ES2616051T3

ES2616051T3 - Método para la síntesis de ácidos nucleicos modificados en el átomo de fósforo

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Publication number: ES2616051T3
Application number: ES09808955.0T
Authority: ES
Inventors: Takeshi Wada; Mamoru Shimizu
Original assignee: Wave Life Sciences Japan Inc
Current assignee: Wave Life Sciences Japan Inc
Priority date: 2008-12-02
Filing date: 2009-12-02
Publication date: 2017-06-09
Anticipated expiration: 2029-12-02
Also published as: AU2009323766A1; RU2015151857A; EP2370451A2; CA2744987C; WO2010064146A2; US20180111958A1; US20160347780A1; KR20110126588A; AU2009323766B2; CN102282155A; JP2012510460A; EP2370451B1; WO2010064146A3; US10329318B2; JP5645840B2; JP2015044842A; US20110294124A1; SG171914A1; CN102282155B; JP6038860B2

Abstract

Un metodo para una sintesis de un acido nucleico que comprende un resto de fosfonato quiral, comprendiendo el metodo: hacer reaccionar un nucleosido que comprende un resto de H-fosfonato aquiral, un reactivo quiral y un nucleosido que comprende un resto 5'-OH, para formar un producto intermedio de oligonucleotido; y convertir el producto intermedio de oligonucleotido en el acido nucleico que comprende un resto de fosfonato quiral; en el que: el acido nucleico que comprende un resto de fosfonato quiral es un compuesto de formula 1:**Fórmula** en la que: R1 es -OH, -SH, -NRdRd, -N3, halogeno, hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y1-, alquenil-Y1-, alquinil- Y1-, aril-Y1-, heteroaril-Y1-, -P(O)(Re)2, -HP(O)(Re), -ORa o -SRc; Y1 es O, NRd, S o Se; Ra es un resto de bloqueo; Rc es un grupo de bloqueo; cada caso de Rd es independientemente hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, acilo, sililo sustituido, carbamato, -P(O)(Re)2 o -HP(O)(Re); cada caso de Re es independientemente hidrogeno, alquilo, arilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y2-, alquenil-Y2-, alquinil-Y2-, aril-Y2- o heteroaril-Y2-, o un cation que es Na+1, Li+1 o K+1; Y2 es O, S o NRd; en donde cada caso de Rd en Y2 es independientemente hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, acilo, sililo sustituido, carbamato; cada caso de R2 es independientemente hidrogeno, -OH, -SH, -NRdRd, -N3, halogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y1-, alquenil-Y1-, alquinil-Y1-, aril-Y1-, heteroaril-Y1-, -ORb o -SRc, en donde Rb es un resto de bloqueo; cada caso de Ba es independientemente una adenina bloqueada o no bloqueada, citosina, guanina, timina, uracilo o nucleobase modificada; cada caso de X es independientemente alquilo, alcoxi, arilo, alquiltio, acilo, -NRfRf, alqueniloxi, alquiniloxi, alqueniltio, alquiniltio, -S-Z+, -Se-Z+ o -BH3 -Z+; cada caso de Rf es independientemente hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo o arilo; Z+ es ion amonio, ion alquilamonio, ion imino heteroaromatico o ion imino heterociclico, cualquiera de los cuales es primario, secundario, terciario o cuaternario, o Z+ es un ion metalico monovalente; R3 es hidrogeno, un grupo de bloqueo, un resto de enlace conectado a un soporte solido o un resto de enlace conectado a un acido nucleico; y n es un numero entero de 1 a 200; y en donde cada resto estereogenico del compuesto de formula 1 tiene opcionalmente mas del 98 % de pureza diaestereomerica como se ha determinado por espectroscopia de RMN 31P o HPLC de fase inversa; el nucleosido que comprende un resto de H-fosfonato aquiral es un compuesto de formula 2:**Fórmula** en la que: R1 es -NRdRd, -N3, halogeno, hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y1-, alquenil-Y1-, alquinil-Y1-, aril-Y1-, heteroaril-Y1-, -P(O)(Re)2, -HP(O)(Re), -ORa o -SRc; Y1 es O, NRd, S o Se; R3 es un resto de bloqueo; Rc es un grupo de bloqueo; cada caso de Rd es independientemente hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, acilo, sililo sustituido, carbamato, -P(O)(Re)2 o -HP(O)(Re); cada caso de Re es independientemente alquilo, arilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y2-, alquenil-Y2-, alquinil-Y2-, aril-Y2- o heteroaril-Y2-; Y2 es O, S o NRd; en donde cada caso de Rd en Y2 es independientemente hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, acilo, sililo sustituido, carbamato; R2 es hidrogeno, -NRdRd, -N3, halogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y1-, alquenil-Y1-, alquinil-Y1-, aril-Y1-, heteroaril-Y1-, -ORb o -SRc, en donde Rb es un resto de bloqueo; y Ba es una adenina bloqueada o no bloqueada, citosina, guanina, timina, uracilo o nucleobase modificada; y Z+ es ion amonio, ion alquilamonio, ion imino heteroaromatico o ion imino heterociclico, cualquiera de los cuales es primario, secundario, terciario o cuaternario, o un ion metalico monovalente; el reactivo quiral es un compuesto de formula 3:**Fórmula** en la que: W1 y W2 son independientemente -NG5-, -O- o -S-; G1, G2, G3, G4 y G5 son independientemente hidrogeno, alquilo, aralquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heterociclilo, heteroarilo o arilo, o dos de G1, G2, G3, G4 y G5 son independientemente G6, en donde dos G6 se toman conjuntamente para formar un anillo carbociclico saturado, parcialmente insaturado o insaturado, o que contiene un heteroatomo de hasta 20 atomos de anillo que es monociclico o policiclico, condensado o no condensado, y en donde no mas de cuatro de G1, G2, G3, G4 y G5 son G6; el nucleosido que comprende un resto 5'-OH es un compuesto de formula 4:**Fórmula** en la que: cada caso de R2 es independientemente hidrogeno, -NRdRd, -N3, halogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, alquil- Y1-, alquenil-Y1-, alquinil-Y1-, aril-Y1-, heteroaril-Y1-, -ORb o -SRc, en donde Rb es un resto de bloqueo; Y1 es O, NRd, S o Se; Rc es un grupo de bloqueo; cada caso de Rd es independientemente hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, acilo, sililo sustituido, carbamato, -P(O)(Re)2 o -HP(O)(Re); cada caso de Re es independientemente alquilo, arilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y2-, alquenil-Y2-, alquinil-Y2-, aril-Y2- o heteroaril-Y2-; Y2 es O, S o NRd; en donde cada caso de Rd en Y2 es independientemente hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, acilo, sililo sustituido, carbamato; cada caso de Ba es independientemente una adenina bloqueada o no bloqueada, citosina, guanina, timina, uracilo o nucleobase modificada; m es un numero entero de 0 a n-1; n es un numero entero de 1 a 200; OA esta conectado a un resto de tritilo, un resto de sililo, un resto de acetilo, un resto de acilo, un resto de arilacilo, un resto de enlace conectado a un soporte solido o un resto de enlace conectado a un acido nucleico; J es O y D es H, o J es S, Se o BH3 y D es un ligando quiral o un resto de formula A:**Fórmula** en la que: W1 y W2 son independientemente NHG5, OH o SH; A es hidrogeno, resto de acilo, arilo, alquilo, aralquilo o sililo; y en la que G1, G2, G3, G4 y G5 son independientemente hidrogeno, alquilo, aralquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heterociclilo, heteroarilo o arilo, o dos de G1, G2, G3, G4 y G5 son independientemente G6, en donde dos G6 se toman conjuntamente para formar un anillo carbociclico saturado, parcialmente insaturado o insaturado, o que contiene un heteroatomo de hasta 20 atomos de anillo que es monociclico o policiclico, condensado o no condensado, y en donde no mas de cuatro de G1, G2, G3, G4 y G5 son G6; y el producto intermedio de oligonucleotido tiene la estructura de:**Fórmula** en la que: W1 y W2 son independientemente NHG5, OH o SH;**Fórmula** G1, G2, G3, G4 y G5 son independientemente hidrogeno, alquilo, aralquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heterociclilo, heteroarilo o arilo, o dos de G1, G2, G3, G4 y G5 son independientemente G6, en donde dos G6 se 30 toman conjuntamente para formar un anillo carbociclico saturado, parcialmente insaturado o insaturado, o que contiene un heteroatomo de hasta 20 atomos de anillo que es monociclico o policiclico, condensado o no condensado, y en donde no mas de cuatro de G1, G2, G3, G4 y G5 son G6; R1 es -OH, -SH, -NRdRd, -N3, halogeno, hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y1-, alquenil-Y1-, alquinil- Y1-, aril-Y1-, heteroaril-Y1-, -P(O)(Re)2, -HP(O)(Re), -ORa o -SRc; Y1 es O, NRd, S o Se; R3 es un resto de bloqueo; Rc es un grupo de bloqueo; cada caso de Rd es independientemente hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, acilo, sililo sustituido, carbamato, -P(O)(Re)2 o -HP(O)(Re); cada caso de Re es independientemente hidrogeno, alquilo, arilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y2-, alquenil-Y2-, alquinil-Y2-, aril-Y2- o heteroaril-Y2-; Y2 es O, S o NRd; en donde cada caso de Rd en Y2 es independientemente hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, acilo, sililo sustituido, carbamato; cada caso de R2 es independientemente hidrogeno, -OH, -SH, -NRdRd, -N3, halogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y1-, alquenil-Y1-, alquinil-Y1-, aril-Y1-, heteroaril-Y1-, -ORb o -SRc, en donde Rb es un resto de bloqueo; cada caso de Ba es independientemente una adenina bloqueada o no bloqueada, citosina, guanina, timina, uracilo o nucleobase modificada; y R3 es hidrogeno, un grupo de bloqueo, un resto de enlace conectado a un soporte solido o un resto de enlace conectado a un acido nucleico.

Description

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DESCRIPCION

Metodo para la smtesis de acidos nucleicos modificados en el atomo de fosforo Campo de la invencion

En el presente documento se describen metodos de smtesis de acidos nucleicos modificados en el atomo de fosforo que comprenden restos de X-fosfonato quirales. Los metodos descritos en el presente documento proporcionan acidos nucleicos modificados en el esqueleto con una alta pureza diaestereomerica mediante una reaccion asimetrica de una molecula aquiral que comprende un resto de H-fosfonato quimicamente estable con un nucleosido/nucleotido.

Antecedentes de la invencion

Los oligonucleotidos son utiles en aplicaciones terapeuticas, de diagnostico, de investigacion y nuevas aplicaciones y en nanomateriales. El uso de secuencias naturales de ADN o ARN esta limitado por su estabilidad a las nucleasas. Adicionalmente, estudios in vitro han mostrado que las propiedades de nucleotidos antisentido tales como afinidad de union, union especifica de secuencia al ARN complementario, estabilidad a nucleasas, estan afectados por las configuraciones de los atomos de fosforo. Por tanto, hay una necesidad en el campo de metodos de produccion de oligonucleotidos que sean estereocontrolados en el fosforo y presenten estabilidad deseada a la degradacion, mientras que retienen la afinidad por secuencias de ADN/aRn complementario exogeno o endogeno. Existe la necesidad de que estos compuestos sean facilmente sintetizados sobre soporte solido o en solucion, y de permitir un amplio intervalo de modificaciones sinteticas en los azucares o nucleobases del oligonucleotido.

En el presente documento se describen smtesis estereocontroladas de acidos nucleicos polimericos y oligomericos modificados en el atomo de fosforo, que en algunas realizaciones, se realiza sobre soporte solido.

Sumario de la invencion

Se describe un metodo para una smtesis de un acido nucleico que comprende un resto de X-fosfonato quiral, que comprende hacer reaccionar una molecula que comprende un resto de H-fosfonato aquiral y un nucleosido que comprende un resto 5'-OH para formar un producto intermedio condensado; y convertir el producto intermedio condensado en el acido nucleico que comprende un resto de X-fosfonato quiral.

En algunas realizaciones, el metodo en el que la etapa de hacer reaccionar la molecula que comprende un resto de H-fosfonato aquiral y el nucleosido que comprende un resto 5'-OH para formar un producto intermedio condensado es una reaccion de una sola etapa.

En algunas realizaciones, el metodo proporciona un acido nucleico que comprende un resto de X-fosfonato quiral de formula 1.

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Formula 1

En algunas realizaciones del compuesto de formula 1, R1 es -OH, -SH, -NRdRd, -N3, halogeno, hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y1-, alquenil-Y1-, alquinil-Y1-, aril-Y1-, heteroaril-Y1-, -P(O)(Re)2, - HP(O)(Re), -ORa o -SRc. Y1 es O, NRd, S o Se. Ra es un resto de bloqueo. Rc es un grupo de bloqueo. Cada caso de Rd es independientemente hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, acilo, sililo sustituido, carbamato, -P(O)(Re)2 o - HP(O)(Re). Cada caso de Re es independientemente hidrogeno, alquilo, arilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y2-, alquenil- Y2-, alquinil-Y2-, aril-Y2- o heteroaril-Y2-, o un cation que es Na+1, Li+1 o K+1. Y2 es O, NRd o S. Cada caso de R2 es independientemente hidrogeno, -OH, -SH, -NRdRd, -N3, halogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y1-, alquenil-Y1-, alquinil-Y1-, aril-Y1-, heteroaril-Y1-, -ORb o -SRc, en el que Rb es un resto de bloqueo. Cada caso de Ba es independientemente una adenina bloqueada o no bloqueada, citosina, guanina, timina, uracilo o nucleobase modificada. Cada caso de X es independientemente alquilo, alcoxi, arilo, alquiltio, acilo, -NRfRf, alqueniloxi, alquiniloxi, alqueniltio, alquiniltio, -S-Z+, -Se-Z+ o -BH3-Z+. Cada caso de Rf es independientemente hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo o arilo. Z+ es ion amonio, ion alquilamonio, ion imino heteroaromatico o ion imino heterociclico,

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cualquiera de los cuales es primario, secundario, terciario o cuaternario, o Z es un ion metalico monovalente. R3 es hidrogeno, un grupo de bloqueo, un resto de enlace conectado a un soporte solido o un resto de enlace conectado a un acido nucleico; y n es un numero entero de 1 a aproximadamente 200.

En algunas realizaciones del metodo, cada resto de X-fosfonato del compuesto de formula 1 tiene mas del 98 % de pureza diaestereomerica como se ha determinado por espectroscopia de RMN 31P o HPLC de fase inversa. En algunas realizaciones del metodo, cada resto de X-fosfonato tiene una configuration Rp. En otras realizaciones del metodo, cada resto de X-fosfonato tiene una configuracion Sp. En otras realizaciones del metodo, cada X-fosfonato tiene independientemente una configuracion Rp o una configuracion Sp.

En realizaciones adicionales del metodo, la molecula que comprende un resto de H-fosfonato aquiral es un compuesto de formula 2.

imagen2

Formula 2

En la formula 2, R1 es -NRdRd, -N3, halogeno, hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y1-, alquenil-Y1-, alquinil- Y1-, aril-Y1-, heteroaril-Y1-, -P(O)(Re)2, -HP(O)(Re), -ORa o -SRc. Y1 es O, NRd, S o Se. Ra es un resto de bloqueo. Rc es un grupo de bloqueo. Cada caso de Rd es independientemente hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, acilo, sililo sustituido, carbamato, -P(O)(Re)2 o -HP(O)(Re). Cada caso de Re es independientemente alquilo, arilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y2-, alquenil-Y2-, alquinil-Y2-, aril-Y2- o heteroaril-Y2-. Y2 es O, NRd o S. R2 es hidrogeno, - NRdRd, N3, halogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y1-, alquenil-Y1-, alquinil-Y1-, aril-Y1-, heteroaril-Y1-, -ORb o - SRc, en el que Rb es un resto de bloqueo. Ba es una adenina bloqueada o no bloqueada, citosina, guanina, timina, uracilo o nucleobase modificada. Z+ es ion amonio, ion alquilamonio, ion imino heteroaromatico o ion imino heterociclico, cualquiera de los cuales es primario, secundario, terciario o cuaternario, o un ion metalico monovalente.

En algunas realizaciones del metodo, el metodo comprende ademas un reactivo quiral. En aun otras realizaciones del metodo, el reactivo quiral es un compuesto de formula 3.

imagen3

Formula 3

W1 y W2 son independientemente -NG5-, -O- o -S-. G1, G2, G3, G4 y G5 son independientemente hidrogeno, alquilo, aralquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heterociclilo, hetarilo o arilo, o dos de G1, G2, G3, G4 y G5 son G6 que tomados conjuntamente forman un anillo carbociclico saturado, parcialmente insaturado o insaturado, o que contiene heteroatomo de hasta aproximadamente 20 atomos de anillo que es monociclico o policiclico, condensado o no condensado, y en el que no mas de cuatro de G1, G2, G3, G4 y G5 son G 6.

En algunas realizaciones del metodo, el nucleosido que comprende un resto 5'-OH es un compuesto de formula 4.

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Cada caso de R2 es independientemente hidrogeno, -NRdRd, N3, halogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y1-, alquenil-Y1-, alquinil-Y1-, aril-Y1-, heteroaril-Y1-, -ORb o -SRc, en el que Rb es un resto de bloqueo. Y1 es O, NRd, S o

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Se. Rc es un grupo de bloqueo. Cada caso de Rd es independientemente hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, acilo, sililo sustituido, carbamato, -P(O)(Re)2 o -HP(O)(Re). Cada caso de Re es independientemente alquilo, arilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y2-, alquenil-Y2-, alquinil-Y2-, aril-Y2- o heteroaril-Y2-. Y2 es O, NRd o S. Cada caso de Ba es independientemente una adenina bloqueada o no bloqueada, citosina, guanina, timina, uracilo o nucleobase modificada. m es un numero entero de 0 a n-1. n es un numero entero de 1 a aproximadamente 200. Oa esta conectado a un resto de tritilo, un resto de sililo, un resto de acetilo, un resto de acilo, un resto de arilacilo, un resto de enlace conectado a un soporte solido o un resto de enlace conectado a un acido nucleico. J es O y D es H, o J es S, Se o BH3 y D es un ligando quiral Ci o un resto de formula A.

A

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G3 G2

Formula A

En la formula A, Wi y W2 son independientemente NHG5, OH o SH. A es hidrogeno, acilo, arilo, alquilo, aralquilo, o un resto de sililo. G1, G2, G3, G4 y G5 son independientemente hidrogeno, alquilo, aralquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heterociclilo, heteroarilo o arilo, o dos de G1, G2, G3, G4 y G5 son G6 que tomados conjuntamente forman un anillo carbociclico saturado, parcialmente insaturado o insaturado, o que contiene heteroatomo de hasta aproximadamente 20 atomos de anillo que es monociclico o policiclico, condensado o no condensado, y en el que no mas de cuatro de G1, G2, G3, G4 y G5 son G6.

En aun otras realizaciones del metodo, el metodo comprende ademas proporcionar un reactivo de condensacion Cr por el que la molecula que comprende un resto de H-fosfonato aquiral se activa para reaccionar con el reactivo quiral para formar un producto intermedio quiral.

En realizaciones adicionales del metodo, el reactivo de condensacion Cr es Ar3PL2, (ArO)3PL2,

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Z1, Z2, Z3, Z4, Z5, Z6, Z7, Z8, Z9 y Z10 son independientemente alquilo, aminoalquilo, cicloalquilo, heterociclico,

cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, alquiloxi, ariloxi o heteroariloxi, o en los que cualquiera de Z2 y Z3, Z5 y Z6, Z7 y Z8, Z8 y Z9, Z9 y Z7, o Z7 y Z8 y Z9, se toman conjuntamente para formar un anillo aliciclico o heterociclico de 3 a 20 miembros. Q- es un contraion, L es un grupo saliente y w es un numero entero de 0 a 3. Ar es arilo, heteroarilo, y/o uno del grupo Ar esta unido al soporte de polimero. En algunas realizaciones del metodo, el contraion del reactivo de condensacion Cr es Cl-, Br-, BF4-, PF6-, TfO-, Tf2N-, AsF6-, ClO4- o SbF6-, en el Tf es

CF3SO2. En otras realizaciones del metodo, el grupo saliente del reactivo de condensacion Cr es F, Cl, Br, I, 3-nitro- 1,2,4-triazol, imidazol, alquiltriazol, tetrazol, pentafluorobenceno o 1-hidroxibenzotriazol.

En algunas realizaciones del metodo, el reactivo de condensacion es fosgeno, cloroformiato de triclorometilo, bis(triclorometil)carbonato (BTC), cloruro de oxalilo, Ph3PCl2, (PhO)3PCh, cloruro N,N'-bis(2-oxo-3- oxazolidinil)fosfmico (BopCl), hexafluorofosfato de 1,3-dimetil-2-(3-nitro-1,2,4-triazol-1-il)-2-pirrolidin-1-il-1,3,2- diazafosfolidinio (MNTP) o hexafluorofosfato de 3-nitro-1,2,4-triazol-1-il-tris(pirrolidin-1-il)fosfonio (PyNTP).

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En otra realization del metodo, el metodo comprende ademas proporcionar un reactivo de activation Ar. En una realizacion, el reactivo de activacion AR es

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en el que Z11, Z12, Z13, Z14, Z15, Z16, Z17, Z18, Z19, Z20 y Z21 son independientemente hidrogeno, alquilo, aminoalquilo,

cicloalquilo, heterodclico, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, alquiloxi, ariloxi o heteroariloxi, o en el que cualquiera de Z11 y Z12, Z11 y Z13, Z11 y Z14, Z12 y Z13, Z12 y Z14, Z13 y Z14, Z15 y Z16, Z15 y Z17, Z16 y Z17, Z18 y Z19, o Z20 y Z21, se toman conjuntamente para formar un anillo alidclico o heterodclico de 3 a 20 miembros, o para formar un anillo aromatico de 5 o 20 miembros; y Q- es un contraion. En una realizacion, el contraion del reactivo de activacion Ar es Cl-, Br-, BF4-, PF6-, TfO-, Tf2N-, AsF6-, ClO4- o SbF6-, en el que Tf es CF3SO2. En una realizacion, el reactivo de activacion Ar es imidazol, 4,5-dicianoimidazol (DCI), 4,5-dicloroimidazol, triflato de 1-fenilimidazolio (PhIMT), triflato de bencimidazolio (BIT), benzotriazol, 3-nitro-1,2,4-triazol (NT), tetrazol, 5-etiltiotetrazol, 5-(4- nitrofenil)tetrazol, triflato de N-cianometilpirrolidinio (CMPT), triflato de N-cianometilpiperidinio, triflato de N- cianometildimetilamonio. En otra realizacion, el reactivo de activacion Ar es 4,5-dicianoimidazol (DCI), triflato de 1- fenilimidazolio (PhIMT), triflato de bencimidazolio (BIT), 3-nitro-1,2,4-triazol (NT), tetrazol o triflato de N- cianometilpirrolidinio (CMPT).

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En una realizacion, el reactivo de activacion Ar es triflato de N-cianometilpirrolidinio (CMPT).

