lugar de pentofuranosila. As patentes U.S. representativas que ensinam a preparação de tais estruturas de açúcar modificado incluem, porém sem limitação, as patentes U.S. números: 4.981.957; 5.118.800; 5.319.080; e
5.359.044. Em algumas modalidades, os açúcares modificados são açúcares em que o átomo de oxigênio dentro do anel ribose é substituído por nitrogênio, enxofre, selênio ou carbono. Em algumas modalidades, um açúcar modificado é uma ribose modificada em que o átomo de oxigênio dentro do anel ribose é substituído por nitrogênio, e em que o nitrogênio é opcionalmente substituído por um grupo alquila (por exemplo, metila, etila, isopropila, etc).
[00623] Os exemplos não limitantes de açúcares modificados incluem glicerol, que formam análogos de ácido nucleico de glicerol (GNA). Em algumas modalidades, um análogo de GNA é descrito em Zhang, R et al., J. Am. Chem. Soc., 2008, 130, 5846-5847; Zhang L, et al., J. Am. Chem. Soc., 2005, 127, 4174-4175 e Tsai CH et al., PNAS, 2007, 14598-14603.
[00624] Em algumas modalidades, outro exemplo de um análogo derivado de GNA, ácido nucleico flexível (FNA) com base no acetal aminal misto de formil glicerol, é descrito em Joyce GF et al., PNAS, 1987, 84, 4398-4402 e Heuberger BD e Switzer C, J. Am. Chem. Soc., 2008, 130, 412-413.
[00625] Exemplos não limitantes adicionais de açúcares modificados incluem açúcares de hexopiranosila (6' a 4'), pentopiranosila (4' a 2'), pentopiranosila (4' a 3') ou tetrofuranosila (3' a 2').
[00626] Em algumas modalidades, um ou mais grupos hidroxila em uma porção química de açúcar são opcional e independentemente substituídos por halogênio, R' –N(R')2, – OR', ou –SR', em que cada R' é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento.
[00627] Em algumas modalidades, pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50% ou mais (por exemplo, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou mais), inclusive, dos açúcares em um oligonucleotídeo, por exemplo, um oligonucleotídeo quiralmente controlado, um oligonucleotídeo de uma pluralidade de oligonucleotídeos de uma composição de oligonucleotídeo, etc. são modificados. Em algumas modalidades, os açúcares de nucleosídeos de purina e, em algumas modalidades, apenas nucleosídeos de purina, são modificados (por exemplo, cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50% ou mais [por exemplo, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou mais dos nucleosídeos purina são modificados). Em algumas modalidades, os açúcares de nucleosídeos de pirimidina e em algumas modalidades, apenas nucleosídeos de pirimidina, são modificados (por exemplo, cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50% ou mais [por exemplo, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%,
85%, 90%, 95% ou mais dos nucleosídeos de pirimidina são modificados). Em algumas modalidades, tanto os nucleosídeos de purina como de pirimidina são modificados.
[00628] Em algumas modalidades, os açúcares modificados incluem aqueles descritos em: A. Eschenmoser, Science (1999), 284:2118; M. Bohringer et al, Helv. Chim. Acta (1992), 75:1416-1477; M. Egli et al, J. Am. Chem. Soc. (2006), 128(33):10847-56; A. Eschenmoser em Chemical Synthesis: Gnosis to Prognosis, C. Chatgilialoglu e V. Sniekus, Ed., (Kluwer Academic, Netherlands, 1996), p.293; K.-U. Schoning et al, Science (2000), 290:1347-1351; A. Eschenmoser et al, Helv. Chim. Acta (1992), 75:218; J. Hunziker et al, Helv. Chim. Acta (1993), 76:259; G. Otting et al, Helv. Chim. Acta (1993), 76:2701; K. Groebke et al, Helv. Chim. Acta (1998), 81:375; e A. Eschenmoser, Science (1999), 284:2118. As modificações para as modificações 2’ podem ser encontradas em Verma, S. et al. Annu. Rev. Biochem. 1998, 67, 99-134 e todas as referências no mesmo. Em algumas modalidades, um açúcar modificado é um descrito no documento WO2012/030683. Em algumas modalidades, um açúcar modificado é qualquer açúcar modificado descrito em qualquer um dentre: Gryaznov, S; Chen, J.-K. J. Am. Chem. Soc. 1994, 116, 3143; Hendrix et al. 1997 Chem. Eur. J. 3: 110; Hyrup et al. 1996 Bioorg. Med. Chem. 4: 5; Jepsen et al. 2004 Oligo. 14 130-146; Jones et al. J. Org. Chem. 1993, 58, 2983; Koizumi et al. 2003 Nuc. Acids Res. 12: 3267-3273; Koshkin et al. 1998 Tetrahedron 54: 3607-3630; Kumar et al. 1998 Bioo. Med. Chem. Let. 8 2219-2222; Lauritsen et al. 2002 Chem. Comm. 5 530-531; Lauritsen et al. 2003 Bioo. Med. Chem. Lett. 13: 253-256; Mesmaeker et al. Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 1994, 33, 226; Morita et al. 2001 Nucl. Acids Res. Supp. 1 241-242;
Morita et al. 2002 Bioo. Med. Chem. Lett. 12: 73-76; Morita et al. 2003 Bioo. Med. Chem. Lett. 2211-2226; Nielsen et al. 1997 Chem. Soc. Rev. 73; Nielsen et al. 1997 J. Chem. Soc. Perkins Transl. 1 3423-3433; Obika et al. 1997 Tetrahedron Lett. 38 (50): 8735-8; Obika et al. 1998 Tetrahedron Lett. 39: 5401- 5404; Pallan et al. 2012 Chem. Comm. 48 8195-8197; Petersen et al. 2003 TRENDS Biotech. 21: 74-81; Rajwanshi et al. 1999 Chem. Commun. 1395-1396; Schultz et al. 1996 Nucleic Acids Res. 24: 2966; Seth et al. 2009 J. Med. Chem. 52: 10-13; Seth et al. 2010 J. Med. Chem. 53: 8309-8318; Seth et al. 2010 J. Org. Chem. 75: 1569-1581; Seth et al. 2012 Bioo. Med. Chem. Lett. 22: 296-299; Seth et al. 2012 Mol. Ther-Nuc. Acids. 1, e47; Seth, Punit P; Siwkowski, Andrew; Allerson, Charles R; Vasquez, Guillermo; Lee, Sam; Prakash, Thazha P; Kinberger, Garth; Migawa, Michael T; Gaus, Hans; Bhat, Balkrishen; et al. From Nucleic Acids Symposium Series (2008), 52(1), 553-554; Singh et al. 1998 Chem. Comm. 1247-1248; Singh et al. 1998 J. Org. Chem. 63: 10035-39; Singh et al. 1998 J. Org. Chem. 63: 6078- 6079; Sorensen 2003 Chem. Comm. 2130-2131; Ts'o et al. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1988, 507, 220; Van Aerschot et al. 1995 Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 34: 1338; Vasseur et al. J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 4006; WO 20070900071; WO 20070900071; ou WO 2016/079181.
[00629] Em algumas modalidades, uma porção química de açúcar modificada é uma porção química de pentose ou hexose opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, uma porção química de açúcar modificada é uma porção química de pentose opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, uma porção química de açúcar modificada é uma porção química de hexose opcionalmente substituída. Em algumas modalidades,
uma porção química de açúcar modificada é uma porção química de ribose ou hexitol opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, uma porção química de açúcar modificada é uma porção química de ribose opcionalmente substituída . Em algumas modalidades, uma porção química de açúcar modificada é uma porção química de hexitol opcionalmente substituída.
[00630] Em algumas modalidades, um açúcar é D-2-desoxirribose. Em algumas modalidades, um açúcar é beta- D-desoxirribofuranose. Em algumas modalidades, uma porção química de açúcar é uma porção química de beta-D- desoxirribofuranose. Em algumas modalidades, um açúcar é D- ribose. Em algumas modalidades, um açúcar é beta-D- ribofuranose. Em algumas modalidades, uma porção química de açúcar é uma porção química de beta-D-ribofuranose. Em algumas modalidades, um açúcar é beta-D-desoxirribofuranose ou beta- D-ribofuranose opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, uma porção química de açúcar é uma porção química de beta-D-desoxirribofuranose ou beta-D-ribofuranose opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, uma porção química/unidade de açúcar em um oligonucleotídeo, ácido nucleico, etc. é um açúcar que compreende um ou mais átomos de carbono, cada um, independentemente conectados a uma ligação internucleotídica, por exemplo, beta-D-desoxirribofuranose ou beta-D-ribofuranose opcionalmente substituída, cujo 5'-C e/ou 3'-C são, cada um, independentemente conectados a uma ligação internucleotídica (por exemplo, uma ligação fosfato natural, uma ligação internucleotídica modificada, uma ligação internucleotídica quiralmente controlada, etc.).
[00631] Em algumas modalidades, cada nucleosídeo de um oligonucleotídeo fornecido compreende uma modificação de açúcar 2'-O-metoxietila.
[00632] Em algumas modalidades, a composição de oligonucleotídeo compreende pelo menos um nucleotídeo de ácido nucleico bloqueado (LNA). Em algumas modalidades, a composição de oligonucleotídeo compreende pelo menos um nucleotídeo modificado que compreende uma porção química de açúcar modificada que é modificada na posição 2'.
[00633] Em algumas modalidades, a composição de oligonucleotídeo compreende a porção química de açúcar modificada que compreende um substituinte 2’ selecionado dentre o grupo que consiste em: H, OR, R, halogênio, SH, SR, NH2, NHR, NR2, e ON, em que R é uma C1-C6 alquila, alquenila ou alquinila opcionalmente substituída e halogênio é F, Cl, Br ou I.
[00634] Em algumas modalidades, uma nucleobase modificada, açúcar, nucleosídeo, nucleotídeo e/ou ligação internucleotídica modificada são selecionados dentre aqueles descritos em Ts'o et al. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1988, 507, 220; Gryaznov, S.; Chen, J.-K. J. Am. Chem. Soc. 1994, 116, 3143; Mesmaeker et al. Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 1994, 33, 226; Jones et al. J. Org. Chem. 1993, 58, 2983; Vasseur et al. J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 4006; Van Aerschot et al. 1995 Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 34: 1338; Hendrix et al. 1997 Chem. Eur. J. 3: 110; Koshkin et al. 1998 Tetrahedron 54: 3607- 3630; Hyrup et al. 1996 Bioorg. Med. Chem. 4: 5; Nielsen et al. 1997 Chem. Soc. Rev. 73; Schultz et al. 1996 Nucleic Acids Res. 24: 2966; Obika et al. 1997 Tetrahedron Lett. 38 (50): 8735-8; Obika et al. 1998 Tetrahedron Lett. 39: 5401-5404; Singh et al. 1998 Chem. Comm. 1247-1248; Kumar et al. 1998 Bioo. Med. Chem. Let. 8 2219-2222; Nielsen et al. 1997 J. Chem.
Soc. Perkins Transl. 1 3423-3433; Singh et al. 1998 J. Org. Chem. 63: 6078-6079; Seth et al. 2010 J. Org. Chem. 75: 1569- 1581; Singh et al. 1998 J. Org. Chem. 63: 10035-39; Sorensen 2003 Chem. Comm. 2130-2131; Petersen et al. 2003 TRENDS Biotech. 21: 74-81; Rajwanshi et al. 1999 Chem. Commun. 1395- 1396; Jepsen et al. 2004 Oligo. 14 130-146; Morita et al. 2001 Nucl. Acids Res. Supp. 1 241-242; Morita et al. 2002 Bioo. Med. Chem. Lett. 12: 73-76; Morita et al. 2003 Bioo. Med. Chem. Lett. 2211-2226; Koizumi et al. 2003 Nuc. Acids Res. 12: 3267- 3273; Lauritsen et al. 2002 Chem. Comm. 5 530-531; Lauritsen et al. 2003 Bioo. Med. Chem. Lett. 13: 253-256; WO 20070900071; Seth et al., Nucleic Acids Symposium Series (2008), 52(1), 553-554; Seth et al. 2009 J. Med. Chem. 52: 10-13; Seth et al. 2012 Mol. Ther-Nuc. Acids. 1, e47; Pallan et al. 2012 Chem. Comm. 48 8195-8197; Seth et al. 2010 J. Med. Chem. 53: 8309- 8318; Seth et al. 2012 Bioo. Med. Chem. Lett. 22: 296-299; WO 2016/079181; US 6.326.199; US 6.066.500; e US 6.440.739.
[00635] Em algumas modalidades, os açúcares e nucleosídeos incluem açúcares e nucleosídeos bicíclicos modificados 6′, respectivamente, que têm quiralidade (R) ou (S) na posição 6′, por exemplo, aqueles descritos na patente nº U.S. 7.399.845. Em outras modalidades, os açúcares e nucleosídeos incluem açúcares e nucleosídeos bicíclicos modificados 5′, respectivamente, que têm quiralidade (R) ou (S) na posição 5′, por exemplo, aqueles descritos na publicação de pedido de patente nº U.S. 20070287831.
[00636] Em algumas modalidades, açúcares modificados, nucleobases, nucleosídeos, nucleotídeos e/ou ligações internucleotídicas são descrito na patente n° U.S.
3.687.808, assim como nas patentes números. U.S. 4.845.205;
5.130.30; 5.134.066; 5.175.273; 5.367.066; 5.432.272;
5.457.187; 5.457.191; 5.459.255; 5.484.908; 5.502.177;
5.525.711; 5.552.540; 5.587.469; 5.594.121. 5.596.091;
5.614.617; 5.681.941; 5.750.692; 6.015.886; 6.147.200;
6.166.197; 6.222.025; 6.235.887; 6.380.368; 6.528.640;
6.639.062; 6.617.438; 7.045.610; 7.427.672; e 7.495.088, os açúcares, nucleobases, nucleosídeos, nucleotídeos e ligações internucleotídicas de cada um dos quais estão aqui incorporados a título de referência.
[00637] Em algumas modalidades, açúcares modificados, nucleobases, nucleosídeos, nucleotídeos e/ou ligações internucleotídicas são aqueles descritos em qualquer um dentre: Gryaznov, S; Chen, J.-K. J. Am. Chem. Soc. 1994, 116, 3143; Hendrix et al. 1997 Chem. Eur. J. 3: 110; Hyrup et al. 1996 Bioorg. Med. Chem. 4: 5; Jepsen et al. 2004 Oligo. 14 130-146; Jones et al. J. Org. Chem. 1993, 58, 2983; Koizumi et al. 2003 Nuc. Acids Res. 12: 3267-3273; Koshkin et al. 1998 Tetrahedron 54: 3607-3630; Kumar et al. 1998 Bioo. Med. Chem. Let. 8 2219-2222; Lauritsen et al. 2002 Chem. Comm. 5 530- 531; Lauritsen et al. 2003 Bioo. Med. Chem. Lett. 13: 253-256; Mesmaeker et al. Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 1994, 33, 226; Morita et al. 2001 Nucl. Acids Res. Supp. 1 241-242; Morita et al. 2002 Bioo. Med. Chem. Lett. 12: 73-76; Morita et al. 2003 Bioo. Med. Chem. Lett. 2211-2226; Nielsen et al. 1997 Chem. Soc. Rev. 73; Nielsen et al. 1997 J. Chem. Soc. Perkins Transl. 1 3423-3433; Obika et al. 1997 Tetrahedron Lett. 38 (50): 8735- 8; Obika et al. 1998 Tetrahedron Lett. 39: 5401-5404; Pallan et al. 2012 Chem. Comm. 48 8195-8197; Petersen et al. 2003 TRENDS Biotech. 21: 74-81; Rajwanshi et al. 1999 Chem. Commun. 1395-1396; Schultz et al. 1996 Nucleic Acids Res. 24: 2966;
Seth et al. 2009 J. Med. Chem. 52: 10-13; Seth et al. 2010 J. Med. Chem. 53: 8309-8318; Seth et al. 2010 J. Org. Chem. 75: 1569-1581; Seth et al. 2012 Bioo. Med. Chem. Lett. 22: 296- 299; Seth et al. 2012 Mol. Ther-Nuc. Acids. 1, e47; Seth, Punit P; Siwkowski, Andrew; Allerson, Charles R; Vasquez, Guillermo; Lee, Sam; Prakash, Thazha P; Kinberger, Garth; Migawa, Michael T; Gaus, Hans; Bhat, Balkrishen; et al. From Nucleic Acids Symposium Series (2008), 52(1), 553-554; Singh et al. 1998 Chem. Comm. 1247-1248; Singh et al. 1998 J. Org. Chem. 63: 10035-39; Singh et al. 1998 J. Org. Chem. 63: 6078-6079; Sorensen 2003 Chem. Comm. 2130-2131; Ts'o et al. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1988, 507, 220; Van Aerschot et al. 1995 Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 34: 1338; Vasseur et al. J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 4006; WO 20070900071; WO 20070900071; e WO 2016/079181.
[00638] Em algumas modalidades, os açúcares modificados, nucleobases, nucleosídeos, nucleotídeos e/ou ligações internucleotídicas incluem, ou incluem aqueles em, HNA, PNA, 2'-Fluoro N3'-P5'-fosforamidato, LNA, beta-D-oxi- LNA, 2'-O,3'-C bicíclico ligado, PS-LNA, beta-D-tio-LNA, beta- D-amino-LNA, xilo-LNA [c], alfa-L-LNA, ENA, beta-D-ENA, LNA ligado à amida, metilfosfonato-LNA, (R, S)-cEt, (R, S)-cMOE, (R, S)-5'-Me-LNA, S-Me cLNA, Metileno-cLNA, 3'-Me-alfa-L-LNA, R-6'-Me-alfa-L-LNA, S-5'-Me-alfa-L-LNA, ou R-5'-Me-alfa-L- LNA. Determinados açúcares modificados, nucleobases, nucleosídeos, nucleotídeos e/ou ligações internucleotídicas são descritos nos documentos US 9394333, US 9744183, US 9605019, US 20130178612, US 20150211006, US 9598458, US 20170037399, WO 2017/015555, WO 2017/062862, os açúcares modificados, nucleobases, nucleosídeos, nucleotídeos, e ligações internucleotídicas de cada um dos quais estão incorporados ao presente documento a título de referência. Distrofina
[00639] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece tecnologias, por exemplo, oligonucleotídeos, composições, métodos, etc., relacionados ao gene distrofina (DMD) ou um produto codificado através do mesmo (uma transcrição, uma proteína (por exemplo, várias variantes da proteína distrofina), etc.). Em algumas modalidades, a sequência de base de um oligonucleotídeo é ou compreende uma sequência cuja sequência é, ou é complementar (por exemplo, 85%, 90%, 95%, 100%; em muitas modalidades, 100%) a uma sequência no gene DMD ou um produto do mesmo (por exemplo, uma transcrição, mRNA, etc.) (tal oligonucleotídeo−oligonucleotídeo DMD). Em algumas modalidades, tal sequência no gene DMD ou um produto do mesmo compreende 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 20, 31, 32, 33, 34, 35 ou mais nucleobases. Em algumas modalidades, tal sequência no gene DMD ou um produto do mesmo compreende pelo menos 10 nucleobases. Em algumas modalidades, tal sequência no gene DMD ou um produto do mesmo compreende pelo menos 15 nucleobases. Em algumas modalidades, tal sequência no gene DMD ou um produto do mesmo compreende pelo menos 16 nucleobases. Em algumas modalidades, tal sequência no gene DMD ou um produto do mesmo compreende pelo menos 17 nucleobases. Em algumas modalidades, tal sequência no gene DMD ou um produto do mesmo compreende pelo menos 18 nucleobases. Em algumas modalidades, tal sequência no gene DMD ou um produto do mesmo compreende pelo menos 19 nucleobases. Em algumas modalidades, tal sequência no gene DMD ou um produto do mesmo compreende pelo menos 20 nucleobases. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece tecnologias, incluindo oligonucleotídeos DMD e composições e métodos de uso dos mesmos, para tratamento de distrofia muscular, que inclui, porém sem limitação, Distrofia Muscular de Duchenne (também abreviado como DMD) e Distrofia Muscular de Becker (BMD). Em algumas modalidades, DMD compreende uma ou mais mutações. Em algumas modalidades, tais mutações são associadas às funções biológicas reduzidas da proteína distrofina em um indivíduo que sofre de ou é suscetível à distrofia muscular.
[00640] Em algumas modalidades, o gene distrofina (DMD) ou um produto do mesmo, ou uma variante ou porção do mesmo, pode ser denominado como DMD, BMD, CMD3B, DXS142, DXS164, DXS206, DXS230, DXS239, DXS268, DXS269, DXS270, DXS272, MRX85, ou distrofina; IDs Externos: OMIM: 300377 MGI: 94909; HomoloGene: 20856; GeneCards: DMD; Em Ser Humano: Entrez: 1756; Ensembl: ENSG00000198947; UniProt: P11532; RefSeq (mRNA): NM_000109; NM_004006; NM_004007; NM_004009; NM_004010; RefSeq (proteína): NP_000100; NP_003997; NP_004000; NP_004001; NP_004002; Localização (UCSC): Chr X: 31,1 a 33,34 Mb; Em Camundongo: Entrez: 13405; Ensembl: ENSMUSG00000045103; UniProt: P11531; RefSeq (mRNA): NM_007868; NM_001314034; NM_001314035; NM_001314036; NM_001314037; RefSeq (proteína): NP_001300963; NP_001300964; NP_001300965; NP_001300966; NP_001300967; Localização (UCSC): Chr X: 82,95 a 85,21 Mb.
[00641] O gene DMD contém supostamente 79 éxons distribuídos em 2,3 milhões de bp de propriedades genéticas no cromossomo X; entretanto, relata-se que apenas aproximadamente 14.000 bp (<1%) são usados para tradução em proteína (sequência de codificação). Relata-se que cerca de 99,5% da sequência genética, as sequências intrônicas, é submetida a splicing da transcrição de RNA heteronuclear inicial de 2,3 milhões de bp para fornecer um mRNA de 14.000 bp maduro que inclui todas as informações principais para produção de proteína distrofina. Em algumas modalidades, os pacientes com DMD têm mutação(s) no gene DMD que impede a construção adequada do mRNA de DMD do tipo selvagem e/ou a produção da proteína distrofina, e pacientes com DMD frequentemente mostram deficiência de distrofina considerável em seu músculo.
[00642] Em algumas modalidades, uma transcrição de distrofina, por exemplo, mRNA, ou proteína abrange aquela relacionada ou produzida a partir de splicing alternativo. Por exemplo, dezesseis transcrições alternativas do gene da distrofina foram relatadas após uma análise padrões de splicing do gene DMD no músculo esquelético, tecidos cerebrais e cardíacos. Sironi et al. 2002 FEBS Letters 517: 163-166.
[00643] Relata-se que a distrofina tem várias isoformas. Em algumas modalidades, a distrofina se refere a uma isoforma específica. Pelo menos três isoformas de distrofina de comprimento total foram relatadas, cada uma controlada por um promotor tecido específico. Klamut et al. 1990 Mol. Cell. Biol. 10: 193-205; Nudel et al. 1989 Nature 337: 76-78; Gorecki et al. 1992 Hum. Mol. Genet. 1: 505-510. A isoforma muscular é supostamente expressa principalmente no músculo esquelético, mas também nos músculos lisos e cardíacos [Bies, R.D., Phelps, S.F., Cortez, M.D., Roberts, R., Caskey,
C.T. e Chamberlain, J.S. 1992 Nucleic Acids Res. 20: 1725- 1731], a distrofina cerebral é supostamente específica para neurônios corticais, mas também pode ser detectada nos neurônios cardíacos e cerebelares, enquanto o tipo de célula de Purkinje supostamente é responsável por quase toda a distrofina cerebelar [Gorecki et al. 1992 Hum. Mol. Genet. 1: 505-510. O splicing alternativo fornece supostamente um meio para diversificação de distrofina: a região 3' do gene supostamente sofre splicing alternativo que resulta em transcrições tecido específicas nos neurônios cerebrais, fibras cardíacas de Purkinje e células musculares lisas [Bies et al. 1992 Nucleic Acids Res. 20: 1725-1731; e Feener et al. 1989 Nature 338: 509-511] enquanto 12 padrões de splicing alternativo foram relatados na região 5' do gene no músculo esquelético [Surono et al. 1997 Biochem. Biophys. Res. Commun. 239: 895-899.
[00644] Em algumas modalidades, mRNA, gene ou proteína de distrofina é uma versão revertente. Entre outros, as distrofinas revertentes foram relatas, por exemplo, em: Hoffman et al. 1990 J. Neurol. Sci. 99:9-25; Klein et al. 1992 Am. J. Hum. Genet. 50: 950-959; e Chelly et al. 1990 Cell 63: 1239-1348; Arahata et al. 1998 Nature 333: 861-863; Bonilla et al. 1988 Cell 54: 447-452; Fanin et al. 1992 Neur. Disord. 2 41-45; Nicholson et al. 1989 J. Neurol. Sci. 94: 137-146; Shimizu et al. 1988 Proc. Jpn. Acad. Sci. 64: 205-208; Sicinzki et al. 1989 Science 244: 1578-1580; e Sherratt et al. Am. J. Hum. Genet. 53: 1007-1015. Várias mutações no gene DMD podem e/ou foram relatadas como causadoras de distrofia muscular. Distrofia muscular
[00645] As composições que compreendem um ou mais oligonucleotídeos DMD descritos no presente documento podem ser usadas para tratar distrofia muscular. Em algumas modalidades, a distrofia muscular (MD) é qualquer uma dentre um grupo de afecções, doenças ou distúrbios musculares que resulte no enfraquecimento e colapso (crescente) dos músculos esqueléticos ao longo do tempo. As afecções, doenças ou distúrbios se diferem em quais músculos são principalmente afetados, o grau de fraqueza, quando os sintomas começam, e quão rapidamente os sintomas pioram. Muitos pacientes com MD eventualmente irão se tornar incapazes de andar. Em muitos casos a distrofia muscular é fatal. Alguns tipos também são associados a problemas em outros órgãos, incluindo o sistema nervoso central. Em algumas modalidades, a distrofia muscular é a Distrofia Muscular de Duchenne (Duchenne) (DMD) ou a Distrofia Muscular de Becker (Becker) (BMD).
[00646] Em algumas modalidades, um sintoma da Distrofia Muscular de Duchenne é a fraqueza muscular associada ao desgaste muscular, com os músculos voluntários sendo afetados primeiro, especialmente aqueles dos dos quadris, área pélvica, coxas, ombros e panturrilhas. A fraqueza muscular também pode ocorrer posteriormente, nos braços, pescoço e outras áreas. As panturrilhas são frequentemente aumentadas. Os sintomas aparecem geralmente antes dos seis anos de idade e podem aparecer na primeira infância. Outros sintomas físicos são: maneira desajeitada de caminhar, pisar ou correr (em alguns casos, os pacientes tendem a andar com sua parte frontal do pé, devido ao aumento do tônus muscular da panturrilha), quedas frequentes, fadiga, dificuldade com habilidades motoras (por exemplo, correr, saltar, pular), hiperlordose lombar, que leva possivelmente ao encurtamento dos músculos flexores do quadril, postura geral e/ou maneira de caminhar, pisar ou correr, contraturas musculares do tendão de Aquiles e funcionalidade prejudicada dos isquiotibiais, dificuldade progressiva de caminhar, deformidades da fibra muscular, pseudo-hipertrofia (aumento) dos músculos da língua e da panturrilha, maior risco de distúrbios neurocomportamentais (por exemplo, TDAH), distúrbios de aprendizagem (por exemplo, dislexia), e fraquezas não progressivas em habilidades cognitivas específicas (por exemplo, memória verbal de curto prazo), que acredita-se que sejam o resultado de distrofina ausente ou disfuncional no cérebro, eventual perda de capacidade de andar (geralmente com 12 de idade), deformidades esqueléticas (incluindo escoliose em alguns casos) e dificuldade em se levantar da posição deitada ou sentada.
[00647] Em algumas modalidades, a distrofia muscular de Becker (BMD) é causada por mutações que dão origem a transcrições encurtadas, porém in-frame resultando na produção de proteína (ou proteínas) truncada porém, parcialmente funcional. Foi relatado que tais proteínas parcialmente funcionais retêm os domínios amino-terminais críticos, ricos em cisteína e C-terminais, Tal proteína (ou proteínas) parcialmente funcional foi relatada por reter os domínios terminais amino, ricos em cisteína e C-terminais críticos, porém geralmente carecem de elementos dos domínios de haste central que foram relatados como de menor significado funcional. England et al. 1990 Nature, 343, 180–182.
[00648] Em algumas modalidades, os fenótipos BMD variam de DMD moderada a virtualmente assintomática, dependendo da mutação precisa e do nível da distrofina produzida. Yin et al. 2008 Hum. Mol. Genet. 17: 3909-3918.
[00649] Em algumas modalidades, os pacientes com distrofia com mutações out-of-frame são geralmente diagnosticados com a Distrofia Muscular de Duchenne mais grave, e pacientes com distrofia com mutações in-frame são geralmente diagnosticados com a Distrofia Muscular de Becker menos grave. Entretanto, uma minoria de pacientes com deleções in-frame é diagnosticada com Distrofia Muscular de Duchenne, incluindo aqueles com mutações de deleção começando ou terminando nos éxons 50 ou 51, que codificam parte da região de dobradiça, tais como deleções dos éxons 47 a 51, 48 a 51, e 49 a 53. Sem se ater a nenhuma teoria particular, a presente revelação observa que a variabilidade de paciente para paciente na gravidade da doença apesar da presença da mesma deleção de éxon, supostamente pode ser estar relacionada ao efeito dos pontos de interrupção de deleção específicos na eficiência e/ou padrões de splicing de mRNA; eficiência de tradução ou transcrição após a reorganização do genoma; e estabilidade ou função da estrutura da proteína truncada. Yokota et al. 2009 Arch. Neurol. 66 32. Salto de Éxon como um Tratamento para Distrofia Muscular
[00650] Em algumas modalidades, um tratamento para distrofia muscular compreende o uso de um oligonucleotídeo DMD que tem capacidade para mediar o salto de um ou mais éxons de Distrofina. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece métodos para tratamento de distrofia muscular que compreende administrar a um indivíduo que sofre da mesma ou suscetível à mesa, um oligonucleotídeo DMD, ou uma composição que compreende um oligonucleotídeo DMD. Particularmente, entre outros aspectos, a presente revelação demonstra que oligonucleotídeo quiralmente controlados/composições de oligonucleotídeo quiralmente controladas são inesperadamente eficazes para modular o salto de éxon em comparação com oligonucleotídeos/composições de oligonucleotídeo, de outro modo, idênticos, porém não quiralmente controlados. Em algumas modalidades, a presente revelação demonstra que a incorporação de uma ou mais ligações internucleotídicas não negativamente carregadas pode aprimorar muito a entrega e/ou eficiência de salto de éxon total.
[00651] Em algumas modalidades, um tratamento para distrofia muscular emprega o uso de um oligonucleotídeo DMD, em que o oligonucleotídeo tem capacidade para fornecer o salto de um ou mais éxons. O salto de um ou mais (por exemplo, múltiplos) éxons DMD pode, por exemplo, remover um éxon (ou éxons) que sofreu mutação, ou compensar uma mutação (ou mutações) (por exemplo, restaurar o quadro de leitura se a mutação for uma mutação de deslocamento de quadro) em um éxon que não é ignorado. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo DMD tem capacidade para mediar o salto de um éxon que compreende uma mutação (por exemplo, um deslocamento de quadro, inserção, deleção, mutação de sentido trocado ou sem sentido ou outra mutação), em que o salto do éxon mantém (ou restaura) o quadro de leitura adequado do gene DMD, e a tradução produz uma proteína DMD truncada, porém funcional (ou muito funcional). Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo DMD compensa um éxon que compreende uma mutação de deslocamento de quadro ao fornecer o salto de um éxon diferente (não aquele que compreende a mutação de deslocamento de quadro) e, desse modo restaura o quadro de leitura do gene DMD. Em algumas modalidades, um paciente que tem distrofia muscular tem uma mutação de deslocamento de quadro em um éxon do gene DMD; e esse paciente é tratado com um oligonucleotídeo DMD que não causa o salto do éxon que tem a mutação, porém causa o salto de um éxon diferente, que restaura o quadro de leitura do gene DMD, de modo que uma proteína DMD funcional seja produzida (e, se o éxon deletado for 3' para o éxon que tem a mutação de deslocamento de quadro, essa proteína DMD funcional terá geralmente um aminoácido de uma proteína DMD normal, exceto para uma sequência of aminoácidos não normalmente encontrada em DMD, abrangendo da mutação de deslocamento de quadro até éxon que é 3' para o éxon deletado).
[00652] Em algumas modalidades, uma composição que compreende um oligonucleotídeo DMD é útil para tratamento de um distúrbio relacionado à Distrofina do sistema nervoso central. Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a um método de tratamento de um distúrbio relacionado à Distrofina do sistema nervoso central, em que o método compreende a etapa de administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um oligonucleotídeo DMD a um paciente que sofre de um distúrbio relacionado à Distrofina do sistema nervoso central. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo DMD é administrado fora do sistema nervoso central (como exemplos não limitantes, intravenosa ou intramuscularmente) a um paciente que sofre de um distúrbio relacionado à Distrofina do sistema nervoso central, e o oligonucleotídeo DMD tem capacidade para passar através da barreira sangue-cérebro para o sistema nervoso central. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo DMD é administrado diretamente no sistema nervoso central (como exemplo não limitante, entrega por via intratecal, intraventricular, intracraniana, etc.,).
[00653] Em algumas modalidades, um distúrbio relacionado à Distrofina do sistema nervoso central, ou um sintoma do mesmo, pode ser qualquer um ou mais dentre: diminuição da inteligência, diminuição da memória de longo prazo, diminuição da memória de curto prazo, comprometimento da linguagem, epilepsia, distúrbio do espectro autista, transtorno do déficit de atenção e hiperatividade (TDAH), transtorno obsessivo-compulsivo, problema de aprendizagem, problema comportamental, diminuição do volume cerebral, diminuição do volume da substância cinzenta, anisotropia fracionária de substância branca inferior, difusividade radial de substância branca superior, uma anormalidade do formato do crânio ou uma alteração deletéria no volume ou estrutura do hipocampo, globo pálido, putâmen caudado, hipotálamo, comissura anterior, cinzenta periaquedutal, cápsula interna, amígdala, corpo caloso, núcleo septal, núcleo accumbens, fímbria, ventrículo ou tálamo mesencéfalo. Em algumas modalidades, um paciente que apresenta sintomas de distrofia muscular relacionados a músculos também apresenta sintomas de um distúrbio do sistema nervoso central relacionado à Distrofina.
[00654] Em algumas modalidades, um distúrbio do sistema nervoso central relacionado à Distrofina é relacionado, associado e/ou causado por uma anormalidade no nível, atividade, expressão e/ou distribuição de um produto de gene do gene da distrofina, tal como Distrofina de comprimento total ou uma isoforma menor da Distrofina, incluindo, porém sem limitação, Dp260, Dp140, Dp116, Dp71 ou Dp40. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo DMD é administrado ao sistema nervoso central de um paciente com distrofia muscular a fim de melhorar um ou mais sistemas de um distúrbio do sistema nervoso central relacionado à Distrofina. Em algumas modalidades, um distúrbio do sistema nervoso central relacionado à Distrofina é relacionado, associado e/ou causado por uma anormalidade no nível, atividade, expressão e/ou distribuição de um produto de gene do gene da distrofina, tal como Distrofina de comprimento total ou uma isoforma menor da Distrofina, incluindo, porém sem limitação, Dp260, Dp140, Dp116, Dp71 ou Dp40. Em algumas modalidades, a administração de um oligonucleotídeo DMD a um paciente que sofre de um distúrbio do sistema nervoso central relacionado à Distrofina aumenta o nível, atividade, e/ou expressão e/ou aprimora a distribuição de um produto de gene do gene da Distrofina.
[00655] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece tecnologias para modular o splicing de pré- mRNA de distrofina, de modo que os éxons selecionados sejam excisados para remover mutações sem sentido ou restaurar o quadro de leitura em torno de mutações de deslocamento de quadro do mRNA maduro. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo DMD que tem capacidade de salto de um éxon tem capacidade para restaurar o quadro de leitura.
[00656] Como um exemplo não limitante, em um paciente com Distrofia Muscular de Duchenne que tem uma deleção do éxon 50, uma transcrição out-of-frame é gerada pelo fato de que o éxon 49 é submetido a splicing no éxon 51. Como resultado, um códon de parada é gerado no éxon 51, que aborta prematuramente a síntese de distrofina. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece oligonucleotídeos que podem mediar o salto do éxon 51, restaurar o quadro de leitura aberta da transcrição, e permitir a produção de uma distrofina truncada similar àquela nos pacientes com distrofia muscular de Becker (BMD).
[00657] Em algumas modalidades, em um paciente com DMD, um gene DMD compreende um éxon que compreende uma mutação, e o distúrbio é pelo menos parcialmente tratado por meio do salto de um ou mais éxons (por exemplo, o éxon que compreende a mutação, ou um éxon adjacente ao éxon que compreende a mutação, ou um conjunto de éxons consecutivos, incluindo o éxon que compreende a mutação).
[00658] Em algumas modalidades, em um paciente com DMD, um gene ou transcrição DMD tem uma mutação em um éxon (éxons), que é uma mutação e/ou deleção com troca de sentido ou sem sentido, inserção, inversão, translocação ou duplicação. Em algumas modalidades, em um paciente com DMD, um gene ou transcrição DMD tem uma mutação em um éxon (ou éxons) que resulta em um deslocamento de quadro, códon de parada prematura ou, de outro modo, perturbação do quadro de leitura adequado.
[00659] Em algumas modalidades, em um tratamento para distrofia muscular, um éxon de DMD é ignorado, em que o éxon codifica uma cadeia de aminoácidos não essencial para a função da proteína DMD, ou cujo salto pode fornecer uma proteína DMD total ou parcialmente funcional. Em algumas modalidades, em um tratamento para distrofia muscular, um éxon de DMD é ignorado, em que o éxon (ou éxons) ignorado inclui um éxon que compreende uma mutação ou é adjacente a (por exemplo, que flanqueia) um éxon que compreende uma mutação, ou em que múltiplos éxons são ignorados, os éxons ignorados incluem opcionalmente um éxon que compreende uma mutação. Em algumas modalidades, em um tratamento para distrofia muscular, dois ou mais éxons são ignorados, em que os éxons ignorados incluem um éxon que compreende uma mutação ou é adjacente a (por exemplo, que flanqueia) um éxon que compreende uma mutação. Em algumas modalidades, em um tratamento para distrofia muscular, um éxon compreende uma mutação de deslocamento de quadro, e o salto de um éxon diferente (enquanto deixa o éxon com a mutação de deslocamento de quadro no lugar) restaura o quadro de leitura adequado.
[00660] Em algumas modalidades, em um tratamento para distrofia muscular, um oligonucleotídeo DMD tem capacidade para mediar o salto de um ou mais éxons DMD, desse modo restaurar ou manter o quadro de leitura adequado e/ou criar uma DMD internamente truncada de modo artificial que fornece atividade biológica pelo menos parcialmente aprimorada ou totalmente restaurada.
[00661] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo DMD ignora um éxon (ou éxons) que não é o éxon 64 e o éxon 70, cujas porções são supostamente importantes para a função de proteína, e/ou que não é o primeiro ou o último éxon. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo DMD ignora um éxon (ou éxons), porém o salto do éxon (ou éxons) não causa a deleção de um ou mais ou todos os sítios de ligação à actina na região N-terminal.
[00662] Em algumas modalidades, uma proteína DMD internamente truncada a partir de uma transcrição de distrofina com um éxon (ou éxons) ignorado é mais funcional do que uma proteína DMD terminalmente truncada, por exemplo, produzida a partir de uma transcrição de distrofina com uma deleção out-of-frame.
[00663] Em algumas modalidades, uma proteína DMD internamente truncada produzida a partir de uma transcrição de distrofina com um éxon (ou éxons) ignorado é mais resistente uma degradação mediada por mutação sem sentido, que pode degradar uma proteína terminalmente truncada DMD, por exemplo, produzida a partir de uma transcrição de distrofina com uma deleção out-of-frame.
[00664] Em algumas modalidades, um tratamento para distrofia muscular emprega o uso de um oligonucleotídeo DMD, em que o oligonucleotídeo tem capacidade para fornecer o salto de um ou mais éxons. O salto de um ou mais (por exemplo, múltiplos) éxons DMD pode, por exemplo, remover um éxon que sofreu mutação, ou compensar uma mutação (por exemplo, restauração para uma mutação de deslocamento de quadro) em um éxon que não é ignorado.
[00665] Em algumas modalidades, a presente revelação abrange o reconhecimento de que a natureza e localização de uma mutação DMD podem ser utilizadas para projetar a estratégia de salto de éxon. Em algumas modalidades, se um paciente com DMD tiver uma a mutação em um éxon, o salto do éxon que sofreu mutação pode produzir um produto de proteína DMD internamente truncado (internamente encurtado), mas pelo menos parcialmente funcional .
[00666] Em algumas modalidades, um paciente com DMD tem uma mutação que altera o splicing de uma transcrição DMD, por exemplo, ao inativar um sítio necessário para splicing, ou ativar um sítio críptico, de modo que o mesmo se torne ativo para splicing, ou ao criar um sítio de splicing alternativo (por exemplo, não natural). Em algumas modalidades, tal mutação causa produção de proteínas com baixa ou nenhuma atividade. Em algumas modalidades, a modulação de splicing, por exemplo, salto de éxon, supressão de tal mutação, etc., pode ser empregada para remover ou reduzir os efeitos de tal mutação, por exemplo, ao restaurar o splicing adequado para produzir proteínas com atividades restauradas, ou produzir uma proteína distrofina internamente truncada com atividades aprimoradas ou restauradas, etc.
[00667] Em algumas modalidades, um paciente com DMD tem uma mutação que é uma duplicação de um ou vários éxons, e a presente revelação fornece tecnologias de salto de éxon para deletar a duplicação e/ou para restaurar o quadro de leitura.
[00668] Em algumas modalidades, um paciente com DMD tem uma mutação que causa o salto de um éxon que, por sua vez, pode causar um deslocamento de quadro. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece tecnologias que podem fornecer salto de um éxon (ou éxons) adicional para restaurar o quadro de leitura. Por exemplo, a deleção do éxon 51, que causa um deslocamento de quadro, pode ser direcionada pelo salto do éxon 50 ou 52, que restaura o quadro de leitura. Em algumas modalidades, um paciente com DMD tem uma mutação em um éxon que causa um deslocamento de quadro, e uma deleção de um éxon (ou éxons) diferente (por exemplo, um éxon diferente, ou um éxon (ou éxons) adjacente ou de flanqueamento imediatamente 5' ou 3' ao éxon que sofreu mutação) restaura o quadro de leitura.
[00669] Em algumas modalidades, a restauração do quadro de leitura pode converter uma mutação out-of-frame em uma mutação in-frame; em algumas modalidades, em seres humanos, tal alteração pode transformar a Distrofia Muscular de Duchenne grave em Distrofia Muscular de Becker moderada.
[00670] Em algumas modalidades, um paciente com DMD ou um paciente com suspeita de ter DMD é analisado quanto ao genótipo DMD antes da administração de uma composição que compreende um oligonucleotídeo DMD.
[00671] Em algumas modalidades, um paciente com DMD ou um paciente com suspeita de ter DMD é analisado quanto ao fenótipo DMD antes da administração de uma composição que compreende um oligonucleotídeo DMD.
[00672] Em algumas modalidades, um paciente com DMD é analisado quanto o genótipo e fenótipo para determinar a relação do genótipo DMD e do fenótipo DMD antes da administração de uma composição que compreende um oligonucleotídeo DMD.
[00673] Em algumas modalidades, verifica-se geneticamente se um paciente tem distrofia antes da administração de uma composição que compreende um oligonucleotídeo DMD.
[00674] Em algumas modalidades, análise de genótipo DMD ou verificação genética de DMD ou um paciente compreende determinar se o paciente tem uma ou mais mutações deletérias em DMD.
[00675] Em algumas modalidades, a análise de genótipo DMD ou verificação genética de DMD ou um paciente compreende determinar se o paciente tem uma ou mais mutações deletérias em DMD e/ou analisar o splicing DMD e/ou detectar as variantes de splicing de DMD, em que uma verificação é produzida por um splicing de DMD anormal.
[00676] Em algumas modalidades, a análise de genótipo DMD ou verificação genética de DMD informa a seleção de uma composição que compreende um oligonucleotídeo DMD útil para tratamento.
[00677] Em algumas modalidades, um gene DMD anormal ou mutante ou uma porção do mesmo é removida ou copiada de um paciente ou uma célula (ou células) ou tecido (ou tecidos) do paciente e o gene DMD anormal ou mutante, ou uma porção do mesmo que compreende a anormalidade ou mutação, ou uma cópia do mesmo, é inserido em uma célula. Em algumas modalidades, essa célula pode ser usada para testar várias composições que compreendem um oligonucleotídeo DMD para prever se tal composição pode ser útil como um tratamento para o paciente. Em algumas modalidades, a célula é um mioblasto ou miotúbulo.
[00678] Em algumas modalidades, um indivíduo ou paciente pode produzir, antes do tratamento com um oligonucleotídeo DMD, uma ou mais variantes de splicing de DMD, sendo que muitas vezes cada variante é produzida a um nível muito baixo. Em algumas modalidades, um método, tal como aquele descrito no Exemplo 20 pode ser usado para detectar baixos níveis de variantes de splicing que são produzidas em um paciente antes, durante ou após a administração de um oligonucleotídeo DMD.
[00679] Em algumas modalidades, um paciente e/ou os tecidos do mesmo são analisados em relação à produção de várias variantes de splicing de um gene DMD antes da administração de uma composição que compreende um oligonucleotídeo DMD.
[00680] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece métodos para projetar um oligonucleotídeo
DMD (por exemplo, um oligonucleotídeo que tem capacidade para mediar o salto de um ou mais éxons de DMD). Em algumas modalidades, a presente revelação utiliza o projeto racional descrito no presente documento e opcionalmente a sequência de passos para projetar oligonucleotídeos, por exemplo, para testar o salto de éxon em um ou mais ensaios e/ou condições. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo eficaz é desenvolvido seguindo o projeto racional, incluindo o uso de várias informações de um determinado sistema biológico.
[00681] Em algumas modalidades, em um método para desenvolver oligonucleotídeos DMD, os oligonucleotídeos são projetados para hibridizar um ou mais motivos relacionados a splicing potenciais e, então testados em relação à sua capacidade de mediar o salto de éxon. Em algumas modalidades, os motivos relacionados a splicing incluem, porém sem limitação, qualquer um ou mais dentre: um receptor, sequência de reconhecimento de éxon (ERS), sítio intensificador de splicing exônico (ESE), sequência intensificadora de splicing (SES), sequência de ponto de ramificação e sítio de splicing doador de um éxon alvo. Determinadas sequências que podem ser envolvidas no splicing foram relatadas, por exemplo, em: Disset et al. 2006 Human Mol. Gen. 15: 999-1013.
[00682] Em algumas modalidades, pacotes de software, tal como RESCUE-ESE, ESEfinder, e o servidor PESX, podem ser utilizados para prever sítios ESE putativos (Fairbrother et al. 2002 Science 297: 1007-1013; Cartegni et al. 2003 Nat. Struct. Biol. 120-125; Zhang e Chasin 2004 Gen. Dev. 18 1241-1250; Smith et al. 2006 Hum. Mol. Genet. 15: 2490- 2508).
[00683] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo DMD que alveja ou interage com um receptor, sequência de reconhecimento de éxon (ERS), sítio intensificador de splicing exônico (ESE) ou sítio de splicing doador de um éxon DMD não interage ou interage significativamente com uma sequência em outro gene (por exemplo, fora do alvo).
[00684] Em algumas modalidades, em uma abordagem racional do projeto de oligonucleotídeo DMD, os oligonucleotídeos são projetados levando em consideração as estruturas secundárias das transcrições de distrofina, por exemplo, mRNA. O oligonucleotídeo projetado pode, então ser avaliado para salto de éxon. Vários oligonucleotídeos DMD eficazes foram projetados com o uso de abordagens racionais descritas na presente revelação.
[00685] Em algumas modalidades, de modo alternativo ou adicional, a caminhada de sequência, por exemplo, de uma sequência de éxons pode ser realizada para pesquisa de sequências de oligonucleotídeos DMD eficazes. Em algumas modalidades, os métodos fornecidos compreendem a caminhada de sequência. Em algumas modalidades, um conjunto de oligonucleotídeos sobrepostos é gerado. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos em um conjunto têm o mesmo comprimento, e as extremidades 5' dos oligonucleotídeos no conjunto são uniformemente separadas. Em algumas modalidades, um conjunto de oligonucleotídeos sobrepostos abrange todo o éxon ou uma porção (ou porções) do mesmo. As extremidades 5' dos oligonucleotídeos em uma caminhada podem ser uniformemente espaçadas a uma distância adequada, por exemplo, 1 base separada, 2 bases separadas, 3 bases separadas, etc. Entre outros fatores, a presente revelação demonstra que as sequências podem ser otimizadas e em combinação com s tecnologias química e/ou estereoquímica da presente revelação, oligonucleotídeos altamente eficazes (e composições e métodos de uso dos mesmos) podem ser preparados. Tecnologias Exemplificativas para Avaliar Oligonucleotídeos e Composições de Oligonucleotídeo
[00686] Várias tecnologias para avaliar as propriedades e/ou atividades de oligonucleotídeos podem ser utilizadas, de acordo com a presente revelação, por exemplo, US 20170037399, WO 2017/015555, WO 2017/015575, WO 2017/192664, WO 2017/062862, WO 2017/192679, WO 2017/210647, etc.
[00687] Por exemplo, os oligonucleotídeos DMD podem ser avaliados em relação à sua capacidade de mediar o salto de éxon em vários ensaios, incluindo ensaios in vitro e in vivo, de acordo com a presente revelação. Os ensaios in vitro podem ser realizados em várias células de teste descritas no presente documento ou conhecidas na técnica, incluindo, porém sem limitação, ∆48-50 Células de Mioblasto Derivadas do Paciente. Os testes in vivo podem ser realizados em animais de teste descritos no presente documento ou conhecidos na técnica, incluindo, porém sem limitação, um camundongo, rato, gato, porco, cão, macaco ou primata não humano.
[00688] Como exemplos não limitantes, vários ensaios são descritos abaixo para avaliar as propriedades/atividades de oligonucleotídeos DMD. Vários outros ensaios adequados estão disponíveis e podem ser utilizados para avaliar as propriedades/atividades de oligonucleotídeo, inclusive aquelas de oligonucleotídeos não projetados para salto de éxon (por exemplo, para oligonucleotídeos que podem envolver RNase H para reduzir os níveis de transcrições alvo, ensaios descritos nos documentos US 20170037399, WO 2017/015555, WO 2017/015575, WO 2017/192664, WO 2017/192679, WO 2017/210647, etc.).
[00689] Um oligonucleotídeo DMD pode ser avaliado em relação à sua capacidade de mediar o salto de um éxon no RNA Distrofina, que pode ser testado, como exemplos não limitantes, com o uso de PCR aninhada, qRT-PCR e/ou sequenciamento.
[00690] Um oligonucleotídeo DMD pode ser avaliado em relação à sua capacidade de mediar a restauração de proteína (por exemplo, produção de uma proteína internamente truncada que carece dos aminoácidos que correspondem aos códons codificados no éxon ignorado, que tem funções aprimoradas em comparação com as proteínas (se houver) produzidas antes do salto de éxon), que pode ser avaliada por vários métodos para detecção e/ou quantificação de proteína, tal como western blot, imunocoloração, etc. Os anticorpos para distrofina são comercialmente disponíveis ou se desejado, podem ser desenvolvidos para propósitos desejados.
[00691] Um oligonucleotídeo DMD pode ser avaliado em relação à sua capacidade de mediar a produção de uma proteína restaurada estável. A estabilidade da proteína restaurada pode ser testada, nos exemplos não limitantes, em ensaio para estabilidade de soro e tecido.
[00692] Um oligonucleotídeo DMD pode ser avaliado em relação à sua capacidade de se ligar à proteína, tal como albumina. As tecnologias relacionadas exemplificativas incluem aquelas descritas, por exemplo, nos documentos WO 2017/015555, WO 2017/015575, etc.
[00693] Um oligonucleotídeo DMD pode ser avaliado em relação á imunoatividade, por exemplo, através de ensaios para ativação de citocina, ativação de complemento, atividade de TLR9, etc. As tecnologias relacionadas exemplificativas incluem aquelas descritas, por exemplo, nos documentos WO 2017/015555, WO 2017/015575, WO 2017/192679, WO 2017/210647, etc.
[00694] Em algumas modalidades, a eficácia de um oligonucleotídeo DMD pode ser testada, por exemplo, em análise e previsão in silico, um extrato livre de células, uma célula transfectada com construtos artificiais, um animal, tal como um camundongo com um transgene da Distrofina humana ou porção do mesmo, linhagens celulares miogênicas humanas normais e distróficas e/ou ensaios clínicos. Pode ser desejável utilizar mais de um ensaio, à medida que as linhagens celulares miogênicas humanas normais e distróficas podem, algumas vezes, produzir resultados de eficácia diferentes sob determinadas condições (Mitrpant et al. 2009 Mol. Ther. 17 1418).
[00695] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos DMD podem ser testados em células in vitro. Em algumas modalidades, o teste in vitro em células envolve entrega gimnótica do oligonucleotídeo (ou oligonucleotídeos), ou entrega com o uso de um agente de entrega ou transfectante, muitos dos quais são conhecidos na técnica e podem ser utilizados, de acordo com a presente revelação.
[00696] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos DMD podem ser testados in vitro em células do músculo esquelético humano normais (hSkMCs). Consulte, por exemplo, Arechavala et al. 2007 Hum. Gene Ther. 18 798-810.
[00697] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos DMD podem ser testados em explante muscular de um paciente com DMD. Os explantes musculares de pacientes com DMD são relatados, por exemplo, em Fletcher et al. 2006 J. Gene Med. 8: 207-216; McClorey et al. 2006 Neur. Dis. 16: 583- 590; e Arechavala et al. 2007 Hum. Gene Ther. 18 798-810.
[00698] Em algumas modalidades, as células são ou compreendem células musculares cultivadas de pacientes com DMD. Consulte, por exemplo: Aartsma-Rus et al. 2003 Hum. Mol. Genet. 8: 907-914.
[00699] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo DMD individual pode demonstrar variabilidade de experimento para experimento em sua capacidade de ignorar um éxon sob determinadas circunstâncias. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo DMD individual pode demonstrar variabilidade em sua capacidade de ignorar um éxon (ou éxons) dependendo de quais células são usadas, das condições de crescimento e outros fatores experimentais. Para controlar variações, tipicamente os oligonucleotídeos a serem testados e os oligonucleotídeos de controle são analisados sob condições iguais ou substancialmente iguais.
[00700] Os experimentos in vitro também incluem aqueles conduzidos com mioblastos derivados do paciente. Determinados resultados de tais experimentos foram descritos no presente documento. Em determinados experimentos, as células foram cultivadas em meio de crescimento esquelético para manter as mesmas em um estado de mioblasto de divisão/imaturo. O meia foi, então, alterado para meio de ‘diferenciação' (contendo insulina e soro de cavalo a 2%) simultaneamente com oligonucleotídeos de pico no meio para dosagem. As células diferenciadas nos miotubos à medida que elas foram se tonando dosadas por um período de tempo adequado, por exemplo, um total de 4d para experimentos de RNA e 6d para experimentos de proteína (tais condições denominadas como ‘pré-diferenciação 0d' (0d + 4d para RNA, 0d + 6d para proteína)).
[00701] Sem se ater a nenhuma teoria particular, a presente revelação observa que pode ser desejável saber se os oligonucleotídeos DMD têm capacidade de entrar nos miotubos maduros e induzir o salto nessas células, assim como nas ‘células imaturas'. Em algumas modalidades, a presente revelação forneceu ensaios para testar os efeitos dos oligonucleotídeos DMD em miotubos. Em algumas modalidades, um cronograma de dosagem diferente da ‘pré-diferenciação 0d' foi usado, em que os mioblastos foram pré-diferenciados nos miotubos em meio de diferenciação por vários dias (4d ou 7d ou 10d) e, então os oligonucleotídeos DMD foram administrados. Determinados protocolos relacionados são descritos no Exemplo
19.
[00702] Em algumas modalidades, a presente revelação demonstrou que, nos experimentos de pré- diferenciação, os oligonucleotídeos DMD (excluindo aqueles que são PMOs) geralmente geram aproximadamente o mesmo nível de salto de RNA e restauração de proteína distrofina, independentemente do número de dias que as células foram cultivadas em meio de diferenciação antes da dosagem. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece oligonucleotídeos que podem ter capacidade de entrar e ser ativos em mioblastos e em miotubos. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo DMD é testado in vitro no paciente Δ45-52 com células DMD (também designadas D45-52 ou del45-52) ou paciente
Δ52 com células DMD (também designadas D52 ou del52) com 0, 4 ou 7 dias de pré-diferenciação.
[00703] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos DMD podem ser testados em qualquer um ou mais dentre vários modelos animais, incluindo modelos não mamíferos e mamíferos; incluindo, como exemplos não limitantes, Caenorhabditis, Drosophila, zebrafish, camundongo, rato, gato, cão e porco. Consulte, por exemplo, uma análise em McGreevey et al. 2015 Dis. Mod. Mech. 8 195-213.
[00704] O uso exemplificativo de camundongos mdx é relatado, por exemplo, em: Lu et al. 2003 Nat. Med. 9: 1009; Jearawiriyapaisarn et al. 2008 Mol. Ther., 16, 1624– 1629; Yin et al. 2008 Hum. Mol. Genet., 17, 3909–3918; Wu et al. 2009 Mol. Ther., 17, 864–871; Wu et al. 2008 Proc. Natl Acad. Sci. USA, 105, 14814–14819; Mann et al. 2001 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 98: 42-47; e Gebski et al. 2003 Hum. Mol. Gen. 12: 1801-1811.
[00705] A eficácia dos oligonucleotídeos DMD pode ser testada em cães, tal como o modelo animal de Distrofia Muscular do Golden Retriever (GRMD). Lu et al. 2005 Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 102:198-203; Alter et al. 2006 Nat. Med. 12:175-7; McClorey et al. 2006 Gene Ther. 13:1373-81; e Yokota et al. 2012 Nucl. Acid Ther. 22 306.
[00706] Um oligonucleotídeo DMD pode ser avaliado in vivo em um animal de teste para entrega eficiente para vários tecidos (por exemplo, músculo esquelético, cardíaco e/ou do diafragma); isso pode testado, em exemplos não limitantes, por ELISA de hibridização e testes para distribuição em tecido animal.
[00707] Um oligonucleotídeo DMD pode ser avaliado in vivo em um animal de teste para PK de plasma; isso pode ser testado, como exemplos não limitantes, por ensaio para AUC (área sob a curva) e meia-vida.
[00708] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos DMD podem ser testados in vivo, por meio de uma administração intramuscular a um músculo de um animal de teste.
[00709] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos DMD podem ser testados in vivo, por meio de uma administração intramuscular no músculo gastrocnêmio de um animal de teste.
[00710] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos DMD podem ser testados in vivo, por meio de uma administração intramuscular no músculo gastrocnêmio de um camundongo.
[00711] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos DMD podem ser testados in vivo, por meio de uma administração intramuscular no músculo gastrocnêmio de um modelo de camundongo transgênico para todo o locus de distrofina humana. Consulte, por exemplo: Bremmer-Bout et al. 2004 Mol. Ther. 10, 232–240.
[00712] Testes adicionais que podem ser realizados para avaliar a eficácia de oligonucleotídeos DMO incluem contagens de fibra centralmente nucleada e contagens de fibras positivas para distrofina, e análise de força de preensão funcional. Consulte, como exemplos não limitantes, os protocolos experimentais relatados em: Yin et al. 2009 Hum. Mol. Genet. 18: 4405-4414.
[00713] Os métodos de teste adicionais de oligonucleotídeos DMD incluem, como exemplo não limitante, os métodos relatados em: Kinali et al. 2009 Lancet 8: 918; Bertoni et al. 2003 Hum. Mol. Gen. 12: 1087-1099. Determinadas Modalidades de Oligonucleotídeos e Composições dos Mesmos
[00714] Entre outros fatores, a presente revelação fornece oligonucleotídeos, e composições e métodos de uso dos mesmos, úteis para alvejamento de vários genes, incluindo produtos codificados através dos mesmos e/ou afecções, doenças e/ou distúrbios associados aos mesmos. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece oligonucleotídeos, e composições e métodos de uso dos mesmos, para DMD. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece um oligonucleotídeo DMD, em que a sequência de base do oligonucleotídeo DMD é ou compreende pelo menos 15 bases contíguas da sequência de qualquer oligonucleotídeo DMD listado no presente documento. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece um oligonucleotídeo DMD, em que a sequência de base do oligonucleotídeo DMD é ou compreende pelo menos 15 bases contíguas da sequência de qualquer oligonucleotídeo DMD listado no presente documento, e em que o oligonucleotídeo DMD é menor que cerca de 50 bases de comprimento. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece um oligonucleotídeo ou uma composição de oligonucleotídeo que compreende uma ligação internucleotídica não negativamente carregada.
[00715] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição quiralmente controlada de um oligonucleotídeo DMD (uma pluralidade de oligonucleotídeos DMD), em que a sequência de base do oligonucleotídeo DMD é ou compreende pelo menos 15 bases contíguas da sequência de qualquer oligonucleotídeo DMD listado no presente documento. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição quiralmente controlada de um oligonucleotídeo DMD, em que a sequência de base do oligonucleotídeo DMD é ou compreende pelo menos 15 bases contíguas da sequência de qualquer oligonucleotídeo DMD listado no presente documento, e em que o oligonucleotídeo DMD é menor que cerca de 50 bases de comprimento.
[00716] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece um oligonucleotídeo quiralmente controlado que tem uma sequência que consiste em ou que compreende uma sequência ou uma porção de 15 bases da mesma encontrada em qualquer oligonucleotídeo listado na Tabela A1, em que um ou mais U podem ser opcional e independentemente substituídos por T ou vice-versa.
[00717] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece um oligonucleotídeo quiralmente controlado que compreende uma sequência de UCAAGGAAGAUGGCAUUUCU, CUCCGGUUCUGAAGGUGUUC, ou UUCUGAAGGUGUUCUUGUAC, ou uma porção da mesma de pelo menos 15 bases de comprimento, em que cada U pode ser opcional e independentemente substituído por T, em que pelo menos uma ligação internucleotídica é uma ligação internucleotídica quiralmente controlada. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece um oligonucleotídeo quiralmente controlado que compreende uma sequência de UCAAGGAAGAUGGCAUUUCU, CUCCGGUUCUGAAGGUGUUC, ou UUCUGAAGGUGUUCUUGUAC, ou uma porção da mesma de pelo menos 15 bases de comprimento, em que cada U pode ser opcional e independentemente substituído por T, em que pelo menos uma ligação internucleotídica quiralmente controlada tem a estrutura da fórmula I, I-a, I-b, I-c, I-n-1, I-n-2, I-n-3, I- n-4, II, II-a-1, II-a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II- d-1, II-d-2, III, ou uma forma de sal da mesma.
Em algumas modalidades, a presente revelação fornece um oligonucleotídeo quiralmente controlado que compreende uma sequência de UCAAGGAAGAUGGCAUUUCU, CUCCGGUUCUGAAGGUGUUC, ou UUCUGAAGGUGUUCUUGUAC, ou uma porção da mesma de pelo menos 15 bases de comprimento, em que cada U pode ser opcional e independentemente substituído por T, em que pelo menos uma ligação internucleotídica quiralmente controlada tem a estrutura da fórmula I, I-a, I-b, I-c, I-n-1, I-n-2, I-n-3, I- n-4, II, II-a-1, II-a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II- d-1, II-d-2, ou uma forma de sal da mesma.
Em algumas modalidades, a presente revelação fornece um oligonucleotídeo quiralmente controlado que compreende uma sequência de UCAAGGAAGAUGGCAUUUCU, CUCCGGUUCUGAAGGUGUUC, ou UUCUGAAGGUGUUCUUGUAC, ou uma porção da mesma de pelo menos 15 bases de comprimento, em que cada U pode ser opcional e independentemente substituído por T, em que cada ligação internucleotídica tem a estrutura da fórmula I, I-a, I-b, I- c, I-n-1, I-n-2, I-n-3, I-n-4, II, II-a-1, II-a-2, II-b-1, II- b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, II-d-2, ou uma forma de sal da mesma.
Em algumas modalidades, a presente revelação fornece um oligonucleotídeo quiralmente controlado que compreende uma sequência de UCAAGGAAGAUGGCAUUUCU, CUCCGGUUCUGAAGGUGUUC, ou UUCUGAAGGUGUUCUUGUAC, ou uma porção da mesma de pelo menos 15 bases de comprimento, em que cada U pode ser opcional e independentemente substituído por T, em que pelo menos uma ligação internucleotídica tem a estrutura da fórmula I-c ou uma forma de sal da mesma.
Em algumas modalidades, a presente revelação fornece um oligonucleotídeo quiralmente controlado que compreende uma sequência de UCAAGGAAGAUGGCAUUUCU, CUCCGGUUCUGAAGGUGUUC, ou UUCUGAAGGUGUUCUUGUAC, ou uma porção da mesma de pelo menos 15 bases de comprimento, em que cada U pode ser opcional e independentemente substituído por T, em que pelo menos uma ligação internucleotídica tem a estrutura da fórmula I-c ou uma forma de sal da mesma, e pelo menos uma ligação internucleotídica é uma ligação internucleotídica não negativamente carregada. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece um oligonucleotídeo quiralmente controlado que compreende uma sequência de UCAAGGAAGAUGGCAUUUCU, CUCCGGUUCUGAAGGUGUUC, ou UUCUGAAGGUGUUCUUGUAC, ou uma porção da mesma de pelo menos 15 bases de comprimento, em que cada U pode ser opcional e independentemente substituído por T, em que pelo menos uma ligação internucleotídica é uma ligação internucleotídica fosforotioato quiralmente controlada, e pelo menos uma ligação internucleotídica é uma ligação internucleotídica não negativamente carregada que tem a estrutura da fórmula I-n-1, I-n-2, I-n-3, I-n-4, II, II-a-1, II-a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, II-d-2, ou uma forma de sal da mesma. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece um oligonucleotídeo quiralmente controlado que compreende uma sequência de UCAAGGAAGAUGGCAUUUCU, CUCCGGUUCUGAAGGUGUUC, ou UUCUGAAGGUGUUCUUGUAC, ou uma porção da mesma de pelo menos 15 bases de comprimento, em que cada U pode ser opcional e independentemente substituído por T, em que cada ligação internucleotídica é um fosfodiéster.
[00718] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo compreende uma ou mais ligações internucleotídicas que compreendem uma modificação de fósforo propensa a se "autoliberar" sob determinadas condições. Ou seja, sob determinadas condições, uma modificação de fósforo particular é projetada de modo que a mesma se autoclive a partir do oligonucleotídeo para fornecer, por exemplo, um diéster de fosfato, tais como aqueles encontrados no DNA e RNA de ocorrência natural. Em algumas modalidades, tal modificação de fósforo tem a estrutura de –O–L–R1, em que cada um dentre L e R1 é independentemente conforme descrito na presente revelação.
[00719] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido da presente revelação compreende modificações químicas e/ou estereoquímica que entregam propriedades desejáveis, por exemplo, entrega para células/tecidos/órgãos alvo, farmacodinâmica, farmacocinética, etc.
[00720] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo compreende uma modificação em um fósforo de ligação que pode ser transformada em uma ligação fosfato natural por uma ou mais esterases, nucleases e/ou enzimas do citocromo P450, incluindo, porém sem limitação: CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1, CYP2A6, CYP2A7, CYP2A13, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C18, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1, CYP2F1, CYP2J2, CYP2R1, CYP2S1, CYP2U1, CYP2W1, CYP3A4, CYP3A5, CYP3A7, CYP3A43, CYP4A11, CYP4A22, CYP4B1, CYP4F2, CYP4F3, CYP4F8, CYP4F11, CYP4F12, CYP4F22, CYP4V2, CYP4X1, CYP4Z1, CYP5A1, CYP7A1, CYP7B1, CYP8A1 (sintase de prostaciclina), CYP8B1 (biossíntese de ácido biliar), CYP11A1, CYP11B1, CYP11B2, CYP17A1, CYP19A1, CYP20A1, CYP21A2, CYP24A1, CYP26A1, CYP26B1, CYP26C1, CYP27A1 (biossíntese de ácido biliar), CYP27B1 (vitamina D3 1-alfa hidroxilase, ativa a vitamina D3), CYP27C1
(função desconhecida), CYP39A1, CYP46A1, e CYP51A1 (lanosterol 14-alfa demetilase).
[00721] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo compreende uma modificação em um fósforo de ligação que é uma porção química de pró-fármaco, por exemplo, uma porção química de modificação P facilita a entrega de um oligonucleotídeo a um local desejado antes da remoção. Por exemplo, em algumas modalidades, uma porção química de modificação P resulta da PEGuilação no fósforo de ligação. Uma pessoa versada na técnica relevante irá observar que vários comprimentos de cadeia PEG são úteis e que a seleção de comprimento de cadeia será determinada, em parte, pelo resultado que se pretender alcançar por meio de PEGuilação. Por exemplo, em algumas modalidades, a PEGuilação é efetuada a fim de reduzir a absorção de RES e prolongar a vida útil de circulação in vivo de um oligonucleotídeo.
[00722] Em algumas modalidades, um reagente de PEGuilação para uso de acordo com a presente revelação tem um peso molecular de cerca de 300 g/mol a cerca de 100,000 g/mol. Em algumas modalidades, um reagente de PEGuilação tem um peso molecular de cerca de 300 g/mol a cerca de 10,000 g/mol. Em algumas modalidades, um reagente de PEGuilação tem um peso molecular de cerca de 300 g/mol a cerca de 5.000 g/mol. Em algumas modalidades, um reagente de PEGuilação tem um peso molecular de cerca de 500 g/mol. Em algumas modalidades, um reagente de PEGuilação tem um peso molecular de cerca de 1,000 g/mol. Em algumas modalidades, um reagente de PEGuilação tem um peso molecular de cerca de 3,.000 g/mol. Em algumas modalidades, um reagente de PEGuilação tem um peso molecular de cerca de 5,000 g/mol.
[00723] Em determinadas modalidades, um reagente de PEGuilação é PEG500. Em determinadas modalidades, um reagente de PEGuilação é PEG1000. Em determinadas modalidades, um reagente de PEGuilação é PEG3000. Em determinadas modalidades, um reagente de PEGuilação é PEG5000.
[00724] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo compreende uma porção química de modificação P que atua como um intensificador de PK, por exemplo, lipídios, lipídios PEGuilados, etc.
[00725] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos da presente revelação, por exemplo, oligonucleotídeos DMD, compreendem uma porção química de modificação P que promove a entrada celular e/ou escape endossomal, tal como um lipídio ou peptídeo de membrana disruptiva.
[00726] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo compreende a porção química de modificação P que atua como uma porção química de alvejamento. Em algumas modalidades, uma porção química de modificação P é ou compreende uma porção química de alvejamento. Em algumas modalidades, uma porção química alvo é uma entidade que se associa a uma carga útil de interesse (por exemplo, com um oligonucleotídeo ou composição de oligonucleotídeo) e também interage com um sítio alvo de interesse, de modo que a carga útil de interesse é seja alvejada ao sítio alvo de interesse quando associada à porção química de alvejamento a uma extensão materialmente maior do que é observado sob condições, de outro modo, comparáveis quando a carga útil de interesse não é associada à porção química de alvejamento. A porção química de alvejamento pode ser, ou compreender, qualquer uma dentre uma variedade de porções químicas, incluindo, por exemplo, porções químicas de molécula pequena, polipeptídeos, carboidratos, etc. As porções químicas de alvejamento são descritas, por exemplo, em Adarsh et al., "Organelle Specific Targeted Drug Delivery – A Review", International Journal of Research in Pharmaceutical e Biomedical Sciences, 2011, p. 895.
[00727] Os exemplos de tais porções químicas de alvejamento incluem, porém sem limitação, proteínas (por exemplo Transferrina), oligopeptídeos (por exemplo, oligopeptídeos contendo RGD cíclicos e acíclicos), anticorpos (anticorpos monoclonais e policlonais, por exemplo anticorpos IgG, IgA, IgM, IgD, IgE), açúcares/carboidratos (por exemplo, monossacarídeos e/ou oligossacarídeos (manose, manose-6- fosfato, galactose, e similares)), vitaminas (por exemplo, folato), ou outras biomoléculas pequenas. Em algumas modalidades, uma porção química de alvejamento é uma molécula esteroide (por exemplo, ácidos biliares incluindo ácido cólico, ácido desoxicólico, ácido biliar ácido desidrocólico; cortisona; digoxigenina; testosterona; colesterol; esteroides catiônicos tal como cortisona tendo um grupo trimetilaminometil hidrazida ligado através de uma ligação dupla na posição 3 do anel cortisona, etc.). Em algumas modalidades, uma porção química de alvejamento é uma molécula lipofílica (por exemplo, hidrocarbonetos alicíclicos, ácidos graxos saturados e insaturados, cercas, terpenos, e hidrocarbonetos polialicíclicos, tais como adamantina e buckminsterfullerenos). Em algumas modalidades, uma molécula lipofílica é um terpenoide, tal como vitamina A, ácido retinoico, retinal ou desidrorretinal. Em algumas modalidades, uma porção química de alvejamento é um peptídeo.
[00728] Em algumas modalidades, uma porção química de modificação P é uma porção química de alvejamento que tem a estrutura de −X−L−R1 em que cada um dentre X, L, e R1 é independentemente conforme descrito na presente revelação.
[00729] Em algumas modalidades, uma porção química de modificação P facilita a entrega específica da célula.
[00730] Em algumas modalidades, uma porção química de modificação P pode realizar uma ou mais de uma função. Por exemplo, em algumas modalidades, uma porção química de modificação P atua como um intensificador PK e um aglutinante de alvejamento. Em algumas modalidades, uma porção química de modificação P atua como um pró-fármaco e um agente de escape endossomal. Várias outras combinações são possíveis e estão incluídas na presente revelação. Determinados Exemplos de Oligonucleotídeos e Composições
[00731] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece oligonucleotídeos e/ou composições de oligonucleotídeo que são úteis para vários propósitos, por exemplo, modular, ignorar, reduzir os níveis de transcrições, aprimorar os níveis de proteínas benéficas, tratar afecções, doenças e distúrbios, etc. Em algumas modalidades, uma presente revelação fornece composições de oligonucleotídeo com propriedades aprimoradas, por exemplo, atividades aumentadas, toxicidades reduzidas, etc. Entre outros fatores, os oligonucleotídeos da presente revelação compreendem modificações químicas, estereoquímica e/ou combinações dos mesmos que podem aprimorar várias propriedades e atividades dos oligonucleotídeos. Os exemplos não limitantes são listados na Tabela A1. Em algumas modalidades, um tipo de oligonucleotídeo é um tipo conforme definido pela sequência de base, padrão de ligações de cadeia principal, padrão de centros quirais de cadeia principal e padrão de modificações de fósforo de cadeia principal de um oligonucleotídeo na Tabela A1, em que o oligonucleotídeo compreende pelo menos uma ligação internucleotídica quiralmente controlada (pelo menos um R ou S em "Estereoquímica/Ligação"). Em algumas modalidades, uma pluralidade de oligonucleotídeos de um tipo de oligonucleotídeo particular é uma pluralidade de um oligonucleotídeo na Tabela A1 (por exemplo, uma pluralidade de oligonucleotídeos é uma pluralidade de WV-1095). Em algumas modalidades, uma pluralidade de oligonucleotídeos em uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada é uma pluralidade de um oligonucleotídeo na Tabela A1 (por exemplo, uma pluralidade de oligonucleotídeos é uma pluralidade de WV- 1095), em que o oligonucleotídeo compreende pelo menos uma ligação internucleotídica quiralmente controlada (pelo menos um R ou S em "Estereoquímica/Ligação").
[00732] A Tabela A1 lista os exemplos não limitantes de oligonucleotídeos DMD. Todos os oligonucleotídeos na Tabela A1 são oligonucleotídeos DMD, exceto para WV-12915, WV-12914, WV-12913, WV-12912, WV-12911, WV-12910, WV-12909, WV-12908, WV-12907, WV-12906, WV-12905, WV-12904, WV-15887, WV-24100, WV-24101, WV-24102, WV-24103, WV-24104, WV-24105, WV-24106, WV-24107, WV-24108, WV-24109, WV-24110, WV-XBD108, WV-XBD 109, WV-XBD 110, WV-XKCD108, WV- XKCD 109, WV-XKCD 110, todos os quais têm como alvo Malat-1, que é um gene alvo diferente de DMD.
[00733] Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a um oligonucleotídeo ou composição de oligonucleotídeo, em que a sequência de base do oligonucleotídeo compreende pelo menos 15 bases contíguas, com 1 a 3 disparidades, da sequência de base de um oligonucleotídeo DMD revelado na Tabela A1. Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a um oligonucleotídeo ou composição de oligonucleotídeo, em que a sequência de base do oligonucleotídeo compreende pelo menos 15 bases da sequência de base de um oligonucleotídeo DMD revelado na Tabela A1. Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a um oligonucleotídeo ou composição de oligonucleotídeo, em que a sequência de base do oligonucleotídeo compreende a sequência de base de um oligonucleotídeo DMD revelado na Tabela A1. Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a um oligonucleotídeo ou composição de oligonucleotídeo, em que a sequência de base do oligonucleotídeo é a sequência de base de um oligonucleotídeo DMD revelado na Tabela A1.
[00734] Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a um oligonucleotídeo ou composição de oligonucleotídeo, em que a sequência de base do oligonucleotídeo compreende pelo menos 15 bases contíguas, com 1 a 3 disparidades, da sequência de base de um oligonucleotídeo DMD revelado na Tabela A1, ou em que a sequência de base do oligonucleotídeo compreende pelo menos 15 bases contíguas da sequência de base de um oligonucleotídeo DMD revelado na Tabela A1, ou em que a sequência de base do oligonucleotídeo compreende a sequência de base de um oligonucleotídeo DMD revelado na Tabela A1, ou em que a sequência de base do oligonucleotídeo é a sequência de base de um oligonucleotídeo
DMD revelado na Tabela A1; e em que o oligonucleotídeo é estereoaleatório (por exemplo, não quiralmente controlado), ou o oligonucleotídeo é quiralmente controlado e/ou o oligonucleotídeo compreende pelo menos uma ligação internucleotídica que é quiralmente controlada e/ou o oligonucleotídeo compreende opcionalmente uma modificação de açúcar que é um LNA e/ou o oligonucleotídeo compreende um açúcar que é uma desoxirribose natural, um 2'-OMe ou um 2'- MOE. Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a um oligonucleotídeo que tem capacidade para mediar o salto de um éxon DMD, em que o oligonucleotídeo compreende pelo menos um LNA.
[00735] Na tabela a seguir, ID indica a identificação ou número de oligonucleotídeo; e a Descrição indica a sequência modificada. Tabela A1. Oligonucleotídeos Exemplificativos. Sequência de Base Ligação/Estereoquímic ID Descrição Nua a ONT- mU*S mC*S UCAAGGAAGAUGGCAUUUC SSSSSSSSSSSSSSSSSSS 395 mA*S mA*S mG*S U mG*S mA*S mA*S mG*S mA*S mU*S mG*S mG*S mC*S mA*S mU*S mU*S mU*S mC*S mU WV- G * G * C * C GGCCAAACCTCGGCTTACC XXXXX XXXXX XXXXX XXXX 1093 * A * A * A * T C * C * T * C * G * G * C * T * T * A * C
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XXXX
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8484 Aeo * Aeo * Geo * Aeo * Teo * XXXXX Geo * Geo * m5Ceo * mA * mU XXXXX * mU * mU * mC * mU XXXX WV- fU * fC * fA * fA * fG * fG * UCAAGGAAGATGGCAUUUCU XXXXX 8485 Aeo * Aeo * Geo * Aeo * Teo * XXXXX Geo * Geo * mC * mA * mU * XXXXX mU * mU * mC * mU XXXX WV- fU * fC * fA * fA * fG * fG * UCAAGGAAGATGGCAUUUCU XXXXX 8486 Aeo * Aeo * Geo * Aeo * Teo * XXXXX Geo * mG * mC * mA * mU * XXXXX mU * mU * mC * mU XXXX WV- fU * fC * fA * fA * fG * fG * UCAAGGAAGATGGCAUUUCU XXXXX 8487 Aeo * Aeo * Geo * Aeo * Teo * XXXXX mG * mG * mC * mA * mU * XXXXX mU * mU * mC * mU XXXX WV- fU * fC * fA * fA * fG * fG * UCAAGGAAGAUGGCAUUUCU XXXXX 8488 Aeo * Aeo * Geo * Aeo * mU * XXXXX mG * mG * mC * mA * mU * XXXXX mU * mU * mC * mU XXXX WV- fU * fC * fA * fA * fG * fG * UCAAGGAAGAUGGCAUUUCU XXXXX 8489 Aeo * Aeo * Geo * mA * mU * XXXXX mG * mG * mC * mA * mU * XXXXX mU * mU * mC * mU XXXX WV- fU * fC * fA * fA * fG * fG * UCAAGGAAGAUGGCAUUUCU XXXXX 8490 Aeo * Aeo * mG * mA * mU * XXXXX mG * mG * mC * mA * mU * XXXXX mU * mU * mC * mU XXXX WV- fU * fC * fA * fA * fG * fG * UCAAGGAAGAUGGCAUUUCU XXXXX 8491 Aeo * mA * mG * mA * mU * XXXXX mG * mG * mC * mA * mU * XXXXX mU * mU * mC * mU XXXX WV- Teo * m5Ceo * Aeo * Aeo * Geo TCAAGGAAGATGGCAUUUCU XXXXX 8492 * Geo * Aeo * Aeo * Geo * Aeo XXXXX * Teo * Geo * Geo * m5Ceo * XXXXX fA * fU * fU * fU * fC * fU XXXX WV- mU * m5Ceo * Aeo * Aeo * Geo UCAAGGAAGATGGCAUUUCU XXXXX 8493 * Geo * Aeo * Aeo * Geo * Aeo XXXXX * Teo * Geo * Geo * m5Ceo * XXXXX fA * fU * fU * fU * fC * fU XXXX WV- mU * mC * Aeo * Aeo * Geo * UCAAGGAAGATGGCAUUUCU XXXXX 8494 Geo * Aeo * Aeo * Geo * Aeo * XXXXX Teo * Geo * Geo * m5Ceo * fA XXXXX * fU * fU * fU * fC * fU XXXX WV- mU * mC * mA * Aeo * Geo * UCAAGGAAGATGGCAUUUCU XXXXX 8495 Geo * Aeo * Aeo * Geo * Aeo * XXXXX Teo * Geo * Geo * m5Ceo * fA XXXXX * fU * fU * fU * fC * fU XXXX WV- mU * mC * mA * mA * Geo * UCAAGGAAGATGGCAUUUCU XXXXX 8496 Geo * Aeo * Aeo * Geo * Aeo * XXXXX Teo * Geo * Geo * m5Ceo * fA XXXXX * fU * fU * fU * fC * fU XXXX WV- mU * mC * mA * mA * mG * UCAAGGAAGATGGCAUUUCU XXXXX 8497 Geo * Aeo * Aeo * Geo * Aeo * XXXXX Teo * Geo * Geo * m5Ceo * fA XXXXX * fU * fU * fU * fC * fU XXXX WV- mU * mC * mA * mA * mG * UCAAGGAAGATGGCAUUUCU XXXXX 8498 mG * Aeo * Aeo * Geo * Aeo * XXXXX Teo * Geo * Geo * m5Ceo * fA XXXXX
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WV- Teo * m5Ceo * Aeo * Aeo * Geo TCAAGGAAGATGGCATTTCT XXXXX 8506 * Geo * Aeo * Aeo * Geo * Aeo XXXXX * Teo * Geo * Geo * m5Ceo * XXXXX Aeo * Teo * Teo * Teo * m5Ceo XXXX * Teo WV- CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTA CTCCAACATCAAGGAAGATG XXXXX 8806 G [todos PMO] G CATTTCTAG XXXXX
XXXXX
XXXXX WV- mU * R mC * R mA * R mA * UCAAGGAAGAUGGCAUUUCU RRRRR 884 R mG * R mG * R mA * R mA * RRRRR R mG * R mA * R mU * R mG * RRRRR R mG * R mC * R mA * R mU * RRRR R mU * R mU * R mC * R mU WV- mU * S mC * R mA * S mA * R UCAAGGAAGAUGGCAUUUCU SRSRS 885 mG * S mG * R mA * S mA * R RSRSR mG * S mA * R mU * S mG * R SRSRS mG * S mC * R mA * S mU * R RSRS mU * S mU * R mC * S mU WV- mU * R mC * R mA * R mA * UCAAGGAAGAUGGCAUUUCU RRRSS 886 S mG * S mG * S mA * S mA * S SSSSS mG * S mA * S mU * S mG * S mG SSSSS * S mC * S mA * S mU * S mU * SRRR R mU * R mC * R mU WV- mU * S mC * S mA * S mA * R UCAAGGAAGAUGGCAUUUCU SSSRR 887 mG * R mG * R mA * R mA * RRRRR R mG * R mA * R mU * R mG * RRRRR R mG * R mC * R mA * R mU * RSSS R mU * S mU * S mC * S mU
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XXXX WV- fG * fU * fA * fC * fU * fU * GUACUUCAUCCCACUGAUUC XXXXX 9087 fC mA * fU mC * fC mC * fA mC XOXOX * fU * fG * fA * fU * fU * fC OXOXX
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137 * SfU * SmU * SmG * SmU * U SSSSS SSSS 16 SmU * SmC * SmU * SmU * SmC * SfU * SfA * SfG * SfC * SfC * SfU WV- fA * SfU * SfC * SfC * SfA AUCCACUGGAGAUUUGUCU SSSSS SSSSS 137 * SfC * SmU * SmG * SmG * G SSSSS SSSS 17 SmA * SmG * SmA * SmU * SmU * SfU * SfG * SfU * SfC * SfU * SfG WV- fA * SfG * SfA * SfU * SfU AGAUUUGUCUGCUUGAGCU SSSSS SSSSS 137 * SfU * SmG * SmU * SmC * U SSSSS SSSS 18 SmU * SmG * SmC * SmU * SmU * SfG * SfA * SfG * SfC * SfU * SfU WV- fU * SfG * SfC * SfU * SfU UGCUUGAGCUUAUUUUCAA SSSSS SSSSS 137 * SfG * SmA * SmG * SmC * G SSSSS SSSS 19 SmU * SmU * SmA * SmU * SmU * SfU * SfU * SfC * SfA * SfA * SfG WV- fU * SfA * SfU * SfU * SfU UAUUUUCAAGUUUAUCUUG SSSSS SSSSS 137 * SfU * SmC * SmA * SmA * C SSSSS SSSS 20 SmG * SmU * SmU * SmU * SmA * SfU * SfC * SfU * SfU * SfG * SfC WV- fU * SfU * SfU * SfA * SfU UUUAUCUUGCUCUUCUGGG SSSSS SSSSS 137 * SfC * SmU * SmU * SmG * C SSSSS SSSS 21 SmC * SmU * SmC * SmU * SmU * SfC * SfU * SfG * SfG * SfG * SfC
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SmG * SfA * SfU * SfU * SfG * SfU * SfU WV- fA * SfA * SfU * SfG * SfA AAUGAUUGUUCUAGCCUCU SSSSS SSSSS 137 * SfU * SmU * SmG * SmU * U SSSSS SSSS 34 SmU * SmC * SmU * SmA * SmG * SfC * SfC * SfU * SfC * SfU * SfU WV- fC * SfU * SfA * SfG * SfC CUAGCCUCUUGAUUGCUGG SSSSS SSSSS 137 * SfC * SmU * SmC * SmU * U SSSSS SSSS 35 SmU * SmG * SmA * SmU * SmU * SfG * SfC * SfU * SfG * SfG * SfU WV- fG * SfA * SfU * SfU * SfG GAUUGCUGGUCUUGUUUUU SSSSS SSSSS 137 * SfC * SmU * SmG * SmG * C SSSSS SSSS 36 SmU * SmC * SmU * SmU * SmG * SfU * SfU * SfU * SfU * SfU * SfC WV- fC * SfU * SfU * SfG * SfU CUUGUUUUUCAAAUUUUGG SSSSS SSSSS 137 * SfU * SmU * SmU * SmU * G SSSSS SSSS 37 SmC * SmA * SmA * SmA * SmU * SfU * SfU * SfU * SfG * SfG * SfG WV- fA * SfA * SfA * SfU * SfU AAAUUUUGGGCAGCGGUAA SSSSS SSSSS 137 * SfU * SmU * SmG * SmG * U SSSSS SSSS 38 SmG * SmC * SmA * SmG * SmC * SfG * SfG * SfU * SfA * SfA * SfU WV- fC * SfA * SfG * SfC * SfG CAGCGGUAAUGAGUUCUUC SSSSS SSSSS 137 * SfG * SmU * SmA * SmA * C SSSSS SSSS
39 SmU * SmG * SmA * SmG * SmU * SfU * SfC * SfU * SfU * SfC * SfC WV- fG * SfA * SfG * SfU * SfU GAGUUCUUCCAACUGGGGA SSSSS SSSSS 137 * SfC * SmU * SmU * SmC * C SSSSS SSSS 40 SmC * SmA * SmA * SmC * SmU * SfG * SfG * SfG * SfG * SfA * SfC WV- fA * SfA * SfC * SfU * SfG AACUGGGGACGCCUCUGUU SSSSS SSSSS 137 * SfG * SmG * SmG * SmA * C SSSSS SSSS 41 SmC * SmG * SmC * SmC * SmU * SfC * SfU * SfG * SfU * SfU * SfC WV- fG * SfC * SfC * SfU * SfC GCCUCUGUUCCAAAUCCUG SSSSS SSSSS 137 * SfU * SmG * SmU * SmU * C SSSSS SSSS 42 SmC * SmC * SmA * SmA * SmA * SfU * SfC * SfC * SfU * SfG * SfC WV- fU * SfG * SfU * SfU * SfC UGUUCCAAAUCCUGCAUUG SSSSS SSSSS 137 * SfC * SmA * SmA * SmA * U SSSSS SSSS 43 SmU * SmC * SmC * SmU * SmG * SfC * SfA * SfU * SfU * SfG * SfU WV- fC * SfA * SfA * SfA * SfU CAAAUCCUGCAUUGUUGCC SSSSS SSSSS 137 * SfC * SmC * SmU * SmG * U SSSSS SSSS 44 SmC * SmA * SmU * SmU * SmG * SfU * SfU * SfG * SfC * SfC * SfU WV- fC * SfU * SfU * SfU * SfU CUUUUAUGAAUGCUUCUCC SSSSS SSSSS
137 * SfA * SmU * SmG * SmA * A SSSSS SSSS 45 SmA * SmU * SmG * SmC * SmU * SfU * SfC * SfU * SfC * SfC * SfA WV- fA * SfU * SfG * SfC * SfU AUGCUUCUCCAAGAGGCAU SSSSS SSSSS 137 * SfU * SmC * SmU * SmC * U SSSSS SSSS 46 SmC * SmA * SmA * SmG * SmA * SfG * SfG * SfC * SfA * SfU * SfU WV- fA * SfA * SfG * SfA * SfG AAGAGGCAUUGAUAUUCUC SSSSS SSSSS 137 * SfG * SmC * SmA * SmU * U SSSSS SSSS 47 SmU * SmG * SmA * SmU * SmA * SfU * SfU * SfC * SfU * SfC * SfU WV- fG * SfA * SfU * SfA * SfU GAUAUUCUCUGUUAUCAUG SSSSS SSSSS 137 * SfU * SmC * SmU * SmC * U SSSSS SSSS 48 SmU * SmG * SmU * SmU * SmA * SfU * SfC * SfA * SfU * SfG * SfU WV- fG * SfU * SfU * SfA * SfU GUUAUCAUGUGGACUUUUC SSSSS SSSSS 137 * SfC * SmA * SmU * SmG * U SSSSS SSSS 49 SmU * SmG * SmG * SmA * SmC * SfU * SfU * SfU * SfU * SfC * SfU WV- fG * SfG * SfA * SfC * SfU GGACUUUUCUGGUAUCAUC SSSSS SSSSS 137 * SfU * SmU * SmU * SmC * U SSSSS SSSS 50 SmU * SmG * SmG * SmU * SmA * SfU * SfC * SfA * SfU * SfC * SfU
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SmU * SfU * SfU * SfA * SfC * SfU * SfC WV- fU * SfC * SfU * SfU * SfU UCUUUUACUCCCUUGGAGU SSSSS SSSSS 137 * SfU * SmA * SmC * SmU * C SSSSS SSSS 63 SmC * SmC * SmC * SmU * SmU * SfG * SfG * SfA * SfG * SfU * SfC WV- fC * SfC * SfU * SfU * SfG CCUUGGAGUCUUCUAGGAG SSSSS SSSSS 137 * SfG * SmA * SmG * SmU * C SSSSS SSSS 64 SmC * SmU * SmU * SmC * SmU * SfA * SfG * SfG * SfA * SfG * SfC WV- fU * SfU * SfC * SfU * SfA UUCUAGGAGCCUUUCCUUA SSSSS SSSSS 137 * SfG * SmG * SmA * SmG * C SSSSS SSSS 65 SmC * SmC * SmU * SmU * SmU * SfC * SfC * SfU * SfU * SfA * SfC WV- fC * SfU * SfU * SfU * SfC CUUUCCUUACGGGUAGCAU SSSSS SSSSS 137 * SfC * SmU * SmU * SmA * C SSSSS SSSS 66 SmC * SmG * SmG * SmG * SmU * SfA * SfG * SfC * SfA * SfU * SfC WV- fG * SfG * SfG * SfU * SfA GGGUAGCAUCCUGUAGGAC SSSSS SSSSS 137 * SfG * SmC * SmA * SmU * A SSSSS SSSS 67 SmC * SmC * SmU * SmG * SmU * SfA * SfG * SfG * SfA * SfC * SfA WV- fC * SfU * SfG * SfU * SfA CUGUAGGACAUUGGCAGUU SSSSS SSSSS 137 * SfG * SmG * SmA * SmC * G SSSSS SSSS
68 SmA * SmU * SmU * SmG * SmG * SfC * SfA * SfG * SfU * SfU * SfG WV- fU * SfU * SfG * SfG * SfC UUGGCAGUUGUUUCAGCUU SSSSS SSSSS 137 * SfA * SmG * SmU * SmU * C SSSSS SSSS 69 SmG * SmU * SmU * SmU * SmC * SfA * SfG * SfC * SfU * SfU * SfC WV- fU * SfU * SfU * SfC * SfA UUUCAGCUUCUGUAAGCCA SSSSS SSSSS 137 * SfG * SmC * SmU * SmU * G SSSSS SSSS 70 SmC * SmU * SmG * SmU * SmA * SfA * SfG * SfC * SfC * SfA * SfG WV- fU * SfG * SfU * SfA * SfA UGUAAGCCAGGCAAGAAAC SSSSS SSSSS 137 * SfG * SmC * SmC * SmA * U SSSSS SSSS 71 SmG * SmG * SmC * SmA * SmA * SfG * SfA * SfA * SfA * SfC * SfU WV- fG * SfC * SfA * SfA * SfG GCAAGAAACUUUUCCAGGU SSSSS SSSSS 137 * SfA * SmA * SmA * SmC * C SSSSS SSSS 72 SmU * SmU * SmU * SmU * SmC * SfC * SfA * SfG * SfG * SfU * SfC WV- fU * SfU * SfU * SfC * SfC UUUCCAGGUCCAGGGGGAA SSSSS SSSSS 137 * SfA * SmG * SmG * SmU * C SSSSS SSSS 73 SmC * SmC * SmA * SmG * SmG * SfG * SfG * SfG * SfA * SfA * SfC WV- fC * SfA * SfG * SfG * SfG CAGGGGGAACUGUUGCAGU SSSSS SSSSS
137 * SfG * SmG * SmA * SmA * A SSSSS SSSS 74 SmC * SmU * SmG * SmU * SmU * SfG * SfC * SfA * SfG * SfU * SfA WV- fU * SfG * SfU * SfU * SfG UGUUGCAGUAAUCUAUGAG SSSSS SSSSS 137 * SfC * SmA * SmG * SmU * U SSSSS SSSS 75 SmA * SmA * SmU * SmC * SmU * SfA * SfU * SfG * SfA * SfG * SfU WV- fA * SfU * SfC * SfU * SfA AUCUAUGAGUUUCUUCCAA SSSSS SSSSS 137 * SfU * SmG * SmA * SmG * A SSSSS SSSS 76 SmU * SmU * SmU * SmC * SmU * SfU * SfC * SfC * SfA * SfA * SfA WV- fU * SfU * SfC * SfU * SfU UUCUUCCAAAGCAGCCUCU SSSSS SSSSS 137 * SfC * SmC * SmA * SmA * C SSSSS SSSS 77 SmA * SmG * SmC * SmA * SmG * SfC * SfC * SfU * SfC * SfU * SfC WV- fG * SfC * SfA * SfG * SfC GCAGCCUCUCGCUCACUCA SSSSS SSSSS 137 * SfC * SmU * SmC * SmU * C SSSSS SSSS 78 SmC * SmG * SmC * SmU * SmC * SfA * SfC * SfU * SfC * SfA * SfC WV- fC * SfU * SfC * SfU * SfC CUCUCGCUCACUCACCCUG SSSSS SSSSS 137 * SfG * SmC * SmU * SmC * C SSSSS SSSS 79 SmA * SmC * SmU * SmC * SmA * SfC * SfC * SfC * SfU * SfG * SfC
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91 SmAfU * SfC * SfC * SfC * OSSOSSSSSS SmAfC * SfU * SmGfA * SfU * SfU * SfC * SfU * SfG * SfA WV- fU * SfU * SfG * SfU * SfA UUGUACUUCAUCCCACUGA SSSSSSSOOSOO 137 * SfC * SfU * SmUmCfA * UUCUGA O 92 SmUmCmCmCfA * SmCmUfG * OSOOSSSSSSS SfA * SfU * SfU * SfC * SfU * SfG * SfA WV- fU * SfU * SfG * SfU * SfA UUGUACUUCAUCCCACUGA SSSSSSSOSOSO 137 * SfC * SfU * SmUfC * UUCUGA SO 93 SmAfU * SmCfC * SmCfA * SOSOSSSSSS SmCfU * SmGfA * SfU * SfU * SfC * SfU * SfG * SfA WV- fU * SfU * SfG * SfU * SfA UUGUACUUCAUCCCACUGA SSSSSSSSOSOS 137 * SfC * SfU * SfU * SmCfA UUCUGA OS 94 * SmUfC * SmCfC * SmAfC * OSOSSSSSSS SmUfG * SfA * SfU * SfU * SfC * SfU * SfG * SfA WV- fC * SfC * SfG * SfG * SfU CCGGUUCUGAAGGUGUUCU SSSSSSSSSSSS 137 * SfU * SfC * SmU * SmG * UGUACU SSS 95 SmA * SmA * SmG * SmG * SSSSSSSSS SmU * SmG * SmU * SmU * SfC * SfU * SfU * SfG * SfU * SfA * SfC * SfU WV- fC * SfC * SfG * SfG * SfU CCGGUUCUGAAGGUGUUCU SSSSSSSSOOOO 137 * SfU * SfC * SfU * UGUACU O 96 SmGmAmAmGmGfU * SmGfU * SOSSSSSSSSS SfU * SfC * SfU * SfU *
SfG * SfU * SfA * SfC * SfU WV- fC * SfC * SfG * SfG * SfU CCGGUUCUGAAGGUGUUCU SSSSSSSOSSSS 137 * SfU * SfC * SmUfG * SfA UGUACU SO 97 * SfA * SfG * SfG * SmUfG SOOOSSSSSS * SmUmUmCfU * SfU * SfG * SfU * SfA * SfC * SfU WV- fC * SfC * SfG * SfG * SfU CCGGUUCUGAAGGUGUUCU SSSSSSSOSOSO 137 * SfU * SfC * SmUfG * UGUACU S 98 SmAfA * SmGfG * SmUfG * OSOSOSSSSSS SmUfU * SmCfU * SfU * SfG * SfU * SfA * SfC * SfU WV- fC * SfC * SfG * SfG * SfU CCGGUUCUGAAGGUGUUCU SSSSSSSSOSOS 137 * SfU * SfC * SfU * SmGfA UGUACU O 99 * SmAfG * SmGfU * SmGfU * SOSSSSSSSSS SmU * SfC * SfU * SfU * SfG * SfU * SfA * SfC * SfU WV- fU * SfU * SfU * SfG * SfC UUUGCCGCUGCCCAAUGCC SSSSSSSSOSSS 138 * SfC * SfG * SfC * SmUfG A OOSSSSS 10 * SmC * SfC * SmCmAfA * SfU * SfG * SfC * SfC * SfA WV- fU * SfU * SfU * SfG * SfC UUUGCCGCUGCCCAAUGCC SSSSSSSSOSSS 138 * SfC * SfG * SfC * SmUfG A OSSSSSS 11 * SmC * SfC * SmCfA * SfA * SfU * SfG * SfC * SfC * SfA WV- fU * SfU * SfU * SfG * SfC UUUGCCGCUGCCCAAUGCC SSSSSSSSnXSS
138 * SfC * SfG * SfC *A S nXnXSSSSS 12 SmUn001fG * SmC * SfC * SmCn001mAn001fA * SfU * SfG * SfC * SfC * SfA WV- fU * SfU * SfU * SfG * SfC UUUGCCGCUGCCCAAUGCC SSSSSSSSnXSS 138 * SfC * SfG * SfC *A S nXSSSSSS 13 SmUn001fG * SmC * SfC * SmCn001fA * SfA * SfU * SfG * SfC * SfC * SfA WV- fU * SfU * SfUn001fG * SfC UUUGCCGCUGCCCAAUGCC SSnXSSnXSSOS 138 * SfCn001fG * SfC * SmUfG A S SOOSSnXSS 14 * SmC * SfC * SmCmAfA * SfU * SfGn001fC * SfC * SfA WV- fU * SfU * SfUn001fG * SfC UUUGCCGCUGCCCAAUGCC SSnXSSnXSSOS 138 * SfCn001fG * SfC * SmUfG A S SOSSSnXSS 15 * SmC * SfC * SmCfA * SfA * SfU * SfGn001fC * SfC * SfA WV- fU * SfU * SfUn001fG * SfC UUUGCCGCUGCCCAAUGCC SSnXSSnXSSnX 138 * SfCn001fG * SfC *A SSS 16 SmUn001fG * SmC * SfC * nXnXSSnXSS SmCn001mAn001fA * SfU * SfGn001fC * SfC * SfA WV- fU * SfU * SfUn001fG * SfC UUUGCCGCUGCCCAAUGCC SSnXSSnXSSnX 138 * SfCn001fG * SfC *A SSS 17 SmUn001fG * SmC * SfC * nXSSSnXSS SmCn001fA * SfA * SfU * SfGn001fC * SfC * SfA
WV- fU * SfG * SfC * SfC * SfA UGCCAUCCUGGAGUUCCUG SSSSSSSSOSSS 138 * SfU * SfC * SfC * SmUfG U OOSSSSS 18 * SmG * SfA * SmGmUfU * SfC * SfC * SfU * SfG * SfU WV- fU * SfG * SfC * SfC * SfA UGCCAUCCUGGAGUUCCUG SSSSSSSSOSSS 138 * SfU * SfC * SfC * SmUfG U OSSSSSS 19 * SmG * SfA * SmGfU * SfU * SfC * SfC * SfU * SfG * SfU WV- fU * SfG * SfC * SfC * SfA UGCCAUCCUGGAGUUCCUG SSSSSSSSnXSS 138 * SfU * SfC * SfC *U S nXnXSSSSS 20 SmUn001fG * SmG * SfA * SmGn001mUn001fU * SfC * SfC * SfU * SfG * SfU WV- fU * SfG * SfC * SfC * SfA UGCCAUCCUGGAGUUCCUG SSSSSSSSnXSS 138 * SfU * SfC * SfC *U S nXSSSSSS 21 SmUn001fG * SmG * SfA * SmGn001fU * SfU * SfC * SfC * SfU * SfG * SfU WV- fU * SfG * SfCn001fC * SfA UGCCAUCCUGGAGUUCCUG SSnXSSnXSSOS 138 * SfUn001fC * SfC * SmUfG U SSO OSSnXSS 22 * SmG * SfA * SmGmUfU * SfC * SfCn001fU * SfG * SfU WV- fU * SfG * SfCn001fC * SfA UGCCAUCCUGGAGUUCCUG SSnXSSnXSSOS 138 * SfUn001fC * SfC * SmUfG U SSO SSSnXSS 23 * SmG * SfA * SmGfU * SfU * SfC * SfCn001fU * SfG *
SfU WV- fU * SfG * SfCn001fC * SfA UGCCAUCCUGGAGUUCCUG SSnXSSnXSSnX 138 * SfUn001fC * SfC *U SSS 24 SmUn001fG * SmG * SfA * nXnXSSnXSS SmGn001mUn001fU * SfC * SfCn001fU * SfG * SfU WV- fU * SfG * SfCn001fC * SfA UGCCAUCCUGGAGUUCCUG SSnXSSnXSSnX 138 * SfUn001fC * SfC *U SSS 25 SmUn001fG * SmG * SfA * nXSSSnXSS SmGn001fU * SfU * SfC * SfCn001fU * SfG * SfU WV- fU * SfC * SfC * SfG * SfG UCCGGUUCUGAAGGUGUUC SSSSSSSOSSS 138 * SfU * SfU * SmCfU * SmG OOSSSSS 26 * SfA * SmAmGfG * SfU * SfG * SfU * SfU * SfC WV- fC * SfU * SfC * SfC * SfG CUCCGGUUCUGAAGGUGUU SSSSSSSSOSSS 138 * SfG * SfU * SfU * SmCfU OOSSSS 27 * SmG * SfA * SmAmGfG * SfU * SfG * SfU * SfU WV- fU * SfC * SfC * SfG * SfG UCCGGUUCUGAAGGUGUU SSSSSSSOSSS 138 * SfU * SfU * SmCfU * SmG OOSSSS 28 * SfA * SmAmGfG * SfU * SfG * SfU * SfU WV- fU * SfC * SfC * SfG * SfG UCCGGUUCUGAAGGUGUUC SSSSSSSOSSS 138 * SfU * SfU * SmCfU * SmG U OOSSSSSS 35 * SfA * SmAmGfG * SfU * SfG * SfU * SfU * SfC * SfU WV- fC * SfC * SfU * SfC * SfC CCUCCGGUUCUGAAGGUGU SSSSSSSSSOSS
138 * SfG * SfG * SfU * SfU * U S OOSSSS 36 SmCfU * SmG * SfA * SmAmGfG * SfU * SfG * SfU * SfU WV- fC * SfU * SfCn001fC * SfG CUCCGGUUCUGAAGGUGUU SSnXSSnXSSOS 138 * SfGn001fU * SfU * SmCfU C nXSOSSSnXSS 57 * SmGn001fA * SmAfG * SfG * SfU * SfGn001fU * SfU * SfC WV- fC * SfU * SfCn001fC * SfG CUCCGGUUCUGAAGGUGUU SSnXSSnXSSOS 138 * SfGn001fU * SfU * SmCfU S SOSSSnXS 58 * SmG * SfA * SmAfG * SfG * SfU * SfGn001fU * SfU WV- fC * SfU * SfCn001fC * SfG CUCCGGUUCUGAAGGUGUU SSnXSSnXSSOS 138 * SfGn001fU * SfU * SmCfU nXSOSSSnXS 59 * SmGn001fA * SmAfG * SfG * SfU * SfGn001fU * SfU WV- fU * SfCn001fC * SfG * UCCGGUUCUGAAGGUGUUC SnXSSnXSSOSS 138 SfGn001fU * SfU * SmCfU * SO SSSnXSS 60 SmG * SfA * SmAfG * SfG * SfU * SfGn001fU * SfU * SfC WV- fU * SfCn001fC * SfG * UCCGGUUCUGAAGGUGUUC SnXSSnXSSOSn 138 SfGn001fU * SfU * SmCfU * X SOSSSnXSS 61 SmGn001fA * SmAfG * SfG * SfU * SfGn001fU * SfU * SfC WV- fU * SfCn001fC * SfG * UCCGGUUCUGAAGGUGUU SnXSSnXSSOSS 138 SfGn001fU * SfU * SmCfU * S OSSSnXS
62 SmG * SfA * SmAfG * SfG * SfU * SfGn001fU * SfU WV- fU * SfCn001fC * SfG * UCCGGUUCUGAAGGUGUU SnXSSnXSSOSn 138 SfGn001fU * SfU * SmCfU * X SOSSSnXS 63 SmGn001fA * SmAfG * SfG * SfU * SfGn001fU * SfU WV- fC * SfU * SfCn001RfC * CUCCGGUUCUGAAGGUGUU SSnRSSnRSSOS 138 SfG * SfGn001RfU * SfU * C S SOSSSnRSS 64 SmCfU * SmG * SfA * SmAfG * SfG * SfU * SfGn001RfU * SfU * SfC WV- fC * SfU * SfCn001RfC * CUCCGGUUCUGAAGGUGUU SSnRSSnRSSOS 138 SfG * SfGn001RfU * SfU * C nRSOSSSnRSS 65 SmCfU * SmGn001RfA * SmAfG * SfG * SfU * SfGn001RfU * SfU * SfC WV- fA * SfC * SfA * SfA * SfG ACAAGUUCUCCUUCUGGAA SSSSS SSSSS 139 * SfU * SmU * SmC * SmU * A SSSSS SSSS 63 SmC * SmC * SmU * SmU * SmC * SfU * SfG * SfG * SfA * SfA * SfA WV- fC * SfU * SfU * SfC * SfU CUUCUGGAAAGGUUCCAAC SSSSS SSSSS 139 * SfG * SmG * SmA * SmA * A SSSSS SSSS 64 SmA * SmG * SmG * SmU * SmU * SfC * SfC * SfA * SfA * SfC * SfA WV- fG * SfG * SfU * SfU * SfC GGUUCCAACAUAAAGCCGA SSSSS SSSSS 139 * SfC * SmA * SmA * SmC * A SSSSS SSSS 65 SmA * SmU * SmA * SmA *
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71 SmC * SmA * SmC * SmA * SmG * SfA * SfU * SfU * SfC * SfA * SfA WV- fC * SfA * SfG * SfA * SfU CAGAUUCAAUUAUAUUUUG SSSSS SSSSS 139 * SfU * SmC * SmA * SmA * C SSSSS SSSS 72 SmU * SmU * SmA * SmU * SmA * SfU * SfU * SfU * SfU * SfG * SfC WV- fA * SfU * SfA * SfU * SfU AUAUUUUGCAGUUUAUCAG SSSSS SSSSS 139 * SfU * SmU * SmG * SmC * A SSSSS SSSS 73 SmA * SmG * SmU * SmU * SmU * SfA * SfU * SfC * SfA * SfG * SfA WV- fU * SfU * SfU * SfA * SfU UUUAUCAGAUAAACCAGCU SSSSS SSSSS 139 * SfC * SmA * SmG * SmA * C SSSSS SSSS 74 SmU * SmA * SmA * SmA * SmC * SfC * SfA * SfG * SfC * SfU * SfC WV- fA * SfA * SfC * SfC * SfA AACCAGCUCCGUCCAGGCA SSSSS SSSSS 139 * SfG * SmC * SmU * SmC * A SSSSS SSSS 75 SmC * SmG * SmU * SmC * SmC * SfA * SfG * SfG * SfC * SfA * SfA WV- fU * SfC * SfC * SfA * SfG UCCAGGCAAACUCUCUCAU SSSSS SSSSS 139 * SfG * SmC * SmA * SmA * C SSSSS SSSS 76 SmA * SmC * SmU * SmC * SmU * SfC * SfU * SfC * SfA * SfU * SfC WV- fU * SfC * SfU * SfC * SfU UCUCUCAUCCUGACACAAA SSSSS SSSSS
139 * SfC * SmA * SmU * SmC * A SSSSS SSSS 77 SmC * SmU * SmG * SmA * SmC * SfA * SfC * SfA * SfA * SfA * SfA WV- fG * SfA * SfC * SfA * SfC GACACAAAAAGUCCAUAGC SSSSS SSSSS 139 * SfA * SmA * SmA * SmA * A SSSSS SSSS 78 SmA * SmG * SmU * SmC * SmC * SfA * SfU * SfA * SfG * SfC * SfA WV- fU * SfC * SfC * SfA * SfU UCCAUAGCACCGUGCUCUA SSSSS SSSSS 139 * SfA * SmG * SmC * SmA * A SSSSS SSSS 79 SmC * SmC * SmG * SmU * SmG * SfC * SfU * SfC * SfU * SfA * SfA WV- fG * SfU * SfG * SfC * SfU GUGCUCUAAUAUUAUCAUU SSSSS SSSSS 139 * SfC * SmU * SmA * SmA * A SSSSS SSSS 80 SmU * SmA * SmU * SmU * SmA * SfU * SfC * SfA * SfU * SfU * SfA WV- fU * SfU * SfA * SfU * SfC UUAUCAUUAUGAUAAUUUU SSSSS SSSSS 139 * SfA * SmU * SmU * SmA * C SSSSS SSSS 81 SmU * SmG * SmA * SmU * SmA * SfA * SfU * SfU * SfU * SfU * SfC WV- fA * SfU * SfA * SfA * SfU AUAAUUUUCUUUCUAGUAA SSSSS SSSSS 139 * SfU * SmU * SmU * SmC * U SSSSS SSSS 82 SmU * SmU * SmU * SmC * SmU * SfA * SfG * SfU * SfA * SfA * SfU
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00 SmA * SmC * SmC * SmA * SmU * SfU * SfU * SfG * SfU * SfA * SfU WV- fG * SfA * SfU * SfA * SfC GAUACCAUUUGUAUUUAGC SSSSS SSSSS 140 * SfC * SmA * SmU * SmU * A SSSSS SSSS 01 SmU * SmG * SmU * SmA * SmU * SfU * SfU * SfA * SfG * SfC * SfA WV- fA * SfU * SfU * SfU * SfG AUUUGUAUUUAGCAUGUUC SSSSS SSSSS 140 * SfU * SmA * SmU * SmU * C SSSSS SSSS 02 SmU * SmA * SmG * SmC * SmA * SfU * SfG * SfU * SfU * SfC * SfC WV- fA * SfU * SfU * SfU * SfA AUUUAGCAUGUUCCCAAUU SSSSS SSSSS 140 * SfG * SmC * SmA * SmU * C SSSSS SSSS 03 SmG * SmU * SmU * SmC * SmC * SfC * SfA * SfA * SfU * SfU * SfC WV- fC * SfA * SfU * SfG * SfU CAUGUUCCCAAUUCUCAGG SSSSS SSSSS 140 * SfU * SmC * SmC * SmC * A SSSSS SSSS 04 SmA * SmA * SmU * SmU * SmC * SfU * SfC * SfA * SfG * SfG * SfA WV- fC * SfC * SfC * SfA * SfA CCCAAUUCUCAGGAAUUUG SSSSS SSSSS 140 * SfU * SmU * SmC * SmU * U SSSSS SSSS 05 SmC * SmA * SmG * SmG * SmA * SfA * SfU * SfU * SfU * SfG * SfU WV- fU * SfC * SfU * SfC * SfA UCUCAGGAAUUUGUGUCUU SSSSS SSSSS
140 * SfG * SmG * SmA * SmA * U SSSSS SSSS 06 SmU * SmU * SmU * SmG * SmU * SfG * SfU * SfC * SfU * SfU * SfU WV- fG * SfA * SfA * SfU * SfU GAAUUUGUGUCUUUCUGAG SSSSS SSSSS 140 * SfU * SmG * SmU * SmG * A SSSSS SSSS 07 SmU * SmC * SmU * SmU * SmU * SfC * SfU * SfG * SfA * SfG * SfA WV- fG * SfU * SfG * SfU * SfC GUGUCUUUCUGAGAAACUG SSSSS SSSSS 140 * SfU * SmU * SmU * SmC * U SSSSS SSSS 08 SmU * SmG * SmA * SmG * SmA * SfA * SfA * SfC * SfU * SfG * SfU WV- fU * SfU * SfC * SfU * SfG UUCUGAGAAACUGUUCAGC SSSSS SSSSS 140 * SfA * SmG * SmA * SmA * U SSSSS SSSS 09 SmA * SmC * SmU * SmG * SmU * SfU * SfC * SfA * SfG * SfC * SfU WV- fG * SfA * SfA * SfA * SfC GAAACUGUUCAGCUUCUGU SSSSS SSSSS 140 * SfU * SmG * SmU * SmU * U SSSSS SSSS 10 SmC * SmA * SmG * SmC * SmU * SfU * SfC * SfU * SfG * SfU * SfU WV- fG * SfU * SfU * SfC * SfA GUUCAGCUUCUGUUAGCCA SSSSS SSSSS 140 * SfG * SmC * SmU * SmU * C SSSSS SSSS 11 SmC * SmU * SmG * SmU * SmU * SfA * SfG * SfC * SfC * SfA * SfC
WV- fC * SfU * SfU * SfC * SfU CUUCUGUUAGCCACUGAUU SSSSS SSSSS 140 * SfG * SmU * SmU * SmA * A SSSSS SSSS 12 SmG * SmC * SmC * SmA * SmC * SfU * SfG * SfA * SfU * SfU * SfA WV- fU * SfU * SfA * SfG * SfC UUAGCCACUGAUUAAAUAU SSSSS SSSSS 140 * SfC * SmA * SmC * SmU * C SSSSS SSSS 13 SmG * SmA * SmU * SmU * SmA * SfA * SfA * SfU * SfA * SfU * SfC WV- fA * SfC * SfU * SfG * SfA ACUGAUUAAAUAUCUUUAU SSSSS SSSSS 140 * SfU * SmU * SmA * SmA * A SSSSS SSSS 14 SmA * SmU * SmA * SmU * SmC * SfU * SfU * SfU * SfA * SfU * SfA WV- fA * SfU * SfC * SfU * SfU AUCUUUAUAUCAUAAUGAA SSSSS SSSSS 140 * SfU * SmA * SmU * SmA * A SSSSS SSSS 15 SmU * SmC * SmA * SmU * SmA * SfA * SfU * SfG * SfA * SfA * SfA WV- fA * SfU * SfA * SfA * SfU AUAAUGAAAACGCCGCCAU SSSSS SSSSS 140 * SfG * SmA * SmA * SmA * U SSSSS SSSS 16 SmA * SmC * SmG * SmC * SmC * SfG * SfC * SfC * SfA * SfU * SfU WV- fG * SfC * SfC * SfG * SfC GCCGCCAUUUCUCAACAGA SSSSS SSSSS 140 * SfC * SmA * SmU * SmU * U SSSSS SSSS 17 SmU * SmC * SmU * SmC * SmA * SfA * SfC * SfA *
SfG * SfA * SfU WV- fU * SfC * SfA * SfA * SfC UCAACAGAUCUGUCAAAUC SSSSS SSSSS 140 * SfA * SmG * SmA * SmU * G SSSSS SSSS 18 SmC * SmU * SmG * SmU * SmC * SfA * SfA * SfA * SfU * SfC * SfG WV- fU * SfG * SfA * SfA * SfG UGAAGAUAAAUACAAUUUC SSSSS SSSSS 140 * SfA * SmU * SmA * SmA * G SSSSS SSSS 19 SmA * SmU * SmA * SmC * SmA * SfA * SfU * SfU * SfU * SfC * SfG WV- fA * SfU * SfU * SfU * SfC AUUUCGAAAAAACAAAUCA SSSSS SSSSS 140 * SfG * SmA * SmA * SmA * A SSSSS SSSS 20 SmA * SmA * SmA * SmC * SmA * SfA * SfA * SfU * SfC * SfA * SfA WV- fA * SfA * SfA * SfA * SfA AAAAAACAAAUCAAAGACU SSSSS SSSSS 140 * SfA * SmC * SmA * SmA * U SSSSS SSSS 21 SmA * SmU * SmC * SmA * SmA * SfA * SfG * SfA * SfC * SfU * SfU WV- fC * SfA * SfA * SfA * SfU CAAAUCAAAGACUUACCUU SSSSS SSSSS 140 * SfC * SmA * SmA * SmA * A SSSSS SSSS 22 SmG * SmA * SmC * SmU * SmU * SfA * SfC * SfC * SfU * SfU * SfA WV- fA * SfA * SfA * SfG * SfA AAAGACUUACCUUAAGAUA SSSSS SSSSS 140 * SfC * SmU * SmU * SmA * C SSSSS SSSS 23 SmC * SmC * SmU * SmU *
SmA * SfA * SfG * SfA * SfU * SfA * SfC WV- fU * SfA * SfA * SfG * SfA UAAGAUACCAUUUGUAUUU SSSSS SSSSS 140 * SfU * SmA * SmC * SmC * A SSSSS SSSS 24 SmA * SmU * SmU * SmU * SmG * SfU * SfA * SfU * SfU * SfU * SfA WV- fA * SfC * SfC * SfA * SfU ACCAUUUGUAUUUAGCAUG SSSSS SSSSS 140 * SfU * SmU * SmG * SmU * U SSSSS SSSS 25 SmA * SmU * SmU * SmU * SmA * SfG * SfC * SfA * SfU * SfG * SfU WV- fU * SfG * SfU * SfA * SfU UGUAUUUAGCAUGUUCCCA SSSSS SSSSS 140 * SfU * SmU * SmA * SmG * A SSSSS SSSS 26 SmC * SmA * SmU * SmG * SmU * SfU * SfC * SfC * SfC * SfA * SfA WV- fU * SfG * SfC * SfU * SfG UGCUGAAGAUAAAUACAA SSSSS SSSSS 140 * SfA * SmA * SmG * SmA * SSSSS SS 27 SmU * SmA * SmA * SfA * SfU * SfA * SfC * SfA * SfA WV- fA * SfA * SfA * SfU * SfA AAAUACAAUUUCGAAAAA SSSSS SSSSS 140 * SfC * SmA * SmA * SmU * SSSSS SS 28 SmU * SmU * SmC * SfG * SfA * SfA * SfA * SfA * SfA WV- fC * SfA * SfA * SfU * SfU CAAUUUCGAAAAAACAAA SSSSS SSSSS 140 * SfU * SmC * SmG * SmA * SSSSS SS
29 SmA * SmA * SmA * SfA * SfA * SfC * SfA * SfA * SfA WV- fC * SfG * SfA * SfA * SfA CGAAAAAACAAAUCAAAG SSSSS SSSSS 140 * SfA * SmA * SmA * SmC * SSSSS SS 30 SmA * SmA * SmA * SfU * SfC * SfA * SfA * SfA * SfG WV- fA * SfA * SfC * SfA * SfA AACAAAUCAAAGACUUAC SSSSS SSSSS 140 * SfA * SmU * SmC * SmA * SSSSS SS 31 SmA * SmA * SmG * SfA * SfC * SfU * SfU * SfA * SfC WV- fU * SfC * SfA * SfA * SfA UCAAAGACUUACCUUAAG SSSSS SSSSS 140 * SfG * SmA * SmC * SmU * SSSSS SS 32 SmU * SmA * SmC * SfC * SfU * SfU * SfA * SfA * SfG WV- fA * SfC * SfU * SfU * SfA ACUUACCUUAAGAUACCA SSSSS SSSSS 140 * SfC * SmC * SmU * SmU * SSSSS SS 33 SmA * SmA * SmG * SfA * SfU * SfA * SfC * SfC * SfA WV- fU * SfA * SfC * SfC * SfU UACCUUAAGAUACCAUUU SSSSS SSSSS 140 * SfU * SmA * SmA * SmG * SSSSS SS 34 SmA * SmU * SmA * SfC * SfC * SfA * SfU * SfU * SfU WV- fA * SfC * SfC * SfU * SfU ACCUUAAGAUACCAUUUG SSSSS SSSSS
140 * SfA * SmA * SmG * SmA * SSSSS SS 35 SmU * SmA * SmC * SfC * SfA * SfU * SfU * SfU * SfG WV- fC * SfC * SfU * SfU * SfA CCUUAAGAUACCAUUUGU SSSSS SSSSS 140 * SfA * SmG * SmA * SmU * SSSSS SS 36 SmA * SmC * SmC * SfA * SfU * SfU * SfU * SfG * SfU WV- fC * SfU * SfU * SfA * SfA CUUAAGAUACCAUUUGUA SSSSS SSSSS 140 * SfG * SmA * SmU * SmA * SSSSS SS 37 SmC * SmC * SmA * SfU * SfU * SfU * SfG * SfU * SfA WV- fA * SfU * SfA * SfC * SfC AUACCAUUUGUAUUUAGC SSSSS SSSSS 140 * SfA * SmU * SmU * SmU * SSSSS SS 38 SmG * SmU * SmA * SfU * SfU * SfU * SfA * SfG * SfC WV- fU * SfU * SfU * SfG * SfU UUUGUAUUUAGCAUGUUC SSSSS SSSSS 140 * SfA * SmU * SmU * SmU * SSSSS SS 39 SmA * SmG * SmC * SfA * SfU * SfG * SfU * SfU * SfC WV- fU * SfU * SfU * SfA * SfG UUUAGCAUGUUCCCAAUU SSSSS SSSSS 140 * SfC * SmA * SmU * SmG * SSSSS SS 40 SmU * SmU * SmC * SfC * SfC * SfA * SfA * SfU * SfU
WV- fA * SfU * SfG * SfU * SfU AUGUUCCCAAUUCUCAGG SSSSS SSSSS 140 * SfC * SmC * SmC * SmA * SSSSS SS 41 SmA * SmU * SmU * SfC * SfU * SfC * SfA * SfG * SfG WV- fC * SfC * SfA * SfA * SfU CCAAUUCUCAGGAAUUUG SSSSS SSSSS 140 * SfU * SmC * SmU * SmC * SSSSS SS 42 SmA * SmG * SmG * SfA * SfA * SfU * SfU * SfU * SfG WV- fC * SfU * SfC * SfA * SfG CUCAGGAAUUUGUGUCUU SSSSS SSSSS 140 * SfG * SmA * SmA * SmU * SSSSS SS 43 SmU * SmU * SmG * SfU * SfG * SfU * SfC * SfU * SfU WV- fA * SfA * SfU * SfU * SfU AAUUUGUGUCUUUCUGAG SSSSS SSSSS 140 * SfG * SmU * SmG * SmU * SSSSS SS 44 SmC * SmU * SmU * SfU * SfC * SfU * SfG * SfA * SfG WV- fU * SfG * SfU * SfC * SfU UGUCUUUCUGAGAAACUG SSSSS SSSSS 140 * SfU * SmU * SmC * SmU * SSSSS SS 45 SmG * SmA * SmG * SfA * SfA * SfA * SfC * SfU * SfG WV- fU * SfC * SfU * SfG * SfA UCUGAGAAACUGUUCAGC SSSSS SSSSS 140 * SfG * SmA * SmA * SmA * SSSSS SS 46 SmC * SmU * SmG * SfU * SfU * SfC * SfA * SfG *
SfC WV- fA * SfA * SfA * SfC * SfU AAACUGUUCAGCUUCUGU SSSSS SSSSS 140 * SfG * SmU * SmU * SmC * SSSSS SS 47 SmA * SmG * SmC * SfU * SfU * SfC * SfU * SfG * SfU WV- fU * SfU * SfC * SfA * SfG UUCAGCUUCUGUUAGCCA SSSSS SSSSS 140 * SfC * SmU * SmU * SmC * SSSSS SS 48 SmU * SmG * SmU * SfU * SfA * SfG * SfC * SfC * SfA WV- fU * SfU * SfC * SfU * SfG UUCUGUUAGCCACUGAUU SSSSS SSSSS 140 * SfU * SmU * SmA * SmG * SSSSS SS 49 SmC * SmC * SmA * SfC * SfU * SfG * SfA * SfU * SfU WV- fU * SfA * SfG * SfC * SfC UAGCCACUGAUUAAAUAU SSSSS SSSSS 140 * SfA * SmC * SmU * SmG * SSSSS SS 50 SmA * SmU * SmU * SfA * SfA * SfA * SfU * SfA * SfU WV- fG * SfA * SfA * SfG * SfA GAAGAUAAAUACAAUUUC SSSSS SSSSS 140 * SfU * SmA * SmA * SmA * SSSSS SS 51 SmU * SmA * SmC * SfA * SfA * SfU * SfU * SfU * SfC WV- fU * SfU * SfU * SfC * SfG UUUCGAAAAAACAAAUCA SSSSS SSSSS 140 * SfA * SmA * SmA * SmA * SSSSS SS 52 SmA * SmA * SmC * SfA *
SfA * SfA * SfU * SfC * SfA WV- fA * SfA * SfA * SfA * SfA AAAAACAAAUCAAAGACU SSSSS SSSSS 140 * SfC * SmA * SmA * SmA * SSSSS SS 53 SmU * SmC * SmA * SfA * SfA * SfG * SfA * SfC * SfU WV- fA * SfA * SfA * SfU * SfC AAAUCAAAGACUUACCUU SSSSS SSSSS 140 * SfA * SmA * SmA * SmG * SSSSS SS 54 SmA * SmC * SmU * SfU * SfA * SfC * SfC * SfU * SfU WV- fA * SfA * SfG * SfA * SfC AAGACUUACCUUAAGAUA SSSSS SSSSS 140 * SfU * SmU * SmA * SmC * SSSSS SS 55 SmC * SmU * SmU * SfA * SfA * SfG * SfA * SfU * SfA WV- fA * SfA * SfG * SfA * SfU AAGAUACCAUUUGUAUUU SSSSS SSSSS 140 * SfA * SmC * SmC * SmA * SSSSS SS 56 SmU * SmU * SmU * SfG * SfU * SfA * SfU * SfU * SfU WV- fC * SfC * SfA * SfU * SfU CCAUUUGUAUUUAGCAUG SSSSS SSSSS 140 * SfU * SmG * SmU * SmA * SSSSS SS 57 SmU * SmU * SmU * SfA * SfG * SfC * SfA * SfU * SfG WV- fG * SfU * SfA * SfU * SfU GUAUUUAGCAUGUUCCCA SSSSS SSSSS 140 * SfU * SmA * SmG * SmC * SSSSS SS
58 SmA * SmU * SmG * SfU * SfU * SfC * SfC * SfC * SfA WV- fA * SfG * SfG * SmAfA * AGGAAGAUGGCAUUUCU SSSOSOSS 141 SmGmA * SfU * SmGmGfC * OOSSSSSS 07 SfA * SfU * SfU * SfU * SfC * SfU WV- fG * SfG * SmAfA * SmGmA GGAAGAUGGCAUUUCU SSOSOSS 141 * SfU * SmGmGfC * SfA * OOSSSSSS 08 SfU * SfU * SfU * SfC * SfU WV- fG * SmAfA * SmGmA * SfU GAAGAUGGCAUUUCU SOSOSSO 141 * SmGmGfC * SfA * SfU * OSSSSSS 09 SfU * SfU * SfC * SfU WV- mAfA * SmGmA * SfU * AAGAUGGCAUUUCU OSOSSOOSSSSS 141 SmGmGfC * SfA * SfU * SfU S 10 * SfU * SfC * SfU WV- fA * SmGmA * SfU * SmGmGfC AGAUGGCAUUUCU SOSSOOSSSSSS 141 * SfA * SfU * SfU * SfU * 11 SfC * SfU WV- mGmA * SfU * SmGmGfC * SfA GAUGGCAUUUCU OSSOOSSSSSS 141 * SfU * SfU * SfU * SfC * 12 SfU WV- mA * SfU * SmGmGfC * SfA AUGGCAUUUCU SSOOSSSSSS 141 * SfU * SfU * SfU * SfC * 13 SfU WV- fU * SmGmGfC * SfA * SfU UGGCAUUUCU SOOSSSSSS 141 * SfU * SfU * SfC * SfU 14
WV- mGmGfC * SfA * SfU * SfU GGCAUUUCU OOSSSSSS 141 * SfU * SfC * SfU 15 WV- mGfC * SfA * SfU * SfU * GCAUUUCU OSSSSSS 141 SfU * SfC * SfU 16 WV- fC * SfA * SfU * SfU * SfU CAUUUCU SSSSSS 141 * SfC * SfU 17 WV- fA * SfU * SfU * SfU * SfC AUUUCU SSSSS 141 * SfU 18 WV- fU * SfU * SfC * SfU UUCU SSS 141 19 WV- fU * SfC * SfU UCU SS 141 20 WV- fC * RfA * SfA * SfG * SfG CAAGGAAGAUGGCAUUUCU RSSSSOSOSS 141 * SmAfA * SmGmA * SfU * OOSSSSSS 21 SmGmGfC * SfA * SfU * SfU * SfU * SfC * SfU WV- fA * RfA * SfG * SfG * AAGGAAGAUGGCAUUUCU RSSSOSOSS 141 SmAfA * SmGmA * SfU * OOSSSSSS 22 SmGmGfC * SfA * SfU * SfU * SfU * SfC * SfU WV- fA * RfG * SfG * SmAfA * AGGAAGAUGGCAUUUCU RSSOSOSS 141 SmGmA * SfU * SmGmGfC * OOSSSSSS 23 SfA * SfU * SfU * SfU *
SfC * SfU WV- fG * RfG * SmAfA * SmGmA GGAAGAUGGCAUUUCU RSOSOSSOOSSS 141 * SfU * SmGmGfC * SfA * SSS 24 SfU * SfU * SfU * SfC * SfU WV- fG * RmAfA * SmGmA * SfU GAAGAUGGCAUUUCU ROSOSSOOSSSS 141 * SmGmGfC * SfA * SfU * SS 25 SfU * SfU * SfC * SfU WV- fA * RmGmA * SfU * SmGmGfC AGAUGGCAUUUCU ROSSOOSSSSSS 141 * SfA * SfU * SfU * SfU * 26 SfC * SfU WV- mA * RfU * SmGmGfC * SfA AUGGCAUUUCU RSOOSSSSSS 141 * SfU * SfU * SfU * SfC * 27 SfU WV- fU * RmGmGfC * SfA * SfU UGGCAUUUCU ROOSSSSSS 141 * SfU * SfU * SfC * SfU 28 WV- fC * RfA * SfU * SfU * SfU CAUUUCU RSSSSS 141 * SfC * SfU 29 WV- fA * RfU * SfU * SfU * SfC AUUUCU RSSSS 141 * SfU 30 WV- fU * RfU * SfC * SfU UUCU RSS 141 31 WV- fU * RfC * SfU UCU RS 141 32
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SfC WV- fC * SfU * SfCn001RfC * CUCCGGUUCUGAAGGUGUU SSnRSSnRSSOS 143 SfG * SfGn001RfU * SfU * C SSOOSSnRSS 44 SmCfU * SmG * SfA * SmAfGfG * SfU * SfGn001RfU * SfU * SfC WV- fC * SfU * SfCn001RfC * CUCCGGUUCUGAAGGUGUU SSnRSSnRSSOS 143 SfG * SfGn001RfU * SfU * C nRSOOSSnRSS 45 SmCfU * SmGn001RfA * SmAfGfG * SfU * SfGn001RfU * SfU * SfC WV- Mod098L001fU * SfC * SfA UCACUCAGAUAGUUGAAGC OSSSSSSOSSSS 143 * SfC * SfU * SfC * SmAfG C OOSSSSSS 46 * SfA * SmU * SfA * SmGmUfU * SfG * SfA * SfA * SfG * SfC * SfC WV- Mod099L001fU * SfC * SfA UCACUCAGAUAGUUGAAGC OSSSSSSOSSSS 143 * SfC * SfU * SfC * SmAfG C OOSSSSSS 47 * SfA * SmU * SfA * SmGmUfU * SfG * SfA * SfA * SfG * SfC * SfC WV- Mod100L001fU * SfC * SfA UCACUCAGAUAGUUGAAGC OSSSSSSOSSSS 143 * SfC * SfU * SfC * SmAfG C OOSSSSSS 48 * SfA * SmU * SfA * SmGmUfU * SfG * SfA * SfA * SfG * SfC * SfC WV- fU * SfC * SfAn001fA * SfG UCAAGGAAGAUGGCAUUUC SSnXSSnXOSOS 145 * SfGn001mAfA * SmGmA * U SOOSSSnXSS 22 SfU * SmGmGfC * SfA * SfU
* SfUn001fU * SfC * SfU WV- fU * SfC * SfAn001fA * SfG UCAAGGAAGAUGGCAUUUC SSnXSSnXOSOS 145 * SfGn001mAfA * SmGmA * U SOOnXSSnXSS 23 SfU * SmGmGfCn001fA * SfU * SfUn001fU * SfC * SfU WV- fU * SfU * SfU * SfG * SfC UUUGCCGCUGCCCAAUGCC SSSSSSOSOSS 145 * SfC * SmGfC * SmUmG * A OOSSSSSS 24 SfC * SmCmCmA * SfA * SfU * SfG * SfC * SfC * SfA WV- fU * SfU * SfUn001fG * SfC UUUGCCGCUGCCCAAUGCC SSnXSSnXOSOS 145 * SfCn001mGfC * SmUmG * A S OOSSSnXSS 25 SfC * SmCmCmA * SfA * SfU * SfGn001fC * SfC * SfA WV- fU * SfU * SfUn001fG * SfC UUUGCCGCUGCCCAAUGCC SSnXSSnXOSOS 145 * SfCn001mGfC * SmUmG * A S OOnXSSnXSS 26 SfC * SmCmCmAn001fA * SfU * SfGn001fC * SfC * SfA WV- fU * SfG * SfC * SfC * SfA UGCCAUCCUGGAGUUCCUG SSSSSSOSOSS 145 * SfU * SmCfC * SmUmG * U OOSSSSSS 27 SfG * SmAmGfU * SfU * SfC * SfC * SfU * SfG * SfU WV- fU * SfG * SfCn001fC * SfA UGCCAUCCUGGAGUUCCUG SSnXSSnXOSOS 145 * SfUn001mCfC * SmUmG * U SOOSSSnXSS 28 SfG * SmAmGfU * SfU * SfC * SfCn001fU * SfG * SfU WV- fU * SfG * SfCn001fC * SfA UGCCAUCCUGGAGUUCCUG SSnXSSnXOSOS 145 * SfUn001mCfC * SmUmG * U SOOnXSSnXSS 29 SfG * SmAmGfUn001fU * SfC * SfCn001fU * SfG * SfU
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WV- fU * SfCn001RfC * SfG * UCCGGUUCUGA SnRSSnRSSOS
14773 SfGn001RfU * SfU * SmCfU AGGUGUUCU SSOOSSnRSSS * SmG * SfA * SmAmGfG * SfU * SfGn001RfU * SfU * SfC * SfU WV- fU * SfCn001RfC * SfG * UCCGGUUCUGA SnRSSnRSSOS 14774 SfGn001RfU * SfU * SmCfU AGGUGUUCU SSOOSnRSSnRS * SmG * SfA * SmAmGfG * SfUn001RfG * SfU * SfUn001RfC * SfU WV- fU * SfC * SfC * SfG * SfG UCCGGUUCUGA SSSSSSSOSSS 14775 * SfU * SfU * SmCfU * SmG AGGUGUUCU OOSSSSSS * SfA * SmAfGfG * SfU * SfG * SfU * SfU * SfC * SfU WV- fU * SfCn001RfC * SfG * UCCGGUUCUGA SnRSSnRSSOS 14776 SfGn001RfU * SfU * SmCfU AGGUGUUCU SSOOSSnRSSS * SmG * SfA * SmAfGfG * SfU * SfGn001RfU * SfU * SfC * SfU WV- fU * SfCn001RfC * SfG * UCCGGUUCUGA SnRSSnRSSOS 14777 SfGn001RfU * SfU * SmCfU AGGUGUUCU SSOOSnRSSnRS * SmG * SfA * SmAfGfG * SfUn001RfG * SfU * SfUn001RfC * SfU WV- fU * SfCn001RfC * SfG * UCCGGUUCUGA SnRSSnRSSOS 14778 SfGn001RfU * SfU * SmCfU AGGUGUUCU SSOOSSSnRSS * SmG * SfA * SmAmGfG * SfU * SfG * SfUn001RfU * SfC * SfU
WV- fU * SfC * SfCn001RfG * UCCGGUUCUGA SSnRSSnRSO 14779 SfG * SfUn001RfU * SmCfU AGGUGUUCU SSSOOSSSnRSS * SmG * SfA * SmAmGfG * SfU * SfG * SfUn001RfU * SfC * SfU WV- fU * SfC * SfCn001RfG * UCCGGUUCUGA SSnRSSnRSO 14790 SfG * SfUn001RfU * SmCfU AGGUGUUCU SSSOOSSnXSSS * SmG * SfA * SmAmGfG * SfU * SfGn001fU * SfU * SfC * SfU WV- fU * SfC * SfCn001RfG * UCCGGUUCUGA SSnRSSnRSO 14791 SfG * SfUn001RfU * SmCfU AGGUGUUCU SSSOOSSnRSSS * SmG * SfA * SmAmGfG * SfU * SfGn001RfU * SfU * SfC * SfU WV- BrfU * SfC * SfA * SfC * UCACUCAGAUA SSSSSSnXSSSS 15052 SfU * SfC * SmAn001fG * GUUGAAGCC nXnXSSSSSS SfA * SmU * SfA * SmGn001mUn001fU * SfG * SfA * SfA * SfG * SfC * SfC WV- Acet5fU * SfC * SfA * SfC UCACUCAGAUA SSSSSSnXSSSS 15053 * SfU * SfC * SmAn001fG * GUUGAAGCC nXnXSSSSSS SfA * SmU * SfA * SmGn001mUn001fU * SfG * SfA * SfA * SfG * SfC * SfC WV- Mod102L001fU * SfC * SfA UCACUCAGAUA OSSSSSSOSSS 15074 * SfC * SfU * SfC * SmAfG GUUGAAGCC SOOSSSSSS
* SfA * SmU * SfA * SmGmUfU * SfG * SfA * SfA * SfG * SfC * SfC WV- Mod103L001fU * SfC * SfA UCACUCAGAUA OSSSSSSOSSS 15075 * SfC * SfU * SfC * SmAfG GUUGAAGCC SOOSSSSSS * SfA * SmU * SfA * SmGmUfU * SfG * SfA * SfA * SfG * SfC * SfC WV- Mod104L001fU * SfC * SfA UCACUCAGAUA OSSSSSSOSSS 15076 * SfC * SfU * SfC * SmAfG GUUGAAGCC SOOSSSSSS * SfA * SmU * SfA * SmGmUfU * SfG * SfA * SfA * SfG * SfC * SfC WV- fC * SfU * SfCn001SfC * CUCCGGUUCUGA SSnSSSnRSSOS 15143 SfG * SfGn001RfU * SfU * AGGUGUUC SSOOSSnRSS SmCfU * SmG * SfA * SmAfGfG * SfU * SfGn001RfU * SfU * SfC WV- fC * SfU * SfCn001SfC * CUCCGGUUCUGA SSnSSSnSSSOSSS 15322 SfG * SfGn001SfU * SfU * AGGUGUUC OOSSnSSS SmCfU * SmG * SfA * SmAfGfG * SfU * SfGn001SfU * SfU * SfC WV- fC * fU * fCn001SfC * fG CUCCGGUUCUGA XXnSXXnSXXO 15323 * fGn001SfU * fU * mCfU * AGGUGUUC XXXOOXXnSXX mG * fA * mAfGfG * fU * fGn001SfU * fU * fC WV- fC * fU * fCn001RfC * fG CUCCGGUUCUGA XXnRXXnRXXO 15324 * fGn001RfU * fU * mCfU * AGGUGUUC XXXOOXXnRXX mG * fA * mAfGfG * fU * fGn001RfU * fU * fC WV- fC * fU * fCn001fC * fG * CUCCGGUUCUGA XXnXXXnXXXO 15325 fGn001fU * fU * mCfU * mG AGGUGUUC XXXOOXXnXXX * fA * mAfGfG * fU * fGn001fU * fU * fC WV- fU * SfC * SfCn001SfG * UCCGGUUCUGA SSnSSSnSSOSSS 15326 SfG * SfUn001SfU * SmCfU AGGUGUUCU OOSSnSSSS * SmG * SfA * SmAmGfG * SfU * SfGn001SfU * SfU * SfC * SfU WV- fU * fC * fCn001SfG * fG UCCGGUUCUGA XXnSXXnSX 15327 * fUn001SfU * mCfU * mG * AGGUGUUCU OXXXOOXX nSXXX fA * mAmGfG * fU * fGn001SfU * fU * fC * fU WV- fU * fC * fCn001RfG * fG UCCGGUUCUGA XXnRXXnRX 15328 * fUn001RfU * mCfU * mG * AGGUGUUCU OXXXOOXX nRXXX fA * mAmGfG * fU * fGn001RfU * fU * fC * fU WV- fU * fC * fCn001fG * fG * UCCGGUUCUGA XXnXXXnXXO 15329 fUn001fU * mCfU * mG * fA AGGUGUUCU XXXOOXXnXXXX * mAmGfG * fU * fGn001fU * fU * fC * fU WV- fC * SfU * SfCn001SfC * CUCCGGUUCUGA SSnSSSnSSSOSSS 15330 SfG * SfGn001SfU * SfU * AGGUGUUC OSSSnSSS SmCfU * SmG * SfA * SmAfG * SfG * SfU * SfGn001SfU * SfU * SfC WV- fC * fU * fCn001SfC * fG CUCCGGUUCUGA XXnSXXnSXXO
15331 * fGn001SfU * fU * mCfU * AGGUGUUC XXXOXXXnSXX mG * fA * mAfG * fG * fU * fGn001SfU * fU * fC WV- fC * fU * fCn001RfC * fG CUCCGGUUCUGA XXnRXXnRXXO 15332 * fGn001RfU * fU * mCfU * AGGUGUUC XXXOXXXnRXX mG * fA * mAfG * fG * fU * fGn001RfU * fU * fC WV- fC * fU * fCn001fC * fG * CUCCGGUUCUGA XXnXXXnXXXO 15333 fGn001fU * fU * mCfU * mG AGGUGUUC XXXOXXXnXXX * fA * mAfG * fG * fU * fGn001fU * fU * fC WV- fU * SfC * SfCn001RfG * UCCGGUUCUGA SSnRSSnRSO 15334 SfG * SfUn001RfU * SmCfU AGGUGUUCU SSSOOSSSnXSS * SmG * SfA * SmAmGfG * SfU * SfG * SfUn001fU * SfC * SfU WV- fU * SfC * SfCn001SfG * UCCGGUUCUGA SSnSSSnSSOSSS 15335 SfG * SfUn001SfU * SmCfU AGGUGUUCU OOSSSnSSS * SmG * SfA * SmAmGfG * SfU * SfG * SfUn001SfU * SfC * SfU WV- L001fU * SfC * SfA * SfC UCACUCAGAUA OSSSSSSnXSSSS 15336 * SfU * SfC * SmAn001fG * GUUGAAGCC nXnXSSSSSS SfA * SmU * SfA * SmGn001mUn001fU * SfG * SfA * SfA * SfG * SfC * SfC WV- Mod059L001fU * SfC * SfA UCACUCAGAUA OSSSSSSnXSSSS 15337 * SfC * SfU * SfC * GUUGAAGCC nXnXSSSSSS
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SfU * SfG * SfU * SfU * SfC * SfU WV- fU * SfC * SfA * SfC * SfU UCACUCAGAUA SSSSSSSOSSS 15588 * SfC * SfA * SmGfA * SmU GUUGAAGCC OOSSSSSS * SfA * SmGmUfU * SfG * SfA * SfA * SfG * SfC * SfC WV- fU * SfC * SfAn001fC * SfU UCACUCAGAUA SSnXSSnXSOSS 15589 * SfCn001fA * SmGfA * SmU GUUGAAGCC SOOSSSnXSS * SfA * SmGmUfU * SfG * SfA * SfAn001fG * SfC * SfC WV- Mod098L001fC * SfU * SfC CUCCGGUUCUGA OSSSSSSSSOSSS 15646 * SfC * SfG * SfG * SfU * AGGUGUUC OOSSSSS SfU * SmCfU * SmG * SfA * SmAmGfG * SfU * SfG * SfU * SfU * SfC WV- Mod098L001fC * SfU * CUCCGGUUCUGA OSSnXSSnXSSOSSS 15647 SfCn001fC * SfG * AGGUGUUC OSSSnXSS SfGn001fU * SfU * SmCfU * SmG * SfA * SmAfG * SfG * SfU * SfGn001fU * SfU * SfC WV- Mod106fU * SfC * SfA * SfC UCACUCAGAUA SSSSSSnXSSSS 15844 * SfU * SfC * SmAn001fG * GUUGAAGCC nXnXSSSSSS SfA * SmU * SfA * SmGn001mUn001fU * SfG * SfA * SfA * SfG * SfC * SfC
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SfC WV- fU * SfC * SfA * SfC * SfU UCACUCAGAUA SSSSSSSOSSS 15856 * SfC * SfA * SmGfA * SmU GUUGAAGCC OOnXSSnXSS * SfA * SmGmUfUn001fG * SfA * SfAn001fG * SfC * SfC WV- fU * SfC * SfAn001fC * SfU UCACUCAGAUA SSnXSSSOSSS 15857 * SfC * SmAfG * SfA * SmU GUUGAAGCC SOOnXSSnXSS * SfA * SmGmUfUn001fG * SfA * SfAn001fG * SfC * SfC WV- fU * SfC * SfAn001fC * SfU UCACUCAGAUA SSnXSSnXOSSSS 15858 * SfCn001mAfG * SfA * SmU GUUGAAGCC OOSSSSSS * SfA * SmGmUfU * SfG * SfA * SfA * SfG * SfC * SfC WV- fU * SfC * SfA * SfC * SfU UCACUCAGAUA SSSSSSOSSS 15859 * SfC * SmAfG * SfA * SmU GUUGAAGCC SOOnXSSnXSS * SfA * SmGmUfUn001fG * SfA * SfAn001fG * SfC * SfC WV- fU * SfC * SfAn001fA * SfG UCAAGGAAGAU SSnXSSSOSOSSO 15860 * SfG * SmAfA * SmGmA * GGCAUUUCU OnXSSnXSS SfU * SmGmGfCn001fA * SfU * SfUn001fU * SfC * SfU WV- fU * SfC * SfAn001fA * SfG UCAAGGAAGAU SSnXSSnXOSOSS 15861 * SfGn001mAfA * SmGmA * GGCAUUUCU OOSSSSSS SfU * SmGmGfC * SfA * SfU * SfU * SfU * SfC * SfU
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WV- fC * SfU * SfU * SfU * SfU * SfA CUUUUAUCAUUU SSSSS 21497 * SfU * SfC * SmA * SfU * SmU * UUUCUCAU SSSSS SfU * SmU * SfU * SfU * SfC * SSSSS SSSS SfU * SfC * SfA * SfU WV- fA * SfC * SfU * SfU * SfU * SfU ACUUUUAUCAUU SSSSS 21496 * SfA * SfU * SmC * SfA * SmU * UUUUCUCA SSSSS SfU * SmU * SfU * SfU * SfU * SSSSS SSSS SfC * SfU * SfC * SfA WV- fA * SfA * SfC * SfU * SfU * SfU AACUUUUAUCAU SSSSS 21495 * SfU * SfA * SmU * SfC * SmA * UUUUUCUC SSSSS SfU * SmU * SfU * SfU * SfU * SSSSS SSSS SfU * SfC * SfU * SfC WV- fC * SfA * SfA * SfC * SfU * SfU CAACUUUUAUCAU SSSSS 21494 * SfU * SfU * SmA * SfU * SmC * UUUUUCU SSSSS SfA * SmU * SfU * SfU * SfU * SSSSS SSSS SfU * SfU * SfC * SfU WV- fC * SfC * SfA * SfA * SfC * SfU CCAACUUUUAU SSSSS 21493 * SfU * SfU * SmU * SfA * SmU * CAUUUUUUC SSSSS SfC * SmA * SfU * SfU * SfU * SSSSS SSSS SfU * SfU * SfU * SfC WV- fG * SfC * SfC * SfA * SfA * SfC GCCAACUUUUA SSSSS 21492 * SfU * SfU * SmU * SfU * SmA * UCAUUUUUU SSSSS SfU * SmC * SfA * SfU * SfU * SSSSS SSSS SfU * SfU * SfU * SfU WV- fU * SfG * SfC * SfC * SfA * SfA UGCCAACUUUU SSSSS 21491 * SfC * SfU * SmU * SfU * SmU * AUCAUUUUU SSSSS SfA * SmU * SfC * SfA * SfU * SSSSS SSSS SfU * SfU * SfU * SfU
WV- fC * SfU * SfG * SfC * SfC * SfA CUGCCAACUUUU SSSSS 21490 * SfA * SfC * SmU * SfU * SmU * AUCAUUUU SSSSS SfU * SmA * SfU * SfC * SfA * SSSSS SSSS SfU * SfU * SfU * SfU WV- fU * SfC * SfU * SfG * SfC * SfC UCUGCCAACUUU SSSSS 21489 * SfA * SfA * SmC * SfU * SmU * UAUCAUUU SSSSS SfU * SmU * SfA * SfU * SfC * SSSSS SSSS SfA * SfU * SfU * SfU WV- fU * SfU * SfC * SfU * SfG * SfC UUCUGCCAACUU SSSSS 21488 * SfC * SfA * SmA * SfC * SmU * UUAUCAUU SSSSS SfU * SmU * SfU * SfA * SfU * SSSSS SSSS SfC * SfA * SfU * SfU WV- fC * SfU * SfU * SfC * SfU * SfG CUUCUGCCAACU SSSSS 21487 * SfC * SfC * SmA * SfA * SmC * UUUAUCAU SSSSS SfU * SmU * SfU * SfU * SfA * SSSSS SSSS SfU * SfC * SfA * SfU WV- fC * SfU * SfCfC * SfG * SfGfU * CUCCGGUUCUGA SSOSS OSSOS 21373 SfU * SmCfU * SmG * SfA * SmAfG AGGUGUUC SSOSS SOSS * SfG * SfU * SfGfU * SfU * SfC Na Tabela A1 (incluindo a Tabela A1.1., Tabela A1.2, Tabela A1.3, etc.): Espaços na Tabela A1 são utilizados para formatação e legibilidade, por exemplo, OXXXXX XXXXX XXXXX XXXX ilustra a mesma estereoquímica que OXXXXXXXXXXXXXXXXXXX; * S e *S indicam a ligação internucleotídica fosforotioato em que o fósforo de ligação tem configuração Sp; etc.
Todos os oligonucleotídeos listados na Tabelas A1 são de fita simples.
Conforme descrito presente pedido, elas podem ser usados como uma fita simples, ou como uma fita para formar complexos com uma ou mais outras fitas.
Algumas sequências, devido ao seu comprimento, são divididas em múltiplas linhas.
ID: Número de identificação para um oligonucleotídeo.
WV-8806, WV-13405, WV-13406 e WV-13407 são totalmente PMO (oligonucleotídeos morfolino; [todos PMO] na Tabela). Abreviações nas Tabelas:
m5Ceo: 5-Metil 2'-Metoxietila C ( ); 5MS: modificação 5'-(S)-CH3 de porções químicas de açúcar; 5MSfC: 2'-F-5'-(S)-metila C (em oligonucleotídeos,
, em que em BA é nucleobase C e R2s é −F, e as posições 5' e 3' se conectam independentemente a −OH, ligações internucleotídicas, ligantes/ligações−H, ligantes/ligações−Mod, etc.
A forma de nucleosídeo é em que em BA é nucleobase C e R2s é −F); C6: ligante C6 amino (L001, −NH−(CH2)6− em que −NH− é conectado a Mod (por exemplo, através de −C(O)− em Mod) ou −H, e −(CH2)6− é conectado à extremidade 5' (ou extremidade 3' se indicado) da cadeia de oligonucleotídeo através de, por exemplo, fosfodiéster (−O−P(O)(OH)−O−. Pode existir como uma forma de sal.
Pode ser ilustrado nas Tabelas como O ou PO), fosforotioato (−O−P(O)(SH)−O−. Pode existir como uma forma de sal.
Pode ser ilustrado nas Tabelas como * se o fosforotioato não for quiralmente controlado; *S, S, ou Sp, se quiralmente controlado e tem uma configuração Sp, e *R, R, ou Rp, se quiralmente controlado e tem uma configuração Rp), ou fosforoditioato (−O−P(S)(SH)−O−. Pode existir como uma forma de sal.
Pode ser ilustrado nas Tabelas como PS2 ou : ou D) ligação.
Pode também ser denominado como ligante C6 ou ligante C6 amina); : ou D: Fosforotioato (Fosforoditioato), representado por D ou dois pontos ( : );
n001: ligação não negativamente carregada (que é estereoaleatória a menos que indicado de outro modo (por exemplo, como n001R, ou n001S)); n002: ligação não negativamente carregada
(que é estereoaleatória a menos que indicado de outro modo (por exemplo, como n002R, ou n002S)); n003: ligação não negativamente carregada
(que é estereoaleatória a menos que indicado de outro modo (por exemplo, como n003R, ou n003S)); n004: ligação não negativamente carregada
(que é estereoaleatória a menos que indicado de outro modo (por exemplo, como n004R, ou n004S)); n005: ligação não negativamente carregada
(que é estereoaleatória a menos que indicado de outro modo (por exemplo, como n005R, ou n005S)); n006: ligação não negativamente carregada
(que é estereoaleatória a menos que indicado de outro modo (por exemplo, como n006R, ou n006S)); n007: ligação não negativamente carregada
(que é estereoaleatória no fósforo de ligação a menos que indicado de outro modo (por exemplo, as n007R, ou n007S)); n008: ligação não negativamente carregada
(que é estereoaleatória a menos que indicado de outro modo (por exemplo, como n008R, ou n008S)); n009: ligação não negativamente carregada
(que é estereoaleatória a menos que indicado de outro modo (por exemplo, como n009R, ou n009S)); n010: ligação não negativamente carregada
(que é estereoaleatória a menos que indicado de outro modo (por exemplo, como n010R, ou n010S)); n001R: n001 sendo quiralmente controlada e tendo a configuração Rp; n002R: n002 sendo quiralmente controlada e tendo a configuração Rp; n003R: n003 sendo quiralmente controlada e tendo a configuração Rp; n004R: n004 sendo quiralmente controlada e tendo a configuração Rp; n005R: n005 sendo quiralmente controlada e tendo a configuração Rp; n006R: n006 sendo quiralmente controlada e tendo a configuração Rp; n007R: n007 sendo quiralmente controlada e tendo a configuração Rp; n008R: n008 sendo quiralmente controlada e tendo a configuração Rp; n009R: n009 sendo quiralmente controlada e tendo a configuração Rp; n010R: n010 sendo quiralmente controlada e tendo a configuração Rp; n001S: n001 sendo quiralmente controlada e tendo a configuração Sp; n002S: n002 sendo quiralmente controlada e tendo a configuração Sp; n003S: n003 sendo quiralmente controlada e tendo a configuração Sp; n004S: n004 sendo quiralmente controlada e tendo a configuração Sp; n005S: n005 sendo quiralmente controlada e tendo a configuração Sp; n006S: n006 sendo quiralmente controlada e tendo a configuração Sp; n007S: n007 sendo quiralmente controlada e tendo a configuração Sp; n008S: n008 sendo quiralmente controlada e tendo a configuração Sp; n009S: n009 sendo quiralmente controlada e tendo a configuração Sp; n010S: n010 sendo quiralmente controlada e tendo a configuração Sp; nO, nX: na Ligação/Estereoquímica, nO ou nX indica uma n001 estereoaleatória; nR: na Ligação/Estereoquímica, nR indica uma ligação, por exemplo, n001, n002, n003, n004, n005, n006, n007, n008, n009, etc., que é quiralmente controlada e que tem a configuração Rp (por exemplo, para n001, n001R na Descrição); nS: na Ligação/Estereoquímica, nS indica uma ligação, por exemplo, n001, n002, n003, n004, n005, n006, n007, n008, n009, etc., que é quiralmente controlada e que tem a configuração Sp (por exemplo, para n001, n001R na Descrição); BrfU: uma unidade de nucleosídeo em que a nucleobase é BrU ( ) e em que o açúcar tem uma modificação 2'-F
(f) ( ); BrmU: uma unidade de nucleosídeo em que a nucleobase é BrU ( ) e em que o açúcar tem uma modificação 2'-OMe
(m) ( ); BrdU: uma unidade de nucleosídeo em que a nucleobase é BrU ( ) e em que o açúcar é 2-desoxirribose (conforme amplamente encontrado no DNA natural; 2'-desóxi (d)) (
); L004: ligante que tem a estrutura de −NH(CH2)4CH(CH2OH)CH2−, em que −NH− é conectado a Mod (por exemplo, através de −C(O)− em Mod) ou −H, e o −CH2− que conecta o sítio é conectado a uma ligação, por exemplo, fosfodiéster (−O−P(O)(OH)−O−. Pode existir como uma forma de sal.
Pode ser ilustrado nas Tabelas como O ou PO), fosforotioato
(−O−P(O)(SH)−O−. Pode existir como uma forma de sal.
Pode ser ilustrado nas Tabelas como * se o fosforotioato não for quiralmente controlado; *S, S, ou Sp, se quiralmente controlado e tem uma configuração Sp, e *R, R, ou Rp, se quiralmente controlado e tem uma configuração Rp), ou fosforoditioato (−O−P(S)(SH)−O−. Pode existir como uma forma de sal.
Pode ser ilustrado nas Tabelas como PS2 ou : ou D) ligação, na extremidade 5' ou 3' de uma cadeia de oligonucleotídeo, conforme indicado.
Por exemplo, um asterisco imediatamente antes de um L004 (por exemplo, *L004) indica que a ligação é uma ligação fosforotioato, e a ausência da indicação de qualquer outra ligação imediatamente antes de L004 indica que a ligação é uma ligação fosfodiéster.
Por exemplo, em WV-9858, que termina em fUL004, o ligante L004 é conectado (por meio do sítio −CH2) à ligação fosfodiéster na posição 3' no açúcar terminal 3’ (que é 2'-F e conectado à nucleobase U), e o ligante L004 é conectado por meio de −NH− a −H; de modo similar, em WV-10886, WV-10887, e WV-10888, o ligante L004 é conectado (por meio do sítio −CH2−) à ligação fosfodiéster na posição 3' do açúcar terminal 3', e o L004 é conectado por meio de −NH− a Mod012 (WV-10886), Mod085 (WV-10887) ou Mod086 (WV-10888); L005: ligante que tem a estrutura de −NH(CH2)5C(O)N(CH2CH2OH)CH2CH2−, em que −NH− é conectado a Mod (por exemplo, através de −C(O)− em Mod) ou −H, e o sítio de conexão −CH2− é conectado a uma ligação, por exemplo, fosfodiéster (−O−P(O)(OH)−O−. Pode existir como uma forma de sal.
Pode ser ilustrado nas Tabelas como O ou PO), fosforotioato (−O−P(O)(SH)−O−. Pode existir como uma forma de sal.
Pode ser ilustrado nas Tabelas como * se o fosforotioato não for quiralmente controlado; *S, S, ou Sp, se quiralmente controlado e tem uma configuração Sp, e *R, R, ou Rp, se quiralmente controlado e tem uma configuração Rp), ou fosforoditioato (−O−P(S)(SH)−O−. Pode existir como uma forma de sal.
Pode ser ilustrado nas Tabelas como PS2 ou : ou D) ligação, na extremidade 5' ou 3' de uma cadeia de oligonucleotídeo, conforme indicado.
Por exemplo, um asterisco imediatamente antes de um L005 (por exemplo, *L005) indica que a ligação é uma ligação fosforotioato, e a ausência da indicação de qualquer outra ligação imediatamente antes de L005 indica que a ligação é uma ligação fosfodiéster.
Por exemplo, em WV-12571, L005 é conectado a −H (nenhuma Mod após L005; por meio do sítio −NH−) e a ligação fosfodiéster na posição 3' do açúcar terminal 3’ (por meio do sítio −CH2−); e em WV-12572, L005 é conectado a Mod020 (por meio do sítio −NH−) e a ligação fosfodiéster na posição 3' do açúcar terminal 3’ (por meio do sítio −CH2−); L001L005: ligante que tem a estrutura de −NH(CH2)5C(O)N(CH2CH2−O−P(O)(OH)−O−(CH2)6NH−)CH2CH2−, em que cada um dos dois −NH− é independentemente conectado a Mod (por exemplo, através de −C(O)−) ou −H, e o sítio de conexão −CH2− é conectado a uma ligação, por exemplo, fosfodiéster (−O−P(O)(OH)−O−. Pode existir como uma forma de sal.
Pode ser ilustrado nas Tabelas como O ou PO), fosforotioato (−O−P(O)(SH)−O−. Pode existir como uma forma de sal.
Pode ser ilustrado nas Tabelas como * se o fosforotioato não for quiralmente controlado; *S, S, ou Sp, se quiralmente controlado e tem uma configuração Sp, e *R, R, ou Rp, se quiralmente controlado e tem uma configuração Rp), ou fosforoditioato (−O−P(S)(SH)−O−. Pode existir como uma forma de sal.
Pode ser ilustrado nas Tabelas como PS2 ou : ou D) ligação, na extremidade 5' ou 3' de uma cadeia de oligonucleotídeo, conforme indicado. eo: modificação 2'-MOE (2'−OCH2CH2OCH3) no nucleosídeo anterior (por exemplo, Aeo ( , em que BA é nucleobase A)); F, f: modificação 2'-F no nucleosídeo posterior (por exemplo, fA ( , em que BA é nucleobase A)); m: modificação 2'-OMe no nucleosídeo posterior (por exemplo, mA ( , em que BA é nucleobase A)); r: 2'-OH no nucleosídeo posterior (por exemplo, rA
( , em que BA é nucleobase A, conforme existia no RNA natural)); L012: ligação internucleotídica que tem a estrutura de −O−P(O)[O(CH2)2O(CH2)2O(CH2)2OH]−O−. Pode ser ilustrado como OO nas Tabelas; *, PS: Fosforotioato; PS2, : D: fosforoditioato (por exemplo, WV-3078, em que dois pontos (:) indica um fosforoditioato); *R, R, Rp: Fosforotioato na conformação Rp; *S, S, Sp: Fosforotioato na conformação Sp; X: Fosforotioato estereoaleatório;
Acet5fU: ;
Acet5mU: NA: Não aplicável; O, PO: fosfodiéster (fosfato). Quando nenhuma ligação internucleotídica é especificada entre duas unidades de nucleosídeo, a ligação internucleotídica é uma ligação fosfodiéster (ligação fosfato natural). Quando usado para indicar ligação entre Mod e um ligante, por exemplo, L001, O pode indicar −C(O)− (que conecta Mod e L001, por exemplo: Mod013L001fU*SfC*SfA*SfA*SfG*SfG*SmAfA*SmGmA*SfU*SmGmGfC*SfA* SfU*SfU*SfU*SfC*SfU (Descrição), OOSSSSSSOSOSSOOSSSSSS (Ligação/Estereoquímica). Observe que o segundo O em OOSSSSSSOSOSSOOSSSSSS (Ligação/Estereoquímica) representa a ligação fosfodiéster que conecta L001 e o 5'−O− do açúcar terminal 5’ da cadeia de oligonucleotídeo (consulte as ilustrações abaixo.
Alternativamente, o 5'−O− pode ser considerado parte da ligação fosfodiéster (ou outro tipo de ligação, tal como uma ligação fosforotioato), em cujo caso a ligação fosfodiéster (ou outro tipo de ligação, tal como ligação fosforotioato) é conectada à posição 5' do açúcar terminal 5' da cadeia de oligonucleotídeo). Em alguns casos,
"O" para −C(O)− (que conecta Mod e L001) é omitido (por exemplo, para Mod013L001fU*SfC*SfA*SfA*SfG*SfG*SmAfA*SmGmA*SfU*SmGmGfC*SfA* SfU*SfU*SfU*SfC*SfU, "Ligação/Estereoquímica" OSSSSSSOSOSSOOSSSSSS); Várias Mods: Mod001 (com −C(O)− que se conecta a, por exemplo, −NH− de um ligante, tal como L001):
Láurico (em Mod013), Mirístico (em Mod014), Palmítico (em Mod005), Esteárico (em Mod015), Oleico (em Mod016), Linoleico (em Mod017), alfa-Linolênico (em Mod018), gama-Linolênico (em Mod019), DHA (em Mod006), Turbinárico (em Mod020), Dilinoleico (em Mod021), TriGlcNAc (em Mod024), Trialfamanose (em Mod026), Monossulfonamida (em Mod 027), Trissulfonamida (em Mod029), Láurico (em Mod030), Mirístico (em Mod031), Palmítico (em Mod032), e Esteárico (em Mod033): Ácido láurico (para Mod013), ácido Mirístico (para Mod014), ácido Palmítico (para Mod005), ácido Esteárico (para Mod015), ácido Oleico (para Mod016), ácido Linoleico (para Mod017), ácido alfa-Linolênico (para Mod018), ácido gama-Linolênico (para Mod019), ácido docosa-hexaenoico (para Mod006), ácido Turbinárico (para Mod020), álcool para Dilinoleíla (para
Mod021), ácido para TriGlcNAc (para Mod024), ácido para Trialfamanose (para Mod026), ácido para Monossulfonamida (para Mod 027), ácido para Trissulfonamida (para Mod029), álcool Laurílico (para Mod030), álcool Miristílico (para Mod031), álcool Palmitílico (para Mod032), e álcool Estearílico (para Mod033), respectivamente, conjugados a cadeias de oligonucleotídeos, por exemplo, através de um grupo amida, um ligante (por exemplo, ligante C6 amino, (L001)) e/ou grupo de ligação (por exemplo, ligação fosfodiéster (PO), ligação fosforotioato (PS), etc.): por exemplo, Mod013 (ácido Láurico com ligante C6 amino e PO ou PS), Mod014 (ácido Mirístico com ligante C6 amino e PO ou PS), Mod005 (ácido Palmítico com ligante C6 amino e PO ou PS), Mod015 (ácido Esteárico com ligante C6 amino e PO ou PS), Mod016 (ácido Oleico com ligante C6 amino e PO ou PS), Mod017 (ácido Linoleico com ligante C6 amino e PO ou PS), Mod018 (ácido alfa-Linolênico com ligante C6 amino e PO ou PS), Mod019 (ácido gama-Linolênico com ligante C6 amino e PO ou PS), Mod006 (DHA com ligante C6 amino e PO ou PS), Mod020 (ácido Turbinárico com ligante C6 amino e PO ou PS), Mod021 (álcool (consulte abaixo) com PO ou PS), Mod024 (ácido (consulte abaixo) com ligante C6 amino e PO ou PS), Mod026 (ácido (consulte abaixo) com ligante C6 amino e PO ou PS), Mod027 (ácido (consulte abaixo) com ligante C6 amino e PO ou PS), Mod029 (ácido (consulte abaixo) com ligante C6 amino e PO ou PS), Mod030 (álcool Laurílico com PO ou PS), Mod031 (álcool Miristílico com PO ou PS), Mod032 (álcool Palmitílico com PO ou PS), e Mod033 (álcool Estearílico com PO ou PS), com PO ou PS para cada oligonucleotídeo indicado na Tabela A1. Por exemplo, álcool estearila WV-3557 conjugado à cadeia de oligonucleotídeo de WV-3473 por meio de PS:
Mod033*fU*SfC*SfA*SfA*SfG*SfG*SmAfA*SmGmA*SfU*SmGmGfC*SfA*SfU *SfU*SfU*SfC*SfU (Descrição), XSSSSSSOSOSSOOSSSSSS (Estereoquímica); e ácido Esteárico WV-4106 conjugado à cadeia de oligonucleotídeo de WV-3473 por meio do grupo amida, C6, e PS: Mod015L001*fU*SfC*SfA*SfA*SfG*SfG*SmAfA*SmGmA*SfU*SmGmGfC*SfA *SfU*SfU*SfU*SfC*SfU (Descrição), XSSSSSSOSOSSOOSSSSSS (Estereoquímica). Determinadas porções químicas para conjugação, e reagentes exemplificativos (muitos dos quais eram anteriormente conhecidos e são comercialmente disponíveis ou podem ser prontamente preparados com o uso de tecnologias conhecidas, de acordo com a presente revelação, por exemplo, ácido Láurico (para Mod013), ácido Mirístico (para Mod014), ácido Palmítico (para Mod005), ácido Esteárico (para Mod015), ácido Oleico (para Mod016), ácido Linoleico (para Mod017), ácido alfa-Linolênico (para Mod018), ácido gama-Linolênico (para Mod019), ácido docosa-hexaenoico (para Mod006), ácido Turbinárico (para Mod020), álcool para Dilinoleíla (para Mod021), álcool Laurílico (para Mod030), álcool Miristílico (para Mod031), álcool Palmitílico (para Mod032), álcool Estearílico (para Mod033), etc.) são listados abaixo.