En algunas realizaciones del metodo, la reaccion se realiza en un disolvente organico aprotico. En otras realizaciones del metodo, el disolvente es acetonitrilo, piridina, tetrahidrofurano o diclorometano. En otras realizaciones del metodo, cuando el disolvente organico aprotico no es basico, esta presente una base en la etapa de reaccion. En algunas realizaciones del metodo, la base es piridina, quinolina o N,N-dimetilanilina. En algunas realizaciones del metodo, la base es

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en la que Z22 y Z23 son independientemente alquilo, aminoalquilo, cicloalquilo, heterodclico, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, alquiloxi, ariloxi o heteroariloxi, o en la que cualquiera de Z22 y Z23 se toman conjuntamente para formar un anillo alidclico o heterodclico de 3 a 10 miembros. En algunas realizaciones del metodo, la base es N-cianometilpirrolidina. En algunas realizaciones del metodo, el disolvente organico aprotico es anhidro. En otras realizaciones del metodo, el disolvente organico aprotico anhidro se acaba de destilar. En aun otras realizaciones del metodo, el disolvente organico aprotico anhidro que se acaba de destilar es piridina. En otra realizacion del metodo, el disolvente organico aprotico anhidro que se acaba de destilar es acetonitrilo.

En algunas realizaciones del metodo, la etapa de convertir el producto intermedio condensado en un compuesto de

formula 1 comprende: modificar el producto intermedio condensado para producir un compuesto de formula 5.

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En la formula 5, R1 es -NRdRd, -N3, halogeno, hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y1-, alquenil-Y1-, alquinil- Y1-, aril-Y1-, heteroaril-Y1-, -P(O)(Re)2, -HP(O)(Re), -ORa o -SRc. Y1 es O, NRd, S o Se. Ra es un resto de bloqueo. Rc

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es un grupo de bloqueo. Cada caso de Rd es independientemente hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, acilo, sililo sustituido, carbamato, -P(O)(Re)2 o -HP(O)(Re). Cada caso de Re es independientemente alquilo, arilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y2-, alquenil-Y2-, alquinil-Y2-, aril-Y2- o heteroaril-Y2-. Y2 es O, NRd o S. Cada caso de R2 es independientemente hidrogeno, -NRdRd, N3, halogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y1-, alquenil-Y1-, alquinil- Y1-, aril-Y1-, heteroaril-Y1-, -ORb o -SRc, en el que Rb es un resto de bloqueo. Cada caso de Ba es independientemente una adenina bloqueada o no bloqueada, citosina, guanina, timina, uracilo, o nucleobase modificada. Cada caso de J es S, Se o BH3. v es un numero entero de 1. Oa esta conectado a un resto de enlace conectado a un soporte solido o un resto de enlace conectado a un acido nucleico. A es un resto de acilo, arilo, alquilo, aralquilo o de sililo. G1, G2, G3, G4 y G5 son independientemente hidrogeno, alquilo, aralquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heterociclilo, heteroarilo o arilo, o dos de G1, G2, G3, G4 y G5 son G6 que tomados conjuntamente forman un anillo carbodclico saturado, parcialmente insaturado o insaturado, o que contiene heteroatomo de hasta aproximadamente 20 atomos de anillo que es monodclico o polidclico, condensado o no condensado, y en el que no mas de cuatro de G1, G2, G3, G4 y G5 son G6.

En algunas realizaciones del metodo, la etapa de convertir el producto intermedio condensado en un compuesto de formula 1 comprende: terminar el producto intermedio condensado y modificar el producto intermedio condensado terminado para producir un compuesto de formula 5.

imagen12

Formula 5

V

En la formula 5, R1 es -NRdRd, -N3, halogeno, hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y1-, alquenil-Y1-, alquinil- Y1-, aril-Y1-, heteroaril-Y1-, -P(O)(Re)2, -HP(O)(Re), -ORa o -SRc. Y1 es O, NRd, S o Se. Ra es un resto de bloqueo. Rc es un grupo de bloqueo. Cada caso de Rd es independientemente hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, acilo, sililo sustituido, carbamato, -P(O)(Re)2 o -HP(O)(Re). Cada caso de Re es independientemente alquilo, arilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y2-, alquenil-Y2-, alquinil-Y2-, aril-Y2- o heteroaril-Y2-. Y2 es O, NRd o S. Cada caso de R2

es independientemente hidrogeno, -NRdRd, N3, halogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y1-, alquenil-Y1-, alquinil- Y1-, aril-Y1-, heteroaril-Y1-, -ORb o -SRc, en el que Rb es un resto de bloqueo. Cada caso de Ba es independientemente una adenina bloqueada o no bloqueada, citosina, guanina, timina, uracilo o nucleobase modificada. Cada caso de J es S, Se o BH3. v es un numero entero de 2 a n-1. Oa esta conectado a un resto de enlace conectado a un soporte solido o un resto de enlace conectado a un acido nucleico. A es un resto de acilo, arilo, alquilo, aralquilo o de sililo. G1, G2, G3, G4 y G5 son independientemente hidrogeno, alquilo, aralquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heterociclilo, heteroarilo o arilo, o dos de G1, G2, G3, G4 y G5 son G6 que tomados conjuntamente forman un anillo carbociclico saturado, parcialmente insaturado o insaturado, o que contiene heteroatomo de hasta aproximadamente 20 atomos de anillo que es monodclico o polidclico, condensado o no condensado, y en el que no mas de cuatro de G1, G2, G3, G4 y G5 son G6.

En algunas realizaciones del metodo, el metodo comprende ademas las etapas de: (a) desbloquear R1 del compuesto de formula 5 para producir un compuesto de formula 4 en la que m es al menos 1, J es S, Se o BH3 y D es un resto de formula A; (b) hacer reaccionar el compuesto de formula 4 usando el metodo de la reivindicacion 10 en la que la etapa de convertir el producto intermedio condensado comprende terminar el producto intermedio condensado y modificar el producto intermedio condensado terminado para producir un compuesto de formula 5 en la que v es mayor de 2 y menor de aproximadamente 200; y (c) opcionalmente repetir las etapas (a) y (b) para formar un compuesto de formula 5 en la que v es mayor de 3 y menor de aproximadamente 200.

En otras realizaciones del metodo, el metodo comprende ademas la etapa de convertir el compuesto de formula 5 en el compuesto de formula 1 en la que cada resto Ba no esta bloqueado. R1 es -OH, -SH, - NRdRd, -N3, halogeno, hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y1-, alquenil-Y1-, alquinil-Y1-, aril-Y1-, heteroaril-Y1-, -P(O)(Re)2, - HP(O)(Re), -ORa o -SRc. Y1 es O, NRd, S o Se. Ra es un resto de bloqueo. Rc es un grupo de bloqueo. Cada caso de Rd es independientemente hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, acilo, sililo sustituido, carbamato, -P(O)(Re)2 o -HP(O)(Re). Cada caso de Re es independientemente hidrogeno, alquilo, arilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y2-, alquenil-Y2-, alquinil-Y2-, aril-Y2- o heteroaril-Y2-, o un cation que es Na+1, Li+1 o K+1. Y2 es O, NRd o S. Cada caso de R2 es independientemente hidrogeno, -OH, -SH, -NRdRd, -N3, halogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y1-, alquenil-Y1-, alquinil-Y1-, aril-Y1-, heteroaril-Y1-, -ORb o -SRc, en el que Rb es un resto de bloqueo. R3 es H. Cada caso de X es independientemente -S-Z+, -Se-Z+ o -BH3-Z+. Z+ es ion amonio, ion alquilamonio, ion imino heteroaromatico o ion imino heterodclico, cualquiera de los cuales es primario, secundario, terciario o cuaternario, o Z es un ion metalico monovalente.

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En algunas realizaciones del metodo, la etapa de convertir el producto intermedio condensado en un compuesto de formula 1 comprende acidificar el producto intermedio condensado para producir un compuesto de formula 4, en la que m es al menos uno, J es O, y D es H. En algunas realizaciones del metodo, el producto intermedio condensado comprende un resto de formula A'.

imagen13

Formula A'

A es hidrogeno y G1 y G2 son independientemente alquilo, aralquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heteroarilo o arilo y G3, G4 y G5 son independientemente hidrogeno, alquilo, aralquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heterociclilo, heteroarilo o arilo, o dos de G1, G2, G3, G4 y G5 son G6 que tomados conjuntamente forman un anillo carbociclico saturado, parcialmente insaturado o insaturado, o que contiene heteroatomo de hasta aproximadamente 20 atomos de anillo que es monociclico o policiclico, condensado o no condensado, y en el que no mas de cuatro de G1, G2, G3, G4 y G5 son G6.

En algunas realizaciones del metodo, el metodo comprende ademas: (a) hacer reaccionar el compuesto de formula 4 en la que m es al menos uno, J es O, y D es H, usando el metodo de la reivindicacion 10 en el que la etapa de convertir el producto intermedio condensado en un compuesto de formula 1 comprende acidificar el producto intermedio condensado para producir un compuesto de formula 4 en la que m es al menos 2 y menor de aproximadamente 200; J es O, y D es H, y (b) opcionalmente repetir la etapa (a) para producir un compuesto de formula 4 en la que m es mayor de 2 y menor de aproximadamente 200.

En algunas realizaciones del metodo, la acidificacion comprende anadir una cantidad de un acido de Br0nsted o de Lewis eficaz para convertir el producto intermedio condensado en el compuesto de formula 4 sin eliminar los restos de purina o pirimidina del producto intermedio condensado. En otras realizaciones del metodo, la acidificacion comprende anadir 1 % de acido trifluoroacetico en un disolvente organico, 3 % de acido dicloroacetico en un disolvente organico, o 3 % de acido tricloroacetico en un disolvente organico. En aun otras realizaciones del metodo, la acidificacion comprende ademas anadir un secuestrante de cationes. En algunas realizaciones del metodo, el secuestrante de cationes es trietilsilano o triisopropilsilano.

En algunas realizaciones del metodo, la etapa de convertir el producto intermedio condensado en un compuesto de formula 1 comprende ademas desbloquear R1 antes de la etapa de acidificar el producto intermedio condensado.

En otras realizaciones del metodo, el metodo comprende ademas la etapa de modificar el compuesto de formula 4 para introducir un resto X produciendo asi un compuesto de formula 1 en la que R3 es un grupo de bloqueo o un resto de enlace conectado a un soporte solido.

En aun otras realizaciones del metodo, el metodo comprende ademas tratar un compuesto modificado con X para producir un compuesto de formula 1 en la que R1 es -OH, -SH, -NRdRd, -N3, halogeno, hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y1-, alquenil-Y1-, alquinil-Y1-, aril-Y1-, heteroaril-Y1-, -P(O)(Re)2, -HP(O)(Re), - ORa o -SRc. Y1 es O, NRd, S o Se. Ra es un resto de bloqueo. Rc es un grupo de bloqueo. Cada caso de Rd es independientemente hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, acilo, sililo sustituido, carbamato, -P(O)(Re)2 o - HP(O)(Re). Cada caso de Re es independientemente hidrogeno, alquilo, arilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y2-, alquenil-Y2-, alquinil-Y2-, aril-Y2- o heteroaril-Y2-, o un cation que es Na+1, Li+1 o K+1. Y2 es O, NRd o S. Cada caso de R2 es independientemente

hidrogeno, -OH, -SH, -NRdRd, -N3, halogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y1-, alquenil-Y1-, alquinil-Y1-, aril-Y1-, heteroaril-Y1-, -ORb o -SRc, en el que Rb es un resto de bloqueo. Cada resto Ba no esta bloqueado. R3 es H. Cada caso de X es independientemente alquilo, alcoxi, arilo, alquiltio, acilo, -NRfRf, alqueniloxi, alquiniloxi, alqueniltio, alquiniltio, -S-Z+, -Se-Z+ o -BH3-Z+. Cada caso de Rf es independientemente hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo o arilo. Z+ es ion amonio, ion alquilamonio, ion imino heteroaromatico o ion imino heterociclico, cualquiera de los cuales es primario, secundario, terciario o cuaternario, o Z es un ion metalico monovalente. n es mayor de 1 y menor de aproximadamente 200.

En algunas realizaciones del metodo, la etapa de modification se realiza usando un agente de boracion, un electrofilo de azufre o un electrofilo de selenio.

En algunas realizaciones del metodo, el electrofilo de azufre es un compuesto que tiene una de las siguientes formulas:

S8 (Formula B), Z24-S-S-Z25 o Z24-S-X-Z25.

Z24 y Z25 son independientemente alquilo, aminoalquilo, cicloalquilo, heterociclico, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, alquiloxi, ariloxi, heteroariloxi, acilo, amida, imida o tiocarbonilo, o Z24 y Z25 se

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toman conjuntamente para formar un anillo alidclico o heterodclico de 3 a 8 miembros, que puede estar sustituido o sin sustituir; X es SO2, O o NRf; y Rf es hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo o arilo.

En algunas realizaciones del metodo, el electrofilo de azufre es un compuesto de formula B, C, D, E o F:

S8

Formula B

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Formula C

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Formula D

*0

Formula E

Formula F

NH

En algunas realizaciones del metodo, el electrofilo de selenio es un compuesto que tiene una de las siguientes formulas:

Se (Formula G), Z26-Se-Se-Z27 o Z26-Se-X-Z27

Z26 y Z27 son independientemente alquilo, aminoalquilo, cicloalquilo, heterodclico, cicloalquilalquilo,

heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, alquiloxi, ariloxi, heteroariloxi, acilo, amida, imida o tiocarbonilo, o Z26 y Z27 se toman conjuntamente para formar un anillo alidclico o heterodclico de 3 a 8 miembros, que puede estar sustituido o sin sustituir; X es SO2, S, O o NRf; y Rf es hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo o arilo.

En algunas realizaciones del metodo, el electrofilo de selenio es un compuesto de formula G, H, I, J, K o L.

II

Ph—P-Ph

Se KSeCN Ph

Formula G Formula H Formula I

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Formula J Formula K

C 'se

NC Se-S^ pN Formula L

En algunas realizaciones del metodo, el agente de boracion es borano-N,N-diisopropiletilamina (BH3DIPEA), borano-piridina (BH3-Py) borano-2-cloropiridina (BH3-CPy), borano-anilina (BH3-An), borano-tetrahidrofurano (BH3THF) o borano-sulfuro de dimetilo (BH3-Me2S).

En algunas realizaciones del metodo, la etapa de modificacion se realiza usando un reactivo de sililacion, seguido de un electrofilo de azufre, un electrofilo de selenio, un agente de boracion, un agente alquilante, un aldehido o un agente acilante.

En algunas realizaciones del metodo, el reactivo de sililacion es clorotrimetilsilano (TMS-Cl), cloruro de triisopropilsililo (TIPS-Cl), cloruro de t-butildimetilsililo (TBDMS-Cl), cloruro de t-butildifenilsililo (TBDPS-Cl), 1,1,1,3,3,3-hexametildisilazano (HMDS), N-trimetilsilildimetilamina (TmSdMA), N-trimetilsilildietilamina (TMSDEA), N- trimetilsililacetamida (TMSA), N,O-bis(trimetilsilil)acetamida (BSA) o N,O-bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida (BSTfA).

En algunas realizaciones del metodo, el electrofilo de azufre es un compuesto que tiene una de las siguientes formulas: S8 (Formula B), Z24-S-S-Z25 o Z24-S-X-Z25, en las que Z24 y Z25 son independientemente alquilo, aminoalquilo, cicloalquilo, heterodclico, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, alquiloxi, ariloxi, heteroariloxi, acilo, amida, imida o tiocarbonilo, o Z24 y Z25 se toman conjuntamente para formar un anillo alidclico o heterodclico de 3 a 8 miembros, que puede estar sustituido o sin sustituir; X es SO2, O o NRf; y Rf es hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo o arilo.

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S8

Formula B

Formula C Formula D

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Formula E

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Formula F

En algunas realizaciones del metodo, el electrofilo de selenio es un compuesto que tiene una de las siguientes formulas: Se (Formula G), Z26-Se-Se-Z27 o Z26-Se-X-Z27, en las que Z26 y Z27 son independientemente alquilo, aminoalquilo, cicloalquilo, heterodclico, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, alquiloxi, ariloxi, heteroariloxi, acilo, amida, imida o tiocarbonilo, o Z26 y Z27 se toman conjuntamente para formar un anillo alidclico o heterodclico de 3 a 8 miembros, que puede estar sustituido o sin sustituir; X es SO2, S, O o NRf; y Rf es hidrogeno,

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alquilo, alquenilo, alquinilo o arilo.

En algunas realizaciones del metodo, el electrofilo de selenio es un compuesto de formula G, H, I, J, K o L:

Se

Formula G

KSeCN Formula H

Ph-P-Ph

Formula I

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Formula J

IP\ e / \

Se-^ NC Se-Se pH Ph '—'

Formula K Formula L

En algunas realizaciones del metodo, el agente de boracion es borano-N,N-diisopropiletilamina (BH3DIPEA), borano-piridina (BH3-Py), borano-2-cloropiridina (BH3-CPy), borano-anilina (BH3-An), borano-tetrahidrofurano (BH3THF) o borano-sulfuro de dimetilo (BH3-Me2S).

En algunas realizaciones del metodo, el agente alquilante es un haluro de alquilo, haluro de alquenilo, haluro de alquinilo, sulfonato de alquilo, sulfonato de alquenilo o sulfonato de alquinilo. En otras realizaciones del metodo, el aldehido es (para)-formaldehido, alquilaldehido, alquenilaldehido, alquinilaldehido o arilaldehido.

En algunas realizaciones del metodo, el agente acilante es un compuesto de formula M o N.

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Formula M

Formula N

G7 es alquilo, cicloalquilo, heterociclico, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, alquiloxi, ariloxi o heteroariloxi; y M es F, Cl, Br, I, 3-nitro-1,2,4-triazol, imidazol, alquiltriazol, tetrazol, pentafluorobenceno o 1- hidroxibenzotriazol.

En algunas realizaciones del metodo, la etapa de modificacion se realiza haciendo reaccionar con un reactivo de halogenacion, seguido de hacer reaccionar con un nucleofilo. En algunas realizaciones del metodo, el reactivo de halogenacion es CCl4, CBr4, Cl2, Br2, I2, cloruro de sulfurilo (SO2CE), fosgeno, bis(triclorometil)carbonato (BTC), monocloruro de azufre, dicloruro de azufre, cloramina, CuCl2, N-clorosuccinimida (NCS), CI4, N-bromosuccinimida (NBS) o N-yodosuccinimida (NIS). En otras realizaciones del metodo, el nucleofilo es NRfRfH, RfOH o RfSH, en el que Rf es hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo o arilo, y al menos uno de Rf de NRfRfH no es hidrogeno.

En algunas realizaciones del metodo, el reactivo quiral es el compuesto de formula 3 en la que Wi es NHG5 y W2 es OH. En algunas realizaciones del metodo, el reactivo quiral es la formula O o la formula P.

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Formula O Formula P

En algunas realizaciones del metodo, el reactivo quiral es la formula Q o la formula R.

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Formula Q

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Formula R

En algunas realizaciones del metodo, Ra es tritilo sustituido o sin sustituir o sililo sustituido. En otras realizaciones del metodo, en las que Ra es tritilo sustituido o sin sustituir o sililo sustituido. En otras realizaciones del metodo, Rb es tritilo sustituido o sin sustituir, sililo sustituido, acetilo, acilo o eter metilico sustituido.

En algunas realizaciones del metodo, R3 es un grupo de bloqueo que es tritilo sustituido, acilo, sililo sustituido o bencilo sustituido. En otras realizaciones del metodo, R3 es un resto de enlace conectado a un soporte solido.

En algunas realizaciones del metodo, el grupo de bloqueo del resto Ba es un resto de bencilo, acilo, formilo, dialquilformamidinilo, isobutirilo, fenoxiacetilo o tritilo, cualquiera de los cuales puede estar sin sustituir o sustituido. En algunas realizaciones del metodo, R1 es -N3, -NRdRa, alquiniloxi o -OH. En algunas realizaciones del metodo, R1 es -N3, -NRdRd, alquiniloxi o -OH. En otras realizaciones del metodo, R2 es -NRdRd, alquilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y1-, alquenil-Y1-, alquinil-Y1-, aril-Y1- o heteroaril-Y1-, y esta sustituido con restos fluorescentes o de union a

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biomolecula. En aun otras realizaciones del metodo, R2 es - NRdRd, alquilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y1-, alquenil- Y1-, alquinil-Y1-, aril-Y1- o heteroaril-Y1-, y esta sustituido con restos fluorescentes o de union a biomolecula.

En algunas realizaciones del metodo, el sustituyente en R2 es un resto fluorescente. En otras realizaciones del metodo, el sustituyente en R2 es biotina o avidina. En aun otras realizaciones del metodo, el sustituyente en R2 es un resto fluorescente. En algunas realizaciones del metodo, el sustituyente en R2 es biotina o avidina. En otras realizaciones del metodo, R2 es -OH, -N3, hidrogeno, halogeno, alcoxi o alquiniloxi. En aun otras realizaciones del metodo, R2 es -OH, -N3, hidrogeno, halogeno, alcoxi o alquiniloxi.

En algunas realizaciones del metodo, Ba es 5-bromouracilo, 5-yodouracilo o 2, 6-diaminopurina. En otras realizaciones del metodo, Ba se modifica por sustitucion con un resto fluorescente o de union a biomolecula. En aun otras realizaciones del metodo, Ba se modifica por sustitucion con un resto fluorescente o de union a biomolecula. En algunas realizaciones del metodo, el sustituyente en Ba es un resto fluorescente. En otras realizaciones del metodo, el sustituyente en Ba es biotina o avidina. En aun otras realizaciones del metodo, el sustituyente en Ba es un resto fluorescente. En algunas realizaciones del metodo, el sustituyente en Ba es biotina o avidina.

En algunas realizaciones del metodo, Z es ion piridinio, ion trietilamonio, ion W,W-diisopropiletilamonio, ion 1,8- diazabiciclo[5.4.0]undec-7-enio, ion sodio o ion potasio. En otras realizaciones del metodo, Z es ion piridinio, ion trietilamonio, ion W,W-diisopropiletilamonio, ion 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-enio, ion sodio o ion potasio. En algunas realizaciones del metodo, X es alquilo, alcoxi, -NRfRf, -S-Z+ o -BH3-Z+. En otras realizaciones del metodo, X es alquilo, alcoxi, - NRfRf, -S-Z+ o -BH3-Z+.

En una realizacion del metodo, el electrofilo de azufre es la formula F, formula E o formula B. En algunas realizaciones del metodo, el electrofilo de azufre es la formula F, formula E o formula B. En otras realizaciones del metodo, el electrofilo de selenio es la formula G o formula L. En aun otras realizaciones del metodo, el electrofilo de selenio es la formula G o la formula L. En algunas realizaciones del metodo, el agente de boracion es borano-N,N- diisopropiletilamina (BH3DIPEA), borano-2-cloropiridina (B^-CPy), borano-tetrahidrofurano (BH3THF) o borano- sulfuro de dimetilo (BH3-Me2S). En otras realizaciones del metodo, el agente de halogenacion es CCl4, CBr4, Ch, cloruro de sulfurilo (SO2Cl2) o N-clorosuccinimida (NCS). En aun otras realizaciones del metodo, el reactivo de condensation es bis(triclorometil)carbonato (BTC), Ph3PCl2 o cloruro de W,W'-bis(2-oxo-3-oxazolidinil)fosfmico (BopCl).