Determinadas porções químicas exemplificativas (por exemplo, porções químicas de lipídio, porção química de alvejamento, etc.) e/ou reagentes de preparação exemplificativos (por exemplo, ácidos, álcoois, etc.) para conjugação a cadeias de oligonucleotídeos incluem o seguinte com um exemplo não limitante de um ligante: Mod005 (com −C(O)− que se conecta a, por exemplo, −NH− de um ligante, tal como L001) e ácido palmítico:
Mod005L001 (com PO ou PS que se conecta a 5'-O- de uma cadeia de oligonucleotídeo):
Mod006 (com −C(O)− que se conecta a, por exemplo, −NH− de um ligante, tal como L001) e DHA:
Mod006L001 (com PO ou PS que se conecta a 5'-O- de uma cadeia de oligonucleotídeo):
Mod009 (com −C(O)− que se conecta a, por exemplo, −NH− de um ligante, tal como L001):
Mod012 (com −C(O)− que se conecta a, por exemplo, −NH− de um ligante, tal como L001):
;
Mod013 (com −C(O)− que se conecta a, por exemplo, −NH− de um ligante, tal como L001) e ácido láurico:
Mod013L001 (com PO ou PS que se conecta a 5'-O- de uma cadeia de oligonucleotídeo):
Mod014 (com −C(O)− que se conecta a, por exemplo, −NH− de um ligante, tal como L001) e ácido mirístico:
Mod014L001 (com PO ou PS que se conecta a 5'-O- de uma cadeia de oligonucleotídeo):
Mod015 (com −C(O)− que se conecta a, por exemplo, −NH− de um ligante, tal como L001) e ácido esteárico:
Mod015L001 (com PO ou PS que se conecta a 5'-O- de uma cadeia de oligonucleotídeo):
Mod016 (com −C(O)− que se conecta a, por exemplo, −NH− de um ligante, tal como L001) e ácido oleico:
Mod016L001 (com PO ou PS que se conecta a 5'-O- de uma cadeia de oligonucleotídeo):
Mod017 (com −C(O)− que se conecta a, por exemplo, −NH− de um ligante, tal como L001) e ácido linoleico:
Mod 017L001 (com PO ou PS que se conecta a 5'-O- de uma cadeia de oligonucleotídeo):
Mod018 (com −C(O)− que se conecta a, por exemplo, −NH− de um ligante, tal como L001) e ácido alfa-linolênico:
Mod018L001 (com PO ou PS que se conecta a 5'-O- de uma cadeia de oligonucleotídeo):
Mod019 (com −C(O)− que se conecta a, por exemplo, −NH− de um ligante, tal como L001) e ácido gama-linolênico:
Mod019L001 (com PO ou PS que se conecta a 5'-O- de uma cadeia de oligonucleotídeo):
Mod020 (com −C(O)− que se conecta a, por exemplo, −NH− de um ligante, tal como L001) e ácido turbinárico:
Mod020L001 (com PO ou PS que se conecta a 5'-O- de uma cadeia de oligonucleotídeo):
Mod021 (com PO ou PS que se conecta a 5'-O- de uma cadeia de oligonucleotídeo) e álcool:
Mod024 (com −C(O)− que se conecta a, por exemplo, −NH− de um ligante, tal como L001) e ácido:
Mod024L001 (com PO ou PS que se conecta a 5'-O- de uma cadeia de oligonucleotídeo):
Mod026 (com −C(O)− que se conecta a, por exemplo, −NH− de um ligante, tal como L001) e ácido:
Mod026L001 (com PO ou PS que se conecta a 5'-O- de uma cadeia de oligonucleotídeo):
Mod027 (com −C(O)− que se conecta a, por exemplo, −NH− de um ligante, tal como L001) e ácido:
Mod027L001 (com PO ou PS que se conecta a 5'-O- de uma cadeia de oligonucleotídeo):
Mod028 (com −C(O)− que se conecta a, por exemplo, −NH− de um ligante, tal como L001):
Mod029 (com −C(O)− que se conecta a, por exemplo, −NH− de um ligante, tal como L001) e ácido:
Mod029L001 (com PO ou PS que se conecta a 5'-O- de uma cadeia de oligonucleotídeo):
Mod030 (com PO ou PS que se conecta a 5'-O- de uma cadeia de oligonucleotídeo) e álcool laurílico:
Mod031 (com PO ou PS que se conecta a 5'-O- de uma cadeia de oligonucleotídeo) e álcool miristílico:
Mod032 (com PO ou PS que se conecta a 5'-O- de uma cadeia de oligonucleotídeo) e álcool palmítico:
Mod033 (com PO ou PS que se conecta a 5'-O- de uma cadeia de oligonucleotídeo) e álcool estearílico:
Mod053 (com −C(O)− que se conecta a, por exemplo, −NH− de um ligante, tal como L001):
Mod070 (com −C(O)− que se conecta a, por exemplo, −NH− de um ligante, tal como L001):
Mod071 (com −C(O)− que se conecta a, por exemplo, −NH− de um ligante, tal como L001):
Mod086 (com −C(O)− que se conecta a, por exemplo, −NH− de um ligante, tal como L001):
Mod092 (com −C(O)− que se conecta a, por exemplo, −NH− de um ligante, tal como L001):
Mod093 (com −C(O)− que se conecta a, por exemplo, −NH− de um ligante, tal como L001):
Mod007 (com −C(O)− que se conecta a, por exemplo, −NH− de um ligante, tal como L001):
Mod050 (com −C(O)− que se conecta a, por exemplo,
−NH− de um ligante, tal como L001):
Mod043 (com −C(O)− que se conecta a, por exemplo, −NH− de um ligante, tal como L001):
Mod057 (com −C(O)− que se conecta a, por exemplo, −NH− de um ligante, tal como L001):
Mod058 (com −C(O)− que se conecta a, por exemplo, −NH− de um ligante, tal como L001):
Mod059 (com −C(O)− que se conecta a, por exemplo, −NH− de um ligante, tal como L001):
Mod066 (com −C(O)− que se conecta a, por exemplo, −NH− de um ligante, tal como L001):
Mod074 (com −C(O)− que se conecta a, por exemplo, −NH− de um ligante, tal como L001):
Mod085 (com −C(O)− que se conecta a, por exemplo, −NH− de um ligante, tal como L001):
Mod091L001 (com PO ou PS que se conecta a 5'-O- de uma cadeia de oligonucleotídeo):
(por exemplo, em WV-11114, X = O (PO) e que se conecta a 5'-O- da cadeia de oligonucleotídeo) Mod097 (com −C(O)− que se conecta a, por exemplo, −NH− de um ligante, tal como L001): Mod098 (com −C(O)− que se conecta a, por exemplo, −NH− de um ligante, tal como L001): Mod099 (com −C(O)− que se conecta a, por exemplo, −NH− de um ligante, tal como L001):
N NH HO O O HN O HN N S O NH NH S HN O
H N O NH2 N
O N H H N O N N O H H O
OH Mod100 (com −C(O)− que se conecta a, por exemplo,
−NH− de um ligante, tal como L001):
Mod102 (com −C(O)− que se conecta a, por exemplo, −NH− de um ligante, tal como L001):
Mod103 (com −C(O)− que se conecta a, por exemplo, −NH− de um ligante, tal como L001):
Mod104 (com −C(O)− que se conecta a, por exemplo, −NH− de um ligante, tal como L001): H2N
NH NH2 HN
O NH N O O O HN
O N O H2N NH
H N HN
NH NH2
O O OH HN HN HN O
N N H2N NH O NH O
H HO N O O O N O S H O N OH N OH H
O Mod105 (com −C(O)− que se conecta a, por exemplo, −NH− de um ligante, tal como L001):
OH OH HO O HO H O N HN O OH OH O HO O O HO O O O O HN N H O N OH H OH O O HO O HO O HN HN O
O Mod106 (com PO ou PS que se conecta a 5'-O- de uma cadeia de oligonucleotídeo): (por exemplo, em WV-15844, X = O (PO) e que se conecta a 5'-O- da cadeia de oligonucleotídeo)
Mod107 (com PO ou PS que se conecta a 5'-O- de uma cadeia de oligonucleotídeo):
(por exemplo, em WV-15845 e WV-16011, X = O (PO) e que se conecta a 5'-O- da cadeia de oligonucleotídeo) Mod108 (com −C(O)− que se conecta a, por exemplo, −NH− de um ligante, tal como L001):
. Mod109:
Mod109L001 (com PO ou PS que se conecta a 5'-O- de uma cadeia de oligonucleotídeo):
(por exemplo, em WV-19792, X = O) Mod110:
Mod110L001 (com PO ou PS que se conecta a 5'-O- de uma cadeia de oligonucleotídeo):
(por exemplo, em WV-19793, X = O)
Mod111:
Mod111L001 (com PO ou PS que se conecta a 5'-O- de uma cadeia de oligonucleotídeo):
(por exemplo, em WV-19794, X = O) Mod 112:
Mod112L001 (com PO ou PS que se conecta a 5'-O- de uma cadeia de oligonucleotídeo):
(por exemplo, em WV-19795, X = O) Mod113:
Mod113L001 (com PO ou PS que se conecta a 5'-O- de uma cadeia de oligonucleotídeo):
(por exemplo, em WV-19796, X = O) Mod114:
Mod114L001 (com PO ou PS que se conecta a 5'-O- de uma cadeia de oligonucleotídeo):
(por exemplo, em WV-19797, X = O) Mod115:
Mod115L001 (com PO ou PS que se conecta a 5'-O- de uma cadeia de oligonucleotídeo):
(por exemplo, em WV-19798, X = O) Mod118:
Mod118L001 (com PO ou PS que se conecta a 5'-O- de uma cadeia de oligonucleotídeo):
Mod119:
Mod119L001 (com PO ou PS que se conecta a 5'-O- de uma cadeia de oligonucleotídeo):
Mod120:
Mod120L001 (com PO ou PS que se conecta a 5'-O- de uma cadeia de oligonucleotídeo):
L009n001L009n001L009n001L009: conectado à posição 5' do açúcar terminal 5' de uma cadeia de oligonucleotídeo (por exemplo, para WV-23576 e WV-23578, açúcar de fU) através de um fosfodiéster:
L009n001L009n001L009n001: conectado à posição 5' do açúcar terminal 5' de uma cadeia de oligonucleotídeo (por exemplo, para WV-23577 e WV-23579, açúcar de fU) através de n001: L010n001L010n001L010n001L009: conectado à posição 5' do açúcar terminal 5' de uma cadeia de oligonucleotídeo (por exemplo, para WV-23936 e WV-23938, açúcar de fU) através de um fosfodiéster: L010n001L010n001L010n001: conectado à posição 5' do açúcar terminal 5' de uma cadeia de oligonucleotídeo (por exemplo, para WV-23937 e WV-23939, açúcar de fU) através de n001:
[00736] Em algumas modalidades, alguns grupos funcionais são opcionalmente protegidos, por exemplo, para Mod024 e/ou Mod 026, os grupos hidroxila são opcionalmente protegidos como AcO−, antes e/ou durante a conjugação a cadeias de oligonucleotídeos, e os grupos funcionais, por exemplo, grupos hidroxila, podem ser desprotegidos, por exemplo, durante a clivagem e/ou desproteção de oligonucleotídeo:
[00737] O requerente observa que apresentados na Tabela A1 estão os modos exemplificativos de apresentar as estruturas de oligonucleotídeos fornecidos, por exemplo, WV- 3546 (Mod020L001fU*SfC*SfA*SfA*SfG*SfG*SmAfA*SmGmA*SfU*SmGmGfC*SfA *SfU*SfU*SfU*SfC*SfU) pode ser apresentado como uma porção química de lipídio (Mod020,
) conectada por meio de −C(O)− (OOSSSSSSOSOSSOOSSSSSS, cujo "O" pode ser omitido como na Tabela A1) ao −NH− de −NH−(CH2)6−, em que o −(CH2)6− é conectado à extremidade 5' da cadeia de oligonucleotídeo por meio de uma ligação fosfodiéster (OOSSSSSSOSOSSOOSSSSSS). Uma pessoa de habilidade comum na técnica entende que um oligonucleotídeo fornecido pode ser apresentado como combinações de unidades de lipídio, ligante e cadeia de oligonucleotídeo de muitos modos diferentes, em que em cada modo a combinação das unidades fornece o mesmo oligonucleotídeo. Por exemplo, WV-3546, pode ser considerado como tendo uma estrutura de Ac−[−LLD−(RLD)a]b, em que a é 1, b é 1, e tem uma porção química de lipídio RLD de ) conectada à sua unidade de cadeia de oligonucleotídeo (Ac) através de um ligante LLD que tem a estrutura de −C(O)−NH−(CH2)6−OP(=O)(OH)−O−, em que −C(O)− é conectado a RLD, e −O− é conectado a Ac (como 5'−O− da cadeia de oligonucleotídeo); um dos muitos modos alternativos é que RLD é , e LLD é −NH−(CH2)6−OP(=O)(OH)−O−, em que −NH− é conectado a RLD, e −O− é conectado a Ac (como 5'−O− da cadeia de oligonucleotídeo).
[00738] Em algumas modalidades, cada ligação internucleotídica fosforotioato de um oligonucleotídeo é independentemente uma ligação internucleotídica quiralmente controlada. Em algumas modalidades, uma composição de oligonucleotídeo fornecida é uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada de um tipo de oligonucleotídeo listado na Tabela A1, em que cada ligação internucleotídica fosforotioato do oligonucleotídeo é independentemente uma ligação internucleotídica quiralmente controlada.
[00739] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece composições que compreendem ou consistem em uma pluralidade de oligonucleotídeos fornecidos (por exemplo, composições de oligonucleotídeo quiralmente controladas). Em algumas modalidades, todos os oligonucleotídeos da pluralidade são do mesmo tipo, isto é, todos têm a mesma sequência de base, padrão de ligações de cadeia principal, padrão de centros quirais de cadeia principal, e padrão de modificações de fósforo de cadeia principal. Em algumas modalidades, todos os oligonucleotídeos do mesmo tipo são estruturalmente idênticos. Em algumas modalidades, as composições fornecidas compreendem oligonucleotídeos de uma pluralidade de tipos de oligonucleotídeos, tipicamente em quantidades controladas. Em algumas modalidades, uma composição de oligonucleotídeo fornecida quiralmente controlada compreende uma combinação de dois ou mais tipos de oligonucleotídeos fornecidos.
[00740] Em algumas modalidades, uma composição de oligonucleotídeo da presente revelação é uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada, em que a sequência dos oligonucleotídeos de sua pluralidade compreende ou consiste em uma sequência de base listada na Tabela A1.
[00741] Em alguns experimentos, os oligonucleotídeos fornecidos podem fornecer atividades surpreendentemente altas, por exemplo, em comparação com aquelas de Drisapersen e/ou Eteplirsen. Por exemplo, as composições de oligonucleotídeo quiralmente controladas de WV- 887, WV-892, WV-896, WV-1714, WV-2444, WV-2445, WV-2526, WV-
2527, WV-2528, e WV-2530, e muitas outras, cada uma, mostrou uma capacidade superior, em algumas modalidades, muitas vezes superior, para mediar o salto de um éxon na distrofina, em comparação com Drisapersen e/ou Eteplirsen. Determinados dados são fornecidos na presente revelação como exemplos.
[00742] Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a uma composição que compreende um oligonucleotídeo quiralmente controlado selecionado dentre qualquer oligonucleotídeo DMD listado no presente documento, ou qualquer oligonucleotídeo DMD que tem uma sequência de base que compreende pelo menos 15 bases consecutivas de qualquer oligonucleotídeo DMD listado no presente documento.
[00743] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido não é superior a 25 bases de comprimento. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido não é superior a 25 a 60 bases de comprimento. Em algumas modalidades, um U pode ser substituir por T, ou vice- versa.
[00744] Em algumas modalidades, ao analisar os oligonucleotídeos exemplificativos em camundongos, os oligonucleotídeos (por exemplo, WV-3473, WV-3545, WV-3546, WV- 942, etc.) são injetados por via intravenosa através da veia caudal em camundongos macho C57BL/10ScSndmdmdx (4 a 5 semanas de idade), em quantidades testadas, por exemplo, 10 mg/kg, 30 mg/kg, etc. Em algumas modalidades, os tecidos são colhidos em tempos testados, por exemplo, no Dia, por exemplo, 2, 7 e/ou 14, etc., após injeção, em algumas modalidades, frescos congelados em nitrogênio líquido e armazenados a -80 °C até a análise.
[00745] Vários ensaios podem ser usados para avaliar os níveis de oligonucleotídeo, de acordo com a presente revelação. Em algumas modalidades, ELISA híbrido é usado para quantificar os níveis de oligonucleotídeo em tecidos com o uso de diluição de artigo de teste em série como curva padrão: Por exemplo, em um procedimento exemplificativo, placa de 96 poços ativada com anidrido maleico (Pierce 15110) foi revestida com 50 µl de sonda de captura a 500 nM em NaHCO3 a 2,5% (Gibco, 25080-094) por 2 horas a 37 °C. A placa foi, então, lavada 3 vezes com PBST (PBS + 0,1% Tween-20), e bloqueada com 5% de leite sem gordura-PBST a 37 °C por 1 hora. O oligonucleotídeo de artigo de teste foi diluído em série na matriz. Esse padrão em conjunto com amostras originais foram diluídos com tampão de lise (Guanidina 4 M; 0,33% N-Lauril Sarcosina; Citrato de Sódio 25 mM; DTT 10 mM) de modo que a quantidade de oligonucleotídeo em todas as amostras seja menor que 100 ng/ml. 20 µl de amostras diluídas foram misturados com 180 µl de sonda de detecção 333 nM diluída em PBST, então desnaturada em máquina PCR (65 °C, 10 min, 95 °C, 15 min, 4 C ∞). 50 µl de amostras desnaturadas foram distribuídos em placa de ELISA bloqueada em triplicatas, e incubadas de um dia para o outro a 4 °C. Após 3 lavagens de PBST, 1:2000 estreptavidina-AP em PBST foi adicionada, 50 µl por poço e incubada à temperatura ambiente por 1 hora. Após lavagem extensa com PBST, 100 µl de AttoPhos (Promega S1000) foram adicionados, incubados à temperatura ambiente no escuro por 10 min e lidos no canal de fluorescência de leitor de placa (Dispositivo Molecular, M5): Ex435 nm, Em555 nm. Os oligonucleotídeos nas amostras foram calculados de acordo com a curva padrão por regressão de 4 parâmetros.
[00746] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos são estáveis tanto em homogenatos de plasma como de tecido. Modalidades e Exemplos Adicionais de Oligonucleotídeos e Composições, incluindo Oligonucleotídeos e Composições de Distrofina (DMD)
[00747] Entre outros fatores, a presente revelação fornece oligonucleotídeos, composições, e métodos para modular splicing, reduzir níveis alvo, tratar várias afecções, distúrbios, doenças, etc. Por exemplo, em algumas modalidades, a presente revelação fornece oligonucleotídeos de distrofina (DMD) e/ou composições de oligonucleotídeo DMD que são úteis para vários propósitos. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo DMD e/ou composição tem capacidade para mediar o salto do éxon 23 no gene DMD de camundongo. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo DMD e/ou composição tem capacidade para mediar o salto do éxon 44 no gene DMD humana ou de camundongo. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo DMD e/ou composição tem capacidade para mediar o salto do éxon 46 no gene DMD humana ou de camundongo. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo DMD e/ou composição tem capacidade para mediar o salto do éxon 47 no gene DMD humana ou de camundongo. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo DMD e/ou composição tem capacidade para mediar o salto do éxon 51 no gene DMD humana ou de camundongo. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo DMD e/ou composição tem capacidade para mediar o salto do éxon 52 no gene DMD humana ou de camundongo. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo DMD e/ou composição tem capacidade para mediar o salto do éxon 53 no gene DMD humana ou de camundongo. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo DMD e/ou composição tem capacidade para mediar o salto do éxon 54 no gene DMD humana ou de camundongo. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo DMD e/ou composição tem capacidade para mediar o salto do éxon 55 no gene DMD humana ou de camundongo.
[00748] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo DMD e/ou composição tem capacidade para mediar o salto de múltiplos éxons no gene DMD humana ou de camundongo.
[00749] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido, por exemplo, um oligonucleotídeo DMD, compreende uma modificação. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo DMD compreende uma modificação de açúcar. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo DMD compreende uma modificação de açúcar na posição 2'. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo DMD compreende uma modificação de açúcar na posição 2' selecionada dentre 2'-F, 2'-OMe e 2'-MOE.
[00750] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo DMD compreende um 2'-F, 2'-OMe e/ou 2'-MOE. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo DMD compreende um 2'-F. Em algumas modalidades, em um oligonucleotídeo DMD, cada açúcar compreende um 2'-F.
[00751] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo DMD compreende um 2'-OMe. Em algumas modalidades, em um oligonucleotídeo DMD, cada açúcar compreende um 2'-OMe. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo DMD compreende um 2'-MOE. Em algumas modalidades, em um oligonucleotídeo DMD, cada açúcar compreende um 2'-MOE.
[00752] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido, por exemplo, um oligonucleotídeo
DMD compreende um 2'-OMe e um 2'-F.
Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido, por exemplo, um oligonucleotídeo DMD, compreende um padrão de modificações de açúcar 2', em que o padrão compreende uma sequência selecionada dentre: fm, mf, ffm, fffm, ffffm, fffffm, ffffffm, fffffffm, ffffffffm, fffffffffm, mf, mff, mfff, mffff, mfffff, mffffff, mfffffff, mfffffff, fmf, fmmf, fmmmf, fmmmmf, fmmmmmf, fmmmmmmf, fmmmmmmmf, fmmmmmmmmf, fmmmmmmmmmf, ffffffmmmmmmmmffffff, fffffmmmmmmmmmmfffff, ffffmmmmmmmmmmmmffff, fffmmmmmmmmmmmmmmfff, ffmmmmmmmmmmmmmmmmff, fmmmmmmmmmmmmmmmmmmf, ffffffffffmmmmmmmmmm, fffffmmmmmmmmffffff, ffffmmmmmmmmmmfffff, fffmmmmmmmmmmmmffff, ffmmmmmmmmmmmmmmfff, fmmmmmmmmmmmmmmmmff, mmmmmmmmmmmmmmmmmmf, fffffffffmmmmmmmmmm, ffffmmmmmmmmffffff, fffmmmmmmmmmmfffff, ffmmmmmmmmmmmmffff, fmmmmmmmmmmmmmmfff, mmmmmmmmmmmmmmmmff, mmmmmmmmmmmmmmmmmf, ffffffffmmmmmmmmmm, fffmmmmmmmmffffff, ffmmmmmmmmmmfffff, fmmmmmmmmmmmmffff, mmmmmmmmmmmmmmfff, mmmmmmmmmmmmmmmff, mmmmmmmmmmmmmmmmf, fffffffmmmmmmmmmm, ffmmmmmmmmffffff, fmmmmmmmmmmfffff, mmmmmmmmmmmmffff, mmmmmmmmmmmmmfff, mmmmmmmmmmmmmmff, mmmmmmmmmmmmmmmf, ffffffmmmmmmmmmm, fmmmmmmmmffffff, mmmmmmmmmmfffff, mmmmmmmmmmmffff, mmmmmmmmmmmmfff, mmmmmmmmmmmmmff, mmmmmmmmmmmmmmf, fffffmmmmmmmmmm, mmmmmmmmffffff, mmmmmmmmmfffff, mmmmmmmmmmffff, mmmmmmmmmmmfff, mmmmmmmmmmmmff, mmmmmmmmmmmmmf, ffffmmmmmmmmmm, ffffffmmmmmmmmfffff, fffffmmmmmmmmmmffff, ffffmmmmmmmmmmmmfff, fffmmmmmmmmmmmmmmff, ffmmmmmmmmmmmmmmmmf, fmmmmmmmmmmmmmmmmmm, ffffffffffmmmmmmmmm, ffffffmmmmmmmmffff, fffffmmmmmmmmmmfff,
ffffmmmmmmmmmmmmff, fffmmmmmmmmmmmmmmf, ffmmmmmmmmmmmmmmmm, fmmmmmmmmmmmmmmmmm, ffffffffffmmmmmmmm, ffffffmmmmmmmmfff, fffffmmmmmmmmmmff, ffffmmmmmmmmmmmmf, fffmmmmmmmmmmmmmm, ffmmmmmmmmmmmmmmm, fmmmmmmmmmmmmmmmm, ffffffffffmmmmmmm, ffffffmmmmmmmmff, fffffmmmmmmmmmmf, ffffmmmmmmmmmmmm, fffmmmmmmmmmmmmm, ffmmmmmmmmmmmmmm, fmmmmmmmmmmmmmmm, ffffffffffmmmmmm, ffffffmmmmmmmmf, fffffmmmmmmmmmm, ffffmmmmmmmmmmm, fffmmmmmmmmmmmm, ffmmmmmmmmmmmmm, fmmmmmmmmmmmmmm, ffffffffffmmmmm, ffffffmmmmmmmm, fffffmmmmmmmmm, ffffmmmmmmmmmm, fffmmmmmmmmmmm, ffmmmmmmmmmmmm, fmmmmmmmmmmmmm, ffffffffffmmmm, ffffffmmmmmmm, fffffmmmmmmmm, ffffmmmmmmmmm, fffmmmmmmmmmm, ffmmmmmmmmmmm, fmmmmmmmmmmmm, ffffffffffmmm, ffffffmmmmmm, fffffmmmmmmm, ffffmmmmmmmm, fffmmmmmmmmm, ffmmmmmmmmmm, fmmmmmmmmmmm, ffffffffffmm, ffffffmmmmm, fffffmmmmmm, ffffmmmmmmm, fffmmmmmmmm, ffmmmmmmmmm, fmmmmmmmmmm, ffffffffffm, mmmmmmmmmmffffffffff, ffffffmmmmmmmmmmmmmm, mmmmmmmmmmmmmmffffff, ffmmmmmmmmfmmfmfffff, mmffffffffmffmfmmmmm, mfmfmfmfmfmfmfmfmfmf, mmmmmmffffffffmmmmmm, ffffffmmmmmmmmffffff, mfmmffmmfmmfffmmmmfm, fmffmmffmffmmmffffmf, fmff, mffm, fmffm, mfmmf, fmmf, fmffmm, mfmmff, mmff, fmmff, mmffm, fmffmmf, mfmmffm, mfmm, mfmmf, mfmmff, fmffmmf, mfmmffm, mmffm, ffmmf, fmfff, mfffm, fmfffm, fmfffmm, mfmmfff, mmfff, fmmfff, mmfffm, fmfffmmf, mfmmfffm, mfmm, mfmmf, mfmmfff, fmfffmmf, mfmmfffm, mmfffm, fffmmf, mfmmmf, fmmmf, fmffmmm, mfmmmff, mmmff, fmmmff, mmmffm, fmffmmmf, mfmmmffm, mfmmm, mfmmmf, mfmmmff, fmffmmmf, mfmmmffm, mmmffm, ffmmmf, ou qualquer porção dos mesmos que compreende pelo menos cinco modificações consecutivas, em que f é 2'-F e m é 2'-OMe.
[00753] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido, por exemplo, um oligonucleotídeo DMD, compreende um padrão que compreende qualquer um dentre: O, OO, OOO, OOOO, OOOOO, OOOOOO, OOOOOOO, OOOOOOOO, OOOOOOOOO, OOOOOOOOOO, OOOOOOOOOOO, S, SS, SSS, SSSS, SSSSS, SSSSSS, SSSSSSS, SSSSSSSS, SSSSSSSSS, SSSSSSSSSS, SSSSSSSSSSS, X, XX, XXX, XXXX, XXXXX, XXXXXX, XXXXXXX, XXXXXXXX, XXXXXXXXX, XXXXXXXXXX, XXXXXXXXXXX, R, RR, RRR, RRRR, RRRRR, RRRRRR, RRRRRRR, RRRRRRRR, RRRRRRRRR, RRRRRRRRRR, RRRRRRRRRRR, OSOOO, OSOO, OSO, SOOO, OXOOO, OXOO, OXO, XOO, ROOOR, ROROR, ROROR, ROORR, RROOR, ROOR, OOR, RRROR, RRRO, RROR, ROR, SOOOR, ROOOS, ROOO, ROO, RO, OOOS, SOOOS, SOOO, SOOSS, SOSOS, SOSO, OSOS, SOS, SSOOS, SSOO, SSO, SOO, SSSOS, SSSO, SOS, XOOOX, XOOO, XOO, XO, OOOX, OOX, OX, SOOOS, SOOO, SOO, SO, OOOS, OOS, XXXXXXXXXXXXX, XXXXXXXXXXXX, XXXXXXXXXXX, XXXXXXXXXX, XXXXXXXXX, XXXXXXXX, XXXXXXX, XXXXXX, XXXXX, XXXX, SSSSRSSRSS, SSSSRSSRS, SSSSRSSR, SSSSRSS, SSSSRS, SSSS, SSS, SSSRSSRSS, SSRSSRSS, SRSSRSS, RSSRSS, SSRSS, SSRS, SSSRSSRSSS, SSRSSRSSS, SSSRSSRSS, SSRSSRSSSS, SRSSRSSSS, SSRSSRSSS, SSRSSSSSSS, SRSSSSSSS, SSRSSSSSS, SSSSSSRSSS, SSSSSRSSS, SSSSSSRSS, SSO, SOS, OSO, OSSO, SSOS, SSOSS, SSOSSO, SSOSSOS, SSOSSOSS, XO, XXO, XOX, XXOX, XXOXX, XXXOXX, XXXOX, XXOXX, XXXOXXX, XXOXXO, XXOXX, XXOXXOX, ou XXOXXOXX, ou qualquer porção dos mesmos que compreende pelo menos 5 ligações internucleotídicas consecutivas, em que X é uma ligação fosforotioato estereoaleatória, S é uma ligação fosforotioato da configuração Sp, e R é uma ligação fosforotioato da configuração Rp.
[00754] Vários oligonucleotídeos, incluindo oligonucleotídeos DMD, que têm essas modificações e padrões dos mesmos, ou porções dos mesmos, são descritos na presente revelação, incluindo aqueles listados na Tabela A1.
[00755] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo DMD compreende uma ligação internucleotídica não negativamente carregada. Os exemplos não limitantes de tal um oligonucleotídeo incluem, entre outros: WV-11237, WV-11238, WV-11239, WV-11340, WV-11341, WV-11342, WV-11343, WV-11344, WV-11345, WV-11346, WV-11347, WV-12123, WV-12124, WV-12125, WV-12126, WV-12127, WV-12128, WV-12129, WV-12130, WV-12131, WV-12132, WV-12133, WV-12134, WV-12135, WV-12136, WV-12553, WV-12554, WV-12555, WV-12556, WV-12557, WV-12558, WV-12559, WV-12872, WV-12873, WV-12876, WV-12877, WV-12878, WV-12879, WV-12880, WV-12881, WV-12882, WV-12883, WV-12884, WV-12885, WV-12887, WV-12888, WV-13408, WV-13409, WV-13594, WV-13595, WV-13596, WV-13597, WV-13812, WV-13813, WV-13814, WV-13815, WV-13816, WV-13817, WV-13820, WV-13821, WV-13822, WV-13823, WV-13824, WV-13825, WV-13857, WV-13858, WV-13859, WV-13860, WV-13861, WV-13862, WV-13863, WV-13864, WV-13865, WV-14342, WV-14343, WV-14344, WV-14345, WV-14522, WV-14523, WV-14525, WV-14526, WV-14528, WV-14529, WV-14530, WV-14532, WV-14533, WV-14565, WV-14566, WV-14773, WV-14774, WV-14776, WV-14777, WV-14778, WV-14779, WV-14790, WV-14791, WV-15052, WV-15053, WV-15143, WV-15322, WV-15323, WV-15324, WV-15325, WV-15326, WV-15327, WV-15328, WV-15329, WV-15330, WV-15331, WV-15332, WV-15333, WV-15334, WV-15335, WV-15336, WV-15337, WV-15338, WV-15366, WV-15369, WV-15589, WV-15647, WV-15844, WV-15845, WV-15846, WV-15850, WV-15851, WV-15852, WV-15853, WV-15854, WV-15855, WV-15856, WV-15857, WV-15858, WV-15859, WV-15860, WV-15861, WV-15862, WV-15912, WV-15913, WV-15928, WV-15929, WV-15930, WV-15931, WV-15932, WV-15933, WV-15934, WV-15935,
WV-15937, WV-15939, WV-15940, WV-15941, WV-15942, WV-15943, WV-15944, WV-15945, WV-15946, WV-15947, WV-15948, WV-15949, WV-15962, WV-15963, WV-15964, WV-15965, WV-15966, WV-15967, WV-15968, WV-15969, WV-15970, WV-15971, WV-15972, WV-15973, WV-16004, WV-16005, WV-16010, WV-16011, WV-16366, WV-16368, WV-16369, WV-16371, WV-16372, WV-16499, WV-16505, WV-16506, WV-16507, WV-17765, WV-17774, WV-17775, WV-17801, WV-17802, WV-17803, WV-17831, WV-17832, WV-17833, WV-17834, WV-17838, WV-17839, WV-17840, WV-17841, WV-17842, WV-17843, WV-17854, WV-17855, WV-17856, WV-17857, WV-17858, WV-17859, WV-17860, WV-17861, WV-17862, WV-17863, WV-17864, WV-17865, WV-17866, WV-17881, WV-17882, WV-17883, WV-18853, WV-18854, WV-18855, WV-18856, WV-18857, WV-18858, WV-18859, WV-18860, WV-18861, WV-18862, WV-18863, WV-18864, WV-18865, WV-18866, WV-18867, WV-18868, WV-18869, WV-18870, WV-18871, WV-18872, WV-18873, WV-18874, WV-18875, WV-18876, WV-18877, WV-18878, WV-18879, WV-18880, WV-18881, WV-18882, WV-18883, WV-18884, WV-18885, WV-18886, WV-18887, WV-18888, WV-18889, WV-18890, WV-18891, WV-18892, WV-18893, WV-18894, WV-18895, WV-18896, WV-18897, WV-18898, WV-18899, WV-18900, WV-18901, WV-18902, WV-18903, WV-18904, WV-18905, WV-18906, WV-18907, WV-18908, WV-18909, WV-18910, WV-18911, WV-18912, WV-18913, WV-18914, WV-18915, WV-18916, WV-18917, WV-18918, WV-18919, WV-18920, WV-18921, WV-18922, WV-18923, WV-18924, WV-18925, WV-18926, WV-18927, WV-18928, WV-18929, WV-18930, WV-18931, WV-18932, WV-18933, WV-18934, WV-18935, WV-18936, WV-18937, WV-18938, WV-18939, WV-18940, WV-18941, WV-18942, WV-18944, WV-18945, WV-19790, WV-19791, WV-19792, WV-19793, WV-19794, WV-19795, WV-19796, WV-19797, WV-19798, WV-19803, WV-19804, WV-19805, WV-19806, WV-19886, WV-19887, WV-19888, WV-19889, WV-19890, WV-19891,
WV-19892, WV-19893, WV-19894, WV-19895, WV-19896, WV-19897, WV-19898, WV-19899, WV-19900, WV-19901, WV-19902, WV-19903, WV-19904, WV-19905, WV-19906, WV-19907, WV-19908, WV-19909, WV-19910, WV-19911, WV-19912, WV-19913, WV-19914, WV-19915, WV-19916, WV-19917, WV-19918, WV-19919, WV-19920, WV-19921, WV-19922, WV-19923, WV-19924, WV-19925, WV-19926, WV-19927, WV-19928, WV-19929, WV-19930, WV-19931, WV-19932, WV-19933, WV-19934, WV-19935, WV-19936, WV-19937, WV-19938, WV-19939, WV-19940, WV-19941, WV-19942, WV-19943, WV-19944, WV-19945, WV-19946, WV-19947, WV-19948, WV-19949, WV-19950, WV-19951, WV-19952, WV-19953, WV-19954, WV-19955, WV-19956, WV-19957, WV-19958, WV-19959, WV-19960, WV-19961, WV-19962, WV-19963, WV-19964, WV-19965, WV-19966, WV-19967, WV-19968, WV-19969, WV-19970, WV-19971, WV-19972, WV-19973, WV-19974, WV-19975, WV-19976, WV-19977, WV-19978, WV-19979, WV-19980, WV-19981, WV-19982, WV-19983, WV-19984, WV-19985, WV-19986, WV-19987, WV-19988, WV-19989, WV-19990, WV-19991, WV-19992, WV-19993, WV-19994, WV-19995, WV-19996, WV-19997, WV-19998, WV-19999, WV-20000, WV-20001, WV-20002, WV-20003, WV-20004, WV-20005, WV-20006, WV-20007, WV-20008, WV-20009, WV-20010, WV-20011, WV-20012, WV-20013, WV-20014, WV-20015, WV-20016, WV-20017, WV-20018, WV-20019, WV-20020, WV-20021, WV-20022, WV-20023, WV-20024, WV-20025, WV-20026, WV-20027, WV-20028, WV-20029, WV-20030, WV-20031, WV-20032, WV-20033, WV-20034, WV-20035, WV-20036, WV-20037, WV-20038, WV-20039, WV-20040, WV-20041, WV-20042, WV-20043, WV-20044, WV-20045, WV-20046, WV-20047, WV-20048, WV-20049, WV-20050, WV-20051, WV-20052, WV-20053, WV-20054, WV-20055, WV-20056, WV-20057, WV-20058, WV-20059, WV-20060, WV-20061, WV-20062, WV-20063, WV-20064, WV-20065, WV-20066, WV-20067, WV-20068, WV-20069, WV-20070, WV-20071,
WV-20072, WV-20073, WV-20074, WV-20075, WV-20076, WV-20077, WV-20078, WV-20079, WV-20080, WV-20081, WV-20082, WV-20083, WV-20084, WV-20085, WV-20086, WV-20087, WV-20088, WV-20089, WV-20090, WV-20091, WV-20092, WV-20093, WV-20094, WV-20095, WV-20096, WV-20097, WV-20098, WV-20099, WV-20100, WV-20101, WV-20102, WV-20103, WV-20104, WV-20105, WV-20106, WV-20107, WV-20108, WV-20109, WV-20110, WV-20111, WV-20112, WV-20113, WV-20114, WV-20115, WV-20116, WV-20117, WV-20118, WV-20119, WV-20120, WV-20121, WV-20122, WV-20123, WV-20124, WV-20125, WV-20126, WV-20127, WV-20128, WV-20129, WV-20130, WV-20131, WV-20132, WV-20133, WV-20134, WV-20135, WV-20136, WV-20137, WV-20138, WV-20139, WV-20140, WV-20141, WV-20142, WV-20143, WV-20144, WV-20145, WV-20146, WV-20147, WV-20148, WV-20149, WV-20150, WV-20151, WV-20152, WV-20153, WV-20154, WV-20155, WV-20156, WV-20157, WV-20158, WV-20159, WV-20160, WV-21210, WV-21211, WV-21212, WV-21217, WV-21218, WV-21219, WV-21226, WV-21245, WV-21252, WV-21253, WV-21257, WV-21258, WV-21374, WV-21375, WV-21376, WV-21377, WV-21378, WV-21379, WV-21380, WV-21381, WV-21382, WV-21383, WV-21384, WV-21385, WV-21386, WV-21387, WV-21388, WV-21389, WV-21390, WV-21578, WV-21579, WV-21580, WV-21581, WV-21582, WV-21583, WV-21584, WV-21585, WV-21586, WV-21587, WV-21588, WV-21589, WV-21590, WV-21591, WV-21592, WV-21593, WV-21594, WV-21595, WV-21596, WV-21597, WV-21598, WV-21599, WV-21600, WV-21601, WV-21602, WV-21603, WV-21604, WV-21605, WV-21606, WV-21607, WV-21608, WV-21609, WV-21610, WV-21611, WV-21612, WV-21613, WV-21614, WV-21615, WV-21616, WV-21617, WV-21618, WV-21619, WV-21620, WV-21621, WV-21622, WV-21623, WV-21624, WV-21625, WV-21626, WV-21627, WV-21628, WV-21629, WV-21630, WV-21631, WV-21632, WV-21633, WV-21634, WV-21635, WV-21636, WV-21637, WV-21638, WV-21639,
WV-21640, WV-21641, WV-21642, WV-21643, WV-21644, WV-21645, WV-21646, WV-21647, WV-21648, WV-21649, WV-21650, WV-21651, WV-21652, WV-21653, WV-21654, WV-21655, WV-21656, WV-21657, WV-21658, WV-21659, WV-21660, WV-21661, WV-21662, WV-21663, WV-21664, WV-21665, WV-21666, WV-21667, WV-21668, WV-21669, WV-21670, WV-21671, WV-21672, WV-21673, WV-21723, WV-21724, WV-21725, WV-21726, WV-21727, WV-21728, WV-21729, WV-21730, WV-21731, WV-21732, WV-21733, WV-21734, WV-21735, WV-21736, WV-21737, WV-21738, WV-21739, WV-21740, WV-21741, WV-21742, WV-21743, WV-21744, WV-21745, WV-21746, WV-21747, WV-21748, WV-21749, WV-21750, WV-21751, WV-21752, WV-21753, WV-21754, WV-21755, WV-21756, WV-21757, WV-21758, WV-21759, WV-21760, WV-21761, WV-21762, WV-21763, WV-21764, WV-21765, WV-21766, WV-21767, WV-21768, WV-21769, WV-21770, WV-21771, WV-21772, WV-21773, WV-21774, WV-21775, WV-21776, WV-21777, WV-21778, WV-21779, WV-21780, WV-21781, WV-21782, WV-21783, WV-21784, WV-21785, WV-21786, WV-21787, WV-21788, WV-21789, WV-21790, WV-21791, WV-21792, WV-21793, WV-21794, WV-21795, WV-21796, WV-21797, WV-21798, WV-21799, WV-21800, WV-21801, WV-21802, WV-21803, WV-21804, WV-21805, WV-21806, WV-21807, WV-21808, WV-21809, WV-21810, WV-21811, WV-21812, WV-21813, WV-21814, WV-21815, WV-21816, WV-21817, WV-21818, WV-22753, WV-23576, WV-23577, WV-23578, WV-23579, WV-23936, WV-23937, WV-23938, e WV-23939. Oligonucleotídeos e Composições de Distrofina Exemplificativos para Salto de Éxon do Éxon 23
[00756] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece oligonucleotídeos, composições de oligonucleotídeo, e métodos de uso dos mesmos para mediar o salto do éxon 23 na DMD de camundongo. Os exemplos não limitantes incluem oligonucleotídeos e composições de WV- 10256, WV-10257, WV-10258, WV-10259, WV-10260, WV-1093, WV- 1094, WV-1095, WV-1096, WV-1097, WV-1098, WV-1099, WV-1100, WV-1101, WV-1102, WV-1103, WV-1104, WV-1105, WV-1106, WV-1121, WV-1122, WV-1123, WV-11231, WV-11232, WV-11233, WV-11234, WV- 11235, WV-11236, WV-1124, WV-1125, WV-1126, WV-1127, WV-1128, WV-1129, WV-1130, WV-11343, WV-11344, WV-11345, WV-11346, WV- 11347, WV-1141, WV-1142, WV-1143, WV-1144, WV-1145, WV-1146, WV-1147, WV-1148, WV-1149, WV-1150, WV-1678, WV-1679, WV-1680, WV-1681, WV-1682, WV-1683, WV-1684, WV-1685, WV-2733, WV-2734, WV-4610, WV-4611, WV-4614, WV-4615, WV-4616, WV-4617, WV-4618, WV-4619, WV-4620, WV-4621, WV-4622, WV-4623, WV-4624, WV-4625, WV-4626, WV-4627, WV-4628, WV-4629, WV-4630, WV-4631, WV-4632, WV-4633, WV-4634, WV-4635, WV-4636, WV-4637, WV-4638, WV-4639, WV-4640, WV-4641, WV-4642, WV-4643, WV-4644, WV-4645, WV-4646, WV-4647, WV-4648, WV-4649, WV-4650, WV-4651, WV-4652, WV-4653, WV-4654, WV-4655, WV-4656, WV-4657, WV-4658, WV-4659, WV-4660, WV-4661, WV-4662, WV-4663, WV-4664, WV-4665, WV-4666, WV-4667, WV-4668, WV-4669, WV-4670, WV-4671, WV-4672, WV-4673, WV-4674, WV-4675, WV-4676, WV-4677, WV-4678, WV-4679, WV-4680, WV-4681, WV-4682, WV-4683, WV-4684, WV-4685, WV-4686, WV-4687, WV-4688, WV-4689, WV-4690, WV-4691, WV-4692, WV-4693, WV-4694, WV-4695, WV-4696, WV-4697, WV-6010, WV-7677, WV-7678, WV-7679, WV-7680, WV-7681, WV-7682, WV-7683, WV-7684, WV-7685, WV-7686, WV-7687, WV-7688, WV-7689, WV-7690, WV-7691, WV-7692, WV-7693, WV-7694, WV-7695, WV-7696, WV-7697, WV-7698, WV-7699, WV-7700, WV-7701, WV-7702, WV-7703, WV-7704, WV-7705, WV-7706, WV-7707, WV-7708, WV-7709, WV-7710, WV-7711, WV-7712, WV-7713, WV-7714, WV-7715, WV-7716, WV-7717, WV-7718, WV-7719, WV-7720, WV-7721, WV-7722, WV-7723, WV-7724, WV-7725, WV-7726, WV-7727, WV-7728, WV-7729,
WV-7730, WV-7731, WV-7732, WV-7733, WV-7734, WV-7735, WV-7736, WV-7737, WV-7738, WV-7739, WV-7740, WV-7741, WV-7742, WV-7743, WV-7744, WV-7745, WV-7746, WV-7747, WV-7748, WV-7749, WV-7750, WV-7751, WV-7752, WV-7753, WV-7754, WV-7755, WV-7756, WV-7757, WV-7758, WV-7759, WV-7760, WV-7761, WV-7762, WV-7763, WV-7764, WV-7765, WV-7766, WV-7767, WV-7768, WV-7769, WV-7770, WV-7771, WV-9163, WV-9164, WV-9165, WV-9166, WV-9167, WV-9168, WV-9169, WV-9170, WV-9171, WV-9172, WV-9173, WV-9174, WV-9175, WV-9176, WV-9177, WV-9178, WV-9179, WV-9180, WV-9181, WV-9182, WV-9183, WV-9184, WV-9185, WV-9186, WV-9187, WV-9188, WV-9189, WV-9190, WV-9191, WV-9192, WV-9193, WV-9194, WV-9195, WV-9196, WV-9197, WV-9198, WV-9199, WV-9200, WV-9201, WV-9202, WV-9203, WV-9204, WV-9205, WV-9206, WV-9207, WV-9208, WV-9209, WV-9210, WV-9408, WV-9409, WV-9410, WV-9411, WV-9412, WV-9413, WV-9414, WV-9415, WV-9416, WV-9417, WV-9418, WV-9419, WV-9420, WV-943, WV-9875, WV-9876, WV-9877, WV-9878, e WV-9879, e outros oligonucleotídeos que têm uma sequência de base que compreende pelo menos 15 bases contíguas de qualquer um desses oligonucleotídeos DMD.
[00757] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo DMD tem capacidade para mediar o salto do éxon 23. Os exemplos não limitantes de tais oligonucleotídeos DMD incluem: WV-12566, WV-12567, WV-12568, WV-12884, WV-12885, WV-12886, WV-12887, WV-12888, WV-12571, e WV-12572, e outros oligonucleotídeos DMD que têm uma sequência de base que compreende pelo menos 15 bases contíguas de qualquer um desses oligonucleotídeos DMD.
[00758] O salto de éxon do éxon DMD 23 e outros éxons pode ser analisado em linhagens celulares derivadas do paciente e em células do modelo de camundongo mdx
(que porta uma mutação de ponto sem sentido no éxon 23 in- frame (Sicinski et al. 1989 Science 244: 1578–1580). Ao ignorar o éxon 23, a mutação sem sentido é desviada enquanto o quadro de leitura é mantido). As cepas adicionais de camundongo mdx, incluindo os alelos mdx2cv, mdx4cv e mdx5cv foram relatados por Wha Bin Im et al. 1996 Hum. Mol. Gen. 5: 1149-1153.
[00759] Os dados que mostram a capacidade de vários oligonucleotídeos DMD para mediar o salto do éxon 23 são mostrados no presente documento, entre outros, na Tabela 1A.1, Tabela 1A.2, Tabela 1A.3, e Tabela 25C.1 a Tabela 25C.5.
[00760] Oligonucleotídeos e Composições de Distrofina Exemplificativos Que Têm Como Alvo o Éxon 44 e Região Intrônica Contígua 3' ao Éxon 44
[00761] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo DMD tem como alvo o éxon DMD 44 ou a região intrônica contígua 3' ao éxon DMD 44.
[00762] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo DMD tem como alvo o éxon DMD 44 ou a região intrônica contígua 3' ao éxon DMD 44, e o oligonucleotídeo tem capacidade para mediar o salto de múltiplos éxons (por exemplo, de éxons 45 a 55, ou 45 a 57).
[00763] Supostamente, um fenômeno conhecido como back-splicing pode ocorrer, em que, por exemplo, uma porção da extremidade 3' do éxon 55 interage com uma porção da extremidade 5' do éxon 45, formando um RNA circular (circRNA), que pode, desse modo, ignorar múltiplos éxons, por exemplo, todos os éxons do éxon 45 a 55, inclusive. O fenômeno também pode ocorrer supostamente entre o éxon 57 e o éxon 45, ignorando múltiplos éxons, por exemplo, todos os éxons do éxon 45 ao 57, inclusive. O back-splicing é descrito na literatura,
por exemplo, em Suzuki et al. 2016 Int. J. Mol. Sci. 17.
[00764] Sem se ater a nenhuma teoria particular, a presente revelação sugere que pode ser possível que um oligonucleotídeo DMD que tem como alvo o éxon DMD 44 ou a região intrônica contígua 3' ao éxon 44 pode ser capaz de mediar o splicing dos éxons 45 a 55, ou dos éxons 45 a 57, cujos éxons são excisados como uma única peça de circular RNA (circRNA) designada 45-55 (ou 55-45) ou 45-57 (ou 57-45), respectivamente.
[00765] Vários oligonucleotídeos foram projetados para alvejar o éxon 44 ou íntron 44, ou que abrangem o éxon 44 e o íntron 44. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos projetados to target éxon 44 ou íntron 44, ou que abrangem o éxon 44 e o íntron 44 são testados para determinar se eles podem aumentar a quantidade de backslicing e/ou salto de múltiplos éxons.
[00766] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece oligonucleotídeos, composições de oligonucleotídeo, e métodos de uso dos mesmos para mediar o salto de éxon em DMD humana, em que a sequência de base do oligonucleotídeo é uma sequência do éxon 44 ou íntron 44, ou uma porção tanto do éxon 44 como do íntron 44. Os exemplos não limitantes incluem oligonucleotídeos e composições de WV- 13963, WV-13964, WV-13965, WV-13966, WV-13967, WV-13968, WV- 13969, WV-13970, WV-13971, WV-13972, WV-13973, WV-13974, WV- 13975, WV-13976, WV-13977, WV-13978, WV-13979, WV-13980, WV- 13981, WV-13982, WV-13983, WV-13984, WV-13985, WV-13986, WV- 13987, WV-13988, WV-13989, WV-13990, WV-13991, WV-13992, WV- 13993, WV-13994, WV-13995, WV-13996, WV-13997, WV-13998, WV- 13999, WV-14000, WV-14001, WV-14002, WV-14003, WV-14004, WV-
14005, WV-14006, WV-14007, WV-14008, WV-14009, WV-14010, WV- 14011, WV-14012, WV-14013, WV-14014, WV-14015, WV-14016, WV- 14017, WV-14018, WV-14019, WV-14020, WV-14021, WV-14022, WV- 14023, WV-14024, WV-14025, WV-14026, WV-14027, WV-14028, WV- 14029, WV-14030, WV-14031, WV-14032, WV-14033, WV-14034, WV- 14035, WV-14036, WV-14037, WV-14038, WV-14039, WV-14040, WV- 14041, WV-14042, WV-14043, WV-14044, WV-14045, WV-14046, WV- 14047, WV-14048, WV-14049, WV-14050, WV-14051, WV-14052, WV- 14053, WV-14054, WV-14055, WV-14056, WV-14057, e WV-14058, e outros oligonucleotídeos que têm uma sequência de base que compreende pelo menos 15 bases contíguas de qualquer um desses oligonucleotídeos DMD.
[00767] Os dados que mostram a capacidade de vários oligonucleotídeos DMD para alvejar o éxon 44 ou o íntron adjacente 3' ao éxon 44 são mostrados na Tabela 22A.2 e Tabela 22A.3.
[00768] Tabela 1A.1. Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos
[00769] Os oligonucleotídeos para o éxon 23 DMD foram testados in vitro quanto à sua capacidade de induzir o salto do éxon 23.
[00770] As células H2K foram dosadas com oligonucleotídeo em meio de diferenciação por 4 dias. O RNA foi extraído com Trizol, pré-amp, então tratado com TaqMan com leitura multiplexada de transcrição DMD ignorada e total; a quantificação absoluta foi por meio de g-Blocks de curva padrão. Nesses e em vários outros estudos, os números indicam a quantidade de salto skipping (isto é, eficiência de salto; ou a porcentagem de salto como uma porcentagem da transcrição de mRNA total).
[00771] Os oligonucleotídeos foram testados a 10, 3,33, 1,11, 0,37, ou 0,12 uM.
Oligonucleotídeo 10 3,33 1,11 0,37 0,12 WV-7684 4,2 2,1 1 0,2 0,1 4,1 2,1 0,9 0,2 0,1 5,2 3,2 1,5 0 0 5,1 3,3 1,1 0 0 WV-12886 27,7 17,5 10 5 2,4 28 17,6 9,8 5 2,3 29,8 22,8 13,1 3,7 32,7 21,5 11,9 3,5 WV-11231 3,8 2,1 1,4 0,4 0,3 3,8 2,1 1,3 0,5 0,3 5,3 2,7 1,4 0,7 0,2 5,1 2,4 1,6 0,8 0,2 WV-10258 24,5 19,9 9,5 4,8 2,8 25,3 20,1 9,1 4,8 2,7 24,4 19,4 13,2 6,2 3,4 24,2 19,7 13,6 6,3 3,5 WV-11345 29,2 24,9 15,9 12,1 5 30,2 24,9 15,5 11,9 5,1 30,8 25,8 17,8 32,3 25,3 17,6 WV-12885 26,8 23,3 16,5 8 2,8 27,5 23 17,2 8,2 3,8 32,3 25,8 16,3 6,1 30,7 27,1 16,3 6,3 WV-15589 22,2 14,8 11,2 4,6 2,2 21,7 15 12,3 4,4 2,3
24,1 11,3 11,4 23,5 8,6 10,8
[00772] Tabela 1A.2. Atividade de determinados oligonucleotídeos
[00773] Nesse estudo, a atividade de salto in vivo foi medida em modelo de camundongo MDX após única dose IV.
[00774] Os camundongos MDX receberam única dose IV de 150mg/kg. Os tecidos congelados rapidamente necropsiados (Quadríceps, Diafragma, etc.) foram pulverizados e o RNA extraído com Trizol. A eficiência de salto foi determinada por ensaio TaqMan multiplex para transcrições DMD ‘totais' e ‘éxon 23 ignorado’, normalizadas para curvas padrão gBlock.
[00775] Os números indicam a quantidade de salto do éxon 23 DMD (como uma porcentagem de mRNA total, em que 100 pode representar 100% ignorado). Quadríceps PBS WV-11345 WV-17774 WV-18945 0,01 0,01 28,61 30,25 3,93 3,92 2,1 1,53 0,01 0,12 26,34 24,53 10,82 10,73 1,16 0,91 0,15 0,06 40,29 36,57 14,79 13,47 2,04 0,92 30 30,05 10,13 6,19 5,05 3,97 23,24 25,18 13,92 14,36 2,4 1,77 Gastrocnêmio PBS WV-11345 WV-17774 WV-18945 0,02 0,02 22,27 13,18 36,41 33,55 2,46 1,95 0,02 0,01 14,74 8,03 18,02 19,55 0,6 0,27 0,09 0,11 11,12 3,68 16,17 15,44 0,36 0,41
22,82 28,29 11,22 10,94 0,72 0,75 18,09 15,66 28,85 27,9 0,61 3,14 Diafragma PBS WV-11345 WV-17774 WV-18945 0,04 0,03 27,05 24 7,11 4,07 0,72 0,82 0,01 1,13 16,22 16,2 18,1 18,6 0,81 0,68 0,04 0,09 15,16 13,23 9,66 10,02 0,33 0,32 33,66 36,52 4,55 4,86 0,63 0,21 20,03 20,55 8,38 9,46 0,56 0,91 Tibial PBS WV-11345 WV-17774 WV-18945 0,01 0,01 34,34 35,04 16,2 15,77 0 0 0 0 28,7 23,07 42,94 42,97 0,04 0,02 7,87 9,87 12,1 14,51 17,01 14,68 15,16 13,91 45,6 41,54
[00776] Tabela 1A.3. Atividade de determinados oligonucleotídeos
[00777] Os oligonucleotídeos foram testados in vitro quanto à capacidade de ignorar o éxon 23 DMD.
[00778] Os oligonucleotídeos foram testados a 10, 3,3, 1,1, 0,3, e 0,1 uM.
[00779] Os números indicam a quantidade de salto do éxon 23 DMD (como uma porcentagem de mRNA total, em que 100 pode representar 100% ignorado). 10 uM 3,3 uM 1,1 uM 0,3 uM 0,1 uM WV-10258 32,1 17,7 11,1 3,9 1,9 33,2 19,4 13 4,6 2,1 29 18,5 11,5 11,1 6,4
29 18,6 12,4 11,3 6 WV-11233 6,8 7,6 0,7 1,6 0,1 6,9 7,8 0,5 1,3 0 11,1 1,3 1,6 0,6 0,7 11 1,3 1,6 0,4 0,7 WV-11345 42 29,3 16,6 8,1 5 40 27,4 17,4 8,2 4,7 WV-18944 7,7 4 1,4 1 0,7 8 4 1,7 1 0,8 WV-17774 44,5 38,2 26,7 11,9 6,6 45,2 37,5 26,3 12,5 6,6 44 37,2 26,7 14,7 4,8 44,7 35,6 27,2 13,2 4,5 WV-18945 14,1 11,6 5 1,9 1,5 14,3 11,2 4,8 2 1,5 21,4 11,4 4,7 2,4 2,6 21,3 11,1 4,7 2,3 3 Mock 0,2 0,6 0 0,3 0,8 0 2,5 0 0,3 2,5 1,2 2 0 0,4 2,5 1,1 Oligonucleotídeos e Composições de Distrofina Exemplificativos para Salto de Éxon do Éxon 45
[00780] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece oligonucleotídeos, composições de oligonucleotídeo, e métodos de uso dos mesmos para mediar o salto do éxon 45 na DMD (por exemplo, de camundongo, ser humano, etc.).
[00781] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido DMD e/ou composição tem capacidade para mediar o salto do éxon 45. Os exemplos não limitantes de tais oligonucleotídeos DMD e composições incluem aqueles dentre: WV-11047, WV-11048, WV-11049, WV-11050, WV-11051, WV- 11052, WV-11053, WV-11054, WV-11055, WV-11056, WV-11057, WV- 11058, WV-11059, WV-11060, WV-11061, WV-11062, WV-11063, WV- 11064, WV-11065, WV-11066, WV-11067, WV-11068, WV-11069, WV- 11070, WV-11071, WV-11072, WV-11073, WV-11074, WV-11075, WV- 11076, WV-11077, WV-11078, WV-11079, WV-11080, WV-11081, WV- 11082, WV-11083, WV-11084, WV-11085, WV-11086, WV-11087, WV- 11088, WV-11089, WV-11090, WV-11091, WV-11092, WV-11093, WV- 11094, WV-11095, WV-11096, WV-11097, WV-11098, WV-11099, WV- 11100, WV-11101, WV-11102, WV-11103, WV-11104, WV-11105, WV- 9594, WV-9595, WV-9596, WV-9597, WV-9598, WV-9599, WV-9600, WV-9601, WV-9602, WV-9603, WV-9604, WV-9605, WV-9606, WV-9607, WV-9608, WV-9609, WV-9610, WV-9611, WV-9612, WV-9613, WV-9614, WV-9615, WV-9616, WV-9617, WV-9618, WV-9619, WV-9620, WV-9621, WV-9622, WV-9623, WV-9624, WV-9625, WV-9626, WV-9627, WV-9628, WV-9629, WV-9630, WV-9631, WV-9632, WV-9633, WV-9634, WV-9635, WV-9636, WV-9637, WV-9638, WV-9639, WV-9640, WV-9641, WV-9642, WV-9643, WV-9644, WV-9645, WV-9646, WV-9647, WV-9648, WV-9649, WV-9650, WV-9651, WV-9652, WV-9653, WV-9654, WV-9655, WV-9656, WV-9657, WV-9658, WV-9659, WV-9762, WV-9763, WV-9764, WV-9765, WV-9766, WV-9767, WV-9768, WV-9769, WV-9770, WV-9771, WV-9772, WV-9773, WV-9774, WV-9775, WV-9776, WV-9777, WV-9778, WV-9779, WV-9780, WV-9781, WV-9782, WV-9783, WV-9784, WV-9785, WV-9786, WV-9787, WV-9788, WV-9789, WV-9790, WV-9791, WV-9792, WV-9793,
WV-9794, WV-9795, WV-9796, WV-9797, WV-9798, WV-9799, WV-9800, WV-9801, WV-9802, WV-9803, WV-9804, WV-9805, WV-9806, WV-9807, WV-9808, WV-9809, WV-9810, WV-9811, WV-9812, WV-9813, WV-9814, WV-9815, WV-9816, WV-9817, WV-9818, WV-9819, WV-9820, WV-9821, WV-9822, WV-9823, WV-9824, WV-9825, e WV-9826, e outros oligonucleotídeos DMD que têm uma sequência de base que compreende pelo menos 15 bases contíguas de qualquer um desses oligonucleotídeos DMD.
[00782] Conforme mostrado em várias tabelas da Tabela 1 a Tabela 22 (e partes das mesmas), vários oligonucleotídeos DMD que compreendem vários padrões de modificações foram testados para salto de vários éxons. As Tabelas mostram os resultados de teste de determinados oligonucleotídeos DMD. Para analisar o salto de éxon de DMD, determinados oligonucleotídeos DMD foram testados in vitro em ∆52 células de mioblasto derivadas de paciente humano (também designadas DEL52) e/ou ∆45 a 52 células de mioblasto derivadas de paciente humano (células humanas em que o éxon 52 ou éxons 45 a 52 já foram deletados, também designado DEL45-52). A menos que observado de outro modo, em vários experimentos, os oligonucleotídeos foram entregues gimnoticamente. Nas tabelas, geralmente, 100,00 pode representar 100% de salto e 0,0 pode representar 0% de salto. Vários oligonucleotídeos DMD são descritos em detalhes na Tabela A1.
[00783] A Tabela 1A.4, abaixo, mostra dados exemplificativos de alguns oligonucleotídeos DMD no salto do éxon 45. Procedimento: ∆48-50 (Del48-50 ou D48-50) mioblastos foram tratados com oligonucleotídeos 10 uM por 4 dias em meio de diferenciação. Tabela 1A.4. Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos.
Os números representam o nível de salto, em que 100 pode representar 100% de salto e 0 pode representar 0% de salto.
Para vários dados descritos no presente documento, "Mock" é um controle negativo, em que água foi usada em vez de um oligonucleotídeo.
WV-11047 0,024 0,009 0,012 0,016 WV-11051 0,022 0,024 0,046 0,014 WV-11052 0,024 0,032 0,014 0,026 WV-11053 0,027 0,009 0,017 0,023 WV-11054 0,029 0,038 0,035 0,028 WV-11055 0,030 0,025 0,016 0,033 WV-11056 0,029 0,043 0,018 0,031 WV-11057 0,000 0,015 0,000 0,032 WV-11058 0,044 0,029 0,049 0,024 WV-11059 0,025 0,041 0,049 0,024 WV-11062 0,218 0,175 0,151 0,231 WV-11063 0,472 0,730 0,456 0,594 WV-11064 0,297 0,307 0,334 0,345 WV-11065 0,651 0,630 0,675 0,544 WV-11066 0,124 0,087 0,137 0,153 WV-11067 0,183 0,210 0,238 0,224 WV-11068 0,212 0,266 0,244 0,406 WV-11069 0,389 0,715 0,407 0,744 WV-11070 1,677 1,473 1,483 1,677 WV-11071 0,385 0,362 0,413 0,310 WV-11072 0,146 0,250 0,142 0,268 WV-11073 0,709 0,876 0,721 0,835 WV-11074 2,015 2,207 1,992 2,527
WV-11075 0,254 0,238 0,157 0,220 WV-11076 0,000 2,715 0,000 2,315 WV-11077 1,568 1,414 1,388 1,308 WV-11078 3,915 3,122 4,175 3,076 WV-11079 7,178 8,083 8,257 6,955 WV-11080 1,467 1,202 1,726 1,155 WV-11081 9,279 4,780 10,244 4,512 WV-11082 3,377 2,646 3,242 2,256 WV-11083 3,964 2,631 4,001 2,419 WV-11084 11,336 7,481 13,752 8,270 WV-11085 1,818 0,679 1,787 2,003 WV-11086 16,017 15,215 17,207 15,191 WV-11087 1,104 0,766 1,728 1,030 WV-11088 14,320 12,940 14,287 10,746 WV-11089 16,126 13,507 15,515 15,389 WV-11090 1,148 0,596 1,405 0,647 WV-11091 0,105 0,069 0,311 0,049 WV-11092 0,094 0,066 0,111 0,066 WV-11093 0,123 0,060 0,087 0,037 WV-11094 0,054 0,062 0,060 0,038 WV-11095 0,317 0,064 0,241 0,109 WV-11096 0,062 0,061 0,096 0,059 WV-11098 0,026 0,033 0,032 0,024 WV-11100 0,015 0,012 0,014 0,011 WV-11101 0,000 0,021 0,000 0,011 WV-11102 0,019 0,030 0,025 0,017 WV-11103 0,017 0,023 0,014 0,029 WV-11104 0,053 0,050 0,067 0,035 WV-11105 0,017 0,033 0,034 0,051
Mock 0,050 0,018 0,010 0,037 Mock 0,019 0,023 0,009 0,023 Tabela 1B.1. e 1B.2. Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos.
As Tabelas abaixo mostram dados exemplificativos de alguns oligonucleotídeos DMD no salto do éxon 45. Procedimento: ∆48-50 (Del48-50 ou DEL48-50 ou D48-50) mioblastos foram tratados com 10 ou 3 uM oligonucleotídeos por 4 dias em meio de diferenciação.
Os oligonucleotídeos foram dosados a 10 µM e 3 µM por 4 dias em Mioblastos DEL48-50. Determinados oligonucleotídeos compreendem uma ligação internucleotídica não negativamente carregada, conforme detalhado na Tabela A1. Tabela 1B.1. Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos. 10 um 3 um WV-13810 7,0 6,5 7,1 6,5 2,7 2,8 2,5 2,3 WV-13811 8,4 8,0 9,1 9,5 3,3 3,2 2,4 2,8 WV-13812 22,8 21,1 22,9 23,7 9,2 9,2 10,0 9,7 WV-13813 19,4 19,9 20,1 20,2 7,6 8,1 7,5 7,4 WV-13814 13,6 13,6 13,5 13,3 5,1 4,3 4,9 4,9 WV-13815 26,9 25,6 23,9 24,3 9,0 8,9 8,2 8,6 WV-13816 37,0 35,0 31,8 33,8 14,0 14,5 14,6 12,0 WV-13817 52,7 55,4 54,3 54,2 24,9 26,1 21,9 21,7 WV-14531 2,9 2,7 2,8 2,9 0,7 0,9 1,0 1,2 WV-14532 4,3 4,3 3,8 4,1 1,4 1,3 1,1 1,0 WV-14533 7,9 7,6 7,3 7,9 1,9 2,1 2,4 2,1 WV-11086 18,3 20,1 18,4 18,4 7,9 7,7 7,6 8,1 Tabela 1B.2. Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos. 10 uM 3 uM WV-13818 3,2 2,8 3,2 2,9 0,9 0,8 1,1 1,2 WV-13819 3,8 3,8 3,0 2,9 1,0 0,9 0,9 1,0 WV-13820 6,6 6,7 6,4 6,3 3,2 3,0 2,9 3,0 WV-13821 7,4 6,5 7,4 6,9 2,2 1,9 2,5 1,9 WV-13822 9,5 9,5 8,1 8,6 3,4 3,5 3,4 3,9 WV-13823 10,4 10,9 11,2 10,5 4,2 5,0 4,1 4,4 WV-13824 17,1 16,3 16,1 15,6 8,1 7,6 7,1 7,0 WV-13825 20,1 19,3 22,5 20,6 9,9 9,8 9,0 9,6 WV-14527 2,2 1,9 1,4 2,0 0,7 0,7 0,9 0,7 WV-14528 2,3 2,2 2,5 2,4 1,0 0,9 1,0 1,0 WV-14529 5,2 1,8 2,0 2,0 0,7 0,7 0,8 0,8 WV-11089 2,6 2,7 2,9 2,5 0,9 0,9 1,4 1,3 Os dados adicionais relacionados ao salto de múltiplos éxons mediados por oligonucleotídeos DMD que têm como alvo o éxon 45 DMD são mostrados na Tabela 22A.1. Oligonucleotídeos e Composições de Distrofina Exemplificativos Que Têm Como Alvo o Éxon 46
[00784] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece oligonucleotídeos, composições de oligonucleotídeo, e métodos de uso dos mesmos para alvejar o éxon 46 e/ou mediar o salto do éxon 46 em DMD humana. Os exemplos não limitantes incluem oligonucleotídeos e composições de WV-13701, WV-13702, WV-13703, WV-13704, WV- 13705, WV-13706, WV-13707, WV-13708, WV-13709, WV-13710, WV- 13711, WV-13712, WV-13713, WV-13714, WV-13715, WV-13716, WV- 13780, e WV-13781, e outros oligonucleotídeos que têm uma sequência de base que compreende pelo menos 15 bases contíguas de qualquer um desses oligonucleotídeos DMD.
[00785] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos DMD são testados primeiro para único salto de éxon para selecionar oligonucleotídeos adequados, então testados de modo combinatório (em combinação com outro oligonucleotídeo DMD) para salto de múltiplos éxons.
[00786] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos DMD que têm como alvo o éxon 46, 47, 52, 54 ou 55 DMD são testados primeiro para único salto de éxon para selecionar os oligonucleotídeos adequados, então testados de modo combinatório (em combinação com outro oligonucleotídeo DMD) para salto de múltiplos éxons. Tabela 2A. Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos. Os números indicam a porcentagem de salto do éxon 46. WV-13701 0,3 0,3 0,5 0,4 WV-13702 0,3 0,4 0,5 0,3 WV-13703 0,9 0,9 1,1 0,8 WV-13704 9,7 5,4 WV-13705 4,9 5,1 5,9 3,4 WV-13706 4,6 4,8 WV-13707 8,5 7,4 5,2 5,1 WV-13708 9,4 10,8 6,0 5,6 WV-13709 8,8 12,1 8,1 4,9 WV-13710 0,1 0,1 0,1 0,1 WV-13711 0,1 0,1 0,0 0,1 WV-13712 3,4 4,7 2,4 2,4 WV-13713 0,5 0,7 0,5 WV-13714 0,6 0,5 0,4 WV-13715 0,9 0,6 0,7
WV-13716 1,5 3,9 1,1 2,8 WV-13780 10,1 5,2 6,1 WV-13781 7,7 6,4 5,0 Mock 0,0 0,0 0,0 0,0 Mock 0,0 0,0 Oligonucleotídeos e Composições de Distrofina Exemplificativos Que Têm Como Alvo o Éxon 47
[00787] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece oligonucleotídeos, composições de oligonucleotídeo, e métodos de uso dos mesmos para alvejar o éxon 47 e/ou mediar o salto do éxon 47 em DMD humana. Os exemplos não limitantes incluem oligonucleotídeos e composições de oligos do éxon 47 que incluem: WV-13717, WV- 13718, WV-13719, WV-13720, WV-13721, WV-13722, WV-13723, WV- 13724, WV-13725, WV-13726, WV-13727, WV-13728, WV-13729, WV- 13730, WV-13731, WV-13732, WV-13788, e WV-13789, e outros oligonucleotídeos que têm uma sequência de base que compreende pelo menos 15 bases contíguas de qualquer um desses oligonucleotídeos DMD. Tabela 3A. Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos. Os números representam a porcentagem do salto do éxon 47. WV-13717 0,0 0,0 WV-13718 0,0 0,0 WV-13719 0,0 0,0 WV-13720 0,0 0,0 WV-13721 0,0 0,0 WV-13722 0,0 0,0 WV-13723 0,5 0,5
WV-13724 1,4 1,8 WV-13725 0,6 0,4 WV-13726 0,0 0,0 WV-13727 1,1 1,1 WV-13728 1,1 1,1 WV-13729 0,2 0,2 WV-13730 0,5 0,6 WV-13731 1,6 1,8 WV-13732 0,1 0,6 Oligonucleotídeos e Composições de Distrofina Exemplificativos para Salto de Éxon do Éxon 51
[00788] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece oligonucleotídeos, composições de oligonucleotídeo, e métodos de uso dos mesmos para mediar o salto do éxon 51 na DMD (por exemplo, de camundongo, ser humano, etc.).
[00789] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido DMD e/ou composição tem capacidade para mediar o salto do éxon 51. Os exemplos não limitantes de tais oligonucleotídeos DMD e composições incluem aqueles dentre: ONT-395, WV-10255, WV-10261, WV-10262, WV-10634, WV- 10635, WV-10636, WV-10637, WV-10868, WV-10869, WV-10870, WV- 10871, WV-10872, WV-10873, WV-10874, WV-10875, WV-10876, WV- 10877, WV-10878, WV-10879, WV-10880, WV-10881, WV-10882, WV- 10883, WV-10884, WV-10885, WV-10886, WV-10887, WV-10888, WV- 1107, WV-1108, WV-1109, WV-1110, WV-1111, WV-1112, WV-1113, WV-1114, WV-1115, WV-1116, WV-1117, WV-1118, WV-1119, WV-1120, WV-11237, WV-11238, WV-11239, WV-1131, WV-1132, WV-1133, WV- 1134, WV-1135, WV-1136, WV-1137, WV-1138, WV-1139, WV-1140, WV-1151, WV-1152, WV-1153, WV-1154, WV-1155, WV-1156, WV-1157,
WV-1158, WV-1159, WV-1160, WV-1709, WV-1710, WV-1711, WV-1712, WV-1713, WV-1714, WV-1715, WV-1716, WV-2095, WV-2096, WV-2097, WV-2098, WV-2099, WV-2100, WV-2101, WV-2102, WV-2103, WV-2104, WV-2105, WV-2106, WV-2107, WV-2108, WV-2109, WV-2165, WV-2179, WV-2180, WV-2181, WV-2182, WV-2183, WV-2184, WV-2185, WV-2186, WV-2187, WV-2188, WV-2189, WV-2190, WV-2191, WV-2192, WV-2193, WV-2194, WV-2195, WV-2196, WV-2197, WV-2198, WV-2199, WV-2200, WV-2201, WV-2202, WV-2203, WV-2204, WV-2205, WV-2206, WV-2207, WV-2208, WV-2209, WV-2210, WV-2211, WV-2212, WV-2213, WV-2214, WV-2215, WV-2216, WV-2217, WV-2218, WV-2219, WV-2220, WV-2221, WV-2222, WV-2223, WV-2224, WV-2225, WV-2226, WV-2227, WV-2228, WV-2229, WV-2230, WV-2231, WV-2232, WV-2233, WV-2234, WV-2235, WV-2236, WV-2237, WV-2238, WV-2239, WV-2240, WV-2241, WV-2242, WV-2243, WV-2244, WV-2245, WV-2246, WV-2247, WV-2248, WV-2249, WV-2250, WV-2251, WV-2252, WV-2253, WV-2254, WV-2255, WV-2256, WV-2257, WV-2258, WV-2259, WV-2260, WV-2261, WV-2262, WV-2263, WV-2264, WV-2265, WV-2266, WV-2267, WV-2268, WV-2273, WV-2274, WV-2275, WV-2276, WV-2277, WV-2278, WV-2279, WV-2280, WV-2281, WV-2282, WV-2283, WV-2284, WV-2285, WV-2286, WV-2287, WV-2288, WV-2289, WV-2290, WV-2291, WV-2292, WV-2293, WV-2294, WV-2295, WV-2296, WV-2297, WV-2298, WV-2299, WV-2300, WV-2301, WV-2302, WV-2303, WV-2304, WV-2305, WV-2306, WV-2307, WV-2308, WV-2309, WV-2310, WV-2311, WV-2312, WV-2313, WV-2314, WV-2315, WV-2316, WV-2317, WV-2318, WV-2319, WV-2320, WV-2321, WV-2322, WV-2323, WV-2324, WV-2325, WV-2326, WV-2327, WV-2328, WV-2329, WV-2330, WV-2331, WV-2332, WV-2333, WV-2334, WV-2335, WV-2336, WV-2337, WV-2338, WV-2339, WV-2340, WV-2341, WV-2342, WV-2343, WV-2344, WV-2345, WV-2346, WV-2347, WV-2348, WV-2349, WV-2350, WV-2351, WV-2352, WV-2353, WV-2354, WV-2361, WV-2362, WV-2363, WV-2364, WV-2365, WV-2366, WV-2367, WV-2368, WV-2369, WV-2370, WV-2381,
WV-2382, WV-2383, WV-2384, WV-2385, WV-2432, WV-2433, WV-2434, WV-2435, WV-2436, WV-2437, WV-2438, WV-2439, WV-2440, WV-2441, WV-2442, WV-2443, WV-2444, WV-2445, WV-2446, WV-2447, WV-2448, WV-2449, WV-2526, WV-2527, WV-2528, WV-2529, WV-2530, WV-2531, WV-2532, WV-2533, WV-2534, WV-2535, WV-2536, WV-2537, WV-2538, WV-2578, WV-2579, WV-2580, WV-2581, WV-2582, WV-2583, WV-2584, WV-2585, WV-2586, WV-2587, WV-2588, WV-2625, WV-2627, WV-2628, WV-2660, WV-2661, WV-2662, WV-2663, WV-2664, WV-2665, WV-2666, WV-2667, WV-2668, WV-2669, WV-2670, WV-2737, WV-2738, WV-2739, WV-2740, WV-2741, WV-2742, WV-2743, WV-2744, WV-2745, WV-2746, WV-2747, WV-2748, WV-2749, WV-2750, WV-2752, WV-2783, WV-2784, WV-2785, WV-2786, WV-2787, WV-2788, WV-2789, WV-2790, WV-2791, WV-2792, WV-2793, WV-2794, WV-2795, WV-2796, WV-2797, WV-2798, WV-2799, WV-2800, WV-2801, WV-2802, WV-2803, WV-2804, WV-2805, WV-2806, WV-2807, WV-2808, WV-2812, WV-2813, WV-2814, WV-3017, WV-3018, WV-3019, WV-3020, WV-3022, WV-3023, WV-3024, WV-3025, WV-3026, WV-3027, WV-3028, WV-3029, WV-3030, WV-3031, WV-3032, WV-3033, WV-3034, WV-3035, WV-3036, WV-3037, WV-3038, WV-3039, WV-3040, WV-3041, WV-3042, WV-3043, WV-3044, WV-3045, WV-3046, WV-3047, WV-3048, WV-3049, WV-3050, WV-3051, WV-3052, WV-3053, WV-3054, WV-3055, WV-3056, WV-3057, WV-3058, WV-3059, WV-3060, WV-3061, WV-3070, WV-3071, WV-3072, WV-3073, WV-3074, WV-3075, WV-3076, WV-3077, WV-3078, WV-3079, WV-3080, WV-3081, WV-3082, WV-3083, WV-3084, WV-3085, WV-3086, WV-3087, WV-3088, WV-3089, WV-3113, WV-3114, WV-3115, WV-3116, WV-3117, WV-3118, WV-3120, WV-3121, WV-3152, WV-3153, WV-3357, WV-3358, WV-3359, WV-3360, WV-3361, WV-3362, WV-3363, WV-3364, WV-3365, WV-3366, WV-3463, WV-3464, WV-3465, WV-3466, WV-3467, WV-3468, WV-3469, WV-3470, WV-3471, WV-3472, WV-3473, WV-3506, WV-3507, WV-3508, WV-3509, WV-3510, WV-3511, WV-3512, WV-3513, WV-3514, WV-3515, WV-3516,
WV-3517, WV-3518, WV-3519, WV-3520, WV-3543, WV-3544, WV-3545, WV-3546, WV-3547, WV-3548, WV-3549, WV-3550, WV-3551, WV-3552, WV-3553, WV-3554, WV-3555, WV-3556, WV-3557, WV-3558, WV-3559, WV-3560, WV-3753, WV-3754, WV-3820, WV-3821, WV-3855, WV-3856, WV-3971, WV-4106, WV-4107, WV-4191, WV-4231, WV-4232, WV-4233, WV-4890, WV-6137, WV-6409, WV-6410, WV-6560, WV-6826, WV-6827, WV-6828, WV-7109, WV-7110, WV-7333, WV-7334, WV-7335, WV-7336, WV-7337, WV-7338, WV-7339, WV-7340, WV-7341, WV-7342, WV-7343, WV-7344, WV-7345, WV-7346, WV-7347, WV-7348, WV-7349, WV-7350, WV-7351, WV-7352, WV-7353, WV-7354, WV-7355, WV-7356, WV-7357, WV-7358, WV-7359, WV-7360, WV-7361, WV-7362, WV-7363, WV-7364, WV-7365, WV-7366, WV-7367, WV-7368, WV-7369, WV-7370, WV-7371, WV-7372, WV-7373, WV-7374, WV-7375, WV-7376, WV-7377, WV-7378, WV-7379, WV-7380, WV-7381, WV-7382, WV-7383, WV-7384, WV-7385, WV-7386, WV-7387, WV-7388, WV-7389, WV-7390, WV-7391, WV-7392, WV-7393, WV-7394, WV-7395, WV-7396, WV-7397, WV-7398, WV-7399, WV-7400, WV-7401, WV-7402, WV-7410, WV-7411, WV-7412, WV-7413, WV-7414, WV-7415, WV-7457, WV-7458, WV-7459, WV-7460, WV-7461, WV-7506, WV-7596, WV-8130, WV-8131, WV-8230, WV-8231, WV-8232, WV-8449, WV-8478, WV-8479, WV-8480, WV-8481, WV-8482, WV-8483, WV-8484, WV-8485, WV-8486, WV-8487, WV-8488, WV-8489, WV-8490, WV-8491, WV-8492, WV-8493, WV-8494, WV-8495, WV-8496, WV-8497, WV-8498, WV-8499, WV-8500, WV-8501, WV-8502, WV-8503, WV-8504, WV-8505, WV-8506, WV-8806, WV-884, WV-885, WV-886, WV-887, WV- 888, WV-889, WV-890, WV-891, WV-892, WV-893, WV-894, WV-895, WV-896, WV-897, WV-9222, WV-9223, WV-9224, WV-9225, WV-9226, WV-9227, WV-942, WV-9540, WV-9541, WV-9737, WV-9738, WV-9739, WV-9740, WV-9741, WV-9742, WV-9827, WV-9828, WV-9829, WV-9830, WV-9831, WV-9832, WV-9833, WV-9834, WV-9835, WV-9836, WV-9837, WV-9838, WV-9839, WV-9840, WV-9841, WV-9842, WV-9843, WV-9844,
WV-9845, WV-9846, WV-9847, WV-9848, WV-9849, WV-9850, WV-9851, WV-9852, WV-9858, e WV-8937, e outros oligonucleotídeos DMD que têm uma sequência de base que compreende pelo menos 15 bases contíguas de qualquer um desses oligonucleotídeos DMD.
[00790] Os exemplos não limitantes adicionais de tais oligonucleotídeos DMD e composições incluem aqueles dentre: WV-2444, WV-2528, WV-2531, WV-2578, WV-2579, WV-2580, WV-2581, WV-2669, WV-2745, WV-3032, WV-3152, WV-3153, WV-3360, WV-3363, WV-3364, WV-3465, WV-3466, WV-3470, WV-3472, WV-3473, WV-3507, WV-3545, WV-3546, WV-3552, WV-4106, WV-4231, WV-4232, WV-4233, WV-887, WV-896, WV-942, e outros oligonucleotídeos DMD que têm uma sequência de base que compreende pelo menos 15 bases contíguas de qualquer um desses oligonucleotídeos DMD.
[00791] Os exemplos não limitantes adicionais de tais oligonucleotídeos DMD e composições incluem aqueles dentre: WV-12494, WV-12130, WV-12131, WV-12132, WV-12133, WV- 12134, WV-12135, WV-12136, WV-12496, WV-12495, WV-12123, WV- 12124, WV-12125, WV-12126, WV-12127, WV-12128, WV-12129, WV- 12553, WV-12554, WV-12555, WV-12556, WV-12557, WV-12558, WV- 12559, WV-12872, WV-12873, WV-12876, WV-12877, WV-12878, WV- 12879, WV-12880, WV-12881, WV-12882, e WV-12883, e outros oligonucleotídeos DMD que têm uma sequência de base que compreende pelo menos 15 bases contíguas de qualquer um desses oligonucleotídeos DMD.
[00792] Em algumas modalidades, a sequência da região de interesse para o salto do éxon 51 difere entre o camundongo e o ser humano.
[00793] Vários ensaios podem ser utilizados para avaliar os oligonucleotídeos em relação ao salto de éxon, de acordo com a presente revelação. Em algumas modalidades, a fim de testar a eficácia de uma combinação particular de química e estereoquímica de um oligonucleotídeo pretendida para o salto do éxon 51 em seres humanos, pode-se preparar o oligonucleotídeo correspondente que tem a sequência de camundongo e, então testado no camundongo. A presente revelação reconhece que nos homólogos humanos e de camundongo do éxon 51, existem algumas diferenças (sublinhadas abaixo):
M GTGGTTACTAAGGAAACTGTCATCTCCAAACTAGAAATGCCATCTTCTTTGCTGTTGGAG H
GTGGTTACTAAGGAAACTGCCATCTCCAAACTAGAAATGCCATCTTCCTTGATGTTGGAG em que M é Camundongo, nt 7571-7630; e H é Ser humano, nt 7665-7724.
[00794] Devido a essas diferenças, oligonucleotídeos DMD ligeiramente diferentes para salto do éxon 51 podem ser preparados para teste em camundongos e seres humanos. Como um exemplo não limitante, as seguintes sequências de oligonucleotídeos DMD podem ser usadas para teste em seres humanos e camundongos: Sequência de oligonucleotídeos DMD HUMANA:
UCAAGGAAGAUGGCAUUUCU Sequência de oligonucleotídeos DMD de CAMUNDONGO:
GCAAAGAAGAUGGCAUUUCU As disparidades entre ser humano e camundongo estão sublinhadas.
[00795] Um oligonucleotídeo DMD destinado para tratar um indivíduo humano pode ser construído com uma combinação particular de sequência de base (por exemplo, UCAAGGAAGAUGGCAUUUCU), e um padrão de química particular, ligações internucleotídicas, estereoquímica e porções químicas adicionais (se houver). Tal oligonucleotídeo DMD pode ser testado in vitro em células humanas ou in vivo em indivíduos humanos, porém pode ter adequação limitada para teste em camundongo, por exemplo, devido ao fato de que as sequências de base dos dois têm disparidades.
[00796] Um oligonucleotídeo DMD correspondente pode ser construído com a sequência de base de camundongo correspondente (GCAAAGAAGAUGGCAUUUCU) e o mesmo padrão de química, ligações internucleotídicas, estereoquímica e porções químicas adicionais (se houver). Tal oligonucleotídeo pode ser testado vivo em camundongo. Vários oligonucleotídeos DMD que compreendem a sequência de base de camundongo foram construídos e testados.
[00797] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo salto de éxon DMD humana pode ser testado em um camundongo que foi modificados para compreender um gene DMD que compreende a sequência humana.
[00798] Vários oligonucleotídeos DMD que compreendem vários padrões de modificações são descritos no presente documento. As Tabelas abaixo mostram os resultados de teste de determinados oligonucleotídeos DMD. Para analisar o salto de éxon de DMD, oligonucleotídeos DMD foram testados in vitro em ∆52 células de mioblasto derivadas de paciente humano e/ou ∆45-52 células de mioblasto derivadas de paciente humano (células humanas em que o éxon 52 ou éxons 45-52 foram realmente deletada). A menos que observado de outro modo, em vários experimentos, os oligonucleotídeos foram entregues gimnoticamente. Tabela 4A. Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos.
Os oligonucleotídeos DMD foram testados in vitro a 10 uM e 3 uM, em triplicatas. Os números representam a eficiência de salto, em que 100,0 pode representar 100% de salto e 0,0 representa 0% de eficiência; os resultados dos experimentos de réplica são mostrados. As descrições totais dos oligonucleotídeos testados nessa Tabela (e outras Tabelas) são fornecidas na Tabela A1. 10 uM 3 uM WV-942 1,0 2,2 1,5 0,2 0,5 0,2 WV-1709 8,5 12,9 7,7 3,3 5,8 3,7 WV-1710 4,1 6,1 4,7 1,1 2,5 1,3 WV-1711 4,4 5,8 3,7 1,1 2,4 1,4 WV-1712 2,6 4,4 3,1 0,9 2,0 1,7 WV-1713 2,1 3,5 2,3 0,6 1,6 0,3 WV-1714 7,8 10,5 10,2 2,3 4,1 2,3 WV-1715 2,2 3,8 3,3 0,8 1,8 1,1 WV-1716 2,1 3,5 2,4 0,9 1,8 0,9
[00799] Na Tabela 4B, abaixo, dados adicionais dos oligonucleotídeos DMD para salto do éxon 51 foram apresentados. Tabela 4B. Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos. Os oligonucleotídeos DMD foram testados a 10uM e 3uM, em triplicatas. Os números representam a eficiência de salto, em que 100,0 pode representar 100% de salto e 0,0 representa 0% de eficiência; os resultados dos experimentos de réplica são mostrados. 10 uM 3 uM WV-942 1,0 2,2 1,5 0,2 0,5 0,2
WV-1714 7,8 10,5 10,2 2,3 4,1 2,3 WV-2444 22,2 26,7 28,6 9,1 12,6 11,9 WV-2445 17,1 20,7 18,7 7,0 9,7 9,1 WV-2528 32,4 34,6 39,3 16,9 19,9 22,3 WV-2529 3,2 5,8 6,1 2,2 4,5 3,0 WV-2530 18,6 21,1 25,4 7,6 11,5 11,4
[00800] Na Tabela 4C, abaixo, dados adicionais dos oligonucleotídeos DMD para salto do éxon 51 foram apresentados. Tabela 4C. Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos. Os números representam a eficiência de salto, em que 100,0 pode representar 100% de salto e 0,0 representa 0% de eficiência; os resultados dos experimentos de réplica são mostrados. WV-942 WV-887 WV-1714 WV-2438 10 uM 1,1 0,7 5,1 3,9 3,6 3,7 9,3 9,3 3 uM 0,5 0,3 1,0 2,2 1,6 1,5 3,9 3,1 1 uM 0,2 0,2 0,6 0,7 0,6 0,3 1,4 1,1 WV-2439 WV-2444 WV-2445 Mock 10 uM 3,2 2,1 12,9 14,3 9,7 8,9 0,4 0,1 3 uM 0,8 0,7 4,7 4,1 3,3 3,5 0,1 0,1 1 uM 0,4 0,3 1,4 1,0 1,1 1,0 0,1
[00801] Na Tabela 4D, abaixo, dados adicionais dos oligonucleotídeos DMD para salto do éxon 51 foram apresentados. Tabela 4D. Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos. Os números representam a eficiência de salto, em que
100,0 pode representar 100% de salto e 0,0 representa 0% de eficiência; os resultados dos experimentos de réplica são mostrados. 10 uM WV-942 0,6 0,6 0,6 0,6 WV-2660 0,2 0,3 0,1 0,1 WV-2661 0,4 0,4 WV-2662 0,2 0,2 0,1 0,1 WV-2663 0,5 0,5 0,4 0,5 WV-2670 5,1 5,2 6,2 7,3
[00802] Na Tabela 5, abaixo, dados adicionais dos oligonucleotídeos DMD para salto do éxon 51 foram apresentados. Tabela 5 Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos. Os números representam a eficiência de salto, em que 100,0 pode representar 100% de salto e 0,0 representa 0% de eficiência; os resultados dos experimentos de réplica são mostrados. 10 uM 3 uM 1 uM Mock 0,0 0,1 0,0 WV-2531 21,7 8,7 3,2 WV-3152 26,1 15,3 5,7 WV-2745 24,0 10,7 4,8 WV-3463 6,6 3,0 0,8 WV-3464 16,1 6,2 2,4 WV-3465 16,4 6,0 1,8 WV-3466 13,0 5,7 2,0 WV-3467 12,6 5,8 2,6
WV-3469 14,2 6,0 1,5 WV-3470 24,9 11,9 6,4 WV-3471 4,9 1,6 1,0 WV-3472 20,1 12,4 7,2 WV-3473 24,9 11,4 7,6 WV-942 3,3 2,1 0,7 Tabela 6 Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos.
Os números representam a eficiência de salto, em que 100,0 pode representar 100% de salto e 0,0 representa 0% de eficiência; os resultados dos experimentos de réplica são mostrados.
Os números são aproximados.
Os oligonucleotídeos foram entregues gimnoticamente a ∆48-50 mioblastos derivados do paciente (4 dias pós-diferenciação). O oligonucleotídeo designado como"PMO" nessa tabela e outras tabelas relacionadas ao salto do éxon 51 DMD é WV-8806 CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG, que é totalmente PMO (Morfolino). 5 uM 1 uM WV-942 0,2 PMO 0,1 WV-6137 1 0,9 WV-7333 0,3 0,2 WV-7334 0,7 0,4 WV-7335 1,7 0,4 WV-7336 2,2 0,6 WV-7337 1,7 0,4 WV-7343 1,4 0,5 WV-7344 2,8 0,7
WV-7345 2,9 1 WV-7346 1,9 0,7 WV-7347 1,2 0,5 WV-7348 2,5 1 WV-7349 3 0,6 WV-7350 3,1 1 WV-7351 1,7 0,6 WV-7352 2,7 0,8 WV-7353 2,8 0,2 WV-7354 2,2 0,3 WV-7355 2,7 1,6 WV-7356 3,3 1,2 WV-7357 2,7 1,1 WV-7358 2,2 0,6 WV-7359 0,7 0,3 WV-7360 0,6 0,5 WV-7361 2,8 0,8 WV-7362 4,1 0,8 WV-7363 2 0,7
[00803] Na Tabela 7, abaixo, dados adicionais dos oligonucleotídeos DMD para salto do éxon 51 foram apresentados. Tabela 7 Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos. Os números representam a eficiência de salto, em que 100,0 pode representar 100% de salto e 0,0 representa 0% de eficiência; os resultados dos experimentos de réplica são mostrados. Os números são aproximados. Mock 0,1
WV-942 0,2 PMO 0,1 WV-7364 2 0,5 WV-7365 1,8 0,5 WV-7366 1,1 5,7 WV-7367 0,2 0,3 WV-7368 0,4 0,4 WV-7369 0,4 0,2 WV-7370 0,2 0,3 WV-7371 0,3 0,2 WV-7372 0,3 WV-7373 0,5 1,3 WV-7374 0,3 0,4 WV-7375 0,2 0,8 WV-7376 0,2 0,5 WV-7377 0,3 0,5 WV-7378 0,4 WV-7379 7,8 1 WV-7380 2,8 0,3 WV-7381 4,1 0,2 WV-7382 1,3 0,1 WV-7383 1,7 0,3 WV-7384 2,8 0,4 WV-7385 1,8 WV-7386 4 1,6 WV-7387 3 1,8 WV-7388 1,2 0,7 WV-7389 0,5 0,4 WV-7390 1 0,5
[00804] Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a metabólitos de qualquer oligonucleotídeo, por exemplo, oligonucleotídeo DMD, revelado no presente documento, ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, um metabólito de um oligonucleotídeo, por exemplo, um oligonucleotídeo DMD é o resultado de um oligonucleotídeo, por exemplo, um oligonucleotídeo DMD que é atuado por uma nuclease (por exemplo, uma exonuclease ou endonuclease ou outras enzimas, incluindo aquelas que podem processar quimicamente uma ou mais modificações de um oligonucleotídeo). Em algumas modalidades, um "metabólito" de um oligonucleotídeo, por exemplo, um oligonucleotídeo DMD não é o produto físico de tal oligonucleotídeo que é metabolizado ou fisicamente tratado com uma nuclease, mas, em vez disso um composto que corresponde quimicamente a um produto de um oligonucleotídeo que é metabolizado ou tratado com uma enzima, por exemplo, uma nuclease. Em algumas modalidades, o metabólito de um oligonucleotídeo, por exemplo, um oligonucleotídeo DMD, é quimicamente sintetizado, sem qualquer processo metabólico e, opcionalmente administrado a um indivíduo.
[00805] Em algumas modalidades, um metabólito é um truncamento de um oligonucleotídeo na extremidade 5' e/ou extremidade 3' por um ou dois nucleotídeos ou nucleosídeos. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece um oligonucleotídeo, por exemplo, oligonucleotídeo DMD que corresponde a um oligonucleotídeo, por exemplo, oligonucleotídeo DMD listado no presente documento, porém, é truncado na extremidade 5' por um ou dois nucleotídeos. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece um oligonucleotídeo, por exemplo, um oligonucleotídeo DMD que corresponde a um oligonucleotídeo, por exemplo, um oligonucleotídeo DMD listado no presente documento, porém, é truncado na extremidade 3' por um ou dois nucleotídeos. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece um oligonucleotídeo, por exemplo, um oligonucleotídeo DMD que corresponde a um oligonucleotídeo, por exemplo, um oligonucleotídeo DMD listado no presente documento, porém, é truncado na extremidade 3' e na extremidade 5' por um ou dois nucleotídeos. Entre outros fatores, tais oligonucleotídeos podem realizar várias funções biológicas, por exemplo, tais oligonucleotídeos DMD pode mediar o salto do éxon 23, 45, 51, 53, ou qualquer outro éxon DMD.
[00806] Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a um oligonucleotídeo DMD que tem a sequência de base de um oligonucleotídeo DMD listado no presente documento, exceto pelo fato de que a sequência de base é mais curta na extremidade 5' por uma ou duas bases. Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a um oligonucleotídeo DMD que tem a sequência de base de um oligonucleotídeo DMD listado no presente documento, exceto pelo fato de que a sequência de base é mais curta na extremidade 3' por uma ou duas bases. Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a um oligonucleotídeo DMD que tem a sequência de base de um oligonucleotídeo DMD revelado no presente documento, exceto pelo fato de que a sequência de base é mais curta na extremidade 3' e na extremidade 5' por uma ou duas bases. Tais oligonucleotídeos DMD, entre outros aspectos, podem mediar o salto do éxon 23, 45, 51, 53, ou qualquer outro éxon DMD.
[00807] Em algumas modalidades, um metabólito de um oligonucleotídeo DMD removeu do oligonucleotídeo uma porção química adicional (por exemplo, um lipídio ou outra porção química conjugada).
[00808] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo da presente revelação pode ser um metabólito de outro oligonucleotídeo. Por exemplo, vários oligonucleotídeos podem ser metabólito de WV-3473, por exemplo, WV-4231 (3' n-1, truncado na extremidade 3' por um nucleotídeo), WV-4232 (3' n-2), WV-4233 (5' n-1), etc. Os dados exemplificativos de tais oligonucleotídeos de "metabólito" foram apresentados na Tabela 9 abaixo (a 1, 3 e 10 uM, em réplicas). Geralmente, um oligonucleotídeo pode ser usado independentemente se o mesmo pode ser ou não um metabólito de outros oligonucleotídeo. Tabela 9 Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos. Os resultados de experimentos de réplica são mostrados. Os números representam a eficiência de salto, em que 100,0 pode representar 100% de salto e 0,0 representa 0% de eficiência; os resultados dos experimentos de réplica são mostrados. Nessa e em outras tabelas, PMO é um controle de oligonucleotídeo Morfolinol. Oligonucleotídeo 10 uM 3 uM 1 uM PMO 2,4 1,6 0,4 1,1 0,4 0,6 WV-3473 78,8 73,5 62,5 59,8 38,8 38,8 WV-4231 (3' n-1) 83,8 71,4 65,0 67,2 44,4 43,0 WV-4232 (3' n-2) 48,5 66,5 42,2 57,5 30,0 WV-4233 (5' n-1) 54,2 45,9 37,1 31,6 18,6 14,5
[00809] Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a oligonucleotídeos DMD que correspondem a qualquer oligonucleotídeo DMD do éxon 51 ou qualquer outro éxon listado no presente documento (por exemplo, na Tabela A1), porém são truncados em um, dois ou mais nucleotídeos na extremidade 5' e/ou extremidade 3'.
[00810] Em algumas modalidades, o comprimento de um oligonucleotídeo fornecido, por exemplo, um oligonucleotídeo DMD, é de 15 a 45 bases. Em algumas modalidades, o comprimento de um oligonucleotídeo fornecido, por exemplo, um oligonucleotídeo DMD, é de 20 a 45 bases. Em algumas modalidades, o comprimento de um oligonucleotídeo fornecido, por exemplo, um oligonucleotídeo DMD, é de 20 a 40 bases. Em algumas modalidades, o comprimento de um oligonucleotídeo fornecido, por exemplo, um oligonucleotídeo DMD, é de 35 bases. Em algumas modalidades, o comprimento de um oligonucleotídeo fornecido, por exemplo, um oligonucleotídeo DMD, é de 20 a 25 bases.
[00811] Em alguns experimentos, os comprimentos dos oligonucleotídeos DMD para saltar o do éxon 51 e 20 ou 25 bases. Tabelas 10A e 10B. Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos. A Tabela 10A mostra os dados de 20-mers para salto do éxon DMD 51; A Tabela 10B mostra dados de 25-mers para salto do éxon DMD 51. As sequências são fornecidas na Tabela A1. Os números representam a eficiência de salto, em que 100,0 pode representar 100% de salto e 0,0 representa 0% de eficiência; os resultados dos experimentos de réplica são mostrados. Tabela 10A. 20-mers Não WV-2313 WV-2314 WV-2315 WV-2316 tratados
0,1 0,1 1,0 1,4 1,7 1,6 2,0 2,0 4,6 2,5 WV-2317 WV-2318 WV-2319 WV-2320 WV-942 1,7 1,1 4,3 4,3 5,0 6,5 2,9 3,7 3,9 3,4 Tabela 10B. 25-mers WV-2223 WV-2224 WV-2225 WV-2226 15,7 14,8 6,6 7,3 13,4 16,1 7,7 7,7 WV-2227 WV-2228 WV-2229 WV-2230 9,8 9,7 15,7 15,6 8,5 8,9 12,9 13,4
[00812] Dados adicionais são fornecidos. Tabela 10C. Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos. Oligonucleotídeos foram testados in vitro a 10, 3 e 1 µM. Os resultados dos experimentos de réplica são mostrados. Os números representam a eficiência de salto, em que 100,0 pode representar 100% de salto e 0,0 representa 0% de eficiência; os resultados dos experimentos de réplica são mostrados. 10 uM 3 uM 1 uM WV-2531 21,7 25,1 8,7 10,6 3,2 4,6 WV-3152 26,1 21,7 15,3 10,7 5,7 4,1 WV-3472 20,1 16,3 12,4 8,5 7,2 3,8 WV-3473 24,9 38,4 11,4 11,2 7,6 6,5 WV-942 3,3 0,2 2,1 0,7 0,1 Tabela 10D. Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos. Oligonucleotídeos foram testados in vitro a 10, 3 e 1 µM. Os resultados dos experimentos de réplica são mostrados. Os números representam a eficiência de salto, em que 100,0 pode representar 100% de salto e 0,0 representa 0% de eficiência; os resultados dos experimentos de réplica são mostrados. 10 uM 3 uM 1 uM WV-1714 5,8 6,2 8,1 2,4 3,0 2,7 0,7 0,7 2,0 WV-3030 29,9 27,2 35,2 6,2 5,6 5,6 0,6 0,6 1,6 WV-3032 31,7 29,3 37,9 7,8 6,4 7,7 1,2 1,1 1,1 WV-2669 3,1 3,1 4,1 1,4 1,7 1,7 0,6 0,7 0,8 WV-3035 13,2 16,4 17,6 1,9 2,5 2,8 1,0 1,1 0,8 Tabela 10E.
Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos.
Oligonucleotídeos foram testados in vitro a 10, 3 e 1 µM.
Os resultados dos experimentos de réplica são mostrados.
Os números representam a eficiência de salto, em que 100,0 pode representar 100% de salto e 0,0 representa 0% de eficiência; os resultados dos experimentos de réplica são mostrados. 10 uM 3 uM 1 uM WV-2531 24,7 21,7 11,0 8,7 4,8 3,2 WV-3360 25,1 12,9 10,1 3,3 WV-3363 24,0 7,7 3,4 WV-3364 72,8 45,5 17,2 9,8 4,0 Tabela 10F.
Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos.
Oligonucleotídeos foram testados in vitro a 10, 3 e 1 µM.
Os números representam a eficiência de salto, em que 100,0 pode representar eficiência de 100% de salto e 0,0 representa 0% de eficiência; os resultados dos experimentos de réplica são mostrados.
10 uM 3 uM 1 uM Mock 0,0 0,1 0,0 WV-2531 21,7 8,7 3,2 WV-3360 25,1 10,1 3,3 WV-3363 24,0 7,7 3,4 WV-3364 45,5 9,8 4,0 Tabela 10G.
Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos.
Oligonucleotídeos foram testados in vitro a 10, 3 e 1 µM.
Os números representam a eficiência de salto, em que 100,0 pode representar eficiência de 100% de salto e 0,0 representa 0% de eficiência; os resultados dos experimentos de réplica são mostrados. 10 uM 3 uM 1 uM WV-1714 5,8 6,2 8,1 2,4 3,0 2,7 0,7 0,7 2,0 WV-3030 29,9 27,2 35,2 6,2 5,6 5,6 0,6 0,6 1,6 WV-3032 31,7 29,3 37,9 7,8 6,4 7,7 1,2 1,1 1,1 WV-2669 3,1 3,1 4,1 1,4 1,7 1,7 0,6 0,7 0,8 WV-3035 13,2 16,4 17,6 1,9 2,5 2,8 1,0 1,1 0,8 Tabela 10H.
Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos.
Oligonucleotídeos foram testados in vitro a 10 e 3 M.
Nessa tabela, em alguns casos, soro e/ou BSA foram adicionados para testar o efeito sobre o salto de éxon.
Os números representam a eficiência de salto, em que 100,0 pode representar 100% de salto e 0,0 representa 0% de eficiência; os resultados dos experimentos de réplica são mostrados. 10 uM, soro a 15% 10 uM, soro a 5% Mock 0,0 0,1 0,0 0,1
WV-942 1,0 1,0 0,2 0,2 0,7 0,5 0,4 0,4 WV-2578 3,2 2,2 2,4 2,3 2,2 0,9 WV-2579 3,1 2,9 2,5 2,5 WV-2580 2,5 2,9 2,4 3,1 6,8 6,4 2,8 3,2 WV-2581 3,3 3,6 3,9 3,7 4,4 5,8 5,8 5,4 10 uM soro a 5% 20 mg/ml 10 uM soro a 5% 4mg/ml
BSA BSA Mock 0,1 0,1 0,1 0,1 WV-942 0,7 0,6 1,4 1,3 0,2 0,3 0,6 0,5 WV-2578 0,9 0,5 0,5 0,6 0,6 0,6 0,5 0,7 WV-2579 0,1 0,1 0,5 0,3 0,1 0,1 0,5 0,4 WV-2580 0,4 0,3 0,2 0,2 0,2 0,1 WV-2581 0,2 0,2 0,4 0,4 0,2 0,2 0,1 0,1 3uM soro a 15% 3uM soro a 5% Mock 0,0 0,0 0,0 0,0 WV-942 0,1 0,0 0,3 0,3 0,1 0,1 0,2 0,2 WV-2578 0,5 0,3 0,3 0,4 0,3 0,5 0,6 0,2 WV-2579 0,6 0,5 1,8 1,5 0,5 0,4 0,3 0,3 WV-2580 1,0 1,0 0,5 0,6 1,2 1,0 0,5 0,7 WV-2581 0,0 0,0 0,6 0,6 0,4 0,5 0,8 0,7 3 uM soro a 5% 20mg/ml 3 uM soro a 5% 4mg/ml
BSA BSA Mock 0,0 0,0 0,0 0,0 WV-942 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,4 0,3 WV-2578 0,2 0,2 0,2 0,3 0,2 0,1 0,1 WV-2579 0,4 0,4 0,2 0,2 0,1 0,1 0,2 0,2
WV-2580 0,2 0,2 0,2 0,3 0,0 0,0 0,3 0,3 WV-2581 0,0 0,0 0,3 0,3 0,1 0,1 0,1 0,1
10 uM, soro a 15% 10uM soro a 5% Mock 0,0 0,1 0,0 0,1 WV-942 1,0 1,0 0,2 0,2 0,7 0,5 0,4 0,4 WV-2578 3,2 2,2 2,4 2,3 2,2 0,9 WV-2579 3,1 2,9 2,5 2,5 WV-2580 2,5 2,9 2,4 3,1 6,8 6,4 2,8 3,2 WV-2581 3,3 3,6 3,9 3,7 4,4 5,8 5,8 5,4
10 uM soro a 5% 20 mg/ml BSA 10 uM soro a 5% 4mg/ml BSA Mock 0,1 0,1 0,1 0,1 WV-942 0,7 0,6 1,4 1,3 0,2 0,3 0,6 0,5 WV- 2578 0,9 0,5 0,5 0,6 0,6 0,6 0,5 0,7 WV- 2579 0,1 0,1 0,5 0,3 0,1 0,1 0,5 0,4 WV- 2580 0,4 0,3 0,2 0,2 0,2 0,1 WV- 2581 0,2 0,2 0,4 0,4 0,2 0,2 0,1 0,1
3uM soro a 15% 3uM soro a 5% Mock 0,0 0,0 0,0 0,0 WV-942 0,1 0,0 0,3 0,3 0,1 0,1 0,2 0,2 WV-2578 0,5 0,3 0,3 0,4 0,3 0,5 0,6 0,2 WV-2579 0,6 0,5 1,8 1,5 0,5 0,4 0,3 0,3 WV-2580 1,0 1,0 0,5 0,6 1,2 1,0 0,5 0,7
WV-2581 0,0 0,0 0,6 0,6 0,4 0,5 0,8 0,7
3 uM soro a 5% 20mg/ml BSA 3 uM soro a 5% 4mg/ml BSA Mock 0,0 0,0 0,0 0,0 WV-942 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,4 0,3 WV-2578 0,2 0,2 0,2 0,3 0,2 0,1 0,1 WV-2579 0,4 0,4 0,2 0,2 0,1 0,1 0,2 0,2 WV-2580 0,2 0,2 0,2 0,3 0,0 0,0 0,3 0,3 WV-2581 0,0 0,0 0,3 0,3 0,1 0,1 0,1 0,1 Tabela 10I.
Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos.
Oligonucleotídeos foram testados in vitro a 10, 3 e 1 µM.
Os números representam a eficiência de salto, em que 100,0 pode representar eficiência de 100% de salto e 0,0 representa 0% de eficiência; os resultados dos experimentos de réplica são mostrados. 10 uM 3 uM 1 uM Mock 0,0 0,1 0,0 WV-2531 21,7 8,7 3,2 WV-3152 26,1 15,3 5,7 WV-2745 24,0 10,7 4,8 WV-3463 6,6 3,0 0,8 WV-3464 16,1 6,2 2,4 WV-3465 16,4 6,0 1,8 WV-3466 13,0 5,7 2,0 WV-3467 12,6 5,8 2,6 WV-3469 14,2 6,0 1,5 WV-3470 24,9 11,9 6,4
WV-3471 4,9 1,6 1,0 WV-3472 20,1 12,4 7,2 WV-3473 24,9 11,4 7,6 WV-942 3,3 2,1 0,7 Tabela 10J.
Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos.
Oligonucleotídeos foram testados in vitro a 10, 3 e 1 µM.
Os números representam a eficiência de salto, em que 100,0 pode representar eficiência de 100% de salto e 0,0 representa 0% de eficiência; os resultados dos experimentos de réplica são mostrados. 10 uM 3 uM 1 uM WV-2531 32,9 32,0 16,9 16,7 6,2 6,2 WV-3360 27,2 26,5 13,4 14,2 6,0 5,9 WV-3361 28,9 28,0 16,7 16,1 6,3 6,0 WV-3362 34,3 32,9 16,2 15,5 6,1 5,8 WV-3363 33,2 33,6 16,4 16,0 6,7 6,4 WV-3364 47,9 47,6 14,2 14,0 6,4 6,5 WV-3365 25,6 24,2 14,7 14,2 6,9 6,4 WV-3366 34,6 34,0 21,1 19,8 8,0 7,4 WV-942 0,6 0,6 0,3 0,3 0,1 0,1 Mock 0,0 0,0 0,1 0,1 0,1 0,0 Tabela 10K.
Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos.
Os oligonucleotídeos foram testados in vitro a 10 µM.
Nessa tabela, os números representam a eficiência de salto em relação a WV-942 (ave); os resultados dos experimentos de réplica são mostrados.
Atividade em relação a WV-942
WV-942 1,1 0,9 Mock 0,1 0,0 WV-2526 18,4 15,3 WV-2527 17,0 16,3 WV-2528 34,6 27,2 WV-2529 3,7 2,8 WV-2530 17,0 16,9 WV-2533 4,1 3,6 WV-2534 2,0 1,2 WV-2535 0,4 0,2 WV-2536 0,2 0,1 WV-2537 1,1 1,0 Tabela 10L.
Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos.
Os oligonucleotídeos foram testados in vitro a 10 e 3 µM.
Nessa tabela, os números representam a eficiência de salto em relação WV-942 (ave); os resultados dos experimentos de réplica são mostrados.
Atividade em relação a WV-942 a 10 uM WV-942 0,8 1,8 1,2 WV-1709 7,1 10,7 6,5 WV-1710 3,4 5,1 3,9 WV-1711 3,6 4,9 3,1 WV-1712 2,1 3,7 2,6 WV-1713 1,8 2,9 1,9 WV-1714 6,5 8,8 8,5 WV-1715 1,8 3,1 2,7 WV-1716 1,7 2,9 2,0
WV-2444 18,5 22,2 23,8 WV-2445 14,2 17,2 15,6 WV-2528 27,0 28,8 32,7 WV-2529 2,7 4,8 5,1 WV-2530 15,5 17,6 21,2 Atividade em relação a WV-942 a 3 uM WV-942 0,7 1,7 0,6 WV-1709 10,9 19,5 12,2 WV-1710 3,6 8,3 4,3 WV-1711 3,6 8,1 4,6 WV-1712 3,0 6,7 5,8 WV-1713 2,0 5,3 0,9 WV-1714 7,5 13,8 7,8 WV-1715 2,6 5,8 3,6 WV-1716 3,2 6,1 3,1 WV-2444 30,3 41,9 39,7 WV-2445 23,4 32,3 30,2 WV-2528 56,3 66,3 74,4 WV-2529 7,5 15,0 10,0 WV-2530 25,2 38,4 37,8
[00813] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo, por exemplo, um oligonucleotídeo DMD, pode ser testado in vivo quanto à capacidade de ignorar um éxon em um tecido em um animal vivo; em algumas modalidades, um tecido é gastrocnêmio, tríceps, quadríceps, diafragma e/ou coração. Em algumas modalidades, um animal vivo é um camundongo, rato, macaco, cão ou primata não humano. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo, por exemplo, um oligonucleotídeo DMD, tem capacidade para mediar o salto, por exemplo, do éxon 23, 45, 51, 53, ou qualquer outro éxon DMD. Vários oligonucleotídeos DMD foram mostrados para mediar o salto de éxon DMD 51 em um tecido em um primata não humano (NHP), em que o tecido era gastrocnêmio, tríceps, quadríceps, diafragma, ou coração.
[00814] Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a métodos para administrar oligonucleotídeos, por exemplo, oligonucleotídeos DMD, em que a linha do tempo de pré-diferenciação (de células de mioblasto para miotubos) e o tratamento com o oligonucleotídeo são adequadamente alterados. Em algumas modalidades, em um teste in vitro, um oligonucleotídeo, por exemplo, um oligonucleotídeo DMD para o éxon 51, foi testado com tratamento de 1 dia ou 4 dias. Tabela 11A. Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos. Os números representam a eficiência de salto, em que 100,0 pode representar 100% de salto e 0,0 representa 0% de eficiência. PMO é um Morfolino que tem a sequência de CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG. Oligonucleotídeo Grupo A Grupo B Grupo C PMO 1,3 0,6 3,3 WV-3473 29,3 23,1 81,6 Condições para os Grupos A a C na Tabela 11A. Grupo A Grupo B Grupo C Pré-diferenciação 1 dia 2 dia 0 dia Tratamento com ASO 1 dia 1 dia 4 dias lavagem 2 dias 2 dias - O Exemplo 19 descreve várias linhas do tempo para experimentos adequados para testar oligonucleotídeos, por exemplo, oligonucleotídeos DMD, por exemplo, em mioblastos derivados do paciente in vitro.
Tabela 11B.
Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos.
Os números representam a eficiência de salto, em que 100,0 pode representar 100% de salto e 0,0 representa 0% de eficiência.
PMO é um oligonucleotídeo de controle que é um Morfolino que corresponde a Eteplirsen.
WV-942 é um oligonucleotídeo que corresponde a Drisapersen.
Oligonucleotídeos foram entregues gimnoticamente.
Conc.
WV-942 PMO (uM) 0,3 0,2 0,0 0,1 0,1 0,5 0,4 0,1 0,0 1 0,6 0,1 0,2 0,1 0,1 0,1 0,1 0,3 3 0,1 0,1 0,1 0,2 0,2 0,5 0,3 0,7 0,2 10 0,5 0,3 0,1 0,8 0,7 1,3 0,8 1,6 0,4 30 0,0 1,0 0,5 2,0 3,4 5,5 2,3 0,9 1,7
Conc. (uM) WV-3473 WV-3545 0,3 5,1 4,7 1,9 8,7 1,4 3,9 6,4 3,0 4,2 0,9 1,1 2,9 1 15,6 8,5 13,8 5,7 6,2 12,9 13,9 11,7 2,8 5,6 5,2 12,0 3 24,4 25,1 7,7 14,7 18,5 27,3 22,6 21,3 16,9 16,9 23,5 10 36,8 38,1 17,3 31,9 33,8 46,9 49,0 51,7 42,9 34,1 31,0 42,1 30 67,7 49,0 47,6 51,6 69,4 91,2 88,9 89,9 83,7 79,8 84,7
Conc. (uM) WV-3546 0,3 6,0 0,7 1,1 0,7 1,6 7,1 1 8,2 12,2 14,2 4,7 5,4 11,1 3 31,5 15,9 29,6
10 62,1 59,1 74,0 49,9 43,6 65,1 30 98,9 98,8 97,4 97,4 95,6 98,1
Tabela 11C.
Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos.
Os números representam a eficiência de salto, em que 100,0 pode representar 100% de salto e 0,0 representa 0% de eficiência.
PMO é um oligonucleotídeo de controle que é um Morfolino que corresponde a Eteplirsen.
WV-942 é um oligonucleotídeo que corresponde a Drisapersen.
Oligonucleotídeos foram entregues gimnoticamente.
Conc. (uM) WV-942 PMO WV-3473 0,3 0,2 0,0 0,1 0,4 0,1 0,0 5,1 4,7 1,9 1 0,6 0,1 0,2 0,1 0,1 0,3 15,6 8,5 13,8 3 0,1 0,1 0,1 0,3 0,7 0,2 24,4 25,1 7,7 10 0,5 0,3 0,1 0,8 1,6 0,4 36,8 38,1 17,3 30 0,0 1,0 0,5 2,3 0,9 1,7 67,7 49,0
Conc. (uM) WV-3545 WV-3546 WV-3543 0,3 6,4 3,0 4,2 6,0 0,7 1,1 5,1 2,1 4,6 1 13,9 11,7 2,8 8,2 12,2 14,2 8,2 2,8 9,2 3 22,6 21,3 16,9 31,5 17,9 21,6 18,8 10 49,0 51,7 42,9 62,1 59,1 74,0 26,7 28,9 31,2 30 91,2 88,9 89,9 98,9 98,8 97,4 83,2 82,5 75,5
Conc. (uM) WV-3544 WV-3554 WV-4107 0,3 5,6 3,0 3,1 2,2 2,0 4,0 1,1 1,0 0,8 1 12,4 9,8 12,0 12,6 4,5 8,4 3,9 2,3 4,0 3 22,7 23,9 15,7 18,6 15,7 18,3 15,7 14,1 13,5
10 37,8 32,0 35,1 42,3 36,8 33,0 70,0 53,6 64,3 30 80,4 81,3 79,1 86,4 91,1 84,3 93,6 92,0 93,0
[00815] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo compreende um derivado de U. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo que tem capacidade para mediar o salto de um éxon de DMD compreende um derivado de U. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo que tem capacidade para mediar o salto de um éxon de DMD e compreende um derivado de U e pelo menos uma ligação internucleotídica quiralmente controlada. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo que tem capacidade para mediar o salto de um éxon de DMD e compreende um derivado de U e pelo menos uma ligação internucleotídica fosforotioato quiralmente controlada. Em algumas modalidades, um derivado de U é BrU ou Acet5U ( ).
[00816] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo compreende BrU. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo que tem capacidade para mediar o salto de um éxon de DMD compreende BrU. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo que tem capacidade para mediar o salto de um éxon de DMD e compreende BrU e pelo menos uma ligação internucleotídica quiralmente controlada. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo que tem capacidade para mediar o salto de um éxon de DMD e compreende BrU e pelo menos uma ligação internucleotídica fosforotioato quiralmente controlada.
[00817] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo compreende Acet5U. Em algumas modalidades, Acet5U é também designado como AcetU ou acetU. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo que tem capacidade para mediar o salto de um éxon de DMD compreende Acet5U. Em algumas modalidades, em um oligonucleotídeo, por exemplo, oligonucleotídeo DMD, qualquer U ou T pode ser opcionalmente substituído por Acet5U (por exemplo, em um primeiro flanco, um núcleo, um segundo flanco, ou qualquer local no oligonucleotídeo). Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo que tem capacidade para mediar o salto de um éxon de DMD compreende uma unidade de nucleosídeo Acet5mU, em que a base é Acet5U e o açúcar é o açúcar de RNA natural comum em que o 2'-OH é substituído por 2'-OMe. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo compreende uma unidade de nucleosídeo Acet5fU, em que a base é Acet5U e o açúcar é o açúcar de RNA natural comum em que o 2'-OH é substituído por 2'-F. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo que tem capacidade para mediar o salto de um éxon de DMD e compreende Acet5U e pelo menos uma ligação internucleotídica quiralmente controlada. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo que tem capacidade para mediar o salto de um éxon de DMD e compreende Acet5U e pelo menos uma ligação internucleotídica fosforotioato quiralmente controlada.
[00818] Conforme mostrado na Tabela 11D, Tabela 11E, e Tabela A1, determinados oligonucleotídeos, por exemplo, oligonucleotídeos DMD, foram projetados e construídos compreendendo BrU ou acet5U. Em alguns oligonucleotídeos, o nucleosídeo na extremidade 5' compreende BrU ou acet5U. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos compreendem uma unidade de nucleosídeo BrfU, em que a base é BrU e o açúcar é o açúcar de RNA natural comum em que o 2'-OH é substituído por 2'-F. Em alguns oligonucleotídeos, o oligonucleotídeo compreende uma unidade de nucleosídeo BrdU, em que a base é BrU e o açúcar é 2-desoxirribose (açúcar de DNA natural comum). Em algumas modalidades, qualquer U ou T pode ser substituído por BrU (por exemplo, em um primeiro flanco, um núcleo, um segundo flanco, ou qualquer local dentro de um oligonucleotídeo). Em algumas modalidades, em um oligonucleotídeo, por exemplo, um oligonucleotídeo DMD, qualquer número de U ou T pode ser substituído por BrU e/ou Acet5U.
[00819] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo compreende uma unidade de nucleosídeo acet5fU, em que a base é acet5U e o açúcar é o açúcar de RNA natural comum em que o 2'-OH é substituído por 2'-F.
[00820] A Tabela 11D mostra dados de vários oligonucleotídeos DMD que medeiam o salto do éxon 51, incluindo o oligonucleotídeo WV-7410, que compreende BrfU, e WV-7413, que compreende acet5fU. A porcentagem foi medida com o uso de RT-qPCR. A entrega gimnótica de oligonucleotídeos 10 µM e 3 µM em ∆48-50 mioblastos derivados do paciente (4 dias pós- diferenciação). O experimento foi realizado em réplicas técnicas. Tabela 11D. Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos. Os números representam a eficiência de salto, em que 100,0 pode representar 100% de salto e 0,0 representa 0% de eficiência. Números aproximados são fornecidos. WV-3152 WV-3516 WV-7410 WV-7413
10 µM 39 10 49 11 3 µM 20 6 34 6 Em algumas modalidades, a presente revelação fornece oligonucleotídeos, por exemplo, vários oligonucleotídeos DMD, que compreendem BrdU no ou próximo ao centro dos oligonucleotídeos (por exemplo, em uma região de núcleo, região intermediária, etc.). Em algumas modalidades, exemplos de tais oligonucleotídeos incluem WV-2812, WV-2813, e WV-2814. Determinados dados de salto de éxon desses oligonucleotídeos foram apresentados abaixo. Tabela 11E. Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos. Os números representam a eficiência de salto, em que
1.000 pode representar 100% de salto e 0,0 representa 0% de eficiência. Números aproximados são fornecidos. 10uM 3uM WV-1714 0,035 0,034 0,012 0,013 WV-2812 0,094 0,095 0,023 0,024 WV-942 0,004 0,004 0,001 0,001 WV-2814 0,004 0,005 0,002 0,002 WV-2813 0,041 0,042 0,017 0,017 Tabela 11F. Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos. Os oligonucleotídeos DMD adicionais para salto do Éxon 51 foram construídos. Vários oligonucleotídeos DMD compreendem BrU. Em alguns casos, um BrU é ligado a um açúcar que é modificado 2'-F (BrfU). Mioblastos D48-50 foram dosados a 10 uM e 3 uM em meio de diferenciação por 4 dias. A porcentagem de salto é mostrada, em que 100 pode representar 100% de salto e 0 pode representar 0% de salto.
10 uM 3 uM WV-9738 44,7 44,0 46,1 45,4 26,6 25,9 25,6 24,4 WV-9739 51,8 49,9 53,2 50,9 32,3 35,4 31,0 33,2 WV-9740 49,9 48,8 47,8 46,1 32,5 30,3 29,0 29,6 WV-9741 36,1 37,8 35,0 35,6 23,5 22,3 21,4 24,6 WV-9742 53,4 54,8 59,1 56,8 41,7 40,4 37,6 40,3 WV-7410 64,8 63,9 65,4 67,0 45,1 43,5 43,9 40,6 WV-7410 66,0 67,2 64,7 64,5 44,9 40,3 33,7 31,7 WV-3152 47,0 45,7 47,1 45,0 28,3 30,2 25,3 22,6 WV-3516 12,5 12,5 9,7 10,4 5,0 4,9 5,2 4,6 MOCK 0,5 0,3 0,5 0,3 0,5 0,6 0,8 0,4 MOCK 0,6 0,4 0,5 0,5 0,6 0,6 0,3 0,4 MOCK 0,3 0,3 0,6 0,2 0,4 0,4 0,2 0,6 Tabela 11G.
Atividade de determinados oligonucleotídeos Atividade de vários oligonucleotídeos DMD do éxon 51 foi testada in vitro.
Os números indicam a quantidade de salto do éxon 23 DMD (como uma porcentagem de mRNA total, em que 100 pode representar 100% ignorado). As quantidades testadas foram: 10, 3,3 e 1,1 uM. 10 3,3 1,1 10 3,3 1,1 20,8 9 4,1 36,9 10,4 4,7 22 10 4,9 27,4 10,4 4,2 WV-3152 WV-14522 17,3 9,3 3,2 21 12,6 5,6 21,3 7,2 4,4 26,5 10,4 5,7 27,4 13,2 12,7 27,2 8,1 6,2 WV-15860 30,4 15,4 9 WV-14523 28,3 8,5 4,9 33 14,2 6 18,4 9,1 3,6
33,4 16,9 5,9 18,7 9,6 4,4 26,6 9,2 5,6 0,21 28,5 6,1 5,4 0,35 WV-15861 Mock 34,1 8,2 5,2 0,48 29,9 11,1 4 0,24 30,7 7,8 33,3 7,2 WV-15862 21,9 15,1 6,8 26,4 13,2 7,2 Tabela 11H.
Atividade de determinados oligonucleotídeos Os oligonucleotídeos para salto do éxon 51 DMD foram testados in vitro.
Os números indicam a quantidade de salto do éxon 23 DMD (como uma porcentagem de mRNA total, em que 100 pode representar 100% ignorado). Concentrações de oligonucleotídeos usados: 10, 3,3 e 1,1 uM. 10 uM 3,3 uM 1,1 uM 10 uM 3,3 uM 1,1 uM Mock 0,2 0,3 0,2 WV- 37,6 22,6 9 0,3 0,2 0,3 17861 38,8 22,5 8,9 0,2 0 0,2 40,7 24,4 13,2 0,2 0,6 0,2 41,7 25,4 11,6 WV-7336 3,1 1,6 0,7 WV- 38,4 18,9 8,1 8,9 1,8 0,1 17862 34,1 19,6 9 5,4 1,4 0,9 34,8 26 10 4,9 1,5 0,7 36,1 21,4 9,5 WV-3152 32,4 26,5 7,5 WV- 32,7 18,2 9,2 27,2 22,2 8,4 17863 35,1 18,9 9,3
28 14,5 7,6 34,8 18,2 8,6 26,8 14,8 7,3 30,7 17 9 WV- 43,3 25,7 10,2 WV- 37,3 23,6 11,7 15860 37,9 23,8 9,6 17864 41,4 23,3 10,6 38,4 24,5 11,2 39,9 20,6 17,5 42,4 21,9 11 38,8 21,7 10,2 WV- 42,3 26,7 16,3 WV- 35,9 16,5 9,3 17859 41,3 26 16,8 17865 34 16,7 7,5 39,9 22,9 15,5 34,4 17,5 11,9 48,6 23,6 14,9 34,1 17,8 9,8 WV- 38,1 19,3 11,7 WV- 48,7 28,4 17,7 17860 35,3 19,2 12 17866 43,3 28,6 13,1 41 28,2 16,4 44,5 24,8 15,4 40,4 21,9 11,1 45,1 30,5 16,3 Tabela 11I.
Atividade de determinados oligonucleotídeos Os oligonucleotídeos para salto do éxon 51 DMD foram testados in vitro.
Os números indicam a quantidade de salto do éxon 23 DMD (como uma porcentagem de mRNA total, em que 100 pode representar 100% ignorado). Concentrações de oligonucleotídeos usados: 10 e 3,3 uM. 10 uM 3,3 uM 10 uM 3,3 uM 0 0 14,6 4,8 0 0 0 0 12 3,7 Mock 0 0 WV-20058 12,6 3,5 WV-20034 15,9 7 WV-20061 35,8 26,5
17,1 8,4 16,1 7,3 39,3 24,2 15,3 7,2 39,9 22,8 29,7 18,3 26,5 17,6 27,2 17,5 26,6 19,4 24,5 16,4 WV-20037 29,2 18,4 WV-20064 27,5 17,1 9,6 4,9 15,7 8,3 9,1 5,2 16,8 9,3 11,4 3,5 17,3 8,6 WV-20040 10,9 2,9 WV-20067 16,3 8,7 20,2 9,6 41,3 26,4 20,4 9,8 31,7 22,3 18,9 9,8 39,7 27,2 WV-20043 21 10,4 WV-20070 38,4 26,9 28,5 14,7 30,9 21,1 29,8 14,2 26,9 17,9 29,2 15,8 31,1 20,2 WV-20046 26,6 14,5 WV-20073 30,7 22,2 20,9 11,6 23,2 16,8 18,9 11,4 18,6 12,2 21,8 16,9 WV-20049 18,4 11,7 WV-20076 22,8 15,8 28,8 18,8 35,7 24,8
30,1 18,6 33,5 24,9 WV-20052 29,6 20,1 WV-3152 32,1 25,3 26,8 17 41,9 27,5 WV-20055 WV-15860
25,3 16,6 43,6 30,7 24,1 17 42,4 30 Tabela 11J.
Atividade de determinados oligonucleotídeos Os oligonucleotídeos para salto do éxon 51 DMD foram testados in vitro.
Os oligonucleotídeos foram dosados 4d a 10uM.
Os números indicam a quantidade de salto do éxon 51 DMD (como uma porcentagem de mRNA total, em que 100 pode representar 100% ignorado). WV-3152 19 20 12 14 WV-20093 35 34 35 38 WV-15860 29 31 26 23 WV-20092 25 26 25 25 WV-20140 1 1 1 1 WV-20091 28 27 30 32 WV-20139 3 3 2 2 WV-20090 21 19 22 22 WV-20138 2 3 WV-20089 8 7 8 9 WV-20137 4 5 WV-20088 22 21 26 25 WV-20136 WV-20087 28 28 33 32 WV-20135 5 5 5 5 WV-20086 25 25 27 26 WV-20134 5 6 5 4 WV-20085 33 31 30 31 WV-20133 17 17 13 13 WV-20084 21 22 21 21 WV-20132 8 8 6 6 WV-20083 21 21 19 17 WV-20131 14 16 12 12 WV-20082 42 37 32 30 WV-20130 10 9 8 8 WV-20081 41 41 30 30 WV-20129 12 14 11 11 WV-20080 49 44 26 25 WV-20128 9 9 8 8 WV-20079 42 38 53 51 WV-20127 8 8 WV-20078 27 28 36 35 WV-20126 7 8 8 7 WV-20077 10 10 10 10 WV-20125 8 8 8 8 WV-20076 45 45 45 41 WV-20124 22 21 21 21 WV-20075 40 31 37 42
WV-20123 13 13 14 12 WV-20074 55 57 53 56 WV-20122 11 12 12 11 WV-20073 51 55 51 50 WV-20121 21 22 22 21 WV-20072 41 36 37 36 WV-20120 28 30 32 33 WV-20071 42 40 44 46 WV-20119 52 50 WV-20070 18 18 25 25 WV-20118 39 37 27 26 WV-20069 11 11 10 9 WV-20117 18 17 15 18 WV-20068 20 17 20 18 WV-20116 20 20 17 17 WV-20067 12 9 11 11 WV-20115 8 8 8 6 WV-20066 12 11 13 12 WV-20114 19 20 15 14 WV-20065 16 15 16 14 WV-20113 20 18 17 15 WV-20064 37 35 37 36 WV-20112 16 15 12 12 WV-20063 19 24 22 WV-20111 31 30 33 31 WV-20062 6 6 7 7 WV-20110 14 14 14 12 WV-20061 24 23 26 24 WV-20109 20 21 25 24 WV-20060 16 17 16 17 WV-20108 27 25 22 22 WV-20059 55 42 62 67 WV-20107 20 19 16 14 WV-20058 28 30 33 33 WV-20106 44 42 34 37 WV-20057 37 38 37 34 WV-20105 23 22 18 18 WV-20056 35 34 33 35 WV-20104 41 40 33 28 WV-20055 40 40 WV-20103 48 52 53 53 WV-20054 25 25 35 36 WV-20102 54 52 55 59 WV-20053 43 45 46 46 WV-20101 38 39 38 43 WV-20052 47 47 53 46 WV-20100 52 51 48 50 WV-20051 30 33 30 30 WV-20099 53 51 47 48 WV-20050 29 28 28 26 WV-20098 46 44 45 46 WV-20049 41 41 38 38 WV-20097 47 46 51 48 WV-20049 24 23 22 21 WV-20096 45 41 42 43 WV-20095 43 41 50 47
WV-20094 55 50 57 55 Oligonucleotídeos e Composições de Distrofina Exemplificativos Que Têm Como Alvo o Éxon 52
[00821] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece oligonucleotídeos, composições de oligonucleotídeo, e métodos de uso dos mesmos para alvejar o éxon 52 e/ou mediar o salto do éxon 52 em DMD humana. Os exemplos não limitantes incluem oligonucleotídeos e composições de oligos do Éxon 52 que incluem: WV-13733, WV- 13734, WV-13735, WV-13736, WV-13737, WV-13738, WV-13739, WV- 13740, WV-13741, WV-13742, WV-13743, e WV-13744, WV-13782, e WV-13783, e outros oligonucleotídeos que têm uma sequência de base que compreende pelo menos 15 bases contíguas de qualquer um desses oligonucleotídeos DMD. Tabela 12A. Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos. Eficiência de salto de vários oligonucleotídeos DMD, testados para salto do éxon DMD 52. WV-13733 0,3 0,2 WV-13734 0,0 0,0 WV-13735 1,6 0,3 WV-13736 3,9 1,3 WV-13737 0,7 0,4 WV-13738 0,0 0,0 WV-13739 28,3 29,3 WV-13740 29,9 33,3 WV-13741 1,6 1,6 WV-13742 12,9 14,1
WV-13743 0,9 1,0 WV-13744 0,6 0,7 WV-13782 0,1 0,1 WV-13783 0,8 0,0 Mock 0,0 0,0 Mock 0,1 0,1 Oligonucleotídeos e Composições de Distrofina Exemplificativos para Salto de Éxon do Éxon 53
[00822] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece oligonucleotídeos, composições de oligonucleotídeo, e métodos de uso dos mesmos para mediar o salto do éxon 53 na DMD (por exemplo, de camundongo, ser humano, etc.).
[00823] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo, por exemplo, um oligonucleotídeo de salto de éxon 53 de DMD humana pode ser testado em um camundongo que foi modificado para compreender um gene DMD que compreende a sequência do éxon 53 humano.
[00824] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo, por exemplo, um oligonucleotídeo DMD, tem capacidade para mediar o salto do éxon 53. Os exemplos não limitantes de tais oligonucleotídeos incluem: WV-10439, WV- 10440, WV-10441, WV-10442, WV-10443, WV-10444, WV-10445, WV- 10446, WV-10447, WV-10448, WV-10449, WV-10450, WV-10451, WV- 10452, WV-10453, WV-10454, WV-10455, WV-10456, WV-10457, WV- 10458, WV-10459, WV-10460, WV-10461, WV-10462, WV-10463, WV- 10464, WV-10465, WV-10466, WV-10467, WV-10468, WV-10469, WV- 10470, WV-10487, WV-10488, WV-10489, WV-10490, WV-10491, WV- 10492, WV-10493, WV-10494, WV-10495, WV-10496, WV-10497, WV- 10498, WV-10499, WV-10500, WV-10501, WV-10502, WV-10503, WV-
10504, WV-10505, WV-10506, WV-10507, WV-10508, WV-10509, WV- 10510, WV-10511, WV-10512, WV-10513, WV-10514, WV-10515, WV- 10516, WV-10517, WV-10518, WV-10519, WV-10520, WV-10521, WV- 10522, WV-10523, WV-10524, WV-10525, WV-10526, WV-10527, WV- 10528, WV-10529, WV-10530, WV-10531, WV-10532, WV-10533, WV- 10534, WV-10535, WV-10536, WV-10537, WV-10538, WV-10539, WV- 10540, WV-10541, WV-10542, WV-10543, WV-10544, WV-10545, WV- 10546, WV-10547, WV-10548, WV-10549, WV-10550, WV-10551, WV- 10552, WV-10553, WV-10554, WV-10555, WV-10556, WV-10557, WV- 10558, WV-10559, WV-10560, WV-10561, WV-10562, WV-10563, WV- 10564, WV-10565, WV-10566, WV-10567, WV-10568, WV-10569, WV- 10570, WV-10571, WV-10572, WV-10573, WV-10574, WV-10575, WV- 10576, WV-10577, WV-10578, WV-10579, WV-10580, WV-10581, WV- 10582, WV-10583, WV-10584, WV-10585, WV-10586, WV-10587, WV- 10588, WV-10589, WV-10590, WV-10591, WV-10592, WV-10593, WV- 10594, WV-10595, WV-10596, WV-10597, WV-10598, WV-10599, WV- 10600, WV-10601, WV-10602, WV-10603, WV-10604, WV-10605, WV- 10606, WV-10607, WV-10608, WV-10609, WV-10610, WV-10611, WV- 10612, WV-10613, WV-10614, WV-10615, WV-10616, WV-10617, WV- 10618, WV-10619, WV-10620, WV-10621, WV-10622, WV-10623, WV- 10624, WV-10625, WV-10626, WV-10627, WV-10628, WV-10629, WV- 10630, WV-10670, WV-10671, WV-10672, WV-11340, WV-11341, WV- 11342, WV-11544, WV-11545, WV-11546, WV-11547, WV-13835, WV- 13864, WV-14344, WV-4698, WV-4699, WV-4700, WV-4701, WV-4702, WV-4703, WV-4704, WV-4705, WV-4706, WV-4707, WV-4708, WV-4709, WV-4710, WV-4711, WV-4712, WV-4713, WV-4714, WV-4715, WV-4716, WV-4717, WV-4718, WV-4719, WV-4720, WV-4721, WV-4722, WV-4723, WV-4724, WV-4725, WV-4726, WV-4727, WV-4728, WV-4729, WV-4730, WV-4731, WV-4732, WV-4733, WV-4734, WV-4735, WV-4736, WV-4737, WV-4738, WV-4739, WV-4740, WV-4741, WV-4742, WV-4743, WV-4744,
WV-4745, WV-4746, WV-4747, WV-4748, WV-4749, WV-4750, WV-4751, WV-4752, WV-4753, WV-4754, WV-4755, WV-4756, WV-4757, WV-4758, WV-4759, WV-4760, WV-4761, WV-4762, WV-4763, WV-4764, WV-4765, WV-4766, WV-4767, WV-4768, WV-4769, WV-4770, WV-4771, WV-4772, WV-4773, WV-4774, WV-4775, WV-4776, WV-4777, WV-4778, WV-4779, WV-4780, WV-4781, WV-4782, WV-4783, WV-4784, WV-4785, WV-4786, WV-4787, WV-4788, WV-4789, WV-4790, WV-4791, WV-4792, WV-4793, WV-9067, WV-9068, WV-9069, WV-9070, WV-9071, WV-9072, WV-9073, WV-9074, WV-9075, WV-9076, WV-9077, WV-9078, WV-9079, WV-9080, WV-9081, WV-9082, WV-9083, WV-9084, WV-9085, WV-9086, WV-9087, WV-9088, WV-9089, WV-9090, WV-9091, WV-9092, WV-9093, WV-9094, WV-9095, WV-9096, WV-9097, WV-9098, WV-9099, WV-9100, WV-9101, WV-9102, WV-9103, WV-9104, WV-9105, WV-9106, WV-9107, WV-9108, WV-9109, WV-9110, WV-9111, WV-9112, WV-9113, WV-9114, WV-9115, WV-9116, WV-9117, WV-9118, WV-9119, WV-9120, WV-9121, WV-9122, WV-9123, WV-9124, WV-9125, WV-9126, WV-9127, WV-9128, WV-9129, WV-9130, WV-9131, WV-9132, WV-9133, WV-9134, WV-9135, WV-9136, WV-9137, WV-9138, WV-9139, WV-9140, WV-9141, WV-9142, WV-9143, WV-9144, WV-9145, WV-9146, WV-9147, WV-9148, WV-9149, WV-9150, WV-9151, WV-9152, WV-9153, WV-9154, WV-9155, WV-9156, WV-9157, WV-9158, WV-9159, WV-9160, WV-9161, WV-9162, WV-9422, WV-9423, WV-9424, WV-9425, WV-9426, WV-9427, WV-9428, WV-9429, WV-9511, WV-9512, WV-9513, WV-9514, WV-9515, WV-9516, WV-9517, WV-9518, WV-9519, WV-9520, WV-9521, WV-9522, WV-9523, WV-9524, WV-9525, WV-9534, WV-9535, WV-9536, WV-9537, WV-9538, WV-9539, WV-9680, WV-9681, WV-9682, WV-9683, WV-9684, WV-9685, WV-9686, WV-9687, WV-9688, WV-9689, WV-9690, WV-9691, WV-9699, WV-9700, WV-9701, WV-9702, WV-9703, WV-9704, WV-9709, WV-9710, WV-9711, WV-9712, WV-9713, WV-9714, WV-9715, WV-9743, WV-9744, WV-9745, WV-9746, WV-9747, WV-9748, WV-9749, WV-9750, WV-9751, WV-9752, WV-9753,
WV-9754, WV-9755, WV-9756, WV-9757, WV-9758, WV-9759, WV-9760, WV-9761, WV-9897, WV-9898, WV-9899, WV-9900, WV-9901, WV-9902, WV-9903, WV-9904, WV-9905, WV-9906, WV-9907, WV-9908, WV-9909, WV-9910, WV-9911, WV-9912, WV-9913, WV-9914, WV-7436, WV-7437, WV-7438, WV-7439, WV-7440, WV-7441, WV-7442, WV-7443, WV-7444, WV-7445, WV-7446, WV-7447, WV-7448, WV-7449, WV-7450, WV-7451, WV-7452, WV-7453, WV-7454, WV-7455, e WV-7456, e outros oligonucleotídeos DMD que têm uma sequência de base que compreende pelo menos 15 bases contíguas de qualquer um desses oligonucleotídeos DMD.
[00825] Exemplos adicionais de tais oligonucleotídeos DMD incluem: WV-9422, WV-9425, WV-9426, WV- 9517, WV-9519, WV-9521, WV-9522, WV-9524, WV-9710, WV-9714, WV-9715, WV-9743, WV-9744, WV-9745, WV-9746, WV-9747, WV-9748, WV-9749, WV-9750, WV-9751, WV-9756, WV-9757, WV-9758, WV-9759, WV-9760, WV-9761, WV-9897, WV-9898, WV-9899, WV-9900, WV-9906, e WV-9912, e outros oligonucleotídeos DMD que têm uma sequência de base que compreende pelo menos 15 bases contíguas de qualquer um desses oligonucleotídeos DMD.
[00826] Os exemplos não limitantes de tais oligonucleotídeos DMD também incluem: WV-12123, WV-12124, WV- 12125, WV-12126, WV-12127, WV-12128, WV-12129, WV-12553, WV- 12554, WV-12555, WV-12556, WV-12557, WV-12558, WV-12559, WV- 12872, WV-12873, WV-12876, WV-12877, WV-12878, WV-12879, WV- 12880, WV-12881, WV-12882, e WV-12883, e outros oligonucleotídeos DMD que têm uma sequência de base que compreende pelo menos 15 bases contíguas de qualquer um desses oligonucleotídeos DMD.
[00827] Os resultados de vários experimentos para salto do éxon 53 de Distrofina são descritos na presente revelação.
Por exemplo, os dados de uma tela de identificação de sequência são mostrados abaixo, na Tabela 13A.
Tabela 13A.
Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos.
A eficiência de salto de vários oligonucleotídeos DMD, testados para salto de éxon 53 de DMD in vitro em células de mioblasto humano Delta 52. Os oligonucleotídeos testados foram gapmers 6-8-6 (2'-F-2'-OMe-2'-F), em que cada ligação internucleotídica é um fosforotioato estereoaleatório.
Os números representam a eficiência de salto, em que 100,0 pode representar 100% de salto e 0,0 representa 0% de eficiência; os resultados dos experimentos de réplica são mostrados.
Oligonucleot Réplica Réplica Oligonucleot Répli Répli ídeo 1 2 ídeo ca 1 ca 2 WV-4698 1,9 2,1 WV-4747 2,5 3,5 WV-4699 2,0 2,2 WV-4748 2,1 1,7 WV-4700 2,8 3,0 WV-4749 2,4 2,4 WV-4701 3,7 2,9 WV-4750 2,3 2,9 WV-4702 2,9 2,7 WV-4751 1,9 2,5 WV-4703 1,8 2,4 WV-4752 2,2 1,6 WV-4704 3,2 3,4 WV-4753 1,6 2,0 WV-4705 3,7 4,3 WV-4754 1,7 2,0 WV-4706 2,6 2,6 WV-4755 1,7 1,9 WV-4707 3,2 3,6 WV-4756 1,7 1,5 WV-4708 4,8 6,0 WV-4757 1,6 1,9 WV-4709 6,6 5,2 WV-4758 1,6 2,0 WV-4710 3,9 4,6 WV-4759 1,6 1,6 WV-4711 5,4 6,7 WV-4760 1,8 1,8 WV-4712 5,3 6,4 WV-4761 1,9 1,6
WV-4713 5,8 8,0 WV-4762 1,2 1,3 WV-4714 2,9 3,6 WV-4763 0,9 2,0 WV-4715 3,3 4,3 WV-4764 3,0 2,7 WV-4716 3,8 4,3 WV-4765 3,4 3,2 WV-4717 6,8 7,0 WV-4766 2,5 2,3 WV-4718 4,3 5,0 WV-4767 2,5 2,7 WV-4719 5,5 6,0 WV-4768 2,3 2,7 WV-4720 7,7 8,6 WV-4769 2,4 2,4 WV-4721 2,7 3,8 WV-4770 2,8 2,8 WV-4722 3,8 4,6 WV-4771 2,3 2,9 WV-4723 3,4 5,6 WV-4772 4,0 2,5 WV-4724 3,5 4,7 WV-4773 3,2 1,8 WV-4725 4,9 6,3 WV-4774 3,0 2,3 WV-4726 4,2 4,4 WV-4775 4,4 3,3 WV-4727 2,7 4,9 WV-4776 3,1 3,8 WV-4728 2,6 5,6 WV-4777 4,5 2,1 WV-4729 3,9 4,1 WV-4778 0,0 2,0 WV-4730 2,4 3,3 WV-4779 2,8 3,4 WV-4731 1,8 2,5 WV-4780 3,2 3,5 WV-4732 1,8 2,3 WV-4781 2,9 3,2 WV-4733 2,3 2,1 WV-4782 1,8 2,9 WV-4734 2,0 2,0 WV-4783 2,1 2,6 WV-4735 2,5 2,7 WV-4784 2,4 2,4 WV-4736 2,7 3,0 WV-4785 3,4 3,6 WV-4737 3,2 3,1 WV-4786 1,8 1,6 WV-4738 3,1 3,5 WV-4787 2,9 2,7 WV-4739 2,6 2,4 WV-4788 2,8 3,1 WV-4740 4,4 3,6 WV-4789 4,3 4,0 WV-4741 3,7 4,1 WV-4790 3,9 2,6
WV-4742 4,5 4,9 WV-4791 2,2 2,2 WV-4743 5,0 5,2 WV-4792 2,5 3,2 WV-4744 3,6 4,7 WV-4793 2,4 2,6 WV-4745 4,1 0,0 Mock 1,3 1,6 WV-4746 2,9 2,0
[00828] Vários oligonucleotídeos foram gerados e testados quanto à eficácia no salto do Éxon 53 DMD in vitro em células de mioblasto derivadas de paciente humano; determinados resultados são mostradas abaixo nas Tabelas 13B a 21 (A e B). Os oligonucleotídeos foram usados a concentrações de 3 e 10 uM, em duas réplicas (R1 e R2). Os números indicam a porcentagem de salto de éxon 53 DMD, em que 0,0 pode indicar nenhum salto, e 100,0 pode indicar 100% de salto. Várias sequências de base foram testadas em combinação com uma variedade de formatos químicos. Por exemplo, em algumas modalidades, uma sequência de base é GUACUUCAUCCCACUGAUUC, GUGUUCTTGTACTTCAUCCC, UUCUGAAGGTGTTCUUGUAC, ou CUCCGGTTCTGAAGGUGUUC, em que U é opcionalmente substituído por T e vice-versa. Vários formatos químicos foram utilizados, incluindo, por exemplo, gapmers (por exemplo, gapmers de flanco-núcleo-flanco 6-8-6). Em algumas modalidades, ambos os flancos são 2'-F, enquanto o núcleo era todo 2'-MOE, 2'-MOE/2- OMe alternados, 2'-OMe/2'-MOE, alternados 2'-MOE/2'-F, alternados 2'-F/2'-MOE, alternados 2'-OMe/2'-F, e alternados 2'-F/2'-OMe, etc. Em algumas modalidades, o primeiro flanco era 2'-MOE ou 2'-OMe e o segundo flanco era 2'-F (um tipo de gapmers assimétricos). Em algumas modalidades, cada ligação internucleotídica é um fosforotioato estereoaleatório. Em algumas modalidades, algumas ligações fosforotioato alternadas são substituídas por ligações fosfodiésteres. Em algumas modalidades, 5'-metil 2'-MOE C é usado.
Descrições de determinados oligonucleotídeos testados são fornecidas na Tabela A1. Tabela 13B.
Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos.
Eficácia de salto de Éxon 53 DMD de vários oligonucleotídeos DMD in vitro.
Os números representam a eficiência de salto, em que 100,0 pode representar 100% de salto e 0,0 representa 0% de eficiência.
Os resultados de experimentos de réplica são mostrados.
Oligonucleotídeo Réplica 1 Réplica 2 10 uM 3 uM 10 uM 3 uM WV-9067 6,6 1,9 1,8 WV-9068 6,5 1,5 1,6 WV-9069 6,9 1,8 1,7 1,5 WV-9070 2,9 3,2 2,6 1,9 WV-9071 2,9 1,9 2,0 1,4 WV-9072 9,6 2,4 2,4 1,5 WV-9073 8,6 3,3 2,7 2,1 WV-9074 8,3 2,4 2,5 1,9 WV-9075 7,0 2,1 2,1 2,0 WV-9076 9,6 3,0 3,1 2,0 WV-9077 6,3 1,7 2,0 1,5 WV-9078 6,1 2,3 2,2 1,9 WV-9079 10,0 3,9 3,6 2,3 WV-9080 7,6 3,1 2,8 2,6 WV-9081 5,7 2,2 1,9 1,6 WV-9082 11,2 6,1 6,4 3,2 WV-9083 6,0 1,9 2,1 1,6
WV-9084 6,6 2,4 2,9 2,1 WV-9085 0,0 7,5 7,6 3,4 WV-9086 7,5 3,4 3,1 2,0 WV-9087 7,1 2,4 2,1 1,7 WV-9088 9,0 3,0 2,6 1,6 WV-9089 8,2 2,5 2,3 1,9 WV-9090 0,0 2,3 2,2 1,6 WV-9091 9,9 4,7 3,7 3,2 WV-9092 9,0 3,4 3,4 2,0 WV-9093 8,7 2,9 3,2 2,0 WV-9094 11,9 6,0 5,2 3,1 WV-9095 7,5 3,4 2,6 2,5 WV-9096 10,1 4,0 4,0 2,9 WV-9097 10,7 5,7 4,5 2,8 WV-9098 8,5 3,6 2,9 2,3 WV-9099 8,1 2,9 2,4 2,4 WV-9100 12,7 6,0 4,7 2,9 WV-9101 7,6 2,9 3,1 2,0 WV-9102 9,9 4,0 3,6 2,5 WV-9103 12,6 6,9 6,1 3,0 WV-9104 11,3 3,7 4,3 2,1 WV-9105 6,5 2,9 2,3 2,4 WV-9106 15,1 7,7 5,5 4,3 WV-9107 7,8 2,5 2,2 2,6 WV-9108 11,3 3,3 3,5 2,2 WV-9109 16,1 10,6 8,9 4,1 WV-9110 8,8 3,5 3,4 1,7 WV-9111 7,3 3,4 2,5 1,7 WV-9112 11,5 4,6 3,4 2,2
WV-9113 10,6 4,2 3,1 2,3 WV-9114 10,8 4,9 4,1 2,6 WV-9115 8,4 0,0 2,5 2,1 WV-9116 7,5 0,0 1,6 1,8 WV-9117 6,8 0,0 2,0 1,5 WV-9118 9,3 0,0 2,7 2,1 WV-9119 7,2 0,6 2,0 2,0 WV-9120 8,5 6,1 2,5 2,0 WV-9121 11,8 5,7 3,9 2,5 WV-9122 8,6 4,0 2,4 2,4 WV-9123 10,7 5,2 2,0 2,0 WV-9124 11,0 5,3 3,6 3,2 WV-9125 8,7 3,5 2,3 2,2 WV-9126 10,5 3,4 3,4 2,4 WV-9127 8,5 3,4 2,7 2,5 WV-9128 8,2 2,9 2,0 2,2 WV-9129 7,5 2,6 1,6 1,7 WV-9130 12,6 0,0 5,4 2,7 WV-9131 7,6 2,3 2,2 1,8 WV-9132 8,4 0,7 3,4 2,3 WV-9133 16,2 7,0 6,9 3,2 WV-9134 8,5 3,9 3,0 1,9 WV-9135 12,5 2,8 2,9 1,7 WV-9136 8,7 4,1 3,1 2,2 WV-9137 7,5 2,5 1,7 1,6 WV-9138 7,2 2,7 2,1 1,7 WV-9139 9,3 5,3 5,1 2,8 WV-9140 8,0 3,1 2,5 2,1 WV-9141 7,7 3,3 2,9 1,8
WV-9142 11,9 6,4 6,0 3,2 WV-9143 7,0 3,2 3,9 1,8 WV-9144 9,8 4,0 3,6 2,7 WV-9145 13,0 6,6 5,3 2,6 WV-9146 7,9 3,7 3,4 1,9 WV-9147 8,2 3,9 3,1 2,0 WV-9148 15,0 8,8 6,4 3,3 WV-9149 6,9 2,9 2,3 3,1 WV-9150 10,8 6,9 5,6 1,9 WV-9151 12,9 7,2 5,1 2,7 WV-9152 8,4 3,4 2,6 1,5 WV-9153 7,2 3,9 2,9 1,7 WV-9154 21,5 14,1 12,4 4,3 WV-9155 6,9 3,3 2,5 1,6 WV-9156 11,0 6,4 4,9 2,4 WV-9157 16,7 10,5 9,7 3,9 WV-9158 7,7 3,7 2,3 1,7 WV-9159 7,7 3,1 3,3 1,5 WV-9160 8,0 3,1 2,8 1,8 WV-9161 8,4 4,5 3,2 2,2 WV-9162 8,9 4,5 4,7 2,2 Mock 2,4 Mock 2,1
WV-9746 2,5 2,5 4,6 3,4 WV-9747 3,0 3,1 5,5 4,8 WV-9748 4,9 2,5 4,3 4,0 WV-9749 2,9 2,7 4,5 4,1 WV-9750 3,2 2,5 4,4 3,8
WV-9751 3,5 2,7 4,7 4,8 WV-9758 1,7 1,9 2,1 3,5 WV-9759 2,6 3,6 2,8 6,1 WV-9760 3,1 3,9 3,4 4,8 WV-9761 3,0 4,8 4,6 7,2 WV-9756 3,9 4,4 5,3 8,4 WV-9757 3,7 4,3 6,8 8,1 WV-9517 3,3 2,7 7,1 5,3 WV-9519 2,4 2,1 5,1 4,6 WV-9521 2,4 2,5 6,3 4,9 WV-9522 2,6 2,3 5,8 4,3 WV-9715 4,6 5,7 10,5 4,2 WV-9714 4,5 3,4 9,0 8,5 WV-9422 2,1 2,0 6,2 4,3 WV-9743 4,1 2,4 7,3 6,2 WV-9744 3,4 1,9 4,4 5,1 WV-9745 2,7 2,4 5,6 6,2 Mock 2,4 1,8 1,7 2,5 Tabela 14 Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos.
Os números representam a eficiência de salto, em que 100,0 pode representar 100% de salto e 0,0 representa 0% de eficiência; os resultados dos experimentos de réplica (R1 e R2) são mostrados. 3 uM-R1 3 uM-R2 10 uM-R1 10 uM-R2 WV-9746 2,5 2,5 4,6 3,4 WV-9747 3,0 3,1 5,5 4,8 WV-9748 4,9 2,5 4,3 4,0 WV-9749 2,9 2,7 4,5 4,1
WV-9750 3,2 2,5 4,4 3,8 WV-9751 3,5 2,7 4,7 4,8 WV-9758 1,7 1,9 2,1 3,5 WV-9759 2,6 3,6 2,8 6,1 WV-9760 3,1 3,9 3,4 4,8 WV-9761 3,0 4,8 4,6 7,2 WV-9756 3,9 4,4 5,3 8,4 WV-9757 3,7 4,3 6,8 8,1 WV-9517 3,3 2,7 7,1 5,3 WV-9519 2,4 2,1 5,1 4,6 WV-9521 2,4 2,5 6,3 4,9 WV-9522 2,6 2,3 5,8 4,3 WV-9715 4,6 5,7 10,5 4,2 WV-9714 4,5 3,4 9,0 8,5 WV-9422 2,1 2,0 6,2 4,3 WV-9743 4,1 2,4 7,3 6,2 WV-9744 3,4 1,9 4,4 5,1 WV-9745 2,7 2,4 5,6 6,2 Mock 2,4 1,8 1,7 2,5 Tabela 15 Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos.
Os números representam a eficiência de salto, em que 100,0 pode representar 100% de salto e 0,0 representa 0% de eficiência. 10 uM 3 uM WV-9897 7,4 4,8 WV-9898 11,8 4,6 WV-9899 10,1 4,1 WV-9900 10,3 4,7
WV-9901 5,7 2,5 WV-9902 8,8 3,5 WV-9903 7,3 3,4 WV-9904 6,9 3,0 WV-9905 6,7 3,1 WV-9906 12,1 5,0 WV-9907 11,1 3,8 WV-9908 12,6 5,1 WV-9909 11,3 3,9 WV-9910 9,8 4,3 WV-9911 3,5 4,0 WV-9912 11,3 4,7 WV-9913 10,3 3,9 WV-9914 9,4 2,8 WV-9747 7,6 3,4 WV-9749 6,4 3,6 WV-9750 6,0 3,5 WV-9758 3,5 2,5 WV-9517 9,6 4,1 Mock 2,5 2,6
[00829] Os oligonucleotídeos adicionais foram gerados e testados para salto de éxon 53 DMD in vitro em células. Determinados dados são mostrados abaixo na Tabela 16. Os oligonucleotídeos foram usados a concentrações de 3 e 10 uM, em duas réplicas. Os números indicam a porcentagem de salto do éxon 53 DMD. Conforme mostrado, os oligonucleotídeos podem ter sequências de base diferentes em combinação com uma variedade de formatos químicos. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos testados tinham 20-mers, cada um, tendo um formato de gapmer de flanco-núcleo-flanco, em que cada flanco era 2'-F, e o núcleo era 2'-OMe ou uma mistura de 2'-OMe e 2'- F.
Em algumas modalidades, cada ligação internucleotídica era uma ligação internucleotídica fosforotioato quiralmente controlada na configuração Sp.
Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos compreendem uma ou mais ligações fosfato naturais.
Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos da presente revelação compreendem um ou mais 5'-metil 2'-F C
(5MSfC, , nucleosídeo é , em que BA é nucleobase C, R2s é −F). Tabela 16 Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos.
Os números representam a eficiência de salto, em que 100,0 pode representar 100% de salto e 0,0 representa 0% de eficiência; os resultados dos experimentos de réplica são mostrados.
Grupo A (3 uM) Grupo B (10 uM) WV-9746 8,0 7,5 13,7 7,5 WV-9747 10,2 9,3 17,4 9,3 WV-9748 8,8 8,2 14,1 8,2 WV-9749 9,9 8,7 15,8 8,7 WV-9750 10,0 9,3 17,3 9,3 WV-9751 9,3 8,4 14,5 8,4 WV-9758 6,9 6,1 8,8 6,1 WV-9759 7,5 7,7 11,3 7,7 WV-9760 8,1 7,3 10,2 7,3 WV-9761 7,3 8,2 12,7 8,2
WV-9756 10,9 10,3 20,2 10,3 WV-9757 22,7 10,1 32,1 10,1 WV-9517 10,3 9,2 20,1 9,2 WV-9519 8,8 8,1 16,2 8,1 WV-9521 9,2 8,0 16,0 8,0 WV-9522 9,5 8,8 17,7 8,8 WV-9715 14,3 12,3 26,9 12,3 WV-9714 13,2 11,3 23,7 11,3 WV-9422 8,3 7,3 16,6 7,3 WV-9743 9,8 7,8 20,1 7,8 WV-9744 7,6 6,7 12,9 6,7 WV-9745 9,6 7,4 17,0 7,4 Mock 4,7 4,9 5,2
[00830] Vários oligonucleotídeos DMD também foram projetados, construídos e testados quanto à eficácia no salto do Éxon 53 DMD in vitro em células de mioblasto diferenciadas. Determinados dados são mostrados abaixo na Tabela 17. Os oligonucleotídeos foram entregues gimnoticamente a concentrações de 3 e 10 µM, em duas réplicas biológicas (R1 e R2). Os números indicam a porcentagem do salto de éxon 53 DMD, conforme determinado por RT-qPCR. Tabela 17 Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos. Os números representam a eficiência de salto, em que 100,0 pode representar 100% de salto e 0,0 representa 0% de eficiência; os resultados dos experimentos de réplica (R1 e R2) são mostrados. 3 uM-R1 3 uM-R2 10 uM-R1 10 uM-R2 WV-9422 2,1 2,0 6,2 4,3
WV-9743 4,1 2,4 7,3 6,2 WV-9744 3,4 1,9 4,4 5,1 WV-9745 2,7 2,4 5,6 6,2 Mock 2,4 1,8 1,7 2,5
[00831] Vários oligonucleotídeos foram projetados, construídos e testados quanto à eficácia no salto do Éxon 53 DMD in vitro em ∆52 células de mioblasto diferenciadas. Determinados dados foram mostrados abaixo na Tabela 18. Em um procedimento exemplificativo, as células foram pré-diferenciadas por 4 dias e os oligonucleotídeos foram entregues gimnoticamente por 4 dias. O meio de diferenciação foi DMEM, soro de cavalo a 2% e 10µg/ml de insulina. Em algumas modalidades, com determinados oligonucleotídeos, sem pré- diferenciar essas células, a eficiência de salto foi relativamente baixa. Os oligonucleotídeos foram entregues gimnoticamente a concentrações de 1, 3 e 10 µM, em réplicas biológicas (R1 e R2). Os números indicam a porcentagem do salto de éxon 53 DMD, conforme determinado por RT-qPCR. PMO53 é um oligonucleotídeo também designado como WV-13405, HumDMDEx53, ou PMO (em experimentos de éxon 53 DMD), ou PMO SR, que tem uma sequência de base de GTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTGTTC e é totalmente PMO (Morfolino). "-" indica que nenhum dado estava disponível para aquela amostra particular. Tabela 18 Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos. Os números representam a eficiência de salto, em que 100,0 pode representar 100% de salto em relação ao controle e 0,0 pode representar 0% de eficiência; os resultados dos experimentos de réplica (R1 e R2) são mostrados.
30 uM 30 uM 10 uM 10 uM 3 uM 3 uM 1 uM 1 uM -R1 -R2 -R1 -R2 -R1 -R2 -R1 -R2 WV-9714 - - 52,1 31,0 25,0 21,7 7,9 9,2 WV-9715 - - - - 12,6 7,3 11,1 8,7 WV-9517 - - - - 20,5 20,4 7,3 6,9 WV-9519 - - 39,0 30,5 15,1 13,3 5,3 6,6 WV-9521 - - 43,2 10,2 16,9 15,1 5,1 5,2 WV-9747 83,0 87,5 50,7 46,6 17,0 19,5 6,4 6,2 WV-9748 66,4 68,2 42,9 33,2 14,5 10,2 4,8 3,9 WV-9749 76,8 80,2 39,2 35,4 18,5 13,0 5,7 23,5 WV-9897 - - - - 26,0 25,3 8,3 8,4 WV-9898 - - - - 22,8 23,6 8,5 7,9 WV-9900 - - 46,7 45,7 25,5 21,8 7,4 7,9 WV-9899 - - 28,7 - 27,2 26,1 8,8 8,8 WV-9906 - - - - 37,9 - 9,7 9,8 WV-9912 - - - - 22,5 - 8,8 9,7 WV-9524 - 14,6 - 32,9 15,2 14,5 5,4 6,9 PMO53 112,8 105,4 53,7 49,3 20,4 19,9 6,9 10,4 Mock 2,2 1,7 2,2 1,5 1,6 1,8 2,0 2,0
[00832] Vários oligonucleotídeos DMD foram projetados, construídos e testados quanto à eficácia no salto do Éxon DMD 53 in vitro em ∆45-52 células de mioblasto diferenciadas. Determinados resultados, normalizados para SFSR9, são mostrados abaixo na Tabela 19. Os oligonucleotídeos foram entregues gimnoticamente a concentrações de 1, 3 e 10 µM, em réplicas biológicas (R1 e R2). Os números indicam a porcentagem do salto de éxon 53 DMD, conforme determinado por RT-qPCR. Tabela 19 Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos.
Os números representam a eficiência de salto, em que 100,0 pode representar 100% de salto e 0,0 representa 0% de eficiência; os resultados dos experimentos de réplica (R1 e R2) são mostrados. 10 uM-R1 10 uM-R2 3 uM-R1 3 uM-R2 1 uM-R1 1 uM-R2 MOCK 0,8 0,8 0,8 0,8 0,9 0,9 MOCK 0,7 0,7 0,8 0,8 0,8 0,8 PMO 18,0 18,0 5,6 5,7 3,8 4,0 PMO 19,3 17,9 9,6 9,4 3,1 3,1 WV-9517 39,4 42,3 16,0 16,1 5,3 5,2 WV-9517 43,8 42,9 18,5 17,5 5,5 5,7 WV-9519 33,7 28,5 14,3 13,3 4,5 4,5 WV-9519 27,6 27,9 12,4 11,3 4,1 4,1 WV-9897 30,8 31,1 11,7 12,5 3,9 3,8 WV-9897 32,3 30,7 12,0 11,9 4,6 4,7 WV-9714 46,8 42,8 21,5 20,6 4,5 4,1 WV-9714 46,5 48,1 25,4 25,6 4,2 2,9 WV-9747 31,1 31,8 12,0 12,5 4,7 4,7 WV-9747 27,6 28,0 10,5 11,1 3,5 3,7 WV-9748 21,7 21,7 7,9 8,0 3,3 3,2 WV-9748 21,1 20,9 8,5 8,1 3,1 3,1 WV-9749 23,2 24,2 10,1 9,4 3,7 3,7 WV-9749 25,3 24,6 10,7 10,5 3,7 3,9 WV-9897 53,2 53,1 24,5 24,4 5,4 5,5 WV-9897 48,3 48,7 22,8 22,8 4,8 4,8 WV-9898 46,5 46,8 21,1 21,1 5,2 5,4 WV-9898 46,3 46,4 23,4 23,8 5,0 4,6 WV-9899 45,4 44,1 19,5 19,5 4,8 5,0
WV-9899 44,9 44,0 21,4 21,2 5,5 5,6 WV-9900 34,9 35,0 19,5 19,6 5,0 5,3 WV-9900 30,2 31,5 17,6 17,6 4,4 4,4 WV-9906 42,9 44,6 18,0 19,0 2,9 3,1 WV-9906 37,5 36,3 17,5 18,2 2,8 3,2 WV-9912 39,8 41,6 19,6 17,7 5,0 4,4 WV-9912 41,6 40,8 21,3 19,9 4,2 4,2
[00833] Teste adicional de oligonucleotídeos foi realizado, e os resultados foram mostrados abaixo nas Tabelas 20 e 21. Tabela 20 Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos. Os números representam a eficiência de salto, em que 100,0 pode representar 100% de salto e 0,0 representa 0% de eficiência; os resultados dos experimentos de réplica são mostrados. 10 uM 10 uM 3 uM 3 uM 1 uM 1 uM WV-9517 34,6 35,6 17,0 19,4 6,7 7,8 WV-9897 43,8 26,8 27,3 9,7 9,8 WV-9898 42,7 30,3 22,8 26,7 8,5 9,3 WV-9899 45,0 16,4 26,8 10,0 8,6 WV- 10670 32,4 32,9 15,2 18,2 7,2 8,0 WV- 10671 28,7 30,9 14,7 16,1 6,7 8,0 WV- 10672 25,6 28,1 11,8 12,2 5,0 5,0 PMO 40,8 36,0 19,1 18,6 10,7 11,7 Mock 1,1 1,9 1,8 1,9 1,7 2,5 Tabela 21 Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos. Os oligonucleotídeos foram testados in vitro em 52 células delta. A, Salto de Éxon a 10 uM é mostrado. B, restauração de proteína. Réplicas ou experimentos diferentes são designados como a), b), e c). A. WV- WV- WV- WV- WV- WV- WV- WV- WV- 9422 9425 9426 9517 9519 9521 9522 9524 9536 a) 8, a) 8 a) 3 a) a) 9, a) 8, a) 8, a) 9 a) 7 c) 4 10, c) 4 c) 5 c) 5 c) 6 WV- WV- WV- WV- WV- WV- WV- WV- WV- 9700 9701 9702 9703 9704 9709 9710 9711 9713 a) 4 a) 4 a) 6 a) 8 a) 7 a) 4 a) 6 a) 6 a) 4 WV- WV- WV- WV- WV- WV- WV- WV- WV- 9714 9715 9746 9747 9748 9749 9750 9751 9756 a) a) c) 4 c) 4 c) 4 c) 4 c) 4 c) 4 c) 7 13, 15, c) 9 c) 9 WV- WV- WV- WV- WV- WV- WV- WV- 9757 9758 9759 9760 9761 9743 9744 9745 c) 7 c) 2 c) 4 c) 4 c) 6 c) 6 c) 4 c) 6 B. WV-9422 WV-9425 WV-9426 WV-9429 WV-9517 b) 4 b) 2 b) 2 b) 1 b) 5
[00834] Os oligonucleotídeos DMD adicionais foram testados quanto à sua capacidade de mediar o salto de um éxon DMD, conforme mostrado abaixo.
Os oligonucleotídeos PMO Totais (Morfolino) têm as seguintes sequências: PMO SR WV-13405 GTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTGTTC PMO WV WV-13406 CTCCGGTTCTGAAGGTGTTC PMO WV-13407 TGCCTCCGGTTCTGAAGGTGTTCTTGTA WV-13407 é também designado PMO NS.
Tabela 21C.
Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos.
Os números representam uma eficiência de salto, em que 100 pode representar 100% de salto e 0 pode representar 0% de salto.
Dados de réplica são mostrados. 10 uM 3 uM Mock 0,1 0,2 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 PMO SR 1,8 1,6 1,1 0,9 0,5 0,5 0,5 0,4 PMO WV 0,8 1,0 1,0 1,1 0,4 0,4 0,5 0,3 PMO 2,3 2,5 1,8 1,8 1,0 0,9 0,6 0,6 WV-10454 5,5 6,1 4,5 3,9 1,3 1,3 0,9 0,7 WV-10455 10,5 13,8 7,3 7,8 2,1 2,8 2,0 2,5 WV-10456 7,2 7,4 5,6 5,0 1,4 1,5 1,7 1,3 WV-10457 9,8 14,2 8,4 9,0 3,8 2,9 3,2 2,9 WV-10458 6,6 5,4 5,6 5,2 1,2 1,1 1,1 1,2 WV-10459 2,4 2,8 2,7 2,5 1,0 1,0 0,5 0,5 WV-10460 7,9 6,0 7,6 7,5 1,9 1,8 1,4 1,4 WV-10461 14,9 11,3 5,7 6,0 2,4 3,7 WV-10462 1,6 2,4 3,4 3,1 0,8 0,8 0,7 0,9 WV-10463 2,6 3,2 2,9 2,7 0,7 0,7 0,7 0,7 WV-10464 1,2 1,1 0,2 0,1 0,4 0,3 0,2 0,3 WV-10465 2,3 1,8 0,6 0,7 0,7 0,7 WV-10466 8,6 9,1 3,9 2,6 1,8 1,6 1,9 1,6
WV-10467 3,2 0,8 1,4 1,1 4,1 4,3 3,3 2,9 WV-10468 2,1 2,0 WV-10469 3,2 3,1 4,8 4,2 0,6 0,6 1,0 0,0 WV-9699 4,6 3,2 2,8 2,4 0,8 0,9 0,7 0,5 WV-9898 19,4 19,0 17,6 18,2 5,4 6,2 5,9 5,4 Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos, por exemplo, oligonucleotídeos DMD, são projetados para ter como alvo elementos intensificadores de splicing intrônico, por exemplo, para oligonucleotídeos DMD para salto do éxon 53, elementos dentro de 4 kb do Éxon 53. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos têm 30-mers.
Os dados exemplificativos para determinados oligonucleotídeos são apresentados na Tabela 21D.
Tabela 21D.
Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos.
Resultados: Entrega gimnótica de ASO Intron 10µM em ∆45-52 mioblastos derivados do paciente (4 dias pós- diferenciação). Realizado em réplicas biológicas.
Os números representam uma porcentagem do salto de éxon, conforme determinado por RT-qPCR.
WV- 10490 1,6 1,6 1,8 1,9 WV- 10491 1,6 1,7 1,7 1,5 WV- 10492 1,4 1,5 1,6 1,4 WV- 10493 0,9 0,6 WV- 1,4 1,5 1,3 1,6
WV- 10495 WV- 10496 1,8 1,5 1,8 1,7 WV- 10497 1,6 1,6 1,5 1,7 WV- 10498 0,7 0,7 2,0 1,8 WV- 10499 1,5 1,4 1,7 1,6 WV- 10500 0,8 1,3 0,9 0,6 WV- 10501 1,2 1,7 1,3 1,4 WV- 10502 1,4 1,4 1,5 1,4 WV- 10503 1,5 1,0 1,7 WV- 10504 1,6 1,8 WV- 10505 1,5 1,2 1,9 1,5 WV- 10506 0,8 0,8 1,4 1,3 WV- 10507 1,4 1,1 0,9 1,4 WV- 10508 1,5 1,4 1,8 1,7
WV- 10509 1,2 1,5 1,4 1,6 WV- 10510 1,3 1,7 1,0 1,6 WV- 10511 0,5 0,9 0,8 1,2 WV- 10512 1,3 1,5 1,7 1,7 WV- 10513 1,5 1,6 1,6 1,7 WV- 10514 1,1 1,7 1,8 WV- 10515 2,0 1,9 1,9 1,9 WV- 10516 8,3 8,7 9,1 8,0 WV- 10517 0,5 0,5 1,7 1,5 WV- 10518 1,7 1,5 1,5 1,7 WV- 10519 1,8 1,6 1,8 1,8 WV- 10520 2,1 1,8 1,8 1,7 WV- 10521 3,3 3,1 2,6 3,4 WV- 10522 1,9 2,0 1,7 2,1 WV- 2,3 2,1 1,9 1,9
WV- 10524 1,8 1,9 2,1 2,0 WV- 10525 2,0 2,1 1,1 1,6 WV- 10526 1,7 1,9 1,8 1,7 WV- 10527 1,1 1,3 1,4 1,5 WV- 10528 1,6 1,6 1,7 1,4 WV- 10529 1,6 1,1 WV- 10530 0,9 1,7 1,7 1,6 WV- 10531 1,2 1,5 1,0 1,3 WV- 10532 1,4 1,6 1,6 1,5 WV- 10533 1,4 0,5 1,5 1,5 WV- 10534 1,3 1,4 1,7 1,6 WV- 10535 0,9 0,6 1,7 1,6 WV- 10536 1,5 1,0 1,4 1,3 WV- 10537 1,4 1,6 1,6 1,4
WV-9517 44,5 42,5 41,6 43,2 WV-9699 13,0 12,7 9,8 9,3 Mock 1,6 1,7 1,4 1,3 Tabela 21E.
Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos. ∆45-52 mioblastos derivados de paciente com DMD, com 7d de pré-diferenciação, foram tratados com oligonucleotídeos em meio de diferenciação muscular a concentrações indicadas sob a condição de absorção livre antes de serem coletados e analisados quanto à eficiência de salto de RNA (4d de dosagem) por qPCR.
Quantificação (normalização SRSF9) relativa.
Os oligonucleotídeos foram testados a uma concentração de 0 a 10 µM.
Os resultados dos experimentos de réplica são mostrados.
Alguns dos oligonucleotídeos testados compreendem uma ligação internucleotídica não negativamente carregada (WV-12887 e WV- 12880). Conc. 10 3,33 1,11 0,3704 0,1235 0 35,2 23,1 9,0 4,0 2,2 1,0 36,3 23,1 8,7 4,0 2,3 1,2 WV-13405 33,1 20,6 8,3 3,3 2,1 1,0 (PMO) 33,7 20,7 8,3 3,2 2,2 1,2 31,2 22,2 8,6 1,7 1,3 1,1 30,4 22,5 10,3 1,5 1,2 0,9 49,6 23,3 6,2 1,7 1,4 1,2 WV-9898 48,3 22,3 5,5 1,5 1,6 1,5 73,1 53,5 38,4 10,3 4,5 1,0 72,1 54,3 37,6 10,3 4,8 1,1 69,3 51,5 24,4 5,5 3,5 1,2 WV-12880 69,6 52,6 23,7 6,2 3,2 1,0
40,4 28,1 3,5 2,1 1,4 1,0 39,8 28,2 1,2 2,1 1,3 1,0 29,3 18,1 5,5 1,8 1,3 1,6 WV-9517 28,9 17,4 4,9 1,7 1,3 1,4 21,2 20,0 3,9 1,6 2,1 1,3 23,6 18,5 3,7 1,9 2,1 1,2 39,5 18,7 5,1 1,7 2,0 1,5 WV-9897 40,9 18,5 5,2 1,6 1,8 1,0 79,7 59,4 44,2 9,6 5,5 0,9 78,7 58,8 44,1 9,6 5,6 0,9 76,1 61,0 38,1 12,3 6,7 1,1 WV-12887 75,0 61,3 31,9 9,8 5,1 1,1 Tabela 21F.
Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos. ∆45-52 mioblastos derivados de paciente com DMD foram tratados com oligos em meio de diferenciação muscular a concentrações indicadas por 4d sob condições de absorção livre e analisados quanto à eficiência de salto de RNA por qPCR. 10 uM 3,3 uM Mock 0,3 0,3 0,3 0,4 0,3 0,3 0,3 0,3 WV-13405 (PMO) 4,3 4,5 4,2 4,7 1,2 1,1 1,8 1,9 WV-9517 15,0 14,2 5,6 5,8 8,7 9,3 WV-11340 32,4 33,7 35,9 36,9 15,4 13,0 15,9 15,0 WV-12873 38,7 37,5 39,6 39,2 13,6 11,7 17,0 14,5 WV-12872 44,9 41,9 44,1 46,5 15,7 17,5 15,7 19,5 WV-13408 49,0 48,7 50,2 50,3 21,6 22,0 23,0 24,5 WV-12553 18,3 20,7 18,7 24,1 7,4 7,6 9,7 8,4 WV-12557 40,0 39,2 33,8 35,9 15,3 15,5 23,6 23,9 WV-12554 38,8 39,0 43,5 44,9 15,1 14,0 20,5 20,3
WV-13409 34,6 38,4 39,1 40,3 14,7 12,9 18,9 16,5 WV-9898 24,1 22,0 7,9 7,7 9,9 8,5 WV-11342 30,4 34,5 31,3 31,9 14,3 14,4 14,1 13,3 WV-12559 44,3 41,8 16,6 16,5 17,4 19,4 WV-12556 42,5 43,0 39,7 43,3 16,1 17,1 18,8 17,1 WV-9897 20,8 17,9 6,0 5,4 6,8 4,8 WV-11341 36,6 39,4 17,8 16,8 18,2 19,3 WV-12558 41,5 39,4 36,0 18,2 15,1 18,5 16,7 WV-12555 44,3 43,6 20,5 19,0 20,2 22,1 WV12880 41,1 43,2 46,1 45,1 27,4 24,6 25,9 29,1 WV-12877 51,5 53,3 26,2 27,1 30,2 30,7 WV-12125 47,3 49,4 37,8 35,1 21,3 20,6 24,0 23,5 WV-12127 40,0 40,6 41,2 39,7 19,9 15,5 18,3 18,0 WV-12129 33,5 35,0 24,4 24,4 13,9 10,7 14,4 13,7 Tabela 21G.
Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos. ∆45-52 mioblastos derivados de paciente com DMD, com 7d de pré-diferenciação, foram tratados com oligos em meio de diferenciação muscular a concentrações indicadas por 4d sob condições de absorção livre e analisados quanto à eficiência de salto de RNA por qPCR.
Conc de Oligo [uM] 10 uM 3,3 uM Mock 0,6 0,6 0,6 0,8 0,7 0,6 1,0 0,8 10, 10, WV-13405 (PMO) 6,9 7,4 1 9 2,2 1,9 4,1 4,4 24, 22, 11, 33, 19, 20, WV-9517 2 0 5 7 9,3 9,8 8 6 WV-11340 50, 54, 61, 63, 30, 22, 33, 30,
70, 66, 71, 74, 24, 29, 27, 38, WV-12872 6 4 0 6 7 2 9 9 60, 59, 62, 62, 20, 15, 33, 24, WV-12873 8 5 9 8 4 3 5 5 73, 72, 75, 75, 35, 35, 42, 46, WV-13408 5 3 8 6 6 7 2 3 32, 39, 38, 51, 13, 14, 22, 18, WV-12553 7 1 0 3 7 6 7 9 65, 64, 76, 80, 26, 27, 45, 45, WV-12557 2 4 7 4 3 1 3 6 61, 61, 69, 71, 27, 22, 38, 37, WV-12554 0 5 5 7 0 9 5 6 57, 63, 66, 69, 23, 18, 34, 28, WV-13409 2 6 2 3 6 9 4 4 45, 40, 16, 14, 13, 12, 20, 16, WV-9898 1 3 3 4 2 1 8 1 49, 58, 57, 60, 27, 27, 30, 27, WV-11342 9 1 9 0 4 8 3 4 72, 68, 50, 56, 33, 32, 35, 42, WV-12559 4 4 8 1 3 8 5 5 70, 71, 68, 73, 31, 33, 42, 37, WV-12556 5 0 4 5 0 5 0 0 42, 34, 41, 10, 17, WV-9897 0 9 2 2 8,0 9 9,4 61, 67, 74, 74, 37, 33, 40, 42, WV-11341 6 2 1 4 0 8 8 9 71, 68, 66, 35, 27, 40, 35, WV-12558 6 0 3 6 1 5 5
70, 68, 56, 61, 35, 32, 40, 45, WV-12555 2 9 0 7 2 4 1 0 58, 63, 68, 66, 44, 36, 44, 52, WV12880 8 0 5 5 4 6 8 1 77, 80, 69, 75, 46, 48, 55, 58, WV-12877 9 2 5 6 3 2 8 4 71, 74, 83, 80, 36, 34, 45, 44, WV-12125 1 1 6 4 5 8 6 3 61, 64, 67, 66, 35, 23, 35, 34, WV-12127 9 0 8 2 0 3 5 7 52, 55, 63, 63, 23, 14, 26, 24, WV-12129 7 8 1 6 8 7 5 1 Tabela 21H.
Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos.
A estabilidade de oligonucleotídeo de comprimento total no ponto de tempo de 5 dias em homogenato de Fígado Humano foi testada.
Os números são réplicas e representam a porcentagem de oligonucleotídeo de comprimento total restante, em que 100 pode representar 100% de oligonucleotídeos restantes (estabilidade completa) e 0 pode representar 0% de oligonucleotídeo restante (instabilidade completa). Alguns nucleotídeos testados compreendem uma ligação internucleotídica não negativamente carregada.
WV-12553 27,2 WV-12124 74,4 WV-12127 45,0 30,1 67,6 42,3 32,1 67,7 43,2 WV-11341 63,6 WV-12125 65,8 WV-12129 50,2 55,0 74,2 53,3 55,7 92,6 51,2
WV-11342 51,7 WV-12126 65,8 WV-12882 60,6 54,0 57,9 66,9 50,8 55,8 68,6 WV-12555 81,1 WV-12880 65,2 WV-12878 76,0 63,9 75,1 76,2 60,9 78,1 WV-12556 73,4 WV-12881 61,9 WV-12876 67,0 75,1 60,3 62,0 66,9 57,7 66,4 WV-12558 59,9 WV-12123 59,5 78,8 55,1 66,0 49,9 WV-12559 68,3 WV-12877 78,9 76,3 78,0 73,3 83,1
WV-9897 59,9 59,6 58,6 WV-9898 44,7 39,1 46,3 Tabela 21I.
Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos.
Os números indicam a quantidade de salto em relação ao controle.
Conc de Oligo [uM] WV- WV- WV- WV- Moc 9517 13826 13827 13835 k 10 uM 45,7 46,5 23,1 40,5 1,2
46,3 45,8 22,9 58,8 1,1 49,3 46,8 26,8 54,5 1,3 48,5 50,3 28,1 55,2 1,2 3,3 uM 18,1 20,3 7,9 24,6 1 17 19,5 8,3 25,3 1,1 22,6 19,7 8,8 26,6 1,1 22,8 20,2 8,3 27,2 1,1 1,1 uM 6 7 2,9 7,9 1 6 6,2 2,7 7,4 1,2 6,9 7,3 0,7 9,6 0,9 6,6 6,8 0,9 9,1 0,7
WV- WV- WV- WV- MOCK 9517 12880 13864 14344 10 uM 36,1 60,2 66,8 47,9 0,9 38,3 62,0 67,0 46,8 1,0 44,5 60,9 68,7 56,8 1,2 43,9 59,2 69,6 56,3 1,0 3,3 uM 15,4 38,3 45,3 25,1 0,9 15,8 37,3 45,6 27,0 0,9 18,8 37,9 50,5 39,2 1,0 18,8 39,6 49,3 38,9 1,0 1,1 uM 4,7 15,8 21,5 12,2 0,6 4,9 14,4 22,6 12,4 0,9 6,4 18,5 24,9 17,2 1,1 6,2 16,2 13,2 17,1 0,9 0,3 uM 2,2 5,0 6,6 5,7 0,8 1,8 5,0 5,9 5,7 0,9 2,7 7,4 8,2 7,2 1,0
2,7 7,5 8,2 6,9 1,0 Tabela 21I.1. Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos.
Eficiência de salto de vários oligonucleotídeos DMD, testados para salto do éxon DMD 53. Os números representam o salto do éxon 53. ∆45-52 mioblastos de paciente foram diferenciados por 7 dias, então tratados com oligonucleotídeos por 4d sob condições gimnóticas em meio de diferenciação.
O RNA foi colhido por extração com Trizol e o salto analisado por TaqMan. 10 uM 3,3 uM 1,1 uM 0,3 uM 0,1 uM 1,1 1,2 0,8 1,0 1,0 1,1 2,0 0,9 1,0 1,1 0,7 1,1 1,0 1,1 Mock 1,2 0,7 1,1 0,9 1,0 44,8 28,6 18,1 9,5 4,0 44,8 23,4 17,4 8,7 4,0 Wv-13405 51,2 26,5 11,4 5,1 3,7 (PMO) 50,8 25,6 11,2 5,5 3,6 35,9 18,3 6,5 2,2 1,9 36,6 17,3 6,4 2,1 1,9 40,2 23,4 5,5 2,7 1,7 WV-9517 38,7 25,6 5,9 2,2 1,8 57,3 36,3 16,4 4,8 7,5 55,8 37,0 18,1 2,8 4,7 57,5 35,9 16,6 8,0 7,4 Wv-12880 58,9 33,0 16,5 7,2 6,8 68,1 45,1 22,6 10,5 7,4 WV-13864 68,0 44,5 23,0 12,0 5,6
67,5 43,1 24,3 8,4 6,0 64,8 44,5 19,9 3,3 6,1 40,2 21,5 6,3 2,8 2,0 39,4 20,3 9,7 2,5 2,0 50,0 21,0 5,5 3,2 2,0 WV-13835 47,7 20,6 6,0 3,3 2,2 41,4 25,9 7,4 4,7 0,7 40,3 24,8 5,8 4,0 0,5 40,1 24,9 9,1 4,3 3,9 WV-14791 41,3 27,2 8,9 4,6 3,5 50,1 28,6 13,6 6,4 3,8 47,4 28,6 8,8 5,8 4,7 54,9 46,1 18,0 11,4 6,6 WV-14344 55,7 38,3 18,7 11,8 6,0 Tabela 21I.2. Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos.
Eficiência de salto de vários oligonucleotídeos DMD, testados para salto do éxon DMD 53. Os números representam o salto do éxon 53. ∆45-52 mioblastos de paciente foram tratados com oligonucleotídeo por 4d (4 dias) sob condições gimnóticas em meio de diferenciação.
O RNA foi colhido por extração com Trizol e o salto analisado por TaqMan. 10 uM 3,3 uM 1,1 uM 0,3 uM 0,1 uM Mock 0,7 0,6 0,6 0,6 0,7 0,7 0,7 0,6 0,6 0,7 0,6 0,6 0,6 0,7 0,7 0,5 0,5 0,7 0,6 0,7 Wv-13405 (PMO) 9,4 1,5 3,4 1,1 0,8
9,3 1,4 3,1 1,1 0,8 6,6 2,8 1,5 0,9 0,8 6,3 2,6 1,5 1,0 0,8 WV-9517 29,3 8,4 2,6 1,0 0,7 28,7 9,2 3,0 1,1 0,8 16,6 6,6 2,3 1,1 0,7 16,9 6,8 2,2 1,1 0,9 WV-12880 37,9 17,7 9,6 3,4 1,3 38,8 19,9 9,1 3,3 1,4 31,4 16,1 7,9 3,3 1,6 31,6 16,8 8,0 3,0 1,5 WV-13864 55,9 28,6 11,7 4,3 2,0 54,3 27,8 11,6 4,6 2,0 43,4 22,2 10,7 4,2 2,0 43,0 22,7 9,8 3,8 2,1 WV-13835 38,7 11,6 2,9 1,3 0,9 37,2 11,0 2,9 1,3 0,8 42,3 13,1 3,5 1,2 0,9 41,5 10,0 3,1 1,3 0,9 WV-14791 26,3 12,1 5,2 1,9 1,3 24,8 11,2 4,7 2,1 1,1 28,0 13,0 5,2 2,2 1,2 27,6 12,4 4,9 2,1 1,4 WV-14344 36,2 17,8 8,0 2,7 1,7 37,4 17,0 7,1 2,7 1,8 37,4 22,3 9,8 3,7 1,7 36,6 22,6 9,9 3,7 1,5 Vários oligonucleotídeos (incluindo WV-9517, WV- 13864, WV-13835, e WV-14791) foram testados em várias concentrações até 30 uM para ativação de TLR9 in vitro em células HEK-blue-TLR9 (16 horas de absorção gimnótica). WV- 13864 e WV-14791 compreendem uma ligação internucleotídica quiralmente controlada não negativamente carregada na configuração Rp. WV-9517, WV-13864, WV-13835, e WV-14791 não exibiram ativação de TLR9 significativa (menos de 2 vezes de indução de TLR9; dados não mostrados). WV-13864 e WV-14791 também exibiram sinal insignificante de até 30 uM em ensaio de liberação de citocina PBMC em comparação com água (dados não mostrados). Oligonucleotídeos e Composições de Distrofina Exemplificativos Que Têm Como Alvo o Éxon 54
[00835] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece oligonucleotídeos, composições de oligonucleotídeo, e métodos de uso dos mesmos para alvejar o éxon 54 e/ou mediar o salto do éxon 54 em DMD humana. Os exemplos não limitantes incluem oligonucleotídeos e composições de oligos do Éxon 54 que incluem: WV-13745, WV- 13746, WV-13747, WV-13748, WV-13749, WV-13750, WV-13751, WV- 13752, WV-13753, WV-13754, WV-13755, WV-13756, WV-13757, WV- 13758, WV-13759, WV-13760, WV-13784, e WV-13785, e outros oligonucleotídeos que têm uma sequência de base que compreende pelo menos 15 bases contíguas de qualquer um desses oligonucleotídeos DMD. Tabela 21J. Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos. Eficiência de salto de vários oligonucleotídeos DMD, testados para salto do éxon DMD 54. WV-13745 0,2 0,3 0,2 0,0 WV-13746 0,6 0,6 0,4 0,4
WV-13747 0,4 0,5 0,4 0,4 WV-13748 1,1 1,2 0,7 0,9 WV-13749 2,5 2,1 1,7 1,8 WV-13750 1,9 2,1 1,4 1,4 WV-13751 4,3 5,1 4,4 5,7 WV-13752 0,0 0,0 3,1 3,9 WV-13753 0,0 0,0 0,0 0,0 WV-13754 6,0 1,4 1,7 WV-13755 1,1 1,2 0,5 0,5 WV-13756 4,7 5,0 2,3 2,4 WV-13757 1,9 2,1 1,1 1,4 WV-13758 2,0 2,2 0,9 1,2 WV-13759 0,7 0,7 0,4 0,2 WV-13760 0,7 0,6 0,3 0,5 WV-13784 0,0 0,0 0,0 0,0 WV-13785 0,0 0,0 0,0 0,0 Mock 0,0 0,0 Mock 0,0 0,0 Oligonucleotídeos e Composições de Distrofina Exemplificativos Que Têm Como Alvo o Éxon 55
[00836] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece oligonucleotídeos, composições de oligonucleotídeo, e métodos de uso dos mesmos para alvejar o éxon 55 e/ou mediar o salto do éxon 55 em DMD humana. Os exemplos não limitantes incluem oligonucleotídeos e composições de oligos do Éxon 55 que incluem: WV-13761, WV- 13762, WV-13763, WV-13764, WV-13765, WV-13766, WV-13767, WV- 13768, WV-13769, WV-13770, WV-13771, WV-13772, WV-13773, WV- 13774, WV-13775, WV-13776, WV-13777, WV-13778, WV-13779, WV- 13786, e WV-13787, e outros oligonucleotídeos que têm uma sequência de base (sequência nua) que compreende pelo menos 15 bases contíguas de qualquer um desses oligonucleotídeos DMD.
[00837] Em algumas modalidades, dois ou mais oligonucleotídeos que têm capacidade de salto ou alvejamento de éxon 44, 46, 47, 51, 52, 53, 54 e/ou 55 podem ser usados em qualquer combinação para mediar o salto de múltiplos éxons. Tabela 21K. Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos. Eficiência de salto de vários oligonucleotídeos DMD, testados para salto do éxon DMD 55. WV-13761 0,5 0,5 0,3 0,4 WV-13762 0,3 0,2 0,1 0,1 WV-13763 0,2 0,2 0,2 0,2 WV-13764 0,1 0,1 0,1 0,1 WV-13765 1,0 1,0 0,4 0,4 WV-13766 2,6 2,7 1,7 1,8 WV-13767 0,2 0,0 1,4 1,6 WV-13768 1,1 1,1 0,7 0,7 WV-13769 1,6 1,8 1,1 1,1 WV-13770 1,4 1,4 0,8 0,9 WV-13771 0,3 0,4 0,2 0,2 WV-13772 1,8 1,7 0,9 0,9 WV-13773 0,0 0,0 0,1 0,1 WV-13774 0,0 0,0 0,0 0,0 WV-13775 1,0 0,8 0,3 0,4 WV-13776 0,7 0,6 0,3 0,7 WV-13777 2,8 2,2 0,4 1,1 WV-13778 0,3 0,3 0,2 0,3 WV-13779 0,0 0,0 0,4 0,4
WV-13786 0,0 0,0 2,0 2,3 WV-13787 0,0 0,0 0,2 0,1 Mock 0,0 0,0 0,0 0,0 Mock 0,0 0,0 0,0 0,0 Oligonucleotídeos e Composições de Distrofina Exemplificativos Que Têm Como Alvo o Éxon 57
[00838] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece oligonucleotídeos, composições de oligonucleotídeo, e métodos de uso dos mesmos para alvejar o éxon 57 e/ou mediar o salto do éxon 57 em DMD humana. Os exemplos não limitantes incluem oligonucleotídeos e composições de oligos do Éxon 57 que incluem: WV-18853, WV- 18854, WV-18855, WV-18856, WV-18857, WV-18858, WV-18859, WV- 18860, WV-18861, WV-18862, WV-18863, WV-18864, WV-18865, WV- 18866, WV-18867, WV-18868, WV-18869, WV-18870, WV-18871, WV- 18872, WV-18873, WV-18874, WV-18875, WV-18876, WV-18877, WV- 18878, WV-18879, WV-18880, WV-18881, WV-18882, WV-18883, WV- 18884, WV-18885, WV-18886, WV-18887, WV-18888, WV-18889, WV- 18890, WV-18891, WV-18892, WV-18893, WV-18894, WV-18895, WV- 18896, WV-18897, WV-18898, WV-18899, WV-18900, WV-18901, WV- 18902, WV-18903, WV-18904, e outros oligonucleotídeos que têm uma sequência de base (sequência nua) que compreende pelo menos 15 bases contíguas de qualquer um desses oligonucleotídeos DMD. Oligonucleotídeos e Composições de Distrofina Exemplificativos para Salto de Éxon de Múltiplos Éxons (Multi- Éxon Skipping)
[00839] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece oligonucleotídeos, composições, e métodos para modulação de splicing, incluindo o salto de múltiplos éxons. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo DMD ou composição do mesmo tem capacidade para mediar o salto de múltiplos éxons no gene da Distrofina humana ou de camundongo.
[00840] Em algumas modalidades, em um paciente com distrofia muscular, os sintomas de distrofia muscular podem ser pelo menos parcialmente aliviados e/ou o distúrbio pelo menos parcialmente tratado por administração de um oligonucleotídeo DMD que tem capacidade de salto de um éxon ou múltiplos éxons. Sem se ater a nenhuma teoria particular, a presente revelação observa que pacientes com BMD com uma deleção de éxons 45 a 55 de DMD mostrou um fenótipo mais moderado ou assintomático.
[00841] Um exemplo não limitante de um esquema para salto de múltiplos éxons é mostrado na Figura 1. Nessa Figura, vários números (43 a 57) indicam éxons; e os formatos dos éxons (por exemplo, <, > ou | ) indicam que o quadro de leitura é representado na extremidade 5' e 3' de cada éxon. Normalmente, o éxon 44 é unido ao éxon 45. Em um exemplo não limitante do salto de múltiplos éxons, os éxons 45 a 55 são ignorados, permitindo que o éxon 44 se una ao éxon
56. A extremidade 3' do éxon 44 é representada pelo mesmo quadro de leitura ( < ) que a extremidade 5' do éxon 56; desse modo, o salto dos éxons 45 a 55 mantém ou restaura o quadro de leitura correto. Em algumas modalidades, o salto de múltiplos éxons restaura o quadro de leitura se um dos éxons ignorados compreende uma mutação que altera o quadro de leitura (em muitos casos, por exemplo, produzindo uma proteína com troca de sentido ou prematuramente truncada).
[00842] Entre outros fatores, a presente revelação observa que vários éxons representam em suas extremidades 5' e/ou 3' diferentes quadros de leitura; desse modo, algumas combinações de salto de quadros de leitura adjacentes, porém não outras combinações têm capacidade de manter ou restaurar o quadro de leitura. Em algumas modalidades, as composições e métodos fornecidos para salto de múltiplos éxons ignoram, como exemplos não limitantes, os éxons 45-46, 45-47, 45-48, 45-49, 45-51, 45-53, 45-55, 47-48, 47-49, 47-51, 47-53, 47-55, 48-49, 48-51, 48-53, 46-55, 50-51, 50-53, 50-55, 49-51, 49-53, 49-55, 52-53, 52-55, 44-45, 44-54, ou 44- 56, em que, em cada caso, o salto de múltiplos éxons mantém ou restaura o quadro de leitura correto. Em algumas modalidades, o salto de conjunto de éxons não sobrepostos tem capacidade para manter ou restaurar o quadro de leitura, por exemplo, salto dos éxons 45 a 46 e éxons 49 a 55; o salto dos éxons 45 a 47 e 49 a 55; o salto dos éxons 45 a 49 e 52 a 55; etc.
[00843] Sem se ater a nenhuma teoria particular, a presente revelação observa que alguns éxons DMD podem ser transcricionalmente submetidos a splicing, enquanto outros são pós-transcricionalmente submetidos a splicing. Por exemplo, cada um dentre os éxons 45 a 55 é supostamente não simultaneamente submetido a splicing, mas, em vez disso, primeiro como três grupos: éxons 45 a 49, 50 a 52 e 53 a 55, os éxons individuais dentro de cada grupo sendo transcricionalmente submetidos a splicing. Supostamente, os íntrons restantes (entre éxons 44/45, 49/50, 52/53, e 55/56) são pós-transcricionalmente submetidos a splicing posteriormente. Sem se ater a nenhuma teoria particular, a presente revelação observa que esse atraso na temporização de splicing pode ser explorado por oligonucleotídeos com capacidade de aumentar o splicing entre éxons cujos íntrons adjacentes são pós-transcricionalmente submetidos a splicing, tal como o éxon 44 e 56. Relata-se que na natureza, tal salto de múltiplos éxons que une o éxon 44 ao éxon 56 ocorre a uma frequência baixa, porém detectável (aproximadamente 1/600). Sem se ater a nenhuma teoria particular, a presente revelação se refere, em parte, aos oligonucleotídeos DMD com capacidade de salto de múltiplos éxons a um nível terapêutica e clinicamente significativo.
[00844] Em algumas modalidades, uma composição que tem capacidade de mediar o salto de múltiplos éxons compreende um oligonucleotídeo DMD. Em algumas modalidades, uma composição que tem capacidade de mediar o salto de múltiplos éxons compreende uma combinação de (por exemplo, dois ou mais diferentes) oligonucleotídeos DMD. Em algumas modalidades, uma composição que tem capacidade de mediar o salto de múltiplos éxons compreende uma combinação of (por exemplo, dois ou mais diferentes) oligonucleotídeos DMD, em que pelo menos um oligonucleotídeo reconhece um alvo associado ao salto do 5' éxon a ser ignorado, e pelo menos um oligonucleotídeo reconhece um alvo associado ao salto do éxon 3' a ser ignorado. Em algumas modalidades, uma composição que tem capacidade de mediar o salto de múltiplos éxons compreende um oligonucleotídeo que tem capacidade para reconhecer tanto (1) um alvo associado ao salto do éxon 5' a ser ignorado e (2) um alvo associado ao salto do éxon 3' a ser ignorado.
[00845] Em algumas modalidades, uma vantagem de uma composição com capacidade de salto de múltiplos éxons é aquela que é útil para tratamento de distrofia associada a uma mutação em qualquer éxon individual incluído no grupo de éxons que é ignorado. Como um exemplo não limitante, um oligonucleotídeo DMD com capacidade para mediar o salto do éxon 48 tem capacidade de tratar apenas mutações dentro daquele éxon (ou, em alguns casos, um éxon adjacente ou próximo), mas não as mutações dentro de outros éxons. Entretanto, uma composição com capacidade para mediar o salto do éxons 45 a 55 tem capacidade para tratar mutações em qualquer um dos éxons 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 ou 55. Desse modo, tanto um paciente com uma mutação no éxon 48 como um paciente com uma mutação no éxon 54 podem ser tratados com uma composição que tem capacidade de salto de éxons 45 a 55. Em algumas modalidades, uma composição com capacidade para mediar o salto do éxons 45 a 55 tem capacidade para tratar até cerca de 63% de pacientes com DMD.
[00846] Em algumas modalidades, uma composição compreende um ou mais oligonucleotídeos DMD, em que a composição tem capacidade para mediar o salto de múltiplos (dois ou mais) éxons DMD.
[00847] Em algumas modalidades, uma MESO (uma composição que compreende um ou mais oligonucleotídeos, cuja composição tem capacidade para mediar o salto de múltiplos éxons) tem uma vantagem em em relação a um oligonucleotídeo DMD que tem capacidade de ignorar apenas um éxon. Em algumas modalidades, uma composição que tem capacidade para mediar o salto de um único éxon, é apenas útil para o tratamento de pacientes tratáveis por meio do salto daquele éxon (por exemplo, pacientes que têm uma lesão genética naquele éxon). Em algumas modalidades, uma MESO é útil para tratar pacientes tratáveis por meio do salto de qualquer um dos éxons, cuja MESO tem capacidade de salto, que é provavelmente uma porcentagem maior da população de pacientes. Em algumas modalidades, o salto de éxons duplo ou múltiplo pode ser potencialmente aplicável a 90% dos pacientes.
[00848] Além disso, em algumas modalidades, devido ao fato de que as extremidades 5' e 3' de um éxon, algumas vezes, não se situam no mesmo quadro, a deleção de tal éxon poderia causar um deslocamento de quadro. O salto de múltiplos éxons, em vários deses casos, pode restaurar o quadro de leitura.
[00849] Em algumas modalidades, o salto de múltiplos éxons é útil para tratar pacientes com DMD com deleção, duplicação e mutações sem sentido.
[00850] Além disso, em algumas modalidades, o salto de múltiplos éxons pode simular a genética da distrofia muscular de Becker mais branda. Em algumas modalidades, a distrofia muscular de Duchenne mais grave, mediada por uma lesão genética em um éxon, pode ser convertida em uma distrofia muscular de Becker mais branda, mediada por uma deleção in- frame de múltiplos éxons. Relata-se que alguns pacientes com BMD e uma pessoa assintomática têm deleções in-frame dos éxons 48 a 51 ou 45 a 51. Singh et al. 1997 Hum. Genet. 99: 206-208; Melacini et al. 1993 J. Am. Col.. Cardiol. 22: 1927-1934; Melis et al. 1998 Eur. J. Paediatr. Neurol. 2: 255-261; e Aartsma- Rus et al. 2003 Hum. Mol. Genet. 8: 907-914.
[00851] Em algumas modalidades, o salto de determinados éxons pode ser mais desafiador do que outros. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece tecnologias para salto de tais éxons, por exemplo, através de modificações químicas, estereoquímica de fósforo de ligação, e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, a presente revelação abrange o reconhecimento de que o salto de múltiplos éxons pode ser útil para o salto de tais éxons desafiadores. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece tecnologias de salto de múltiplos éxons para salto de tais éxons desafiadores.
[00852] Em algumas modalidades, o salto de éxon, por exemplo, o salto de éxon DMD, pode ser usado para tratar pacientes, por exemplo, pacientes com DMD, com transcrições de RNA circulares ou circularizadas (por exemplo, aquelas de DMD). As transcrições DMD circulares são relatadas, como um exemplo não limitante em: Gualandi et al. 2003 J. Med. Gen. 40:e100.
[00853] Em algumas modalidades, uma composição que tem capacidade de mediar o salto de múltiplos éxons (MESO) compreende um oligonucleotídeo DMD que tem capacidade de mediar o salto de múltiplos éxons. Em algumas modalidades, uma composição que tem capacidade de mediar o salto de múltiplos éxons (MESO) compreende dois oligonucleotídeos DMD que juntos (por exemplo, quando usados em combinação) têm capacidade de mediar o salto de múltiplos éxons. Em algumas modalidades, uma composição que tem capacidade de mediar o salto de múltiplos éxons (MESO) compreende um coquetel de (por exemplo, uma mistura de três ou mais) oligonucleotídeos DMD que juntos (por exemplo, quando usados em combinação como um coquetel) têm capacidade de mediar o salto de múltiplos éxons. As combinações ou coquetéis de oligonucleotídeos que têm capacidade de mediar o salto de múltiplos éxons foram relatadas, por exemplo, por Yokota et al. 2009 Arch. Neurol. 66: 32; Yokota et al. 2012 Nucl. Acid Ther. 22: 306; Adkin et al. 2012 Neur. Dis. 22: 297-305; Echigoya et al. 2013 Nucl. Acid. Ther.; e Echigoya et al. 2015
Molecular Therapy—Nucleic Acids 4: e225. Entre outros fatores, a presente revelação fornece combinações mais eficazes, através de, por exemplo, sequências, modificações químicas e/ou química de fósforo de ligação selecionadas, etc.
[00854] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece oligonucleotídeos que, quando combinados com outros oligonucleotídeos, podem fornecer atividades drasticamente aumentadas em comparação com qualquer um dos oligonucleotídeos individualmente antes da combinação. Por exemplo, em algumas modalidades, a presente revelação fornece oligonucleotídeos DMD que são individualmente incapazes de mediar o salto eficiente de um éxon particular; quando combinados com outros oligonucleotídeos, tais oligonucleotídeos têm capacidade de mediar o salto de múltiplos éxons. Entre outros fatores, a presente revelação fornece terapia de combinação, em que dois ou mais oligonucleotídeos são usados em conjunto para fornecer propriedades e/ou atividades desejadas e/ou melhoradas. Quando usados na terapia de combinação, os dois ou mais agentes, por exemplo, oligonucleotídeos, podem ser administrados simultaneamente, ou separadamente de modos adequados para que os mesmos obtenham seus efeitos de combinação. Em algumas modalidades, dois ou mais oligonucleotídeos em uma combinação são todos (principalmente) para o salto do mesmo éxon, e sua combinação fornece salto melhorado de tal éxon, em algumas modalidades, significativamente mais do que a adição de seus efeitos separados. Em algumas modalidades, dois ou mais oligonucleotídeos em uma combinação são para o salto de éxons diferentes, e sua combinação fornece salto eficaz, algumas vezes mais do que os oligonucleotídeos podem alcançar individualmente, de dois ou mais éxons. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece combinações de oligonucleotídeos com sinergias entre dois ou mais oligonucleotídeos diferentes. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece combinações de oligonucleotídeos diferentes em que um ou mais, ou cada oligonucleotídeo por si próprio é eficaz para o salto de éxon. Determinadas combinações são descritas em Adams et al. 2007 BMC Mol. Biol. 8:57. Entre outros fatores, a presente revelação fornece combinações mais eficazes, através de, por exemplo, controle projetado de um ou mais ou todos os elementos estruturais dos oligonucleotídeos. Em algumas modalidades, uma combinação fornecida fornece salto de éxon do éxon 45 DMD. Em algumas modalidades, uma combinação fornecida fornece salto de éxon de outro éxon DMD, incluindo aqueles descritos no presente documento ou, de outro modo, desejáveis para salto (por exemplo, para prevenção ou tratamento de uma ou mais condições, doenças ou distúrbios, etc.) conforme conhecido na técnica.
[00855] Em algumas modalidades, coquetéis, combinações e misturas de oligonucleotídeos, por exemplo, para salto de múltiplos éxons podem ter desvantagens em comparação com oligonucleotídeos únicos que podem realizar a mesma ou funções comparáveis, tais como custos mais altos de produtos, complicações na fabricação e entrega, carga regulatória aumentada, etc. De acordo com as regulamentações da FDA cada componente em uma combinação pode precisar ser separadamente testado quanto à toxicidade, bem como toda a combinação. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece oligonucleotídeos únicos que podem alcançar as mesmas funções ou funções comparáveis de combinações de oligonucleotídeo, e podem ser utilizados para substituir as combinações de oligonucleotídeo, através de um controle preciso e projetado de um ou mais elementos estruturais of oligonucleotídeos, por exemplo, modificações químicas, estereoquímica, e combinações dos mesmos.
[00856] Várias tecnologias são adequadas para avaliar o salto de múltiplos éxons, de acordo com a presente revelação. Os exemplos não limitantes são descritos no Exemplo 20 e na Figura 2.
[00857] Em algumas modalidades, uma composição para salto de múltiplos éxons DMD compreende um oligonucleotídeo DMD que tem capacidade de salto do éxon 45 DMD. Vários oligonucleotídeos DMD foram testados quanto à sua capacidade de ignorar o éxon 45, conforme mostrado na Tabela 1A. Vários oligonucleotídeos DMD para salto do éxon 45 também foram testados quanto à sua capacidade de ignorar múltiplos éxons, conforme mostrado na Tabela 22A. Entre outros fatores, a presente revelação demonstra que vários oligonucleotídeos, incluindo WV-11088 e WV-11089, podem fornecer níveis baixos de salto dos éxons 45-55 (criando uma junção entre o éxon 44 e o éxon 56 ou 44-56).
[00858] Em outro experimento, os oligonucleotídeos WV-11047, WV-11051 a WV-11059 não demonstraram salto significativo sob a condição testada específica, e os oligonucleotídeos WV-11062 a WV-11069, cada um, exibiram níveis detectáveis de salto que foram <1% sob a condição testada específica. Os oligonucleotídeos WV-11091 a WV-11096, WV-11098, e WV-11100 a WV-11105 exibiram <.5% de salto do éxon 45 sob a condição testada específica. Tabela 22A. Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos.
Os oligonucleotídeos foram testados quanto à sua capacidade de salto do éxon 45 DMD em ∆48-50 células.
Os números indicam o nível de salto, em que 100 pode representar 100% de salto e 0 pode representar 0% de salto.
WV-11070 1,6 WV-11071 0,3 WV-11072 0,2 WV-11073 0,7 WV-11074 2,2 WV-11075 0,2 WV-11076 1,2 WV-11077 1,3 WV-11078 3,3 WV-11079 7,5 WV-11080 1,3 WV-11081 7,2 WV-11082 2,8 WV-11083 3,1 WV-11084 10,1 WV-11085 1,5 WV-11086 15,8 WV-11087 1,1 WV-11088 13 WV-11089 15,1 WV-11090 0,9 Vários oligonucleotídeos, incluindo WV-11088 e WV- 11089, mostraram níveis detectáveis de salto de múltiplos éxons (especificamente dos éxons 45-55) (aproximadamente 0,1% de salto).
[00859] Em outro experimento, vários oligonucleotídeos DMD que têm como alvo o éxon 45 foram testados in ∆48-50 quanto a uma capacidade de ignorar múltiplos éxons (especificamente 45 a 53, criando uma junção entre o éxon 44 e o éxon 54 ou 44-54). Os oligonucleotídeos testados foram: WV-11047, WV-11051, WV-11052, WV-11053, WV-11054, WV- 11055, WV-11056, WV-11057, WV-11058, WV-11059, WV-11062, WV- 11063, WV-11064, WV-11065, WV-11066, WV-11067, WV-11068, WV- 11069, WV-11070, WV-11071, WV-11072, WV-11073, WV-11074, WV- 11075, WV-11076, WV-11077, WV-11078, WV-11079, WV-11080, WV- 11081, WV-11082, WV-11083, WV-11084, WV-11085, WV-11086, WV- 11087, WV-11088, WV-11089, WV-11090, WV-11091, WV-11092, WV- 11093, WV-11094, WV-11095, WV-11096, WV-11098, WV-11100, WV-
11101. Todos esses oligonucleotídeos, em um experimento, demonstraram em média cerca de 0,05% ou menos salto dos éxons 44-54 (dados não mostrados).
[00860] Os oligonucleotídeos que têm como alvo o éxon 45 também foram testados para salto dos éxons 45 a 57, conforme mostrado na Tabela 22A.1. Tabela 22A.1. Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos. Os oligonucleotídeos foram testados em ∆48-50 quanto à sua capacidade de salto dos éxons 45 a 57, DMD criando uma junção entre o éxon 44 e o éxon 58 ou 44-58. Os números indicam o nível de salto, em que 100 pode representar 100% de salto e 0 pode representar 0% de salto. Os dados de réplica nessa e em outras tabelas são mostrados. WV-11047 0,064 0,118 0,048 0,099 WV-11051 0,044 0,101 0,034 0,079
WV-11052 0,076 0,089 0,078 0,090 WV-11053 0,082 0,076 0,078 0,072 WV-11054 0,126 0,083 0,110 0,100 WV-11055 0,037 0,071 0,048 0,073 WV-11056 0,133 0,102 0,116 0,092 WV-11057 0,000 0,001 0,000 0,097 WV-11058 0,102 0,030 0,071 0,042 WV-11059 0,171 0,100 0,157 0,075 WV-11062 0,070 0,112 0,081 0,088 WV-11063 0,088 0,078 0,051 0,081 WV-11064 0,085 0,071 0,071 0,075 WV-11065 0,073 0,114 0,077 0,143 WV-11066 0,083 0,100 0,004 0,143 WV-11067 0,115 0,069 0,094 0,068 WV-11068 0,112 0,071 0,125 0,053 WV-11069 0,075 0,075 0,083 0,053 WV-11070 0,062 0,107 0,067 0,101 WV-11071 0,085 0,116 0,073 0,118 WV-11072 0,080 0,097 0,052 0,084 WV-11073 0,052 0,148 0,047 0,118 WV-11074 0,155 0,098 0,116 0,101 WV-11075 0,145 0,079 0,126 0,113 WV-11076 0,000 0,105 0,000 0,111 WV-11077 0,050 0,087 0,080 0,058 WV-11078 0,087 0,095 0,077 0,103 WV-11079 0,076 0,063 0,079 0,062 WV-11080 0,059 0,058 0,052 0,070 WV-11081 0,077 0,086 0,058 0,055 WV-11082 0,117 0,071 0,112 0,080
WV-11083 0,077 0,108 0,091 0,091 WV-11084 0,080 0,102 0,053 0,069 WV-11085 0,047 0,143 0,041 0,140 WV-11086 0,085 0,087 0,084 0,074 WV-11087 0,114 0,034 0,000 0,056 WV-11088 0,134 0,112 0,057 0,063 WV-11089 0,074 0,113 0,109 0,082 WV-11090 0,119 0,076 0,074 0,081 WV-11091 0,000 0,055 0,031 0,054 WV-11092 0,039 0,057 0,068 0,058 WV-11093 0,147 0,061 0,138 0,061 WV-11094 0,108 0,078 0,061 0,080 WV-11095 0,062 0,061 0,056 0,072 WV-11096 0,104 0,071 0,072 0,101 WV-11098 0,072 0,095 0,081 0,065 WV-11100 0,068 0,079 0,078 0,068 WV-11101 0,000 0,058 0,000 0,048
[00861] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo DMD tem como alvo o éxon DMD 44 ou a região intrônica contígua 3' ao éxon DMD 44 e tem capacidade para mediar o salto de múltiplos éxons.
[00862] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo DMD tem como alvo o éxon DMD 44 ou a região intrônica contígua 3' ao éxon DMD 44, e o oligonucleotídeo tem capacidade para mediar o salto de múltiplos éxons (por exemplo, de éxons 45 a 55, ou 45 a 57).
[00863] Supostamente, um fenômeno conhecido como back-splicing pode ocorrer, em que, por exemplo, uma porção da extremidade 3' do éxon 55 interage com uma porção da extremidade 5' do éxon 45, formando um RNA circular (circRNA),
que pode, desse modo, ignorar múltiplos éxons, por exemplo, todos os éxons do éxon 45 a 55, inclusive. O fenômeno também pode ocorrer supostamente entre o éxon 57 e o éxon 45, ignorando múltiplos éxons, por exemplo, todos os éxons do éxon 45 ao 57, inclusive. O back-splicing é descrito na literatura, por exemplo, em Suzuki et al. 2016 Int. J. Mol. Sci. 17.
[00864] Sem se ater a nenhuma teoria particular, a presente revelação sugere que pode ser possível que um oligonucleotídeo DMD que tem como alvo o éxon DMD 44 ou a região intrônica contígua 3' ao éxon 44 pode ser capaz de mediar o splicing dos éxons 45 a 55, ou dos éxons 45 a 57, cujos éxons são excisados como uma única peça de circular RNA (circRNA) designada 45-55 (ou 55-45) ou 45-57 (ou 57-45), respectivamente.
[00865] Vários oligonucleotídeos foram projetados para alvejar o éxon 44 ou íntron 44, ou que abrangem o éxon 44 e o íntron 44. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos projetados to target éxon 44 ou íntron 44, ou que abrangem o éxon 44 e o íntron 44 são testados para determinar se eles podem aumentar a quantidade de backslicing e/ou salto de múltiplos éxons.
[00866] Conforme mostrado na Tabela 22A.2 e Tabela 22A.3, abaixo, os oligonucleotídeos DMD que têm como alvo o Éxon44 foram testados quanto à capacidade de aumentar circRNA 55-45 (por exemplo, mediar o salto de múltiplos éxons dos éxons 45 a 55); ou quanto à capacidade de aumentar circRNA 57-45 (por exemplo, mediar o salto de múltiplos éxons dos éxons 45 a 57). Vários oligonucleotídeos DMD compreendem várias diferenças incluindo, entre outros, a sequência e o comprimento de base (18 ou 20 bases). Os números indicam a quantidade relativa de circRNA 55-45 (Tabela 22A.2) ou circRNA 57-45 (Tabela 22A.3). Nessa e em várias outras tabelas, Rep indica Réplica.
Tabela 22A.2. Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos.
WV-13964 0,9 1 WV-14016 1,2 1,5 WV-13965 1,1 1,1 WV-14017 1,5 1,5 WV-13966 1,1 0,6 WV-14018 0,8 1 WV-13967 1,3 1,2 WV-14019 1,2 1,4 WV-13969 1 0,8 WV-14020 1 1 WV-13971 0,3 0,9 WV-14021 1 1,3 WV-13972 1,1 1,3 WV-14022 1,3 1,5 WV-13973 1,1 1,3 WV-14023 1,3 1,7 WV-13976 1,2 1,2 WV-14024 1,2 1,2 WV-13979 0,5 0,5 WV-14025 1,5 1,6 WV-13980 1,3 0,4 WV-14026 2,4 0,6 WV-13981 0,9 0,7 WV-14027 1,2 1,2 WV-13982 1 1 WV-14028 1,1 1,2 WV-13983 0,9 0,6 WV-14029 1,2 1,4 WV-13984 1,1 WV-14030 1,3 1,6 WV-13985 1,3 0,8 WV-14031 1,3 1,6 WV-13987 1,2 1 WV-14032 1,2 1,5 WV-13988 1,4 0,9 WV-14033 1,3 WV-13989 1,6 1 WV-14034 1,1 1,2 WV-13990 1,7 1 WV-14035 1,2 1,4 WV-13991 1,4 1 WV-14036 1,1 1,1 WV-13992 1,6 1 WV-14037 1,1 1,2 WV-13993 1,2 1 WV-14038 1,4 1,4 WV-13994 1,2 0,6 WV-14039 1,2 1,2
WV-13995 1,1 0,9 WV-14040 2,2 3 WV-13996 1,4 1 WV-14041 2,3 2,4 WV-13997 1,2 1,3 WV-14042 1,3 1,3 WV-13998 1,2 0,8 WV-14043 1,1 1,4 WV-13999 1,2 1,3 WV-14044 1,3 1,5 WV-14000 0,9 0,9 WV-14045 1,8 2,1 WV-14001 1,1 1,5 WV-14046 1,3 1,6 WV-14002 1 1,1 WV-14047 1,2 1,6 WV-14003 2 2,1 WV-14048 3,8 4,9 WV-14004 1,9 1,2 WV-14049 2,1 2,6 WV-14005 1,1 1 WV-14050 1,4 1,5 WV-14006 1,2 1,4 WV-14051 1,5 1,7 WV-14007 1,3 1,7 WV-14052 1,4 2,2 WV-14008 1,4 1,1 WV-14053 1,5 1,4 WV-14009 1,3 1,3 WV-14054 1,4 1,8 WV-14010 1 1,1 WV-14055 1,3 1,6 WV-14011 3,2 3,7 WV-14056 1,3 1,4 WV-14012 1,8 2 WV-14057 1,7 2,1 WV-14013 1,4 1,8 WV-14058 1,8 1,4 WV-14014 1,1 1,3 WV-14015 1,1 1,3 Tabela 22A.3. Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos.
Rep Rep Rep Rep Biológica 1 Biológica 2 Biológica 1 Biológica 2 WV- mock 0,9 1 0,6 14010 WV- mock 0,8 1 3,1 4,7 14011
WV- mock 1 1,4 1,3 1,7 14012 WV- mock 1 0,5 0,9 1 14013 WV- mock 1,9 1,2 0,9 1,1 14014 WV- mock 0,7 0,7 0,4 1,2 14015 WV- mock 0,9 0,6 0,4 2,1 14016 WV- mock 0,3 1,6 1,4 1,3 14017 WV- WV- 0,8 1 0,8 0,7 13964 14018 WV- WV- 0,8 0,7 1,3 1,5 13965 14019 WV- WV- 1 0,7 0,6 1,2 13966 14020 WV- WV- 1,2 0,9 1,2 1,4 13967 14021 WV- WV- 1,2 1,3 1,6 1,6 13969 14022 WV- WV- 0,5 1,2 1,3 13971 14023 WV- WV- 0,9 1,3 1,4 1,1 13972 14024 WV- WV- 0,6 1,4 0,5 1,6 13973 14025 WV- 1,3 1,6 WV- 1,9
WV- WV- 0,5 0,3 1,1 0,9 13979 14027 WV- WV- 1,4 0,6 0,8 1 13980 14028 WV- WV- 0,8 1,3 1,1 1,3 13981 14029 WV- WV- 1,1 1 1,2 1,4 13982 14030 WV- WV- 1 0,8 1,2 1,5 13983 14031 WV- WV- 0,8 0,4 0,9 1,7 13984 14032 WV- WV- 1,3 1,6 0,9 13985 14033 WV- WV- 1,4 1,1 0,8 1,1 13987 14034 WV- WV- 1,4 1 1,3 1,1 13988 14035 WV- WV- 1,5 0,7 0,7 0,9 13989 14036 WV- WV- 1,3 0,6 1,2 1 13990 14037 WV- WV- 1,3 0,8 1,4 1,6 13991 14038 WV- WV- 1,6 2,4 1,1 0,5 13992 14039 WV- WV- 0,9 0,9 2,5 4,4 13993 14040
WV- WV- 0,6 1 2 2,8 13994 14041 WV- WV- 0,9 1,6 1,4 1,2 13995 14042 WV- WV- 1,2 0,8 1,4 1,4 13996 14043 WV- WV- 1,4 0,7 1,7 1,2 13997 14044 WV- WV- 1,2 0,8 1,7 2 13998 14045 WV- WV- 0,9 0,9 1,1 1,9 13999 14046 WV- WV- 0,6 0,3 1,3 2 14000 14047 WV- WV- 0,8 0,9 3,1 7,1 14001 14048 WV- WV- 0,6 1,3 1,9 2,5 14002 14049 WV- WV- 2,1 2 1,6 1,4 14003 14050 WV- WV- 2,1 0,7 1,8 1,7 14004 14051 WV- WV- 0,9 0,8 0,9 2,6 14005 14052 WV- WV- 1,3 1,1 1,1 1,8 14006 14053 WV- WV- 0,9 1,6 1,2 2 14007 14054 WV- 1,3 1,1 WV- 1,2 2
WV- WV- 0,9 1 1,4 0,9 14009 14056 WV- WV- 1 0,6 1,5 1,9 14010 14057 WV- WV- 3,1 4,7 1,3 1 14011 14058
[00867] Em algumas modalidades, uma composição com capacidade de mediar o salto de éxon de um éxon DMD particular compreende dois ou mais oligonucleotídeos que têm como alvo um éxon particular. Em algumas modalidades, uma combinação de dois ou mais oligonucleotídeos fornece níveis de salto significativamente maiores que a adição do nível de salto de cada oligonucleotídeo individualmente. Em algumas modalidades, uma combinação de dois ou mais oligonucleotídeos fornece níveis significativos (1%, 5%, 10%, ou mais) e/ou detectáveis de salto enquanto cada oligonucleotídeo individualmente não fornece níveis detectáveis de salto. As combinações de oligonucleotídeos tradicionais (por exemplo, oligonucleotídeo estereoaleatório e/ou oligonucleotídeos sem ligações internucleotídicas não negativamente carregadas descritos na presente revelação) foram relatadas para fornecer determinados efeitos aprimorados, por exemplo, em Wilton et al. 2007 Mol. Ther. 7: 1288-1296 (éxons 10, 20, 34, 65, etc.). Entre outros fatores, as combinações fornecidas compreendem pelo menos um oligonucleotídeo que compreende uma ou mais ligações internucleotídicas quiralmente controladas e/ou uma ou mais ligações internucleotídicas não negativamente carregadas, e podem fornecer níveis significativamente aumentados de salto de éxon.
[00868] Entre outros fatores, a presente revelação reconhece que determinados éxons são particularmente difíceis de ignorar. Por exemplo, em um relatório, para éxons 47 e 57. oligonucleotídeos DMD individuais não foram capazes de mediar o salto de éxon, porém pares de oligonucleotídeos foram capazes de mediar o salto de éxon. Em um relatório, o salto eficaz do éxon 45 foi mediado combinando-se dois oligonucleotídeos DMD que, individualmente, não foram eficazes no salto desse éxon. Aartsma-Rus et al. 2006 Mol. Ther. 14:
401. Aartsma-Rus et al. 2006 Mol. Ther. 14: 401. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece oligonucleotídeos (por exemplo, oligonucleotídeos quiralmente controlados), e composições e métodos de uso dos mesmos, para salto de éxon de tais éxons desafiadores. Com as tecnologias de modificações química e/ou estereoquímica descritas no presente documento, a presente revelação fornece tecnologias com eficiência de salto de éxon muito aprimorada. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece um único oligonucleotídeo (por exemplo, um oligonucleotídeo quiralmente controlado) e composições do mesmo (por exemplo, uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada) para salto de éxon de um ou mais éxons que são difíceis de ignorar. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece combinações de oligonucleotídeos (por exemplo,, oligonucleotídeos quiralmente controlados) e composições dos mesmos (por exemplo, composições de oligonucleotídeo quiralmente controladas) para salto de éxon de um ou mais éxons que são difíceis de ignorar. Em algumas modalidades, combinações de oligonucleotídeos DMD que têm como alvo o mesmo éxon medeiam os níveis de salto de éxon aumentados em relação aos oligonucleotídeos DMD individuais.
[00869] Em algumas modalidades, uma composição compreende dois ou mais oligonucleotídeos DMD, em que cada oligonucleotídeo DMD individual medeia os baixos níveis de salto de éxon, enquanto a combinação medeia um nível de salto mais alto (mais alto do que a adição de níveis obtidos por cada oligonucleotídeo individualmente).
[00870] Em algumas modalidades, uma composição compreende dois ou mais oligonucleotídeos DMD, em que os oligonucleotídeos têm como alvo éxons diferentes.
[00871] Em algumas modalidades, uma combinação de múltiplos oligonucleotídeos DMD que têm como alvo éxons diferentes tem capacidade para mediar o salto de dois ou mais (por exemplo, múltiplos) éxons.
[00872] Em algumas modalidades, uma composição compreende dois ou mais oligonucleotídeos DMD. Em algumas modalidades, uma composição compreende dois ou mais oligonucleotídeos DMD, pelo menos um dos quais é descrito no presente documento ou tem uma sequência de base, estereoquímica ou outra característica química descrita no presente documento. Oligonucleotídeos Que Compreendem Ligações Internucleotídicas Não Negativamente Carregadas podem Fornecer Atividades Significativamente Aprimoradas.
[00873] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece oligonucleotídeos que compreendem uma ou mais ligações internucleotídicas não negativamente carregadas. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada é uma ligação internucleotídica neutra. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece oligonucleotídeos que compreendem uma ou mais ligações internucleotídicas neutras. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura da fórmula I-n-1, I-n-2, I-n-3, I-n-4, II, II-a-1, II-a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, II-d-2, ou uma forma de sal do mesmo.
[00874] Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada compreende uma porção química de triazol. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada compreende um grupo triazolila opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura de . Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura de . Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada compreende um grupo triazolila substituído. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura de , em que W é O ou S. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada compreende um grupo alquinila opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura de , em que W é O ou S.
[00875] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece oligonucleotídeos que compreendem uma ligação internucleotídica, por exemplo, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada, que compreende uma porção química de guanidina cíclica. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica compreende uma guanidina cíclica e tem a estrutura de: . Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica, por exemplo, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada, que compreende uma guanidina cíclica é estereoquimicamente controlada.
[00876] Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada, ou uma ligação internucleotídica neutra, é ou compreende uma estrutura selecionada dentre , , , ou , em que W é O ou S. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada é uma ligação internucleotídica quiralmente controlada. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica neutra é uma ligação internucleotídica quiralmente controlada. Em algumas modalidades, um ácido nucleico ou um oligonucleotídeo que compreende uma ligação internucleotídica modificada que compreende uma porção química de guanidina cíclica é um siRNA, siRNA de fita dupla, siRNA de fita simples, gapmer, skipmer, blockmer, oligonucleotídeo antissenso, antagomir, microRNA, pré-microRNs, antimir, supermir, ribozima, adaptador de Ul, ativador de RNA, agente de RNAi, oligonucleotídeo decoy, oligonucleotídeo formador de triplex, aptâmero ou adjuvante.
[00877] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo compreende uma ligação internucleotídica neutra e uma ligação internucleotídica quiralmente controlada. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo compreende uma ligação internucleotídica neutra e uma ligação internucleotídica quiralmente controlada que é um fosforotioato na configuração Rp ou Sp. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece um oligonucleotídeo que compreende uma ou mais ligações internucleotídicas não negativamente carregadas e uma ou mais ligações internucleotídicas fosforotioato, em que cada ligação internucleotídica fosforotioato no oligonucleotídeo é independentemente uma ligação internucleotídica quiralmente controlada. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece um oligonucleotídeo que compreende uma ou mais ligações internucleotídicas neutras e uma ou mais ligações internucleotídicas fosforotioato, em que cada ligação internucleotídica fosforotioato no oligonucleotídeo é independentemente uma ligação internucleotídica quiralmente controlada. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido compreende pelo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,
14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais ligações internucleotídicas fosforotioato quiralmente controladas.
[00878] Sem se ater a nenhuma teoria particular, a presente revelação observa que uma ligação internucleotídica neutra é mais hidrofóbica do que uma ligação internucleotídica fosforotioato (PS), que é mais hidrofóbica do que uma ligação fosfodiéster (ligação fosfato natural, PO). Tipicamente, diferente de uma PS ou PO, uma ligação internucleotídica neutra contém menos carga. Sem se ater a nenhuma teoria particular, a presente revelação observa que a incorporação de uma ou mais ligações internucleotídicas neutras em um oligonucleotídeo pode aumentar a capacidade de os oligonucleotídeos serem absorvidos por uma célula e/ou escaparem dos endossomas. Sem se ater a nenhuma teoria particular, a presente revelação observa que a incorporação de uma ou mais ligações internucleotídicas neutras pode ser utilizada para modular a temperatura de fusão entre um oligonucleotídeo e seu ácido nucleico alvo.
[00879] Sem se ater a nenhuma teoria particular, a presente revelação observa que a incorporação de uma ou mais ligações internucleotídicas não negativamente carregadas, por exemplo, ligações internucleotídicas neutras, em um oligonucleotídeo pode ter capacidade de aumentar a capacidade de os oligonucleotídeo mediarem uma função, tal como salto de éxon ou knockdown de gene. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo que tem capacidade para alterar o salto de um ou mais éxons em um gene alvo compreende uma ou mais ligações internucleotídicas neutras. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo que tem capacidade para mediar o salto de um éxon (ou éxons) em um gene alvo compreende uma ou mais ligações internucleotídicas neutras. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo que tem capacidade para mediar o salto de um ou mais éxons DMD compreende uma ou mais ligações internucleotídicas neutras.
[00880] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo que tem capacidade para mediar o knockdown de um nível de um ácido nucleico ou um produto codificado através do mesmo compreende uma ou mais ligações internucleotídicas não negativamente carregadas. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo que tem capacidade para mediar o knockdown da expressão de um gene alvo compreende uma ou mais ligações internucleotídicas não negativamente carregadas. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo que tem capacidade para mediar o knockdown da expressão de um gene alvo compreende uma ou mais ligações internucleotídicas neutras.
[00881] Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada não é quiralmente controlada. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada é quiralmente controlada. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada é quiralmente controlada e seu fósforo de ligação é Rp. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada é quiralmente controlada e seu fósforo de ligação é Sp.
[00882] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais ligações internucleotídicas não negativamente carregadas. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais ligações internucleotídicas neutras.
Em algumas modalidades, cada uma dentre a ligação internucleotídica não negativamente carregada e/ou ligações internucleotídicas neutras é opcional e independentemente quiralmente controlada.
Em algumas modalidades, cada ligação internucleotídica não negativamente carregada em um oligonucleotídeo é independentemente uma ligação internucleotídica quiralmente controlada.
Em algumas modalidades, cada ligação internucleotídica neutra em um oligonucleotídeo é independentemente uma ligação internucleotídica quiralmente controlada.
Em algumas modalidades, pelo menos uma ligação internucleotídica não negativamente carregada/ligação internucleotídica neutra tem a estrutura de , em que W é O ou S.
Em algumas modalidades, pelo menos uma ligação internucleotídica não negativamente carregada/ligação internucleotídica neutra tem a estrutura de . Em algumas modalidades, pelo menos uma ligação internucleotídica não negativamente carregada/ligação internucleotídica neutra tem a estrutura de
. Em algumas modalidades, pelo menos uma ligação internucleotídica não negativamente carregada/ligação internucleotídica neutra tem a estrutura de , em que W é O ou S.
Em algumas modalidades, pelo menos uma ligação internucleotídica não negativamente carregada/ligação internucleotídica neutra tem a estrutura de . Em algumas modalidades, pelo menos uma ligação internucleotídica não negativamente carregada/ligação internucleotídica neutra tem a estrutura de . Em algumas modalidades, pelo menos uma ligação internucleotídica não negativamente carregada/ligação internucleotídica neutra tem a estrutura de
, em que W é O ou S.
Em algumas modalidades, pelo menos uma ligação internucleotídica não negativamente carregada/ligação internucleotídica neutra tem a estrutura de
. Em algumas modalidades, pelo menos uma ligação internucleotídica não negativamente carregada/ligação internucleotídica neutra tem a estrutura de . Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido compreende pelo menos uma ligação internucleotídica não negativamente carregada em que seu fósforo de ligação está na configuração Rp, e pelo menos uma ligação internucleotídica não negativamente carregada em que seu fósforo de ligação está na configuração Sp.
[00883] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo que tem capacidade para aumentar a frequência de salto de um éxon de um gene alvo compreende uma ligação internucleotídica não negativamente carregada. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo que tem capacidade para aumentar a frequência de salto de um éxon de um gene alvo compreende uma ligação internucleotídica não negativamente carregada e é útil para o tratamento de uma doença em que o éxon compreende uma mutação mutação deletéria ou associada à doença. Um exemplo não limitante é o gene DMD, em que o salto de um éxon que compreende uma mutação contribui para distrofia muscular.
[00884] Vários oligonucleotídeos, incluindo oligonucleotídeos DMD, que compreendem uma ou mais ligações internucleotídicas não negativamente carregadas/ligações internucleotídicas neutras foram projetados e/ou construídos e/ou testados, por exemplo, WV-11343, WV-11344, WV-11345, WV- 11346, WV-11347, WV-11237, WV-11238, WV-11239, WV-12130, WV- 12131, WV-12132, WV-12133, WV-12134, WV-12135, WV-12136, WV- 11340, WV-11341, WV-11342, WV-12123, WV-12124, WV-12125, WV- 12126, WV-12127, WV-12128, WV-12129, WV-12553, WV-12554, WV- 12555, WV-12556, WV-12557, WV-12558, WV-12559, WV-12872, WV- 12873, etc. Os oligonucleotídeos DMD para salto do éxon 23 e que compreendem uma ligação internucleotídica não negativamente carregada (por exemplo, uma ligação internucleotídica neutra) incluem: WV-11343, WV-11344, WV- 11345, WV-11346, e WV-11347. Os oligonucleotídeos DMD exemplificativos para salto do éxon 51 e que compreendem uma ligação internucleotídica não negativamente carregada (por exemplo, uma ligação internucleotídica neutra) incluem: WV- 11237, WV-11238, WV-11239, WV-12130, WV-12131, WV-12132, WV- 12133, WV-12134, WV-12135, e WV-12136. Os oligonucleotídeos DMD exemplificativos para salto do éxon 53 e que compreendem uma ligação internucleotídica não negativamente carregada (por exemplo, uma ligação internucleotídica neutra) incluem: WV- 11340, WV-11341, WV-11342, WV-12123, WV-12124, WV-12125, WV- 12126, WV-12127, WV-12128, WV-12129, WV-12553, WV-12554, WV- 12555, WV-12556, WV-12557, WV-12558, WV-12559, WV-12872, e WV-
12873. Determinados oligonucleotídeos estão na Tabela A1.
[00885] Os oligonucleotídeos DMD adicionais que compreendem uma ligação internucleotídica não negativamente carregada foram projetados e/ou construídos. Esses incluem oligonucleotídeos DMD para salto do éxon DMD 45, WV-14528, WV-14529, WV-14532, e WV-14533.
[00886] A eficácia de vários oligonucleotídeos DMD que compreendem uma ligação internucleotídica não negativamente carregada no salto do éxon DMD 45 é mostrada na Tabela 1B.1 e Tabela 1B.2 no presente documento.
[00887] A eficácia de vários oligonucleotídeos DMD que compreendem uma ligação internucleotídica não negativamente carregada no salto do éxon DMD 53 é mostrada na Tabela 21E, Tabela 21F, Tabela 21G e Tabela 21H no presente documento.
[00888] Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada pode ser designada como nX se estereoaleatória, ou nS quiralmente controlada e fósforo de ligação na configuração Sp, ou nR se quiralmente controlada e o fósforo de ligação na configuração Rp.
[00889] Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada pode ser designada como n001 se estereoaleatória ou n001S quiralmente controlada e fósforo de ligação na configuração Sp, ou n001R se quiralmente controlada e o fósforo de ligação na configuração Rp (por exemplo, na Tabela A1).
[00890] Vários oligonucleotídeos DMD que compreendem uma ligação internucleotídica não negativamente carregada na configuração Rp foram construídos, incluindo WV- 12872, WV-13408, WV-12554, WV-13409, WV-12555, e WV-12556.
[00891] Vários oligonucleotídeos DMD que compreendem uma ligação internucleotídica não negativamente carregada na configuração Sp foram construídos, incluindo WV- 12557, WV-12558, e WV-12559.
[00892] Os dados que mostram a atividade e estabilidade de vários oligonucleotídeos que compreendem uma ligação internucleotídica não negativamente carregada na configuração Rp ou Sp são mostrados na Tabela 21H Tabela 21I, Tabela 21I.1 e Tabela 21I.2
[00893] Vários oligonucleotídeos (incluindo WV-9517, WV-13864, WV-13835, e WV-14791) foram testados em várias concentrações até 30 uM para ativação de TLR9 em células HEK-blue-TLR9 (16 horas de absorção gimnótica). WV-13864 e WV- 14791 compreendem uma ligação internucleotídica quiralmente controlada não negativamente carregada na configuração Rp. WV-
9517, WV-13864, WV-13835, e WV-14791 não exibiram ativação de TLR9 significativa (dados não mostrados).
[00894] Vários oligonucleotídeos que têm como alvo um gene diferente de DMD que foram projetados e/ou construídos compreendem uma ligação internucleotídica não negativamente carregada.
[00895] Abaixo estão apresentados os oligonucleotídeos que compreendem uma porção química de guanidina cíclica que tem como alvo DMD ou Malat-1 (Malat1). Os oligonucleotídeos DMD são projetados para mediar o salto do éxon 23 (em camundongos) ou éxon 51 ou éxon 53 (em seres humanos). Os oligonucleotídeos Malat-1 são projetados para knockdown de mRNA Malat1, por exemplo, mediado através de RNase H. Tabela 22B. Oligonucleotídeos Malat-1 exemplificativos que compreendem uma cadeia principal neutra. Todos esses oligonucleotídeos têm a sequência de base de UGCCAGGCTGGTTATGACUC. Oligonucleotídeo Descrição Estereoquímica WV-11533 mU * SGeon001m5Ceon001 SnXnXnXSSRSSR m5Ceo n001mA * SG * SG * RC SSRSSSSSS * ST * SG * RG * ST * ST * RA * ST * SmG * SmA * SmC * SmU * SmC WV-12504 Mod001L001mU * SGeon001 OSnXnXnXSSRSS m5Ceon001 m5Ceon001mA * SG RSSRSSSSSS * SG * RC * ST * SG * RG * ST * ST * RA * ST * SmG * SmA * SmC * SmU * SmC WV-12505 L001mU * SGeon001m5Ceon001 OSnXnXnXSSRSS m5Ceon001mA * SG * SG * RC RSSRSSSSSS * ST * SG * RG * ST * ST * RA * ST * SmG * SmA * SmC * SmU * SmC
[00896] Os oligonucleotídeos que compreendem ligações internucleotídicas não negativamente carregadas e que têm como alvo outros alvos de gene também foram projetados, construídos e/ou testados quanto às suas propriedades e atividades, incluindo atividades para reduzir níveis de mRNAs e/ou proteínas alvo, por exemplo, através de knockdown mediado por RNaseH. Tais oligonucleotídeos são ativos na redução de níveis alvo.
[00897] Vários oligonucleotídeos Malat1 que foram projetados, construídos e testados compreendem uma ligação internucleotídica não negativamente carregada. Vários oligonucleotídeos Malat1 compreendem 1, 2 ou 3 ligações internucleotídicas não negativamente carregadas em um flanco e/ou um núcleo. Tabela 22C. Oligonucleotídeos Malat1 Todos os oligonucleotídeos nessa tabela têm a sequência de base de UGCCAGGCTGGTTATGACUC. Oligonucleotídeo Sequência Estereoquímica WV-8587 mU * SGeo m5Ceo SOOOSSRSSR m5Ceo mA * SG * SSRSSSSSS SG * RC * ST * SG * RG * ST * ST * RA * ST * S mG * S mA * S mC * S mU * S mC WV-14733 mU * SGeo m5Ceo SOOOSSSSSS m5Ceo mA * SG * SSSSSSSSS SG * SC * ST * SG * SG * ST * ST * SA * ST * S mG * S mA * S mC * S mU * S mC WV-15351 mU * SGeo m5Ceo SOOOSSnXSS m5Ceo mA * SG * nXSSnXSSSSSS SGn001C * ST * SGn001G * ST * STn001A * ST * S mG * S mA * S mC * S mU * S mC WV-15352 mU * SGeo m5Ceo SOOOSSnXSS m5Ceo mA * SG * RSSRSSSSSS SGn001C * ST * SG * RG * ST * ST * RA * ST * S mG * S mA * S mC * S mU * S mC WV-15353 mU * SGeo m5Ceo SOOOSSRSSnX m5Ceo mA * SG * SSRSSSSSS SG * RC * ST * SGn001G * ST * ST * RA * ST * S mG * S mA * S mC * S mU * S mC WV-15354 mU * SGeo m5Ceo SOOOSSRSSRSS m5Ceo mA * SG * nXSSSSSS SG * RC * ST * SG
* RG * ST * STn001A * ST * S mG * S mA * S mC * S mU * S mC WV-15356 mU * SGeo m5Ceo SOOOSSRnXnX m5Ceo mA * SG * RSSRSSSSSS SG * RCn001Tn001G * RG * ST * ST * RA * ST * S mG * S mA * S mC * S mU * S mC WV-15357 mU * SGeo m5Ceo SOOOSSRSSR m5Ceo mA * SG * nXnXRSSSSSS SG * RC * ST * SG * RGn001Tn001T * RA * ST * S mG * S mA * S mC * S mU * S mC WV-15358 mU * SGeo m5Ceo SOOOSSRSSRS m5Ceo mA * SG * SRnXnXSSSS SG * RC * ST * SG * RG * ST * ST * RAn001Tn001 mG * S mA * S mC * S mU * S mC WV-8582 mU * SGeo m5Ceo SOOOSSSSSSS m5Ceo mA * SG * SRSSSSSS SG * SC * ST * SG * SG * ST * ST *
RA * ST * S mG * S mA * S mC * S mU * S mC WV-15359 mU * SGeo m5Ceo SOOOSSSSSSS m5Ceo mA * SG * SnXnXnXSSSS SG * SC * ST * SG * SG * ST * STn001An001Tn001 mG * S mA * S mC * S mU * S mC WV-15360 mU * SGeo m5Ceo SOOOSSSSSSS m5Ceo mA * SG * SnXSSSSSS SG * SC * ST * SG * SG * ST * STn001A * ST * S mG * S mA * S mC * S mU * S mC WV-15361 mU * SGeo m5Ceo SOOOSSSSSSS m5Ceo mA * SG * SRSnXnXSSS SG * SC * ST * SG * SG * ST * ST * RA * STn001 mGn001 mA * S mC * S mU * S mC WV-15362 mU * SGeo m5Ceo SOOOSSSSSSS m5Ceo mA * SG * SRnXSSSSS SG * SC * ST * SG * SG * ST * ST * RAn001T * S mG * S mA * S mC * S mU * S mC WV-15363 mU * SGeo m5Ceo SOOOSSSSSSS m5Ceo mA * SG * SRSnXSSSS SG * SC * ST * SG * SG * ST * ST * RA * STn001 mG * S mA * S mC * S mU * S mC WV-14556 mUn001Geon001 nXnXnXOSSRS m5Ceon001 m5Ceo SRSSRSSSSSS mA * SG * SG * RC * ST * SG * RG * ST * ST * RA * ST * S mG * S mA * S mC * S mU * S mC WV-14557 mUn001Geon001 nXnXOnXSSRS m5Ceo m5Ceon001 SRSSRSSSSSS mA * SG * SG * RC * ST * SG * RG * ST * ST * RA * ST * S mG * S mA * S mC * S mU * S mC WV-14558 mUn001Geon001 nXnXOOnXSRS m5Ceo m5Ceo SRSSRSSSSSS mAn001G * SG * RC * ST * SG * RG * ST * ST * RA * ST * S mG * S mA *
S mC * S mU * S mC WV-14559 mUn001Geo nXOnXnXSSRSS m5Ceon001 RSSRSSSSSS m5Ceon001 mA * SG * SG * RC * ST * SG * RG * ST * ST * RA * ST * S mG * S mA * S mC * S mU * S mC WV-14560 mUn001Geo nXOnXOnXSRSS m5Ceon001 m5Ceo RSSRSSSSSS mAn001G * SG * RC * ST * SG * RG * ST * ST * RA * ST * S mG * S mA * S mC * S mU * S mC WV-14561 mUn001Geo m5Ceo nXOOnXnXSRSS m5Ceon001 RSSRSSSSSS mAn001G * SG * RC * ST * SG * RG * ST * ST * RA * ST * S mG * S mA * S mC * S mU * S mC WV-11533 mU * SGeon001 SnXnXnXSSRSS m5Ceon001 RSSRSSSSSS m5Ceon001 mA * SG * SG * RC * ST
* SG * RG * ST * ST * RA * ST * S mG * S mA * S mC * S mU * S mC WV-14562 mU * SGeon001 SnXnXOnXSRSS m5Ceon001 m5Ceo RSSRSSSSSS mAn001G * SG * RC * ST * SG * RG * ST * ST * RA * ST * S mG * S mA * S mC * S mU * S mC WV-14563 mU * SGeon001 SnXOnXnXSRSS m5Ceo m5Ceon001 RSSRSSSSSS mAn001G * SG * RC * ST * SG * RG * ST * ST * RA * ST * S mG * S mA * S mC * S mU * S mC WV-14564 mU * SGeo SOnXnXnXSRSS m5Ceon001 RSSRSSSSSS m5Ceon001 mAn001G * SG * RC * ST * SG * RG * ST * ST * RA * ST * S mG * S mA * S mC * S mU * S mC WV-14349 Mod098L001 mU * OSOOOSSRSSRS
SGeo m5Ceo m5Ceo SRSSSSSS mA * SG * SG * RC * ST * SG * RG * ST * ST * RA * ST * S mG * S mA * S mC * S mU * S mC Tabela 22D.
Dados de oligonucleotídeos Malat1 Os números representam o knockdown de mRNA Malat1 em relação a HPRT1, em que 1,000 pode representar nenhum (0,0%) knockdown e 0,000 representa 100,0% de knockdown; os resultados dos experimentos de réplica são mostrados.
WV-9491 é um controle negativo que não é projetado para ter como alvo Malat1. 0,004 uM 0,02 uM 0,1 uM WV-8587 1,23 1,21 0,94 0,95 0,84 0,81 0,54 0,53 0,61 WV-14733 1,81 1,06 1,36 1,47 1,12 1,17 0,98 0,97 0,72 WV-15351 1,27 0,92 1,00 0,89 0,95 0,92 0,74 0,66 0,71 WV-15352 1,49 1,78 1,52 0,88 0,83 0,91 0,50 0,52 0,73 WV-15353 0,85 0,91 1,10 0,65 0,59 0,68 0,44 0,42 0,40 WV-15354 1,31 1,00 0,90 0,69 0,94 0,79 0,56 0,87 0,74 WV-15356 0,77 0,87 0,68 0,49 0,67 0,63 0,30 0,35 0,31 WV-15357 0,91 1,02 1,13 0,66 0,75 0,79 0,37 0,32 0,36 WV-15358 0,80 0,82 0,90 0,83 0,85 0,85 0,36 0,45 0,43 WV-8582 1,11 1,06 1,15 1,30 1,15 1,14 0,67 0,85 1,06 WV-15359 1,16 1,26 1,02 0,92 0,83 0,83 0,85 0,90 WV-15360 1,57 1,38 1,31 1,05 0,99 0,83 1,03 0,91 0,80 WV-15361 0,92 1,11 1,00 0,71 0,63 0,68 0,74 1,09 0,73 WV-15362 1,23 1,22 1,07 0,90 0,83 0,82 0,99 0,97 0,80
WV-15363 1,16 1,03 0,85 0,89 0,87 0,90 1,10 1,18 1,01 WV-14556 0,81 0,84 0,91 0,46 0,42 0,58 0,15 0,23 0,17 WV-14557 0,75 1,10 0,96 0,46 0,40 0,54 0,19 0,19 0,21 WV-14558 0,96 1,11 0,90 0,77 1,08 0,78 1,27 0,40 0,45 WV-14559 0,80 0,62 0,75 0,35 0,36 0,37 0,12 0,17 0,13 WV-14560 1,11 0,99 1,03 0,44 0,48 0,60 0,29 0,31 0,15 WV-14561 0,71 0,73 1,04 0,47 0,41 0,48 0,22 0,24 0,16 WV-11533 0,74 0,75 0,87 0,40 0,37 0,41 0,14 0,14 0,09 WV-14562 0,79 0,60 0,60 0,53 0,45 0,64 0,22 0,33 0,24 WV-14563 0,76 0,96 0,79 0,57 0,51 0,53 0,23 0,23 0,24 WV-14564 0,72 0,65 0,70 0,58 0,47 0,50 0,17 0,20 0,21 WV-9491 1,02 0,96 1,28 0,82 0,93 1,27 0,88 0,91 1,06 WV-14349 1,07 1,34 1,03 0,86 0,77 1,11 0,63 0,60 0,79
[00898] Vários oligonucleotídeos Malat1 que foram projetados, construídos e testados compreendem uma ou mais ligações internucleotídicas não negativamente carregadas em um núcleo. Em várias modalidades de um oligonucleotídeo Malat1, um fosforotioato na configuração Rp é substituído por uma ligação internucleotídica não negativamente carregada. Tabela 22E. Dados de oligonucleotídeos Malat1 Os números representam o knockdown de mRNA Malat1 em relação a HPRT1, em que 1.000 pode representar nenhum (0,0%) knockdown e 0,000 representa 100,0% de knockdown; os resultados dos experimentos de réplica são mostrados. WV- WV- WV- WV- WV- WV- 8587 15351 15352 15353 15354 9491 0,004 1,23 1,27 1,49 0,85 1,31 1,02 uM 1,21 0,92 1,78 0,91 1,00 0,96 0,94 1,00 1,52 1,10 0,90 1,28
0,02 uM 0,95 0,89 0,88 0,65 0,69 0,82 0,84 0,95 0,83 0,59 0,94 0,93 0,81 0,92 0,91 0,68 0,79 1,27 0,1 uM 0,54 0,74 0,50 0,44 0,56 0,88 0,53 0,66 0,52 0,42 0,87 0,91 0,61 0,71 0,73 0,40 0,74 1,06
[00899] Vários oligonucleotídeos Malat1 que foram projetados, construídos e testados compreendem uma ligação internucleotídica não negativamente carregada. Vários oligonucleotídeos Malat1 compreendem 1 ou mais ligações internucleotídicas não negativamente carregadas. Tabela 22F. Dados de determinados oligonucleotídeos. Os números representam o knockdown de mRNA Malat1 em relação a HPRT1, em que 1.000 pode representar nenhum (0,0%) knockdown e 0,000 representa 100,0% de knockdown; os resultados dos experimentos de réplica são mostrados. WV-8587 WV-15356 WV-15357 WV-15358 WV-9491 0,004 1,23 0,77 0,91 0,80 1,02 uM 1,21 0,87 1,02 0,82 0,96 0,94 0,68 1,13 0,90 1,28 0,02 0,95 0,49 0,66 0,83 0,82 uM 0,84 0,67 0,75 0,85 0,93 0,81 0,63 0,79 0,85 1,27 0,1 uM 0,54 0,30 0,37 0,36 0,88 0,53 0,35 0,32 0,45 0,91 0,61 0,31 0,36 0,43 1,06
[00900] Vários oligonucleotídeos Malat1 que foram projetados, construídos e testados compreendem uma ligação internucleotídica não negativamente carregada. Vários oligonucleotídeos Malat1 compreendem 1 ou mais ligações internucleotídicas não negativamente carregadas. Em várias tabelas e ao longo do texto no presente documento, a presença ou ausência de um hífen na designação de um oligonucleotídeo é irrelevante. Por exemplo, WV8582 é equivalente a WV-8582. Tabela 22G. Dados de determinados oligonucleotídeos. Os números representam o knockdown de mRNA Malat1 em relação a HPRT1, em que 1.000 pode representar nenhum (0,0%) knockdown e 0,000 representa 100,0% de knockdown; os resultados dos experimentos de réplica são mostrados. WV- WV- WV- WV- WV- WV- WV- 8582 15359 15360 15361 15362 15363 9491 1,11 1,16 1,57 0,92 1,23 1,16 1,02 0,004 1,06 1,26 1,38 1,11 1,22 1,03 0,96 uM 1,15 1,02 1,31 1,00 1,07 0,85 1,28 1,30 0,92 1,05 0,71 0,90 0,89 0,82 1,15 0,83 0,99 0,63 0,83 0,87 0,93 0,02 uM 1,14 0,83 0,83 0,68 0,82 0,90 1,27 0,67 0,85 1,03 0,74 0,99 1,10 0,88 0,85 0,91 1,09 0,97 1,18 0,91 0,1 uM 1,06 0,90 0,80 0,73 0,80 1,01 1,06
[00901] Vários oligonucleotídeos Malat1 que foram projetados, construídos e testados compreendem uma ligação internucleotídica não negativamente carregada. Vários oligonucleotídeos Malat1 compreendem 1 ou mais ligações internucleotídicas não negativamente carregadas. Tabela 22H. Dados de determinados oligonucleotídeos. Os números representam o knockdown de mRNA Malat1 em relação a HPRT1, em que 1.000 pode representar nenhum (0,0%) knockdown e 0,000 representa 100,0% de knockdown; os resultados dos experimentos de réplica são mostrados.
0,004 uM 0,02 uM WV-11533 0,74 0,75 0,87 0,40 0,37 0,41 WV-14556 0,81 0,84 0,91 0,46 0,42 0,58 WV-14557 0,75 1,10 0,96 0,46 0,40 0,54 WV-14558 0,96 1,11 0,90 0,77 1,08 0,78 WV-14559 0,80 0,62 0,75 0,35 0,36 0,37 WV-14560 1,11 0,99 1,03 0,44 0,48 0,60 WV-14561 0,71 0,73 1,04 0,47 0,41 0,48 WV-14562 0,79 0,60 0,60 0,53 0,45 0,64 WV-14563 0,76 0,96 0,79 0,57 0,51 0,53 WV-14564 0,72 0,65 0,70 0,58 0,47 0,50 WV-9491 1,02 0,96 1,28 0,82 0,93 1,27 0,1 uM WV-11533 0,14 0,14 0,09 WV-14556 0,15 0,23 0,17 WV-14557 0,19 0,19 0,21 WV-14558 1,27 0,40 0,45 WV-14559 0,12 0,17 0,13 WV-14560 0,29 0,31 0,15 WV-14561 0,22 0,24 0,16 WV-14562 0,22 0,33 0,24 WV-14563 0,23 0,23 0,24 WV-14564 0,17 0,20 0,21 WV-9491 0,88 0,91 1,06
[00902] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos foram projetados, construídos e testados in vitro em relação aos oligonucleotídeos de referência testados que não compreendem quaisquer ligações internucleotídicas não negativamente carregadas, por exemplo, em Astrócitos iCell, em várias doses gimnóticas adequadas (por exemplo, 0,0,014,0,041,0,123,0,37,1,11,3,33,10 uM) por um período de tempo adequado, por exemplo, 2 dias.
[00903] As Tabelas 23, 24 e 25 apresentam resultados experimentais. Tabela 23 Dados de determinados oligonucleotídeos. Os números representam o knockdown de mRNA Malat1, em que 1,000 pode representar nenhum (0,0%) knockdown e 0,000 representa 100,0% de knockdown; os resultados dos experimentos de réplica são mostrados. Dose Oligonucleotídeo testado (fold change (uM) relativo Malat1/HPRT1) WV-8587 WV-9696 0 0,924 0,970 1,106 1,162 1,040 0,799 0,013717 0,833 0,930 0,730 0,997 0,844 0,918 0,041152 1,186 0,868 0,874 1,076 0,957 0,844 0,123457 0,772 0,827 0,658 0,970 0,756 0,821 0,37037 0,610 0,610 0,553 0,821 0,520 0,681 1,111111 0,394 0,360 0,425 0,431 0,419 0,402 3,333333 0,157 0,136 0,162 0,225 0,214 0,220 10 0,051 0,052 0,065 0,090 0,086 0,091 Dose Oligonucleotídeo testado (fold change (uM) relativo Malat1/HPRT1) WV-11114 WV-11533 0 0,761 0,881 1,212 0,958 0,985 1,056 0,013717 1,048 1,027 1,187 0,900 0,932 1,020 0,041152 0,912 0,958 1,108 0,453 0,503 0,479
0,123457 0,971 1,063 1,238 0,356 0,387 0,332 0,37037 0,706 0,846 0,692 0,105 0,107 0,096 1,111111 0,429 0,486 0,574 0,048 0,051 0,049 3,333333 0,181 0,196 0,203 0,033 0,032 0,030 10 0,080 0,075 0,087 0,026 0,034 0,031 Tabela 24 IC50 de certos oligonucleotídeos Malat1. Oligonucleotídeo IC50 WV-8587 757nM WV-9696 806nM WV-11114 894nM WV-11533 49nM
[00904] Entre outros fatores, a presente revelação demonstra que os oligonucleotídeos que compreendem uma ou mais ligações internucleotídicas não negativamente carregadas podem fornecer atividades drasticamente aprimoradas - conforme ilustrado na Tabela 24, um aprimoramento de mais de 15 vezes pode ser alcançado em termos de IC50.
[00905] Em outro experimento, vários oligonucleotídeos Malat1 incluindo WV-11533, que compreendem três ligações internucleotídicas neutras, foram avaliados para knockdown de Malat1, medidos por uma redução na abundância de um RNA Malat1, WV-7772, que é complementar aos oligonucleotídeos testados, na presença de RNaseH. Oligonucleot Descrição Sequência Nua Ligação/Estereoqu ídeo ímica WV-11533 mU * UGCCAGGCTG SnXnXnXSSRSSRSSRS SGeon001m5Ce GTTATGACUC SSSSS o n001m5Ceo n001mA * SG *
SG * RC * ST * SG * RG * ST * ST * RA * ST * SmG * SmA * SmC * SmU * SmC WV-8556 mU * UGCCAGGCTGG XOOOXXXXXX Geom5Ceom5Ce TTATGACUC XXXXXXXXX omA * G * G * C * T * G * G * T * T * A * T * mG * mA * mC * mU * mC WV-8587 mU * UGCCAGGCTGG SOOOSSRSSRSS SGeom5Ceom5C TTATGACUC RSSSSSS eomA * SG * SG * RC * ST * SG * RG * ST * ST * RA * ST * SmG * SmA * SmC * SmU * SmC WV-7772 rC rU rG rA CUGAGUCAUAACCAGCC OOOOOOOOOOOOOOOOO rG rU rC rA UGGCA OOOO rU rA rA rC rC rA rG rC rC rU rG rG rC rA WV-9696 L001mU * UGCCAGGCT OSOOOSSRSSRS SGeom5Ceom5C GGTTATGACUC SRSSSSSS eomA * SG * SG * RC * ST * SG * RG * ST * ST * RA * ST * SmG * SmA * SmC * SmU * SmC WV-11114 Mod091L001mU UGCCAGGCT OSOOOSSRSSRS * GGTTATGACUC SRSSSSSS SGeom5Ceom5C eomA * SG * SG * RC * ST * SG * RG * ST * ST * RA * ST * SmG * SmA * SmC * SmU * SmC
[00906] Em um pontos no tempo de 45 minutos, menos de 20% do RNA Malat1 permaneceu na presença de RNase H e WV-11533 ou WV-8587, indicando mais de 80% de knockdown; e cerca de 60% do RNA Malat1 permaneceu na presença de RNase H e WV-8556, que é estereoaleatório e não compreende uma cadeia principal neutra. Entre outros fatores, a presente revelação demonstra que os oligonucleotídeos que compreendem ligações internucleotídicas não negativamente carregadas e/ou ligações internucleotídicas quiralmente controladas mostrou atividades significativamente aprimoradas na redução de níveis de ácidos nucleicos alvo, por exemplo, através de knockdown mediado por RNase H.
[00907] Determinados oligonucleotídeos foram também testados para estabilidade em homogenato de fígado de rato a 0, 1 e 2 dias. Tanto para WV-11533 como para WV-8587, mais de 80% do oligonucleotídeo de comprimento total permaneceu em 2 dias; cerca de 40% do WV-8556 estereoaleatório permaneceu.
[00908] Os oligonucleotídeos também foram testados para Tm com o RNA Malat1, WV-7772. Um conjunto exemplificativo de condições de teste: Duplex 1 µM em 1X PBS (pH 7,2); Faixa de Temperatura: 15 °C a 90 °C; Taxa de Temperatura: 0,5 °C/min; Intervalo de Medição: 0,5 °C. Os resultados mostraram o seguinte duplex Tm (°C) com WV-7772: WV-8556, 73,52; WV-8587, 69,57; e WV-11533, 68,67.
[00909] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos que compreendem ligações internucleotídicas não negativamente carregadas fornecem atividades de modulação de splicing aprimoradas. Vários oligonucleotídeos para mediar o salto de um éxon em DMD foram preparados e/ou testados, em que os oligonucleotídeos compreendem ligações internucleotídicas não negativamente carregadas. Determinados oligonucleotídeos que compreendem ligações internucleotídicas não negativamente carregadas são listados na Tabela A1. Tabela 25A. Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos. Os números indicam o nível de salto de éxon; por exemplo, 27,13 na coluna 2, fileira 2, representa 27,13% de salto de um éxon DMD. Os oligonucleotídeos foram testados in vitro em células a 10 ou 3 uM. Oligonucleotídeo 10 uM 3 uM WV-9898 27,13 13,38 11,27 9,69 WV-9897 33,61 31,46 11,82 9,52 WV-9517 20,21 12,08 6,72 6,89
WV-11342 44,84 41,17 19,22 18,43 WV-11341 38,85 44,85 18,95 20,63 WV-11340 41,51 43,08 17,79 16,4 PMO 3,89 4,05 2,08 1,52 Mock 0,49 0,53 0,45 0,52 Tabela 25B. Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos. Os números indicam o nível de salto de éxon em relação ao controle; os números são aproximados. Os oligonucleotídeos foram testados in vitro em células a 10 ou 3 uM. PMO indica um oligonucleotídeo todo PMO. Mock WV-11237 WV-3152 WV-3516 PMO 10 uM 1 49 35 7 3 3 uM 1 22 16 3 2
[00910] Vários oligonucleotídeos DMD para salto de éxon 23 em camundongos foram construídos, vários dos quais compreendem uma ligação internucleotídica não negativamente carregada, incluindo WV-11343, WV-11344, WV- 11345, WV-11346, e WV-11347. Esses oligonucleotídeos foram testados e demonstraram o salto do éxon 23, conforme mostrado na tabela abaixo. Tabela 25C.1. Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos. Os números representam o nível de salto do éxon 23 em relação ao controle. 10 uM 3,3 uM WV-7684 5 2 WV-10256 25 13
WV-11343 44 33 WV-10257 16 10 WV-11344 42 29 WV-10258 22 20 WV-11345 48 39 WV-10259 24 10 WV-11346 43 32 WV-10260 23 14 WV-11347 43 32
[00911] Em alguns experimentos, células del45-52 (mioblastos derivados do paciente) foram tratadas com vários oligonucleotídeos, incluindo WV-13405 (PMO), WV-9517 e WV-9898, em meio de diferenciação muscular a 15, 10, 3,3, 1,1, 0,3, 0,1 e 0 uM sob condições de absorção livre por 6 dias antes de serem coletados e analisados quanto à restauração de proteína distrofina por Western blot. WV-9517 e WV-9898 demonstraram produção de DMD significativa a concentrações de 3,3 uM e superiores; WV-13405 não mostrou produção de DMD significativa a uma concentração de 3,3 uM, porém mostrou produção de DMD a concentrações de 10 e 15 uM. O controle foi Vinculina.
[00912] Conforme mostrado na Tabela 25D, os oligonucleotídeos adicionais que foram construídos foram capazes de mediar o salto do éxon 53 e compreendem pelo menos uma ligação internucleotídica neutra.
[00913] Vários oligonucleotídeos DMD adicionais para salto do éxon 23 em camundongos foram construídos. Esses oligonucleotídeos foram testados e demonstraram o salto do éxon 23, conforme mostrado na tabela abaixo.
Tabela 25C.2. Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos.
Os oligonucleotídeos DMD foram testados in vitro quanto à sua capacidade de ignorar o éxon 23 DMD em células H2K murinas.
A entrega de oligonucleotídeo foi gimnótica, e tratamento de 4 dias foi usado.
Os números representam o nível de salto do éxon 23 em relação ao controle. 100,0 pode representar 100% de transcrições ignoradas; 0 pode representar 0% de transcrições ignoradas.
Os dados de réplicas são mostrados.
WV-11345 WV-24092 WV-24098 Mock 10 uM 37,8 39,8 30,2 32,4 41,5 40,2 0 0 3,3 uM 22,4 22,9 13,4 14,5 24,3 23,5 0 0 1,1 uM 9,2 8,1 3 3,1 10,5 9,9 0 0 Tabela 25C.3. Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos.
Os oligonucleotídeos DMD foram testados in vitro quanto à sua capacidade de ignorar o éxon 23 DMD em células H2K murinas.
A entrega de oligonucleotídeo foi gimnótica, e tratamento de 4 dias foi usado.
Os números representam o nível de salto do éxon 23 em relação ao controle. 100,0 pode representar 100% de transcrições ignoradas; 0 pode representar 0% de transcrições ignoradas.
Os dados de réplicas são mostrados. 10 3,3 1,1 uM uM uM 22,9 11,6 3,8 WV-10258 34,2 17,8 6,1 WV-12885 32,4 18,6 6,9
23,7 10,6 3,8 WV-23576 25,6 11,5 3,3 23,3 13,9 6,6 WV-23577 22 11,8 4,9 WV-23578 16,1 13,9 7,1 19,2 8,3 6,7 WV-23579 20,7 29,8 5,5 18,8 9,2 3,5 WV-23937 6,3 4,2 1,3 26,4 16 6,9 WV-23938 30,3 16,7 7,3 35,2 23,3 11,8 WV-23939 33,6 22 12,9 0 0 0 Mock 0 0 0 Tabela 25C.4. Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos.
Os oligonucleotídeos DMD foram testados in vitro quanto à sua capacidade de ignorar o éxon 23 DMD em células H2K murinas.
A entrega de oligonucleotídeo foi gimnótica, e tratamento de 4 dias foi usado.
Alguns dos oligonucleotídeos testados compreendem um ou mais LNA.
Os números representam o nível de salto do éxon 23 em relação ao controle. 100,0 pode representar 100% de transcrições ignoradas; 0 pode representar 0% de transcrições ignoradas.
Os dados de réplicas são mostrados.
WV-10258 WV-25536 WV-25537 WV-25539 Mock 10 uM 22,9 2,3 10,7 11,8 15,1 12,5 8,1 0 0
3,3 uM 11,6 1,5 3,6 7,3 9,9 5,6 3,8 0 0 1,1 uM 3,8 1,1 1,3 2,7 4,2 1,8 2,3 0 0 Tabela 25C.5. Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos.
Os oligonucleotídeos DMD foram testados in vitro quanto à sua capacidade de ignorar o éxon 23 DMD em células H2K murinas.
A entrega de oligonucleotídeo foi gimnótica, e tratamento de 4 dias foi usado.
Alguns dos oligonucleotídeos testados compreendem uma ou mais ligações internucleotídicas não negativamente carregadas.
Os números representam o nível de salto do éxon 23 em relação ao controle. 100,0 pode representar 100% de transcrições ignoradas; 0 pode representar 0% de transcrições ignoradas.
Os dados de réplicas são mostrados. 10 uM 3,3 uM 1,1 uM 10 uM 3,3 uM 1,1 uM WV-10258 22,9 11,6 3,8 WV-23939 35,2 23,3 11,8 33,6 22 12,9 WV-11345 37,8 22,4 9,2 WV-24092 30,2 13,4 3 39,8 22,9 8,1 32,4 14,5 3,1 WV-12885 34,2 17,8 6,1 WV-24098 41,5 24,3 10,5 32,4 18,6 6,9 40,2 23,5 9,9 WV-23576 23,7 10,6 3,8 WV-25536 2,3 1,5 1,1 25,6 11,5 3,3 10,7 3,6 1,3 WV-23577 23,3 13,9 6,6 WV-25537 11,8 7,3 2,7 15,1 9,9 4,2 WV-23578 22 11,8 4,9 WV-25539 12,5 5,6 1,8 16,1 13,9 7,1 8,1 3,8 2,3 WV-23579 19,2 8,3 6,7 Mock 0 0 0 20,7 29,8 5,5 0 0 0
WV-23937 18,8 9,2 3,5 6,3 4,2 1,3 WV-23938 26,4 16 6,9 30,3 16,7 7,3 Tabela 25C.6. Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos.
Os oligonucleotídeos que têm como alvo Malat-1, em que os oligonucleotídeos compreendem uma ligação internucleotídica não negativamente carregada, foram testados quanto à sua capacidade de realizar knockdown de Malat-1 em neurônios GABA in vitro, com tratamento de 4 dias.
Os números representam o nível de Malat-1 em relação a controle de HPRT1 e água, em que 1,0 pode representar 100% de nível de Malat-1 (0% de knockdown) e 0 pode representar 0% de nível de Malat-1 (100% de knockdown). As concentrações (Conc.) testadas são fornecidas como [Log (dose uM)]. Os dados de réplicas são mostrados.
Conc.
WV-24104 WV-24109 -4,70927 0,891 0,837 0,814 1,059 -4,40824 0,942 1,052 0,765 1,208 -4,10721 0,948 1,030 0,754 1,104 -3,80618 0,855 1,143 0,792 1,059 -3,50515 1,067 1,234 0,831 0,891 -3,20412 0,797 0,968 0,760 1,045 -2,90309 0,968 0,825 0,675 1,067 -2,60206 0,825 1,016 0,765 1,135 -2,30103 1,059 0,872 0,648 0,613 -2 0,988 1,067 0,413 0,548 -1,70927 0,754 0,955 0,357 0,362
-1,69897 0,922 0,797 0,313 0,340 -1,40824 0,666 0,739 0,220 0,227 -1,10721 0,548 0,604 0,162 0,170 -0,80618 0,404 0,427 0,096 0,098 -0,50515 0,352 0,427 0,062 0,053 -0,20412 0,272 0,206 0,027 0,027 0,09691 0,132 0,103 0,013 0,014 0,39794 0,061 0,058 0,008 0,011 0,69897 0,028 0,032 0,007 0,008 1 0,018 0,019 0,008 0,009 1,30103 0,016 0,015 0,009 0,010
IC50 de WV-24104 foi 132 nM; e IC50 de WV-24109 foi 12 nM.
Tabela 25D.
Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos.
D45-52 mioblastos foram tratados por 4 dias com oligonucleotídeo 10 e 3 uM.
Os números nessa e em várias outras tabelas indicam a quantidade de salto em relação ao controle. 10 uM 3 uM mock 0,9 1,0 0,5 0,8 0,9 0,9 1,0 1,0 WV-9517 20,1 18,9 18,3 19,3 9,0 8,9 7,7 7,6 WV-11340 28,9 29,4 26,7 26,7 12,8 12,6 11,5 11,4 WV-11342 18,7 17,9 20,4 20,0 8,3 8,3 7,6 7,7 WV-12553 17,0 19,2 20,0 18,6 8,1 8,1 7,8 8,3 WV-12123 21,7 22,7 21,6 22,4 9,5 9,6 9,9 9,6 WV-12124 17,6 17,5 16,5 17,6 6,7 6,9 7,2 7,0 WV-12125 39,5 38,6 40,6 39,4 18,5 16,8 17,9 17,6
WV-12126 31,2 31,1 32,3 32,2 14,7 14,3 14,1 14,7 WV-12127 36,8 38,0 37,0 38,3 17,4 16,9 17,0 16,9 WV-12128 27,0 26,3 26,3 26,8 10,1 10,8 10,1 10,0 WV-12129 32,9 33,5 35,1 35,3 14,8 14,9 16,0 16,0
10 uM 3 uM Mock 1,6 1,5 1,8 1,8 1,7 1,6 1,5 1,7 WV-9517 30,3 31,1 32,4 29,2 14,1 13,9 13,5 14,5 WV-11340 48,7 50,3 45,1 44,6 24,0 25,8 23,8 23,3 WV-12553 28,7 27,8 27,5 27,0 13,5 13,6 13,1 13,8 WV-9897 39,7 38,5 37,3 35,6 18,8 19,1 18,0 17,7 WV-11341 47,1 47,4 21,8 22,5 22,5 23,1 WV-12555 55,7 54,7 55,7 54,6 27,1 27,7 26,0 26,0 WV-12558 36,0 35,8 49,9 47,3 21,2 19,8 22,1 22,1 WV-9898 43,6 41,7 38,0 38,8 21,1 20,6 WV-11342 43,7 44,3 42,1 41,8 22,5 20,9 19,0 20,1 WV-12556 46,1 46,4 45,6 44,0 24,2 23,1 21,3 21,0 WV-12559 47,4 45,1 45,6 47,2 21,0 21,7 24,5 22,6
10 uM 3 uM Mock 1,7 1,6 1,8 1,7 1,7 1,7 1,6 1,5 WV-9517 29,8 29,8 28,7 29,2 15,6 15,4 16,0 16,2 WV-11340 45,7 44,5 46,1 47,3 25,7 24,0 23,8 24,4 WV-11342 44,6 46,6 45,3 44,2 21,5 21,0 19,8 20,3 WV-12876 42,4 43,3 41,2 41,0 26,2 26,3 24,5 26,0 WV-12877 53,7 53,8 52,4 52,3 37,8 36,5 34,3 32,9 WV-12878 48,5 48,3 45,1 46,2 31,4 30,9 29,3 30,0 WV-12879 34,1 34,9 33,2 34,0 19,7 19,8 21,4 21,1 WV-12880 50,4 50,1 51,4 52,1 33,0 32,5 32,9 32,0
WV-12881 41,6 42,9 38,8 39,4 26,1 25,6 24,3 22,7 WV-12882 29,6 29,7 32,3 31,3 15,3 15,1 15,5 15,2 WV-12129 57,8 57,0 55,5 55,6 33,1 32,2
[00914] Vários oligonucleotídeos DMD que compreendem uma cadeia principal neutra quiralmente controlada foram construídos, incluindo WV-12555, que compreende uma ligação internucleotídica neutra na configuração Rp, e WV- 12558, que compreende uma ligação internucleotídica neutra na configuração Sp. Esses também foram testados para salto de um éxon DMD, conforme mostrado na Tabela 25E. Tabela 25E. Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos. D45-52 mioblastos foram tratados por 4 dias com oligonucleotídeo 10 e 3 uM. Oligonucleotídeos foram entregues gimnoticamente. Os números representam a quantidade de salto em relação ao controle. MOCK WV-9517 WV-11340 WV-9897 WV-11341 WV-12555 WV-12558 1,6 30,3 48,7 39,7 47,1 55,7 36,0 1,5 31,1 50,3 38,5 47,4 54,7 35,8 1,8 32,4 45,1 37,3 55,7 49,9 10 uM 1,8 29,2 44,6 35,6 54,6 47,3 1,7 14,1 24,0 18,8 21,8 27,1 21,2 1,6 13,9 25,8 19,1 22,5 27,7 19,8 1,5 13,5 23,8 18,0 22,5 26,0 22,1 3 uM 1,7 14,5 23,3 17,7 23,1 26,0 22,1
[00915] Em algumas modalidades, > aumento de 2 vezes na eficiência de salto de éxon foi obtido. Tabela 25F. Dados exemplificativos de determinados oligonucleotídeos. Vários oligonucleotídeos DMD para salto de éxon 53 ou 51 foram incubados em lisado de tecido por 5 dias; os oligonucleotídeos de comprimento total detectados por LC-MS. Os números representam uma porcentagem do oligonucleotídeo de comprimento total restante. Mais de 75% dos oligonucleotídeos permaneceram em lisados musculares humanos e de MDX em de incubação. Os dados de um experimento anterior foram realizados para WV-3473, com 2ª incubação em lisado muscular de MDX. ND: Não determinado; a estabilidade de WV-3473 em lisado muscular humano não foi realizada. Músculo de Fígado Músculo Rim camundongo Humano Humano Humano
MDX WV-9517 82,4 77,8 84 73,7 3,08 7,9 2,01 3,59 WV-9897 88,3 82 96,1 75,2 9,12 4,2 5,5 3,8 WV-9898 74 75,8 96,8 81,5 5,07 6,4 8,9 5 WV-3473 69,8 69,8 ND 24 5,91 5,91 ND 0,15
[00916] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo que compreende uma ligação internucleotídica neutra (por exemplo, um tipo de guanidina cíclica) demonstrou um nível mais alto de salto de éxon que um oligonucleotídeo correspondente que não compreende tal ligação internucleotídica neutra.
[00917] Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a um oligonucleotídeo ou uma composição de oligonucleotídeo que tem capacidade para mediar interferência de RNA de fita simples, em que o oligonucleotídeo ou composição de oligonucleotídeo compreende uma ligação internucleotídica não negativamente carregada.
[00918] Conforme descrito no presente documento, vários oligonucleotídeos que compreendem uma ligação internucleotídica não negativamente carregada e que têm como alvo qualquer um dentre vários genes diferentes, com sequências de base diferentes, padrões de modificações de açúcar, química de cadeia principal e padrões de estereoquímica de ligações internucleotídicas de cadeia principal foram construídos, incluindo, porém sem limitação vários oligonucleotídeos que têm como alvo C9orf72 (um gene diferente de DMD, ou Malat1).
[00919] São descritos no presente documento vários exemplos não limitantes de oligonucleotídeos que têm como alvo C9orf72 (que é um gene diferente dos outros genes mencionados no presente documento) e que compreendem uma ligação internucleotídica não negativamente carregada.
[00920] Uma expansão de repetição de hexanucleotídeo no gene C9orf72 (Cromossomo 9, quadro de leitura aberta 72) é supostamente a causa genética mais frequente de esclerose lateral amiotrófica (ALS) e demência frontotemporal (FTD). As variantes de gene C9orf72 que compreendem a expansão de repetição e/ou produtos da mesma também são associadas a outros distúrbios relacionados a C9orf72, tais como síndrome de degeneração corticobasal (CBD), síndrome parkinsoniana atípica, degeneração olivopontocerebelar (OPCD), esclerose lateral primária (PLS), atrofia muscular progressiva (PMA), fenocópia de doença de Huntington (HD), doença de Alzheimer (AD), distúrbio bipolar, esquizofrenia e outros distúrbio não motores. Vários oligonucleotídeos que foram projetados e construídos compreendem uma ligação internucleotídica neutra e que têm como alvo um alvo C9orf72 (por exemplo, um oligonucleotídeo C9orf72) e têm capacidade para realizar knockdown ou diminuir a expressão, nível e/ou atividade do gene alvo C9orf72 e/ou um produto de gene do mesmo (uma transcrição, particularmente uma transcrição contendo expressão de repetição, uma proteína, etc.).
[00921] Vários oligonucleotídeos projetados para ter como alvo C9orf72 e que compreendem uma ligação internucleotídica não negativamente carregada incluem, porém sem limitação: WV-11532, WV-13305, WV-13307, WV-13309, WV- 13311, WV-13312, WV-13313, WV-13803, WV-13804, WV-13805, WV- 13806, WV-13807, WV-13808, WV-14553, e WV-14555. Esses são descritos abaixo na Tabela 25G. Tabela 25G. Os oligonucleotídeos que têm como alvo C9orf72 compreendem uma ligação internucleotídica neutra. Sequência Oligonucleotídeo Sequência Estereoquímica Nua mC * Sm5Ceon001 Teon001 m5Ceon001 mA * SC * ST * SC CCTCACTCACCC SnXnXnXSSSRSSR WV-11532 * RA * SC * SC *
ACTCGCCA SSSSSSSS RC * SA * SC * ST * SmC * SmG * SmC * SmC * SmA m5Ceo * CCTCACTCACCC RnXnXnXRSSRSSR WV-13305 Rm5Ceon001
ACTCGCCA SSSSSSSS Teon001 m5Ceon001
Sequência Oligonucleotídeo Sequência Estereoquímica Nua Aeo * RC * ST * SC * RA * SC * SC * RC * SA * SC * ST * SmC * SmG * SmC * SmC * SmA m5Ceo * Sm5Ceon001 Teon001 m5Ceon001 Aeo * RC * ST * SC CCTCACTCACCC SnXnXnXRSSRSSR WV-13307 * RA * SC * SC * ACTCGCCA SSSSSSSS RC * SA * SC * ST * SmC * SmG * SmC * SmC * SmA m5Ceo * Rm5Ceon001 Teon001 m5Ceon001 Aeo * RC * ST * SC CCTCACTCACCC RnXnXnXRSSRSSS WV-13309 * RA * SC * SC * ACTCGCCA RSSSSSSS SC * RA * SC * ST * SmC * SmG * SmC * SmC * SmA m5Ceo * Sm5Ceon001 Teon001 m5Ceon001 CCTCACTCACCC SnXnXnXRSSRSSS WV-13311 Aeo * RC * ST * SC ACTCGCCA RSSSSSSS * RA * SC * SC * SC * RA * SC * ST
Sequência Oligonucleotídeo Sequência Estereoquímica Nua * SmC * SmG * SmC * SmC * SmA mC * Sm5Ceon001 Teon001 m5Ceon001 mA * SC * ST * SC CCTCACTCACCC SnXnXnXSSSR WV-13312 * RA * SC * SC *
ACTCGCCA SSSSSSSSSSS SC * SA * SC * ST * SmC * SmG * SmC * SmC * SmA m5Ceo * Rm5Ceon001 Teon001 m5Ceon001 Aeo * CCTCACTCACCC RnXnXnXRSSR WV-13313 RC * ST * SC * RA
ACTCGCCA SSSSSSSSSSS * SC * SC * SC * SA * SC * ST * SmC * SmG * SmC * SmC * SmA Teo * Geon001 m5Ceon001 m5Ceon001 Geo * C TGCCGCCTCCT XnXnXnXXXXXXX WV-13803 * C * T * C * C *
CACTCACCC XXXXXXXXX T * C * A * C * T * mC * mA * mC * mC * mC Teo * Geom5Ceom TGCCGCCTCCT XOOOXXXXXXXXX WV-13804 5CeoGeo * C * C * CACTCACCC XXnXnXnXX
Sequência Oligonucleotídeo Sequência Estereoquímica Nua T * C * C * T * C * A * C * T * mCn001 mAn001 mCn001 mC * mC Teo * Geon001 m5Ceon001 m5Ceon001 Geo * C TGCCGCCTCCT XnXnXnXXXXXXXX WV-13805 * C * T * C * C * CACTCACCC XXXXnXnXnXX T * C * A * C * T * mCn001 mAn001 mCn001 mC * mC Geo * m5Ceon001 Geon001 m5Ceon001 Geo * A * C * T * GCGCGACTCCT XnXnXnXXXXXXXX WV-13806 C * C * T * G * A
GAGTTCCAG XXXXOOOX * G * T * Teom5Ceom5CeoAeo * Geo Geo * m5CeoGeom5CeoGeo * A * C * T * C * C * T * G * A * G GCGCGACTCCT XOOOXXXXXXXXXX WV-13807 * T * Teon001 GAGTTCCAG XnXnXnXX m5Ceon001 m5Ceon001 Aeo * Geo WV-13808 Geo * m5Ceon001 GCGCGACTCCT XnXnXnXXXXXXXXX
Sequência Oligonucleotídeo Sequência Estereoquímica Nua Geon001 m5Ceon001 GAGTTCCAG XXXnXnXnXX Geo * A * C * T * C * C * T * G * A * G * T * Teon001 m5Ceon001 m5Ceon001 Aeo * Geo m5Ceo * Rm5Ceon001 Teon001 m5Ceon001 Aeo * RC * ST * SC CCTCACTCACCC RnXnXnXRSSRSSR WV-14553 * RA * SC * SC * ACTCGCCA SSSRSSSS RC * SA * SC * ST * Rm5Ceo * SmG * SmC * SmC * SmA m5Ceo * Rm5Ceon001 Teon001 m5Ceon001 Aeo * RC * ST * SC CCTCACTCACCC RnXnXnXRSSRSSS WV-14555 * RA * SC * SC * ACTCGCCA RSSRSSSS SC * RA * SC * ST * Rm5Ceo * SmG * SmC * SmC * SmA Diversas variantes de um mRNA C9orf72 são produzidas a partir do gene C9orf72: V2 (que não compreende a repetição de hexanucleotídeo deletéria e que compreende cerca de 90% de todas as transcrições); V3 (que compreende a repetição de hexanucleotídeo e compreende cerca de 9% de todas as transcrições); e V1 (que compreende a repetição de hexanucleotídeo e compreende cerca de 1% de todas as transcrições). As repetições de hexanucleotídeo supostamente elicitam o ganho de toxicidades de função, pelo menos parcialmente mediado pelas proteínas de repetição de dipeptídeo e formação de focos, por exemplo, por meio de transcrições contendo expansão de repetição e/ou íntrons contendo expansão de repetição submetida a splicing e/ou transcrição antissenso da região contendo expansão de repetição e várias proteínas de ligação de ácido nucleico. Tanto WV-8008 como WV-11532 têm a mesma sequência de base (ou sequência nua), CCTCACTCACCCACTCGCCA. Eles diferem, entre outros, pelo fato de que o último compreende 3 ligações internucleotídicas neutras contíguas (Xn), porém o primeiro não compreende quaisquer ligações internucleotídicas neutras. As estruturas desses oligonucleotídeos é fornecida abaixo, na Tabela 25H. Tabela 25H. Oligonucleotídeos C9orf72. Oligonucleotídeo Sequência Estereoquímica m5Ceo * Rm5CeoTeom5CeoAeo * RC * ST * SC * RA * SC * SC * RC ROOORSSRSSRS WV-8008 * SA * SC * ST * SmC * SmG * SSSSSSS SmC * SmC * SmA mC * Sm5Ceon001Teon001m5Ceon001mA * SnXnXnXSSSRSS WV-11532 SC * ST * SC * RA * SC * SC *
RSSSSSSSS RC * SA * SC * ST * SmC * SmG * SmC * SmC * SmA WV-8008 e WV-11532 foram testados quanto à sua capacidade realizar knockdown da expressão de transcrição compreendendo hexanucleotídeo (isto é, associada à doença) V3 em comparação com as transcrições totais (todas V), conforme mostrado abaixo na Tabela 25I.
Tabela 25I e J.
Atividade de vários oligonucleotídeos c9orf72. Nas Tabelas 25I a 25J, vários oligonucleotídeos c9orf72 foram testados em neurônios motores, com os oligonucleotídeos gimnoticamente entregues a concentrações de 0,003 a 10 µM (As concentrações são fornecidas como exp10). O oligonucleotídeo c9orf72 testado WV-11532 compreende três ligações internucleotídicas neutras.
Nas Tabelas 14A e 14B, são mostrados os níveis residuais de transcrições c9orf72 [por exemplo, todas as transcrições (todas V) ou apenas V3] em relação a HPRT1, após o tratamento com oligonucleotídeos c9orf72, em que 1,000 pode representar 100% de nível de transcrição relativo (se, knockdown) e 0,000 pode representar 0% de nível de transcrição relativo (por exemplo, 100% de knockdown). Os resultados de experimentos de réplica são mostrados.
Tabela 25I.
Atividade de vários oligonucleotídeos c9orf72 (nível residual de todas as transcrições V C9orf72) Conc.
WV-8008 WV-11532 -2,495 0,999 0,958 0,913 1,006 0,894 0,900 -1,796 0,965 0,864 0,882 0,972 0,829 0,858 -1,097 1,006 0,900 0,932 0,907 0,888 0,858 -0,398 0,800 0,742 0,806 0,795 0,747 0,742 0,301 0,624 0,611 0,687 0,562 0,554 0,554 1 0,524 0,500 0,521 0,409 0,411 0,387 Tabela 25J.
Atividade de vários oligonucleotídeos c9orf72 (nível residual de transcrições V3 C9orf72) Conc. WV-8008 WV-11532 -2,495 0,947 0,871 1,014 0,927 0,853 0,908 -1,796 0,877 0,841 0,908 0,836 0,769 0,841 -1,097 0,665 0,743 0,871 0,620 0,633 0,717 -0,398 0,555 0,427 0,707 0,421 0,415 0,427 0,301 0,210 0,178 0,304 0,096 0,105 0,094 1 0,056 0,071 0,083 0,012 0,015 0,015
[00922] Conforme descrito no presente documento e nos dados não mostrados, vários oligonucleotídeos que compreendem uma ligação internucleotídica não negativamente carregada e que têm como alvo genes diferentes, com sequências de base diferentes, padrões of modificações de açúcar, químicas de cadeia principal, e padrões de estereoquímica de ligações internucleotídicas de cadeia principal foram construídos, incluindo, porém sem limitação vários oligonucleotídeos que têm como alvo DMD, Malat1 ou C9orf72.
[00923] Os oligonucleotídeos que compreendem uma ligação internucleotídica não negativamente carregada também foram construídos para ter como alvo seis outros genes não descritos no presente documento (em que os seis genes não eram DMD, Malat1 ou C9orf72); esses oligonucleotídeos incluem oligonucleotídeos projetados para ter como alvo esses genes e reduz a expressão, nível e/ou atividade do gene ou seu produto de gene. Esses e vários oligonucleotídeos que compreendem uma ligação internucleotídica neutra descrita no presente documento têm capacidade de realizar várias funções, incluindo reduzir o nível, expressão e/ou atividade de um gene ou seu produto de gene (por exemplo, através de um mecanismo mediado por RNaseH- ou impedimento estérico, ou por meio de um mecanismo mediado por interferência de RNA de fita simples) e que induz o salto de um éxon (por exemplo, modulação de salto).
[00924] Sem se ater a nenhuma teoria particular, o requerente observa que uma ligação internucleotídica não negativamente carregada e/ou neutra pode aprimorar a entrada de um oligonucleotídeo em uma célula e/ou escapar de um endossoma. Oligonucleotídeos Que Compreendem uma Ligação Internucleotídica Não Negativamente Carregada Podem Fornecer Níveis Desejados de Ativação de TLR9
[00925] Entre outros fatores, os oligonucleotídeos que compreendem ligações internucleotídicas não negativamente carregadas podem fornecer níveis desejados de propriedades e/ou atividades, por exemplo, atividades antagonistas ou agonistas de TLR9. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos que compreendem ligações internucleotídicas não negativamente carregadas demonstram níveis mais baixos de ativação de TLR9 em ser humano e/ou um modelo animal (por exemplo, um camundongo) em comparação com determinados oligonucleotídeos comparáveis da mesma sequências de base, mas que não têm ligações internucleotídicas não negativamente carregadas. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos que compreendem ligações internucleotídicas não negativamente carregadas têm toxicidade mais baixa em comparação com determinados oligonucleotídeos das mesmas sequências de base, mas que não têm ligações internucleotídicas não negativamente carregadas. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada está dentro de um motivo de CpG e é a ligação internucleotídica entre o C e
G.
[00926] Em um experimento, vários oligonucleotídeos que têm como alvo o gene C foram construídos. O gene C é um gene diferente de DMD, ou SMalat-1. A sequência desses oligonucleotídeos compreende um CpG, um motivo conhecido por ativar TLR9.
[00927] Tabela 25K.
[00928] Esse experimento representa um teste de indução de TLR9 humano ou TLR9 camundongo em células HEK293. Os números representam um controle indutivo relativo em relação ao controle negativo, água. Concentrações testadas: 0,93 uM, 2,77 uM, 8,33 uM, 25 uM, 75 uM. Controle positivo: WV-BZ21. O experimento foi realizado em duplicatas biológicas.
[00929] Tabela 25K. Oligonucleotídeos usados nesse estudo Oligonucleotídeo Sequência Estereoquímica WV-HZ12 mN * SOOOS SSRSS Sm5NeoNeom5NeomN RSSSSSSSS * SN * SN * SN * RN * SN * SN * RN * SN * SN * SN * SmC * SmG * SmN * SmN * SmN WV-BZ761 mN * SOOOS SSRSS Sm5NeoNeom5NeomN RSSSSOSSS * SN * SN * SN * RN * SN * SN * RN * SN * SN * SN * SmCmG * SmN * SmN * SmN
WV-BZ762 mN * SOOOS SSRSS Sm5NeoNeom5NeomN RSSSSOSSS * SN * SN * SN * RN * SN * SN * RN * SN * SN * SN * Sm5CeomG * SmN * SmN * SmN WV-BZ763 mN * SOOOS SSRSS Sm5NeoNeom5NeomN RSSSSSSSS * SN * SN * SN * RN * SN * SN * RN * SN * SN * SN * Sm5Ceo * SmG * SmN * SmN * SmN WV-BZ764 mN * SOOOS SSRSS Sm5NeoNeom5NeomN RSSSROSSS * SN * SN * SN * RN * SN * SN * RN * SN * SN * SN * Rm5CeomG * SmN * SmN * SmN WV-BZ765 mN * SOOOS SSRSS RSSSRSS Sm5NeoNeom5NeomN SS * SN * SN * SN * RN * SN * SN * RN * SN * SN * SN * Rm5Ceo * SmG * SmN * SmN * SmN WV-BZ766 mN * SOOOS SSRSS Sm5NeoNeom5NeomN RSSSSSSSS
* SN * SN * SN * RN * SN * SN * RN * SN * SN * SN * Sm5mC * SmG * SmN * SmN * SmN WV-BA207 mN * SOOOS SSRSS Sm5NeoNeom5NeomN SRSSSnXSSS * SN * SN * SN * RN * SN * SN * SN * RN * SN * SN * SmCn001mG * SmN * SmN * SmN WV-BA208 m5Neo * ROOOR SSRSS Rm5NeoNeom5NeoNeo RSSSSnXSSS * RN * SN * SN * RN * SN * SN * RN * SN * SN * SN * SmCn001mG * SmN * SmN * SmN WV-BA209 m5Neo * ROOOR SSRSS Rm5NeoNeom5NeoNeo SRSSSnXSSS * RN * SN * SN * RN * SN * SN * SN * RN * SN * SN * SmCn001mG * SmN * SmN * SmN WV-BZ21 T * C * G * T * C XXXXX XXXXX XXXXX * G * T * T * T * XXXXX XXX T * G * T * C * G * T * T * T * T *
G * T * C * G * T * T Tabela 25L.
Atividade de determinados oligonucleotídeos.
Todos os oligonucleotídeos testados (WV-HZ12, WV- BZ761, WV-BZ762, WV-BZ763, WV-BZ764, WV-BZ765, WV-BZ766, WV- BA207, WV-BA208, e WV-BA209) têm como alvo o gene C e todos têm a mesma sequência de base, em que cada base é indicada genericamente por N, exceto pelo fato de que o único motivo de CpG é indicado.
WV-BZ21, controle positivo, tem uma sequência de base de TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT, que compreende vários motivos de CpG, e não é projetado para ter como alvo o gene C.
Os números indicam indução relativa de atividade de hTLR9 em relação água. 2,77 8,33 0,93uM uM uM 25 uM 75 uM WV-HZ12 1,0 1,0 1,0 1,0 0,9 1,1 1,0 1,1 1,0 1,0 WV-BZ761 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,1 1,0 1,1 1,0 0,9 WV-BZ762 1,0 1,0 1,0 1,1 1,0 1,0 1,1 1,0 1,0 1,0 WV-BZ763 1,0 1,0 1,1 1,1 1,1 1,1 1,1 1,1 1,1 1,0 WV-BZ764 1,0 1,0 1,0 0,9 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 WV-BZ765 1,0 0,9 1,1 1,0 1,0 1,0 1,1 1,0 0,9 0,9 WV-BZ766 1,1 1,3 1,5 1,5 1,5
1,2 1,3 1,3 1,4 1,4 WV-BA207 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,1 1,1 1,0 1,0 1,0 WV-BA208 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,1 1,0 0,9 1,0 WV-BA209 1,0 1,0 1,0 0,9 1,0 1,1 1,0 0,9 1,0 1,0 WV-BZ21 10,0 12,0 12,0 11,4 11,0 (controle positivo) 9,4 10,4 11,4 11,5 11,1 Tabela 25M.
Atividade de determinados oligonucleotídeos.
Esses oligonucleotídeos também foram testados para indução de camundongo TLR9. Os números indicam indução relativa de atividade de mTLR9 em relação água. 0,93u 2,77 8,33 25 75 M uM uM uM uM WV-HZ12 2,9 4,4 4,7 5,0 4,9 3,0 4,1 4,8 5,1 5,2 WV-BZ761 1,2 1,5 1,8 2,1 2,1 1,2 1,4 1,8 2,1 2,2 WV-BZ762 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,1 1,1 0,9 1,0 WV-BZ763 1,0 1,1 1,1 1,1 1,0 1,1 1,0 1,1 1,1 1,1 WV-BZ764 1,0 1,1 1,1 1,1 1,1 1,0 1,1 1,1 1,1 1,1 WV-BZ765 1,0 1,2 1,3 1,3 1,2
1,1 1,2 1,3 1,3 1,3 WV-BZ766 1,1 1,3 1,4 1,6 1,6 1,1 1,2 1,4 1,6 1,6 WV-BA207 1,1 1,1 1,1 1,1 1,1 1,0 1,0 1,1 1,1 1,2 WV-BA208 1,0 1,1 1,1 1,2 1,1 1,0 1,0 1,1 1,2 1,2 WV-BA209 1,0 1,2 1,1 1,2 1,1 1,0 1,1 1,2 1,2 1,3 WV-BZ21 (controle 21,4 22,4 22,9 21,2 18,1 positivo) 22,9 24,0 23,8 22,3 18,9
[00930] Em algumas modalidades, foi observado que, em alguns casos, determinados oligonucleotídeos que não induziram ativação de TLR9 considerável, ou induziram o nível muito baixo de ativação de TLR9 acima do mock em relação a TLR9 humano ou de camundongo. Oligonucleotídeos Exemplificativos Que Compreendem Porções Químicas Adicionais
[00931] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece oligonucleotídeos que compreendem uma ou mais porções químicas adicionais, por exemplo, porções químicas de alvejamento, porções químicas de carboidrato, etc. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece oligonucleotídeos que compreendem uma ou mais porções químicas de sulfonamida. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido compreende uma ou duas ou mais porções químicas de sulfonamida. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece oligonucleotídeos que podem modular splicing, por exemplo, oligonucleotídeos DMD que podem modular o salto de éxon, em que os oligonucleotídeos compreendem uma ou mais porções químicas de sulfonamida. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece oligonucleotídeos que medeiam o salto de éxon DMD 23, 45, 51 ou 53, ou múltiplos éxons DMD, em que os oligonucleotídeos compreendem uma ou mais porções químicas de sulfonamida.
[00932] Em algumas modalidades, uma porção química de sulfonamida tem ou compreende a estrutura de −L−SO2N(R1)2. Em algumas modalidades, uma porção química de sulfonamida tem ou compreende a estrutura de −SO2N(R1)2. Em algumas modalidades, uma porção química de sulfonamida tem ou compreende a estrutura de −Cy−SO2N(R1)2. Em algumas modalidades, −Cy− é aromático. Em algumas modalidades, −Cy− é um anel fenila opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, −Cy− é . Em algumas modalidades, −Cy− é um anel heteroarila opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, −Cy− é um anel heteroarila com 5 a 6 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 4 heteroátomos. Em algumas modalidades, −Cy− é . Em algumas modalidades, cada R1 é −H.
[00933] Uma porção química de sulfonamida pode ser conectada a uma cadeia de oligonucleotídeo através de vários ligantes adequados, de acordo com a presente revelação, tais como aqueles descritos no presente documento e/ou no documento WO/2017/062862, os ligantes dos quais são incorporados ao presente documento a título de referência. As porções químicas de sulfonamidas exemplificativas, incluindo porções químicas de mono, bi e trissulfonamida, são descritas abaixo:
, , , , e H2NO2S
H N HN O O O O O O O N N
H H O N H2NO2S H
O O N HN
H O H2NO2S .
[00934] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo compreende uma ligação internucleotídica modificada e uma porção química de sulfonamida opcionalmente através de um ligante. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo que compreende uma ligação internucleotídica modificada e uma porção química de sulfonamida é um siRNA, siRNA de fita dupla, siRNA de fita simples, gapmer, skipmer,
blockmer, oligonucleotídeo antissenso, antagomir, microRNA, pré-microRNs, antimir, supermir, ribozima, adaptador de Ul, ativador de RNA, agente de RNAi, oligonucleotídeo decoy, oligonucleotídeo formador de triplex, aptâmero ou adjuvante. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece um oligonucleotídeo que compreende uma ligação internucleotídica modificada que compreende uma sulfonamida. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo compreende uma sulfonamida e uma ligação internucleotídica quiralmente controlada. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo compreende uma sulfonamida e uma ligação internucleotídica quiralmente controlada que é uma ligação internucleotídica fosforotioato.
[00935] Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a um oligonucleotídeo que compreende uma porção química de sulfonamida ou um derivado ou variante do mesmo. Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a uma composição de oligonucleotídeo, em que o oligonucleotídeo compreende uma porção química de sulfonamida ou um derivado ou variante do mesmo e o oligonucleotídeo compreende pelo menos uma ligação internucleotídica quiralmente controlada.
[00936] Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a um oligonucleotídeo que compreende uma porção química de sulfonamida ou um derivado ou variante do mesmo, em que o oligonucleotídeo tem capacidade para mediar uma diminuição na expressão, nível e/ou atividade de um gene alvo ou produto de gene do mesmo.
[00937] Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a um oligonucleotídeo que compreende uma porção química de sulfonamida ou um derivado ou variante do mesmo, em que o oligonucleotídeo tem capacidade para mediar a modulação do salto de éxon de um gene alvo. Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a um oligonucleotídeo que compreende uma porção química de sulfonamida ou um derivado ou variante do mesmo, em que o oligonucleotídeo tem capacidade para aumentar o salto de um éxon de um gene alvo.
[00938] Oligonucleotídeos exemplificativos que podem ser utilizados para modulação de splicing, por exemplo, salto de éxon, que compreendem uma porção química de sulfonamida incluem WV-3548, WV-3366, etc. Outros oligonucleotídeos que compreendem uma porção química de sulfonamida foram projetados, construídos e/ou testados para várias atividades. Por exemplo, os oligonucleotídeos que compreendem uma porção química de "mono-sulfonamida", tais como WV-2836, WV-7419, WV-7421, WV-7422, WV-7408, WV-7409, WV- 7427, WV-7863, e WV-7864; oligonucleotídeo que compreende uma "bi-sulfonamida", WV-7423; e oligonucleotídeo que compreende uma "tri-sulfonamida", WV-7417. Tabela 26A. Determinados oligonucleotídeos Malat1. Oligonucleotídeo Descrição Sequência Nua Ligação/ Estereoquímica WV-2735 Geo * Geo * Geo GGGTCAGCTG XXXXXXXXXXX * Teo * m5Ceo * CCAATGCTAG XXXXXXXX A * G * C * T * G * C * C * A * A * T * Geo * m5Ceo * Teo * Aeo * Geo WV-2835 Mod027L001 * Geo GGGTCAGCTGC XXXXXXXXXXX * Geo * Geo * CAATGCTAG XXXXXXXXX
Teo * m5Ceo * A * G * C * T * G * C * C * A * A * T * Geo * m5Ceo * Teo * Aeo * Geo WV-2836 Mod028L001 * Geo GGGTCAGCTGCC XXXXXXXXXXX * Geo * Geo * AATGCTAG XXXXXXXXX Teo * m5Ceo * A * G * C * T * G * C * C * A * A * T * Geo * m5Ceo * Teo * Aeo * Geo WV-3174 mU * mG * mC * UGCCAGGCTGGT XXXXXXXXXXX mC * mA * G * G TATGACUC XXXXXXXX * C * T * G * G * T * T * A * T * mG * mA * mC * mU * mC WV-7301 Teo * Geo * TGCCAGGCTGGT XXXXXXXXXXX m5Ceo * m5Ceo * TATGACTC XXXXXXXX Aeo * G * G * C * T * G * G * T * T * A * T * Geo * Aeo * m5Ceo * Teo * m5Ceo WV-7408 Mod027L001Geo * GGGTCAGCTGCCA OXXXXXXXXXXX Geo * Geo * Teo ATGCTAG XXXXXXXX
* m5Ceo * A * G * C * T * G * C * C * A * A * T * Geo * m5Ceo * Teo * Aeo * Geo WV-7409 Mod028L001Geo * GGGTCAGCTGCC OXXXXXXXXXXX Geo * Geo * Teo AATGCTAG XXXXXXXX * m5Ceo * A * G * C * T * G * C * C * A * A * T * Geo * m5Ceo * Teo * Aeo * Geo WV-7417 Mod029L001 * Geo GGGTCAGCTGC XXXXXXXXXXX * Geo * Geo * CAATGCTAG XXXXXXXXX Teo * m5Ceo * A * G * C * T * G * C * C * A * A * T * Geo * m5Ceo * Teo * Aeo * Geo WV-7419 Mod045L001 * Geo GGGTCAGCTGC XXXXXXXXXXX * Geo * Geo * CAATGCTAG XXXXXXXXX Teo * m5Ceo * A * G * C * T * G * C * C * A * A * T * Geo * m5Ceo * Teo * Aeo * Geo WV-7421 Mod047L001 * Geo GGGTCAGCTGC XXXXXXXXXXX * Geo * Geo * CAATGCTAG XXXXXXXXX
Teo * m5Ceo * A * G * C * T * G * C * C * A * A * T * Geo * m5Ceo * Teo * Aeo * Geo WV-7422 Mod048L001 * Geo GGGTCAGCTG XXXXXXXXXXX * Geo * Geo * CCAATGCTAG XXXXXXXXX Teo * m5Ceo * A * G * C * T * G * C * C * A * A * T * Geo * m5Ceo * Teo * Aeo * Geo WV-7423 Mod049L001 * Geo GGGTCAGCTG XXXXXXXXXXX * Geo * Geo * CCAATGCTAG XXXXXXXXX Teo * m5Ceo * A * G * C * T * G * C * C * A * A * T * Geo * m5Ceo * Teo * Aeo * Geo WV-7427 Mod045L001Geo * GGGTCAGCTG OXXXXXXXXXXX Geo * Geo * Teo CCAATGCTAG XXXXXXXX * m5Ceo * A * G * C * T * G * C * C * A * A * T * Geo * m5Ceo * Teo * Aeo * Geo WV-7863 Mod046L001Geo * GGGTCAGCTG OXXXXXXXXXXX
Geo * Geo * Teo CCAATGCTAG XXXXXXXX * m5Ceo * A * G * C * T * G * C * C * A * A * T * Geo * m5Ceo * Teo * Aeo * Geo WV-7864 Mod054L001Geo * GGGTCAGCTG OXXXXXXXXXXX Geo * Geo * Teo CCAATGCTAG XXXXXXXX * m5Ceo * A * G * C * T * G * C * C * A * A * T * Geo * m5Ceo * Teo * Aeo * Geo WV-9430 Mod029L001mU * UGCCAGGCTG OXXXXXXXXX mG * mC * mC * GTTATGACUC XXXXXXXXXX mA * G * G * C * T * G * G * T * T * A * T * mG * mA * mC * mU * mC WV-7420 Mod046L001 * Geo GGGTCAGCTG XXXXXXXXX * Geo * Geo * CCAATGCTAG XXXXXXXXXXX Teo * m5Ceo * A * G * C * T * G * C * C * A * A * T * Geo * m5Ceo * Teo * Aeo * Geo Para essa Tabela, as descrições correspondem àquelas da Tabela A1, e
Mod045:
; Mod046:
; Mod047:
; Mod048:
; Mod049:
; Mod054:
; Nessas Mods, −C(O)− se conecta a −NH− de um ligante
(por exemplo, L001).
[00939] Os oligonucleotídeos que compreendem uma porção química de sulfonamida foram testados quanto à sua capacidade para realizar knockdown de Malat1. Os oligonucleotídeos testados foram gimnoticamente entregues para ∆48-50 miotubos derivados do paciente, que foram dosados a 3,1, 0,3 e 0,1 µM concentrações. As células foram deixadas se diferenciar por 4 dias (por exemplo, esse experimento foi de 4 dias pós-diferenciação). qPCR foi usado para avaliar o knockdown de Malat-1. Os os resultados são mostrados na Tabela 26B. Tabela 26B. Dados exemplificativos de oligonucleotídeos Malat1. Os números representam o nível de mRNA Malat-1 relativo. WV- WV- WV- WV- WV- WV- WV- WV- Mock 3174 8927 8929 8930 8931 8934 9385 9390 3 µM 10 11 10 11 9 8 33 95 1 µM 18 28 24 22 19 20 49 100 0,3 39 56 50 67 46 42 43 67 95 µM 0,1 63 73 68 81 68 69 56 81 100 µM Vários oligonucleotídeos Malat1, muitos compreendendo uma porção química de sulfonamida, foram testados quanto à sua capacidade de realizar knockdown de Malat1 em miotubos pré-diferenciados. Determinados dados são mostrados na Tabela 26C. ∆48-50 mioblastos derivados do paciente foram diferenciados por 4 dias antes da dosagem a 1 e 0,1 µM concentrações. O RNA foi colhido 48 horas pós- tratamento para medição. Tabela 26C. Dados exemplificativos de oligonucleotídeos Malat1. Os números representam o nível de mRNA Malat-1 relativo. Os números são aproximados. WV- WV- WV- WV- WV- WV- WV- WV- 3174 8927 8929 8930 8931 8934 9385 9390 1 µM 22 31 25 25 36 24 18 45 0,1 62 70 79 72 78 55 59 66 µM WV- WV- WV- WV- MOCK 8448 7558 7559 7560 1 µM 33 34 22 23 98 0,1 68 72 69 82 98 µM
[00940] Em alguns experimentos, os animais foram dosados com oligonucleotídeos, incluindo alguns que compreendem uma porção química de sulfonamida, e os animais foram posteriormente sacrificados e seus tecidos testados para o nível dos ligonucleotídeos.
[00941] Em alguns experimentos, o seguinte protocolo foi usado: Animais: 32 camundongos Mdx machos e 32 camundongos C57BL/6 fêmeas (todos com 8 a 10 semanas de idade). Os animais de teste foram aclimatados à instalação por pelo menos 3 dias após a chegada. Dosagem: S.C. (subcutânea) dosagem nos dias 1, 3 e 5 (5 ml/kg). Necrópsia: os animais foram submetidos à eutanásia 72 horas após a última injeção SC. Todos os animais foram perfundidos com PBS. Os seguintes tecidos foram coletados: cérebro, nervo ciático, medula espinhal, olhos, fígado, rim, baço, coração, diafragma, gastrocnêmio, quadríceps e tríceps, tecido adiposo branco, tecido adiposo marrom. Os tecidos frescos serão brevemente enxaguados com PBS, suavemente secos, pesados e congelados em nitrogênio líquido em tubos de 2 ml e armazenados a -80 ºC (em gelo seco). Histologia: Quadríceps e Rim pós-fixados em Formalina a 10% e processados em lâminas (seções embebidas com parafina). Em alguns experimentos, as variantes adequadas desse protocolo foram usadas.
[00942] Determinados resultados são mostrados nas Tabelas 27, 28 e 29. Tabela 27 Knockdown e presença de oligonucleotídeo em vários tecidos. Os números indicam níveis de mRNA Malat1 em relação a mHprt (mHPRT ou mHPRT1), e presença of oligonucleotídeo (ug/g). Procedimento Experimental: Espécie de Estudo: Camundongos MDX com 5 a 6 semanas; Via: Subcutâneo; nº Doses: QD por 3 dias; Pontos no Tempo Após a última Dose: 2 dias; Nível de dose diária (ug): 12,5 mg/kg. Gastro
SD Tríceps Coração Coração Quadríceps Sequência Média± SD Média± SD Média± SD Diafragma Média± SD Média± SD Malat1 Média± (ug/g) pD pD pD pD pD pK PBS 1,000 ± 1,000 ± 1,000 ± 1,000 ± 1,000 ± 0,000 ± 0,142 0,265 0,042 0,276 0,074 0,000 WV-2735 0,776 ± 0,699 ± 0,731 ± 0,879 ± 0,707 ± 1,631 ± 0,122 0,150 0,107 0,158 0,173 0,692
WV-2835 0,639 ± 0,588 ± 0,417 ± 0,895 ± 0,510 ± 1,987 ± 0,119 0,036 0,065 0,116 0,066 0,203 WV-2836 0,621 ± 0,834 ± 0,616 ± 0,769 ± 0,619 ± 7,001 ± 0,124 0,206 0,169 0,229 0,389 1,331 Tabela 28 Knockdown e presença de oligonucleotídeo em vários tecidos. Os números indicam níveis de mRNA Malat1 em relação a mHprt, e presença de oligonucleotídeo (ug/g). Procedimento Experimental: Espécie de Estudo: Camundongos MDX com 10 a 12 semanas; Via: Subcutâneo; nº Doses: QD por 3 dias; Pontos no Tempo Após a última Dose: 3 dias; e Nível de dose diária (ug): 12 mg/kg. Quadríceps pD Tríceps Média± pD Gastro Média± Diafragma pD Coração Média± Oligonucleotídeo Média± SD Média± SD pD
SD
SD pD 1,000 ± 1,000 ± 1,000 ± 1,000 ± 1,000 SD ± PBS 0,266 0,207 0,138 0,191 0,221 0,952 ± 0,876 ± 0,998 ± 0,651 ± 1,032 ± WV-2735 0,232 0,180 0,072 0,046 0,541 0,593 ± 0,877 ± 0,645 ± 0,563 ± 1,032 ± WV-2835 0,167 0,180 0,124 0,091 0,240 0,556 ± 0,739 ± 0,695 ± 0,614 ± 0,544 ± WV-2836 0,172 0,047 0,102 0,120 0,109 0,610 ± 1,009 ± 0,809 ± 0,698 ± 0,588 ± WV-3174 0,109 0,047 0,137 0,069 0,258 WV-7301 0,624 ± 0,846 ± 0,837 ± 0,453 ± 0,887 ±
0,074 0,172 0,141 0,031 0,142 Quadríceps Diafragma pK Coração Média± Oligonucleotídeo Média± SD (ug/g) Média± SD (ug/g) SD (ug/g) pK pK PBS 0,000 ± 0,000 0,096 ± 0,015 0,000 ± 0,000 WV-2735 5,616 ± 2,724 3,207 ± 1,465 0,342 ± 0,169 WV-2835 8,421 ± 3,374 5,734 ± 1,465 0,777 ± 0,203 WV-2836 11,221 ± 7,877 6,142 ± 1,006 0,664 ± 0,441 WV-3174 9,792 ± 8,339 4,609 ± 1,006 0,619 ± 0,122 WV-7301 6,659 ± 3,858 5,728 ± 2,092 0,707 ± 0,191 Tabela 29 Knockdown e presença de oligonucleotídeo em vários tecidos. Os números indicam níveis de mRNA Malat1 em relação a mHprt, e presença de oligonucleotídeo (ug/g). Procedimento Experimental: Espécie de Estudo: Camundongos wt com 10 a 12 semanas; Via: Subcutâneo; nº Doses: QD por 3 dias; Pontos no Tempo Após a última Dose: 3 dias; e Nível de dose diária (ug): 12 mg/kg. Tríceps Coração Quadríceps pD Gastro Média± Diafragma Oligonucleotídeo Média± SD Média± SD Média± SD Média± SD pD pD
SD pD pD PBS 1,000 ± 1,000 ± 1,000 ± 1,000 ± 1,000 ±
0,266 0,191 0,249 0,191 0,147 0,753 ± 0,667 ± 0,756 ± 0,651 ± 0,596 ± WV-2735 0,230 0,132 0,136 0,046 0,140 0,611 ± 0,549 ± 0,656 ± 0,563 ± 0,546 ± WV-2835 0,165 0,077 0,101 0,091 0,092 0,640 ± 0,596 ± 0,812 ± 0,614 ± 0,774 ± WV-2836 0,186 0,114 0,216 0,120 0,168 0,796 ± 0,610 ± 0,870 ± 0,698 ± 0,703 ± WV-3174 0,142 0,111 0,081 0,069 0,099 0,456 ± 0,498 ± 0,753 ± 0,453 ± 0,368 ± WV-7301 0,116 0,097 0,113 0,031 0,031 Quadríceps
Diafragma
Coração Oligonucleotídeo
Média± SD (ug/g)
Média± SD (ug/g)
Média± SD (ug/g) pK pK pK
PBS 0,000 ± 0,000 0,108 ± 0,016 0,000 ± 0,000 WV-2735 2,787 ± 0,734 9,219 ± 3,234 0,428 ± 0,084 WV-2835 2,700 ± 0,891 9,895 ± 2,466 0,726 ± 0,207 WV-2836 2,273 ± 0,621 9,751 ± 6,912 0,670 ± 0,242 WV-3174 2,142 ± 0,778 7,568 ± 1,807 0,612 ± 0,172 WV-7301 2,868 ± 0,334 6,174 ± 2,456 0,975 ± 0,216 Tabela 30 Knockdown e presença de oligonucleotídeo em vários tecidos.
Os números indicam níveis de mRNA Malat1 em relação a mHprt, e presença de oligonucleotídeo (ug/g). Procedimento Experimental: Espécie de Estudo: Camundongos wt com 5 a 6 semanas; Via: Subcutâneo; nº Doses: QD por 1 dias; Pontos no Tempo Após a última Dose: 3 dias; e Nível de dose diária (ug): 200 mg/kg. pD Sequência pD Gastro pD Diafragma pD Coração Quadríceps Malat1 Média± SD Média± SD Média± SD Média± SD PBS 1,000 ± 0,256 1,000 ± 0,309 1,000 ± 0,345 1,000 ± 0,432 WV-3174 0,752 ± 0,118 0,833 ± 0,160 0,647 ± 0,058 0,599 ± 0,120 WV-3174 0,603 ± 0,118 0,678 ± 0,145 0,421 ± 0,092 0,582 ± 0,185 WV-3174 0,454 ± 0,112 0,523 ± 0,104 0,380 ± 0,081 0,415 ± 0,062 WV-3174 0,342 ± 0,033 0,505 ± 0,119 0,322 ± 0,077 0,340 ± 0,055 pK pK Gastro pK Diafragma pK Coração Sequência Quadríceps Média± SD Média± SD Média± SD Malat1 Média± SD (ug/g) (ug/g) (ug/g) (ug/g) PBS 0,011 ± 0,025 0,000 ± 0,000 0,000 ± 0,000 0,000 ± 0,000 WV-3174 1,388 ± 0,677 1,704± 0,524 2,502 ± 0,919 1,781 ± 0,668 WV-3174 6,651 ± 5,930 4,563 ± 1,705 7,366 ± 3,939 2,532 ± 0,487 12,374 ± 14,574 ± 12,075 ± WV-3174 4,081 8,235 3,739 4,611 ± 1,050 15,227 ± 14,124 ± 22,734 ± 12,660 ± WV-3174 4,925 2,285 4,484 2,437 Métodos Exemplificativos para Preparar Oligonucleotídeos e Composições
[00943] Entre outros fatores, a presente revelação fornece tecnologias (métodos, reagentes, condições, processos de purificação, etc.) para prepara oligonucleotídeos e composições de oligonucleotídeo, que incluem oligonucleotídeos quiralmente controlados e nucleotídeos de oligonucleotídeo quiralmente controlados. Várias tecnologias (métodos, reagentes, condições, processos de purificação, etc.), conforme descrito no presente documento, podem ser utilizadas para preparar oligonucleotídeos fornecidos e composições dos mesmos, de acordo com a presente revelação, incluindo, porém sem limitação aquelas descritas nos documentos US 9695211, US 9605019, US 9598458, US 2013/0178612, US 20150211006, US 20170037399, WO 2017/015555, WO 2017/062862, WO 2017/160741, WO 2017/192664, WO 2017/192679, WO 2017/210647, WO 2018/223056, WO 2018/237194, e/ou WO 2019/055951, as tecnologias de preparação de cada um dos quais estão incorporadas ao presente documento a título de referência.
[00944] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece oligonucleotídeos quiralmente controlados. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo quiralmente controlado fornecido é mais de 50% puro. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo quiralmente controlado fornecido é mais de cerca de 55% puro. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo quiralmente controlado fornecido é mais de cerca de 60% puro. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo quiralmente controlado fornecido é mais de cerca de 65% puro. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo quiralmente controlado fornecido é mais de cerca de 70% puro. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo quiralmente controlado fornecido é mais de cerca de 75% puro. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo quiralmente controlado fornecido é mais de cerca de 80% puro. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo quiralmente controlado fornecido é mais de cerca de 85% puro. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo quiralmente controlado fornecido é mais de cerca de 90% puro. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo quiralmente controlado fornecido é mais de cerca de 91% puro. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo quiralmente controlado fornecido é mais de cerca de 92% puro. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo quiralmente controlado fornecido é mais de cerca de 93% puro. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo quiralmente controlado fornecido é mais de cerca de 94% puro. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo quiralmente controlado fornecido é mais de cerca de 95% puro. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo quiralmente controlado fornecido é mais de cerca de 96% puro. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo quiralmente controlado fornecido é mais de cerca de 97% puro. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo quiralmente controlado fornecido é mais de cerca de 98% puro. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo quiralmente controlado fornecido é mais de cerca de 99% puro. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo quiralmente controlado fornecido é mais de cerca de 99,5% puro. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo quiralmente controlado fornecido é mais de cerca de 99,6% puro. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo quiralmente controlado fornecido é mais de cerca de 99,7% puro. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo quiralmente controlado fornecido é mais de cerca de 99,8% puro. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo quiralmente controlado fornecido é mais de cerca de 99,9% puro. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo quiralmente controlado fornecido é mais de pelo menos cerca de 99% puro.
[00945] Em algumas modalidades, uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada é uma composição projetada para compreender um único tipo de oligonucleotídeo.
Em determinadas modalidades, tais composições são cerca de 50% diastereomericamente puras.
Em algumas modalidades, tais composições são cerca de 50% diastereomericamente puras.
Em algumas modalidades, tais composições são cerca de 50% diastereomericamente puras.
Em algumas modalidades, tais composições são cerca de 55% diastereomericamente puras.
Em algumas modalidades, tais composições são cerca de 60% diastereomericamente puras.
Em algumas modalidades, tais composições são cerca de 65% diastereomericamente puras.
Em algumas modalidades, tais composições são cerca de 70% diastereomericamente puras.
Em algumas modalidades, tais composições são cerca de 75% diastereomericamente puras.
Em algumas modalidades, tais composições são cerca de 80% diastereomericamente puras.
Em algumas modalidades, tais composições são cerca de 85% diastereomericamente puras.
Em algumas modalidades, tais composições são cerca de 90% diastereomericamente puras.
Em algumas modalidades, tais composições são cerca de 91% diastereomericamente puras.
Em algumas modalidades, tais composições são cerca de 92% diastereomericamente puras.
Em algumas modalidades, tais composições são cerca de 93% diastereomericamente puras.
Em algumas modalidades, tais composições são cerca de 94% diastereomericamente puras.
Em algumas modalidades, tais composições são cerca de 95% diastereomericamente puras.
Em algumas modalidades, tais composições são cerca de 96% diastereomericamente puras.
Em algumas modalidades, tais composições são cerca de 97% diastereomericamente puras.
Em algumas modalidades, tais composições são cerca de 98% diastereomericamente puras. Em algumas modalidades, tais composições são cerca de 99% diastereomericamente puras. Em algumas modalidades, tais composições são cerca de 99,5% diastereomericamente puras. Em algumas modalidades, tais composições são cerca de 99,6% diastereomericamente puras. Em algumas modalidades, tais composições são cerca de 99,7% diastereomericamente puras. Em algumas modalidades, tais composições são cerca de 99,8% diastereomericamente puras. Em algumas modalidades, tais composições são cerca de 99,9% diastereomericamente puras. Em algumas modalidades, tais composições são pelo menos cerca de 99% diastereomericamente puras.
[00946] Entre outros fatores, a presente revelação reconhece o desafio da preparação estereosseletiva (em vez de estereoaleatória ou racêmica) de oligonucleotídeos. Entre outros fatores, a presente revelação fornece métodos e reagentes para preparação estereosseletiva de oligonucleotídeos que compreendem múltiplas (por exemplo, mais de 5, 6, 7, 8, 9, ou 10) ligações internucleotídicas, e particularmente para oligonucleotídeos que compreendem múltiplas (por exemplo, mais de 5, 6, 7, 8, 9, ou 10) ligações internucleotídicas quirais. Em algumas modalidades, em uma preparação estereoaleatória ou racêmica de oligonucleotídeos, pelo menos uma ligação internucleotídica quiral é formada com menos de 90:10, 95:5, 96:4, 97:3 ou 98:2 de diastereosseletividade. Em algumas modalidades, para uma preparação estereosseletiva ou quiralmente controlada de oligonucleotídeos, cada ligação internucleotídica quiral é formada com mais de 90:10, 95:5, 96:4, 97:3, ou 98:2 de diastereosseletividade. Em algumas modalidades, para uma preparação estereosseletiva ou quiralmente controlada de oligonucleotídeos, cada ligação internucleotídica quiral é formada com mais de 95:5 de diastereosseletividade. Em algumas modalidades, para uma preparação estereosseletiva ou quiralmente controlada de oligonucleotídeos, cada ligação internucleotídica quiral é formada com mais de 96:4 de diastereosseletividade. Em algumas modalidades, para uma preparação estereosseletiva ou quiralmente controlada de oligonucleotídeos, cada ligação internucleotídica quiral é formada com mais de 97:3 de diastereosseletividade. Em algumas modalidades, para uma preparação estereosseletiva ou quiralmente controlada de oligonucleotídeos, cada ligação internucleotídica quiral é formada com mais de 98:2 de diastereosseletividade. Em algumas modalidades, para uma preparação estereosseletiva ou quiralmente controlada de oligonucleotídeos, cada ligação internucleotídica quiral é formada com mais de 99:1 de diastereosseletividade. Em algumas modalidades, a diastereosseletividade de uma ligação internucleotídica quiral em um oligonucleotídeo pode ser medida através de uma reação modelo, por exemplo formação de um dímero essencialmente sob as mesmas condições ou comparáveis, em que o dímero tem a mesma ligação internucleotídica que a ligação internucleotídica quiral, o nucleosídeo 5’ do dímero é igual ao nucleosídeo para a extremidade 5' da ligação internucleotídica quiral, e o nucleosídeo 3' do dímero é igual ao nucleosídeo para a extremidade 3' da ligação internucleotídica quiral.
[00947] Em algumas modalidades, uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada é uma composição projetada para compreender múltiplos tipos de oligonucleotídeos. Em algumas modalidades, os métodos da presente revelação permitem a geração de uma biblioteca de oligonucleotídeos quiralmente controlados de modo que uma quantidade pré-selecionada de qualquer um ou mais tipos de oligonucleotídeos quiralmente controlados possam ser misturados com qualquer um ou mais outros tipos de oligonucleotídeos quiralmente controlados para criar uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada. Em algumas modalidades, a quantidade pré-selecionada de um tipo de oligonucleotídeo é uma composição que tem qualquer uma das purezas diastereoméricas descritas acima.
[00948] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece métodos para produzir um oligonucleotídeo quiralmente controlado que compreende as etapas de: (1) acoplamento; (2) capping; (3) modificação opcional; (4) desbloqueio; e (5) repetição das etapas (1) a (4) até um comprimento desejado ser obtido.
[00949] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece um método, por exemplo, para preparar um oligonucleotídeo, que compreende um ou mais ciclos, cada um dos quais compreendendo independentemente: (1) uma etapa de acoplamento; (2) opcionalmente uma etapa de capping de pré- modificação; (3) uma etapa de modificação; (4) opcionalmente uma etapa de capping pós- modificação; e
(5) opcionalmente uma etapa de desbloqueio.
[00950] Em algumas modalidades, um ciclo compreende uma ou mais etapas de capping pré-modificação. Em algumas modalidades, um ciclo compreende um ou mais etapas de capping pós-modificação. Em algumas modalidades, um ciclo compreende uma ou mais etapas de capping pré e pós-modificação. Em algumas modalidades, um ciclo compreende uma ou mais etapa de desbloqueio. Em algumas modalidades, um ciclo compreende uma etapa de acoplamento, uma etapa de capping pré-modificação, uma etapa de modificação, uma etapa de capping pós-modificação e uma etapa de desbloqueio. Em algumas modalidades, um ciclo compreende uma etapa de acoplamento, uma etapa de capping pré- modificação, uma etapa de modificação e uma etapa de desbloqueio. Em algumas modalidades, um ciclo compreende uma etapa de acoplamento, uma etapa de modificação, uma etapa de capping pós-modificação e uma etapa de desbloqueio. Em algumas modalidades, um ou mais ciclos compreendem uma etapa de acoplamento, uma etapa de capping pré-modificação, uma etapa de modificação, uma etapa de capping pós-modificação e uma etapa de desbloqueio. Em algumas modalidades, um ou mais ciclos compreendem uma etapa de acoplamento, uma etapa de capping pré-modificação, uma etapa de modificação e uma etapa de desbloqueio. Em algumas modalidades, um ou mais ciclos compreendem uma etapa de acoplamento, uma etapa de modificação, uma etapa de capping pós-modificação e uma etapa de desbloqueio.