En otro aspecto se describe un metodo de identification o detection de una molecula diana en una muestra, comprendiendo el metodo: poner en contacto una muestra que se sospecha que contiene una molecula diana con una molecula sensora de acido nucleico de formula 1, sintetizada segun los metodos de la invencion, en el que un cambio en una senal generada por una unidad generadora de senales indica la presencia de dicha diana en dicha muestra. La molecula sensora de acido nucleico se une especificamente con la molecula diana. En algunas realizaciones hay una pluralidad de moleculas sensoras de acido nucleico. En algunas realizaciones, la pluralidad de moleculas sensoras de acido nucleico comprende moleculas sensoras de acido nucleico que se unen especificamente a diferentes moleculas diana. En algunos casos, el metodo comprende ademas cuantificar el cambio en la senal generada por la unidad generadora de senales para cuantificar la cantidad de molecula diana en la muestra. La unidad generadora de senales detecta cualquier tipo de senal, que incluye, pero no se limita a, fluorescencia, resonancia de plasmones superficiales, extincion de fluorescencia, quimioluminiscencia, interferometria o deteccion del indice de refraction.

La muestra que va a detectarse es una muestra ambiental, material de riesgo biologico, muestra organica, farmaco, toxina, aroma, fragancia o muestra biologica. La muestra biologica es una celula, extracto de celulas, lisado celular, tejido, extracto de tejido, fluido corporal, suero, sangre o hemoderivado. En algunas realizaciones del metodo, la presencia de la molecula diana indica la presencia de una afeccion patologica. En algunas realizaciones del metodo, la presencia de la molecula diana indica la presencia de una molecula deseable.

En otro aspecto se describe un metodo de amplification de regiones deseadas de acido nucleico de un molde de acido nucleico que comprende: (a) proporcionar una pluralidad de primeros cebadores de PCR que tienen una region de secuencia de nucleotidos fija complementaria a una secuencia consenso de interes; (b) proporcionar una pluralidad de segundos cebadores de PCR, (c) amplificar el molde de acido nucleico mediante pCr usando la pluralidad de primeros cebadores de PCR y la pluralidad de segundos cebadores de PCR en condiciones en las que un subconjunto de la pluralidad de primeros cebadores se une a la secuencia consenso de interes sustancialmente donde quiera que se produzca en el molde, y un subconjunto de la pluralidad de segundos cebadores se une al molde en localizaciones eliminadas de los primeros cebadores de forma que las regiones de acido nucleico flanqueadas por el primer cebador y el segundo cebador se amplifiquen especificamente, y en el que la pluralidad de primeros cebadores de PCR y/o la pluralidad de segundos cebadores de PCT son moleculas de acidos nucleicos de formula 1 que se producen segun los metodos de la invention.

En algunas realizaciones, el molde es ADN genomico. En algunas realizaciones, el molde es ADN genomico eucariota. En algunas realizaciones, el molde es ADN genomico humano. En algunas realizaciones, el molde es ADN procariota. En algunas realizaciones, el molde es ADN que es un ADN genomico clonado, una region de ADN

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subgenomica, un cromosoma o una region subcromosomica. En algunas realizaciones, el molde es ARN. Breve descripcion de los dibujos

Las novedosas caracteristicas de la invencion se exponen en las reivindicaciones adjuntas. Se obtendra un mejor entendimiento de las caracteristicas y ventajas de la presente invencion por referencia a la siguiente descripcion detallada que expone realizaciones ilustrativas, en las que los principios de la invencion se utilizan, y dibujos adjuntos de los que:

Figura 1. Espectro de RMN 1H de (Sp)-4tt (CDCI3)

Figura 2. Espectro de RMN 31P de (Sp)-4tt (CDCI3)

Figura 3. Espectro de RMN 1H de (Rp)-4tt (CDCI3)

Figura 4. Espectro de RMN 31P de (Rp)-4tt (CDCI3)

Figura 5A. Perfil de UPLC® en bruto de (Sp)-5tt

Figura 5B. Perfil de UPLC® en bruto de (Sp)-5tt usando BTC en lugar de Ph3PCl2 Figura 6A. Perfil de UPLC® en bruto de (Sp)-5tt

Figura 6B. Perfil de UPLC® en bruto de (Sp)-5tt usando BTC en lugar de PH3PCL2

Figura 7A. Perfil de UPLC® en bruto de (Rp)-5tt

Figura 7B. Perfil de UPLC® en bruto de (Rp)-5tt

Figura 8. Perfil de UPLC® en bruto de (Rp)-5tt

Figura 9A. Perfil de UPLC® en bruto de (Sp)-5ct

Figura 9B. Perfil de UPLC® en bruto de (Sp)-5ct

Figura 10A. Perfil de UPLC® en bruto de (Rp)-5ct

Figura 10B. Perfil de UPLC® en bruto de (Rp)-5ct

Figura 11. Perfil de UPLC® en bruto de (Sp)-5at

Figura 12. Perfil de UPLC® en bruto de (Rp)-5at

Figura 13. Perfil de UPLC® en bruto de (Sp)-5gt

Figura 14. Perfil de UPLC® en bruto de (Rp)-5gt

Figura 15A. Perfil de UPLC® en bruto de (Sp)-5tt

Figura 15B. Perfil de UPLC® en bruto de (Sp)-5tt

Figura 16A. Perfil de UPLC® en bruto de (Sp)-5tt

Figura 16B. Perfil de UPLC® en bruto de (Sp)-5tt

Figura 17A. Perfil de UPLC® en bruto de (Rp)-5tt

Figura 17B. Perfil de UPLC® en bruto de (Rp)-5tt

Figura 18. Perfil de UPLC® en bruto de (Sp)-5ct

Figura 19. Perfil de UPLC® en bruto de (Rp)-5ct

Figura 20A. Perfil de UPLC® en bruto de (Sp)-5at

Figura 20B. Perfil de UPLC® en bruto de (Sp)-5at

Figura 21. Perfil de UPLC® en bruto de (Sp)-5at

Figura 22A. Perfil de UPLC® en bruto de (Rp)-5at

Figura 22B. Perfil de UPLC® en bruto de (Rp)-5at

Figura 23. Perfil de UPLC® en bruto de (Sp)-5gt

Figura 24. Perfil de UPLC® en bruto de (Rp)-5gt

Figura 25. Perfil de UPLC® en bruto de (Sp)-7tt

Figura 26. Perfil de UPLC® en bruto de (Rp)-7tt

Figura 27. Perfil de UPLC® en bruto de (Sp)-8tt

Figura 28. Perfil de UPLC® en bruto de (Rp)-8tt

Figura 29A. Perfil de UPLC® en bruto de AII-(Sp)-[Tps]3T

Figura 29B. Espectro de EM-MALDI TOF de AII-(Sp)-[Tps]3T

Figura 30A. Perfil de UPLC® en bruto de (Sp, Rp, Sp)-[Tps]3T

Figura 30B. Espectro de EM-MALDI TOF de (Sp, Rp, Sp)-[Tps]3T

Figura 31A. Perfil de UPLC® en bruto de (RP, SP, RP)-[Tps]3T

Figura 31B. Espectro de EM-MALDI TOF de (Rp, Sp, Rp)-[Tps]3T

Figura 32A. Perfil de UPLC® en bruto de AII-(Rp)-[Tps]3T

Figura 32B. Espectro de EM-MALDI TOF de AII-(Rp)-[Tps]3T

Figura 33A. Perfil de UPLC® en bruto de (Sp)-9umu

Figura 33B. Espectro de EM-MALDI TOF de (Sp)-9umu

Figura 34A. Perfil de UPLC® en bruto de (Rp)-9uMu

Figura 34B. Espectro de EM-MALDI TOF de (Rp)-9umu

Figura 35A. Perfil de UPLC® en bruto de (Sp)-10uFu

Figura 35B. Espectro de EM-MALDI TOF de (Sp)-10ufu

Figura 36A. Perfil de UPLC® en bruto de (Rp)-10uFu

Figura 36B. Espectro de EM-MALDI TOF de (Rp)-10ufu

Figura 37A. Perfil de UPLC® en bruto de (Sp)-1 1 nt

Figura 37B. Espectro de EM-MALDI TOF de (Sp)-1 1 nt

Figura 38A. Perfil de UPLC® en bruto de (Rp)-1 1 nt

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Figura 38B. Espectro de EM-MALDI TOF de (Rp)-11nt Descripcion detallada de la invencion Definiciones.

A menos que se establezca de otro modo, los siguientes terminos usados en la presente solicitud, que incluyen la memoria descriptiva y reivindicaciones, tienen las definiciones dadas a continuacion. Debe observarse que, como se usa en la memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "una", "el" y "la" incluyen referentes plurales, a menos que el contexto dicte claramente de otro modo. A menos que se indique lo contrario, se emplean metodos convencionales de espectroscopia de masas, RMN, HPLC, quimica de proteinas, bioquimica, tecnicas de ADN recombinante y farmacologia. En la presente solicitud, el uso de "o" o "y" significa "y/o", a menos que se establezca de otro modo. Ademas, el uso del termino "que incluye", ademas de otras formas, tales como "incluyen", "incluye" e "incluido", no es limitante.

El termino "acido nucleico" engloba poli- u oligorribonucleotidos (ARN) y poli- u oligodesoxirribonucleotidos (ADN); ARN o ADN derivados de N-glucosidos o C-glucosidos de nucleobases y/o nucleobases modificadas; acidos nucleicos derivados de azucares y/o azucares modificados; y acidos nucleicos derivados de puentes de fosfato y/o puentes de atomos de fosforo modificados. El termino engloba acidos nucleicos que contienen cualquier combinacion de nucleobases, nucleobases modificadas, azucares, azucares modificados, puentes de fosfato o puentes de atomos de fosforo modificados. Ejemplos incluyen, y no se limitan a, acidos nucleicos que contienen restos de ribosa, los acidos nucleicos que contienen restos de desoxirribosa, acidos nucleicos que contienen tanto restos de ribosa como de desoxirribosa, acidos nucleicos que contienen restos de ribosa y ribosa modificada. El prefijo poli- se refiere a un acido nucleico que contiene aproximadamente 1 a aproximadamente 10.000 unidades de monomeros de nucleotidos y en el que el prefijo oligo- se refiere a un acido nucleico que contiene aproximadamente 1 a aproximadamente 200 unidades de monomeros de nucleotidos.

El termino "nucleobase" se refiere a las partes de acidos nucleicos que participan en el enlace de hidrogeno que une una hebra de acido nucleico a otra hebra complementaria en un modo especifico de secuencia. Las nucleobases que existen de forma natural mas comunes son adenina (A), guanina (G), uracilo (U), citosina (C) y timina (T).

El termino "nucleobase modificada" se refiere a un resto que puede sustituir a una nucleobase. La nucleobase modificada imita la disposition espacial, propiedades electronicas, o alguna otra propiedad fisicoquimica de la nucleobase y retiene la propiedad de enlace de hidrogeno que une una hebra de acido nucleico a otra en un modo especifico de secuencia. Una nucleobase modificada puede emparejarse con las cinco bases que existen de forma natural (uracilo, timina, adenina, citosina o guanina) sin afectar sustancialmente el comportamiento de fusion, reconocimiento por enzimas intracelulares o actividad del duplex de oligonucleotido.

El termino "nucleosido" se refiere a un resto en el que una nucleobase o una nucleobase modificada esta unida covalentemente a un azucar o azucar modificado.

El termino "azucar" se refiere a un monosacarido en forma cerrada y/o abierta. Los azucares incluyen, pero no se limitan a, restos de ribosa, desoxirribosa, pentofuranosa, pentopiranosa y hexopiranosa.

El termino "azucar modificado" se refiere a un resto que puede sustituir a un azucar. El azucar modificado imita la disposicion espacial, propiedades electronicas, o alguna otra propiedad fisicoquimica de un azucar.

El termino "nucleotido" se refiere a un resto en el que una nucleobase o una nucleobase modificada esta unida covalentemente a un azucar o azucar modificado, y el azucar o azucar modificado esta unido covalentemente a un grupo fosfato o un resto de atomo de fosforo modificado.

El termino "reactivo quiral" se refiere a un compuesto que es quiral o enantiopuro y puede usarse para induction asimetrica en la sintesis de acidos nucleicos.

El termino "ligando quiral" o "auxiliar quiral" se refiere a un resto que es quiral o enantiopuro y controla el resultado estereoquimico de una reaction.

En una reaccion de condensation, el termino "reactivo de condensation" se refiere a un reactivo que activa un sitio menos reactivo y lo hace mas susceptible al ataque por un nucleofilo.

El termino "resto de bloqueo" se refiere a un grupo que enmascara transitoriamente la reactividad de un grupo funcional. El grupo funcional puede desenmascararse posteriormente por la elimination del resto de bloqueo.

Los terminos "agentes de boracion", "electrofilos de azufre", "electrofilos de selenio" se refieren a compuestos que son utiles en la etapa de modification usada para introducir grupos BH3, S y Se, respectivamente, para modification en el atomo de fosforo.

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El termino "resto" se refiere a un segmento espedfico o grupo funcional de una molecula. Los restos qmmicos son entidades qmmicas frecuentemente reconocidas incorporadas en o anadidas a una molecula.

El termino "soporte solido" se refiere a cualquier soporte que permita la produccion en masa sintetica de acidos nucleicos y puede ser reutilizado si se necesita. Como se usa en el presente documento, el termino se refiere a un polimero que es insoluble en los medios empleados en las etapas de reaccion realizadas para sintetizar los acidos nucleicos, y se derivatiza para comprender grupos reactivos.

El termino "resto de enlace" se refiere a cualquier resto opcionalmente ubicado entre el nucleosido terminal y el soporte solido o entre el nucleosido terminal y otro nucleosido, nucleotido o acido nucleico.

Como se usa en el presente documento, "tratamiento" o "tratar", o "paliar" o "mejorar", se usan indistintamente en el presente documento. Estos terminos se refieren a un enfoque para obtener resultados beneficiosos o deseados que incluyen, pero no se limitan a, beneficio terapeutico y/o un beneficio profilactico. Por beneficio terapeutico se indica la erradicacion o mejora del trastorno subyacente que esta tratandose. Por tanto, se logra un beneficio terapeutico con la erradicacion o mejora de uno o mas de los sintomas fisiologicos asociados al trastorno subyacente de forma que se observe una mejora en el paciente, a pesar de que el paciente pueda todavia estar afectado por el trastorno subyacente. Para el beneficio profilactico, las composiciones pueden administrarse a un paciente en riesgo de desarrollar una enfermedad particular, o a un paciente que refiere uno o mas de los sintomas fisiologicos de una enfermedad, aun cuando pueda no haberse hecho un diagnostico de esta enfermedad.

Un "efecto terapeutico", como se usa el termino en el presente documento, engloba un beneficio terapeutico y/o un beneficio profilactico como se ha descrito anteriormente. Un efecto profilactico incluye retrasar o eliminar la aparicion de una enfermedad o afeccion, retrasar o eliminar la aparicion de sintomas de una enfermedad o afeccion, ralentizar, detener o invertir la progresion de una enfermedad o afeccion, o cualquier combinacion de los mismos.

Un grupo "alquilo" se refiere a un grupo de hidrocarburo alifatico. El resto alquilo puede ser un grupo alquilo saturado (que significa que no contiene ninguna unidad de insaturacion, por ejemplo dobles enlaces carbono-carbono o triples enlaces carbono-carbono) o el resto alquilo puede ser un grupo alquilo insaturado (que significa que contiene al menos una unidad de insaturacion). El resto alquilo, tanto si es saturado como insaturado, puede ser ramificado, de cadena lineal, o incluir una porcion ciclica. El punto de union de un alquilo esta en un atomo de carbono que no es parte de un anillo.

El resto "alquilo" puede tener 1 a 10 atomos de carbono (siempre que aparezca en el presente documento, un intervalo numerico tal como "1 a 10" se refiere a cada numero entero en el intervalo dado; por ejemplo, "1 a 10 atomos de carbono" significa que el grupo alquilo puede consistir en 1 atomo de carbono, 2 atomos de carbono, 3 atomos de carbono, etc., hasta e incluyendo 10 atomos de carbono, aunque la presente definicion tambien cubre la aparicion del termino "alquilo" donde no se designa intervalo numerico). Alquilo incluye tanto grupos alquilo de cadena ramificada como lineal. El grupo alquilo de los compuestos descritos en el presente documento puede designarse "alquilo C1-C6" o designaciones similares. A modo de ejemplo solo, "alquilo C1-C6" indica que hay uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis atomos de carbono en la cadena de alquilo, es decir, la cadena de alquilo esta seleccionada del grupo que consiste en metilo, etilo, propilo, /so-propilo, n-butilo, iso-butilo, sec-butilo y t-butilo. Grupos alquilo tipicos incluyen, pero de ninguna forma se limitan a, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, terc-butilo, pentilo, hexilo, alilo, ciclopropilmetilo, ciclobutilmetilo, ciclopentilmetilo, ciclohexilmetilo, y similares. En un aspecto, un alquilo es un alquilo C1-C6.

Como se usa en el presente documento, el termino "arilo" se refiere a un anillo aromatico en el que cada uno de los atomos que forma el anillo es un atomo de carbono. Los anillos de arilo estan formados por cinco, seis, siete, ocho, nueve o mas de nueve atomos de carbono. Los grupos arilo estan sustituidos o sin sustituir. En un aspecto, un arilo es un fenilo o un naftalenilo. Dependiendo de la estructura, un grupo arilo puede ser un monoradical o un diradical (es decir, un grupo arileno). En un aspecto, un arilo es un arilo C6-C10.

"Heteroarilo", o alternativamente "heteroaromatico", se refiere a un radical aromatico de 5 a 18 miembros (por ejemplo, heteroarilo C5-C13) que incluye uno o mas heteroatomos de anillo seleccionados de nitrogeno, oxigeno y azufre, y que puede ser un sistema de anillos monociclico, biciclico, tridclico o tetradclico. Siempre que aparezca en el presente documento, un intervalo numerico tal como "5 a 18" se refiere a cada numero entero en el intervalo dado; por ejemplo, "5 a 18 atomos de anillo" significa que el grupo heteroarilo puede consistir en 5 atomos de anillo, 6 atomos de anillo, etc., hasta e incluyendo 18 atomos de anillo. Un resto "heteroaromatico" o de "heteroarilo" que contiene N se refiere a un grupo aromatico en el que al menos uno de los atomos del esqueleto del anillo es un atomo de nitrogeno. El grupo heteroarilo polidclico puede estar condensado o no condensado. El (Los) heteroatomo(s) en el radical heteroarilo estan opcionalmente oxidados. Uno o mas atomos de nitrogeno, si estan presentes, estan opcionalmente cuaternizados. El heteroarilo esta unido al resto de la molecula mediante cualquier atomo del (de los) anillo(s). Ejemplos de heteroarilos incluyen, pero no se limitan a, azepinilo, acridinilo, bencimidazolilo, bencindolilo, 1,3-benzodioxolilo, benzofuranilo, benzooxazolilo, benzo[d]tiazolilo, benzotiadiazolilo, benzo[b][1,4]dioxepinilo, benzo[b][1,4]oxazinilo, 1,4-benzodioxanilo, benzonaftofuranilo, benzoxazolilo,

benzodioxolilo, benzodioxinilo, benzoxazolilo, benzopiranilo, benzopiranonilo, benzofuranilo, benzofuranonilo,

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benzofurazanilo, benzotiazolilo, benzotienilo (benzotiofenilo), benzotieno[3,2-d]pirimidinilo, benzotriazolilo,

benzo[4,6]imidazo[1,2-a]piridinilo, carbazolilo, cinnolinilo, ciclopenta[c(]pirimidinilo, 6,7-dihidro-5H-

ciclopenta[4,5]tieno[2,3-d]pirimidinilo, 5,6-dihidrobenzo[h]quinazolinilo, 5,6-dihidrobenzo[h]cinnolinilo, 6,7-dihidro- 5Hbenzo[6,7]ciclohepta[1,2-c]piridazinilo, dibenzofuranilo, dibenzotiofenilo, furanilo, furazanilo, furanonilo, furo[3,2-

c] piridinilo, 5,6,7,8,9,10-hexahidrocicloocta[c(]pirimidinilo, 5,6,7,8,9,10-hexahidrocicloocta[c(]piridazinilo, 5,6,7,8,9,10-

hexahidrocicloocta[d]piridinilo,isotiazolilo, imidazolilo, indazolilo, indolilo, indazolilo, isoindolilo, indolinilo, isoindolinilo, isoquinolilo, indolizinilo, isoxazolilo, 5,8-metano-5,6,7,8-tetrahidroquinazolinilo, naftiridinilo, 1,6-naftiridinonilo, oxadiazolilo, 2-oxoazepinilo, oxazolilo, oxiranilo, 5,6,6a,7,8,9,10,10a-octahidrobenzo[h]quinazolinilo, 1 -fenil-1 H- pirrolilo, fenazinilo, fenotiazinilo, fenoxazinilo, ftalazinilo, pteridinilo, purinilo, piranilo, pirrolilo, pirazolilo, pirazolo[3,4- djpirimidinilo, piridinilo, pirido[3,2-d]pirimidinilo, pirido[3,4-d]pirimidinilo, pirazinilo, pirimidinilo, piridazinilo, pirrolilo, quinazolinilo, quinoxalinilo, quinolinilo, isoquinolinilo, tetrahidroquinolinilo, 5,6,7,8-tetrahidroquinazolinilo, 5,6,7,8- tetrahidrobenzo[4,5]tieno[2,3-d]pirimidinilo, 6,7,8,9-tetrahidro-5H-ciclohepta[4,5]tieno[2,3-d]pirimidinilo, 5,6,7,8-

tetrahidropirido[4,5-c]piridazinilo, tiazolilo, tiadiazolilo, tiapiranilo, triazolilo, tetrazolilo, triazinilo, tieno[2,3-

d] pirimidinilo, tieno[3,2-d]pirimidinilo, tieno[2,3-c]pridinilo y tiofenilo (es decir, tienilo). A menos que se establezca de otro modo espedficamente en la memoria descriptiva, un resto heteroarilo esta opcionalmente sustituido con uno o mas sustituyentes que son independientemente: alquilo, heteroalquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, arilalquilo, heteroarilo, heteroarilalquilo, hidroxi, halogeno, ciano, nitro, oxo, tioxo, trimetilsilanilo, -ORa, -SRa, -OC(O)Ra, -N(Ra)2, -C(O)Ra, -C(O)ORa, -C(O)N(Ra)2, -N(Ra)C(O)ORa, -N(Ra)C(O)Ra, - N(Ra)S(O)tRa (donde t es 1 o 2), -S(O)tORa (donde t es 1 o 2) o -S(O)tN(Ra)2 (donde t es 1 o 2) donde cada Ra es independientemente hidrogeno, alquilo, fluoroalquilo, carbociclilo, carbociclilalquilo, arilo, aralquilo, heterociclilo, heterociclilalquilo, heteroarilo o heteroarilalquilo.

El termino "alidclico" se refiere a un resto todo de carbono que es tanto alifatico como dclico. Los grupos alidclicos contienen uno o mas anillos de todo carbono que pueden estar tanto saturados como insaturados, pero que no tienen caracter aromatico. Los grupos alidclicos estan sustituidos o sin sustituir y pueden contener de uno a diez atomos de carbono. En un aspecto, un alidclico es un cicloalcano monodclico. En otro aspecto, un alidclico es un cicloalcano bidclico.

El termino "aralquilo" se refiere a un grupo alquilo sustituido con un grupo arilo. Grupos aralquilo adecuados incluyen bencilo, picolilo, y similares, todos los cuales pueden estar opcionalmente sustituidos.

Un "resto de acilo" se refiere a un grupo alquil(C=O), aril(C=O) o aralquil(C=O). Un resto de acilo puede tener un resto intermedio (Y) que es oxi, amino, tio o seleno entre el grupo carbonilo y de hidrocarburo. Por ejemplo, un grupo acilo puede ser alquil-Y-(C=O), aril-Y-(C=O) o aralquil-Y-(C=O).

Grupos "alquenilo" son grupos de hidrocarburo de cadena lineal, cadena ramificada y dclicos que contienen al menos un doble enlace carbono-carbono. Los grupos alquenilo pueden estar sustituidos.

Grupos "alquinilo" son grupos de hidrocarburo de cadena lineal, cadena ramificada y dclicos que contienen al menos un triple enlace carbono-carbono. Los grupos alquinilo pueden estar sustituidos.

Un grupo "alcoxi" se refiere a un grupo alquilo unido a oxigeno, es decir, grupo (alquil)-O-, donde alquilo es como se define en el presente documento. Ejemplos incluyen grupos metoxi (-OCH3) o etoxi (-OCH2CH3).

Un grupo "alqueniloxi" se refiere a un grupo alquenilo unido a oxigeno, es decir, grupo (alquenil)-O-, donde alquenilo es como se define en el presente documento.

Un grupo "alquiniloxi" se refiere a un grupo alquinilo unido a oxigeno, es decir, grupo (alquinil)-O-, donde alquinilo es como se define en el presente documento.

Un grupo "ariloxi" se refiere a un grupo arilo unido a oxigeno, es decir, grupo (aril)-O-, donde el arilo es como se define en el presente documento. Un ejemplo incluye fenoxi (-OC6H5).

El termino "alquilseleno" se refiere a un grupo alquilo que tiene un grupo seleno sustituido unido al mismo, es decir, grupo (alquil)-Se-, en el que alquilo se define en el presente documento.

El termino "alquenilseleno" se refiere a un grupo alquenilo que tiene un grupo seleno sustituido unido al mismo, es decir, grupo (alquenil)-Se-, en el que alquenilo se define en el presente documento.

El termino "alquinilseleno" se refiere a un grupo alquinilo que tiene un grupo seleno sustituido unido al mismo, es decir, grupo (alquinil)-Se-, en el que alquenilo se define en el presente documento.

El termino "alquiltio" se refiere a un grupo alquilo unido a un atomo de azufre de enlace, es decir, grupo (alquil)-S-, en el que alquilo se define en el presente documento. Por ejemplo, un alquiltio es un metiltio y similares.

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El termino "alqueniltio" se refiere a un grupo alquenilo unido a un atomo de azufre de enlace, es dedr, grupo (alquenil)-S-, en el que alquilo se define en el presente documento.

El termino "alquiniltio" se refiere a un grupo alquinilo unido a un atomo de azufre de enlace, es dedr, grupo (alquinil)- S-, en el que alquenilo se define en el presente documento.

El termino "alquilamino" se refiere a un grupo amino sustituido con al menos un grupo alquilo, es decir, -NH(alquilo) o -N-(alquilo)2, en los que alquilo se define en el presente documento.

El termino "alquenilamino" se refiere a un grupo amino sustituido con al menos un grupo alquenilo, es decir, - NH(alquenilo) o -N-(alquenilo)2, en el que alquenilo se define en el presente documento.

El termino "alquinilamino" se refiere a un grupo amino sustituido con al menos un grupo alquinilo, es decir, - NH(alquinilo) o -N-(alquinilo)2, en el que alquinilo se define en el presente documento.

El termino "halogeno" pretende incluir fluor, cloro, bromo y yodo.

Un "grupo fluorescente" se refiere a una molecula que, cuando se excita con luz que tiene una longitud de onda seleccionada, emite luz de una longitud de onda diferente. Grupos fluorescentes incluyen, pero no se limitan a, grupos indol, fluoresceina, tetrametilrodamina, Texas Red, BODIPY, acido 5-[(2-aminoetil)amino]naftaleno-1- sulfonico (EDANS), cumarina y Lucifer yellow.

Un "ion amonio" es un cation poliatomico positivamente cargado de la formula quimica NH4+.

Un "ion alquilamonio" es un ion amonio que tiene al menos uno de sus atomos de hidrogeno sustituido con un grupo alquilo, en el que alquilo se define en el presente documento. Ejemplos incluyen ion trietilamonio, ion N,N- diisopropiletilamonio.

Un "ion iminio" tiene la estructura general R2C=NR2+. Los grupos R se refieren a grupos alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo como se define en el presente documento. Un "ion imino heteroaromatico" se refiere a un ion iminio donde el nitrogeno y sus grupos R unidos forman un anillo heteroaromatico. Un "ion imino heterodclico" se refiere a un ion iminio donde el nitrogeno y sus grupos R unidos forman un anillo heterodclico.

Los terminos "amino" o "amina" se refiere a un grupo radical -N(Rh)2, donde cada Rh es independientemente hidrogeno, alquilo, fluoroalquilo, carbociclilo, carbociclilalquilo, arilo, aralquilo, heterociclilo, heterociclilalquilo, heteroarilo o heteroarilalquilo, a menos que se establezca de otro modo espedficamente en la memoria descriptiva. Cuando un grupo -N(Rf)2 tiene dos Rf distintos de hidrogeno, pueden combinarse con el atomo de nitrogeno para formar un anillo de 4, 5, 6 o 7 miembros. Por ejemplo, se indica que -N(Rf)2 incluye, pero no se limita a, 1 -pirrolidinilo y 4-morfolinilo. Uno cualquiera o mas de hidrogeno, alquilo, fluoroalquilo, carbociclilo, carbociclilalquilo, arilo, aralquilo, heterociclilo, heterociclilalquilo, heteroarilo o heteroarilalquilo estan opcionalmente sustituidos con uno o mas sustituyentes que son independientemente alquilo, heteroalquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, arilalquilo, heteroarilo, heteroarilalquilo, hidroxi, halogeno, ciano, trifluorometilo, trifluorometoxi, nitro, trimetilsilanilo, -OR', -SR', -OC(O)R', -N(R')2, -C(O)R', -C(O)OR', -OC(O)N(R')2, -C(O)N(R')2, - N(Ri)C(O)ORi, -N(R')C(O)R',-N(R')C(O)N(R')2, N(R')C(NR')N(R')2, -N(R')S(O)tR' (donde t es 1 o 2), -S(O)tORf (donde t es 1 o 2) o -S(O)tN(Rf)2 (donde t es 1 o 2), donde cada R' es independientemente hidrogeno, alquilo, fluoroalquilo, carbociclilo, carbociclilalquilo, arilo, aralquilo, heterociclilo, heterociclilalquilo, heteroarilo o heteroarilalquilo.

"Carbamato", como se usa en el presente documento, se refiere a un resto unido a un grupo amino que tiene la formula -C(O)OR donde R es alquilo, fluoroalquilo, carbociclilo, carbociclilalquilo, arilo, aralquilo, heterociclilo, heterociclilalquilo, heteroarilo o heteroarilalquilo. Ejemplos incluyen, pero no se limitan a, Boc (terc-butil-OC(O)-), CBz (bencil-Oc(O)-), Teoc (Me3SiCH2CH2oC(O)-), alloc (alil-OC(O)-) o Fmoc (9-fluorenilmetil-OC(O)-).

"Sililo sustituido", como se usa en el presente documento, se refiere a un resto que tiene la formula R3Si-. Ejemplos incluyen, pero no se limitan a, TBDEM (terc-butildimetilsililo), TBDPS (terc-butildifenilsililo) o TEM (trimetilsililo).

El termino "tiol" se refiere a grupos -SH, e incluyen grupos tiol sustituidos, es decir, grupos -SRj, en los que Rj son cada uno independientemente un grupo alquilo, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, arilaralquilo, heterociclilo o heterociclilalquilo sustituido o sin sustituir como se define en el presente documento.

Metodos de sintesis

Discusion general de los metodos de sintesis de un acido nucleico que comprende un resto de X-fosfonato quiral.

El presente metodo proporciona una sintesis eficiente de acidos nucleicos modificados en el atomo de fosforo en el que la configuracion estereoquimica en un atomo de fosforo esta controlada, produciendose asi un oligonucleotido

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estereodefinido. El metodo elimina la necesidad de separaciones complejas de mezclas diaestereomericas y permite el uso de materiales de partida aquirales baratos facilmente disponibles. El metodo de sintesis desvelado en el presente documento comprende una reaccion asimetrica de un resto de H-fosfonato aquiral (formula 2) con un nucleosido que comprende un resto nucleofilo, tal como un grupo hidroxi (formula 4-1, donde Qi es cualquiera de un grupo de bloqueo, un resto de enlace a un soporte o a una cadena de nucleotido) para proporcionar un acido nucleico modificado en el atomo de fosforo que comprende un resto de X-fosfonato quiral, que es un compuesto de formula 1, como se muestra en el Esquema 1. De tal manera se produce un polimero u oligomero de nucleotido que tiene alta pureza diaestereomerica. En algunas realizaciones, el acido nucleico contiene modificaciones en las nucleobases, resto de azucar y/o grupos protectores.

imagen26

La reaccion de una molecula que comprende un resto de H-fosfonato aquiral de formula 2 con un nucleosido que comprende un resto nucleofilo de formula 4-1 produce la formacion de un producto intermedio condensado; que se convierte en el acido nucleico que comprende un resto de X-fosfonato quiral. La sintesis del producto intermedio condensado comprende las etapas de (a) activacion del compuesto de formula 2 con un agente de condensacion,

(b) reaccion con un reactivo quiral, seguido de (c) reaccion con el compuesto de formula 4-1. El esquema general se muestra en el Esquema 2. El reactivo quiral llega a unirse al producto intermedio condensado como un grupo de auxiliar quiral. En el proceso proporcionado en el presente documento, las etapas (a)-(c) que conducen al producto intermedio condensado pueden realizarse sin aislar ningun producto intermedio, es decir, en el mismo recipiente o en un solo recipiente. Asi, el proceso obvia la necesidad del aislamiento de productos intermedios discretos. El proceso desvelado en el presente documento puede realizarse en solucion o sobre soporte solido. Dependiendo de las condiciones de reaccion, la adicion de un reactivo de activacion puede ser util para la etapa de condensacion. Por ejemplo, el reactivo de activacion puede anadirse a la reaccion despues de haberse completado las etapas (a)-

(c) o puede anadirse a la reaccion al mismo tiempo que las etapas (a)-(c).

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W2—H

Esquema 2. Etapas de reaccion que conducen a la formacion de un producto intermedio condensado.

a- Cr . _ 1C

R2

Formula 2

<j> R2

Qi

Formula 4-1

OR3

Producto intermedio condesado

I r2 ,0

R2 .

OR3

Formula 1

En una realizacion, el producto intermedio condensado se convierte en un acido nucleico que comprende un resto de X-fosfonato quiral de formula 1 por termination del auxiliar quiral sobre el producto intermedio condensado con un resto A, que es un resto de acilo, arilo, alquilo, aralquilo o de sililo, y modificando el fosforo para introducir J, que es S, Se o BH3, produciendo un compuesto de formula 5-1. En una realizacion (Option A, Esquema 3), el compuesto de formula 5-1 se convierte en el compuesto de formula 1, donde X es S, Se o BH3, y n es 1 (dimero), escindiendo el auxiliar quiral, y desbloqueando los grupos de bloqueo y escindiendo del soporte solido, si se desea. Cuando se forma el dimero, la etapa de terminacion en el Esquema 3 es opcional. Alternativamente (Opcion B, Esquema 3), el compuesto de formula 5-1 se somete a alargamiento de cadena repitiendo las etapas para producir un producto intermedio condensado donde otro monomero de formula 2 se anade al oligonucleotido. Las etapas de terminacion, modification, desbloqueo y alargamiento de cadena se repiten hasta que se logra n deseado. En ese momento, se escinden los auxiliares quirales en cada fosfonato, se escinden los grupos de bloqueo restantes, que incluyen la escision de un soporte solido, si se desea, para producir el compuesto de formula 1, donde X es S, Se o BH3, y n es mayor de o igual a 2 y menor de aproximadamente 200.

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Esquema 3. Conversion del producto intermedio condesado en el compuesto de formula 1 mediante la Ruta

A.

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Producto intermedio condesado Formula 5-1

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Opcion B

Compuesto de formula 1 n > 2, menos de aproximadamente 200

d. desbloqueo de R1

e. alargamiento de cadena

f. terminacion

g. modificacion

f. repetir las etapas d, e, f, g n veces

i. escision del reactivo quiral

j. desbloqueo de los grupos de bloqueo restantes

En otro metodo proporcionado en el presente documento, el producto intermedio condensado se convierte en un acido nucleico que comprende un resto de X-fosfonato quiral de formula 1 acidificando el producto intermedio condensado para eliminar el grupo de bloqueo en R1, que tambien elimina el auxiliar quiral. En una realizacion (Opcion A, Esquema 4), el compuesto de formula 4 se modifica para introducir un resto X en el fosforo, para producir un compuesto de formula 1, que se desbloquea para eliminar los grupos de bloqueo restantes, y eliminar de un soporte de sintesis, si se desea, para producir un compuesto de formula 1 en la que R3 es hidrogeno y n es 1.

Alternativamente, el compuesto de formula 4 en el Esquema 4 (Opcion B) se somete a la etapa de reaccion de alargamiento de cadena, y entonces se acidifica para desbloquear el grupo de bloqueo R1 del nucleosido recien anadido. La etapa de alargamiento de cadena y la etapa de desbloqueo de R1 se realizan durante m repeticiones. En ese momento, el compuesto de formula 4, en la que m es igual a n-1, se modifica para introducir un resto X en cada fosforo, para producir un compuesto de formula 1, que se desbloquea para eliminar los grupos de bloqueo restantes, y eliminar de un soporte de sintesis, si se desea, para producir un compuesto de formula 1 en la que R3 es hidrogeno y n es mayor de o igual a 2 y menor de aproximadamente 200.

Esquema 4. Conversion del producto intermedio condesado en el compuesto de formula 1 mediante la Ruta

B.

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En tanto la Opcion A como la Opcion B del Esquema 4, X es alquilo, alcoxi, arilo, alquiltio, acilo, -NRfRf, alqueniloxi, alquiniloxi, alqueniltio, alquiniltio, -S-Z+, -Se-Z+ o -BH3-Z+, donde cada Rf es independientemente hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo o arilo; Z+ es ion amonio, ion alquilamonio, ion imino heteroaromatico o ion imino heterociclico, cualquiera de los cuales es primario, secundario, terciario o cuaternario, o Z es un ion metalico monovalente. En otras realizaciones, Z es ion piridinio, ion trietilamonio, ion W,W-diisopropiletilamonio, ion 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec- 7-enio, ion sodio o ion potasio.

Acido nucleico modificado en el atomo de fosforo que comprende un resto de X-fosfonato quiral de formula 1.

El proceso de la description proporciona un acido nucleico que comprende un resto de X-fosfonato quiral de la siguiente formula general 1-1 o formula 1-2:

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X^O

1“Uw3Jla

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Formula 1-2

En las que el resto de X-fosfonato conecta restos de nucleosido naturales o restos de nucleosido no naturales en el que el anillo de ribosa natural esta sustituido con un anillo que contiene oxigeno mas grande o mas pequenos o en el que el anillo esta sustituido con una estructura no dclica en la que W3 es -S-, -O-, amino sustituido o sin sustituir, alquileno, alquenileno o alquinileno. En otras realizaciones del acido nucleico, el resto de X-fosfonato conecta restos de nucleosido naturales con restos de nucleosido no naturales. En aun otras realizaciones del acido nucleico, el resto de X-fosfonato conecta restos de nucleosido con restos de azucar diferentes entre si.

El proceso de la invencion proporciona un acido nucleico que comprende un resto de X-fosfonato quiral es un compuesto de formula 1:

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Formula 1

En la formula 1, R1 es -OH, -SH, -NRdRd, -N3, halogeno, hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y1-, alquenil- Y1-, alquinil-Y1-, aril-Y1-, heteroaril-Y1-, -P(O)(Re)2, -HP(O)(Re), -ORa o -SRc.

Y1 es O, NRd, S o Se.

Ra es un resto de bloqueo.

Rc es un grupo de bloqueo.

Cada caso de Rd es independientemente hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, acilo, sililo sustituido, carbamato, -P(O)(Re)2 o -HP(o)(Re).

Cada caso de Re es independientemente hidrogeno, alquilo, arilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y2-, alquenil-Y2-, alquinil- Y2-, aril-Y2- o heteroaril-Y2-, o un cation que es Na+1, Li+1 o K+1.

Y2 es O, NRd o S.

Cada caso de R2 es independientemente hidrogeno, -OH, -SH, -NRdRd, -N3, halogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y1-, alquenil-Y1-, alquinil-Y1-, aril-Y1-, heteroaril-Y1-, -ORb o -SRc, en el que Rb es un resto de bloqueo.

Cada caso de Ba es independientemente una adenina bloqueada o no bloqueada, citosina, guanina, timina, uracilo o nucleobase modificada.

Cada caso de X es independientemente alquilo, alcoxi, arilo, alquiltio, acilo, -NRfRf, alqueniloxi, alquiniloxi, alqueniltio, alquiniltio, -S-Z+, -Se-Z+ o -BH3-Z+.

Cada caso de Rf es independientemente hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo o arilo.

Z+ es ion amonio, ion alquilamonio, ion imino heteroaromatico o ion imino heterociclico, cualquiera de los cuales es primario, secundario, terciario o cuaternario, o Z es un ion metalico monovalente.

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R3 es hidrogeno, un grupo de bloqueo, un resto de enlace conectado a un soporte solido o un resto de enlace conectado a un acido nucleico; y n es un numero entero de 1 a aproximadamente 200.

En una realizacion, cualquiera de los grupos R2 esta sustituido con, por ejemplo, un resto fluorescente, un resto de biotina o un resto de avidina.

En una realizacion, el acido nucleico descrito en el presente documento se prepara a partir de todos los monomeros de ribonucleotido. En otra realizacion, se prepara a partir de todos los monomeros de desoxirribonucleotido. En otra realizacion mas, el acido nucleico se prepara a partir de una mezcla de monomeros de ribonucleotido o de desoxirribonucleotido. En una realizacion, el acido nucleico es una mezcla de restos de ARN y de ADN. En otra realizacion, el acido nucleico comprende un sustituyente en R2 que no se encuentra en acidos nucleicos de ARN o ADN.

Ba representa una nucleobase, que es una nucleobase natural o modificada. Cada caso de la nucleobase esta independientemente bloqueada o no bloqueada.

Cada caso de X es independientemente alquilo, alcoxi, arilo, alquiltio, acilo, -NRfRf, alqueniloxi, alquiniloxi, alqueniltio, alquiniltio, -S-Z+, -Se-Z+ o -BH3-Z+, en el que cada caso de Rf es independientemente hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo o arilo; Z+ es ion amonio, ion alquilamonio, ion imino heteroaromatico o ion imino heterociclico, cualquiera de los cuales es primario, secundario, terciario o cuaternario, o Z es un ion metalico monovalente. En algunas realizaciones, X es alquilo, alcoxi, -NRfRf, -S-Z+ o -BH3-Z+. En otras realizaciones, Z es ion piridinio, ion trietilamonio, ion N,N-diisopropiletilamonio, ion 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-enio, ion sodio o ion potasio.

R3 es hidrogeno, un grupo de bloqueo, un resto de enlace conectado a un soporte solido o un resto de enlace conectado a un acido nucleico, que se preparan usando metodos en el presente documento o conocidos en la tecnica. El acido nucleico unido a R3 que se prepara usando cualquier metodo conocido comprende atomos de fosforo que estan modificados, no modificados, o mezclas de fosforo modificado y sin modificar y comprenden cualquier configuracion en el atomo de fosforo. En una realizacion, R3 es un resto de enlace unido a otro nucleosido o nucleotido.

Resto de X-fosfonato

Como se usa en el presente documento, resto de X-fosfonato se refiere al atomo de fosforo del enlace del esqueleto internucleosidico que se modifica para unirse covalentemente a un resto X, donde X puede ser, pero no se limita a, azufre, selenio, alquilo, boro, acilo, amino, tiol o alcoxi. El resto X modifica el atomo de fosforo por sustitucion de uno de los atomos de oxigeno en el esqueleto internucleosidico. Los enlaces del esqueleto internucleosidico se muestran a continuation (dentro de los recuadros rectangulares discontinuos) para dos fragmentos de acido nucleico como ejemplos no limitantes. La estructura de la izquierda a continuacion muestra el grupo fosfato encontrado en los enlaces del esqueleto internucleosidico natural. La estructura de la derecha a continuacion muestra un resto de X-fosfonato como enlace del esqueleto internucleosidico.

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Un resto fosforotioato comprende un resto de azufre como resto X. Un resto fosforoselenoato comprende un resto de selenio como resto X. Un resto alquilfosfonato (por ejemplo, metilfosfonato) comprende un grupo alquilo (por ejemplo, grupo metilo) como resto X. Un resto boronofosfonato comprende un grupo borano como resto X.

En una realizacion, el acido nucleico comprende grupos fosforotioato en los enlaces del esqueleto. En algunas realizaciones, el acido nucleico comprende grupos fosforoselenoato en los enlaces del esqueleto. En otras realizaciones, el acido nucleico comprende grupos alquilfosfonato (por ejemplo, metilfosfonato) en los enlaces del esqueleto. En aun otras realizaciones, el acido nucleico comprende grupos boronofosfonato en los enlaces del esqueleto.

Cada resto X puede ser independientemente elegido de los diversos restos X descritos en el presente documento. Esto permite que multiples restos X esten presentes dentro de un acido nucleico. En una realizacion, el mismo resto X se usa en todo el acido nucleico. En otras realizaciones, se usan diferentes restos X en todo el acido nucleico. Por ejemplo, dentro de un acido nucleico, algunos de los X-fosfonatos son restos fosfotioato mientras que otros X- fosfonatos dentro del mismo acido nucleico son restos alquilfosfonato. Sera evidente para un experto en la materia

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que son posibles otras variaciones y alternancias de modificaciones de fosforo y dependen del uso y las aplicaciones de estos acidos nucleicos. En algunas realizaciones, la eleccion del resto X depende de las propiedades bioqmmicas del acido nucleico y sus interacciones con muestras biologicas.