[00951] Quando descreve os métodos fornecidos, a palavra "ciclo" tem seu significado comum, conforme entendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica. Em algumas modalidades, uma rodada de etapas (1)-(4)
é denominada como um ciclo. Em algumas modalidades, alguns ciclos compreendem modificação. Em algumas modalidades, alguns ciclos não compreendem modificação. Em algumas modalidades, alguns ciclos compreendem e alguns ciclos não compreendem modificação. Em algumas modalidades, cada ciclo compreende independentemente uma etapa de modificação. Em algumas modalidades, cada ciclo não compreende uma etapa de ciclagem.
[00952] Em algumas modalidades, para formar uma ligação internucleotídica quiralmente controlada, uma fosforamidita quiralmente pura que compreende um auxiliar quiral é utilizada para formar estereosseletivamente a ligação internucleotídica quiralmente controlada. Vários auxiliares quirais e fosforamidita, por exemplo, aqueles descritos nos documentos US 9695211, US 9605019, US 9598458, US 2013/0178612, US 20150211006, US 20170037399, WO 2017/015555, WO 2017/062862, WO 2017/160741, WO 2017/192664, WO 2017/192679, WO 2017/210647, WO 2018/223056, WO 2018/237194, e/ou WO 2019/055951, os auxiliares quirais e fosforamidita de cada um dos quais são incorporados ao presente documento a título de referência, podem ser utilizados, de acordo com a presente revelação.
[00953] Em algumas modalidades, uma etapa de acoplamento fornece um oligonucleotídeo compreende uma ligação internucleotídica da fórmula I, I-a, I-b, I-c, I-n-1, I-n-2, I-n-3, I-n-4, II, II-a-1, II-a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II- c-2, II-d-1, II-d-2, etc., ou uma forma de sal da mesma, em que PL é P. Em algumas modalidades, tal ligação internucleotídica é uma ligação internucleotídica quiralmente controlada. Em algumas modalidades, tal ligação internucleotídica compreende uma porção química de auxiliar quiral.
[00954] Em algumas modalidades, uma etapa de modificação fornece um oligonucleotídeo compreende uma ligação internucleotídica da fórmula I, I-a, I-b, I-c, I-n-1, I-n-2, I-n-3, I-n-4, II, II-a-1, II-a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II- c-2, II-d-1, II-d-2, III, etc., ou uma forma de sal da mesma, em que PL é P=W. Em algumas modalidades, uma etapa de modificação fornece um oligonucleotídeo compreende uma ligação internucleotídica da fórmula I, I-a, I-b, I-c, I-n-1, I-n-2, I-n-3, I-n-4, II, II-a-1, II-a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II- c-2, II-d-1, II-d-2, etc., ou uma forma de sal da mesma, em que PL é P=W. Em algumas modalidades, W é S. Em algumas modalidades, W é O. Em algumas modalidades, tal ligação internucleotídica é uma ligação internucleotídica quiralmente controlada. Em algumas modalidades, tal ligação internucleotídica compreende uma porção química de auxiliar quiral. Em algumas modalidades, a etapa de modificação fornece a ligação internucleotídica não negativamente carregada. Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura da fórmula I, I-a, I- b, I-c, I-n-1, I-n-2, I-n-3, I-n-4, II, II-a-1, II-a-2, II-b- 1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, II-d-2, etc., ou uma forma de sal da mesma. Em algumas modalidades, tal ligação internucleotídica é uma ligação internucleotídica neutra. Em algumas modalidades, tal ligação internucleotídica é uma ligação internucleotídica quiralmente controlada. Em algumas modalidades, tal ligação internucleotídica compreende uma porção química de auxiliar quiral. Em algumas modalidades, tal ligação internucleotídica não compreende porção química de auxiliar quiral. Em algumas modalidades, uma porção química de auxiliar quiral cai durante a modificação.
[00955] As tecnologias fornecidas fornecem várias vantagens. Entre outros fatores, conforme demonstrado no presente documento, as tecnologias fornecidas podem aprimorar muito a pureza e rendimento brutos de síntese de oligonucleotídeo, particularmente para oligonucleotídeos modificados e/ou quiralmente puros que fornecem várias propriedades e atividades que são críticas para propósitos terapêuticos. Com a capacidade de fornecer rendimento e pureza brutos inesperadamente altos para oligonucleotídeos terapeuticamente importantes, as tecnologias fornecidas podem reduzir significativamente os custos de fabricação (através de, por exemplo, purificação simplificada, rendimentos totais muito aprimorados, etc.). Em algumas modalidades, as tecnologias fornecidas podem ser prontamente aumentadas para produzir oligonucleotídeos em quantidades e qualidades suficientes para propósitos clínicos. Em algumas modalidades, as tecnologias fornecidas que compreendem auxiliares quirais que compreendem grupos removedores de elétrons em G2 (por exemplo, auxiliares quirais PSM) são particularmente úteis para preparar ligações internucleotídicas quiralmente controladas que compreendem ligações P-N (por exemplo, ligações internucleotídicas não negativamente carregadas, tais como n001, n002, n003, n004, n005, n006, n007, n008, n009, n010, etc.) e podem simplificar significativamente as operações de fabricação, reduzir custos e/ou facilitar a formação a jusante.
[00956] Em algumas modalidades, tecnologias fornecidas fornece, compatibilidade de reagentes aprimorada. Por exemplo, conforme demonstrado na presente revelação, as tecnologias fornecidas fornecem flexibilidade para usar diferentes sistemas de reagentes para oxidação, sulfurização e/ou reações azida, particularmente para síntese de oligonucleotídeo quiralmente controlada.
[00957] Entre outros fatores, a presente revelação fornece composições de oligonucleotídeo de alta pureza bruta. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece a composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada de alta pureza bruta. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece oligonucleotídeo quiralmente controlado de alta pureza bruta. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece oligonucleotídeo de alta pureza bruta e/ou alta estereopureza. Suportes e Ligantes
[00958] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos podem ser preparados na solução. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos podem ser preparados com o uso de um suporte. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos são preparados com o uso de um suporte sólido. O suporte sólido adequado que pode ser utilizado, de acordo com a presente revelação inclui, por exemplo, o suporte sólido descrito nos documentos US 9695211, US 9605019, US 9598458, US 2013/0178612, US 20150211006, US 20170037399, WO 2017/015555, WO 2017/062862, WO 2017/160741, WO 2017/192664, WO 2017/192679, WO 2017/210647, WO 2018/223056, WO 2018/237194, e/ou WO 2019/055951, o suporte sólido de cada um dos quais é incorporado ao presente documento a título de referência.
[00959] Em algumas modalidades, uma porção química de ligante é utilizada para conectar uma cadeia de oligonucleotídeo a um suporte durante a síntese. Os ligantes adequados são amplamente utilizados na técnica, e incluem aqueles descritos nos documentos US 9695211, US 9605019, US 9598458, US 2013/0178612, US 20150211006, US 20170037399, WO 2017/015555, WO 2017/062862, WO 2017/160741, WO 2017/192664, WO 2017/192679, WO 2017/210647, WO 2018/223056, WO 2018/237194, e/ou WO 2019/055951, o ligante de cada um dos quais é incorporado ao presente documento a título de referência
[00960] Em algumas modalidades, a química de ligação é um ligante de ácido succinâmico, ou um ligante de succinato (-CO-CH2-CH2-CO-), ou um ligante de oxalila (-CO-CO- ). Em algumas modalidades, uma porção química de ligação e o nucleosídeo são ligados entre si através de uma ligação éster. Em algumas modalidades, uma porção química de ligação e um nucleosídeo são ligados entre si através de uma ligação amida. Em algumas modalidades, uma porção química de ligação conecta um nucleosídeo a outro nucleotídeo ou ácido nucleico. Os ligantes adequados são revelados, por exemplo, em Oligonucleotides And Analogues A Practical Approach, Ekstein, F. Ed., IRL Press, N.Y., 1991, Chapter 1 e Solid-Phase Supports for Oligonucleotide Synthesis, Pon, R. T., Curr. Prot. Nucleic Acid Chem., 2000, 3.1.1-3.1.28. Em algumas modalidades, um ligante universal (UnyLinker) é usado para fixar o oligonucleotídeo ao suporte sólido (Ravikumar et al., Org. Process Res. Dev., 2008, 12 (3), 399–410). Em algumas modalidades, outros ligantes universais são usados (Pon, R. T., Curr. Prot. Nucleic Acid Chem., 2000, 3.1.1-3.1.28). Em algumas modalidades, vários ligantes ortogonais (tais como ligantes dissulfeto) são usados (Pon, R. T., Curr. Prot. Nucleic Acid Chem., 2000, 3.1.1-3.1.28).
[00961] Entre outros fatores, a presente revelação reconhece que um ligante pode ser escolhido ou projetado para ser compatível com um conjunto de condições de reação empregadas na síntese de oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, para evitar a degradação de oligonucleotídeos e evitar a dessulfurização, grupos auxiliares são seletivamente removidos antes da desproteção. Em algumas modalidades, o grupo DPSE pode ser seletivamente removido por íons F−. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece ligantes que são estáveis sob ligantes que são estáveis sob uma condição de desproteção DPSE, por exemplo, TBAF 0,1 M em MeCN, HF-Et3N 0,5 M em THF ou MeCN, etc. Em algumas modalidades, um ligante fornecido é um ligante conforme exemplificado abaixo: . Solventes
[00962] A síntese de oligonucleotídeos fornecidos é geralmente realizada em solventes orgânicos apróticos. Em algumas modalidades, um solvente é um solvente de nitrila, tal como, por exemplo, acetonitrila. Em algumas modalidades, um solvente é um solvente de amina básico, tal como, por exemplo, piridina. Em algumas modalidades, um solvente é um solvente etéreo, tal como, por exemplo, tetra- hidrofurano. Em algumas modalidades, um solvente é um hidrocarboneto halogenado, tal como, por exemplo, diclorometano. Em algumas modalidades, uma mistura de solventes é usada. Em determinadas modalidades, um solvente é uma mistura de qualquer uma ou mais das classes de solventes descritas acima.
[00963] Em algumas modalidades, quando um solvente orgânico aprótico não é básico, uma base está presente na etapa de reação. Em algumas modalidades quando uma base está presente, a base é uma base de amina, tal como, por exemplo, piridina, quinolina ou N,N-dimetilanilina. Outras base de amina exemplificativas incluem pirrolidina, piperidina, N-metil pirrolidina, piridina, quinolina, N,N- dimetilaminopiridina (DMAP), ou N,N-dimetilanilina.
[00964] Em algumas modalidades, uma base é outra além de uma base de amina.
[00965] Em algumas modalidades, um solvente orgânico aprótico é anidro. Em algumas modalidades, um solvente orgânico aprótico anidro é recém-destilado. Em algumas modalidades, um solvente orgânico aprótico anidro recém- destilado é um solvente de amina básico, tal como, por exemplo, piridina. Em algumas modalidades, um solvente orgânico aprótico anidro recém-destilado é um solvente etéreo, tal como, por exemplo, tetra-hidrofurano. Em algumas modalidades, um solvente orgânico aprótico anidro recém-destilado é um solvente de nitrila, tal como, por exemplo, acetonitrila.
Reagentes quirais/Auxiliares quirais
[00966] Em algumas modalidades, os reagentes quirais (também podem ser chamados de auxiliares quirais) são usados para conferir estereosseletividade à produção de oligonucleotídeos quiralmente controlados. Muitos reagentes quirais, também denominados por aqueles versados na técnica e no presente documento como auxiliares quirais, podem ser usados de acordo com os métodos da presente revelação. Exemplos de tais reagentes quirais são descritos no presente documento e nos documentos US 9695211, US 9605019, US 9598458, US 2013/0178612, US 20150211006, US 20170037399, WO 2017/015555, WO 2017/062862, WO 2017/160741, WO 2017/192664, WO 2017/192679, WO 2017/210647, WO 2018/098264, WO 2018/223056, WO 2018/237194, e/ou WO 2019/055951, os auxiliares quirais de cada um dos quais são incorporados a título de referência.
[00967] Em algumas modalidades, um reagente quiral para uso, de acordo com os métodos da presente revelação, tem a Fórmula 3-I, abaixo: , Fórmula 3-I em que: W1 e W2 são qualquer um dentre −O−, −S−, −NG5−, ou −NG5−O−; U1 e U3 são átomos de carbono que são ligados a U2 se estiver presente, ou uns aos outros se r for 0, por meio de uma ligação simples, dupla ou tripla; U2 é −C−, −CG8−, −CG8G8−, −NG8−, −N−, −O−, ou −S− em que r é um número inteiro de 0 a 5; e cada um dentre G1, G2, G3, G4, G5, e G8 é independentemente R1 conforme descrito na presente revelação.
[00968] Em algumas modalidades, W1 e W2 são qualquer um dentre −O−, −S−, ou −NG5−, U1 e U3 são átomos de carbono que são ligados a U2 se estiver presente, ou uns aos outros se r for 0, por meio de uma ligação simples, dupla ou tripla. U2 é −C−, −CG8−, −CG8G8−, −NG8−, −N−, −O−, ou −S− em que r é um número inteiro de 0 a 5 e não mais que dois heteroátomos são adjacentes. Quando qualquer um dentre U2 é C, uma ligação tripla precisa ser formada entre uma segunda ocorrência de U2, que é C, ou a um dentre U1 ou U3. De modo similar, quando qualquer um dentre U2 for CG8, uma ligação dupla é formada entre uma segunda ocorrência de U2 que é −CG8− ou −N−, ou a um dentre U1 ou U3.
[00969] Em algumas modalidades, −U1G3G4−(U2)r−U3G1G2− é −CG3G4−CG1G2−. Em algumas modalidades, −U1−(U2)r−U3− é −CG3= CG1−. Em algumas modalidades, −U1−(U2)r−U3− é −C≡C−. Em algumas modalidades, −U1−(U2)r−U3− é −CG3=CG8−CG1G2−. Em algumas modalidades, −U1−(U2)r−U3− é −CG3G4−O−CG1G2−. Em algumas modalidades, −U1−(U2)r−U3− é −CG3G4−NG8−CG1G2−. Em algumas modalidades, −U1−(U2)r−U3− é −CG3G4−N−CG2−. Em algumas modalidades, −U1−(U2)r−U3− é −CG3G4−N=CG8−CG1G2−.
[00970] Em algumas modalidades, G1, G2, G3, G4, G5, e G8 são independentemente R1 conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, G1, G2, G3, G4, G5, e G8 são independentemente R conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, G1, G2, G3, G4, G5, e G8 são independentemente hidrogênio, ou um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre alifático, alquila, aralquila,
cicloalquila, cicloalquilalquila, heteroalifático, heterociclila, heteroarila, e arila; ou dois dentre G1, G2, G3, G4, e G5 são G6 (tomados em conjunto para formar um anel contendo heteroátomo ou carbocíclico saturado ou parcialmente insaturado opcionalmente substituído de até cerca de 20 átomos de anel que é monocíclico ou policíclico, e é fundido ou não fundido). Em algumas modalidades, um anel formado assim é substituído por porções químicas de oxo, tioxo, alquila, alquenila, alquinila, heteroarila ou arila. Em algumas modalidades, quando um anel formado tomando dois G6 em conjunto é substituído, o mesmo é substituído por uma porção química que é volumosa o suficiente para conferir estereosseletividade durante a reação.
[00971] Em algumas modalidades, um anel formado tomando-se dois G6 em conjunto é ciclopentila, pirrolila, ciclopropila, ciclo-hexenila, ciclopentenila, tetra-hidropiranila ou piperazinila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, um anel formado tomando-se dois G6 em conjunto é ciclopentila, pirrolila, ciclopropila, ciclo- hexenila, ciclopentenila, tetra-hidropiranila, pirrolidinila ou piperazinila opcionalmente substituída.
[00972] Em algumas modalidades, G1 é fenila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, G1 é fenila. Em algumas modalidades, G2 é metila ou hidrogênio. Em algumas modalidades, G2 é hidrogênio. Em algumas modalidades, G1 é fenila opcionalmente substituída e G2 é metila. Em algumas modalidades, G1 é fenila e G2 é metila. Em algumas modalidades, G1 é −CH2Si(R)3, em que um R é opcionalmente substituído C1-6 alifático, e os outros dois R são, cada um, independentemente um anel aromático monocíclico ou policíclico, saturado ou parcialmente insaturado com 3 a 20 membros opcionalmente substituído tendo 0 a 5 heteroátomos. Em algumas modalidades, os outros dois R são, cada um, independentemente fenila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, G1 é −CH2SiMePh2.
[00973] Em algumas modalidades, r é 0.
[00974] Em algumas modalidades, W1 é −NG5−O−. Em algumas modalidades, W1 é −NG5−O−, em que o −O− é ligado a −H. Em algumas modalidades, W1 é –NG5–. Em algumas modalidades, um dentre G3 e G4 é tomado em conjunto com G5 para formar um anel com 3 a 10 membros opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, um dentre G3 e G4 é tomado em conjunto com G5 para formar um anel pirrolidinila opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, um dentre G3 e G4 é tomado em conjunto com G5 para formar um anel pirrolidinila. Em algumas modalidades, G5 é C1-6 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, G5 é metila. Em algumas modalidades, um dentre G1 e G2 e um dentre G3 e G4 são tomados em conjunto com seus átomos intervenientes para formar um anel com 3 a 10 membros opcionalmente substituído tendo 0 a 3 heteroátomos. Em algumas modalidades, um anel formado com 3 membros. Em algumas modalidades, um anel formado com 4 membros. Em algumas modalidades, um anel formado com 5 membros. Em algumas modalidades, um anel formado com 6 membros. Em algumas modalidades, um anel formado com 7 membros. Em algumas modalidades, um anel formado é substituído. Em algumas modalidades, um anel formado é não substituído. Em algumas modalidades, um anel formado não tem heteroátomo. Em algumas modalidades, um anel formado é saturado. Para compostos exemplificativos, consulte WV-CA-293 e WV-CA-294.
[00975] Em algumas modalidades, W2 é –O–.
[00976] Em algumas modalidades, um reagente quiral é um composto da Fórmula 3-AA: Fórmula 3-AA em que cada variável é independentemente conforme definido acima e descrito no presente documento.
[00977] Em algumas modalidades da Fórmula 3AA, W1 e W2 são independentemente -NG5-, -O-, ou -S-; G1, G2, G3, G4, e G5 são independentemente hidrogênio, ou um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre alquila, aralquila, cicloalquila, cicloalquilalquila, heteroalifático, heterociclila, heteroarila ou arila; ou dois dentre G1, G2, G3, G4, e G5 são G6 (tomados em conjunto para formar um anel contendo heteroátomo ou carbocíclico saturado, parcialmente insaturado ou insaturado opcionalmente substituído de até cerca de 20 átomos de anel que é monocíclico ou policíclico, fundido ou não fundido), e não mais que quatro dentre G1, G2, G3, G4, e G5 são G6. De modo similar aos compostos da Fórmula 3-I, qualquer um dentre G1, G2, G3, G4, ou G5 é opcionalmente substituído por porções químicas de oxo, tioxo, alquila, alquenila, alquinila, heteroarila ou arila. Em algumas modalidades, tal substituição induz a estereosseletividade na produção de oligonucleotídeos quiralmente controlados. Em algumas modalidades, uma porção química contendo heteroátomo, por exemplo, heteroalifático, heterociclila, heteroarila, etc., tem 1 a 5 heteroátomos. Em algumas modalidades, os heteroátomos são selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, sulfure e silício. Em algumas modalidades, pelo menos um heteroátomo é nitrogênio.
[00978] Em algumas modalidades, W1 é −NG5−O−. Em algumas modalidades, W1 é −NG5−O−, em que o −O− é ligado a H. Em algumas modalidades, W1 é −NG5−. Em algumas modalidades, G5 e um dentre G3 e G4 são tomados em conjunto para formar um anel com 3 a 10 membros opcionalmente substituído tendo 0 a 3 heteroátomos além do átomo de nitrogênio de W1. Em algumas modalidades, G5 e G3 são tomados em conjunto para formar um anel com 3 a 10 membros opcionalmente substituído tendo 0 a 3 heteroátomos além do átomo de nitrogênio de W1. Em algumas modalidades, G5 e G4 são tomados em conjunto para formar um anel com 3 a 10 membros opcionalmente substituído tendo 0 a 3 heteroátomos além do átomo de nitrogênio de W1. Em algumas modalidades, um anel formado é um anel com 4, 5, 6, 7, ou 8 membros opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, um anel formado é um anel com 4 membros opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, um anel formado é um anel com 5 membros opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, um anel formado é um anel com 6 membros opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, um anel formado é um anel com 7 membros opcionalmente substituído.
[00979] Em algumas modalidades, um reagente quiral fornecido tem a estrutura de . Em algumas modalidades, um reagente quiral fornecido tem a estrutura de . Em algumas modalidades, um reagente quiral fornecido tem a estrutura de . Em algumas modalidades, um reagente quiral fornecido tem a estrutura de . Em algumas modalidades, um reagente quiral fornecido tem a estrutura de . Em algumas modalidades, um reagente quiral fornecido tem a estrutura de . Em algumas modalidades, um reagente quiral fornecido tem a estrutura de . Em algumas modalidades, um reagente quiral fornecido tem a estrutura de .
[00980] Em algumas modalidades, W1 é −NG5, W2 é O, cada um dentre G1 e G3 é independentemente hidrogênio ou um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre C1-10 alifático, heterociclila, heteroarila e arila, G2 é −C(R)2Si(R)3, e G4 e G5 são tomados em conjunto para formar um anel contendo heteroátomo saturado, parcialmente insaturado ou insaturado opcionalmente substituído de até cerca de 20 átomos de anel que é monocíclico ou policíclico, fundido ou não fundido. Em algumas modalidades, cada R é independentemente hidrogênio, ou um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre C1–C6 alifático, carbociclila, arila, heteroarila, e heterociclila. Em algumas modalidades, G2 é −C(R)2Si(R)3, em que −C(R)2− é −CH2− opcionalmente substituído, e cada R de −Si(R)3 é independentemente um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre C1-10 alifático, heterociclila, heteroarila e arila. Em algumas modalidades, pelo menos um R de −Si(R)3 é independentemente C1-10 alquila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, pelo menos um R de −Si(R)3 é independentemente fenila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, um R of −Si(R)3 é independentemente fenila opcionalmente substituída, e cada um dentre os outros dois R é independentemente C1-10 alquila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, um R de −Si(R)3 é independentemente C1-10 alquila opcionalmente substituída, e cada um dentre os outros dois R é independentemente fenila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, G2 é −CH2Si(Ph)(Me)2 opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, G2 é −CH2Si(Me)(Ph)2 opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, G2 é −CH2Si(Me)(Ph)2. Em algumas modalidades, G4 e G5 são tomados em conjunto para formar um anel saturado com 5 a 6 opcionalmente substituído contendo um átomo de nitrogênio (ao qual G5 é fixado). Em algumas modalidades, G4 e G5 são tomados em conjunto para formar um anel saturado com 5 membros opcionalmente substituído contendo um átomo de nitrogênio. Em algumas modalidades, G1 é hidrogênio. Em algumas modalidades, G3 é hidrogênio. Em algumas modalidades, tanto G1 como G3 são hidrogênio.
[00981] Em algumas modalidades, W1 é −NG5, W2 é O, cada um dentre G1 e G3 é independentemente R1, G2 é −R1, e G4 e G5 são tomados em conjunto para formar um anel contendo heteroátomo saturado, parcialmente insaturado ou insaturado opcionalmente substituído de até cerca de 20 átomos de anel que é monocíclico ou policíclico, fundido ou não fundido. Em algumas modalidades, cada um dentre G1 e G3 é independentemente R. Em algumas modalidades, cada um dentre G1 e G3 é independentemente −H. Em algumas modalidades, G2 é conectado ao restante da molécula através de um átomo de carbono, e o átomo de carbono é substituído por um ou mais grupos removedores de elétrons.
Em algumas modalidades, G2 é metila substituída por um ou mais grupos removedores de elétrons.
Em algumas modalidades, G2 é metila substituída por um e não mais que um grupo removedor de elétrons.
Em algumas modalidades, G2 é metila substituída por dois ou mais grupos removedores de elétrons.
Entre outros fatores, um auxiliar quiral que tem G2 que compreende um grupo removedor de elétrons pode ser prontamente removido por uma base (lábil à base, por exemplo, sob uma condição anidra substancialmente isenta de água; em muitos casos, de preferência antes que os oligonucleotídeos que compreendem ligações internucleotídicas que compreendem tais auxiliares quirais sejam expostos a condições/sistemas de reagente que compreendem uma quantidade substancial de água, particularmente na presença de uma base (por exemplo, condições de clivagem/sistemas de reagente com o uso de NH4OH)) e fornece várias vantagens, conforme descrito no presente documento, por exemplo, alta pureza bruta, alto rendimento, alta estereosseletividade, operação mais simplificada, menos etapas, custo de fabricação adicionalmente reduzido e/ou formulação a jusante mais simplificada (por exemplo, baixa quantidade de sal (sais) após a clivagem), etc.
Em algumas modalidades, conforme descrito nos Exemplos, tais auxiliares podem fornecer compatibilidade química alternativa ou adicional com outros grupos funcionais e/ou de proteção.
Em algumas modalidades, conforme demonstrado nos Exemplos, os auxiliares quirais lábeis à base são particularmente úteis para construção de ligações internucleotídicas não negativamente carregadas quiralmente controladas (por exemplo,
ligações internucleotídicas neutras, tal como n001); em alguns casos, conforme demonstrado nos Exemplos, eles podem fornecer rendimento significativamente aprimorado e/ou pureza bruta com alta estereosseletividade, por exemplo, quando utilizados com remoção usando uma base sob uma condição anidra.
Em algumas modalidades, tal auxiliar quiral é ligado a um fósforo de ligação por meio de um átomo de oxigênio (por exemplo, que corresponde a um grupo −OH em um composto de auxiliar quiral correspondente, por exemplo, um composto da fórmula I), o átomo de carbono no auxiliar quiral ao qual o oxigênio é ligado (o carbono alfa) também se liga a −H (além de outros grupos; em algumas modalidades, um carbono secundário), e o próximo átomo de carbono (o carbono beta) no auxiliar quiral é ligado a um ou dois grupos removedores de elétrons.
Em algumas modalidades, −W2−H é −OH.
Em algumas modalidades, G1 é −H.
Em algumas modalidades, G2 compreende um ou dois grupos removedores de elétrons ou pode, de outro modo, facilitar a remoção do auxiliar quiral por uma base.
Em algumas modalidades, G1 é −H, G2 compreende um ou dois grupos removedores de elétrons, −W2−H é −OH.
Em algumas modalidades, G1 é −H, G2 compreende um ou dois grupos removedores de elétrons, −W2−H é −OH, −W1−H é −NG5−H, e um dentre G3 e G4 é tomado em conjunto com G5 para formar com seus átomos intervenientes um anel conforme descrito no presente documento (por exemplo, um anel monocíclico, bicíclico ou policíclico com 3 a 20 membros opcionalmente substituído tendo além do átomo de nitrogênio no qual G5 se situa, 0 a 5 heteroátomos (por exemplo, um anel saturado monocíclico com 3, 4, 5 ou 6 membros opcionalmente substituído tendo além do átomo de nitrogênio no qual G5 se situa, nenhum outro heteroátomo)).
[00982] Conforme observado por aqueles versados na técnica, vários grupos removedores de elétrons são conhecidos na técnica e podem ser utilizados de acordo com a presente revelação. Em algumas modalidades, um grupo removedor de elétrons compreende e/ou é conectado ao átomo de carbono, por exemplo, através de −S(O)−, −S(O)2−, −P(O)(R1)−, −P(S)R1−, ou −C(O)−. Em algumas modalidades, um grupo removedor de elétrons é −CN, −NO2, halogênio, −C(O)R1, −C(O)OR', −C(O)N(R')2, −S(O)R1, −S(O)2R1, −P(W)(R1)2, −P(O)(R1)2, −P(O)(OR')2, ou −P(S)(R1)2. Em algumas modalidades, um grupo removedor de elétrons é arila ou heteroarila, por exemplo, fenila, substituída por um ou mais dentre −CN, −NO2, halogênio, −C(O)R1, −C(O)OR', −C(O)N(R')2, −S(O)R1, −S(O)2R1, −P(W)(R1)2, −P(O)(R1)2, −P(O)(OR')2, ou −P(S)(R1)2.
[00983] Em algumas modalidades, G2 é −L−R'. Em algumas modalidades, G2 é −L'−L"−R', em que L' é −C(R)2− ou opcionalmente substituído −CH2−, e L" é −P(O)(R')−, −P(O)(R')O−, −P(O)(OR')−, −P(O)(OR')O−, −P(O)[N(R')]−, −P(O)[N(R')]O−, −P(O)[N(R')][N(R')]−, −P(S)(R')−, −S(O)2−, −S(O)2−, −S(O)2O−, −S(O)−, −C(O)−, −C(O)N(R')−, ou −S−. Em algumas modalidades, L' é −C(R)2−. Em algumas modalidades, L' é −CH2− opcionalmente substituído.
[00984] Em algumas modalidades, L' é −C(R)2−. Em algumas modalidades, cada R é independentemente hidrogênio, ou um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre C1–C6 alifático, carbociclila, arila, heteroarila, e heterociclila. Em algumas modalidades, L' é −CH2−. Em algumas modalidades, L" é −P(O)(R')−, −P(S)(R')−, −S(O)2−. Em algumas modalidades, G2 é −L'−C(O)N(R')2. Em algumas modalidades, G2 é −L'−P(O)(R')2. Em algumas modalidades, G2 é −L'−P(S)(R')2. Em algumas modalidades, cada R' é independentemente alifático, heteroalifático, arila, ou heteroarila opcionalmente substituído conforme descrito na presente revelação (por exemplo, aquelas modalidades descritas para R). Em algumas modalidades, cada R' é independentemente fenila opcionalmente substituída.
Em algumas modalidades, cada R' é independentemente fenila opcionalmente substituída em que um ou mais substituintes são independentemente selecionados dentre −CN, −OMe, −Cl, −Br, e −F.
Em algumas modalidades, cada R' é independentemente fenila substituída em que um ou mais substituintes são independentemente selecionados dentre −CN, −OMe, −Cl, −Br, e −F.
Em algumas modalidades, cada R' é independentemente fenila substituída em que os substituintes são independentemente selecionados dentre −CN, −OMe, −Cl, −Br, e −F.
Em algumas modalidades, cada R' é independentemente fenila monossubstituída, em que o substituinte é independentemente selecionado dentre −CN, −OMe, −Cl, −Br, e −F.
Em algumas modalidades, dois R' são iguais.
Em algumas modalidades, dois R' são diferentes.
Em algumas modalidades, G2 é −L'−S(O)R'. Em algumas modalidades, G2 é −L'−C(O)N(R')2. Em algumas modalidades, G2 é −L'−S(O)2R'. Em algumas modalidades, R' é alifático, heteroalifático, arila ou heteroarila opcionalmente substituído conforme descrito na presente revelação (por exemplo, aquelas modalidades descritas para R). Em algumas modalidades, R' é fenila opcionalmente substituída.
Em algumas modalidades, R' é fenila opcionalmente substituída em que um ou mais substituintes são independentemente selecionados dentre −CN, −OMe, −Cl, −Br, e −F.
Em algumas modalidades, R' é fenila substituída em que um ou mais substituintes são independentemente selecionados dentre −CN, −OMe, −Cl, −Br, e −F. Em algumas modalidades, R' é fenila substituída em que cada substituinte é independentemente selecionado dentre −CN, −OMe, −Cl, −Br, e −F. Em algumas modalidades, R' é fenila monossubstituída. Em algumas modalidades, R' é fenila monossubstituída, em que o substituinte é independentemente selecionado dentre −CN, −OMe, −Cl, −Br, e −F. Em algumas modalidades, um substituinte é um grupo removedor de elétrons. Em algumas modalidades, um grupo removedor de elétrons é −CN, −NO2, halogênio, −C(O)R1, −C(O)OR', −C(O)N(R')2, −S(O)R1, −S(O)2R1, −P(W)(R1)2, −P(O)(R1)2, −P(O)(OR')2, ou −P(S)(R1)2.
[00985] Em algumas modalidades, G2 é −CH2−L"−R opcionalmente substituído, em que cada um dentre L" e R é independentemente conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, G2 é −CH(−L"−R)2 opcionalmente substituído, em que cada um dentre L" e R é independentemente conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, G2 é −CH(−S−R)2 opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, G2 é opcionalmente substituído −CH2−S−R. Em algumas modalidades, os dois grupos R são tomados em conjunto com seus átomos intervenientes para formar um anel. Em algumas modalidades, um anel formado é um anel com 5, 6, 7 membros opcionalmente substituído tendo 0 a 2 heteroátomos além dos heteroátomos intervenientes. Em algumas modalidades, G2 é opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, G2 é . Em algumas modalidades, −S− pode ser convertido em −S(O)− ou −S(O)2−, por exemplo, por oxidação,
por exemplo, para facilitar a remoção por uma base.
[00986] Em algumas modalidades, G2 é −L'−R', em que cada variável é conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, G2 é −CH2−R'. Em algumas modalidades, G2 é −CH(R')2. Em algumas modalidades, G2 é −C(R')3. Em algumas modalidades, R' é arila ou heteroarila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é arila ou heteroarila substituída em que um ou mais substituintes são independentemente um grupo removedor de elétrons. Em algumas modalidades, −L'− é opcionalmente substituído −CH2−, e R' é R, em que R é arila ou heteroarila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é arila ou heteroarila substituída em que um ou mais substituintes são independentemente um grupo removedor de elétrons. Em algumas modalidades, R é arila ou heteroarila substituída em que cada substituinte é independentemente um grupo removedor de elétrons. Em algumas modalidades, R é arila ou heteroarila substituída por dois ou mais substituintes, em que cada substituinte é independentemente um grupo removedor de elétrons. Em algumas modalidades, um grupo removedor de elétrons é −CN, −NO2, halogênio, −C(O)R1, −C(O)OR', −C(O)N(R')2, −S(O)R1, −S(O)2R1, −P(W)(R1)2, −P(O)(R1)2, −P(O)(OR')2, ou −P(S)(R1)2. Em algumas modalidades, R' é . Em algumas modalidades, R' é p-
NC NO2Ph−. Em algumas modalidades, R' é . Em algumas modalidades, R' é . Em algumas modalidades, R' é
. Em algumas modalidades, R' é .
Em algumas modalidades, R' é . Em algumas modalidades, G2 é . Em algumas modalidades, R' é . Em algumas modalidades, R' é . Em algumas modalidades, R' é 2,4,6-triclorofenila. Em algumas modalidades, R' é 2,4,6-trifluorofenila. Em algumas modalidades, G2 é −CH(4-clorofenil)2. Em algumas modalidades, G2 é −CH(R')2, em que cada R' é . Em algumas modalidades, G2 é −CH(R')2, em que cada R' é . Em algumas modalidades, R' é −C(O)R. Em algumas modalidades, R' é CH3C(O)−.
[00987] Em algumas modalidades, G2 é −L'−S(O)2R', em que cada variável é conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, G2 é −CH2−S(O)2R'. Em algumas modalidades, G2 é −L'−S(O)R', em que cada variável é conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, G2 é −CH2−S(O)R'. Em algumas modalidades, G2 é −L'−C(O)2R', em que cada variável é conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, G2 é −CH2−C(O)2R'. Em algumas modalidades, G2 é −L'−C(O)R', em que cada variável é conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, G2 é −CH2−C(O)R'. Em algumas modalidades, −L'− é −CH2− opcionalmente substituído, e R' é R. Em algumas modalidades, R é arila ou heteroarila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, R é heteroalifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, R é heteroarila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é opcionalmente substituído arila. Em algumas modalidades, R é fenila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R não é fenila, ou mono-, di- ou tri- fenila substituída, em que cada substituinte é selecionado dentre −NO2, halogênio, −CN, −C1-3 alquila, e C1-3 alquilóxi. Em algumas modalidades, R é arila ou heteroarila substituída em que um ou mais substituintes são independentemente um grupo removedor de elétrons. Em algumas modalidades, R é arila ou heteroarila substituída em que cada substituinte é independentemente um grupo removedor de elétrons. Em algumas modalidades, R é arila ou heteroarila substituída por dois ou mais substituintes, em que cada substituinte é independentemente um grupo removedor de elétrons. Em algumas modalidades, um grupo removedor de elétrons é −CN, −NO2, halogênio, −C(O)R1, −C(O)OR', −C(O)N(R')2, −S(O)R1, −S(O)2R1, −P(W)(R1)2, −P(O)(R1)2, −P(O)(OR')2, ou −P(S)(R1)2. Em algumas modalidades, R' é fenila. Em algumas modalidades, R' é fenila substituída. Em algumas modalidades, R' é . Em
NC algumas modalidades, R' é . Em algumas modalidades, R' é . Em algumas modalidades, R' é C1-6 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, R' é t- butila. Em algumas modalidades, R' é isopropila. Em algumas modalidades, R' é metila. Em algumas modalidades, G2 é −CH2C(O)OMe. Em algumas modalidades, G2 é −CH2C(O)Ph. Em algumas modalidades, G2 é −CH2C(O)-tBu.
[00988] Em algumas modalidades, G2 é −L'−NO2. Em algumas modalidades, G2 é −CH2−NO2. Em algumas modalidades, G2 é −L'−S(O)2N(R')2. Em algumas modalidades, G2 é −CH2−S(O)2N(R')2. Em algumas modalidades, G2 é −L'−S(O)2NHR'. Em algumas modalidades, G2 é −CH2−S(O)2NHR'. Em algumas modalidades, R' é metila. Em algumas modalidades, G2 é −CH2−S(O)2NH(CH3). Em algumas modalidades, R' é −CH2Ph. Em algumas modalidades, G2 é −CH2−S(O)2NH(CH2Ph). Em algumas modalidades, G2 é −CH2−S(O)2N(CH2Ph)2. Em algumas modalidades, R' é fenila. Em algumas modalidades, G2 é −CH2−S(O)2NHPh. Em algumas modalidades, G2 é −CH2−S(O)2N(CH3)Ph. Em algumas modalidades, G2 é −CH2−S(O)2N(CH3)2. Em algumas modalidades, G2 é −CH2−S(O)2NH(CH2Ph). Em algumas modalidades, G2 é −CH2−S(O)2NHPh. Em algumas modalidades, G2 é −CH2−S(O)2NH(CH2Ph). Em algumas modalidades, G2 é −CH2−S(O)2N(CH3)2. Em algumas modalidades, G2 é −CH2−S(O)2N(CH3)Ph. Em algumas modalidades, G2 é −L'−S(O)2N(R')(OR'). Em algumas modalidades, G2 é −CH2−S(O)2N(R')(OR'). Em algumas modalidades, cada R' é metila. Em algumas modalidades, G2 é −CH2−S(O)2N(CH3)(OCH3). Em algumas modalidades, G2 é −CH2−S(O)2N(Ph)(OCH3). Em algumas modalidades, G2 é −CH2−S(O)2N(CH2Ph)(OCH3). Em algumas modalidades, G2 é −CH2−S(O)2N(CH2Ph)(OCH3). Em algumas modalidades, G2 é −L'−S(O)2OR'. Em algumas modalidades, G2 é −CH2−S(O)2OR'. Em algumas modalidades, G2 é −CH2−S(O)2OPh. Em algumas modalidades, G2 é −CH2−S(O)2OCH3. Em algumas modalidades, G2 é −CH2−S(O)2OCH2Ph.
[00989] Em algumas modalidades, G2 é −L'−P(O)(R')2. Em algumas modalidades, G2 é −CH2−P(O)(R')2. Em algumas modalidades, G2 é −L'−P(O)[N(R')2]2. Em algumas modalidades, G2 é −CH2−P(O)[N(R')2]2. Em algumas modalidades, G2 é −L'−P(O)[O(R')2]2. Em algumas modalidades, G2 é −CH2−P(O)[O(R')2]2. Em algumas modalidades, G2 é −L'−P(O)(R')[N(R')2]2. Em algumas modalidades, G2 é −CH2−P(O)(R')[N(R')2]. Em algumas modalidades, G2 é −L'−P(O)(R')[O(R')]. Em algumas modalidades, G2 é −CH2−P(O)(R')[O(R')]. Em algumas modalidades, G2 é −L'−P(O)(OR')[N(R')2]. Em algumas modalidades, G2 é −CH2−P(O)(OR')[N(R')2]. Em algumas modalidades, G2 é −L'−C(O)N(R')2, em que cada variável é conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, G2 é −CH2−C(O)N(R')2. Em algumas modalidades, cada R' é independentemente R. Em algumas modalidades, um R' é alifático opcionalmente substituído, e um R é arila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, um R' é opcionalmente substituído C1-6 alifático, e um R é fenila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, cada R' é independentemente C1-6 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, G2 é −CH2−P(O)(CH3)Ph. Em algumas modalidades, G2 é −CH2−P(O)(CH3)2. Em algumas modalidades, G2 é −CH2−P(O)(Ph)2. Em algumas modalidades, G2 é −CH2−P(O)(OCH3)2. Em algumas modalidades, G2 é −CH2−P(O)(CH2Ph)2. Em algumas modalidades, G2 é −CH2−P(O)[N(CH3)Ph]2. Em algumas modalidades, G2 é −CH2−P(O)[N(CH3)2]2. Em algumas modalidades, G2 é −CH2−P(O)[N(CH2Ph)2]2. Em algumas modalidades, G2 é −CH2−P(O)(OCH3)2. Em algumas modalidades, G2 é −CH2−P(O)(OPh)2.
[00990] Em algumas modalidades, G2 é −L'−SR'.
Em algumas modalidades, G2 é −CH2−SR'. Em algumas modalidades, R' é fenila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R' é fenila.
[00991] Em algumas modalidades, um reagente quiral fornecido tem a estrutura de , em que cada R1 é independentemente conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, um reagente quiral fornecido tem a estrutura de , em que cada R1 é independentemente conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, cada R1 é independentemente R conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, cada R1 é independentemente R, em que R é alifático, arila, heteroalifático ou heteroarila opcionalmente substituído conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, cada R1 é fenila. Em algumas modalidades, R1 é −L−R'. Em algumas modalidades, R1 é −L−R', em que L é −O−, −S−, ou −N(R'). Em algumas modalidades, um reagente quiral fornecido tem a estrutura de , em que cada X1 é independentemente −H, um grupo removedor de elétrons, −NO2, −CN, −OR, −Cl, −Br, ou −F, e W é O ou S. Em algumas modalidades, um reagente quiral fornecido tem a estrutura de
, em que cada X1 é independentemente −H, um grupo removedor de elétrons, −NO2, −CN, −OR, −Cl, −Br, ou −F, e W é O ou S. Em algumas modalidades, cada X1 é independentemente −CN, −OR, −Cl, −Br, ou −F, em que R não é −H. Em algumas modalidades, R é C1-6 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, R é C1-6 alquila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é −CH3. Em algumas modalidades, um ou mais X1 são independentemente grupos removedores de elétrons (por exemplo, −CN, −NO2, halogênio, −C(O)R1, −C(O)OR', −C(O)N(R')2, −S(O)R1, −S(O)2R1, −P(W)(R1)2, −P(O)(R1)2, −P(O)(OR')2, −P(S)(R1)2, etc.).
[00992] Em algumas modalidades, um reagente quiral fornecido tem a estrutura de , em que R1 é conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, um reagente quiral fornecido tem a estrutura de , em que R1 é conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, R1 é R conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, R1 é R, em que R é alifático, arila, heteroalifático ou heteroarila opcionalmente substituído conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, R1 é −L−R'. Em algumas modalidades, R1 é
−L−R', em que L é −O−, −S−, ou −N(R'). Em algumas modalidades, um reagente quiral fornecido tem a estrutura de , em que X1 é −H, um grupo removedor de elétrons, −NO2, −CN, −OR, −Cl, −Br, ou −F, e W é O ou S. Em algumas modalidades, um reagente quiral fornecido tem a estrutura de , em que X1 é −H, um grupo removedor de elétrons, −NO2, −CN, −OR, −Cl, −Br, ou −F, e W é O ou S. Em algumas modalidades, X1 é −CN, −OR, −Cl, −Br, ou −F, em que R não é −H. Em algumas modalidades, R é C1-6 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, R é C1-6 alquila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é −CH3. Em algumas modalidades, X1 é um grupo removedor de elétrons (por exemplo, −CN, −NO2, halogênio, −C(O)R1, −C(O)OR', −C(O)N(R')2, −S(O)R1, −S(O)2R1, −P(W)(R1)2, −P(O)(R1)2, −P(O)(OR')2,−P(S)(R1)2, etc.). Em algumas modalidades, X1 é um grupo removedor de elétrons que não é −CN, −NO2, ou halogênio. Em algumas modalidades, X1 não é −H, −CN, −NO2, halogênio, ou C1-3 alquilóxi.
[00993] Em algumas modalidades, G2 é −CH(R21)−CH(R22)=C(R23)(R24), em que cada um dentre R21, R22, R23, e R24 é independentemente R. Em algumas modalidades, R22 e R23 são ambos R, e os dois grupos R são tomados em conjunto com seus átomos intervenientes para formar um anel arila ou heteroarila opcionalmente substituído conforme descrito no presente documento. Em algumas modalidades, um ou mais substituintes são independentemente grupos removedores de elétrons.
Em algumas modalidades, R21 e R24 são ambos R, e os dois grupos R são tomados em conjunto com seus átomos intervenientes para formar um anel opcionalmente substituído conforme descrito no presente documento.
Em algumas modalidades, R21 e R24 são ambos R, e os dois grupos R são tomados em conjunto com seus átomos intervenientes para formar um anel saturado ou parcialmente saturado opcionalmente substituído conforme descrito no presente documento.
Em algumas modalidades, R22 e R23 são ambos R, e os dois grupos R são tomados em conjunto com seus átomos intervenientes para formar um anel arila ou heteroarila opcionalmente substituído conforme descrito no presente documento, e R21 e R24 são ambos R, e os dois grupos R são tomados em conjunto com seus átomos intervenientes para formar um anel parcialmente saturado opcionalmente substituído conforme descrito no presente documento.
Em algumas modalidades, R21 é −H.
Em algumas modalidades, R24 é −H.
Em algumas modalidades, G2 é opcionalmente substituído.
Em algumas modalidades, G2 é opcionalmente substituído, , ou , em que cada Anel A2 é independentemente um anel monocíclico, bicíclico ou policíclico com 3 a 15 membros conforme descrito no presente documento.
Em algumas modalidades, o Anel A2 é um anel arila ou heteroarila monocíclico com 5 a 10 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 5 heteroátomos conforme descrito no presente documento.
Em algumas modalidades, o Anel A2 é um anel fenila opcionalmente substituído conforme descrito no presente documento. Em algumas modalidades, Em algumas modalidades, G2 é opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, G2 é . Em algumas modalidades, G2 é . Em algumas modalidades, G2 é .
[00994] Certos compostos exemplificativos úteis para auxiliares quirais são apresentados, por exemplo, nas Tabelas CA-1 a CA-13. Em algumas modalidades, um composto útil é um enantiômero de um composto, por exemplo, nas Tabelas CA-1 a CA-13. Em algumas modalidades, um composto útil é um diastereômero de um composto, por exemplo, nas Tabelas CA-1 a CA-13. Em algumas modalidades, um composto útil para auxiliares quirais para remoção sob condições básicas (por exemplo, por meio de uma base sob uma condição anidra) é um composto das Tabelas CA-1 a CA-13, ou um enantiômero ou um diastereômero do mesmo. Em algumas modalidades, tal composto é um composto da Tabela CA-1 ou um enantiômero ou um diastereômero do mesmo. Em algumas modalidades, tal composto é um composto da Tabela CA- 2 ou um enantiômero ou um diastereômero do mesmo. Em algumas modalidades, tal composto é um composto da Tabela CA-3 ou um enantiômero ou um diastereômero do mesmo. Em algumas modalidades, tal composto é um composto da Tabela CA-4 ou um enantiômero ou um diastereômero do mesmo. Em algumas modalidades, tal composto é um composto da Tabela CA-5 ou um enantiômero ou um diastereômero do mesmo. Em algumas modalidades, tal composto é um composto da Tabela CA-6 ou um enantiômero ou um diastereômero do mesmo. Em algumas modalidades, tal composto é um composto da Tabela CA-7 ou um enantiômero ou um diastereômero do mesmo. Em algumas modalidades, tal composto é um composto da Tabela CA-8 ou um enantiômero ou um diastereômero do mesmo. Em algumas modalidades, tal composto é um composto da Tabela CA-9 ou um enantiômero ou um diastereômero do mesmo. Em algumas modalidades, tal composto é um composto da Tabela CA-10 ou um enantiômero ou um diastereômero do mesmo. Em algumas modalidades, tal composto é um composto da Tabela CA-11 ou um enantiômero ou um diastereômero do mesmo. Em algumas modalidades, tal composto é um composto da Tabela CA-12 ou um enantiômero ou um diastereômero do mesmo. Em algumas modalidades, tal composto é um composto da Tabela CA-13 ou um enantiômero ou um diastereômero do mesmo.
[00995] Em algumas modalidades, quando entra em contato com uma base, uma porção química de auxiliar quiral, por exemplo, de uma ligação internucleotídica, cujo composto correspondente é um composto da Fórmula 3-I ou 3-AA pode ser liberada como um alceno, que tem a mesma estrutura que um produto formado pela eliminação de uma molécula de água do composto correspondente (eliminação de −W2−H = −OH e um alfa- H de G2). Em algumas modalidades, tal alceno tem a estrutura de (grupo removedor de elétrons)2=C(R1)−L−N(R5)(R6), (grupo removedor de elétrons)H=C(R1)−L−N(R5)(R6), CH(−L"−R')=C(R1)−L−N(R5)(R6) em que o grupo CH é opcionalmente substituído, ou Cx=C(R1)−L−N(R5)(R6), em que Cx é opcionalmente substituído, e pode ser opcionalmente fundido com um ou mais anéis opcionalmente substituídos, e cada outra variável é independentemente conforme descrito no presente documento. Em algumas modalidades, Cx é opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, Cx é . Em algumas modalidades, tal alceno é . Em algumas modalidades, tal alceno é . Em algumas modalidades, tal alceno é .
[00996] Em algumas modalidades, um reagente quiral é um aminoálcool. Em algumas modalidades, um reagente quiral é um aminotiol. Em algumas modalidades, um reagente quiral é um aminofenol. Em algumas modalidades, um reagente quiral é (S)- e (R)-2-metilamino-1-feniletanol, (1R, 2S)- efedrina, ou (1R, 2S)-2-metilamino-1,2-difeniletanol.
[00997] Em algumas modalidades da revelação, um reagente quiral é um composto de uma das seguintes fórmulas: Fórmula O Fórmula P Fórmula Q Fórmula R
DPSE.
[00998] Em algumas modalidades, um reagente quiral útil é um composto selecionado dentre os compostos abaixo, ou seu estereoisômero relacionado, particularmente enantiômero (por exemplo, WV-CA-237 é um estereoisômero relacionado de WV-CA-236 (um diastereômero relacionado, tendo a mesma constituição, a mesma configuração em centro quiral, porém não no outro); WV-CA-108 é um enantiômero relacionado de WV-CA-236 (imagem espelhada um do outro)): Tabela CA-1. Auxiliares quirais exemplificativos.
WV-CA-231 WV-CA-232 WV-CA-233 WV-CA-234 WV-CA-235 WV-CA-236
WV-CA-237 WV-CA-238
H
HO N WV-CA-239
NC WV-CA-240 WV-CA-241 WV-CA-242 WV-CA-243
WV-CA-244 WV-CA-245
H
HO N WV-CA-246
S
S WV-CA-247 WV-CA-248 WV-CA-249 WV-CA-250 WV-CA-251
WV-CA-252
WV-CA-253
WV-CA-254
WV-CA-255
WV-CA-256
WV-CA-257
WV-CA-258 WV-CA-259 WV-CA-260
H HO N
O WV-CA-261
O S
O WV-CA-262 WV-CA-263
WV-CA-264
WV-CA-265
WV-CA-266
WV-CA-267
WV-CA-268
WV-CA-269
WV-CA-270
WV-CA-271
WV-CA-272
WV-CA-273
WV-CA-274
WV-CA-275
WV-CA-276
WV-CA-277
WV-CA-278
WV-CA-279
WV-CA-280
WV-CA-281
WV-CA-282
WV-CA-283
WV-CA-284
WV-CA-285
WV-CA-286
WV-CA-287
WV-CA-288
WV-CA-289
WV-CA-290
WV-CA-291
WV-CA-293 WV-CA-294
[00999] Em algumas modalidades, um composto fornecido é um enantiômero de um composto selecionado dentre a Tabela CA-1 ou um sal do mesmo. Em algumas modalidades, um composto fornecido é um diastereômero de um composto selecionado dentre a Tabela CA-1 ou um sal do mesmo.
[001000] Em algumas modalidades, um reagente quiral útil é um composto selecionado dentre os compostos abaixo, ou seu estereoisômero relacionado, particularmente enantiômero: Tabela CA-2. Auxiliares quirais exemplificativos.
H WV-CA- WV-CA- HO N 231 239 NC WV-CA- WV-CA- 249 272 WV-CA- WV-CA- 273 274
WV-CA- WV-CA- 275 276 WV-CA- WV-CA- 277 278 WV-CA- WV-CA- 279 280 WV-CA- WV-CA- 281 282 WV-CA- WV-CA- 283 284 WV-CA- 285
[001001] Em algumas modalidades, um composto fornecido é um enantiômero de um composto selecionado dentre a Tabela CA-2 ou um sal do mesmo. Em algumas modalidades, um composto fornecido é um diastereômero de um composto selecionado dentre a Tabela CA-2 ou um sal do mesmo.
[001002] Em algumas modalidades, um reagente quiral útil é um composto selecionado dentre os compostos abaixo, ou seu estereoisômero relacionado, particularmente enantiômero: Tabela CA-3. Auxiliares quirais exemplificativos.
WV-CA- WV-CA- 236 237 WV-CA- WV-CA- 238 240 WV-CA- WV-CA- 241 242 WV-CA- WV-CA- 243 252 WV-CA- WV-CA- 290 291
WV-CA- WV-CA- 108 183
[001003] Em algumas modalidades, um composto fornecido é um enantiômero de um composto selecionado dentre a Tabela CA-3 ou um sal do mesmo. Em algumas modalidades, um composto fornecido é um diastereômero de um composto selecionado dentre a Tabela CA-3 ou um sal do mesmo.
[001004] Em algumas modalidades, um reagente quiral útil é um composto selecionado dentre os compostos abaixo, ou seu estereoisômero relacionado, particularmente enantiômero: Tabela CA-4. Auxiliares quirais exemplificativos.
WV-CA- WV-CA- 251 253 WV-CA- WV-CA- 255 257 WV-CA- WV-CA- 258 263
[001005] Em algumas modalidades, um composto fornecido é um enantiômero de um composto selecionado dentre a Tabela CA-4 ou um sal do mesmo. Em algumas modalidades, um composto fornecido é um diastereômero de um composto selecionado dentre a Tabela CA-4 ou um sal do mesmo.
[001006] Em algumas modalidades, um reagente quiral útil é um composto selecionado dentre os compostos abaixo, ou seu estereoisômero relacionado, particularmente enantiômero: Tabela CA-5. Auxiliares quirais exemplificativos.
WV-CA- WV-CA- 254 256 WV-CA- 259
[001007] Em algumas modalidades, um composto fornecido é um enantiômero de um composto selecionado dentre a Tabela CA-5 ou um sal do mesmo. Em algumas modalidades, um composto fornecido é um diastereômero de um composto selecionado dentre a Tabela CA-5 ou um sal do mesmo.
[001008] Em algumas modalidades, um reagente quiral útil é um composto selecionado dentre os compostos abaixo, ou seu estereoisômero relacionado, particularmente enantiômero: Tabela CA-6. Auxiliares quirais exemplificativos.
H
HO N WV-CA- WV-CA- O 260 261 O S
O WV-CA- 262
[001009] Em algumas modalidades, um composto fornecido é um enantiômero de um composto selecionado dentre a Tabela CA-6 ou um sal do mesmo. Em algumas modalidades, um composto fornecido é um diastereômero de um composto selecionado dentre a Tabela CA-6 ou um sal do mesmo.
[001010] Em algumas modalidades, um reagente quiral útil é um composto selecionado dentre os compostos abaixo, ou seu estereoisômero relacionado, particularmente enantiômero: Tabela CA-7. Auxiliares quirais exemplificativos.
WV-CA- WV-CA- 245 264 WV-CA- WV-CA- 265 266
[001011] Em algumas modalidades, um composto fornecido é um enantiômero de um composto selecionado dentre a Tabela CA-7 ou um sal do mesmo. Em algumas modalidades, um composto fornecido é um diastereômero de um composto selecionado dentre a Tabela CA-7 ou um sal do mesmo.
[001012] Em algumas modalidades, um reagente quiral útil é um composto selecionado dentre os compostos abaixo, ou seu estereoisômero relacionado, particularmente enantiômero: Tabela CA-8. Auxiliares quirais exemplificativos.
WV-CA- WV-CA- 267 269 WV-CA- 271
[001013] Em algumas modalidades, um composto fornecido é um enantiômero de um composto selecionado dentre a Tabela CA-8 ou um sal do mesmo. Em algumas modalidades, um composto fornecido é um diastereômero de um composto selecionado dentre a Tabela CA-8 ou um sal do mesmo.
[001014] Em algumas modalidades, um reagente quiral útil é um composto selecionado dentre os compostos abaixo, ou seu estereoisômero relacionado, particularmente enantiômero:
Tabela CA-9. Auxiliares quirais exemplificativos.
WV-CA- WV-CA- 268 270
[001015] Em algumas modalidades, um composto fornecido é um enantiômero de um composto selecionado dentre a Tabela CA-9 ou um sal do mesmo. Em algumas modalidades, um composto fornecido é um diastereômero de um composto selecionado dentre a Tabela CA-9 ou um sal do mesmo.
[001016] Em algumas modalidades, um reagente quiral útil é um composto selecionado dentre os compostos abaixo, ou seu estereoisômero relacionado, particularmente enantiômero: Tabela CA-10. Auxiliares quirais exemplificativos.
H
HO N WV-CA- WV-CA- 244 246 S
S
[001017] Em algumas modalidades, um composto fornecido é um enantiômero de um composto selecionado dentre a Tabela CA-10 ou um sal do mesmo. Em algumas modalidades, um composto fornecido é um diastereômero de um composto selecionado dentre a Tabela CA-10 ou um sal do mesmo.
[001018] Em algumas modalidades, um reagente quiral útil é um composto selecionado dentre os compostos abaixo, ou seu estereoisômero relacionado, particularmente enantiômero: Tabela CA-11. Auxiliares quirais exemplificativos.
WV-CA- WV-CA- 247 248
[001019] Em algumas modalidades, um composto fornecido é um enantiômero de um composto selecionado dentre a Tabela CA-11 ou um sal do mesmo. Em algumas modalidades, um composto fornecido é um diastereômero de um composto selecionado dentre a Tabela CA-11 ou um sal do mesmo.
[001020] Em algumas modalidades, um reagente quiral útil é um composto selecionado dentre os compostos abaixo, ou seu estereoisômero relacionado, particularmente enantiômero: Tabela CA-12. Auxiliares quirais exemplificativos.
WV-CA- WV-CA- 250 286 WV-CA- WV-CA- 287 288 WV-CA- 289
[001021] Em algumas modalidades, um composto fornecido é um enantiômero de um composto selecionado dentre a Tabela CA-12 ou um sal do mesmo. Em algumas modalidades, um composto fornecido é um diastereômero de um composto selecionado dentre a Tabela CA-12 ou um sal do mesmo.
[001022] Em algumas modalidades, um reagente quiral útil é um composto selecionado dentre os compostos abaixo, ou seu estereoisômero relacionado, particularmente enantiômero: Tabela CA-13. Auxiliares quirais exemplificativos.
WV-CA- WV-CA- 110 315 WV-CA- WV-CA- 110b 324
[001023] Em algumas modalidades, um composto fornecido é um enantiômero de um composto selecionado dentre a Tabela CA-13 ou um sal do mesmo. Em algumas modalidades, um composto fornecido é um diastereômero de um composto selecionado dentre a Tabela CA-13 ou um sal do mesmo.
[001024] Conforme observado por aqueles versados na técnica, os reagentes quirais são tipicamente estereopuros ou substancialmente estereopuros, e são tipicamente utilizados como um único estereoisômero substancialmente isento de outros estereoisômeros. Em algumas modalidades, os compostos da presente revelação são estereopuros ou substancialmente estereopuros.
[001025] Conforme demonstrado no presente documento, quando usados para preparar uma ligação internucleotídica quiral, para obter estereosseletividade geralmente os reagentes quirais estereoquimicamente puros são utilizados. Entre outros fatores, a presente revelação fornece reagentes quirais estereoquimicamente puros, inclusive aqueles que têm as estruturas descritas.
[001026] A escolha do reagente quiral, por exemplo, o isômero representado pela Fórmula Q ou seu estereoisômero, Fórmula R, permite o controle de quiralidade específico em um fósforo de ligação. Desse modo, uma configuração Rp ou Sp pode ser selecionada em cada ciclo sintético, permitindo o controle da estrutura tridimensional total de um oligonucleotídeo quiralmente controlado. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo quiralmente controlado tem todos os estereocentros Rp. Em algumas modalidades da revelação, um oligonucleotídeo quiralmente controlado tem dos os estereocentros Sp. Em algumas modalidades da revelação, cada fósforo de ligação no oligonucleotídeo quiralmente controlado é independentemente Rp ou Sp. Em algumas modalidades da revelação, cada fósforo de ligação no oligonucleotídeo quiralmente controlado é independentemente Rp ou Sp, e pelo menos um é Rp e pelo menos um é Sp. Em algumas modalidades, a seleção de centros Rp e Sp é feita para conferir uma superestrutura tridimensional específica a um oligonucleotídeo quiralmente controlado. Exemplos de tal seleção são descritos em mais detalhes no presente documento.
[001027] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido compreende uma porção química de auxiliar quiral, por exemplo, em uma ligação internucleotídica. Em algumas modalidades, um auxiliar quiral é conectado a um fósforo de ligação. Em algumas modalidades, a auxiliar quiral é conectado a um fósforo de ligação através de W2. Em algumas modalidades, um auxiliar quiral é conectado a um fósforo de ligação através de W2, em que W2 é O. Opcionalmente, W1, por exemplo, quando W1 é −NG5−, é capeado durante a síntese de oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, W1 em um auxiliar quiral em um oligonucleotídeo é capeado, por exemplo, por meio de um reagente de capping durante a síntese de oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, W1 pode ser intencionalmente capeado para modular a propriedade de oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, W1 é capeado com −R1. Em algumas modalidades, R1 é −C(O)R'. Em algumas modalidades, R' é C1-6 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, R' é metila.
[001028] Em algumas modalidades, um reagente quiral para uso de acordo com a presente revelação é selecionado por sua capacidade de ser removido em uma etapa particular no ciclo mostrado acima. Por exemplo, em algumas modalidades, é desejável remover um reagente quiral durante a etapa de modificação do fósforo de ligação. Em algumas modalidades, é desejável remover um reagente quiral antes da etapa de modificação do fósforo de ligação. Em algumas modalidades, é desejável remover um reagente quiral após a etapa de modificação do fósforo de ligação. Em algumas modalidades, é desejável remover um reagente quiral após uma primeira etapa de acoplamento ter ocorrido, porém antes de uma segunda etapa de acoplamento ter ocorrido, de modo que um reagente quiral não esteja presente no oligonucleotídeo em crescimento durante o segundo acoplamento (e, igualmente para etapas de acoplamento subsequentes adicionais). Em algumas modalidades, um reagente quiral é removido durante uma reação de "desbloqueio" que ocorre após a modificação do fósforo de ligação, mas antes do início de um ciclo subsequente. Métodos e reagentes exemplificativos para remoção são descritos no presente documento.
[001029] Em algumas modalidades, a remoção de auxiliar quiral é obtida ao realizar a etapa de modificação e/ou desbloqueio, conforme ilustrado no Esquema I. Pode ser benéfico combinar a remoção de auxiliar quiral com outras transformações, tal como modificação e desbloqueio. Uma pessoa de habilidade comum na técnica pode observar que as etapas salvas/transformação podem aprimorar a eficiência total da síntese, por exemplo, em relação ao rendimento e pureza de produto, especialmente para oligonucleotídeos mais longos. Um um exemplo em que o auxiliar quiral é removido durante modificação e/ou desbloqueio é ilustrado no Esquema I.
[001030] Em algumas modalidades, um reagente quiral para uso de acordo com os métodos da presente revelação é caracterizado pelo fato de que o mesmo é removível sob determinadas condições. Por exemplo, em algumas modalidades, um reagente quiral é selecionado por sua capacidade de ser removido sob condições ácidas. Em determinadas modalidades, um reagente quiral é selecionado por sua capacidade de ser removido sob condições moderadamente ácidas. Em determinadas modalidades, um reagente quiral é selecionado por sua capacidade de ser removido por meio de uma reação de eliminação E1 (por exemplo, a remoção ocorre devido à formação de cátion intermediário no reagente quiral sob condições ácidas, fazendo com que o reagente quiral clive a partir do oligonucleotídeo). Em algumas modalidades, um reagente quiral é caracterizado pelo fato de que o mesmo tem uma estrutura reconhecida como sendo capaz de acomodar ou facilitar uma reação de eliminação E1. Uma pessoa versada na técnica relevante irá observar que estruturas podem ser consideradas como sendo propensas a sofrer tais reações de eliminação.
[001031] Em algumas modalidades, um reagente quiral é selecionado por sua capacidade de ser removido com um nucleófilo. Em algumas modalidades, um reagente quiral é selecionado por sua capacidade de ser removido com um nucleófilo de amina. Em algumas modalidades, um reagente quiral é selecionado por sua capacidade de ser removido com um nucleófilo diferente de uma amina.
[001032] Em algumas modalidades, um reagente quiral é selecionado por sua capacidade de ser removido com uma base. Em algumas modalidades, um reagente quiral é selecionado por sua capacidade de ser removido com uma amina. Em algumas modalidades, um reagente quiral é selecionado por sua capacidade de ser removido com uma diferente de uma amina.
[001033] Em algumas modalidades, as fosforamiditas quiralmente puras que compreendem auxiliares quirais podem ser isoladas antes do uso. Em algumas modalidades, as fosforamiditas quiralmente puras que compreendem auxiliares quirais podem ser usadas sem isolamento - em algumas modalidades, elas podem ser usadas diretamente após a formação. Ativação
[001034] Conforme observado por aqueles versados na técnica, a preparação de oligonucleotídeo pode usar várias condições, reagentes, etc. para ativar um componente de reação, por exemplo, durante a preparação de fosforamidita, durante uma ou mais etapas durante os ciclos, durante a clivagem/desproteção pós-ciclo, etc. Várias tecnologias para ativação podem ser utilizadas de acordo com a presente revelação, incluindo, porém sem limitação aquelas descritas nos documentos US 9695211, US 9605019, US 9598458, US 2013/0178612, US 20150211006, US 20170037399, WO 2017/015555, WO 2017/062862, WO 2017/160741, WO 2017/192664, WO 2017/192679, WO 2017/210647, WO 2018/223056, WO 2018/237194, e/ou WO 2019/055951, as tecnologias de ativação de cada uma das quais são incorporadas a título de referência. Determinadas tecnologias de ativação, por exemplo, reagentes, condições, métodos, etc. são ilustradas nos Exemplos. Acoplamento
[001035] Em algumas modalidades, os ciclos da presente revelação compreendem etapas de condensação/acoplamento estereosseletivas para formar ligações internucleotídicas quiralmente controladas. Para condensação, frequentemente um reagente de ativação é usado, tal como 4,5- dicianoimidazol (DCI), 4,5-dicloroimidazol, triflato de 1- fenilimidazólio (PhIMT), triflato de benzimidazólio (BIT), benztriazol, 3-nitro-l,2,4-triazol (NT), tetrazol, 5- etiltiotetrazol (ETT), 5-benziltiotetrazol (BTT), 5-(4- nitrofenil)tetrazol, triflato de N-cianometilpirrolidínio (CMPT), triflato de N-cianometilpiperidínio, triflato de N- cianometildimetilamônio, etc. As condições e reagentes adequados, incluindo fosforamiditas quirais, incluem aquelas descritas nos documentos US 9695211, US 9605019, US 9598458, US 2013/0178612, US 20150211006, US 20170037399, WO 2017/015555, WO 2017/062862, WO 2017/160741, WO 2017/192664, WO 2017/192679, WO 2017/210647, WO 2018/223056, WO 2018/237194, e/ou WO 2019/055951, os reagentes de condensação, condições e métodos de cada um dos quais são incorporados a título de referência. Determinadas tecnologias de acoplamento,
por exemplo, reagentes, condições, métodos, etc. são ilustradas nos Exemplos.
[001036] Em algumas modalidades, uma fosforamidita para acoplamento tem a estrutura de , , ou , em que cada variável é independentemente conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, cada R é independentemente C1-6 alifático opcionalmente substituído. Uma pessoa versada na técnica irá observar que dois grupos R em qualquer estrutura ou fórmula podem ser iguais ou diferentes. Em algumas modalidades, cada R é independentemente C1-6 alquila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, cada R é independentemente C1-6 alquenila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, cada R é independentemente C1-6 alquinila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, cada R é independentemente isopropila. Em algumas modalidades, −X−L−R1 compreende um grupo triazol opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, X é uma ligação covalente. Em algumas modalidades, L é uma ligação covalente. Em algumas modalidades, −X−L−R1 é R1. Em algumas modalidades, R1 compreende um anel opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, R1 é R conforme descrito no presente documento. Em algumas modalidades, R1 é opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, R1 é . Em algumas modalidades, R1 é .Em algumas modalidades, R1 é . Em algumas modalidades, −L− compreende C1-6 alquileno. Em algumas modalidades, −L− compreende C1-6 alquenileno. Em algumas modalidades, −L− compreende . Em algumas modalidades, R1 é R conforme descrito no presente documento. Em algumas modalidades, −L− é e R1 é H. Em algumas modalidades, −L−R1 é . Em algumas modalidades, −X−L−R1 é . Em algumas modalidades, −X−L−R1 é –OCH2CH2CN.
[001037] Em algumas modalidades, uma fosforamidita quiral para acoplamento tem a estrutura de , , , , , ou , em que cada variável é independentemente conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, uma fosforamidita quiral para acoplamento tem a estrutura de , , ,
, , , ,
, , , ,
, , ou . Em algumas modalidades, uma fosforamidita quiral para acoplamento tem a estrutura de , , ,
, , ,
, ou , em que cada variável é independentemente conforme descrito na presente revelação.
Em algumas modalidades, G1 ou G2 compreende um grupo removedor de elétrons conforme descrito na presente revelação.
Em algumas modalidades, uma fosforamidita quiral para acoplamento tem a estrutura de , ,
, , , ,
, , , , , ou , em que cada variável é independentemente conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, R1 é R' conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, R1 é R conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, R é fenila opcionalmente substituída conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, R é fenila. Em algumas modalidades, R é 4-metil fenila. Em algumas modalidades, R é 4-metoxi fenila. Em algumas modalidades, R é C1-6 alifático opcionalmente substituído conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, R é C1-6 alquila opcionalmente substituída conforme descrito na presente revelação. Por exemplo, em algumas modalidades, R é metila; em algumas modalidades, R é isopropila; em algumas modalidades, R é t-butila; etc.
[001038] Em algumas modalidades, R5s−Ls− é R'O−. Em algumas modalidades, R'O− é DMTrO−. Em algumas modalidades, R4s é −H. Em algumas modalidades, R4s e R2s são tomados em conjunto para formar uma ponte −L−O− conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, o −O− é conectado ao carbono na posição 2'. Em algumas modalidades, L é −CH2−. Em algumas modalidades, L é −CH(Me)−. Em algumas modalidades, L é −(R)−CH(Me)−. Em algumas modalidades, L é −(S)−CH(Me)−. Em algumas modalidades, R2s é −H. Em algumas modalidades, R2s é −F. Em algumas modalidades, R2s é −OR'. Em algumas modalidades, R2s é −OMe. Em algumas modalidades, R2s é −MOE. Conforme observado por aqueles versados na técnica, BA pode ser adequadamente protegido durante a síntese.
[001039] Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica formada em uma etapa de acoplamento tem a estrutura da fórmula I ou uma forma de sal da mesma. Em algumas modalidades, PL é P. Em algumas modalidades, −X−L−R1 é , , , , , , , , , ou , em que cada variável é independentemente de acordo com a presente revelação. Em algumas modalidades, −X−L−R1 é −CH2CH2CN.
[001040] Em algumas modalidades, um acoplamento forma uma ligação internucleotídica com uma estereosseletividade de 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais. Em algumas modalidades, a estereosseletividade é de 85% ou mais. Em algumas modalidades, a estereosseletividade é de 85% ou mais. Em algumas modalidades, a estereosseletividade é de 90% ou mais. Em algumas modalidades, a estereosseletividade é de 91% ou mais. Em algumas modalidades, a estereosseletividade é de 92% ou mais. Em algumas modalidades, a estereosseletividade é de 93% ou mais. Em algumas modalidades, a estereosseletividade é de 94% ou mais. Em algumas modalidades, a estereosseletividade é de 95% ou mais. Em algumas modalidades, a estereosseletividade é de 96% ou mais. Em algumas modalidades, a estereosseletividade é de 97% ou mais. Em algumas modalidades, a estereosseletividade é de 98% ou mais. Em algumas modalidades, a estereosseletividade é de 99% ou mais. Capping
[001041] Se o ácido nucleico final for maior que um dímero, uma porção química -OH não reagida é geralmente capeada com um grupo de bloqueio/capping. Auxiliares quirais nos oligonucleotídeos também podem ser capeados com um grupo de bloqueio para formar um intermediário condensado capeado. As tecnologias de capping adequadas (por exemplo, reagentes, condições, etc.) incluem aquelas descritas nos documentos US 9695211, US 9605019, US 9598458, US 2013/0178612, US 20150211006, US 20170037399, WO 2017/015555, WO 2017/062862, WO 2017/160741, WO 2017/192664, WO 2017/192679, WO 2017/210647, WO 2018/223056, WO 2018/237194, e/ou WO 2019/055951, as tecnologias de capping de cada um dos quais são incorporadas a título de referência. Em algumas modalidades, um reagente de capping é um ácido carboxílico ou um derivado do mesmo. Em algumas modalidades, um reagente de capping é R'COOH. Em algumas modalidades, uma etapa de capping introduz R'COO− no grupo 5'-OH não reagido e/ou grupos amino nos auxiliares quirais. Em algumas modalidades, um ciclo pode compreender duas ou mais etapas de capping. Em algumas modalidades, um ciclo compreende um primeiro capping antes da modificação de um produto de acoplamento (por exemplo,
converter P(III) em P(V)), e outro capping após a modificação de um produto de acoplamento.
Em algumas modalidades, um primeiro capping é realizado sob uma condição de amidação, por exemplo, que compreende um reagente acilante (por exemplo, um anidrido que tem a estrutura de (RC(O))2O, (por exemplo, Ac2O)) e uma base (por exemplo, 2,6-lutidina). Em algumas modalidades, um primeiro capping capeia um grupo amino, por exemplo, aquele de um auxiliar quiral em uma ligação internucleotídica.
Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica formada em uma etapa de acoplamento tem a estrutura da fórmula I ou uma forma de sal da mesma.
Em algumas modalidades, PL é P.
Em algumas modalidades, −X−L−R1 é , ,
, , , , ,
, , ou , em que cada variável é independentemente de acordo com a presente revelação.
Em algumas modalidades, R1 é R−C(O)−. Em algumas modalidades, R é CH3−. Em algumas modalidades, cada acoplamento quiralmente controlado (por exemplo, com o uso de um auxiliar quiral) é seguido de um primeiro capping.
Tipicamente, os ciclos para acoplamento não quiralmente controlado com o uso de fosforamidita tradicional para construir ligações fosfato naturais não contêm um primeiro capping.
Em algumas modalidades, um segundo capping é realizado, por exemplo, sob uma condição de esterificação (por exemplo, condições de capping de síntese de oligonucleotídeo de fosforamidita tradicional) em que 5'−OH livre é capeado.
[001042] Determinadas tecnologias de capping, por exemplo, reagentes, condições, métodos, etc. são ilustradas nos Exemplos. Modificação
[001043] Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica em que seu fósforo de ligação existe como P(III) é modificado para formar outra ligação internucleotídica modificada (por exemplo, uma da fórmula I, I-a, I-b, I-c, I-n-1, I-n-2, I-n-3, I-n-4, II, II-a-1, II-a- 2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, II-d-2, III, ou uma forma de sal do mesmo) ou uma ligação fosfato natural. Em muitas modalidades, P(III) é modificado por reação com eletrófilo. Vários tipos de reações adequadas para P(III) podem ser utilizadas de acordo com a presente revelação. As tecnologias de modificação adequadas a(por exemplo, reagentes (por exemplo, reagente de sulfurização, reagente de oxidação, etc.), condições, etc.) incluem aquelas descritas nos documentos US 9695211, US 9605019, US 9598458, US 2013/0178612, US 20150211006, US 20170037399, WO 2017/015555, WO 2017/062862, WO 2017/160741, WO 2017/192664, WO 2017/192679, WO 2017/210647, WO 2018/223056, WO 2018/237194, e/ou WO 2019/055951, as tecnologias de modificação de cada um dos quais são incorporadas a título de referência.
[001044] Em algumas modalidades, conforme ilustrado nos Exemplos, a presente revelação fornece reagentes de modificação para introduzir ligações internucleotídicas não negativamente carregadas que incluem ligações internucleotídicas neutras.
[001045] Em algumas modalidades, a modificação ocorre dentro de um ciclo. Em algumas modalidades, a modificação pode se situar fora de um ciclo. Por exemplo, em algumas modalidades, uma ou mais etapas de modificação podem ser realizadas após a cadeia de oligonucleotídeo ter sido alcançada para introduzir modificações simultaneamente em uma ou mais ligações internucleotídicas e/ou outros locais.
[001046] Em algumas modalidades, a modificação compreende o uso de uma química click, por exemplo, em que um grupo alcino de um oligonucleotídeo, por exemplo, de uma ligação internucleotídica, é reagido com uma azida. Vários reagentes e condições para química click podem ser utilizados de acordo com a presente revelação. Em algumas modalidades, uma azida tem a estrutura de R1−N3, em que R1 é conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, R1 é C1-6 alquila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R1 é isopropila.
[001047] Em algumas modalidades, conforme demonstrado nos exemplos, uma ligação P(III) pode ser convertida em uma ligação internucleotídica não negativamente carregada ao reagir a ligação P(III) com uma azida ou um sal azido imidazolínio (por exemplo, um composto que compreende ; em algumas modalidades, denominada como uma reação azida) sob condições adequadas. Em algumas modalidades, um sal azido imidazolínio é um sal de PF6−. Em algumas modalidades,
um sal azido imidazolínio é um sal de . Em algumas modalidades, um reagente útil, por exemplo, um sal azido imidazolínio, é um sal de . Em algumas modalidades,
um reagente útil é um sal de . Em algumas modalidades, um reagente útil é um sal de . Em algumas modalidades, um reagente útil é um sal de . Tais reagentes que compreendem cátions de nitrogênio também contêm contra-ânions (por exemplo, Q− conforme descrito na presente revelação), que são amplamente conhecidos na técnica e estão contidos em vários reagentes químicos.
Em algumas modalidades, um reagente útil é Q+Q−, em que Q+ é ,
, , , ou , e Q− é um contra-ânion.
Em algumas modalidades, Q+ é . Em algumas modalidades, Q+ é . Em algumas modalidades, Q+ é
. Em algumas modalidades, Q+ é . Em algumas modalidades, Q+ é . Conforme observado por aqueles versados na técnica, em um composto que tem a estrutura de Q+Q−, tipicamente o número de cargas positivas em Q+ é igual ao número de cargas negativas em Q−. Em algumas modalidades, Q+ é um cátion monovalente e Q− é um ânion monovalente.
Em algumas modalidades, Q− é F−, Cl−, Br−, BF4−, PF6−, TfO−, Tf2N−, AsF6−, ClO4−, ou SbF6−. Em algumas modalidades, Q− é PF6−. Aqueles versados na técnica irão observar prontamente que muitos outros tipos de contra-ânions estão disponíveis e podem ser utilizados de acordo com a presente revelação.
Em algumas modalidades, um sal azido imidazolínio é 2-azido-1,3-dimetilimidazolínio hexafluorofosfato.
Em algumas modalidades, uma azida é
. Em algumas modalidades, um sal azido imidazolínio é . Em algumas modalidades, um sal azido imidazolínio é . Em algumas modalidades, uma azida é . Em algumas modalidades, uma azida é . Em algumas modalidades, uma azida é . Em algumas modalidades, um sal azido imidazolínio é . Em algumas modalidades, um sal azido imidazolínio é . Em algumas modalidades, um sal azido imidazolínio é . Em algumas modalidades, um sal azido imidazolínio é .
[001048] Em algumas modalidades, uma ligação P(III) é reagida com um eletrófilo que tem a estrutura de R−GZ,
em que R é conforme descrito na presente revelação, e GZ é um grupo de saída, por exemplo, −Cl, −Br, −I, −OTf, −Oms, −OTosila, etc. Em algumas modalidades, R é −CH3. Em algumas modalidades, R é −CH2CH3. Em algumas modalidades, R é −CH2CH2CH3. Em algumas modalidades, R é −CH2OCH3. Em algumas modalidades, R é CH3CH2OCH2−. Em algumas modalidades, R é PhCH2OCH2−. Em algumas modalidades, R é . Em algumas modalidades, R é . Em algumas modalidades, R é CH2=CHCH2−. Em algumas modalidades, R é CH3SCH2−. Em algumas modalidades, R é −CH2COOCH3. Em algumas modalidades, R é −CH2COOCH2CH3. Em algumas modalidades, R é −CH2CONHCH3.
[001049] Em algumas modalidades, após uma etapa de modificação, um fósforo de ligação P(III) é convertido em uma ligação internucleotídica P(V). Em algumas modalidades, um fósforo de ligação P(III) é convertido em uma ligação internucleotídica P(V), e todos os grupos ligados ao fósforo de ligação permanecem inalterados. Em algumas modalidades, um fósforo de ligação é convertido de P em iP(=O). Em algumas modalidades, a um de ligação é convertido de P em P(=S). Em algumas modalidades, um fósforo de ligação é convertido de P em P(=N−L−R5). Em algumas modalidades, a fósforo de ligação é R1 N R1
P N convertido de P em , Lb R1 , , , ou , em que cada variável é independentemente conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, P é convertido em . Em algumas R1 N R1
P N modalidades, P é convertido em Lb R1 . Em algumas modalidades, P é convertido em . Em algumas modalidades, P é convertido em . Em algumas modalidades, P é convertido em . Conforme observado por aqueles versados na técnica, para cada cation existe tipicamente um contra-ânion, de modo que número total de cargas positivas seja igual ao número de cargas negativas em um sistema (por exemplo, composto, composição, etc.). Em algumas modalidades, um contra-ânion é Q− conforme descrito na presente revelação (por exemplo, F−, Cl−, Br−, BF4−, PF6−, TfO−, Tf2N−, AsF6−, ClO4−, SbF6−, etc.). Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica que tem a estrutura da fórmula I, I-a, I-b, I-c, I-n-1, I-n-2, I-n-3, I-n-4, II, II-a-1, II-a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, II-d-2, ou uma forma de sal da mesma, em que PL é P, é convertido em uma ligação internucleotídica que tem a estrutura da fórmula I, I-a, I-b, I-c, I-n-1, I-n-2, I-n-3, I-n-4, II, II-a-1, II-a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, II-d-2, III, ou uma forma de sal da mesma, em que PL é P(=W) ou P→B(R')3 ou PN.
Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica que tem a estrutura da fórmula I, I-a, I-b, I-c, I-n-1, I-n-2, I-n-3, I-n-4, II, II-a-1, II-a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, II-d- 2, ou uma forma de sal da mesma, em que PL é P, é convertido em uma ligação internucleotídica que tem a estrutura da fórmula I, I-a, I-b, I-c, I-n-1, I-n-2, I-n-3, I-n-4, II, II-a-1, II- a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, II-d-2, ou uma forma de sal da mesma, em que PL é P(=W) ou P→B(R')3. Em algumas modalidades, um fósforo de ligação P, que é PL é uma ligação internucleotídica que tem a estrutura da fórmula I, I-a, I-b, I-c, I-n-1, I-n-2, I-n-3, I-n-4, II, II-a-1, II-a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, II-d-2, ou uma forma de sal da mesma é convertido em PL que é P(=W) ou P→B(R')3. Em algumas modalidades, um fósforo de ligação P, que é PL em uma ligação internucleotídica que tem a estrutura da fórmula I ou uma forma de sal da mesma é convertido em PL que é P(=W) ou P→B(R')3. Em algumas modalidades, W é O (por exemplo, para uma reação de oxidação). Em algumas modalidades, W é S (por exemplo, para uma reação de sulfurização). Em algumas modalidades, W é =N−L−R5 (por exemplo, para uma reação de azida). Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica que tem a estrutura da fórmula I ou uma forma de sal da mesma (por exemplo, em que PL é P) é convertida em uma ligação internucleotídica que tem a estrutura da fórmula III ou uma forma de sal da mesma:
,
III em que: R1 N R1
P N PN é P(=N−L−R5), Q-, Lb R1 Q-, Q-, Q-, ou Q-, Q- é um ânion, e cada uma das outras variáveis é independentemente conforme descrito na presente revelação.
[001050] Em algumas modalidades, PN é P(=N−L−R5). Em algumas modalidades, PN é Q-. Em algumas R1 N R1
P N modalidades, PN é Lb R1 Q-. Em algumas modalidades, PN é Q-. Em algumas modalidades, PN é Q-. Em algumas modalidades, PN é Q-. Em algumas modalidades, as ligações internucleotídicas da presente revelação podem existir em uma forma de sal. Em algumas modalidades, as ligações internucleotídicas da fórmula III podem existir em uma forma de sal. Em algumas modalidades, em uma forma de sal de uma ligação internucleotídica da fórmula R1 N R1
P N III PN é , Lb R1 , , , ou . Em algumas modalidades, PN é P=WN, em que WN é conforme descrito no presente documento.
[001051] Em algumas modalidades, Y, Z, e −X−L−R1 permanece igual durante a conversão. Em algumas modalidades, cada um dentre X, Y e Z é independentemente −O−. Em algumas modalidades, conforme descrito no presente documento, −X−L−R1 é de tal estrutura em que H−X−L−R1 é um reagente quiral descrito no presente documento, ou um reagente quiral capeado descrito no presente documento em que um grupo amino do reagente quiral (tipicamente de −W1−H ou −W2−H, que compreende um grupo amino −NHG5−) é capeado, por exemplo, com −C(O)R' (substituindo um −H, por exemplo, −N[−C(O)R']G5−). Em algumas modalidades, −X−L−R1 é , ,
, , , , , , , ou , em que cada variável é independentemente de acordo com a presente revelação. Em algumas modalidades, em que R1 é −C(O)R. Em algumas modalidades, R1 é CH3C(O)−. Em algumas modalidades, conforme descrito no presente documento, G2 compreende um grupo removedor de elétrons. Em algumas modalidades, G2 é −CH2SO2Ph.
[001052] Em algumas modalidades, uma ligação internucleotídica (por exemplo, uma ligação internucleotídica modificada, uma ligação internucleotídica quiral, uma ligação internucleotídica quiralmente controlada, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada, uma ligação internucleotídica neutra, etc.) tem a estrutura da fórmula I, I-a, I-b, I-c, I-n-1, I-n-2, I-n-3, I-n-4, II, II-a-1, II-a- 2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, II-d-2, ou uma forma de sal da mesma, em que PL é P(=N−L−R5), ou da fórmula III ou uma forma de sal da mesma. Em algumas modalidades, tal ligação internucleotídica é quiralmente controlada. Em algumas modalidades, todas tais ligações internucleotídicas são quiralmente controladas. Em algumas modalidades, o fósforo de ligação de pelo menos uma de tais ligações internucleotídicas é Rp. Em algumas modalidades, o fósforo de ligação de pelo menos uma de tais ligações internucleotídicas é Sp. Em algumas modalidades, o fósforo de ligação de pelo menos uma de tais ligações internucleotídicas é Rp, e o fósforo de ligação de pelo menos uma de tais ligações internucleotídicas é Sp. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos da presente revelação compreendem um ou mais (por exemplo, 1 a 5, 1 a 10, 1 a 15, 1 a 20, 1 a 25, 1 a 30, 1 a 40, 1 a 50, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, etc.) tais ligações internucleotídicas. Em algumas modalidades, tal oligonucleotídeo compreende adicionalmente um ou mais outros tipos de ligações internucleotídicas, por exemplo, uma ou mais ligações fosfato naturais, e/ou uma ou mais ligações internucleotídicas fosforotioato (por exemplo, em algumas modalidades, um ou mais das quais são independentemente quiralmente controladas; em algumas modalidades, cada uma das quais é independentemente quiralmente controlada; em algumas modalidades, pelo menos uma é Rp; em algumas modalidades, pelo menos uma é Sp; em algumas modalidades, pelo menos uma é Rp e pelo menos uma é Sp; etc.) Em algumas modalidades, tais oligonucleotídeos são estereopuros (substancialmente livre de outros estereoisômeros). Em algumas modalidades, a presente revelação fornece composições de oligonucleotídeo quiralmente controladas de tais oligonucleotídeos. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece composições de oligonucleotídeo quiralmente puras de tais oligonucleotídeos.
[001053] Em algumas modalidades, a modificação prossegue com uma estereosseletividade de 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais. Em algumas modalidades, a estereosseletividade é de 85% ou mais. Em algumas modalidades, a estereosseletividade é de 85% ou mais. Em algumas modalidades, a estereosseletividade é de 90% ou mais. Em algumas modalidades, a estereosseletividade é de 91%
ou mais. Em algumas modalidades, a estereosseletividade é de 92% ou mais. Em algumas modalidades, a estereosseletividade é de 93% ou mais. Em algumas modalidades, a estereosseletividade é de 94% ou mais. Em algumas modalidades, a estereosseletividade é de 95% ou mais. Em algumas modalidades, a estereosseletividade é de 96% ou mais. Em algumas modalidades, a estereosseletividade é de 97% ou mais. Em algumas modalidades, a estereosseletividade é de 98% ou mais. Em algumas modalidades, a estereosseletividade é de 99% ou mais. Em algumas modalidades, a modificação é estereoespecífica. Desbloqueio
[001054] Em algumas modalidades, um ciclo compreende uma etapa de ciclo. Em algumas modalidades, o grupo hidroxila 5' do oligonucleotídeo de crescimento é bloqueado (isto é, protegido) e precisa ser desbloqueado a fim de reagir subsequentemente com um parceiro de acoplamento de nucleosídeo.
[001055] Em algumas modalidades, a acidificação é usada para remover um grupo de bloqueio. As tecnologias de desbloqueio adequadas (por exemplo, reagentes, condições, etc.) incluem aquelas descritas nos documentos US 9695211, US 9605019, US 9598458, US 2013/0178612, US 20150211006, US 20170037399, WO 2017/015555, WO 2017/062862, WO 2017/160741, WO 2017/192664, WO 2017/192679, WO 2017/210647, WO 2018/223056, WO 2018/237194, e/ou WO 2019/055951, as tecnologias de desbloqueio de cada um dos quais são incorporadas a título de referência. Determinadas tecnologias de desbloqueio, por exemplo, reagentes, condições, métodos, etc. são ilustradas nos Exemplos.
Clivagem e Desproteção
[001056] Em determinado estágio, por exemplo, após os comprimentos de oligonucleotídeo desejados terem sido alcançado, a clivagem e/ou desproteção são realizadas para desproteger nucleobases bloqueadas etc. e clivar os produtos de oligonucleotídeo a partir do suporte. Em algumas modalidades, a clivagem e a desproteção são realizadas separadamente. Em algumas modalidades, a clivagem e a desproteção são realizadas em uma etapa, ou em duas ou mais etapas, mas sem separação dos produtos entre si. Em algumas modalidades, a clivagem e/ou desproteção utiliza condições básicas e temperatura elevada. Em algumas modalidades, para determinados auxiliares quirais, uma condição de fluoreto é necessária (por exemplo, TBAF, HF-ET3N, etc., opcionalmente com base adicional). As tecnologias de clivagem e desproteção adequadas (por exemplo, reagentes, condições, etc.) incluem aquelas descritas nos documentos US 9695211, US 9605019, US 9598458, US 2013/0178612, US 20150211006, US 20170037399, WO 2017/015555, WO 2017/062862, WO 2017/160741, WO 2017/192664, WO 2017/192679, WO 2017/210647, WO 2018/223056, WO 2018/237194, e/ou WO 2019/055951, as tecnologias de clivagem e desproteção de cada um dos quais são incorporadas a título de referência. Determinadas tecnologias de clivagem e desproteção, por exemplo, reagentes, condições, métodos, etc. são ilustradas nos Exemplos.
[001057] Em algumas modalidades, determinados auxiliares quirais são removidos sob condições básicas. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos são colocados em contato com uma base, por exemplo, uma amina que tem a estrutura de N(R)3, para remover determinados auxiliares quirais (por exemplo, aqueles que compreendem um grupo removedor de elétrons em G2 conforme descrito na presente revelação). Em algumas modalidades, uma base é NHR2. Em algumas modalidades, cada R é independentemente C1-6 alifático opcionalmente substituído.
Em algumas modalidades, cada R é independentemente C1-6 alquila opcionalmente substituída.
Em algumas modalidades, uma amina é DEA.
Em algumas modalidades, uma amina é TEA.
Em algumas modalidades, uma amina é fornecida como uma solução, por exemplo, uma solução de acetonitrila.
Em algumas modalidades, tal contato é realizado sob condições anidras.
Em algumas modalidades, tal contato é realizado imediatamente após os comprimentos de oligonucleotídeo desejados serem alcançados (por exemplo, primeira etapa após os ciclos de síntese). Em algumas modalidades, tal contato é realizado antes da remoção de auxiliares quirais e/ou grupos de proteção e/ou clivagem de oligonucleotídeos a partir de um suporte sólido.
Em algumas modalidades, o contato com uma base pode remover grupos cianoetila utilizados na síntese de oligonucleotídeo padrão, fornecendo uma ligação fosfato natural que pode existir em uma forma de sal (com o cátion sendo, por exemplo, um sal de amônio). Em algumas modalidades, o contato com uma base fornece uma ligação internucleotídica da fórmula I-n-1, I-n-2, I-n-3, I-n-4, II, II-a-1, II-a-2, II- b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, ou II-d-2, ou uma forma de sal da mesma.
Em algumas modalidades, o contato com a base remove um auxiliar quiral de uma ligação internucleotídica da fórmula I, I-a, I-b, I-c, I-n-1, I-n-2, I-n-3, I-n-4, II, II- a-1, II-a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, ou II-d- 2, ou uma forma de sal da mesma.
Em algumas modalidades, o contato com a base remove um auxiliar quiral (por exemplo,
−X−L−R1) de uma ligação internucleotídica da fórmula I ou uma forma de sal da mesma (por exemplo, em que PL é P(=N−L−R5)). Em algumas modalidades, o contato com a base remove um auxiliar quiral (por exemplo, −X−L−R1) de uma ligação internucleotídica da fórmula III ou uma forma de sal da mesma. Em algumas modalidades, o contato com uma base converte uma ligação internucleotídica da fórmula I ou uma forma de sal da mesma (por exemplo, em que PL é P(=N−L−R5)), ou da fórmula III ou uma forma de sal da mesma, em uma ligação internucleotídica da fórmula II-n-1, I-n-2, I-n-3, I-n-4, II, II-a-1, II-a-2, II- b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, ou II-d-2, ou uma forma de sal da mesma. Ciclos
[001058] Os ciclos adequados para preparar oligonucleotídeos da presente revelação incluem aqueles descritos nos documentos US 9695211, US 9605019, US 9598458, US 2013/0178612, US 20150211006, US 20170037399, WO 2017/015555, WO 2017/062862, WO 2017/160741, WO 2017/192664, WO 2017/192679, WO 2017/210647 (por exemplo, Esquemas I, I-b, I-c, I-d, I-e, I-f, etc.), WO 2018/223056, WO 2018/237194, e/ou WO 2019/055951, os ciclos de cada um dos quais são incorporados a título de referência. Por exemplo, em algumas modalidades, um ciclo exemplificativo é o Esquema I-f. Determinados os ciclos são ilustrados nos Exemplos (por exemplo, para preparação de ligações fosfato naturais, que utilizam outros auxiliares quirais, etc.). Esquema I-e. Ciclo exemplificativo usando auxiliar quiral DPSE.
[001059] Em algumas modalidades, R2s é H ou −OR1, em que R1 não é hidrogênio. Em algumas modalidades, R2s é H ou −OR1, em que R1 é C1-6 alquila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R2s é H. Em algumas modalidades, R2s é −OMe. Em algumas modalidades, R2s é −OCH2CH2OCH3. Em algumas modalidades, R2s é −F. Em algumas modalidades, R4s é −H. Em algumas modalidades, R4s e R2s são tomados em conjunto para formar uma ponte −L−O− conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, o −O− é conectado ao carbono na posição 2'. Em algumas modalidades, L é −CH2−. Em algumas modalidades, L é −CH(Me)−. Em algumas modalidades, L é −(R)−CH(Me)−. Em algumas modalidades, L é −(S)−CH(Me)−. Purificação e Caracterização
[001060] Várias tecnologias de purificação e/ou caracterização (métodos, instrumentos, protocolos, etc.)
podem ser utilizadas para purificar e/ou caracterizar oligonucleotídeos e composições de oligonucleotídeo, de acordo com a presente revelação. Em algumas modalidades, a purificação é realizada com o uso de vários tipos de tecnologias de HPLC/UPLC. Em algumas modalidades, a caracterização compreende MS, NMR, UV, etc. Em algumas modalidades, a purificação e a caracterização podem ser realizadas em conjunto, por exemplo,, HPLC-MS, UPLC-MS, etc. as tecnologias de purificação e caracterização incluem aquelas descritas nos documento US 9695211, US 9605019, US 9598458, US 2013/0178612, US 20150211006, US 20170037399, WO 2017/015555, WO 2017/062862, WO 2017/160741, WO 2017/192664, WO 2017/192679, WO 2017/210647, WO 2018/223056, WO 2018/237194, e/ou WO 2019/055951, as tecnologias de purificação e caracterização de cada um dos quais são incorporadas a título de referência.
[001061] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece métodos para preparar oligonucleotídeo e composições de oligonucleotídeo fornecidos. Em algumas modalidades, um método fornecido compreende fornecer um reagente quiral fornecido que tem a estrutura da fórmula 3-I ou 3-AA. Em algumas modalidades, um método fornecido compreende fornecer um reagente quiral fornecido que tem a estrutura de , em que W1 é −NG5, W2 é O, cada um dentre G1 e G3 é independentemente hidrogênio ou um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre C1-10 alifático, heterociclila, heteroarila e arila, G2 é −C(R)2Si(R)3, e G4 e G5 são tomados em conjunto para formar um anel contendo heteroátomo saturado, parcialmente insaturado ou insaturado opcionalmente substituído de até cerca de 20 átomos de anel que é monocíclico ou policíclico, fundido ou não fundido, em que cada R é independentemente hidrogênio, ou um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre C1–C6 alifático, carbociclila, arila, heteroarila, e heterociclila.
Em algumas modalidades,
um reagente quiral fornecido tem a estrutura de ,
, , ou , em que cada variável é independentemente conforme descrito na presente revelação.
Em algumas modalidades, um método fornecido compreende fornecer uma fosforamidita que compreende uma porção química de um reagente quiral que tem a estrutura de ,
, , , ou , em que −W1H e −W2H, ou os grupos hidroxila e amino, formam ligações com o átomo de fósforo da fosforamidita.
Em algumas modalidades, −W1H e −W2H, ou os grupos hidroxila e amino, formam ligações com o átomo de fósforo da fosforamidita, por exemplo, em ou
. Em algumas modalidades, uma fosforamidita tem a estrutura de , , ,
, , , ,
, , , ,
, , , ,
, , , ,
, , , , , , , , , , ou ou em que BPRO é BA conforme descrito na presente revelação, e cada outra variável é conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, BPRO é uma nucleobase protegida. Em algumas modalidades, BPRO é A, T, G, C, U protegido ou um tautômero dos mesmos. Em algumas modalidades, R é um grupo de proteção. Em algumas modalidades, R é DMTr.
[001062] Em algumas modalidades, G2 é −C(R)2Si(R)3, em que −C(R)2− é −CH2− opcionalmente substituído, e cada R de −Si(R)3 é independentemente um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre C1-10 alifático, heterociclila,
heteroarila e arila.
Em algumas modalidades, pelo menos um R de −Si(R)3 é independentemente C1-10 alquila opcionalmente substituída.
Em algumas modalidades, pelo menos um R de −Si(R)3 é independentemente fenila opcionalmente substituída.
Em algumas modalidades, um R of −Si(R)3 é independentemente fenila opcionalmente substituída, e cada um dentre os outros dois R é independentemente C1-10 alquila opcionalmente substituída.
Em algumas modalidades, um R de −Si(R)3 é independentemente C1-10 alquila opcionalmente substituída, e cada um dentre os outros dois R é independentemente fenila opcionalmente substituída.
Em algumas modalidades, G2 é −CH2Si(Ph)(Me)2 opcionalmente substituído.
Em algumas modalidades, G2 é −CH2Si(Me)(Ph)2 opcionalmente substituído.
Em algumas modalidades, G2 é −CH2Si(Me)(Ph)2. Em algumas modalidades, G2 é −CH2SiMe3. Em algumas modalidades, G2 é −CH2Si(iPr)3. Em algumas modalidades, G4 e G5 são tomados em conjunto para formar um anel saturado com 5 a 6 opcionalmente substituído contendo um átomo de nitrogênio (ao qual G5 é fixado). Em algumas modalidades, G4 e G5 são tomados em conjunto para formar um anel saturado com 5 membros opcionalmente substituído contendo um átomo de nitrogênio.
Em algumas modalidades, G1 é hidrogênio.
Em algumas modalidades, G3 é hidrogênio.
Em algumas modalidades, tanto G1 como G3 são hidrogênio.
Em algumas modalidades, tanto G1 como G3 são hidrogênio, G2 é −C(R)2Si(R)3, em que −C(R)2− é opcionalmente substituído −CH2−, e cada R de −Si(R)3 é independentemente um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre C1-10 alifático, heterociclila, heteroarila e arila, e G4 e G5 são tomados em conjunto para formar um anel saturado com 5 membros opcionalmente substituído contendo um átomo de nitrogênio.
Em algumas modalidades, um método fornecido compreende adicionalmente fornecer um reagente contendo flúor. Em algumas modalidades, um reagente contendo flúor fornecido remove um reagente quiral, ou um produto formado a partir de um reagente quiral, a partir de oligonucleotídeos após a síntese. Vários reagentes contendo flúor conhecidos, incluindo aquelas fontes F- para remover grupos −SiR3, podem ser utilizados de acordo com a presente revelação, por exemplo, TBAF, HF3-Et3N etc. Em algumas modalidades, um reagente contendo flúor fornece melhores resultados, por exemplo, tempo de tratamento mais curto, temperatura mais baixa, menos dessulfurização, etc, em comparação com métodos tradicionais, tal como amônia concentrada. Em algumas modalidades, para determinado reagente contendo flúor, a presente revelação fornece ligantes para resultados aprimorados, por exemplo, menos clivagem de oligonucleotídeos a partir do suporte durante a remoção de reagente quiral (ou produto formado a partir do mesmo durante a síntese de oligonucleotídeo). Em algumas modalidades, um ligante fornecido é um ligante SP. Em algumas modalidades, a presente revelação demonstrou que um complexo HF-base pode ser utilizado, tal como HF-NR3, para controlar a clivagem durante a remoção de reagente quiral (ou produto de oligonucleotídeo). Em algumas modalidades, HF-NR3 é HF-NEt3. Em algumas modalidades, HF-NR3 permite o uso de ligantes tradicionais, por exemplo, ligante de succinila.
[001063] Em algumas modalidades, conforme descrito no presente documento, G2 compreende um grupo removedor de elétrons, por exemplo, em sua posição α. Em algumas modalidades, G2 é metila substituída por um ou mais grupos removedores de elétrons. Em algumas modalidades, um grupo removedor de elétrons compreende e/ou é conectado ao átomo de carbono, por exemplo, através de −S(O)−, −S(O)2−, −P(O)(R1)−, −P(S)R1−, ou −C(O)−. Em algumas modalidades, um grupo removedor de elétrons é −CN, −NO2, halogênio, −C(O)R1, −C(O)OR', −C(O)N(R')2, −S(O)R1, −S(O)2R1, −P(W)(R1)2, −P(O)(R1)2, −P(O)(OR')2, ou −P(S)(R1)2. Em algumas modalidades, um grupo removedor de elétrons é arila ou heteroarila, por exemplo, fenila, substituída por um ou mais dentre −CN, −NO2, halogênio, −C(O)R1, −C(O)OR', −C(O)N(R')2, −S(O)R1, −S(O)2R1, −P(W)(R1)2, −P(O)(R1)2, −P(O)(OR')2, ou −P(S)(R1)2. Em algumas modalidades, G2 é −CH2S(O)R'. Em algumas modalidades, G2 é −CH2S(O)2R'. Em algumas modalidades, G2 é −CH2P(O)(R')2. Modalidades exemplificativas adicionais são descritas, por exemplo, como reagentes/auxiliares quirais.
[001064] A confirmação de que um oligonucleotídeo estereocontrolado (por exemplo, um preparado por um método descrito no presente documento ou na técnica) compreende a ligação internucleotídica estereocontrolada pretendida (quiralmente controlada) pode ser realizada com o uso de uma variedade de tecnologias adequadas. Um oligonucleotídeo estereocontrolado (quiralmente controlado) compreende pelo menos uma ligação internucleotídica estereocontrolada, que pode ser, por exemplo, uma ligação internucleotídica estereocontrolada que compreende um fósforo, uma ligação internucleotídica fosforotioato estereocontrolada (PS) na configuração Rp, uma PS na configuração Sp, etc. As tecnologias úteis incluem, como exemplos não limitantes: NMR (por exemplo, 1D (unidimensional) e/ou 2D (bidimensional) 1H- 31P HETCOR (espectroscopia de correlação heteronuclear)), HPLC, RP-HPLC, espectrometria de massa, LC-MS e/ou nucleases estereospecíficas. Em algumas modalidades, as nucleases estereospecíficas incluem: benzonase, nuclease microcócica, e svPDE (fosfodiesterase de veneno de cobra), que são específicas para ligações internucleotídicas na configuração Rp (por exemplo, um PS na configuração Rp); e nuclease P1, nuclease de feijão mungo e nuclease S1, que são específicas para ligações internucleotídicas na configuração Sp (por exemplo, um PS na configuração Sp).
[001065] Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a um método para confirmar ou identificar o padrão de estereoquímica da cadeia principal de um oligonucleotídeo e/ou estereoquímica de ligações internucleotídicas particulares. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo compreende uma ligação internucleotídica estereocontrolada que compreende um fósforo, um fosforotioato estereocontrolado (PS) na configuração Rp, ou um PS na configuração Sp. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo compreende pelo menos uma ligação internucleotídica estereocontrolada e pelo menos uma ligação internucleotídica que não é estereocontrolada. Em algumas modalidades, um método compreende a digestão de um oligonucleotídeo com uma nuclease estereospecífica. Em algumas modalidades, uma nuclease estereospecífica é selecionada dentre: benzonase, nuclease microcócica, e svPDE (fosfodiesterase de veneno de cobra), que são específicas para ligações internucleotídicas na configuração Rp (por exemplo, um PS na configuração Rp); e nuclease P1, nuclease de feijão mungo e nuclease S1, que são específicas para ligações internucleotídicas na configuração Sp (por exemplo, um PS na configuração Sp). Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo ou fragmentos do mesmo produzidos por digestão com uma nuclease estereospecífica são analisados. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo ou fragmentos do mesmo (por exemplo, produzidos pela digestão com uma nuclease estereospecífica) são analisados por NMR, 1D (unidimensional) e/ou 2D (bidimensional) 1H-31P HETCOR (espectroscopia de correlação heteronuclearo), HPLC, RP-HPLC, espectrometria de massa, LC-MS, UPLC, etc. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo ou fragmentos do mesmo são comparadas com fragmentos quimicamente sintetizados do oligonucleotídeo que tem um padrão de estereoquímica conhecido.
[001066] Sem se ater a nenhuma teoria particular, a presente revelação observa que, em pelo menos alguns casos, a estereoespecificidade de uma nuclease particular pode ser alterada por uma modificação (por exemplo, modificação 2') de um açúcar, por uma sequência de base, ou por um contexto estereoquímico. Por exemplo, em algumas modalidades, benzonase e nuclease microcócica, que são específicas para ligações internucleotídicas Rp, foram tanto incapazes de clivar uma ligação internucleotídica Rp PS flanqueada por ligações internucleotídicas Sp PS.
[001067] Várias técnicas e materiais podem ser utilizados. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece combinações de tecnologias úteis. Por exemplo, em algumas modalidades, a estereoquímica de uma ou mais ligações internucleotídicas particulares de um oligonucleotídeo pode ser confirmada por digestão do oligonucleotídeo com uma nuclease estereospecífica e análise dos fragmentos resultantes (por exemplo, produtos de digestão de nuclease) por meio de qualquer uma dentre uma variedade de técnicas (por exemplo,
separação baseada na razão massa-carga, NMR, HPLC, espectrometria de massa, etc.). Em algumas modalidades, a estereoquímica dos produtos de digestão de um oligonucleotídeo com uma nuclease estereospecífica pode ser confirmada por meio de comparação (por exemplo, NMR, HPLC, espectrometria de massa, etc.) com fragmentos quimicamente sintetizados (por exemplo, dímeros, trímeros, tetrâmeros, etc.) produzidos, por exemplo, por meio de tecnologias que controlam a estereoquímica.
[001068] Em um exemplo, foi confirmado que um oligonucleotídeo tem o padrão de estereoquímica projetado e pretendido na cadeia principal. O oligonucleotídeo testado compreende um núcleo que compreende nucleosídeos 2'-desóxi, em que todas as ligações internucleotídicas eram PS na configuração Sp, exceto para um PS na configuração Rp; e dois flancos, cada um dos quais compreendendo nucleosídeos 2'-OMe, em que todas as ligações internucleotídicas em cada flanco eram fosfodiéster (PO), exceto para um PS na configuração Sp em cada flanco. O oligonucleotídeo foi digerido com uma nuclease estereospecífica (por exemplo, nuclease P1). Os vários fragmentos foram analisados (por exemplo, por LC-MS e em comparação com quimicamente fragmentos sintetizados de estereoquímica conhecida). Foi confirmado que o oligonucleotídeo tinha o padrão de estereoquímica pretendido em sua cadeia principal.
[001069] Em outro exemplo, foi confirmado que um oligonucleotídeo que tem uma sequência diferente tem o padrão de estereoquímica pretendido em sua cadeia principal, com o uso de digestão com uma nuclease estereospecífica e análise dos fragmentos resultantes. Esse oligonucleotídeo compreende um núcleo que compreende nucleotídeos 2'-desóxi, em que todas as ligações internucleotídicas eram PS na configuração Sp, exceto para um PS na configuração Rp; e dois flancos, cada um dos quais compreendendo nucleotídeos 2'-OMe, em que todas as ligações internucleotídicas em cada flanco eram fosfodiéster (PO), exceto para um PS na configuração Sp em cada flanco.
[001070] Em ainda outro exemplo, um oligonucleotídeo diferente foi testado para confirmar que as ligações internucleotídicas estavam nas configurações pretendidas. O oligonucleotídeo tem capacidade para ignorar o éxon 51 de DMD; a maior parte dos nucleotídeos no oligonucleotídeo era 2'-F e o restante era 2'-OMe; a maior parte das ligações internucleotídicas no oligonucleotídeo era PS na configuração Sp e o restante era PO. Esse oligonucleotídeo foi testado pela digestão com nucleases estereospecíficas, e os fragmentos de digestão resultantes foram analisados (por exemplo, por LC-MS e em comparação com os fragmentos quimicamente sintetizados de estereoquímica conhecida). Os resultados confirmaram que o oligonucleotídeo tinha o padrão pretendido de ligações internucleotídicas estereocontroladas.
[001071] Em algumas modalidades, NMR é útil para caracterização e/ou confirmação de estereoquímica. Em um conjunto de experimentos exemplificativos, um conjunto de oligonucleotídeos que compreendem um motivo de CpG estereocontrolado foram testados para confirmar a estereoquímica pretendida do motivo de CpG. Os oligonucleotídeos do conjunto compreendem um motivo que tem a estrutura de pCpGp, em que C é citosina, G é Guanina, e p é um fosforotioato que é estereoaleatório ou estereocontrolado (por exemplo, na configuração Rp ou Sp). Por exemplo, um oligonucleotídeo compreende uma estrutura pCpGp, em que o padrão de estereoquímica dos fosforotioatos (por exemplo, o ppp) era RRR; em outro oligonucleotídeo, o padrão de estereoquímica do ppp era RSS; em outro oligonucleotídeo, o padrão de estereoquímica do ppp era RSR; etc. No conjunto, todos os padrões de estereoquímica possíveis do ppp foram representados. Na porção do oligonucleotídeo fora da estrutura pCpGp, todas as ligações internucleotídicas eram PO; todos os nucleosídeos nos oligonucleotídeos eram 2'-desóxi. Esses vários oligonucleotídeos foram testados em NMR, sem digestão com uma nuclease estereospecífica, e padrões de picos distintos foram observados, indicando que cada PS que era Rp ou Sp produziu um pico exclusivo, e confirmando que os oligonucleotídeos compreendiam ligações internucleotídicas PS estereocontroladas da estereoquímica pretendida.
[001072] Os padrões de estereoquímica das ligações internucleotídicas de vários outros oligonucleotídeos estereocontrolados foram confirmados, em que os oligonucleotídeos compreendem uma variedade de modificações químicas e padrões de estereoquímica.
[001073] Conforme aqueles versados na técnica irão observar, em algumas modalidades, um oligonucleotídeo de produto de uma etapa, o ciclo ou preparação é um oligonucleotídeo que compreende O5P, OP, *PD, *PDS, *PDR, *N, *NS e/ou *NR conforme descrito no presente documento, cujo oligonucleotídeo é opcionalmente ligado a um suporte (por exemplo, CPG), opcionalmente por meio de um ligante (por exemplo, um ligante CAN). Por exemplo, em algumas modalidades, após capping de acoplamento e/ou pré-modificação e antes da modificação, O5P é , , , ou uma forma de sal do mesmo. Em algumas modalidades, após a modificação O5P é LPO, LPA, LPB, ou uma forma de sal do mesmo. Metabólitos
[001074] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo DMD corresponde a um fragmento de um oligonucleotídeo DMD mais longo diferente. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo DMD corresponde a um metabólito produzido pela clivagem (por exemplo, clivagem enzimática por uma nuclease) de umoligonucleotídeo DMD mais longo, que produz um fragmento ou porção do oligonucleotídeo DMD mais longo. Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a um oligonucleotídeo DMD que corresponde a um metabólito produzido pela clivagem de um oligonucleotídeo DMD descrito no presente documento. Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a um oligonucleotídeo DMD que corresponde à uma porção, ou fragmento de um oligonucleotídeo DMD revelado no presente documento.
[001075] Vários experimentos foram realizados, em que um oligonucleotídeo DMD foi incubado in vitro na presença de qualquer uma dentre várias substâncias que compreendem nucleases. Em vários experimentos, tais substâncias incluem homogenato cerebral, fluido cerebroespinhal ou plasma de rato Sprague-Dawley ou macaco Cynomolgus. Plasma foi heparinizado. Os oligonucleotídeos foram incubados por vários pontos no tempo (por exemplo, 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 dias para homogenato de tecido cerebral, com um período de incubação de 0, 1 ou 2 dias; 0, 1, 2, 4, 8, 16, 24 ou 48 h para fluido cerebroespinhal; ou 0, 1, 2, 4, 8, 16 ou 24 h para plasma). A pré-incubação indica que o homogenato é incubado a 37 °C por 0, 24 ou 48 h para ativar as enzimas antes de adicionar o oligonucleotídeo. A concentração final e o volume de oligonucleotídeos foi de 20 µM em 200 µl. Os produtos produzidos por clivagem dos oligonucleotídeos foram analisados por LC/MS.
[001076] Para um oligonucleotídeo DMD, que tem 20 bases de comprimento, testado em homogenato de cérebro de rato, os metabólitos principais representaram a extremidade 3' do oligonucleotídeo, que foi truncado por 4, 10, 11, 12, ou 13 bases.
[001077] Um oligonucleotídeo DMD de teste tinha um comprimento de 20 bases e foi testado em homogenato de cérebro de rato, rendendo metabólitos principais que foram truncados na extremidade 5' por 4, 10, 11, 12, ou 13 bases, deixando metabólitos que representam a extremidade 3' do oligonucleotídeo e que tinham 16, 10, 9, 8 ou 7 bases de comprimento, respectivamente. Esse oligonucleotídeo também produziu um metabólito que era um fragmento 5' que tinha 12 bases de comprimento (truncado na extremidade 3' por 8 bases).
[001078] Um segundo oligonucleotídeo de teste tinha um comprimento de 20 bases e foi testado em homogenato de cérebro de rato, rendendo metabólitos principais que foram truncados na extremidade 3' por 4, 8, 9, ou 10 bases, deixando metabólitos que representam a extremidade 5' do oligonucleotídeo e que tinham 16, 12, 11 ou 10 bases de comprimento, respectivamente.
[001079] Os dois oligonucleotídeos testados compreendem ligações internucleotídicas que são fosfodiésteres, fosforotioato na configuração Rp, e fosforotioatos na configuração Sp. Em algumas modalidades, fosfodiésteres eram mais lábeis que o fosforotioato na configuração Rp ou o fosforotioato na configuração Sp. Em alguns casos, um metabólito de um oligonucleotídeo representa um produto de uma clivagem em um fosfodiéster.
[001080] Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a um oligonucleotídeo DMD que corresponde ao um metabólito de um oligonucleotídeo DMD revelado no presente documento. Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a um oligonucleotídeo DMD que tem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11, 12, 13, ou mais bases mais curtas que um oligonucleotídeo DMD revelado no presente documento. Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a um oligonucleotídeo DMD que tem uma sequência de base que tem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11, 12, 13, ou mais bases mais curtas que aquelas de um oligonucleotídeo DMD revelado no presente documento.
[001081] Em algumas modalidades, um metabólito é designado como 3'-N-#, ou 5'-N-#, em que # indica o número de bases removidas, e 3' ou 5' indica qual extremidade da molécula a partir da qual as bases foram deletadas. Por exemplo, 3'-N-1 indica um fragmento ou metabólito em que 1 base foi removida da extremidade 3'.
[001082] Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a um oligonucleotídeo que corresponde a um fragmento ou metabólito de um oligonucleotídeo DMD revelado no presente documento, em que o fragmento ou metabólito pode ser descrito como correspondendo a 3'-N-1, 3'-N-2, 3'-N-3, 3'-N- 4, 3'-N-5, 3'-N-6, 3'-N-7, 3'-N-8, 3'-N-9, 3'-N-10, 3'-N-11, 3'-N-12, 5'-N-1, 5'-N-2, 5'-N-3, 5'-N-4, 5'-N-5, 5'-N-6, 5'- N-7, 5'-N-8, 5'-N-9, 5'-N-10, 5'-N-11, ou 5'-N-12 de um oligonucleotídeo DMD descrito no presente documento.
[001083] Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a um oligonucleotídeo DMD que tem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11, 12, 13, ou mais bases mais curtas na extremidade 5' que um oligonucleotídeo DMD revelado no presente documento. Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a um oligonucleotídeo DMD que tem uma sequência de base que tem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11, 12, 13, ou mais bases mais curtas na extremidade 5' que aquelas de um oligonucleotídeo DMD revelado no presente documento. Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a um oligonucleotídeo DMD que tem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11, 12, 13, ou mais bases mais curtas na extremidade 3' que um oligonucleotídeo DMD revelado no presente documento. Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a um oligonucleotídeo DMD que tem uma sequência de base que tem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11, 12, 13, ou mais bases mais curtas na extremidade 3' que aquelas de um oligonucleotídeo DMD revelado no presente documento.
[001084] Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a um DMD que corresponde a um metabólito de um oligonucleotídeo DMD, em que o metabólito é truncado na extremidade 5' e/ou 3' em relação ao oligonucleotídeo DMD revelado no presente documento. Em algumas modalidades, a presente revelação se refere to a DMD que corresponde a um metabólito de um oligonucleotídeo DMD, em que o metabólito é truncado tanto na extremidade 5' como na 3' em relação ao oligonucleotídeo DMD revelado no presente documento. Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a um oligonucleotídeo DMD que tem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11, 12, 13, ou mais bases totais mais curtas na extremidade 5' e/ou 3' que um oligonucleotídeo DMD revelado no presente documento. Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a um oligonucleotídeo DMD que tem uma sequência de base que tem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11, 12, 13, ou mais bases totais mais curtas na extremidade 5' e/ou 3’ que aquelas de um oligonucleotídeo DMD revelado no presente documento.
[001085] Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a um oligonucleotídeo DMD que pode ser representado por um produto de clivagem de um oligonucleotídeo DMD revelado no presente documento, que é clivado em uma ligação fosfodiéster. Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a um oligonucleotídeo DMD que pode ser representado por um produto de clivagem de um oligonucleotídeo DMD revelado no presente documento, se tal oligonucleotídeo foi clivado em uma ligação fosforotioato na configuração Rp. Em algumas modalidades, a presente revelação se refere a um oligonucleotídeo DMD que pode ser representado por um produto de clivagem de um oligonucleotídeo DMD revelado no presente documento, se tal oligonucleotídeo foi clivado em uma ou mais ligações fosfodiéster e/ou ligações fosforotioato na configuração Rp.
Aplicações Biológicas, Uso Exemplificativo e Regimes de Dosagem
[001086] Conforme descrito no presente documento, as composições e métodos fornecidos são úteis para vários propósitos, por exemplo, aqueles descritos nos documentos US 9695211, US 9605019, US 9598458, US 2013/0178612, US 20150211006, US 20170037399, WO 2017/015555, WO 2017/062862, WO 2017/160741, WO 2017/192664, WO 2017/192679, e/ou WO 2017/210647. Entre outros fatores, as tecnologias fornecidas podem funcionar e/ou fornecer vários benefícios através de vários mecanismos químicos e/ou biológicos, vias, etc. (por exemplo, RNase H, RNAi, modulação de splicing (salto de éxon (por exemplo, para DMD em indivíduos/amostras com DMD), inclusão de éxon (por exemplo, para SMN2 em indivíduos/amostras com SMA)), etc.). Em algumas modalidades, as tecnologias fornecidas reduzem os níveis, atividades, expressões, etc. de um ácido nucleico e/ou um produto do mesmo. Por exemplo, em algumas modalidades, as tecnologias fornecidas reduzem os níveis e/ou atividades de transcrições alvo e/ou produtos codificados através das mesmas (sem a intenção de se limitar a nenhuma teoria particular, em algumas modalidades, por meio de via RNase H). Em algumas modalidades, as tecnologias fornecidas aumentam os níveis e/ou atividades de transcrições alvo e/ou produtos codificados através das mesmas (sem a intenção de se limitar a nenhuma teoria particular, em algumas modalidades, por meio do salto de éxon). Vários oligonucleotídeos que compreendem vários tipos de ligações internucleotídicas modificadas, incluindo muitas que compreendem ligações internucleotídicas não negativamente carregadas (por exemplo, n001), que têm várias sequências de base e/ou vários ácidos nucleicos alvos (por exemplo, transcrições de vários genes) foram preparados, e várias propriedades úteis, atividades e/ou vantagens foram demonstradas. Determinados tais oligonucleotídeos, incluindo muitos que compreendem ligações internucleotídicas não negativamente carregadas, transcrições alvo de PNPLA3, C9orf72, SMN2, etc. e demonstraram várias atividades e/ou benefícios. Os oligonucleotídeos exemplificativos que compreendem ligações internucleotídicas não negativamente carregadas e têm como alvo vários genes, e composições e usos dos mesmos, incluem aqueles descritos nos documentos WO 2018/223056, WO 2019/032607, PCT/US18/55653, e WO 2019/032612, cada um dos quais é independentemente incorporado ao presente documento a título de referência.
[001087] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece métodos para modular o nível de uma transcrição ou um produto codificado através da mesma em um sistema, que compreende administrar uma quantidade eficaz de um oligonucleotídeo fornecido ou uma composição do mesmo. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece métodos para modular o nível de uma transcrição ou um produto codificado da mesma em um sistema, que compreende colocar a transcrição em contato com um oligonucleotídeo fornecido ou uma composição do mesmo. Em algumas modalidades, um sistema é um sistema in vitro. Em algumas modalidades, um sistema é uma célula. Em algumas modalidades, um sistema é um tecido. Em algumas modalidades, um sistema é um órgão. Em algumas modalidades, um sistema é um organismo. Em algumas modalidades, um sistema é um indivíduo. Em algumas modalidades, um sistema é um ser humano. Em algumas modalidades, a modulação do nível de uma transcrição diminui o nível da transcrição. Em algumas modalidades, a modulação do nível de uma transcrição aumenta o nível da transcrição.
[001088] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece métodos para prevenir ou tratar uma afecção, doença ou distúrbio associado a uma sequência de ácidos nucleicos ou um produto codificado através dos mesmos, que compreende administrar a um indivíduo que sofre de ou suscetível a isso, uma quantidade eficaz de um oligonucleotídeo fornecido ou composição do mesmo, em que o oligonucleotídeo ou composição do mesmo modula o nível de uma transcrição do sequência de ácidos nucleicos. Em algumas modalidades, uma sequência de ácidos nucleicos é um gene. Em algumas modalidades, a modulação do nível de uma transcrição diminui o nível da transcrição. Em algumas modalidades, a modulação do nível de uma transcrição aumenta o nível da transcrição.
[001089] Em algumas modalidades, a alteração do nível de uma transcrição modulada, por exemplo, através de knockdown, salto de éxon, etc., é pelo menos 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 200, 500, ou 1.000 vezes.
[001090] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos e composições de oligonucleotídeo modulam o splicing. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos e composições de oligonucleotídeo promovem o salto de éxon produzindo, desse modo, um nível de transcrição que aumentou as funções benéficas da transcrição antes do salto de éxon. Em algumas modalidades, uma função benéfica é a codificação de uma proteína que aumentou as funções biológicas. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece métodos para modular splicing, que compreende administrar a um sistema de splicing um oligonucleotídeo fornecido ou composição de oligonucleotídeo, em que o splicing de pelo menos uma transcrição é alterado. Em algumas modalidades, o nível de pelo menos um produto de splicing é aumentado pelo menos 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 200, 500, ou 1000 vezes. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece métodos para modular o splicing de DMD, que compreende administrar a um sistema de splicing um oligonucleotídeo DMD fornecido ou composição do mesmo.
[001091] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece métodos para prevenir ou tratar DMD, que compreende administrar a um indivíduo suscetível ou que sofre da mesma, uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade eficaz de um oligonucleotídeo fornecido ou composição de oligonucleotídeo.
[001092] Em algumas modalidades, as composições e métodos fornecidas fornecem padrões de splicing aprimorados de transcrições em comparação com um padrão de referência, que é um padrão a partir de uma condição de referência selecionada dentre o grupo que consiste na ausência da composição, presença de uma composição de referência, e combinações dos mesmos. Um aprimoramento pode ser um aprimoramento de quaisquer funções biológicas desejadas. Em algumas modalidades, por exemplo, na DMD, um aprimoramento na produção de um mRNA a partir do qual uma proteína distrofina com atividades biológicas aprimoradas é produzido.
[001093] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos quiralmente controlados e composições de oligonucleotídeo quiralmente controladas são particularmente úteis e eficazes, em que os oligonucleotídeos (ou oligonucleotídeos de uma pluralidade nas composições de oligonucleotídeo quiralmente controladas) compreendem opcionalmente uma ou mais ligações internucleotídicas não negativamente carregadas. Entre outros fatores, tais oligonucleotídeos e composições de oligonucleotídeo podem fornecer efeitos muito aprimorados, melhor entrega, toxicidade inferior, etc.
[001094] Para distrofia muscular de Duchenne, as mutações e/ou éxons DMD exemplificativos adequados para salto são amplamente conhecidos na técnica, incluindo, porém sem limitação aqueles descritos na patente nº U.S. 8.759.507, patente nº U.S. 8.486.907, e a referência citada nas mesmas.
[001095] Em algumas modalidades, um ou mais éxons ignorados são selecionados dentre éxon 2, 29, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 e 60. Em algumas modalidades, o éxon 2 de DMD é ignorado. Em algumas modalidades, o éxon 29 de DMD é ignorado. Em algumas modalidades, o éxon 40 de DMD é ignorado. Em algumas modalidades, o éxon 41 de DMD é ignorado. Em algumas modalidades, o éxon 42 de DMD é ignorado. Em algumas modalidades, o éxon 43 de DMD é ignorado. Em algumas modalidades, o éxon 44 de DMD é ignorado. Em algumas modalidades, o éxon 45 de DMD é ignorado. Em algumas modalidades, o éxon 46 de DMD é ignorado. Em algumas modalidades, o éxon 47 de DMD é ignorado. Em algumas modalidades, o éxon 48 de DMD é ignorado. Em algumas modalidades, o éxon 49 de DMD é ignorado. Em algumas modalidades, o éxon 50 de DMD é ignorado. Em algumas modalidades, o éxon 51 de DMD é ignorado. Em algumas modalidades, o éxon 52 de DMD é ignorado. Em algumas modalidades, o éxon 53 de DMD é ignorado. Em algumas modalidades, o éxon 54 de DMD é ignorado. Em algumas modalidades, o éxon 50 de DMD é ignorado. Em algumas modalidades, o éxon 55 de DMD é ignorado. Em algumas modalidades, um éxon ignorado é qualquer éxon cuja inclusão diminui uma função desejada de DMD. Em algumas modalidades, um éxon ignorado é qualquer éxon cuja salto aumentou uma função desejada de DMD.
[001096] Em algumas modalidades, mais de um éxon de DMD é ignorado. Em algumas modalidades, dois ou mais éxons de DMD são ignorados. Em algumas modalidades, dois ou mais éxons adjacentes de DMD são ignorados.
[001097] Em algumas modalidades, para salto de éxon da transcrição DMD, ou para tratamento de DMD, uma sequência de uma pluralidade de oligonucleotídeos fornecidos compreende uma lista de sequências DMD no presente documento. Em algumas modalidades, uma sequência compreende uma das SEQ ID Nos 1-30 da patente nº U.S. 8.759.507. Em algumas modalidades, uma sequência compreende uma das SEQ ID Nos 1-211 da patente nº U.S. US 8.486.907. Em algumas modalidades, para salto de éxon da transcrição DMD, ou para tratamento de DMD, uma sequência de uma pluralidade de oligonucleotídeos fornecidos é uma sequência DMD revelada no presente documento. Em algumas modalidades, uma sequência é uma das SEQ ID Nos 1- 30 da patente nº U.S. 8.759.507. Em algumas modalidades, uma sequência é uma das SEQ ID Nos 1-211 da patente nº U.S.
8.486.907. Em algumas modalidades, uma sequência é, compreende ou compreende pelo menos 15 bases consecutivas da sequência de qualquer lista de oligonucleotídeos no presente documento, por exemplo, na Tabela A1. Em algumas modalidades, uma sequência é uma descrita em Kemaladewi, et al., Dual exon skipping in myostatin and dystrophin for Duchenne muscular dystrophy, BMC Med Genomics. 20 de abril de 2011;4:36. doi: 10.1186/1755- 8794-4-36; ou Malerba et al., Dual Myostatin and Dystrophin Éxon Skipping by Morpholino Nucleic Acid Oligomers Conjugated to a Cell-penetrating Peptide Is a Promising Therapeutic Strategy for the Treatment of Duchenne Muscular Dystrophy, Mol Ther Nucleic Acids. 2012 Dec 18;1:e62. doi:
10.1038/mtna.2012.54.
[001098] Em algumas modalidades, uma composição de oligonucleotídeo fornecida é administrada em uma dose e/ou frequência mais baixa que aquela de uma composição de oligonucleotídeo de referência comparável de outro modo com efeito comparável na alteração do splicing de uma transcrição alvo. Em algumas modalidades, uma composição estereocontrolada (quiralmente controlada) de oligonucleotídeo é administrada em uma dose e/ou frequência mais baixa que aquela de uma composição de oligonucleotídeo de referência estereoaleatória comparável de outro modo com efeito comparável na alteração no splicing da transcrição alvo. Se for desejado, uma composição fornecida também pode ser administrada em dose/frequência mais alta devido às suas toxicidades mais baixas.
[001099] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos, as composições e métodos têm baixas toxicidades, por exemplo, em comparação com uma composição de referência. Conforme amplamente conhecido na técnica, os oligonucleotídeos podem induzir toxicidades quando administrados, por exemplo, a células, tecidos, organismo,
etc.
Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos podem induzir resposta imune indesejada.
Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo pode induzir ativação de complemento.
Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos podem induzir a ativação da via alternativa do complemento.
Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos podem induzir inflamação.
Entre outros fatores, o sistema complementar tem atividade citolítica forte que pode danificar células e, portanto deve ser modulado para reduzir lesões potenciais.
Em algumas modalidades, a lesão vascular induzida por oligonucleotídeo é um desafio recorrente no desenvolvimento de oligonucleotídeos, por exemplo, para uso farmacêutico.
Em algumas modalidades, uma fonte primária de inflamação quando altas doses de oligonucleotídeos são administradas, envolve a ativação da cascata de complemento alternativa.
Em algumas modalidades, a ativação de complemento é um desafio comum associado aos oligonucleotídeos contendo fosforotioato, e há também um potencial de algumas sequências de fosforotioatos para induzir ativação celular imune inata.
Em algumas modalidades, a liberação de citocina é associada à administração de oligonucleotídeos.
Por exemplo, em algumas modalidades, aumentos na proteína quimiotática de monócito interleucina-6 (IL-6) (MCP-1) e/ou interleucina-12 (IL-12) são observados.
Consulte, por exemplo, Frazier, Antisense Oligonucleotide Therapies: The Promise e the Challenges from a Toxicologic Pathologist's Perspective.
Toxicol Pathol., 43: 78-89, 2015; e Engelhardt, et al., Scientific e Regulatory Policy Committee Points-to-consider Paper: Drug-induced Vascular Injury Associated with Nonsmall Molecule Therapeutics in Preclinical Development: Parte 2. Antisense Oligonucleotides.
Toxicol
Pathol. 43: 935-944, 2015.
[001100] As composições de oligonucleotídeo, conforme fornecidas no presente documento, podem ser usadas como agentes para modular vários processos e mecanismos celulares, incluindo, porém sem limitação, transcrição, tradução, respostas imunes, epigenética, etc. Além disso, as composições de oligonucleotídeo, conforme fornecidas no presente documento, podem ser usadas como reagentes para propósitos de pesquisa diagnóstico. Uma pessoa versada na técnica irá reconhecer prontamente que a presente revelação revelação no presente documento não se limita ao uso particular, porém é aplicável a quaisquer situações em que o uso de oligonucleotídeos sintéticos é desejável. Entre outros fatores, as composições fornecidas são úteis em uma variedade de aplicações terapêuticas, de diagnóstico, agrícolas e/ou de pesquisa.
[001101] Vários regimes de dosagem podem ser utilizados para administrar composições de oligonucleotídeo quiralmente controladas fornecidas, por exemplo, aquelas descritas nos documentos US 9695211, US 9605019, US 9598458, US 2013/0178612, US 20150211006, US 20170037399, WO 2017/015555, WO 2017/062862, WO 2017/160741, WO 2017/192664, WO 2017/192679, e/ou WO 2017/210647, os regimes de dosagem de cada um dos quais é são incorporados ao presente documento a título de referência.
[001102] Em algumas modalidades, com sua baixa toxicidade, os oligonucleotídeos e composições fornecidos podem ser administrados em dosagem mais alta e/ou com frequência mais alta. Em algumas modalidades, com sua entrega aprimorada (e outras propriedades), as composições fornecidas podem ser administradas em dosagens mais mais baixas e/ou com frequência mais baixa para obter efeitos biológicos, por exemplo, eficácia clínica.
[001103] Uma única dose pode conter várias quantidades de oligonucleotídeos. Em algumas modalidades, uma única dose pode conter várias quantidades de um tipo de oligonucleotídeo quiralmente controlado, conforme adequadamente desejado pela aplicação. Em algumas modalidades, uma única dose contém cerca de 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300 ou mais (por exemplo, cerca de 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 ou mais) mg de um tipo de oligonucleotídeo quiralmente controlado. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo quiralmente controlado é administrada em uma quantidade mais baixa, em uma única dose e/ou em dose total, do que um oligonucleotídeo quiralmente não controlado. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo quiralmente controlado é administrado em uma quantidade mais baixa em uma única dose e/ou em dose total, do que um oligonucleotídeo quiralmente não controlado devido à eficácia aprimorada. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo quiralmente controlado é administrado em uma quantidade mais alta, em uma única single dose e/ou em dose total, do que um oligonucleotídeo quiralmente não controlado. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo quiralmente controlado é administrado em uma quantidade mais alta em uma única dose e/ou em dose total, do que um oligonucleotídeo quiralmente não controlado devido à segurança aprimorada. Composições Farmacêuticas
[001104] Quando usado como terapêutica, um oligonucleotídeo ou composição de oligonucleotídeo fornecido descrito no presente documento é administrado como uma composição farmacêutica. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um oligonucleotídeo fornecido, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e pelo menos um ingrediente inativo farmaceuticamente aceitável selecionado dentre diluentes farmaceuticamente aceitáveis, excipientes farmaceuticamente aceitáveis e carreadores farmaceuticamente aceitáveis. Em algumas modalidades, nas composições fornecidas os oligonucleotídeos fornecidos podem existir como sais, de preferência, sais farmaceuticamente aceitáveis, por exemplo, sais de sódio, sal de amônio, etc. Em algumas modalidades, um sal de um oligonucleotídeo fornecido compreende dois ou mais cátions, por exemplo, em algumas modalidades, até o número de grupos ácidos negativamente carregados (por exemplo, fosfato, fosforotioato, etc.) em um oligonucleotídeo. Conforme observado por aqueles versados na técnica, os oligonucleotídeos descritos no presente documento podem ser fornecidos e/ou utilizados em uma forma de sal, particularmente uma forma de sal farmaceuticamente aceitável.
[001105] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece sais de oligonucleotídeos fornecidos, por exemplo, oligonucleotídeos quiralmente controlados, e composições farmacêuticas dos mesmos. Em algumas modalidades, um sal é um sal farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, cada íon de hidrogênio que pode ser doado para uma base (por exemplo, sob condições de uma solução aquosa, uma composição farmacêutica, etc.) é substituído por um cátion não -H+. Por exemplo, em algumas modalidades, um sal farmaceuticamente aceitável de um oligonucleotídeo é um sal de íon metálico, em que cada íon de hidrogênio (por exemplo, de −OH, −SH, etc., suficientemente ácido em água) de cada ligação internucleotídica (por exemplo, uma ligação fosfato natural, uma ligação diéster de fosforotioato, etc.) é substituído por um íon metálico. Em algumas modalidades, um sal fornecido é um sal totalmente de sódio. Em algumas modalidades, um sal farmaceuticamente aceitável fornecido é um sal totalmente de sódio. Em algumas modalidades, um sal fornecido é um sal totalmente de sódio, em que cada ligação internucleotídica que é uma ligação fosfato natural (forma ácida −O−P(O)(OH)−O−), se houver, existe como sua forma de sal de sódio (−O−P(O)(ONa)−O−), e cada ligação internucleotídica que é uma ligação diéster de fosforotioato (ligação internucleotídica fosforotioato; forma ácida −O−P(O)(SH)−O−), se houver, existe como sua forma de sal de sódio (−O−P(O)(SNa)−O−).
[001106] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é formulada para injeção intravenosa, administração oral, administração bucal, inalação, administração nasal, administração tópica, administração oftálmica ou administração ótica. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é a um comprimido, uma pílula, uma cápsula, um líquido, uma inalante, uma solução de aspersão nasal, um supositório, uma suspensão, um gel, um coloide, uma dispersão, uma suspensão, uma solução, uma emulsão, um unguento, uma loção, um colírio ou uma gota otológica.
[001107] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece uma composição farmacêutica que compreende oligonucleotídeo quiralmente controlado, ou composição do mesmo, em mistura por adição com um excipiente farmaceuticamente aceitável. Uma pessoa versada na técnica irá reconhecer que as composições farmacêuticas incluem os sais farmaceuticamente aceitáveis do oligonucleotídeo quiralmente controlado, ou composição do mesmo, descritos acima.
[001108] Uma variedade de nanocarreadores supramoleculares pode ser usada para entregar ácidos nucleicos. Nanocarreadores exemplificativos incluem, porém sem limitação lipossomas, complexos polímero catiônicos e vários poliméricos. A complexação de ácidos nucleicos com vários policátions é outra abordagem para entrega intracelular; isso inclui o uso de policátions PEGuilados, complexos de polietilenoamina (PEI), copolímeros em bloco catiônicos e dendrímeros. Vários nanocarreadores catiônico, incluindo PEI e dendrímeros de poliamidoamina ajudam a liberar os teores dos endossomas. Outras abordagens incluem o uso de nanopartículas poliméricas, micelas de polímero, pontos quânticos e lipoplexos. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo é conjugado a outro molecular.
[001109] As estratégias de entrega de ácido nucleico adicionais são conhecidas além das estratégias de entrega exemplificativas descritas no presente documento.
[001110] Em aplicações terapêuticas e/ou de diagnóstico, os compostos da revelação podem ser formulados para uma variedade de modos de administração, incluindo administração sistêmica e tópica ou localizada. As técnicas e formulações podem ser geralmente encontradas em Remington, The Science e Practice of Pharmacy, (20ª ed. 2000).
[001111] Os oligonucleotídeos fornecidos e composições dos mesmos, são eficazes em relação a uma ampla faixa de dosagem. Por exemplo, no tratamento de seres humanos adultos, as dosagens de cerca de 0,01 a cerca de 1000 mg, de cerca de 0,5 a cerca de 100 mg, de cerca de 1 a cerca de 50 mg per dia, e de cerca de 5 a cerca de 100 mg per dia são exemplos de dosagens que podem ser usadas. A dosagem exata irá depender da via de administração, da forma na qual o composto é administrado, do indivíduo a ser tratado, do peso corporal do indivíduo a ser tratado e das preferências e da experiências do médico responsável.
[001112] Os sais farmaceuticamente aceitáveis são geralmente bem conhecidos por aqueles de habilidade comum na técnica, e podem incluir, a título de exemplo, porém sem limitação, acetato, benzenossulfonato, besilato, benzoato, bicarbonato, bitartrato, brometo, edetado de cálcio, carnsilato, carbonato, citrato, edetato, edisilato, estolato, esilato, fumarato, gluceptato, gluconato, glutamato, glicolilarsanilato, hexilresorcinato, hidrabamina, bromidrato, cloridrato, hidroxinaftoato, iodeto, isetionato, lactato, lactobionato, malato, maleato, mandelato, mesilato, mucato, napsilato, nitrato, pamoato (embonato), pantotenato, fosfato/difosfato, poligalacturonato, salicilato, estearato, subacetato, succinato, sulfato, tanato, tartrato ou teoclato. Outros sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser encontrados, por exemplo, em Remington, The Science e Practice of Pharmacy (20ª ed. 2000). Os sais farmaceuticamente aceitáveis preferenciais incluem, por exemplo, acetato, benzoato, brometo, carbonato, citrato, gluconato, bromidrato, cloridrato, maleato, mesilato, napsilato, pamoato (embonato), fosfato, salicilato, succinato, sulfato ou tartrato.
[001113] Conforme observado por uma pessoa que tem habilidade comum na técnica, os oligonucleotídeos podem ser formulados como vários sais, por exemplo, para usos farmacêuticos. Em algumas modalidades, um sal é um sal de cátion metálico e/ou sal de amônio. Em algumas modalidades, um sal é um sal de cátion metálico de um oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, um sal é um sal de amônio de um oligonucleotídeo. Sais de metais alcalinos ou alcalino terrosos representativos incluem sódio, lítio, potássio, cálcio, magnésio e similares. Em algumas modalidades, um sal é um sal de sódio de um oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, quando adequado, amônio não tóxico, amônio quaternário e cátions de amina formados com oligonucleotídeos. Conforme observado por uma pessoa que tem habilidade comum na técnica, um sal de um oligonucleotídeo pode conter mais de um cátion, por exemplo, íons de sódio, à medida que pode haver mais de um ânion dentro de um oligonucleotídeo.
[001114] Dependendo das condições específicas sendo tratadas, tais agentes podem ser formulados em formas de dosagem líquida ou sólida e administrados sistêmica ou localmente. Os agentes podem ser entregues, por exemplo, em uma forma de liberação temporizada ou sustentada, conforme é conhecido pelas pessoas versadas na técnica. As técnicas para formulação e administração podem ser encontradas em Remington, The Science e Practice of Pharmacy (20ª ed. 2000). As vias adequadas podem incluir administração oral, bucal, por aspersão por inalação, sublingual, retal, transdérmica, vaginal, transmucosal, nasal ou intestinal; entrega parenteral, incluindo intramuscular, subcutânea, injeções intramedulares, assim como injeções intratecais,
intraventriculares diretas, intravenosas, intra-articulares, intraesternais, intrassinoviais, intra-hepáticas, intralesionais, intracranianas, intraperitoneais, intranasais ou intraoculares ou outros modos de entrega.
[001115] Para injeção, os agentes da revelação podem ser formulados e diluídos em soluções aquosas, tal como em tampões fisiologicamente compatíveis, tal como uma solução de Hank, solução de Ringer, ou tampão salino fisiológico. Para tal administração transmucosal, penetrantes adequados à barreira a ser permeada são usados na formulação. Tais penetrantes são geralmente conhecidos na técnica.
[001116] O uso de carreadores inertes farmaceuticamente aceitáveis para formular os compostos no presente documento revelados para a prática da revelação em dosagens adequadas para administração sistêmica é abrangido pelo escopo da revelação. Com a escolha adequada do carreador e prática de fabricação adequada, as composições da presente revelação, em particular, aquelas formuladas como soluções, podem ser administradas parenteralmente, tal como por meio de injeção intravenosa.
[001117] os compostos, por exemplo, oligonucleotídeos, podem ser prontamente formulados com o uso de carreadores farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos na técnica em dosagens adequadas para administração oral. Tais carreadores permitem que os compostos da revelação sejam formulados como comprimidos, pílulas, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, pastas fluidas, suspensões e similares, para ingestão oral por um indivíduo (por exemplo, paciente) a ser tratado.
[001118] Para entrega nasal ou inalação, os agentes da revelação também podem ser formulados por métodos conhecidos por aqueles versados na técnica, e podem incluir, por exemplo, porém sem limitação, exemplos de solubilizantes, diluentes ou substâncias dispersantes, tais como solução salina, conservantes, tais como álcool benzílico, promotores de absorção e fluorocarbonos.
[001119] Em determinadas modalidades, os oligonucleotídeos e composições são entregues para o SNC. Em determinadas modalidades, os oligonucleotídeos e composições são entregues para o fluido cerebroespinhal. Em determinadas modalidades, os oligonucleotídeos e composições são administrados ao parênquima cerebral. Em determinadas modalidades, os oligonucleotídeos e composições são entregues para um animal/indivíduo por administração intratecal ou administração intracerebroventricular. A ampla distribuição de oligonucleotídeos e composições, descrita no presente documento, dentro do sistema nervoso central pode ser obtida com a administração intraparenquimal, administração intratecal ou administração intracerebroventricular.
[001120] Em determinadas modalidades, a administração parenteral é por injeção, por exemplo, por uma seringa, uma bomba, etc. Em determinadas modalidades, a injeção é uma injeção em bolus. Em determinadas modalidades, a injeção é administrada diretamente a um tecido, tal como corpo estriado, caudado, córtex, hipocampo e cerebelo.
[001121] Em determinadas modalidades, os métodos de localização específica de um agente farmacêutico, tal como por injeção em bolus, diminuem a concentração eficaz média (EC50) em um fator de 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50. Em determinadas modalidades, o tecido alvejado é tecido cerebral.
Em determinadas modalidades, o tecido alvejado é tecido estriado. Em determinadas modalidades, a diminuição da EC50 é desejável devido ao fato de que a mesma reduz a dose necessária para obter um resultado farmacológico em um paciente que necessite do mesmo.
[001122] Em determinadas modalidades, um oligonucleotídeo é entregue por injeção ou infusão, uma vez por mês, a cada dois meses, a cada 90 dias, a cada 3 meses, a cada 6 meses, duas vezes por ano ou uma vez por ano.
[001123] As composições farmacêuticas adequadas para uso na presente revelação incluem composições em que os ingredientes ativos estão contidos em uma quantidade eficaz para alcançar o propósito pretendido. A determinação das quantidades eficazes está dentro da capacidade dos versados na técnica, especialmente à luz da revelação detalhada fornecida no presente documento.
[001124] Além dos ingredientes ativos, essas composições farmacêuticas podem conter carreadores farmaceuticamente aceitáveis adequados que compreendem excipientes e auxiliares que facilitam o processamento de um composto ativo para preparações que podem ser usadas farmaceuticamente. As preparações formuladas para administração oral podem ser na forma de comprimidos, drágeas, cápsulas ou soluções.
[001125] As preparações farmacêuticas para uso oral podem ser obtidas combinando-se um composto ativo com excipientes sólidos, triturando-se opcionalmente uma mistura resultante e processando-se a mistura de grânulos, após adição de auxiliares adequados, se desejado, para obter comprimidos ou núcleos de drágea. Os excipientes adequados são, em particular, cargas, tais como açúcares, incluindo lactose, sacarose, manitol ou sorbitol; preparações de celulose, por exemplo, amido de milho, amido de trigo, amido de arroz, amido de batata, gelatina, goma tragacanto, metil celulose, hidroxipropilmetil-celulose, carboximetil-celulose de sódio (CMC) e/ou polivinilpirrolidona (PVP: povidona). Se desejado, agentes desintegrantes podem ser adicionados, tal como polivinilpirrolidona reticulada, ágar ou ácido algínico ou um sal do mesmo, tal como alginato de sódio.
[001126] Os núcleos de drágea são fornecidos com revestimentos adequados. Para esse propósito, soluções de açúcar concentradas podem ser usadas, que podem conter opcionalmente goma arábica, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenoglicol (PEG) e/ou dióxido de titânio, soluções de laca e solventes orgânicos adequados ou misturas de solventes. Corantes ou pigmentos podem ser adicionados aos comprimidos ou revestimentos de drágea para identificação ou para caracterizar combinações diferentes de doses de composto ativo.
[001127] As preparações farmacêuticas que podem ser usadas oralmente incluem cápsulas “push-fit” produzidas a partir de gelatina, assim como cápsulas moles vedadas produzidas a partir de gelatina, e um plastificante, tal como glicerol ou sorbitol. As cápsulas “push-fit” podem conter os ingredientes ativos em mistura por adição com carga, tal como lactose, aglutinantes, tais como amidos e/ou lubrificantes, tal como talco ou estearato de magnésio e, opcionalmente, estabilizantes. Em cápsulas moles, um composto ativo pode ser dissolvido ou suspenso em líquidos adequados, tais como óleos graxos, parafina líquida ou polietileno glicóis líquidos (PEGs). Além disso, estabilizantes podem ser adicionados.
[001128] Em algumas modalidades, qualquer oligonucleotídeo DMD, ou combinação do mesmo, descrito no presente documento, ou qualquer composição que compreende um oligonucleotídeo DMD descrito no presente documento, pode ser combinado com qualquer preparação farmacêutica descrita no presente documento ou conhecida na técnica. Determinadas Modalidades de Conjugados e Porções Químicas Adicionais
[001129] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos compreendem uma ou mais porções químicas adicionais (por exemplo, diferentes das porções químicas típicas de nucleobases, açúcares e/ou ligações internucleotídicas, etc.), opcionalmente através de um ligante. Em algumas modalidades, uma porção química é uma porção química de lipídio. Em algumas modalidades, uma porção química é uma porção química de carboidrato. Em algumas modalidades, uma porção química é uma porção química de alvejamento. Em algumas modalidades, uma porção química é uma porção química de um aglutinante. Em algumas modalidades, uma porção química pode aumentar a entrega de oligonucleotídeos para determinadas organelas, células, tecidos, órgãos e/ou organismos. Em algumas modalidades, uma porção química melhora uma ou mais das propriedades e/ou atividades desejadas. Determinadas porções químicas exemplificativas utilizadas em determinados oligonucleotídeos são apresentadas nas Tabelas (por exemplo, vários Mod na Tabela A1). Em algumas modalidades, uma porção química compreende uma ou mais porções químicas de açúcar ou derivados das mesmas, por exemplo, glicose, manose,
etc.
Em algumas modalidades, uma porção química é ou compreende uma porção química de lipídio.
Em algumas modalidades, uma porção química é ou compreende uma porção química de vitamina E.
Em algumas modalidades, uma porção química compreende uma ou mais porções químicas de peptídeo.
Em algumas modalidades, um peptídeo é um peptídeo de penetração celular.
Em algumas modalidades, um peptídeo é um aglutinante de uma proteína, por exemplo, um receptor de superfície celular.
Em algumas modalidades, um peptídeo é um peptídeo Tfr1. Determinadas porções químicas de peptídeo exemplificativas são utilizadas para preparar os oligonucleotídeos descritos nas Tabelas, por exemplo, Tabela 1A.
Em algumas modalidades, uma porção química compreende uma ou mais porções químicas básicas.
Em algumas modalidades, uma porção química básica é positivamente carregada, por exemplo a cerca de pH 7,4. Em algumas modalidades, uma porção química básica é ou compreende uma porção química de guanidina.
Em algumas modalidades, uma porção química básica é ou compreende −N(R1)2, em que cada R1 é independentemente conforme descrito na presente revelação.
Em algumas modalidades, uma porção química básica é ou compreende −N(R1)3, em que cada R1 é independentemente conforme descrito na presente revelação.
Em algumas modalidades, uma porção química básica é ou compreende −N=C(N(R1)2)2, em que cada R1 é independentemente conforme descrito na presente revelação.
Em algumas modalidades, cada R1 é independentemente R conforme descrito na presente revelação.
Em algumas modalidades, cada R1 é independentemente C1-6 alquila opcionalmente substituída.
Em algumas modalidades, R1 é metila.
Em algumas modalidades, um ou dois R1 são iguais.
Em algumas modalidades, cada R1 é igual.
Em algumas modalidades, pelo menos um R1 é diferente do outro R1. Em algumas modalidades, uma porção química básica é −N=C(N(CH3)2)2. Em algumas modalidades, uma porção química compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais porções químicas de açúcar, peptídeo, lipídio e/ou básicas. Em algumas modalidades, o número é 1. Em algumas modalidades, o número é
2. Em algumas modalidades, o número é 3. Em algumas modalidades, o número é 4. Em algumas modalidades, o número é
5. Em algumas modalidades, o número é 6. Em algumas modalidades, uma porção química compreende uma porção química de aglutinante de uma proteína, por exemplo, uma proteína receptora de uma célula alvo. Em algumas modalidades, um aglutinante é um aglutinante para um receptor de vitamina E. Em algumas modalidades, um aglutinante é para o receptor Tfr1. As porções químicas, conforme descrito e demonstrado na presente revelação, incluem e podem ser utilizadas como porções químicas de carboidrato, porções químicas de lipídio, porções químicas de alvejamento, etc., e podem fornecer uma variedade de funções, por exemplo, aprimorar a entrega, uma ou mais propriedades, atividades, etc.
[001130] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece oligonucleotídeos que compreendem porções químicas adicionais, opcionalmente conectadas à porção química de oligonucleotídeo através de um ligante. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece oligonucleotídeos que compreendem (RD)b−LM1−LM2−LM3−, em que: cada RD é independentemente uma porção química; cada um dentre LM1, LM2, e LM3 é independentemente L; e b é 1 a 1000.
[001131] Em algumas modalidades, cada um dentre LM1, LM2, e LM3 é independentemente um grupo de ligação covalente ou bivalente ou multivalente linear ou ramificado opcionalmente substituído selecionado dentre um grupo C1-10 alifático e um grupo C1-10 heteroalifático tendo 1 a 5 heteroátomos, em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por C1-6 alquileno, C1-6 alquenileno, , −C(R')2−, −O−, −S−, −S−S−, −N(R')−, −C(O)−, −C(S)−, −C(NR')−, −C(O)N(R')−, −N(R')C(O)N(R')−, −N(R')C(O)O−, −S(O)−, −S(O)2−, −S(O)2N(R')−, −C(O)S−, −C(O)O−, −P(O)(OR')−, −P(O)(SR')−, −P(O)(R')−, −P(O)(NR')−, −P(S)(OR')−, −P(S)(SR')−, −P(S)(R')−, −P(S)(NR')−, −P(R')−, −P(OR')−, −P(SR')−, −P(NR')−, −P(OR')[B(R')3]−, −OP(O)(OR')O−, −OP(O)(SR')O−, −OP(O)(R')O−, −OP(O)(NR')O−, −OP(OR')O−, −OP(SR')O−, −OP(NR')O−, −OP(R')O−, ou −OP(OR')[B(R')3]O−; e um ou mais CH ou átomos de carbono são opcional e independentemente substituídos por CyL.
[001132] Em algumas modalidades, LM1 compreende um ou mais −N(R')− e um ou mais −C(O)−. Em algumas modalidades, um ligante (por exemplo, L, LM, etc.) ou LM1 é ou compreende , em que nL é 1 a
8. Em algumas modalidades, um ligante ou −LM1−LM2−LM3− é
, ou uma forma de sal do mesmo, em que nL é 1 a 8. Em algumas modalidades, a ligante ou −LM1−LM2−LM3− é
, ou uma forma de sal do mesmo, em que: nL é 1 a 8. cada grupo amino se conecta independentemente a uma porção química; e O átomo P se conecta ao 5'-OH do oligonucleotídeo.
Em algumas modalidades, a porção química e o ligante, ou (RD)b−LM1−LM2−LM3−, é ou compreende
. Em algumas modalidades, a porção química e o ligante, ou (RD)b−LM1−LM2−LM3−, é ou compreende
. Em algumas modalidades, a porção química e o ligante, ou (RD)b−LM1−LM2−LM3−, é ou compreende
. Em algumas modalidades, a porção química e o ligante, ou (RD)b−LM1−LM2−LM3−,
é ou compreende . Em algumas modalidades, a porção química e o ligante, ou (RD)b−LM1−LM2−LM3−, é ou compreende
. Em algumas modalidades, a porção química e o ligante, ou (RD)b−LM1−LM2−LM3−, é ou compreende
. Em algumas modalidades, a porção química e o ligante, ou (RD)b−LM1−LM2−LM3−, é ou compreende
. Em algumas modalidades, um ligante, ou LM1, é ou compreende
. Em algumas modalidades, a porção química e o ligante, ou (RD)b−LM1−LM2−LM3−, é ou compreende: . Em algumas modalidades, a porção química e ligante, ou (RD)b−LM1−LM2−LM3−,
é ou compreende: . Em algumas modalidades, um ligante é
. Em algumas modalidades, a porção química e ligante, ou (RD)b−LM1−LM2−LM3−, é ou compreende:
. Em algumas modalidades, a porção química e ligante, ou (RD)b−LM1−LM2−LM3−, é ou compreende: .
[001133] Em algumas modalidades, nL é 1 a 8.
Em algumas modalidades, nL é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ou 8. Em algumas modalidades, nL é 1. Em algumas modalidades, nL é 2. Em algumas modalidades, nL é 3. Em algumas modalidades, nL é
4. Em algumas modalidades, nL é 5. Em algumas modalidades, nL é 6. Em algumas modalidades, nL é 7. Em algumas modalidades, nL é 8.
[001134] Em algumas modalidades, LM2 é um grupo de ligação covalente ou bivalente linear ou ramificado opcionalmente substituído selecionado dentre um grupo C1-10 alifático e um grupo C1-10 heteroalifático tendo 1 a 5 heteroátomos, em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por C1-6 alquileno, C1-6 alquenileno, , −C(R')2−, −O−, −S−, −S−S−, −N(R')−, −C(O)−, −C(S)−, −C(NR')−, −C(O)N(R')−, −N(R')C(O)N(R')−, −N(R')C(O)O−, −S(O)−, −S(O)2−, −S(O)2N(R')−, −C(O)S−, −C(O)O−, −P(O)(OR')−, −P(O)(SR')−, −P(O)(R')−, −P(O)(NR')−, −P(S)(OR')−, −P(S)(SR')−, −P(S)(R')−, −P(S)(NR')−, −P(R')−, −P(OR')−, −P(SR')−, −P(NR')−, −P(OR')[B(R')3]−, −OP(O)(OR')O−, −OP(O)(SR')O−, −OP(O)(R')O−, −OP(O)(NR')O−, −OP(OR')O−, −OP(SR')O−, −OP(NR')O−, −OP(R')O−, ou −OP(OR')[B(R')3]O−; e um ou mais CH ou átomos de carbono são opcional e independentemente substituídos por CyL. Em algumas modalidades, LM2 é um grupo de ligação covalente ou bivalente linear ou ramificado opcionalmente substituído selecionado dentre um grupo C1-10 alifático e um grupo C1-10 heteroalifático tendo 1 a 5 heteroátomos, em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por C1- 6 alquileno, C1-6 alquenileno, , −C(R')2−, −O−, −S−, −S−S−, −N(R')−, −C(O)−, −C(S)−, −C(NR')−, −C(O)N(R')−, −N(R')C(O)N(R')−, −N(R')C(O)O−, −S(O)−, −S(O)2−, −S(O)2N(R')−,
−C(O)S−, −C(O)O−, −P(O)(OR')−, −P(O)(SR')−, ou −P(O)(R')−. Em algumas modalidades, LM2 é um C1-10 alifático de ligação covalente ou bivalente linear ou ramificado opcionalmente substituído em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por C1-6 alquileno, C1-6 alquenileno, , −C(R')2−, −O−, −S−, −N(R')−, ou −C(O)−. Em algumas modalidades, LM2 é −NH−(CH2)6−, em que −NH− é ligado a LM1.
[001135] Em algumas modalidades, LM3 é −P(O)(OR')−, −P(O)(SR')−, −P(O)(R')−, −P(O)(NR')−, −P(S)(OR')−, −P(S)(SR')−, −P(S)(R')−, −P(S)(NR')−, −P(R')−, −P(OR')−, −P(SR')−, −P(NR')−, −P(OR')[B(R')3]−, −OP(O)(OR')−, −OP(O)(SR')−, −OP(O)(R')−, −OP(O)(NR')−, −OP(S)(OR')−, −OP(S)(SR')−, −OP(S)(R')−, −OP(S)(NR')−, −OP(R')−, −OP(OR')−, −OP(SR')−, −OP(NR')−, ou −OP(OR')[B(R')3]−. Em algumas modalidades, LM3 é −OP(O)(OR')−, ou −OP(O)(SR')−, em que −O− é ligado a LM2. Em algumas modalidades, o átomo P é conectado a uma unidade de açúcar, uma unidade de nucleobase ou uma ligação internucleotídica. Em algumas modalidades, o átomo P é conectado a um grupo −OH através da formação de uma ligação P−O. Em algumas modalidades, o átomo P é conectado ao grupo 5'−OH através da formação de uma ligação P−O.
[001136] Em algumas modalidades, LM1 é uma ligação covalente. Em algumas modalidades, LM2 é uma ligação covalente. Em algumas modalidades, LM3 é uma ligação covalente. Em algumas modalidades, LM1 é LM2 conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, LM1 é LM3 conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, LM2 é LM1 conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, LM2 é LM3 conforme descrito na presente revelação.
Em algumas modalidades, LM3 é LM1 conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, LM3 é LM2 conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, LM é LM1 conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, LM é LM2 conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, LM é LM3 conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, LM é LM1−LM2, em que cada um dentre LM1 e LM2 é independentemente conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, LM é LM1−LM3, em que cada um dentre LM1 e LM3 é independentemente conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, LM é LM2−LM3, em que cada um dentre LM2 e LM3 é independentemente conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, LM é LM1−LM2−LM3, em que cada um dentre LM1, LM2 e LM3 é independentemente conforme descrito na presente revelação.
[001137] Em algumas modalidades, cada RD é independentemente uma porção química conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, RD é uma porção química adicional. Em algumas modalidades, RD é a porção química de alvejamento. Em algumas modalidades, RD é ou compreende uma porção química de carboidrato. Em algumas modalidades, RD é ou compreende uma porção química de lipídio. Em algumas modalidades, RD é ou compreende uma porção química de aglutinante para, por exemplo, receptores celulares, tal como um receptor sigma, um receptor de asialoglicoproteina, etc. Em algumas modalidades, uma porção química de aglutinante é ou compreende uma porção química de anisamida, que pode ser uma porção química de aglutinante para um receptor sigma. Em algumas modalidades, uma porção química de aglutinante é ou compreende um lipídio. Em algumas modalidades, uma porção química de aglutinante é ou compreende uma porção química de GalNAc, que pode ser uma porção química de aglutinante para um receptor de asialoglicoproteína.
Em algumas modalidades, RD é selecionado dentre fenila opcionalmente substituída,
, , ,
, e , em que n' é 0 ou 1, e cada outra variável é independentemente conforme descrito na presente revelação.
Em algumas modalidades, Rs é F.
Em algumas modalidades, Rs é OMe.
Em algumas modalidades, Rs é OH.
Em algumas modalidades, Rs é NHAc.
Em algumas modalidades, Rs é NHCOCF3. Em algumas modalidades, R' é H.
Em algumas modalidades, R é H.
Em algumas modalidades, R2s é NHAc, e R5s é OH.
Em algumas modalidades, R2s é p-anisoíla, e R5s é OH.
Em algumas modalidades, R2s é NHAc e R5s é p-anisoíla.
Em algumas modalidades, R2s é OH, e R5s é p- anisoíla.
Em algumas modalidades, RD é selecionado dentre
, , ,
, , ,
, , ,
, ,
, ,
, e . As modalidades adicionais de RDincluem modalidades de porção química adicionais, por exemplo, aquelas descritas nos exemplos.
[001138] Em algumas modalidades, n' é 1. Em algumas modalidades, n' é 0.
[001139] Em algumas modalidades, n" é 1. Em algumas modalidades, n" é 2.
[001140] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo fornecido, por exemplo, oligonucleotídeo DMD, é conjugado a um componente adicional (porção química). Em algumas modalidades, uma composição compreende qualquer oligonucleotídeo DMD, ou combinação dos mesmos, descritos no presente documento, pode ser conjugada com qualquer porção química descrita no presente documento ou conhecida na técnica.
[001141] Em algumas modalidades, uma composição que compreende um oligonucleotídeo fornecido, por exemplo, um oligonucleotídeo DMD, compreende um componente adicional que é qualquer um dentre: Sulfonamida (Inibidor de Anidrases Carbônicas IV); lipídio clivável; aglutinante do Receptor de Transferrina 1 (CD71, TfR); alvejamento de transportador OCTN2 (L-Cartinina); aglutinante do Receptor Glut4 e Glut1; Receptor de manose C1 (Mrc1) e aglutinante do Receptor de manose 6P (M6Pr); lipídio clivável; Colesterol; ou um Peptídeo (incluindo, porém sem limitação, um peptídeo de entrega curta ou peptídeo de penetração celular (CPP)).
[001142] Foram projetados e/ou construídos vários oligonucleotídeos que compreendem um componente adicional que é, compreende ou é derivado de: colesterol; L- carnitina (ligação amida e carbamato); ácido fólico; ácido gambógico; lipídio clivável (ligação 1,2-dilaurina e éster); aglutinante receptor de insulina; CPP; glicose (tri e hexantenária); e manose (tri e hexantenária, alfa e beta); e vários esquemas de síntese para esses componentes adicionais e oligonucleotídeos que compreendem os mesmos ou moléculas derivadas dos mesmos foram concebidos.
[001143] Em algumas modalidades, uma composição que compreende um oligonucleotídeo, por exemplo, um oligonucleotídeo DMD compreende um compreende adicional que é derivado de . WV-DL-14 também é conhecido como WV-DL-014. Em algumas modalidades, o ácido gambógico ou um derivado do mesmo se liga ao receptor Transferrina (CD71).
[001144] Em algumas modalidades, uma composição que compreende um oligonucleotídeo, por exemplo, um oligonucleotídeo DMD compreende um componente adicional que é derivado de L-cartinina, que se liga ao transportador OCTN2. Em algumas modalidades, uma composição que compreende um oligonucleotídeo DMD compreende um componente adicional que é derivado de .
[001145] Em algumas modalidades, uma composição que compreende um oligonucleotídeo, por exemplo, um oligonucleotídeo DMD compreende um componente adicional que é uma sulfonamida ou um derivado do mesmo.
[001146] Em algumas modalidades, uma composição que compreende um oligonucleotídeo, por exemplo, um oligonucleotídeo DMD compreende um componente adicional que é derivado de qualquer um dentre:
[001147] Em algumas modalidades, uma composição que compreende um oligonucleotídeo, por exemplo, um oligonucleotídeo DMD compreende um componente adicional que é ou compreende ou compreende um derivado de:
.
[001148] Em algumas modalidades, uma composição que compreende um oligonucleotídeo, por exemplo, um oligonucleotídeo DMD compreende um componente adicional que é ou compreende ou compreende um derivado de: .
[001149] Em algumas modalidades, uma composição que compreende um oligonucleotídeo, por exemplo, um oligonucleotídeo DMD compreende um componente adicional que é derivado de qualquer um dentre: WV-DL-001, WV-DL-002, WV-DL- 003, WV-DL-006, WV-DL-007, WV-DL-008, WV-DL-009, WV-DL-010, WV-DL-011, WV-DL-012, ou WV-Dl-014, e outros componentes adicionais, em que o terminal -COOH é usado para conjugar o componente adicional a um ligante ou a um oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, uma composição que compreende um oligonucleotídeo, por exemplo, um oligonucleotídeo DMD compreende um componente adicional que é derivado de qualquer um dentre: WV-DL-001, WV-DL-002, WV-DL-003, WV-DL-006, WV-DL- 007, WV-DL-008, WV-DL-009, WV-DL-010, WV-DL-011, WV-DL-012, ou WV-Dl-014, e outros componentes adicionais, em que o terminal
-COOH é usado para conjugar o componente adicional a um ligante, em que o processo de conjugação converte o -COOH em um −C(O)− que se conecta a um ligante. Em algumas modalidades, uma composição que compreende um oligonucleotídeo, por exemplo, um oligonucleotídeo DMD compreende um componente adicional que é derivado de qualquer um dentre: WV-DL-001, WV- DL-002, WV-DL-003, WV-DL-006, WV-DL-007, WV-DL-008, WV-DL-009, WV-DL-010, WV-DL-011, WV-DL-012, ou WV-Dl-014, e outros componentes adicionais, em que o terminal -COOH é usado para conjugar o componente adicional a um ligante, em que o processo de conjugação substitui o -COOH por −C(O)− que se conecta a −NH− de um ligante (por exemplo, L001). Um exemplo não limitante de um produto desse processo para conjugação, com o uso de um componente adicional derivado de WV-DL-006 é mostrado aqui: , em que WV-DL-005 indica o componente adicional.