Configuracion de resto de X-fosfonato.

Los metodos descritos en el presente documento son utiles para controlar la configuracion de cada atomo de fosforo en el enlace del esqueleto internucleosidico. El reactivo quiral permite el control especifico de la quiralidad en el X- fosfonato. Asi, puede seleccionarse tanto una configuracion Rp como Sp en cada ciclo de sintesis, permitiendo el control de la estructura tridimensional global del producto de acido nucleico. En algunas realizaciones, la seleccion de las configuraciones Rp y Sp se hace para conferir una superestructura tridimensional especifica a la cadena de acido nucleico.

En algunas realizaciones, cada resto de X-fosfonato puede tener una configuracion Rp. En otras realizaciones, cada resto de X-fosfonato puede tener una configuracion Sp. En otra realization, cada resto de X-fosfonato puede tener independientemente una configuracion Rp o una configuracion Sp. En realizaciones especificas, los restos de X- fosfonato alternan entre Rp y Sp tal como Rp, Sp, Rp o Sp, Rp, Sp en todo el acido nucleico. En otras realizaciones especificas, los restos de X-fosfonato contienen configuraciones repetidas de Rp, Rp, Sp, Sp en todo el acido nucleico. En aun otras realizaciones, el acido nucleico comprende todas las configuraciones Rp. En realizaciones adicionales, el acido nucleico comprende todos los restos Sp. En algunas realizaciones, los enlaces del esqueleto internucleosidico del extremo 5' y 3' son de la configuracion Sp y los enlaces del esqueleto internucleosidico internos son todos de la configuracion Rp. Las realizaciones descritas en el presente documento sirven de ejemplos de como la configuracion puede controlarse usando estos metodos. El acido nucleico descrito en el presente documento no se limita a estos patrones de configuracion. Sera evidente para un experto en la materia que son posibles otras variaciones y alternancias en las configuraciones Rp y Sp y dependen del uso y aplicaciones del acido nucleico.

Determination de la pureza de configuraciones de X-fosfonato.

La pureza de la configuracion en cada resto de X-fosfonato en el acido nucleico se determina usando metodos analiticos convencionales tales como, pero no se limitan a, espectroscopia de RMN 31P o HPLC de fase inversa. Usando los metodos descritos en el presente documento, en una realizacion, cada resto de X-fosfonato del compuesto puede tener mas del 80 % de pureza diaestereomerica. En una realizacion, cada resto de X-fosfonato del

compuesto puede tener mas del 60 % de pureza diaestereomerica. En una realizacion, cada resto de X-fosfonato del

compuesto puede tener mas del 70 % de pureza diaestereomerica. En una realizacion, cada resto de X-fosfonato del

compuesto puede tener mas del 85 % de pureza diaestereomerica. En una realizacion, cada resto de X-fosfonato del

compuesto puede tener mas del 90 % de pureza diaestereomerica. En una realizacion, cada resto de X-fosfonato del

compuesto puede tener mas del 95 % de pureza diaestereomerica. En otra realizacion, cada resto de X-fosfonato del compuesto puede tener mas del 98 % de pureza diaestereomerica. En otra realizacion, cada resto de X- fosfonato del compuesto puede tener mas del 99 % de pureza diaestereomerica. En una realizacion, cada resto de X-fosfonato del compuesto puede tener mas de aproximadamente el 60 %, mas de aproximadamente el 70 %, mas de aproximadamente el 80 %, mas de aproximadamente el 83 %, mas de aproximadamente el 84 %, mas de aproximadamente el 85 %, mas de aproximadamente el 86 %, mas de aproximadamente el 87 %, mas de

aproximadamente el 88 %, mas de aproximadamente el 89 %, mas de aproximadamente el 90 %, mas de

aproximadamente el 91 %, mas de aproximadamente el 92 %, mas de aproximadamente el 93 %, mas de

aproximadamente el 94 %, mas de aproximadamente el 95 %, mas de aproximadamente el 96 %, mas de

aproximadamente el 97 %, mas de aproximadamente el 98 %, o mas de aproximadamente el 99 % de pureza diaestereomerica. En una realizacion, cada resto de X-fosfonato puede tener de aproximadamente el 60 % a aproximadamente el 99,9 % de pureza diaestereomerica. En una realizacion, cada resto de X-fosfonato puede tener de aproximadamente el 60 % a aproximadamente el 99 % de pureza diaestereomerica. En una realizacion, cada resto de X-fosfonato puede tener de aproximadamente el 60 % a aproximadamente el 70 % de pureza diaestereomerica. En una realizacion, cada resto de X-fosfonato puede tener de aproximadamente el 70 % a aproximadamente el 80 % de pureza diaestereomerica. En una realizacion, cada resto de X-fosfonato puede tener de aproximadamente el 80 % a aproximadamente el 90 % de pureza diaestereomerica. En una realizacion, cada resto de X-fosfonato puede tener de aproximadamente el 80 % a aproximadamente el 99 % de pureza diaestereomerica. En una realizacion, cada resto de X-fosfonato puede tener de aproximadamente el 85 % a aproximadamente el 95 % de pureza diaestereomerica. En una realizacion, cada resto de X-fosfonato puede tener de aproximadamente el 90 % a aproximadamente el 95 % de pureza diaestereomerica. En una realizacion, cada resto de X-fosfonato puede tener de aproximadamente el 95 % a aproximadamente el 99 % de pureza diaestereomerica. En una realizacion, cada resto de X-fosfonato puede tener de aproximadamente el 90 % a aproximadamente el 99,9 % de pureza diaestereomerica.

La cantidad de una configuracion particular con respecto a otra configuracion afecta la estructura tridimensional de los acidos nucleicos, ademas de su estabilidad. Por consiguiente, diferentes configuraciones afectan las propiedades

biologicas, quimicas y fisicas de los acidos nucleicos. En una realizacion, el acido nucleico comprende un mayor

porcentaje de configuracion Sp que configuracion Rp. En otra realizacion, el acido nucleico comprende un mayor

porcentaje de configuracion Rp que configuracion Sp. En otra realizacion, el acido nucleico comprende el mismo

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porcentaje de configuracion Rp que configuracion Sp. En una realizacion, el acido nucleico puede comprender 020 % de configuracion Rp. En una realizacion, el acido nucleico puede comprender 20-40 % de configuracion Rp. En una realizacion, el acido nucleico puede comprender 40-60 % de configuracion Rp. En una realizacion, el acido nucleico puede comprender 60-80 % de configuracion Rp. En una realizacion, el acido nucleico puede comprender 80-100 % de configuracion Rp. En una realizacion, el acido nucleico puede comprender 0-20 % de configuracion Sp. En una realizacion, el acido nucleico puede comprender 20-40 % configuracion de Sp. En una realizacion, el acido nucleico puede comprender 40-60 % de configuracion Sp. En una realizacion, el acido nucleico puede comprender 60-80 % de configuracion Sp. En una realizacion, el acido nucleico puede comprender 80-100 % de configuracion Sp.

Longitud del acido nucleico modificado en el atomo de fosforo.

El acido nucleico que comprende un resto de X-fosfonato quiral de formula 1 comprende de aproximadamente 1 nucleosido a aproximadamente 200 nucleosidos. En algunas realizaciones, el acido nucleico que comprende un resto de X-fosfonato quiral de formula 1 se combina ademas en oligomeros o polimeros. En algunas realizaciones, el acido nucleico de formula 1 es un dimero. En otras realizaciones, el acido nucleico de formula 1 comprende hasta aproximadamente 100 nucleosidos. En otras realizaciones, el acido nucleico de formula 1 comprende hasta

aproximadamente 150 nucleosidos. En otras realizaciones, el acido nucleico de formula 1 comprende hasta

aproximadamente 200 nucleosidos. En otras realizaciones, el acido nucleico de formula 1 comprende hasta

aproximadamente 300 nucleosidos. En algunas realizaciones, el acido nucleico de formula 1 comprende de 1 a

aproximadamente 200 nucleosidos. En otras realizaciones, el acido nucleico comprende de 1 a aproximadamente 150 nucleosidos. En realizaciones adicionales, el acido nucleico contiene de 1 a aproximadamente 10 nucleosidos. En otras realizaciones, el acido nucleico contiene de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 nucleosidos. En realizaciones adicionales, el acido nucleico contiene de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 nucleosidos. En algunas realizaciones, el acido nucleico comprende de 1 a aproximadamente 5 nucleosidos, o aproximadamente 5 a aproximadamente 10 nucleosidos, o aproximadamente 5 a aproximadamente 15 nucleosidos, o aproximadamente 10 a aproximadamente 20 nucleosidos, o aproximadamente 15 a aproximadamente 25 nucleosidos, o aproximadamente 20 a aproximadamente 30 nucleosidos, o aproximadamente 25 a aproximadamente 35 nucleosidos, o aproximadamente 30 a aproximadamente 40 nucleosidos. En algunas realizaciones de formula 1, n es un numero entero de 1 a aproximadamente 200. En algunas realizaciones de formula 1, n es un numero entero de 1 a aproximadamente 150. En algunas realizaciones de formula 1, n es un numero entero de 1 a aproximadamente 10. En algunas realizaciones de formula 1, n es un numero entero de 10 a aproximadamente 50. En algunas realizaciones de formula 1, n es un numero entero de 10 a aproximadamente 100. En algunas realizaciones de formula 1, n es un numero entero de 1 a aproximadamente 5, o aproximadamente 5 a aproximadamente 10, o aproximadamente 5 a aproximadamente 15, o aproximadamente 10 a aproximadamente 20, o aproximadamente 15 a aproximadamente 25, o aproximadamente 20 a aproximadamente 30, o aproximadamente 25 a aproximadamente 35, o aproximadamente 30 a aproximadamente 40.

Variaciones adicionales del acido nucleico modificado en el atomo de fosforo.

El acido nucleico de formula 1 puede ser monocatenario. En algunas realizaciones, el acido nucleico de formula 1 se hibrida con una hebra complementaria para formar un acido nucleico bicatenario.

En algunas realizaciones, el acido nucleico de formula 1 puede comprender una estructura lineal abierta. En otras realizaciones, los extremos respectivos del acido nucleico de formula 1 se unen para formar una estructura circular.

Dentro de un acido nucleico, el componente de azucar de cada unidad comprende los mismos azucares o diferentes. En algunas realizaciones, los azucares son azucares modificados o azucares que estan sustituidos. En algunas realizaciones, los azucares son todos restos de azucar ribosa. En algunas realizaciones, los azucares son todos restos de azucar desoxirribosa. En otras realizaciones, los azucares son todos restos pentofuranosa, pentopiranosa o hexopiranosa. En realizaciones adicionales, el componente de azucar comprende estructuras de anillo cerradas o estructuras abiertas.

Dentro de la estructura del acido nucleico, se denomina comunmente que los puentes de atomos de fosforo estan formando el esqueleto internucleosidico de los acidos nucleicos. Los enlaces del esqueleto internucleosidico en los acidos nucleicos incluyen, y no se limitan a, puentes de atomos de fosforo 2' a 5', puentes de atomos de fosforo 3' a 5', puentes de atomos de fosforo 5' a 3' y los puentes de atomos de fosforo 3' a 2' y los puentes 4' a 2' descritos en la patente de EE.UU. N.° 6.608.186 y Joyce, G.F. Nature, 2002, 418, 214-220. Ejemplos no limitantes de estas variaciones en los enlaces del esqueleto internucleosidico se muestran a continuacion:

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Dependiendo del componente de azucar o de azucar modificado, tambien se contemplan otros tipos de puentes de atomos de fosforo que incluyen, y no se limitan a, los puentes de bisfosfonato de metileno mostrados a continuacion y descritos en Xu, L. et al, J. Med. Chem., 2005, 48,4177-4181.

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El acido nucleico de formula 1 puede comprender las mismas nucleobases o diferentes. En algunas realizaciones, el acido nucleico de formula 1 comprende todas las nucleobases iguales. En otras realizaciones, el acido nucleico de formula 1 comprende todas las nucleobases diferentes. En otras realizaciones, el acido nucleico de formula 1 comprende las nucleobases que existen de forma natural. En algunas realizaciones, el acido nucleico de formula 1 comprende nucleobases modificadas. En aun otras realizaciones, el acido nucleico contiene nucleobases que imitan la secuencia de nucleobases de un acido nucleico encontrado en la naturaleza. En algunas realizaciones, el acido nucleico de formula 1 comprende una mezcla de nucleobases que existen de forma natural y nucleobases modificadas.

Moleculas que comprenden un resto de H-fosfonato aquiral.

La molecula que comprende un resto de H-fosfonato aquiral es un compuesto de formula 2:

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En la formula 2, R1 es -NRdRd, -N3, halogeno, hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y1-, alquenil-Y1-, alquinil- Y1-, aril-Y1-, heteroaril-Y1-, -P(O)(Re)2, -HP(O)(Re), -ORa o -SRc.

Y1 es O, NRd, S o Se.

Ra es un resto de bloqueo.

Rc es un grupo de bloqueo.

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Cada caso de Re es independientemente alquilo, arilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y2-, alquenil-Y2-, alquinil-Y2-, aril-Y2- o heteroaril-Y2-.

Y2 es O, NRd o S.

R2 es hidrogeno, -NRdRd, N3, halogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y1-, alquenil-Y1-, alquinil-Y1-, aril-Y1-, heteroaril-Y1-, -ORb o -SRc, en el que Rb es un resto de bloqueo.

Ba es una adenina bloqueada o no bloqueada, citosina, guanina, timina, uracilo o nucleobase modificada.

Z+ es ion amonio, ion alquilamonio, ion imino heteroaromatico o ion imino heterodclico, cualquiera de los cuales es primario, secundario, terciario o cuaternario, o un ion metalico monovalente.

En algunas realizaciones, Z es ion piridinio, ion trietilamonio, ion N,N-diisopropiletilamonio, ion 1,8- diazabiciclo[5.4.0]undec-7-enio, ion sodio o ion potasio.

En algunas realizaciones, el azucar es un anillo de ribosa. En otras realizaciones, el azucar es restos desoxirribosa, pentofuranosa, pentopiranosa o hexopiranosa. En otras realizaciones, el azucar es un azucar modificado. En algunas realizaciones, el azucar es un analogo de glicerol o un azucar con sustituciones.

Los monomeros de nucleosidos de H-fosfonato se preparan facilmente y son estables. Se han descrito metodos de su preparacion (vease, por ejemplo, Froehler, B.C. Methods in Molecular Biology. En Protocols for Oligonucleotides and Analogs; Agrawal, S., Ed.; Humana: Totowa, 1993; vol 20, p 63-80).

En algunas realizaciones, el monomero de nucleosidos comprende un resto de H-fosfonato aquiral unido al nucleosido en la posicion 3'. En aun realizaciones adicionales, el monomero de nucleosidos comprende un resto de H-fosfonato aquiral unido al resto de nucleosido en la posicion 3' mediante un resto de enlace intermedio. En realizaciones especificas, el resto de enlace intermedio es un grupo metileno (vease, por ejemplo, el documento WO/2001/02415). En algunas realizaciones, el resto de H-fosfonato esta unido en la posicion 2' del monomero de nucleosidos. En otras realizaciones, el monomero de nucleosidos comprende un resto de H-fosfonato aquiral unido al nucleosido en la posicion 5'.

Compuestos con un resto nucleofilo libre.

El compuesto que comprende un resto nucleofilo libre es un compuesto de formula 4-1 y reacciona en el centro de fosforo del producto intermedio quiral. La direccion de ataque en el fosforo por el grupo o resto nucleofilo depende de los sustituyentes del auxiliar quiral en el producto intermedio quiral (producto intermedio condensado). En una realizacion, la adicion de un reactivo de activacion puede ser util para ayudar al compuesto que comprende un resto nucleofilo libre a reaccionar en el centro de fosforo del producto intermedio quiral.

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Formula 4-1

En algunas realizaciones, el compuesto que comprende un resto nucleofilo libre es un acido nucleico previamente preparado usando metodos descritos en el presente documento o se prepara usando otros metodos conocidos de la sintesis de acidos nucleicos. En una realizacion, el compuesto que comprende un resto nucleofilo libre comprende un unico monomero de nucleosidos. En otra realizacion, el compuesto que comprende un resto nucleofilo libre comprende mas de una unidad de nucleosidos. En algunas realizaciones, el compuesto que comprende un resto nucleofilo libre es un producto de una etapa de alargamiento de cadena. En aun otras realizaciones, el compuesto que comprende un resto nucleofilo libre es un oligomero. En realizaciones adicionales, el compuesto que comprende un resto nucleofilo libre es un polimero. En algunas realizaciones, el compuesto que comprende un resto nucleofilo libre comprende un grupo hidroxilo como resto nucleofilo libre. En algunas realizaciones, el compuesto que comprende un resto nucleofilo libre comprende un grupo amino como resto nucleofilo libre. En algunas realizaciones, el compuesto que comprende un resto nucleofilo libre comprende un grupo tiol como resto nucleofilo libre.

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En algunas realizaciones, el compuesto que comprende un resto nucleofilo libre comprende un resto nucleofilo en cualquier posicion del azucar de nucleosido. En algunas realizaciones, el resto nucleofilo esta localizado en la posicion 5' del azucar. En algunas realizaciones, el resto nucleofilo esta localizado en la posicion 4' del azucar. En otras realizaciones, el resto nucleofilo esta localizado en la posicion 3' del azucar. En otras realizaciones, el resto nucleofilo esta localizado en la posicion 2' del azucar.

En algunas realizaciones, el compuesto de formula 4-1 es un nucleosido que comprende un resto 5'-OH y es un compuesto de formula 4:

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En la formula 4, cada caso de R2 es independientemente hidrogeno, -NRdRd, N3, halogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y1-, alquenil-Y1-, alquinil-Y1-, aril-Y1-, heteroaril-Y1-, -ORb o -SRc, en el que Rb es un resto de bloqueo.

Y1 es O, NRd, S o Se.

Rc es un grupo de bloqueo.

Y2 es O, NRd o S.

m es un numero entero de 0 a n-1.

n es un numero entero de 1 a aproximadamente 200.

Oa esta conectado a un resto de tritilo, un resto de sililo, un resto de acetilo, un resto de acilo, un resto de arilacilo, un resto de enlace conectado a un soporte solido o un resto de enlace conectado a un acido nucleico.

J es O y D es H, o J es S, Se o BH3 y D es un ligando quiral Ci o un resto de formula A:

imagen39

G3 G2

Formula A

en la que Wi y W2 son independientemente NHG5, OH o SH.

A es hidrogeno, resto de acilo, arilo, alquilo, aralquilo o sililo.

G1, G2, G3, G4 y G5 son independientemente hidrogeno, alquilo, aralquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heteroarilo o arilo, o dos de G1, G2, G3, G4 y G5 son G6 que tomados conjuntamente forman un anillo carbociclico saturado, parcialmente insaturado o insaturado, o que contiene heteroatomo de hasta

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aproximadamente 20 atomos de anillo que es monodclico o polidclico, condensado o no condensado, y en el que no mas de cuatro de G1, G2, G3, G4 y G5 son G6.

En otras realizaciones, donde J es S, Se o BH3 y D es un resto de formula A-I:

imagen40

Formula A-I

en la que Ui, U3, U2, r, G1, G2, G3, G4, Wi, W2, A son como se definen en el presente documento para la

formula 3-I. En una realizacion de la formula A-I, A es hidrogeno.

En algunas realizaciones, el nucleosido que comprende un resto 5'-OH de formula 4 es un producto intermedio de un ciclo de alargamiento de cadena previo como se describe en el presente documento. En aun otras realizaciones, el compuesto de formula 4 es un producto intermedio de otro metodo sintetico de acido nucleico conocido. En algunas realizaciones, el compuesto de formula 4 esta unido a un soporte solido. En otras realizaciones, el compuesto de formula 4 no esta unido a soporte solido y esta libre en el disolvente o solucion.

En una realizacion, m es 0 y el compuesto de formula 4 es una unica unidad de nucleosidos y se considera el primer nucleosido del acido nucleico. En alguna realizacion, m es 0 y el compuesto de formula 4 es una unidad de nucleosidos unida a otro acido nucleico mediante el oxigeno de 3'. En otras realizaciones, m es mayor de 0 y el compuesto de formula 4 es un acido nucleico polimerico u oligomerico que comprende un resto 5'-Oh. En otras realizaciones, m es mayor de 0 y el compuesto de formula 4 es el producto final de un ciclo de alargamiento de cadena previo. En algunas realizaciones, donde m es mayor de 0, el compuesto de formula 4 es un nucleosido que se une ademas a un nucleotido, mediante un enlace tanto en la posicion 3' como en otra posicion en el nucleosido.

Donde el compuesto de formula 4 esta unido a otro nucleotido o acido nucleico, el enlace del esqueleto internucleosidico de fosfato incluye, y no se limitan a, puentes de atomos de fosforo 2' a 5', puentes de atomos de fosforo 3' a 5', puentes de atomos de fosforo 5' a 3' y los puentes de atomos de fosforo 3' a 2' y puentes 4' a 2'. El enlace del esqueleto internucleosidico de fosfato incluye otros tipos de puentes de atomos de fosforo, tambien se contempla que incluyen, pero no se limitan a, puentes de metilenbisfosfonato.

El acido nucleico de formula 1 comprende las mismas nucleobases o diferentes. En algunas realizaciones, el acido nucleico de formula 1 comprende todas las nucleobases iguales. En otras realizaciones, el acido nucleico de formula 1 comprende nucleobases diferentes. En otras realizaciones, el acido nucleico de formula 1 comprende las nucleobases que existen de forma natural. En algunas realizaciones, el acido nucleico de formula 1 comprende nucleobases modificadas. En aun otras realizaciones, el acido nucleico contiene nucleobases que imitan la secuencia de nucleobases de un acido nucleico encontrado en la naturaleza. En algunas realizaciones, el acido nucleico de formula 1 comprende una mezcla de nucleobases que existen de forma natural y nucleobases modificadas.

El compuesto que comprende un resto nucleofilo libre esta libre en solucion. En algunas realizaciones, el compuesto que comprende un resto nucleofilo libre no esta unido a un soporte solido. Esto permite sintetizar los acidos nucleicos en solucion (sintesis en fase liquida o sintesis en fase de solucion). Alternativamente, el compuesto que comprende un resto nucleofilo libre se une previamente a otro resto tal como un soporte solido. En algunas realizaciones, el compuesto que comprende un resto nucleofilo libre es un nucleosido unido a un soporte solido en el hidroxilo 3' del nucleosido. La union del acido nucleico a un soporte solido permite la sintesis usando sintesis en fase solida. Durante la sintesis de acidos nucleicos, el compuesto unido a un soporte solido se trata con diversos reactivos en un ciclo de alargamiento de cadena o ciclos de alargamiento de cadena repetidos para lograr el alargamiento escalonado de una cadena de acido nucleico en crecimiento con unidades de acido nucleico individuales. Las etapas de purificacion normalmente no se llevan a cabo hasta que se sintetiza la secuencia de acidos nucleicos completamente ensamblada. Se conocen diversos tipos de materiales de soporte solido y se usan en la sintesis de acidos nucleicos, proteinas y oligosacaridos. En algunas realizaciones, el compuesto que comprende un resto nucleofilo libre se une a un soporte solido mediante un resto de enlace. En otras realizaciones, el compuesto que comprende un resto nucleofilo libre se une a un soporte solido sin un resto de enlace.