[001150] Em algumas modalidades, uma composição que compreende um oligonucleotídeo, por exemplo, um oligonucleotídeo DMD compreende um componente adicional que é um lipídio. Em algumas modalidades, uma composição que compreende um oligonucleotídeo, por exemplo, um oligonucleotídeo DMD compreende um componente adicional que é um lipídio, incluindo, porém sem limitação um lipídio descrito no presente documento.
[001151] Em algumas modalidades, uma composição que compreende um oligonucleotídeo, por exemplo, um oligonucleotídeo DMD, compreende um componente adicional, em que o componente adicional é conjugado ao oligonucleotídeo através de um ligante clivável. Em algumas modalidades, uma composição que compreende um oligonucleotídeo, por exemplo, um oligonucleotídeo DMD, compreende um componente adicional que é um lipídio, em que o lipídio é conjugado ao oligonucleotídeo através de um ligante clivável. Em algumas modalidades, uma composição que compreende um oligonucleotídeo, por exemplo, um oligonucleotídeo DMD, compreende um componente adicional que é um lipídio, que inclui, porém sem limitação um lipídio descrito no presente documento, em que o lipídio é conjugado ao oligonucleotídeo via através de um ligante clivável.
[001152] Em algumas modalidades um ligante clivável compreende um éster. Em algumas modalidades, um ligante clivável é clivável dentro de uma célula, que permite que o oligonucleotídeo seja fisicamente separado do componente adicional.
[001153] Em algumas modalidades um ligante clivável é ou compreende: , , , , , ou .
[001154] Os exemplos não limitantes de um oligonucleotídeo conjugado a um lipídio (ou lipídios) através de um ligante clivável são mostrados aqui: , e .
[001155] Um exemplo não limitante de um oligonucleotídeo que compreende um componente adicional que é ácido esteárico, ligado ao oligonucleotídeo através de um ligante clivável é mostrado aqui: , em que o ácido esteárico indica o componente adicional.
[001156] Um reagente não limitante útil para conjugar ácido esteárico através de um ligante clivável e sua preparação e uso exemplificativos são mostrados abaixo:
[001157] Um reagente não limitante útil para conjugar um derivado de colesterol através de um ligante clivável, e sua preparação exemplificativa, são mostrados aqui: .
[001158] Em algumas modalidades, uma composição que compreende um oligonucleotídeo compreende um componente adicional derivado de: .
[001159] Em algumas modalidades, uma composição que compreende um oligonucleotídeo compreende um componente adicional derivado de: , e .
[001160] Em algumas modalidades, uma composição que compreende um oligonucleotídeo, por exemplo, um oligonucleotídeo DMD compreende um aglutinante de receptor de manose. Em algumas modalidades, uma composição que compreende um oligonucleotídeo, por exemplo, um oligonucleotídeo DMD compreende um aglutinante receptor de manose que é um inibidor de receptor de manose. Em algumas modalidades, uma composição que compreende um oligonucleotídeo, por exemplo, um oligonucleotídeo DMD compreende um componente adicional que é derivado de qualquer um dentre:
, em que a seta indica um -COOH que pode ser usado para conjugar o componente adicional a um oligonucleotídeo, opcionalmente através de um ligante.
[001161] Um exemplo não limitante de um procedimento para preparar um componente adicional que compreende um aglutinante de receptor de manose é mostrado aqui: .
[001162] Em algumas modalidades, uma composição que compreende um oligonucleotídeo, por exemplo, um oligonucleotídeo DMD compreende um componente adicional que é um aglutinante (ou derivado do mesmo) que se liga a um receptor de glicose ou Glut4. Em algumas modalidades, uma composição que compreende um oligonucleotídeo, por exemplo, um oligonucleotídeo DMD compreende um componente adicional que é um aglutinante (ou derivado do mesmo) que se liga a um receptor de glicose. Em algumas modalidades, uma composição que compreende um oligonucleotídeo, por exemplo, um oligonucleotídeo DMD compreende um componente adicional que é um aglutinante (ou derivado do mesmo) que se liga a e inibe um receptor de glicose. Em algumas modalidades, um aglutinante (ou derivado do mesmo) que se liga a um receptor de glicose ou Glut4 é mono, bi, tri, ou hexantenário. Em algumas modalidades, uma composição que compreende um oligonucleotídeo, por exemplo, um oligonucleotídeo DMD compreende um componente adicional que é derivado de: .
[001163] Um exemplo não limitante de um procedimento para síntese de um inibidor de receptor de glicose triantenário é mostrado aqui:
[001164] Um exemplo não limitante de um procedimento para síntese de um inibidor de receptor de glicose hexantenário é mostrado aqui:
[001165] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo, por exemplo, um oligonucleotídeo DMD compreende um componente adicional, em que o componente adicional aumenta a internalização do oligonucleotídeo através de endocitose mediada por receptor.
[001166] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo, por exemplo, um oligonucleotídeo DMD compreende um componente adicional, em que o componente adicional é um aptâmero.
[001167] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo, por exemplo, um oligonucleotídeo DMD compreende um componente adicional, em que o componente adicional é um aptâmero que é um aptâmero de peptídeo, um aptâmero de RNA, um aptâmero de DNA, ou um aptâmero que compreende um nucleotídeo de RNA, um nucleotídeo de DNA, um nucleotídeo modificado e/ou um aminoácido e/ou peptídeo.
[001168] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo, por exemplo, um oligonucleotídeo DMD compreende um componente adicional, em que o componente adicional é um aptâmero que se liga a um receptor.
[001169] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo, por exemplo, um oligonucleotídeo DMD compreende um componente adicional, em que o componente adicional é um aptâmero que se liga a um receptor que é um receptor de manose, um receptor de manose-6-fosfato ou receptor de transferrina.
[001170] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo, por exemplo, um oligonucleotídeo DMD compreende um componente adicional, em que o componente adicional é um aptâmero que aumenta a internalização do oligonucleotídeo.
[001171] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo, por exemplo, um oligonucleotídeo DMD compreende um componente adicional, em que o componente adicional é um aptâmero que aumenta a internalização do oligonucleotídeo através endocitose mediada por receptor.
[001172] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo, por exemplo, um oligonucleotídeo DMD compreende um componente adicional, em que o componente adicional é ou compreende um peptídeo. Em algumas modalidades, um peptídeo é um peptídeo de penetração celular (CPP). Em algumas modalidades, um CPP é rico em arginina. Em algumas modalidades, um CPP tem ou compreende a sequência de aminoácidos de RRQPPRSISSHPC ou RRQPPRSISSHP.
[001173] Um exemplo não limitante de um procedimento para conjugar um peptídeo a um oligonucleotídeo DMD é mostrado aqui:
[001174] Em algumas modalidades, um peptídeo compreende a sequência de aminoácidos de RC ou RRC. Em algumas modalidades, um peptídeo compreende uma estrutura de:
[001175] Os oligonucleotídeos fornecidos, por exemplo, os oligonucleotídeos DMD, podem ser conjugados como PMOs aos peptídeos de penetração celular. Yokota et al. 2012 Nucl. Acid Ther. 22 306; Wu et al. 2009 Mol. Ther. 17 864–871; Goyenvalle et al. 2010 Mol. Ther. 18, 198–205; Jearawiriyapaisarn et al. 2010 Cardiovasc. Res. 85, 444–453.; Crisp et al. 2011 Hum. Mol. Genet. 20, 413–421; Widrick et al.
2011; Wu et al. 2011 PLoS One 6, e19906.
[001176] Em algumas modalidades, uma composição que compreende um oligonucleotídeo, por exemplo, um oligonucleotídeo DMD compreende um ou mais peptídeos e/ou etiquetas de peptídeo. Em algumas modalidades, um peptídeo é ou compreende um heptapeptídeo de alvejamento muscular (MSP). Em algumas modalidades, a sequência de um heptapeptídeo de alvejamento muscular é ou compreende a sequência de ASSLNIAXB. Em algumas modalidades, um peptídeo é ou compreende um peptídeo de penetração celular. Em algumas modalidades, a sequência de um peptídeo de penetração celular compreende múltiplas argininas. Em algumas modalidades, a sequência de um peptídeo de penetração celular é ou compreende RXRRBRRXRRBRXB.
[001177] Em algumas modalidades, a sequência de um peptídeo é ou compreende uma sequência de: ASSLNIAXB, RXRRBRRXRRBRXB, RXRRXRRXRRXRXB, ASSLNIAXB-RXRRBRRXRRBRXB, RXRRBRRXRRBRXB-ASSLNIAXB, ou qualquer sequência que compreende tanto ASSLNIAXB como RXRRBRRXRRBRXB ou RXRRXRRXRRXRXB, em que R é L-arginina, X é ácido 6-amino-hexanoico e B é beta-alanina.
[001178] Um heptapeptídeo de alvejamento muscular (MSP) fundido a um peptídeo de penetração celular rico em arginina (peptídeo B) pode ser conjugado aos oligonucleotídeos fornecidos, de acordo com a presente revelação. Yin et al. 2009 Hum. Mol. Genet. 18: 4405-4414. Yokota et al. 2009 Arch. Neurol. 66 32.
[001179] Em algumas modalidades, uma composição que compreende um oligonucleotídeo, por exemplo, um oligonucleotídeo DMD compreende anisamida ou um derivado da mesma.
[001180] Em algumas modalidades, uma composição que compreende um oligonucleotídeo, por exemplo, um oligonucleotídeo DMD compreende um ou mais grupos guanidínio. vPMOs são supostamente oligômeros de morfolino conjugados com a porção química de entrega contendo oito grupos guanidínio terminais em um arcabouço de dendrímero que permite a entrada nas células. Morcos et al. 2008 Biotechniques 45: 613–618; Yokota et al. 2012 Nucl. Acid Ther. 22 306.
[001181] Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo, por exemplo, oligonucleotídeo DMD é entregue com o uso de um leash. Um exemplo não limitante de um leash é relatado em: Gebski et al. 2003 Hum. Mol. Gen. 12: 1801-1811.
[001182] Em algumas modalidades, uma porção química adicional é colesterol; L-carnitina (ligação amida e carbamato); ácido fólico; lipídio clivável (ligação 1,2- dilaurina e éster); aglutinante receptor de insulina; ácido gambógico; CPP; glicose (tri e hexantenária); ou manose (tri e hexantenária, alfa e beta).
[001183] Determinadas porções químicas, por exemplo, porções químicas de lipídio, porções químicas de carboidrato, porções químicas de alvejamento, etc. e porções químicas de ligante para conectar tais porções químicas às cadeias de oligonucleotídeos (por exemplo, através de açúcares, nucleobases, ligações internucleotídicas, etc.) são descritas nas Tabelas como exemplo; algumas dessas porções químicas e porções químicas de ligante e tecnologias relacionadas para sua preparação, conjugação com cadeias de oligonucleotídeos, e uso são descritas, por exemplo, nos documentos WO 2017/062862, WO 2017/192679, WO 2017/210647, etc. Lipídios
[001184] Em algumas modalidades, uma porção química/componente adicional é uma porção química de lipídio. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece composições de oligonucleotídeo que compreendem adicionalmente um ou mais lipídios. Em algumas modalidades, a incorporação de porções químicas de lipídio em oligonucleotídeos pode fornecer propriedades muito aprimoradas inesperadas (por exemplo, atividades, toxicidades, distribuição, farmacocinética, etc.).
[001185] Uma composição pode ser obtida combinando-se um composto ativo com um lipídio. Em algumas modalidades, o lipídio é conjugado a um composto ativo. Em algumas modalidades, o lipídio não é conjugado a um composto ativo. Em algumas modalidades, um lipídio compreende uma cadeia C10-C40 alifática linear, saturada ou parcialmente insaturada. Em algumas modalidades, um lipídio compreende uma cadeia C10- C40 alifática linear, saturada ou parcialmente insaturada, opcionalmente substituída por um ou mais grupos C1-4 alifáticos. Em algumas modalidades, um lipídio compreende uma cadeia C10- C60 alifática linear, saturada ou parcialmente insaturada. Em algumas modalidades, um lipídio compreende uma cadeia C10-C60 alifática linear, saturada ou parcialmente insaturada, opcionalmente substituída por um ou mais grupos C1-4 alifáticos. Em algumas modalidades, um lipídio compreende uma cadeia C10- C80 alifática linear, saturada ou parcialmente insaturada. Em algumas modalidades, um lipídio compreende uma cadeia C10-C80 alifática linear, saturada ou parcialmente insaturada, opcionalmente substituída por um ou mais grupos C1-4 alifáticos. Em algumas modalidades, um lipídio compreende uma cadeia C10- C100 alifática linear, saturada ou parcialmente insaturada. Em algumas modalidades, um lipídio compreende uma cadeia C10-C100 alifática linear, saturada ou parcialmente insaturada, opcionalmente substituída por um ou mais grupos C1-4 alifáticos.
[001186] Em algumas modalidades, um lipídio compreende um grupo C10-C80 alifático saturado ou parcialmente insaturado opcionalmente substituído, em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre C1–C6 alquileno, C1–C6 alquenileno, , uma porção química C1–C6 heteroalifática, −C(R′)2–, –Cy–, –O– , –S–, –S–S–, −N(R′)–, −C(O)–, –C(S)–, –C(NR′)–, –C(O)N(R′)–, −N(R′)C(O)N(R′)-, –N(R′)C(O)–, –N(R′)C(O)O–, −OC(O)N(R′)-, – S(O)–, –S(O)2–, −S(O)2N(R′)–, −N(R′)S(O)2–, –SC(O)–, –C(O)S–, – OC(O)–, e −C(O)O–, em que cada variável é independentemente conforme definido e descrito no presente documento. Em algumas modalidades, um lipídio compreende uma cadeia C10-C80 alifática saturada ou parcialmente insaturada. Em algumas modalidades, um lipídio compreende uma cadeia C10-C80 alifática linear saturada ou parcialmente insaturada. Em algumas modalidades, um lipídio compreende uma cadeia C10-C80 alifática linear, saturada ou parcialmente insaturada, opcionalmente substituída por um ou mais grupos C1-4 alifáticos. Em algumas modalidades, um lipídio compreende um grupo C10-C60 alifático saturado ou parcialmente insaturado opcionalmente substituído, em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre C1–C6 alquileno, C1–C6 alquenileno, , uma porção química C1–C6 heteroalifática, −C(R′)2–, –Cy–, –O– , –S–, –S–S–, −N(R′)–, −C(O)–, –C(S)–, –C(NR′)–, –C(O)N(R′)–, −N(R′)C(O)N(R′)-, –N(R′)C(O)–, –N(R′)C(O)O–, −OC(O)N(R′)-, –
S(O)–, –S(O)2–, −S(O)2N(R′)–, −N(R′)S(O)2–, –SC(O)–, –C(O)S–, – OC(O)–, e −C(O)O–, em que cada variável é independentemente conforme definido e descrito no presente documento.
Em algumas modalidades, um lipídio compreende uma cadeia C10-C60 alifática saturada ou parcialmente insaturada.
Em algumas modalidades, um lipídio compreende uma cadeia C10-C60 alifática linear saturada ou parcialmente insaturada.
Em algumas modalidades, um lipídio compreende uma cadeia C10-C60 alifática linear, saturada ou parcialmente insaturada, opcionalmente substituída por um ou mais grupos C1-4 alifáticos.
Em algumas modalidades, um lipídio compreende um grupo C10-C40 alifático saturado ou parcialmente insaturado opcionalmente substituído, em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre C1–C6 alquileno, C1–C6 alquenileno, , uma porção química C1–C6 heteroalifática, −C(R′)2–, –Cy–, –O– , –S–, –S–S–, −N(R′)–, −C(O)–, –C(S)–, –C(NR′)–, –C(O)N(R′)–, −N(R′)C(O)N(R′)-, –N(R′)C(O)–, –N(R′)C(O)O–, −OC(O)N(R′)-, – S(O)–, –S(O)2–, −S(O)2N(R′)–, −N(R′)S(O)2–, –SC(O)–, –C(O)S–, – OC(O)–, e −C(O)O–, em que cada variável é independentemente conforme definido e descrito no presente documento.
Em algumas modalidades, um lipídio compreende uma cadeia C10-C40 alifática saturada ou parcialmente insaturada.
Em algumas modalidades, um lipídio compreende uma cadeia C10-C40 alifática linear saturada ou parcialmente insaturada.
Em algumas modalidades, um lipídio compreende uma cadeia C10-C40 alifática linear, saturada ou parcialmente insaturada, opcionalmente substituída por um ou mais grupos C1-4 alifáticos.
Em algumas modalidades, um lipídio compreende uma cadeia C10-C80 alifática linear,
saturada ou parcialmente insaturada não substituída.
Em algumas modalidades, um lipídio compreende não mais que uma cadeia C10-C80 alifática linear, saturada ou parcialmente insaturada opcionalmente substituída.
Em algumas modalidades, um lipídio compreende duas ou mais cadeias C10-C80 alifáticas lineares, saturadas ou parcialmente insaturadas opcionalmente substituídas.
Em algumas modalidades, um lipídio compreende uma cadeia C10-C60 alifática linear, saturada ou parcialmente insaturada não substituída.
Em algumas modalidades, um lipídio compreende não mais que uma cadeia C10-C60 alifática linear, saturada ou parcialmente insaturada opcionalmente substituída.
Em algumas modalidades, um lipídio compreende duas ou mais cadeias C10-C60 alifáticas lineares, saturadas ou parcialmente insaturadas opcionalmente substituídas.
Em algumas modalidades, um lipídio compreende uma cadeia C10-C40 alifática linear, saturada ou parcialmente insaturada não substituída.
Em algumas modalidades, um lipídio compreende não mais que uma cadeia C10-C40 alifática linear, saturada ou parcialmente insaturada opcionalmente substituída.
Em algumas modalidades, um lipídio compreende duas ou mais cadeias C10-C40 alifáticas lineares, saturadas ou parcialmente insaturadas opcionalmente substituídas.
Em algumas modalidades, um lipídio compreende uma cadeia C10-C40 alifática linear, saturada ou parcialmente insaturada.
Em algumas modalidades, um lipídio é selecionado dentre o grupo que consiste em: ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido oleico, ácido linoleico, ácido alfa-linolênico, ácido gama-linolênico, ácido docosa-hexanoico (cis-DHA), ácido turbinárico e dilinoleíla.
Em algumas modalidades, um lipídio não é conjugado a uma cadeia de oligonucleotídeo (seja através de uma ou mais porções químicas de ligante ou não). Em algumas modalidades, um lipídio é conjugado a uma cadeia de oligonucleotídeo, opcionalmente através de uma ou mais porções químicas de ligante.
[001187] Em algumas modalidades, um lipídio é selecionado dentre o grupo que consiste em: ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido oleico, ácido linoleico, ácido alfa-linolênico, ácido gama- linolênico, ácido docosa-hexanoico (cis-DHA), ácido turbinárico e dilinoleíla. Em algumas modalidades, um lipídio tem uma estrutura de qualquer um dentre: , , , , , , ,
,
,
,
. Em algumas modalidades, um composto ativo é um oligonucleotídeo descrito no presente documento.
Em algumas modalidades, um composto ativo é um oligonucleotídeo que tem capacidade para mediar o salto de um éxon na distrofina.
Em algumas modalidades, um composto ativo é um oligonucleotídeo que tem capacidade para mediar o salto do éxon 51 na distrofina.
Em algumas modalidades, um composto ativo é um ácido nucleico de uma sequência que compreende ou consiste em qualquer sequência de qualquer ácido nucleico descrito no presente documento.
Em algumas modalidades, um composto ativo é um ácido nucleico de uma sequência que compreende ou consiste em qualquer sequência de qualquer oligonucleotídeo mencionado na Tabela A1. Em algumas modalidades, uma composição compreende um lipídio e um composto ativo, e compreende adicionalmente outro componente selecionado dentre: outro lipídio, e um composto ou porção de alvejamento.
Em algumas modalidades, um lipídio inclui, sem limitação: um amino lípido; um lípido anfipático; um lípido aniônico; uma apolipoproteína; um lípido catiônico; um lipídio catiônico de baixo peso molecular; um lipídio catiônico tal como CLinDMA e DLinDMA; um lipídio catiônico ionizável; um componente de camuflagem; um lipídio auxiliar; um lipopeptídeo; um lipídio neutro; um lipídio zwitteriónico neutro; uma molécula pequena hidrofóbica; uma vitamina hidrofóbica; um lipídio PEG; um lipídio não carregado modificado com um ou mais polímeros hidrofílicos; fosfolipídeo tal como 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina; um lípido stealth; um esterol; um colesterol; e um lipídio de alvejamento; e qualquer outro lipídio descrito no presente documento ou relatado na técnica. Em algumas modalidades, uma composição compreende um lipídio e uma porção de outro lipídio com capacidade para mediar pelo menos uma função de outro lipídio. Em algumas modalidades, um composto ou porção química de alvejamento tem capacidade para alvejar um composto (por exemplo, uma composição que compreende um lipídio e um composto ativo) a uma célula ou tecido ou subconjunto específico de células ou tecidos. Em algumas modalidades, uma porção de alvejamento é projetada para tirar vantagem da expressão célula ou tecido-específica de alvos, receptores, proteínas ou outros componentes subcelulares específicos. Em algumas modalidades, uma porção química de direcionamento é um ligante (por exemplo, uma molécula pequena, anticorpo, peptídeo, proteína, carboidrato, aptâmero, etc.) que alveja uma composição a uma célula ou tecido e/ou se liga a um alvo, receptor, proteína ou outro componente subcelular.
[001188] Em algumas modalidades, a incorporação de uma porção de lipídio para entrega de um composto ativo permite (por exemplo, não impede ou interfere)
a função de um composto ativo. Exemplo não-limitadores de lipídios incluem: ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido oleico, ácido linoleico, ácido alfa-linolênico, ácido gama-linolênico, ácido docosaexanoico (cis-DHA), ácido turbinárico e dilinoleíla.
[001189] Em algumas modalidades, a conjugação de lipídio, tal como a conjugação de ácidos graxos, pode aprimorar uma ou mais propriedades de oligonucleotídeos. Em algumas modalidades, a conjugação de lipídio aprimora a entrega.
[001190] Em algumas modalidades, conforme suportado por dados experimentais, a conjugação com lipídios pode aumentar a eficiência de salto.
[001191] Em algumas modalidades, uma composição para entrega de um composto ativo é capaz de alvejar um composto ativo a células ou tecidos específicos, conforme desejado. Em algumas modalidades, uma composição para entrega de um composto ativo é capaz de alvejar um composto ativo a uma célula ou tecido muscular. Em algumas modalidades, a presente revelação pertence a composições e métodos relacionados à entrega de compostos ativos, em que as composições compreendem um composto ativo, um lipídio. Em algumas modalidades para uma célula ou tecido muscular, o lipídio é selecionado dentre: ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido oleico, ácido linoleico, ácido alfa-linolênico, ácido gama-linolênico, ácido docosaexanoico (cis-DHA), ácido turbinárico e dilinoleíla. As composições exemplificativas foram preparadas compreendendo um composto ativo (WV-942) e um lipídio, e essas composições tinham capacidade para alvejar células e tecidos, por exemplo,
células ou tecidos musculares. Os lipídios exemplificativos usados incluem ácido esteárico, ácido oleico, ácido alfa- linolênico, ácidos gama-linolênico, cis-DHA, ácido turbinárico e ácido dilinoleico.
[001192] Várias composições que compreendem um composto ativo e qualquer um dentre: ácido esteárico, ácido oleico, ácido alfa-linolênico, ácido gama-linolênico, cis-DHA ou ácido turbinárico, tinham capacidade para entregar um composto ativo a vários tecidos, incluindo tecido muscular gastrocnêmio, tecido muscular do coração, tecido muscular do quadríceps, tecido muscular gastrocnêmio e tecido muscular do diafragma.
[001193] Em algumas modalidades, uma composição que compreende um lipídio, selecionado dentre: ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido oleico, ácido linoleico, ácido alfa- linolênico, ácido gama-linolênico, ácido docosaexaenóico (cis- DHA), ácido turbinárico e dilinoleíla, e um composto ativo tem capacidade para entregar um composto ativo a células e tecidos extra-hepáticos, por exemplo, células ou tecidos musculares.
[001194] Em algumas modalidades, um lipídio tem a estrutura de RLD−OH, em que em que RLD é um grupo C10-C80 alifático saturado ou parcialmente insaturado opcionalmente substituído, em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por C1–C6 alquileno, C1–C6 alquenileno, , uma porção química C1–C6 heteroalifático, −C(R′)2–, –Cy–, –O–, –S–, –S–S–, −N(R′)–, −C(O)–, –C(S)–, –C(NR′)–, –C(O)N(R′)–, −N(R′)C(O)N(R′)-, −N(R′)C(O)–, –N(R′)C(O)O–, −OC(O)N(R′)−, –S(O)–, –S(O)2–, −S(O)2N(R′)–, −N(R′)S(O)2− –SC(O)–, –C(O)S–, –OC(O)–, e −C(O)O–
. Em algumas modalidades, um lipídio tem a estrutura de RLD−C(O)OH. Em algumas modalidades, RLD é , , , , , , , , , , ou . oligonucleotídeos exemplificativos que compreendem tais grupos RLD são descritos no presente documento e no documento WO 2017/062862, a descrição de RLD é incorporada ao presente documento a título de referência.
[001195] Em algumas modalidades, um lipídio é conjugado com um composto ativo opcionalmente através de uma porção química de ligante. Em algumas modalidades, um ligante é LM. Em algumas modalidades, um ligante é L. Em algumas modalidades, −L− compreende uma cadeia alifática bivalente. Em algumas modalidades, −L− compreende um grupo fosfato. Em algumas modalidades, −L− compreende grupo fosforotioato. Em algumas modalidades, −L− tem a estrutura de −C(O)NH−(CH2)6−OP(=O)(S−)−. Em algumas modalidades, −L− tem a estrutura de −C(O)NH−(CH2)6−OP(=O)(O−)−.
[001196] Os lipídios, opcionalmente através de ligantes, podem ser conjugados aos oligonucleotídeos em vários locais adequados. Em algumas modalidades, os lipídios são conjugados através do grupo 5'-OH. Em algumas modalidades, os lipídios são conjugados através do grupo 3'-OH. Em algumas modalidades, os lipídios são conjugados através de uma ou mais porções químicas de açúcar. Em algumas modalidades, os lipídios são conjugados através de uma ou mais bases. Em algumas modalidades, os lipídios são incorporados através de uma ou mais ligações internucleotídicas. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo pode conter múltiplos lipídios conjugados que são independentemente conjugados através de seu 5'-OH, 3'-OH, porções químicas de açúcar, porções de base e/ou ligações internucleotídicas.
[001197] Em algumas modalidades, uma composição compreende um oligonucleotídeo, por exemplo, oligonucleotídeo DMD e um lipídio selecionado dentre: ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido oleico, ácido linoleico, ácido alfa-linolênico, ácido gama-linolênico, ácido docosaexaenóico (cis-DHA), ácido turbinárico, ácido araquidônico e dilinoleíla, em que o lipídio é conjugado diretamente ao agente biologicamente ativo (sem um ligante interposto entre o lipídio e o agente biologicamente ativo). Em algumas modalidades, uma composição compreende um oligonucleotídeo e um lipídeo selecionado dentre: ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido oleico, ácido linoleico, ácido alfa-linolênico, ácido gama-linolênico, ácido docosaexaenóico (cis-DHA), ácido turbinárico e dilinoleíla, em que o lipídio é conjugado diretamente ao agente biologicamente ativo (sem um ligante interposto entre o lipídeo e o agente biologicamente ativo).
[001198] Em algumas modalidades, uma composição compreende um oligonucleotídeo DMD e qualquer lipídio conhecido na técnica, em que o lipídio é conjugado ou não conjugado ao oligonucleotídeo.
[001199] Exemplos não limitadores de lipídios, e métodos de produção dos mesmos e conjugação dos mesmos são fornecidos, por exemplo, no documento WO 2017/062862, cujos lipídios e métodos relacionados estão incorporados no presente documento a título de referência. Porções químicas de alvejamento
[001200] Em algumas modalidades, uma porção química/componente adicional é uma porção química de alvejamento. Em algumas modalidades, uma composição fornecida compreende adicionalmente uma porção química de alvejamento. Em algumas modalidades, uma porção química de alvejamento é conjugada com uma cadeia de oligonucleotídeos. Em algumas modalidades, um agente biologicamente ativo é conjugado tanto a um lipídio como a uma cadeia de oligonucleotídeo. Várias porções químicas de alvejamento podem ser usadas, de acordo com a presente revelação, por exemplo, lipídios, anticorpos, peptídeos, carboidratos, etc.
[001201] As porções químicas de alvejamento podem ser incorporadas em tecnologias fornecidas através de muitos tipos de métodos, de acordo com a presente revelação. Em algumas modalidades, as porções químicas de alvejamento são quimicamente conjugadas com oligonucleotídeos.
[001202] Em algumas modalidades, as composições fornecidas compreendem duas ou mais porções químicas de alvejamento. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos compreendem duas ou mais porções químicas de alvejamento conjugadas. Em algumas modalidades, as duas ou mais porções químicas de alvejamento conjugadas são iguais. Em algumas modalidades, as duas ou mais porções químicas de alvejamento conjugadas são diferentes Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos compreendem não mais que uma porção química de alvejamento. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos de uma composição fornecida compreendem tipos diferentes de porções químicas de alvejamento conjugadas. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos de uma composição fornecida compreendem o mesmo tipo de porções químicas de alvejamento.
[001203] As porções químicas de alvejamento podem ser conjugadas a oligonucleotídeos opcionalmente através de ligantes Vários tipos de ligantes na técnica podem ser usados de acordo com a presente revelação. Em algumas modalidades, um ligante compreende um grupo fosfato, que pode, por exemplo, ser usado para conjugar porções químicas de alvejamento através de química similar àquela empregada na síntese de oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, um ligante compreende um grupo amida, éster ou éter. Em algumas modalidades, um ligante é LM. Em algumas modalidades, um ligante tem a estrutura de −L−. As porções químicas de alvejamento podem ser conjugadas através de ligantes iguais ou diferentes em comparação com lipídios.
[001204] As porções químicas de alvejamento, opcionalmente através de ligantes, podem ser conjugadas aos oligonucleotídeos em vários locais adequados. Em algumas modalidades, as porções químicas de alvejamento são conjugadas através do grupo 5'-OH. Em algumas modalidades, as porções químicas de alvejamento são conjugadas através do grupo 3'-OH. Em algumas modalidades, as porções químicas de alvejamento são conjugadas através de uma ou mais porções químicas de açúcar. Em algumas modalidades, as porções químicas de alvejamento são conjugadas através de uma ou mais bases. Em algumas modalidades, as porções químicas de alvejamento são incorporadas através de uma ou mais ligações internucleotídicas. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo pode conter múltiplas porções químicas de alvejamento conjugadas que são independentemente conjugadas através de seu 5'-OH, 3'-OH, porções químicas de açúcar, porções de base e/ou ligações internucleotídicas. As porções químicas de alvejamento e lipídios podem ser conjugados nos mesmos locais, vizinhos e/ou separados. Em algumas modalidades, a porção química de alvejamento é conjugada em uma extremidade de um oligonucleotídeo, e um lipídio é conjugado na outra extremidade.
[001205] Em algumas modalidades, uma porção química de alvejamento interage com uma proteína sobre a superfície de células alvejadas. Em algumas modalidades, tal interação facilita a internalização em células alvejadas. Em algumas modalidades, uma porção química de alvejamento compreende uma porção de açúcar. Em algumas modalidades, uma porção química de alvejamento compreende uma porção química de polipeptídeo. Em algumas modalidades, uma porção química de alvejamento compreende um anticorpo. Em algumas modalidades, uma porção química de alvejamento é um anticorpo. Em algumas modalidades, uma porção química de alvejamento compreende um inibidor. Em algumas modalidades, uma porção química de alvejamento é uma porção de um inibidor de molécula pequena. Em algumas modalidades, um inibidor é um inibidor de uma proteína sobre a superfície de células alvejadas. Em algumas modalidades, um inibidor é um inibidor de anidrase carbônica. Em algumas modalidades, um inibidor é um inibidor de anidrase carbônica expresso sobre a superfície de células-alvo. Em algumas modalidades, uma anidrase carbônica é I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX, X, XI, XII, XIII, XIV, XV ou XVI. Em algumas modalidades, uma anidrase carbônica é ligada à membrana. Em algumas modalidades, uma anidrase carbônica é IV, IX, XII ou XIV. Em algumas modalidades, um inibidor é IV, IX, XII e/ou XIV. Em algumas modalidades, um inibidor é um inibidor de anidrase carbônica III. Em algumas modalidades, um inibidor é um inibidor de anidrase carbônica IV. Em algumas modalidades, um inibidor é um inibidor de anidrase carbônica IX. Em algumas modalidades, um inibidor é um inibidor de anidrase carbônica XII. Em algumas modalidades, um inibidor é um inibidor de anidrase carbônica XIV. Em algumas modalidades, um inibidor compreende ou é uma sulfonamida (por exemplo, aquelas descritas em Supuran, CT. Nature Rev Drug Discover 2008, 7, 168-181, tais sulfonamidas estão incorporadas no presente documento a título de referência). Em algumas modalidades, um inibidor é uma sulfonamida. Em algumas modalidades, as células alvejadas são células musculares.
[001206] Em algumas modalidades, uma porção química de alvejamento é RLD ou RCD ou RTD conforme definido e descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, RCD compreende ou é . Em algumas modalidades, RCD compreende ou é
. Em algumas modalidades, RCD compreende ou é
. Em algumas modalidades, RTD é uma porção química de sulfonamida conforme descrito na presente revelação.
Em algumas modalidades, RTD compreende ou é . Em algumas modalidades, RTD ou RCD compreende ou é
. Em algumas modalidades, RTD ou RCD compreende ou é
. Em algumas modalidades, RTD compreende ou é
. Em algumas modalidades, RTD ou RCD compreende ou é
. Em algumas modalidades, RTD ou RCD compreende ou é .
Em algumas modalidades, RTD compreende ou é . Em algumas modalidades, RTD compreende ou é
. Em algumas modalidades, RTD ou RCD compreende ou é
. Em algumas modalidades, RTD ou RCD compreende ou é
. Em algumas modalidades, RTD compreende ou é
. Em algumas modalidades, RTD compreende ou é . Em algumas modalidades, RLD é uma porção química de alvejamento que compreende ou é uma porção química de lipídio. Em algumas modalidades, X é O. Em algumas modalidades, X é S.
[001207] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece tecnologias (por exemplo, reagentes, métodos, etc.) para conjugar várias porções químicas com as cadeias de oligonucleotídeos. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece tecnologias para conjugar a porção química de alvejamento com as cadeias de oligonucleotídeos. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece ácidos que compreendem porções de alvejamento para conjugação, por exemplo, RLD−COOH. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece ligantes para conjugação, por exemplo, LLD. O versado na técnica entende que muitas tecnologias conhecidas e amplamente praticadas podem ser utilizadas para conjugação com cadeias de oligonucleotídeos de acordo com a presente revelação. Em algumas modalidades, um ácido é . Em algumas modalidades, um ácido é .
Em algumas modalidades, um ácido fornecido é . Em algumas modalidades, um ácido fornecido é
. Em algumas modalidades, um ácido fornecido é . um ácido graxo, que pode fornecer uma porção química de lipídio como uma porção química de alvejamento. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece métodos e reagentes para preparar tais ácidos.
[001208] Em algumas modalidades, uma porção química adicional, por exemplo, uma que compreende uma porção química de guanidina, pode ser incorporada em um oligonucleotídeo para aprimorar uma ou mais propriedades e/ou atividades. Em algumas modalidades, tal porção química adicional é útil para aprimorar a entrega. Em algumas modalidades, uma porção química adicional compreende um ou mais grupos que têm a estrutura da fórmula I-n-1, I-n-2, I-n- 3, I-n-4, II, II-a-1, II-a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1 ou II-d-2 conforme descrito no presente documento. Em algumas modalidades, uma porção química adicional compreende um ou mais grupos que têm a estrutura da fórmula I-n-1, I-n- 2, I-n-3, I-n-4, II-a-1, II-a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II- c-2, II-d-1 ou II-d-2 conforme descrito no presente documento. Em algumas modalidades, tal porção química tem a estrutura da fórmula R1−[−L−LP]n−, em que cada LP tem independentemente a estrutura da fórmula I-n-1, I-n-2, I-n-3, I-n-4, II, II-a-1,
II-a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1 ou II-d-2 conforme descrito no presente documento, e cada outra variável é independentemente conforme descrito no presente documento.
Em algumas modalidades, R1 é −OH.
Em algumas modalidades, R1 é −H.
Em algumas modalidades, cada L é independentemente C1-10 alifático bivalente opcionalmente substituído.
Em algumas modalidades, cada L é independentemente −(CH2)3− alquileno.
Em algumas modalidades, cada L é independentemente C1-6 alquileno.
Em algumas modalidades, cada LP é independentemente n001 (
). Em algumas modalidades, uma porção química adicional é . Em algumas modalidades, uma porção química adicional é ligada a carbono de extremidade 5’ de uma cadeia de oligonucleotídeo.
Em algumas modalidades, a mesma pode ser incorporada, por exemplo, usando reagentes incluindo aqueles ilustrados abaixo:
Em algumas modalidades, uma porção química adicional pode ser ligada a uma cadeia de oligonucleotídeo através de um grupo clivável, por exemplo, um grupo fosfato, a uma cadeia de oligonucleotídeo (por exemplo, no carbono de extremidade 5'):
O O O O HO O P O O P O O P O O P O 3' O- 5'
N N N
N N N N N N Em algumas modalidades, L é uma porção de açúcar conforme descrito no presente documento. Por exemplo, em algumas modalidades, L é . Em algumas modalidades, uma porção química adicional é . Em algumas modalidades, a mesma é ligada a carbono de extremidade 5’ de uma cadeia de oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, a mesma pode ser incorporada, por exemplo, usando reagentes incluindo aqueles ilustrados abaixo: Em algumas modalidades, as porções químicas adicionais descritas no presente documento podem compreender uma ou mais cadeias de alquila. Em algumas modalidades, as porções químicas adicionais descritas no presente documento podem compreender uma ou mais porções químicas de lipídio.
Aqueles versados na técnica entendem que muitas outras modalidades de LP, incluindo porções químicas de ligação internucleotídica, podem ser utilizadas em porções químicas adicionais, por exemplo, n009. Em algumas modalidades, uma porção química adicional é
. Em algumas modalidades,
uma porção química adicional é . Conforme descrito no presente documento, em algumas modalidades, uma porção química adicional pode ser ligada ao carbono de extremidade 5’ de uma cadeia de oligonucleotídeo.
Em algumas modalidades, uma porção química adicional pode ser incorporada, por exemplo, usando reagentes inclusive aqueles ilustrados abaixo:
Aqueles versados na técnica entenderão que muitas outras tecnologias, incluindo tecnologias químicas sintéticas, podem ser utilizadas de acordo com a presente revelação para fornecer compostos, por exemplo, oligonucleotídeos, reagentes para incorporar porções químicas adicionais, etc.
[001209] Em algumas modalidades, os compostos fornecidos, por exemplo, reagentes, produtos (por exemplo, oligonucleotídeos, amiditas, etc.) etc. são pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 97% ou 99% puros. Em algumas modalidades, a pureza é de pelo menos 50%. Em algumas modalidades, a pureza é de pelo menos 75%. Em algumas modalidades, a pureza é de pelo menos 80%. Em algumas modalidades, a pureza é de pelo menos 85%. Em algumas modalidades, a pureza é de pelo menos 90%. Em algumas modalidades, a pureza é de pelo menos 95%. Em algumas modalidades, a pureza é de pelo menos 96%. Em algumas modalidades, a pureza é de pelo menos 97%. Em algumas modalidades, a pureza é de pelo menos 98%. Em algumas modalidades, a pureza é de pelo menos 99%. Terapia de Combinação
[001210] Em algumas modalidades, a um indivíduo é administrado um tratamento adicional (incluindo, porém sem limitação, um agente ou método terapêutico) além de oligonucleotídeo ou composição de oligonucleotídeo fornecida, por exemplo, uma composição que compreende um oligonucleotídeo DMD. Em algumas modalidades, uma composição que compreende um oligonucleotídeo DMD (ou oligonucleotídeos DMD) (ou duas ou mais composições, cada uma compreendendo um oligonucleotídeo DMD) é administrada a um paciente juntamente com um tratamento adicional.
[001211] Em algumas modalidades, a presente revelação pertence a um método para tratar distrofia muscular, distrofia muscular de Duchenne (Duchenne) (DMD), ou distrofia muscular de Becker (Becker) (BMD), que compreende (a) administrar a um indivíduo suscetível à mesma ou que sofre da mesma, uma composição que compreende um oligonucleotídeo fornecido, e (b) administrar ao indivíduo um tratamento adicional que tem capacidade para prevenir, tratar, melhorar ou retardar o progresso da distrofia muscular. Em algumas modalidades, um tratamento adicional é uma composição que compreende um segundo oligonucleotídeo.
[001212] Em algumas modalidades, um tratamento adicional tem capacidade para prevenir, tratar, melhorar ou retardar o progresso da distrofia muscular por si só. Em algumas modalidades, um tratamento adicional tem capacidade para prevenir, tratar, melhorar ou retardar o progresso da distrofia muscular quando administrado com um oligonucleotídeo fornecido.
[001213] Em algumas modalidades, um tratamento adicional é administrado ao indivíduo antes, após ou simultaneamente com uma composição que compreende um oligonucleotídeo fornecido, por exemplo, um oligonucleotídeo fornecido DMD Em algumas modalidades, uma composição compreende tanto um oligonucleotídeo DMD (ou oligonucleotídeos DMD) como um tratamento adicional. Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo DMD (ou oligonucleotídeos DMD) e um tratamento adicional (ou tratamentos adicionais) estão em composições separadas. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece tecnologias (por exemplo, composições, métodos, etc.) para terapia de combinação, por exemplo, com outros agentes terapêuticos e/ou procedimentos médicos. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos e/ou composições fornecidos podem ser usados juntamente com um ou mais outros agentes terapêuticos Em algumas modalidades, composições fornecidas compreendem oligonucleotídeos fornecidos, e um ou mais outros agentes terapêuticos Em algumas modalidades, o um ou mais outros agentes terapêuticos podem ter um ou mais alvos diferentes e/ou um ou mais mecanismos diferentes em direção a alvos, em comparação com oligonucleotídeos fornecidos na composição Em algumas modalidades, a agente terapêutico é um oligonucleotídeo.
Em algumas modalidades, a agente terapêutico é um fármaco de molécula pequena.
Em algumas modalidades, um agente terapêutico é uma proteína.
Em algumas modalidades, um agente terapêutico é um anticorpo.
Vários agentes terapêuticos podem ser usados de acordo com a presente revelação.
Por exemplo, os oligonucleotídeos para DMD podem ser usados juntamente com um ou mais agentes terapêuticos que modulam a produção de utrofina (moduladores de utrofina). m algumas modalidades, um modulador de utrofina promove a produção de utrofina.
Em algumas modalidades, um modulador de utrofina é ezutromide.
Em algumas modalidades, um modulador de utrofina é ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos ou composições dos mesmos são administrados antes, simultaneamente ou subsequentemente a um ou mais outros agentes terapêuticos e/ou procedimentos médicos.
Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos ou composições dos mesmos são administrados simultaneamente com um ou mais outros agentes terapêuticos e/ou procedimentos médicos.
Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos ou composições dos mesmos são administrados antes de um ou mais outros agentes terapêuticos e/ou procedimentos médicos.
Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos ou composições dos mesmos são administrados subsequentemente a um ou mais outros agentes terapêuticos e/ou procedimentos médicos.
Em algumas modalidades, as composições fornecidas compreendem um ou mais outros agentes terapêuticos
[001214] Em algumas modalidades, uma composição que compreende um oligonucleotídeo DMD é coadministrada com um agente adicional para aprimorar o salto de um éxon DMD de interesse. Em algumas modalidades, um agente adicional é um anticorpo, oligonucleotídeo, proteína ou molécula pequena. Em algumas modalidades, um agente adicional interfere em uma proteína envolvida em splicing. Em algumas modalidades, um agente adicional interfere em uma proteína envolvida em splicing, em que a proteína é uma proteína SR.
[001215] Em algumas modalidades, um agente adicional interfere em uma proteína envolvida em splicing, em que a proteína é uma proteína SR, que contém um domínio de proteína com uma ou mais repetições longas de resíduos de aminoácidos serina (S) e arginina (R). As proteínas SR são supostamente fortemente fosforiladas nas células e estão envolvidas no splicing constitutivo e alternativo. Long et al. 2009 Biochem. J. 417: 15-27; Shepard et al. 2009 Genome Biol. 10: 242. Em algumas modalidades, um agente adicional é um composto químico que inibe ou diminui uma proteína quinase SR. Em algumas modalidades, um composto químico que inibe ou diminui uma proteína quinase SR é SRPIN340. SRPIN340 é registrado em, por exemplo, Fukuhura et al. 2006 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103: 11329-11333. Em algumas modalidades, um composto químico é um inibidor da quinase específico para quinases semelhantes a Cdc (Clks) que também têm capacidade para fosforilar proteínas SR. Em algumas modalidades, um inibidor da quinase específico para quinases semelhantes a Cdc (Clks) que também têm capacidade para fosforilar proteínas SR é TG003. TG003 supostamente afetou o splicing tanto in vitro como in vivo. Nowak et al. 2010 J. Biol. Chem. 285: 5532-5540;
Muraki et al. 2004 J. Biol. Chem. 279: 24246-24254; Yomoda et al. 2008 Genes Cells 13: 233-244; e Nishida et al. 2011 Nat Commun. 2:308.
[001216] Em algumas modalidades, em um paciente com distrofia muscular, o tecido muscular é substituído por tecido adiposo e conjuntivo, e os músculos afetados podem parecer maiores devido ao aumento do teor de gordura, uma condição conhecida como pseudo-hipertrofia. Em algumas modalidades, uma composição que compreende um oligonucleotídeo DMD (ou oligonucleotídeos DMD) é administrada juntamente com um tratamento que reduz ou impede o desenvolvimento de tecido adiposo ou fibroso ou conjuntivo, ou substituição de tecido muscular por tecido adiposo ou fibroso ou conjuntivo.
[001217] Em algumas modalidades, uma composição que compreende um oligonucleotídeo DMD (ou oligonucleotídeos DMD) é administrada juntamente com um tratamento que reduz ou impede o desenvolvimento de tecido adiposo ou fibroso ou conjuntivo, em que o tratamento é um anticorpo para o fator de crescimento do tecido conjuntivo (CTGF), um mediador central de fibrose (por exemplo, FG-3019). Em algumas modalidades, uma composição que compreende um oligonucleotídeo DMD (ou oligonucleotídeos DMD) é administrada juntamente com um agente que reduz o teor de gordura do corpo humano.
[001218] Os tratamentos adicionais incluem: retardar o progresso da doença por moduladores imunes (por exemplo, esteroides e inibidores do fator de crescimento de transformação beta), induzir ou introduzir proteínas que podem compensar a deficiência de distrofina na miofibra (por exemplo,
utrofina, biglicano e laminina), ou promover a resposta regenerativa do músculo (por exemplo, miostatina e ativina 2B).
[001219] Em algumas modalidades, um tratamento adicional é uma molécula pequena com capacidade para restaurar o equilíbrio normal de cálcio dentro das células musculares.
[001220] Em algumas modalidades, um tratamento adicional é uma molécula pequena com capacidade para restaurar o equilíbrio normal de cálcio dentro das células musculares corrigindo a atividade de um tipo de canal chamado complexo do canal de cálcio do receptor de rianodina (RyR). Em algumas modalidades, tal molécula pequena é Rycal ARM210 (ARMGO Pharma, Tarry Town, NY).
[001221] Em algumas modalidades, um tratamento adicional é um flavonoide.
[001222] Em algumas modalidades, um tratamento adicional é um flavonoide tal como Epicatequina. A epicatequina é um flavonoide encontrado no chocolate amargo colhido do cacaueiro que foi relatado em animais e seres humanos por aumentar a produção de novas mitocôndrias no coração e músculos (por exemplo, biogênese mitocondrial) enquanto estimula simultaneamente a regeneração do tecido muscular.
[001223] Em algumas modalidades, um tratamento adicional é terapia genética com folistatina.
[001224] Em algumas modalidades, um tratamento adicional é a entrega de vírus adenoassociado de folistatina 344 para aumentar a força muscular e prevenir o desgaste muscular e a fibrose.
[001225] Em algumas modalidades, um tratamento adicional é glicocorticoide.
[001226] Em algumas modalidades, um tratamento adicional é prednisona.
[001227] Em algumas modalidades, um tratamento adicional é deflazacort.
[001228] Em algumas modalidades, um tratamento adicional é vamorolona (VBP15).
[001229] Em algumas modalidades, um tratamento adicional é a entrega de um gene de Distrofina exógena ou versão sintética ou porção do mesmo, tal como um gene de microdistrofina.
[001230] Em algumas modalidades, um tratamento adicional é a entrega de um gene de Distrofina exógena ou porção do mesmo, tal como um gene de microdistrofina, tal como SGT-001, um sistema de transferência de gene mediado por vetor viral adenoassociado (AAV) para entrega de um gene de distrofina sintética ou microdistrofina (Solid BioSciences, Cambridge, Mass.).
[001231] Em algumas modalidades, um tratamento adicional é tratamento com células-tronco.
[001232] Em algumas modalidades, um tratamento adicional é um esteroide.
[001233] Em algumas modalidades, um tratamento adicional é a corticosteroide.
[001234] Em algumas modalidades, um tratamento adicional é prednisona.
[001235] Em algumas modalidades, um tratamento adicional é um agonista beta-2.
[001236] Em algumas modalidades, um tratamento adicional é um inibidor de canal iônico.
[001237] Em algumas modalidades, um tratamento adicional é um inibidor de canal de cálcio.
[001238] Em algumas modalidades, um tratamento adicional é um inibidor de canal de cálcio que é uma xantina. Em algumas modalidades, um tratamento adicional é um inibidor de canal de cálcio que é metilxantina. Em algumas modalidades, um tratamento adicional é um inibidor de canal de cálcio que é pentoxifilina. Em algumas modalidades, um tratamento adicional é um inibidor do canal de cálcio que é um derivado de metilxantina selecionado de: pentoxifilina, furafilina, lisofilina, propentofilina, pentifilina, teofilina, torbafilina, albifilina, enprofilina e derivados das mesmas.
[001239] Em algumas modalidades, um tratamento adicional é um tratamento para doença cardíaca ou doença cardiovascular.
[001240] Em algumas modalidades, um tratamento adicional é um medicamento para pressão sanguínea.
[001241] Em algumas modalidades, um tratamento adicional é cirurgia.
[001242] Em algumas modalidades, um tratamento adicional é cirurgia para corrigir músculos encurtados, endireitar a coluna ou tratar um problema cardíaco ou pulmonar.
[001243] Em algumas modalidades, um tratamento adicional é uma cinta, andador, andador de pé ou outro meio mecânico para caminhar.
[001244] Em algumas modalidades, um tratamento adicional é exercício e/ou terapia física.
[001245] Em algumas modalidades, um tratamento adicional é ventilação assistida.
[001246] Em algumas modalidades, um tratamento adicional é anticonvulsivo, imunossupressor ou tratamento para constipação.
[001247] Em algumas modalidades, um tratamento adicional é um inibidor de NF-κB.
[001248] Em algumas modalidades, um tratamento adicional compreende ácido salicílico e/ou ácido docosaexaenoico (DHA).
[001249] Em algumas modalidades, um tratamento adicional é edasalonexent (CAT-1004, Catabasis), um conjugado de ácido salicílico e ácido docosaexaenoico (DHA).
[001250] Em algumas modalidades, um tratamento adicional é um produto terapêutico baseado em células.
[001251] Em algumas modalidades, um tratamento adicional compreende células derivadas de cardiosfera alogênica.
[001252] Em algumas modalidades, um tratamento adicional é CAP-1002 (Capricor). Certas Modalidades de Variáveis
[001253] As modalidades de variáveis são amplamente descritas na presente revelação. Aqueles versados na técnica entendem que uma modalidade descrita para uma variável pode ser opcional e independentemente combinada com modalidades para outras variáveis, e tais combinações, sempre que e quando adequado, estão dentro do escopo da presente revelação. As modalidades de uma variável (por exemplo R) fornecidas quando se descreve uma variável que pode ser tal variável (por exemplo, R1, que pode ser R) são geralmente aplicáveis a outras variáveis que podem ser as mesmas variáveis (por exemplo, Rs, que pode ser R). Várias modalidades de muitas variáveis são também descritas em outras seções da presente revelação.
[001254] Em algumas modalidades, PL é P(=W). Em algumas modalidades, PL é P. Em algumas modalidades, PL é um P quiral (P*). Em algumas modalidades, PL é P→B(R')3.
[001255] Em algumas modalidades, W é O. Em algumas modalidades, W é S. Em algumas modalidades, W é Se. Em algumas modalidades, W é –N(–L–R5).
[001256] Em algumas modalidades, X é O. Em algumas modalidades, X é S. Em algumas modalidades, X é –N(– L–R5)–. Em algumas modalidades, −L−R5 é −R, que é tomado em conjunto com um grupo R de −L−R1 (por exemplo, um −C(R')− em L) para formar uma ligação dupla ou um anel conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, X é L.
[001257] Em algumas modalidades, Y é O. Em algumas modalidades, Y é S. Em algumas modalidades, Z é O. Em algumas modalidades, Z é S. Em algumas modalidades, Y é O e Z é O.
[001258] Em algumas modalidades, W é O, Y é O e Z é O. Em algumas modalidades, W é S, Y é O e Z é O.
[001259] Em algumas modalidades, R1 é −H. Em algumas modalidades, R1 é −L−R. Em algumas modalidades, R1 é halogênio. Em algumas modalidades, R1 é −CN. Em algumas modalidades, R1 é −NO2. Em algumas modalidades, R1 é −L−Si(R)3. Em algumas modalidades, R1 é −OR. Em algumas modalidades, R1 é −SR. Em algumas modalidades, R1 é −N(R)2.
[001260] Em algumas modalidades, R1 é R conforme descrito na presente revelação.
[001261] Em algumas modalidades, −X−L−R1 compreende ou é uma porção química opcionalmente substituída de um auxiliar quiral (por exemplo, H−X−L−R1 é um auxiliar quiral opcionalmente substituído (por exemplo, capeado)), por exemplo, conforme usado na síntese de oligonucleotídeo quiralmente controlada, tais como aqueles descritos nos documentos US 20150211006, US 20150211006, WO 2017015555, WO 2017015575, WO 2017062862, ou WO 2017160741, os auxiliares quirais de cada um dos quais são incorporados ao presente documento a título de referência.
[001262] Em algumas modalidades, −X−L−R1 é −OR. Em algumas modalidades, −X−L−R1 é −OH. Em algumas modalidades, −X−L−R1 é −SR. Em algumas modalidades, −X−L−R1 é −SH.
[001263] Em algumas modalidades, −X−L−R1 é −R. Em algumas modalidades, R é −CH3. Em algumas modalidades, R é −CH2CH3. Em algumas modalidades, R é −CH2CH2CH3. Em algumas modalidades, R é −CH2OCH3. Em algumas modalidades, R é CH3CH2OCH2−. Em algumas modalidades, R é PhCH2OCH2−. Em algumas modalidades, R é . Em algumas modalidades, R é . Em algumas modalidades, R é CH2=CHCH2−. Em algumas modalidades, R é CH3SCH2−. Em algumas modalidades, R é −CH2COOCH3. Em algumas modalidades, R é −CH2COOCH2CH3. Em algumas modalidades, R é −CH2CONHCH3.
[001264] Em algumas modalidades, −X−L−R1 é ou compreende uma porção química de guanidina. Em algumas modalidades, −X−L−R1 é ou compreende . Em algumas modalidades, −X−L−R1 é −L−Wz, em que Wz é selecionado dentre , , , , ,
, , , e , em que R" é R' e n é 0 a 15. Em algumas modalidades, R' e R" são independentemente , , , , ou . Em algumas modalidades, L é −O−CH2CH2−. Em algumas modalidades, n é 0 a
3. Em algumas modalidades, cada Rs é independentemente −H, −OCH3, −F, −CN, −CH3, −NO2, −CF3, ou −OCF3. Em algumas modalidades, R' e R" são iguais. Em algumas modalidades, R' e R" são diferentes.
[001265] Em algumas modalidades, Em algumas modalidades, −X−L−R1 é , em que cada R' é independentemente conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, dois R' em dois átomos de nitrogênio diferentes são tomados em conjunto para formar um anel opcionalmente substituído conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, um anel é saturado. Em algumas modalidades, um anel é monocíclico. Em algumas modalidades, um anel tem 3 a 10 membros. Em algumas modalidades, um anel tem 3 membros. Em algumas modalidades, um anel tem 4 membros. Em algumas modalidades, um anel tem 5 membros. Em algumas modalidades, um anel tem 6 membros. Em algumas modalidades, um anel tem 7 membros. Em algumas modalidades, um anel não tem heteroátomo de anel adicional além dos dois átomos de nitrogênio.
[001266] Em algumas modalidades, R5 é R1 conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, R5 é −H. Em algumas modalidades, R5 é R conforme descrito na presente revelação.
[001267] Em algumas modalidades, L é um grupo metileno bivalente opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, L é −CH2−.Em algumas modalidades, cada L é independentemente um grupo de ligação covalente ou bivalente linear ou ramificado opcionalmente substituído selecionado dentre um grupo C1-30 alifático e um grupo C1-30 heteroalifático tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício, em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre C1-6 alquileno, C1-6 alquenileno, , um grupo C1–C6 heteroalifático bivalente tendo 1 a 5 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício, −C(R')2−, −Cy−, −O−, −S−, −S−S−, −N(R')−, −C(O)−, −C(S)−, −C(NR')−, −C(O)N(R')−, −N(R')C(O)N(R')−, −N(R')C(O)O−, −S(O)−, −S(O)2−, −S(O)2N(R')−, −C(O)S−, −C(O)O−, −P(O)(OR')−, −P(O)(SR')−, −P(O)(R')−, −P(O)(NR')−, −P(S)(OR')−, −P(S)(SR')−, −P(S)(R')−, −P(S)(NR')−, −P(R')−, −P(OR')−, −P(SR')−, −P(NR')−, −P(OR')[B(R')3]−, −OP(O)(OR')O−, −OP(O)(SR')O−, −OP(O)(R')O−, −OP(O)(NR')O−, −OP(OR')O−, −OP(SR')O−, −OP(NR')O−, −OP(R')O−, ou −OP(OR')[B(R')3]O−, e um ou mais CH ou átomos de carbono são opcional e independentemente substituídos por CyL.
[001268] Em algumas modalidades, L é um grupo de ligação covalente ou bivalente linear ou ramificado opcionalmente substituído selecionado dentre um grupo C1-30 alifático e um grupo C1-30 heteroalifático tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício, em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre C1-6 alquileno, C1-6 alquenileno, , um grupo C1–C6 heteroalifático bivalente tendo 1 a 5 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício, −C(R')2−, −Cy−, −O−, −S−, −S−S−, −N(R')−, −C(O)−, −C(S)−, −C(NR')−, −C(O)N(R')−, −N(R')C(O)N(R')−, −N(R')C(O)O−, −S(O)−, −S(O)2−, −S(O)2N(R')−, −C(O)S−, −C(O)O−, −P(O)(OR')−, −P(O)(SR')−, −P(O)(R')−, −P(O)(NR')−, −P(S)(OR')−, −P(S)(SR')−, −P(S)(R')−, −P(S)(NR')−, −P(R')−, −P(OR')−, −P(SR')−, −P(NR')−, −P(OR')[B(R')3]−, −OP(O)(OR')O−, −OP(O)(SR')O−, −OP(O)(R')O−, −OP(O)(NR')O−, −OP(OR')O−, −OP(SR')O−, −OP(NR')O−, −OP(R')O−, ou −OP(OR')[B(R')3]O−, e um ou mais CH ou átomos de carbono são opcional e independentemente substituídos por CyL.
Em algumas modalidades, L é um grupo C1-30 alifático de ligação covalente ou bivalente linear ou ramificado opcionalmente substituído , em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre C1-6 alquileno, C1-6 alquenileno, , um grupo C1–C6 heteroalifático bivalente tendo 1 a 5 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício, −C(R')2−, −Cy−, −O−, −S−, −S−S−, −N(R')−, −C(O)−, −C(S)−, −C(NR')−, −C(O)N(R')−, −N(R')C(O)N(R')−, −N(R')C(O)O−, −S(O)−, −S(O)2−, −S(O)2N(R')−, −C(O)S−, −C(O)O−, −P(O)(OR')−, −P(O)(SR')−, −P(O)(R')−, −P(O)(NR')−, −P(S)(OR')−, −P(S)(SR')−, −P(S)(R')−, −P(S)(NR')−, −P(R')−, −P(OR')−,
−P(SR')−, −P(NR')−, −P(OR')[B(R')3]−, −OP(O)(OR')O−, −OP(O)(SR')O−, −OP(O)(R')O−, −OP(O)(NR')O−, −OP(OR')O−, −OP(SR')O−, −OP(NR')O−, −OP(R')O−, ou −OP(OR')[B(R')3]O−, e um ou mais CH ou átomos de carbono são opcional e independentemente substituídos por CyL.
Em algumas modalidades, L é um grupo C1-30 heteroalifático de ligação covalente ou bivalente linear ou ramificado opcionalmente substituído tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício, em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre C1-6 alquileno, C1-6 alquenileno, , um grupo C1–C6 heteroalifático bivalente tendo 1 a 5 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício, −C(R')2−, −Cy−, −O−, −S−, −S−S−, −N(R')−, −C(O)−, −C(S)−, −C(NR')−, −C(O)N(R')−, −N(R')C(O)N(R')−, −N(R')C(O)O−, −S(O)−, −S(O)2−, −S(O)2N(R')−, −C(O)S−, −C(O)O−, −P(O)(OR')−, −P(O)(SR')−, −P(O)(R')−, −P(O)(NR')−, −P(S)(OR')−, −P(S)(SR')−, −P(S)(R')−, −P(S)(NR')−, −P(R')−, −P(OR')−, −P(SR')−, −P(NR')−, −P(OR')[B(R')3]−, −OP(O)(OR')O−, −OP(O)(SR')O−, −OP(O)(R')O−, −OP(O)(NR')O−, −OP(OR')O−, −OP(SR')O−, −OP(NR')O−, −OP(R')O−, ou −OP(OR')[B(R')3]O−, e um ou mais CH ou átomos de carbono são opcional e independentemente substituídos por CyL.
Em algumas modalidades, L é um grupo de ligação covalente ou bivalente linear ou ramificado opcionalmente substituído selecionado dentre um grupo C1-30 alifático e um grupo C1-30 heteroalifático tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício, em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre C1-6 alquileno, C1-6 alquenileno, , um grupo C1–C6 heteroalifático bivalente tendo 1 a 5 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício, −C(R')2−, −Cy−, −O−, −S−, −S−S−, −N(R')−, −C(O)−, −C(S)−, −C(NR')−, −C(O)N(R')−, −N(R')C(O)N(R')−, −N(R')C(O)O−, −S(O)−, −S(O)2−, −S(O)2N(R')−, −C(O)S−, ou −C(O)O−, e um ou mais CH ou átomos de carbono são opcional e independentemente substituídos por CyL.
Em algumas modalidades, L é um grupo de ligação covalente ou bivalente linear ou ramificado opcionalmente substituído selecionado dentre um grupo C1-10 alifático e um grupo C1-10 heteroalifático tendo 1 a 5 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício, em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre C1-6 alquileno, C1-6 alquenileno, −C(R')2−, −Cy−, −O−, −S−, −S−S−, −N(R')−, −C(O)−, −C(S)−, −C(NR')−, −C(O)N(R')−, −N(R')C(O)N(R')−, −N(R')C(O)O−, −S(O)−, −S(O)2−, −S(O)2N(R')−, −C(O)S−, e −C(O)O−, e um ou mais CH ou átomos de carbono são opcional e independentemente substituídos por CyL.
Em algumas modalidades, L é um grupo de ligação covalente ou bivalente linear ou ramificado opcionalmente substituído selecionado dentre um grupo C1-10 alifático e um grupo C1-10 heteroalifático tendo 1 a 5 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício, em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre −C(R')2−, −Cy−, −O−, −S−, −S−S−, −N(R')−, −C(O)−, −C(S)−, −C(NR')−, −C(O)N(R')−,
−N(R')C(O)N(R')−, −N(R')C(O)O−, −S(O)−, −S(O)2−, −S(O)2N(R')−, −C(O)S−, e −C(O)O−.
[001269] Em algumas modalidades, L é uma ligação covalente. Em algumas modalidades, L é C1-30 alifático bivalente opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, L é C1-30 heteroalifático bivalente opcionalmente substituído tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre boro, oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício.
[001270] Em algumas modalidades, as porções químicas alifáticas, por exemplo aquelas dentre L, Ls, LM, R, etc., monovalentes ou bivalentes ou multivalentes, e podem conter qualquer número de átomos de carbono (antes de qualquer substituição opcional) dentro de sua faixa, por exemplo, C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23, C24, C25, C26, C27, C28, C29, C30, etc. Em algumas modalidades, as porções químicas heteroalifáticas, por exemplo aquelas dentre L, R, etc., monovalentes ou bivalentes ou multivalentes, e podem conter qualquer número de átomos de carbono (antes de qualquer substituição opcional) dentro de sua faixa, por exemplo, C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23, C24, C25, C26, C27, C28, C29, C30, etc.
[001271] Em algumas modalidades, uma unidade de metileno de um ligante, por exemplo, L, Ls, LM, etc., é substituída por −Cy−, em que −Cy− é conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por −O−, −S−, −N(R')−, −C(O)−, −S(O)−, −S(O)2−, −P(O)(OR')−, −P(O)(SR')−, −P(S)(OR')−, ou −P(S)(OR')−. Em algumas modalidades, uma unidade de metileno é substituída por
−O−. Em algumas modalidades, uma unidade de metileno é substituída por −S−. Em algumas modalidades, uma unidade de metileno é substituída por −N(R')−. Em algumas modalidades, uma unidade de metileno é substituída por −C(O)−. Em algumas modalidades, uma unidade de metileno é substituída por −S(O)−. Em algumas modalidades, uma unidade de metileno é substituída por −S(O)2−. Em algumas modalidades, uma unidade de metileno é substituída por −P(O)(OR')−. Em algumas modalidades, uma unidade de metileno é substituída por −P(O)(SR')−. Em algumas modalidades, uma unidade de metileno é substituída por −P(O)(R')−. Em algumas modalidades, uma unidade de metileno é substituída por −P(O)(NR')−. Em algumas modalidades, uma unidade de metileno é substituída por −P(S)(OR')−. Em algumas modalidades, uma unidade de metileno é substituída por −P(S)(SR')−. Em algumas modalidades, uma unidade de metileno é substituída por −P(S)(R')−. Em algumas modalidades, uma unidade de metileno é substituída por −P(S)(NR')−. Em algumas modalidades, uma unidade de metileno é substituída por −P(R')−. Em algumas modalidades, uma unidade de metileno é substituída por −P(OR')−. Em algumas modalidades, uma unidade de metileno é substituída por −P(SR')−. Em algumas modalidades, uma unidade de metileno é substituída por −P(NR')−. Em algumas modalidades, uma unidade de metileno é substituída por −P(OR')[B(R')3]−. Em algumas modalidades, uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por −O−, −S−, −N(R')−, −C(O)−, −S(O)−, −S(O)2−, −P(O)(OR')−, −P(O)(SR')−, −P(S)(OR')−, ou −P(S)(OR')−. Em algumas modalidades, uma unidade de metileno é substituída por −OP(O)(OR')O−, −OP(O)(SR')O−, −OP(O)(R')O−, −OP(O)(NR')O−, −OP(OR')O−, −OP(SR')O−, −OP(NR')O−, −OP(R')O−, ou −OP(OR')[B(R')3]O−, cada um dos quais pode ser independentemente uma ligação internucleotídica.
[001272] Em algumas modalidades, L ou Ls (por exemplo, quando Ls é L), por exemplo, quando conectado a Rs ou anel de açúcar, é −CH2−. Em algumas modalidades, L é −C(R)2−, em que pelo menos um R não é hidrogênio. Em algumas modalidades, L é −CHR−. Em algumas modalidades, R é hidrogênio. Em algumas modalidades, L é −CHR−, em que R não é hidrogênio. Em algumas modalidades, C de −CHR− é quiral. Em algumas modalidades, L é −(R)−CHR−, em que C de −CHR− é quiral. Em algumas modalidades, L é −(S)−CHR−, em que C de −CHR− é quiral. Em algumas modalidades, R é C1-6 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, R é C1-6 alquila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é C1-5 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, R é C1-5 alquila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é C1-4 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, R é C1-4 alquila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é C1-3 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, R é C1-3 alquila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é C2 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, R é metila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é C1-6 alifático. Em algumas modalidades, R é C1-6 alquila. Em algumas modalidades, R é C1-5 alifático. Em algumas modalidades, R é C1-5 alquila. Em algumas modalidades, R é C1-4 alifático. Em algumas modalidades, R é C1-4 alquila. Em algumas modalidades, R é C1-3 alifático. Em algumas modalidades, R é C1-3 alquila. Em algumas modalidades, R é C2 alifático. Em algumas modalidades, R é metila. Em algumas modalidades, R é C1-6 haloalifático. Em algumas modalidades, R é C1-6 haloalquila. Em algumas modalidades, R é C1-5 haloalifático. Em algumas modalidades, R é C1-5 haloalquila. Em algumas modalidades, R é C1-4 haloalifático. Em algumas modalidades, R é C1-4 haloalquila. Em algumas modalidades, R é C1-3 haloalifático. Em algumas modalidades, R é C1-3 haloalquila. Em algumas modalidades, R é C2 haloalifático. Em algumas modalidades, R é metila substituída por um ou mais halogênios. Em algumas modalidades, R é −CF3. Em algumas modalidades, L é −CH=CH− opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, L é (E)−CH=CH− opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, L é (Z)−CH=CH− opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, L é −C≡C−.
[001273] Em algumas modalidades, L compreende pelo menos um átomo de fósforo. Em algumas modalidades, pelo menos uma unidade de metileno de L é substituída por −P(O)(OR')−, −P(O)(SR')−, −P(O)(R')−, −P(O)(NR')−, −P(S)(OR')−, −P(S)(SR')−, −P(S)(R')−, −P(S)(NR')−, −P(R')−, −P(OR')−, −P(SR')−, −P(NR')−, −P(OR')[B(R')3]−, −OP(O)(OR')O−, −OP(O)(SR')O−, −OP(O)(R')O−, −OP(O)(NR')O−, −OP(OR')O−, −OP(SR')O−, −OP(NR')O−, −OP(R')O−, ou −OP(OR')[B(R')3]O−.
[001274] Em algumas modalidades, L é ligado a um fósforo de uma ligação (por exemplo, quando X é uma ligação covalente), por exemplo, o fósforo de uma ligação que tem a fórmula I, I-a, I-b, I-c, I-n-1, I-n-2, I-n-3, I-n-4, II, II- a-1, II-a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, II-d-2, ou uma forma de sal do mesmo. Em algumas modalidades, tal ligação é uma ligação internucleotídica. Em algumas modalidades, tal ligação é uma ligação internucleotídica quiralmente controlada.
[001275] Em algumas modalidades, L é −Cy−. Em algumas modalidades, L é .
[001276] Em algumas modalidades, L é um grupo C1-30 alifático bivalente linear ou ramificado opcionalmente substituído em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, L é um grupo C1-30 heteroalifático bivalente linear ou ramificado opcionalmente substituído tendo 1 a 10 heteroátomos em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas conforme descrito na presente revelação.
[001277] Em algumas modalidades, um grupo heteroalifático na presente revelação, por exemplo, de L, R (incluindo qualquer variável que pode ser R), etc., compreende uma porção química de . Em algumas modalidades, =N− é diretamente ligado a um átomo de fósforo. Em algumas modalidades, um grupo heteroalifático compreende uma porção química de . Em algumas modalidades, um grupo heteroalifático compreende uma porção química de . Em algumas modalidades, tal porção química é diretamente ligada a um átomo de fósforo. Em algumas modalidades, R é C1-6 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, R é C1-6 alquila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é isopropila.
[001278] Em algumas modalidades, −Cy− é C3-20 cicloalifático monocíclico, bicíclico ou policíclico bivalente opcionalmente substituído.
Em algumas modalidades, −Cy− é C6- 20 arila monocíclica, bicíclica ou policíclica bivalente opcionalmente substituída.
Em algumas modalidades, −Cy− é anel heterociclila monocíclico, bicíclico ou policíclico com 3 a 20 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 5 heteroátomos.
Em algumas modalidades, −Cy− é anel heterociclila monocíclico, bicíclico ou policíclico com 5 a 20 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 5 heteroátomos, em que pelo menos um heteroátomo é oxigênio.
Em algumas modalidades, −Cy− tem 3 a 10 membros.
Em algumas modalidades, −Cy− tem 3 membros.
Em algumas modalidades, −Cy− tem 4 membros.
Em algumas modalidades, −Cy− tem 5 membros.
Em algumas modalidades, −Cy− tem 6 membros.
Em algumas modalidades, −Cy− tem 7 membros.
Em algumas modalidades, −Cy− tem 8 membros.
Em algumas modalidades, −Cy− tem 9 membros.
Em algumas modalidades, −Cy− tem 10 membros.
Em algumas modalidades, −Cy− é anel tetra- hidrofurano bivalente opcionalmente substituído.
Em algumas modalidades, −Cy− é uma porção química de furanose opcionalmente substituída.
Em algumas modalidades, −Cy− é um anel heteroarila bivalente com 5 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 4 heteroátomos.
Em algumas modalidades, pelo menos um heteroátomo é nitrogênio.
Em algumas modalidades, cada heteroátomo é nitrogênio.
Em algumas modalidades, −Cy− é um anel triazol bivalente opcionalmente substituído.
Em algumas modalidades, Em algumas modalidades, −Cy− é opcionalmente substituído.
Em algumas modalidades, −Cy− é
. Em algumas modalidades, R é C1-6 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, R é C1-6 alquila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é isopropila.
[001279] Em algumas modalidades, CyL é um grupo trivalente ou tetravalente opcionalmente substituído selecionado dentre um C3-20 cicloalifático, um anel C6-20 arila, um anel heteroarila com 5 a 20 membros tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício, e um anel heterociclila com 3 a 20 membros tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo, boro e silício. Em algumas modalidades, CyL é trivalente. Em algumas modalidades, CyL é tetravalente. Em algumas modalidades, um ou mais CH em uma porção química, por exemplo, L, Ls, LM, etc. são independentemente substituídos por um grupo CyL trivalente. Em algumas modalidades, um ou mais átomos de carbono em uma porção química, por exemplo, L, Ls, LM, etc. são independentemente substituídos por um grupo CyL tetravalente. Em algumas modalidades, um ou mais CH em uma porção química, por exemplo, L, Ls, LM, etc. são independentemente substituídos por um grupo CyL trivalente, e um ou mais átomos de carbono em uma porção química, por exemplo, L, Ls, LM, etc. são independentemente substituídos por um grupo CyL tetravalente.
[001280] Em algumas modalidades, CyL é monocíclico. Em algumas modalidades, CyL é bicíclico. Em algumas modalidades, CyL é policíclico.
[001281] Em algumas modalidades, CyL é saturado. Em algumas modalidades, CyL é parcialmente insaturado. Em algumas modalidades, CyL é aromático. Em algumas modalidades, CyL é ou compreende uma porção química de anel saturado. Em algumas modalidades, CyL é ou compreende uma porção química de anel parcialmente insaturado. Em algumas modalidades, CyL é ou compreende uma porção química de anel aromático.
[001282] Em algumas modalidades, CyL é um anel C3-20 cicloalifático opcionalmente substituído conforme descrito na presente revelação (por exemplo, aquele descrito para R porém tetravalente). Em algumas modalidades, um anel é um anel C3-20 cicloalifático saturado opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, um anel é um anel C3-20 cicloalifático parcialmente insaturado opcionalmente substituído. Um anel cicloalifático pode ser de vários tamanhos conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, um anel tem 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 membros. Em algumas modalidades, um anel tem 3 membros. Em algumas modalidades, um anel tem 4 membros. Em algumas modalidades, um anel tem 5 membros. Em algumas modalidades, um anel tem 6 membros. Em algumas modalidades, um anel tem 7 membros. Em algumas modalidades, um anel tem 8 membros. Em algumas modalidades, um anel tem 9 membros. Em algumas modalidades, um anel tem 10 membros. Em algumas modalidades, um anel é uma porção química de ciclopropila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, um anel é uma porção química de ciclobutila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, um anel é uma porção química de ciclopentila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, um anel é uma porção química de ciclo-hexila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, um anel é uma porção química de ciclo-heptila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, um anel é uma porção química de ciclooctanila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, um anel cicloalifático é um anel cicloalquila. Em algumas modalidades, um anel cicloalifático é monocíclico. Em algumas modalidades, um anel cicloalifático é bicíclico. Em algumas modalidades, um anel cicloalifático é policíclico. Em algumas modalidades, um anel é uma porção química cicloalifática conforme descrito na presente revelação para R com mais valências.
[001283] Em algumas modalidades, CyL é um anel arila com 6 a 20 membros opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, um anel é uma porção química de fenila trivalente ou tetravalente opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, um anel é uma porção química de fenila tetravalente. Em algumas modalidades, um anel é uma porção química de naftaleno opcionalmente substituída. Um anel pode ser de tamanhos diferentes conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, um anel arila tem 6 membros. Em algumas modalidades, um anel arila tem 10 membros. Em algumas modalidades, um anel arila tem 14 membros. Em algumas modalidades, um anel arila é monocíclico. Em algumas modalidades, um anel arila é bicíclico. Em algumas modalidades, um anel arila é policíclico. Em algumas modalidades, um anel é porção química de arila conforme descrito na presente revelação para R com mais valências.
[001284] Em algumas modalidades, CyL é um anel heteroarila com 5 a 20 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 10 heteroátomos, por exemplo, independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício.
Em algumas modalidades, CyL é um anel heteroarila com 5 a 20 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 10 heteroátomos, por exemplo, independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, e enxofre.
Em algumas modalidades, CyL é um anel heteroarila com 5 a 6 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 4 heteroátomos, por exemplo, independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, e enxofre.
Em algumas modalidades, CyL é um anel heteroarila com 5 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 4 heteroátomos, por exemplo, independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, e enxofre.
Em algumas modalidades, CyL é um anel heteroarila com 6 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 4 heteroátomos, por exemplo, independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, e enxofre.
Em algumas modalidades, conforme descrito na presente revelação, os anéis heteroarila podem ser de vários tamanhos e conter vários números e/ou tipos de heteroátomos.
Em algumas modalidades, um anel heteroarila contém não mais que um heteroátomo.
Em algumas modalidades, um anel heteroarila contém mais de um heteroátomo.
Em algumas modalidades, um anel heteroarila contém não mais um tipo de heteroátomo.
Em algumas modalidades, um anel heteroarila contém mais de um tipo de heteroátomos.
Em algumas modalidades, um anel heteroarila tem 5 membros.
Em algumas modalidades, um anel heteroarila tem 6 membros.
Em algumas modalidades, um anel heteroarila tem 8 membros.
Em algumas modalidades, um anel heteroarila tem 9 membros.
Em algumas modalidades, um anel heteroarila tem 10 membros.
Em algumas modalidades, um anel heteroarila é monocíclico.
Em algumas modalidades, um anel heteroarila é bicíclico.
Em algumas modalidades, um anel heteroarila é policíclico. Em algumas modalidades, um anel heteroarila é uma porção química de nucleobase, por exemplo, A, T, C, G, U, etc. Em algumas modalidades, um anel é uma porção química de heteroarila conforme descrito na presente revelação para R com mais valências. Em algumas modalidades, como nos ligantes descritos na presente revelação, CyL é
[001285] Em algumas modalidades, CyL é um anel heterociclila com 3 a 20 membros tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício. Em algumas modalidades, CyL é um anel heterociclila com 3 a 20 membros tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, e enxofre. Em algumas modalidades, um anel heterociclila é saturado. Em algumas modalidades, um anel heterociclila é parcialmente insaturado. Um anel heterociclila pode ser de vários tamanhos conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, um anel tem 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 membros. Em algumas modalidades, um anel tem 3 membros. Em algumas modalidades, um anel tem 4 membros. Em algumas modalidades, um anel tem 5 membros. Em algumas modalidades, um anel tem 6 membros. Em algumas modalidades, um anel tem 7 membros. Em algumas modalidades, um anel tem 8 membros. Em algumas modalidades, um anel tem 9 membros. Em algumas modalidades, um anel tem 10 membros. Os anéis heterociclila podem conter vários números e/ou tipos de heteroátomos. Em algumas modalidades, um anel heterociclila contém não mais que um heteroátomo. Em algumas modalidades, um anel heterociclila contém mais de um heteroátomo. Em algumas modalidades, um anel heterociclila contém não mais que um tipo de heteroátomo. Em algumas modalidades, um anel heterociclila contém mais de um tipo de heteroátomo. Em algumas modalidades, um anel heterociclila é monocíclico. Em algumas modalidades, um anel heterociclila é bicíclico. Em algumas modalidades, um anel heterociclila é policíclico. Em algumas modalidades, um anel é uma porção química de heterociclila conforme descrito na presente revelação para R com mais valências.
[001286] Conforme prontamente observado por uma pessoa de habilidade comum na técnica, muitas porções químicas de anel adequadas são extensivamente descritas e podem ser usadas de acordo com a presente revelação, por exemplo, aquelas descritas para R (que podem tem mais valências para CyL).
[001287] Em algumas modalidades, CyL é uma porção química de açúcar em um ácido nucleico. Em algumas modalidades, CyL é uma porção química de furanose opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, CyL é uma porção química de piranose. Em algumas modalidades, CyL é uma porção química de furanose opcionalmente substituída encontrada no DNA. Em algumas modalidades, CyL é uma porção química de furanose opcionalmente substituída encontrada no RNA. Em algumas modalidades, CyL é uma porção química de 2'-desoxirribofuranose opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, CyL é uma porção química de ribofuranose opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, as substituições fornecem modificações de açúcar conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, uma porção química de 2'-desoxirribofuranose opcionalmente substituída e/ou uma porção química de ribofuranose opcionalmente substituída compreendem substituição em uma posição 2'. Em algumas modalidades, uma posição 2' é uma modificação 2' conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, uma modificação 2' é −F. Em algumas modalidades, uma modificação 2' é −OR, em que R é conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, R não é hidrogênio. Em algumas modalidades, CyL é uma porção química de açúcar modificada, tal como uma porção química de açúcar em LNA, alfa-L-LNA ou GNA. Em algumas modalidades, CyL é uma porção química de açúcar modificada, tal como uma porção química de açúcar em ENA. Em algumas modalidades, CyL é uma porção química de açúcar terminal de um oligonucleotídeo, que conecta uma ligação internucleotídica e uma nucleobase. Em algumas modalidades, CyL é uma porção química de açúcar terminal de um oligonucleotídeo, por exemplo, quando essa terminação é conectada a um suporte sólido opcionalmente através de um ligante. Em algumas modalidades, CyL é uma porção química de açúcar que conecta duas ligações internucleotídicas e uma nucleobase. Os açúcares e porções químicas de açúcar exemplificativos são extensivamente descritos na presente revelação.
[001288] Em algumas modalidades, CyL é uma porção química de nucleobase. Em algumas modalidades, uma nucleobase é uma nucleobase natural, tal como A, T, C, G, U, etc. Em algumas modalidades, uma nucleobase é uma nucleobase modificada. Em algumas modalidades, CyL é porção química nucleobase opcionalmente substituída selecionada dentre A, T, C, G, U, e 5mC. As nucleobases e porções químicas de nucleobase exemplificativas são extensivamente descritas na presente revelação.
[001289] Em algumas modalidades, duas porções químicas de CyL são ligadas entre si, em que uma CyL é uma porção química de açúcar e a outra é uma porção química de nucleobase. Em algumas modalidades, tal porção química de açúcar e porção química de nucleobase formam uma porção química de nucleosídeo. Em algumas modalidades, uma porção química de nucleosídeo é natural. Em algumas modalidades, uma porção química de nucleosídeo é modificada. Em algumas modalidades, CyL é uma porção química de nucleosídeo natural opcionalmente substituída selecionada dentre adenosina, 5-metiluridina, citidina, guanosina, uridina, 5-metilcitidina, 2'- desoxiadenosina, timidina, 2'-desoxicitidina, 2'- desoxiguanosina, 2'-desoxiuridina, e 5-metil-2'- desoxicitidina. Os nucleosídeos e porções químicas de nucleosídeos exemplificativos são extensivamente descritos na presente revelação.
[001290] O Anel AL pode ser monovalente, bivalente ou polivalente. Em algumas modalidades, o Anel AL é monovalente (por exemplo, quando g é 0 e sem substituição). Em algumas modalidades, o Anel AL é bivalente. Em algumas modalidades, o Anel AL é polivalente. Em algumas modalidades, o Anel AL é bivalente e é −Cy−. Em algumas modalidades, o Anel AL é um anel triazol bivalente opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, o Anel AL é trivalente e é CyL. Em algumas modalidades, o Anel AL é tetravalente e é CyL. Em algumas modalidades, o Anel AL é opcionalmente substituído.
[001291] Em algumas modalidades, −X−L−R1 é alquinila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, −X−L−R1 é . Em algumas modalidades, um grupo alquinila, por exemplo, , pode reagir com vários reagentes através de várias reações para fornecer modificações adicionais. Por exemplo, em algumas modalidades, um grupo alquinila pode reagir com azidas através de química “click”. Em algumas modalidades, uma azida tem a estrutura de R1−N3.
[001292] Em algumas modalidades, cada Rs é independentemente −H, halogênio, −CN, −N3, −NO, −NO2, −L−R', −L−Si(R)3, −L−OR', −L−SR', −L−N(R')2, −O−L−R', −O−L−Si(R)3, −O−L−OR', −O−LsSR', ou −O−LsN(R')2 conforme descrito na presente revelação.
[001293] Em algumas modalidades, Rs é R', em que R' é conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, Rs é R, em que R é conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, Rs é C1-6 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, Rs é metila. Em algumas modalidades, Rs é C1-30 heteroalifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, Rs compreende um ou mais átomos de silício. Em algumas modalidades, Rs é −CH2Si(Ph)2CH3.
[001294] Em algumas modalidades, Rs é −L−R'. Em algumas modalidades, Rs é −L−R' em que −L− é um grupo heteroalifático C1-30 bivalente opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, Rs é −CH2Si(Ph)2CH3.
[001295] Em algumas modalidades, Rs é −F. Em algumas modalidades, Rs é −Cl. Em algumas modalidades, Rs é −Br. Em algumas modalidades, Rs é −I. Em algumas modalidades, Rs é −CN. Em algumas modalidades, Rs é −N3. Em algumas modalidades, Rs é −NO. Em algumas modalidades, Rs é −NO2. Em algumas modalidades, Rs é −L−Si(R)3. Em algumas modalidades, Rs é −Si(R)3. Em algumas modalidades, Rs é −L−R'. Em algumas modalidades, Rs é −R'. Em algumas modalidades, Rs é −L−OR'. Em algumas modalidades, Rs é −OR'. Em algumas modalidades, Rs é −L−SR'. Em algumas modalidades, Rs é −SR'. Em algumas modalidades, Rs é −L−N(R')2. Em algumas modalidades, Rs é −N(R')2. Em algumas modalidades, Rs é −O−L−R'. Em algumas modalidades, Rs é −O−L−Si(R)3. Em algumas modalidades, Rs é −O−L−OR'. Em algumas modalidades, Rs é −O−L−SR'. Em algumas modalidades, Rs é −O−L−N(R')2. Em algumas modalidades, Rs é uma modificação 2' conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, Rs é −OR, em que R é conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, Rs é −OR, em que R é C1-6 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, Rs é −OMe. Em algumas modalidades, Rs é −OCH2CH2OMe. Em algumas modalidades, Rs é R1s, R2s, R3s, R4s, ou R5s conforme descrito na presente revelação.
[001296] Em algumas modalidades, g é 0 a 20. Em algumas modalidades, g é 1 a 20. Em algumas modalidades, g é 1 a 5. Em algumas modalidades, g é 1. Em algumas modalidades, g é 2. Em algumas modalidades, g é 3. Em algumas modalidades, g é 4. Em algumas modalidades, g é 5. Em algumas modalidades, g é 6. Em algumas modalidades, g é 7. Em algumas modalidades, g é 8. Em algumas modalidades, g é 9. Em algumas modalidades, g é 10. Em algumas modalidades, g é 11. Em algumas modalidades, g é 12. Em algumas modalidades, g é 13. Em algumas modalidades, g é 14. Em algumas modalidades, g é 15. Em algumas modalidades, g é 16. Em algumas modalidades, g é 17. Em algumas modalidades, g é 18. Em algumas modalidades, g é 19. Em algumas modalidades, g é 20.
[001297] Em algumas modalidades, é . Em algumas modalidades, é . Em algumas modalidades, é .
[001298] Em algumas modalidades, cada Anel A é independentemente um anel monocíclico, bicíclico ou policíclico com 3 a 20 membros opcionalmente substituído tendo 0 a 10 heteroátomos, por exemplo, independentemente selecionado dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício. Em algumas modalidades, o Anel A é um anel opcionalmente substituído, cujo anel é conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, o Anel A compreende um átomo de anel de oxigênio. Em algumas modalidades, Anel A é ou compreende um anel de uma porção química de açúcar. Em algumas modalidades, um anel é . Em algumas modalidades, um anel é . Em algumas modalidades, um anel é . Em algumas modalidades, um anel é um anel bicíclico, por exemplo, encontrado em uma porção química de açúcar de LNA.
[001299] Em algumas modalidades, uma unidade de açúcar tem a estrutura , em que cada variável é independentemente conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, uma unidade de nucleosídeo tem a estrutura , em que cada variável é independentemente conforme descrito na presente revelação.
[001300] Em algumas modalidades, Ls é −C(R5s)2− e é conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, Ls é −CHR5s− e é conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, Ls é −C(R)2− e é conforme descrito na presente revelação.
Em algumas modalidades, Ls é −CHR− e é conforme descrito na presente revelação.
[001301] Em algumas modalidades, é , BA é conectado a C1, e cada um dentre R1s, R2s, R3s, R4s e R5s é independentemente conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, é , em que R2s é conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, é , em que R2s não é −OH. Em algumas modalidades, é , em que R2s e R4s são R, e os dois grupos R são tomados em conjunto com seus átomos intervenientes para formar um anel opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, , ou Anel A, é opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, , ou Anel A, é opcionalmente substituído.
Em algumas modalidades, , ou Anel A, é opcionalmente substituído.
[001302] Em algumas modalidades, cada um dentre R1s, R2s, R3s, R4s, e R5s é independentemente Rs, em que Rs é conforme descrito na presente revelação.
[001303] Em algumas modalidades, R1s é Rs em que Rs é conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, R1s se situa na posição 1' (BA se situa na posição 1'). Em algumas modalidades, R1s é −H. Em algumas modalidades, R1s é −F. Em algumas modalidades, R1s é −Cl. Em algumas modalidades, R1s é −Br. Em algumas modalidades, R1s é −I. Em algumas modalidades, R1s é −CN. Em algumas modalidades, R1s é −N3. Em algumas modalidades, R1s é −NO. Em algumas modalidades,
R1s é −NO2. Em algumas modalidades, R1s é −L−R'. Em algumas modalidades, R1s é −R'. Em algumas modalidades, R1s é −L−OR'. Em algumas modalidades, R1s é −OR'. Em algumas modalidades, R1s é −L−SR'. Em algumas modalidades, R1s é −SR'. Em algumas modalidades, R1s é L−L−N(R')2. Em algumas modalidades, R1s é −N(R')2. Em algumas modalidades, R1s é −OR', em que R' é C1-6 alifático opcionalmente substituído.
Em algumas modalidades, R1s é −OR', em que R' é C1-6 alquila opcionalmente substituída.
Em algumas modalidades, R1s é −OMe.
Em algumas modalidades, R1s é −MOE.
Em algumas modalidades, R1s é hidrogênio.
Em algumas modalidades, Rs em uma posição 1’ é hidrogênio, e Rs na outra posição 1' não é hidrogênio conforme descrito no presente documento.
Em algumas modalidades, Rs em ambas as posições 1' são hidrogênio.
Em algumas modalidades, Rs em uma posição 1' é hidrogênio, e a outra posição 1' é conectada a uma ligação internucleotídica.
Em algumas modalidades, R1s é −F.
Em algumas modalidades, R1s é −Cl.
Em algumas modalidades, R1s é −Br.
Em algumas modalidades, R1s é −I.
Em algumas modalidades, R1s é −CN.
Em algumas modalidades, R1s é −N3. Em algumas modalidades, R1s é −NO.
Em algumas modalidades, R1s é −NO2. Em algumas modalidades, R1s é −L−R'. Em algumas modalidades, R1s é −R'. Em algumas modalidades, R1s é −L−OR'. Em algumas modalidades, R1s é −OR'. Em algumas modalidades, R1s é −L−SR'. Em algumas modalidades, R1s é −SR'. Em algumas modalidades, R1s é −L−N(R')2. Em algumas modalidades, R1s é −N(R')2. Em algumas modalidades, R1s é −OR', em que R' é C1-6 alifático opcionalmente substituído.
Em algumas modalidades, R1s é −OR', em que R' é C1-6 alquila opcionalmente substituída.
Em algumas modalidades, R1s é −OH.
Em algumas modalidades, R1s é −OMe.
Em algumas modalidades, R1s é −MOE.
Em algumas modalidades, R1s é hidrogênio. Em algumas modalidades, um R1s em uma posição 1' é hidrogênio, e o outro R1s na outra posição 1' não é hidrogênio conforme descrito no presente documento. Em algumas modalidades, R1s em ambas as posições 1' são hidrogênio. Em algumas modalidades, R1s é −O−L−OR'. Em algumas modalidades, R1s é −O−L−OR', em que L é C1-6 alquileno opcionalmente substituído, e R' é C1-6 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, R1s é −O−(C1-6 alquileno opcionalmente substituído)−OR'. Em algumas modalidades, R1s é −O−(C1-6 alquileno opcionalmente substituído)−OR', em que R' é C1-6 alquila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R1s é −OCH2CH2OMe.
[001304] Em algumas modalidades, R2s é Rs em que Rs é conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, se houver dois R2s na posição 2', um R2s é −H e o outro não é. Em algumas modalidades, R2s se situa na posição 2' (BA se situa na posição 1'). Em algumas modalidades, R2s é −H. Em algumas modalidades, R2s é −F. Em algumas modalidades, R2s é −Cl. Em algumas modalidades, R2s é −Br. Em algumas modalidades, R2s é −I. Em algumas modalidades, R2s é −CN. Em algumas modalidades, R2s é −N3. Em algumas modalidades, R2s é −NO. Em algumas modalidades, R2s é −NO2. Em algumas modalidades, R2s é −L−R'. Em algumas modalidades, R2s é −R'. Em algumas modalidades, R2s é −L−OR'. Em algumas modalidades, R2s é −OR'. Em algumas modalidades, R2s é −L−SR'. Em algumas modalidades, R2s é −SR'. Em algumas modalidades, R2s é L−L−N(R')2. Em algumas modalidades, R2s é −N(R')2. Em algumas modalidades, R2s é −OR', em que R' é C1-6 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, R2s é −OR', em que R' é C1-6 alquila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R2s é −OMe. Em algumas modalidades, R2s é −MOE.
Em algumas modalidades, R2s é hidrogênio.
Em algumas modalidades, Rs em uma posição 2’ é hidrogênio, e Rs na outra posição 2' não é hidrogênio conforme descrito no presente documento.
Em algumas modalidades, Rs em ambas as posições 2' são hidrogênio.
Em algumas modalidades, Rs em uma posição 2' é hidrogênio, e a outra posição 2' é conectada a uma ligação internucleotídica.
Em algumas modalidades, R2s é −F.
Em algumas modalidades, R2s é −Cl.
Em algumas modalidades, R2s é −Br.
Em algumas modalidades, R2s é −I.
Em algumas modalidades, R2s é −CN.
Em algumas modalidades, R2s é −N3. Em algumas modalidades, R2s é −NO.
Em algumas modalidades, R2s é −NO2. Em algumas modalidades, R2s é −L−R'. Em algumas modalidades, R2s é −R'. Em algumas modalidades, R2s é −L−OR'. Em algumas modalidades, R2s é −OR'. Em algumas modalidades, R2s é −L−SR'. Em algumas modalidades, R2s é −SR'. Em algumas modalidades, R2s é −L−N(R')2. Em algumas modalidades, R2s é −N(R')2. Em algumas modalidades, R2s é −OR', em que R' é C1-6 alifático opcionalmente substituído.
Em algumas modalidades, R2s é −OR', em que R' é C1-6 alquila opcionalmente substituída.
Em algumas modalidades, R2s é −OH.
Em algumas modalidades, R2s é −OMe.
Em algumas modalidades, R2s é −MOE.
Em algumas modalidades, R2s é hidrogênio.
Em algumas modalidades, um R2s em uma posição 2' é hidrogênio, e o outro R2s na outra posição 2' não é hidrogênio conforme descrito no presente documento.
Em algumas modalidades, R2s em ambas as posições 2' são hidrogênio.
Em algumas modalidades, R2s é −O−L−OR'. Em algumas modalidades, R2s é −O−L−OR', em que L é C1-6 alquileno opcionalmente substituído, e R' é C1-6 alifático opcionalmente substituído.
Em algumas modalidades, R2s é −O−(C1-6 alquileno opcionalmente substituído)−OR'. Em algumas modalidades, R2s é
−O−(C1-6 alquileno opcionalmente substituído)−OR', em que R' é C1-6 alquila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R2s é −OCH2CH2OMe.
[001305] Em algumas modalidades, R2s compreende uma porção química de guanidina. Em algumas modalidades, R2s compreende . Em algumas modalidades, R2s é −L−Wz, em que Wz é selecionado dentre , , , , , , , , e , em que R" é R' e n é 0 a 15. Em algumas modalidades, R' e R" são independentemente , , , , ou . Em algumas modalidades, L é −O−CH2CH2−. Em algumas modalidades, n é 0 a 3. Em algumas modalidades, cada Rs é independentemente −H, −OCH3, −F, −CN, −CH3, −NO2, −CF3, ou −OCF3. Em algumas modalidades, R' e R" são iguais. Em algumas modalidades, R' e R" são diferentes.
[001306] Em algumas modalidades, R3s é Rs em que Rs é conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, R3s se situa na posição 3' (BA se situa na posição 1'). Em algumas modalidades, R3s é −H.
Em algumas modalidades, R3s é −F.
Em algumas modalidades, R3s é −Cl.
Em algumas modalidades, R3s é −Br.
Em algumas modalidades, R3s é −I.
Em algumas modalidades, R3s é −CN.
Em algumas modalidades, R3s é −N3. Em algumas modalidades, R3s é −NO.
Em algumas modalidades, R3s é −NO2. Em algumas modalidades, R3s é −L−R'. Em algumas modalidades, R3s é −R'. Em algumas modalidades, R3s é −L−OR'. Em algumas modalidades, R3s é −OR'. Em algumas modalidades, R3s é −L−SR'. Em algumas modalidades, R3s é −SR'. Em algumas modalidades, R3s é −L−N(R')2. Em algumas modalidades, R3s é −N(R')2. Em algumas modalidades, R3s é −OR', em que R' é C1-6 alifático opcionalmente substituído.
Em algumas modalidades, R3s é −OR', em que R' é C1-6 alquila opcionalmente substituída.
Em algumas modalidades, R3s é −OMe.
Em algumas modalidades, R3s é −MOE.
Em algumas modalidades, R3s é hidrogênio.
Em algumas modalidades, Rs em uma posição 3’ é hidrogênio, e Rs na outra posição 3' não é hidrogênio conforme descrito no presente documento.
Em algumas modalidades, Rs em ambas as posições 3' são hidrogênio.
Em algumas modalidades, Rs em uma posição 3' é hidrogênio, e a outra posição 3' é conectada a uma ligação internucleotídica.
Em algumas modalidades, R3s é −F.
Em algumas modalidades, R3s é −Cl.
Em algumas modalidades, R3s é −Br.
Em algumas modalidades, R3s é −I.
Em algumas modalidades, R3s é −CN.
Em algumas modalidades, R3s é −N3. Em algumas modalidades, R3s é −NO.
Em algumas modalidades, R3s é −NO2. Em algumas modalidades, R3s é −L−R'. Em algumas modalidades, R3s é −R'. Em algumas modalidades, R3s é −L−OR'. Em algumas modalidades, R3s é −OR'. Em algumas modalidades, R3s é −L−SR'. Em algumas modalidades, R3s é −SR'. Em algumas modalidades, R3s é
L−L−N(R')2. Em algumas modalidades, R3s é −N(R')2. Em algumas modalidades, R3s é −OR', em que R' é C1-6 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, R3s é −OR', em que R' é C1-6 alquila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R3s é −OH. Em algumas modalidades, R3s é −OMe. Em algumas modalidades, R3s é −MOE. Em algumas modalidades, R3s é hidrogênio.
[001307] Em algumas modalidades, R4s é Rs em que Rs é conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, R4s se situa na posição 4' (BA se situa na posição 1'). Em algumas modalidades, R4s é −H. Em algumas modalidades, R4s é −F. Em algumas modalidades, R4s é −Cl. Em algumas modalidades, R4s é −Br. Em algumas modalidades, R4s é −I. Em algumas modalidades, R4s é −CN. Em algumas modalidades, R4s é −N3. Em algumas modalidades, R4s é −NO. Em algumas modalidades, R4s é −NO2. Em algumas modalidades, R4s é −L−R'. Em algumas modalidades, R4s é −R'. Em algumas modalidades, R4s é −L−OR'. Em algumas modalidades, R4s é −OR'. Em algumas modalidades, R4s é −L−SR'. Em algumas modalidades, R4s é −SR'. Em algumas modalidades, R4s é −L−N(R')2. Em algumas modalidades, R4s é −N(R')2. Em algumas modalidades, R4s é −OR', em que R' é C1-6 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, R4s é −OR', em que R' é C1-6 alquila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R4s é −OMe. Em algumas modalidades, R4s é −MOE. Em algumas modalidades, R4s é hidrogênio. Em algumas modalidades, Rs em uma posição 4’ é hidrogênio, e Rs na outra posição 4' não é hidrogênio conforme descrito no presente documento. Em algumas modalidades, Rs em ambas as posições 4' são hidrogênio. Em algumas modalidades, Rs em uma posição 4' é hidrogênio, e a outra posição 4' é conectada a uma ligação internucleotídica. Em algumas modalidades, R4s é −F. Em algumas modalidades, R4s é −Cl. Em algumas modalidades, R4s é −Br. Em algumas modalidades, R4s é −I. Em algumas modalidades, R4s é −CN. Em algumas modalidades, R4s é −N3. Em algumas modalidades, R4s é −NO. Em algumas modalidades, R4s é −NO2. Em algumas modalidades, R4s é −L−R'. Em algumas modalidades, R4s é −R'. Em algumas modalidades, R4s é −L−OR'. Em algumas modalidades, R4s é −OR'. Em algumas modalidades, R4s é −L−SR'. Em algumas modalidades, R4s é −SR'. Em algumas modalidades, R4s é L−L−N(R')2. Em algumas modalidades, R4s é −N(R')2. Em algumas modalidades, R4s é −OR', em que R' é C1-6 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, R4s é −OR', em que R' é C1-6 alquila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R4s é −OH. Em algumas modalidades, R4s é −OMe. Em algumas modalidades, R4s é −MOE. Em algumas modalidades, R4s é hidrogênio.
[001308] Em algumas modalidades, R5s é Rs em que Rs é conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, R5s é R' em que R' é conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, R5s é −H. Em algumas modalidades, dois ou mais R5s são conectados ao mesm átomo de carbono, e pelo menos um não é −H. Em algumas modalidades, R5s não é −H. Em algumas modalidades, R5s é −F. Em algumas modalidades, R5s é −Cl. Em algumas modalidades, R5s é −Br. Em algumas modalidades, R5s é −I. Em algumas modalidades, R5s é −CN. Em algumas modalidades, R5s é −N3. Em algumas modalidades, R5s é −NO. Em algumas modalidades, R5s é −NO2. Em algumas modalidades, R5s é −L−R'. Em algumas modalidades, R5s é −R'. Em algumas modalidades, R5s é −L−OR'. Em algumas modalidades, R5s é −OR'. Em algumas modalidades, R5s é −L−SR'. Em algumas modalidades, R5s é −SR'. Em algumas modalidades, R5s é L−L−N(R')2. Em algumas modalidades, R5s é −N(R')2. Em algumas modalidades, R5s é −OR', em que R' é C1-6 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, R5s é −OR', em que R' é C1-6 alquila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R5s é −OH. Em algumas modalidades, R5s é −OMe. Em algumas modalidades, R5s é −MOE. Em algumas modalidades, R5s é hidrogênio.
[001309] Em algumas modalidades, R5s é C1-6 alifático opcionalmente substituído conforme descrito na presente revelação, por exemplo, modalidades de C1-6 alifático descritas para R ou outras variáveis. Em algumas modalidades, R5s é C1-6 alquila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R5s é metila opcionalmente substituída, em que cada substituinte, se houver, compreende independentemente não mais que um átomo de carbono. Em algumas modalidades, R5s é metila opcionalmente substituída, em que cada substituinte, se houver, independentemente é halogênio. Em algumas modalidades, R5s é metila. Em algumas modalidades, R5s é etila.
[001310] Em algumas modalidades, R5s é um grupo hidroxila protegido adequado para síntese de oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, R5s é −OR', em que R' é C1-6 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, R5s é DMTrO−. Os grupos protetores exemplificativos são amplamente conhecidos para uso de acordo com a presente revelação. Para exemplos adicionais, consulte Greene, T. W.; Wuts, P. G. M. Protective Grupos in Organic Synthesis, 2ª ed.; Wiley: New York, 1991, e os documentos US 9695211, US 9605019, US 9598458, US 2013/0178612, US 20150211006, US 20170037399, WO 2017/015555, WO 2017/062862, WO 2017/160741, WO 2017/192664,
WO 2017/192679 e/ou WO 2017/210647, cujos grupos protetores estão aqui incorporados a título de referência.
[001311] Em algumas modalidades, dois ou mais dentre R1s, R2s, R3s, R4s, e R5s são R e podem ser tomados em conjunto com o átomo (ou átomos) interveniente para formar um anel conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, R2s e R4s são R tomados em conjunto para formar um anel, e uma porção química de açúcar pode ser uma porção química de açúcar bicíclica, por exemplo, uma porção química de açúcar LNA.
[001312] Em algumas modalidades, Ls é L conforme descrito na presente revelação.
[001313] Em algumas modalidades, Ls é −C(R5s)2−, em que cada R5s é independentemente conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, um dentre R5s é H e o outro não é H. Em algumas modalidades, nenhum R5s é H. Em algumas modalidades, Ls é −CHR5s−, em que cada R5s é independentemente conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, o átomo de carbono de −C(R5s)2− é estereoaleatório. Em algumas modalidades, o mesmo é da configuração R. Em algumas modalidades, o mesmo é da configuração S. Em algumas modalidades, −C(R5s)2− é 5'-C, opcionalmente substituído, de uma porção química de açúcar. Em algumas modalidades, o C de −C(R5s)2− é da configuração R. Em algumas modalidades, o C de −C(R5s)2− é da configuração S. Conforme descrito na presente revelação, em algumas modalidades, R5s é C1-6 alifático opcionalmente substituído; em algumas modalidades, R5s é metila.
[001314] Em algumas modalidades, compostos fornecidos compreendem um ou mais anéis bivalentes ou multivalentes opcionalmente substituídos, por exemplo, Anel A, CyL, aqueles formados por dois ou mais grupos R (R e (combinações de) variáveis que podem ser R) tomados em conjunto, etc. Em algumas modalidades, um anel é um grupo cicloalifático, arila, heteroarila ou heterociclila conforme descrito para R, porém bivalente ou multivalente. Conforme observado por aqueles versados na técnica, as porções químicas de anel descritas para uma variável, por exemplo, Anel A, também podem ser aplicáveis a outras variáveis, por exemplo, CyL, se os requisitos das outras variáveis, por exemplo, número de heteroátomos, valência, etc., forem satisfeitos. Os anéis exemplificativos são extensivamente descritos na presente revelação.
[001315] Em algumas modalidades, um anel, por exemplo, um Anel A, R, etc. que é opcionalmente substituído, é um anel monocíclico, bicíclico ou policíclico com 3 a 20 membros tendo 0 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício.
[001316] Em algumas modalidades, um anel pode ser de qualquer tamanho dentro de sua faixa, por exemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 membros.
[001317] Em algumas modalidades, um anel é monocíclico. Em algumas modalidades, um anel é saturado e monocíclico. Em algumas modalidades, um anel é monocíclico e parcialmente saturado. Em algumas modalidades, um anel é monocíclico e aromático.
[001318] Em algumas modalidades, um anel é bicíclico. Em algumas modalidades, um anel é policíclico. Em algumas modalidades, um anel bicíclico ou policíclico compreende duas ou mais porções químicas de anel monocíclico, cada uma das quais pode ser saturada, parcialmente saturada ou aromática, e cada das quais pode conter nenhum ou 1 a 10 heteroátomos.
Em algumas modalidades, um anel bicíclico ou policíclico compreende um anel monocíclico saturado.
Em algumas modalidades, um anel bicíclico ou policíclico compreende um anel monocíclico saturado que não contém heteroátomos.
Em algumas modalidades, um anel bicíclico ou policíclico compreende um anel monocíclico saturado que compreende um ou mais heteroátomos.
Em algumas modalidades, um anel bicíclico ou policíclico compreende um anel monocíclico parcialmente saturado.
Em algumas modalidades, um anel bicíclico ou policíclico compreende um anel monocíclico parcialmente saturado que não contém heteroátomos.
Em algumas modalidades, um anel bicíclico ou policíclico compreende um anel monocíclico parcialmente saturado que compreende um ou mais heteroátomos.
Em algumas modalidades, um anel bicíclico ou policíclico compreende um anel monocíclico aromático.
Em algumas modalidades, um anel bicíclico ou policíclico compreende um anel monocíclico aromático que não contém heteroátomos.
Em algumas modalidades, um anel bicíclico ou policíclico compreende um anel monocíclico aromático que compreende um ou mais heteroátomos.
Em algumas modalidades, um anel bicíclico ou policíclico compreende um anel saturado e um anel parcialmente saturado, cada um dos quais contém independentemente um ou mais heteroátomos.
Em algumas modalidades, um anel bicíclico compreende um anel saturado e um anel parcialmente saturado, cada cada um dos quais compreende independentemente nenhum, ou um ou mais heteroátomos. Em algumas modalidades, um anel bicíclico compreende um anel aromático e um anel parcialmente saturado, cada cada um dos quais compreende independentemente nenhum, ou um ou mais heteroátomos. Em algumas modalidades, um anel policíclico compreende um anel saturado e um anel parcialmente saturado, cada cada um dos quais compreende independentemente nenhum, ou um ou mais heteroátomos. Em algumas modalidades, um anel policíclico compreende um anel aromático e um anel parcialmente saturado, cada cada um dos quais compreende independentemente nenhum, ou um ou mais heteroátomos. Em algumas modalidades, um anel policíclico compreende um anel aromático e um anel saturado, cada cada um dos quais compreende independentemente nenhum, ou um ou mais heteroátomos. Em algumas modalidades, um anel policíclico compreende um anel aromático, um anel saturado, e um anel parcialmente saturado, cada cada um dos quais compreende independentemente nenhum, ou um ou mais heteroátomos. Em algumas modalidades, um anel compreende pelo menos um heteroátomo. Em algumas modalidades, um anel compreende pelo menos um átomo de nitrogênio. Em algumas modalidades, um anel compreende pelo menos um átomo de oxigênio. Em algumas modalidades, um anel compreende pelo menos um átomo de enxofre.
[001319] Conforme observado por aqueles versados na técnica de acordo com a presente revelação, um anel é tipicamente opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, um anel é não substituído. Em algumas modalidades, um anel é substituído. Em algumas modalidades, um anel é substituído em um ou mais de seus átomos de carbono. Em algumas modalidades, um anel é substituído em um ou mais de seus heteroátomos. Em algumas modalidades, um anel é substituído em um ou mais de seus átomos de carbono, e um ou mais de seus heteroátomos. Em algumas modalidades, dois ou mais substituintes podem estar situados no mesmo átomo de anel. Em algumas modalidades, todos os átomos de anel disponíveis são substituídos. Em algumas modalidades, nem todos os átomos de anel disponíveis são substituídos. Em algumas modalidades, nas estruturas fornecidas onde indica-se que os anéis sejam conectados a outras estruturas (por exemplo, Anel A em ), "opcionalmente substituído" significa que, apesar daquelas estruturas já conectadas, as posições de anel substituíveis restantes, se houver, são opcionalmente substituídas.
[001320] Em algumas modalidades, um anel é um anel C3-30 cicloalifático bivalente ou multivalente. Em algumas modalidades, um anel é um anel C3-20 cicloalifático bivalente ou multivalente. Em algumas modalidades, um anel é um anel C3- 10 cicloalifático bivalente ou multivalente. Em algumas modalidades, um anel é um anel carbocíclico saturado ou parcialmente insaturado com 3 a 30 membros bivalente ou multivalente. Em algumas modalidades, um anel é um anel carbocíclico saturado ou parcialmente insaturado com 3 a 7 membros bivalente ou multivalente. Em algumas modalidades, um anel é um anel carbocíclico saturado ou parcialmente insaturado com 3 membros bivalente ou multivalente. Em algumas modalidades, um anel é um anel carbocíclico saturado ou parcialmente insaturado com 4 membros bivalente ou multivalente. Em algumas modalidades, um anel é um anel carbocíclico saturado ou parcialmente insaturado com 5 membros bivalente ou multivalente. Em algumas modalidades, um anel é um anel carbocíclico saturado ou parcialmente insaturado com 6 membros bivalente ou multivalente. Em algumas modalidades, um anel é um anel carbocíclico saturado ou parcialmente insaturado com 7 membros bivalente ou multivalente. Em algumas modalidades, um anel é um anel ciclo-hexila bivalente ou multivalente. Em algumas modalidades, um anel é um anel ciclopentila bivalente ou multivalente. Em algumas modalidades, um anel é um anel ciclobutila bivalente ou multivalente. Em algumas modalidades, um anel é um anel ciclopropila bivalente ou multivalente.
[001321] Em algumas modalidades, um anel é um anel C6-30 arila bivalente ou multivalente. Em algumas modalidades, um anel é um anel fenila bivalente ou multivalente.
[001322] Em algumas modalidades, um anel é um anel arila bicíclico saturado ou parcialmente insaturado com 8 a 10 membros bivalente ou multivalente . Em algumas modalidades, um anel é um anel bicíclico saturado com 8 a 10 membros bivalente ou multivalente. Em algumas modalidades, um anel é um anel bicíclico parcialmente insaturado com 8 a 10 membros bivalente ou multivalente. Em algumas modalidades, um anel é um anel arila bicíclico com 8 a 10 membros bivalente ou multivalente. Em algumas modalidades, um anel é um anel naftila bivalente ou multivalente.
[001323] Em algumas modalidades, um anel é um anel heteroarila com 5 a 30 membros bivalente ou multivalente tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício. Em algumas modalidades, um anel é um anel heteroarila bivalente ou multivalente com 5 a 30 membros tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, e enxofre. Em algumas modalidades, um anel é um anel heteroarila com 5 a 30 membros bivalente ou multivalente tendo 1 a 5 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício. Em algumas modalidades, um anel é um anel heteroarila bivalente ou multivalente com 5 a 30 membros tendo 1 a 5 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, e enxofre.
[001324] Em algumas modalidades, um anel é um anel heteroarila monocíclico com 5 a 6 membros bivalente ou multivalente tendo 1 a 4 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em algumas modalidades, um anel é um anel heteroarila monocíclico com 5 a 6 membros bivalente ou multivalente tendo 1 a 3 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, enxofre, e oxigênio.
[001325] Em algumas modalidades, um anel é um anel heteroarila monocíclico com 5 membros bivalente ou multivalente tendo 1 a 4 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio ou enxofre. Em algumas modalidades, um anel é um anel heteroarila monocíclico com 6 membros bivalente ou multivalente tendo 1 a 4 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre.
[001326] Em determinadas modalidades, um anel é um anel heteroarila bicíclico com 8 a 10 membros bivalente ou multivalente tendo 1 a 4 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em algumas modalidades, um anel é um anel heteroarila fundido com 5,6 membros bivalente ou multivalente tendo 1 a 4 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em algumas modalidades, um anel é um anel heteroarila fundido com 5,6 membros bivalente ou multivalente tendo 1 a 5 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em determinadas modalidades, um anel é um anel heteroarila fundido com 6,6 membros bivalente ou multivalente tendo 1 a 4 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre.
[001327] Em algumas modalidades, um anel é um anel heterocíclico com 3 a 30 membros bivalente ou multivalente tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício. Em algumas modalidades, um anel é um anel heterocíclico saturado ou parcialmente insaturado com 3 a 7 membros bivalente ou multivalente tendo 1 a 3 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em determinadas modalidades, um anel é um anel monocíclico parcialmente insaturado com 5 a 7 membros bivalente ou multivalente tendo 1 a 3 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em determinadas modalidades, um anel é um anel monocíclico parcialmente insaturado com 5 a 6 membros bivalente ou multivalente tendo 1 a 3 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em determinadas modalidades, um anel é um anel monocíclico parcialmente insaturado com 5 membros bivalente ou multivalente tendo 1 a 3 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em determinadas modalidades, um anel é um anel monocíclico parcialmente insaturado com 6 membros bivalente ou multivalente tendo 1 a 3 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em determinadas modalidades, um anel é um anel monocíclico parcialmente insaturado com 7 membros bivalente ou multivalente tendo 1 a 3 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em algumas modalidades, um anel é um anel heterocíclico com 3 membros bivalente ou multivalente tendo um heteroátomo selecionado dentre nitrogênio, oxigênio ou enxofre. Em algumas modalidades, um anel é um anel heterocíclico com 4 membros bivalente ou multivalente tendo 1 a 3 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em algumas modalidades, um anel é um anel heterocíclico com 5 membros bivalente ou multivalente tendo 1 a 3 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em algumas modalidades, um anel é um anel heterocíclico com 6 membros bivalente ou multivalente tendo 1 a 3 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em algumas modalidades, um anel é um anel heterocíclico com 7 membros bivalente ou multivalente tendo 1 a 3 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre.
[001328] Em algumas modalidades, um anel é um anel heterocíclico bicíclico saturado ou parcialmente insaturado com 7 a 10 membros bivalente ou multivalente tendo 1 a 5 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em algumas modalidades, um anel é um anel heteroarila bicíclico com 8 a 10 membros bivalente ou multivalente tendo 1 a 5 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre.
[001329] Em algumas modalidades, um anel é um anel heteroarila fundido com 5,6 membros bivalente ou multivalente tendo 1 a 5 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em determinadas modalidades, um anel é um anel heteroarila fundido com 6,6 membros bivalente ou multivalente tendo 1 a 5 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre.
[001330] Em algumas modalidades, um anel formado por dois ou mais grupos tomados em conjunto, que é tipicamente um anel com 5 a 7 membros saturado monocíclico opcionalmente substituído que não tem heteroátomos adicionais além dos heteroátomos intervenientes, se houver. Em algumas modalidades, um anel formado por dois ou mais grupos tomados em conjunto é um anel com 5 membros saturado monocíclico que não tem heteroátomos adicionais além dos heteroátomos intervenientes, se houver. Em algumas modalidades, um anel formado por dois ou mais grupos tomados em conjunto é um anel com 6 membros saturado monocíclico que não tem heteroátomos adicionais além dos heteroátomos intervenientes, se houver. Em algumas modalidades, um anel formado por dois ou mais grupos tomados em conjunto é um anel com 7 membros saturado monocíclico que não tem heteroátomos adicionais além dos heteroátomos intervenientes, se houver.
[001331] Em algumas modalidades, um anel formado por dois ou mais grupos tomados em conjunto é um anel arila bicíclico, saturado ou parcialmente insaturado com 5 a 30 membros, tendo além dos heteroátomos intervenientes, se houver, 0 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício.
Em algumas modalidades, um anel formado por dois ou mais grupos tomados em conjunto é um anel arila bicíclico, saturado ou parcialmente insaturado com 5 a 30 membros, tendo além dos heteroátomos intervenientes, se houver, 0 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio e enxofre.
Em algumas modalidades, um anel formado por dois ou mais grupos tomados em conjunto é um anel saturado e bicíclico com 8 a 10 membros que não tem heteroátomos adicionais além dos heteroátomos intervenientes, se houver.
Em algumas modalidades, um anel formado por dois ou mais grupos tomados em conjunto é um anel saturado e bicíclico com 8 membros que não tem heteroátomos adicionais além dos heteroátomos intervenientes, se houver.
Em algumas modalidades, um anel formado por dois ou mais grupos tomados em conjunto é um anel saturado e bicíclico com 9 membros que não tem heteroátomos adicionais além dos heteroátomos intervenientes, se houver.
Em algumas modalidades, um anel formado por dois ou mais grupos tomados em conjunto é um anel saturado e bicíclico com 10 membros que não tem heteroátomos adicionais além dos heteroátomos intervenientes, se houver.
Em algumas modalidades, um anel formado por dois ou mais grupos tomados em conjunto é bicíclico e compreende um anel com 5 membros fundido a um anel com 5 membros.
Em algumas modalidades, um anel formado por dois ou mais grupos tomados em conjunto é bicíclico e compreende um anel com 5 membros fundido a um anel com 6 membros.
Em algumas modalidades, o anel com 5 membros compreende um ou mais átomos de nitrogênio, fósforo e oxigênio intervenientes como átomos de anel. Em algumas modalidades, um anel formado por dois ou mais grupos tomados em conjunto compreende um sistema de anel que tem a estrutura de cadeia
P P
O N O N principal de , , , ou .
[001332] Em algumas modalidades, um anel formado por dois ou mais grupos tomados em conjunto é um anel arila policíclico, saturado ou parcialmente insaturado com 3 a 30 membros tendo, além dos heteroátomos intervenientes, se houver, 0 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício. Em algumas modalidades, um anel formado por dois ou mais grupos tomados em conjunto é um anel arila policíclico, saturado ou parcialmente insaturado com 3 a 30 membros, tendo além dos heteroátomos intervenientes, se houver, 0 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio e enxofre.
[001333] Em algumas modalidades, um anel formado por dois ou mais grupos tomados em conjunto é monocíclico, bicíclico ou policíclico e compreende um anel monocíclico com 5 a 10 membros, cujos átomos de anel compreendem um ou mais átomos de nitrogênio, fósforo e/ou oxigênio intervenientes. Em algumas modalidades, um anel formado por dois ou mais grupos tomados em conjunto é monocíclico, bicíclico ou policíclico e compreende um anel monocíclico com 5 a 9 membros, cujos átomos de anel compreendem um ou mais átomos de nitrogênio, fósforo e/ou oxigênio intervenientes. Em algumas modalidades, um anel formado por dois ou mais grupos tomados em conjunto é monocíclico, bicíclico ou policíclico e compreende um anel monocíclico com 5 a 8 membros, cujos átomos de anel compreendem um ou mais átomos de nitrogênio, fósforo e/ou oxigênio intervenientes. Em algumas modalidades, um anel formado por dois ou mais grupos tomados em conjunto é monocíclico, bicíclico ou policíclico e compreende um anel monocíclico com 5 a 7 membros, cujos átomos de anel compreendem um ou mais átomos de nitrogênio, fósforo e/ou oxigênio intervenientes. Em algumas modalidades, um anel formado por dois ou mais grupos tomados em conjunto é monocíclico, bicíclico ou policíclico e compreende um anel monocíclico com 5 a 6 membros, cujos átomos de anel compreendem um ou mais átomos de nitrogênio, fósforo e/ou oxigênio intervenientes.
[001334] Em algumas modalidades, um anel formado por dois ou mais grupos tomados em conjunto é monocíclico, bicíclico ou policíclico e compreende um anel monocíclico com 5 membros, cujos átomos de anel compreendem um ou mais átomos de nitrogênio, fósforo e/ou oxigênio intervenientes. Em algumas modalidades, um anel formado por dois ou mais grupos tomados em conjunto é monocíclico, bicíclico ou policíclico e compreende um anel monocíclico com 6 membros, cujos átomos de anel compreendem um ou mais átomos de nitrogênio, fósforo e/ou oxigênio intervenientes. Em algumas modalidades, um anel formado por dois ou mais grupos tomados em conjunto é monocíclico, bicíclico ou policíclico e compreende um anel monocíclico com 7 membros, cujos átomos de anel compreendem um ou mais átomos de nitrogênio, fósforo e/ou oxigênio intervenientes. Em algumas modalidades, um anel formado por dois ou mais grupos tomados em conjunto é monocíclico, bicíclico ou policíclico e compreende um anel monocíclico com 8 membros, cujos átomos de anel compreendem um ou mais átomos de nitrogênio, fósforo e/ou oxigênio intervenientes. Em algumas modalidades, um anel formado por dois ou mais grupos tomados em conjunto é monocíclico, bicíclico ou policíclico e compreende um anel monocíclico com 9 membros, cujos átomos de anel compreendem um ou mais átomos de nitrogênio, fósforo e/ou oxigênio intervenientes. Em algumas modalidades, um anel formado por dois ou mais grupos tomados em conjunto é monocíclico, bicíclico ou policíclico e compreende um anel monocíclico com 10 membros, cujos átomos de anel compreendem um ou mais átomos de nitrogênio, fósforo e/ou oxigênio intervenientes.
[001335] Em algumas modalidades, um anel formado por dois ou mais grupos tomados em conjunto é monocíclico, bicíclico ou policíclico e compreende um anel com 5 membros, cujos átomos de anel consistem em átomos de carbono e nos átomos de nitrogênio, fósforo e oxigênio intervenientes. Em algumas modalidades, um anel formado por dois ou mais grupos tomados em conjunto é monocíclico, bicíclico ou policíclico e compreende um anel com 6 membros, cujos átomos de anel consistem em átomos de carbono e nos átomos de nitrogênio, fósforo e oxigênio intervenientes. Em algumas modalidades, um anel formado por dois ou mais grupos tomados em conjunto é monocíclico, bicíclico ou policíclico e compreende um anel com 7 membros, cujos átomos de anel consistem em átomos de carbono e nos átomos de nitrogênio, fósforo e oxigênio intervenientes. Em algumas modalidades, um anel formado por dois ou mais grupos tomados em conjunto é monocíclico, bicíclico ou policíclico e compreende um anel com 8 membros, cujos átomos de anel consistem em átomos de carbono e nos átomos de nitrogênio, fósforo e oxigênio intervenientes. Em algumas modalidades, um anel formado por dois ou mais grupos tomados em conjunto é monocíclico, bicíclico ou policíclico e compreende um anel com 9 membros, cujos átomos de anel consistem em átomos de carbono e nos átomos de nitrogênio, fósforo e oxigênio intervenientes. Em algumas modalidades, um anel formado por dois ou mais grupos tomados em conjunto é monocíclico, bicíclico ou policíclico e compreende um anel com 10 membros, cujos átomos de anel consistem em átomos de carbono e nos átomos de nitrogênio, fósforo e oxigênio intervenientes.
[001336] Em algumas modalidades, os anéis descritos no presente documento são não substituídos. Em algumas modalidades, os anéis descritos no presente documento são substituídos. Em algumas modalidades, os substituintes são selecionados dentre aqueles descritos nos compostos exemplificativos fornecidos na presente revelação.
[001337] Em algumas modalidades, cada BA é independentemente um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre C5-30 heteroarila tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício, e C3-30 heterociclila tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo, boro e silício; cada Anel A é independentemente um anel monocíclico, bicíclico ou policíclico com 3 a 20 membros opcionalmente substituído tendo 0 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício; e cada LP tem independentemente a estrutura da fórmula
I, I-a, I-b, I-c, I-n-1, I-n-2, I-n-3, I-n-4, II, II-a-1, II- a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, II-d-2, ou uma forma de sal da mesma, em que cada variável é independentemente conforme descrito na presente revelação.
[001338] Em algumas modalidades, cada BA é independentemente uma C5-30 heteroarila opcionalmente substituída tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício, em que a heteroarila compreende um ou mais heteroátomos selecionados dentre oxigênio e nitrogênio; cada Anel A é independentemente um anel saturado monocíclico ou bicíclico com 5 a 10 membros opcionalmente substituído tendo 0 a 5 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício, em que o anel compreende pelo menos um átomo de oxigênio; e cada LP tem independentemente a estrutura da fórmula I, I-a, I-b, I-c, I-n-1, I-n-2, I-n-3, I-n-4, II, II-a-1, II- a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, II-d-2, ou forma de sal da mesma, em que cada variável é independentemente conforme descrito na presente revelação.
[001339] Em algumas modalidades, cada BA é independentemente um A, T, C, G, ou U opcionalmente substituído, ou um tautômero opcionalmente substituído de A, T, C, G, ou U; cada Anel A é independentemente um anel saturado monocíclico ou bicíclico com 5 a 7 membros opcionalmente substituído tendo um ou mais átomos de oxigênio; e cada LP tem independentemente a estrutura da fórmula I, I-a, I-b, I-c, I-n-1, I-n-2, I-n-3, I-n-4, II, II-a-1, II-
a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, II-d-2, ou forma de sal da mesma, em que cada variável é independentemente conforme descrito na presente revelação.
[001340] Em algumas modalidades, cada BA é independentemente uma nucleobase protegida ou opcionalmente substituída selecionada dentre adenina, citosina, guanosina, timina e uracila; cada Anel A é independentemente um anel saturado monocíclico ou bicíclico com 5 a 7 membros opcionalmente substituído tendo um ou mais átomos de oxigênio; e cada LP tem independentemente a estrutura da fórmula I, I-a, I-b, I-c, I-n-1, I-n-2, I-n-3, I-n-4, II, II-a-1, II- a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, II-d-2, ou forma de sal da mesma, em que cada variável é independentemente conforme descrito na presente revelação.
[001341] Em algumas modalidades, R5s−Ls− é −CH2OH. Em algumas modalidades, R5s−Ls− é −CH(R5s)−OH, em que R5s é conforme descrito na presente revelação.
[001342] Em algumas modalidades, BA é um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre C3-30 cicloalifático, C6-30 arila, C5-30 heteroarila tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício, C3-30 heterociclila tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício, uma porção química de nucleobase natural, e uma porção química de nucleobase modificada. Em algumas modalidades, BA é um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre C5-30 heteroarila tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício, C3-30 heterociclila tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício, uma porção química de nucleobase natural, e uma porção química de nucleobase modificada. Em algumas modalidades, BA é um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre C5-30 heteroarila tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício, uma porção química de nucleobase natural, e uma porção química de nucleobase modificada. Em algumas modalidades, BA é C5-30 heteroarila opcionalmente substituída tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio e enxofre. Em algumas modalidades, BA são nucleobases naturais opcionalmente substituídas e tautômeros das mesmas. Em algumas modalidades, BA são nucleobases naturais protegidas e tautômeros das mesmas. Vários grupos protetores de nucleobase para síntese de oligonucleotídeo são conhecidos e podem ser utilizados de acordo com a presente revelação. Em algumas modalidades, BA é uma nucleobase opcionalmente substituída selecionada dentre adenina, citosina, guanosina, timina e uracila, e tautômeros das mesmas. Em algumas modalidades, BA é uma nucleobase opcionalmente protegida selecionada dentre adenina, citosina, guanosina, timina e uracila, e tautômeros das mesmas.
[001343] Em algumas modalidades, BA é C3-30 cicloalifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, BA é C6-30 arila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, BA é C3-30 heterociclila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, BA é C5-30 heteroarila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, BA é uma porção química de base natural opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, BA é uma porção química de base modificada opcionalmente substituída. BA é um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre C3-30 cicloalifático, C6-30 arila, C3-30 heterociclila, e C5-30 heteroarila. Em algumas modalidades, BA é um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre C3- 30 cicloalifático, C6-30 arila, C3-30 heterociclila, C5-30 heteroarila, e uma porção química de nucleobase natural.
[001344] Em algumas modalidades, BA é conectado através de um anel aromático. Em algumas modalidades, BA é conectado através de um heteroátomo. Em algumas modalidades, BA é conectado através de um heteroátomo de anel de um anel aromático. Em algumas modalidades, BA é conectado através de um átomo de nitrogênio de anel de um anel aromático.
[001345] Em algumas modalidades, BA é uma porção química de nucleobase natural. Em algumas modalidades, BA é uma porção química de nucleobase natural opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, BA é uma porção química de nucleobase natural substituída. Em algumas modalidades, BA é opcionalmente substituído, ou um tautômero opcionalmente substituído de A, T, C, U, ou G. Em algumas modalidades, BA é nucleobase natural A, T, C, U, ou G. Em algumas modalidades, BA é um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre nucleobases naturais A, T, C, U, e G.
[001346] Em algumas modalidades, BA é um resíduo de base de purina opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, BA é um resíduo de base de purina protegido. Em algumas modalidades, BA é um resíduo de adenina opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, BA é um resíduo de adenina protegido. Em algumas modalidades, BA é um resíduo de guanina opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, BA é um resíduo de guanina protegido. Em algumas modalidades, BA é um resíduo de citosina opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, BA é um resíduo de citosina protegido. Em algumas modalidades, BA é um resíduo de timina opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, BA é um resíduo de timina protegido. Em algumas modalidades, BA é um resíduo de uracila opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, BA é um resíduo de uracila protegido. Em algumas modalidades, BA é um resíduo de 5-metilcitosina opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, BA é um resíduo de 5-metilcitosina protegido.
[001347] Em algumas modalidades, s é 0 a 20. Em algumas modalidades, s é 1 a 20. Em algumas modalidades, s é 1 a 5. Em algumas modalidades, s é 1. Em algumas modalidades, s é 2. Em algumas modalidades, s é 3. Em algumas modalidades, s é 4. Em algumas modalidades, s é 5. Em algumas modalidades, s é 6. Em algumas modalidades, s é 7. Em algumas modalidades, s é 8. Em algumas modalidades, s é 9. Em algumas modalidades, s é 10. Em algumas modalidades, s é 11. Em algumas modalidades, s é 12. Em algumas modalidades, s é 13. Em algumas modalidades, s é 14. Em algumas modalidades, s é 15. Em algumas modalidades, s é 16. Em algumas modalidades, s é 17. Em algumas modalidades, s é 18. Em algumas modalidades, s é 19. Em algumas modalidades, s é 20.
[001348] Em algumas modalidades, LP é uma ligação internucleotídica. Em algumas modalidades, LP é uma ligação internucleotídica da fórmula I, I-a, I-b, I-c, I-n-1, I-n-2, I-n-3, I-n-4, II, II-a-1, II-a-2, II-b-1, II-b-2, II- c-1, II-c-2, II-d-1, II-d-2, ou uma forma de sal da mesma. Em algumas modalidades, LP é uma ligação fosfato natural. Em algumas modalidades, LP é uma ligação internucleotídica não negativamente carregada. Em algumas modalidades, LP é uma ligação internucleotídica neutra. Em algumas modalidades, LP é uma ligação internucleotídica negativamente carregada. Em algumas modalidades, LP é uma ligação internucleotídica fosforotioato. Em algumas modalidades, LP é uma ligação internucleotídica quiralmente controlada.
[001349] Em algumas modalidades, z é 1 a
1.000. Em algumas modalidades, z+1 é um comprimento de oligonucleotídeo conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, z é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 to 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 ou 1.000. Em algumas modalidades, z é 10 a 100. Em algumas modalidades, z é 10 a
50. Em algumas modalidades, z é 15 a 100. Em algumas modalidades, z é 20 a 50. Em algumas modalidades, z não é inferior a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, ou 19. Em algumas modalidades, z não é inferior a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, ou 14. Em algumas modalidades, z não é superior a 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, ou 200. Em algumas modalidades, z é 5 a 50, 10 a 50, 14 a 50, 14 a 45, 14 a 40, 14 a 35, 14 a 30, 14 a 25, 14 a 100, 14 a 150, 14 a 200, 14 a 250, 14 a 300, 15 a 50, 15 a 45, 15 a 40, 15 a 35, 15 a 30, 15 a 25, 15 a 100, 15 a 150, 15 a 200, 15 a 250, 15 a 300, 16 a 50, 16 a 45, 16 a 40, 16 a 35, 16 a 30, 16 a 25, 16 a 100, 16 a 150, 16 a 200, 16 a 250, 16 a 300, 17 a 50, 17 a 45, 17 a 40, 17 a 35, 17 a 30, 17 a 25, 17 a 100, 17 a 150, 17 a 200, 17 a 250, 17 a 300, 18 a 50, 18 a 45, 18 a 40, 18 a 35, 18 a 30, 18 a 25, 18 a 100, 18 a 150, 18 a 200, 18 a 250, 18 a 300,
19 a 50, 19 a 45, 19 a 40, 19 a 35, 19 a 30, 19 a 25, 19 a 100, 19 a 150, 19 a 200, 19 a 250, ou 19 a 300. Em algumas modalidades, z é 10. Em algumas modalidades, z é 11. Em algumas modalidades, z é 12. Em algumas modalidades, z é 13. Em algumas modalidades, z é 14. Em algumas modalidades, z é 15. Em algumas modalidades, z é 16. Em algumas modalidades, z é 17. Em algumas modalidades, z é 18. Em algumas modalidades, z é 19. Em algumas modalidades, z é 20. Em algumas modalidades, z é 21. Em algumas modalidades, z é 22. Em algumas modalidades, z é 23. Em algumas modalidades, z é 24. Em algumas modalidades, z é 25. Em algumas modalidades, z é 26. Em algumas modalidades, z é 27. Em algumas modalidades, z é 28. Em algumas modalidades, z é 29. Em algumas modalidades, z é 30. Em algumas modalidades, z é 31. Em algumas modalidades, z é 32. Em algumas modalidades, z é 33. Em algumas modalidades, z é 34.
[001350] Em algumas modalidades, L3E é −L− ou −L−L−. Em algumas modalidades, L3E é −L−. Em algumas modalidades, L3E é −L−L−. Em algumas modalidades, L3E é uma ligação covalente. Em algumas modalidades, L3E é um ligante usado na síntese de oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, L3E é um ligante usado na síntese de oligonucleotídeo em fase sólida. Vários tipos de ligantes são conhecidos e podem ser utilizados de acordo com a presente revelação. Em algumas modalidades, um ligante é um ligante succinato (−O−C(O)−CH2−CH2−C(O)−). Em algumas modalidades, um ligante é um ligante oxalila (−O−C(O)−C(O)−). Em algumas modalidades, L3E é um ligante succinil-piperidina (SP). Em algumas modalidades, L3E é um ligante succinila. Em algumas modalidades, L3E é um ligante Q. Em algumas modalidades, L3E é −O−.
[001351] Em algumas modalidades, R3E é −R', −L−R', −OR', ou um suporte sólido. Em algumas modalidades, R3E é −R' conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, R3E é −R conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, R3E é hidrogênio. Em algumas modalidades, R3E é −L−R'. Em algumas modalidades, R3E é −OR'. Em algumas modalidades, R3E é um suporte para síntese de oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, R3E é um suporte sólido. Em algumas modalidades, um suporte sólido é um suporte CPG. Em algumas modalidades, um suporte sólido é um suporte de poliestireno. Em algumas modalidades, R3E é −H. Em algumas modalidades, −L3−R3E é −H. Em algumas modalidades, R3E é −OH. Em algumas modalidades, −L3−R3E é −OH. Em algumas modalidades, R3E é C1-6 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, R3E é C1-6 alquila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R3E é −OR'. Em algumas modalidades, R3E é −OH. Em algumas modalidades, R3E é −OR', em que R' não é hidrogênio. Em algumas modalidades, R3E é −OR', em que R' é C1- 6 alquila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R3E é um cap de extremidade 3' (por exemplo, aqueles usados em tecnologias de RNAi).
[001352] Em algumas modalidades, R3E é um suporte sólido. Em algumas modalidades, R3E é um suporte sólido para síntese de oligonucleotídeo. Vários tipos de suporte sólido são conhecidos e podem ser utilizados de acordo com a presente revelação. Em algumas modalidades, um suporte sólido é HCP. Em algumas modalidades, um suporte sólido é CPG.
[001353] Em algumas modalidades, R' é −R, −C(O)R, −C(O)OR, ou −S(O)2R, em que R é conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, R' é R, em que R é conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, R' é −C(O)R, em que R é conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, R' é −C(O)OR, em que R é conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, R' é −S(O)2R, em que R é conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, R' é hidrogênio. Em algumas modalidades, R' não é hidrogênio. Em algumas modalidades, R' é R, em que R é C1-20 alifático opcionalmente substituído conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, R' é R, em que R é C1-20 heteroalifático opcionalmente substituído conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, R' é R, em que R é C6-20 arila opcionalmente substituída conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, R' é R, em que R é C6-20 arilalifáatico opcionalmente substituído conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, R' é R, em que R é C6-20 aril-heteroalifático opcionalmente substituído conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, R' é R, em que R é heteroarila com 5 a 20 membros opcionalmente substituída conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, R' é R, em que R é heterociclila com 3 a 20 membros opcionalmente substituída conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, dois ou mais R' são R, e são opcional e independentemente tomados em conjunto para formar um anel opcionalmente substituído conforme descrito na presente revelação.
[001354] Em algumas modalidades, cada R é independentemente −H, ou um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre C1-30 alifático, C1-30 heteroalifático tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício, C6-30 arila, C6-30 arilalifático, C6-30 aril-heteroalifático tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício, heteroarila com 5 a 30 membros tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício, e heterociclila com 3 a 30 membros tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício, ou dois grupos R são opcional e independentemente tomados em conjunto para formar uma ligação covalente, ou: dois ou mais grupos R no mesmo átomo são opcional e independentemente tomados em conjunto com o átomo para formar um anel monocíclico, bicíclico ou policíclico com 3 a 30 membros opcionalmente substituído tendo, além do átomo, 0 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício; ou dois ou mais grupos R em dois ou mais átomos são opcional e independentemente tomados em conjunto com seus átomos intervenientes para formar um anel monocíclico, bicíclico ou policíclico com 3 a 30 membros opcionalmente substituído tendo, além dos átomos intervenientes, 0 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício.
[001355] Em algumas modalidades, cada R é independentemente −H, ou um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre C1-30 alifático, C1-30 heteroalifático tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício, C6-30 arila, C6-30 arilalifático, C6-30 aril-heteroalifático tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício, heteroarila com 5 a 30 membros tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício, e heterociclila com 3 a 30 membros tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício, ou dois grupos R são opcional e independentemente tomados em conjunto para formar uma ligação covalente, ou: dois ou mais grupos R no mesmo átomo são opcional e independentemente tomados em conjunto com o átomo para formar um anel monocíclico, bicíclico ou policíclico com 3 a 30 membros opcionalmente substituído tendo, além do átomo, 0 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício. dois ou mais grupos R em dois ou mais átomos são opcional e independentemente tomados em conjunto com seus átomos intervenientes para formar um anel monocíclico, bicíclico ou policíclico com 3 a 30 membros opcionalmente substituído tendo, além dos átomos intervenientes, 0 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício.
[001356] Em algumas modalidades, cada R é independentemente −H, ou um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre C1-20 alifático, C1-20 heteroalifático tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício, C6-20 arila, C6-20 arilalifático, C6-20 aril-heteroalifático tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício, heteroarila com 5 a 20 membros tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício, e heterociclila com 3 a 20 membros tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício, ou dois grupos R são opcional e independentemente tomados em conjunto para formar uma ligação covalente, ou: dois ou mais grupos R no mesmo átomo são opcional e independentemente tomados em conjunto com o átomo para formar um anel monocíclico, bicíclico ou policíclico com 3 a 20 membros opcionalmente substituído tendo, além do átomo, 0 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício. dois ou mais grupos R em dois ou mais átomos são opcional e independentemente tomados em conjunto com seus átomos intervenientes para formar um anel monocíclico, bicíclico ou policíclico com 3 a 20 membros opcionalmente substituído tendo, além dos átomos intervenientes, 0 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício.
[001357] Em algumas modalidades, cada R é independentemente −H, ou um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre C1-30 alifático, C1-30 heteroalifático tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício, C6-30 arila, C6-30 arilalifático, C6-30 aril-heteroalifático tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício, heteroarila com 5 a 30 membros tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício, e heterociclila com 3 a 30 membros tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício.
[001358] Em algumas modalidades, cada R é independentemente −H, ou um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre C1-20 alifático, C1-20 heteroalifático tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício, C6-20 arila, C6-20 arilalifático, C6-20 aril-heteroalifático tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício, heteroarila com 5 a 20 membros tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício, e heterociclila com 3 a 20 membros tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício.
[001359] Em algumas modalidades, R é hidrogênio. Em algumas modalidades, R não é hidrogênio. Em algumas modalidades, R é um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre C1-30 alifático, C1-30 heteroalifático tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício, C6-30 arila, um anel heteroarila com 5 a 30 membros tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício, e um anel heterocíclico com 3 a 30 membros tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício.
[001360] Em algumas modalidades, R é hidrogênio ou um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre C1-20 alifático, fenila, um anel carbocíclico saturado ou parcialmente insaturado com 3 a 7 membros, um anel arila bicíclico saturado, ou parcialmente insaturado com 8 a 10 membros, um anel heteroarila monocíclico com 5 a 6 membros tendo 1 a 4 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre, um anel heterocíclico saturado ou parcialmente insaturado com 4 a 7 membros tendo 1 a 3 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre, um anel heterocíclico bicíclico saturado ou parcialmente insaturado com 7 a 10 membros tendo 1 a 5 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre, ou um anel heteroarila bicíclico com 8 a 10 membros tendo 1 a 5 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre.
[001361] Em algumas modalidades, R é C1-30 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, R é C1-20 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, R é C1-15 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, R é C1-10 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, R é C1-6 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, R é C1-6 alquila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é hexila, pentila, butila, propila, etila ou metila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é hexila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é pentila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é butila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é propila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é etila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é metila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é hexila. Em algumas modalidades, R é pentila. Em algumas modalidades, R é butila. Em algumas modalidades, R é propila. Em algumas modalidades, R é etila. Em algumas modalidades, R é metila. Em algumas modalidades, R é isopropila. Em algumas modalidades, R é n-propila. Em algumas modalidades, R é terc-butila. Em algumas modalidades, R é sec-butila. Em algumas modalidades, R é n-butila. Em algumas modalidades, R é −(CH2)2CN.
[001362] Em algumas modalidades, R é C3-30 cicloalifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, R é C3-20 cicloalifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, R é C3-10 cicloalifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, R é ciclo- hexila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é ciclo-hexila. Em algumas modalidades, R é ciclopentila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é ciclopentila. Em algumas modalidades, R é ciclobutila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é ciclobutila. Em algumas modalidades, R é ciclopropila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é ciclopropila.
[001363] Em algumas modalidades, R é um anel carbocíclico saturado ou parcialmente insaturado com 3 a 30 membros opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, R é um anel carbocíclico saturado ou parcialmente insaturado com 3 a 7 membros opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, R é um anel carbocíclico saturado ou parcialmente insaturado com 3 membros opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, R é um anel carbocíclico saturado ou parcialmente insaturado com 4 membros opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, R é um anel carbocíclico saturado ou parcialmente insaturado com 5 membros opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, R é um anel carbocíclico saturado ou parcialmente insaturado com 6 membros opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, R é um anel carbocíclico saturado ou parcialmente insaturado com 7 membros opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, R é opcionalmente substituído ciclo-heptila. Em algumas modalidades, R é ciclo-heptila. Em algumas modalidades, R é ciclo-hexila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é ciclo-hexila. Em algumas modalidades, R é ciclopentila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é ciclopentila. Em algumas modalidades, R é ciclobutila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é ciclobutila. Em algumas modalidades, R é ciclopropila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é ciclopropila.
[001364] Em algumas modalidades, quando R é ou compreende uma estrutura de anel, por exemplo, cicloalifático, ciclo-heteroalifático, arila, heteroarila, etc., a estrutura de anel pode ser monocíclica, bicíclica ou policíclica. Em algumas modalidades, R é ou compreende uma estrutura monocíclica. Em algumas modalidades, R é ou compreende uma estrutura bicíclica. Em algumas modalidades, R é ou compreende uma estrutura policíclica.
[001365] Em algumas modalidades, R é C1-30 heteroalifático opcionalmente substituído tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício. Em algumas modalidades, R é C1-20 heteroalifático opcionalmente substituído tendo 1 a 10 heteroátomos. Em algumas modalidades,
R é C1-20 heteroalifático opcionalmente substituído tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo ou silício, incluindo opcionalmente uma ou mais formas oxidadas de nitrogênio, enxofre, fósforo ou selênio. Em algumas modalidades, R é C1-30 heteroalifático opcionalmente substituído que compreende 1 a 10 grupos independentemente selecionados dentre , –N=, Si ≡N, –S–, –S(O)–, –S(O)2–, –O–, =O, , , e .
[001366] Em algumas modalidades, R é C6-30 arila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é fenila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é fenila. Em algumas modalidades, R é fenila substituída.
[001367] Em algumas modalidades, R é um anel arila bicíclico saturado ou parcialmente insaturado com 8 a 10 membros opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, R é um anel saturado bicíclico com 8 a 10 membros opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, R é um anel bicíclico parcialmente insaturado com 8 a 10 membros opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, R é um anel arila bicíclico com 8 a 10 membros opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, R é naftila opcionalmente substituída.
[001368] Em algumas modalidades, R é anel heteroarila com 5 a 30 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício. Em algumas modalidades, R é anel heteroarila com 5 a 30 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, e enxofre. Em algumas modalidades, R é anel heteroarila com 5 a
30 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 5 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício. Em algumas modalidades, R é anel heteroarila com 5 a 30 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 5 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, e enxofre.
[001369] Em algumas modalidades, R é um anel heteroarila monocíclico com 5 a 6 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 4 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em algumas modalidades, R é um anel heteroarila monocíclico com 5 a 6 membros substituído tendo 1 a 4 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em algumas modalidades, R é um anel heteroarila monocíclico com 5 a 6 membros não substituído tendo 1 a 4 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em algumas modalidades, R é um anel heteroarila monocíclico com 5 a 6 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 3 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, enxofre, e oxigênio. Em algumas modalidades, R é um anel heteroarila monocíclico com 5 a 6 membros substituído tendo 1 a 3 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em algumas modalidades, R é um anel heteroarila monocíclico com 5 a 6 membros não substituído tendo 1 a 3 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, enxofre, e oxigênio.
[001370] Em algumas modalidades, R é um anel heteroarila monocíclico com 5 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 4 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio ou enxofre. Em algumas modalidades, R é um anel heteroarila monocíclico com 6 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 4 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre.
[001371] Em algumas modalidades, R é um anel heteroarila monocíclico com 5 membros opcionalmente substituído tendo um heteroátomo selecionado dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em algumas modalidades, R é selecionado dentre pirrolila, furanila ou tienila opcionalmente substituída.
[001372] Em algumas modalidades, R é um anel heteroarila com 5 membros opcionalmente substituído tendo dois heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em determinadas modalidades, R é um anel heteroarila com 5 membros opcionalmente substituído tendo um átomo de nitrogênio, e um heteroátomo adicional selecionado dentre enxofre ou oxigênio. Os grupos R exemplificativos incluem, porém sem limitação pirazolila, imidazolila, tiazolila, isotiazolila, oxazolila ou isoxazolila opcionalmente substituída.
[001373] Em algumas modalidades, R é um anel heteroarila com 5 membros opcionalmente substituído tendo três heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Os grupos R exemplificativos incluem, porém sem limitação triazolila, oxadiazolila ou tiadiazolila opcionalmente substituída.
[001374] Em algumas modalidades, R é um anel heteroarila com 5 membros opcionalmente substituído tendo quatro heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Os grupos R exemplificativos incluem, porém sem limitação tetrazolila, oxatriazolila e tiatriazolila opcionalmente substituída.
[001375] Em algumas modalidades, R é um anel heteroarila com 6 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 4 átomos de nitrogênio. Em algumas modalidades, R é um anel heteroarila com 6 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 3 átomos de nitrogênio. Em outras modalidades, R é um anel heteroarila com 6 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 2 átomos de nitrogênio. Em algumas modalidades, R é um anel heteroarila com 6 membros opcionalmente substituído tendo quatro átomos de nitrogênio. Em algumas modalidades, R é um anel heteroarila com 6 membros opcionalmente substituído tendo três átomos de nitrogênio. Em algumas modalidades, R é um anel heteroarila com 6 membros opcionalmente substituído tendo dois átomos de nitrogênio. Em determinadas modalidades, R é um anel heteroarila com 6 membros opcionalmente substituído tendo um átomo de nitrogênio. Os grupos R exemplificativos incluem porém sem limitação piridinila, pirimidinila, pirazinila, piridazinila, triazinila ou tetrazinila opcionalmente substituída.
[001376] Em determinadas modalidades, R é um anel heteroarila bicíclico cp, 8 a 10 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 4 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em algumas modalidades, R é um anel heteroarila fundido com 5,6 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 4 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em outras modalidades, R é um anel heteroarila fundido com 5,6 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 2 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em determinadas modalidades, R é um anel heteroarila fundido com 5,6 membros opcionalmente substituído tendo 1 heteroátomo independentemente selecionado dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em algumas modalidades, R é uma indolila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é uma azabiciclo[3.2.1]octanila opcionalmente substituída. Em determinadas modalidades, R é um anel heteroarila fundido com 5,6 membros opcionalmente substituído tendo 2 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em algumas modalidades, R é uma azaindolila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é uma benzimidazolila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é uma benzotiazolila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é uma benzoxazolila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é uma indazolila opcionalmente substituída. Em determinadas modalidades, R é um anel heteroarila fundido com 5,6 membros opcionalmente substituído tendo 3 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre.
[001377] Em algumas modalidades, R é um anel heteroarila fundido com 5,6 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 5 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em algumas modalidades, R é um anel heteroarila fundido com 5,6 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 4 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em algumas modalidades, R é um anel heteroarila fundido com 5,6 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 3 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em algumas modalidades, R é um anel heteroarila fundido com 5,6 membros opcionalmente substituído tendo dois heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em algumas modalidades, R é um anel heteroarila fundido com 5,6 membros opcionalmente substituído tendo três heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em algumas modalidades, R é um anel heteroarila fundido com 5,6 membros opcionalmente substituído tendo quatro heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em algumas modalidades, R é um anel heteroarila fundido com 5,6 membros opcionalmente substituído tendo cinco heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre.
[001378] Em determinadas modalidades, R é um anel heteroarila fundido com 5,6 membros opcionalmente substituído tendo um heteroátomo independentemente selecionado dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em algumas modalidades, R é indolila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é benzofuranila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é benzo[b]tienila opcionalmente substituída. Em determinadas modalidades, R é um anel heteroarila fundido com 5,6 membros opcionalmente substituído tendo dois heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em algumas modalidades, R é azaindolila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é benzimidazolila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é benzotiazolila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é benzoxazolila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é uma indazolila opcionalmente substituída. Em determinadas modalidades, R é um anel heteroarila fundido com 5,6 membros opcionalmente substituído tendo três heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em algumas modalidades, R é oxazolopidinila, tiazolopiridinila ou imidazopiridinila opcionalmente substituída. Em determinadas modalidades, R é um anel heteroarila fundido com 5,6 membros opcionalmente substituído tendo quatro heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio e enxofre. Em algumas modalidades, R é purinila, oxazolopirimidinila, tiazolopirimidinila, oxazolopirazinila, tiazolopirazinila, imidazopirazinila, oxazolopiridazinila, tiazolopiridazinila ou imidazopiridazinila opcionalmente substituída. Em determinadas modalidades, R é um anel heteroarila fundido com 5,6 membros opcionalmente substituído tendo cinco heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre.
[001379] Em algumas modalidades, R é 1,4-di- hidropirrolo[3,2-b]pirrolila, 4H-furo[3,2-b]pirrolila, 4H- tieno[3,2-b]pirrolila, furo[3,2-b]furanila, tieno[3,2- b]furanila, tieno[3,2-b]tienila, 1H-pirrolo[1,2- a]imidazolila, pirrolo[2,1-b]oxazolila ou pirrolo[2,1- b]tiazolila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é di-hidropirroloimidazolila, 1H-furoimidazolila, 1H- tienoimidazolila, furooxazolila, furoisoxazolila, 4H- pirrolooxazolila, 4H-pirroloisoxazolila, tienooxazolila, tienoisoxazolila, 4H-pirrolotiazolila, furotiazolila, tienotiazolila, 1H-imidazoimidazolila, imidazooxazolila ou imidazo[5,1-b]tiazolila opcionalmente substituída.
[001380] Em determinadas modalidades, R é um anel heteroarila fundido com 6,6 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 4 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em algumas modalidades, R é um anel heteroarila fundido com 6,6 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 2 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em outras modalidades, R é um anel heteroarila fundido com 6,6 membros opcionalmente substituído tendo 1 heteroátomo independentemente selecionado dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em algumas modalidades, R é uma quinolinila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é uma isoquinolinila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é um anel heteroarila fundido com 6,6 membros opcionalmente substituído tendo 2 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em algumas modalidades, R é quinazolina opcionalmente substituído ou uma quinoxalina.
[001381] Em algumas modalidades, R é anel heterocíclico com 3 a 30 membros tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício. Em algumas modalidades, R é anel heterocíclico com 3 a 30 membros tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, e enxofre. Em algumas modalidades, R é anel heterocíclico com 3 a 30 membros tendo 1 a 5 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício. Em algumas modalidades, R é anel heterocíclico com 3 a 30 membros tendo 1 a 5 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, e enxofre.
[001382] Em algumas modalidades, R é um anel heterocíclico saturado ou parcialmente insaturado com 3 a 7 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 3 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em algumas modalidades, R é um anel heterocíclico saturado ou parcialmente insaturado com 3 a 7 membros substituído tendo 1 a 3 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em algumas modalidades, R é um anel heterocíclico saturado ou parcialmente insaturado com 3 a 7 membros não substituído tendo 1 a 3 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em determinadas modalidades, R é um anel monocíclico parcialmente insaturado com 5 a 7 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 3 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em determinadas modalidades, R é um anel monocíclico parcialmente insaturado com 5 a 6 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 3 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em determinadas modalidades, R é um anel monocíclico parcialmente insaturado com 5 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 3 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em determinadas modalidades, R é um anel monocíclico parcialmente insaturado com 6 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 3 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em determinadas modalidades, R é um anel monocíclico parcialmente insaturado com 7 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 3 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em algumas modalidades, R é anel heterocíclico com 3 membros opcionalmente substituído tendo um heteroátomo selecionado dentre nitrogênio, oxigênio ou enxofre. Em algumas modalidades, R é anel heterocíclico com 4 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 3 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em algumas modalidades, R é anel heterocíclico com 5 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 3 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em algumas modalidades, R é anel heterocíclico com 6 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 3 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em algumas modalidades, R é anel heterocíclico com 7 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 3 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre.
[001383] Em algumas modalidades, R é um anel heterocíclico saturado ou parcialmente insaturado com 3 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 2 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em algumas modalidades, R é um anel heterocíclico saturado ou parcialmente insaturado com 4 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 2 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em algumas modalidades, R é um anel heterocíclico saturado ou parcialmente insaturado com 5 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 2 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em algumas modalidades, R é um anel heterocíclico saturado ou parcialmente insaturado com 6 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 2 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em algumas modalidades, R é um anel heterocíclico saturado ou parcialmente insaturado com 7 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 2 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre.
[001384] Em algumas modalidades, R é um anel heterocíclico saturado ou parcialmente insaturado com 4 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 2 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em algumas modalidades, R é um anel heterocíclico parcialmente insaturado com 4 membros opcionalmente substituído tendo 2 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em algumas modalidades, R é um anel heterocíclico parcialmente insaturado com 4 membros opcionalmente substituído que não tem mais que 1 heteroátomo. Em algumas modalidades, R é um anel heterocíclico parcialmente insaturado com 4 membros opcionalmente substituído tendo não mais que 1 heteroátomo, em que o heteroátomo é nitrogênio. Em algumas modalidades, R é um anel heterocíclico parcialmente insaturado com 4 membros opcionalmente substituído tendo não mais que 1 heteroátomo, em que o heteroátomo é oxigênio. Em algumas modalidades, R é um anel heterocíclico parcialmente insaturado com 4 membros opcionalmente substituído tendo não mais que 1 heteroátomo, em que o heteroátomo é enxofre. Em algumas modalidades, R é um anel heterocíclico parcialmente insaturado com 4 membros opcionalmente substituído tendo 2 átomos de oxigênio. Em algumas modalidades, R é um anel heterocíclico parcialmente insaturado com 4 membros opcionalmente substituído tendo 2 átomos de nitrogênio. Em algumas modalidades, R é um anel heterocíclico saturado ou parcialmente insaturado com 4 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 2 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em algumas modalidades, R é um anel heterocíclico parcialmente insaturado com 4 membros opcionalmente substituído tendo 2 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em algumas modalidades, R é um anel heterocíclico parcialmente insaturado com 4 membros opcionalmente substituído que não tem mais que 1 heteroátomo. Em algumas modalidades, R é um anel heterocíclico parcialmente insaturado com 4 membros opcionalmente substituído tendo não mais que 1 heteroátomo, em que o heteroátomo é nitrogênio. Em algumas modalidades, R é um anel heterocíclico parcialmente insaturado com 4 membros opcionalmente substituído tendo não mais que 1 heteroátomo, em que o heteroátomo é oxigênio. Em algumas modalidades, R é um anel heterocíclico parcialmente insaturado com 4 membros opcionalmente substituído tendo não mais que 1 heteroátomo, em que o heteroátomo é enxofre. Em algumas modalidades, R é um anel heterocíclico parcialmente insaturado com 4 membros opcionalmente substituído tendo 2 átomos de oxigênio. Em algumas modalidades, R é um anel heterocíclico parcialmente insaturado com 4 membros opcionalmente substituído tendo 2 átomos de nitrogênio.
[001385] Em algumas modalidades, R é um anel heterocíclico saturado ou parcialmente insaturado com 5 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 2 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em algumas modalidades, R é um anel heterocíclico parcialmente insaturado com 5 membros opcionalmente substituído tendo 2 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em algumas modalidades, R é um anel heterocíclico parcialmente insaturado com 5 membros opcionalmente substituído que não tem mais que 1 heteroátomo. Em algumas modalidades, R é um anel heterocíclico parcialmente insaturado com 5 membros opcionalmente substituído tendo não mais que 1 heteroátomo, em que o heteroátomo é nitrogênio. Em algumas modalidades, R é um anel heterocíclico parcialmente insaturado com 5 membros opcionalmente substituído tendo não mais que 1 heteroátomo, em que o heteroátomo é oxigênio. Em algumas modalidades, R é um anel heterocíclico parcialmente insaturado com 5 membros opcionalmente substituído tendo não mais que 1 heteroátomo, em que o heteroátomo é enxofre. Em algumas modalidades, R é um anel heterocíclico parcialmente insaturado com 5 membros opcionalmente substituído tendo 2 átomos de oxigênio. Em algumas modalidades, R é um anel heterocíclico parcialmente insaturado com 5 membros opcionalmente substituído tendo 2 átomos de nitrogênio.
[001386] Em algumas modalidades, R é um anel heterocíclico saturado ou parcialmente insaturado com 6 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 2 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em algumas modalidades, R é um anel heterocíclico parcialmente insaturado com 6 membros opcionalmente substituído tendo 2 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em algumas modalidades, R é um anel heterocíclico parcialmente insaturado com 6 membros opcionalmente substituído que não tem mais que 1 heteroátomo. Em algumas modalidades, R é um anel heterocíclico parcialmente insaturado com 6 membros opcionalmente substituído tendo não mais que 1 heteroátomo, em que o heteroátomo é nitrogênio. Em algumas modalidades, R é um anel heterocíclico parcialmente insaturado com 6 membros opcionalmente substituído tendo não mais que 1 heteroátomo, em que o heteroátomo é oxigênio. Em algumas modalidades, R é um anel heterocíclico parcialmente insaturado com 6 membros opcionalmente substituído tendo não mais que 1 heteroátomo, em que o heteroátomo é enxofre. Em algumas modalidades, R é um anel heterocíclico parcialmente insaturado com 6 membros opcionalmente substituído tendo 2 átomos de oxigênio. Em algumas modalidades, R é um anel heterocíclico parcialmente insaturado com 6 membros opcionalmente substituído tendo 2 átomos de nitrogênio.
[001387] Em determinadas modalidades, R é um anel heterocíclico saturado ou parcialmente insaturado com 3 a 7 membros tendo 1 a 2 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio e enxofre. Em determinadas modalidades, R é oxiranila, oxetanila, tetra- hidrofuranila, tetra-hidropiranila, oxepaneila, aziridineila, azetidineila, pirrolidinila, piperidinila, azepanila, tiiranila, tietanila, tetra-hidrotiofenila, tetra- hidrotiopiranila, tiepanila, dioxolanila, oxatiolanila, oxazolidinila, imidazolidinila, tiazolidinila, ditiolanila, dioxanila, morfolinila, oxatianila, piperazinila, tiomorfolinila, ditianila, dioxepanila, oxazepanila, oxatiepanila, ditiepanila, diazepanila, di-hidrofuranonila,
tetra-hidropiranonila, oxepanonila, pirolidinonila, piperidinonila, azepanonila, di-hidrotiofenonila, tetra- hidrotiopiranonila, tiepanonila, oxazelidinonila, oxazinanonila, oxazepanonila, dioxolanonila, dioxanonila, dioxepanonila, oxatiolinonila, oxatianonila, oxatiepanonila, tiazolidinonila, tiazinanonila, tiazepanonila, imidazolidinonila, tetra-hidropirimidinonila, diazepanonila, imidazolidinadionila, oxazelidinadionila, tiazolidinadionila, dioxolanodionil, oxatiolanodionila, piperazinadionila, morfolinadionila, tiomorfolinadionila, tetra-hidropiranila, tetra-hidrofuranila, morfolinila, tiomorfolinila, piperidinila, piperazinila, pirrolidinila, tetra- hidrotiofenila ou tetra-hidrotiopiranila opcionalmente substituída.
[001388] Em determinadas modalidades, R é um anel monocíclico parcialmente insaturado com 5 a 6 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 2 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em determinadas modalidades, R é um grupo tetra- hidropiridinila, di-hidrotiazolila, di-hidrooxazolila ou oxazolinila opcionalmente substituído.
[001389] Em algumas modalidades, R é um anel heterocíclico bicíclico saturado ou parcialmente insaturado com 7 a 10 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 5 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em algumas modalidades, R é indolinila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é isoindolinila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é 1, 2, 3, 4-tetra-hidroquinolinila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é 1, 2,
3, 4-tetra-hidroisoquinolinila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é uma azabiciclo[3.2.1]octanila opcionalmente substituída.
[001390] Em algumas modalidades, R é um anel heteroarila bicíclico cp, 8 a 10 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 5 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre.
[001391] Em algumas modalidades, R é um anel heteroarila fundido com 5,6 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 5 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em algumas modalidades, R é um anel heteroarila fundido com 5,6 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 4 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em algumas modalidades, R é um anel heteroarila fundido com 5,6 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 3 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em algumas modalidades, R é um anel heteroarila fundido com 5,6 membros opcionalmente substituído tendo dois heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em algumas modalidades, R é 1,4-di- hidropirrolo[3,2-b]pirrolila, 4H-furo[3,2-b]pirrolila, 4H- tieno[3,2-b]pirrolila, furo[3,2-b]furanila, tieno[3,2- b]furanila, tieno[3,2-b]tienila, 1H-pirrolo[1,2- a]imidazolila, pirrolo[2,1-b]oxazolila ou pirrolo[2,1- b]tiazolila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é um anel heteroarila fundido com 5,6 membros opcionalmente substituído tendo três heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em algumas modalidades, R é di-hidropirroloimidazolila, 1H-
furoimidazolila, 1H-tienoimidazolila, furooxazolila, furoisoxazolila, 4H-pirrolooxazolila, 4H-pirroloisoxazolila, tienooxazolila, tienoisoxazolila, 4H-pirrolotiazolila, furotiazolila, tienotiazolila, 1H-imidazoimidazolila, imidazooxazolila ou imidazo[5,1-b]tiazolila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é um anel heteroarila fundido com 5,6 membros opcionalmente substituído tendo quatro heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em algumas modalidades, R é um anel heteroarila fundido com 5,6 membros opcionalmente substituído tendo cinco heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre.
[001392] Em algumas modalidades, R é um anel heteroarila fundido com 5,6 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 5 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em outras modalidades, R é um anel heteroarila fundido com 5,6 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 2 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em determinadas modalidades, R é um anel heteroarila fundido com 5,6 membros opcionalmente substituído tendo um heteroátomo independentemente selecionado dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em algumas modalidades, R é indolila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é benzofuranila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é benzo[b]tienila opcionalmente substituída. Em determinadas modalidades, R é um anel heteroarila fundido com 5,6 membros opcionalmente substituído tendo dois heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em algumas modalidades, R é azaindolila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é benzimidazolila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é benzotiazolila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é benzoxazolila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é uma indazolila opcionalmente substituída. Em determinadas modalidades, R é um anel heteroarila fundido com 5,6 membros opcionalmente substituído tendo três heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em algumas modalidades, R é oxazolopidinila, tiazolopiridinila ou imidazopiridinila opcionalmente substituída. Em determinadas modalidades, R é um anel heteroarila fundido com 5,6 membros opcionalmente substituído tendo quatro heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio e enxofre. Em algumas modalidades, R é purinila, oxazolopirimidinila, tiazolopirimidinila, oxazolopirazinila, tiazolopirazinila, imidazopirazinila, oxazolopiridazinila, tiazolopiridazinila ou imidazopiridazinila opcionalmente substituída. Em determinadas modalidades, R é um anel heteroarila fundido com 5,6 membros opcionalmente substituído tendo cinco heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre.
[001393] Em determinadas modalidades, R é um anel heteroarila fundido com 6,6 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 5 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em algumas modalidades, R é um anel heteroarila fundido com 6,6 membros opcionalmente substituído tendo 1 a 2 heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em outras modalidades, R é um anel heteroarila fundido com 6,6 membros opcionalmente substituído tendo um heteroátomo selecionado dentre nitrogênio, oxigênio e enxofre. Em algumas modalidades, R é quinolinila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é isoquinolinila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é um anel heteroarila fundido com 6,6 membros opcionalmente substituído tendo dois heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em algumas modalidades, R é quinazolinila, ftalazinila, quinoxalinila ou naftiridinila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é um anel heteroarila fundido com 6,6 membros opcionalmente substituído tendo três heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em algumas modalidades, R é piridopirimidinila, piridopiridazinila, piridopirazinila ou benzotriazinila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é um anel heteroarila fundido com 6,6 membros opcionalmente substituído tendo quatro heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em algumas modalidades, R é piridotriazinila, pteridinila, pirazinopirazinila, pirazinopiridazinila, piridazinopiridazinila, pirimidopiridazinila ou pirimidopirimidinila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R é um anel heteroarila fundido com 6,6 membros opcionalmente substituído tendo cinco heteroátomos independentemente selecionados dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre.
[001394] Em algumas modalidades, R é C6-30 arilalifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, R é C6-20 arilalifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, R é C6-10 arilalifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, uma porção química de arila do arilalifático tem 6, 10, ou 14 átomos de carbono de arila. Em algumas modalidades, uma porção química de arila do arilalifático tem 6 átomos de carbono de arila. Em algumas modalidades, uma porção química de arila do arilalifático tem 10 átomos de carbono de arila. Em algumas modalidades, uma porção química de arila do arilalifático tem 14 átomos de carbono de arila. Em algumas modalidades, uma porção química de arila é fenila opcionalmente substituída.
[001395] Em algumas modalidades, R é C6-30 aril-heteroalifático opcionalmente substituído tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício. Em algumas modalidades, R é C6-30 aril-heteroalifático opcionalmente substituído tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, e enxofre. Em algumas modalidades, R é C6-20 aril-heteroalifático opcionalmente substituído tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício. Em algumas modalidades, R é C6-20 aril-heteroalifático opcionalmente substituído tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, e enxofre. Em algumas modalidades, R é C6-10 aril- heteroalifático opcionalmente substituído tendo 1 a 5 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício. Em algumas modalidades, R é C6-10 aril-heteroalifático opcionalmente substituído tendo 1 a 5 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio e enxofre.
[001396] Em algumas modalidades, dois grupos
R são opcional e independentemente tomados em conjunto para formar uma ligação covalente. Em algumas modalidades, −C=O é formado. Em algumas modalidades, −C=C− é formado. Em algumas modalidades, é formado.
[001397] Em algumas modalidades, dois ou mais grupos R no mesmo átomo são opcional e independentemente tomados em conjunto com o átomo para formar um anel monocíclico, bicíclico ou policíclico com 3 a 30 membros opcionalmente substituído tendo, além do átomo, 0 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício. Em algumas modalidades, dois ou mais grupos R no mesmo átomo são opcional e independentemente tomados em conjunto com o átomo para formar um anel monocíclico, bicíclico ou policíclico com 3 a 20 membros opcionalmente substituído tendo, além do átomo, 0 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício. Em algumas modalidades, dois ou mais grupos R no mesmo átomo são opcional e independentemente tomados em conjunto com o átomo para formar um anel monocíclico, bicíclico ou policíclico com 3 a 10 membros opcionalmente substituído tendo, além do átomo, 0 a 5 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício. Em algumas modalidades, dois ou mais grupos R no mesmo átomo são opcional e independentemente tomados em conjunto com o átomo para formar um anel monocíclico, bicíclico ou policíclico com 3 a 6 membros opcionalmente substituído tendo, além do átomo, 0 a 3 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício. Em algumas modalidades, dois ou mais grupos R no mesmo átomo são opcional e independentemente tomados em conjunto com o átomo para formar um anel monocíclico, bicíclico ou policíclico com 3 a 5 membros opcionalmente substituído tendo, além do átomo, 0 a 3 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício.
[001398] Em algumas modalidades, dois ou mais grupos R em dois ou mais átomos são opcional e independentemente tomados em conjunto com seus átomos intervenientes para formar um anel monocíclico, bicíclico ou policíclico com 3 a 30 membros opcionalmente substituído tendo, além dos átomos intervenientes, 0 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício. Em algumas modalidades, dois ou mais grupos R em dois ou mais átomos são opcional e independentemente tomados em conjunto com seus átomos intervenientes para formar um anel monocíclico, bicíclico ou policíclico com 3 a 20 membros opcionalmente substituído tendo, além dos átomos intervenientes, 0 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício. Em algumas modalidades, dois ou mais grupos R em dois ou mais átomos são opcional e independentemente tomados em conjunto com seus átomos intervenientes para formar um anel monocíclico, bicíclico ou policíclico com 3 a 10 membros opcionalmente substituído tendo, além dos átomos intervenientes, 0 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício. Em algumas modalidades, dois ou mais grupos R em dois ou mais átomos são opcional e independentemente tomados em conjunto com seus átomos intervenientes para formar um anel monocíclico, bicíclico ou policíclico com 3 a 10 membros opcionalmente substituído tendo, além dos átomos intervenientes, 0 a 5 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício. Em algumas modalidades, dois ou mais grupos R em dois ou mais átomos são opcional e independentemente tomados em conjunto com seus átomos intervenientes para formar um anel monocíclico, bicíclico ou policíclico com 3 a 6 membros opcionalmente substituído tendo, além dos átomos intervenientes, 0 a 3 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício. Em algumas modalidades, dois ou mais grupos R em dois ou mais átomos são opcional e independentemente tomados em conjunto com seus átomos intervenientes para formar um anel monocíclico, bicíclico ou policíclico com 3 a 5 membros opcionalmente substituído tendo, além dos átomos intervenientes, 0 a 3 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício.
[001399] Em algumas modalidades, os heteroátomos nos grupos R, ou nas estruturas formadas por dois ou mais grupos R tomados em conjunto, são selecionados dentre oxigênio, nitrogênio e enxofre. Em algumas modalidades, um anel formado tem 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 membros. Em algumas modalidades, um anel formado é saturado. Em algumas modalidades, um anel formado é parcialmente saturado. Em algumas modalidades, um anel formado é aromático. Em algumas modalidades, um anel formado compreende uma porção química de anel aromático saturada ou parcialmente insaturada. Em algumas modalidades, um anel formado compreende 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 átomos de anel aromático. Em algumas modalidades, um anel formado contém não mais que 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 átomos de anel aromático. Em algumas modalidades, os átomos de anel aromático são selecionados dentre carbono, nitrogênio, oxigênio e enxofre.
[001400] Em algumas modalidades, um anel formado por dois ou mais grupos R (ou dois ou mais grupos selecionados dentre R e variáveis que podem ser R) tomados em conjunto é um C3-30 cicloalifático, C6-30 arila, heteroarila com 5 a 30 membros tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício, ou anel heterociclila com 3 a 30 membros tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício, conforme descrito para R, porém bivalente ou multivalente.
[001401] Conforme observado por aqueles versados na técnica, as modalidades de R descritas na presente revelação também podem ser independentemente modalidades para variáveis que podem ser R.
[001402] Em algumas modalidades, a é 1 a 100. Em algumas modalidades, a é 1 a 50. Em algumas modalidades, a é 1 a 40. Em algumas modalidades, a é 1 a 30. Em algumas modalidades, a é 1 a 20. Em algumas modalidades, a é 1 a 15. Em algumas modalidades, a é 1 a 10. Em algumas modalidades, a é 1 a 9. Em algumas modalidades, a é 1 a 8. Em algumas modalidades, a é 1 a 7. Em algumas modalidades, a é 1 a 6. Em algumas modalidades, a é 1 a 5. Em algumas modalidades, a é 1 a 4. Em algumas modalidades, a é 1 a 3. Em algumas modalidades, a é 1 a 2. Em algumas modalidades, a é 1. Em algumas modalidades, a é 2. Em algumas modalidades, a é 3. Em algumas modalidades, a é 4. Em algumas modalidades, a é 5. Em algumas modalidades, a é 6. Em algumas modalidades, a é 7. Em algumas modalidades, a é 8. Em algumas modalidades, a é 9. Em algumas modalidades, a é 10. Em algumas modalidades, a é mais de 10.
[001403] Em algumas modalidades, b é 1 a 100. Em algumas modalidades, b é 1 a 50. Em algumas modalidades, b é 1 a 40. Em algumas modalidades, b é 1 a 30. Em algumas modalidades, b é 1 a 20. Em algumas modalidades, b é 1 a 15. Em algumas modalidades, b é 1 a 10. Em algumas modalidades, b é 1 a 9. Em algumas modalidades, b é 1 a 8. Em algumas modalidades, b é 1 a 7. Em algumas modalidades, b é 1 a 6. Em algumas modalidades, b é 1 a 5. Em algumas modalidades, b é 1 a 4. Em algumas modalidades, b é 1 a 3. Em algumas modalidades, b é 1 a 2. Em algumas modalidades, b é 1. Em algumas modalidades, b é 2. Em algumas modalidades, b é 3. Em algumas modalidades, b é 4. Em algumas modalidades, b é 5. Em algumas modalidades, b é 6. Em algumas modalidades, b é 7. Em algumas modalidades, b é 8. Em algumas modalidades, b é 9. Em algumas modalidades, b é 10. Em algumas modalidades, b é 1. Em algumas modalidades, b é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, ou mais.
[001404] Em algumas modalidades, LLD é L. Em algumas modalidades, LLD é LM bivalente.
[001405] Em algumas modalidades, LM é −LM1−LM2−LM3− conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, LM é LM1 conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, LM é LM2 conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, LM é LM3 conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, LM é L conforme descrito na presente revelação.
[001406] Em algumas modalidades, LM1 é L. Em algumas modalidades, LM2 é L. Em algumas modalidades, LM3 é L. Em algumas modalidades, LM1 é uma ligação covalente. Em algumas modalidades, LM2 é uma ligação covalente. Em algumas modalidades, LM3 é uma ligação covalente. Em algumas modalidades, LM1 é LM2 conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, LM1 é LM3 conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, LM2 é LM1 conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, LM2 é LM3 conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, LM3 é LM1 conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, LM3 é LM2 conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, LM é LM1 conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, LM é LM2 conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, LM é LM3 conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, LM é LM1−LM2, em que cada um dentre LM1 e LM2 é independentemente conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, LM é LM1−LM3, em que cada um dentre LM1 e LM3 é independentemente conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, LM é LM2−LM3, em que cada um dentre LM2 e LM3 é independentemente conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, LM é LM1−LM2−LM3, em que cada um dentre LM1, LM2 e LM3 é independentemente conforme descrito na presente revelação.
[001407] Em algumas modalidades, LM1 compreende um ou mais −N(R')− e um ou mais −C(O)−. Em algumas modalidades, um ligante ou LM1 é ou compreende
, em que nL é 1 a 8. Em algumas modalidades, um ligante ou −LM1−LM2−LM3− é
, ou uma forma de sal da mesma, em que nL é 1 a 8. Em algumas modalidades, um ligante ou −LM1−LM2−LM3− é
, ou uma forma de sal da mesma, em que: nL é 1 a 8. cada grupo amino se conecta independentemente a uma porção química; e o átomo P se conecta ao 5'-OH do oligonucleotídeo.
Em algumas modalidades, a porção química e o ligante, ou (RD)b−LM1−LM2−LM3−, é ou compreende
. Em algumas modalidades, a porção química e o ligante, ou (RD)b−LM1−LM2−LM3−, é ou compreende
. Em algumas modalidades, a porção química e o ligante, ou (RD)b−LM1−LM2−LM3−, é ou compreende
. Em algumas modalidades, a porção química e o ligante, ou (RD)b−LM1−LM2−LM3−,
é ou compreende . Em algumas modalidades, a porção química e o ligante, ou (RD)b−LM1−LM2−LM3−, é ou compreende
. Em algumas modalidades, a porção química e o ligante, ou (RD)b−LM1−LM2−LM3−, é ou compreende
. Em algumas modalidades, a porção química e o ligante, ou
(RD)b−LM1−LM2−LM3−, é ou compreende
. Em algumas modalidades, o ligante, ou LM1, é ou compreende
. Em algumas modalidades, a porção química e o ligante, ou (RD)b−LM1−LM2−LM3−, é ou compreende: . Em algumas modalidades, a porção química e o ligante, ou (RD)b−LM1−LM2−LM3−,
é ou compreende: .
[001408] Em algumas modalidades, nL é 1 a 8. Em algumas modalidades, nL é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8. Em algumas modalidades, nL é 1. Em algumas modalidades, nL é 2. Em algumas modalidades, nL é 3. Em algumas modalidades, nL é
4. Em algumas modalidades, nL é 5. Em algumas modalidades, nL é 6. Em algumas modalidades, nL é 7. Em algumas modalidades, nL é 8.
[001409] Em algumas modalidades, pelo menos um LM é diretamente ligado a uma unidade de açúcar de um oligonucleotídeo fornecido. Em algumas modalidades, um LM se liga diretamente a uma unidade de açúcar e incorpora uma porção química de lipídio em um oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, um LM se liga diretamente a uma unidade de açúcar e incorpora uma porção química de carboidrato em um oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, um LM se liga diretamente a uma unidade de açúcar e incorpora um grupo RLD em um oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, um LM se liga diretamente a uma unidade de açúcar e incorpora um grupo RCD em um oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, LM é diretamente ligado através de 5'-OH de uma cadeia de oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, LM é diretamente ligado através de 3'-OH de uma cadeia de oligonucleotídeo.
[001410] Em algumas modalidades, pelo menos um LM é diretamente ligado a uma unidade de ligação internucleotídica de um oligonucleotídeo fornecido. Em algumas modalidades, um LM se liga diretamente a uma unidade de ligação internucleotídica e incorpora uma porção química de lipídio em um oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, um LM se liga diretamente a uma unidade de ligação internucleotídica e incorpora uma porção química de carboidrato em um oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, um LM se liga diretamente a uma unidade de ligação internucleotídica e incorpora um grupo RLD em um oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, um LM se liga diretamente a uma unidade de ligação internucleotídica e incorpora um gripo RCD em um oligonucleotídeo.
[001411] Em algumas modalidades, pelo menos um LM é diretamente ligado a uma unidade de nucleobase de um oligonucleotídeo fornecido. Em algumas modalidades, um LM se liga diretamente a uma unidade de nucleobase e incorpora uma porção química de lipídio em um oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, um LM se liga diretamente a uma unidade de nucleobase e incorpora uma porção química de carboidrato em um oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, um LM se liga diretamente a uma unidade de nucleobase e incorpora um grupo RLD em um oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, um LM se liga diretamente a uma unidade de nucleobase e incorpora um grupo RCD em um oligonucleotídeo.
[001412] Em algumas modalidades, LM é bivalente. Em algumas modalidades, LM é multivalente. Em algumas modalidades, LM é
, em que LM é diretamente ligado a uma nucleobase, por exemplo, como em:
. Em algumas modalidades, LM é
. Em algumas modalidades, LM é
. Em algumas modalidades, LM é . Em algumas modalidades, LM é . Em algumas modalidades, uma porção química de ligante, por exemplo, LM, LM1, LM2, LM3, L, Ls, etc., é ou compreende . Em algumas modalidades, uma porção química de ligante, por exemplo, LM, LM1, LM2, LM3, L, Ls, etc., é ou compreende .
[001413] Em algumas modalidades, RD é uma porção química de lipídio. Em algumas modalidades, RD é uma porção química de alvejamento. Em algumas modalidades, RD é uma porção química de carboidrato. Em algumas modalidades, RD é uma porção química de sulfonamida. Em algumas modalidades, RD é um anticorpo ou um fragmento do mesmo. Em algumas modalidades, RD é RLD conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, RD é RCD conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, RD é RTD conforme descrito na presente revelação.
[001414] Em algumas modalidades, uma porção química de lipídio tem a estrutura de RLD. Em algumas modalidades, RLD é C10, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23, C24, ou C25 a C20, C21, C22, C23, C24, C25, C26, C27, C28, C29, C30, C35, C40, C45, C50, C60, C70, ou C80 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, RLD é C10-80 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, RLD é C20-80 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, RLD é C10-70 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, RLD é C20-70 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, RLD é C10-60 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, RLD é C20-60 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, RLD é C10-50 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, RLD é C20-50 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, RLD é C10-40 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, RLD é C20-40 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, RLD é C10-30 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, RLD é C20-30 alifático opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, RLD é C10, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23, C24, ou C25 a C20, C21, C22, C23, C24, C25, C26, C27, C28, C29, C30, C35, C40, C45, C50, C60, C70, ou C80 alifático não substituído. Em algumas modalidades, RLD é C10-80 alifático não substituído. Em algumas modalidades, RLD é C20-80 alifático não substituído. Em algumas modalidades, RLD é C10-70 alifático não substituído. Em algumas modalidades, RLD é C20-70 alifático não substituído. Em algumas modalidades, RLD é C10-60 alifático não substituído. Em algumas modalidades, RLD é C20-60 alifático não substituído. Em algumas modalidades, RLD é C10-50 alifático não substituído. Em algumas modalidades, RLD é C20-50 alifático não substituído. Em algumas modalidades, RLD é C10-40 alifático não substituído. Em algumas modalidades, RLD é C20-40 alifático não substituído. Em algumas modalidades, RLD é C10-30 alifático não substituído. Em algumas modalidades, RLD é C20-30 alifático não substituído.
[001415] Em algumas modalidades, RLD não é hidrogênio. Em algumas modalidades, RLD é uma porção química de lipídio. Em algumas modalidades, RLD é uma porção química de alvejamento. Em algumas modalidades, RLD é uma porção química de alvejamento que compreende uma porção química de carboidrato. Em algumas modalidades, RLD é uma porção química de GalNAc.
[001416] Em algumas modalidades, RTD é RLD, em que RLD é independentemente conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, RTD é RCD, em que RCD é independentemente conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, RTD compreende uma porção química de sulfonamida. Em algumas modalidades, um RTD compreende uma porção química de carboidrato. Em algumas modalidades, um RTD compreende uma porção química de GalNAc.
[001417] Em algumas modalidades, RCD é um grupo linear ou ramificado opcionalmente substituído selecionado dentre um grupo alifático C1-30 e um grupo heteroalifático C1-30 tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo, boro e silício, em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por C1-6 alquileno, C1-6 alquenileno, , −C(R')2−, −O−, −S−, −S−S−, −N(R')−, −C(O)−, −C(S)−, −C(NR')−, −C(O)N(R')−, −N(R')C(O)N(R')−, −N(R')C(O)O−, −S(O)−, −S(O)2−, −S(O)2N(R')−, −C(O)S−, −C(O)O−, −P(O)(OR')−, −P(O)(SR')−, −P(O)(R')−, −P(O)(NR')−, −P(S)(OR')−, −P(S)(SR')−, −P(S)(R')−, −P(S)(NR')−, −P(R')−, −P(OR')−, −P(SR')−, −P(NR')−, −P(OR')[B(R')3]−, −OP(O)(OR')O−, −OP(O)(SR')O−, −OP(O)(R')O−, −OP(O)(NR')O−, −OP(OR')O−, −OP(SR')O−, −OP(NR')O−, −OP(R')O−, ou −OP(OR')[B(R')3]O−; e um ou mais átomos de carbono são opcional e independentemente substituídos por CyL.
Em algumas modalidades, RCD é um grupo linear ou ramificado opcionalmente substituído selecionado dentre um grupo alifático C1-30 e um grupo heteroalifático C1-30 tendo 1 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo, boro e silício, em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por C1-6 alquileno, C1-6 alquenileno, , −C(R')2−, −O−, −S−, −S−S−, −N(R')−, −C(O)−, −C(S)−, −C(NR')−, −C(O)N(R')−, −N(R')C(O)N(R')−, −N(R')C(O)O−, −S(O)−, −S(O)2−, −S(O)2N(R')−, −C(O)S−, −C(O)O−, −P(O)(OR')−, −P(O)(SR')−, −P(O)(R')−, −P(O)(NR')−, −P(S)(OR')−, −P(S)(SR')−, −P(S)(R')−, −P(S)(NR')−, −P(R')−, −P(OR')−, −P(SR')−, −P(NR')−, −P(OR')[B(R')3]−, −OP(O)(OR')O−, −OP(O)(SR')O−, −OP(O)(R')O−, −OP(O)(NR')O−, −OP(OR')O−, −OP(SR')O−, −OP(NR')O−, −OP(R')O−, ou −OP(OR')[B(R')3]O−; e um ou mais átomos de carbono são independentemente substituídos por uma porção química de monossacarídeo, dissacarídeo ou polissacarídeo.
Em algumas modalidades, RCD é um grupo linear ou ramificado opcionalmente substituído selecionado dentre um grupo alifático C1-30 e um grupo heteroalifático C1-30 tendo 1 a
10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo, boro e silício, em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por C1-6 alquileno, C1-6 alquenileno, , −C(R')2−, −O−, −S−, −S−S−, −N(R')−, −C(O)−, −C(S)−, −C(NR')−, −C(O)N(R')−, −N(R')C(O)N(R')−, −N(R')C(O)O−, −S(O)−, −S(O)2−, −S(O)2N(R')−, −C(O)S−, −C(O)O−, −P(O)(OR')−, −P(O)(SR')−, −P(O)(R')−, −P(O)(NR')−, −P(S)(OR')−, −P(S)(SR')−, −P(S)(R')−, −P(S)(NR')−, −P(R')−, −P(OR')−, −P(SR')−, −P(NR')−, −P(OR')[B(R')3]−, −OP(O)(OR')O−, −OP(O)(SR')O−, −OP(O)(R')O−, −OP(O)(NR')O−, −OP(OR')O−, −OP(SR')O−, −OP(NR')O−, −OP(R')O−, ou −OP(OR')[B(R')3]O−; e um ou mais átomos de carbono são independentemente substituídos por uma porção química de GalNac.
[001418] Em algumas modalidades, cada RD é independentemente uma porção química conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, RD é uma porção química adicional. Em algumas modalidades, RD é a porção química de alvejamento. Em algumas modalidades, RD é ou compreende uma porção química de carboidrato. Em algumas modalidades, RD é ou compreende uma porção química de lipídio. Em algumas modalidades, RD é ou compreende uma porção química de aglutinante para, por exemplo, receptores celulares, tal como um receptor sigma, um receptor de asialoglicoproteina, etc. Em algumas modalidades, uma porção química de aglutinante é ou compreende uma porção química de anisamida, que pode ser uma porção química de aglutinante para um receptor sigma. Em algumas modalidades, uma porção química de aglutinante é ou compreende um lipídio. Em algumas modalidades, uma porção química de aglutinante é ou compreende uma porção química de
GalNAc, que pode ser uma porção química de aglutinante para um receptor de asialoglicoproteína.
Em algumas modalidades, RD é selecionado dentre fenila opcionalmente substituída,
, , ,
, e , em que n' é 0 ou 1, e cada outra variável é independentemente conforme descrito na presente revelação.
Em algumas modalidades, Rs é F.
Em algumas modalidades, Rs é OMe.
Em algumas modalidades, Rs é OH.
Em algumas modalidades, Rs é NHAc.
Em algumas modalidades, Rs é NHCOCF3. Em algumas modalidades, R' é H.
Em algumas modalidades, R é H.
Em algumas modalidades, R2s é NHAc, e R5s é OH.
Em algumas modalidades, R2s é p-anisoíla, e R5s é OH.
Em algumas modalidades, R2s é NHAc e R5s é p-anisoíla.
Em algumas modalidades, R2s é OH, e R5s é p- anisoíla.
Em algumas modalidades, RD é selecionado dentre
, , ,
, , ,
, , ,
, ,
, ,
, e . As modalidades adicionais de RDincluem modalidades de porção química adicionais, por exemplo, aquelas descritas nos exemplos.
[001419] Em algumas modalidades, RD, RLD ou RTD é ou compreende . Em algumas modalidades, RD, RLD ou RTD é ou compreende . Em algumas modalidades, RD, RLD ou RTD é ou compreende . Em algumas modalidades, RD, RLD ou RTD é ou compreende . Em algumas modalidades, RD, RLD, RCD ou RTD é ou compreende . Em algumas modalidades, RD, RLD, ou RTD é ou compreende
. Em algumas modalidades, RD, RLD, RCD ou RTD é ou compreende −N(R1)2, em que cada R1 é independentemente conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, RD, RLD, RCD ou RTD é ou compreende −N(R1)3, em que cada R1 é independentemente conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, RD, RLD, RCD ou RTD é ou compreende uma ou mais porções químicas de guanidina. Em algumas modalidades, RD, RLD, RCD ou RTD é ou compreende −N=C(N(R1)2), em que cada R1 é independentemente conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, RD ou
N RTD é ou compreende OH O . Em algumas modalidades, RD, RLD ou RTD é ou compreende . Em algumas modalidades, RD ou RTD é ou compreende
. Em algumas modalidades, RD ou RTD é ou compreende
. Em algumas modalidades, RD, RCD, ou RTD é ou compreende
. Em algumas modalidades, RD, RLD, ou RTD é ou compreende
. Em algumas modalidades, RD, RCD, ou RTD é ou compreende
. Em algumas modalidades, RD, RLD, ou RTD é ou compreende
. Em algumas modalidades, RD ou
RTD é ou compreende . Em algumas modalidades, RD ou RTD é ou compreende
. Em algumas modalidades, RD ou RTD é ou compreende
. Em algumas modalidades, RD ou RTD é ou compreende
. Em algumas modalidades, RD ou RTD é ou compreende
. Em algumas modalidades, RD ou RTD é ou compreende
. Em algumas modalidades, RD, RCD, ou RTD é ou compreende
OH OH HO O HO H O N HN O OH OH O HO O O HO O O O O HN N H O N OH H OH O O HO O HO O HN HN
O O . Em algumas modalidades, RD, RCD, ou RTD é ou compreende . Em algumas modalidades, RD, RCD, ou RTD é ou compreende
. Em algumas modalidades, RD, RLD, RCD ou RTD compreende . Em algumas modalidades, RD, RLD, RCD ou RTD compreende .
[001420] Em algumas modalidades, n' é 1. Em algumas modalidades, n' é 0.
[001421] Em algumas modalidades, n" é 1. Em algumas modalidades, n" é 2. Em algumas modalidades, uma porção química da presente revelação, por exemplo, um anel heteroalifático, heteroarila, heterociclila, etc., pode conter um um ou mais heteroátomos. Em algumas modalidades, um heteroátomo é qualquer átomo que não seja carbono e não seja hidrogênio. Em algumas modalidades, cada heteroátomo é independentemente selecionado dentre boro, nitrogênio, oxigênio, enxofre,
silício e fósforo. Em algumas modalidades, cada heteroátomo é independentemente selecionado dentre nitrogênio, oxigênio, enxofre, silício e fósforo. Em algumas modalidades, cada heteroátomo é independentemente selecionado dentre boro, nitrogênio, oxigênio, enxofre e fósforo. Em algumas modalidades, cada heteroátomo é independentemente selecionado dentre boro, nitrogênio, oxigênio, enxofre e silício. Em algumas modalidades, cada heteroátomo é independentemente selecionado dentre nitrogênio, oxigênio, e enxofre. Em algumas modalidades, pelo menos um heteroátomo é nitrogênio. Em algumas modalidades, pelo menos um heteroátomo é oxigênio. Em algumas modalidades, pelo menos um heteroátomo é enxofre.
[001422] Em algumas modalidades, y, t, n e m, por exemplo, em um padrão de estereoquímica são, cada um, independentemente 1 a 20 conforme descrito na presente revelação. Em algumas modalidades, y é 1. Em algumas modalidades, y é pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15. Em algumas modalidades, y é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15. Em algumas modalidades, y é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Em algumas modalidades, y é 1. Em algumas modalidades, y é 2. Em algumas modalidades, y é 3. Em algumas modalidades, y é 4. Em algumas modalidades, y é 5. Em algumas modalidades, y é 6. Em algumas modalidades, y é 7. Em algumas modalidades, y é 8. Em algumas modalidades, y é 9. Em algumas modalidades, y é 10.
[001423] Em algumas modalidades, n é 1. Em algumas modalidades, n é pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15. Em algumas modalidades, n é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ou 15. Em algumas modalidades, n é 1 a 10. Em algumas modalidades, n é 1, 2, 3,
4, 5, 6, 7 ou 8. Em algumas modalidades, n é 1. Em algumas modalidades, n é 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8. Em algumas modalidades, n é 3, 4, 5, 6, 7 ou 8. Em algumas modalidades, n é 4, 5, 6, 7 ou 8. Em algumas modalidades, n é 5, 6, 7 ou 8. Em algumas modalidades, n é 6, 7 ou 8. Em algumas modalidades, n é 7 ou
8. Em algumas modalidades, n é 1. Em algumas modalidades, n é
2. Em algumas modalidades, n é 3. Em algumas modalidades, n é
4. Em algumas modalidades, n é 5. Em algumas modalidades, n é
6. Em algumas modalidades, n é 7. Em algumas modalidades, n é
8. Em algumas modalidades, n é 9. Em algumas modalidades, n é
10.
[001424] Em algumas modalidades, m é 0 a 50. Em algumas modalidades, m é 1 a 50. Em algumas modalidades, m é 1. Em algumas modalidades, m é 2 a 50. Em algumas modalidades, m é pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ou
15. Em algumas modalidades, m é 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8. Em algumas modalidades, m é 3, 4, 5, 6, 7 ou 8. Em algumas modalidades, m é 4, 5, 6, 7 ou 8. Em algumas modalidades, m é 5, 6, 7 ou 8. Em algumas modalidades, m é 6, 7 ou 8. Em algumas modalidades, m é 7 ou 8. Em algumas modalidades, m é 0. Em algumas modalidades, m é 1. Em algumas modalidades, m é 2. Em algumas modalidades, m é 3. Em algumas modalidades, m é 4. Em algumas modalidades, m é 5. Em algumas modalidades, m é 6. Em algumas modalidades, m é 7. Em algumas modalidades, m é 8. Em algumas modalidades, m é 9. Em algumas modalidades, m é 10. Em algumas modalidades, m é 11. Em algumas modalidades, m é 12. Em algumas modalidades, m é 13. Em algumas modalidades, m é
14. Em algumas modalidades, m é 15. Em algumas modalidades, m é 16. Em algumas modalidades, m é 17. Em algumas modalidades, m é 18. Em algumas modalidades, m é 19. Em algumas modalidades,
m é 20. Em algumas modalidades, m é 21. Em algumas modalidades, m é 22. Em algumas modalidades, m é 23. Em algumas modalidades, m é 24. Em algumas modalidades, m é 25. Em algumas modalidades, m é pelo menos 2. Em algumas modalidades, m é pelo menos 3. Em algumas modalidades, m é pelo menos 4. Em algumas modalidades, m é pelo menos 5. Em algumas modalidades, m é pelo menos 6. Em algumas modalidades, m é pelo menos 7. Em algumas modalidades, m é pelo menos 8. Em algumas modalidades, m é pelo menos 9. Em algumas modalidades, m é pelo menos 10. Em algumas modalidades, m é pelo menos 11. Em algumas modalidades, m é pelo menos 12. Em algumas modalidades, m é pelo menos 13. Em algumas modalidades, m é pelo menos 14. Em algumas modalidades, m é pelo menos 15. Em algumas modalidades, m é pelo menos 16. Em algumas modalidades, m é pelo menos 17. Em algumas modalidades, m é pelo menos 18. Em algumas modalidades, m é pelo menos 19. Em algumas modalidades, m é pelo menos 20. Em algumas modalidades, m é pelo menos 21. Em algumas modalidades, m é pelo menos 22. Em algumas modalidades, m é pelo menos 23. Em algumas modalidades, m é pelo menos 24. Em algumas modalidades, m é pelo menos 25. Em algumas modalidades, m é pelo menos maior que 25.
[001425] Em algumas modalidades, t é 1 a 20. Em algumas modalidades, t é 1. Em algumas modalidades, t é pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ou 15. Em algumas modalidades, t é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ou 15. Em algumas modalidades, t é 1 a 5. Em algumas modalidades, t é 2. Em algumas modalidades, t é 3. Em algumas modalidades, t é 4. Em algumas modalidades, t é 5. Em algumas modalidades, t é 6. Em algumas modalidades, t é 7. Em algumas modalidades, t é 8. Em algumas modalidades, t é 9. Em algumas modalidades, t é 10. Em algumas modalidades, t é 11. Em algumas modalidades, t é 12. Em algumas modalidades, t é
13. Em algumas modalidades, t é 14. Em algumas modalidades, t é 15. Em algumas modalidades, t é 16. Em algumas modalidades, t é 17. Em algumas modalidades, t é 18. Em algumas modalidades, t é 19. Em algumas modalidades, t é 20.
[001426] Em algumas modalidades, cada um dentre t e m é independentemente pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ou 15. Em algumas modalidades, cada um dentre t e m é independentemente pelo menos 3. Em algumas modalidades, cada um dentre t e m é independentemente pelo menos 4. Em algumas modalidades, cada um dentre t e m é independentemente pelo menos 5. Em algumas modalidades, cada um dentre t e m é independentemente pelo menos 6. Em algumas modalidades, cada um dentre t e m é independentemente pelo menos 7. Em algumas modalidades, cada um dentre t e m é independentemente pelo menos 8. Em algumas modalidades, cada um dentre t e m é independentemente pelo menos 9. Em algumas modalidades, cada um dentre t e m é independentemente pelo menos 10.
[001427] Conforme usado na presente revelação, em algumas modalidades, "um ou mais" consiste em 1 a 200, 1 a 150, 1 a 100, 1 a 90, 1 a 80, 1 a 70, 1 a 60, 1 a 50, 1 a 40, 1 a 30, ou 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25. Em algumas modalidades, "um ou mais" consiste em um. Em algumas modalidades, "um ou mais" consiste em dois. Em algumas modalidades, "um ou mais" consiste em três. Em algumas modalidades, "um ou mais" consiste em quatro. Em algumas modalidades, "um ou mais" consiste em cinco. Em algumas modalidades, "um ou mais" consiste em seis.
Em algumas modalidades, "um ou mais" consiste em sete.
Em algumas modalidades, "um ou mais" consiste em oito.
Em algumas modalidades, "um ou mais" consiste em nove.
Em algumas modalidades, "um ou mais" consiste em dez.
Em algumas modalidades, "um ou mais" consiste em pelo menos um.
Em algumas modalidades, "um ou mais" consiste em pelo menos dois.
Em algumas modalidades, "um ou mais" consiste em pelo menos três.
Em algumas modalidades, "um ou mais" consiste em pelo menos quatro.
Em algumas modalidades, "um ou mais" consiste em pelo menos cinco.
Em algumas modalidades, "um ou mais" consiste em pelo menos seis.
Em algumas modalidades, "um ou mais" consiste em pelo menos sete.
Em algumas modalidades, "um ou mais" consiste em pelo menos oito.
Em algumas modalidades, "um ou mais" consiste em pelo menos nove.
Em algumas modalidades, "um ou mais" consiste em pelo menos dez.
Conforme usado na presente revelação, em algumas modalidades, "pelo menos um" consiste em 1 a 200, 1 a 150, 1 a 100, 1 a 90, 1 a 80, 1 a 70, 1 a 60, 1 a 50, 1 a 40, 1 a 30, ou 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25. Em algumas modalidades, “pelo menos um” consiste em um.
Em algumas modalidades, "pelo menos um" consiste em dois.
Em algumas modalidades, "pelo menos um" consiste em três.
Em algumas modalidades, "pelo menos um" consiste em quatro.
Em algumas modalidades, "pelo menos um" consiste em cinco.
Em algumas modalidades, "pelo menos um" consiste em seis.
Em algumas modalidades, "pelo menos um" consiste em sete.
Em algumas modalidades, "pelo menos um" consiste em oito.
Em algumas modalidades, "pelo menos um" consiste em nove.
Em algumas modalidades, "pelo menos um” consiste em dez.
[001428] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece as seguintes modalidades:
1. Uma composição de oligonucleotídeo, que compreende uma pluralidade de oligonucleotídeos de um tipo de oligonucleotídeo particular definido por: 1) sequência de base; 2) padrão de ligações de cadeia principal; 3) padrão de centros quirais de cadeia principal; e 4) padrão de modificações de fósforo de cadeia principal, em que: os oligonucleotídeos da pluralidade compreendem pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 ligações internucleotídicas quiralmente controladas; e os oligonucleotídeos da pluralidade compreendem pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 ligações internucleotídicas não negativamente carregadas.
2. A composição de oligonucleotídeo, de acordo com a modalidade 1, em que a composição de oligonucleotídeo é caracterizada pelo fato de que, quando entra em contato com uma transcrição em um sistema de splicing de transcrição, o splicing da transcrição é alterado em relação àquele observado sob a condição de referência selecionada dentre o grupo que consiste na ausência da composição, presença de uma composição de referência, e combinações dos mesmos.
3. Uma composição de oligonucleotídeo, que compreende uma pluralidade de oligonucleotídeos de um tipo de oligonucleotídeo particular definido por:
1) sequência de base; 2) padrão de ligações de cadeia principal; 3) padrão de centros quirais de cadeia principal; e 4) padrão de modificações de fósforo de cadeia principal, em que: os oligonucleotídeos da pluralidade compreendem pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 ligações internucleotídicas quiralmente controladas; e sendo que a composição de oligonucleotídeo é caracterizada pelo fato de que, quando entra em contato com uma transcrição em um sistema de splicing de transcrição, o splicing da transcrição é alterado em relação àquele observado sob a condição de referência selecionada dentre o grupo que consiste na ausência da composição, presença de uma composição de referência, e combinações dos mesmos.
4. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada ligação internucleotídica quiral dos oligonucleotídeos da pluralidade é independentemente uma ligação internucleotídica quiralmente controlada.
5. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada ligação internucleotídica quiral modificada tem independentemente uma estereopureza de pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% em seu fósforo de ligação quiral.
6. Uma composição que compreende uma pluralidade de oligonucleotídeos de um tipo de oligonucleotídeo particular definido por:
1) sequência de base; 2) padrão de ligações de cadeia principal; 3) padrão de centros quirais de cadeia principal; e 4) padrão de modificações de fósforo de cadeia principal, cuja composição é quiralmente controlada e é enriquecida, em relação a uma preparação substancialmente racêmica de oligonucleotídeos tendo a mesma sequência de base, padrão de ligações de cadeia principal e padrão de modificações de fósforo de cadeia principal, para oligonucleotídeos do tipo de oligonucleotídeo particular, em que: a composição de oligonucleotídeo é caracterizada pelo fato de que, quando entra em contato com uma transcrição em um sistema de splicing de transcrição, o splicing da transcrição é alterado pelo fato de que o nível de inclusão de uma sequência de ácidos nucleicos é aumentado em relação àquele observado sob uma condição de referência selecionada dentre o grupo que consiste na ausência da composição, presença de uma composição de referência, e combinações dos mesmos.
7. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o padrão de centros quirais de cadeia principal compreende pelo menos um Sp.
8. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o padrão de centros quirais de cadeia principal compreende pelo menos um Rp.
9. Uma composição que compreende uma pluralidade de oligonucleotídeos de um tipo de oligonucleotídeo particular definido por: 1) sequência de base; 2) padrão de ligações de cadeia principal; e
3) padrão de modificações de fósforo de cadeia principal, em que: os oligonucleotídeos da pluralidade compreendem pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 ligações internucleotídicas não negativamente carregadas; a composição de oligonucleotídeo é caracterizada pelo fato de que, quando entra em contato com uma transcrição em um sistema de splicing de transcrição, o splicing da transcrição é alterado pelo fato de que o nível de inclusão de uma sequência de ácidos nucleicos é aumentado em relação àquele observado sob uma condição de referência selecionada dentre o grupo que consiste na ausência da composição, presença de uma composição de referência, e combinações dos mesmos.
10. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada ligação internucleotídica não negativamente carregada é independentemente uma ligação internucleotídica, pelo menos 50% da qual existe em sua forma não negativamente carregada a pH 7,4.
11. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada ligação internucleotídica não negativamente carregada é independentemente uma ligação internucleotídica neutra, em que pelo menos 50% da ligação internucleotídica existe em sua forma neutra a pH 7,4.
12. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a forma neutra de cada ligação internucleotídica não negativamente carregada tem independentemente uma pKa não inferior a 8, 9, 10, 11, 12, 13, ou 14.
13. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a forma neutra de cada ligação internucleotídica não negativamente carregada, quando as unidades às quais a mesma se conecta são substituídas por −CH3, tem independentemente uma pKa não inferior a 8, 9, 10, 11, 12, 13, ou 14.
14. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a condição de referência é a ausência da composição.
15. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a condição de referência é a presença de uma composição de referência.
16. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a composição de referência é uma composição de outro modo idêntica, em que os oligonucleotídeos da pluralidade não compreendem ligações internucleotídicas quiralmente controladas.
17. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a composição de referência é uma composição de outro modo idêntica, em que os oligonucleotídeos da pluralidade não compreendem ligações internucleotídicas não negativamente carregadas.
18. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o padrão de ligações de cadeia principal compreende uma ou mais ligações de cadeia principal selecionadas dentre ligações fosfodiéster, fosforotioato e fosfoditioato.
19. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos da pluralidade, cada um, compreendem uma ou mais modificações de açúcar.
20. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que as modificações de açúcar compreendem uma ou mais modificações selecionadas dentre: porções químicas de 2'-O-metila, 2'-MOE, 2'-F, morfolino e açúcar bicíclico.
21. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma ou mais modificações de açúcar são modificações 2'-F.
22. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos da pluralidade, cada um, compreendem uma região de extremidade 5' que compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais unidades de nucleosídeo que compreendem uma porção química de açúcar modificada 2'-F.
23. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos da pluralidade, cada um, compreendem uma região de extremidade 3' que compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais unidades de nucleosídeo que compreendem uma porção química de açúcar modificada 2'-F.
24. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos da pluralidade, cada um, compreendem uma região intermediária entre a região de extremidade 5' e a região 3’ que compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais unidades nucleotídicas que compreendem uma ligação fosfodiéster.
25. Uma composição que compreende uma pluralidade de oligonucleotídeos de um tipo de oligonucleotídeo particular definido por:
1) sequência de base; 2) padrão de ligações de cadeia principal; e 3) padrão de modificações de fósforo de cadeia principal, em que: os oligonucleotídeos da pluralidade compreendem: 1) uma região de extremidade 5' que compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais unidades de nucleosídeo que compreendem uma porção química de açúcar modificada 2'-F; 2) uma região de extremidade 3' que compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais unidades de nucleosídeo que compreendem uma porção química de açúcar modificada 2'-F; e 3) uma região intermediária entre a região de extremidade 5' e a região 3' que compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais unidades nucleotídicas que compreendem uma ligação fosfodiéster.
26. A composição, de acordo com a modalidade 25, em que a composição de oligonucleotídeo é caracterizada pelo fato de que, quando entra em contato com uma transcrição em um sistema de splicing de transcrição, o splicing da transcrição é alterado pelo fato de que o nível de inclusão de uma sequência de ácidos nucleicos é aumentado em relação àquele observado sob uma condição de referência selecionada dentre o grupo que consiste na ausência da composição, presença de uma composição de referência, e combinações dos mesmos.
27. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a região de extremidade 5' compreende 1 ou mais unidades de nucleosídeo que não compreendem uma porção química de açúcar modificada 2'-F.
28. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a região de extremidade 3' compreende 1 ou mais unidades de nucleosídeo que não compreendem uma porção química de açúcar modificada 2'-F.
29. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a região intermediária compreende 1 ou mais unidades nucleotídicas que não compreendem ligação fosfodiéster.
30. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a primeira dentre a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais unidades de nucleosídeo que compreendem uma porção química de açúcar modificada 2'-F e uma ligação internucleotídica modificada da extremidade 5' é a primeira, segunda, terceira, quarta ou quinta unidade de nucleosídeo do oligonucleotídeo a partir da extremidade 5', e a última dentre a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais unidades de nucleosídeo que compreendem uma porção química de açúcar modificada 2'-F e uma ligação internucleotídica modificada da extremidade 3' é a última, segunda, terceira, quarta ou quinta unidade de nucleosídeo do oligonucleotídeo.
31. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a região de extremidade 5' compreende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais unidades de nucleosídeo consecutivas que compreendem uma porção química de açúcar modificada 2'-F.
32. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a região de extremidade 5' compreende 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais unidades de nucleosídeo consecutivas que compreendem a porção química de açúcar modificada 2'-F.
33. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a região de extremidade 3' compreende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais unidades de nucleosídeo consecutivas que compreendem uma porção química de açúcar modificada 2'-F.
34. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a região de extremidade 3' compreende 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais unidades de nucleosídeo consecutivas que compreendem a porção química de açúcar modificada 2'-F.
35. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada ligação internucleotídica entre duas unidades de nucleosídeo que compreendem uma porção química de açúcar modificada 2'-F na região de extremidade 5' é independentemente uma ligação internucleotídica modificada.
36. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada ligação internucleotídica entre duas unidades de nucleosídeo que compreendem uma porção química de açúcar modificada 2'-F na região de extremidade 3' é independentemente uma ligação internucleotídica modificada.
37. A composição, de acordo com a modalidade 35 ou 36, em que cada ligação internucleotídica modificada é independentemente uma ligação internucleotídica quiral.
38. A composição, de acordo com a modalidade 35 ou 36, em que cada ligação internucleotídica modificada é independentemente uma ligação internucleotídica quiralmente controlada.
39. A composição, de acordo com a modalidade 35 ou 36, em que cada ligação internucleotídica modificada é uma ligação internucleotídica fosforotioato.
40. A composição, de acordo com a modalidade 35 ou
36, em que cada ligação internucleotídica modificada é uma ligação internucleotídica fosforotioato quiralmente controlada.
41. A composição, de acordo com a modalidade 35 ou 36, em que cada ligação internucleotídica modificada é uma ligação internucleotídica fosforotioato quiralmente controlada Sp.
42. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a região intermediária compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais ligações fosfato naturais.
43. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a região intermediária compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais ligações fosfato naturais cada independentemente entre uma unidade de nucleosídeo que compreende uma porção química de açúcar modificada 2'−OR1 e uma unidade de nucleosídeo que compreende uma porção química de açúcar modificada 2'−F, ou entre duas unidades de nucleosídeo, cada um, compreendendo independentemente uma porção química de açúcar de modificada 2'−OR1, em que R1 é C1-6 alquila opcionalmente substituída.
44. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a região intermediária compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais ligações internucleotídicas não negativamente carregadas.
45. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a região intermediária compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais ligações internucleotídicas não negativamente carregadas, cada uma, independentemente entre uma unidade de nucleosídeo que compreende uma porção química de açúcar modificada 2'−OR1e uma unidade de nucleosídeo que compreende uma porção química de açúcar modificada 2'−F, ou entre duas unidades de nucleosídeo, cada uma, compreendendo independentemente uma porção química de açúcar modificada 2'−OR1, em que R1 é C1-6 alquila opcionalmente substituída.
46. A composição, de acordo com a modalidade 43 ou 45, em que 2'−OR1 é 2'−OCH3.
47. A composição, de acordo com a modalidade 43 ou 45, em que 2'−OR1 é 2'−OCH2CH2OCH3.
48. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a região de extremidade 5' compreende pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 ligações internucleotídicas modificadas quirais.
49. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a região de extremidade 5' compreende pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 ligações internucleotídicas modificadas quirais consecutivas.
50. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada ligação internucleotídica na região de extremidade 5' é uma ligação internucleotídica quiral modificada.
51. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a região de extremidade 3' compreende pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 ligações internucleotídicas modificadas quirais.
52. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a região de extremidade 3' compreende pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 ligações internucleotídicas modificadas quirais consecutivas.
53. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada ligação internucleotídica na região de extremidade 3' é uma ligação internucleotídica quiral modificada.
54. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a região intermediária compreende pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 ligações internucleotídicas modificadas quirais.
55. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a região intermediária compreende pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 ligações internucleotídicas modificadas quirais consecutivas.
56. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades 48 a 55, em que cada ligação internucleotídica quiral modificada é independentemente uma ligação internucleotídica quiralmente controlada.
57. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades 48 a 55, em que cada ligação internucleotídica quiral modificada é independentemente uma ligação internucleotídica quiralmente controlada em que seu fósforo de ligação quiralmente controlado tem uma configuração Sp.
58. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades 48 a 57, em que cada ligação internucleotídica quiral modificada é independentemente uma ligação internucleotídica fosforotioato quiralmente controlada.
59. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a região intermediária compreende pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 ligações internucleotídicas não negativamente carregadas.
60. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a região intermediária compreende pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 ligações internucleotídicas neutras.
61. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma ligação internucleotídica neutra é uma ligação internucleotídica quiral.
62. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma ligação internucleotídica neutra é uma ligação internucleotídica quiralmente controlada independentemente de Rp ou Sp em seu fósforo de ligação.
63. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a sequência de base compreende uma sequência que não tem mais de 5 disparidades a partir de uma porção com 20 bases de comprimento do gene da distrofina ou seu complemento.
64. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o comprimento da sequência de base dos oligonucleotídeos da pluralidade não é superior a 50 bases.
65. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o padrão de centros quirais de cadeia principal compreende pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 centros quiralmente controlados independentemente de Rp ou Sp.
66. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o padrão de centros quirais de cadeia principal compreende pelo menos 5 centros quiralmente controlados independentemente de Rp ou Sp.
67. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o padrão de centros quirais de cadeia principal compreende pelo menos 6 centros quiralmente controlados independentemente de Rp ou Sp.
68. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o padrão de centros quirais de cadeia principal compreende pelo menos 10 centros quiralmente controlados independentemente de Rp ou Sp.
69. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos do tipo de oligonucleotídeo particular têm capacidade para mediar o salto de um ou mais éxons do gene da distrofina.
70. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos do tipo de oligonucleotídeo particular têm capacidade para mediar o salto do éxon 45, 51 ou 53 do gene da distrofina.
71. A composição, de acordo com a modalidade 70, em que os oligonucleotídeos do tipo de oligonucleotídeo particular têm capacidade para mediar o salto do éxon 45 do gene da distrofina.
72. A composição, de acordo com a modalidade 70, em que os oligonucleotídeos do tipo de oligonucleotídeo particular têm capacidade para mediar o salto do éxon 51 do gene da distrofina.
73. A composição, de acordo com a modalidade 70, em que os oligonucleotídeos do tipo de oligonucleotídeo particular têm capacidade para mediar o salto do éxon 53 do gene da distrofina.
74. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a composição fornece salto de éxon de dois ou mais éxons.
75. A composição, de acordo com a modalidade 71, em que a sequência de base compreende uma sequência que não tem mais de 5 disparidades a partir de uma sequência da Tabela A1.
76. A composição, de acordo com a modalidade 71, em que a sequência de base compreende ou é uma sequência da Tabela A1.
77. A composição, de acordo com a modalidade 71, em que a sequência de base é uma sequência da Tabela A1.
78. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos da pluralidade são oligonucleotídeos de um oligonucleotídeo selecionado dentre a Tabela A1.
79. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos compreendem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais ligações internucleotídicas não negativamente carregadas.
80. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos compreendem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais ligações internucleotídicas não negativamente carregadas quiralmente controladas.
81. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos compreendem 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais ligações internucleotídicas não negativamente carregadas consecutivas.
82. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos compreendem 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais ligações internucleotídicas não negativamente carregadas quiralmente controladas consecutivas.
83. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos compreendem uma estrutura de flanco-núcleo-flanco, núcleo- flanco ou flanco-núcleo.
84. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que um flanco compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais ligações internucleotídicas não negativamente carregadas.
85. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos compreendem uma estrutura de flanco-núcleo-flanco, núcleo- flanco ou flanco-núcleo, e em que um flanco compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais ligações internucleotídicas não negativamente carregadas quiralmente controladas.
86. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos compreendem uma estrutura de flanco-núcleo-flanco, núcleo- flanco ou flanco-núcleo, e em que um flanco compreende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais ligações internucleotídicas não negativamente carregadas consecutivas.
87. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos compreendem uma estrutura de flanco-núcleo-flanco, núcleo- flanco ou flanco-núcleo, e em que um flanco compreende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais ligações internucleotídicas não negativamente carregadas quiralmente controladas consecutivas.
88. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos compreendem ou consistem em uma estrutura de flanco-núcleo- flanco, e em que apenas um flanco compreende uma ou mais ligações internucleotídicas não negativamente carregadas.
89. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos compreendem uma estrutura de flanco-núcleo-flanco, núcleo- flanco ou flanco-núcleo, e em que um núcleo compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais ligações internucleotídicas não negativamente carregadas.
90. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos compreendem uma estrutura de flanco-núcleo-flanco, núcleo- flanco ou flanco-núcleo, e em que um núcleo compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais ligações internucleotídicas não negativamente carregadas quiralmente controladas.
91. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos compreendem uma estrutura de flanco-núcleo-flanco, núcleo- flanco ou flanco-núcleo, e em que um núcleo compreende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais ligações internucleotídicas não negativamente carregadas consecutivas.
92. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos compreendem uma estrutura de flanco-núcleo-flanco, núcleo- flanco ou flanco-núcleo, e em que um núcleo compreende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais ligações internucleotídicas não negativamente carregadas quiralmente controladas consecutivas.
93. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 100% das ligações internucleotídicas de um flanco é independentemente uma ligação internucleotídica não negativamente carregada, uma ligação internucleotídica fosfato natural ou uma ligação internucleotídica quiral Rp.
94. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 100% das ligações internucleotídicas de um flanco é independentemente uma ligação internucleotídica não negativamente carregada ou uma ligação internucleotídica fosfato natural.
95. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 100% das ligações internucleotídicas de um flanco é independentemente uma ligação internucleotídica não negativamente carregada.
96. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades 93 a 95, em que a porcentagem é 50% ou mais.
97. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades 93 a 95, em que a porcentagem é 60% ou mais.
98. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades 93 a 95, em que a porcentagem é 75% ou mais.
99. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades 93 a 95, em que a porcentagem é 80% ou mais.
100. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades 93 a 95, em que a porcentagem é 90% ou mais.
101. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos compreendem, cada um, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada e uma ligação internucleotídica fosfato natural.
102. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos compreendem, cada um, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada, uma ligação internucleotídica fosfato natural e uma ligação internucleotídica quiral Rp.
103. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que um flanco compreende uma ligação internucleotídica não negativamente carregada e uma ligação internucleotídica fosfato natural.
104. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que um flanco compreende uma ligação internucleotídica não negativamente carregada, uma ligação internucleotídica fosfato natural e uma ligação internucleotídica quiral Rp.
105. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que um núcleo compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais ligações internucleotídicas não negativamente carregadas.
106. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que todas as ligações internucleotídicas não negativamente carregadas do mesmo oligonucleotídeo têm a mesma constituição.
107. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada das ligações internucleotídicas não negativamente carregadas tem independentemente a estrutura da fórmula II, II-a-1, II-a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, II-d-2, ou uma forma de sal da mesma.
108. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada das ligações internucleotídicas não negativamente carregadas tem independentemente a estrutura da fórmula II, II-a-1, II-a-2,
II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, II-d-2, ou uma forma de sal da mesma.
109. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o padrão de ligações de cadeia principal compreende pelo menos uma ligação internucleotídica não negativamente carregada que é uma ligação internucleotídica neutra.
110. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos do tipo particular são estruturalmente idênticos.
111. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada dos oligonucleotídeos compreende uma porção química conjugada à cadeia de oligonucleotídeo do oligonucleotídeo opcionalmente através de uma porção química de ligante, em que a porção química compreende uma porção química de carboidrato, uma porção química de peptídeo, uma porção química de aglutinante receptor ou uma porção química que tem a estrutura de −N(R1)2, −N(R1)3, ou −N=C(N(R1)2)2.
112. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada dos oligonucleotídeos compreende uma porção química conjugada à cadeia de oligonucleotídeo do oligonucleotídeo opcionalmente através de uma porção química de ligante, em que a porção química compreende uma porção química de guanidina.
113. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada dos oligonucleotídeos compreende uma porção química conjugada à cadeia de oligonucleotídeo do oligonucleotídeo opcionalmente através de uma porção química de ligante, em que a porção química compreende −N=C(N(CH3)2)2.
114. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que pelo menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, ou 90% dos oligonucleotídeos na composição que têm a mesma constituição que os oligonucleotídeos do tipo de oligonucleotídeo particular são oligonucleotídeos do tipo de oligonucleotídeo particular.
115. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que pelo menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, ou 90% dos oligonucleotídeos na composição que têm a sequência de base, padrão de ligações de cadeia principal, e padrão de modificações de fósforo de cadeia principal do tipo de oligonucleotídeo particular são oligonucleotídeos do tipo de oligonucleotídeo particular.
116. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que pelo menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, ou 90% dos oligonucleotídeos na composição que têm a sequência de base do tipo de oligonucleotídeo particular são oligonucleotídeos do tipo de oligonucleotídeo particular.
117. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades 114 a 116, em que a porcentagem é pelo menos 10%.
118. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades 114 a 116, em que a porcentagem é pelo menos 50%.
119. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades 114 a 116, em que a porcentagem é pelo menos 80%.
120. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades 114 a 116, em que a porcentagem é pelo menos 90%.
121. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma ligação internucleotídica não negativamente carregada é uma ligação fosforamidato.
122. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma ligação internucleotídica não negativamente carregada compreende uma porção química de guanidina.
123. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura da fórmula I: ,
I ou uma forma de sal da mesma, em que: PL é P(=W), P, ou P→B(R')3; W é O, N(–L–R5), S ou Se; cada um dentre R1 e R5 é independentemente −H, −L−R', halogênio, −CN, −NO2, −L−Si(R')3, −OR', −SR', ou −N(R')2; cada um dentre X, Y e Z é independentemente –O–, – S–, –N(–L–R5)–, ou L; cada L é independentemente um grupo de ligação covalente, ou bivalente, linear ou ramificado opcionalmente substituído selecionado dentre um grupo alifático C1-30 e um grupo heteroalifático C1-30 tendo 1 a 10 heteroátomos, em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por C1-6 alquileno, C1-6 alquenileno, , um grupo heteroalifático C1–C6 bivalente tendo 1 a 5 heteroátomos, −C(R')2−, −Cy−, −O−, −S−, −S−S−, −N(R')−, −C(O)−, −C(S)−, −C(NR')−, −C(O)N(R')−, −N(R')C(O)N(R')−, −N(R')C(O)O−, −S(O)−, −S(O)2−, −S(O)2N(R')−, −C(O)S−, −C(O)O−, −P(O)(OR')−, −P(O)(SR')−, −P(O)(R')−, −P(O)(NR')−, −P(S)(OR')−, −P(S)(SR')−, −P(S)(R')−,
−P(S)(NR')−, −P(R')−, −P(OR')−, −P(SR')−, −P(NR')−, −P(OR')[B(R')3]−, −OP(O)(OR')O−, −OP(O)(SR')O−, −OP(O)(R')O−, −OP(O)(NR')O−, −OP(OR')O−, −OP(SR')O−, −OP(NR')O−, −OP(R')O−, ou −OP(OR')[B(R')3]O−, e um ou mais CH ou átomos de carbono são opcional e independentemente substituídos por CyL; cada −Cy− é independentemente um grupo bivalente opcionalmente substituído selecionado dentre um anel cicloalifático C3-20, um anel C6-20 arila, um anel heteroarila com 5 a 20 membros tendo 1 a 10 heteroátomos, e um anel heterociclila com 3 a 20 membros tendo 1 a 10 heteroátomos; cada CyL é independentemente um grupo trivalente ou tetravalente opcionalmente substituído selecionado dentre um anel cicloalifático C3-20, um anel C6-20 arila, um anel heteroarila com 5 a 20 membros tendo 1 a 10 heteroátomos, e um anel heterociclila com 3 a 20 membros tendo 1 a 10 heteroátomos; cada R' é independentemente −R, −C(O)R, −C(O)OR, ou −S(O)2R; cada R é independentemente −H, ou um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre C1-30 alifático, C1-30 heteroalifático tendo 1 a 10 heteroátomos, C6-30 arila, C6- 30 arilalifático, C6-30 aril-heteroalifático tendo 1 a 10 heteroátomos, heteroarila com 5 a 30 membros tendo 1 a 10 heteroátomos, e heterociclila com 3 a 30 membros tendo 1 a 10 heteroátomos, ou dois grupos R são opcional e independentemente tomados em conjunto para formar uma ligação covalente, ou dois ou mais grupos R no mesmo átomo são opcional e independentemente tomados em conjunto para formar um anel monocíclico, bicíclico ou policíclico com 3 a 30 membros opcionalmente substituído tendo, além do átomo, 0 a 10 heteroátomos, ou dois ou mais grupos R em dois ou mais átomos são opcional e independentemente tomados em conjunto com seus átomos intervenientes para formar um anel monocíclico, bicíclico ou policíclico com 3 a 30 membros opcionalmente substituído tendo, além dos átomos intervenientes, 0 a 10 heteroátomos.
124. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada ligação internucleotídica não negativamente carregada tem independentemente a estrutura da fórmula I ou uma forma de sal da mesma.
125. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura da fórmula I-n-1 ou uma forma de sal da mesma: . I-n-1
126. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada ligação internucleotídica não negativamente carregada tem independentemente a estrutura da fórmula I-n-1 ou uma forma de sal da mesma.
127. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura da fórmula I-n-2 ou uma forma de sal da mesma:
. I-n-2
128. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura da fórmula I-n-3 ou uma forma de sal da mesma: . I-n-3
129. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada ligação internucleotídica não negativamente carregada tem independentemente a estrutura da fórmula I-n-3 ou uma forma de sal da mesma.
130. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura da fórmula I-n-3 ou uma forma de sal da mesma, em que um R' a partir de um −N(R')2 e um R' a partir do outro −N(R')2 são tomados em conjunto com seus átomos intervenientes para formar um anel monocíclico, bicíclico ou policíclico com 3 a 30 membros opcionalmente substituído tendo, além dos átomos intervenientes, 0 a 10 heteroátomos.
131. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada ligação internucleotídica não negativamente carregada tem independentemente a estrutura da fórmula I-n-3 ou uma forma de sal da mesma, em que um R' a partir de um −N(R')2 e um R' a partir do outro −N(R')2 são tomados em conjunto com seus átomos intervenientes para formar um anel monocíclico, bicíclico ou policíclico com 3 a 30 membros opcionalmente substituído tendo, além dos átomos intervenientes, 0 a 10 heteroátomos.
132. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura da fórmula I-n-3 ou uma forma de sal da mesma, em que um R' a partir de um −N(R')2 e um R' a partir do outro −N(R')2 são tomados em conjunto com seus átomos intervenientes para formar um anel monocíclico com 5 membros opcionalmente substituído tendo não mais que dois átomos de nitrogênio.
133. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada ligação internucleotídica não negativamente carregada tem independentemente a estrutura da fórmula I-n-3 ou uma forma de sal da mesma, em que um R' a partir de um −N(R')2 e um R' a partir do outro −N(R')2 são tomados em conjunto com seus átomos intervenientes para formar um anel monocíclico com 5 membros opcionalmente substituído tendo não mais que dois átomos de nitrogênio.
134. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades 128 a 131, em que o anel formado é um anel saturado.
135. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades 128-131, em que o anel formado é um anel parcialmente insaturado.
136. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura da fórmula II:
,
II ou uma forma de sal da mesma, em que: PL é P(=W), P, ou P→B(R')3; W é O, N(–L–R5), S ou Se; cada um dentre X, Y e Z é independentemente –O–, – S–, –N(–L–R5)–, ou L; R5 é −H, −L−R', halogênio, −CN, −NO2, −L−Si(R')3, −OR', −SR', ou −N(R')2; O anel AL é um anel monocíclico, bicíclico ou policíclico com 3 a 20 membros opcionalmente substituído tendo 0 a 10 heteroátomos; cada Rs é independentemente −H, halogênio, −CN, −N3, −NO, −NO2, −L−R', −L−Si(R)3, −L−OR', −L−SR', −L−N(R')2, −O−L−R', −O−L−Si(R)3, −O−L−OR', −O−L−SR', ou −O−L−N(R')2; g é 0 a 20; cada L é independentemente um grupo de ligação covalente, ou bivalente, linear ou ramificado opcionalmente substituído selecionado dentre um grupo alifático C1-30 e um grupo heteroalifático C1-30 tendo 1 a 10 heteroátomos, em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por C1-6 alquileno, C1-6 alquenileno, , um grupo heteroalifático C1–C6 bivalente tendo 1 a 5 heteroátomos, −C(R')2−, −Cy−, −O−, −S−, −S−S−, −N(R')−, −C(O)−, −C(S)−, −C(NR')−, −C(O)N(R')−, −N(R')C(O)N(R')−, −N(R')C(O)O−, −S(O)−, −S(O)2−, −S(O)2N(R')−, −C(O)S−, −C(O)O−, −P(O)(OR')−, −P(O)(SR')−, −P(O)(R')−, −P(O)(NR')−, −P(S)(OR')−, −P(S)(SR')−, −P(S)(R')−,
−P(S)(NR')−, −P(R')−, −P(OR')−, −P(SR')−, −P(NR')−, −P(OR')[B(R')3]−, −OP(O)(OR')O−, −OP(O)(SR')O−, −OP(O)(R')O−, −OP(O)(NR')O−, −OP(OR')O−, −OP(SR')O−, −OP(NR')O−, −OP(R')O−, ou −OP(OR')[B(R')3]O−, e um ou mais CH ou átomos de carbono são opcional e independentemente substituídos por CyL; cada −Cy− é independentemente um grupo bivalente opcionalmente substituído selecionado dentre um anel cicloalifático C3-20, um anel C6-20 arila, um anel heteroarila com 5 a 20 membros tendo 1 a 10 heteroátomos, e um anel heterociclila com 3 a 20 membros tendo 1 a 10 heteroátomos; cada CyL é independentemente um grupo trivalente ou tetravalente opcionalmente substituído selecionado dentre um anel cicloalifático C3-20, um anel C6-20 arila, um anel heteroarila com 5 a 20 membros tendo 1 a 10 heteroátomos, e um anel heterociclila com 3 a 20 membros tendo 1 a 10 heteroátomos; cada R' é independentemente −R, −C(O)R, −C(O)OR, ou −S(O)2R; cada R é independentemente −H, ou um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre C1-30 alifático, C1-30 heteroalifático tendo 1 a 10 heteroátomos, C6-30 arila, C6- 30 arilalifático, C6-30 aril-heteroalifático tendo 1 a 10 heteroátomos, heteroarila com 5 a 30 membros tendo 1 a 10 heteroátomos, e heterociclila com 3 a 30 membros tendo 1 a 10 heteroátomos, ou dois grupos R são opcional e independentemente tomados em conjunto para formar uma ligação covalente, ou dois ou mais grupos R no mesmo átomo são opcional e independentemente tomados em conjunto para formar um anel monocíclico, bicíclico ou policíclico com 3 a 30 membros opcionalmente substituído tendo, além do átomo, 0 a 10 heteroátomos, ou dois ou mais grupos R em dois ou mais átomos são opcional e independentemente tomados em conjunto com seus átomos intervenientes para formar um anel monocíclico, bicíclico ou policíclico com 3 a 30 membros opcionalmente substituído tendo, além dos átomos intervenientes, 0 a 10 heteroátomos.
137. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada ligação internucleotídica não negativamente carregada tem independentemente a estrutura da fórmula II, ou uma forma de sal da mesma.
138. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura da fórmula II-a- 1: , II-a-1 ou uma forma de sal da mesma.
139. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada ligação internucleotídica não negativamente carregada tem independentemente a estrutura da fórmula II-a-1, ou uma forma de sal da mesma.
140. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura da fórmula II-a- 2:
, II-a-2 ou uma forma de sal da mesma.
141. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada ligação internucleotídica não negativamente carregada tem independentemente a estrutura da fórmula II-a-2, ou uma forma de sal da mesma.
142. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura da fórmula II-b- 1: , II-b-1 ou uma forma de sal da mesma.
143. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada ligação internucleotídica não negativamente carregada tem independentemente a estrutura da fórmula II-b-1, ou uma forma de sal da mesma.
144. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura da fórmula II-b- 2:
, II-b-2 ou uma forma de sal da mesma.
145. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada ligação internucleotídica não negativamente carregada tem independentemente a estrutura da fórmula II-b-2, ou uma forma de sal da mesma.
146. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura da fórmula II-c- 1: , II-c-1 ou uma forma de sal da mesma.
147. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada ligação internucleotídica não negativamente carregada tem independentemente a estrutura da fórmula II-c-1, ou uma forma de sal da mesma.
148. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura da fórmula II-c- 2:
, II-c-2 ou uma forma de sal da mesma.
149. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada ligação internucleotídica não negativamente carregada tem independentemente a estrutura da fórmula II-c-2, ou uma forma de sal da mesma.
150. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura da fórmula II-d- 1: , II-d-1 ou uma forma de sal da mesma.
151. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada ligação internucleotídica não negativamente carregada tem independentemente a estrutura da fórmula II-d-1, ou uma forma de sal da mesma.
152. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura da fórmula II-d- 2:
, II-d-2 ou uma forma de sal da mesma.
153. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada ligação internucleotídica não negativamente carregada tem independentemente a estrutura da fórmula II-d-2, ou uma forma de sal da mesma.
154. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades 136 a 153, em que cada ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a mesma estrutura.
155. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que, se aplicável, cada ligação internucleotídica nos oligonucleotídeos da pluralidade que não é uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem independentemente a estrutura da fórmula I.
156. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada ligação internucleotídica nos oligonucleotídeos da pluralidade tem independentemente a estrutura da fórmula I.
157. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que um ou mais PL são P(=W).
158. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada PL é independentemente P(=W).
159. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que um ou mais W são O.
160. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada W é O.
161. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que um ou mais Y são O.
162. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada Y é O.
163. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que um ou mais Z são O.
164. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada Z é O.
165. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que um ou mais X são O.
166. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que um ou mais X são S.
167. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura de .
168. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura de .
169. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura de .
170. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que para cada ligação internucleotídica da fórmula I ou uma forma de sal da mesma que não é uma ligação internucleotídica não negativamente carregada, X é independentemente O ou S, e −Ls−R5 é −H (ligação fosfato natural ou ligação fosforotioato, respectivamente).
171. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada ligação fosforotioato, se houver, nos oligonucleotídeos da pluralidade é independentemente uma ligação internucleotídica quiralmente controlada.
172. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que pelo menos uma ligação internucleotídica não negativamente carregada é uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada.
173. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que pelo menos uma ligação internucleotídica não negativamente carregada é uma composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada.
174. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos da pluralidade compreendem uma porção química de alvejamento, em que a porção química de alvejamento é independentemente conectada a uma cadeia principal de oligonucleotídeo através de um ligante.
175. A composição, de acordo com a modalidade 174, em que a porção química de alvejamento é uma porção química de carboidrato.
176. A composição, de acordo com a modalidade 174 ou 175, em que a porção química de alvejamento compreende ou é uma porção química de GalNAc.
177. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos da pluralidade compreendem uma porção química de lipídio, em que a porção química de lipídio é independentemente conectada a uma cadeia principal de oligonucleotídeo através de um ligante.
178. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o oligonucleotídeo da pluralidade compreende um padrão de centros quirais de cadeia principal de (Np/Op)t[(Rp)n(Sp)m]y, (Np/Op)t[(Op)n(Sp)m]y, (Np/Op)t[(Op/Rp)n(Sp)m]y, (Sp)t[(Rp)n(Sp)m]y, (Sp)t[(Op)n(Sp)m]y, (Sp)t[(Op/Rp)n(Sp)m]y, [(Rp)n(Sp)m]y, [(Op)n(Sp)m]y, [(Op/Rp)n(Sp)m]y, (Rp)t(Np)n(Rp)m, (Rp)t(Sp)n(Rp)m, (Rp)t[(Np/Op)n]y(Rp)m, (Rp)t[(Sp/Np)n]y(Rp)m, (Rp)t[(Sp/Op)n]y(Rp)m, (Np/Op)t(Np)n(Np/Op)m, (Np/Op)t(Sp)n(Np/Op)m, (Np/Op)t[(Np/Op)n]y(Np/Op)m, (Np/Op)t[(Sp/Op)n]y(Np/Op)m, (Np/Op)t[(Sp/Op)n]y(Np/Op)m, (Rp/Op)t(Np)n(Rp/Op)m, (Rp/Op)t(Sp)n(Rp/Op)m, (Rp/Op)t[(Np/Op)n]y(Rp/Op)m, (Rp/Op)t[(Sp/Op)n]y(Rp/Op)m, ou (Rp/Op)t[(Sp/Op)n]y(Rp/Op)m.
179. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o oligonucleotídeo da pluralidade compreende um padrão de centros quirais de cadeia principal de (Sp)t[(Rp)n(Sp)m]y.
180. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que y é 1.
181. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que n é 1.
182. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que t é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10.
183. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que t é 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10.
184. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que m é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou
10.
185. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que m é 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10.
186. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos da pluralidade têm a estrutura da fórmula O-I ou um sal da mesma.
187. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que LP na fórmula O-I tem independentemente a estrutura da fórmula I, I-a, I-b, I-c, I- n-1, I-n-2, I-n-3, I-n-4, II, II-a-1, II-a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, II-d-2, ou uma forma de sal da mesma.
188. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que um é .
189. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que um é .
190. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que um é .
191. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que um é opcionalmente substituído.
192. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que Ls na fórmula O-I entre LP e o Anel A é −C(R5s)2−.
193. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que Ls na fórmula O-I entre LP e o Anel A é −CH(R5s)−.
194. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que −L3E−R3E na fórmula O-I é −OH.
195. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos da pluralidade têm a estrutura de Ac−[−LLD−(RLD)a]b, Ac−[−LM−(RD)a]b, [(Ac)a−LM]b−RD, (Ac)a−LM−(Ac)b, ou (Ac)a−LM−(RD)b, ou um sal da mesma.
196. A composição, de acordo com a modalidade 195, em que H−Ac, [H]a−Ac ou [H]b−Ac é um oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das modalidades 186 a 194.
197. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos da pluralidade existem como sais, em que uma ou mais ligações internucleotídicas não neutras na condição da composição existem independentemente como uma forma de sal.
198. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos da pluralidade existem como sais, em que uma ou mais ligações internucleotídicas negativamente carregadas na condição da composição existem independentemente como uma forma de sal.
199. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos da pluralidade existem como sais, em que uma ou mais ligações internucleotídicas negativamente carregadas na condição da composição existem independentemente como um sal metálico.
200. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos da pluralidade existem como sais, em que cada ligação internucleotídica negativamente carregada na condição da composição existe independentemente como um sal metálico.
201. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos da pluralidade existem como sais, em que cada ligação internucleotídica negativamente carregada na condição da composição existe independentemente como um sal de sódio.
202. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos da pluralidade existem como sais, em que cada ligação internucleotídica negativamente carregada é independentemente uma ligação fosfato natural (cuja forma neutra é −O−P(O)(OH)−O) ou ligação internucleotídica fosforotioato (cuja forma neutra é −O−P(O)(SH)−O).
203. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada heteroátomo em heteroalifático, heteroalquila, heterociclila ou heteroarila é independentemente boro, nitrogênio, oxigênio, silício, enxofre, ou fósforo.
204. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada heteroátomo em heteroalifático, heteroalquila, heterociclila ou heteroarila é independentemente nitrogênio, oxigênio, silício, enxofre, ou fósforo.
205. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada heteroátomo em heteroalifático, heteroalquila, heterociclila ou heteroarila é independentemente nitrogênio, oxigênio ou enxofre.
206. Uma composição farmacêutica que compreende uma composição de oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, e um carreador farmaceuticamente aceitável.
207. Um método para alterar o splicing de uma transcrição alvo, que compreende administrar uma composição de oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores.
208. O método, de acordo com a modalidade 207, em que o splicing da transcrição alvo é alterado em relação à ausência da composição.
209. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a alteração consistem no fato de que um ou mais éxons são ignorados em um nível aumentado em relação à ausência da composição.
210. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a transcrição alvo é o pré-mRNA da distrofina.
211. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o éxon 51 da distrofina é ignorado em um nível aumentado em relação à ausência da composição.
212. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 207 a 210, em que o éxon 53 da distrofina é ignorado em um nível aumentado em relação à ausência da composição.
213. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 207 a 210, em que o éxon 45 da distrofina é ignorado em um nível aumentado em relação à ausência da composição.
214. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que dois ou mais éxons da distrofina são ignorados em um nível aumentado em relação à ausência da composição
215. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma proteína codificada pelo mRNA com o éxon ignorado fornece uma ou mais funções melhores que uma proteína codificada pelo mRNA correspondente sem o salto de éxon.
216. Um método para tratar distrofia muscular, distrofia muscular de Duchenne (Duchenne) (DMD), ou distrofia muscular de Becker (Becker) (BMD), que compreende administrar a um indivíduo suscetível à mesma ou que sofre da mesma, uma composição de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores.
217. Um método para tratar distrofia muscular, distrofia muscular de Duchenne (Duchenne) (DMD), ou distrofia muscular de Becker (Becker) (BMD), que compreende (a) administrar a um indivíduo suscetível à mesma ou que sofre da mesma uma composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, e (b) administrar ao indivíduo tratamento adicional.
218. O método, de acordo com a modalidade 217, em que o tratamento adicional tem capacidade para prevenir, tratar, melhorar ou retardar o progresso da distrofia muscular, distrofia muscular de Duchenne (Duchenne) (DMD), ou distrofia muscular de Becker (Becker) (BMD).
219. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o tratamento adicional compreende administrar uma composição de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos da composição têm uma sequência de base diferente.
220. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o tratamento adicional compreende administrar uma composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos da composição têm uma sequência de base diferente e têm como alvo um éxon diferente.
221. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o sistema de splicing de transcrição compreende um mioblasto ou miotúbulo.
222. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o sistema de splicing de transcrição compreende uma célula de mioblasto.
223. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o sistema de splicing de transcrição compreende uma célula de mioblasto, que é colocada em contado com a composição após 0, 4 ou 7 dias de pré- diferenciação.
224. Uma composição que compreende uma combinação que compreende: (a) uma primeira composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores; (b) uma segunda composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores; e, opcionalmente (c) uma terceira composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a primeira, segunda e terceira composições são diferentes.
EXEMPLIFICAÇÃO
[001429] O que foi anteriormente mencionado foi uma descrição de certas modalidades não limitantes da revelação. Consequentemente, deve-se compreender que as modalidades da revelação descrita no presente são meramente ilustrativas das aplicações dos princípios da revelação. A referência no presente documento a detalhes das modalidades ilustradas não pretende limitar o escopo de quaisquer reivindicações.
[001430] Vários métodos para preparar, e para avaliar as propriedades e/ou atividades de oligonucleotídeos e composições de oligonucleotídeo são amplamente conhecidos na técnica e podem ser utilizados de acordo com a presente revelação, incluindo, porém sem limitação aqueles descritos nos documentos US 9394333, US 9744183, US 9605019, US 9598458, US 2015/0211006, US 2017/0037399, WO 2017/015555, WO 2017/192664, WO 2017/015575, WO 2017/062862, WO 2017/160741, WO 2017/192679, WO 2017/210647, WO 2018/223056, WO 2018/237194, e WO 2019/055951, os métodos e reagentes de cada um dos quais estão incorporados ao presente documento a título de referência. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece tecnologias para preparar oligonucleotídeos e composições dos mesmos, particularmente oligonucleotídeos quiralmente controlados que compreendem cadeias principais neutras (por exemplo, n001, n002, n003, n004, n005, n006, n007, n008, n009, n010, etc.) e composições de oligonucleotídeo quiralmente controladas dos mesmos e tecnologias para avaliar e usar vários oligonucleotídeos e composições dos mesmos. Entre outros fatores, o requerente descreve no presente documento tecnologias exemplificativas para preparar, avaliar e usar os oligonucleotídeos fornecidos e composições de oligonucleotídeo.
[001431] As funções e vantagens de certas modalidades da presente revelação podem ser mais completamente entendidas a partir dos exemplos descritos abaixo. Os exemplos a seguir se destinam a ilustrar certos benefícios de tais modalidades. Exemplo 1: Síntese exemplificativa de composições de oligonucleotídeos
[001432] As tecnologias para preparar oligonucleotídeo e composições do mesmo são amplamente conhecidas na técnica. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos e composições de oligonucleotídeo da presente revelação foram preparados com o uso de tecnologias, por exemplo, reagentes (por exemplo, suportes sólidos, reagentes de acoplamento, reagentes de clivagem, fosforamiditas, etc.), auxiliares quirais, solventes (por exemplo, para reações, lavagem, etc.), ciclos, condições de reação (por exemplo, tempo, temperatura, etc.), etc., descritos em um ou mais dos documentos US 9394333, US 9744183, US 9605019, US 9598458, US 2015/0211006, US 2017/0037399, WO 2017/015555, WO 2017/192664, WO 2017/015575, WO 2017/062862, WO 2017/160741, WO 2017/192679, WO 2017/210647, WO 2018/223056, WO 2018/237194, e WO 2019/055951. Exemplo 2: Síntese exemplificativa de oligonucleotídeos que compreendem uma ligação internucleotídica que compreende uma porção química de triazol ou uma porção química de alcino.
[001433] Vários tipos de ligações internucleotídicas podem ser preparadas de acordo com a presente revelação. Descreve-se nesse exemplo a preparação de oligonucleotídeos que compreendem ligações internucleotídicas que compreendem porções químicas de triazol. Conforme observado por aqueles versados na técnica, a tecnologia descrita no presente documento pode ser prontamente utilizada para conjugar várias porções químicas desejáveis, por exemplo, aquelas derivadas de GalNAc, lipídios, peptídeos, aglutinantes, etc. Entre outros fatores, tal conjugação pode ser útil para a entrega de oligonucleotídeos para vários sistemas alvo (por exemplo, CNS, músculos, olhos, etc.).
[001434] O oligonucleotídeo exemplificativo que compreende ligações internucleotídicas que compreendem porções químicas de triazol.
[001435] Esquema de síntese para preparação de dímero em fase de solução.
[001436] Esquema de síntese para preparação de dímero no suporte sólido.
[001437] Oligonucleotídeos de cadeia principal de triazol:
[001438] Esquema de síntese para preparação de dímero em fase de solução:
[001439] Esquema de síntese para preparação de dímero no suporte sólido:
[001440] Oligonucleotídeos de cadeia principal de alcino:
[001441] Esquema de síntese para preparação de dímero no suporte sólido:
Exemplo 3: Síntese exemplificativa de ligações internucleotídicas fosforamidato que compreendem uma porção química de guanidina
[001442] Conforme ilustrado no presente documento, as ligações internucleotídicas fosforamidato podem ser prontamente preparadas a partir de ligações internucleotídicas fosfito, incluindo ligações internucleotídicas fosfito estereopuras, de acordo com a presente revelação.
[001443] A uma solução agitada de amidita (474 mg, 0,624 mmol, 1,5 equiv., pré-seca por coevaporação com acetonitrila seca e sob vácuo por um mínimo de 12 h) e álcool protegido com TBS (150 mg, 0,41 mmol, pré-seco por coevaporação com acetonitrila seca e sob vácuo por um mínimo de 12 h) em acetonitrila seca (5,2 ml) foi adicionado 5-(etiltio)-1H- tetrazol (ETT, 2,08 ml, 0,6 M, 3 equiv.) sob atmosfera de argônio à temperatura ambiente.
A mistura de reação foi agitada por 5 min, então monitorada por LCMS e, então uma solução de hexafluorofosfato de 2-azido-1,3-dimetilimidazolínio (356 mg, 1,24 mmol, 3 equiv.) em acetonitrila (1 ml) foi adicionada.
Uma vez que a reação foi concluída (após ~ 5 min, monitorada por LCMS) então trietilamina (0,17 ml, 1,24 mmol, 3 equiv) foi adicionada e a reação foi monitorada por LCMS.
A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida e, então redissolvida em diclorometano (50 ml), lavada com água (25 ml), bicarbonato de sódio aq. saturado (25 ml), e salmoura (25 ml), e seca com sulfato de magnésio.
O solvente foi removido sob pressão reduzida.
O produto bruto foi purificado por coluna de gel de sílica (80 g) usando DCM (trietilamina a 5%) e MeOH como eluente.
As frações contendo produto foram coletadas e o solvente foi evaporado.
O produto resultante pode conter sal tricloridrato de trietilamina (TEA.HCl). Para remover o sal, o produto foi redissolvido em DCM (50 ml) e lavado com bicarbonato de sódio aq. saturado (20 ml) e salmoura (20 ml) então seco com sulfato de magnésio e o solvente foi evaporado.
Um sólido amarelo pálido foi obtido.
Rendimento: 440 mg (89%). 31P RMN (162 MHz, CDCl3) δ -1,34, -1,98. MS calculado para C51H65FN7O14PSi [M]+ 1078,17, Observado: 1078,57 [M + H]+.
[001444] Síntese de dímero estereopuro (Rp).
[001445] A uma solução agitada de amidita quiral L-DPSE (1,87 g, 2,08 mmol, 1,5 equiv., pré-seca por coevaporação com acetonitrila seca e sob vácuo por um mínimo de 12 h) e álcool protegido com TBS (500 mg, 1,38 mmol, pré- seco por coevaporação com acetonitrila seca e sob vácuo por um mínimo de 12 h) em acetonitrila seca (18 ml) foi adicionado trifluorometanossulfonato de 2-(1H-imidazol-1-il) acetonitrila (CMIMT, 5,54 ml, 0,5M, 2 equiv.) sob atmosfera de argônio à temperatura ambiente. A mistura de reação resultante foi agitada por 5 min, então monitorada por LCMS e, então uma solução de hexafluorofosfato de 2-azido-1,3- dimetilimidazolínio (1,18 g, 4,16 mmol, 3 equiv.) em acetonitrila (2 ml) foi adicionada. Uma vez que a reação foi concluída (após ~ 5 min, monitorada por LCMS), a mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida e, então redissolvida em diclorometano (70 ml), lavada com água (40 ml), bicarbonato de sódio aq. saturado (40 ml) e salmoura (40 ml), e seca com sulfato de magnésio. O solvente foi removido sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por coluna de gel de sílica (120 g) usando DCM (trietilamina a 5%) e MeOH como eluente. As frações contendo produto foram coletadas e o solvente foi evaporado. O produto resultante continha sal TEA.HCl. Para remover o sal, o produto foi redissolvido em DCM (50 ml) e lavado com bicarbonato de sódio aq. saturado (20 ml) e salmoura (20 ml) e, então seco com sulfato de magnésio e o solvente foi evaporado. Um sólido espumoso amarelo pálido foi obtido. Rendimento: 710 mg (47%). 31P RMN (162 MHz, CDCl3) δ - 1,38. MS calculado para C51H65FN7O14PSi [M]+ 1078,17, Observado: 1078,19.
[001446] Síntese de dímero estereopuro (Sp).
[001447] O mesmo procedimento foi seguido para o dímero Rp. No lugar de amidita quiral L-DPSE, amidita quiral D-DPSE foi usada. Um sólido espumoso amarelo pálido foi obtido. Rendimento: 890 mg (59%). 31P RMN (162 MHz, CDCl3) δ -1,93. MS calculado para C51H65FN7O14PSi [M]+ 1078,17, Observado: 1078,00.
[001448] Em uma 31P NMR exemplificativa (padrão interno de ácido fosfórico a δ 0,0), a preparação estereoaleatória mostrou dois picos a -1,34 e -1,98, respectivamente; a preparação Rp estereopura mostrou um pico a -1,93, e a preparação estereopura Sp mostrou um pico a - 1,38. Exemplo 4A. Preparação de oligonucleotídeos com ligações internucleotídicas que compreendem grupo guanidínio neutro
[001449] De acordo com as tecnologias descritas na presente revelação, os oligonucleotídeos com várias ligações internucleotídicas neutras e/ou catiônicas (por exemplo, um pH fisiológico) podem ser preparados. Abaixo é ilustrada a preparação de oligonucleotídeos que compreendem tais ligações internucleotídicas representativas.
[001450] WV-11237 é um oligonucleotídeo que compreende quatro ligações internucleotídicas que têm a estrutura de (n001) para introduzir uma natureza neutra na cadeia principal e reduzir as cargas negativas totais da cadeia principal. Peso molecular esperado: 7113,4.
[001451] Como um exemplo, uma preparação de WV-11237, que inclui determinadas condições sintéticas e resultados analíticos, é descrita abaixo. Resumidamente, as ligações internucleotídicas estereopuras foram construídas com o uso de amiditas L-DPSE e ciclo de acoplamento DPSE típicos que compreendem Detritilação-> Acoplamento-> Pré-Cap-> Tiolação-> Pós-Cap. Os ciclos para as ligações internucleotídicas n001 foram modificados e compreendiam Detritilação-> Acoplamento-> tratamento com Dimetil imidazólio -> Pós-cap. Em comparação com determinados ciclos de oxidação, etapas de oxidação de oxidação do P(III), por exemplo, com I2- Piridina (pir)-água, foram substituídas pelo tratamento com dimetil imidazólio.
[001452] Determinadas condições e/ou resultados de uma preparação exemplificativa.
Escala sintética: 127 µmol Condições sintéticas (ligações internucleotídicas estereopuras) Etapas Sintéticas Condições Detritilação DCA a 3% em Tolueno; 300 cm/h, inspeção UV 436 Acoplamento 2,5 eq. de amidita quiral 0,2 M, 67% de CMIMT 0,6 M Tempo de reciclagem: 10 min Pré-Cap B Reagente: 20:30:50::Anidrido acético: Lutidina: Acetonitrila 1,5 CV, 3 min CT Tiolação Reagente: Hidreto de xantana 0,2 M 0,6 CV, 6 min CT Capping (1:1 Cap 0,4 CV, 0,8 min CT A+Cap B) Cap A = N-Metilimidazol em acetonitrila, 20/80, v/v (20%:80% = NMI:ACN (v/v)) Cap B = anidrido acético/2,6-Lutidina/Acetonitrila, 20/30/50, v/v/v , 20%:30%:50% = Ac2O:2,6-Lutidina:ACN (v/v/v) Condições sintéticas (n001 estereoaleatório) Etapas Sintéticas Condições Detritilação DCA a 3% em Tolueno; 300 cm/h, inspeção UV 436 Acoplamento 2,5 eq. de amidita padrão 0,2 M, 67% de ETT 0,6M Tempo de reciclagem: 8 min Tratamento com dimetil 2,30 CV, 5 min CT, 3,5 eq. imidazólio:
Capping (1:1 Cap A+Cap 0,4 CV, 0,8 min CT B) Parâmetros de Processo de Síntese: Sintetizador: AKTA Oligopilot 100 Suporte Sólido: CPG 2'Fluoro-U, (85 umol/g) Escala sintética: 127 umol; 1,5 gm Diâmetro de coluna: 20 mm Volume de coluna: 6,3 ml Reagentes de Acoplamento Estereopuros: Monômero: 0,2 M em MeCN (2'Fluoro-dA-L-DPSE, 2'Fluoro-dG-L-DPSE, 2'-OMe-A-L-DPSE); 0,2 M em isobutironitrila a 20%/MeCN (2'Fluoro-dC-L-DPSE, 2'Fluoro-U- L-DPSE) Desbloqueio: Ácido Dicloroacético a 3% (DCA) em Tolueno Ativador: CMIMT 0,6M em MeCN Sulfurização: Hidreto de Xantana 0,2 M em piridina Cap A: N-Metilimidazol em acetonitrila, 20/80, v/v (NMI a 20% em MeCN) Cap B: Anidrido acético/2,6-Lutidina/Acetonitrila, 20/30/50, v/v/v, (Anidrido acético, Lutidina, MeCN (20:30:50)) Pré-Cap: Cap B Puro Reagentes de Acoplamento Estereoaleatórios: Monômero: 0,2 M em MeCN (2'OMeA e 2'OMeG) Desbloqueio: DCA a 3% em Tolueno Ativador: ETT 0,6M em MeCN 2-Azido-1,3-dimetilimidazolínio-hexafluorofosfato: 0,1 M em MeCN Cap A: NMI a 20% em MeCN Cap B: Anidrido acético, Lutidina, MeCN
Condição de Desproteção: Desproteção de vaso único ao tratar primeiro o suporte com Trifluoridrato de Trietilamina 5M (TEA.HF) em Dimetilsulfóxido (DMSO), H2O, Trietilamina (pH 6,8). Incubação: 3 h, temperatura ambiente, 80 µl/µmol. Seguido de adição de amônia aquosa (200 µl/µmol). Incubação: 24 h, 35 oC. O material desprotegido foi filtrado de modo estéril com o uso de filtros de 0,45 µm. Rendimento: 72 O.D. / µmol Formulação para Solução 5X de TEA.HF em DMSO/Água, 5/1, v/v: Volume Volume Total Reagente Solventes/Reagentes (ml) (ml) DMSO 55,0 (5X) Água 11,0 TEA.HF em Trietilamina (TEA) 9,0 100 DMSO/Água, Trifluoridrato de 5/1, v/v Trietilamina 25,0 (TEA.3HF)
[001453] Em um cromatograma UPLC bruto exemplificativo, existem quatro picos distintos todos tendo o mesmo peso molecular de 7.113,2: RT Área % de Área Altura 9 7,843 402732 16,75 212901 10 7,884 941388 39,14 327190 11 7,968 595232 24,75 275741 12 8,025 353090 14,68 150141
[001454] O cromatograma QC UPLC final exemplificativo mostrou quatro picos distintos todos tendo o peso molecular desejado de 7113,2 (% de Pureza 95,32). LC-MS bruta mostrou um único pico de peso molecular desejado de 7113,2 (dados não mostrados). A QC LC-MS final exemplificativa mostrou um pico maior com o peso molecular desejado de 7113,1.
[001455] Outros oligonucleotídeos podem ser preparados com o uso de condições de ciclo similares ou variantes das mesmas dependendo das químicas específicas de cada oligonucleotídeo. Os dados MS de determinados oligonucleotídeos são listados abaixo: ID Média Observado ID Média Observado WV- WV- 7113,40288 7113,1 8887,86402 8887,5 11237 12504 WV- WV- 6967,19736 6967,4 7278,017 7278,2 11340 12505 WV- WV- 6876,08178 6875,6 8944,9584 8945,2 11341 12506 WV- WV- 6888,1173 6887,7 7335,11138 7334,4 11342 12507 WV- WV- 7072,39402 7072,4 7155,95736 7156,3 11343 12508 WV- WV- 6981,27844 6981,6 7171,78104 7171 11344 12539 WV- WV- 6981,27844 6981,6 7171,78104 7171 11345 12540 WV- WV- 6981,27844 6981,6 7457,21802 7457 11346 12541 WV- WV- 6981,27844 6981,6 7219,97784 7219 11347 12542 WV- 6905,78632 6905 WV- 7235,97724 7236
WV- WV- 7098,86298 7099 7112,86454 7113 11533 12544 WV- WV- 7909,88196 7909,4 6872,0517 6872 12116 12553 WV- WV- 7909,88196 7909,8 6876,08178 6875,8 12117 12555 WV- WV- 7909,88196 7910,2 6888,1173 6887,8 12118 12556 WV- WV- 7909,88196 7909,4 6876,08178 6875,6 12119 12558 WV- WV- 7909,88196 7909,8 6888,1173 6887,7 12120 12559 WV- WV- 7909,88196 7909,8 7204,43754 7204,4 12121 12876 WV- WV- 7125,35748 7125 7113,32196 7113,5 12123 12877 WV- WV- 6967,19736 6967 7125,35748 7125,4 12124 12878 WV- WV- 6967,19736 6967 6919,00056 6919,1 12125 12879 WV- WV- 6967,19736 6967 6923,03064 6923,2 12126 12880 WV- WV- 7046,27742 7046 6935,06616 6935,3 12127 12881 WV- WV- 7046,27742 7046 7094,4195 7094,1 12128 12882 WV- WV- 7046,27742 7046 7410,73974 7411,1 12129 12883 Exemplo 4B.
Ligações internucleotídicas quiralmente controladas não negativamente carregadas
[001456] Síntese de dímero.
[001457] Esse procedimento serve para tornar a cadeia principal de fosfato de dímero estereopura após incorporar a mesma aos sítios seletivos de oligonucleotídeos (por exemplo, oligonucleotídeo antissenso ou ASO, agente de RNAi de fita simples ou ssRNA, etc.). Uma segunda abordagem consiste em sintetizar as moléculas com o uso de um sintetizador de oligonucleotídeos automatizado para introduzir uma ligação internucleotídica não negativamente carregada, por exemplo, uma ligação internucleotídica neutra, em um sítio específico ou oligonucleotídeo completo.
[001458] Procedimento experimental geral (A): A uma solução agitada de amidita estereoaleatória (474 mg, 0,624 mmol, 1,5 equiv., pré-seca por coevaporação com acetonitrila seca e mantida sob vácuo por no mínimo 12 h) e álcool protegido com TBS (150 mg, 0,41 mmol, pré-seco por coevaporação com acetonitrila seca e mantido sob vácuo por no mínimo 12 h) em acetonitrila seca (5,2 ml) foi adicionado 5- (Etiltio)-1H-tetrazol (ETT, 2,08 ml, 0,6 M, 3 equiv.) sob atmosfera de argônio à temperatura ambiente. A mistura de reação resultante foi agitada por 5 min, então monitorada por LCMS e, então uma solução de hexafluorofosfato de 2-azido-1,3- dimetilimidazolínio (356 mg, 1,24 mmol, 3 equiv.) em acetonitrila (1 ml) foi adicionada. Uma vez que a reação foi concluída (após ~ 5 min, monitorada por LCMS) então trietilamina (0,17 ml, 1,24 mmol, 3 equiv.) foi adicionada e monitorada por LCMS. A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida e então redissolvida em diclorometano (50 ml) lavada com água (25 ml), bicarbonato de sódio aq. saturado (25 ml) e salmoura (25 ml) seca com sulfato de magnésio. O solvente foi removido sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por coluna de gel de sílica (80 g) usando DCM (trietilamina a 2%) e MeOH como eluente. As frações contendo produto foram coletadas e evaporadas. Sólido amarelo pálido 1001 obtido. Rendimento: 440 mg (89%). 31P RMN (162 MHz, CDCl3) δ -1,34, -1,98. MS (ES) m/z calculado para C51H65FN7O14PSi [M]+ 1077,40, Observado: 1078,57 [M + H]+.
[001459] Procedimento experimental geral (B) para dímero estereopuro (Rp): A uma solução agitada de amidita quiral L (ou) D-DPSE (1,87 g, 2,08 mmol, 1,5 equiv., pré-seca por coevaporação com acetonitrila seca e mantida vácuo por no mínimo 12 h) e álcool protegido com TBS (500 mg, 1,38 mmol, pré-seco por coevaporação com acetonitrila seca e mantido sob vácuo por no mínimo 12 h) em acetonitrila seca (18 ml) foi adicionado trifluorometanossulfonato de 2-(1H-imidazol-1- il)acetonitrila (CMIMT, 5,54 ml, 0,5 M, 2 equiv.) sob atmosfera de argônio à temperatura ambiente.
A mistura de reação resultante foi agitada por 5 min, então monitorada por LCMS e, então uma solução de hexafluorofosfato de 2-azido-1,3- dimetilimidazolínio (1,18 g, 4,16 mmol, 3 equiv.) em acetonitrila (2 ml) foi adicionada.
Uma vez que a reação foi concluída (após ~ 5 min, monitorada por LCMS) então, a mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida e, então redissolvida em diclorometano (70 ml) lavada com água (40 ml), bicarbonato de sódio aq. saturado (40 ml) e salmoura (40 ml) seca com sulfato de magnésio.
O solvente foi removido sob pressão reduzida.
O produto bruto foi purificado por coluna de gel de sílica (120 g) usando DCM (trietilamina a 2%) e MeOH como eluente.
As frações contendo produto são evaporadas.
Sólido espumoso amarelo pálido 1002 foi obtido.
Rendimento: 710 mg (47%). 31P RMN (162 MHz, CDCl3) δ -1,38. MS (ES) m/z calculado para C51H65FN7O14PSi [M]+ 1077,40, Observado: 1078,19 [M + H]+.
[001460] Dímero estereopuro (Sp) 1003: O procedimento B foi seguido conforme mostrado acima. Amidita quiral D-DPSE foi usada. Sólido espumoso amarelo pálido foi obtido. Rendimento: 890 mg (59%). 31P RMN (162 MHz, CDCl3) δ - 1,93. MS (ES) m/z calculado para C51H65FN7O14PSi [M]+ 1077,40, Observado: 1078,00 [M + H]+.
[001461] Procedimento experimental geral (C) para desproteção do grupo TBS: A uma solução agitada de composto protegido com TBS (9,04 mmol) em trifluoridrato (THF) (70 ml), foi adicionado TBAF (1,0 M, 13,6 mmol) à rt. A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 2 a 4 h. LCMS mostrou que não havia material de partida restante, então concentrada seguido de purificação usando sistema ISCO- combiflash (coluna de sílica de alto desempenho gold rediSep de 330 g pré-equilibrada 3 CV com TEA a 2% em DCM) e DCM/Metanol/TEA a 2% como um eluente gradiente. As frações de coluna contendo produto foram agrupadas e evaporadas seguido de secagem sob alto vácuo proporcionaram o produto puro.
[001462] Procedimento experimental geral (D) para amiditas quirais: O composto desprotegido de TBS (2,5 mmol) foi seco por coevaporação com 80 ml de tolueno anidro (30 ml x 2) a 35 oC e seco a alto vácuo de um dia para o outro. Após seco, o mesmo foi dissolvido em THF seco (30 ml), seguido de adição de trietilamina (17,3 mmol) então, a mistura de reação foi resfriada a -65 °C [para sabores de Guanina: TMS- Cl, 2,5 mmol foi adicionado a -65 °C, para sabores não Guanina nenhum TMS-Cl foi adicionado]. A solução THF de [(1R,3S,3aS)- 1-cloro-3-((metildifenilsilil)metil)tetra-hidro-1H,3H- pirrolo[1,2-c][1,3,2]oxazafosfol (ou) (1S,3R,3aR)-1-cloro-3- ((metildifenilsilil)metil)tetra-hidro-1H,3H-pirrolo[1,2-
c][1,3,2]oxazafosfol (1,8 equiv.) foi adicionada através de seringa à mistura de reação acima durante 2 min, então gradualmente aquecida à temperatura ambiente. Após 20 a 30 min, à rt, TLC assim como LCMS indicaram que o material de partida foi convertido no produto (tempo de reação: 1 h). Então, a mistura de reação foi filtrada sob argônio com o uso de um tubo de filtro isento de ar, lavada com THF e seca sob evaporação rotativa a 26 °C, proporcionou o material sólido bruto, que foi purificado por sistema ISCO-combiflash (coluna de sílica de alto desempenho gold rediSep de 40 g (pré- equilibrada 3 CV com CH3CN/5% TEA, então 3 CV com DCM/5% TEA) usando DCM/CH3CN/5% TEA como um solvente (composto eluído a 10 a 40 DCM/CH3CN/TEA a 5%). Após a evaporação de coluna, as frações agrupadas foram secas sob alto vácuo e proporcionaram sólido branco para gerar o rendimento isolado.
[001463] 31P NMR (padrão interno de ácido fosfórico a δ 0,0): 1001: -1,34 e -1,98. 1002: -1,93. 1003: - 1,38. 1H NMR de 1001, 1002, e 1003 demonstraram diferentes deslocamentos químicos para múltiplos hidrogênios dos diastereômeros. LCMS também mostrou tempos de retenção diferentes para os dois diastereômeros. Sob uma condição, os seguintes tempos de retenção foram observados: 1,90 e 2,15 para 1001, 1,92 para um diastereômero, e 2,17 para o outro.
[001464] Composto 1004: Procedimentos B e C seguidos, Sólido espumoso branco-sujo, Rendimento: (36%). 31P RMN (162 MHz, CDCl3) δ -1,23. MS (ES) m/z calculado para C47H54FN8O14P [M]+ 1004,34, Observado: 1043,21 [M + K]+.
[001465] Composto 1005: Procedimento D usado, Sólido espumoso branco-sujo, Rendimento: (81%). 31P RMN (162 MHz, CDCl3) δ 154,43, -2,52. MS (ES) m/z calculado para C66H76FN9O15P2Si [M]+ 1343,46, Observado: 1344,85 [M + H]+.
[001466] Composto 1006: Procedimentos B, e C seguidos, Sólido espumoso branco-sujo, Rendimento: (47%). 31P RMN (162 MHz, CDCl3) δ -2,54. MS (ES) m/z calculado para C47H54FN8O14P [M]+ 1004,34, Observado: 1043,12 [M + K]+.
[001467] Composto 1007: Procedimento D usado, Sólido espumoso branco-sujo, Rendimento: (81%). 31P RMN (162 MHz, CDCl3) δ 153,55, -2,20. MS (ES) m/z calculado para C66H76FN9O15P2Si [M]+ 1343,46, Observado: 1344,75 [M + H]+.
[001468] Composto 1008: Procedimentos B e C seguidos, Sólido espumoso branco-sujo, Rendimento: (36%). 31P RMN (162 MHz, CDCl3) δ -1,38. MS (ES) m/z calculado para C58H63FN13O13P [M]+ 1199,43, Observado: 1200,76 [M + H]+.
[001469] Composto 1009: Procedimento D usado, Sólido espumoso branco-sujo, Rendimento: (60%). 31P RMN (162 MHz, CDCl3) δ 157,26, -2,86. MS (ES) m/z calculado para C77H85FN14O14P2Si [M]+ 1538,55, Observado: 1539,93 [M + H]+.
[001470] Composto 1010: Procedimentos B e C seguidos, Sólido espumoso branco-sujo, Rendimento: (36%). 31P RMN (162 MHz, CDCl3) δ -2,82. MS (ES) m/z calculado para C58H63FN13O13P [M]+ 1199,43, Observado: 1200,19 [M + H]+.
[001471] Composto 1011: Procedimento D usado, Sólido espumoso branco-sujo, Rendimento: (63%). 31P RMN (162 MHz, CDCl3) δ 159,56, -2,99. MS (ES) m/z calculado para C77H85FN14O14P2Si [M]+ 1538,55, Observado: 1539,83 [M + H]+.
[001472] Composto 1012: Procedimentos B e C seguidos, Sólido espumoso branco-sujo, Rendimento: (36%). [α] 23 D 31P = - 25,74 (c 1,06, CHCl3). RMN (162 MHz, Clorofórmio-d) δ -1,83. 1H RMN (400 MHz, Clorofórmio-d) δ 12,14 (s, 1H), 11,28 (s, 1H), 9,15 (s, 1H), 8,56 (s, 1H), 8,25 – 7,94 (m, 2H), 7,90 (s, 1H), 7,72 – 7,48 (m, 2H), 7,44 (dd, J = 8,2, 6,7 Hz, 2H), 7,35 – 7,26 (m, 2H), 7,24 – 7,02 (m, 8H), 6,81 – 6,56 (m, 4H), 6,04 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 5,67 (d, J = 5,5 Hz, 1H), 4,83 (dt, J = 8,6, 4,4 Hz, 1H), 4,71 – 4,54 (m, 2H), 4,49 (dt, J = 14,2, 4,8 Hz, 2H), 4,35 (ddt, J = 11,0, 5,1, 3,2 Hz, 1H), 4,28 – 4,09 (m, 2H), 3,68 (s, 6H), 3,37 (d, J = 3,3 Hz, 7H), 3,33 – 3,17 (m, 5H), 2,82 (s, 5H), 2,74 – 2,60 (m, 1H), 1,92 (s, 2H), 1,72 – 1,50 (m, 1H), 1,08 (d, J = 6,9 Hz, 3H), 0,94 (d, J =
6,9 Hz, 3H). MS (ES) m/z calculado para C59H66N13O14P 1211,45 [M]+, Observado: 1212,42 [M + H]+.
[001473] Composto 1013: Procedimento D usado, 23 Sólido espumoso branco-sujo, Rendimento: (78%). [α] D = -15,48 (c 0,96, CHCl3). 31P RMN (162 MHz, Clorofórmio-d) δ 159,42, - 2,47. MS (ES) m/z calculado para C78H88N14O15P2Si 1550,57 [M]+, Observado: 1551,96 [M + H]+.
[001474] Composto 1014: Procedimentos B e C seguidos, Sólido espumoso branco-sujo, Rendimento: (30%). [α] 23
D = - 21,45 (c 0,55, CHCl3). MS (ES) m/z calculado para C59H66N13O14P 1211,45 [M]+, Observado: 1212,80 [M + H]+.
[001475] Composto 1015: Procedimento D usado,
D Sólido espumoso branco-sujo, Rendimento: (68%). [α] = - 15,63 (c 1,44, CHCl3). MS (ES) m/z Calculado para C78H88N14O15P2Si 1550,57 [M]+, Observado: 1551,77 [M + H]+.
[001476] Composto 1016: Procedimento D usado, Sólido espumoso branco-sujo, Rendimento: (64%). 31P RMN (162 MHz, CDCl3) δ 156,64, -2,67. MS (ES) m/z Calculado para C78H88N14O15P2Si 1550,57 [M]+, Observado: 1551,77 [M + H]+.
[001477] Procedimento experimental geral (E) para dímero estereopuro com o uso de sulfonil amidita: A uma solução agitada de sulfonil amidita estereopura 1017 (259 mg, 0,275 mmol, 1,5 equiv) e álcool protegido com TBS (100 mg, 0,18 mmol) em acetonitrila seca (2 ml) foi adicionado trifluorometanossulfonato de 2-(1H-imidazol-1-il)acetonitrila (CMIMT, 0,73 ml, 0,36 mmol, 0,5 M, 2 equiv.) sob atmosfera de argônio à temperatura ambiente. A mistura de reação resultante foi agitada por 5 min e monitorada por LCMS então, uma mistura de anidrido acético (2 M em ACN, 0,18 ml, 0,36 mmol, 2 eq.) e lutidina (2 M em ACN, 0,18 ml, 0,36 mmol, 2 eq.) foi adicionada, então agitada por ~5 min, então uma solução de hexafluorofosfato de 2-azido-1,3-dimetilimidazolínio (104,7 mg, 0,367 mmol, 2 equiv.) em acetonitrila (1 ml) foi adicionada. Uma vez que a reação foi concluída (após ~ 5 min, monitorada por LCMS) então, trietilamina (0,13 ml, 0,91 mmol, 5 equiv.) foi adicionada e monitorada por LCMS. Uma vez que a reação foi concluída, a mesma foi concentrada sob pressão reduzida e, então redissolvida em diclorometano (50 ml) lavada com água (25 ml), bicarbonato de sódio aq. saturado (25 ml) e salmoura (25 ml) seca com sulfato de magnésio. O solvente foi removido sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por coluna de gel de sílica (80 g) usando DCM (trietilamina a 2%) e MeOH como eluente. As frações contendo produto foram coletadas e evaporadas. Sólido branco-sujo 1018 obtido. Rendimento: 204 mg (82%). 31P RMN (162 MHz, CDCl3) δ -1,87. MS (ES) m/z calculado para C74H75FN10O14P [M]+ 1359,44, Observado: 1360,39 [M + H]+.
[001478] Fosforamiditas adicionais que podem ser utilizadas para síntese incluem: . Auxiliares quirais úteis adicionais incluem: . Outras fosforamiditas e auxiliares quirais, tais como aqueles descritos nos documentos US 9695211, US 9605019, US 9598458, US 2013/0178612, US 20150211006, US 20170037399, WO 2017/015555, WO 2017/062862, WO 2017/160741, WO 2017/192664, WO 2017/192679, WO 2017/210647, WO 2018/098264, WO 2018/223056 e/ou WO 2018/237194, os auxiliares quirais e fosforamiditas de cada um dos quais estão incorporados a título de referência. Exemplo 4C Síntese de N2,N6-bis(4-sulfamoilbenzoil)- L-lisina
[001479] Etapa 1: A uma solução de ácido 4- sulfamoilbenzoico (10,00 g, 49,70 mmol) e HOSu (6,29 g, 54,67 mmol) em DMF (300 ml) foi adicionado DCC (10,25 g, 49,70 mmol) a 0 °C. A mistura foi agitada a 0 °C por 16 horas. LCMS mostrou que o composto foi consumido. A mistura resultante foi combinada e constituída com outro lote de produto bruto (1 g de escala). A suspensão branca de N,N'-diciclo-hexilureia (DCU) foi filtrada e o sólido branco removido. O filtrado foi concentrado para gerar um óleo. Esse produto bruto foi lavado com 2-propanol quente (50 ml*3) para proporcionar um sólido branco-sujo. O composto (2,5-dioxopirrolidin-1-il) 4- sulfamoilbenzoato (11,80 g, 38,66 mmol, rendimento de 77,78%, 97,713% de pureza) (rendimento de taxa de conversão para lote de 10 g) foi obtido como um sólido branco. O composto (2,5- dioxopirrolidin-1-il) 4-sulfamoilbenzoato (13 g) foi totalmente obtido como um sólido branco para dois lotes de reações. 1H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ = 8,30 (d, J=8,4
Hz, 2H), 8,08 (d, J=8,3 Hz, 2H), 7,70 (s, 2H), 2,96 - 2,87 (m, 4H); 13C RMN (101 MHz, DMSO-d6) δ = 170,62, 161,47, 150,32, 131,40, 127,65, 127,18, 26,04; HPLC pureza: 97,71%.
[001480] Etapa 2: A uma solução de (2,5- dioxopirrolidin-1-il) 4-sulfamoilbenzoato (5,00 g, 16,76 mmol) e ácido (2S)-2,6-diamino-hexanoico (1,23 g, 8,38 mmol) em H2O (50 ml) e DMF (50,00 ml) foi adicionado NaHCO3 (2,11 g, 25,14 mmol). A mistura foi agitada a 15 °C por 16 horas. LCMS mostrou que a MS com o composto desejado foi detectada. A mistura concentrada sob pressão reduzida para gerar um produto bruto (6 g). O produto bruto (3,5 g) foi purificado por HPLC prep (coluna: Phenomenex luna C18 250*50 mm*10 um;fase móvel: [água (0,1% TFA)-ACN];B%: 1% a 30%, 20 min). N2,N6-bis(4- sulfamoilbenzoil)-L-lisina (1,40 g, rendimento de 30,40%, pureza de 93,268%) foi obtido como um sólido branco e 2,5 g de produto bruto como um sólido amarelo. 1H RMN (400 MHz, DMSO- d6) δ = 12,64 (s l, 1H), 8,80 (d l, J=7,5 Hz, 1H), 8,65 (t l, J=5,3 Hz, 1H), 8,04 (d, J=8,2 Hz, 2H), 7,99 - 7,95 (m, 2H), 7,95 - 7,84 (m, 4H), 7,48 (d l, J=11,6 Hz, 4H), 4,44 - 4,32 (m, 1H), 3,28 (d l, J=6,1 Hz, 2H), 1,94 - 1,71 (m, 3H), 1,63 - 1,36 (m, 4H); 13C RMN (101 MHz, DMSO-d6) δ = 174,04, 166,08, 165,58, 146,89, 146,57, 138,05, 137,36, 128,60, 128,26, 126,05, 53,21, 30,77, 29,11, 23,84. LCMS (M-H+): 511,0 (M+H)+; HPLC pureza: 93,268%. Exemplo 4D Tecnologias exemplificativas para preparação de oligonucleotídeo quiralmente controlado - auxiliares quirais úteis exemplificativos
[001481] Entre outros fatores, a presente revelação fornece tecnologias (por exemplo, auxiliares quirais, fosforamiditas, ciclos, condições, reagentes, etc.)
que são úteis para preparar ligações internucleotídicas quiralmente controladas. Em algumas modalidades, as tecnologias fornecidas são particularmente úteis para preparar determinadas ligações internucleotídicas, por exemplo, ligações internucleotídicas não negativamente carregadas, ligações internucleotídicas neutras, etc., que compreendem P−N=, em que P é a ligação. Em algumas modalidades, o fósforo de ligação é trivalente. Em algumas modalidades, o fósforo de ligação é pentavalente. Em algumas modalidades, tais ligações internucleotídicas têm a estrutura da fórmula I-n-1, I-n-2, I- n-3, I-n-4, II, II-a-1, II-a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c- 2, II-d-1, II-d-2, ou uma forma de sal do mesmo. Determinadas tecnologias exemplificativas (auxiliares quirais e suas preparações, fosforamiditas e suas preparações, ciclos, condições, reagentes, etc.) são descritas nos Exemplos no presente documento. Entre outros fatores, tais auxiliares quirais fornecem condições de reação mais moderadas, compatibilidade de grupo funcional mais alta, condições de desproteção e/ou clivagem alternativas, rendimentos de produto bruto e/ou purificado mais altos, pureza de produto bruto mais alta, pureza de produto mais alta e/ou estereosseletividade mais alta (ou substancialmente igual ou comparável) em comparação com um auxiliar quiral de referência (por exemplo, da fórmula O, P, Q, R ou DPSE).
[001482] Dois lotes em paralelo: A uma solução de metilsulfonilbenzeno (102,93 g, 658,96 mmol, 1,5 eq.) em THF (600 ml) foi adicionado KHMDS (1 M, 658,96 ml, 1,5 eq.) por gotejamento a -70 °C, e aquecido a -30 °C lentamente durante 30 min. A mistura foi, então resfriada a -70 °C. Uma solução de composto 1 (150 g, 439,31 mmol, 1 eq.) em THF (400 ml) foi adicionada por gotejamento a -70 °C. A mistura foi agitada a -70 °C por 3 h. TLC (Éter de petróleo: Acetato de etila = 3:1, Rf = 0,1) indicou que o composto 1 foi completamente consumido e uma nova mancha principal com maior polaridade foi detectada. 2 lotes combinados. A mistura de reação foi bruscamente arrefecida por adição de NH4Cl saturado (aq. 1000 ml) e, então extraída com EtOAc (1000 ml x 3). As camadas orgânicas combinadas foram secas com Na2SO4, filtradas e concentradas sob pressão reduzida para gerar 1000 ml de solução. Então, o MeOH (600 ml) foi adicionado, concentrado sob pressão reduzida para gerar 1000 ml de solução, então, o resíduo foi filtrado e lavado com MeOH (150 ml); o resíduo foi dissolvido com THF (1000 ml) e MeOH (600 ml), então concentrado sob pressão reduzida para gerar 1000 ml de solução. Então, filtrado para gerar um resíduo e lavado com MeOH (150 ml). E repetido novamente. O composto 2 (248 g, produto bruto) foi obtido como um sólido branco. E a solução-mãe combinada foi concentrada sob pressão reduzida para gerar o composto 3 (200 g, produto bruto) como óleo amarelo.
[001483] Composto 2: 1H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ = 7,80 (d, J =7,5 Hz, 2H), 7,74 - 7,66 (m, 1H), 7,61 - 7,53 (m, 2H), 7,47 (d, J = 7,5 Hz, 6H), 7,24 - 7,12 (m, 9H), 4,50 - 4,33 (m, 1H), 3,33 (s, 1H), 3,26 (ddd, J = 2,9, 5,2, 8,2 Hz, 1H), 3,23 - 3,10 (m, 2H), 3,05 - 2,91 (m, 2H), 1,59 - 1,48 (m, 1H), 1,38 - 1,23 (m, 1H), 1,19 - 1,01 (m,
1H), 0,31 - 0,12 (m, 1H).
[001484] Preparação do composto WV-CA-108.
[001485] A uma solução do composto 2 (248 g, 498,35 mmol, 1 eq.) em THF (1 l) foi adicionado HCl (5 M, 996,69 ml, 10 eq.). A mistura foi agitada a 15 °C por 1 h. TLC (Éter de petróleo: Acetato de etila = 3:1, Rf = 0,03) indicou que o composto 2 foi completamente consumido e uma nova mancha principal com maior polaridade foi detectada. A mistura resultante foi lavada com MTBE (500 ml x 3). As camadas orgânicas combinadas foram extraídas de volta com água (100 ml). A camada aquosa combinada foi ajustada a pH 12 com NaOH aq. 5M e extraída com DCM (500 ml x 3). As camadas orgânicas combinadas foram secas com Na2SO4 anidro, filtradas e concentradas para proporcionar um sólido branco. WV-CA-108 (122,6 g, produto bruto) foi obtido como um sólido branco.
[001486] 1H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ = 7,95 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 7,66 (t, J = 7,5 Hz, 1H), 7,57 (t, J = 7,7 Hz, 2H), 4,03 (ddd, J = 2,6, 5,3, 8,3 Hz, 1H), 3,37 - 3,23 (m, 2H), 3,20 - 3,14 (m, 1H), 2,91 - 2,75 (m, 3H), 2,69 (s l, 1H), 1,79 - 1,54 (m, 5H); 13C RMN (101 MHz, CLOROFÓRMIO- d) δ = 139,58, 133,83, 129,28, 127,98, 67,90, 61,71, 59,99, 46,88, 25,98, 25,84; LCMS [M + H]+: 256,1. LCMS pureza: 100%. SFC 100% de pureza.
[001487] Entre outros fatores, a presente revelação abrange o reconhecimento de que as bases utilizadas nas reações (por exemplo, do composto 1 ao composto 2) podem causar impacto na estereosseletividade de tais reações.
Determinados resultados exemplificativos são descritos abaixo: Auxiliar Quiral S. nº Aldeído Nucleófilo Base (Diastereosseletividade, cis/trans)
1 1 n-BuLi WV-CA-108 (87:13)
2 1 LiHMDS WV-CA-108 (1,85:1)
3 1 LDA WV-CA-108 (1,85:1)
4 1 KHMDS WV-CA-108 (10:1)
5 1 t-BuOK WV-CA-108 (10:1)
6 4 n-BuLi WV-CA-242 (2:1)
7 4 KHMDS WV-CA-242 (8:1)
8 4 n-BuLi WV-CA-243 (2:1)
9 4 KHMDS WV-CA-243 (8:1)
10 4 n-BuLi WV-CA-347 (5,5:1)
11 4 KHMDS WV-CA-347 (10:1)
12 4 KHMDS WV-CA-247 (43:57) 13 4 n-BuLi WV-CA-247 (~1:1) 14 4 LiHMDS WV-CA-247 (~ 39:51) 15 4 NaHMDS WV-CA-247 (~ 40:66)
[001488] Preparação do composto WV-CA-237.
[001489] A uma solução do composto 3 (400,00 g, 803,78 mmol) em THF (1,5 l) foi adicionado HCl (5 M, 1,61 l). A mistura foi agitada a 15 °C por 2 h. TLC indicou que o composto 3 foi completamente consumido e uma nova mancha principal com maior polaridade foi detectada. A mistura resultante foi lavada com MTBE (500 ml x 3). A camada aquosa combinada foi ajustada a pH 12 com NaOH aq. 5M e extraída com DCM (500 ml x 1) e EtOAc (1000 ml x 2). As camadas orgânicas combinadas foram secas com Na2SO4 anidro, filtradas e concentradas para proporcionar um sólido marrom. WV-CA-237 (100 g, produto bruto) foi obtido como um sólido marrom.
[001490] O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna (SiO2, Éter de petróleo/Acetato de etila = 3/1 a Acetato de etila: Metanol = 1: 2) para gerar 24 g de produto bruto. Então, o resíduo de 4 g foi purificado por HPLC prep (coluna: Phenomenex luna C18 250 x 50 mm x 10 um; fase móvel: [água (HCl a 0,05%)-ACN]; B%: 2% → 20%, 15 min) para gerar o composto desejado (2,68 g, rendimento de 65%) como um sólido branco. WV-CA-237 (2,68 g) foi obtido como um sólido branco. WV-CA-237 : 1H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ = 7,98 - 7,88 (m, 2H), 7,68 - 7,61 (m, 1H), 7,60 - 7,51 (m, 2H), 4,04 (dt, J = 2,4, 5,6 Hz, 1H), 3,85 (ddd, J = 3,1, 5,6, 8,4 Hz, 1H), 3,37 - 3,09 (m, 3H), 2,95 - 2,77 (m, 3H), 1,89 - 1,53 (m, 4H), 1,53 - 1,39 (m, 1H); 13C RMN (101 MHz, CLOROFÓRMIO- d) δ = 139,89, 133,81, 133,70, 129,26, 129,16, 128,05, 127,96, 68,20, 61,77, 61,61, 61,01, 60,05, 46,67, 28,02, 26,24, 25,93; LCMS [M + H]+ :256,1. LCMS pureza: 80,0%. SFC dr = 77,3 : 22,7.
[001491] A uma solução do composto 4 (140 g, 410,02 mmol) em THF (1400 ml) foi adicionado metilsulfonilbenzeno (96,07 g, 615,03 mmol), então adicionou- se KHMDS (1 M, 615,03 ml) em 0,5 h. A mistura foi agitada a - 70 ~ -40 °C por 3 h. TLC indicou que o composto 4 foi consumido e uma nova mancha formada. A mistura de reação foi bruscamente arrefecida por adição de 3000 ml de NH4Cl aq. saturado a 0 °C e, então diluída com EtOAc (3000 ml) e extraída com EtOAc (2000 ml x 3). Seca com Na2SO4, filtrada e concentrada sob pressão reduzida para gerar um resíduo. Ao produto bruto foi adicionado THF (1000 ml) e MeOH (1500 ml), concentrado sob pressão reduzida a 45 °C até restar cerca de 1000 ml de resíduo, o sólido filtrado. Repetir 3 vezes. O composto 5 (590 g, 72,29% de rendimento) foi obtido como um sólido amarelo. 1H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ = 7,81 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 7,75 - 7,65 (m, 1H), 7,62 - 7,53 (m, 2H), 7,48 (d l, J = 7,2Hz, 6H), 7,25 - 7,11 (m, 9H), 4,50 - 4,37 (m, 1H), 3,31 - 3,11 (m, 3H), 3,04 - 2,87 (m, 2H), 1,60 - 1,48 (m, 1H), 1,39 - 1,24 (m,1H), 1,11 (dtd, J = 4,5, 8,8, 12,8 Hz, 1H), 0,32 - 0,12 (m, 1H).
[001492] Preparação do composto WV-CA-236.
[001493] A uma solução do composto 5 (283 g, 568,68 mmol) em THF (1100 ml) foi adicionado HCl (5 M, 1,14 l). A mistura foi agitada a 25 °C por 2 h. TLC indicou que o composto 5 foi consumido e duas novas manchas formadas. A mistura de reação foi lavada com MTBE (1000 ml x 3), então a fase aquosa foi basificada por adição de NaOH (5M) até o pH = 12 a 0°C e, então extraída com DCM (1000 ml x 3) para gerar um resíduo, seca com Na2SO4, filtrada e concentrada sob pressão reduzida para gerar um resíduo. O composto WV-CA-236 (280 g, 1,10 mol, 96,42% de rendimento) foi obtido como um sólido amarelo.
[001494] Ao produto bruto adicionou-se HCl/ EtOAc (1400 ml, 4M) a 0 °C, 2 h depois, filtrou-se o sólido branco e lavou-se o sólido com MeOH (1000 ml x 3). LCMS mostrou que o sólido continha outro pico (MS = 297). Então, foi adicionado ao sólido branco H2O (600 ml) e lavado com DCM (300 ml x 3). À fase aquosa foi adicionado NaOH (5 M) até o pH =
12. Então, diluída com DCM (800 ml) e extraída com DCM (800 ml x 4). A camada orgânica combinada foi seca com Na2SO4, filtrada e concentrada sob pressão reduzida para gerar o produto. O composto WV-CA-236 (280 g) foi obtido como um sólido amarelo. 1H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ = 8,01 - 7,89 (m, 2H), 7,69 - 7,62 (m, 1H), 7,61 - 7,51 (m, 2H), 4,05 (ddd, J = 2,8, 5,2,8,4 Hz, 1H), 3,38 - 3,22 (m, 2H), 3,21 - 3,08 (m, 1H), 2,95 - 2,72 (m, 4H), 1,85 - 1,51 (m, 4H); 13C RMN (101 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ = 139,75, 133,76, 129,25, 127,94, 67,57, 61,90, 60,16, 46,86, 25,86. LCMS [M + H]+: 256. LCMS pureza: 95,94. pureza SFC: 99,86%.
[001495] A uma solução de 1-metoxi-4- metilsulfonil-benzeno (36,82 g, 197,69 mmol) em THF (500 ml) foi adicionado KHMDS (1 M, 197,69 ml) a -70 °C, 0,5 h depois, adicionou-se o composto 4 (45 g, 131,79 mmol) em THF (400 ml) a -70 °C. A mistura foi agitada a -70 → -30 °C por 4 h e, então adicionou-se à mistura KHMDS (1 M, 131,79 ml) a -70 °C. A mistura foi agitada a -70°C por 1 h. TLC indicou que restou composto 4, e duas novas manchas foram detectadas. A mistura de reação foi bruscamente arrefecida por NH4Cl saturado (aq. 300 ml) e, então extraída com EtOAc (500 ml x 3). As camadas orgânicas combinadas foram secas com Na2SO4, filtradas e concentradas sob pressão reduzida para gerar um resíduo. O resíduo foi dissolvido em THF (800 ml) e MeOH (500 ml) e, então concentrado sob pressão reduzida até restarem 200 ml de solvente. À mistura foi adicionado MeOH (500 ml) e concentrada sob pressão reduzida até restar 200 ml de solvente e o sólido apareceu. O sólido foi filtrado para gerar o produto. A trituração foi repetida 2 vezes. O composto 6 (49,8 g, 71,61% de rendimento) foi obtido como um sólido marrom. 1H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ = 7,73 - 7,66 (m, 2H), 7,46 (d, J =7,5 Hz, 6H), 7,24 - 7,11 (m, 9H), 7,04 - 6,96 (m, 2H), 4,37 (td, J =3,1, 8,3 Hz, 1H), 3,94 - 3,88 (m, 3H), 3,36 (s, 1H), 3,26 - 3,10 (m, 3H), 3,00 - 2,89 (m, 2H), 1,58 - 1,45 (m, 1H), 1,37 - 1,23 (m, 1H), 1,15 - 1,00 (m, 1H), 0,26 - 0,10 (m, 1H).
[001496] Preparação do composto WV-CA-241.
[001497] A uma solução do composto 6 (50 g, 94,76 mmol) em THF (250 ml) foi adicionado HCl (5 M, 189,51 ml). A mistura foi agitada a 20 °C por 3 h. TLC indicou que o composto 6 foi consumido e duas novas manchas formadas. A mistura de reação foi extraída com MTBE (200 ml x 3) e as fases de MTBE foram descartadas. E, então a fase aquosa foi adicionada a NaOH 5 M (aq.) a pH = 9 e extraída com DCM (200 ml x 5). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (100 ml), secas com Na2SO4, filtradas e concentradas sob pressão reduzida para gerar o produto. WV-CA-241 (27 g, 98,10% de rendimento, pureza LCMS: 98,24% de pureza) foi obtido como um óleo incolor. 1H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ = 7,83 - 7,76 (m, 2H), 6,98 - 6,91 (m, 2H), 4,00 (ddd, J = 2,9, 5,0, 8,4 Hz, 1H), 3,81 (s, 3H), 3,33 - 3,07 (m, 5H), 2,87 - 2,75 (m, 2H), 1,74 - 1,49 (m, 4H); 13C RMN (101 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ = 163,79, 131,10, 130,21, 114,44, 67,66, 61,88, 60,25, 55,69, 46,85, 25,84, 25,81. LCMS [M + H]+: 286,1. LCMS pureza: 98,24%. SFC: dr = 0.18: 99,82. LCMS Pureza: 99,9%; SFC Pureza: 99,82%.
[001498] A uma solução de 2- metilsulfonilpropano (32,21 g, 263,59 mmol) em THF (1200 ml) foi adicionado KHMDS (1 M, 263,59 ml) por gotejamento a -60 °C, e aquecido a -30 °C, lentamente durante 30 min. A mistura foi, então resfriada a -70 °C. Uma solução do composto 4 (60 g, 175,72 mmol) em THF (300 ml) foi adicionada por gotejamento a -70 °C → 60 °C, durante 30 min. A mistura foi agitada a -70 °C → 60 °C por 2 h. TLC mostrou que o composto 4 foi consumido e uma nova mancha foi detectada. A mistura de reação foi arrefecida bruscamente com NH4Cl aq. sat. (800 ml) e, então extraída com EtOAc (1 l x 3). As camadas orgânicas combinadas foram secas com Na2SO4 anidro, filtradas e concentradas. O composto 7 (95 g, produto bruto) foi obtido como um óleo amarelo.
[001499] Preparação do composto WV-CA-242.
[001500] A uma solução do composto 7 (95 g, 204,90 mmol) em THF (400 ml) foi adicionado HCl (5 M, 409,81 ml). A mistura foi agitada a 0 → 25 °C por 2 h. TLC indicou que o composto 7 foi consumido e uma nova mancha formada. A mistura de reação foi lavada com MTBE (300 ml x 3), então a fase aquosa foi basificada por adição de NaOH (5 M) até o pH = 12 a 0 °C e, então extraída com DCM (300 ml x 3) para gerar um resíduo seco com Na2SO4, filtrada e concentrada sob pressão reduzida para gerar um resíduo. O composto WV-CA-242 (45 g, 99,23% de rendimento) foi obtido como um óleo amarelo. LCMS [M + H]+: 222,0.
[001501] Purificação do composto WV-CA-242.
[001502] Uma solução de WV-CA-242 (45 g, 203,33 mmol), ácido (E)-3-fenilprop-2-enoico (30,12 g, 203,33 mmol) em EtOH (450 ml) foi agitada a 80 °C por 1 h. A reação foi concentrada a vácuo. O resíduo foi dissolvido em TBME (400 ml) e, então agitado a 80°C por 15 min e, então à mistura adicionou-se EtOH (20 ml) e MeCN (30 ml) e, então a mistura foi filtrada, e a torta filtrada foi lavada com TBME (30 ml x 2) e, então isso foi realizado 8 vezes. O sal (35 g, produto bruto) foi obtido como um sólido vermelho.
[001503] A uma solução de sal (34 g, 92,02 mmol) em H2O (20 ml) adicionou-se NaOH aq. 5N (5 M, 36,81 ml). A mistura foi agitada a 25 °C por 10 min. A reação foi extraída com DCM (100 ml x 8) e, então a fase orgânica foi concentrada a vácuo. O composto WV-CA-242 (18,9 g, 91,09% de rendimento,
pureza LCMS: 98,16%) foi obtido como um sólido branco-sujo. 1H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ = 4,13 (ddd, J = 2,1, 4,6, 9,5 Hz, 1H), 3,38 (spt, J = 6,9 Hz, 1H), 3,23 - 3,14 (m, 2H), 3,01 (dd, J = 2,1, 14,4 Hz, 1H), 2,95 - 2,91 (m, 2H), 1,83 - 1,60 (m, 4H), 1,40 (dd, J = 4,0, 6,8 Hz, 6H); 13C RMN (101 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ = 67,45, 61,71, 53,93, 53,42, 46,80, 25,86, 5,43, 16,03, 14,17. LCMS [M + H]+: 222,1. LCMS pureza: 98,17%.
[001504] A uma solução 2-metil-2- (metilsulfonil)propano (14,96 g, 109,83 mmol) em THF (150 ml) foi adicionado KHMDS (1 M, 109,83 ml) por gotejamento a -70 °C, e aquecido a -30 °C lentamente durante 30 min. A mistura foi, então resfriada a -70 °C. Uma solução do composto 4 (25,00 g, 73,22 mmol) em THF (100 ml) foi adicionada por gotejamento a -70 °C. A mistura foi agitada a -70 °C por 4 h. TLC (Éter de petróleo: Acetato de etila = 3:1 Rf = 0,3) mostrou que restou um pouco do composto 4, e uma nova mancha principal com maior polaridade foi detectada. A mistura de reação foi bruscamente arrefecida por adição de NH4Cl (aq., 100 ml) e, então extraída com EtOAc (100 ml x 3). As camadas orgânicas combinadas foram secas com Na2SO4, filtradas e concentradas sob pressão reduzida para gerar 30 ml de solução. Então, o MeOH (30 ml) foi adicionado, concentrado sob pressão reduzida para gerar 30 ml de solução, então, o resíduo foi filtrado e lavado com MeOH (10 ml); o resíduo foi dissolvido com THF (30 ml) e MeOH (30 ml) e, então concentrado sob pressão reduzida para gerar 30 ml de solução. Então, filtrado para gerar um resíduo e lavado com
MeOH (10 ml). E repetir novamente para gerar 21 g de sólido branco e 20 g de óleo marrom. O composto 8 (21 g, produto bruto) foi obtido como um sólido branco, e o composto 8A (20 g, produto bruto) como um óleo marrom. 1H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ = 7,56 (d, J = 7,5 Hz, 6H), 7,32 - 7,23 (m, 6H), 7,21 - 7,14 (m, 3H), 4,85 - 4,68 (m, 1H), 3,52 - 3,43 (m, 4H), 3,41 (td, J = 3,8, 8,1 Hz, 1H), 3,28 (td, J = 8,5, 11,9 Hz, 1H), 3,09 - 2,91 (m, 2H), 2,78 (dd, J = 2,6, 13,6 Hz, 1H), 1,65 - 1,50 (m, 1H), 1,37 (s, 10H), 1,16 - 0,98 (m, 2H), 0,39 - 0,21 (m, 1H). LCMS [M + H]+: 235,9.
[001505] Preparação do composto WV-CA-243.
[001506] A uma solução do composto 8 (20 g, 41,87 mmol) em THF (200 ml) foi adicionado HCl (5 M, 83,74 ml). A mistura foi agitada a 15 °C por 3 h. TLC indicou que o composto 8 foi completamente consumido e uma nova mancha principal com maior polaridade foi detectada. A mistura resultante foi lavada com MTBE (100 ml x 3). A camada aquosa combinada foi ajustada a pH 12 com NaOH aq. 5M e extraída com DCM (50 ml x 3). As camadas orgânicas combinadas foram secas com Na2SO4 anidro, filtradas e concentradas para proporcionar um sólido branco. WV-CA-243 (9 g, 90,42% de rendimento, 99% de pureza) foi obtido como um sólido branco. 1H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ 4,18 (ddd, J = 2,8, 5,8, 8,2 Hz, 1H), 3,29 - 3,21 (m, 1H), 3,19 (d, J = 2,6 Hz, 1H), 3,16 - 3,08 (m, 1H), 2,92 (t, J = 6,6 Hz, 2H), 2,74 (s l, 1H), 1,92 - 1,81 (m, 1H),
1,81 - 1,61 (m, 3H), 1,42 (s, 10H); 13CRMN (101 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ = 68,01, 62,00, 59,73, 49,79, 46,96, 26,77, 25,80, 23,22. LCMS [M + H]+: 236,1. LCMS pureza: 99,46%.
[001507] A uma solução (clorometil)(fenil)sulfano de Mg (17,08 g, 702,90 mmol, 4 eq.) e I2 (0,50 g, 1,97 mmol, 396,83 ul, 1,12 – 2 eq.) em THF (100 ml) foi adicionado 1,2-dibromoetano (1,25 g, 6,63 mmol, 0,5 ml, 3,77 – 2 eq.). Uma vez que a mistura se tornou incolor, clorometilsulfanilbenzeno (111,51 g, 702,90 mmol, 4 eq.) em THF (100 ml) foi adicionado por gotejamento a 10 a 20 °C por 1 h. Após a adição, a mistura foi agitada a 10 a 20 °C por 1 h, a maior parte de Mg foi consumida. E, então a mistura foi adicionada à mistura do composto 1 (60 g, 175,72 mmol, 1 eq.) em THF (600 ml) a -78 °C, a mistura foi agitada a -78 °C a 20 °C por 4 h. TLC (Éter de petróleo: Acetato de etila = 9: 1, Rf = 0,26) indicou que restou composto 1 e duas novas manchas se formaram. A mistura de reação foi arrefecida bruscamente por adição de água (100 ml) a 0 °C e, então extraída com EtOAc (100 ml x 3). As camadas orgânicas combinadas foram secas com Na2SO4, filtradas e concentradas sob pressão reduzida para gerar um resíduo. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna (SiO2, Éter de petróleo/Acetato de etila = 200/1 a 10:1) 2 vezes. O composto 9 (80 g, 171,80 mmol, 97,77% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. 1H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ = 7,52 (d, J = 7,5 Hz, 6H), 7,31 - 7,09 (m,
14H), 4,24 - 4,14 (m, 1H), 3,54 - 3,44 (m, 1H), 3,30 - 3,18 (m, 1H), 3,08 - 2,96 (m, 1H), 2,91 (s, 1H), 2,80 (d, J = 7,0 Hz, 2H), 1,69 - 1,53 (m, 1H), 1,39 - 1,30 (m, 1H), 1,15 - 1,01 (m, 1H), 0,30 - 0,12 (m, 1H).
[001508] Preparação do composto WV-CA-244.
[001509] A uma solução do composto 9 (80 g, 171,80 mmol, 1 eq.) em EtOAc (350 ml) foi adicionado HCl (5 M, 266,30 ml, 7,75 eq.). A mistura foi agitada a 15 °C por 18 h. TLC (Éter de petróleo: Acetato de etila = 9:1, Rf = 0,01) indicou que o composto 9 foi consumido e novas manchas se formaram. A mistura de reação foi extraída com MTBE (200 ml x 3) e as fases de MTBE foram descartadas. E, então a fase aquosa foi adicionada a NaOH 2 M (aq.) a pH = 9 e extraída com EtOAc (200 ml x 5). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (200 ml), secas com Na2SO4, filtradas e concentradas sob pressão reduzida para gerar o produto bruto. Ao produto bruto foi adicionado EtOAc (100 ml) a 70 °C. A mistura foi agitada a 70 °C → 20 °C por 1 h. A mistura de reação foi filtrada, e a torta do filtro foi seca para gerar o produto. WV-CA-244 (31,9 g, 142,84 mmol, 94,66% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. 1H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ = 7,37 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 7,26 (t, J = 7,7 Hz, 2H), 7,20 - 7,12 (m, 1H), 3,74 - 3,65 (m, 1H), 3,24 - 3,15 (m, 1H), 3,13 - 3,00 (m, 2H), 3,00 - 2,21 (m, 4H), 1,77 - 1,59 (m, 4H); 13C RMN (101 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ = 136,04, 129,35,
128,95, 126,15, 70,75, 61,64, 46,86, 38,54, 25,86, 25,17. LCMS [M + H]+: 224,1. LCMS pureza: 99,57%.
[001510] A uma solução de 4- metilsulfonilbenzonitrila (47,76 g, 263,59 mmol, 1,5 eq.) em THF (800 ml) foi adicionado KHMDS (1 M, 263,59 ml, 1,5 eq.) a -70 °C → -40 °C, 0,5 h depois, adicionou-se o composto 4 (60,00 g, 175,72 mmol, 1 eq.) em THF (400 ml) a -70 °C. A mistura foi agitada a -70 °C por 2,5 h. TLC (Éter de petróleo: Acetato de etila = 1:1, Rf = 0,4) indicou que o composto 4 foi consumido e uma nova mancha formada. A mistura de reação foi bruscamente arrefecida por adição de NH4Cl (20 ml) a 0 °C e extraída com DCM (600 ml x 3). Seca com Na2SO4, filtrada e concentrada sob pressão reduzida para gerar um resíduo. O resíduo foi lavado com MeOH (500 ml x 5) para obter o composto 10 (28 g, 53,57 mmol, 30,49% de rendimento) como um sólido amarelo. 1H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ = 7,84 - 7,74 (m, 2H), 7,73 - 7,65 (m, 2H), 7,32 (d, J = 7,2 Hz, 6H), 7,15 - 6,99 (m, 9H), 4,20 (td, J = 2,9, 5,6 Hz, 1H), 3,22 (ddd, J = 3,1, 5,7, 8,3 Hz, 1H), 3,12 - 3,03 (m, 2H), 3,02 - 2,92 (m, 1H), 2,90 - 2,77 (m, 2H), 1,39 - 1,26 (m, 1H), 1,20 - 0,93 (m, 2H), 0,13 - 0,11 (m, 1H).
[001511] Preparação do composto WV-CA-238.
[001512] A uma solução do composto 10 (28 g, 53,57 mmol, 1 eq.) em DCM (196 ml) foi adicionado TFA (12,22 g, 107,15 mmol, 7,93 ml, 2 eq.). A mistura foi agitada a 0 °C por 3 h. TLC e LCMS indicaram que o composto 10 foi consumido e duas novas manchas formadas. A mistura de reação foi lavada com MTBE (100 ml x 3), então, a fase aquosa foi basificada por adição de NaOH (5 M) até o pH = 12 a 0 °C e, então extraída com DCM (50 ml x 3) para gerar um resíduo seco com Na2SO4, filtrada e concentrada sob pressão reduzida para gerar um resíduo. O composto WV-CA-238 (9,5 g, 33,42 mmol, 62,38% de rendimento, 98,62% de pureza) foi obtido como um sólido amarelo. 1H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ = 8,09 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 7,87 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 4,06 (ddd, J = 2,9, 4,9, 8,3 Hz, 1H), 3,38 - 3,16 (m, 3H), 2,96 - 2,79 (m, 2H), 1,81 - 1,64 (m, 3H), 1,61 - 1,45 (m, 1H). 13C RMN (101 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ = 144,05, 132,88, 128,93, 117,48, 117,15, 67,63, 61,50, 60,09, 46,83, 25,88, 25,55. LCMS [M + H]+: 281,1. LCMS pureza: 98,62%. SFC: dr = 99,75: 0,25.
[001513] A uma solução de metilsulfinilbenzeno (25 g, 178,31 mmol, 1,5 eq.) em THF (400 ml) foi adicionado
KHMDS (1 M, 178,31 ml, 1,5 eq.) por gotejamento a -60 °C, e aquecido a -30°C lentamente durante 30 min.
A mistura foi então resfriada a -70 °C.
Uma solução do composto 4 (40,59 g, 118,88 mmol, 1 eq.) em THF (100 ml) foi adicionada por gotejamento a -70 °C.
A mistura foi agitada a -70 °C → -50 °C por 2 h.
TLC (Éter de petróleo: Acetato de etila = 3:1) mostrou que restou composto 4. A mistura de reação foi resfriada a -70 °C, KHMDS adicionalmente adicionado (1M, 40 ml), e agitada a -70 °C →~ -40 °C por 2 h.
TLC (Éter de petróleo: Acetato de etila = 3:1) mostrou que o restou pouco composto 4. A mistura de reação foi arrefecida bruscamente com NH4Cl sat. (aq. 300 ml), e a fase aquosa separada foi extraída com EtOAc (200 ml x 3). As camadas orgânicas combinadas foram secas com Na2SO4 anidro, filtradas e concentradas para proporcionar um resíduo como uma goma amarela, que foi cristalizada em MeOH (100 ml), filtradas e enxaguadas com MeOH (50 ml) para gerar um sólido branco-sujo (17 g), e o filtrado foi concentrado para proporcionar uma goma amarela (50 g). O produto sólido branco (17 g) foi redissolvido em THF (150 ml), e MeOH adicionado (80 ml), e a mistura foi concentrada para remover THF, filtrada e seca para gerar um sólido branco-sujo, que foi redissolvido em THF (150 ml), e MeOH adicionado (80 ml), e a mistura foi concentrada para remover THF, filtrada e seca para gerar o produto como um sólido branco-sujo (13 g). O filtrado foi concentrado para gerar 4 g de produto bruto.
Sem purificação adicional.
O composto de produto 11 (13 g, 26,99 mmol, 22,70% de rendimento) foi obtido como um sólido branco-sujo. 1H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ = 7,62 - 7,56 (m, 2H), 7,55 - 7,52 (m, 3H), 7,51 - 7,45 (m, 6H), 7,25 - 7,12 (m, 9H), 4,60 (td, J = 2,4, 10,1 Hz, 1H), 3,72 (s, 1H), 3,27 - 3,13 (m, 2H), 3,04 - 2,84
(m, 2H), 2,46 (dd, J = 2,2, 13,5 Hz, 1H), 1,71 - 1,53 (m, 1H), 1,42 - 1,28 (m, 1H), 1,07 - 0,90 (m, 1H), 0,37 - 0,21 (m, 1H).
[001514] Preparação do composto WV-CA-247.
[001515] A uma solução do composto 11 (13 g, 26,99 mmol, 1 eq.) em THF (45 ml) foi adicionado HCl (5 M, 52,00 ml, 9,63 eq.) aquoso. A mistura foi agitada a 20 °C por 2 h. TLC (Éter de petróleo: Acetato de etila = 3: 1) mostrou que a reação foi concluída. A mistura resultante foi lavada com MTBE (60 ml x 3). A camada aquosa combinada foi ajustada a pH 12 com NaOH aq. 5 M e extraída com DCM (80 ml x 3). As camadas orgânicas combinadas foram secas com Na2SO4 anidro, filtradas e concentradas para proporcionar um sólido branco (5,8 g). Sem purificação adicional. O composto WV-CA-247 (5,8 g, 24,17 mmol, 89,55% de rendimento, 99,74% de pureza) foi obtido como um sólido branco. 1H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ = 7,67 - 7,60 (m, 2H), 7,55 - 7,42 (m, 3H), 4,17 (ddd, J = 2,6, 4,2, 9,9 Hz, 1H), 3,74 - 3,23 (s l, 2H), 3,13 (dt, J = 4,3, 7,3 Hz, 1H), 2,96 - 2,74 (m, 4H), 1,81 - 1,52 (m, 4H). 13C RMN (101 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ = 143,99, 130,93, 129,32, 123,92, 66,97, 62,23, 61,58, 46,86, 25,88, 25,3. LCMS [M + H]+:
240. LCMS pureza: 99,74%. SFC: dr = 99,48: 0,52.
[001516] A uma solução de 1,3-ditiano (13,21 g, 109,83 mmol) em THF (250 ml) foi adicionado n-BuLi (2,5 M, 29,29 ml) a -20 °C, 0,5 h depois adicionou-se o composto 1 (25 g, 73,22 mmol) em THF (250 ml) a -70 °C. A mistura foi agitada a -70 → 20 °C por 16 h. TLC indicou que restou composto 4, e uma nova mancha foi detectada. A mistura de reação foi bruscamente arrefecida por NH4Cl (200 ml) e, então extraída com EtOAc (200 ml x 5). As camadas orgânicas combinadas foram secas com Na2SO4, filtradas e concentradas sob pressão reduzida para gerar um resíduo. O resíduo foi purificado por MPLC (SiO2, Éter de petróleo/Acetato de etila = 50/1 a 10/1, 5% TEA) 2 vezes. Composto 12 (16 g, 47,33% de rendimento) foi obtido como um óleo amarelo. 1H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ = 7,59 (d, J = 7,0 Hz, 5H), 7,29 - 7,25 (m, 6H), 7,20 - 7,14 (m, 3H), 4,39 (dd, J = 2,4, 10,3 Hz, 1H), 4,03 (ddd, J = 2,4, 5,6, 8,2 Hz, 1H), 3,38 (d, J = 10,1 Hz, 1H), 3,28 (ddd, J = 7,0, 10,1, 12,3 Hz, 1H), 3,07 - 2,99 (m, 1H), 2,93 - 2,85 (m, 1H), 2,63 - 2,54 (m, 1H), 2,34 - 2,18 (m, 2H), 1,97 - 1,82 (m, 2H), 1,59 - 1,45 (m, 1H), 1,22 - 1,11 (m, 1H), 0,22 - 0,06 (m, 1H).
[001517] Preparação do composto WV-CA-246.
[001518] A uma solução do composto 12 (16 g, 34,66 mmol) em EtOAc (80 ml) foi adicionado HCl (5 M, 69,31 ml). A mistura foi agitada a 15 °C por 16 h. TLC indicou que o composto 12 foi completamente consumido e novas manchas se formaram. A mistura de reação foi extraída com TBME (100 ml x 3) e as fases de TBME foram descartadas. E, então a fase aquosa foi adicionada a NaOH 5 M (aq.) a pH = 9 e extraída com DCM
(100 ml x 5). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (100 ml), secas com Na2SO4, filtradas e concentradas sob pressão reduzida para gerar o produto bruto. O resíduo foi purificado por HPLC prep (coluna: Phenomenex luna C18 250 x 50mm x 10 um; fase móvel: [água (0,1% TFA) - ACN]; B%: 0% a 15%, 20 min e coluna: Phenomenex luna (2) C18 250 x 50 x 10um; fase móvel: [água (0,1% TFA) - ACN]; B%: 0% a 12%, 20 min). WV-CA-246 (4,2 g, 55,25% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. 1H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ = 4,13 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 3,83 (dd, J = 5,1, 7,2 Hz, 1H), 3,49 (dt, J = 5,1, 7,3 Hz, 1H), 3,13 - 2,76 (m, 6H), 2,60 (s l, 2H), 2,20 - 2,05 (m, 1H), 2,04 - 1,90 (m, 1H), 1,89 - 1,62 (m, 4H). 13C RMN (101 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ = 73,76, 59,94, 50,42, 46,83, 28,95, 28,45, 25,87, 25,32. HPLC pureza: 97,75%. LCMS [M + H]+: 220,1. SFC: dr = 0,22: 99,78.
[001519] A uma solução de N-metil-N-fenil- acetamida (18,5 g, 124,00 mmol) em THF (250 ml) foi adicionado KHMDS (1 M, 124,00 ml) por gotejamento a -70 °C, e aquecido a -30 °C lentamente durante 30 min. A mistura foi, então resfriada a -70 °C. Uma solução do composto 4 (28,23 g, 82,67 mmol) em THF (150 ml) foi adicionada por gotejamento a -70 °C. A mistura foi agitada a -70 °C ~ -50 °C por 3 h. TLC mostrou que a reação foi quase concluída. A mistura de reação foi arrefecida bruscamente com NH4Cl (aq., 30 ml), e extraída com EtOAc (25 ml x 3). As camadas orgânicas combinadas foram secas com Na2SO4 anidro, filtradas e concentradas para proporcionar um resíduo como goma amarela. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna em gel de sílica (Éter de petróleo: Acetato de etila = 10: 1, 3: 1, 1: 1, 1: 2, 5% TEA). O composto 13 (38 g, 93,7% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. 1H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ = 7,53 (d l, J = 7,5 Hz, 6H), 7,44 - 7,31 (m, 4H), 7,26 - 7,09 (m, 12H), 4,46 - 4,40 (m, 1H), 3,90 (s l, 1H), 3,31 - 3,19 (m, 4H), 3,15 - 3,07 (m, 1H), 3,00 - 2,91 (m, 1H), 1,48 - 1,26 (m, 2H), 0,86 - 0,74 (m, 1H), 0,33 - 0,19 (m, 1H).
[001520] Preparação do composto WV-CA-248.
[001521] A uma solução do composto 13 (38 g, 77,45 mmol) em THF (125 ml) foi adicionado HCl (5 M, 152,00 ml) aquoso. A mistura foi agitada a 20 °C por 2 h. TLC mostrou que a reação foi concluída. A mistura resultante foi lavada com MTBE (80 ml x 3), EtOAc (100 ml x 3), e DCM (100 ml x 2), por dua vez. A camada aquosa combinada foi ajustada a pH = 12 com NaOH aq. 5M e extraída com DCM (120 ml x 3). As camadas orgânicas combinadas foram secas com Na2SO4 anidro, filtradas e concentradas para proporcionar uma goma amarela. O produto bruto de WV-CA-248 (15,2 g, 73,26% de rendimento, 92,7% de pureza) parece uma goma amarela. A uma solução de WV-CA-248 (14,5 g, 58,39 mmol) em EtOH (150 ml) foi adicionado ácido (E)-3-fenilprop-2-enoico (8,65 g, 58,39 mmol). A mistura foi agitada a 80°C por 1 h. A mistura foi concentrada a vácuo. O resíduo foi dissolvido em TBME (50 ml) e, então à mistura foi adicionado MeCN (3 ml), a mistura se tornou transparente, então a solução foi deixada em repouso e, então o sólido apareceu, e a mistura foi filtrada, e a torta filtrada foi lavada com TMBE (10 ml x 2), e a torta filtrada foi o composto desejado. O resíduo (6,5 g, produto bruto) foi obtido como um sólido amarelo. O resíduo foi dissolvido em H2O (10 ml), adicionou-se NaOH aq. (5 M, 6,56 ml, 2 eq.). A mistura foi agitada a 25 °C por 10 min. O pH da mistura foi 13. A solução foi extraída com DCM (40 ml x 6), e a fase orgânica foi concentrada a vácuo. O composto WV-CA-248 (4 g, 91,74% de rendimento, 93,4% de pureza) foi obtido como um óleo marrom. 1H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO- d) δ = 7,49 - 7,31 (m, 3H), 7,21 (d l, J = 7,3 Hz, 2H), 4,00 (td, J = 4,3, 8,6 Hz, 1H), 3,48 (s l, 2H), 3,28 (s, 3H), 3,10 - 2,98 (m, 1H), 2,97 - 2,80 (m, 2H), 2,36 - 2,17 (m, 2H), 1,79 - 1,47 (m, 3H), 1,79 - 1,47 (m, 1H). 13C RMN (101 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ = 172,38, 143,42, 129,89, 128,04, 127,27, 69,90, 62,29, 46,77, 37,98, 37,23, 25,99, 25,65. LCMS [M + H]+: 249,1. LCMS pureza: 93,35%. SFC: SFC pureza = 94,26%.
[001522] A uma solução de metilsulfonilmetano (8,27 g, 87,86 mmol) em THF (150 ml) foi adicionado KHMDS (1 M, 87,86 ml) a -70 °C ~ -40 °C, 0,5 h depois adicionou-se o composto 1 (20 g, 58,57 mmol) em THF (100 ml). A mistura foi agitada a -70 °C por 1,5 h. TLC indicou que restou pouco composto 4 e uma nova mancha se formou. A mistura de reação foi bruscamente arrefecida por adição de NH4Cl (aq. 200 ml) a 0 °C e, então diluída com EtOAc (200 ml) e extraída com EtOAc (200 ml x 3). Seca com Na2SO4, filtrada e concentrada sob pressão reduzida para gerar um resíduo. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna (SiO2, Éter de petróleo/ Acetato de etila = 1/ 0 → 0: 1). O composto 14 (12 g, produto bruto, HNMR mostrou razão de isômero cis/trans ~ 10:1) foi obtido como um óleo amarelo. 1H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ = 7,58 - 7,47 (m, 7H), 7,26 - 7,22 (m, 5H), 7,20 - 7,13 (m, 3H), 4,51 - 4,46 (m, 1H), 3,99 - 3,88 (m, 1H), 3,48 - 3,39 (m, 1H), 3,21 - 2,97 (m, 4H), 2,96 - 2,91 (m, 3H), 2,68 (d l, J = 14,6 Hz, 1H), 1,57 - 1,43 (m, 1H), 1,36 - 1,26 (m, 1H), 1,20 - 1,10 (m, 1H), 0,57 - 0,44 (m, 1H), 0,25 - 0,04 (m, 1H).
[001523] Preparação de WV-CA-252.
[001524] A uma solução do composto 14 (18 g, 41,32 mmol) em THF (82 ml) foi adicionado HCl (5 M, 82,65 ml). A mistura foi agitada a 25 °C por 3 h. TLC indicou que o composto 14 foi consumido e duas novas manchas formadas. A mistura de reação foi lavada com MTBE (50 ml x 3), então a fase aquosa foi basificada por adição de NaOH (5M) até o pH = 12 a 0 °C e, então extraída com DCM (50 ml x 6) para gerar um resíduo seco com Na2SO4, filtrada e concentrada sob pressão reduzida para gerar um resíduo. O composto bruto WV-CA-252 (6,5 g, 81,4% de rendimento) foi obtido como um sólido amarelo. 1H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ = 4,13 (ddd, J = 1,8, 4,0, 9,7 Hz, 1H), 3,23 (dt, J = 4,2, 7,4 Hz, 1H), 3,18 - 3,09 (m, 1H), 3,05 (s, 4H), 3,00 - 2,90 (m, 3H), 1,95 - 1,68 (m, 4H), 1,67 - 1,48 (m, 1H). LCMS [M + H]+: 194,0.
[001525] Uma mistura do composto 1A (52,24 g, 241,62 mmol) em THF (500 ml) foi desgaseificada e purgada com N2 3 vezes e, então a mistura foi resfriada a -70 °C e, então à mistura adicionou-se LDA (2 M, 112,76 ml). A mistura foi agitada a -40 °C por 30 min e, então à mistura adicionou-se o composto 1 (55 g, 161,08 mmol) em THF (250 ml) a -70 °C. A mistura foi agitada a -70 °C por 2 h sob atmosfera de N2. TLC indicou que o composto 1 foi completamente consumido e uma nova mancha se formou. A reação foi limpa de acordo com TLC. A reação foi arrefecida bruscamente por NH4Cl aq. sat. (300 ml) e, então extraída com EtOAc (100 ml x 3). A fase orgânica combinada foi lavada com salmoura (100 ml), seca com Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada a vácuo. O resíduo foi dissolvido em MeOH (300 ml) e filtrado; a torta filtrada era o produto desejado. O composto 2 (53 g, produto bruto) foi obtido como um sólido branco.
[001526] Preparação do composto WV-CA-245.
[001527] A uma solução do composto 15 (72 g, 129,11 mmol) em THF (400 ml) foi adicionado HCl (5 M, 258,22 ml). A mistura foi agitada a 25 °C por 1 h. LC-MS mostrou que o composto 15 foi completamente consumido e um pico principal com massa desejada foi detectado. A reação foi extraída com TBME (100 ml x 3), NaOH aq. 5 N adicionado a pH = 13 e, então extraída com DCM (50 ml x 3), e a fase orgânica combinada foi concentrada a vácuo. WV-CA-245 (38 g, 92,82% de rendimento, 99,5% de pureza) foi obtido como um sólido branco. 1H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ = 7,81 - 7,71 (m, 4H), 7,58 - 7,44 (m, 6H), 4,01 - 3,92 (m, 1H), 3,16 - 3,09 (m, 1H), 2,92 - 2,79 (m, 2H), 2,63 - 2,44 (m, 2H), 1,82 - 1,60 (m, 4H). 13C RMN (101 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ = 133,88, 132,89, 132,86, 131,95, 131,88, 130,73, 128,74, 68,98, 68,94, 63,79, 63,67, 47,03, 34,21, 33,49, 26,37, 25,88. LCMS [M + H]+: 316,1. LCMS pureza: 99,45%. SFC: SFC pureza = 99,5%.
[001528] A uma solução do composto 1B (13,32 g, 87,86 mmol) em THF (200 ml) foi adicionado KHMDS (1 M, 82,00 ml) a -70 °C sob N2 e, então a mistura foi agitada a -70 °C por 10 min e, então à mistura adicionou-se o composto 1 (20 g, 58,57 mmol) em THF (100 ml), a reação foi agitada a – 70 °C por 30 min. TLC indicou que o composto 1 foi completamente consumido e uma nova mancha se formou. A reação foi limpa de acordo com TLC. A mistura de reação foi arrefecida bruscamente com NH4Cl aq. sat. (100 ml) e, então extraída com EtOAc (50 ml x 3). As camadas orgânicas combinadas foram secas com Na2SO4 anidro, filtradas e concentradas. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna (SiO2, Éter de petróleo/Acetato de etila = 50: 1, 20: 1, 10: 1, 1: 1, 0: 1). O composto 16 (12 g, produto bruto) foi obtido como um sólido amarelo.
[001529] Preparação do composto WV-CA-249.
[001530] A uma solução do composto 16 (12 g, 24,34 mmol) em THF (50 ml) foi adicionado HCl aq. (5 M, 48,68 ml). A mistura foi agitada a 25 °C por 30 min. TLC indicou que o composto 16 foi completamente consumido e uma nova mancha se formou. A reação foi limpa de acordo com TLC. A reação foi extraída com TBME (100 ml x 3) e, então à mistura adicionou- se NaOH aq. 5N a pH = 13, extraída com DCM (100 ml x 3) e, então a fase orgânica foi concentrada a vácuo. WV-CA-249 (5,36 g, 87,84% de rendimento, 100,00% de pureza) foi obtido como um sólido amarelo. 1H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ = 7,64 (s, 1H), 7,49 (d, J = 0,9 Hz, 2H), 3,88 (td, J = 3,6, 9,4 Hz, 1H), 3,24 - 3,16 (m, 1H), 3,02 - 2,89 (m, 3H), 2,78 (dd, J = 9,4, 14,0 Hz, 1H), 1,84 - 1,70 (m, 4H). 13C RMN (101 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ = 143,11, 134,94, 132,60, 132,33, 130,12, 117,63, 111,52, 70,86, 62,02, 46,76, 37,90, 25,88, 24,21. LCMS [M + H]+: 251,0. LCMS pureza: 100,000%. SFC: SFC pureza = 98,28%.
[001531] A uma solução de nitrometano (30,59 g, 501,15 mmol) em THF (300 ml) foi adicionado KHMDS (1 M, 263,59 ml) a 20 a 25 °C e agitada por 1 h. O composto 1 (30 g, 87,86 mmol) em THF (90 ml) foi adicionado à mistura a 20 a 25 °C e agitado por 0,5 h. TLC mostrou que o material de partida foi principalmente consumido, e o produto desejado foi formado. A mistura foi arrefecida bruscamente por NH4Cl aq. Saturado (300 ml) e extraída com acetato de etila (100 ml × 3). A fase orgânica foi lavada com NaCl aq. saturado (100 ml × 3) e seca com Na2SO4 anidro, então concentrada sob pressão reduzida para remover o solvente. O produto bruto foi purificado por MPLC (SiO2, Acetato de etila/Éter de petróleo = 0% → 20%) para obter o composto 17 (26,55 g, 75,08% de rendimento) como sólido amarelo. O produto foi detectado por 1H RMN. 1H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ = 7,54 - 7,44 (m, 6H), 7,28 - 7,21 (m, 6H), 7,20 - 7,14 (m, 3H), 4,64 (td, J = 3,0, 9,4 Hz, 1H), 4,53 - 4,06 (m, 3H), 3,60 - 3,40 (m, 1H), 3,24 - 2,96 (m, 3H), 1,52 - 1,41 (m, 1H), 1,40 - 1,28 (m, 1H), 1,17 - 0,94 (m, 1H), 0,67 - 0,50 (m, 1H), 0,23 (quin d, J = 8,8, 11,6 Hz, 1H).
[001532] Preparação do composto WV-CA-250.
[001533] A uma solução do composto 17 (7,5 g, 18,63 mmol) em EtOAc (35 ml) foi adicionado HCl/EtOAc (4 M, 50 ml) a 20 a 25 °C e agitado por 1 h. TLC mostrou que o material de partida foi completamente consumido. Despejou-se o líquido sobrenadante da mistura, a goma amarela na parede do frasco foi concentrada sob pressão reduzida para remover o solvente. WV-CA-250 (2,10 g, 56,70% de rendimento, 98,927% de pureza, sal HCl) foi obtido como goma amarela. O produto foi detectado por 1H RMN, 13C RMN e LCMS. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ = 9,89 - 9,54 (m, 1H), 9,03 - 8,75 (m, 1H), 8,94 (s l, 1H), 4,97 - 4,78 (m, 1H), 4,65 - 4,35 (m, 2H), 3,70 - 3,41 (m, 4H), 3,22 - 3,03 (m, 2H), 2,06 - 1,65 (m, 4H). 13C RMN (101 MHz, DMSO-
d6) δ = 79,42, 79,00, 67,89, 66,82, 61,53, 60,77, 45,44, 45,25, 26,93, 24,57, 23,95, 23,81. LCMS [M + H]+: 161,1, pureza: 98,92%.
[001534] A uma solução do composto benzilamina (30 g, 279,97 mmol) e TEA (56,66 g, 559,95 mmol) em DCM (60 ml) foi adicionado MsCl (38,49 g, 335,97 mmol) em DCM (30 ml) a 0 °C. A mistura foi agitada a 0 °C por 2 h. LC-MS mostrou que o composto 18A foi consumido e muitos novos picos foram detectados. A mistura de reação foi lavada com HCl (1 M, 50 ml x 3) e NaHCO3 sat. (aq. 50 ml x 3). A camada orgânica foi lavada com salmoura (50 ml), seca com Na2SO4, filtrada e concentrada sob pressão reduzida para gerar um resíduo. TLC mostrou uma mancha principal. O resíduo foi purificado por MPLC (SiO2, Éter de petróleo/Acetato de etila=5/1 a 1:1). O composto 18A (35 g, 67,49% de rendimento) foi obtido como um sólido amarelo claro. 1H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ = 7,44 - 7,24 (m, 5H), 4,82 (s l, 1H), 4,31 (d, J = 6,2 Hz, 2H), 2,85 (s, 3H).
[001535] A uma solução do composto 18A (16,28 g, 87,86 mmol) em THF (60 ml) foi adicionado LDA (2 M, 87,86 ml) a 0 °C. A mistura foi agitada a 0 a 25 °C por 0,5 h. E,
então o composto 1 (15 g, 43,93 mmol) em THF (60 ml) foi adicionado à solução acima a -70 °C. A mistura foi agitada a -70 a 25 °C por 4 h. TLC indicou que o composto 1 foi completamente consumido e muitas novas manchas se formaram. A mistura de reação foi adicionada com NH4Cl sat. (aq. 50 ml) e extraída com EtOAc (100 ml x 3). As camadas orgânicas combinadas foram secas com Na2SO4, filtradas e concentradas sob pressão reduzida para gerar um resíduo. O resíduo foi purificado por TLC prep (SiO2, Éter de petróleo/Acetato de etila=5/1, 2% TEA). O composto 18 (22 g, 95,08% de rendimento) foi obtido como um óleo amarelo.
[001536] Preparação do composto WV-CA-255.