El compuesto que comprende un resto nucleofilo libre comprende un azucar, azucar sustituido o azucar modificado. En algunas realizaciones, el azucar es un azucar ribosa. En algunas realizaciones, el azucar es un azucar desoxirribosa. En algunas realizaciones, el compuesto que comprende un resto nucleofilo libre comprende una mezcla de un azucar ribosa y un azucar desoxirribosa. En otras realizaciones, el azucar es restos de pentofuranosa,

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pentopiranosa, hexopiranosa o mezclas de los mismos. En realizaciones adicionales, el azucar comprende una estructura de anillo cerrada, una estructura abierta, o mezclas de las mismas.

El reactante de nucleosido que comprende un resto OH sin proteger puede contener el grupo OH sin proteger en cualquier posicion en el nucleo de azucar. En una realizacion, un resto de H-fosfonato aquiral se condensa con un nucleosido que comprende un resto 5'-OH para formar el producto intermedio condensado. En otra realizacion, un resto de H-fosfonato aquiral se condensa con un nucleosido que comprende un resto 4'-OH para formar el producto intermedio condensado. En otra realizacion, un resto de H-fosfonato aquiral se condensa con un nucleosido que comprende un resto 3'-OH para formar el producto intermedio condensado. En otra realizacion mas, un resto de H- fosfonato aquiral se condensa con un nucleosido que comprende un resto 2'-OH para formar el producto intermedio condensado.

En algunas realizaciones, acidificar el producto intermedio condensado produce un compuesto de formula 4 en la que m es al menos uno. En otras realizaciones, el producto intermedio condensado comprende un resto de formula A', que es equivalente a un resto de formula A en la que A es hidrogeno y en la que G1 y G2 son independientemente alquilo, aralquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heteroarilo o arilo y G3, G4 y G5 son independientemente hidrogeno, alquilo, aralquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heterociclilo, heteroarilo o arilo, o dos de G1, G2, G3, G4 y G5 son G6 que tomados conjuntamente forman un anillo carbociclico saturado, parcialmente insaturado o insaturado, o que contiene heteroatomo de hasta aproximadamente 20 atomos de anillo que es monociclico o policiclico, condensado o no condensado, y en el que no mas de cuatro de G1, G2, G3, G4 y G5 son G6.

Discusion detallada de los metodos de sintesis.

La extension de la cadena de acido nucleico puede realizarse en la direction 3' a 5'. En una realizacion, el acido nucleico se sintetiza a partir del hidroxilo libre en el extremo 5' en ciclos repetitivos de reacciones quimicas. Alternativamente, la extension de la cadena de acido nucleico puede realizarse en la direccion 5' a 3'. En una realizacion, el acido nucleico se sintetiza a partir del hidroxilo libre en el extremo 3' en ciclos repetitivos de reacciones quimicas.

Una realizacion del metodo de sintesis del acido nucleico se muestra en el esquema 5 (Via A). Se entiende que los metodos en el presente documento no se limitan al esquema, su secuencia de acontecimientos o sus productos intermedios como se ilustran. En una realizacion descrita en el Esquema 5, un H-fosfonato aquiral de formula 2 se trata con un reactivo de condensation para formar un producto intermedio de estructura II. En una realizacion, un reactivo de activation se anade a la mezcla de reaction durante la etapa de condensacion. El uso de un reactivo de activation depende de las condiciones de reaccion tales como los disolventes que se usan para la reaccion. El producto intermedio de estructura II no se aisla y se trata en el mismo recipiente con un reactivo quiral para formar un producto intermedio quiral de estructura III. El producto intermedio de estructura III no se aisla y se somete a una reaccion en el mismo recipiente con un nucleosido o nucleosido modificado de estructura IV para proporcionar un compuesto de fosfito quiral de estructura V. En algunas realizaciones, la estructura V se extrae en un disolvente para separarla de productos secundarios, impurezas y/o reactivos. En otras realizaciones, cuando el metodo se realiza mediante sintesis en fase solida, el soporte solido que comprende el compuesto de estructura V se filtra de los productos secundarios, impurezas y/o reactivos. Si el acido nucleico final es mas grande que un dimero, el auxiliar quiral en el compuesto de estructura V se termina con un grupo de bloqueo para proporcionar un compuesto de estructura VI. Si el acido nucleico final es un dimero, entonces no es necesaria la etapa de termination. El compuesto de estructura VI se modifica mediante reaccion con un electrofilo para proporcionar un compuesto de estructura VII. El producto intermedio condensado modificado y terminado de estructura VII se desbloquea para eliminar el grupo de bloqueo en el extremo 5' de la cadena de acido nucleico en crecimiento para proporcionar un compuesto de estructura IV. Se permite opcionalmente que el compuesto de estructura IV vuelva a entrar en el ciclo de alargamiento de cadena para formar un producto intermedio condensado, un producto intermedio condensado terminado, un producto intermedio condensado terminado modificado y un producto intermedio terminado modificado desprotegido en 5'. Siguiendo al menos una ronda del ciclo de alargamiento de cadena, el producto intermedio terminado modificado desprotegido en 5' se desbloquea adicionalmente por elimination del ligando del auxiliar quiral y otros grupos protectores, por ejemplo, grupos protectores de nucleobase, nucleobase modificada, azucar y azucar modificado, para proporcionar un acido nucleico de formula 1. En otras realizaciones, el nucleosido que comprende un resto 5'-Oh es un producto intermedio de un ciclo de alargamiento de cadena previo como se describe en el presente documento. En aun otras realizaciones, el nucleosido que comprende un resto 5'-OH es un producto intermedio obtenido de otro metodo sintetico de acidos nucleicos conocido. Despues de un ciclo de sintesis con el primer nucleosido, los nucleosidos, nucleotidos o acidos nucleicos que contienen un resto -OH no protegido pueden usarse para ciclos de alargamiento posteriores. En realizaciones donde se usa un soporte solido, el acido nucleico modificado en el atomo de fosforo se escinde entonces del soporte solido. En ciertas realizaciones, los acidos nucleicos se dejan unidos sobre el soporte solido para fines de purification y luego se escinden del soporte solido tras la purificacion. En una realizacion, la sintesis descrita en el Esquema 5 (Via A) es util cuando las posiciones G1 y G2 del ligando del auxiliar quiral de formula A son hidrogeno. En aun otras realizaciones, los compuestos de estructura III-VII comprenden un resto de formula A-I en lugar de un resto de formula A.

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Esquema 5. Sintesis de un acido nucleico que comprende un resto de X-fosfonato quiral de formula 1

mediante la Ruta A.

imagen41

activacion

condensacion

Formula 2

terminacion

eliminar el auxiliar quiral

ciclo

de alargamiento de cadena

eliminar otros grupos protectores, escindir del soporte solido

desbloquear el extremo 5'

modificar

Formula 1

\yt]: reactivo quiral
\yt]

. -A . El

En otra realizacion, descrita en el Esquema 6 (Ruta B), un H-fosfonato aquiral de formula 2 se trata con un reactivo de condensacion para formar un producto intermedio de estructura II. En una realizacion, un reactivo de activacion se anade a la mezcla de reaccion durante la etapa de condensacion. El uso de un reactivo de activacion depende de las condiciones de reaccion tales como los disolventes que se usan para la reaccion. El producto intermedio de estructura II no se aisla y se trata en el mismo recipiente con un reactivo quiral para formar un producto intermedio quiral de estructura III. El producto intermedio de estructura III no se aisla y se somete a una reaccion en el mismo recipiente con un nucleosido o nucleosido modificado de estructura IX para proporcionar un compuesto de fosfito quiral de estructura X. En algunas realizaciones, la estructura X se extrae en un disolvente para separarla de productos secundarios, impurezas y/o reactivos. En otras realizaciones, cuando el metodo se realiza mediante sintesis en fase solida, el soporte solido que comprende el compuesto de estructura X se filtra de los productos secundarios, impurezas y/o reactivos. El compuesto de estructura X se trata con un acido para eliminar el grupo de bloqueo en el extremo 5' de la cadena de acido nucleico en crecimiento (estructura XI). La etapa de acidificacion tambien elimina el ligando de auxiliar quiral para proporcionar un compuesto de estructura IX. Se permite opcionalmente que el producto intermedio desbloqueado en 5' vuelva a entrar en la ciclo de alargamiento de cadena para formar un producto intermedio condensado que contiene un extremo 5' bloqueado, que entonces se acidifica hasta eliminar el grupo de bloqueo del extremo 5' y el ligando de auxiliar quiral. Siguiendo al menos una ronda de ciclo de alargamiento de cadena, el producto intermedio desprotegido en 5' se somete a una etapa de modificacion para introducir un resto X unido a cada uno de los atomos de fosforo para proporcionar un compuesto de estructura XII. El producto intermedio modificado se desbloquea por la eliminacion de los grupos protectores restantes, por ejemplo, se eliminan los grupos protectores de nucleobase, nucleobase modificada, azucar o azucar modificado, para proporcionar un acido nucleico de formula 1. En otras realizaciones, el nucleosido que comprende un resto 5'- OH es un producto intermedio de un ciclo de alargamiento de cadena previo como se describe en el presente documento. En aun otras realizaciones, el nucleosido que comprende un resto 5'-OH es un producto intermedio obtenido de otro metodo sintetico de acidos nucleicos conocido. Despues de un ciclo de sintesis con el primer nucleosido, el nucleosido, nucleotido o acido nucleico que contiene un resto -OH no protegido puede usarse para ciclos de alargamiento posteriores. En realizaciones donde se usa un soporte solido, el acido nucleico modificado en el atomo de fosforo se escinde entonces del soporte solido. En ciertas realizaciones, los acidos nucleicos se dejan unidos sobre el soporte solido para fines de purificacion y luego se escinden del soporte solido tras la purificacion. En una realizacion, la sintesis descrita en el Esquema 6 (Ruta B) es util cuando las posiciones G1 y G2 del ligando de auxiliar quiral de formula A no son hidrogeno. En algunas realizaciones, los compuestos de estructuras III, X y XI comprenden un resto de formula A-I en lugar de un resto de formula A.

Esquema 6. Sfntesis de un acido nucleico que comprende un resto de X-fosfonato quiral de formula 1

mediante la Ruta B.

imagen42

5

Sfntesis de 5' a 3' inversa de acidos nucleicos.

Un acido nucleico que comprende un resto de X-fosfonato quiral de formula 1 se sintetiza alternativamente de la direccion 5’ a 3’. En realizaciones donde se usa un soporte solido, el acido nucleico se une al soporte solido 10 mediante su extremo 5’ del acido nucleico en crecimiento, presentando asf su grupo 3’ para la reaccion, que incluye reaccion enzimatica (por ejemplo, ligacion y polimerizacion). En algunas realizaciones, esta orientacion se manipula preparando monomeros de nucleosidos que comprenden un resto de H-fosfonato aquiral en la posicion 5’ y grupo hidroxilo protegido en la posicion 3’. En una realization, el acido nucleico se sintetiza segun el Esquema 7. En el Esquema 7, -R4 es -ORb como se ha definido anteriormente o, en el ultimo ciclo de sfntesis, es R4, que es 15 equivalente a R1 como se define en el presente documento.

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Esquema 7. Smtesis de 5’ a 3' de un acido nucleico que comprende un resto de X-fosfonato quiral de formula

1.

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activacion

acidificar

condensacion

modificar

se elimina el auxiliar

reactivo quiral

?W-

o r

(desbloquear el extremo 3 )

XIV

de alargamiento

de cadena

R2 J

eliminar otros grupos protectores

escindir del soporte solido

quiral durante

la acidificacion

G3 G2

Formula 1

En la realization descrita en el Esquema 7, se trata un H-fosfonato aquiral de estructura Ir con un reactivo de condensacion para formar un producto intermedio de estructura IIr. El producto intermedio de estructura IIr no se aisla y se trata en el mismo recipiente con un reactivo quiral para formar un producto intermedio de estructura Illr. En una realizacion, un reactivo de activacion se usa durante la etapa de condensacion. El uso de un reactivo de activacion depende de las condiciones de reaction tales como los disolventes que se usan para la reaction. El producto intermedio de estructura Illr no se aisla y se somete a una reaccion en el mismo recipiente con un nucleosido o nucleosido modificado de estructura XIII para proporcionar un compuesto de fosfito quiral de estructura XIV. En algunas realizaciones, la estructura XIV se extrae en un disolvente para separarla de productos secundarios, impurezas y/o reactivos. En otras realizaciones, cuando el metodo se realiza mediante smtesis en fase solida, el soporte solido que comprende el compuesto de estructura XIV se filtra de los productos secundarios, impurezas y/o reactivos. El compuesto de estructura XIV se trata con un acido para eliminar el grupo de bloqueo en el extremo 3’ de la cadena de acido nucleico en crecimiento (estructura XV). La etapa de acidificacion tambien elimina el ligando de auxiliar quiral para proporcionar un compuesto de estructura XIII. Se permite opcionalmente que el producto intermedio desbloqueado en 3’ vuelva a entrar en la ciclo de alargamiento de cadena para formar un producto intermedio condensado que contiene un extremo 3’ bloqueado, que entonces se acidifica hasta eliminar el grupo de bloqueo del extremo 3’ y el ligando de auxiliar quiral. Siguiendo al menos una ronda de ciclo de alargamiento de cadena, el producto intermedio desprotegido en 3’ se somete a una etapa de modification para introducir un resto X unido a cada uno de los atomos de fosforo para proporcionar un compuesto de estructura XVI. El producto intermedio modificado se desbloquea por la elimination de los grupos protectores restantes, por ejemplo, se eliminan grupos protectores de nucleobase, nucleobase modificada, azucar o azucar modificado, para proporcionar un acido nucleico de formula 1. En otras realizaciones, el nucleosido que comprende un resto 3’-OH es un producto intermedio de un ciclo de alargamiento de cadena previo como se describe en el presente documento. En aun otras realizaciones, el nucleosido que comprende un resto 3’-OH es un producto intermedio obtenido de otro metodo sintetico de acidos nucleicos conocido. Despues de un ciclo de sintesis con el primer nucleosido, pueden usarse nucleosidos, nucleotidos o acidos nucleicos que contienen un resto -OH no protegido para ciclos de alargamiento posteriores. En realizaciones donde se usa un soporte solido, el acido nucleico modificado en el atomo de fosforo puede entonces escindirse del soporte solido, localizado en el extremo 5’. En ciertas realizaciones, los acidos nucleicos pueden opcionalmente dejarse unidos sobre el soporte solido para fines de purification y luego se escinden del soporte solido tras la purificacion. En un aspecto, la sintesis descrita en el Esquema 7 es util cuando ninguna de las posiciones G1 y G2 del ligando de auxiliar quiral de formula A son hidrogeno. La sintesis de 5’ a 3’ inversa puede llevarse a cabo usando los mismos materiales de partida en el Esquema 7 en un mecanismo analogo a las etapas en la Ruta A. En algunas realizaciones, los compuestos de estructuras IIIr, XIV y XV comprenden un resto de formula A-I en lugar de un resto de formula A.

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Ciclo de alargamiento de cadena.

La smtesis estereoselectiva de un acido nucleico modificado en un atomo de fosforo comprende un ciclo de alargamiento de cadena. El ciclo de alargamiento de cadena empieza con una reaccion de condensation entre un compuesto que es la siguiente unidad (por ejemplo, molecular que comprende un resto de H-fosfonato aquiral) que va a anadirse al acido nucleico y otro compuesto que comprende un resto nucleofilo libre (por ejemplo, resto hidroxilo). En algunas realizaciones, el compuesto que comprende un resto nucleofilo libre es un nucleosido de monomero. En otras realizaciones, el compuesto que comprende un resto nucleofilo libre es un oligomero o polimero de acido nucleico de un ciclo de alargamiento de cadena previo como se describe en el presente documento. En otras realizaciones, el compuesto que comprende un resto nucleofilo libre es un oligomero o polimero de acido nucleico de un ciclo de alargamiento de cadena realizado usando otros metodos conocidos en la tecnica.

El numero de rondas de ciclos de alargamiento de cadena se determina por la longitud del acido nucleico que se sintetiza. En algunas realizaciones, el ciclo de alargamiento de cadena se produce una vez. En otras realizaciones, el ciclo de alargamiento de cadena se repite mas de una vez para lograr el alargamiento escalonado de una cadena de oligonucleotido en crecimiento con unidades de nucleotido individuales.

En una realization, se necesita una ronda del ciclo de alargamiento de cadena si un acido nucleico es un dimero. En otra realizacion, se necesitan 9 rondas del ciclo de alargamiento de cadena si un acido nucleico comprende diez unidades de nucleosido. En otra realizacion mas, se necesitan 20 rondas del ciclo de alargamiento de cadena si van a anadirse 20 unidades de nucleosido adicionales a una cadena de acido nucleico previamente sintetizada. Sera evidente para aquellos expertos en la tecnica que el numero de ciclos de alargamiento de cadena puede ajustarse para la longitud diana del acido nucleico. Los acidos nucleicos sintetizados por los metodos en el presente documento no estan limitados por el numero de ciclos de alargamiento de cadena como se describe en el presente documento.

Modification del producto intermedio condensado obtenido mediante la Ruta A para introducir un resto de X- fosfonato.

Esquema 8. Modificacion del producto intermedio condensado obtenido mediante la Ruta A.

imagen44

En el compuesto de formula 5, R1 es -NRdRd, -N3, halogeno, hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y1-, alquenil-Y1-, alquinil-Y1-, aril-Y1-, heteroaril-Y1-, -P(O)(Re)2 o -HP(O)(Re), -ORa o -SRc.

Y1 es O, NRd, S o Se; Ra es un resto de bloqueo.

Rc es un grupo de bloqueo.

Y2 es O, NRd o S.

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Cada caso de R2 es independientemente hidrogeno, -NRdRd, N3, halogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y1-, alquenil-Y1-, alquinil-Y1-, aril-Y1-, heteroaril-Y1-, -ORb o -SRc, en el que Rb es un resto de bloqueo.

Cada caso de Ba es independientemente una adenina bloqueada o no bloqueada, citosina, guanina, timina, uracilo, o nucleobase modificada.

Cada caso de J es S, Se o BH3; v es un numero entero de 1 a n-1.

Oa esta conectado a un resto de enlace conectado a un soporte solido o un resto de enlace conectado a un acido nucleico.

A es un resto de acilo, arilo, alquilo, aralquilo o de sililo; y G1, G2, G3, G4 y G5 son independientemente hidrogeno, alquilo, aralquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heterociclilo, heteroarilo o arilo, o dos de G1, G2, G3, G4 y G5 son G6 que tomados conjuntamente forman un anillo carbociclico saturado, parcialmente insaturado o insaturado, o que contiene heteroatomo de hasta aproximadamente 20 atomos de anillo que es monociclico o policiclico, condensado o no condensado, y en el que no mas de cuatro de G1, G2, G3, G4 y G5 son G6.

En algunas realizaciones, el compuesto de formula 5 comprende un resto de formula A-I unido en el atomo de fosforo. En otras realizaciones, el compuesto de formula 5 comprende un resto de formula A unido en el atomo de fosforo. En el metodo ilustrado en la Ruta A, el producto intermedio condensado resultante de la adicion de un nuevo nucleosido se termina para producir el compuesto de estructura V y entonces se modifica en el fosforo para introducir J, que es S, Se o BH3, produciendo un compuesto de formula 5, donde v es un numero entero de 1 a n-1. El compuesto de formula 5 tanto se trata para escindir el auxiliar quiral terminado y desbloquear los grupos de bloqueo restantes como se somete a ciclos adicionales de alargamiento de cadena y modificacion de fosforo. En el caso de que el acido nucleico final sea un dimero, la terminacion no es necesaria. En una realization de la estructura V, A es hidrogeno, resto de acilo, arilo, alquilo, aralquilo o de sililo. En una realizacion del Esquema 9, el producto intermedio condensado resultante de la adicion de un nuevo nucleosido no se termina para producir un compuesto de estructura V, donde v es 0. Esta estructura V, donde v es 0, se modifica entonces en el fosforo para introducir J, que es S, Se o BH3, produciendo un compuesto de formula 5, donde v es un numero entero de 0.

En algunas realizaciones, el agente de modificacion es un electrofilo de azufre, electrofilo de selenio o agente de boracion.

En algunas realizaciones, el electrofilo de azufre es un compuesto que tiene una de las siguientes formulas:

S8 (Formula B), Z24-S-S-Z25 o Z24-S-X-Z25,

en las que Z24 y Z25 son independientemente alquilo, aminoalquilo, cicloalquilo, heterociclico, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, alquiloxi, ariloxi, heteroariloxi, acilo, amida, imida o tiocarbonilo, o Z24 y Z25 se toman conjuntamente para formar un anillo aliciclico o heterociclico de 3 a 8 miembros, que puede estar sustituido o sin sustituir; X es SO2, O o NRf; y Rf es hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo o arilo. En otras realizaciones, el electrofilo de azufre es un compuesto de formula B, C, D, E o F:

imagen45

S8

Formula B

imagen46

Formula C

imagen47

Formula D

*0

Formula E

Formula F

NH

En otras realizaciones, el electrofilo de azufre es la formula F, formula E o formula B.

En algunas realizaciones, el electrofilo de selenio es un compuesto que tiene una de las siguientes formulas:

Se (Formula G), Z26-Se-Se-Z27 o Z26-Se-X-Z27,

en las que Z26 y Z27 son independientemente alquilo, aminoalquilo, cicloalquilo, heterociclico, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, alquiloxi, ariloxi, heteroariloxi, acilo, amida, imida o tiocarbonilo, o Z26 y Z27 se toman conjuntamente para formar un anillo aliciclico o heterociclico de 3 a 8 miembros, que puede estar sustituido o sin sustituir; X es SO2, S, O o NRf; y Rf es hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo o arilo.

En otras realizaciones, el electrofilo de selenio es un compuesto de formula G, H, I, J, K o L.

5

10

15

20

25

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35

40

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50

55

Se

Formula G

£

P-F

KSeCN Formula H

Plr-P—Ph

Formula I

imagen48

Formula J

P\

Se-§p

Ph

Formula K

/ \

NC Se-S^ Formula L

En algunas realizaciones, el electrofilo de selenio es la formula G o la formula L.

En algunas realizaciones, el agente de boracion es borano-N,W-diisopropiletilamina (BH3DIPEA), borano-piridina (BH3-Py), borano-2-cloropiridina (BH3-CPy), borano-anilina (BH3-An), borano-tetrahidrofurano (BH3THF) o borano- sulfuro de dimetilo (BH3-Me2S), anilina-cianoborano, trifenilfosfina-carboalcoxiboranos.

En otras realizaciones, el agente de boracion es borano-N,N-diisopropiletilamina (BH3DIPEA), borano-2-cloropiridina (BH3-CPy), borano-tetrahidrofurano (BH3THF) o borano-sulfuro de dimetilo (BH3-Me2S).