[001537] A uma solução do composto 18 (22 g, 41,77 mmol) em EtOAc (15 ml) foi adicionado HCl (4 M em acetato de etila, 31,33 ml) a 0 °C. A mistura foi agitada a 0 a 25 °C por 2 h. E o sólido apareceu na mistura de reação. TLC indicou que o composto 18 foi completamente consumido e muitas novas manchas se formaram. A mistura de reação foi filtrada. A torta do filtro foi dissolvida em água (10 ml), lavada com MTBE (40 ml x 3). A fase aquosa foi adicionada com Na2CO3 (pó) a pH = 8~9 e extraída com DCM (50 ml x 5). As camadas orgânicas combinadas foram secas com Na2SO4, filtradas e concentradas sob pressão reduzida para gerar um resíduo. WV-CA-255 (11 g, 92,60% de rendimento) foi obtido como um sólido marrom. 1H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ = 7,46 - 7,25 (m, 5H), 4,65 - 3,72 (m,
5H), 3,14 - 3,01 (m, 3H), 2,95 - 2,77 (m, 2H), 1,89 - 1,34 (m, 4H). 13C RMN (101 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ = 136,99, 128,71, 128,62, 128,19, 128,09, 127,85, 69,12, 67,58, 61,98, 61,70, 55,55, 55,36, 47,36, 47,30, 46,60, 46,28, 28,05, 26,16, 25,71, 24,92. LCMS [M + H]+: 285,0, LCMS pureza: 99,8%. SFC : dr (trans/cis) = 32,36: 67,64.
[001538] A uma solução do composto dibenzilamina (30 g, 152,07 mmol) em DCM (250 ml) foi adicionado TEA (15,39 g, 152,07 mmol). A mistura foi resfriada a 0 °C, e à mistura adicionou-se MsCl (17,42 g, 152,07 mmol) em DCM (50 ml) e, então a mistura foi agitada a 25 °C por 12 horas. LC-MS mostrou que a massa desejada foi detectada. A reação foi arrefecida bruscamente por H2O (100 ml) e a fase orgânica foi extraída com H2O (100 ml×3), a fase orgânica foi seca com Na2SO4 e, então concentrada a vácuo. Não há necessidade de purificação adicional. O composto 19A (39 g, produto bruto) foi obtido como um sólido branco. 1H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO- d) δ = 7,41 - 7,29 (m, 9H), 4,36 (s, 4H), 2,82 - 2,75 (m, 3H). LCMS [M + H]+: 298,0, pureza: 86,6%.
[001539] A uma solução do composto 19A (19,36 g, 70,29 mmol) em THF (200 ml) foi adicionado KHMDS (1 M, 76,15 ml) por gotejamento a -78 °C a -70 °C sob N2. A mistura foi aquecida a -40 °C e agitada por 0,5 h, então resfriada a -78 °C. À mistura foi adicionado o composto 1 (20 g, 58,57 mmol) em THF (100 ml) a -78 °C a -70 °C e agitada por 1 h sob N2. TLC mostrou que o material de partida foi completamente consumido. A mistura foi arrefecida bruscamente por NH4Cl aq. saturado (200 ml) e extraída com acetato de etila (70 ml × 3). A fase orgânica foi lavada com NaCl aq. saturado (70 ml × 3) e seca com Na2SO4 anidro, então concentrada sob pressão reduzida para remover o solvente para obter o produto bruto como goma amarela. O produto bruto foi redissolvido com metanol (200 ml) e deixado em repouso a 20 a 25 °C por 12 horas. O composto 19 (20,4 g, 99,99% de rendimento) foi cristalizado a partir do solvente como sólido branco, então filtrado e seco a vácuo. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida para remover o solvente para gerar o composto 20 (28,4 g, produto bruto) como goma marrom. 1H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ = 7,47 - 7,42 (m, 6H), 7,23 - 7,05 (m, 19H), 4,36 (td, J = 3,0, 8,6 Hz, 1H), 4,23 - 4,12 (m, 4H), 3,29 - 3,19 (m, 1H), 3,29 - 3,19 (m, 1H), 3,11 (ddd, J = 7,1, 9,5, 12,1 Hz, 1H), 2,97 - 2,82 (m, 2H), 2,59 (dd, J = 3,1, 14,2 Hz, 1H), 1,37 - 1,27 (m, 1H), 1,24 - 1,14 (m, 1H), 1,00 - 0,92 (m, 1H), 0,16 - 0,02 (m, 1H).
[001540] Preparação do composto WV-CA-263.
[001541] A uma solução do composto 19 (20 g, 32,42 mmol) em THF (100 ml) foi adicionado HCl (5 M, 64,85 ml) a 20 a 25 °C e agitado por 0,5 h. TLC mostrou que o material de partida foi completamente consumido. A mistura foi extraída com TBME (80 ml × 3), então ajustou o pH da mistura com NaOH aq. (65 ml, 5M) a 11 a 13 e extraída com DCM (100 ml × 3). A fase orgânica foi seca com Na2SO4 anidro e concentrada sob pressão reduzida para remover o solvente. O produto bruto foi usado para a próxima etapa sem qualquer purificação. WV-CA-263 (10,04 g, 82,68% de rendimento, 100% de pureza) foi obtido como sólido branco. 1H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ = 7,38 - 7,28 (m, 10H), 4,38 (s, 4H), 4,01 (ddd, J=2,6, 5,6, 8,5 Hz, 1H), 3,20 - 3,13 (m, 2H), 3,10 - 3,02 (m, 1H), 2,91 (t, J=6,5 Hz, 2H), 1,89 (d l, J=8,6 Hz, 1H), 1,82 - 1,66 (m, 4H), 1,62 - 1,52 (m, 1H). 13C RMN (101 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ = 135,62, 128,77, 128,70, 127,98, 77,35, 76,87 (d, J=31,5 Hz, 1C), 68,84, 61,51, 57,03, 50,35, 46,96, 26,27, 25,88. LCMS [M + H]+: 375,1, pureza: 100,00%. SFC: dr = 99,55: 0,45.
[001542] A uma solução de 3,3-dimetilbutan-2- ona (11,00 g, 109,83 mmol) em THF (125 ml) foi adicionado LDA (2 M, 54,91 ml) por gotejamento a -70 °C, e a mesma foi agitada a -70 °C ~ -60 °C por 1 h. A solução do composto 1 (25 g, 73,22 mmol) em THF (125 ml) foi adicionada por gotejamento a -70 °C ~ -60 °C. A mistura foi agitada a -70°C por 1,5 h. TLC mostrou que o composto 1 foi quase consumido. A mistura de reação foi arrefecida bruscamente com NH4Cl (aq., 200 ml), e a camada aquosa separada foi extraída com EtOAc (150 ml x 3). As camadas orgânicas combinadas foram secas com Na2SO4 anidro, filtradas e concentradas para proporcionar um resíduo como um sólido amarelo claro. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna em gel de sílica (Éter de petróleo + 5% TEA; Éter de petróleo: Acetato de etila (20: 1) + 5% TEA). O composto 21 (17 g, 52,6% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. 1H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ= 7,37 - 7,25 (m, 6H), 7,03 - 6,95 (m, 6H), 6,94 - 6,84 (m, 3H), 4,22 (td, J = 2,7, 9,2 Hz, 1H), 3,09 (td, J = 4,1, 7,6 Hz, 1H), 3,04 - 2,92 (m, 2H), 2,75 (ddd, J = 2,9, 8,5, 12,0 Hz, 1H), 2,26 (dd, J = 9,3, 17,0 Hz, 1H), 2,04 (dd, J = 3,4, 16,9 Hz, 1H), 1,43 - 1,24 (m, 2H), 1,14 - 1,01 (m, 1H), 0,84 (s, 9H), 0,81 - 0,71 (m, 1H), 0,09 - -0,07 (m, 1H).
[001543] Preparação do composto WV-CA-289.
[001544] A uma solução do composto 21 (16 g, 36,23 mmol) em EtOAc (25 ml) foi adicionado HCl/EtOAc 4 M (100 ml). A mistura foi agitada a 25 °C por 0,5 h. TLC mostrou que a reação foi concluída. A mistura resultante foi filtrada, e o sólido foi agitado em EtOAc (150 ml), filtrado e retriturado com EtOAc/MeOH (150 ml/5 ml), filtrado e seco para proporcionar o composto WV-CA-289 (7,5 g, 87,8% de rendimento, sal HCl) como um sólido branco. 1H RMN (400 MHz, METANOL-d4) δ = 4,43 (ddd, J = 3,5, 4,6, 7,8 Hz, 1H), 3,71 (dt, J =3,5, 8,0 Hz, 1H), 3,42 - 3,22 (m, 2H), 2,92 (dd, J = 7,6, 17,7 Hz, 1H), 2,73 (dd, J = 4,9, 17,7 Hz, 1H), 2,23 - 1,90 (m, 4H), 1,28 - 1,05 (m, 9H). [M + H]+: 200,1, pureza: 100,00%.
[001545] A uma solução de metilsulfonilbenzeno (13,72 g, 87,86 mmol) em THF (100 ml) foi adicionado LiHMDS (1 M, 87,86 ml) em 0,5 h a -70 °C - 0 °C, então o composto 4 adicionado em THF (100 ml). A mistura foi agitada a -70 °C em 2,5 h. TLC indicou que restou um pouco de composto 4 e duas nova manchas se formaram. A mistura de reação foi bruscamente arrefecida por adição de NH4Cl aq. (300 ml) a 0 °C, extraída com DCM (200 ml x 3). Seca com Na2SO4, filtrada e concentrada sob pressão reduzida para gerar um resíduo. Ao produto bruto foi adicionado THF (100 ml) e MeOH (150 ml), concentrado sob pressão reduzida a 45 °C até restar cerca de 100 ml de resíduo, o sólido filtrado. Repetido 3 vezes. Obteve-se 20 g de sólido, o líquido mãe foi concentrado sob pressão reduzida para obter o composto 22 (20 g, produto bruto) como um óleo amarelo. O composto (1R)-2-(benzenossulfonil)-1-[(2R)-1- tritilpirrolidin-2-il]etanol (20 g, 68,61% de rendimento) foi obtido como um sólido branco.
[001546] Preparação do composto WV-CA-290. Trt H
HO N HO N O
O 5M HCl O S
O S 22 WV-CA-290
[001547] A uma solução do composto 22 (20 g, 40,19 mmol) em THF (80 ml) foi adicionado HCl (5 M, 80,38 ml)
a 0 °C. A mistura foi agitada a 25 °C por 2 h. TLC mostrou que o composto 22 foi consumido e duas novas manchas formadas. A mistura de reação foi lavada com MTBE (50 ml x 3), então a fase aquosa foi basificada por adição de NaOH (5M) até o pH = 12 a 0 °C e, então extraída com DCM (50 ml x 3) para gerar um resíduo seco com Na2SO4, filtrada e concentrada sob pressão reduzida para gerar um resíduo. O resíduo foi purificado por HPLC prep (coluna: Phenomenex luna C18 250 x 50mm x 10 um; fase móvel: [água (0,1% TFA) - ACN]; B%: 0% a 15%, 20 min). O composto WV-CA-290 (0,7 g, 6,78% de rendimento, 99,39% de pureza) foi obtido como um sólido amarelo. 1H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ = 7,95 - 7,85 (m, 2H), 7,64 - 7,56 (m, 1H), 7,55 - 7,46 (m, 2H), 3,79 (ddd, J = 3,2, 5,4, 8,4 Hz, 1H), 3,28 - 3,05 (m, 3H), 2,92 - 2,72 (m, 2H), 1,84 - 1,54 (m, 3H), 1,51 - 1,37 (m, 1H). 13C RMN (101 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ = 139,81, 133,74, 129,19, 128,07, 68,15, 61,55, 60,97,46,67, 28,03, 26,27. SFC: (AD_MeOH_IPAm _10_40_25_35_6min), 100% pureza. LCMS [M + H]+: 256,1. LCMS pureza: 99,39%.
[001548] Dois lotes em paralelo: A uma solução do composto terc-butil(metil)sulfano (25 g, 239,89 mmol) em MeOH (625 ml) foi adicionado Oxone (457,18 g, 743,67 mmol) em H2O (625 ml) a 0 °C. A mistura foi agitada a 15 °C por 12 h. HNMR mostrou que o composto terc-butil(metil)sulfano foi completamente consumido e o composto desejado foi detectado. Dois lotes combinados da mistura de reação, filtrados e concentrados sob pressão reduzida para evaporar o MeOH e, então extraídos com EtOAc (400 ml x 4). As camadas orgânicas combinadas foram secas com Na2SO4, filtradas e concentradas sob pressão reduzida para gerar um resíduo. O composto 23A (55 g, produto bruto) foi obtido como um óleo incolor, confirmado por HNMR. 1HRMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ = 7,26 (s, 1H), 5,30 (s, 8H), 2,81 (s, 3H), 1,43 (s, 9H).
[001549] A uma solução do composto 23A (50 g, 367,07 mmol) em THF (510 ml) foi adicionado KHMDS (1 M, 367,07 ml) por gotejamento a -70 °C, e aquecido a -30 °C lentamente durante 30 min. A mistura foi, então resfriada a -70 °C. A solução de composto 1 (83,56 g, 244,72 mmol) em THF (340 ml) foi adicionada por gotejamento a -70 °C. A mistura foi agitada a -70 °C por 4 h. TLC mostrou que restou um pouco do composto 1, e uma nova mancha principal com maior polaridade foi detectada. A mistura de reação foi bruscamente arrefecida por adição de NH4Cl (aq. 800 ml) e, então extraída com EtOAc (500 ml x 3). As camadas orgânicas combinadas foram secas com Na2SO4, filtradas e concentradas sob pressão reduzida para gerar óleo marrom. O produto bruto foi dissolvido com THF (300 ml), então concentrado sob pressão reduzida (40 °C) para gerar 150 ml de solução clarificada. Então, adicionado a 300 ml de MeOH e concentrado sob pressão reduzida para gerar 200 ml de solução, então filtrado para gerar um resíduo e lavado com MeOH (10 ml). A solução-mãe foi concentrada sob pressão reduzida para gerar 100 ml de solução então, filtrada para gerar um resíduo e lavada com MeOH (10 ml). Combinados todos os resíduos, repetidos duas vezes para gerar 60 g de resíduo. O composto 23
(60 g, produto bruto) foi obtido como um sólido branco. 1HRMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ = 7,56 (d, J = 7,5 Hz, 6H), 7,32 - 7,23 (m, 6H), 7,21 - 7,14 (m, 3H), 4,85 - 4,68 (m, 1H), 3,41 (td, J = 3,8, 8,1 Hz, 1H), 3,28 (td, J = 8,5, 11,9 Hz, 1H), 3,09 - 2,91 (m, 2H), 2,78 (dd, J = 2,6, 13,6 Hz, 1H), 1,65 - 1,50 (m, 1H), 1,37 (s, 9H), 1,16 - 0,98 (m, 2H), 0,39 - 0,21 (m, 1H).
[001550] Preparação do composto WV-CA-240.
[001551] A uma solução do composto 23 (59 g, 123,52 mmol) em THF (500 ml) foi adicionado HCl (5 M, 247,04 ml). A mistura foi agitada a 20 °C por 3 h. TLC indicou que o composto 23 foi completamente consumido e uma nova mancha principal com maior polaridade foi detectada. A mistura resultante foi lavada com MTBE (500 ml x 3). A camada aquosa combinada foi ajustada a pH 12 com NaOH aq. 5 M e extraída com DCM (200 ml x 3). As camadas orgânicas combinadas foram secas com Na2SO4 anidro, filtradas e concentradas para proporcionar um sólido branco. WV-CA-240 (23,6 g, 81,14% de rendimento, 99,95% de pureza) foi obtido como um sólido branco. 1HRMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ = 4,18 (ddd, J = 2,8, 5,8, 8,2 Hz, 1H), 3,29 - 3,21 (m, 1H), 3,19 (d, J = 2,6 Hz, 1H), 3,16 - 3,08 (m, 1H), 2,92 (t, J = 6,6 Hz, 2H), 2,74 (s l, 2H), 1,92 - 1,81 (m, 1H), 1,81 - 1,61 (m, 3H), 1,42 (s, 9H). 13CRMN (101 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ = 68,01, 62,00, 59,73, 49,79, 46,96, 26,77, 25,80, 23,22. LCMS [M + H]+: 236,1. LCMS pureza 99,95%.
[001552] A uma solução de WV-CA-108 (37 g, 144,91 mmol, 1 eq.) em MeOH (370 ml) foi adicionado prop-2- enenitrila (7,69 g, 144,91 mmol, 9,61 ml, 1 eq.). A mistura foi agitada a 20 °C por 3 h., (TLC, Éter de petróleo: Acetato de etila = 1:3, Rf = 0,31) mostrou que WV-CA-108 foi completamente consumido e em LCMS um pico principal com MS desejada foi detectado. A mistura de reação foi filtrada e concentrada sob pressão reduzida para render um resíduo. O composto 24 (44 g, produto bruto) foi obtido como um sólido branco. LCMS [M + H] +: 308,9.
[001553] Preparação do composto WV-CA-291.
[001554] Uma solução do composto 24 (44 g, 142,67 mmol, 1 eq.) em DCM (220 ml) e MeOH (220 ml) foi resfriada até -78 °C. Então, mCPBA (36,93 g, 214,01 mmol, 1,5 eq.) e K2CO3 (29,58 g, 214,01 mmol, 1,5 eq.) foi adicionado. Após a adição, a mistura foi agitada a -78 °C por 3 h. E a mistura resultante foi agitada a 20 °C por 12 h. LC-MS mostrou que o composto 24 foi completamente consumido e um pico principal com MS desejada foi detectado. A mistura de reação foi filtrada e concentrada sob pressão reduzida para render um resíduo. O resíduo foi purificado por cromatografia flash em gel de sílica. O resíduo foi purificado por cromatografia flash em gel de sílica. (ISCO®; 220 g de Coluna flash de Sílica
SepaFlash®, Eluente de gradiente de 0~30% de Acetato de etila/Éter de petróleo em 100 ml/min). WV-CA-291 (12 g, 42,05 mmol, 29,47% de rendimento, 95,08% de pureza) foi obtido como um sólido amarelo. 1H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ= 7,98 - 7,92 (m, 2H), 7,65 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 7,61 - 7,53 (m, 2H), 4,50 - 4,39 (m, 1H), 3,33 - 3,15 (m, 3H), 2,97 - 2,78 (m, 2H), 1,89 - 1,64 (m, 4H). 13CRMN (101 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ = 139,61, 133,90, 129,31, 128,02, 71,21, 64,96, 60,05, 58,12, 21,23, 20,29. LCMS [M + H] +: 272,0. LCMS pureza 95,08%. Exemplo 4E Tecnologias exemplificativas para preparação de oligonucleotídeo quiralmente controlado - fosforamiditas úteis exemplificativas
[001555] Entre outros fatores, a presente revelação fornece fosforamiditas úteis para síntese de oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, as fosforamiditas fornecidas são particularmente úteis para a preparação de ligações internucleotídicas quiralmente controladas. Em algumas modalidades, as fosforamiditas fornecidas são particularmente úteis para preparar ligações internucleotídicas quiralmente controladas, por exemplo, ligações internucleotídicas não negativamente carregadas ou ligações internucleotídicas neutras, etc., que compreendem P−N=. Em algumas modalidades, o fósforo de ligação é trivalente. Em algumas modalidades, o fósforo de ligação é pentavalente. Em algumas modalidades, tais ligações internucleotídicas têm a estrutura da fórmula I-n-1, I-n-2, I- n-3, I-n-4, II, II-a-1, II-a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c- 2, II-d-1, II-d-2, ou uma forma de sal do mesmo.
[001556] Procedimento Geral I para Cloroderivado: Em algumas modalidades, em um procedimento exemplificativo, um auxiliar quiral (174,54 mmol) foi seco por evaporação azeotrópica com tolueno anidro (80 ml x 3) a 35 oC em um evaporador rotativo e seco sob alto vácuo de um dia para o outro. Uma solução deste auxiliar quiral seco (174,54 mmol) e 4-metilmorfolina (366,54 mmol) dissolvido em THF anidro (200 ml) foi adicionada a uma solução resfriada com gelo (banho de álcool isopropílico-gelo seco) de triclorofosfina (37,07 g, 16,0 ml, 183,27 mmol) em THF anidro (150 ml) colocada em um frasco de fundo redondo de três gargalos através de uma cânula sob Argônio (Temp inicial: -10,0 oC, Máx: temp 0 oC, adição de 28 min) e a mistura de reação foi aquecida a 15 oC por 1 h. Após isto, o sólido branco precipitado foi filtrado por vácuo sob argônio usando tubo de filtro sem ar (Chemglass: Tubo de Filtro, 24/40 Inner Joints, 80 mm OD Medium Frit, Airfree, Schlenk). O solvente foi removido com evaporador rotativo sob argônio à baixa temperatura (25 oC) e o semissólido bruto obtido foi seco a vácuo de um dia para o outro (~15 h) e foi usado na etapa seguinte diretamente.
[001557] Procedimento Geral I para Cloroderivado: Em algumas modalidades, em um procedimento exemplificativo, um auxiliar quiral (174,54 mmol) foi seco por evaporação azeotrópica com tolueno anidro (80 ml x 3) a 35 oC em um evaporador rotativo e seco sob alto vácuo de um dia para o outro. Uma solução deste auxiliar quiral seco (174,54 mmol) e 4-metilmorfolina (366,54 mmol) dissolvido em THF anidro (200 ml) foi adicionada a uma solução resfriada com gelo (banho de álcool isopropílico-gelo seco) de triclorofosfina (37,07 g, 16,0 ml, 183,27 mmol) em THF anidro (150 ml) colocada em um frasco de fundo redondo de três gargalos através de uma cânula sob Argônio (Temp inicial: -10,0 oC, Máx: temp 0 oC, adição de
28 min) e a mistura de reação foi aquecida a 15 oC por 1 h. Após isto, o sólido branco precipitado foi filtrado por vácuo sob argônio usando tubo de filtro sem ar (Chemglass: Tubo de Filtro, 24/40 Inner Joints, 80 mm OD Medium Frit, Airfree, Schlenk). O solvente foi removido com evaporador rotativo sob argônio à baixa temperatura (25 oC) e o semissólido bruto obtido foi seco a vácuo de um dia para o outro (~15 h) e foi usado na etapa seguinte diretamente.
[001558] Procedimento Geral III para Acoplamento: Em algumas modalidades, em um procedimento exemplificativo, um nucleosídeo (9,11 mmol) foi seco por coevaporação com 60 ml de tolueno anidro (60 ml x 2) a 35 oC e seco sob alto vácuo de um dia para o outro. O nucleosídeo seco foi dissolvido em THF seco (78 ml), seguido de adição de trietilamina (63,80 mmol) e, então, resfriado até -5 °C sob Argônio (para invólucro de 2'F-dG/2'OMe-dG 0,95 eq de TMS-Cl usado). A solução de THF do produto bruto (produzida a partir do procedimento geral I (ou) II, 14,57 mmol), foi adicionada através de uma cânula por 3 min, então, gradualmente aquecida até a temperatura ambiente. Após 1 h à temperatura ambiente, TLC indicou a conversão de SM no produto (tempo de reação total de 1 h), a mistura de reação foi, então, bruscamente arrefecida com H2O (4,55 mmol) a 0 oC, e MgSO4 anidro (9,11 mmol) foi adicionado e agitado por 10 min. Então, a mistura de reação foi filtrada sob argônio usando tubo de filtro sem ar, lavada com THF e seca sob evaporação rotativa a 26 °C para proporcionar um produto sólido bruto, que foi seco sob alto vácuo de um dia para o outro. O produto bruto foi purificado por sistema ISCO-Combiflash (coluna de sílica rediSep de alto desempenho pré-equilibrada com Acetonitrila) usando Acetato de etila/Hexano com TEA a 1% como um solvente (composto eluído em 100% de EtOAc/Hexanos/1% de Et3N) (para invólucro de 2'F-dG de Acetonitrila/Acetato de etila com TEA a 1% usado). Após a evaporação de frações de coluna agrupadas o resíduo foi seco sob alto vácuo para proporcionar o produto como um sólido branco.
[001559] Preparação de amiditas (1030 a 1039).
[001560] Preparação de 1030: Procedimento Geral I seguido pelo Procedimento Geral III usado. Sólido espumoso branco-sujo. Rendimento: (73%). 31P RMN (162 MHz, CDCl3) δ 153,32. (ES) m/z Calculado para C47H50FN6O10PS: 940,98 [M]+, Observado: 941,78 [M + H]+.
[001561] Preparação de 1031: Procedimento Geral I seguido pelo Procedimento Geral III usado. Sólido espumoso branco-sujo. Rendimento: (78%). 31P RMN (162 MHz, CDCl3) δ 153,62. (ES) m/z Calculado para C42H43FN3O10PS: 831,85 [M]+, Observado: 870,58 [M + K]+.
[001562] Preparação de 1032: Procedimento Geral I seguido pelo Procedimento Geral III usado. Sólido espumoso branco-sujo. Rendimento: (68%). 31P RMN (162 MHz, CDCl3) δ 153,95. (ES) m/z Calculado para C44H46FN4O10PS: 872,26 [M]+, Observado: 873,62 [M + H]+.
[001563] Preparação de 1033: Procedimento Geral I seguido pelo Procedimento Geral III usado. sólido espumoso branco. Rendimento: (87%). 31P RMN (162 MHz, CDCl3) δ 151,70. (ES) m/z Calculado para C50H48FN6O9PS: 958,29 [M]+, Observado: 959,79, 960,83 [M + H]+.
[001564] Preparação de 1034: Procedimento Geral I seguido pelo Procedimento Geral III usado. Sólido espumoso branco-sujo. Rendimento: (65%). 31P RMN (162 MHz, CDCl3) δ 154,80. (ES) m/z Calculado para C51H51N6O10PS: 971,31 [M]+, Observado: 971,81 [M + H]+.
[001565] Preparação de 1035: Procedimento Geral I seguido pelo Procedimento Geral III usado. Sólido espumoso branco-sujo. Rendimento: (76%). 31P RMN (162 MHz, CDCl3) δ 156,50. (ES) m/z Calculado para C53H55N6O11PS: 1014,33 [M]+, Observado: 1015,81 [M + H]+.
[001566] Preparação de 1036: Procedimento Geral I seguido pelo Procedimento Geral III usado. Sólido espumoso branco-sujo. Rendimento: (78%). 31P RMN (162 MHz, CDCl3) δ 156,40. (ES) m/z Calculado para C50H57N6O12PS: 996,34 [M]+, Observado: 997,90 [M + H]+.
[001567] Preparação de 1037: Procedimento Geral I seguido pelo Procedimento Geral III usado. Sólido espumoso branco-sujo. Rendimento: (73%). 31P RMN (162 MHz, CDCl3) δ 154,87. (ES) m/z Calculado para C46H52N3O12PS: 901,30 [M]+, Observado: 940,83 [M + K]+.
[001568] Preparação de 1038: Procedimento Geral I seguido pelo Procedimento Geral III usado. Sólido espumoso branco-sujo. Rendimento: (75%). 31P RMN (162 MHz, CDCl3) δ 154,94. (ES) m/z Calculado para C53H57N4O12PS: 1004,34 [M]+, Observado: 1005,86 [M + H]+.
[001569] Preparação de 1039: Procedimento Geral I seguido pelo Procedimento Geral III usado. Sólido espumoso branco-sujo. Rendimento: (80%). 31P RMN (162 MHz, CDCl3) δ 153,52. (ES) m/z Calculado para C44H47N4O10PS: 854,28 [M]+, Observado: 855,41 [M + H]+.
[001570] Preparação de amiditas (1040 a 1049).
[001571] Preparação de 1040: Procedimento Geral I seguido pelo Procedimento Geral III usado. Sólido espumoso branco-sujo. Rendimento: (78%). 31P RMN (162 MHz, CDCl3) δ 157,80. (ES) m/z Calculado para C47H50FN6O10PS: 940,98 [M]+, Observado: 941,68 [M + H]+.
[001572] Preparação de 1041: Procedimento Geral I seguido pelo Procedimento Geral III usado. Sólido espumoso branco-sujo. Rendimento: (78%). 31P RMN (162 MHz, CDCl3) δ 157,79. (ES) m/z Calculado para C42H43FN3O10PS: 831,85 [M]+, Observado: 870,68 [M + K]+.
[001573] Preparação de 1042: Procedimento Geral I seguido pelo Procedimento Geral III usado. Sólido espumoso branco-sujo. Rendimento: (78%). 31P RMN (162 MHz, CDCl3) δ 158,07. (ES) m/z Calculado para C44H46FN4O10PS: 872,26 [M]+, Observado: 873,62 [M + H]+.
[001574] Preparação de 1043: Procedimento Geral I seguido pelo Procedimento Geral III usado. sólido espumoso branco. Rendimento: (86%). 31P RMN (162 MHz, CDCl3) δ 156,48. (ES) m/z Calculado para C50H48FN6O9PS: 958,29 [M]+, Observado: 959,79, 960,83 [M + H]+.
[001575] Preparação de 1044: Procedimento Geral I seguido pelo Procedimento Geral III usado. Sólido espumoso branco-sujo. Rendimento: (65%). 31P RMN (162 MHz, CDCl3) δ 154,80. (ES) m/z Calculado para C51H51N6O10PS: 971,31 [M]+, Observado: 971,81 [M + H]+.
[001576] Preparação de 1045: Procedimento Geral I seguido pelo Procedimento Geral III usado. Sólido espumoso branco-sujo. Rendimento: (77%). 31P RMN (162 MHz, CDCl3) δ 154,74. (ES) m/z Calculado para C53H55N6O11PS: 1014,33 [M]+, Observado: 1015,81 [M + H]+.
[001577] Preparação de 1046: Procedimento Geral I seguido pelo Procedimento Geral III usado. Sólido espumoso branco-sujo. Rendimento: (76%). 31P RMN (162 MHz, CDCl3) δ 155,05. (ES) m/z Calculado para C50H57N6O12PS: 996,34 [M]+, Observado: 997,90 [M + H]+.
[001578] Preparação de 1047: Procedimento Geral I seguido pelo Procedimento Geral III usado. Sólido espumoso branco-sujo. Rendimento: (75%). 31P RMN (162 MHz, CDCl3) δ 155,44. (ES) m/z Calculado para C46H52N3O12PS: 901,30 [M]+, Observado: 940,83 [M + K]+.
[001579] Preparação de 1048: Procedimento Geral I seguido pelo Procedimento Geral III usado. Sólido espumoso branco-sujo. Rendimento: (73%). 31P RMN (162 MHz, CDCl3) δ 155,96. (ES) m/z Calculado para C53H57N4O12PS: 1004,34 [M]+, Observado: 1005,86 [M + H]+.
[001580] Preparação de 1049: Procedimento Geral I seguido pelo Procedimento Geral III usado. Sólido espumoso branco-sujo. Rendimento: (80%). 31P RMN (162 MHz, CDCl3) δ 156,37. (ES) m/z Calculado para C44H47N4O10PS: 854,28 [M]+, Observado: 855,31 [M + H]+.
[001581] Preparação de Amiditas (1051).
[001582] Preparação de 1051: Procedimento Geral II seguido pelo Procedimento Geral III usado. Sólido espumoso branco-sujo. Rendimento: (72%). 31P RMN (162 MHz, CDCl3) δ 154,26. (ES) m/z Calculado para C42H50FN4O10PS: 852,29 [M]+, Observado: 853,52 [M + H]+.
[001583] Preparação de Amiditas (1052).
[001584] Preparação de 1052: Procedimento Geral II seguido pelo Procedimento Geral III usado. Sólido espumoso branco-sujo. Rendimento: (76%). 31P RMN (162 MHz, CDCl3) δ 156,37. (ES) m/z Calculado para C42H50FN4O10PS: 852,29 [M]+, Observado: 853,52 [M + H]+.
[001585] Preparação de Amiditas (1053, 1054).
[001586] Preparação de 1053: Procedimento Geral II seguido pelo Procedimento Geral III usado. Sólido espumoso branco-sujo. Rendimento: (80%). 31P RMN (162 MHz, CDCl3) δ 156,62. (ES) m/z Calculado para C47H50FN6O8PS: 908,98 [M]+, Observado: 909,36 [M + H]+.
[001587] Preparação de 1054: Procedimento Geral II seguido pelo Procedimento Geral III usado. Sólido espumoso branco-sujo. Rendimento: (79%). 31P RMN (162 MHz, CDCl3) δ 157,62. (ES) m/z Calculado para C44H46FN4O8PS: 840,90 [M]+, Observado: 841,67 [M + H]+.
[001588] Preparação de Amiditas (1055).
[001589] Preparação de 1055: Procedimento Geral II seguido pelo Procedimento Geral III usado. Sólido espumoso branco. Rendimento: (77 %). 31P RMN (162 MHz, CDCl3) δ 160,00. (ES) m/z Calculado para C45H45FN5O10PS: 897,26 [M]+, Observado: 898,74 [M + H]+.
[001590] Preparação de Amiditas (1056).
[001591] Preparação de 1056: Procedimento Geral II seguido pelo Procedimento Geral III usado. Sólido espumoso branco-sujo. Rendimento: (84%). 31P RMN (162 MHz, CDCl3) δ 154,80. (ES) m/z Calculado para C45H44ClFN5O8P: 867,26 [M]+, Observado: 868,69 [M + H]+.
[001592] Preparação de Amiditas (1057).
[001593] Preparação de 1057: Procedimento Geral II seguido pelo Procedimento Geral III usado. sólido espumoso branco. Rendimento: (91%). 31P RMN (162 MHz, CDCl3) δ 154,48. (ES) m/z Calculado para C52H55FN5O10PS: 991,34 [M]+, Observado: 992,87 [M + H]+. Exemplo 4F Tecnologias Exemplificativas para preparação de oligonucleotídeo quiralmente controlada - ciclos, condições e reagentes exemplificativos para a síntese de oligonucleotídeo
[001594] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece tecnologias (por exemplo, reagentes, solventes, condições, parâmetros de ciclo, métodos de clivagem, métodos de desproteção, métodos de purificação, etc.) que são particularmente úteis para preparar ligações internucleotídicas quiralmente controladas. Em algumas modalidades, tais ligações internucleotídicas, por exemplo, ligações internucleotídicas não negativamente carregadas ou ligações internucleotídicas neutras, etc., compreendem P−N=, em que P é o fósforo de ligação. Em algumas modalidades, o fósforo de ligação é trivalente. Em algumas modalidades, o fósforo de ligação é pentavalente. Em algumas modalidades, tais ligações internucleotídicas têm a estrutura da fórmula I-
n-1, I-n-2, I-n-3, I-n-4, II, II-a-1, II-a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, II-d-2, ou uma forma de sal do mesmo. Conforme demonstrado no presente documento, as tecnologias da presente revelação podem fornecer condições de reação brandas, alta compatibilidade de grupo funcional, condições alternativas de desproteção e/ou clivagem, altos rendimentos de produto bruto e/ou purificado, alta pureza de produto bruto, alta pureza de produto bruto e/ou alta estereosseletividade.
[001595] Em algumas modalidades, um ciclo para preparar ligações de fosfato neutras compreende ou consiste em desproteção (por exemplo, destritilação), acoplamento, oxidação (por exemplo, usando I2/Pyr/Água ou outros métodos adequados disponíveis na técnica) e capping (por exemplo, cap 2 descrito no presente documento ou outros métodos adequados disponíveis na técnica). Um ciclo exemplificativo é mostrado abaixo, em que B1 e B2 são, independentemente, nucleobases. Como entendido por aqueles versados na técnica, várias modificações, por exemplo, modificações de açúcar, modificações de base, etc. são compatíveis e podem estar incluídas.
[001596] Em algumas modalidades, um ciclo para preparar ligações de fosfato não naturais (por exemplo, ligações internucleotídicas de fosforotioato) compreende ou consiste em desproteção (por exemplo, destritilação), acoplamento, um primeiro capping (por exemplo, capping-1 conforme descrito no presente documento), modificação (por exemplo, tiolação usando XH ou outros métodos adequados disponíveis na técnica), e um segundo capping (por exemplo, capping-2 conforme descrito no presente documento outros métodos adequados disponíveis na técnica). Um ciclo exemplificativo é mostrado abaixo, em que B1 e B2 são, independentemente, nucleobases. Como entendido por aqueles versados na técnica, várias modificações, por exemplo, modificações de açúcar, modificações de base, etc. são compatíveis e podem estar incluídas. Em algumas modalidades, um ciclo que usa um auxiliar quiral DPSE é chamado de um ciclo DPSE ou ciclo de amidita DPSE.
[001597] Em algumas modalidades, um ciclo para preparar ligações de fosfato não naturais (por exemplo, certas ligações intenucleotídicas não negativamente carregadas,
ligações intenucleotídicas neutras, etc.), particularmente aquelas que compreendem P−N=, em que P é o fósforo de ligação e/ou aquelas que têm a estrutura da fórmula I-n-1, I-n-2, I- n-3, I-n-4, II, II-a-1, II-a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c- 2, II-d-1, II-d-2, III, ou uma forma de sal da mesma, compreende ou consiste em desproteção (por exemplo, destritilação), acoplamento, um primeiro capping (por exemplo, capping-1 conforme descrito no presente documento),
modificação (por exemplo, usando ADIH ( , hexafluorofosfato de 2-azido-1,3-dimetil-4,5-di-hidro-1H- imidazol-3-io (V)) ou outros métodos adequados disponíveis na técnica), e um segundo capping (por exemplo, capping-2 conforme descrito no presente documento ou outros métodos adequados disponíveis na técnica). Um ciclo exemplificativo é mostrado abaixo, em que B1 e B2 são, independentemente, nucleobases.
Em algumas modalidades, um auxiliar quiral utilizado em tal ciclo para preparar uma ligação internucleotídica quiralmente controlada compreende um grupo removedor de elétrons conforme descrito no presente documento, por exemplo, vários auxiliares quirais que têm um G2 que compreende um grupo removedor de elétrons.
Em algumas modalidades, G2 compreende um grupo –SO2R conforme descrito no presente documento (por exemplo, em algumas modalidades, R é fenila opcionalmente substituída; em algumas modalidades, R é alquila opcionalmente substituída (por exemplo, t-butila); em algumas modalidades, foi observado que R que é alquila (por exemplo, R que é t-butila (por exemplo, WV-CA-240)) pode fornecer resultados comparáveis a R que é fenila opcionalmente substituída (por exemplo, R que é fenila
(PSM))). Como entendido por aqueles versados na técnica, várias modificações, por exemplo, modificações de açúcar, modificações de base, etc. são compatíveis e podem estar incluídas. Em algumas modalidades, um ciclo que usa um auxiliar quiral PSM é chamado de um ciclo de PSM ou ciclo de amidita PSM.
[001598] Vários métodos de clivagem e desproteção podem ser usados de acordo com a presente revelação. Em algumas modalidades, como entendido por aqueles versados na técnica, os parâmetros de clivagem e desproteção
(por exemplo, bases, solventes, temperaturas, equivalentes, tempo, etc.) podem ser ajustados em vista de, por exemplo, estruturas de oligonucleotídeos que serão preparadas (por exemplo, nucleobases, açúcares, ligações internucleotídicas e modificações/desproteções dos mesmos), suportes sólidos, escalas de reação, etc.
Em algumas modalidades, a clivagem e desproteção compreendem uma ou duas ou mais etapas individuais.
Por exemplo, em algumas modalidades, uma clivagem e desproteção em duas etapas é utilizada.
Em algumas modalidades, uma etapa de clivagem e desproteção compreende um reagente contendo fluoreto (por exemplo, TEA-HF, opcionalmente tamponado com bases adicionais tais como TEA) em um solvente adequado (por exemplo, DMSO/H2O) em uma quantidade adequada (por exemplo, cerca de 100 ou mais (por exemplo, 100 ± 5) ml/mmol) e é realizada a uma temperatura adequada (por exemplo, cerca de 0 a 100, 0 a 80, 0 a 50, 0 a 40, 0 a 30, 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 ºC (por exemplo, em um exemplo, 27 ± 2 ºC)) por um período de tempo adequado (por exemplo, cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50 ou mais horas (por exemplo, em um exemplo, 6 ± 0,5 h)). Em algumas modalidades, uma etapa de clivagem e desproteção compreende uma base adequada (por exemplo, NR3) em um solvente adequado (por exemplo, água) (por exemplo, NH4OH conc.) a uma quantidade adequada (por exemplo, cerca de 200 ou mais (por exemplo, 200 ± 5) ml/mmol) e é realizada a uma temperatura adequada (por exemplo, cerca de 0 a 100, 0 a 80, 0 a 50, 0 a 40, 0 a 30, 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 ºC (por exemplo, em um exemplo, 37 ± 2 ºC)) por um período de tempo adequado (por exemplo, cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,
9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50 ou mais horas (por exemplo, em um exemplo, 24 ± 1 h)). Em algumas modalidades, a clivagem e desproteção compreende ou consiste em duas etapas, em que uma etapa (por exemplo, etapa 1) é 1 x TEA-HF em DMSO/H2O, 100 ± 5 ml/mmol, 27 ± 2 ºC e 6 ± 0,5 h, e a outra etapa (por exemplo, etapa 2) é NH4OH conc., 200 ± 5 ml/mmol, 37 ± 2 ºC e 24 ± 1 h. Certos exemplos de processos de clivagem e desproteção são descritos aqui.
[001599] Conforme observado por aqueles versados na técnica, a síntese de oligonucleotídeo é frequentemente realizada em suporte sólido Muitos tipos de suporte sólido são comercialmente disponíveis e/ou podem ser, de outro modo, preparados/obtidos e podem ser usados de acordo com a presente revelação. Em algumas modalidades, um suporte sólido é CPG. Em algumas modalidades, um suporte sólido é NittoPhase HL. Os tipos e tamanhos de suporte sólido podem ser selecionados com base nas aplicações desejadas e, em alguns casos, para um uso específico, um tipo de suporte sólido pode executar melhorar do que o outro. Em algumas modalidades, foi observado que para certas preparações, CPG pode entregar maiores rendimentos e/ou purezas de produto bruto em comparação com certos suportes sólidos de polímero tais como NittoPhase HL.
[001600] As amiditas são tipicamente dissolvidas em solventes em concentrações adequadas. Em algumas modalidades, as amiditas são dissolvidas em ACN. Em algumas modalidades, as amiditas são dissolvidas em uma mistura de dois ou mais solventes. Em algumas modalidades, as amiditas são dissolvidas em uma mistura de ACN e IBN (por exemplo, ACN a 20%/ IBN a 80%). Várias concentrações de amiditas podem ser usadas e podem ser ajustadas em vista de condições específicas (por exemplo, suporte sólido, oligonucleotídeos que serão preparados, tempos de reação, escalas, etc.). Em algumas modalidades, uma concentração de cerca de 0,01 a 0,5, 0,05 a 0,5, 0,1 a 0,5, 0,05, 0,1, 0,15, 0,2, 0,25, 0,3, 0,35, 0,4, 0,45 ou 0,5 M é usada. Em algumas modalidades, uma concentração de cerca de 0,2 M é usada. Em muitas modalidades, as soluções de amidita são secas. Em algumas modalidades, peneiras moleculares 3 Å são usadas para secar soluções de amidita (ou manter soluções de amidita secas). Em algumas modalidades, as peneiras moleculares são usadas em cerca de 15 a 20% v/v.
[001601] Vários equivalentes de amiditas podem ser úteis para síntese de oligonucleotídeo. Como aqueles versados na técnica entenderão, os equivalentes de amiditas podem ser ajustados em vista de condições específicas (por exemplo, suporte sólido, oligonucleotídeos que serão preparados, tempos de reação, escalas, etc.), e equivalentes iguais ou diferentes podem ser usados durante a síntese. Em algumas modalidades, equivalentes de amiditas têm cerca de 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5 ou mais. Em algumas modalidades, um equivalente adequado é de cerca de 2. Em algumas modalidades, um equivalente adequado é de cerca de 2,5. Em algumas modalidades, um equivalente adequado é de cerca de 3. Em algumas modalidades, um equivalente adequado é de cerca de 3,5. Em algumas modalidades, um equivalente adequado é de cerca de 4.
[001602] Vários ativadores estão disponíveis na técnica e podem ser utilizados de acordo com a presente revelação. Em algumas modalidades, um ativador é ETT. Em algumas modalidades, um ativador é CMIMT. Em algumas modalidades, CMIMT é utilizado para síntese quiralmente controlada. Conforme observado por aqueles versados na técnica, ativadores iguais ou diferentes podem ser utilizados para amiditas diferentes, e podem ser utilizados em quantidades diferentes. Em algumas modalidades, os ativadores são utilizados em cerca de 40 a 100%, por exemplo, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% de entrega. Em algumas modalidades, uma entrega é de cerca de 60% (por exemplo, para ETT). Em algumas modalidades, uma entrega é de cerca de 70% (por exemplo, para CMIMT). Em algumas modalidades, a razão molar de ativador/amidita é de cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais. Em algumas modalidades, uma razão molar é de cerca de 3 a 6. Em algumas modalidades, uma razão molar é de cerca de
1. Em algumas modalidades, uma razão molar é de cerca de 2. Em algumas modalidades, uma razão molar é de cerca de 3. Em algumas modalidades, uma razão molar é de cerca de 4. Em algumas modalidades, uma razão molar é de cerca de 5. Em algumas modalidades, uma razão molar é de cerca de 6. Em algumas modalidades, uma razão molar é de cerca de 7. Em algumas modalidades, uma razão molar é de cerca de 8. Em algumas modalidades, uma razão molar é de cerca de 9. Em algumas modalidades, uma razão molar é de cerca de 10. Em algumas modalidades, uma razão molar é cerca de 2 a 5, 2 a 4 ou 3 a 4 (por exemplo, para ETT). Em algumas modalidades, uma razão molar é cerca de 3,7 (por exemplo, para ETT). Em algumas modalidades, uma razão molar é cerca de 3 a 8, 4 a 8, 4 a 7, 4 a 6, 5 a 7, 5 a 8 ou 5 a 6 (por exemplo, para CMIMT). Em algumas modalidades, uma razão molar é de cerca de 5,8 (por exemplo, para CMIMT).
[001603] Conforme entendido por aqueles versados na técnica, várias taxas de fluxo e tempos de reação adequados podem ser utilizados para síntese de oligonucleotídeo, e podem ser ajustadas de acordo com os oligonucleotídeos que serão preparados, escalas, configurações sintéticas, etc. Em algumas modalidades, uma taxa de fluxo de reciclo utilizada para síntese é cerca de 200 cm/h. Em algumas modalidades, um tempo de reciclo é cerca de 1 a 10 minutos. Em algumas modalidades, um tempo de reciclo é de cerca de 8 minutos. Em algumas modalidades, um tempo de reciclo é de cerca de 10 minutos.
[001604] Muitas tecnologias estão disponíveis para modificar ligações P(III), por exemplo, após o acoplamento. Por exemplo, vários métodos estão disponíveis para converter uma ligação P(III) em uma ligação do tipo P(V) P(=O), por exemplo, através de oxidação. Em algumas modalidades, I2/Pyr/H2O é usado. De modo similar, vários métodos estão disponíveis para converter uma ligação P(III) em uma ligação do tipo P(V) P(=S), por exemplo, através de sulfurização. Em algumas modalidades, como ilustrado no presente documento, XH é utilizado como um reagente de tiolação. As tecnologias para converter ligações P(III) em ligações do tipo P(V) P(=N−) estão também amplamente disponíveis e podem ser usadas de acordo com a presente revelação. Em algumas modalidades, como ilustrado no presente documento, ADIH é empregado. Parâmetros de reação adequados são descritos no presente documento. Em algumas modalidades, ADIH é usado a uma concentração de cerca de 0,01 a 0,5, 0,05 a 0,5, 0,1 a 0,5, 0,05, 0,1, 0,15, 0,2, 0,25, 0,3, 0,35, 0,4, 0,45 ou 0,5 M. Em algumas modalidades, a concentração de ADIH é cerca de 0,25 M. Em algumas modalidades, a concentração de ADIH é cerca de 0,3 M. Em algumas modalidades, ADIH é usada em cerca de 1 a 50, 1 a 40, 1 a 30, 1 a 25, 1 a 20, 1 a 10, ou 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45 ou 50 ou mais equivalentes. Em algumas modalidades, um equivalente de ADIH é cerca de 7,5. Em algumas modalidades, um equivalente de ADIH é cerca de 10. Em algumas modalidades, um equivalente de ADIH é cerca de 15. Em algumas modalidades, um equivalente de ADIH é cerca de 20. Em algumas modalidades, um equivalente de ADIH é cerca de 23. Em algumas modalidades, um equivalente de ADIH é cerca de 25. Em algumas modalidades, um equivalente de ADIH é cerca de 30. Em algumas modalidades, um equivalente de ADIH é cerca de 35. Em algumas modalidades, em um experimento, ADIH foi usado em equivalente de 15,2 e tempo de contato de 15 min. Em algumas modalidades, dependendo das amiditas, concentrações, equivalentes, tempos de contato, etc. de reagentes, por exemplo, ADIH, podem ser ajustados.
[001605] As tecnologias da presente revelação são adequadas para preparação em várias escalas. Em algumas modalidades, a síntese é realizada em centenas de umol ou mais. Em algumas modalidades, uma escala é cerca de 200 umol. Em algumas modalidades, uma escala é cerca de 300 umol. Em algumas modalidades, uma escala é cerca de 400 umol. Em algumas modalidades, uma escala é cerca de 500 umol. Em algumas modalidades, uma escala é cerca de 550 umol. Em algumas modalidades, uma escala é cerca de 600 umol. Em algumas modalidades, uma escala é cerca de 650 umol. Em algumas modalidades, uma escala é cerca de 700 umol. Em algumas modalidades, uma escala é cerca de 750 umol. Em algumas modalidades, uma escala é cerca de 800 umol. Em algumas modalidades, uma escala é cerca de 850 umol. Em algumas modalidades, uma escala é cerca de 900 umol. Em algumas modalidades, uma escala é cerca de 950 umol. Em algumas modalidades, uma escala é cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25, ou mais mmol. Em algumas modalidades, uma escala é cerca de 1 mmol ou mais. Em algumas modalidades, uma escala é cerca de 2 mmol ou mais. Em algumas modalidades, uma escala é cerca de 5 mmol ou mais. Em algumas modalidades, uma escala é cerca de 10 mmol ou mais. Em algumas modalidades, uma escala é cerca de 15 mmol ou mais. Em algumas modalidades, uma escala é cerca de 20 mmol ou mais. Em algumas modalidades, uma escala é cerca de 25 mmol ou mais.
[001606] Em algumas modalidades, os rendimentos observados foram 85 a 90 OD/umol (por exemplo, 85,000 OD/mmol para uma síntese de 10,2 mmol, com uma pureza de produto bruto de 58,4% (% de FLP)).
[001607] As tecnologias da presente revelação, entre outros aspectos, podem fornecer várias vantagens quando usadas para preparar oligonucleotídeos que compreendem ligações internucleotídicas quiralmente controladas, por exemplo, aquelas que compreendem P−N= em que P é um fósforo de ligação (por exemplo, ligações internucleotídicas de I-n-1, I- n-2, I-n-3, I-n-4, II, II-a-1, II-a-2, II-b-1, II-b-2, II-c- 1, II-c-2, II-d-1, II-d-2, ou uma forma de sal dos mesmos, etc.). Por exemplo, conforme demonstrado no presente documento, as tecnologias da presente revelação podem fornecer altas purezas e rendimentos de produto bruto (por exemplo, em muitas modalidades, cerca de 55 a 60% de produto de comprimento total para um oligonucleotídeo de 20-mer) com quantidade mínima de oligonucleotídeos mais curtos (por exemplo, de acoplamento, decomposição incompleta, etc.). Tais altos rendimentos e/ou purezas de produto bruto, entre outros aspectos, podem reduzir significativamente a purificação a jusante e podem reduzir significativamente o custo de produção e o custo dos produtos, e em algumas modalidades, facilitam muito ou tornam possível a produção comercial em larga escala, ensaios clínicos e/ou vendas comerciais.
[001608] Procedimento exemplificativo para preparar composições de oligonucleotídeo quiralmente controladas - WV-13864.
[001609] São descritos abaixo procedimentos exemplificativos para preparar WV-13864 usando suporte sólido de baixa densidade aparente de vidro de poro controlado (CPG) (por exemplo, 2'-fC (acetila) através de ligante de CNA CPG (600Å LBD)). As fosforamiditas úteis incluem fosforamidita 5′- ODMTr-2′-F-dA(N6-Bz)-(L)-DPSE, fosforamidita 5′-ODMTr-2′-F- dC(N4-Ac)-(L)-DPSE, fosforamidita 5′-ODMTr-2′-F-dG(N2-iBu)- (L)-DPSE, fosforamidita 5′-ODMTr-2′-F-dU-(L)-DPSE, fosforamidita 5′-ODMTr-2′-OMe-G(N2-iBu)-(L)-DPSE, fosforamidita 5′-ODMTr-2′-F-dC(N4-Ac)-(L)-PSM, fosforamidita 5′-ODMTr-2′-F-dG(N2-iBu)-(L)-PSM, fosforamidita 5'-DMT-2'- OMe-A (Bz)-β-Cianoetila e fosforamidita 5'-DMT-2'-OMe-C (Ac)- β-Cianoetila.
[001610] Solução de hidreto de xantana (XH) 0,1 M foi usada para tiolação. As ligações PN neutras foram formadas usando 0,3 M de hexafluorofosfato de 2-azido-1,3- dimetil-imidazolínio (ADIH) em acetonitrila. A solução de oxidação era 0,04 a 0,06 M de iodo em piridina/água, 90/10, v/v. Cap A eraN-Metilimidazol em acetonitrila, 20/80, v/v. Cap B era anidrido acético/2,6-Lutidina/Acetonitrila, 20/30/50, v/v/v. O desbloqueio foi realizado usando ácido dicloroacético a 3% em tolueno. NH4OH usado foi hidróxido de amônio concentrado a 28 a 30%.
[001611] Destritilação.
[001612] Para iniciar a síntese, o suporte sólido 5'-ODMTr-2'-F-dC(N4-Ac)-CPG foi submetido à remoção catalisada por ácido do grupo protetor DMTr da 5'-hidroxila por tratamento com 3% (DCA) em tolueno. A etapa de remoção de DMTr foi geralmente visualizada com cor vermelha ou laranja forte e pode ser monitorada por comando de relógio UV no comprimento de onda de 436 nm.
[001613] A remoção de DMTr pode ser repetida no início de um ciclo de síntese. Em cada caso, após a destritilatção, o material ligado a suporte foi lavado com acetonitrila na preparação da etapa seguinte da síntese.
[001614] Acoplamento.
[001615] As amiditas foram dissolvidas em acetonitrila (ACN) ou em isobutironitrila a 20% (IBN)/ACN a 80% a uma concentração de 0,2M sem correção de densidade. As soluções foram secas em peneiras moleculares (3Å) não menos que 4 h antes do uso (15 a 20%, v/v).
Amidita Solvente Concentração MS3Å 0,2M 15- 5'-ODMTr-2'-OMe-A(N6- ACN 20%, Bz)-CE v/v
0,2M 15- 5'-ODMTr-2'-OMe-C(N4- ACN 20%, Ac)-CE v/v 0,2M 15- 5'-ODMTr-2'-F-dA(N6- ACN 20%, Bz)-(L)-DPSE v/v 0,2M 15- 5'-ODMTr-2'-F-dC(N4- ACN 20%, Ac)-(L)-DPSE v/v 0,2M 15- 5'-ODMTr-2'-F-dU-(L)- 20% IBN/ 80% 20%,
DPSE ACN v/v 0,2M 15- 5'-ODMTr-2'-F-dG(N2- ACN 20%, iBu)-(L)-DPSE v/v 0,2M 15- 5'-ODMTr-2'-OMe-G(N2- 20% IBN/ 80% 20%, iBu)-(L)-DPSE ACN v/v 0,2M 15- 5'-ODMTr-2'-F-dC(N4- ACN 20%, Ac)-(L)-PSM v/v 0,2M 15- 5'-ODMTr-2'-F-dG(N2- ACN 20%, iBu)-(L)-PSM v/v
[001616] A abordagem de acoplamento de ativadores duplos (CMIMT e ETT) foi usada. Ambos os ativadores foram dissolvidos em ACN a uma concentração de 0,5M. CMIMT foi usado para acoplamento quiralmente controlado com razão molar de CMIMT para amidita de 5.833/1. ETT foi usado para o acoplamento de amiditas padrão (para ligações de fosfato naturais) com razão molar de ETT para amidita de 3.752/1. O tempo de reciclo para todas as amiditas DPSE e PSM foi 10 min exceto mG-L-DPSE que foi 8 min. Todas as amiditas padrão foram acopladas por 8 min.
[001617] Cap-1 (Capping-1, primeiro capping).
[001618] Cap B (Ac2O / 2,6-lutidina / MeCN (2:3:5, v/v/v)) foi usado. Em algumas modalidades, os grupos amino secundários foram capeados com Cap-1, por exemplo, nos auxiliares quirais. Em algumas modalidades, a proteção incompleta de aminas secundárias pode levar a uma reação colateral resultando em um acoplamento ou formação malsucedida de um ou mais subprodutos. Em algumas modalidades, Cap-1 pode não ser uma condição eficiente para esterificação (por exemplo, uma condição menos eficiente do que Cap-2 (o segundo capping) para capping de 5'-OH não reagido).
[001619] Tiolação para Ciclos DPSE.
[001620] Após o Cap-1, intermediários de fosfito, P(III), foram modificados com reagente de sulfurização. Em uma preparação exemplificativa, 1,2 CV (6-7 equivalente) de reagente de sulfurização (0,1 M de XH / piridina-ACN, 1:1, v/v) foi entregue através da coluna sintética por meio de fluxo através de modo ao longo de 6 minutos de tempo de contato para formar P(V).
[001621] Reação de Azida para Ciclos PSM.
[001622] Após o Cap-1, um reagente adequado (por exemplo, que compreende −N3 tal como ADIH), em ACN foi usado para formar ligações internucleotídicas neutras (ligações PN). Em uma preparação exemplificativa, 10,3 eq. de 0,25 M de ADIH ao longo de 10 min de tempo de contato para fG-
L-PSM e 25,8 eq. de 0,3 M de ADIH ao longo de 15 min de tempo de contato para fC-L-PSM foram usados nos respectivos ciclos.
[001623] Oxidação para Ciclos de Nucleotídeo Padrão.
[001624] A etapa de Cap-1 não foi necessária para ciclo de amidita padrão. Após o acoplamento de uma amidita padrão no suporte sólido, o intermediário de fosfito, P(III), foi oxidado com 0,05 M de solução de iodo/água/piridina para formar P(V). Em uma preparação exemplificativa, 3,5 eq. de solução de oxidação foram entregues à coluna por um fluxo através de modo ao longo de 2 min de tempo de contato para oxidação eficiente.
[001625] Cap-2 (capping-2, um segundo capping).
[001626] A eficiência de acoplamento na síntese de o oligonucleotídeo em fase sólida para cada ciclo foi aprox. 97 a 100% e monitorada, por exemplo, por liberação de cátion DMTr. Grupos hidroxila 5’ não acoplados residuais, tipicamente 1 a 3% por monitoramento de destrit, no suporte sólido foram bloqueados com Cap A (N-Metilimidazol a 20% em acetonitrila (NMI/ACN = 20/80, v/v)) e Cap B (20%:30%:50% = Ac2O:2,6-Lutidina: reagentes ACN (v/v/v)) (por exemplo, 1:1). Ambos os reagentes (por exemplo, 0,4 CV) foram entregues à coluna por fluxo através de modo ao longo de 0,8 min de tempo de contato para impedir a formação de sequências falhas. Os grupos amina não capeados podem também ser protegidos nesta etapa.
[001627] Como ilustrado no presente documento, em algumas modalidades, uma amidita DPSE ou ciclo DPSE é Destritilação -> Acoplamento -> Cap-1 (Capping-1, primeiro capping) -> Tiolação -> Cap-2 (Capping-1, Pós-capping, segundo capping); em algumas modalidades, uma amidita PSM ou ciclo PSM é Destritilação -> Acoplamento -> Cap-1 (Capping-1, primeiro capping) -> Reação de azida -> Cap-2 (Capping-1, Pós-capping, segundo capping); em algumas modalidades, uma amidita padrão ou ciclo padrão (traditconal, não quiralmente controlada) é Destritilação -> Acoplamento -> Oxidação -> Cap-2 (Capping-1, Pós-capping, segundo capping).
[001628] Os ciclos sintéticos foram selecionados e repetidos até o comprimento desejado ser obtido.
[001629] Lavagem de amina.
[001630] Em algumas modalidades, as tecnologias fornecidas são particularmente eficazes para preparar oligonucleotídeos que compreendem ligações internucleotídicas que compreendem P−N=, em que P é o fósforo de ligação. Em algumas modalidades, as tecnologias fornecidas compreendem colocar um intermediário em contato com uma base. Em algumas modalidades, um contato é realizado após os comprimentos de oligonucleotídeo desejados serem obtidos. Em algumas modalidades, tal contato fornece um oligonucleotídeo que compreende ligações internucleotídicas que compreendem P−N=, em que P é o fósforo de ligação (por exemplo, aquelas da fórmula I-n-1, I-n-2, I-n-3, I-n-4, II, II-a-1, II-a-2, II-b- 1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, II-d-2, ou um sal do mesmo). Em algumas modalidades, um contato remove um auxiliar quiral (por exemplo, aqueles com um G2 que é conectado ao restante da molécula através de um átomo de carbono, e o átomo de carbono é conectado a pelo menos um grupo removedor de elétrons (por exemplo, WV-CA-231, WV-CA-236, WV-CA-240, etc.)). Em algumas modalidades, um contato é realizado usando uma base ou uma solução de uma base que é substancialmente isenta de OH− ou água (anidra). Em algumas modalidades, uma base é uma amina (por exemplo, N(R)3). Em algumas modalidades, uma amina tem a estrutura de NH(R)2, em que cada R é independentemente C1-6 alifático opcionalmente substituído; em algumas modalidades, cada R é independentemente C1-6 alquila opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, uma base é N, N- dietilamina (DEA). Em algumas modalidades, uma solução de base é DEA/ACN a 20%. Em algumas modalidades, tal contato com uma base reduz os níveis de subprodutos que, em um ou mais locais de ligações internucleotídicas que compreendem P−N=, têm, em vez disso, ligações de fosfato naturais.
[001631] Em uma preparação exemplificativa, uma lavagem de amina em coluna foi realizada após o término de ciclos de síntese de oligonucleotídeo e nucleotídeo, por cinco volumes de coluna de DEA a 20% em acetonitrila ao longo de 15 min de tempo de contato.
[001632] Em algumas modalidades, o contato com uma base podem também remover o grupo 2-cianoetila usado para construção de ligação de fosfato natural padrão. Em algumas modalidades, o contato com uma base fornece uma ligação de fosfato natural (por exemplo, em uma forma de sal em que o cátion é o sal de amônio correspondente da base de amina).
[001633] Clivagem e desproteção.
[001634] Após o contato com uma base, os oligonucleotídeos são expostos à clivagem e desproteção adicional. Em uma preparação exemplificativa, a remoção de auxiliar (por exemplo, DPSE), clivagem & desproteção era um processo em duas etapas. Na etapa 1, o suporte sólido CPG com oligonucleotídeos foi tratado com 1 x de solução TEA-HF (DMSO:
Água: TEA.3HF: TEA = 43: 8,6: 2,8: 1 = v/v/v/v, 100 ± 5 ul/ umol) para 6 ± 0,5h a 27 ± 2 °C. A pasta fluida a granel foi então tratada com hidróxido de amônio concentrado (28 a 30%, 200 ± 10 ml/mmol) por 24 ± 1h a 37 ± 2 °C (etapa 2) para liberar o oligonucleotídeo do suporte sólido. O produto bruto foi coletado por filtração. Os filtrados foram combinados com lavagens (por exemplo, água) do suporte sólido. Em algumas modalidades, os rendimentos observados eram cerca de 80 a 90 OD/umol.
[001635] Procedimento exemplificativo para preparar composições de oligonucleotídeo quiralmente controladas - WV-13835.
[001636] Em uma preparação exemplificativa, WV-13835 foi preparado em uma escala de 1,2 mmol começando de CPG 2'-F-U. DPSE foi usado como auxiliar quiral para ligações internucleotídicas quiralmente controladas. A preparação compreende vários ciclos que compreendem uma etapa de desbloqueio (destritilação sob uma condição ácida), uma etapa de acoplamento (com uma fosforamidita DPSE), uma etapa de capping pré-modificação (por exemplo, Cap B), uma etapa de modificação (por exemplo, tiolação usando 0,1M de XH em Pyr/CAN), uma etapa de capping pós-modificação (por exemplo, sob uma condição de cap 2 (1:1 Cap A + Cap B). Em algumas modalidades, um ciclo compreende uma etapa de modificação que é ou compreende oxidação com I2/Pyr/H2O. A clivagem e desproteção. Incluíram duas etapas, em que a etapa um utilizou TEA-HF em 100 ml/mmol e 27 ± 2,5 ºC, e a etapa 2 utilizou NH4OH conc. em 200 ml/mmol e 37 ± 2,5 ºC. O rendimento de produto bruto total foi 91800 OD (76500 OD/mmol). A % líquida de FLP era 53,6% e a % de FLP de NAP (após a dessalinização) era 58,3%. A % de FLP em produto bruto era 1,71 g.
[001637] Procedimento exemplificativo para preparar composições de oligonucleotídeo quiralmente controladas - WV-14791.
[001638] Em uma preparação exemplificativa, WV-14791 foi preparado em uma escala de 402 umol começando de CPG 2'-F-U. DPSE foi usado como auxiliar quiral para ligações internucleotídicas de fosforotioato quiralmente controladas e PSM para n001 quiralmente controlado. A preparação compreende vários ciclos que compreendem uma etapa de desbloqueio (destritilação sob uma condição ácida), uma etapa de acoplamento (com um DPSE (para uma ligação internucleotídica de fosforotioato quiralmente controlada) ou fosforamiditas PSM (para uma ligação internucleotídica de n001 quiralmente controlado)), uma etapa de capping pré-modificação (por exemplo, Cap B), uma etapa de modificação (por exemplo, tiolação usando 0,1M de XH em Pyr/CAN para ligações internucleotídicas de fosforotioato, hexafluorofosfato de 2- azido-1,3-dimetil-imidazolínio em CAN para n001),), uma etapa de capping pós-modificação (por exemplo, sob uma condição de cap 2 (1:1 Cap A + Cap B). Em algumas modalidades, um ciclo compreende uma etapa de modificação que é ou compreende oxidação com I2/Pyr/H2O. O rendimento de produto bruto total foi 27000 OD (67,1 OD/umol). A % líquida de FLP era 45,7% e a % de FLP de NAP (após a dessalinização) era 51,8%. A % de FLP em produto bruto era 445 mg.
[001639] Procedimento exemplificativo para preparar composições de oligonucleotídeo quiralmente controladas - WV-14344.
[001640] Em uma preparação exemplificativa, WV-14344 foi preparado em uma escala de 400 umol começando de CPG 2'-F-C. DPSE foi usado como auxiliar quiral para ligações internucleotídicas de fosforotioato quiralmente controladas e PSM para n001 quiralmente controlado. A preparação compreende vários ciclos que compreendem uma etapa de desbloqueio (destritilação sob uma condição ácida), uma etapa de acoplamento (com um DPSE (para uma ligação internucleotídica de fosforotioato quiralmente controlada) ou fosforamiditas PSM (para uma ligação internucleotídica de n001 quiralmente controlado)), uma etapa de capping pré-modificação (por exemplo, Cap B), uma etapa de modificação (por exemplo, tiolação usando 0,1M de XH em Pyr/CAN para ligações internucleotídicas de fosforotioato, hexafluorofosfato de 2- azido-1,3-dimetil-imidazolínio em CAN para n001),), uma etapa de capping pós-modificação (por exemplo, sob uma condição de cap 2 (1:1 Cap A + Cap B). Em algumas modalidades, um ciclo compreende uma etapa de modificação que é ou compreende oxidação com I2/Pyr/H2O. O rendimento de produto bruto total foi 32000 OD (80 OD/umol). A % líquida de FLP era 48,8% e a % de FLP de NAP (após a dessalinização) era 59,2%. A % de FLP em produto bruto era 571 mg.
[001641] Preparação exemplificativa de composições de oligonucleotídeo quiralmente controladas.
[001642] Várias composições de oligonucleotídeo incluindo composição de oligonucleotídeo quiralmente controlada foram preparadas usando as tecnologias descritas no presente documento. Em algumas modalidades, as composições de oligonucleotídeo foram preparadas usando síntese em fase sólida automatizada. Certas preparações foram realizadas em 25 umol usando colunas TWIST™ de coluna de 10um/15um (GlenResearch, catálogo #20-0040) preenchida com 325 mg de nucleosídeos-CPG ligados a CNA.
Ciclos exemplificativos e reagentes de modificação de azida para ligações internucleotídicas quiralmente controladas em 25 umol foram mostrados abaixo.
Período Etapa Operação Reagentes Volume de espera Desbloqueio 1 DCA/DCM a 3% 10 ml 1 min (destritilação) 0,2M de monômero/MeCN 0,5 ml 2 Acoplamento 8 min 0,6M de 1 ml CMIMT/MeCN Capping pré- 3 modificação Cap-B 2 ml 2 min (cap-1)
Modificação 0,2M de (sulfurização Xh/piridina 4 ou ou 2 ml 6 min reação de 0,5M de 2 ml 10 min azida) reagente de azida/MeCN Capping pós- 5 modificação Cap-A + Cap-B 2 ml 45 s (cap-2)
Ligação Reagente Ligação Reagente final de azida final de azida n001 n006 n003 n008 n004
[001643] Após o término dos ciclos, o suporte CPG foi tratado com DEA a 20% em MeCN por 12 min, lavado com MeCN seco e seco sob argônio e vácuo. O suporte CPG seco foi transferido para um tubo plástico de 15 ml, tratado com solução 1X (1M de HF- TEA em H2O-DMSO (1:5, v/v), 100 ul/umol) por 6 h a 28 °C, então NH3 conc. foi adicionado (200 ul/umol) e reagido por 24 h a 37 °C. A mistura foi resfriada até a temperatura ambiente e o CPG foi removido por filtração por membrana, e o produto foi analisado por LTQ e RP-UPLC com um gradiente linear de MeCN (1 a 15%/15 min) em (10 mM de TEA, 100 mM de HFIP em água) a 55 °C em uma taxa de 0,8 ml/min. Os oligonucleotídeos brutos foram purificados por AEX-HPLC eluindo com 20 mM de NaOH a 2,5M de NaCl, e dessalinizado para obter as composições de oligonucleotídeo alvo.
[001644] As preparações exemplificativas foram mencionadas abaixo, com a pureza UPLC de produto bruto situada na faixa de cerca de 9% a cerca de 58% por cento. Purezas HPLC de produto bruto mais altas foram observadas para a preparação dos mesmos oligonucleotídeos e/ou outros. Escala Massa Oligonucleotídeo (umol) Observada WV-16006 70 6912,3 WV-16007 70 7068,9
WV-24092 24 7282 WV-24098 24 7237,1 WV-24104 24 7399,1 WV-24109 24 7355,1 WV-25536 24 6729,1 WV-25537 24 6705,2 WV-25538 24 6739,1 WV-25539 24 6702 WV-25540 24 6726,9 WV-25541 25 7012,6 WV-25542 25 7014,1 WV-25543 25 6989,9 WV-25544 25 7024,2
[001645] Entre outros fatores, as tecnologias fornecidas proporcionaram altas purezas e/ou rendimentos de produto bruto. Em muitas preparações (várias escalas, reagentes, concentrações, tempos de reação, etc.), cerca de 55 a 60% de purezas de produto bruto (% de FLP) foram obtidos, com a quantidade mínima de oligonucleotídeos mais curtos (por exemplo, de acoplamento, decomposição incompleta, reações colaterais, etc.). Em muitas modalidades, as quantidades do oligonucleotídeo mais curto mais significativo são não mais que cerca de 2 a 10%, frequentemente não mais que 2 a 4% (por exemplo, em algumas modalidades, tão baixas quanto cerca de 2% (com o oligonucleotídeo mais curto mais significativo sendo N- 3)).
[001646] Várias tecnologias estão disponíveis para a purificação de oligonucleotídeo e podem ser utilizadas de acordo com a presente revelação. Em algumas modalidades, os produtos brutos foram adicionalmente purificados (por exemplo,
mais de 90% de pureza) usando, por exemplo, purificação AEX e/ou UF/DF.
[001647] Com o uso de tecnologias descritas no presente documento, vários oligonucleotídeos que compreendem sequências de base, modificações (por exemplo, modificações de nucleobase, açúcar e ligação internucleotídica) e/ou padrões dos mesmos, estereoquímica de fósforo de ligação e/ou padrões diversos dos mesmos, etc. foram preparados em várias escalas a partir de umol a mmol. Tais oligonucleotídeos têm vários alvos e podem funcionar através de vários mecanismos. Certos oligonucleotídeos foram apresentados nas Tabelas da presente revelação.
[001648] Como entendido por aqueles versados na técnica, exemplos descritos no presente documento servem apenas para ilustração. Aqueles versados na técnica entenderão que várias condições, parâmetros, etc. podem ser ajustados de acordo com, por exemplo, instrumentação, escalas, reagentes, resultados desejados, etc. Certos resultados podem ser aprimorados usando várias tecnologias de acordo com o presente revelação. Entre outros fatores, os oligonucleotídeos fornecidos e composições dos mesmos podem fornecer propriedades e/ou atividades significativamente aprimoradas, por exemplo, em vários ensaios e modelos in vivo, e podem ser particularmente úteis para prevenir e/ou tratar várias condições, distúrbios ou doenças. Certos dados são fornecidos nos Exemplos no presente documento. Exemplo 4G Síntese de certos reagentes para incorporação de Mod
[001649] Conforme descrito na presente revelação, o oligonucleotídeo da presente revelação pode compreender várias porções químicas adicionais (por exemplo, várias Mods) além da cadeia de porção química de oligonucleotídeo Em algumas modalidades, a presente revelação fornece oligonucleotídeo que compreende a Mod descrita no presente documento. Em algumas modalidades, tais porções químicas adicionais fornecem propriedades, atividades, entregas aprimoradas, etc. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece porções químicas adicionais úteis, e tecnologias para preparar e incorporar tais porções químicas adicionais. Certos exemplos são descritos abaixo. Aqueles versados na técnica observam e várias tecnologias relacionadas a porções químicas adicionais (por exemplo, estruturas, preparações, incorporação, usos, etc.), por exemplo, aquelas descritas nos documentos US 9394333, US 9744183, US 9605019, US 9598458, US 2015/0211006, US 2017/0037399, WO 2017/015555, WO 2017/192664, WO 2017/015575, WO 2017/062862, WO 2017/160741, WO 2017/192679, WO 2017/210647, WO 2018/223056, WO 2018/237194, WO 2019/055951, etc., tais tecnologias de cada um dos quais que são independentemente incorporadas a título de referência, podem ser utilizadas de acordo com a presente revelação.
[001650] Síntese de ácido 5-((1,19-bis((1,3- dimetilimidazolidin-2-ilideno)amino)-10-((3-((3-((1,3- dimetilimidazolidin-2-ilideno)amino)propil)amino)-3- oxopropoxi)metil)-5,15-dioxo-8,12-dioxa-4,16-diazanonadecan- 10-il)amino)-5-oxopentanoico.
[001651] Etapa 1: A uma solução de 15,15- bis(13,13-dimetil-5,11-dioxo-2,12-dioxa-6,10- diazatetradecil)-2,2-dimetil-4,10,17-trioxo-3,13-dioxa- 5,9,16-triazahenicosan-21-oato de benzila (5 g, 4,95 mmol, 1 eq.) em DCM (50 ml) foi adicionado TFA (16,93 g, 148,48 mmol, 10,99 ml, 30 eq.) a 0 °C. A mistura foi agitada a 0 a 25 °C por 2 h. A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida para remover o solvente. Então, foram adicionados ACN (5 ml) e MTBE (40 ml), o líquido viscoso foi filtrado. O produto bruto 5-((1,19-diamino-10-((3-((3-aminopropil)amino)- 3-oxopropoxi)metil)-5,15-dioxo-8,12-dioxa-4,16- diazanonadecan-10-il)amino)-5-oxopentanoato de benzila (5,21 g, produto bruto, 3TFA) foi obtido como um óleo amarelado. LCMS: (M+H+): 710,6; (M+Na+): 732,7.
[001652] Etapa 2: A uma solução de 5-((1,19- diamino-10-((3-((3-aminopropil)amino)-3-oxopropoxi)metil)- 5,15-dioxo-8,12-dioxa-4,16-diazanonadecan-10-il)amino)-5- oxopentanoato de benzila (5,21 g, produto bruto, 3TFA) em DCM (35 ml) foi adicionado DIEA (6,39 g, 49,45 mmol, 8,61 ml, 10 eq.) e 2-cloro-1,3-dimetil-4,5-di-hidroimidazol-1- io;hexafluorofosfato (4,55 g, 16,32 mmol, 3,3 eq.). A mistura foi agitada a 25 °C por 15 h. A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida para remover o solvente. O produto bruto foi purificado por RP-MPLC (Espec: C18, 330g, 20~35 micron, 100 Å). O produto 5-((1,19-bis((1,3- dimetilimidazolidin-2-ilideno)amino)-10-((3-((3-((1,3- dimetilimidazolidin-2-ilideno)amino)propil)amino)-3- oxopropoxi)metil)-5,15-dioxo-8,12-dioxa-4,16-diazanonadecan- 10-il)amino)-5-oxopentanoato de benzila (4,94 g, produto bruto) foi obtido como um óleo amarelo. 1H RMN (400MHz, METANOL-d4) δ = 7,39 - 7,29 (m, 5H), 3,70 - 3,62 (m, 28H), 3,45 (q, J=6,6 Hz, 7H), 3,30 - 3,26 (m, 6H), 3,08 - 2,99 (m, 21H), 2,47 - 2,39 (m, 9H), 2,23 (t, J=7,4 Hz, 2H), 1,92 - 1,78 (m, 10H).
[001653] Etapa 3: A uma solução de 5-((1,19- bis((1,3-dimetilimidazolidin-2-ilideno)amino)-10-((3-((3- ((1,3-dimetilimidazolidin-2-ilideno)amino)propil)amino)-3- oxopropoxi)metil)-5,15-dioxo-8,12-dioxa-4,16-diazanonadecan- 10-il)amino)-5-oxopentanoato de benzila (2 g, 2,00 mmol, 1 eq.) em THF (10 ml) e H2O (2 ml) foi adicionado LiOH.H2O (588,51 mg, 14,02 mmol, 7 eq.). A mistura foi agitada a 25 °C por 3 h. A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida para remover o solvente. O resíduo foi purificado por HPLC prep (coluna: Phenomenex luna C18 250*50 mm*10 um; fase móvel: [água (TFA a 0,1%)- ACN]; B%: 0% a 25%, 20min). Ácido 5-((1,19- bis((1,3-dimetilimidazolidin-2-ilideno)amino)-10-((3-((3- ((1,3-dimetilimidazolidin-2-ilideno)amino)propil)amino)-3- oxopropoxi)metil)-5,15-dioxo-8,12-dioxa-4,16-diazanonadecan- 10-il)amino)-5-oxopentanoico (0,6 g, 651,84 umol, 32,54% de rendimento, 98,66% de pureza) foi obtido como uma goma amarela. 1H RMN (400MHz, DMSO-d6) δ = 8,03 (t l, J = 5,6 Hz, 3H), 7,75 (t l, J = 5,6 Hz, 3H), 7,08 (s, 1H), 3,62 - 3,54 (m, 24H), 3,34 (q, J = 6,6 Hz, 7H), 3,12 (q, J = 6,2 Hz, 5H), 2,96 (s, 18H), 2,30 (t l, J = 6,4 Hz, 6H), 2,23 - 2,03 (m, 4H), 1,79 - 1,59 (m, 8H); LCMS: (M/2+H+): 454,9; LCMS pureza: 98,66%.
[001654] Síntese de ácido (E)-2-metil-14,14- bis((E)-2-metil-3-morfolino-9-oxo-12-oxa-2,4,8-triazatridec- 3-en-13-il)-3-morfolino-9,16-dioxo-12-oxa-2,4,8,15-tetra- azaicos-3-en-20-oico.
[001655] Etapa 1: A uma solução de 15,15- bis(13,13-dimetil-5,11-dioxo-2,12-dioxa-6,10- diazatetradecil)-2,2-dimetil-4,10,17-trioxo-3,13-dioxa- 5,9,16-triazahenicosan-21-oato de benzila (5 g, 4,95 mmol, 1 eq.) em DCM (50 ml) foi adicionado TFA (16,93 g, 148,48 mmol, 10,99 ml, 30 eq.). A mistura foi agitada a 0 a 25 °C por 2 h. A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida para remover o solvente, então foram adicionados ACN (50 ml) e MTBE
(500 ml), o líquido viscoso foi filtrado O produto bruto 5- ((1,19-diamino-10-((3-((3-aminopropil)amino)-3- oxopropoxi)metil)-5,15-dioxo-8,12-dioxa-4,16-diazanonadecan- 10-il)amino)-5-oxopentanoato de benzila (5,21 g, produto bruto, 3TFA) foi obtido como um óleo amarelo. LCMS: (M+H+): 710,6; (M+Na+): 732,5.
[001656] Etapa 2: A uma solução de 5-((1,19- diamino-10-((3-((3-aminopropil)amino)-3-oxopropoxi)metil)- 5,15-dioxo-8,12-dioxa-4,16-diazanonadecan-10-il)amino)-5- oxopentanoato de benzila (3,86 g, 3,67 mmol, 1 eq., 3TFA) em DCM (35,1 ml) foi adicionado DIEA (4,73 g, 36,63 mmol, 6,38 ml, 10 eq.) e [[(Z)-(1-ciano-2-etoxi-2-oxo- etilideno)amino]oxi-morfolino-metileno]- dimetilammonium;hexafluorofosfato (5,18 g, 12,09 mmol, 3,3 eq.). A mistura foi agitada a 25 °C por 15 h. A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida para remover o solvente. O produto bruto foi dissolvido por ACN (15 ml), então, introduzido na coluna de fase reversa. O produto bruto foi purificado por HPLC de fase reversa (0,75 % de TFA em água, e acetonitrila). O composto de produto bruto (E)-2-metil- 14,14-bis((E)-2-metil-3-morfolino-9-oxo-12-oxa-2,4,8- triazatridec-3-en-13-il)-3-morfolino-9,16-dioxo-12-oxa- 2,4,8,15-tetra-azaicos-3-en-20-oato de benzila (4,14 g, produto bruto) foi obtido como um óleo amarelo. 1H RMN (400MHz, METANOL-d4) δ = 7,43 - 7,24 (m, 5H), 3,78 (s l, 13H), 3,72 - 3,64 (m, 12H), 3,50 - 3,36 (m, 13H), 3,27 (d l, J = 8,6 Hz, 11H), 3,11 - 2,97 (m, 18H), 2,50 - 2,42 (m, 8H), 2,26 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 1,93 - 1,78 (m, 8H).
[001657] Etapa 3: A uma solução de (E)-2- metil-14,14-bis((E)-2-metil-3-morfolino-9-oxo-12-oxa-2,4,8-
triazatridec-3-en-13-il)-3-morfolino-9,16-dioxo-12-oxa- 2,4,8,15-tetra-azaicos-3-en-20-oato de benzila (2 g, 1,77 mmol, 1 eq.) em THF (1 ml) e H2O (0,2 ml) foi adicionado LiOH.H2O (519,71 mg, 12,38 mmol, 7 eq.). A mistura foi agitada a 25 °C por 3 h. A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida para remover o solvente. O resíduo foi purificado por HPLC prep (Phenomenex luna C18 250*50 mm *10 um; fase móvel: [água (TFA a 0,1%)-ACN]; B%: 0% a 20%, 20 min). O composto ácido (E)-2-metil-14,14-bis((E)-2-metil-3- morfolino-9-oxo-12-oxa-2,4,8-triazatridec-3-en-13-il)-3- morfolino-9,16-dioxo-12-oxa-2,4,8,15-tetra-azaicos-3-en-20- oico (1,2 g, 1,14 mmol, 64,65% de rendimento, 99,16% de pureza) foi obtido como uma goma amarela. 1H RMN (400MHz, DMSO-d6) δ = 7,99 (s l, 3H), 7,84 (s l, 3H), 7,06 (s, 1H), 3,67 (s l, 12H), 3,59 - 3,49 (m, 12H), 3,44 -3,25 (m, 12H), 3,11 (s l, 12H), 3,02 - 2,81 (m, 17H), 2,31 (t l, J = 6,1 Hz, 6H), 2,23 - 2,04 (m, 4H), 1,79 - 1,60 (m, 8H). LCMS: (M/2+H+): 521,0; LCMS pureza: 99,16%.
[001658] Síntese de ácido (S)-3- (dimetilamino)-26-(3-(dimetilamino)-14,14-bis(3- (dimetilamino)-2-metil-9-oxo-12-oxa-2,4,8-triazatridec-3-en- 13-il)-2-metil-9,16-dioxo-12-oxa-2,4,8,15-tetra-azaicos-3-en- 20-amido)-14,14-bis(3-(dimetilamino)-2-metil-9-oxo-12-oxa- 2,4,8-triazatridec-3-en-13-il)-2-metil-9,16,20,27-tetraoxo- 12-oxa-2,4,8,15,21,28-hexa-azatetratriacont-3-en-34-oico.
[001659] Etapa 1: A uma solução de ácido 3- (dimetilamino)-14,14-bis(3-(dimetilamino)-2-metil-9-oxo-12- oxa-2,4,8-triazatridec-3-en-13-il)-2-metil-9,16-dioxo-12-oxa- 2,4,8,15-tetra-azaicos-3-en-20-oico (10 g, 10,94 mmol, 5 eq.) em DMF (100 ml) foi adicionado DIPEA (2,83 g, 21,88 mmol, 3,81 ml, 10 eq.) e seguido de (S)-6-(2,6-diamino- hexanamido)hexanoato de benzila (924,07 mg, 2,19 mmol, 1 eq., 2HCl) e então HATU (1,91 g, 5,03 mmol, 2,3 eq.) foi adicionado à mistura por gotejamento em DMF (10 ml) a 0 °C. A mistura de reação foi agitada a 25 °C por 12 h. A mistura foi concentrada a vácuo. O resíduo foi purificado por HPLC prep (condição de TFA). Coluna: Coluna: Phenomenex luna C 18 250 * 50 mm * 10 um; fase móvel: [água (TFA a 0,1%)-ACN]; B% de CH3CN: 10% a 35%, 20min. (S)-3-(Dimetilamino)-26-(3-(dimetilamino)-14,14- bis(3-(dimetilamino)-2-metil-9-oxo-12-oxa-2,4,8-triazatridec- 3-en-13-il)-2-metil-9,16-dioxo-12-oxa-2,4,8,15-tetra-azaicos- 3-en-20-amido)-14,14-bis(3-(dimetilamino)-2-metil-9-oxo-12- oxa-2,4,8-triazatridec-3-en-13-il)-2-metil-9,16,20,27- tetraoxo-12-oxa-2,4,8,15,21,28-hexa-azatetratriacont-3-en-34- oato de benzila (3,7 g, produto bruto) foi obtido como um óleo amarelo. 1H RMN (400MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ = 8,01 - 7,77 (m, 10H), 7,63 (t l, J=4,9 Hz, 6H), 7,40 - 7,29 (m, 5H), 7,07 (d l, J=16,5 Hz, 2H), 5,08 (s, 2H), 4,18 - 4,07 (m, 1H), 3,63 - 3,46 (m, 24H), 3,10 (dd l, J=3,2, 5,1 Hz, 25H), 3,00 - 2,78 (m, 79H), 2,39 - 2,23 (m, 18H), 2,15 - 1,98 (m, 20H), 1,72 - 1,13 (m, 31H). LCMS: M/4+H+ = 536,5.
[001660] Etapa 2: A uma solução do composto (S)-3-(dimetilamino)-26-(3-(dimetilamino)-14,14-bis(3- (dimetilamino)-2-metil-9-oxo-12-oxa-2,4,8-triazatridec-3-en- 13-il)-2-metil-9,16-dioxo-12-oxa-2,4,8,15-tetra-azaicos-3-en- 20-amido)-14,14-bis(3-(dimetilamino)-2-metil-9-oxo-12-oxa- 2,4,8-triazatridec-3-en-13-il)-2-metil-9,16,20,27-tetraoxo- 12-oxa-2,4,8,15,21,28-hexa-azatetratriacont-3-en-34-oato de benzila (4,4 g, 2,05 mmol, 1 eq.) em THF (40 ml) e H2O (8 ml) foi adicionado LiOH.H2O (603,45 mg, 14,38 mmol, 7 eq.). A mistura foi agitada a 25 °C por 2 h. A mistura foi concentrada a vácuo. O resíduo foi purificado por HPLC prep (condição de TFA). Coluna: Phenomenex luna C 18 250 * 50 mm* 10 um; fase móvel: água (TFA a 0,1%)-ACN]; B%: 2% a 30%, 20 min. Composto ácido (S)-3-(dimetilamino)-26-(3-(dimetilamino)-14,14-bis(3- (dimetilamino)-2-metil-9-oxo-12-oxa-2,4,8-triazatridec-3-en- 13-il)-2-metil-9,16-dioxo-12-oxa-2,4,8,15-tetra-azaicos-3-en- 20-amido)-14,14-bis(3-(dimetilamino)-2-metil-9-oxo-12-oxa- 2,4,8-triazatridec-3-en-13-il)-2-metil-9,16,20,27-tetraoxo- 12-oxa-2,4,8,15,21,28-hexa-azatetratriacont-3-en-34-oico (1,4 g, 678,84 umol, 33,04% de rendimento, 99,483% de pureza) foi obtido como um óleo amarelo. 1H RMN (400MHz, DMSO-d6) δ = 8,00 (t l, J=5,5 Hz, 6H), 7,91 (t l, J=5,6 Hz, 1H), 7,87 - 7,79 (m, 2H), 7,67 (t l, J=4,8 Hz, 5H), 7,15 - 7,01 (m, 2H), 4,17 - 4,10 (m, 1H), 3,70 - 3,43 (m, 24H), 3,16 - 3,06 (m, 24H), 3,05 - 2,75 (m, 76H), 2,30 (t l, J=6,4 Hz, 12H), 2,18 (t, J=7,4 Hz, 2H), 2,15 - 1,98 (m, 8H), 1,66 (quin, J=6,6 Hz, 17H), 1,48 (quin, J=7,4 Hz, 3H), 1,41 - 1,31 (m, 4H), 1,28 - 1,17 (m, 4H). 13C RMN (101MHz, DMSO-d6) δ = 174,85, 172,67, 172,61, 172,40, 172,19, 170,87, 161,50, 158,77 (q, J=35,2 Hz, 1C), 118,06, 115,15, 68,72, 67,84, 60,03, 53,08, 42,36, 38,87, 38,78, 36,40, 35,95, 35,88, 35,81, 35,25, 34,91, 34,08, 29,85, 29,40, 29,19, 26,34, 24,63, 23,47, 22,14. LCMS: M/3+H+ = 684,7, pureza: 99,48%.
[001661] Síntese de ácido (S)-6-(4-(4-(N-((2- amino-4-oxo-3,4-di-hidropteridin-6-il)metil)-2,2,2- trifluoroacetamido)benzamido)-5-metoxi-5- oxopentanamido)hexanoico.
[001662] Etapa 1: A uma solução de ácido (S)- 4-(((benziloxi)carbonil)amino)-5-metoxi-5-oxopentanoico (14 g, 47,41 mmol, 1 eq.) em THF (150 ml) foi adicionado TEA (14,39 g, 142,23 mmol, 19,80 ml, 3 eq.), seguido de 6-aminoexanoato 6-aminoexanoato de terc-butila (11,54 g, 61,63 mmol, 1,3 eq.) a 0 a 5°C e agitado por 0,5 hora.
T3P (60,34 g, 94,82 mmol, 56,39 ml, 50% de pureza, 2 eq.) foi adicionado à mistura a 0 a 5 °C e agitado a 20 a 25 °C por 12 horas.
TLC (Éter de petróleo/Acetato de etila = 1:1, Rf = 0,35) mostrou que o material de partida foi completamente consumido.
A mistura foi concentrada sob pressão reduzida para remover o solvente e, então redissolvida com acetato de etila (100 ml). A fase orgânica foi lavada por NaHCO3 aquoso saturado (50 ml×3) e seca com Na2SO4 anidro.
O produto bruto foi purificado por MPLC
(SiO2, Éter de petróleo/Acetato de etila = 1:1) para obter (S)- 6-(4-(((benziloxi)carbonil)amino)-5-metoxi-5- oxopentanamido)hexanoato de terc-butila (19,7 g, produto bruto) como um óleo amarelo.
[001663] Etapa 2: Uma mistura de (S)-6-(4- (((benziloxi)carbonil)amino)-5-metoxi-5- oxopentanamido)hexanoato de terc-butila (15 g, 32,29 mmol, 1 eq.) e Pd/C (10 g, 10% de pureza) em THF (300 ml) foi evacuada a vácuo e preenchida com H2 (15 Psi) três vezes, então agitada a 20 a 25 °C por 6 horas. TLC (Éter de petróleo/Acetato de etila = 1:1, Rf = 0) mostrou que o material de partida foi completamente consumido. A mistura foi filtrada e concentrada sob pressão reduzida para remover o máximo de solvente. O produto bruto foi usado para a etapa seguinte sem qualquer purificação. (S)-6-(4-amino-5-metoxi-5- oxopentanamido)hexanoato de terc-butila (10,67 g, 31,42 mmol, 97,31% de rendimento, 97,303% de pureza) foi obtido como um líquido incolor (em solvente). LCMS: M + H+ = 331,2, pureza: 97,70%.
[001664] Etapa 3: A uma mistura de ácido 4-(N- ((2-Amino-4-oxo-3,4-di-hidropteridin-6-il)-metil)-2,2,2- trifluoroacetamido)benzoico (8,28 g, 25,06 mmol, 1,1 eq.) e DIPEA (8,83 g, 68,33 mmol, 11,90 ml, 3 eq.) em DMSO (20 ml) foi adicionado HATU (8,66 g, 22,78 mmol, 1 eq.) e (S)-6-(4- amino-5-metoxi-5-oxopentanamido)hexanoato de terc-butila a 20 a 25 °C e agitado por 12 horas. A mistura foi diluída com H2O (20 ml) e extraída com acetato de etila (20 ml×3). A fase orgânica foi concentrada sob pressão reduzida para remover o solvente. O produto bruto foi purificado por MPLC (SiO2, Metanol/Acetato de etila = 2:5) para obter (S)-6-(4-(4-(N-((2-
amino-4-oxo-3,4-di-hidropteridin-6-il)metil)-2,2,2- trifluoroacetamido)benzamido)-5-metoxi-5- oxopentanamido)hexanoato de terc-butila (26,2 g, produto bruto) como uma goma marrom. LCMS: M + H+ = 721,2.
[001665] Etapa 4: A uma solução de (S)-6-(4- (4-(N-((2-amino-4-oxo-3,4-di-hidropteridin-6-il)metil)-2,2,2- trifluoroacetamido)benzamido)-5-metoxi-5- oxopentanamido)hexanoato de terc-butila (13,1 g, 11,39 mmol, 1 eq.) em DCM (100 ml) foi adicionado TFA (7,79 g, 68,35 mmol, 5,06 ml, 6 eq.) a 0 a 5 °C e a mistura foi agitada a 35 a 40 °C por 12 horas. A mistura foi concentrada sob pressão reduzida para remover o solvente. O produto bruto foi detectado por HPLC e purificado por HPLC prep (coluna: Phenomenex luna C18 250*50 mm*10 um; fase móvel: [água (HCl a 0,05%)-ACN]; B%: 15% a 35%, 20 min) para obter ácido (S)-6-(4-(4-(N-((2-amino-4- oxo-3,4-di-hidropteridin-6-il)metil)-2,2,2- trifluoroacetamido)benzamido)-5-metoxi-5- oxopentanamido)hexanoico (1,51 g, 1,88 mmol, 32,96% de rendimento, 82,627% de pureza). 1H RMN (400MHz, DMSO-d6) δ = 8,92 (d l, J=7,1 Hz, 1H), 8,74 (s, 1H), 7,93 (d l, J=8,4 Hz, 3H), 7,83 (t l, J=5,5 Hz, 1H), 7,66 (d l, J=8,3 Hz, 2H), 5,18 (s, 2H), 5,06 - 4,52 (m, 3H), 4,45 - 4,32 (m, 1H), 3,63 (s, 2H), 3,00 (q, J=6,2 Hz, 2H), 2,25 - 2,13 (m, 4H), 2,12 - 2,03 (m, 1H), 1,99 - 1,87 (m, 1H), 1,46 (quin, J=7,5 Hz, 2H), 1,35 (td, J=7,4, 14,9 Hz, 2H), 1,27 - 1,15 (m, 2H). 13C RMN (101MHz, DMSO-d6) δ = 174,91, 172,83, 171,50, 166,02, 159,47, 153,27, 149,15, 142,22, 134,71, 129,15, 128,99, 128,64, 54,27, 52,97, 52,38, 38,79, 34,05, 32,16, 29,29, 26,76, 26,40, 24,66. LCMS: M + H+ = 665,2. Exemplo 5: Síntese de N6-stearoil-N2-(4-
sulfamoilbenzoil)-L-lisina
[001666] Etapa 1: A uma solução de ácido esteárico (8,00 g, 28,12 mmol) em DCM (210 ml) foi adicionada 1-hidroxipirrolidina-2,5-diona (3,24 g, 28,12 mmol) seguida de EDCI (5,39 g, 28,12 mmol) a 15°C. A mistura foi agitada a 15 °C por 21 h. TLC mostrou que parte do ácido esteárico permaneceu. Adicionalmente foram adicionados 1- hidroxipirrolidina-2,5-diona (0,32 g) e EDCI (1,07 g). A agitação continuou a 15 °C por 8 h. TLC mostrou que a reação foi concluída. O solvente foi evaporado sob pressão reduzida. O resíduo foi dissolvido em DCM (300 ml) e a solução lavada com água (200 ml); a fase aquosa foi então extraída novamente com DCM (2*100 ml). A fase orgânica combinada foi seca (MgSO4) e o solvente evaporado sob pressão reduzida para produzir estearato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ila como um sólido branco. Sem purificação adicional. O produto bruto estearato de 2,5- dioxopirrolidin-1-ila (10,70 g, produto bruto) foi usado na etapa seguinte sem purificação adicional. TLC (Éter de petróleo : Acetato de etila = 1:1) Rf = 0,79.
[001667] Etapa 2: A uma solução de (terc- butoxicarbonil)-L-lisina (4,49 g, 18,24 mmol) e estearato de
2,5-dioxopirrolidin-1-ila (5,80 g, 15,20 mmol) em DMF (20 ml) foi adicionado DIPEA (5,89 g, 45,60 mmol, 7,96 ml). A mistura foi agitada a 20 °C por 20 horas. TLC e LCMS mostraram que a reação foi concluída. A mistura resultante foi concentrada até secar sob pressão reduzida. O resíduo foi combinado com 9 g de composto bruto, particionado entre água (200 ml) e EtOAc (300 ml) e DCM (80 ml). A camada aquosa separada foi extraída com EtOAc (300 ml*3). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com água (100 ml*2), secas com MgSO4anidro, filtradas e concentradas para proporcionar o produto como um sólido branco (14,5 g). O produto bruto composto N2-(terc-butoxicarbonil)- N6-estearoil-L-lisina (7,70 g, produto bruto) foi usado na etapa seguinte sem purificação adicional. 1H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ = 11,29 (s l, 1H), 7,97 (s, 1H), 5,88 (s l, 1H), 5,24 (d l, J=7,3 Hz, 1H), 4,21 (d l, J=5,1 Hz, 1H), 3,17 (q, J=6,5 Hz, 2H), 2,11 (t, J=7,6 Hz, 2H), 1,79 (s l, 1H), 1,64 (dt, J=7,9, 14,0 Hz, 1H), 1,58 - 1,42 (m, 4H), 1,41 - 1,28 (m, 11H), 1,18 (s l, 29H), 0,81 (t, J=6,7 Hz, 3H); LCMS: (M+Na+): 535,3; TLC (Éter de petróleo : Acetato de etila = 1:1) Rf = 0,01.
[001668] Etapa 3: A uma solução de N2-(terc- butoxicarbonil)-N6-estearoil-L-lisina (12,50 g, 24,38 mmol) em DCM (120 ml) foi adicionado TFA (46,20 g, 405,20 mmol, 30 ml). A mistura foi agitada a 15°C por 4,5 h. TLC mostrou que a reação foi quase concluída. A mistura resultante foi concentrada sob pressão reduzida em um evaporador giratório com bomba de água para gerar um sólido bruto cinza. O composto de produto bruto N6-estearoil-L-lisina (12,80 g, produto bruto, sal de TFA) foi usado na etapa seguinte sem purificação adicional. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ = 8,19 (s l, 3H), 7,77
- 7,65 (m, 1H), 3,88 (d l, J=4,9 Hz, 1H), 3,02 (d l, J=5,5 Hz, 2H), 2,03 (t l, J=7,3 Hz, 2H), 1,75 (s l, 2H), 1,56 - 1,34 (m, 6H), 1,24 (s, 28H), 0,86 (t l, J=6,4 Hz, 3H); LCMS: (M+H+): 413,3.
[001669] Etapa 4: A uma solução do composto N6-estearoil-L-lisina (5,00 g, 9,49 mmol, sal de TFA) em DMF (150 ml) foi adicionado o composto 2,5-dioxopirrolidin-1-il 4- sulfamoilbenzoato (3,98 g, 13,34 mmol) seguido de DIPEA (9,40 g, 72,73 mmol, 12,70 ml). A mistura foi agitada a 80°C durante 18 h. TLC mostrou que a reação foi concluída. A mistura resultante foi concentrada sob pressão reduzida até restarem 20 ml de mistura de resíduo. Ao resíduo foi adicionado DCM (80 ml) e éter de petróleo (50 ml). Após permanecer por 36 h a 15°C, o sólido precipitado foi filtrado e seco para gerar o produto como um sólido amarelo-claro (1,9 g). O filtrado foi concentrado até secar e triturado com ACN (100 ml), filtrado e a torta do filtro foi seca para gerar um produto bruto (2,4 g). O filtrado foi concentrado para gerar um produto bruto oleoso. Sem purificação adicional. N6-estearoil-N2-(4- sulfamoilbenzoil)-L-lisina (1,90 g, 33,60% de rendimento) foi obtido como um sólido amarelo-claro. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 13,19 - 11,82 (m, 1H), 8,74 (d l, J=5,7 Hz, 1H), 8,04 (d l, J=6,6 Hz, 2H), 7,91 (d l, J=7,1 Hz, 2H), 7,74 (s l, 1H), 7,49 (s l, 2H), 4,35 (s l, 1H), 3,02 (s l, 2H), 2,02 (s l, 2H), 1,80 (s l, 2H), 1,23 (s l, 31H), 0,86 (s l, 3H); 13C RMN (101 MHz, DMSO-d6) δ 174,06, 172,39, 165,94, 146,85, 137,28, 128,54, 125,99, 53,24, 38,55, 35,88, 31,76, 30,69, 29,50, 29,41, 29,24, 29,18, 25,78, 23,72, 22,55, 14,39; LCMS: (M+H+): 596,4, pureza: 89,89%. Exemplo 6: Síntese de ácido 18-oxo-18-((4-
sulfamoilfenotil)amino)octadecanoico
[001670] A uma solução de ácido octadecanedioico (4,90 g, 15,58 mmol) e 4-(2- aminoetil)benzenossulfonamida (3,12 g, 15,58 mmol) em DCM (50 ml) foi adicionado HATU (7,11 g, 18,70 mmol) e DIPEA (6,04 g, 46,74 mmol, 8,16 ml). A mistura foi agitada a 10°C por 16 horas. A mistura resultante foi concentrada sob pressão reduzida para gerar um resíduo. O resíduo foi lavado por CH3CN (100 ml*2) para gerar o produto bruto (11 g) como um sólido branco. 1 g de produto bruto foi dissolvido por DMSO/DMF (V/V=3:1, 20 ml) purificado por HPLC prep. (coluna: Phenomenex luna C18 250*50 mm*10 um;fase móvel: [água (0,1% TFA)-ACN];B%: 45% a 75%,20 min ) para gerar 40 mg de produto como um sólido branco. 10 g de produto bruto foram adicionados a CH3CN/H2O (V/V=4:1, 100 ml) e permaneceram no instrumento ultrassônico por 30 min, então filtrados para gerar a torta do filtro, a torta do filtro foi lavada por éter de petróleo (20 ml) e acetona (20 ml). A torta do filtro foi concentrada sob pressão reduzida para gerar 6 g de produto como um sólido amarelo. O composto ácido 18-oxo-18-((4- sulfamoilfenotil)amino)octadecanoico (6,00 g, 77,53% de rendimento) foi obtido como um sólido amarelo. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ = 7,86 (t l, J=5,3 Hz, 1H), 7,71 (d, J=8,2 Hz, 2H), 7,35 (d, J=7,9 Hz, 2H), 7,27 (s, 2H), 3,26 (q, J=6,6 Hz, 3H), 2,75 (t l, J=7,2 Hz, 2H), 2,15 (t, J=7,3 Hz, 1H), 2,00 (t l, J=7,3 Hz, 2H), 1,44 (d l, J=6,6 Hz, 4H), 1,21 (s, 23H), 1,06 (d, J=6,6 Hz, 3H). LCMS: (M+H+): 497,3, pureza 67,72%. Exemplo 7: Síntese de ácido 1,7,14-trioxo-12,12-
bis((3-oxo-3-((3-(4- sulfamoilbenzamido)propil)amino)propoxi)metil)-1-(4- sulfamoilfenil)-10-oxa-2,6,13-triazaoctadecan-18-oico
[001671] Etapa 1: Uma solução de 3,3'-((2- amino-2-((3-(terc-butoxi)-3-oxopropoxi)metil)propano-1,3- diil)bis(oxi))dipropanoato de di-terc-butila (4,0 g, 7,91 mmol) e di-hidro-2H-piran-2,6(3H)-diona (0,903 g, 7,91 mmol) em THF (40 ml) foi agitada a 50 °C por 3 h e à rt por 3 h. LC- MS mostrou o produto desejado. O solvente foi evaporado. para gerar ácido 5-((9-((3-(terc-butoxi)-3-oxopropoxi)metil)- 2,2,16,16-tetrametil-4,14-dioxo-3,7,11,15-tetraoxaeptadecan- 9-il)amino)-5-oxopentanoico, que foi diretamente usado na etapa seguinte sem purificação..
[001672] Etapa 2: A uma solução de ácido 5- ((9-((3-(terc-butoxi)-3-oxopropoxi)metil)-2,2,16,16-
tetrametil-4,14-dioxo-3,7,11,15-tetraoxaeptadecan-9- il)amino)-5-oxopentanoico (4,90 g, 7,91 mmol) e (bromometil)benzeno (1,623 g, 9,49 mmol) em DMF foi adicionado K2CO3anidro (3,27 g, 23,73 mmol). A mistura foi agitada a 40 °C por 4 h e à temperatura ambiente de um dia para o outro. O solvente foi evaporado sob pressão reduzida. A mistura de reação foi diluída com EtOAc, lavada com água, seca com sulfato de sódio anidro, concentrada sob pressão reduzida para gerar um resíduo, que foi purificado por ISCO eluindo com EtOAc a 10% em hexano a EtOAc a 50% em hexano para gerar 3,3'-((2-(5- (benziloxi)-5-oxopentanamido)-2-((3-(terc-butoxi)-3- oxopropoxi)metil)propano-1,3-diil)bis(oxi))dipropanoato de di-terc-butila (5,43 g, 7,65 mmol, 97 % de rendimento) como um óleo incolor.1H RMN (400 MHz, Clorofórmio-d) δ 7,41 – 7,28 (m, 5H), 6,10 (s, 1H), 5,12 (s, 2H), 3,72 – 3,60 (m, 12H), 2,50 – 2,38 (m, 8H), 2,22 (t, J = 7,3 Hz, 2H), 1,95 (p, J = 7,4 Hz, 2H), 1,45 (s, 27H); MS (ESI), 710,5 (M+H)+.
[001673] Etapa 3: Uma solução de 3,3'-((2-(5- (benziloxi)-5-oxopentanamido)-2-((3-(terc-butoxi)-3- oxopropoxi)metil)propano-1,3-diil)bis(oxi))dipropanoato de di-terc-butila (5,43 g, 7,65 mmol) em ácido fórmico (50 ml) foi agitada à temperatura ambiente por 48 h. LC-MS mostrou que reação não foi concluída. O solvente foi evaporado sob pressão reduzida. O produto bruto foi redissolvido em ácido fórmico (50 ml) e foi agitado à temperatura ambiente por 6 h. LC-MS mostrou que reação foi concluída. O solvente foi evaporado sob pressão reduzida, coevaporado com tolueno (3X) sob pressão reduzida, e seco sob vácuo para render ácido 3,3'-((2-(5- (benziloxi)-5-oxopentanamido)-2-((2- carboxietoxi)metil)propano-1,3-diil)bis(oxi))dipropanoico
(4,22 g, 7,79 mmol, 100 % de rendimento) como um sólido branco.1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) δ 12,11 (s, 3H), 7,41 – 7,27 (m, 5H), 6,97 (s, 1H), 5,07 (s, 2H), 3,55 (d, J = 6,4 Hz, 6H), 2,40 (t, J = 6,3 Hz, 6H), 2,37 – 2,26 (m, 2H), 2,08 (t, J = 7,3 Hz, 2H), 1,70 (p, J = 7,4 Hz, 2H); MS (ESI), 542,3 (M+H)+.
[001674] Etapa 4: Uma solução de ácido 3,3'- ((2-(5-(benziloxi)-5-oxopentanamido)-2-((2- carboxietoxi)metil)propano-1,3-diil)bis(oxi))dipropanoico (4,10 g, 7,57 mmol) e HOBt (4,60 g, 34,1 mmol) em DCM (60 ml) e DMF (15 ml) a 0 °C foi adicionada a (3-aminopropil)carbamato de terc-butila (5,94 g, 34,1 mmol), EDAC sal HCl (6,53 g, 34,1 mmol) e DIPEA (10,55 ml, 60,6 mmol). A mistura de reação foi agitada a 0 °C por 15 minutos e à temperatura ambiente por 20 h. LC-MS mostrou que a reação não foi concluída. Sal HCl EDAC (2,0 g) e (3-aminopropil)carbamato de terc-butila (1,0 g) foram adicionados à mistura de reação. A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 4 h. O solvente foi evaporado para gerar um resíduo, que foi dissolvido em EtOAc (300 ml), lavado com água (1X), bicarbonato de sódio saturado (2X), ácido cítrico a 10% (2X) e água, seco com sulfato de sódio e concentrado para gerar um resíduo que foi purificado por ISCO (80 g de cartucho de ouro) eluindo com DCM a MeOH a 30% em DCM para gerar 15,15-bis(13,13-dimetil-5,11-dioxo-2,12- dioxa-6,10-diazatetradecil)-2,2-dimetil-4,10,17-trioxo-3,13- dioxa-5,9,16-triazaenicosan-21-oato de benzila 5 (6,99 g, 6,92 mmol, 91 % de rendimento) como um sólido branco.1H RMN (500 MHz, Clorofórmio-d) δ 7,35 (t, J = 4,7 Hz, 5H), 6,89 (s, 3H), 6,44 (s, 1H), 5,22 (d, J = 6,6 Hz, 3H), 5,12 (s, 2H), 3,71 – 3,62 (m, 12H), 3,29 (q, J = 6,2 Hz, 6H), 3,14 (q, J = 6,5 Hz, 6H), 2,43 (dt, J = 27,0, 6,7 Hz, 8H), 2,24 (t, J = 7,2 Hz,
2H), 1,96 (p, J = 7,5 Hz, 2H), 1,69 – 1,59 (m, 6H), 1,43 (d, J = 5,8 Hz, 27H); MS (ESI): 1011,5 (M+H)+.
[001675] Etapa 5: A uma solução de 15,15- bis(13,13-dimetil-5,11-dioxo-2,12-dioxa-6,10- diazatetradecil)-2,2-dimetil-4,10,17-trioxo-3,13-dioxa- 5,9,16-triazahenicosan-21-oato de benzila (1,84 g, 1,821 mmol) em DCM (40 ml) foi adicionado ácido 2,2,2-trifluoroacético (7,02 ml, 91 mmol). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente de um dia para o outro. O solvente foi evaporado para gerar 5-((1,19-diamino-10-((3-((3- aminopropil)amino)-3-oxopropoxi)metil)-5,15-dioxo-8,12-dioxa- 4,16-diazanonadecan-10-il)amino)-5-oxopentanoato de benzila como um óleo incolor. MS (ESI), 710,6 (M+H)+.
[001676] Etapa 6: A uma solução de ácido 4- sulfamoilbenzoico (1,466 g, 7,28 mmol) e HATU (2,77 g, 7,28 mmol) em DCM (40 ml) seguido de 5-((1,19-diamino-10-((3-((3- aminopropil)amino)-3-oxopropoxi)metil)-5,15-dioxo-8,12-dioxa- 4,16-diazanonadecan-10-il)amino)-5-oxopentanoato de benzila (1,293 g, 1,821 mmol) em DMF (4,0 ml). A mistura foi agitada à temperatura ambiente por 5 h. O solvente foi evaporado sob pressão reduzida para gerar um resíduo, que foi purificado por ISCO (40 g de coluna de ouro) eluindo com DCM a MeOH a 50% em DCM para gerar 1,7,14-trioxo-12,12-bis((3-oxo-3-((3-(4- sulfamoilbenzamido)propil)amino)-propoxi)metil)-1-(4- sulfamoilfenil)-10-oxa-2,6,13-triazaoctadecan-18-oato de benzila (0,36 g, 0,286 mmol, 16% de rendimento). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,60 (t, J = 5,6 Hz, 3H), 7,96 – 7,81 (m, 15H), 7,44 (s, 6H), 7,35 – 7,23 (m, 5H), 7,04 (s, 1H), 5,02 (s, 2H), 3,50 (t, J = 6,9 Hz, 6H), 3,48 (s, 6 H), 3,23 (q, J = 6,6 Hz, 6H), 3,06 (q, J = 6,6 Hz, 6H),, 2,29 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 2,24
(t, J = 6,5 Hz, 6H), 2,06 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 1,69-1,57 (m, 8H).
[001677] Etapa 7: A um frasco de fundo redondo lavado com Ar foi adicionado Pd/C a 10% (80 mg, 0,286 mmol) e EtOAc (15 ml). Uma solução de 1,7,14-trioxo-12,12-bis((3-oxo- 3-((3-(4-sulfamoilbenzamido)propil)amino)propoxi)metil)-1-(4- sulfamoilfenil)-10-oxa-2,6,13-triazaoctadecan-18-oato de benzila (360 mg) em metanol (15 ml) foi adicionado seguido de dietil(metil)silano (0,585 g, 5,72 mmol) por gotejamento. A mistura foi agitada à temperatura ambiente por 3 h. LC-MS mostrou que reação foi concluída, diluída com EtOAc e filtrada através de celite, lavada com MeOH a 20% em EtOAc, concentrada sob pressão reduzida para gerar ácido 1,7,14-trioxo-12,12- bis((3-oxo-3-((3-(4-sulfamoilbenzamido)propil)- amino)propoxi)metil)-1-(4-sulfamoilfenil)-10-oxa-2,6,13- triazaoctadecan-18-oico (360 mg, 100% de rendimento) como um sólido branco. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,60 (t, J = 5,6 Hz, 3H), 7,94 – 7,81 (m, 15H), 7,44 (s, 6H), 7,04 (s, 1H), 3,50 (t, J = 6,9 Hz, 6H), 3,48 (s, 6 H), 3,23 (q, J = 6,6 Hz, 6H), 3,06 (q, J = 6,6 Hz, 6H),, 2,24 (t, J = 6,4 Hz, 6H), 2,14 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 2,05 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 1,66-1,57 (m, 8H); MS (ESI), 1170,4 (M+H)+. Exemplo 8: Síntese de 2,5-dioxopirrolidin-1-il 4- oxo-4-((4-sulfamoilfenotil)amino)butanoato
[001678] Etapa 1: Uma solução de 4-(2- aminoetil)benzenossulfonamida (20 g, 99,87 mmol), tetra- hidrofuran-2,5-diona (9,99 g, 99,87 mmol) em THF (200 ml) foi agitada a 60 °C por 16 h. A mistura de reação foi diluída com HCl (aq., 1 M, 100 ml) e extraída com EtOAc (200 ml * 3). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (100 ml * 2), secas com Na2SO4, filtradas e concentradas sob pressão reduzida para gerar ácido 4-oxo-4-((4- sulfamoilfenotil)amino)butanoico (17 g, 55,60 mmol, 55,67% de rendimento, 98,228% de pureza) obtido como um sólido branco. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ = 7,94 (t, J = 5,7 Hz, 1H), 7,72 (d, J = 7,9 Hz, 2H), 7,37 (d, J = 8,3 Hz, 2H), 3,30 - 3,20 (m, 2H), 2,75 (t, J = 7,2 Hz, 2H), 2,53 - 2,44 (m, 4H), 2,44 - 2,35 (m, 3H), 2,32 - 2,23 (m, 2H). LCMS: (M+H+): 301,1.
[001679] Etapa 2: A uma solução de ácido 4- oxo-4-((4-sulfamoilfenotil)amino)butanoico (17 g, 56,60 mmol) e HOSu (10,42 g, 90,57 mmol) em DMF (200 ml) foi adicionado DCC (18,69 g, 90,57 mmol, 18,32 ml) a 0 °C a 5°C. A mistura foi agitada a 0 a 5 °C por 16 h. LCMS mostrou que a reação não foi concluída. A mistura foi agitada a 15 °C por 16 h. LCMS mostrou que reação foi concluída e um pico principal com MS desejada foi detectado. A suspensão branca de N,N'-diciclo- hexilureia (DCU) foi filtrada e o sólido branco removido. O filtrado foi concentrado em um óleo. Este produto bruto foi lavado com 2-propanol (60 ml*3) quente, produzindo um sólido branco-sujo. O produto bruto foi adicionado a THF (100 ml) e Éter de petróleo (50 ml) e agitado por 30 min, então filtrado para gerar 2,5-dioxopirrolidin-1-il 4-oxo-4-((4- sulfamoilfenotil)amino)butanoato (8 g, 16,58 mmol, 29,29% de rendimento, 82,36% de pureza) como um sólido branco. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ = 8,12 - 7,96 (m, 1H), 7,71 (d l, J=7,9 Hz, 2H), 7,37 (d l, J=8,2 Hz, 2H), 3,58 (t l, J=6,7 Hz, 1H), 3,30 - 3,21 (m, 2H), 2,89 - 2,70 (m, 8H), 2,58 (s, 1H), 2,42
(t l, J=6,7 Hz, 2H); LCMS: (M+H+)): 398,0, LCMS pureza: 82,36%. Exemplo 9: Síntese de ácido 4-oxo-4-((4- sulfamoilfenil)amino)butanoico
[001680] A um reagente sólido de 4- aminobenzenossulfonamida (2,0 g, 11,61 mmol) e tetraidrofurano-2,5-diona (1,16 g, 11,61 mmol) foi adicionado THF (30 ml). A mistura de reação foi agitada a 60 °C por 4 h, e sólido branco precipitado. A mistura de reação foi resfriada à temperatura ambiente, e filtrada para gerar um sólido branco. O sólido branco foi seco sob vácuo para gerar ácido 4-oxo-4- (4-sulfamoilanilino)butanoico (2,115 g, 67% de rendimento). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 10,31 (s, 1H), 7,74 (s, 4H), 7,23 (s, 2H), 2,65 – 2,51 (m, 4H). Exemplo 10: Síntese de estearato de 3-(((4- nitrofenoxi)carbonil)oxi)propila
[001681] Etapa 1: Uma mistura de propano-1,3- diol (9,80 g, 128,75 mmol, 9,33 ml), Piridina (2,61 g, 33,01 mmol, 2,66 ml) em CHCl3 (50 ml) foi desgaseificada e purificada com N2 3 vezes e, então a mistura foi por gotejada com cloreto de estearoíla (10 g, 33,01 mmol) em CHCl3 (50 ml) a 0 °C e agitada a 20°C por 20 h sob atmosfera de N2. A mistura foi extraída com EtOAc (50 ml * 2), e as camadas orgânicas combinadas foram lavadas com 1N de HCl (50 ml * 2), NaHCO3 aq.
(50 ml * 2), H2O (50 ml), secas com Na2SO4, filtradas e concentradas sob pressão reduzida para gerar um resíduo. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna (SiO2, Acetato de etila/Éter de petróleo = 2%, 12,5%) para proporcionar estearato de 3-hidroxipropila (9 g) como uma goma branca. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ = 4,24 (t, J = 6,06 Hz, 2H), 3,69 (t, J = 5,95 Hz, 2H), 2,31 (t, J = 7,50 Hz, 2H), 1,87 (q, J = 6,06 Hz, 2H), 1,56-1,68 (m, 2H), 1,22-1,31 (m, 24H), 0,88 (t, J = 6,73 Hz, 3H); TLC (Éter de petróleo: Acetato de etila = 3: 1) Rf = 0,54.
[001682] Etapa 2: Uma mistura de estearato de 3-hidroxipropila (9 g, 26,27 mmol), TEA (3,99 g, 39,41 mmol, 5,49 ml) em DCM (160 ml) foi gotejada com a solução de carbonocloridato de 4-nitrofenila (6,35 g, 31,53 mmol) em DCM (20 ml), então desgaseificada e purificada com N2 3 vezes a 0 °C e, então a mistura foi agitada a 20°C por 16 h sob atmosfera de N2. TLC indicou que o composto foi completamente consumido e muitas novas manchas se formaram. A reação foi limpa de acordo com TLC. A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida para remover o solvente. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna (SiO2, Acetato de etila/Éter de petróleo = 0%, 5%) para proporcionar estearato de 3-(((4- nitrofenoxi)carbonil)oxi)propila (5,73 g, 11,29 mmol, 42,96% de rendimento) como um sólido branco-sujo. 1H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ = 8,29 (d, J = 9,21 Hz, 2H), 7,39 (d, J = 9,21 Hz, 2H), 4,39 (t, J = 6,36 Hz, 2H), 4,24 (t, J = 6,14 Hz, 2H), 2,32 (t, J = 7,45 Hz, 2H), 2,11 (t, J = 6,36 Hz, 2H), 1,57 - 1,68 (m, 2H), 1,21 - 1,32 (m, 28H), 0,88 (t, J = 6,80 Hz, 3H); 13C RMN (101 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ = 173,73, 155,44, 152,40, 145,37, 125,30, 121,74, 66,00, 60,22, 34,21, 31,91,
29,68, 29,67, 29,64, 29,60, 29,30, 27,92, 24,91, 22,69, 14,12; TLC (Éter de petróleo: Acetato de etila = 3:1) Rf = 0,72. Exemplo 11: Síntese de didodecanoato de (R)-3-(((4- nitrofenoxi)carbonil)oxi)propano-1,2-diíla
[001683] A uma solução de carbonocloridato de 4-nitrofenila (69,51 mg, 0,34 mmol) em THF (3,0 ml) à temperatura ambiente foi adicionado didodecanoato de (S)-3- hidroxipropano-1,2-diíla (1,2-dilaurina) e DIPEA (0,11 ml, 0,66 mmol). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 3 h. O solvente foi evaporado sob pressão reduzida, diluído com EtOAc, lavado com água, seco com sulfato de sódio, concentrado para gerar o produto desejado didodecanoato de (R)-3-(((4-nitrofenoxi)carbonil)oxi)propano- 1,2-diíla (204 mg, 100% de rendimento). 1H RMN (400 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,22 (d, J = 8,9 Hz, 2H), 7,32 (d, J = 8,9 Hz, 2H), 5,32-5,28 (m, 1 H), 4,34 – 4,09 (m, 4H), 2,31-2,23 (m, 4H), 1,58-0,79 (m, 42H). Exemplo 12: Síntese de ácido 4,10,17-trioxo-15,15- bis((3-oxo-3-((3-(4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5- tris(benzoiloxi)-6-((benzoiloxi)metil)tetra-hidro-2H-piran-2- il)oxi)butanamido)propil)amino)propoxi)metil)-1- (((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-tris(benzoiloxi)-6- ((benzoiloxi)metil)tetra-hidro-2H-piran-2-il)oxi)-13-oxa- 5,9,16-triazaenicosan-21-oico
[001684] Etapa 1: A uma solução de 15,15- bis(13,13-dimetil-5,11-dioxo-2,12-dioxa-6,10- diazatetradecil)-2,2-dimetil-4,10,17-trioxo-3,13-dioxa- 5,9,16-triazaenicosan-21-oato de benzila (0,95 g, 0,940 mmol) em DCM (5 ml) foi foi adicionado TFA (5 ml). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 4 h. LC-MS mostrou que a reação foi concluída. O solvente foi evaporado sob pressão reduzida para gerar 5-((1,19-diamino-10-((3-((3- aminopropil)amino)-3-oxopropoxi)metil)-5,15-dioxo-8,12-dioxa- 4,16-diazanonadecan-10-il)amino)-5-oxopentanoato de benzila como um óleo incolor. Usar diretamente para a próxima etapa sem purificação.
[001685] Etapa 2: A uma solução de 5-((1,19- diamino-10-((3-((3-aminopropil)amino)-3-oxopropoxi)metil)- 5,15-dioxo-8,12-dioxa-4,16-diazanonadecan-10-il)amino)-5- oxopentanoato de benzila (0,46 mmol) em DCM (6 ml) foram adicionados HOBt (62,16 mg, 0,46 mmol), HBTU (558,24 mg, 1,47 mmol), DIPEA (1,2 ml, 6,9 mmol) e a solução de ácido 4- (((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-tris(benzoiloxi)-6-
((benzoiloxi)metil)tetra-hidro-2H-piran-2-il)oxi)butanoico (1,10 g, 1,61 mmol) em acetonitrila (5 ml). A mistura de reação foi agitada à rt por 3 h. O solvente foi evaporado sob pressão reduzida para gerar um resíduo, que foi diluído com EtOAc, lavado com água, seco com sulfato de sódio anidro para gerar um resíduo, que foi purificado por ISCO (24g de coluna de ouro) eluindo com DCM a MeOH a 20% em DCM para gerar éster 4,10,17- trioxo-15,15-bis((3-oxo-3-((3-(4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5- tris(benzoiloxi)-6-((benzoiloxi)metil)tetra-hidro-2H-piran-2- il)oxi)butanamido)propil)amino)propoxi)metil)-1- (((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-tris(benzoiloxi)-6- ((benzoiloxi)metil)tetra-hidro-2H-piran-2-il)oxi)-13-oxa- 5,9,16-triazahenicosan-21-anoico benzílico (1,14 g, 91,7%). MS (ESI), 1353,6 ((M/2+H)+.
[001686] Etapa 3: A uma solução de éster 4,10,17-trioxo-15,15-bis((3-oxo-3-((3-(4-(((2R,3R,4S,5R,6R)- 3,4,5-tris(benzoiloxi)-6-((benzoiloxi)metil)tetra-hidro-2H- piran-2-il)oxi)butanamido)propil)amino)propoxi)metil)-1- (((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-tris(benzoiloxi)-6- ((benzoiloxi)metil)tetra-hidro-2H-piran-2-il)oxi)-13-oxa- 5,9,16-triazahenicosan-21-anoico benzílico (1,09 g, 0,400 mmol) em EtOAc (50 ml) foi adicionado Pd-C a 10% (200 mg). A mistura de reação foi agitada à rt por 4 h sob balão de hidrogênio. LC-MS mostrou que a reação não foi concluída. A mistura de reação foi adicionada a Pd-C a 10% (300 mg) e agitada à temperatura ambiente por 24 h sob balão de hidrogênio. A mistura de reação foi filtrada, lavada com EtOAc/MeOH, concentrada para gerar ácido 4,10,17-trioxo-15,15- bis((3-oxo-3-((3-(4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5- tris(benzoiloxi)-6-((benzoiloxi)metil)tetra-hidro-2H-piran-2-
il)oxi)butanamido)propil)amino)propoxi)metil)-1- (((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-tris(benzoiloxi)-6- ((benzoiloxi)metil)tetra-hidro-2H-piran-2-il)oxi)-13-oxa- 5,9,16-triazaenicosan-21-oico (1,055 g, 100%). MS (ESI), 1308,1 ((M/2+H)+. Exemplo 13: Síntese de ácido 5-(4-(4,6- bis((3,9,13,20,26-pentaoxo-15,15-bis((3-oxo-3-((3-(4- (((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-tris(benzoiloxi)-6- ((benzoiloxi)metil)tetra-hidro-2H-piran-2- il)oxi)butanamido)propil)amino)propoxi)metil)-29- (((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-tris(benzoiloxi)-6- ((benzoiloxi)metil)tetra-hidro-2H-piran-2-il)oxi)-17-oxa- 4,8,14,21,25-pentaazanonacosil)amino)-1,3,5-triazin-2- il)piperazin-1-il)-5-oxopentanoico
[001687] Etapa 1 a 2. A um reagente sólido 2,4,6-tricloro-1,3,5-triazina (0,500 g, 2,71 mmol) em THF (30 ml) foram adicionados 3-aminopropanoato de terc-butila, sal HCl (0,985 g, 5,42 mmol) e DIPEA (2,36 ml, 13,56 mmol). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 5 h.
LC-MS mostrou o produto desejado; MS(ESI): 402,4 (M+H)+. O solvente foi evaporado sob pressão reduzida para gerar um resíduo, que foi diretamente usado na etapa seguinte.
A uma solução de 3,3'-((6-cloro-1,3,5-triazina-2,4- diil)bis(azanediil))dipropionato de di-terc-butila (1,052 g, 2,71 mmol) em aceotnitrila (50 ml) foram adicionados 5-oxo-5- (piperazin-1-il)pentanoato de benzila (1,103 g, 3,80 mmol) e K2CO3 (2,248 g, 16,27 mmol). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente de um dia para o outro a 50 ºC. A mesma foi diluída com EtOAc, filtrada e concentrada sob pressão reduzida para gerar um resíduo, que foi purificado por ISCO (40 g de ouro) eluindo com EtOAc a 20% em hexano a EtOAc a 50% em hexano para gerar 3,3'-((6-(4-(5-(benziloxi)-5- oxopentanoil)piperazin-1-il)-1,3,5-triazina-2,4- diil)bis(azanodiil))dipropionato de di-terc-butila (1,13 g, 64%) como um sólido branco. 1H RMN (400 MHz, Clorofórmio-d) δ 7,43 – 7,30 (m, 5 H), 5,15 (s, 2H), 3,75 (s l, 4H), 3,63 (s l, 6H), 3,43 (s l, 2H), 2,51 (q, J = 7,0, 6,5 Hz, 6H), 2,42 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 2,09 – 1,96 (m, 2H), 1,48 (s, 18H); MS (ESI): 656,6 (M+H)+.
[001688] Etapa 3: Uma solução de 3,3'-((6-(4- (5-(benziloxi)-5-oxopentanoil)piperazin-1-il)-1,3,5-triazina- 2,4-diil)bis(azanodiil))dipropionato de di-terc-butila (1,10 g, 1,68 mmol) em ácido fórmico (20 ml) foi agitada à temperatura ambiente de um dia para o outro. LC-MS mostrou que a reação não foi concluída. e o solvente foi evaporado. Ácido fórmico (20 ml) foi adicionado à mistura de reação e a mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 5 h. LC-MS mostrou que a reação foi concluída. O solvente foi concentrado, coevaporado com tolueno (2X) e seco sob vácuo de um dia para o outro para gerar ácido 3,3'-((6-(4-(5-(benziloxi)-5- oxopentanoil)piperazin-1-il)-1,3,5-triazina-2,4- diil)bis(azanodiil))dipropionico (0,91 g, 100 % de rendimento) como um sólido branco. MS (ESI), 544,2 (M+H)+.
[001689] Etapa 4: Uma solução de ácido 3,3'- ((6-(4-(5-(benziloxi)-5-oxopentanoil)piperazin-1-il)-1,3,5- triazina-2,4-diil)bis(azanodiil))dipropionico (0,91 g, 1,68 mmol) e HOBt (0,76 g, 4,36 mmol) em DCM (30 ml) e DMF (3 ml)
a 0 °C foi adicionada a (3-aminopropil)carbamato de terc-butila (0,840 g, 4,36 mmol), EDC sal HCl (0,836 g, 4,36 mmol) e DIPEA (1,460 ml, 8,39 mmol). A mistura de reação foi agitada a 0 °C por 15 minutos e à temperatura ambiente por 20 h. O solvente foi evaporado para gerar um resíduo, que foi dissolvido em EtOAc (300 ml), lavado com água (1X), bicarbonato de sódio saturado (2X), ácido cítrico a 10% (2X) e água, seco com sulfato de sódio e concentrado para gerar um resíduo que foi purificado por ISCO (80 g de cartucho de ouro) eluindo com DCM a MeOH a 30% em DCM para gerar 5-(4-(4,6-bis((3-((3-((terc- butoxicarbonil)amino)propil)amino)-3-oxopropil)amino)-1,3,5- triazin-2-il)piperazin-1-il)-5-oxopentanoato de benzila (1,11 g, 77 % de rendimento) como um sólido branco. MS (ESI): 857,5 (M+H)+.
[001690] Etapa 5: Uma solução de 5-(4-(4,6- bis((3-((3-((terc-butoxicarbonil)amino)propil)amino)-3- oxopropil)amino)-1,3,5-triazin-2-il)piperazin-1-il)-5- oxopentanoato de benzila (75,93 mg, 0,090 mmol) em DCM (3 ml) foi adicionada a TFA (0,5 ml). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 3 h. O solvente foi evaporado sob pressão reduzida, diretamente usado na etapa seguinte sem purificação. MS (ESI): 656,3 (M+H)+.
[001691] Etapa 6: A uma solução de ácido 4,10,17-trioxo-15,15-bis((3-oxo-3-((3-(4-(((2R,3R,4S,5R,6R)- 3,4,5-tris(benzoiloxi)-6-((benzoiloxi)metil)tetra-hidro-2H- piran-2-il)oxi)butanamido)propil)amino)propoxi)metil)-1- (((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-tris(benzoiloxi)-6- ((benzoiloxi)metil)tetra-hidro-2H-piran-2-il)oxi)-13-oxa- 5,9,16-triazaenicosan-21-oico (580 mg, 0,222 mmol) em DCM (10 ml) foi adicionado HBTU (84,1 mg, 0,220 mmol), HOBt (11,99 mg,
0,09 mmol) e DIPEA (0,15 ml, 0,890 mmol). A mistura de reação foi agitada à rt por 5 minutos e uma solução de 5-(4-(4,6- bis((3-((3-aminopropil)amino)-3-oxopropil)amino)-1,3,5- triazin-2-il)piperazin-1-il)-5-oxopentanoato de benzila, sal TFA (0,090 mmol) em acetonitrila foi adicionada à mistura de reação. A mistura de reação foi agitada à rt de um dia para o outro. O solvente foi evaporado sob pressão reduzida para gerar um resíduo, que foi purificado por ISCO (24 g de ouro) eluindo com DCM a MeOH a 40% em DCM para gerar éster 5-(4-(4,6- bis((3,9,13,20,26-pentaoxo-15,15-bis((3-oxo-3-((3-(4- (((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-tris(benzoiloxi)-6- ((benzoiloxi)metil)tetra-hidro-2H-piran-2- il)oxi)butanamido)propil)amino)propoxi)metil)-29- (((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-tris(benzoiloxi)-6- ((benzoiloxi)metil)tetra-hidro-2H-piran-2-il)oxi)-17-oxa- 4,8,14,21,25-penta-azanonacosil)amino)-1,3,5-triazin-2- il)piperazin-1-il)-5-oxopentanoico benzílico (300 mg, 57,8%). MS (ESI), 1950,6 ((M/3+H)+.
[001692] Etapa 7: A uma solução de éster 5-(4- (4,6-bis((3,9,13,20,26-pentaoxo-15,15-bis((3-oxo-3-((3-(4- (((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-tris(benzoiloxi)-6- ((benzoiloxi)metil)tetra-hidro-2H-piran-2- il)oxi)butanamido)propil)amino)propoxi)metil)-29- (((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-tris(benzoiloxi)-6- ((benzoiloxi)metil)tetra-hidro-2H-piran-2-il)oxi)-17-oxa- 4,8,14,21,25-pentaazanonacosil)amino)-1,3,5-triazin-2- il)piperazin-1-il)-5-oxopentanoico benzílico (300 mg, 0,05 mmol) em EtOAc (10 ml) foi adicionado Pd-C a 10% (100 mg). A mistura de reação foi agitada à rt sob balão de hidrogênio de um dia para o outro. LC-MS mostrou que a reação não foi concluída.
A mistura de reação foi adicionada a MeOH (1 ml) e trietilsilano (2 ml). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 4 h.
LC-MS mostrou o produto desejado.
A mistura de reação foi filtrada, lavada com EtOAc/MeOH, e concentrada sob pressão reduzida para gerar um resíduo, que foi purificado por ISCO (50 g de cartucho de C18) eluindo com TFA a 1% em água à acetonitrila a 100% e liofilizada para gerar ácido 5-(4-(4,6-bis((3,9,13,20,26-pentaoxo-15,15-bis((3-oxo- 3-((3-(4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-tris(benzoiloxi)-6- ((benzoiloxi)metil)tetra-hidro-2H-piran-2- il)oxi)butanamido)propil)amino)propoxi)metil)-29- (((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-tris(benzoiloxi)-6- ((benzoiloxi)metil)tetra-hidro-2H-piran-2-il)oxi)-17-oxa- 4,8,14,21,25-pentaazanonacosil)amino)-1,3,5-triazin-2- il)piperazin-1-il)-5-oxopentanoico (120 mg, 40,6% de rendimento) como um sólido branco.
MS (ESI), 1920 ((M/3+H)+. Exemplo 14: Síntese de ácido 5-(4-(4,6- bis((3,9,13,20,26-pentaoxo-15,15-bis((3-oxo-3-((3-(5- (((2S,3S,4S,5R,6R)-3,4,5-triacetoxi-6-(acetoximetil)tetra- hidro-2H-piran-2- il)oxi)pentanamido)propil)amino)propoxi)metil)-30- (((2S,3S,4S,5R,6R)-3,4,5-triacetoxi-6-(acetoximetil)tetra- hidro-2H-piran-2-il)oxi)-17-oxa-4,8,14,21,25-penta- azatriacontil)amino)-1,3,5-triazin-2-il)piperazin-1-il)-5- oxopentanoico
[001693] Etapa 1: A uma solução de ácido 5- (((2S,3S,4S,5R,6R)-3,4,5-triacetoxi-6-(acetoximetil)tetra- hidro-2H-piran-2-il)oxi)pentanoico (2,43 g, 5,43 mmol) em DCM foram adicionados HBTU (2,06 g, 5,43 mmol), HOBt (183,36 mg, 1,36 mmol) e DIPEA (4,73 ml, 27,14 mmol). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 10 minutos, e uma solução de 5-((1,19-diamino-10-((3-((3-aminopropil)amino)-3- oxopropoxi)metil)-5,15-dioxo-8,12-dioxa-4,16-diazanonadecan- 10-il)amino)-5-oxopentanoato de benzila, sal TFA (1,36 mmol) em acetonitrila foi adicionada.
A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 3 h.
O solvente foi concentrado sob pressão reduzida para gerar um resíduo, que foi purificado por ISCO (80 g de cartucho de ouro) eluindo com MeOH a 5% em DCM a MeOH a 60% em DCM para gerar éster 5,12,18-trioxo-7,7-bis((3- oxo-3-((3-(5-(((2S,3S,4S,5R,6R)-3,4,5-triacetoxi-6- (acetoximetil)tetra-hidro-2H-piran-2-
il)oxi)pentanamido)propil)amino)propoxi)metil)-22- (((2S,3S,4S,5R,6R)-3,4,5-triacetoxi-6-(acetoximetil)tetra- hidro-2H-piran-2-il)oxi)-9-oxa-6,13,17-triazadocosanoico benzílico (2,22 g, 81,8%). MS (ESI): 1002 (M/2+H)+.
[001694] Etapa 2: A uma solução de éster 5,12,18-trioxo-7,7-bis((3-oxo-3-((3-(5-(((2S,3S,4S,5R,6R)- 3,4,5-triacetoxi-6-(acetoximetil)tetra-hidro-2H-piran-2- il)oxi)pentanamido)propil)amino)propoxi)metil)-22- (((2S,3S,4S,5R,6R)-3,4,5-triacetoxi-6-(acetoximetil)tetra- hidro-2H-piran-2-il)oxi)-9-oxa-6,13,17-triazadocosanoico benzílico (2,20 g, 1,1 mmol) em EtOAc (30 ml) e MeOH (3 ml) foi adicionado Pd-C a 10% (300 mg) e trietilsilano (1,8 ml, 11,3 mmol) lentamente. A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 1 h. A mistura de reação foi filtrada através de celite e concentrada para gerar ácido 5,12,18- trioxo-7,7-bis((3-oxo-3-((3-(5-(((2S,3S,4S,5R,6R)-3,4,5- triacetoxi-6-(acetoximetil)tetra-hidro-2H-piran-2- il)oxi)pentanamido)propil)amino)propoxi)metil)-22- (((2S,3S,4S,5R,6R)-3,4,5-triacetoxi-6-(acetoximetil)tetra- hidro-2H-piran-2-il)oxi)-9-oxa-6,13,17-triazadocosanoico. MS (ESI), 1912 (M+H)+.
[001695] Etapa 3: A uma solução de ácido 5,12,18-trioxo-7,7-bis((3-oxo-3-((3-(5-(((2S,3S,4S,5R,6R)- 3,4,5-triacetoxi-6-(acetoximetil)tetra-hidro-2H-piran-2- il)oxi)pentanamido)propil)amino)propoxi)metil)-22- (((2S,3S,4S,5R,6R)-3,4,5-triacetoxi-6-(acetoximetil)tetra- hidro-2H-piran-2-il)oxi)-9-oxa-6,13,17-triazadocosanoico (1911 mg, 0,580 mmol) em DCM (30 ml) foram adicionados HBTU (266 mg, 0,700 mmol), HOBt (31,56 mg, 0,23 mmol) e DIPEA (0,81 ml, 4,67 mmol). A mistura de reação foi agitada à rt por 10 minutos e uma solução de 5-(4-(4,6-bis((3-((3- aminopropil)amino)-3-oxopropil)amino)-1,3,5-triazin-2- il)piperazin-1-il)-5-oxopentanoato de benzila, sal TFA (0,23 mmol) em acetonitrila (5 ml) foi adicionada à mistura de reação. A mistura de reação foi agitada à rt por 3 h. O solvente foi evaporado sob pressão reduzida para gerar um resíduo, que foi purificado por ISCO (24 g de ouro) eluindo com DCM a MeOH a 50% em DCM para gerar éster 5-(4-(4,6-bis((3,9,13,20,26- pentaoxo-15,15-bis((3-oxo-3-((3-(5-(((2S,3S,4S,5R,6R)-3,4,5- triacetoxi-6-(acetoximetil)tetra-hidro-2H-piran-2- il)oxi)pentanamido)propil)amino)propoxi)metil)-30- (((2S,3S,4S,5R,6R)-3,4,5-triacetoxi-6-(acetoximetil)tetra- hidro-2H-piran-2-il)oxi)-17-oxa-4,8,14,21,25-penta- azatriacontil)amino)-1,3,5-triazin-2-il)piperazin-1-il)-5- oxopentanoico benzílico (430 mg, 41,4%). MS (ESI), 1482,1 (M/3+H)+.
[001696] Etapa 4: Uma solução de éster 5-(4- (4,6-bis((3,9,13,20,26-pentaoxo-15,15-bis((3-oxo-3-((3-(5- (((2S,3S,4S,5R,6R)-3,4,5-triacetoxi-6-(acetoximetil)tetra- hidro-2H-piran-2- il)oxi)pentanamido)propil)amino)propoxi)metil)-30- (((2S,3S,4S,5R,6R)-3,4,5-triacetoxi-6-(acetoximetil)tetra- hidro-2H-piran-2-il)oxi)-17-oxa-4,8,14,21,25-penta- azatriacontil)amino)-1,3,5-triazin-2-il)piperazin-1-il)-5- oxopentanoico benzílico (420 mg, 0,090 mmol) em EtOAc (15 ml) e MeOH (2 ml) foi adicionado Pd-C a 10% (200 mg). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente sob balão de hidrogênio de um dia para o outro. A mistura de reação foi filtrada através de celite, lavada com MeOH a 50% em EtOAc e concentrada sob pressão reduzida para gerar ácido 5-(4-(4,6-
bis((3,9,13,20,26-pentaoxo-15,15-bis((3-oxo-3-((3-(5- (((2S,3S,4S,5R,6R)-3,4,5-triacetoxi-6-(acetoximetil)tetra- hidro-2H-piran-2- il)oxi)pentanamido)propil)amino)propoxi)metil)-30- (((2S,3S,4S,5R,6R)-3,4,5-triacetoxi-6-(acetoximetil)tetra- hidro-2H-piran-2-il)oxi)-17-oxa-4,8,14,21,25-penta- azatriacontil)amino)-1,3,5-triazin-2-il)piperazin-1-il)-5- oxopentanoico. MS (ESI), 1452,0 (M/3+H)+. Exemplo 15: Síntese de 3-(((4- nitrofenoxi)carbonil)oxi)propil (4E,8E,12E,16E)-4,8,13,17,21- pentametildocosa-4,8,12,16,20-pentaenoato
[001697] Etapa 1: À solução de ácido turbinárico (2,00 g, 4,992mmol) em DCM (20 ml) foram adicionados 1,3-propanodiol (1,8 ml, 24,96 mmol), EDC (1,91 g, 9,984 mmol) e DMAP (30,5 mg). A mistura de reação foi agitada à rt por 5 h. LC-MS mostrou que a reação foi concluída. A mistura de reação foi concentrada, diluída com EtOAc (100 ml), lavada sucessivamente com 1N de solução aq. de HC (20 ml), solução aq. saturada de 3 (20 ml), água (10 ml), e salmoura (5 ml), seca com sulfato de sódio, filtrada e concentrada para gerar um resíduo, que foi purificado por ISCO (40 g de cartucho de ouro) usando EtOAc a 0 a 100% em hexano como o gradiente para gerar (4E,8E,12E,16E)-4,8,13,17,21-pentametildocosa- 4,8,12,16,20-pentaenoato de 3-hidroxipropila (1,129g, 49% de rendimento). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 5,15 – 5,02 (m, 5H), 4,46 (t, J = 5,1 Hz, 1H), 4,06 (t, J = 6,6 Hz, 2H), 3,45 (td, J = 6,3, 5,1 Hz, 2H), 2,40 – 2,31 (m, 2H), 2,20 (t, J = 7,6 Hz, 2H), 2,08-1,90 (m, 16H), 1,70 (p, J = 6,4 Hz, 2H), 1,64 (d, J = 1,5 Hz, 3H), 1,56 (m, 15H); MS (ESI), 481,3 (M+Na)+.
[001698] Etapa 2: A uma solução de (4E,8E,12E,16E)-4,8,13,17,21-pentametildocosa-4,8,12,16,20- pentaenoato de 3-hidroxipropila (1,12g, 2,4416 mmol) em DCM anidro (12,5 ml) a 0 °C foi adicionado TEA (0,68 ml), e uma solução de cloformato de 4-nitrofenila (738mg) em DCM anidro (5 ml) lentamente. A mistura de reação foi agitada a 0 °C por 40 min, e à temperatura ambiente de um dia para o outro. A mistura de reação foi concentrada para gerar um resíduo, que foi purificado por ISCO (40 g de cartucho de ouro) com eluição usando EtOAc a 0 a 50% em hexano para gerar (4E,8E,12E,16E)- 4,8,13,17,21-pentametildocosa-4,8,12,16,20-pentaenoato de 3- (((4-nitrofenoxi)carbonil)oxi)propila (1,06 g, 70% de rendimento). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,34 – 8,29 (m, 2H), 7,58 – 7,51 (m, 2H), 5,13 – 5,01 (m, 5H), 4,32 (t, J = 6,3 Hz, 2H), 4,13 (t, J = 6,3 Hz, 2H), 2,44 – 2,34 (m, 2H), 2,21 (t, J = 7,6 Hz, 2H), 2,07 – 1,87 (m, 18H), 1,63 (d, J = 1,5 Hz, 3H), 1,55 (m, 15H). Exemplo 16: Preparação de certas porções químicas e oligonucleotídeos que compreendem certas porções químicas
[001699] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece porções químicas que podem ser incorporadas em oligonucleotídeos. Em algumas modalidades, uma porção química é uma porção química de alvejamento. Em algumas modalidades, uma porção química é uma porção química de carboidrato. Em algumas modalidades, uma porção química é uma porção química de lipídio. Em algumas modalidades, as porções químicas podem ser incorporadas em oligonucleotídeos para aprimorar uma ou mais propriedades, atividades e/ou entrega. Certas porções químicas, sua preparação, e oligonucleotídeos que compreendem tais porções químicas são descritos no presente exemplo. Aqueles versados na técnica observam que tais porções químicas podem também ser incorporadas em oligonucleotídeos que têm outras sequências de base, modificações, etc.
[001700] Síntese de ácido 3-(dimetilamino)- 14,14-bis(3-(dimetilamino)-2-metil-9-oxo-12-oxa-2,4,8- triazatridec-3-en-13-il)-2-metil-9,16-dioxo-12-oxa-2,4,8,15- tetra-azaicos-3-en-20-oico
[001701] Etapa 1: A uma solução de 15,15- bis(13,13-dimetil-5,11-dioxo-2,12-dioxa-6,10- diazatetradecil)-2,2-dimetil-4,10,17-trioxo-3,13-dioxa- 5,9,16-triazaenicosan-21-oato de benzila (9,0 g, 8,91 mmo) em DCM (100 ml) foi adicionado TFA (30,47 g, 267,27 mmol, 19,79 ml) a 0 °C. A mistura foi agitada a 0 a 15 °C por 4 h. A mistura foi formada em duas fases. A fase inferior foi separada e concentrada sob pressão reduzida para gerar um produto bruto. 5-((1,19-Diamino-10-((3-((3-aminopropil)amino)-3- oxopropoxi)metil)-5,15-dioxo-8,12-dioxa-4,16-diazanonadecan- 10-il)amino)-5-oxopentanoato de benzila, sal TFA (13 g) foi obtido como um óleo amarelo. 1H RMN (400 MHz, METANOL-d4) Deslocamento = 7,39 - 7,27 (m, 5H), 5,12 (s, 2H), 3,70 - 3,63 (m, 13H), 3,32 - 3,30 (m, 2H), 3,26 (s, 2H), 2,94 (t, J=7,3 Hz, 7H), 2,49 - 2,38 (m, 9H), 2,23 (t, J=7,4 Hz, 2H), 1,94 - 1,78 (m, 9H). LCMS: M+H+= 710,2.
[001702] Etapa 2: A uma solução de 5-((1,19- diamino-10-((3-((3-aminopropil)amino)-3-oxopropoxi)metil)- 5,15-dioxo-8,12-dioxa-4,16-diazanonadecan-10-il)amino)-5- oxopentanoato de benzila, sal TFA (13 g) em DCM (200 ml) foram adicionados DIPEA (15,97 g, 123,58 mmol, 21,53 ml) e HATU (15,51 g, 40,78 mmol). A mistura foi agitada a 15 °C por 15 h. LCMS mostrou que o composto 2 foi consumido e a MS desejada foi detectada A mistura foi concentrada sob pressão reduzida para gerar um resíduo. O resíduo foi purificado por HPLC prep (coluna: Agela innoval ods-2 250*80mm; fase móvel: água (TFA a 0,1%)-ACN]; B%: 8% a 38%, 20 min) para gerar composto 3- (dimetilamino)-14,14-bis(3-(dimetilamino)-2-metil-9-oxo-12- oxa-2,4,8-triazatridec-3-en-13-il)-2-metil-9,16-dioxo-12-oxa- 2,4,8,15-tetra-azaicos-3-en-20-oato de benzila (6,5 g, 52,37% de rendimento) como um óleo marrom. LCMS: M/2+H+= 503,1.
[001703] Etapa 3: A uma solução do composto 3- (dimetilamino)-14,14-bis(3-(dimetilamino)-2-metil-9-oxo-12- oxa-2,4,8-triazatridec-3-en-13-il)-2-metil-9,16-dioxo-12-oxa- 2,4,8,15-tetra-azaicos-3-en-20-oato de benzila (5,7 g, 5,68 mmol) em MeOH (30 ml) e H2O (6 ml) foi adicionado LiOH.H2O
(1,67 g, 39,73 mmol). A mistura foi agitada a 15 °C por 2 h. LCMS mostrou que o composto 3 foi consumido e a MS desejada foi detectada A mistura foi concentrada sob pressão reduzida para gerar um resíduo. O resíduo foi purificado por HPLC prep (coluna: Phenomenex luna C18 250*50 mm*10 um;fase móvel: água (TFA a 0,1%)-ACN]; B%: 0% a 25%, 20min). Ácido 3- (dimetilamino)-14,14-bis(3-(dimetilamino)-2-metil-9-oxo-12- oxa-2,4,8-triazatridec-3-en-13-il)-2-metil-9,16-dioxo-12-oxa- 2,4,8,15-tetra-azaicos-3-en-20-oico (2,09 g, 2,25 mmol, 40% de rendimento) foi obtido como uma goma amarela. 1HRMN (400 MHz, DMSO-d6) Deslocamento = 8,07 (t l, J = 5,7 Hz, 3H), 7,75 (t l, J = 5,0 Hz, 3H), 7,08 (s, 1H), 3,63 - 3,45 (m, 12H), 3,09 (q, J = 6,1 Hz, 11H), 2,88 (d l, J = 15,3 Hz, 36H), 2,29 (t l, J = 6,4 Hz, 6H), 2,18 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 2,12 - 2,06 (m, 2H), 1,65 (t l, J = 6,6 Hz, 8H). 13CRMN (101 MHz, DMSO-d6) Shift = 173,10, 170,88, 169,27, 159,88, 157,61, 157,27, 156,93, 156,58, 119,48, 116,56, 113,63, 110,70, 67,13, 66,27, 58,46, 40,77, 34,82, 34,34, 33,88, 31,87, 28,23, 19,66, 0,00. LCMS: M + H+ = 915,7, pureza: 98,265%.
[001704] Síntese de ácido 5- (((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-triacetoxi-6-(acetoximetil)tetra- hidro-2H-piran-2-il)oxi)pentanoico
[001705] Etapa 1: Uma mistura de fenilmetanol (864,10 g, 7,99 mol), composto 1 (100 g, 998,85 mmol), e resina de troca catiônica (1,92 g, 998,85 mmol.).) foi agitada a 75°C com N2 por 4 h, e, então a mistura foi agitada a 20°C por 12 h sob atmosfera de N2. TLC mostrou que o composto 1 foi completamente consumido e dois picos principais foram detectados. A mistura de reação foi filtrada e então o resíduo foi lavado com DCM (500 ml). A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida para gerar um resíduo. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna (SiO2, Éter de petróleo/Acetato de etila = 10/1 a 3:1) para obter o composto 2 como um óleo incolor (62 g, 29,81% de rendimento). 1HRMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d): δ = 7,41 - 7,27 (m, 5H), 5,11 (s, 2H), 3,62 (t, J = 6,4 Hz, 2H), 2,39 (t, J = 7,3 Hz, 2H), 1,77 - 1,70 (m, 2H), 1,65 - 1,51 (m, 2H); TLC (Éter de petróleo / Acetato de etila = 3:1) Rf = 0,20.
[001706] Etapa 2: A uma solução do composto 3 (350 g, 896,66 mmol.) em DMF (2 l) foi adicionada hidrazina de ácido acético (99,10 g, 1,08 mol). A mistura foi agitada a 60°C por 5h. TLC mostrou que o material de partida foi consumido. A mistura foi concentrada para mover o máximo de solvente e água (500 ml) foi adicionada, e a mistura foi extraída com EtOAc (500 ml*3). O orgânico combinado foi seco com Na2SO4, filtrado e concentrado para obter o composto 4 como um óleo marrom (310 g, produto bruto). 1HRMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d): δ = 5,49 (t, J = 9,9 Hz, 1H), 5,39 (d, J = 3,5 Hz, 1H), 5,06 - 4,99 (m, 1H), 4,84 (dd, J = 3,5, 10,1 Hz, 1H), 4,25 - 4,17 (m, 2H), 4,13 - 4,02 (m, 2H), 2,04 - 1,96 (m, 12H); TLC (Éter de petróleo / Acetato de etila = 1:1) Rf = 0,43.
[001707] Etapa 3: A uma solução do composto 4 (310 g, 890,03 mmol.) em DCM (1,5 l) foi adicionada 2,2,2- tricloroacetonitrila (1,16 kg, 8,01 mol) a 0 °C. A mistura foi adicionada por gotejamento a DBU (271,00 g, 1,78 mol) e dissolvida em DCM (1 l) a 0 °C. A mistura foi agitada a 20°C por 1h. TLC mostrou que o material de partida foi consumido. A mistura foi concentrada para obter o produto bruto. A mistura foi purificada por cromatografia em gel de sílica (Éter de petróleo / Acetato de etila 20:1, 10:1, 5:1) para obter o composto 5 como um óleo amarelo (90 g, 20,52% de rendimento). 1HRMN (400 MHz, CDCl3): δ = 8,70 (s, 1H), 6,56 (d l, J = 3,1 Hz, 1H), 5,57 (t, J = 9,8 Hz, 1H), 5,24 - 5,08 (m, 2H), 4,35 - 4,15 (m, 2H), 2,11 - 1,99 (m, 12H); TLC (Éter de petróleo / Acetato de etila = 1:1) Rf = 0,31.
[001708] Etapa 4: A uma solução do composto 5 (89,5 g, 181,66 mmol) e do composto 2 (75,66 g, 363,31 mmol) em DCM (800 ml) foi adicionado 4A MS (90 g), a mistura foi agitada a -30°C por 30 min. TMSOTf (40,37 g, 181,66 mmol.) foi adicionado à reação e a mistura foi agitada a 25°C por 3h. LCMS e TLC mostraram que o material de partida foi consumido e LCMS mostrou que a de-Ac MS foi encontrada NaHCO3 sat, (aq., 100 ml) foi adicionado e a mistura foi extraída com DCM (150 ml*3). O orgânico combinado foi seco com Na2SO4, filtrado e concentrado para obter o produto bruto. A mistura de composto 6 benzila e do composto 6A (98 g) foi totalmente obtida como um óleo amarelo, a mistura foi usada diretamente na etapa seguinte. TLC (Éter de petróleo / Acetato de etila = 2:1) Rf = 0,38.
[001709] Etapa 5: A mistura do composto 6 e do composto 6A (98 g de produto bruto) foi dissolvida na piridina (150 ml) e, então, Ac2O (150 ml) foi adicionado. A mistura foi agitada a 20°C por 12 h. TLC mostrou que o material de partida foi consumido. A mistura foi concentrada para obter o produto bruto. A mistura foi purificada por MPLC (sílica, Éter de petróleo / Acetato de etila = 20:1, 10:1, 05:1) para obter o composto 6 como um óleo amarelo (41 g, 41,84% de rendimento) e 12 g de produto bruto. 1HRMN (400 MHz, CDCl3): δ = 7,39 - 7,31 (m, 5H), 5,23 - 4,93 (m, 3H), 4,48 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 4,37 - 4,22 (m, 1H), 4,17 - 4,05 (m, 1H), 3,92 - 3,81 (m, 1H), 3,71 - 3,63 (m, 1H), 3,48 (td, J = 6,3, 9,8 Hz, 1H), 2,44 - 2,32 (m, 2H), 2,09 - 1,98 (m, 12H), 1,75 - 1,53 (m, 4H); LCMS: (M+Na+): 561,0; SFC: de%: 100%; TLC (Éter de petróleo / Acetato de etila = 3:1) Rf = 0,14.
[001710] Etapa 6: A uma solução do composto 7 (19,5 g, 36,21 mmol) em EtOAc (200 ml) foi adicionado Pd/C (4 g, 17,64 mmol, 10% de pureza) sob atmosfera de N2. A suspensão foi desgaseificada e purificada com H2 3 vezes. A mistura foi agitada sob H2 (25 Psi) a 20°C por 2 h. LCMS e TLC mostraram que o material de partida foi consumido A mistura foi filtrada, a torta foi lavada com MeOH (50 ml*3) e o filtro combinado foi concentrado para obter o produto bruto. A mistura foi purificada por cromatografia em gel de sílica (Éter de petróleo
/ Acetato de etila = 3:1, 1:1, 1:3) para obter ácido 5- (((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-triacetoxi-6-(acetoximetil)tetra- hidro-2H-piran-2-il)oxi)pentanoico 7 como um sólido branco (23,9 g, 51,72 mmol, 71,41% de rendimento, 97,03% de LCMS pureza). 1HRMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d): δ = 5,24 - 5,17 (m, 1H), 5,12 - 4,96 (m, 2H), 4,50 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 4,26 (dd, J = 4,7, 12,3 Hz, 1H), 4,20 - 4,02 (m, 1H), 3,95 - 3,85 (m, 1H), 3,75 - 3,64 (m, 1H), 3,55 - 3,46 (m, 1H), 2,42 - 2,32 (m, 2H), 2,15 - 1,99 (m, 12H), 1,76 - 1,57 (m, 4H); 13CRMN (101 MHz, CLOROFÓRMIO-d): δ = 178,85, 170,71, 170,30, 169,40, 169,35, 100,71, 72,81, 71,74, 71,25, 69,37, 68,42, 61,94, 33,36, 28,59, 21,09, 20,70, 20,56; LCMS: (M-H+): 447,1, LCMS pureza: 97,03%; TLC (Éter de petróleo / Acetato de etila = 1:1) Rf = 0,03.
[001711] Síntese de ácido 5,12,18-trioxo-7,7- bis((3-oxo-3-((3-(5-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-triacetoxi-6- (acetoximetil)tetra-hidro-2H-piran-2- il)oxi)pentanamido)propil)amino)propoxi)metil)-22- (((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-triacetoxi-6-(acetoximetil)tetra- hidro-2H-piran-2-il)oxi)-9-oxa-6,13,17-triazadocosanoico
[001712] Etapa 1: A uma solução de 15,15- bis(13,13-dimetil-5,11-dioxo-2,12-dioxa-6,10- diazatetradecil)-2,2-dimetil-4,10,17-trioxo-3,13-dioxa- 5,9,16-triazaenicosan-21-oato de benzila (2,15 g, 2,1282 mmol) em DCM (20 ml) foi foi adicionado TFA (5 ml). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 4 h. LC-MS mostrou que a reação foi concluída. O solvente foi evaporado sob pressão reduzida para gerar 5-((1,19-diamino-10-((3-((3- aminopropil)amino)-3-oxopropoxi)metil)-5,15-dioxo-8,12-dioxa- 4,16-diazanonadecan-10-il)amino)-5-oxopentanoato de benzila como um óleo incolor. Usar diretamente para a próxima etapa sem purificação.
[001713] Etapa 2: A uma solução de ácido 5- (((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-triacetoxi-6-(acetoximetil)tetra- hidro-2H-piran-2-il)oxi)pentanoico (3,817 g, 8,51 mmol) em DMF
(20 ml) foram adicionados DIPEA (5,66 ml, 31,92 mmol) e HATU (2,824 g, 7,45 mmol) seguido de 5-((1,19-diamino-10-((3-((3- aminopropil)amino)-3-oxopropoxi)metil)-5,15-dioxo-8,12-dioxa- 4,16-diazanonadecan-10-il)amino)-5-oxopentanoato de benzila (2,1282 mmol). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 3 h. O solvente foi evaporado sob pressão reduzida para gerar um resíduo, que foi purificado por ISCO (120 g de coluna de ouro) eluindo com DCM a MeOH a 50% em DCM para gerar éster 5,12,18-trioxo-7,7-bis((3-oxo-3-((3-(5- (((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-triacetoxi-6-(acetoximetil)tetra- hidro-2H-piran-2- il)oxi)pentanamido)propil)amino)propoxi)metil)-22- (((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-triacetoxi-6-(acetoximetil)tetra- hidro-2H-piran-2-il)oxi)-9-oxa-6,13,17-triazadocosanoico benzílico (5,08 g, 120%), que contém algumas impurezas. MS (ESI), 1001,4 ((M/2+H)+.
[001714] Etapa 3: A uma solução de éster 5,12,18-trioxo-7,7-bis((3-oxo-3-((3-(5-(((2R,3R,4S,5R,6R)- 3,4,5-triacetoxi-6-(acetoximetil)tetra-hidro-2H-piran-2- il)oxi)pentanamido)propil)amino)propoxi)metil)-22- (((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-triacetoxi-6-(acetoximetil)tetra- hidro-2H-piran-2-il)oxi)-9-oxa-6,13,17-triazadocosanoico benzílico (5,08 g,) em EtOAc (100 ml) e MeOH (10 ml) foi adicionado Pd-C a 10% (500 mg). A mistura de reação foi agitada à rt por 4 h sob balão de hidrogênio. LC-MS mostrou que a reação foi concluída. A mistura de reação foi filtrada, lavada com EtOAc/MeOH, concentrada para gerar ácido 45,12,18-trioxo- 7,7-bis((3-oxo-3-((3-(5-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-triacetoxi- 6-(acetoximetil)tetra-hidro-2H-piran-2- il)oxi)pentanamido)propil)amino)propoxi)metil)-22-
(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-triacetoxi-6-(acetoximetil)tetra- hidro-2H-piran-2-il)oxi)-9-oxa-6,13,17-triazadocosanoico (4,60 g, 95%). MS (ESI), 1912 ((M+H)+.
[001715] Síntese de ácido (S)-5,11,18,22- tetraoxo-16,16-bis((3-oxo-3-((3-(5-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5- triacetoxi-6-(acetoximetil)tetra-hidro-2H-piran-2- il)oxi)pentanamido)propil)amino)propoxi)metil)-1- (((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-triacetoxi-6-(acetoximetil)tetra- hidro-2H-piran-2-il)oxi)-28-(5,12,18-trioxo-7,7-bis((3-oxo-3- ((3-(5-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-triacetoxi-6- (acetoximetil)tetra-hidro-2H-piran-2- il)oxi)pentanamido)propil)amino)propoxi)metil)-22- (((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-triacetoxi-6-(acetoximetil)tetra- hidro-2H-piran-2-il)oxi)-9-oxa-6,13,17-triazadocosanamido)- 14-oxa-6,10,17,23-tetra-azanonacosan-29-oico
[001716] Etapa 1: A uma solução de ácido
5,12,18-trioxo-7,7-bis((3-oxo-3-((3-(5-(((2R,3R,4S,5R,6R)- 3,4,5-triacetoxi-6-(acetoximetil)tetra-hidro-2H-piran-2- il)oxi)pentanamido)propil)amino)propoxi)metil)-22- (((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-triacetoxi-6-(acetoximetil)tetra- hidro-2H-piran-2-il)oxi)-9-oxa-6,13,17-triazadocosanoico (987 mg, 0,520 mmol) em acetonitrila (3 ml) e DCM (10 ml) foram adicionados DIPEA (0,27 ml, 1,55 mmol) e HATU (150 mg, 0,400 mmol) seguido de sal de éster L-lisina di-4-toluenossulfonato benzílico (100 mg, 0,170 mmol). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente de um dia para o outro. O solvente foi evaporado sob pressão reduzida para gerar um resíduo, que foi purificado por ISCO (40 g de coluna de ouro) eluindo com DCM a MeOH a 30% em DCM para gerar éster (S)-5,11,18,22-tetraoxo- 16,16-bis((3-oxo-3-((3-(5-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5- triacetoxi-6-(acetoximetil)tetra-hidro-2H-piran-2- il)oxi)pentanamido)propil)amino)propoxi)metil)-1- (((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-triacetoxi-6-(acetoximetil)tetra- hidro-2H-piran-2-il)oxi)-28-(5,12,18-trioxo-7,7-bis((3-oxo-3- ((3-(5-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-triacetoxi-6- (acetoximetil)tetra-hidro-2H-piran-2- il)oxi)pentanamido)propil)amino)propoxi)metil)-22- (((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-triacetoxi-6-(acetoximetil)tetra- hidro-2H-piran-2-il)oxi)-9-oxa-6,13,17-triazadocosanamido)- 14-oxa-6,10,17,23-tetra-azanonacosan-29-oico benzílico (433 mg, 63%), que contém algumas impurezas. MS (ESI), 1342,0 ((M/3+H)+.
[001717] Etapa 3: A uma solução de éster (S)- 5,11,18,22-tetraoxo-16,16-bis((3-oxo-3-((3-(5- (((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-triacetoxi-6-(acetoximetil)tetra- hidro-2H-piran-2-
il)oxi)pentanamido)propil)amino)propoxi)metil)-1- (((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-triacetoxi-6-(acetoximetil)tetra- hidro-2H-piran-2-il)oxi)-28-(5,12,18-trioxo-7,7-bis((3-oxo-3- ((3-(5-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-triacetoxi-6- (acetoximetil)tetra-hidro-2H-piran-2- il)oxi)pentanamido)propil)amino)propoxi)metil)-22- (((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-triacetoxi-6-(acetoximetil)tetra- hidro-2H-piran-2-il)oxi)-9-oxa-6,13,17-triazadocosanamido)- 14-oxa-6,10,17,23-tetra-azanonacosan-29-oico benzílico (430 mg) em EtOAc (15 ml) e MeOH (3 ml) foi adicionado Pd-C a 10% (100 mg). A mistura de reação foi agitada à rt por 4 h sob balão de hidrogênio. LC-MS mostrou que a reação foi concluída. A mistura de reação foi filtrada, lavada com EtOAc/MeOH, concentrada para gerar ácido (S)-5,11,18,22-tetraoxo-16,16- bis((3-oxo-3-((3-(5-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-triacetoxi-6- (acetoximetil)tetra-hidro-2H-piran-2- il)oxi)pentanamido)propil)amino)propoxi)metil)-1- (((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-triacetoxi-6-(acetoximetil)tetra- hidro-2H-piran-2-il)oxi)-28-(5,12,18-trioxo-7,7-bis((3-oxo-3- ((3-(5-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-triacetoxi-6- (acetoximetil)tetra-hidro-2H-piran-2- il)oxi)pentanamido)propil)amino)propoxi)metil)-22- (((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-triacetoxi-6-(acetoximetil)tetra- hidro-2H-piran-2-il)oxi)-9-oxa-6,13,17-triazadocosanamido)- 14-oxa-6,10,17,23-tetraazanonacosan-29-oico (400 mg, 94%). MS (ESI), 1968 ((M/2+H)+.