En realizaciones adicionales, despues de la modificacion del producto intermedio condensado obtenido mediante la Ruta A, el compuesto de formula 5 se desbloquea en la posicion R1 para producir un compuesto de formula 4, en la que m es al menos 1, J es S, Se o BH3 y D es un resto de formula A. En algunas realizaciones, tras el desbloqueo de R1, se produce un compuesto de formula 4 en la que D es un resto de formula A-I. El compuesto de formula 4 se hace reaccionar con un nucleosido de estructura III para producir un producto intermedio condensado. La etapa de convertir el producto intermedio condensado comprende terminar el producto intermedio condensado y modificar el producto intermedio condensado terminado para producir un compuesto de formula 5. En algunas realizaciones del compuesto de formula 5, v es mayor de 2 y menor de aproximadamente 200. Se repite opcionalmente desbloquear en la posicion R1, hacer reaccionar con un nucleosido de estructura III, terminar y modificar para formar un compuesto de formula 5 en la que v aumenta 1 numero entero. En algunas realizaciones del compuesto de formula 5, v es mayor de 3 y menor de aproximadamente 200.

En realizaciones adicionales, el compuesto de formula 5 se convierte en el compuesto de formula 1 donde en algunas realizaciones cada resto Ba no esta bloqueado. En otras realizaciones, el compuesto de formula 5 se convierte en el compuesto de formula 1 en la que no todos los restos Ba estan sin bloquear.

R1 es -OH, -SH, -NRdRd, -N3, halogeno, hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y1-, alquenil-Y1-, alquinil-Y1-, aril-Y1-, heteroaril-Y1-, -P(O)(Re)2, -HP(O)(Re), -ORa o -SRc; donde Y1 es O, NRd, S o Se, Ra es un resto de bloqueo y Rc es un grupo de bloqueo. En algunas realizaciones, R1 esta desbloqueado. En aun otras realizaciones, R1 sigue bloqueado.

Cada caso de Rd es independientemente hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, sililo sustituido, carbamato, - P(O)(Re)2 o -HP(O)(Re), y cada caso de Re es independientemente hidrogeno, alquilo, arilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y2-, alquenil-Y2-, alquinil-Y2-, aril-Y2- o heteroaril-Y2-, o un cation que es Na+1, Li+1 o K+1, donde Y2 es O, NRd o S.

Cada caso de R2 es independientemente hidrogeno, -OH, -SH, -NRdRd, N3, halogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y1-, alquenil-Y1-, alquinil-Y1-, aril-Y1-, heteroaril-Y1-.

En algunas realizaciones, R3 es H. En otras realizaciones, R3 es un grupo de bloqueo o un resto de enlace conectado a soporte solido, nucleosido, nucleotido o acido nucleico. En algunas realizaciones, cada caso de X es independientemente -S-Z+, -Se-Z+ o -BH3-Z+; y Z+ es ion amonio, ion alquilamonio, ion imino heteroaromatico o ion imino heterociclico, cualquiera de los cuales es primario, secundario, terciario o cuaternario, o Z+ es un ion metalico monovalente.

Modificacion del compuesto de formula 4 obtenido mediante la Ruta B para introducir un resto de X- fosfonato.

Los metodos usados para modificar el compuesto de formula 4 obtenido mediante la Ruta B se ilustran en los Esquemas de reaccion 9a y 9b. El fosfonato y el fosfito son conocidos por tautomerizar y existir en equilibrio. El tautomero de fosfito es menos estable que el tautomero de fosfonato. El equilibrio tiende hacia el tautomero de fosfonato en condiciones neutras debido al enlace P=O muy fuerte. En condiciones acidas, el grupo fosforilo del fosfonato llega a protonarse reversiblemente. La escision del enlace P-H en el producto intermedio se produce lentamente para producir el producto intermedio de fosfito. La estructura IX se modifica entonces para formar la estructura XII, usando los reactivos mostrados en los Esquemas de reaccion 9a y 9b.

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Esquema de reaccion 9a. Modificacion de fosforo en los productos intermedios sintetizados mediante la Ruta B, usando una halogenacion inicial en el fosforo.

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Esquema de reaccion 9b. Modificacion de fosforo en los productos intermedios sintetizados mediante la

Ruta B, usando una sililacion inicial.

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En algunas realizaciones, la etapa de modificacion se realiza haciendo reaccionar la estructura IX con un reactivo de halogenacion, seguido de haciendo reaccionar con un nucleofilo (Esquema 9a). En realizaciones especificas, el reactivo de halogenacion es CCl4, CBr4, CI4, Cl2, Br2, I2, cloruro de sulfurilo (SO2Ch), fosgeno, bis(triclorometil)carbonato (BTC), monocloruro de azufre, dicloruro de azufre, cloramina, CuCl2, N-clorosuccinimida (NCS), N-bromosuccinimida (NBS) o N-yodosuccinimida (NIS). En otras realizaciones especificas, el reactivo de halogenacion es CCl4, CBr4, Ch, cloruro de sulfurilo (SO2Cl2) o N-clorosuccinimida (NCS). En algunas realizaciones, el nucleofilo es aminas primarias o secundarias, alcoholes, o tioles. En otras realizaciones, el nucleofilo es NRfRfH, RfOH o RfSH, en el que Rf es hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo o arilo, y al menos uno de Rf de NRfRfH no es hidrogeno.

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La etapa de modificacion tambien puede realizarse haciendo reaccionar la estructura IX con un reactivo de sililacion, seguido de reaccion con un electrofilo de azufre, un electrofilo de selenio, un agente de boracion, un agente alquilante, un aldehido o un agente acilante (Esquema 9b).

En realizaciones especificas, el reactivo de sililacion es clorotrimetilsilano (TMS-CI), cloruro de triisopropilsililo (TIPS- Cl), cloruro de t-butildimetilsililo (TBDMS-Cl), cloruro de t-butildifenilsililo (TBDPS-Cl), 1,1,1,3,3,3-hexametildisilazano (HMDS), N-trimetilsilildimetilamina (TMSdMa), N-trimetilsilildietilamina (TmSDEA), N-trimetilsililacetamida (TMSA), N,O-bis(trimetilsilil)acetamida (BSA) o N,O-bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida (BSTfA).

En otras realizaciones especificas, el electrofilo de azufre es un compuesto que tiene una de las siguientes formulas:

S8 (Formula B), Z24-S-S-Z21 o Z24-S-X-Z25,

S8

Formula B

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Formula C Formula D

Formula E

HN-/

/ Vs

Formula F

Se (Formula G), Z26-Se-Se-Z27 o Z26-Se-X-Z27,

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Ph-P-Ph

Se KSeCN Ph

Formula G Formula H Formula I

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Formula J

P\

Se-§p

Ph

Formula K

/ \

NC Se-S^ yON Formula L

En algunas realizaciones, el agente de boracion es borano-N,N-diisopropiletilamina (BH3DIPEA), borano-piridina (BH3-Py), borano-2-cloropiridina (BH3-CPy), borano-anilina (BH3-An), borano-tetrahidrofurano (BH3THF) o borano- sulfuro de dimetilo (BH3-Me2S), anilina-cianoborano, trifenilfosfina-carboalcoxiboranos. En otras realizaciones, el agente de boracion es borano-N,N-diisopropiletilamina (BH3DIPEA), borano-2-cloropiridina (BH3-CPy), borano- tetrahidrofurano (BH3THF) o borano-sulfuro de dimetilo (BH3-Me2S).

En otras realizaciones, el agente alquilante es un haluro de alquilo, haluro de alquenilo, haluro de alquinilo, sulfonato de alquilo, sulfonato de alquenilo o sulfonato de alquinilo.

En otras realizaciones, el aldehido es (para)-formaldehido, alquilaldehido, alquenilaldehido, alquinilaldehido o arilaldehido.

En aun otras realizaciones, el agente acilante es un compuesto de formula M o N:

O

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Formula M

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Formula N

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en las que G7 es alquilo, cicloalquilo, heterodclico, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, alquiloxi, ariloxi o heteroariloxi; y M es F, Cl, Br, I, 3-nitro-1,2,4-triazol, imidazol, alquiltriazol, tetrazol, pentafluorobenceno o 1- hidroxibenzotriazol.

En realizaciones adicionales, despues de acidificar, el compuesto de formula 4, en la que m es al menos uno, J es O y D es H, se hace reaccionar con un nucleosido de estructura III para formar un producto intermedio condensado, que se convierte acidificando para producir un compuesto de formula 4 en la que m es al menos 2 y menos de aproximadamente 200; J es O y D es H. En otras realizaciones, el compuesto de formula 4 se hace reaccionar ademas opcionalmente con un nucleosido de estructura III para formar un producto intermedio condensado, seguido de acidificacion. La reaccion con el nucleosido de estructura III y la acidificacion se repiten hasta que se logre un numero deseado de unidades en la cadena en crecimiento. En algunas realizaciones, se produce un compuesto de formula 4 en la que m aumenta 1 numero entero. En algunas realizaciones, se produce un compuesto de formula 4 en la que m es mayor de 2 y menor de aproximadamente 200. En algunas realizaciones, el producto intermedio condensado comprende un resto de formula A-I en lugar de un resto de formula A.

En realizaciones adicionales, el compuesto de formula 4 se modifica para introducir un resto X, produciendo asi un compuesto de formula 1. En una realizacion del compuesto de formula 1, R3 es un grupo de bloqueo o un resto de enlace conectado a un soporte solido. En otras realizaciones, R1 esta desbloqueado. En aun otras realizaciones, el compuesto de formula 1 se trata de forma que R1 siga bloqueado. En aun realizaciones adicionales, el compuesto de formula 1 se trata de forma que R1 es -OH, -SH, -NRdRd, -N3, halogeno, hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, alquil- Y1-, alquenil-Y1-, alquinil-Y1-, aril-Y1-, heteroaril-Y1-, -P(O)(Re)2, -HP(O)(Re), -ORa o -SRc; donde Y1 es O, NRd, S o Se, Ra es un resto de bloqueo, y Rc es un grupo de bloqueo, cada caso de Rd es independientemente hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, acilo, sililo sustituido, carbamato, -P(O)(Re)2 o -HP(O)(Re), y cada caso de Re es independientemente hidrogeno, alquilo, arilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y2-, alquenil-Y2-, alquinil-Y2-, aril-Y2- o heteroaril-Y2-, o un cation que es Na+1, Li+1 o K+1, donde Y2 es O, NRd o S.

Cada caso de R2 es independientemente hidrogeno, -OH, -SH, -NRdRd, N3, halogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y1-, alquenil-Y1-, alquinil-Y1-, aril-Y1-, heteroaril-Y1-. En algunas realizaciones, R2 esta desbloqueado. En aun otras realizaciones, R2 sigue bloqueado.

En algunas realizaciones, cada resto Ba no esta bloqueado. En otras realizaciones, no todos los restos Ba estan no bloqueados. En otras realizaciones, R3 es H. En algunas realizaciones, R3 es un grupo de bloqueo o un resto de enlace conectado a soporte solido, nucleosido, nucleotido o acido nucleico. En algunas realizaciones, cada caso de X es independientemente alquilo, alcoxi, arilo, alquiltio, acilo, -NRfRf, alqueniloxi, alquiniloxi, alqueniltio, alquiniltio, -S- Z+, -Se-Z+ o -BH3-Z+; cada caso de Rf es independientemente hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo o arilo; Z+ es ion amonio, ion alquilamonio, ion imino heteroaromatico o ion imino heterodclico, cualquiera de los cuales es primario, secundario, terciario o cuaternario, o Z+ es un ion metalico monovalente.

Condiciones de reaccion y reactivos usados en los metodos de la invencion

Condiciones

Las etapas de hacer reaccionar una molecula que comprende un resto de H-fosfonato aquiral y un nucleosido que comprende un resto 5'-OH para formar un producto intermedio condensado pueden producirse sin aislar ningun producto intermedio. En algunas realizaciones, las etapas de hacer reaccionar una molecula que comprende un resto de H-fosfonato aquiral y un nucleosido que comprende un resto 5'-OH para formar un producto intermedio condensado se producen en una reaccion de una sola etapa. En una realizacion, una molecula que comprende un resto de H-fosfonato aquiral, reactivo de condensation, reactivo quiral y compuesto que comprende un resto nucleofilo libre se anaden a la mezcla de reaccion en momentos diferentes. En otra realizacion, una molecula que comprende un resto de H-fosfonato aquiral, reactivo de condensacion y reactivo quiral estan presentes en el mismo recipiente de reaccion o mismo matraz. En otra realizacion, una molecula que comprende un resto de H-fosfonato aquiral, reactivo de condensacion, reactivo quiral y compuesto que comprende un resto nucleofilo libre estan presentes en el mismo recipiente de reaccion o mismo matraz. Esto permite realizar la reaccion sin aislamiento de productos intermedios y elimina etapas que requieren tiempo, produciendo una sintesis economica y eficiente. En realizaciones espedficas, el H-fosfonato aquiral, reactivo de condensacion, aminoalcohol quiral, nucleosido de 5'-OH estan presentes al mismo tiempo en una reaccion. En otra realizacion, la formation del producto intermedio quiral para la condensacion se forma in situ y no se aisla antes de la reaccion de condensacion. En otra realizacion, una molecula que comprende un resto de H-fosfonato aquiral se ha activado mediante reaccion con un reactivo de condensacion, reactivo quiral en un recipiente de reaccion diferente del que se usa cuando se hace reaccionar el producto intermedio quiral con el compuesto que comprende un resto 5'-OH libre. En una realizacion, un reactivo de activation se anade durante la etapa de condensacion. En una realizacion, un reactivo de activation se anade despues de que el resto de H-fosfonato aquiral, reactivo de condensacion y reactivo quiral ya se hayan mezclado juntos. En otra realizacion, un reactivo de activacion se anade junto con el resto de H-fosfonato aquiral, reactivo de condensacion y reactivo quiral. Dependiendo de las condiciones de reaccion, un reactivo de activacion puede ser util durante la sintesis, por ejemplo, en la etapa de condensacion. Por ejemplo, si se usa piridina como base en la etapa de preactivacion o condensacion, no necesita estar presente un reactivo de activacion tal como CMPT ya que la

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piridina actua de catalizador nucleofilo (es decir, activador). Si se usa otra base, tal como W-cianometilpirrolidina (CMP), que no es tan nucleofila como piridina, en la etapa de condensacion, entonces el uso de un reactivo de activacion, tal como CMPT, puede anadirse como reactivo de activacion.

Sintesis sobre soporte solido

En algunas realizaciones, la sintesis del acido nucleico se realiza en solucion. En otras realizaciones, la sintesis del acido nucleico se realiza sobre fase solida. Los grupos reactivos de un soporte solido puede estar sin proteger o protegidos. Durante la sintesis de oligonucleotidos, un soporte solido se trata con diversos reactivos en varios ciclos de sintesis para lograr el alargamiento escalonado de una cadena de oligonucleotidos en crecimiento con unidades de nucleotidos individuales. La unidad de nucleosidos al final de la cadena que esta directamente unida al soporte solido se llama "el primer nucleosido" como se usa en el presente documento. El primer nucleosido esta unido al soporte solido mediante un resto conector, es decir, un diradical con enlaces covalentes a tanto el polimero del soporte solido como al nucleosido. El conector permanece intacto durante los ciclos de sintesis realizados para ensamblar la cadena de oligonucleotido y se escinde despues del ensamblaje de la cadena para liberar el oligonucleotido del soporte.

Soportes solidos para la sintesis de acidos nucleicos en fase solida incluyen los soportes descritos en, por ejemplo, las patentes de EE.UU. 4.659.774, 5.141.813, 4.458.066; Caruthers, patentes de EE.UU. N.° 4.415.732, 4.458.066, 4.500.707, 4.668.777, 4.973.679 y 5.132.418; Andrus et al., patentes de EE.UU. N.° 5.047.524, 5.262.530; y Koster, patentes de EE.UU. N.° 4.725.677 (reexpedida como Re34.069). En algunas realizaciones, la fase solida es un soporte de polimero organico. En otras realizaciones, la fase solida es un soporte de polimero inorganico. En algunas realizaciones, el soporte de polimero organico es poliestireno, aminometilpoliestireno, un copolimero de injerto de polietilenglicol-poliestireno, poliacrilamida, polimetacrilato, poli(alcohol vinilico), polimero altamente reticulado (HCP), u otros polimeros sinteticos, hidratos de carbono tales como celulosa y almidon, u otros hidratos de carbono polimericos, u otros polimeros organicos y cualquier copolimero, material compuesto o combination de los materiales inorganicos u organicos anteriores. En otras realizaciones, el soporte de polimero inorganico es silice, alumina, polividrio controlado (CPG), que es un soporte de gel de silice, o aminopropil-CPG. Otros soportes solidos utiles incluyen soportes solidos fluorados (vease, por ejemplo, el documento WO/2005/070859), soportes solidos de alquilamina de cadena larga (LCAA)-vidrio de poro controlado (CPG) (veanse, por ejemplo, S. P. Adams, K. S. Kavka, E. J. Wykes, S. B. Holder y G. R. Galluppi, J. Am. Chem. Soc., 1983, 105, 661-663; G. R. Gough, M. J. Bruden y P. T. Gilham, Tetrahedron Lett., 1981, 22, 4177-4180). Soportes de membrana y membranas polimericas (vease por ejemplo, Innovation and Perspectives in Solid Phase Synthesis, Peptides, Proteins and Nucleic Acids, ch 21 pp 157-162, 1994, Ed. Roger Epton y la patente de EE.UU. N.° 4.923.901) tambien son utiles para la sintesis de acidos nucleicos. Una vez formada, una membrana puede funcionalizarse quimicamente para su uso en la sintesis de acidos nucleicos. Ademas de la union de un grupo funcional a la membrana, el uso de un grupo conector o espaciador unido a la membrana puede usarse para minimizar el impedimento esterico entre la membrana y la cadena sintetizada.

Otros soportes solidos adecuados incluyen aquellos generalmente conocidos en la tecnica por ser adecuados para su uso en metodologias en fase solida, que incluyen, por ejemplo, el vidrio comercializado como soporte PrimerTM 200, vidrio de poro controlado (CPG), vidrio de poro controlado con oxalilo (vease, por ejemplo, Alul, et al., Nucleic Acids Research, 1991, 19, 1527), soporte TentaGel - un soporte derivatizado de aminopolietilenglicol (vease, por ejemplo, Wright, et al., Tetrahedron Lett., 1993, 34, 3373), y Poros-a copolimero de poliestireno/divinilbenceno.

Los polimeros activados en la superficie se han demostrado para su uso en la sintesis de acidos nucleicos naturales y modificados y proteinas en varios medios de soporte solido. El material de soporte solido puede ser cualquier polimero adecuadamente uniforme en porosidad, tiene contenido de amina suficiente y suficientemente flexible para experimentar cualquier manipulation auxiliar sin perder integridad. Ejemplos de materiales seleccionados adecuados incluyen nailon, polipropileno, poliester, politetrafluoroetileno, poliestireno, policarbonato y nitrocelulosa. Otros materiales pueden servir de soporte solido, dependiendo del diseno del investigador. En vista de algunos disenos, por ejemplo, un metal recubierto, puede seleccionarse en particular oro o platino (vease, por ejemplo, la publication de EE.UU. N.° 20010055761). En una realization de la sintesis de oligonucleotidos, por ejemplo, un nucleosido esta anclado a un soporte solido que esta funcionalizado con restos hidroxilo o amino. Alternativamente, el soporte solido se derivatiza para proporcionar un grupo trialcoxitritilo labil a los acidos, tal como un grupo trimetoxitritilo (TMT). Sin desear quedar ligado a teoria, se espera que la presencia del grupo protector de trialcoxitritilo permita la desnitrilacion inicial en condiciones comunmente usadas en sintetizadores de ADN. Para una liberation mas rapida de material de oligonucleotido en solucion con amoniaco acuoso, se introduce opcionalmente un conector de diglicolato sobre el soporte.

Resto de enlace

Se usa opcionalmente un resto de enlace o conector para conectar el soporte solido con el compuesto que comprende un resto nucleofilo libre. Se conocen conectores adecuados tales como moleculas cortas que sirven para conectar un soporte solido con grupos funcionales (por ejemplo, grupos hidroxilo) de moleculas de nucleosidos iniciales en tecnicas sinteticas en fase solida. En algunas realizaciones, el resto de enlace es un conector de acido

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succinamico, o un conector de succinato (-CO-CH2-CH2-CO-), o un conector de oxalilo (-CO-CO-). En otras realizaciones, el resto de enlace y el nucleosido estan unidos juntos mediante un enlace ester. En otras realizaciones, el resto de enlace y el nucleosido estan unidos juntos mediante un enlace amida. En realizaciones adicionales, el resto de enlace conecta el nucleosido con otro nucleotido o acido nucleico. Conectores adecuados se desvelan en, por ejemplo, Oligonucleotides And Analogues A Practical Approach, Ekstein, F. Ed., IRL Press, N.Y., 1991, Capitulo 1.

Se usa un resto de conector para conectar el compuesto que comprende un resto nucleofilo libre con otro nucleosido, nucleotido o acido nucleico. En algunas realizaciones, el resto de enlace es un enlace fosfodiester. En otras realizaciones, el resto de enlace es un resto de H-fosfonato. En aun otras realizaciones, el resto de enlace es un resto de X-fosfonato.

Disolventes para la sintesis

La sintesis de los acidos nucleicos se realiza en un disolvente organico aprotico. En algunas realizaciones, el disolvente es acetonitrilo, piridina, tetrahidrofurano o diclorometano. En algunas realizaciones, cuando el disolvente organico aprotico no es basico, esta presente una base en la etapa de reaccion. En algunas realizaciones donde esta presente una base, la base es piridina, quinolina o N,N-dimetilanilina o N-cianometilpirrolidina. Otros ejemplos de bases incluyen pirrolidina, piperidina, N-metilpirrolidina, piridina, quinolina, N,N-dimetilaminopiridina (DMAP), N,N- dimetilanilina o N-cianometilpirrolidina. En algunas realizaciones del metodo, la base es

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en la que Z22 y Z23 son independientemente alquilo, aminoalquilo, cicloalquilo, heterodclico, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, alquiloxi, ariloxi o heteroariloxi, o en la que cualquiera de Z22 y Z23 se toman conjuntamente para formar un anillo alidclico o heterodclico de 3 a 10 miembros. En algunas realizaciones del metodo, la base es N-cianometilpirrolidina. En algunas realizaciones, el disolvente organico aprotico es anhidro. En otras realizaciones, el disolvente organico aprotico anhidro se acaba de destilar. En algunas realizaciones, el disolvente organico aprotico anhidro que se acaba de destilar es piridina. En otras realizaciones el disolvente organico aprotico anhidro que se acaba de destilar es tetrahidrofurano. En otras realizaciones, el disolvente organico aprotico anhidro que se acaba de destilar es acetonitrilo. El disolvente puede ser una combinacion de 2 o mas disolventes. Dependiendo de que disolvente se use para la sintesis, es util la adicion de un reactivo de activacion.