[001718] Síntese de WV-12567
[001719] A uma solução de WV-12566 em 0,4 ml de NMP e 0,57 ml de água foram adicionados DIPEA (20 µl) e uma solução de 3-(((4-nitrofenoxi)carbonil)oxi)propil (4E,8E,12E,16E)-4,8,13,17,21-pentametildocosa-4,8,12,16,20- pentaenoato (20 mg) em NMP (0,40 ml). A mistura de reação foi agitada por 12 horas a 35 °C. LC-MS mostrou que o material de partida desapareceu O produto bruto foi purificado em RP HPLC (C8) usando 50 mM de TEAA em água e acetonitrila, e dessalinizado para obter 1,77 mg do conjugado WV-12567. Massa Desconvolucionada: 7362; Peso molecular calculado: 7360.
[001720] Síntese de WV-12570
[001721] A uma solução de ácido (4E,8E,12E,16E)-4,8,13,17,21-pentametildocosa-4,8,12,16,20- pentaenoico (turbinárico) (6,4 mg, 16 µmol) e HATU (5,4 mg, 14,4 µmol) foi adicionado DIPEA (17µl). A mistura foi agitada por 30 min à rt. A mistura de reação foi adicionada a uma solução de WV 12569 (12,4 mg, 1,6 µmol) em água (0,20 ml) e NMP (0,20 ml) e agitada por 2 h a 35 °C. LC-MS mostrou que o material de partida desapareceu. O produto bruto foi purificado em RP HPLC (C-8) usando 50 mM de TEAA em água e acetonitrila, e dessalinizado para obter 2,10 mg do conjugado WV-12570. Massa Desconvolucionada: 8172; Peso molecular calculado: 8170.
[001722] Síntese de WV-14333
[001723] A uma solução de ácido 4,10,17- trioxo-15,15-bis((3-oxo-3-((3-(4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5- tris(benzoiloxi)-6-((benzoiloxi)metil)tetra-hidro-2H-piran-2- il)oxi)butanamido)propil)amino)propoxi)metil)-1- (((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-tris(benzoiloxi)-6- ((benzoiloxi)metil)tetra-hidro-2H-piran-2-il)oxi)-13-oxa- 5,9,16-triazaenicosan-21-oico (25,4 mg, 9,72 µmol) em acetonitrila (0,50 ml) foram adicionados HATU (3,32 mg, 8,75 µmol) e DIPEA (8,5 µl). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 30 minutos. A mistura de reação foi adicionada a uma solução de WV-12566 (16,7 mg, 2,43 µmol) em 0,5 ml de água. A mistura de reação foi agitada a 30 °C por 2 h, e LC-MS mostrou que a reação foi concluída. A mistura de reação foi transferida para o tubo de pressão, e 4 ml de hidróxido de amônio a 28 a 30% foram adicionados. A mistura de reação foi agitada a 35 °C de um dia para o outro. LC-MS mostrou que a reação foi completamente desprotegida. O produto bruto foi purificado por ISCO através de 30 g de Cartucho C18 eluindo com 50 mM de TEAA à acetonitrila, e dessalinizado para obter 12,8 mg do conjugado WV-14333. Massa Desconvolucionada: 8224; Peso molecular calculado: 8221.
[001724] Síntese de WV-14332
[001725] Uma solução de carbonato de 4- nitrofenil (2,5,7,8-tetrametil-2-(4,8,12- trimetiltridecil)croman-6-ila) (7,24 mg, 12,15 µmol) e DIPEA (8,50 µl) em NMP (0,20 ml) foi adicionada a uma solução de WV- 12566 (16,7 mg, 2,43 µmol) em 0,5 ml de DMSO e 0,05 ml de água. A mistura de reação foi agitada por 3 horas a 40 °C. LC-MS mostrou que a reação foi muito limpa. O produto bruto foi liofilizado, purificado em RP HPLC (C-8) usando 50 mM de TEAA em água e acetonitrila, e dessalinizado para obter 10 mg do conjugado WV-14332. Massa Desconvolucionada: 7335; Peso molecular calculado: 7334.
[001726] Síntese de WV-14346
[001727] A uma solução de ácido 3- (dimetilamino)-14,14-bis(3-(dimetilamino)-2-metil-9-oxo-12- oxa-2,4,8-triazatridec-3-en-13-il)-2-metil-9,16-dioxo-12-oxa- 2,4,8,15-tetra-azaicos-3-en-20-oico (75,26 mg, 82,34 µmol) em DMF (1,0 ml) foram adicionados DIPEA (123 µl, 0,823 mmol) e HATU (28,1 mg, 74,12 µmol). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 15 minutos. A mistura de reação foi adicionada a uma solução de WV-12566 (113,22 mg, 16,47 µmol) em 1,50 ml de DMSO e 0,50 ml de água. A mistura de reação foi agitada por 2 hora à rt. LC-MS mostrou que a reação foi concluída. A mistura de reação foi diluída com água, e centrifugada a vácuo à alta velocidade até secar. O produto bruto foi purificado por RP-HPLC eluindo com 50 mM de TEAA em água à acetonitrila, e dessalinizado para obter 84,3 mg do conjugado WV-14346. Massa Desconvolucionada: 7772; Peso molecular calculado: 7771.
[001728] Síntese de WV-14335
[001729] Etapa 1: Uma solução de ácido 3-(2- Piridilditio)-propiônico-OSu (9,08 mg) em DMF (1,0 ml) foi adicionada a uma solução de WV-12566 (100 mg, 14,54 em 1,5 ml de tampão de fosfato de sódio a 0,5 M (pH = 8). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 1 h. LC-MS mostrou que a reação foi concluída. A mesma foi diluída com água, e liofilizada para gerar o produto desejado.
[001730] Síntese de WV-14335
[001731] Etapa 1: Uma solução de ácido 3-(2- Piridilditio)-propiônico-OSu (9,08 mg) em DMF (1,0 ml) foi adicionada a uma solução de WV-12566 (100 mg, 14,54 em 1,5 ml de tampão de fosfato de sódio a 0,5 M (pH = 8). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 1 h. LC-MS mostrou que a reação foi concluída. A mesma foi diluída com água, e liofilizada para gerar o produto desejado.
[001732] Etapa 2: Uma solução de H- RRQPPRSISSHPC-OH (5,47 mg, 3,6 umol) em DMF (0,85 ml) e 0,1 M de bicarbonato de sódio (0,15 ml) foi adicionado ao produto acima (etapa 1) (12 mg, 1,8 µmol) em 0,1 M de bicarbonato de sódio (0,50 ml). A mistura de reação foi agitada por 1,5 hora à rt. LC-MS mostrou que a reação foi concluída. A mistura de reação foi diluída com água, e centrifugada a vácuo à alta velocidade até secar. O produto bruto foi purificado por RP- HPLC eluindo com 50 mM de TEAA em água à acetonitrila, e dessalinizado para obter 3,0 mg do conjugado WV-14335. Massa Desconvolucionada: 8485; Peso molecular calculado: 8482.
[001733] Síntese de WV-14347
[001734] Uma solução de Ac-CHAIYPRH-OH (3,74 mg, 3,6 µmol) em DMF (0,85 ml) e 0,1 M de NaHCO3 (0,15 ml) foi adicionado a SPDP oligo (etapa 1 produto de WV-14335) (12 mg, 1,8 µmol) em 0,10 M de NaHCO3 (0,50 ml). A mistura de reação foi agitada por 1,5 hora à temperatura ambiente. LC-MS mostrou que a reação foi concluída. A mistura de reação foi diluída com água, e centrifugada a vácuo à alta velocidade até secar.
O produto bruto foi purificado por RP-HPLC eluindo com 50 mM de TEAA em água à acetonitrila, e dessalinizado para obter 8,8 mg do conjugado WV-14347. Massa Desconvolucionada: 8003; Peso molecular calculado: 7999.
[001735] Síntese de WV-14348
[001736] Uma solução de Ac-CTHRPPMWSPVWP-OH (5,88 mg, 3,6 µmol) em DMF (0,85 ml) e 0,1 M de NaHCO3 (0,15 ml) foi adicionado a SPDP oligo (etapa 1 produto de WV-14335) (12 mg, 1,8 µmol) em 0,10 M de NaHCO3 (0,50 ml). A mistura de reação foi agitada por 1,5 hora à temperatura ambiente. LC-MS mostrou que a reação foi concluída. A mistura de reação foi diluída com água, e centrifugada a vácuo à alta velocidade até secar. O produto bruto foi purificado por RP-HPLC eluindo com 50 mM de TEAA em água à acetonitrila, e dessalinizado para obter 4,1 mg do conjugado WV-14348. Massa Desconvolucionada: 8602; Peso molecular calculado: 8597.
[001737] Síntese de WV-15074
[001738] Etapa 1: Uma solução de 2,5- dioxopirrolidin-1-il 4-((2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)metil)ciclo-hexano-1-carboxilato (8,25 mg, 24,71 µmol) em DMF (0,30 ml) foi adicionada a WV-12566 (113,22 mg, 16,47 µmol) e DIPEA (31 µl, 173 µmol) em DMSO (1,50 ml) e água (0,5 ml). A mistura de reação foi agitada por 30 minutos à temperatura ambiente. MS mostrou que a reação foi quase concluída.
[001739] Etapa 2: Uma solução de Ac-CHAIYPRH- OH (38,47 mg, 37,1 µmol) em DMF (0,50 ml) foi adicionada à mistura de reação acima. A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 2 h. LC_MS mostrou que reação foi concluída A mistura de reação foi diluída com água, e centrifugada a vácuo à alta velocidade até secar. O produto bruto foi purificado por RP-HPLC eluindo com 50 mM de TEAA em água à acetonitrila, e dessalinizado para obter 66,0 mg do conjugado WV-15074. Massa Desconvolucionada: 8133; Peso molecular calculado: 8132.
[001740] Síntese de WV-15075
[001741] Etapa 1: Uma solução de 2,5- dioxopirrolidin-1-il 4-((2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)metil)ciclo-hexano-1-carboxilato (1,3 mg, 3,99 µmol) em DMF (0,10 ml) foi adicionada a uma solução de WV-12566 (16,7 mg, 2,49 µmol) e DIPEA (3,5 µl) em DMSO (0,30 ml) e água (0,10 ml). A mistura de reação foi agitada por 1 h à temperatura ambiente. MS mostrou que a reação foi quase concluída.
[001742] Etapa 2: Uma solução de Ac- CTHRPPMWSPVWP-OH (9,8 mg, 6,0 µmol) em DMF (0,20 ml) foi adicionada à mistura de reação acima. A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 3 h. LC_MS mostrou que a reação foi concluída. A mistura de reação foi diluída com água, e centrifugada a vácuo à alta velocidade até secar. O produto bruto foi purificado por RP-HPLC eluindo com 50 mM de TEAA em água à acetonitrila, e dessalinizado para obter 8,9 mg do conjugado WV-15075. Massa Desconvolucionada: 8735; Peso molecular calculado: 8730.
[001743] Síntese de WV-15076
[001744] Etapa 1: Uma solução de 2,5- dioxopirrolidin-1-il 4-((2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)metil)ciclo-hexano-1-carboxilato (1,3 mg, 3,99 umol) em DMF (0,10 ml) foi adicionada a uma solução de WV-12566 (16,7 mg, 2,49 µmol) e DIPEA (3,5 µl) em DMSO (0,30 ml) e água (0,10 ml). A mistura de reação foi agitada por 1 h à temperatura ambiente. MS mostrou que a reação foi quase concluída.
[001745] Etapa 2: Uma solução de H- RRQPPRSISSHPC-OH (9,1 mg, 6,0 µmol) em DMF (0,20 ml) foi adicionada à mistura de reação acima. A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 3 h. LC_MS mostrou que a reação foi concluída. A mistura de reação foi diluída com água, e centrifugada a vácuo à alta velocidade até secar. O produto bruto foi purificado por RP-HPLC eluindo com 50 mM de TEAA em água à acetonitrila, e dessalinizado para obter 4,7 mg do conjugado WV-15076. Massa Desconvolucionada: 8735; Peso molecular calculado: 8730.
[001746] Síntese de WV-15367
[001747] A uma solução de ácido 5,12,18- trioxo-7,7-bis((3-oxo-3-((3-(5-(((2S,3S,4S,5R,6R)-3,4,5- triacetoxi-6-(acetoximetil)tetra-hidro-2H-piran-2- il)oxi)pentanamido)propil)amino)propoxi)metil)-22- (((2S,3S,4S,5R,6R)-3,4,5-triacetoxi-6-(acetoximetil)tetra- hidro-2H-piran-2-il)oxi)-9-oxa-6,13,17-triazadocosanoico (13,9 mg, 7,29 µmol) em DMF (0,50 ml) foram adicionados DIPEA (6,3 µl, 36,4 µmol) e HATU (2,3 mg, 6,0 µmol). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 30 minutos. A mistura de reação foi adicionada a uma solução de WV-12566
(16,7 mg, 2,43 µmol) em 0,30 ml de DMSO e 0,10 ml de água. A mistura de reação foi agitada por 2 hora à rt. LC_MS mostrou que reação foi concluída À mistura de reação foi adicionado hidróxido de amônio a 28 a 30%, agitado a 40 °C por 3 h. LC_MS mostrou que a reação foi concluída. A mistura de reação foi diluída com água, e centrifugada a vácuo à alta velocidade até secar. O produto bruto foi purificado por RP-HPLC eluindo com 50 mM de TEAA em água à acetonitrila, e dessalinizado para obter 9,2 mg do conjugado WV-15367. Massa Desconvolucionada: 8269; Peso molecular calculado: 8263.
[001748] Síntese de WV-15368
[001749] A uma solução de ácido 5-(4-(4,6- bis((3,9,13,20,26-pentaoxo-15,15-bis((3-oxo-3-((3-(5- (((2S,3S,4S,5R,6R)-3,4,5-triacetoxi-6-(acetoximetil)tetra- hidro-2H-piran-2- il)oxi)pentanamido)propil)amino)propoxi)metil)-30- (((2S,3S,4S,5R,6R)-3,4,5-triacetoxi-6-(acetoximetil)tetra- hidro-2H-piran-2-il)oxi)-17-oxa-4,8,14,21,25-penta- azatriacontil)amino)-1,3,5-triazin-2-il)piperazin-1-il)-5-
oxopentanoico (31,7 mg, 7,29 µmol) em DMF (0,50 ml) foram adicionados DIPEA (6,3 μl 36,4 µmol) e HATU (2,3 mg, 6,0 µmol). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 30 minutos. A mistura de reação foi adicionada a uma solução de WV-12566 (16,7 mg, 2,43 µmol) em 0,30 ml de DMSO e 0,10 ml de água. A mistura de reação foi agitada por 2 horas à rt. LC_MS mostrou que reação foi concluída À mistura de reação foi adicionado hidróxido de amônio a 28 a 30% (1,0 ml), agitado a 40 °C por 5 h. LC_MS mostrou que a reação foi concluída. A mistura de reação foi diluída com água, e centrifugada a vácuo à alta velocidade até secar. O produto bruto foi purificado por RP-HPLC eluindo com 50 mM de TEAA em água à acetonitrila, e dessalinizado para obter 7,5 mg do conjugado WV-15368. Massa Desconvolucionada: 10206; Peso molecular calculado: 10200.
[001750] Síntese de WV-15882
[001751] A uma solução de ácido 5,12,18- trioxo-7,7-bis((3-oxo-3-((3-(5-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5- triacetoxi-6-(acetoximetil)tetra-hidro-2H-piran-2- il)oxi)pentanamido)propil)amino)propoxi)metil)-22- (((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-triacetoxi-6-(acetoximetil)tetra- hidro-2H-piran-2-il)oxi)-9-oxa-6,13,17-triazadocosanoico (102 mg, 53,43 µmol) em DMF (1,0 ml) foram adicionados DIPEA (46,8 µl, 266,5 µmol) e HATU (13,5 mg, 35,68 µmol). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 30 minutos.
A mistura de reação foi adicionada a uma solução de WV-12566 (122,65 mg, 17,84 µmol) em 1,5 ml de DMSO e 0,50 ml de água.
A mistura de reação foi agitada por 1,5 hora à rt.
LC_MS mostrou que reação foi concluída À mistura de reação foi adicionado hidróxido de amônio a 28 a 20% (5,0 ml) e agitado a 35 °C por 1,5 h. LC_MS mostrou que a reação foi concluída. A mistura de reação foi diluída com água, e centrifugada a vácuo à alta velocidade até secar. O produto bruto foi purificado por RP-HPLC eluindo com 50 mM de TEAA em água à acetonitrila, e dessalinizado para obter 83,8 mg do conjugado WV-15882. Massa Desconvolucionada: 8263; Peso molecular calculado: 8264.
[001752] Alguns exemplos fazem referência a oligonucleotídeos que alvejam Malat1. Alguns desses oligonucleotídeos são descritos em outra parte no presente documento e/ou abaixo. Oligonucleotídeo Sequência Sequência Estereoquímica Modificada Nua WV-2809 L001 * Geo * Geo * GGGTCAGCTGC XXXXXXXXXXX Geo * Teo * m5Ceo * CAATGCTAG XXXXXXXXX A * G * C * T * G * C * C * A * A * T * Geo * m5Ceo * Teo * Aeo * Geo WV-3356 L001Geo * Geo * Geo GGGTCAGCTGC OXXXXXXXXXXX * Teo * m5Ceo * A * CAATGCTAG XXXXXXXX G * C * T * G * C * C * A * A * T * Geo * m5Ceo * Teo * Aeo * Geo WV-7430 Mod043L001Geo * Geo GGGTCAGCTGC OXXXXXXXXXXX * Geo * Teo * m5Ceo CAATGCTAG XXXXXXXX * A * G * C * T * G * C * C * A * A * T
* Geo * m5Ceo * Teo * Aeo * Geo WV-7519 Mod009L001 * Geo * GGGTCAGCTGC XXXXXXXXXXX Geo * Geo * Teo * CAATGCTAG XXXXXXXXX m5Ceo * A * G * C * T * G * C * C * A * A * T * Geo * m5Ceo * Teo * Aeo * Geo WV-7557 L001mU * mG * mC * UGCCAGGCTG OXXXXXXXXXXX mC * mA * G * G * C GTTATGACUC XXXXXXXX * T * G * G * T * T * A * T * mG * mA * mC * mU * mC WV-7558 Mod027L001mU * mG * UGCCAGGCTG OXXXXXXXXXXX mC * mC * mA * G * GTTATGACUC XXXXXXXX G * C * T * G * G * T * T * A * T * mG * mA * mC * mU * mC WV-7559 Mod028L001mU * mG * UGCCAGGCTG OXXXXXXXXXXX mC * mC * mA * G * GTTATGACUC XXXXXXXX G * C * T * G * G * T * T * A * T * mG * mA * mC * mU * mC WV-7560 Mod007L001mU * mG * UGCCAGGCTG OXXXXXXXXXXX mC * mC * mA * G * GTTATGACUC XXXXXXXX G * C * T * G * G * T * T * A * T * mG * mA * mC * mU * mC
WV-8448 Mod059L001mU * mG * UGCCAGGCTG OXXXXXXXXXXX mC * mC * mA * G * GTTATGACUC XXXXXXXX G * C * T * G * G * T * T * A * T * mG * mA * mC * mU * mC WV-8927 Mod053L001mU * mG * UGCCAGGCTG OXXXXXXXXXXX mC * mC * mA * G * GTTATGACUC XXXXXXXX G * C * T * G * G * T * T * A * T * mG * mA * mC * mU * mC WV-8929 Mod057L001mU * mG * UGCCAGGCTG OXXXXXXXXXXX mC * mC * mA * G * GTTATGACUC XXXXXXXX G * C * T * G * G * T * T * A * T * mG * mA * mC * mU * mC WV-8930 Mod058L001mU * mG * UGCCAGGCTG OXXXXXXXXXXX mC * mC * mA * G * GTTATGACUC XXXXXXXX G * C * T * G * G * T * T * A * T * mG * mA * mC * mU * mC WV-8931 Mod009L001mU * mG * UGCCAGGCTG OXXXXXXXXXXX mC * mC * mA * G * GTTATGACUC XXXXXXXX G * C * T * G * G * T * T * A * T * mG * mA * mC * mU * mC WV-8934 Mod050L001mU * mG * UGCCAGGCTG OXXXXXXXXXXX mC * mC * mA * G * GTTATGACUC XXXXXXXX G * C * T * G * G *
T * T * A * T * mG * mA * mC * mU * mC WV-9385 Mod066L001mU * mG * UGCCAGGCTG OXXXXXXXXXXX mC * mC * mA * G * GTTATGACUC XXXXXXXX G * C * T * G * G * T * T * A * T * mG * mA * mC * mU * mC WV-9390 Mod074L001mU * mG * UGCCAGGCTG OXXXXXXXXXXX mC * mC * mA * G * GTTATGACUC XXXXXXXX G * C * T * G * G * T * T * A * T * mG * mA * mC * mU * mC WV-13809 Mod097L001mU * UGCCAGGCTG OSOOOSSRS SGeom5Ceom5CeomA * GTTATGACUC SRSSRSSSSSS SG * SG * RC * ST * SG * RG * ST * ST * RA * ST * SmG * SmA * SmC * SmU * SmC WV-27145 mU * SGCCmA * SG * UGCCAGGCTG SOOOSSRSnXR SG * RC * STn001G * GTTATGACUCU SSRSSSSSSS RG * ST * ST * RA * ST * SmG * SmA * SmC * SmU * SmC * SfU As modificações (por exemplo, designadas por Mod seguidas de um número, como Mod097, Mod074, etc.) são descritas na legenda na Tabela A1 ou em outra parte no presente documento
[001753] Síntese de WV-13809
[001754] Uma solução de carbonato de 4- nitrofenil (2,5,7,8-tetrametil-2-(4,8,12- trimetiltridecil)croman-6-ila) (vitamina E ativada) (15 mg, 25 µmol) e DIPEA (21 µl) em NMP (0,20 ml) foi adicionada a uma solução de WV-9696 em 0,5 ml de DMSO e 0,05 ml de água. A mistura de reação foi agitada por 2 h a 50 °C. LC-MS mostrou que a reação foi concluída. O produto bruto foi liofilizado, purificado em RP HPLC (C-8) usando 50 mM de TEAA em água e acetonitrila, e dessalinizado para obter 4,90 mg do conjugado WV-13809. Massa Desconvolucionada: 7451; Peso molecular calculado: 7451.
[001755] Síntese de WV-14349
[001756] A uma solução de ácido 3- (dimetilamino)-14,14-bis(3-(dimetilamino)-2-metil-9-oxo-12- oxa-2,4,8-triazatridec-3-en-13-il)-2-metil-9,16-dioxo-12-oxa- 2,4,8,15-tetra-azaicos-3-en-20-oico (19,61 mg, 21,45 µmol) em DMF (0,30 ml) foram adicionados DIPEA (75 µl) e HATU (7,32 mg, 19,31 µmol). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 20 minutos.
A mistura de reação foi adicionada a uma solução de WV-9696 (30 mg, 4,29 µmol) em 0,4 ml de DMSO e 0,10 ml de água.
A mistura de reação foi agitada à rt de um dia para o outro.
LC_MS mostrou que a reação não foi concluída.
A uma solução de ácido 3-(dimetilamino)-14,14-bis(3- (dimetilamino)-2-metil-9-oxo-12-oxa-2,4,8-triazatridec-3-en- 13-il)-2-metil-9,16-dioxo-12-oxa-2,4,8,15-tetra-azaicos-3-en- 20-oico (10 mg) em DMF (0,10 ml) foram adicionados DIPEA (38 µl) e HATU (3,7 mg). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 20 minutos.
A mistura de reação foi adicionada à mistura de reação acima com WV-9696. A mistura de reação foi agitada a 30 ºC por 2 h. LC_MS mostrou que a reação foi concluída. A mistura de reação foi diluída com água, e centrifugada a vácuo à alta velocidade até secar. O produto bruto foi purificado por RP-HPLC eluindo com 50 mM de TEAA em água à acetonitrila, e dessalinizado para obter 9,1 mg do conjugado WV-14349. Massa Desconvolucionada: 7893; Peso molecular calculado: 7889.
[001757] Síntese de WV8448
[001758] A uma solução de ácido 4,10,17- trioxo-15,15-bis((3-oxo-3-((3-(4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5- tris(benzoiloxi)-6-((benzoiloxi)metil)tetra-hidro-2H-piran-2- il)oxi)butanamido)propil)amino)propoxi)metil)-1- (((2R,3R,5R,6R)-3,4,5-tris(benzoiloxi)-6- ((benzoiloxi)metil)tetra-hidro-2H-piran-2-il)oxi)-13-oxa- 5,9,16-triazaenicosan-21-oico (57 mg, 21,8 µmol), HATU (7,5mg,
19,6 µmol) e DIPEA (14,6 mg, 109 µmol) em DMF (2,0 ml) foi agitado à temperatura ambiente por 15 minutos A esta solução foram adicionados 75 mg (10,9 µmol) de WV7557 em 1 ml de água. A mistura de reação foi agitada por 60 minutos para obter o produto desejado. Este produto foi aquecido a 40oC com NH4OH por 3 h. LC_MS mostrou que a reação foi concluída. A mistura de reação foi diluída com água, e centrifugada a vácuo à alta velocidade até secar. O produto bruto foi purificado por RP- HPLC eluindo com 50 mM de TEAA em água à acetonitrila, e dessalinizado para obter 39,73 mg do conjugado WV-8448. Massa Desconvolucionada: 8233; Peso molecular calculado: 8227.
[001759] Síntese de WV8927
[001760] A uma solução de ácido gambógico (21 mg, 33,6 µmol) em 2 ml de DMF seco foram adicionados HATU (11,5 mg, 30,2 µmol) e DIPEA (3,6 mg, 28 µmol) e bem agitado em vórtex. A esta solução foi adicionado WV7557 (42 mg, 5,6 µmol) em água (1 ml) e agitado por 4 horas. A Análise LC indicou a formação de produto, porém o material de partida permaneceu. Outros 6 seis equivalentes de complexo de ácido gambógico-HATU (mesma quantidade usada inicialmente) foram adicionados e bem agitados por 2 horas. A análise LC indicou mais formação de produto. A mistura de reação foi diluída com água (10 ml). O excesso de ácido gambógico foi precipitado. Este precipitado foi removido por filtração e o produto bruto foi purificado por RP-HPLC eluindo com 50 mM de TEAA em água à acetonitrila, e dessalinizado para obter 19 mg do conjugado WV-8927. Massa Desconvolucionada: 7496; Peso molecular calculado: 7492.
[001761] Síntese de WV-7558
[001762] A uma solução de ácido 4- sulfamoilbenzoico (7,3 mg, 36 µmol) em DMF (2,0 ml) foram adicionados HATU (12,4 mg, 32,7 µmol) e DIPEA (46 mg, 360 µmol) e agitados em vórtex Após 2 minutos WV7557 (50 mg, 7,27 µmol) em 1 ml de água foi adicionado e bem agitado. Após 60 minutos, a mistura de reação foi diluída com água (5 ml) e filtrada. O filtrado foi purificado por cromatografia em coluna RP (C-18) e dessalinizado para obter o produto (17 mg). Massa calculada: 7064; Massa Desconvolucionada: 7068.
[001763] Síntese de WV-7559
[001764] A uma solução de ácido 4-oxo-4-((4- sulfamoilfenotil)amino)butanoico (8,7 mg, 29 µmol) em DMF (2,0 ml) foram adicionados HATU (9,9 mg, 26 µmol) e DIPEA (37 mg, 290 µmol) e agitados em vórtex. Após 2 minutos WV7557 (40 mg, 5,81 µmol) em 1 ml de água foi adicionado e bem agitado. Após 30 minutos, a mistura de reação foi diluída com água (5 ml) e filtrada. O filtrado foi purificado por cromatografia em coluna RP (C-18) e dessalinizado para obter o produto (13 mg). Massa calculada: 7163; Massa Desconvolucionada: 7166.
[001765] A uma solução de WV7557 (62 mg, 9 µmol) em água (0,5 ml) e DMF (2,5 ml) foi adicionado DIPEA (11,6 mg, 90 µmol) e bem agitado A esta solução foi adicionado ácido 3-(2-Piridilditio)-propiônico-OSu (4 mg, 12,6 µmol) e bem agitado por 2h. O produto bruto foi diluído com água e purificado em ISCO (coluna C18) usando 50 mM de TEAA e acetonitrila. Quantidade de produto obtido: 46 mg.
[001766] Síntese de WV-8929
[001767] A uma solução do oligo (derivado de WV7557, 23,5 mg, 3,3 µmol) em mistura de água-DMF (2 ml + 1 ml) foi adicionado DIPEA (8,52 mg, 66 µmol), e agitado em vórtex por 5 minutos. A esta solução foi adicionado H- RRQPPRSISSHPC-OH (10 mg, 6,6 µmol) e novamente agitado em vórtex por 5 minutos. Após 12 horas, a mistura de reação foi analisada por LC-MS. LC_MS mostrou que reação foi concluída A mistura de reação foi diluída com água, e centrifugada a vácuo à alta velocidade até secar. O produto bruto foi purificado por RP-HPLC eluindo com 50 mM de TEAA em água à acetonitrila, e dessalinizado para obter 14 mg do conjugado WV-8929. Massa Desconvolucionada: 8496; Peso molecular calculado: 8490.
[001768] Síntese de WV-8930
[001769] A uma solução do oligo (derivado de WV7557, 23,5 mg, 3,3 µmol) em mistura de água-DMF (2 ml + 1 ml) foi adicionado DIPEA (8,52 mg, 66 µmol) e agitado em vórtex por 5 minutos. A esta solução foi adicionado H-Arg-Arg-Cys-OH (4 mg, 10 µmol) e agitado em vórtex por 5 minutos. Após 12 horas, a mistura de reação foi analisada por LC-MS. LC_MS mostrou que reação foi concluída A mistura de reação foi diluída com água, e centrifugada a vácuo à alta velocidade até secar. O produto bruto foi purificado por RP-HPLC eluindo com 50 mM de TEAA em água à acetonitrila, e dessalinizado para obter 5 mg do conjugado WV-8930. Massa Desconvolucionada: 7405; Peso molecular calculado: 7401.
[001770] Síntese de WV8931
[001771] Uma solução de WV7557 (20 mg, 2,91 µmol) em 0,47 ml de água foi tratada com DIPEA (3,76 mg, 29,1 µmol) e bem agitada em vórtex por 5 minutos A esta solução foi adicionada uma solução de carbonato de (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-dimetil-17-((R)-6-metil- heptan-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- tetradecaidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-ila (4-nitrofenila) (derivado de colesterol ativado) (10,50 mg, 19 µmol) em NMP (1,0 ml). A solução se tornou ligeiramente amarelada. A mesma foi agitada a 40 graus por 12 horas. Uma solução amarela brilhante foi obtida. A análise LC-MS indicou formação de produto. Esta solução foi diluída em 10 ml de água, filtrada e purificada em uma RP-HPLC usando uma coluna C-8 e dessalinizada. Quantidade de produto obtido: 18 mg; Massa Desconvolucionada: 7298; Peso molecular calculado: 7293.
[001772] Síntese de WV8934
[001773] L-carnitina (3 mg, 17,5 µmol) e HATU (6 mg, 16 µmol) foram misturados e transformados em uma solução de 1 ml em DMF. DIPEA (5,7 mg, 44 µmol) foi adicionado e bem agitado por 3 minutos. A esta solução foi adicionada uma solução de WV-7557 (30 mg, 4,4 mmol) em 0,5 ml de água e bem agitada por 30 minutos. A análise LC-MS da solução indicou formação de produto. Porém, o oligo inicial estava presente na mistura de reação. Mais 4 equivalentes de complexo L- carnitina/HATU foram adicionados novamente e bem agitados por 2 h. A mistura de reação foi diluída com água e o produto bruto foi purificado em uma coluna RP (C-18) para obter o produto. Quantidade de produto obtido: 12 mg, Massa Calculada: 7025; Massa Desconvolucionada: 7029.
[001774] Síntese de WV-9390
[001775] A uma solução de ácido 5-oxo-5-(4-(4- ((2,8,12,19,25-pentaoxo-14,14-bis((3-oxo-3-((3-(5- (((2S,3S,4S,5R,6R)-3,4,5-triacetoxi-6-(acetoximetil)tetra- hidro-2H-piran-2- il)oxi)pentanamido)propil)amino)propoxi)metil)-29- (((2S,3S,4S,5R,6R)-3,4,5-triacetoxi-6-(acetoximetil)tetra- hidro-2H-piran-2-il)oxi)-16-oxa-3,7,13,20,24- pentaazanonacosil)amino)-6-((3,9,13,20,26-pentaoxo-15,15-
bis((3-oxo-3-((3-(5-(((2S,3S,4S,5R,6R)-3,4,5-triacetoxi-6- (acetoximetil)tetra-hidro-2H-piran-2- il)oxi)pentanamido)propil)amino)propoxi)metil)-30- (((2S,3S,4S,5R,6R)-3,4,5-triacetoxi-6-(acetoximetil)tetra- hidro-2H-piran-2-il)oxi)-17-oxa-4,8,14,21,25-penta- azatriacontil)amino)-1,3,5-triazin-2-il)piperazin-1- il)pentanoico (15 mg, 3,5 µmol) e HATU (1,33 mg, 3,5 µmol) em DMF (1,0 ml) foi adicionado DIPEA (4,5 mg, 35 µmol) e agitado em vórtex por 2 minutos. A esta solução foi adicionado WV7557 (12 mg, 1,74 µmol) em água (0,5 ml) e agitado por 60 minutos. 5 ml de água foram adicionados à mesma e o solvente foi removido sob vácuo. O produto bruto foi purificado em uma coluna RP (C- 8) para obter o produto acetilado (Massa calculada: 10207, Massa Desconvolucionada: 10212). Este produto foi dissolvido em 5 ml de solução de hidróxido de amônio a 30% e aquecido a 40 graus Celsius por 6 horas. O solvente foi removido sob vácuo e o produto bruto foi purificado em uma coluna RP (C-8) para obter o produto. Quantidade de produto obtido (10 mg). Massa Calculada: 10205; Massa Desconvolucionada obtida: 10205.
[001776] Síntese de WV 9430
[001777] A uma solução de ácido 1,7,14-trioxo- 12,12-bis((3-oxo-3-((3-(4- sulfamoilbenzamido)propil)amino)propoxi)metil)-1-(4- sulfamoilfenil)-10-oxa-2,6,13-triazaoctadecan-18-oico (5,14 mg, 1,45 µmol) em DMF foram adicionados HATU (1,5 mg, 3,96 µmol) e DIPEA (2 mg, 15 µmol). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 2 minutos. Uma solução de WV7557 em 0,4 ml de água foi adicionada e bem agitada. Após 30 minutos, a mistura de reação foi diluída com água (5 ml) e filtrada. O filtrado foi purificado por cromatografia em coluna RP (C-18) e dessalinizado para obter o produto WV-9430 (6 mg). Massa calculada: 8032; Massa Desconvolucionada: 8031.
[001778] Síntese de WV-9385
[001779] WV7557 (48 mg, 6,9 µmol) foi dissolvido em 1 ml de NMP e 0,5 ml de água. DIPEA (14 mg, 103,5 µmol) foi adicionado a esta solução. Submetido a vórtice por 5 minutos. A esta solução foi adicionado estearato de 3-(((4- nitrofenoxi)carbonil)oxi)propila (14 mg, 27,6 µmol) em 1 ml de NMP. A mistura de reação foi filtrada e o filtrado foi purificado por cromatografia em coluna RP (C-8) para obter o produto. O material purificado foi dessalinizado e 11 mg de produto foram obtidos. Massa calculada: 7250; Massa Desconvolucionada: 7254.
[001780] Síntese de WV-7560
[001781] Ácido 12,12-bis((3-((3-(4- metoxibenzamido)propil)amino)-3-oxopropoxi)metil)-1-(4- metoxifenil)-1,7,14-trioxo-10-oxa-2,6,13-triazapentacosan-25- oico (anisamida triantenária) (32,5 mg, 29 µmol), HATU (10 mg, 26,1 µmol) e DIPEA (28 mg, 58 µmol) foram dissolvidos em 2 ml de DMF. Após 2 minutos WV7557 (100 mg, 15 µmol) em 1 ml de água foi adicionado e bem agitado. Após 60 minutos, a mistura de reação foi diluída com água (5 ml) e filtrada. O filtrado foi purificado por cromatografia em coluna RP (C-8) e dessalinizado para obter o produto (55 mg). Massa calculada: 7983; Massa Desconvolucionada: 7987.
[001782] Síntese de WV-7408
[001783] Uma suspensão de WV 3356 (40 mg, 5,3 µmol) e DIPEA (7 mg, 53 µmol) em 2 ml de DMF foi agitada em vórtex por cinco minutos. A esta suspensão foi adicionada uma solução de 2,5-dioxopirrolidin-1-il 4-sulfamoilbenzoato (8 mg, 26,5 µmol)] em 1 ml de DMF. A mistura de reação foi agitada por 12 horas. Posteriormente, a mistura de reação foi diluída com 5 ml de água e filtrada. O filtrado foi purificado por cromatografia em coluna RP (C-18) e dessalinizado para obter o produto (20 mg). Massa calculada: 7596; Massa Desconvolucionada: 7594.
[001784] Síntese de WV7409
[001785] A uma solução de ácido 4-oxo-4-((4- sulfamoilfenotil)amino)butanoico (2,16 mg, 7,2 µmol), HATU (2,32 mg, 6,1 µmol) e DIPEA (3,1 mg, 24 µmol) foram dissolvidos em 1 ml de DMF e agitados em vórtex Após 2 minutos WV3356 (18 mg, 2,4 µmol) em 0,5 ml de água foi adicionado e bem agitado.
Após 60 minutos, a mistura de reação foi diluída com água (5 ml) e filtrada. O filtrado foi purificado por cromatografia em coluna RP (C-18) e dessalinizado para obter o produto (9 mg). Massa calculada: 7694; Massa Desconvolucionada: 7695.
[001786] Síntese de WV-7430
[001787] A uma solução de WV3356 (32 mg, 4,3 µmol) em DMF (2,0 ml) foi adicionado DIPEA (5,8 mg, 43 µmol) foi adicionada uma solução de (R)-3-(((4- nitrofenoxi)carbonil)oxi)propano-1,2-diil didodecanoato (11 mg, 17,6 µmol) em acetonitrila (1,0 ml). A mistura de reação foi agitada a 40oC por 12 horas. A análise LC-MS indicou a formação de produto. A mistura de reação foi diluída com água e filtrada. O filtrado foi purificado por cromatografia em coluna RP (C-8) para obter o produto. O material purificado foi dessalinizado e 11 mg de produto foram obtidos. Massa calculada:7895, Massa Desconvolucionada:7896.
[001788] Síntese de WV-7419
[001789] A uma suspensão de WV-2809 (56 mg, 7,5 µmol, 125 mg de suporte) em DMF (2,0 ml) foi adicionado DIPEA (19,3 mg, 150 µmol) e bem agitado em vórtex por 5 minutos. A esta suspensão foi adicionado 18-oxo-18-((4-(N-(2,2,2- trifluoroacetil)sulfamoil)fenotil)amino)octadecanoato de perfluorofenila (12 mg, 15 µmol) e agitado por 12 horas à temperatura ambiente. O suporte sólido foi lavado com acetonitrila (20 ml X 3) e seco. Este suporte foi tratado com DEA a 20% em acetonitrila (1 ml) por 10 minutos. A solução de DEA foi removida por filtração. O suporte sólido foi lavado com acetonitrila (20 ml X 3) e seco. O suporte sólido foi aquecido com 2 ml de hidróxido de amônio a 30% por 12 horas. O suporte foi removido por filtração e o filtrado foi liofilizado para remover o solvente. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna RP (C-8) e dessalinizado para obter o produto (7 mg). Massa calculada:7906, Massa Desconvolucionada:7909.
[001790] Síntese de WV-7519
[001791] A uma suspensão de WV2809 (60 mg, 8 µmol, 150 mg de suporte) em 2 ml de NMP foi adicionado DIPEA (11 mg, 80 µmol) e bem agitado em vórtex por 5 minutos. A esta suspensão foi adicionado carbonocloridato de (8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-dimetil-17-((R)-6-metileptan-2- il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecaidro-1H- ciclopenta[a]fenantren-3-ila (15 mg, 33 µmol) e agitado por 12 horas à temperatura ambiente. O suporte sólido foi lavado com acetonitrila (20 ml X 3) e seco. Este suporte foi tratado com DEA a 20% em acetonitrila (1 ml) por 10 minutos. A solução de DEA foi removida por filtração. O suporte sólido foi lavado com acetonitrila (20 ml X 3) e seco. O suporte sólido foi aquecido a 50 oC com 2 ml de hidróxido de amônio a 30% por 12 horas. O suporte foi removido por filtração e o filtrado foi liofilizado para remover o solvente. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna RP (C-8) e dessalinizado para obter o produto (20 mg). Massa calculada:7840, Massa Desconvolucionada: 7841.
[001792] Síntese de WV-7422
[001793] A uma suspensão de WV2809 (56 mg, 7,5 µmol, 125 mg de suporte) em 2 ml de NMP foi adicionado DIPEA (19,3 mg, 150 µmol) e bem agitado em vórtex por 5 minutos. A esta suspensão foi adicionado 3-(4-(N-(2,2,2- trifluoroacetil)sulfamoil)fenil)propanoato de perfluorofenila (37 mg, 75 µmol) e agitado por 12 horas à temperatura ambiente. O suporte sólido foi lavado com acetonitrila (20 ml X 3) e seco. Este suporte foi tratado com DEA a 20% em acetonitrila (1 ml) por 10 minutos. A solução de DEA foi removida por filtração. O suporte sólido foi lavado com acetonitrila (20 ml X 3) e seco. O suporte sólido foi aquecido a 50 oC com 2 ml de hidróxido de amônio a 30% por 12 horas. O suporte foi removido por filtração e o filtrado foi liofilizado para remover o solvente. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna RP (C-8) e dessalinizado para obter o produto (18 mg). Massa calculada:7638, Massa Desconvolucionada:7641.
[001794] Síntese de WV-7421
[001795] Ácido 2-(4-sulfamoilfenil)acético (17,2 mg, 80 µmol), HATU (28 mg, 76 molµ) e DIPEA (20,6 mg, 160 µmol) em 2 ml de NMP foram bem agitados em vórtex por 2 minutos. A esta suspensão foi adicionado WV2809 (60 mg, 8 µmol, 150 mg de suporte) e bem agitado por 12 horas à temperatura ambiente. O suporte sólido foi lavado com acetonitrila (20 ml X 3) e seco. Este suporte foi tratado com DEA a 20% em acetonitrila (1 ml) por 10 minutos. A solução de DEA foi removida por filtração. O suporte sólido foi lavado com acetonitrila (20 ml X 3) e seco. O suporte sólido foi aquecido a 50oC com 2 ml de hidróxido de amônio a 30% por 12 horas. O suporte foi removido por filtração e o filtrado foi liofilizado para remover o solvente. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna RP (C-18) e dessalinizado para obter o produto (20 mg). Massa calculada:7624, Massa Desconvolucionada:7627.
[001796] Síntese de WV-7417
[001797] Uma suspensão de ácido 1,7,14-trioxo- 12,12-bis((3-oxo-3-((3-(4- sulfamoilbenzamido)propil)amino)propoxi)metil)-1-(4- sulfamoilfenil)-10-oxa-2,6,13-triazaoctadecan-18-oico (40 mg, 34 µmol), HATU (12 mg, 76 µmol) e DIPEA (44 mg, 340 µmol) em 2 ml de NMP foi bem agitada em vórtex por 3 minutos.
A esta suspensão foi adicionado WV2809 (60 mg, 8 µmol, 150 mg de suporte) e bem agitado por 12 horas a 40 °C.
O suporte sólido foi lavado com acetonitrila (20 ml X 3) e seco.
Este suporte foi tratado com DEA a 20% em acetonitrila (1 ml) por 10 minutos.
A solução de DEA foi removida por filtração.
O suporte sólido foi lavado com acetonitrila (20 ml X 3) e seco.
O suporte sólido foi aquecido a 50oC com 2 ml de hidróxido de amônio a 30% por 12 horas.
O suporte foi removido por filtração e o filtrado foi liofilizado para remover o solvente.
O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna RP (C-18) e dessalinizado para obter o produto (10 mg). Massa calculada:8579, Massa Desconvolucionada:8577.
Exemplo 17: Procedimento geral para a desproteção de amina
[001798] 15,2 g de NHBoc amina foram dissolvidos em DCM seco (100 ml) então TFA (50 ml) foi adicionado por gotejamento à RT A mistura de reação foi agitada à RT de um dia para o outro. Os solventes foram removidos sob pressão reduzida então coevaporados com tolueno (2 x 50 ml) então usados na etapa seguinte sem qualquer purificação adicional. NMR em CD3OD confirmou a desproteção NHBoc. Exemplo 18: Procedimento geral para a formação de anisamida
[001799] Procedimento-A: A amina bruta da etapa anterior foi dissolvida em uma mistura de DCM (100 ml) e Et3N (10 equ.) à RT. Durante este processo, a mistura de reação foi resfriada com um banho de água. Então, cloreto de 4-metoxibenzoíla (4 equ) foi adicionado por gotejamento à mistura de reação sob atmosfera de argônio à RT, a agitação continuou por 3 h. A mistura de reação foi diluída com água e extraída com DCM. A camada orgânica foi extraída com NaHCO3 aq., 1N de HCl, salmoura então seca com sulfato de magnésio, evaporada até secar. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna de sílica usando DCM-MeOH como eluente.
[001800] Procedimento-B: A amina bruta (0,27 equ), ácido e HOBt (1 equ) foram dissolvidos em uma mistura de DCM e DMF (2:1) em um RBF de tamanho adequado sob argônio. EDAC.HCl (1,25 equ) foi adicionado em porções à mistura de reação sob agitação constante. Após 15 min, a mistura de reação foi resfriada a ~10 oC então DIEA (2,7 equ) foi adicionado durante um período de 5 min. A mistura de reação foi lentamente aquecida até a temperatura ambiente e agitada sob argônio de um dia para o outro. TLC indicou a conclusão da condição TLC de reação, DCM: MeOH (9,5:0,5). Os solventes foram removidos sob pressão reduzida, então água foi adicionada ao resíduo, e um sólido gomoso separado. A solução limpa foi decantada, e o resíduo sólido foi dissolvido em EtOAc e lavado sucessivamente com água, ácido cítrico aquoso a 10%, NaHCO3 aq., seguido de salmoura saturada. A camada orgânica foi separada e seca com sulfato de magnésio. O solvente foi removido sob pressão reduzida então o produto bruto foi purificado com coluna de sílica para obter o produto puro.
[001801] Anisamida foi obtida a partir da amina em 32% de rendimento em 2 etapas usando o procedimento- B acima: 1H RMN (CDCl3): δ = 7,74 (d, 6H), 7,44 (t, 2H), 7,34 (t, 1H), 7,26 (m, 5H), 7,05 (m, 3H), 6,83 (d, 6H), 6,46 (s, 1H), 5,01 (s, 2H), 3,75 (s, 9H), 3,57 (m, 12H), 3,37 (m, 6H), 3,25 (m, 6H), 2,31 (m, 8H), 2,11 (m, 2H), 1,84 (m, 2H), 1,62 (m, 6H) ppm.
[001802] Anisamida foi obtida a partir da amina em 57% de rendimento em 2 etapas usando o procedimento- A acima: 1H RMN (CDCl3): δ = 7,75 (m, 3H), 7,73 (d, 6H), 7,43 (t, 3H), 7,25 (m, 5H), 6,80 (d, 6H), 6,51 (s l, 1H), 5,01 (s, 2H), 3,72 (s, 9H), 3,58 (m, 6H), 3,21 (m, 12H), 2,33 (t, 3H),
2,25 (t, 2H), 2,02 (t, 2H), 1,64 (q, 6H), 1,52 (p, 2H), 1,41 (q, 2H), 1,12 (m, 12H) ppm.
[001803] Procedimento geral para desbenzilação.
[001804] O éster benzílico (10 g) foi dissolvido em uma mistura de acetato de etila (100 ml) e metanol (25 ml) então Pd/C, 1 g (teor de paládio a 10%) foi adicionado sob atmosfera de argônio então a mistura de reação foi aspirada e lavada com hidrogênio e agitada à RT sob atmosfera de H2 por 3 h. TLC indicou o término da reação, filtrada através de filtro de Celite e lavada com metanol, evaporada até secar para produzir um sólido branco espumoso.
[001805] Rendimento de 98%, 1H RMN (CD3OD): δ = 8,35 (t, 1H), 8,01 (t, 1H), 7,82 (d, 6H), 7,27 (d, 1H), 6,99 (d, 6H), 3,85 (s, 9H), 3,68 (m, 12H), 3,41 (m, 6H), 3,29 (m, 6H), 2,42 (m, 6H), 2,31 (q, 2H), 2,21 (td, 2H), 1,80 (m, 8H)
ppm.
[001806] Rendimento de 94%, 1H RMN (CD3OD): δ = 8,36 (t, 2H), 8,02 (t, 2H), 7,82 (d, 6H), 7,23 (d, 1H), 6,98 (d, 6H), 3,85 (s, 9H), 3,70 (s, 6H), 3,67 (t, 6H), 3,41 (q, 4H), 3,28 (m, 8H), 2,42 (t, 6H), 2,27 (t, 2H), 2,13 (t, 2H), 1,79 (p, 6H), 1,54 (dp, 4H), 1,25 (m, 12H) ppm. Exemplo 19: Cronogramas para ‘Pré-diferenciação' de mioblastos de paciente para dosagem gimnótica
[001807] Várias tecnologias, por exemplo, aquelas descritas nos documentos US 9394333, US 9744183, US 9605019, US 9598458, US 2015/0211006, US 2017/0037399, WO 2017/015555, WO 2017/192664, WO 2017/015575, WO 2017/062862, WO 2017/160741, WO 2017/192679 e WO 2017/210647, etc., podem ser utilizadas de acordo com a presente revelação para avaliar as propriedades e/ou atividades de tecnologias da presente revelação. Em algumas modalidades, as tecnologias da presente revelação, por exemplo, oligonucleotídeos e composições e métodos de uso dos mesmos, demonstram inesperadamente resultados superiores em comparação com uma tecnologia de referência adequada (por exemplo, uma tecnologia baseada em uma composição de oligonucleotídeos estereoaleatória que tem a mesma sequência de base, porém sem ligações internucleotídicas neutras e/ou catiônicas a pH fisiológico).
São descritos abaixo exemplos de tecnologias que podem ser úteis para avaliar propriedades e/ou atividades de oligonucleotídeos descritos na presente revelação. Aqueles versados na técnica entendem que as condições ilustradas abaixo podem ser variadas/modificadas, e adicionalmente e/ou alternativamente, outros reagentes, temperaturas, condições, períodos de tempo, quantidades adequados, etc., podem ser utilizados de acordo com a presente revelação.
[001808] Manutenção de Linhagens Celulares de Mioblasto Derivadas do Paciente:
[001809] As células de mioblasto DMD ∆52 e DMD ∆45 a 52 foram mantidas em Meio de Crescimento do Músculo Esquelético completo (Promocell, Heidelberg, Alemanha) suplementado com FBS a 5%, 1X Penicilina-Estreptomicina e 1X L-Glutamina. Os frascos ou placas foram revestidos com solução de Matrigel:DMEM (1:100) por um período de tempo adequado, por exemplo, 30 min, após o qual a solução de Matrigel:DMEM foi removida por aspiração antes da inoculação de células em Meio de Crescimento de Músculo Esquelético completo.
[001810] Procedimento de Dosagem Padrão (0 dia de pré-diferenciação)
[001811] No Dia 1: Revestir recipientes de crescimento celular adequados, por exemplo, placas de 6 poços ou placas de 24 poços, com Solução de Matrigel: Solução DMEM. Incubar em uma condição, por exemplo, 37 °C, CO2 a 5% por um período de tempo adequado, por exemplo, 30 min. Aspirar e inocular um número adequado de células para recipientes de crescimento celular, por exemplo, 150K células/poço em um total de 1500 µl de meio de crescimento completo em uma placa de 6 poços e 30K células/poço em 500 ul de meio de crescimento em uma placa de 24 poços. Incubar em uma condição adequada por um período de tempo adequado, por exemplo, 37 °C, CO2 a 5% de um dia para o outro.
[001812] No Dia 2: Preparar um Meio de diferenciação, por exemplo, DMEM + Soro de Cavalo a 5% + 10µg/ml de Insulina. Preparar diluições de oligonucleotídeo adequadas em Meio de Diferenciação, por exemplo, diluições em série de 30 uM, 10 uM, 3,33 uM, 1,11 uM, 0,37 uM. Aspirar meio de crescimento de células aderentes, e adicionar solução de oligonucleotídeo:Meio de Diferenciação a células. Os oligonucleotídeos permanecem nas células (sem alteração de meio) até a coleta de células.
[001813] No Dia 6: Obter RNA. Em um procedimento típico, um número adequado de células, por exemplo, células de poços de uma placa de 24 poços, foram lavadas, por exemplo, com PBS frio, seguido de adição de uma quantidade adequada de um reagente para extração de RNA e armazenamento de amostra/extração de RNA, por exemplo, 500 ul/poço de TRIZOL em uma placa de 24 poços e placa de congelamento a -80°C ou continuando com a extração de RNA para obter RNA.
[001814] No Dia 8: Obter proteína. Em um procedimento típico, um número adequado de células, por exemplo, células em poços de placa de 6 poços, foi lavado, por exemplo, com PBS frio. Uma quantidade adequada de um tampão de lise adequado foi então adicionada - por exemplo, em um procedimento típico, 200 ul/poço de RIPA suplementado com inibidores de protease para uma placa de 6 poços. Após a lise a amostra pode ser armazenada, por exemplo, congelamento a - 80 ° C, ou continuar com a extração da proteína.
[001815] Outros procedimentos adequados podem ser empregados, por exemplo, aqueles descritos abaixo. Conforme observado por aqueles versados na técnica, muitos parâmetros, como reagentes, temperaturas, condições, períodos de tempo, quantidades, etc., podem ser modificados.
[001816] Procedimento de Dosagem Pré- Diferenciação de 4 dias
[001817] No Dia 1: Revestir placas de 6 poços ou placas de 24 poços com Solução de Matrigel: Solução DMEM. Incubar a 37 °C, CO2 a 5% por 30 min. Aspirar, inocular 150K células/poço em um total de 1500 µl de meio de crescimento completo em uma placa de 6 poços e 30K células/poço em 500 ul de meio de crescimento em uma placa de 24 poços. Incubar a 37 °C e CO2 a 5% de um dia para o outro.
[001818] No Dia 2: Preparar meio de diferenciação da seguinte forma: DMEM + 5% Soro de Cavalo + 10µg/ml Insulina. Aspirar Meio de Crescimento e substituir por Meio de Diferenciação.
[001819] No Dia 6: As células foram diferenciadas por 4 dias. Preparar diluições de oligonucleotídeo em Meio de Diferenciação, por exemplo, diluições em série de 30 uM, 10 uM, 3,33 uM, 1,11 uM, 0,37 uM. Aspirar Meio de diferenciação de células aderentes, e adicionar solução de oligonucleotídeo:Meio de Diferenciação a células. Os oligonucleotídeos permanecem nas células (sem alteração de meio) até a coleta de células.
[001820] No Dia 10: Lavar as células em uma placa de 24 poços com PBS frio, adicionar 500 ul/poço de TRIZOL na placa de 24 poços e congelar a placa a -80 °C ou continuar com a extração de RNA.
[001821] No Dia 12: Lavar as células em placa de 6 poços com PBS fria. Adicionar 200 ul/poço de RIPA suplementado com inibidores de protease. Congelar a placa a - 80 °C ou continuar com a extração de proteína.
[001822] Procedimento de Dosagem Pré- Diferenciação de 7 dias
[001823] No Dia 1: Revestir placas de 6 poços ou placas de 24 poços com Solução de Matrigel: Solução DMEM. Incubar a 37 °C, CO2 a 5% por 30 min. Aspirar, inocular 150K células/poço em um total de 1500 µl de meio de crescimento completo em uma placa de 6 poços e 30K células/poço em 500 ul de meio de crescimento em uma placa de 24 poços. Incubar a 37 °C e CO2 a 5% de um dia para o outro.
[001824] No Dia 2: Preparar meio de diferenciação da seguinte forma: DMEM + 5% Soro de Cavalo + 10µg/ml Insulina. Aspirar Meio de Crescimento e substituir por Meio de Diferenciação.
[001825] No Dia 9: As células foram diferenciadas por 7 dias. Preparar diluições de oligonucleotídeo em Meio de Diferenciação, por exemplo, diluições em série de 30 uM, 10 uM, 3,33 uM, 1,11 uM, 0,37 uM. Aspirar Meio de diferenciação de células aderentes, e adicionar solução de oligonucleotídeo:Meio de Diferenciação a células. Os oligonucleotídeos permanecem nas células (sem alteração de meio) até a coleta de células.
[001826] No Dia 13: Lavar as células em uma placa de 24 poços com PBS frio, adicionar 500 ul/poço de TRIZOL na placa de 24 poços e congelar a placa a -80 °C ou continuar com a extração de RNA.
[001827] No Dia 15: Lavar as células em placa de 6 poços com PBS fria. Adicionar 200 ul/poço de RIPA suplementado com inibidores de protease. Congelar a placa a - 80 °C ou continuar com a extração de proteína.
[001828] Procedimento de Dosagem Pré- Diferenciação de 10 dias
[001829] No Dia 1: Revestir placas de 6 poços ou placas de 24 poços com Solução de Matrigel: Solução DMEM. Incubar a 37 °C, CO2 a 5% por 30 min. Aspirar, inocular 150K células/poço em um total de 1500 µl de meio de crescimento completo em uma placa de 6 poços e 30K células/poço em 500 ul de meio de crescimento em uma placa de 24 poços. Incubar a 37 °C e CO2 a 5% de um dia para o outro.
[001830] No Dia 2: Preparar meio de diferenciação da seguinte forma: DMEM + 5% Soro de Cavalo + 10µg/ml Insulina. Aspirar Meio de Crescimento e substituir por Meio de Diferenciação.
[001831] No Dia 12: As células foram diferenciadas por 10 dias. Preparar diluições de oligonucleotídeo em Meio de Diferenciação, por exemplo, diluições em série de 30 uM, 10 uM, 3,33 uM, 1,11 uM, 0,37 uM. Aspirar Meio de diferenciação de células aderentes, e adicionar solução de oligonucleotídeo:Meio de Diferenciação a células. Os oligonucleotídeos permanecem nas células (sem alteração de meio) até a coleta de células.
[001832] No Dia 16: Lavar as células em uma placa de 24 poços com PBS frio, adicionar 500 ul/poço de TRIZOL na placa de 24 poços e congelar a placa a -80 °C ou continuar com a extração de RNA.
[001833] No Dia 18: Lavar as células em placa de 6 poços com PBS fria. Adicionar 200 ul/poço de RIPA suplementado com inibidores de protease. Congelar a placa a - 80 °C ou continuar com a extração de proteína. Exemplo 20: Ensaio de multi-salto de éxon
[001834] O ensaio descrito no presente documento pode ser adaptado para detectar quaisquer variantes de splicing do gene com frequência de cada variante (quantificação). DMD Éxon43-Éxon64 é usado como um exemplo.
[001835] Entre outros fatores, uma característica exclusiva deste ensaio é que um identificador molecular exclusivo (UMI) é introduzido nos iniciadores de transcrição reversa com uma sequência de manipuladores de PCR exclusiva (esta pode ser qualquer sequência sem homologia a sequências genômicas ou transcriptoma). Portanto, cada cDNA tem seu UMI exclusivo (código de barras) que pode ser usado em análises de sequenciamento posteriores para eliminar o erro sistemático de PCR e sequenciamento em direção a amplicons menores.
[001836] Em um procedimento típico, as etapas incluem: O iniciador de RT reversa contendo um manipulador de PCR na extremidade 5', então 8 a 16 sequências de nucleotídeos aleatoriamente incorporadas que criam UMI/código de barras e sequência de complemento reversa em éxon 64 (iniciador de RT reversa na tabela), foi usado para iniciar a transcrição reversa por um kit de RT (por exemplo, SuperScript IV, ThermoFisher, Cambridge, MA). Então, a PCR primária e aninhada foi executada para amplificar fragmentos específicos do gene usados para o sequenciamento de longo alcance de PacBio ou a plataforma Oxford Nanopore MinION.
[001837] As sequências de NGS (arquivos BAM) foram mapeadas para sequência de referência (DMD por exemplo)
para identificar as variante de splicing (junções de éxon). O UMI foi contado em cada variante de splicing, e a frequência da variante foi calculada pelas contagens de UMI em cada variante dividida pelas contagens totais de UMI em todas as variantes.
[001838] Uma ilustração deste processo é mostrada na Figura 2. Exemplo de iniciador de RT Reversa: 5'-CAGTGGTATCAACGCAGAGTACG-NNNNNNNN- ctgagaatctgacattattcagg-3' 5'-letra maiúscula = sequência de ligação N1 (secundária aninhada) N…..N = UMI sublinhado = sequência específica de gene no éxon64 Iniciador direto (éxon 43): Fnest = 5'-gaagctctctcccagcttgat-3' Entre outros fatores, a presente revelação fornece as seguintes modalidades exemplificativas:
1. Uma composição de oligonucleotídeo, que compreende uma pluralidade de oligonucleotídeos de um tipo de oligonucleotídeo particular definido por: 1) sequência de base; 2) padrão de ligações de cadeia principal; 3) padrão de centros quirais de cadeia principal; e 4) padrão de modificações de fósforo de cadeia principal, em que: os oligonucleotídeos da pluralidade compreendem pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 ligações internucleotídicas quiralmente controladas; e sendo que a composição de oligonucleotídeo é caracterizada pelo fato de que, quando entra em contato com uma transcrição em um sistema de splicing de transcrição, o splicing da transcrição é alterado em relação àquele observado sob a condição de referência selecionada dentre o grupo que consiste na ausência da composição, presença de uma composição de referência, e combinações dos mesmos.
2. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a transcrição é uma transcrição de Distrofina.
3. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o splicing da transcrição é alterado de modo que o nível de salto do éxon 45, 51, ou 53, ou múltiplos éxons seja aumentado.
4. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada ligação internucleotídica quiral dos oligonucleotídeos da pluralidade é independentemente uma ligação internucleotídica quiralmente controlada.
5. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada ligação internucleotídica quiral modificada tem independentemente uma estereopureza de pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% em seu fósforo de ligação quiral.
6. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a sequência de base é ou compreende ou compreende 15 bases contíguas da sequência de base de qualquer oligonucleotídeo na Tabela A1.
7. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o padrão de ligações de cadeia principal compreende pelo menos uma ligação internucleotídica não negativamente carregada.
8. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o padrão de ligações de cadeia principal compreende pelo menos uma ligação internucleotídica não negativamente carregada que é uma ligação internucleotídica neutra.
9. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o padrão de ligações de cadeia principal compreende pelo menos uma ligação internucleotídica neutra que é ou compreende um triazol, triazol neutro, alcino ou uma guanidina cíclica.
10. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o tipo de oligonucleotídeo compreende qualquer um dentre: colesterol; L-carnitina (ligação amida e carbamato); ácido fólico; ácido gambógico; lipídio clivável (ligação 1,2-dilaurina e éster); aglutinante receptor de insulina; CPP; glicose (tri e hexantenária); ou manose (tri e hexantenária, alfa e beta).
11. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o tipo de oligonucleotídeo é qualquer oligonucleotídeo listado na Tabela A1.
12. Uma composição que compreende uma pluralidade de oligonucleotídeos de um tipo de oligonucleotídeo particular definido por: 1) sequência de base; 2) padrão de ligações de cadeia principal; 3) padrão de centros quirais de cadeia principal; e 4) padrão de modificações de fósforo de cadeia principal, cuja composição é quiralmente controlada e é enriquecida, em relação a uma preparação substancialmente racêmica de oligonucleotídeos tendo a mesma sequência de base, padrão de ligações de cadeia principal e padrão de modificações de fósforo de cadeia principal, para oligonucleotídeos do tipo de oligonucleotídeo particular, em que: a composição de oligonucleotídeo é caracterizada pelo fato de que, quando entra em contato com uma transcrição in a sistema de splicing de transcrição, o splicing da transcrição é alterado pelo fato de que o nível de salto de um éxon é aumentado em relação àquele observado sob uma condição de referência selecionada dentre o grupo que consiste na ausência da composição, presença de uma composição de referência, e combinações dos mesmos.
13. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a transcrição é uma transcrição de Distrofina.
14. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o éxon é éxon DMD 45, 51 ou 53 ou múltiplos éxons DMD, e em que o splicing da transcrição é alterado de modo que o nível de salto do éxon 45, 51, ou 53, ou múltiplos éxons seja aumentado.
15. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o padrão de centros quirais de cadeia principal compreende pelo menos um Sp.
16. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o padrão de centros quirais de cadeia principal compreende pelo menos um Rp.
17. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a composição é uma composição quiralmente pura.
18. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada ligação internucleotídica quiral modificada tem independentemente uma estereopureza de pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% em seu fósforo de ligação quiral.
19. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a sequência de base é ou compreende ou compreende 15 bases contíguas da sequência de base de qualquer oligonucleotídeo na Tabela A1.
20. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o padrão de ligações de cadeia principal compreende pelo menos uma ligação internucleotídica não negativamente carregada.
21. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o padrão de ligações de cadeia principal compreende pelo menos uma ligação internucleotídica não negativamente carregada que é uma ligação internucleotídica neutra.
22. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o padrão de ligações de cadeia principal compreende pelo menos uma ligação internucleotídica neutra que é ou compreende um triazol, triazol neutro, alcino ou uma guanidina cíclica.
23. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o tipo de oligonucleotídeo compreende qualquer um dentre: colesterol; L-carnitina (ligação amida e carbamato); ácido fólico; ácido gambógico; lipídio clivável (ligação 1,2-dilaurina e éster); aglutinante receptor de insulina; CPP; glicose (tri e hexantenária); ou manose (tri e hexantenária, alfa e beta).
24. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o tipo de oligonucleotídeo é qualquer oligonucleotídeo listado na Tabela A1.
25. Uma composição que compreende uma pluralidade de oligonucleotídeos de um tipo de oligonucleotídeo particular definido por: 1) sequência de base; 2) padrão de ligações de cadeia principal; e 3) padrão de modificações de fósforo de cadeia principal, em que: os oligonucleotídeos da pluralidade compreendem pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 ligações internucleotídicas não negativamente carregadas; a composição de oligonucleotídeo é caracterizada pelo fato de que, quando entra em contato com uma transcrição in a sistema de splicing de transcrição, o splicing da transcrição é alterado pelo fato de que o nível de salto de um éxon é aumentado em relação àquele observado sob uma condição de referência selecionada dentre o grupo que consiste na ausência da composição, presença de uma composição de referência, e combinações dos mesmos.
26. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a transcrição é uma transcrição de Distrofina.
27. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o éxon é éxon DMD 45, 51, ou 53 ou múltiplos éxons DMD, e o splicing da transcrição é alterado de modo que o nível de salto do éxon 45, 51, ou 53, ou múltiplos éxons seja aumentado.
28. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada ligação internucleotídica não negativamente carregada é independentemente uma ligação internucleotídica, pelo menos 50% da qual existe em sua forma não negativamente carregada a pH 7,4.
29. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada ligação internucleotídica não negativamente carregada é independentemente uma ligação internucleotídica neutra, em que pelo menos 50% da ligação internucleotídica existe em sua forma neutra a pH 7,4.
30. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a forma neutra de cada ligação internucleotídica não negativamente carregada tem independentemente uma pKa não inferior a 8, 9, 10, 11, 12, 13, ou 14.
31. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a forma neutra de cada ligação internucleotídica não negativamente carregada, quando as unidades às quais a mesma se conecta são substituídas por −CH3, tem independentemente uma pKa não inferior a 8, 9, 10, 11, 12, 13, ou 14.
32. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a condição de referência é a ausência da composição.
33. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a condição de referência é a presença de uma composição de referência.
34. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a composição de referência é uma composição de outro modo idêntica, em que os oligonucleotídeos da pluralidade não compreendem ligações internucleotídicas quiralmente controladas.
35. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a composição de referência é uma composição de outro modo idêntica, em que os oligonucleotídeos da pluralidade não compreendem ligações internucleotídicas não negativamente carregadas.
36. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o padrão de ligações de cadeia principal compreende uma ou mais ligações de cadeia principal selecionadas dentre ligações fosfodiéster, fosforotioato e fosfoditioato.
37. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos da pluralidade, cada um, compreendem uma ou mais modificações de açúcar.
38. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que as modificações de açúcar compreendem uma ou mais modificações selecionadas dentre: porções químicas de 2'-O-metila, 2'-MOE, 2'-F, morfolino e açúcar bicíclico.
39. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma ou mais modificações de açúcar são modificações 2'-F.
40. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos da pluralidade, cada um, compreendem uma região de extremidade 5'
que compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais unidades de nucleosídeo que compreendem uma porção química de açúcar modificada 2'-F.
41. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos da pluralidade, cada um, compreendem uma região de extremidade 3' que compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais unidades de nucleosídeo que compreendem uma porção química de açúcar modificada 2'-F.
42. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos da pluralidade, cada um, compreendem uma região intermediária entre a região de extremidade 5' e a região 3’ que compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais unidades nucleotídicas que compreendem uma ligação fosfodiéster.
43. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a sequência de base é ou compreende ou compreende 15 bases contíguas da sequência de base de qualquer oligonucleotídeo na Tabela A1.
44. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o padrão de ligações de cadeia principal compreende pelo menos uma ligação internucleotídica não negativamente carregada.
45. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o padrão de ligações de cadeia principal compreende pelo menos uma ligação internucleotídica não negativamente carregada que é uma ligação internucleotídica neutra.
46. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o padrão de ligações de cadeia principal compreende pelo menos uma ligação internucleotídica neutra que é ou compreende um triazol, triazol neutro, alcino ou uma guanidina cíclica.
47. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o tipo de oligonucleotídeo compreende qualquer um dentre: colesterol; L-carnitina (ligação amida e carbamato); ácido fólico; ácido gambógico; lipídio clivável (ligação 1,2-dilaurina e éster); aglutinante receptor de insulina; CPP; glicose (tri e hexantenária); ou manose (tri e hexantenária, alfa e beta).
48. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o tipo de oligonucleotídeo é qualquer oligonucleotídeo listado na Tabela A1.
49. Uma composição que compreende uma pluralidade de oligonucleotídeos de um tipo de oligonucleotídeo particular definido por: 1) sequência de base; 2) padrão de ligações de cadeia principal; e 3) padrão de modificações de fósforo de cadeia principal, em que: os oligonucleotídeos da pluralidade compreendem: 1) uma região de extremidade 5' que compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais unidades de nucleosídeo que compreendem uma porção química de açúcar modificada 2'-F; 2) uma região de extremidade 3' que compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais unidades de nucleosídeo que compreendem uma porção química de açúcar modificada 2'-F; e 3) uma região intermediária entre a região de extremidade 5' e a região 3' que compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6,
7, 8, 9, 10 ou mais unidades nucleotídicas que compreendem uma ligação fosfodiéster.
50. A composição, de acordo com a modalidade 43 ou 49, em que a composição de oligonucleotídeo é caracterizada pelo fato de que, quando entra em contato com uma transcrição em um sistema de splicing de transcrição, o splicing da transcrição é alterado pelo fato de que o nível de salto de um éxon é aumentado em relação àquele observado sob uma condição de referência selecionada dentre o grupo que consiste na ausência da composição, presença de uma composição de referência, e combinações dos mesmos.
51. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a transcrição é uma transcrição de Distrofina.
52. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o éxon é éxon DMD 45, 51, ou 53 ou múltiplos éxons DMD, e o splicing da transcrição é alterado de modo que o nível de salto do éxon 45, 51, ou 53, ou múltiplos éxons seja aumentado.
53. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a região de extremidade 5' compreende 1 ou mais unidades de nucleosídeo que não compreendem u8ma porção química de açúcar modificada 2'-F.
54. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a região de extremidade 3' compreende 1 ou mais unidades de nucleosídeo que não compreendem u8ma porção química de açúcar modificada 2'-F.
55. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a região intermediária compreende 1 ou mais unidades nucleotídicas que não compreendem ligação fosfodiéster.
56. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a primeira dentre a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais unidades de nucleosídeo que compreendem uma porção química de açúcar modificada 2'-F e uma ligação internucleotídica modificada da extremidade 5' é a primeira, segunda, terceira, quarta ou quinta unidade de nucleosídeo do oligonucleotídeo a partir da extremidade 5', e a última dentre a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais unidades de nucleosídeo que compreendem uma porção química de açúcar modificada 2'-F e uma ligação internucleotídica modificada da extremidade 3' é a última, segunda, terceira, quarta ou quinta unidade de nucleosídeo do oligonucleotídeo.
57. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a região de extremidade 5' compreende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais unidades de nucleosídeo consecutivas que compreendem uma porção química de açúcar modificada 2'-F.
58. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a região de extremidade 5' compreende 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais unidades de nucleosídeo consecutivas que compreendem a porção química de açúcar modificada 2'-F.
59. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a região de extremidade 3' compreende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais unidades de nucleosídeo consecutivas que compreendem uma porção química de açúcar modificada 2'-F.
60. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a região de extremidade 3'
compreende 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais unidades de nucleosídeo consecutivas que compreendem a porção química de açúcar modificada 2'-F.
61. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada ligação internucleotídica entre duas unidades de nucleosídeo que compreendem uma porção química de açúcar modificada 2'-F na região de extremidade 5' é independentemente uma ligação internucleotídica modificada.
62. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada ligação internucleotídica entre duas unidades de nucleosídeo que compreendem uma porção química de açúcar modificada 2'-F na região de extremidade 3' é independentemente uma ligação internucleotídica modificada.
63. A composição, de acordo com a modalidade 61 ou 62, em que cada ligação internucleotídica modificada é independentemente uma ligação internucleotídica quiral.
64. A composição, de acordo com a modalidade 61 ou 62, em que cada ligação internucleotídica modificada é independentemente uma ligação internucleotídica quiralmente controlada.
65. A composição, de acordo com a modalidade 61 ou 62, em que cada ligação internucleotídica modificada é uma ligação internucleotídica fosforotioato.
66. A composição, de acordo com a modalidade 61 ou 62, em que cada ligação internucleotídica modificada é uma ligação internucleotídica fosforotioato quiralmente controlada.
67. A composição, de acordo com a modalidade 61 ou 62, em que cada ligação internucleotídica modificada é uma ligação internucleotídica fosforotioato quiralmente controlada
Sp.
68. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a região intermediária compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais ligações fosfato naturais.
69. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a região intermediária compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais ligações fosfato naturais cada independentemente entre uma unidade de nucleosídeo que compreende uma porção química de açúcar modificada 2'−OR1 e uma unidade de nucleosídeo que compreende uma porção química de açúcar modificada 2'−F, ou entre duas unidades de nucleosídeo, cada um, compreendendo independentemente uma porção química de açúcar de modificada 2'−OR1, em que R1 é C1-6 alquila opcionalmente substituída.
70. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a região intermediária compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais ligações internucleotídicas não negativamente carregadas.
71. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a região intermediária compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais ligações internucleotídicas não negativamente carregadas, cada uma, independentemente entre uma unidade de nucleosídeo que compreende uma porção química de açúcar modificada 2'−OR1e uma unidade de nucleosídeo que compreende uma porção química de açúcar modificada 2'−F, ou entre duas unidades de nucleosídeo, cada uma, compreendendo independentemente uma porção química de açúcar modificada 2'−OR1, em que R1 é C1-6 alquila opcionalmente substituída.
72. A composição, de acordo com a modalidade 69 ou 71, em que 2'−OR1 é 2'−OCH3.
73. A composição, de acordo com a modalidade 69 ou 71, em que 2'−OR1 é 2'−OCH2CH2OCH3.
74. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a região de extremidade 5' compreende pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 ligações internucleotídicas modificadas quirais.
75. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a região de extremidade 5' compreende pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 ligações internucleotídicas modificadas quirais consecutivas.
76. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada ligação internucleotídica na região de extremidade 5' é uma ligação internucleotídica quiral modificada.
77. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a região de extremidade 3' compreende pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 ligações internucleotídicas modificadas quirais.
78. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a região de extremidade 3' compreende pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 ligações internucleotídicas modificadas quirais consecutivas.
79. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada ligação internucleotídica na região de extremidade 3' é uma ligação internucleotídica quiral modificada.
80. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a região intermediária compreende pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 ligações internucleotídicas modificadas quirais.
81. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a região intermediária compreende pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 ligações internucleotídicas modificadas quirais consecutivas.
82. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades 74 a 81, em que cada ligação internucleotídica quiral modificada é independentemente uma ligação internucleotídica quiralmente controlada.
83. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades 74 a 81, em que cada ligação internucleotídica quiral modificada é independentemente uma ligação internucleotídica quiralmente controlada em que seu fósforo de ligação quiralmente controlado tem uma configuração Sp.
84. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades 74 a 83, em que cada ligação internucleotídica quiral modificada é independentemente uma ligação internucleotídica fosforotioato quiralmente controlada.
85. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a região intermediária compreende pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 ligações internucleotídicas não negativamente carregadas.
86. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a região intermediária compreende pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 ligações internucleotídicas neutras.
87. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma ligação internucleotídica neutra é uma ligação internucleotídica quiral.
88. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma ligação internucleotídica neutra é uma ligação internucleotídica quiralmente controlada independentemente de Rp ou Sp em seu fósforo de ligação.
89. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a sequência de base compreende uma sequência que não tem mais de 5 disparidades a partir de uma porção com 20 bases de comprimento do gene da distrofina ou seu complemento.
90. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o comprimento da sequência de base dos oligonucleotídeos da pluralidade não é superior a 50 bases.
91. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o padrão de centros quirais de cadeia principal compreende pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 centros quiralmente controlados independentemente de Rp ou Sp.
92. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o padrão de centros quirais de cadeia principal compreende pelo menos 5 centros quiralmente controlados independentemente de Rp ou Sp.
93. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o padrão de centros quirais de cadeia principal compreende pelo menos 6 centros quiralmente controlados independentemente de Rp ou Sp.
94. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o padrão de centros quirais de cadeia principal compreende pelo menos 10 centros quiralmente controlados independentemente de Rp ou Sp.
95. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos do tipo de oligonucleotídeo particular têm capacidade para mediar o salto de um ou mais éxons do gene da distrofina.
96. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos do tipo de oligonucleotídeo particular têm capacidade para mediar o salto do éxon 45, 51 ou 53 do gene da distrofina.
97. A composição, de acordo com a modalidade 96, em que os oligonucleotídeos do tipo de oligonucleotídeo particular têm capacidade para mediar o salto do éxon 45 do gene da distrofina.
98. A composição, de acordo com a modalidade 96, em que os oligonucleotídeos do tipo de oligonucleotídeo particular têm capacidade para mediar o salto do éxon 51 do gene da distrofina.
99. A composição, de acordo com a modalidade 96, em que os oligonucleotídeos do tipo de oligonucleotídeo particular têm capacidade para mediar o salto do éxon 53 do gene da distrofina.
100. A composição, de acordo com a modalidade 97, em que a sequência de base compreende uma sequência que não tem mais de 5 disparidades a partir da sequência de qualquer oligonucleotídeo revelado no presente documento.
101. A composição, de acordo com a modalidade 97, em que a sequência de base compreende ou é a sequência de qualquer oligonucleotídeo revelado no presente documento..
102. A composição, de acordo com a modalidade 97, em que a sequência de base é aquela de qualquer oligonucleotídeo revelado no presente documento.
103. A composição, de acordo com a modalidade 97, em que a sequência de base compreende uma sequência que não tem mais de 5 disparidades a partir da sequência de qualquer oligonucleotídeo revelado no presente documento.
104. A composição, de acordo com a modalidade 97, em que a sequência de base compreende ou é qualquer oligonucleotídeo revelado no presente documento.
105. A composição, de acordo com a modalidade 97, em que a sequência de base é qualquer oligonucleotídeo revelado no presente documento.
106. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos da pluralidade são qualquer oligonucleotídeo revelado no presente documento.
107. A composição, de acordo com a modalidade 18, em que os oligonucleotídeos do tipo de oligonucleotídeo particular são qualquer oligonucleotídeo revelado no presente documento.
108. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a sequência de base é ou compreende ou compreende 15 bases contíguas da sequência de base de qualquer oligonucleotídeo na Tabela A1.
109. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o padrão de ligações de cadeia principal compreende pelo menos uma ligação internucleotídica não negativamente carregada.
110. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos compreendem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais ligações internucleotídicas não negativamente carregadas.
111. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos compreendem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais ligações internucleotídicas não negativamente carregadas quiralmente controladas.
112. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos compreendem 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais ligações internucleotídicas não negativamente carregadas consecutivas.
113. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos compreendem 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais ligações internucleotídicas não negativamente carregadas quiralmente controladas consecutivas.
114. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos compreendem uma estrutura de flanco-núcleo-flanco, núcleo- flanco ou flanco-núcleo.
115. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que um flanco compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais ligações internucleotídicas não negativamente carregadas.
116. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos compreendem uma estrutura de flanco-núcleo-flanco, núcleo- flanco ou flanco-núcleo, e em que um flanco compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais ligações internucleotídicas não negativamente carregadas quiralmente controladas.
117. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos compreendem uma estrutura de flanco-núcleo-flanco, núcleo- flanco ou flanco-núcleo, e em que um flanco compreende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais ligações internucleotídicas não negativamente carregadas consecutivas.
118. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos compreendem uma estrutura de flanco-núcleo-flanco, núcleo- flanco ou flanco-núcleo, e em que um flanco compreende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais ligações internucleotídicas não negativamente carregadas quiralmente controladas consecutivas.
119. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos compreendem ou consistem em uma estrutura de flanco-núcleo- flanco, e em que apenas um flanco compreende uma ou mais ligações internucleotídicas não negativamente carregadas.
120. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos compreendem uma estrutura de flanco-núcleo-flanco, núcleo- flanco ou flanco-núcleo, e em que um núcleo compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais ligações internucleotídicas não negativamente carregadas.
121. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos compreendem uma estrutura de flanco-núcleo-flanco, núcleo- flanco ou flanco-núcleo, e em que um núcleo compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais ligações internucleotídicas não negativamente carregadas quiralmente controladas.
122. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos compreendem uma estrutura de flanco-núcleo-flanco, núcleo- flanco ou flanco-núcleo, e em que um núcleo compreende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais ligações internucleotídicas não negativamente carregadas consecutivas.
123. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos compreendem uma estrutura de flanco-núcleo-flanco, núcleo- flanco ou flanco-núcleo, e em que um flanco compreende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais ligações internucleotídicas não negativamente carregadas quiralmente controladas consecutivas.
124. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 100% das ligações internucleotídicas de um flanco é independentemente uma ligação internucleotídica não negativamente carregada, uma ligação internucleotídica fosfato natural ou uma ligação internucleotídica quiral Rp.
125. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 100% das ligações internucleotídicas de um flanco é independentemente uma ligação internucleotídica não negativamente carregada ou uma ligação internucleotídica fosfato natural.
126. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 100% das ligações internucleotídicas de um flanco é independentemente uma ligação internucleotídica não negativamente carregada.
127. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades 124 a 126, em que a porcentagem é 50% ou mais.
128. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades 124 a 126, em que a porcentagem é 60% ou mais.
129. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades 124 a 126, em que a porcentagem é 75% ou mais.
130. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades 124 a 126, em que a porcentagem é 80% ou mais.
131. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades 124 a 126, em que a porcentagem é 90% ou mais.
132. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos compreendem, cada um, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada e uma ligação internucleotídica fosfato natural.
133. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos compreendem, cada um, uma ligação internucleotídica não negativamente carregada, uma ligação internucleotídica fosfato natural e uma ligação internucleotídica quiral Rp.
134. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que um flanco compreende uma ligação internucleotídica não negativamente carregada e uma ligação internucleotídica fosfato natural.
135. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que um flanco compreende uma ligação internucleotídica não negativamente carregada, uma ligação internucleotídica fosfato natural e uma ligação internucleotídica quiral Rp.
136. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que um flanco compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais ligações internucleotídicas não negativamente carregadas.
137. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que todas as ligações internucleotídicas não negativamente carregadas do mesmo oligonucleotídeo têm a mesma constituição.
138. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada uma das ligações internucleotídicas não negativamente carregadas tem independentemente a estrutura da fórmula I-n-1, I-n-2, I-n-3, I-n-4, II, II-a-1, II-a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II- d-1, II-d-2, ou uma forma de sal da mesma.
139. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada uma das ligações internucleotídicas não negativamente carregadas tem independentemente a estrutura da fórmula I-n-1, I-n-2, I-n-3, I-n-4, II, II-a-1, II-a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II- d-1, II-d-2, ou uma forma de sal da mesma.
140. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada uma das ligações internucleotídicas não negativamente carregadas tem independentemente a estrutura da fórmula II, II-a-1, II-a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, II-d-2, ou uma forma de sal da mesma.
141. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada uma das ligações internucleotídicas não negativamente carregadas tem independentemente a estrutura da fórmula II, II-a-1, II-a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, II-d-2, ou uma forma de sal da mesma.
142. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o padrão de ligações de cadeia principal compreende pelo menos uma ligação internucleotídica não negativamente carregada que é uma ligação internucleotídica neutra.
143. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o padrão de ligações de cadeia principal compreende pelo menos uma ligação internucleotídica neutra que é ou compreende um triazol, triazol neutro, alcino ou uma guanidina cíclica.
144. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o tipo de oligonucleotídeo compreende qualquer um dentre: colesterol; L-carnitina (ligação amida e carbamato); ácido fólico; ácido gambógico; lipídio clivável (ligação 1,2-dilaurina e éster); aglutinante receptor de insulina; CPP; glicose (tri e hexantenária); ou manose (tri e hexantenária, alfa e beta).
145. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o tipo de oligonucleotídeo é qualquer oligonucleotídeo listado na Tabela A1.
146. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada dos oligonucleotídeos compreende uma porção química conjugada à cadeia de oligonucleotídeo do oligonucleotídeo opcionalmente através de uma porção química de ligante, em que a porção química compreende uma porção química de carboidrato, uma porção química de peptídeo, uma porção química de aglutinante receptor, ou uma porção química que tem a estrutura de −N(R1)2, −N(R1)3, ou −N=C(N(R1)2)2.
147. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada dos oligonucleotídeos compreende uma porção química conjugada à cadeia de oligonucleotídeo do oligonucleotídeo opcionalmente através de uma porção química de ligante, em que a porção química compreende uma porção química de guanidina.
148. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada dos oligonucleotídeos compreende uma porção química conjugada à cadeia de oligonucleotídeo do oligonucleotídeo opcionalmente através de uma porção química de ligante, em que a porção química compreende −N=C(N(CH3)2)2.
149. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que pelo menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, ou 90% dos oligonucleotídeos na composição que têm a sequência de base do tipo de oligonucleotídeo particular são oligonucleotídeos do tipo de oligonucleotídeo particular.
150. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que pelo menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, ou 90% dos oligonucleotídeos na composição que têm a sequência de base, padrão de ligações de cadeia principal, e padrão de modificações de fósforo de cadeia principal do tipo de oligonucleotídeo particular são oligonucleotídeos do tipo de oligonucleotídeo particular.
151. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos do tipo particular são estruturalmente idênticos.
152. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma ligação internucleotídica não negativamente carregada é uma ligação fosforamidato.
153. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma ligação internucleotídica não negativamente carregada compreende uma porção química de guanidina.
154. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura da fórmula I: ,
I ou uma forma de sal da mesma, em que: PL é P(=W), P, ou P→B(R')3; W é O, N(–L–R5), S ou Se; cada um dentre R1 e R5 é independentemente −H, −L−R', halogênio, −CN, −NO2, −L−Si(R')3, −OR', −SR', ou −N(R')2; cada um dentre X, Y e Z é independentemente –O–, – S–, –N(–L–R5)–, ou L; cada L é independentemente um grupo de ligação covalente, ou bivalente, linear ou ramificado opcionalmente substituído selecionado dentre um grupo alifático C1-30 e um grupo heteroalifático C1-30 tendo 1 a 10 heteroátomos, em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por C1-6 alquileno, C1-6 alquenileno, , um grupo heteroalifático C1–C6 bivalente tendo 1 a 5 heteroátomos, −C(R')2−, −Cy−, −O−, −S−, −S−S−, −N(R')−, −C(O)−, −C(S)−, −C(NR')−, −C(O)N(R')−, −N(R')C(O)N(R')−, −N(R')C(O)O−, −S(O)−, −S(O)2−, −S(O)2N(R')−, −C(O)S−, −C(O)O−, −P(O)(OR')−, −P(O)(SR')−, −P(O)(R')−, −P(O)(NR')−, −P(S)(OR')−, −P(S)(SR')−, −P(S)(R')−, −P(S)(NR')−, −P(R')−, −P(OR')−, −P(SR')−, −P(NR')−, −P(OR')[B(R')3]−, −OP(O)(OR')O−, −OP(O)(SR')O−, −OP(O)(R')O−,
−OP(O)(NR')O−, −OP(OR')O−, −OP(SR')O−, −OP(NR')O−, −OP(R')O−, ou −OP(OR')[B(R')3]O−, e um ou mais CH ou átomos de carbono são opcional e independentemente substituídos por CyL; cada −Cy− é independentemente um grupo bivalente opcionalmente substituído selecionado dentre um anel cicloalifático C3-20, um anel C6-20 arila, um anel heteroarila com 5 a 20 membros tendo 1 a 10 heteroátomos, e um anel heterociclila com 3 a 20 membros tendo 1 a 10 heteroátomos; cada CyL é independentemente um grupo trivalente ou tetravalente opcionalmente substituído selecionado dentre um anel cicloalifático C3-20, um anel C6-20 arila, um anel heteroarila com 5 a 20 membros tendo 1 a 10 heteroátomos, e um anel heterociclila com 3 a 20 membros tendo 1 a 10 heteroátomos; cada R' é independentemente −R, −C(O)R, −C(O)OR, ou −S(O)2R; cada R é independentemente −H, ou um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre C1-30 alifático, C1-30 heteroalifático tendo 1 a 10 heteroátomos, C6-30 arila, C6- 30 arilalifático, C6-30 aril-heteroalifático tendo 1 a 10 heteroátomos, heteroarila com 5 a 30 membros tendo 1 a 10 heteroátomos, e heterociclila com 3 a 30 membros tendo 1 a 10 heteroátomos, ou dois grupos R são opcional e independentemente tomados em conjunto para formar uma ligação covalente, ou dois ou mais grupos R no mesmo átomo são opcional e independentemente tomados em conjunto para formar um anel monocíclico, bicíclico ou policíclico com 3 a 30 membros opcionalmente substituído tendo, além do átomo, 0 a 10 heteroátomos, ou dois ou mais grupos R em dois ou mais átomos são opcional e independentemente tomados em conjunto com seus átomos intervenientes para formar um anel monocíclico, bicíclico ou policíclico com 3 a 30 membros opcionalmente substituído tendo, além dos átomos intervenientes, 0 a 10 heteroátomos.
155. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada ligação internucleotídica não negativamente carregada tem independentemente a estrutura da fórmula I ou uma forma de sal da mesma.
156. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura da fórmula I-n-1 ou uma forma de sal da mesma: . I-n-1
157. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada ligação internucleotídica não negativamente carregada tem independentemente a estrutura da fórmula I-n-1 ou uma forma de sal da mesma.
158. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura da fórmula I-n-2 ou uma forma de sal da mesma: I-n-2
159. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura da fórmula I-n-3 ou uma forma de sal da mesma: . I-n-3
160. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada ligação internucleotídica não negativamente carregada tem independentemente a estrutura da fórmula I-n-3 ou uma forma de sal da mesma.
161. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura da fórmula I-n-3 ou uma forma de sal da mesma, em que um R' a partir de um −N(R')2 e um R' a partir do outro −N(R')2 são tomados em conjunto com seus átomos intervenientes para formar um anel monocíclico, bicíclico ou policíclico com 3 a 30 membros opcionalmente substituído tendo, além dos átomos intervenientes, 0 a 10 heteroátomos.
162. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada ligação internucleotídica não negativamente carregada tem independentemente a estrutura da fórmula I-n-3 ou uma forma de sal da mesma, em que um R' a partir de um −N(R')2 e um R' a partir do outro −N(R')2 são tomados em conjunto com seus átomos intervenientes para formar um anel monocíclico, bicíclico ou policíclico com 3 a 30 membros opcionalmente substituído tendo, além dos átomos intervenientes, 0 a 10 heteroátomos.
163. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura da fórmula I-n-3 ou uma forma de sal da mesma, em que um R' a partir de um −N(R')2 e um R' a partir do outro −N(R')2 são tomados em conjunto com seus átomos intervenientes para formar um anel monocíclico com 5 membros opcionalmente substituído tendo não mais que dois átomos de nitrogênio.
164. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada ligação internucleotídica não negativamente carregada tem independentemente a estrutura da fórmula I-n-3 ou uma forma de sal da mesma, em que um R' a partir de um −N(R')2 e um R' a partir do outro −N(R')2 são tomados em conjunto com seus átomos intervenientes para formar um anel monocíclico com 5 membros opcionalmente substituído tendo não mais que dois átomos de nitrogênio.
165. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades 159 a 162, em que o anel formado é um anel saturado.
166. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades 159 a 162, em que o anel formado é um anel parcialmente insaturado.
167. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura da fórmula I-n-4 ou uma forma de sal da mesma: . I-n-4
168. A composição, de acordo com a modalidade 167,
em que La é uma ligação covalente.
169. A composição, de acordo com a modalidade 167, em que La é −N(R1)−.
170. A composição, de acordo com a modalidade 167, em que La é −N(R')−.
171. A composição, de acordo com a modalidade 167, em que La é −N(R)−.
172. A composição, de acordo com a modalidade 167, em que La é −S(O)−.
173. A composição, de acordo com a modalidade 167, em que La é −S(O)2−.
174. A composição, de acordo com a modalidade 167, em que La é −S(O)2N(R')−.
175. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades 167 a 174, em que Lb é uma ligação covalente.
176. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades 167 a 174, em que Lb é −N(R1)−.
177. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades 167 a 174, em que Lb é −N(R')−.
178. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades 167 a 174, em que Lb é −N(R)−.
179. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades 167 a 174, em que Lb é −S(O)−.
180. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades 167 a 174, em que Lb é −S(O)2−.
181. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades 167 a 174, em que Lb é −S(O)2N(R')−.
182. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura da fórmula II:
,
II ou uma forma de sal da mesma, em que: PL é P(=W), P, ou P→B(R')3; W é O, N(–L–R5), S ou Se; cada um dentre X, Y e Z é independentemente –O–, –S– , –N(–L–R5)–, ou L; R5 é −H, −L−R', halogênio, −CN, −NO2, −L−Si(R')3, −OR', −SR', ou −N(R')2; O anel AL é um anel monocíclico, bicíclico ou policíclico com 3 a 20 membros opcionalmente substituído tendo 0 a 10 heteroátomos; cada Rs é independentemente −H, halogênio, −CN, −N3, −NO, −NO2, −L−R', −L−Si(R)3, −L−OR', −L−SR', −L−N(R')2, −O−L−R', −O−L−Si(R)3, −O−L−OR', −O−L−SR', ou −O−L−N(R')2; g é 0 a 20; cada L é independentemente um grupo de ligação covalente, ou bivalente, linear ou ramificado opcionalmente substituído selecionado dentre um grupo alifático C1-30 e um grupo heteroalifático C1-30 tendo 1 a 10 heteroátomos, em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por C1-6 alquileno, C1-6 alquenileno, , um grupo heteroalifático C1–C6 bivalente tendo 1 a 5 heteroátomos, −C(R')2−, −Cy−, −O−, −S−, −S−S−, −N(R')−, −C(O)−, −C(S)−, −C(NR')−, −C(O)N(R')−, −N(R')C(O)N(R')−, −N(R')C(O)O−, −S(O)−, −S(O)2−, −S(O)2N(R')−, −C(O)S−, −C(O)O−, −P(O)(OR')−, −P(O)(SR')−, −P(O)(R')−, −P(O)(NR')−, −P(S)(OR')−, −P(S)(SR')−, −P(S)(R')−,
−P(S)(NR')−, −P(R')−, −P(OR')−, −P(SR')−, −P(NR')−, −P(OR')[B(R')3]−, −OP(O)(OR')O−, −OP(O)(SR')O−, −OP(O)(R')O−, −OP(O)(NR')O−, −OP(OR')O−, −OP(SR')O−, −OP(NR')O−, −OP(R')O−, ou −OP(OR')[B(R')3]O−, e um ou mais CH ou átomos de carbono são opcional e independentemente substituídos por CyL; cada −Cy− é independentemente um grupo bivalente opcionalmente substituído selecionado dentre um anel cicloalifático C3-20, um anel C6-20 arila, um anel heteroarila com 5 a 20 membros tendo 1 a 10 heteroátomos, e um anel heterociclila com 3 a 20 membros tendo 1 a 10 heteroátomos; cada CyL é independentemente um grupo trivalente ou tetravalente opcionalmente substituído selecionado dentre um anel cicloalifático C3-20, um anel C6-20 arila, um anel heteroarila com 5 a 20 membros tendo 1 a 10 heteroátomos, e um anel heterociclila com 3 a 20 membros tendo 1 a 10 heteroátomos; cada R' é independentemente −R, −C(O)R, −C(O)OR, ou −S(O)2R; cada R é independentemente −H, ou um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre C1-30 alifático, C1-30 heteroalifático tendo 1 a 10 heteroátomos, C6-30 arila, C6- 30 arilalifático, C6-30 aril-heteroalifático tendo 1 a 10 heteroátomos, heteroarila com 5 a 30 membros tendo 1 a 10 heteroátomos, e heterociclila com 3 a 30 membros tendo 1 a 10 heteroátomos, ou dois grupos R são opcional e independentemente tomados em conjunto para formar uma ligação covalente, ou dois ou mais grupos R no mesmo átomo são opcional e independentemente tomados em conjunto para formar um anel monocíclico, bicíclico ou policíclico com 3 a 30 membros opcionalmente substituído tendo, além do átomo, 0 a 10 heteroátomos, ou dois ou mais grupos R em dois ou mais átomos são opcional e independentemente tomados em conjunto com seus átomos intervenientes para formar um anel monocíclico, bicíclico ou policíclico com 3 a 30 membros opcionalmente substituído tendo, além dos átomos intervenientes, 0 a 10 heteroátomos.
183. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada ligação internucleotídica não negativamente carregada tem independentemente a estrutura da fórmula II, ou uma forma de sal da mesma.
184. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura da fórmula II-a- 1: , II-a-1 ou uma forma de sal da mesma.
185. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura da fórmula II-a- 2: , II-a-2 ou uma forma de sal da mesma.
186. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada ligação internucleotídica não negativamente carregada tem independentemente a estrutura da fórmula II-a-1 ou II-a-2, ou uma forma de sal da mesma.
187. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades 182 a 186, em que uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura da fórmula II-b- 1: , II-b-1 ou uma forma de sal da mesma, em que g é 0 a 18.
188. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades 182 a 187, em que uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura da fórmula II-b- 2: , II-b-2 ou uma forma de sal da mesma, em que g é 0 a 18.
189. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada ligação internucleotídica não negativamente carregada tem independentemente a estrutura da fórmula II-b-1 ou II-b-2, ou uma forma de sal da mesma.
190. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades 182 a 188, em que o Anel AL é um anel monocíclico com 3 a 20 membros opcionalmente substituído tendo 0 a 10 heteroátomos (além dos dois átomos de nitrogênio para a fórmula II-b-1 ou II-b-2).
191. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades 182 a 188, em que o Anel AL é anel monocíclico saturado com 5 membros opcionalmente substituído.
192. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades 182 a 191, em que uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura da fórmula II-c- 1: , II-c-1 ou uma forma de sal da mesma, em que g é 0 a 4.
193. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades 182 a 193, em que uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura da fórmula II-c- 2: , II-c-2 ou uma forma de sal da mesma, em que g é 0 a 4.
194. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada ligação internucleotídica não negativamente carregada tem independentemente a estrutura da fórmula II-c-1 ou II-c-2, ou uma forma de sal da mesma.
195. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades 182 a 193, em que cada ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a mesma estrutura.
196. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que, se aplicável, cada ligação internucleotídica nos oligonucleotídeos da pluralidade que não é uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem independentemente a estrutura da fórmula I.
197. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada ligação internucleotídica nos oligonucleotídeos da pluralidade tem independentemente a estrutura da fórmula I.
198. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que um ou mais PL são P(=W).
199. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada PL é independentemente P(=W).
200. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que um ou mais W são O.
201. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada W é O.
202. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que um ou mais W são O.
203. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que um ou mais W são independentemente N(–L–R5).
204. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma ou mais ligações internucleotídicas têm independentemente a estrutura da fórmula III ou forma de sal da mesma: .
III
205. A composição, de acordo com a modalidade 204, em que PN é P(=N−L−R5).
206. A composição, de acordo com a modalidade 204, em que PN é Q-.
207. A composição, de acordo com a modalidade 204, em que PN é Q-.
208. A composição, de acordo com a modalidade 207, em que La é uma ligação covalente.
209. A composição, de acordo com a modalidade 207, em que La é −N(R1)−.
210. A composição, de acordo com a modalidade 207, em que La é −N(R')−.
211. A composição, de acordo com a modalidade 207, em que La é −N(R)−.
212. A composição, de acordo com a modalidade 207, em que La é −S(O)−.
213. A composição, de acordo com a modalidade 207,
em que La é −S(O)2−.
214. A composição, de acordo com a modalidade 207, em que La é −S(O)2N(R')−.
215. A composição, de acordo com a modalidade 204, em que PN é Q-.
216. A composição, de acordo com a modalidade 204, em que PN é Q-.
217. A composição, de acordo com a modalidade 204, em que PN é Q-.
218. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que um ou mais Y são O.
219. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada Y é O.
220. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que um ou mais Z são O.
221. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada Z é O.
222. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que um ou mais X são O.
223. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que um ou mais X são S.
224. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura de .
225. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura de .
226. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma ligação internucleotídica não negativamente carregada tem a estrutura de .
227. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que para cada ligação internucleotídica da fórmula I ou um sal da mesma que não é uma ligação internucleotídica não negativamente carregada, X é independentemente O ou S, e −L−R1 é −H (ligação fosfato natural ou ligação fosforotioato, respectivamente).
228. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada ligação fosforotioato, se houver, nos oligonucleotídeos da pluralidade é independentemente uma ligação internucleotídica quiralmente controlada.
229. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que pelo menos uma ligação internucleotídica não negativamente carregada é uma ligação internucleotídica quiralmente controlada.
230. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que pelo menos uma ligação internucleotídica não negativamente carregada é uma ligação internucleotídica quiralmente controlada.
231. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos da pluralidade compreendem uma porção química de alvejamento em que a porção química de alvejamento é independentemente conectada a uma cadeia principal de oligonucleotídeo através de um ligante.
232. A composição, de acordo com a modalidade 231, em que a porção química de alvejamento é uma porção química de carboidrato.
233. A composição, de acordo com a modalidade 231 ou 232, em que a porção química de alvejamento compreende ou é uma porção química de GalNac.
234. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos da pluralidade compreendem uma porção química de lipídio em que a porção química de lipídio é independentemente conectada a uma cadeia principal de oligonucleotídeo através de um ligante.
235. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos da pluralidade existem como sais, em que uma ou mais ligações internucleotídicas não neutras na condição da composição existem independentemente como uma forma de sal.
236. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos da pluralidade existem como sais, em que uma ou mais ligações internucleotídicas negativamente carregadas na condição da composição existem independentemente como uma forma de sal.
237. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos da pluralidade existem como sais, em que uma ou mais ligações internucleotídicas negativamente carregadas na condição da composição existem independentemente como um sal metálico.
238. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos da pluralidade existem como sais, em que cada ligação internucleotídica negativamente carregada na condição da composição existe independentemente como um sal metálico.
239. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos da pluralidade existem como sais, em que cada ligação internucleotídica negativamente carregada na condição da composição existe independentemente como sal de sódio.
240. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os oligonucleotídeos da pluralidade existem como sais, em que cada ligação internucleotídica negativamente carregada é independentemente uma ligação fosfato natural (cuja forma neutra é −O−P(O)(OH)−O) ou ligação internucleotídica fosforotioato (cuja forma neutra é −O−P(O)(SH)−O).
241. Uma composição de oligonucleotídeo, que compreende uma pluralidade de oligonucleotídeos de um tipo de oligonucleotídeo particular definido por: 1) sequência de base; 2) padrão de ligações de cadeia principal; 3) padrão de centros quirais de cadeia principal; e 4) padrão de modificações de fósforo de cadeia principal, em que: os oligonucleotídeos da pluralidade compreendem pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 ligações internucleotídicas quiralmente controladas; e os oligonucleotídeos da pluralidade compreendem pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 ligações internucleotídicas não negativamente carregadas.
242. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que pelo menos uma ligação internucleotídica não negativamente carregada é uma ligação internucleotídica neutra.
243. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma ligação internucleotídica neutra é ou compreende um triazol, triazol neutro, alcino ou uma guanidina cíclica.
244. A composição de oligonucleotídeo de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a composição de oligonucleotídeo é caracterizada pelo fato de que, quando entra em contato com uma transcrição em um sistema de splicing de transcrição, o splicing da transcrição é alterado em relação àquele observado sob uma condição de referência selecionada dentre o grupo que consiste na ausência da composição, presença de uma composição de referência, e combinações dos mesmos.
245. A composição de oligonucleotídeo de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a transcrição é uma transcrição de Distrofina.
246. A composição de oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o splicing da transcrição é alterado de modo que o nível de salto do éxon 45, 51, ou 53, ou múltiplos éxons seja aumentado.
247. A composição de oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a composição de oligonucleotídeo tem capacidade para mediar o knockdown de um gene alvo.
248. Uma composição de oligonucleotídeo, que compreende uma pluralidade de oligonucleotídeos de um tipo de oligonucleotídeo particular definido por: 1) sequência de base; 2) padrão de ligações de cadeia principal; 3) padrão de centros quirais de cadeia principal; e 4) padrão de modificações de fósforo de cadeia principal, em que: os oligonucleotídeos da pluralidade compreendem colesterol; L-carnitina (ligação amida e carbamato); ácido fólico; lipídio clivável (ligação 1,2-dilaurina e éster); aglutinante receptor de insulina; ácido gambógico; CPP; glicose (tri e hexantenária); ou manose (tri e hexantenária, alfa e beta).
249. A composição, de acordo com a modalidade 248, em que os oligonucleotídeos da pluralidade compreendem pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 ligações internucleotídicas quiralmente controladas.
250. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a composição de oligonucleotídeo é caracterizada pelo fato de que, quando entra em contato com uma transcrição em um sistema de splicing de transcrição, o splicing da transcrição é alterado em relação àquele observado sob uma condição de referência selecionada dentre o grupo que consiste na ausência da composição, presença de uma composição de referência, e combinações dos mesmos.
251. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a transcrição é uma transcrição de Distrofina.
252. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o splicing da transcrição é alterado de modo que o nível de salto do éxon 45, 51, ou 53, ou múltiplos éxons seja aumentado.
253. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a composição de oligonucleotídeo tem capacidade para mediar o knockdown de um gene alvo.
254. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada heteroátomo é independentemente boro, nitrogênio, oxigênio, silício, enxofre ou fósforo.
255. A composição farmacêutica que compreende uma composição de oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, e um carreador farmaceuticamente aceitável.
256. Um método para alterar o splicing de uma transcrição alvo, que compreende administrar uma composição de oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores.
257. O método, de acordo com a modalidade 256, em que o splicing da transcrição alvo é alterado em relação à ausência da composição.
258. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a alteração consistem no fato de que um ou mais éxons são ignorados em um nível aumentado em relação à ausência da composição.
259. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a transcrição alvo é o pré-mRNA da distrofina.
260. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o éxon 45 da distrofina é ignorado em um nível aumentado em relação à ausência da composição.
261. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o éxon 51 da distrofina é ignorado em um nível aumentado em relação à ausência da composição.
262. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 256 a 259, em que o éxon 53 da distrofina é ignorado em um nível aumentado em relação à ausência da composição.
263. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma proteína codificada pelo mRNA com o éxon ignorado fornece uma ou mais funções melhores que uma proteína codificada pelo mRNA correspondente sem o salto de éxon.
264. Um método para tratar distrofia muscular, distrofia muscular de Duchenne (Duchenne) (DMD), ou distrofia muscular de Becker (Becker) (BMD), que compreende administrar a um indivíduo suscetível à mesma ou que sofre da mesma, uma composição de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores.
265. Um método para tratar distrofia muscular, distrofia muscular de Duchenne (Duchenne) (DMD), ou distrofia muscular de Becker (Becker) (BMD), que compreende administrar a um indivíduo suscetível à mesma ou que sofre da mesma, uma composição que compreende qualquer oligonucleotídeo revelado no presente documento.
266. Um método para tratar distrofia muscular, distrofia muscular de Duchenne (Duchenne) (DMD), ou distrofia muscular de Becker (Becker) (BMD), que compreende (a) administrar a um indivíduo suscetível à mesma ou que sofre da mesma, uma composição que compreende qualquer oligonucleotídeo revelado no presente documento, e (b) administrar ao indivíduo tratamento adicional que tem capacidade para prevenir, tratar, melhorar ou retardar o progresso da distrofia muscular, distrofia muscular de Duchenne (Duchenne) (DMD), ou distrofia muscular de Becker (Becker) (BMD).
267. O método, de acordo com a modalidade 266, em que o tratamento adicional é um segundo oligonucleotídeo.
268. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o sistema de splicing de transcrição compreende um mioblasto ou miotúbulo.
269. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o sistema de splicing de transcrição compreende uma célula de mioblasto.
270. A composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o sistema de splicing de transcrição compreende uma célula de mioblasto, que é colocada em contado com a composição após 0, 4 ou 7 dias de pré- diferenciação.
271. Uma composição que compreende uma combinação que compreende: (a) uma primeira composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores; (b) uma segunda composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores; e, opcionalmente (c) uma terceira composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a primeira, segunda e terceira composições são diferentes.
272. Um método para preparar um oligonucleotídeo ou uma composição de oligonucleotídeo do mesmo, que compreende fornecer um composto que tem a estrutura de: , Fórmula 3-I ou um sal do mesmo.
273. Um método para preparar um oligonucleotídeo ou uma composição de oligonucleotídeo do mesmo, que compreende fornecer um composto que tem a estrutura de: , ou um sal do mesmo.
274. Um método para preparar um oligonucleotídeo ou uma composição de oligonucleotídeo do mesmo, que compreende fornecer um composto que tem a estrutura de , , , , , , , ou
, ou um sal do mesmo.
275. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 272 a 274, em que o composto é estereoquimicamente puro.
276. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 272 a 275, em que o composto é um composto das Tabelas CA-1, CA-2, CA-3, CA-4, CA-5, CA-6, CA-7, CA-8, CA-9, CA-10, CA-11, ou CA-12, ou um diastereômero ou enantiômero relacionado do mesmo.
277. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 272 a 275, em que o composto é um composto da Tabela CA-2 ou um diastereômero ou enantiômero relacionado do mesmo.
278. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 272 a 275, em que o composto é um composto da Tabela CA-3 ou um diastereômero ou enantiômero relacionado do mesmo.
279. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 272 a 275, em que o composto é um composto da Tabela CA-4 ou um diastereômero ou enantiômero relacionado do mesmo.
280. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 272 a 275, em que o composto é um composto da Tabela CA-5 ou um diastereômero ou enantiômero relacionado do mesmo.
281. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 272 a 275, em que o composto é um composto da Tabela CA-6 ou um diastereômero ou enantiômero relacionado do mesmo.
282. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 272 a 275, em que o composto é um composto da Tabela CA-7 ou um diastereômero ou enantiômero relacionado do mesmo.
283. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 272 a 275, em que o composto é um composto da Tabela CA-8 ou um diastereômero ou enantiômero relacionado do mesmo.
284. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 272 a 275, em que o composto é um composto da Tabela CA-9 ou um diastereômero ou enantiômero relacionado do mesmo.
285. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 272 a 275, em que o composto é um composto da Tabela CA-10 ou um diastereômero ou enantiômero relacionado do mesmo.
286. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 272 a 275, em que o composto é um composto da Tabela CA-11 ou um diastereômero ou enantiômero relacionado do mesmo.
287. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 272 a 275, em que o composto é um composto da Tabela CA-12 ou um diastereômero ou enantiômero relacionado do mesmo.
288. Um método para preparar um oligonucleotídeo ou uma composição de oligonucleotídeo do mesmo, que compreende fornecer um composto fosforamidita que compreende uma porção química de auxiliar quiral que tem a estrutura de
, , , , , , , , , ou .
289. Um método para preparar um oligonucleotídeo ou uma composição de oligonucleotídeo do mesmo, que compreende fornecer um composto fosforamidita que tem a estrutura de: , , , , , , , , , , , , ou
, ou um sal do mesmo.
290. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 272 a 289, em que W1 é −NG5−.
291. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 272 a 290, em que G5 e um dentre G3 e G4 são tomados em conjunto para formar um anel saturado com 3 a 8 membros opcionalmente substituído tendo 0 a 3 heteroátomos além do nitrogênio de −NG5−.
292. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 272 a 290, em que G5 e um dentre G3 e G4 são tomados em conjunto para formar um anel saturado com 5 membros opcionalmente substituído que não tem heteroátomos além do nitrogênio de −NG5−.
293. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 272 a 292, em que W2 é −O−.
294. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 272 a 293, em que G2 compreende um grupo de removedor de elétrons.
295. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 272 a 293, em que G2 é metila substituída por um ou mais grupos removedores de elétrons.
296. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 294 a 295, em que um grupo removedor de elétrons é −CN, −NO2, halogênio, −C(O)R1, −C(O)OR', −C(O)N(R')2, −S(O)R1, −S(O)2R1, −P(W)(R1)2, −P(O)(R1)2, −P(O)(OR')2, ou −P(S)(R1)2, ou arila ou heteroarila substituída por um ou mais dentre −CN, −NO2, halogênio, −C(O)R1, −C(O)OR', −C(O)N(R')2, −S(O)R1, −S(O)2R1, −P(W)(R1)2, −P(O)(R1)2, −P(O)(OR')2, ou −P(S)(R1)2.
297. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 294 a 295, em que um grupo removedor de elétrons é −CN, −NO2, halogênio, −C(O)R1, −C(O)OR', −C(O)N(R')2, −S(O)R1, −S(O)2R1, −P(W)(R1)2, −P(O)(R1)2, −P(O)(OR')2, ou −P(S)(R1)2, ou fenila substituída por um ou mais dentre −CN, −NO2, halogênio, −C(O)R1, −C(O)OR', −C(O)N(R')2, −S(O)R1, −S(O)2R1, −P(W)(R1)2, −P(O)(R1)2, −P(O)(OR')2, ou −P(S)(R1)2.
298. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 294 a 295, em que um grupo removedor de elétrons é −CN, −NO2, halogênio, −C(O)R1, −C(O)OR', −C(O)N(R')2, −S(O)R1, −S(O)2R1, −P(W)(R1)2, −P(O)(R1)2, −P(O)(OR')2, ou −P(S)(R1)2.
299. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 272 a 294, em que G2 é −L'−L"−R', em que L' é −C(R)2− ou −CH2− opcionalmente substituído, e L" é uma ligação covalente, −P(O)(R')−, −P(O)(R')O−, −P(O)(OR')−, −P(O)(OR')O−, −P(O)[N(R')]−, −P(O)[N(R')]O−, −P(O)[N(R')][N(R')]−, −P(S)(R')−, −S(O)2−, −S(O)2−, −S(O)2O−, −S(O)−, −C(O)−, ou −C(O)N(R')−.
300. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 272 a 294, em que G2 é −L'−L"−R', em que L' é −C(R)2− ou −CH2− opcionalmente substituído, e L" é −P(O)(R')−, −P(O)(R')O−, −P(O)(OR')−, −P(O)(OR')O−, −P(O)[N(R')]−, −P(O)[N(R')]O−, −P(O)[N(R')][N(R')]−, −P(S)(R')−, −S(O)2−, −S(O)2−, −S(O)2O−, −S(O)−, −C(O)−, ou −C(O)N(R')−.
301. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 272 a 300, em que G2 é −L'−S(O)2R'.
302. O método, de acordo com a modalidade 301, em que R' é C1-6 alifático opcionalmente substituído.
303. O método, de acordo com a modalidade 301, em que R' é opcionalmente C1-6 alquila opcionalmente substituída.
304. O método, de acordo com a modalidade 301, em que R' é metila, isopropila ou t-butila.
305. O método, de acordo com a modalidade 301, em que R' é fenila opcionalmente substituída.
306. O método, de acordo com a modalidade 301, em que R' é fenila.
307. O método, de acordo com a modalidade 301, em que R' é fenila substituída.
308. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 272 a 300, em que G2 é −L'−P(O)(R')2.
309. O método, de acordo com a modalidade 308, em que um R' é C1-6 alifático opcionalmente substituído.
310. O método, de acordo com a modalidade 308, em que um R' é C1-6 alquila opcionalmente substituída.
311. O método, de acordo com a modalidade 308, em que um R' é fenila opcionalmente substituída.
312. O método, de acordo com a modalidade 308, em que um R' é fenila.
313. O método, de acordo com a modalidade 308, em que um R' é fenila substituída.
314. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 309 a 313, em que o outro R' é C1-6 alifático opcionalmente substituído.
315. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 309 a 313, em que o outro R' é C1-6 alquila opcionalmente substituída.
316. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 309 a 313, em que o outro R' é fenila opcionalmente substituída.
317. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 309 a 313, em que o outro R' é fenila.
318. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 309 a 313, em que o outro R' é fenila substituída.
319. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 299 a 318, em que L' é −C(R')2−.
320. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 299 a 318, em que L' é −CH2− opcionalmente substituído.
321. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 299 a 318, em que L' é −CH2−.
322. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 272 a 321, que compreende fornecer um ou mais compostos adicionais, em que cada composto é independentemente um composto, de acordo com qualquer uma das modalidades 272 a
321.
323. O método, de acordo com a modalidade 322, em que um composto adicional tem uma estrutura diferente do composto.
324. O método, de acordo com a modalidade 322, em que em um composto adicional, G2 é −L'−Si(R)3, em que cada R é independentemente não −H.
325. O método, de acordo com a modalidade 322, em que em um composto adicional, G2 é −CH2SiCH3Ph2.
326. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 272 a 325, que compreende um ou mais ciclos, cada um dos quais compreendendo ou consistindoe independentemente em:
1) desbloqueio; 2) acoplamento; 3) opcionalmente um primeiro capping; 4) modificação; e 5) opcionalmente um segundo capping.
327. Um método para preparar um oligonucleotídeo ou uma composição do mesmo, que compreende um ou mais ciclos, cada cada um dos quais compreende ou consiste independentemente em: 1) desbloqueio; 2) acoplamento; 3) opcionalmente um primeiro capping; 4) modificação; e 5) opcionalmente um segundo capping.
328. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 326 a 327, em que pelo menos um ciclo compreende ou consiste em 1) a 5).
329. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 326 a 328, em que as etapas são realizadas sequencialmente de 1) a 5).
330. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 326 a 329, em que os ciclos são realizados até um comprimento desejado de um oligonucleotídeo ser alcançado.
331. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 326 a 330, em que o desbloqueio remove um grupo de proteção em 5'--OH e fornece um 5'−OH livre.
332. O método, de acordo com a modalidade 331, em que o grupo de proteção é R'-C(O)−.
333. O método, de acordo com a modalidade 331, em que o grupo de proteção é DMTr.
334. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 331 a 333, que compreende colocar os oligonucleotídeos a serem desbloqueados em contato com um ácido.
335. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 272 a 334, que compreende um acoplamento que compreende: 1) fornecer uma fosforamidita; e 2) reagir a fosforamidita com um oligonucleotídeo, em que uma ligação P−O é formada entre o fósforo da fosforamidita e o 5'−OH do oligonucleotídeo.
336. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 272 a 335, que compreende um acoplamento que compreende: 1) fornecer uma fosforamidita; e 2) reagir a fosforamidita com um oligonucleotídeo, em que uma ligação P−O é formada entre o fósforo da fosforamidita e o 5'−OH do oligonucleotídeo, em que a fosforamidita é um composto, de acordo com qualquer uma das modalidades 288 a 321.
337. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 272 a 336, que compreende um acoplamento que compreende: 1) fornecer uma fosforamidita; e 2) reagir a fosforamidita com um oligonucleotídeo, em que uma ligação P−O é formada entre o fósforo da fosforamidita e o 5'−OH do oligonucleotídeo, em que a fosforamidita é um composto, de acordo com qualquer uma das modalidades 288 a 293, em que G2 é −L'−Si(R)3, em que cada R é independentemente não −H.
338. O método, de acordo com a modalidade 337, em que G2 é −CH2SiCH3Ph2.
339. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 336 a 338, em que o acoplamento forma uma ligação internucleotídica com uma estereosseletividade de 85%, 90%,
91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais.
340. O método, de acordo com a modalidade 339, em que a ligação internucleotídica formada é uma ligação internucleotídica da fórmula I ou uma forma de sal da mesma.
341. O método, de acordo com a modalidade 340, em que −X−L−R1 é , , , , , , , , , ou .
342. O método, de acordo com a modalidade 340 ou 341, em que PL é P.
343. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 272 a 342, que compreende um acoplamento que compreende: 1) fornecer uma fosforamidita; e 2) reagir a fosforamidita com um oligonucleotídeo, em que uma ligação P−O é formada entre o fósforo da fosforamidita e o 5'−OH do oligonucleotídeo, em que a fosforamidita é uma fosforamidita padrão para a síntese de oligonucleotídeo, em que o átomo de fósforo é ligado ao nucleosídeo protegido, −N(i-Pr)2, e 2- cianoetila.
344. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 272 a 343, que compreende um primeiro capping que compreende: 1) fornecer um reagente acilante, e 2) colocar um oligonucleotídeo em contato com o reagente acilante, em que o primeiro capping capeia um grupo amino de uma ligação internucleotídica.
345. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 272 a 344, que compreende um primeiro capping que forma uma ligação internucleotídica da fórmula I ou uma forma de sal da mesma, em que −X−L−R1 é , , , , , , , , , ou .
346. O método, de acordo com a modalidade 345, em que PL é P e R1 é −C(O)R.
347. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 272 a 346, em que um primeiro capping é realizado após cada acoplamento da modalidade 339.
348. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 272 a 347, que compreende uma etapa de modificação que é ou compreende sulfurização.
349. O método, de acordo com a modalidade 348, em que a sulfurização instala =S em um fósforo de ligação.
350. O método, de acordo com a modalidade 348 ou 349, em que a sulfurização forma uma ligação internucleotídica da fórmula I ou uma forma de sal da mesma, em que PL é P(=S).
351. O método, de acordo com a modalidade 350, em que −X−L−R1 é , , , , , , , , , ou .
352. O método, de acordo com a modalidade 351, em que R1 é −C(O)R.
353. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 272 a 352, que compreende uma etapa de modificação que é ou compreende oxidação.
354. O método, de acordo com a modalidade 348, em que a sulfurização instala =O em um fósforo de ligação.
355. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 272 a 354, que compreende uma etapa de modificação que instala =N−L−R5 em um fósforo de ligação.
356. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 272 a 354, que compreende uma etapa de modificação que converte um fósforo de ligação em , ,
, , ou .
357. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 272 a 356, que compreende uma etapa de modificação que compreende colocar o oligonucleotídeo em contato com um sal azido imidazolínio.
358. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 272 a 356, que compreende uma etapa de modificação que compreende colocar o oligonucleotídeo em contato com um composto que compreende , , , , ou .
359. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 272 a 356, que compreende uma etapa de modificação que compreende colocar o oligonucleotídeo em contato com um composto que tem a estrutura de Q−, Q− , Q−, Q−, ou Q−, em que Q− é um ânion.
360. O método, de acordo com a modalidade 359, em que Q− é F−, Cl−, Br−, BF4−, PF6−, TfO−, Tf2N−, AsF6−, ClO4−, ou SbF6−.
361. O método, de acordo com a modalidade 360, em que Q− é PF6−.
362. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 272 a 362, em que uma etapa de modificação forma uma ligação internucleotídica da fórmula I ou uma forma de sal da mesma, em que PL é P(=N−L−R5).
363. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 272 a 362, em que uma etapa de modificação forma uma ligação internucleotídica da fórmula III ou uma forma de sal da mesma.
364. O método, de acordo com a modalidade 362 ou 363, em que −X−L−R1 é , , , , , , , , , ou .
365. O método, de acordo com a modalidade 364, em que R1 é −C(O)R.
366. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 272 a 365, que compreende um segundo capping que capeia 5'−OH livre.
367. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 272 a 366, que compreende um segundo capping que capeia 5'−OH livre, em que um segundo capping é realizado em cada ciclo.
368. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 272 a 366, que compreende um segundo capping que capeia 5'−OH livre, em que um segundo capping é realizado em cada ciclo que é seguido por outro ciclo.
369. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 366 a 368, em que um 5'−OH é capeado como −OAc.
370. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 272 a 369, em que o oligonucleotídeo é fixado a um suporte sólido.
371. O método, de acordo com a modalidade 370, em que o suporte sólido é CPG.
372. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 370 a 371, que compreende um contato em que o oligonucleotídeo é colocado em contato com uma base.
373. O método, de acordo com a modalidade 372, em que o contato é realizado substancialmente sem água.
374. O método, de acordo com a modalidade 372 ou 373, em que o contato ocorre após o comprimento de oligonucleotídeo ser alcançado antes da desproteção e clivagem do oligonucleotídeo.
375. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 372 a 374, em que a base é uma base amina que tem a estrutura de NR3.
376. O método, de acordo com a modalidade 375, em que a base é trietilamina.
377. O método, de acordo com a modalidade 375, em que a base é N, N-dietilamina.
378. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 372 a 377, em que o contato remove um auxiliar quiral.
379. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 372 a 378, em que o contato remove um grupo −X−L−R1.
380. O método, de acordo com a modalidade 379, em que −X−L−R1 é , , , , , , , , , ou .
381. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 372 a 380, em que o contato forma uma ligação internucleotídica da fórmula I-n-1, I-n-2, I-n-3, I-n-4, II, II-a-1, II-a-2, II-b-1, II-b-2, II-c-1, II-c-2, II-d-1, ou II- d-2, em que PL é P(O).
382. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 364 a 381, em que G2 compreende um grupo removedor de elétrons.
383. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 364 a 382, em que G2 é metila substituída por um ou mais grupos removedores de elétrons.
384. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 382-383, em que um grupo removedor de elétrons é −CN, −NO2, halogênio, −C(O)R1, −C(O)OR', −C(O)N(R')2, −S(O)R1, −S(O)2R1, −P(W)(R1)2, −P(O)(R1)2, −P(O)(OR')2, ou −P(S)(R1)2, ou arila ou heteroarila substituída por um ou mais dentre −CN, −NO2, halogênio, −C(O)R1, −C(O)OR', −C(O)N(R')2, −S(O)R1, −S(O)2R1, −P(W)(R1)2, −P(O)(R1)2, −P(O)(OR')2, ou −P(S)(R1)2.
385. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 382 a 383, em que um grupo removedor de elétrons é −CN, −NO2, halogênio, −C(O)R1, −C(O)OR', −C(O)N(R')2, −S(O)R1, −S(O)2R1, −P(W)(R1)2, −P(O)(R1)2, −P(O)(OR')2, ou −P(S)(R1)2, ou fenila substituída por um ou mais dentre −CN, −NO2, halogênio, −C(O)R1, −C(O)OR', −C(O)N(R')2, −S(O)R1, −S(O)2R1, −P(W)(R1)2, −P(O)(R1)2, −P(O)(OR')2, ou −P(S)(R1)2.
386. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 382 a 383, em que um grupo removedor de elétrons é −CN, −NO2, halogênio, −C(O)R1, −C(O)OR', −C(O)N(R')2, −S(O)R1, −S(O)2R1, −P(W)(R1)2, −P(O)(R1)2, −P(O)(OR')2, ou −P(S)(R1)2.
387. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 364 a 386, em que G2 é −L'−L"−R', em que L' é −C(R)2− ou opcionalmente substituído −CH2− , e L" é uma ligação covalente, −P(O)(R')−, −P(O)(R')O−, −P(O)(OR')−, −P(O)(OR')O−, −P(O)[N(R')]−, −P(O)[N(R')]O−, −P(O)[N(R')][N(R')]−, −P(S)(R')−, −S(O)2−, −S(O)2−, −S(O)2O−, −S(O)−, −C(O)−, ou −C(O)N(R')−.
388. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 364 a 386, em que G2 é −L'−L"−R', em que L' é −C(R)2− ou −CH2− opcionalmente substituído, e L" é −P(O)(R')−, −P(O)(R')O−, −P(O)(OR')−, −P(O)(OR')O−, −P(O)[N(R')]−, −P(O)[N(R')]O−, −P(O)[N(R')][N(R')]−, −P(S)(R')−, −S(O)2−,
−S(O)2−, −S(O)2O−, −S(O)−, −C(O)−, ou −C(O)N(R')−.
389. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 364 a 388, em que G2 é −L'−S(O)2R'.
390. O método, de acordo com a modalidade 389, em que R' é C1-6 alifático opcionalmente substituído.
391. O método, de acordo com a modalidade 389, em que R' é opcionalmente C1-6 alquila opcionalmente substituída.
392. O método, de acordo com a modalidade 389, em que R' é metila, isopropila ou t-butila.
393. O método, de acordo com a modalidade 389, em que R' é fenila opcionalmente substituída.
394. O método, de acordo com a modalidade 389, em que R' é fenila.
395. O método, de acordo com a modalidade 389, em que R' é fenila substituída.
396. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 364 a 388, em que G2 é −L'−P(O)(R')2.
397. O método, de acordo com a modalidade 396, em que um R' é C1-6 alifático opcionalmente substituído.
398. O método, de acordo com a modalidade 396, em que um R' é C1-6 alquila opcionalmente substituída.
399. O método, de acordo com a modalidade 396, em que um R' é fenila opcionalmente substituída.
400. O método, de acordo com a modalidade 396, em que um R' é fenila.
401. O método, de acordo com a modalidade 396, em que um R' é fenila substituída.
402. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 397 a 401, em que o outro R' é C1-6 alifático opcionalmente substituído
403. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 397 a 401, em que o outro R' é C1-6 alquila opcionalmente substituída.
404. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 309 a 313, em que o outro R' é fenila opcionalmente substituída.
405. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 309 a 313, em que o outro R' é fenila.
406. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 309 a 313, em que o outro R' é fenila substituída.
407. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 387 a 406, em que L' é −C(R')2−.
408. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 387 a 406, em que L' é −CH2− opcionalmente substituído
409. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 387 a 406, em que L' é −CH2−.
410. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 372 a 409, em que o contato remove 2'-cianoetila.
411. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 372 a 410, em que o contato forma uma ligação fosfato natural ou uma forma de sal da mesma.
412. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 272 a 410, que compreende a remoção de outro auxiliar quiral ou grupo que tenha uma estrutura diferente daquela, de acordo com qualquer uma das modalidades 378 a 410.
413. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 272 a 410, que compreende a remoção de
, , , , , , , , , ou , em que G2 é −L'−Si(R)3, em que cada R é independentemente não −H.
414. O método, de acordo com a modalidade 413, em que G2 é −CH2SiCH3Ph2.
415. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 412 a 414, que compreende colocar um oligonucleotídeo em contato com um fluoreto.
416. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 412 a 414, que compreende colocar um oligonucleotídeo em contato com uma solução que compreende TEA-HF e uma base.
417. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 272 a 416, que compreende a clivagem de oligonucleotídeo a partir de um suporte sólido.
418. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 272 a 417, em que o oligonucleotídeo ou uma composição do mesmo é um oligonucleotídeo ou composição, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 254.
419. O composto, de acordo com qualquer uma das modalidades 272 a 321, ou um diastereômero ou enantiômero relacionado.
420. Um oligonucleotídeo, em que o oligonucleotídeo é, WV-20104, WV-20103, WV-20102, WV-20101, WV-20100, WV-20099,
WV-20098, WV-20097, WV-20096, WV-20095, WV-20094, WV-20106, WV-20119, WV-20118, WV-13739, WV-13740, WV-9079, WV-9082, WV- 9100, WV-9096, WV-9097, WV-9106, WV-9133, WV-9148, WV-9154, WV-9898, WV-9899, WV-9900, WV-9906, WV-9907, WV-9908, WV-9909, WV-9756, WV-9757, WV-9517, WV-9714, WV-9715, WV-9519, WV-9521, WV-9747, WV-9748, WV-9749, WV-9897, WV-9898, WV-9900, WV-9899, WV-9906, WV-9912, WV-9524, WV-9912, WV-9906, WV-9900, WV-9899, WV-9899, WV-9898, WV-9898, WV-9898, WV-9898, WV-9898, WV-9897, WV-9897, WV-9897, WV-9897, WV-9897, WV-9747, WV-9714, WV-9699, WV-9517, WV-9517, WV-13409, WV-13408, WV-12887, WV-12882, WV- 12881, WV-12880, WV-12880, WV-WV12880, WV-12878, WV-12877, WV- 12877, WV-12876, WV-12873, WV-12872, WV-12559, WV-12559, WV- 12558, WV-12558, WV-12557, WV-12556, WV-12556, WV-12555, WV- 12555, WV-12554, WV-12553, WV-12129, WV-12127, WV-12125, WV- 12123, WV-11342, WV-11342, WV-11341, WV-11341, WV-11340, WV- 10672, WV-10671, WV-10670, WV-10461, WV-10455, WV-9897, WV- 9898, WV-13826, WV-13827, WV-13835, WV-12880, WV-14344, WV- 13864, WV-13835, WV-14791, WV-14344, WV-13754, WV-13766,, WV- 11086, WV-11089, WV-17859, WV-17860, WV-20070, WV-20073, WV- 20076, WV-20052, WV-20099, WV-20049, WV-20085, WV-20087, WV- 20034, WV-20046, WV-20052, WV-20061, WV-20064, WV-20067, WV- 20092, WV-20091, WV-20093, WV-20084, WV-9738, WV-9739, WV-9740, WV-9741, WV-15860, WV-15862, WV-11084, WV-11086, WV-11088, WV- 11089, WV-14522, WV-14523, WV-17861, WV-17862, WV-13815, WV- 13816, WV-13817, WV-13780, WV-17862, WV-17863, WV-17864, WV- 17865, WV-17866, WV-20082, WV-20081, WV-20080, WV-20079, WV- 20076, WV-20075, WV-20074, WV-20073, WV-20072, WV-20071, WV- 20064, WV-20059, WV-20058, WV-20057, WV-20056, WV-20053, WV- 20052, WV-20051, WV-20050, WV-20049, WV-20094, WV-20095, ou uma forma de sal do mesmo.
EQUIVALENTES
[001839] Tendo descrito algumas modalidades ilustrativas da revelação, deve ser evidente para aqueles versados na técnica que o antecedente é meramente ilustrativo e não limitativo, tendo sido apresentado apenas a título de exemplo. Várias modificações e outras modalidades ilustrativas estão dentro do escopo de um versado na técnica e são contempladas como incluídos dentro do escopo da revelação. Em particular, embora muitos dos exemplos apresentados no presente documento envolvam combinações específicas de ações de método ou elementos de sistema, deve ser entendido que essas ações e esses elementos podem ser combinados de outras maneiras para atingir os mesmos objetivos. Ações, elementos e características discutidos apenas em conjunto com uma modalidade não se destinam a ser excluídos de uma função similar em outras modalidades. Além disso, para as uma ou mais limitações de meio mais função, se houver, recitadas nas seguintes reivindicações, os meios não se destinam a ser limitados aos meios revelados no presente documento para desempenhar a função recitada, porém se destinam a cobrir no escopo qualquer meio, conhecido agora ou desenvolvidos posteriormente, para realizar a função recitada.
[001840] O uso de termos ordinais como "primeiro", "segundo", "terceiro", etc., nas reivindicações para modificar um elemento de reivindicação não conota, por si só, qualquer prioridade, precedência ou ordem de um elemento de reivindicação sobre outro ou a ordem temporal em que ações de um método são realizadas, porém são usados meramente como rótulos para distinguir um elemento de reivindicação com um certo nome de outro elemento com um mesmo nome (porém, para uso do termo ordinal) para distinguir os elementos de reivindicação. De modo similar, o uso de a), b), etc., ou i), ii), etc. por si só não conota nenhuma prioridade, precedência ou ordem de etapas nas reivindicações. De modo similar, o uso desses termos no relatório descritivo não conota por si só qualquer prioridade, precedência ou ordem necessária.
[001841] O relatório descritivo escrito supracitado é considerado suficiente para permitir que um versado na técnica pratique a invenção. A presente revelação não é limitada em escopo por exemplos fornecidos. Os exemplos são destinados como ilustração de um ou mais aspectos de uma invenção e outras modalidades funcionalmente equivalentes estão dentro do escopo da invenção. Várias modificações além daquelas mostradas e descritas no presente documento se tornarão evidentes para aqueles versados na técnica a partir da descrição anterior e estão dentro do escopo das reivindicações em anexo. As vantagens e objetivos da invenção não são necessariamente abrangidas por cada modalidade da invenção.

Claims (53)

REIVINDICAÇÕES
1. COMPOSIÇÃO DE OLIGONUCLEOTÍDEO, caracterizada por compreender uma pluralidade de oligonucleotídeos de um tipo de oligonucleotídeo particular definido por: 1) sequência de base; 2) padrão de ligações de cadeia principal; 3) padrão de centros quirais de cadeia principal; e 4) padrão de modificações de fósforo de cadeia principal, em que: os oligonucleotídeos da pluralidade compreendem pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 ligações internucleotídicas quiralmente controladas; e os oligonucleotídeos da pluralidade compreendem pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 ligações internucleotídicas não negativamente carregadas.
2. COMPOSIÇÃO DE OLIGONUCLEOTÍDEO, que compreende uma pluralidade de oligonucleotídeos de um tipo de oligonucleotídeo particular definido por: 1) sequência de base; 2) padrão de ligações de cadeia principal; 3) padrão de centros quirais de cadeia principal; e 4) padrão de modificações de fósforo de cadeia principal, em que: os oligonucleotídeos da pluralidade compreendem pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 ligações internucleotídicas quiralmente controladas; e sendo que a composição de oligonucleotídeo é caracterizada por, quando entrar em contato com uma transcrição em um sistema de splicing de transcrição, o splicing da transcrição é alterado em relação àquele observado sob a condição de referência selecionada dentre o grupo que consiste na ausência da composição, presença de uma composição de referência, e combinações dos mesmos.
3. OLIGONUCLEOTÍDEO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo padrão de ligações de cadeia principal compreender pelo menos uma ligação internucleotídica não negativamente carregada.
4. COMPOSIÇÃO DE OLIGONUCLEOTÍDEO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela composição de oligonucleotídeo ser colocada em contato com uma transcrição em um sistema de splicing de transcrição, o splicing da transcrição é alterado em relação àquele observado sob uma condição de referência selecionada dentre o grupo que consiste na ausência da composição, presença de uma composição de referência, e combinações dos mesmos.
5. OLIGONUCLEOTÍDEO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por uma ou mais ligações internucleotídicas não negativamente carregadas serem independentemente quiralmente controladas.
6. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada por uma ligação internucleotídica não negativamente carregada ter a estrutura da fórmula I: ,
I ou uma forma de sal da mesma, em que: PL é P(=W), P, ou P→B(R')3; W é O, N(–L–R5), S ou Se; cada um dentre R1 e R5 é independentemente −H, −L−R', halogênio, −CN, −NO2, −L−Si(R')3, −OR', −SR', ou −N(R')2; X é –N(–L–R5)–; cada um dentre Y e Z é independentemente –O–, –S–, –N(–L–R5)–, ou L; cada L é independentemente um grupo de ligação covalente, ou bivalente, linear ou ramificado opcionalmente substituído selecionado dentre um grupo alifático C1-30 e um grupo heteroalifático C1-30 tendo 1 a 10 heteroátomos, em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por C1-6 alquileno, C1-6 alquenileno, , um grupo heteroalifático C1–C6 bivalente tendo 1 a 5 heteroátomos, −C(R')2−, −Cy−, −O−, −S−, −S−S−, −N(R')−, −C(O)−, −C(S)−, −C(NR')−, −C(O)N(R')−, −N(R')C(O)N(R')−, −N(R')C(O)O−, −S(O)−, −S(O)2−, −S(O)2N(R')−, −C(O)S−, −C(O)O−, −P(O)(OR')−, −P(O)(SR')−, −P(O)(R')−, −P(O)(NR')−, −P(S)(OR')−, −P(S)(SR')−, −P(S)(R')−, −P(S)(NR')−, −P(R')−, −P(OR')−, −P(SR')−, −P(NR')−, −P(OR')[B(R')3]−, −OP(O)(OR')O−, −OP(O)(SR')O−, −OP(O)(R')O−, −OP(O)(NR')O−, −OP(OR')O−, −OP(SR')O−, −OP(NR')O−, −OP(R')O−, ou −OP(OR')[B(R')3]O−, e um ou mais CH ou átomos de carbono são opcional e independentemente substituídos por CyL; cada −Cy− é independentemente um grupo bivalente opcionalmente substituído selecionado dentre um anel cicloalifático C3-20, um anel C6-20 arila, um anel heteroarila com 5 a 20 membros tendo 1 a 10 heteroátomos, e um anel heterociclila com 3 a 20 membros tendo 1 a 10 heteroátomos;
cada CyL é independentemente um grupo trivalente ou tetravalente opcionalmente substituído selecionado dentre um anel cicloalifático C3-20, um anel C6-20 arila, um anel heteroarila com 5 a 20 membros tendo 1 a 10 heteroátomos, e um anel heterociclila com 3 a 20 membros tendo 1 a 10 heteroátomos; cada R' é independentemente −R, −C(O)R, −C(O)OR, ou −S(O)2R; cada R é independentemente −H, ou um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre C1-30 alifático, C1-30 heteroalifático tendo 1 a 10 heteroátomos, C6-30 arila, C6- 30 arilalifático, C6-30 aril-heteroalifático tendo 1 a 10 heteroátomos, heteroarila com 5 a 30 membros tendo 1 a 10 heteroátomos, e heterociclila com 3 a 30 membros tendo 1 a 10 heteroátomos, ou dois grupos R são opcional e independentemente tomados em conjunto para formar uma ligação covalente, ou dois ou mais grupos R no mesmo átomo são opcional e independentemente tomados em conjunto para formar um anel monocíclico, bicíclico ou policíclico com 3 a 30 membros opcionalmente substituído tendo, além do átomo, 0 a 10 heteroátomos, ou dois ou mais grupos R em dois ou mais átomos são opcional e independentemente tomados em conjunto com seus átomos intervenientes para formar um anel monocíclico, bicíclico ou policíclico com 3 a 30 membros opcionalmente substituído tendo, além dos átomos intervenientes, 0 a 10 heteroátomos.
7. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada por uma ligação internucleotídica não negativamente carregada ter a estrutura da fórmula I-n-3:
, I-n-3 ou uma forma de sal da mesma, em que: PL é P(=W), P, ou P→B(R')3; W é O, N(–L–R5), S ou Se; cada um dentre R1 e R5 é independentemente −H, −L−R', halogênio, −CN, −NO2, −L−Si(R')3, −OR', −SR', ou −N(R')2; cada um dentre Y e Z é independentemente –O–, –S–, –N(–L–R5)–, ou L; cada L é independentemente um grupo de ligação covalente, ou bivalente, linear ou ramificado opcionalmente substituído selecionado dentre um grupo alifático C1-30 e um grupo heteroalifático C1-30 tendo 1 a 10 heteroátomos, em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por C1-6 alquileno, C1-6 alquenileno, , um grupo heteroalifático C1–C6 bivalente tendo 1 a 5 heteroátomos, −C(R')2−, −Cy−, −O−, −S−, −S−S−, −N(R')−, −C(O)−, −C(S)−, −C(NR')−, −C(O)N(R')−, −N(R')C(O)N(R')−, −N(R')C(O)O−, −S(O)−, −S(O)2−, −S(O)2N(R')−, −C(O)S−, −C(O)O−, −P(O)(OR')−, −P(O)(SR')−, −P(O)(R')−, −P(O)(NR')−, −P(S)(OR')−, −P(S)(SR')−, −P(S)(R')−, −P(S)(NR')−, −P(R')−, −P(OR')−, −P(SR')−, −P(NR')−, −P(OR')[B(R')3]−, −OP(O)(OR')O−, −OP(O)(SR')O−, −OP(O)(R')O−, −OP(O)(NR')O−, −OP(OR')O−, −OP(SR')O−, −OP(NR')O−, −OP(R')O−, ou −OP(OR')[B(R')3]O−, e um ou mais CH ou átomos de carbono são opcional e independentemente substituídos por CyL;
cada −Cy− é independentemente um grupo bivalente opcionalmente substituído selecionado dentre um anel cicloalifático C3-20, um anel C6-20 arila, um anel heteroarila com 5 a 20 membros tendo 1 a 10 heteroátomos, e um anel heterociclila com 3 a 20 membros tendo 1 a 10 heteroátomos; cada CyL é independentemente um grupo trivalente ou tetravalente opcionalmente substituído selecionado dentre um anel cicloalifático C3-20, um anel C6-20 arila, um anel heteroarila com 5 a 20 membros tendo 1 a 10 heteroátomos, e um anel heterociclila com 3 a 20 membros tendo 1 a 10 heteroátomos; cada R' é independentemente −R, −C(O)R, −C(O)OR, ou −S(O)2R; cada R é independentemente −H, ou um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre C1-30 alifático, C1-30 heteroalifático tendo 1 a 10 heteroátomos, C6-30 arila, C6- 30 arilalifático, C6-30 aril-heteroalifático tendo 1 a 10 heteroátomos, heteroarila com 5 a 30 membros tendo 1 a 10 heteroátomos, e heterociclila com 3 a 30 membros tendo 1 a 10 heteroátomos, ou dois grupos R são opcional e independentemente tomados em conjunto para formar uma ligação covalente, ou dois ou mais grupos R no mesmo átomo são opcional e independentemente tomados em conjunto para formar um anel monocíclico, bicíclico ou policíclico com 3 a 30 membros opcionalmente substituído tendo, além do átomo, 0 a 10 heteroátomos, ou dois ou mais grupos R em dois ou mais átomos são opcional e independentemente tomados em conjunto com seus átomos intervenientes para formar um anel monocíclico,
bicíclico ou policíclico com 3 a 30 membros opcionalmente substituído tendo, além dos átomos intervenientes, 0 a 10 heteroátomos.
8. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada por uma ligação internucleotídica não negativamente carregada ter a estrutura de .
9. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pela ligação internucleotídica não negativamente carregada é quiralmente controlada e é Rp.
10. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pela transcrição ser uma transcrição de Distrofina.
11. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo splicing da transcrição ser alterado de modo que o nível de salto do éxon 45, 51, ou 53, ou múltiplos éxons seja aumentado.
12. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada por cada ligação internucleotídica quiral dos oligonucleotídeos da pluralidade ser independentemente uma ligação internucleotídica quiralmente controlada.
13. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pela sequência de base ser ou compreende, ou compreende 15 bases contíguas da sequência de base de qualquer oligonucleotídeo na Tabela A1.
14. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 11,
caracterizada pelo tipo de oligonucleotídeo compreender qualquer um dentre: colesterol; L-carnitina (ligação amida e carbamato); ácido fólico; ácido gambógico; lipídio clivável (ligação 1,2-dilaurina e éster); aglutinante receptor de insulina; CPP; glicose (tri e hexantenária); ou manose (tri e hexantenária, alfa e beta).
15. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada por cada ligação internucleotídica não negativamente carregada ser independentemente uma ligação internucleotídica pelo menos 50% da qual existe em sua forma não negativamente carregada a pH 7,4.
16. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelos oligonucleotídeos da pluralidade, cada um, compreenderem uma ou mais modificações de açúcar.
17. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada por uma ou mais modificações de açúcar serem modificações 2'-F.
18. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizada por cada heteroátomo ser independentemente boro, nitrogênio, oxigênio, silício, enxofre, ou fósforo.
19. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender uma composição de oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, e um carreador farmaceuticamente aceitável.
20. MÉTODO PARA ALTERAR O SPLICING DE UMA TRANSCRIÇÃO ALVO, caracterizado por compreender administrar uma composição de oligonucleotídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 19.
21. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 20,
caracterizado pela transcrição alvo ser pré-mRNA da distrofina.
22. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo éxon 45 da distrofina ser ignorado em um nível aumentado em relação à ausência da composição.
23. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo éxon 51 da distrofina ser ignorado em um nível aumentado em relação à ausência da composição.
24. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo éxon 53 da distrofina ser ignorado em um nível aumentado em relação à ausência da composição.
25. MÉTODO PARA TRATAR DISTROFIA MUSCULAR, DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE (DUCHENNE) (DMD) OU DISTROFIA MUSCULAR DE BECKER (Becker) (BMD), caracterizado por compreender administrar, a um indivíduo suscetível à mesma ou que sofre da mesma, uma composição, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 24.
26. MÉTODO PARA PREPARAR UM OLIGONUCLEOTÍDEO OU UMA COMPOSIÇÃO DE OLIGONUCLEOTÍDEO DO MESMO, caracterizado pelo oligonucleotídeo compreender uma ou mais ligações internucleotídicas não negativamente carregadas, que compreende fornecer um composto fosforamidita que tem a estrutura de: , , ,
, , , ,
, , , ,
, ou , ou um sal do mesmo, em que: R5s é independentemente R' ou −OR'; cada BA é independentemente um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre C3-30 cicloalifático, C6-30 arila, C5-30 heteroarila tendo 1 a 10 heteroátomos, C3-30 heterociclila tendo 1 a 10 heteroátomos, uma porção química de nucleobase natural, e uma porção química de nucleobase modificada; cada Rs é independentemente −H, halogênio, −CN, −N3, −NO, −NO2, −L−R', −L−Si(R)3, −L−OR', −L−SR', −L−N(R')2, −O−L−R', −O−L−Si(R)3, −O−L−OR', −O−L−SR', ou −O−L−N(R')2; cada s é independentemente 0 a 20; cada Ls é independentemente −C(R5s)2−, ou L; cada L é independentemente um grupo de ligação covalente, ou bivalente, linear ou ramificado opcionalmente substituído selecionado dentre um grupo alifático C1-30 e um grupo heteroalifático C1-30 tendo 1 a 10 heteroátomos, em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por C1-6 alquileno, C1-6 alquenileno, , um grupo heteroalifático C1–C6 bivalente tendo 1 a 5 heteroátomos, −C(R')2−, −Cy−, −O−, −S−, −S−S−, −N(R')−, −C(O)−, −C(S)−, −C(NR')−, −C(O)N(R')−, −N(R')C(O)N(R')−, −N(R')C(O)O−, −S(O)−, −S(O)2−, −S(O)2N(R')−, −C(O)S−, −C(O)O−, −P(O)(OR')−, −P(O)(SR')−, −P(O)(R')−, −P(O)(NR')−, −P(S)(OR')−, −P(S)(SR')−, −P(S)(R')−, −P(S)(NR')−, −P(R')−, −P(OR')−, −P(SR')−, −P(NR')−, −P(OR')[B(R')3]−, −OP(O)(OR')O−, −OP(O)(SR')O−, −OP(O)(R')O−, −OP(O)(NR')O−, −OP(OR')O−, −OP(SR')O−, −OP(NR')O−, −OP(R')O−, ou −OP(OR')[B(R')3]O−, e um ou mais CH ou átomos de carbono são opcional e independentemente substituídos por CyL; cada −Cy− é independentemente um grupo bivalente opcionalmente substituído selecionado dentre um anel cicloalifático C3-20, um anel C6-20 arila, um anel heteroarila com 5 a 20 membros tendo 1 a 10 heteroátomos, e um anel heterociclila com 3 a 20 membros tendo 1 a 10 heteroátomos; cada CyL é independentemente um grupo trivalente ou tetravalente opcionalmente substituído selecionado dentre um anel cicloalifático C3-20, um anel C6-20 arila, um anel heteroarila com 5 a 20 membros tendo 1 a 10 heteroátomos, e um anel heterociclila com 3 a 20 membros tendo 1 a 10 heteroátomos; cada Anel A é independentemente um anel monocíclico, bicíclico ou policíclico com 3 a 20 membros opcionalmente substituído tendo 0 a 10 heteroátomos independentemente selecionados dentre oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e silício; cada um dentre G1, G2, G3, G4, G5, e G8 é independentemente R1; cada R1 é independentemente −H, −L−R', halogênio, −CN, −NO2, −L−Si(R')3, −OR', −SR', ou −N(R')2; cada R' é independentemente −R, −C(O)R, −C(O)OR, ou −S(O)2R; cada R é independentemente −H, ou um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre C1-30 alifático, C1-30 heteroalifático tendo 1 a 10 heteroátomos, C6-30 arila, C6- 30 arilalifático, C6-30 aril-heteroalifático tendo 1 a 10 heteroátomos, heteroarila com 5 a 30 membros tendo 1 a 10 heteroátomos, e heterociclila com 3 a 30 membros tendo 1 a 10 heteroátomos, ou dois grupos R são opcional e independentemente tomados em conjunto para formar uma ligação covalente, ou dois ou mais grupos R no mesmo átomo são opcional e independentemente tomados em conjunto para formar um anel monocíclico, bicíclico ou policíclico com 3 a 30 membros opcionalmente substituído tendo, além do átomo, 0 a 10 heteroátomos, ou dois ou mais grupos R em dois ou mais átomos são opcional e independentemente tomados em conjunto com seus átomos intervenientes para formar um anel monocíclico, bicíclico ou policíclico com 3 a 30 membros opcionalmente substituído tendo, além dos átomos intervenientes, 0 a 10 heteroátomos; e em que G2 compreende um grupo removedor de elétrons.
27. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 26,
caracterizado por G5 e um dentre G3 e G4 serem tomados em conjunto para formar um anel saturado com 3 a 8 membros opcionalmente substituído tendo 0 a 3 heteroátomos além do nitrogênio de −NG5−.
28. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo oligonucleotídeo compreender uma ligação internucleotídica que tem a estrutura de .
29. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 28, caracterizado por G2 compreender um grupo removedor de elétrons.
30. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado por G2 ser −L'−S(O)2R', em que L' é –CH2− opcionalmente substituído.
31. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado por R' ser C1-6 alifático opcionalmente substituído.
32. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado por R' ser t-butila.
33. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado por R' ser fenila opcionalmente substituída.
34. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado por R' ser fenila.
35. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado por compreender um ou mais ciclos, cada um dos quais compreendendo ou consistindo independentemente em: 1) desbloqueio; 2) acoplamento; 3) opcionalmente um primeiro capping;
4) modificação; e 5) opcionalmente um segundo capping.
36. OLIGONUCLEOTÍDEO, caracterizado por compreender uma ligação internucleotídica que tem a estrutura da fórmula III: ,
III em que: PN é P(=N−L−R5), Q-, Q-, Q-, Q-, ou Q-; Q- é um ânion; e cada um dentre R1 e R5 é independentemente −H, −L−R', halogênio, −CN, −NO2, −L−Si(R')3, −OR', −SR', ou −N(R')2; cada um dentre Y e Z é independentemente –O–, –S–, –N(–L–R5)–, ou L; cada L é independentemente um grupo de ligação covalente, ou bivalente, linear ou ramificado opcionalmente substituído selecionado dentre um grupo alifático C1-30 e um grupo heteroalifático C1-30 tendo 1 a 10 heteroátomos, em que uma ou mais unidades de metileno são opcional e independentemente substituídas por C1-6 alquileno, C1-6 alquenileno, , um grupo heteroalifático C1–C6 bivalente tendo 1 a 5 heteroátomos, −C(R')2−, −Cy−, −O−, −S−, −S−S−,
−N(R')−, −C(O)−, −C(S)−, −C(NR')−, −C(O)N(R')−, −N(R')C(O)N(R')−, −N(R')C(O)O−, −S(O)−, −S(O)2−, −S(O)2N(R')−, −C(O)S−, −C(O)O−, −P(O)(OR')−, −P(O)(SR')−, −P(O)(R')−, −P(O)(NR')−, −P(S)(OR')−, −P(S)(SR')−, −P(S)(R')−, −P(S)(NR')−, −P(R')−, −P(OR')−, −P(SR')−, −P(NR')−, −P(OR')[B(R')3]−, −OP(O)(OR')O−, −OP(O)(SR')O−, −OP(O)(R')O−, −OP(O)(NR')O−, −OP(OR')O−, −OP(SR')O−, −OP(NR')O−, −OP(R')O−, ou −OP(OR')[B(R')3]O−, e um ou mais CH ou átomos de carbono são opcional e independentemente substituídos por CyL; cada −Cy− é independentemente um grupo bivalente opcionalmente substituído selecionado dentre um anel cicloalifático C3-20, um anel C6-20 arila, um anel heteroarila com 5 a 20 membros tendo 1 a 10 heteroátomos, e um anel heterociclila com 3 a 20 membros tendo 1 a 10 heteroátomos; cada CyL é independentemente um grupo trivalente ou tetravalente opcionalmente substituído selecionado dentre um anel cicloalifático C3-20, um anel C6-20 arila, um anel heteroarila com 5 a 20 membros tendo 1 a 10 heteroátomos, e um anel heterociclila com 3 a 20 membros tendo 1 a 10 heteroátomos; cada R' é independentemente −R, −C(O)R, −C(O)OR, ou −S(O)2R; cada R é independentemente −H, ou um grupo opcionalmente substituído selecionado dentre C1-30 alifático, C1-30 heteroalifático tendo 1 a 10 heteroátomos, C6-30 arila, C6- 30 arilalifático, C6-30 aril-heteroalifático tendo 1 a 10 heteroátomos, heteroarila com 5 a 30 membros tendo 1 a 10 heteroátomos, e heterociclila com 3 a 30 membros tendo 1 a 10 heteroátomos, ou dois grupos R são opcional e independentemente tomados em conjunto para formar uma ligação covalente, ou dois ou mais grupos R no mesmo átomo são opcional e independentemente tomados em conjunto para formar um anel monocíclico, bicíclico ou policíclico com 3 a 30 membros opcionalmente substituído tendo, além do átomo, 0 a 10 heteroátomos, ou dois ou mais grupos R em dois ou mais átomos são opcional e independentemente tomados em conjunto com seus átomos intervenientes para formar um anel monocíclico, bicíclico ou policíclico com 3 a 30 membros opcionalmente substituído tendo, além dos átomos intervenientes, 0 a 10 heteroátomos; e −X−L−R1 é , , , , , , , , ou , em que G2 compreende um grupo removedor de elétrons.
37. OLIGONUCLEOTÍDEO, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado por G2 ser −L'−S(O)2R', em que L' é –CH2− opcionalmente substituído.
38. OLIGONUCLEOTÍDEO, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado por R' ser C1-6 alifático opcionalmente substituído.
39. OLIGONUCLEOTÍDEO, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado por R' ser t-butila.
40. OLIGONUCLEOTÍDEO, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado por R' ser fenila opcionalmente substituída.
41. OLIGONUCLEOTÍDEO, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado por R' ser fenila.
42. OLIGONUCLEOTÍDEO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 41, caracterizado por R1 ser –C(O)R'.
43. OLIGONUCLEOTÍDEO, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado por R' ser –CH3.
44. OLIGONUCLEOTÍDEO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 41, caracterizado por Q− ser F−, Cl−, Br−, BF4−, PF6−, TfO−, Tf2N−, AsF6−, ClO4−, ou SbF6−.
45. OLIGONUCLEOTÍDEO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 44, caracterizado pelo oligonucleotídeo ser fixado a um suporte sólido.
46. OLIGONUCLEOTÍDEO, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo suporte sólido ser CPG.
47. MÉTODO PARA PREPARAR UM OLIGONUCLEOTÍDEO, caracterizado por compreender colocar um oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 46, em contato com uma base.
48. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo contato ser realizado substancialmente sem água.
49. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47 ou 48, caracterizado pelo contato ocorrer após o comprimento de oligonucleotídeo ser alcançado antes da desproteção e clivagem do oligonucleotídeo.
50. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47 a 49, caracterizado pela base ser uma base amina que tem a estrutura de NR3.
51. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pela base ser N, N-dietilamina.
52. OLIGONUCLEOTÍDEO, composto ou método caracterizado por ser de acordo com as modalidades exemplificativas 1 a 420.
53. OLIGONUCLEOTÍDEO, sendo que o oligonucleotídeo é caracterizado por ser WV-20104, WV-20103, WV-20102, WV- 20101, WV-20100, WV-20099, WV-20098, WV-20097, WV-20096, WV- 20095, WV-20094, WV-20106, WV-20119, WV-20118, WV-13739, WV- 13740, WV-9079, WV-9082, WV-9100, WV-9096, WV-9097, WV-9106, WV-9133, WV-9148, WV-9154, WV-9898, WV-9899, WV-9900, WV-9906, WV-9907, WV-9908, WV-9909, WV-9756, WV-9757, WV-9517, WV-9714, WV-9715, WV-9519, WV-9521, WV-9747, WV-9748, WV-9749, WV-9897, WV-9898, WV-9900, WV-9899, WV-9906, WV-9912, WV-9524, WV-9912, WV-9906, WV-9900, WV-9899, WV-9899, WV-9898, WV-9898, WV-9898, WV-9898, WV-9898, WV-9897, WV-9897, WV-9897, WV-9897, WV-9897, WV-9747, WV-9714, WV-9699, WV-9517, WV-9517, WV-13409, WV- 13408, WV-12887, WV-12882, WV-12881, WV-12880, WV-12880, WV- WV12880, WV-12878, WV-12877, WV-12877, WV-12876, WV-12873, WV- 12872, WV-12559, WV-12559, WV-12558, WV-12558, WV-12557, WV- 12556, WV-12556, WV-12555, WV-12555, WV-12554, WV-12553, WV- 12129, WV-12127, WV-12125, WV-12123, WV-11342, WV-11342, WV- 11341, WV-11341, WV-11340, WV-10672, WV-10671, WV-10670, WV- 10461, WV-10455, WV-9897, WV-9898, WV-13826, WV-13827, WV- 13835, WV-12880, WV-14344, WV-13864, WV-13835, WV-14791, WV- 14344, WV-13754, WV-13766,, WV-11086, WV-11089, WV-17859, WV- 17860, WV-20070, WV-20073, WV-20076, WV-20052, WV-20099, WV- 20049, WV-20085, WV-20087, WV-20034, WV-20046, WV-20052, WV- 20061, WV-20064, WV-20067, WV-20092, WV-20091, WV-20093, WV- 20084, WV-9738, WV-9739, WV-9740, WV-9741, WV-15860, WV-15862,
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Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107011400B (zh) 2012-07-13 2021-05-25 波涛生命科学有限公司 不对称辅助基团
MX2015000577A (es) 2012-07-13 2015-08-14 Wave Life Sciences Pte Ltd Control quiral.
KR102423317B1 (ko) 2014-01-16 2022-07-22 웨이브 라이프 사이언시스 리미티드 키랄 디자인
RU2708237C2 (ru) 2014-08-22 2019-12-05 Общество с ограниченной ответственностью "НооГен" Модифицированные олигонуклеотиды и способ их получения
MA43072A (fr) 2015-07-22 2018-05-30 Wave Life Sciences Ltd Compositions d'oligonucléotides et procédés associés
JP7286320B2 (ja) 2016-03-13 2023-06-05 ウェイブ ライフ サイエンシズ リミテッド ホスホラミダイト及びオリゴヌクレオチド合成のための組成物並びに方法
US11013757B2 (en) 2016-06-03 2021-05-25 Wave Life Sciences Ltd. Oligonucleotides, compositions and methods thereof
CN110088113A (zh) 2016-11-23 2019-08-02 波涛生命科学有限公司 用于亚磷酰胺和寡核苷酸合成的组合物和方法
CN111050806A (zh) 2017-06-02 2020-04-21 波涛生命科学有限公司 寡核苷酸组合物及其使用方法
US11597927B2 (en) 2017-06-02 2023-03-07 Wave Life Sciences Ltd. Oligonucleotide compositions and methods of use thereof
JP7402696B2 (ja) 2017-06-21 2023-12-21 ウェイブ ライフ サイエンシズ リミテッド 合成のための化合物、組成物、及び方法
JP2020534253A (ja) 2017-08-08 2020-11-26 ウェーブ ライフ サイエンシーズ リミテッド オリゴヌクレオチド組成物及びその方法
KR20200052369A (ko) 2017-09-18 2020-05-14 웨이브 라이프 사이언시스 리미티드 올리고뉴클레오티드 제조 기술
WO2019075357A1 (en) 2017-10-12 2019-04-18 Wave Life Sciences Ltd. OLIGONUCLEOTIDE COMPOSITIONS AND RELATED METHODS
WO2020028832A1 (en) 2018-08-02 2020-02-06 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies
US11168141B2 (en) 2018-08-02 2021-11-09 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies
EA202190416A1 (ru) 2018-08-02 2021-06-23 Дайн Терапьютикс, Инк. Мышечно-специфические комлексы и их применение для лечения плече-лопаточно-лицевой мышечной дистрофии
AU2020241559A1 (en) * 2019-03-20 2021-11-11 Wave Life Sciences Ltd. Technologies useful for oligonucleotide preparation
CN114555621A (zh) 2019-08-15 2022-05-27 Ionis制药公司 键修饰的寡聚化合物及其用途
WO2021125311A1 (ja) * 2019-12-19 2021-06-24 日本新薬株式会社 エクソンスキッピングを可能にするアンチセンス核酸
EP4153747A2 (en) 2020-05-22 2023-03-29 Wave Life Sciences Ltd. Double stranded oligonucleotide compositions and methods relating thereto
CN112430645A (zh) * 2020-12-09 2021-03-02 北京华瑞康源生物科技发展有限公司 一种多重实时荧光pcr法检测人dmd基因拷贝数的相对定量方法及试剂盒
IL309626A (en) 2021-06-23 2024-02-01 Nippon Shinyaku Co Ltd A combination of antisense oligomers
US11638761B2 (en) 2021-07-09 2023-05-02 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating Facioscapulohumeral muscular dystrophy
US11771776B2 (en) 2021-07-09 2023-10-03 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies
CA3226457A1 (en) * 2021-07-30 2023-02-02 Amy WALKER Nanoparticles and peptides for the delivery of cargos to muscle cells
EP4124345A1 (en) * 2021-07-30 2023-02-01 4basebio UK Ltd Nanoparticles for muscle delivery
WO2023014938A1 (en) * 2021-08-05 2023-02-09 Sanegene Bio Usa Inc. 1'-alkyl modified ribose derivatives and methods of use
WO2023152371A1 (en) 2022-02-14 2023-08-17 Proqr Therapeutics Ii B.V. Guide oligonucleotides for nucleic acid editing in the treatment of hypercholesterolemia
WO2023168014A2 (en) * 2022-03-02 2023-09-07 Wave Life Sciences Ltd. Oligonucleotide compositions and methods thereof for exon skipping
CN114600803B (zh) * 2022-03-15 2023-05-09 北京协和建昊医药技术开发有限责任公司 一种斑马鱼cyp3a4代谢酶抑制模型、建立方法及应用
WO2024013361A1 (en) 2022-07-15 2024-01-18 Proqr Therapeutics Ii B.V. Oligonucleotides for adar-mediated rna editing and use thereof
WO2024013360A1 (en) 2022-07-15 2024-01-18 Proqr Therapeutics Ii B.V. Chemically modified oligonucleotides for adar-mediated rna editing

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5852188A (en) * 1990-01-11 1998-12-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having chiral phosphorus linkages
ATE151076T1 (de) * 1990-07-02 1997-04-15 Hoechst Ag Oligonucleotid-analoge mit terminalen 3'-3'-bzw. 5'-5'-internucleotidverknüpfungen
US5512668A (en) * 1991-03-06 1996-04-30 Polish Academy Of Sciences Solid phase oligonucleotide synthesis using phospholane intermediates
US6242589B1 (en) * 1998-07-14 2001-06-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Phosphorothioate oligonucleotides having modified internucleoside linkages
AR040996A1 (es) * 2002-08-19 2005-04-27 Coley Pharm Group Inc Acidos nucleicos inmunoestimuladores
HUE028632T2 (en) * 2004-06-28 2016-12-28 Univ Western Australia To skip an antisense oligonucleotide exon and use it for procedures
JP2006248949A (ja) * 2005-03-09 2006-09-21 Univ Nagoya ヌクレオシド誘導体、ヌクレオチド誘導体及びそれらの製造方法
ES2564563T3 (es) * 2007-10-26 2016-03-23 Academisch Ziekenhuis Leiden Medios y métodos para contrarrestar trastornos del músculo
ES2616051T3 (es) * 2008-12-02 2017-06-09 Wave Life Sciences Japan, Inc. Método para la síntesis de ácidos nucleicos modificados en el átomo de fósforo
RU2674600C2 (ru) * 2012-07-03 2018-12-11 Просенса Текнолоджиз Б.В. Олигонуклеотид для лечения пациентов с мышечной дистрофией
MX2015000577A (es) * 2012-07-13 2015-08-14 Wave Life Sciences Pte Ltd Control quiral.
JP6246121B2 (ja) * 2012-07-13 2017-12-13 株式会社新日本科学 キラル核酸アジュバント
KR102423317B1 (ko) * 2014-01-16 2022-07-22 웨이브 라이프 사이언시스 리미티드 키랄 디자인
RU2708237C2 (ru) * 2014-08-22 2019-12-05 Общество с ограниченной ответственностью "НооГен" Модифицированные олигонуклеотиды и способ их получения
MA43072A (fr) * 2015-07-22 2018-05-30 Wave Life Sciences Ltd Compositions d'oligonucléotides et procédés associés
BR112018006636B1 (pt) * 2015-10-09 2023-03-28 Wave Life Sciences Ltd Composição de oligonucleotídeo, composição farmacêutica e uso da composição de oligonucleotídeo
US11013757B2 (en) * 2016-06-03 2021-05-25 Wave Life Sciences Ltd. Oligonucleotides, compositions and methods thereof

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