Condiciones de acidificacion para eliminar grupos de bloqueo.

La acidificacion para eliminar grupos de bloqueo se lleva a cabo por un acido de Br0nsted o acido de Lewis. En algunas realizaciones, la acidificacion se usa para eliminar grupos de bloqueo R1. Acidos de Br0nsted utiles son acidos carboxilicos, acidos alquilsulfonicos, acidos arilsulfonicos, acido fosforico y sus derivados, acido fosfonico y sus derivados, acidos alquilfosfonicos y sus derivados, acidos arilfosfonicos y sus derivados, acido fosfinico, acidos dialquilfosfinicos y acidos diarilfosfinicos que tiene un valor de pKa (25 °C en agua) de -0,6 (acido trifluoroacetico) a 4,76 (acido acetico) en un disolvente organico o agua (en el caso del acido acetico del 80 %). La concentracion del acido (1 al 80 %) usada en la etapa de acidificacion depende de la acidez del acido. Debe tenerse consideracion a la concentracion de acido, ya que condiciones de acido fuerte produciran despurinacion/despirimidinacion, en las que las bases de purinilo o pirimidinilo se escinden del anillo de ribosa.

10 o o o

tl . II .11 .11

R-S-OH R10-P-OH R1-P-OH R1-P-OH

KUUUH 6 OR2 OR2 R2

R = H, alquilo, arilo R = alquilo, arilo R1, R2 = H, alquilo, arilo R1, R2 = H, alquilo, arilo R1, R2 = H, alquilo, arilo

En algunas realizaciones, la acidificacion se lleva a cabo por un acido de Lewis en un disolvente organico. Acidos de Lewis utiles son ZnX2 en el que X es Cl, Br, I o CF3SO3.

En algunas realizaciones, la acidificacion comprende anadir una cantidad de un acido de Br0nsted o de Lewis eficaz para convertir el producto intermedio condensado en el compuesto de formula 4 sin eliminar los restos de purina del producto intermedio condensado.

Acidos que son utiles en la etapa de acidificacion tambien incluyen, pero no se limitan a, 10 % de acido fosforico en un disolvente organico, 10 % de acido clorhidrico en un disolvente organico, 1 % de acido trifluoroacetico en un disolvente organico, 3 % de acido dicloroacetico en un disolvente organico u 80 % de acido acetico en agua. La concentracion de cualquier acido de Br0nsted o de Lewis usada en el proceso se selecciona de forma que la concentracion del acido no supere una concentracion que produce la escision de la nucleobase del resto de azucar.

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En algunas realizaciones, la acidificacion comprende anadir 1 % de acido trifluoroacetico en un disolvente organico. En algunas realizaciones, la acidificacion comprende anadir aproximadamente 0,1 % a aproximadamente 8 % de acido trifluoroacetico en un disolvente organico. En otras realizaciones, la acidificacion comprende anadir 3 % de acido dicloroacetico en un disolvente organico. En otras realizaciones, la acidificacion comprende anadir aproximadamente 0,1 % a aproximadamente 10 % de acido dicloroacetico en un disolvente organico. En aun otras realizaciones, la acidificacion comprende anadir 3 % de acido tricloroacetico en un disolvente organico. En aun otras realizaciones, la acidificacion comprende anadir aproximadamente 0,1 % a aproximadamente 10 % de acido tricloroacetico en un disolvente organico. En algunas realizaciones, la acidificacion comprende anadir 80 % de acido acetico en agua. En algunas realizaciones, la acidificacion comprende anadir aproximadamente 50 % a aproximadamente 90 %, o aproximadamente 50 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 50 % a aproximadamente 70 %, aproximadamente 50 % a aproximadamente 60 %, aproximadamente 70 % a aproximadamente 90 % de acido acetico en agua. En algunas realizaciones, la acidificacion comprende la adicion adicional de secuestrantes de cationes al disolvente acido. En realizaciones especificas, los secuestrantes de cationes pueden ser trietilsilano o triisopropilsilano. En algunas realizaciones, R1 se desbloquea antes de la etapa de acidificar el producto intermedio condensado. En algunas realizaciones, R1 se desbloquea por acidificacion, que comprende anadir 1 % de acido trifluoroacetico en un disolvente organico. En algunas realizaciones, R1 se desbloquea por acidificacion, que comprende anadir 3 % de acido dicloroacetico en un disolvente organico. En algunas realizaciones, R1 se desbloquea por acidificacion, que comprende anadir 3 % de acido tricloroacetico en un disolvente organico.

Eliminacion de restos o grupos de bloqueo.

Grupos funcionales tales como restos hidroxilo o amino que se localizan en nucleobases o restos de azucar se bloquean rutinariamente con grupos (restos) de bloqueo (protectores) durante la sintesis y posteriormente se desbloquean. En general, un grupo de bloqueo convierte una funcionalidad quimica de una molecula inerte en condiciones de reaccion especificas y puede despues eliminarse de tal funcionalidad en una molecula sin danar sustancialmente el resto de la molecula (vease, por ejemplo, Green and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2nd Ed., John Wiley & Sons, New York, 1991). Por ejemplo, pueden bloquearse grupos amino con grupos de bloqueo de nitrogeno tales como ftalimido, 9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMOC), trifenilmetilsulfenilo, t-BOC, 4,4'- dimetoxitritilo (DMTr), 4-metoxitritilo (MMTr), 9-fenilxantin-9-ilo (Pixyl), tritilo (Tr), o 9-(p-metoxifenil)xantin-9-ilo (MOX). Pueden protegerse grupos carboxilo como grupos acetilo. Pueden protegerse grupos hidroxi tales como tetrahidropiranilo (THP), t-butildimetilsililo (TBDMS), 1-[(2-cloro-4-metil)fenil]-4-metoxipiperidin-4-ilo (Ctmp), 1-(2- fluorofenil)-4-metoxipiperidin-4-ilo (Fpmp), 1-(2-cloroetoxi)etilo, 3-metoxi-1,5-dicarbometoxipentan-3-ilo (MDP), bis(2- acetoxietoxi)metilo (ACE), triisopropilsililoximetilo (TOM), 1-(2-cianoetoxi)etilo (CEE), 2-cianoetoximetilo (CEm), [4- (N-dicloroacetil-N-metilamino)benciloxi]metilo, 2-cianoetilo (CN), pivaloiloximetilo (PivOM), levuniloximetilo (ALE). Se han descrito otros grupos de bloqueo hidroxilo representativos (vease, por ejemplo, Beaucage et al., Tetrahedron, 1992, 46, 2223). En algunas realizaciones, grupos de bloqueo de hidroxilo son grupos labiles a los acidos, tales como tritilo, monometoxitritilo, dimetoxitritilo, trimetoxitritilo, 9-fenilxantin-9-ilo (Pixyl) y 9-(p-metoxifenil)xantin-9-ilo (MOX). Tambien pueden bloquearse grupos funcionales quimicos incluyendolos en una forma de precursor. Asi, un grupo azido puede considerarse una forma bloqueada de una amina, ya que el grupo azido se convierte facilmente en la amina. Se conocen grupos protectores representativos adicionales utilizados en la sintesis de acidos nucleicos (vease, por ejemplo, Agrawal et al., Protocols for Oligonucleotide Conjugates, Eds., Humana Press, New Jersey, 1994, Vol. 26, pp. 1-72).

Se conocen diversos metodos y se usan para la eliminacion de grupos de bloqueo de los acidos nucleicos. En algunas realizaciones, se eliminan todos los grupos de bloqueo. En otras realizaciones, los grupos de bloqueo se eliminan parcialmente. En aun otras realizaciones, pueden ajustarse las condiciones de reaccion para eliminar grupos de bloqueo en ciertos restos. En ciertas realizaciones donde R2 es un grupo de bloqueo, la eliminacion del grupo de bloqueo en R2 es ortogonal a la eliminacion del grupo de bloqueo en R1. Los grupos de bloqueo en R1 y R2 siguen intactos durante las etapas de sintesis y se eliminan conjuntamente despues del ensamblaje de cadena. En algunas realizaciones, el grupo de bloqueo R2 se elimina simultaneamente con la escision de los acidos nucleicos del soporte solido y con la eliminacion de los grupos de bloqueo de nucleobases. En realizaciones especificas, se elimina el grupo de bloqueo en R1, mientras que los grupos de bloqueo en R2 y las nucleobases siguen intactos. Los grupos de bloqueo en R1 son escindibles sobre soportes solidos con una base organica tal como una amina primaria, una amina secundaria, o una mezcla de las mismas. El desbloqueo de la posicion R1 se denomina comunmente desproteccion del extremo delantero.

En una realizacion, los grupos de bloqueo de nucleobases, si estan presentes, son escindibles despues del ensamblaje del acido nucleico respectivo con un reactivo acido. En otra realizacion, uno o mas de los grupos de bloqueo de nucleobases es escindible en condiciones ni acidas ni basicas, por ejemplo, escindible con sales de fluoruro o complejos de acido fluorhidrico. En otra realizacion mas, uno o mas de los grupos de bloqueo de nucleobases es escindible despues del ensamblaje del acido nucleico respectivo en presencia de base o un disolvente basico, y en la que el grupo de bloqueo de nucleobases es estable a las condiciones de la etapa de desproteccion del extremo delantero con aminas.

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En algunas realizaciones, no se requieren grupos de bloqueo para nucleobases. En otras realizaciones, se requieren grupos de bloqueo para nucleobases. En aun otras realizaciones, ciertas nucleobases requieren grupo de bloqueo mientras que otras nucleobases no requieren grupos de bloqueo. En realizaciones donde las nucleobases se bloquean, los grupos de bloqueo se eliminan tanto completamente como parcialmente en condiciones apropiadas para eliminar el grupo de bloqueo en el extremo delantero. Por ejemplo, R1 puede indicar ORa, en el que Ra es acilo, y Ba indica guanina bloqueada con un grupo acilo que incluye, pero no se limita a, isobutirilo, acetilo o 4-(terc- butilfenoxi)acetilo. Los grupos acilo en R1 y Ba se eliminaran o eliminaran parcialmente durante la misma etapa de desbloqueo.

Reactivos

Reactivo de condensacion.

El reactivo de condensacion (CR) util en los metodos de la invencion tiene una de las siguientes formulas generales: Ar3PL2, y (ArO)3PL2,

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0: O z5 Q Z7 < I

X: Z2—P—L , 11 Z4—S—L Z8—P—1 1

1 L: ' z> 1 1 || ’76 O z9

CR1: Cr2 Cr3 Cr4 Cr5

Z10w P L5.w Cr6

en las que Z1, Z2, Z3, Z4, Z5, Z6, Z7, Z8, Z9 y Z10 estan seleccionados independientemente de alquilo, aminoalquilo,

cicloalquilo, heterociclico, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, alquiloxi, ariloxi o heteroariloxi, o en las que cualquiera de Z2 y Z3, Z5 y Z6, Z7 y Z8, Z8 y Z9, Z9 y Z7, o Z7 y Z8 y Z9 se toma conjuntamente para formar un anillo aliciclico o heterociclico de 3 a 20 miembros; Q- es un contraion; w es un numero entero de 0 a 3; L es un grupo saliente; y Ar es arilo, heteroarilo y/o uno del grupo Ar esta unido al soporte de polimero.

En algunas realizaciones, el contraion del reactivo de condensacion Cr es Cl-, Br-, BF4-, PF6-, TfO-, Tf2N-, AsF6-, CO4- o SbF6-, en el que Tf es CF3SO2. En algunas realizaciones, el grupo saliente del reactivo de condensacion Cr es F, Cl, Br, I, 3-nitro-1,2,4-triazol, imidazol, alquiltriazol, tetrazol, pentafluorobenceno o 1-hidroxibenzotriazol.

Ejemplos de agentes de condensacion que pueden usarse en el proceso incluyen, y no se limitan a, cloruro de pentafluorobenzoilo, carbonildiimidazol (CDI), 1-mesitilensulfonil-3-nitrotriazol (MSNT), clorhidrato de 1-etil-3-(3'- dimetilaminopropil)carbodiimida (EDCI-HCl), hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxitris(dimetilamino)fosfonio (PyBOP), cloruro N,W-bis(2-oxo-3-oxazolidinil)fosfmico (BopCl), hexafluorofosfato de 2-(1H-7-azabenzotriazol-1-il)- 1,1,3,3-tetrametiluronio (HATU) y hexafluorofosfato de O-benzotriazol-N,N,N',N'-tetrametiluronio (HBTU), DIPCDI; bromuro N,W-bis(2-oxo-3-oxazolidinil)fosfmico (BopBr), hexafluorofosfato de 1,3-dimetil-2-(3-nitro-1,2,4-triazol-1-il)-2- pirrolidin-1 -il-1,3,2-diazafosfolidinio (MNTP), hexafluorofosfato de 3-nitro-1,2,4-triazol-1-il-tris(pirrolidin-1-il)fosfonio (PyNTP), hexafluorofosfato de bromotripirrolidinofosfonio (PyBrOP); tetrafluoroborato de O-(benzotriazol-l-il)- N,N,N',N'-tetrametiluronio (TBTU); hexafluorofosfato de tetrametilfluoroformamidinio (TFFH); (PhO)3PCl2, y bis(triclorometil)carbonato (BTC). En ciertas realizaciones, el contraion del reactivo de condensacion Cr es Cl-, Br-, BF4-, PF6-, TfO-, Tf2N-, AsF6-, ClO4-, o SbF6-, en el que Tf es CF3SO2.

En otras realizaciones de la invencion, el reactivo de condensacion es 1-(2,4,6-triisopropilbencenosulfonil)-5-(piridin- 2-il)tetrazolida, cloruro de pivaloilo, hexafluorofosfato de bromotrispirrolidinofosfonio, cloruro N,N'-bis(2-oxo-3- oxazolidinil)fosfmico (BopCl), (PhO)3PCl2, o 2-cloro-5,5-dimetil-2-oxo-1,3,2-dioxafosfinano, bis(triclorometil)carbonato (BTC) o Ph3PCl2. En una realizacion, el reactivo de condensacion es cloruro N,W-bis(2-oxo-3-oxazolidinil)fosfmico (BopCl). En una realizacion, el reactivo de condensacion es bis(triclorometil)carbonato (BTC). En una realizacion, el reactivo de condensacion es Ph3PCh. Se han descrito otros reactivos de condensacion conocidos (vease, por ejemplo, el documento WO/2006/066260).

En otras realizaciones, el reactivo de condensacion es hexafluorofosfato de 1,3-dimetil-2-(3-nitro-1,2,4-triazol-1-il)-2- pirrolidin-1 -il-1,3,2-diazafosfolidinio (MNTP), hexafluorofosfato de 3-nitro-1,2,4-triazol-1-il-tris(pirrolidin-1-il)fosfonio (PyNTP), bis(triclorometil)carbonato (BTC), (PhO)3PCl2 o Ph3PCl2.

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Reactivo de activacion.

El reactivo de activacion util en el presente documento debe tener una fuerte capacidad de donar protones para ser capaz de activar el producto intermedio quiral para la reaccion con un compuesto que comprende un resto nucleofilo libre. En una realizacion, el producto intermedio quiral es la estructura III mostrada en el Esquema 5 o 6 o es la estructura III,- mostrada en el Esquema 7. El reactivo de activacion actua protonando el atomo de nitrogeno de estructura III o III- cuando W1 es un nitrogeno. El uso de un reactivo de activacion depende de los disolventes usados para la sintesis.

El reactivo de activacion (Ar) util en el metodo de la invention tiene una de las siguientes formulas generales:

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Z11, Z12, Z13, Z14, Z15, Z16, Z17, Z18, Z19, Z20 y Z21 son independientemente hidrogeno, alquilo, aminoalquilo,

cicloalquilo, heterociclico, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, alquiloxi, ariloxi o heteroariloxi, o en las que cualquiera de Z11 y Z12, Z11 y Z13, Z11 y Z14, Z12 y Z13, Z12 y Z14, Z13 y Z14, Z15 y Z16, Z15 y Z17, Z16 y Z17, Z18 y Z19, o Z20 y Z21, se toma conjuntamente para formar un anillo aliciclico o heterociclico de 3 a 20 miembros, o para formar un anillo aromatico de 5 o 20 miembros. Q- es un contraion. En algunas realizaciones del metodo, el contraion del reactivo de activacion Ar es Cl-, Br-, BF4- , PF6- , TfO-, Tf2N-, AsF6-, ClO4- o SbF6-, en el que Tf es CF3SO2.

En algunas realizaciones del metodo, el reactivo de activacion es imidazol, 4,5-dicianoimidazol (DCI), 4,5- dicloroimidazol, triflato de 1-fenilimidazolio (PhIMT), triflato de bencimidazolio (BIT), benzotriazol, 3-nitro-1,2,4-triazol (NT), tetrazol, 5-etiltiotetrazol, 5-(4-nitrofenil)tetrazol, triflato de N-cianometilpirrolidinio (CMPT), triflato de N- cianometilpiperidinio, triflato de N-cianometildimetilamonio.

En algunas realizaciones del metodo, el reactivo de activacion es 4,5-dicianoimidazol (DCI), triflato de 1- fenilimidazolio (PhIMT), triflato de bencimidazolio (BIT), 3-nitro-1,2,4-triazol (NT), tetrazol o triflato de N- cianometilpirrolidinio (CMPT).

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En algunas realizaciones del metodo, el reactivo de activacion es triflato de N-cianometilpirrolidinio (CMPT).

Reactivo quiral.

En los metodos de la presente invencion, se usan reactivos quirales para conferir estereoselectividad en la production de enlaces de X-fosfonato. Pueden usarse muchos auxiliares quirales diferentes en este proceso que son compuestos de formula 3-I donde W1 y W2 son cualquiera de -O-, -S- o -NG5-, que son capaces de reaccionar con el material de partida de H-fosfonato, un compuesto de formula 2 para formar el producto intermedio quiral, como se muestra en la estructura III de los Esquemas 5 y 6.

H—Wi W2—H

G4<^fu'^'l3',/G1

G3 G2

Formula 3-I

U1 y U3 son atomos de carbono que estan unidos a U2 si esta presente, o entre si si r es 0, mediante un enlace sencillo, doble o triple. U2 es -C-, -CG8-, -CG8G8-, -NG8-, -N-, -O- o -S- donde r es un numero entero de 0 a 5 y no mas de dos heteroatomos son adyacentes. Cuando uno cualquiera de U2 es C, debe formarse un triple enlace entre un segundo caso de U2, que es C, o con uno de U1 o U3. Similarmente, cuando uno cualquiera de U2 es CG8, se forma un doble enlace entre un segundo caso de U2 que es -CG8- o -N-, o con uno de U1 o U3.

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Por ejemplo, en algunas realizaciones, -Ui-(U2)r-U3- es -CG3G4-CG1G2-. En algunas realizaciones, -Ui-(U2)r-U3- es - CG3= CG1-. En algunas realizaciones, -Ui-(U2)r-U3- es -C=C-. En algunas realizaciones, -Ui-(U2)r-U3- es -CG3=CG8- CG1G2-. En algunas realizaciones, -UHU2V-U3- es -CG3G4-O-CG1G2-. En algunas realizaciones, -Ui-(U2)r-U3- es - CG3G4-NG8-CG1G2-. En algunas realizaciones, -Ui-(U2)r-U3- es -CG3G4-N-CG2-. En algunas realizaciones, -Ui-(U2)r- U3- es -CG3G4-N=C G8-CG1G2-.

G1, G2, G3, G4, G5 y G8 son independientemente hidrogeno, alquilo, aralquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heterociclilo, hetarilo o arilo, o dos de G1, G2, G3, G4 y G5 son G6 tomados conjuntamente forman un anillo carbociclico saturado, parcialmente insaturado o insaturado, o que contiene heteroatomo de hasta aproximadamente 20 atomos de anillo que es monociclico o polidclico, y esta condensado o sin condensar. En algunas realizaciones, el anillo asi formado esta sustituido con restos oxo, tioxo, alquilo, alquenilo, alquinilo, heteroarilo o arilo. En algunas realizaciones, cuando el anillo formado tomando dos G6 juntos esta sustituido, esta sustituido con un resto que es lo suficientemente voluminoso para conferir estereoselectividad durante la reaccion.

Por ejemplo, en algunas realizaciones, el anillo formado tomando dos de G6 juntos es ciclopentilo, pirrolilo, ciclopropilo, ciclohexenilo, ciclopentenilo, tetrahidropiranilo o piperazinilo.

En algunas realizaciones de la invencion, el reactivo quiral es un compuesto de formula 3.

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Formula 3

En algunas realizaciones de formula 3, Wi y W2 son independientemente -NG5-, -O- o -S-; G1, G2, G3, G4 y G5 son independientemente hidrogeno, alquilo, aralquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heterociclilo, hetarilo o arilo, o dos de G1, G2, G3, G4 y G5 son G6 que tomados conjuntamente forman un anillo carbociclico saturado, parcialmente insaturado o insaturado, o que contiene heteroatomo de hasta aproximadamente 20 atomos de anillo que es monociclico o policiclico, condensado o no condensado, y no mas de cuatro de G1, G2, G3, G4 y G5 son G6. Similarmente a los compuestos de formula 3', cualquiera de G1, G2, G3, G4 o G5 estan sustituidos con restos oxo, tioxo, alquilo, alquenilo, alquinilo, heteroarilo o arilo. En algunas realizaciones, tal sustitucion induce la estereoselectividad en la produccion de X-fosfonato.

En algunas realizaciones de la invencion, el reactivo quiral tiene una de las siguientes formulas:

g5-nh oh G4HGi G3 G2: Gs-h(H SH G4n7>'Gi G3 G2 g5-nh him-g1 gAtAs1 G3 G2

Formulas 3-A: 3-B 3-C

3-F

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3-D 3-E

En algunas realizaciones, el reactivo quiral es un aminoalcohol. En algunas otras realizaciones, el reactivo quiral es un aminotiol. En aun otras realizaciones, el reactivo quiral es un aminofenol. En algunas realizaciones, el reactivo quiral es (S)- y (R)-2-metilamino-1-feniletanol, (1R, 2S)-efedrina o (1R, 2S)-2-metilamino-1,2-difeniletanol.

En otras realizaciones de la invencion, el reactivo quiral es un compuesto de una de las siguientes formulas:

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Formula O

Formula P

Formula Q

Formula R

La eleccion del reactivo quiral, por ejemplo, el isomero representado por la formula O o su estereoisomero, formula P, permite el control especifico de la quiralidad en el fosforo. Asi, puede seleccionarse tanto una configuracion Rp como Sp en cada ciclo de sintesis, permitiendo el control de la estructura tridimensional global del producto de acido nucleico. En algunas realizaciones de la invencion, un producto de acido nucleico tiene todos los estereocentros Rp. En algunas realizaciones de la invencion, un producto de acido nucleico tiene todos los estereocentros Sp. En algunas realizaciones, la seleccion de los centros Rp y Sp se hace para conferir una superestructura tridimensional especifica a la cadena de acido nucleico.

Nucleobases y nucleobases modificadas

La nucleobase Ba en la formula 1 es una nucleobase natural o una nucleobase modificada derivada de nucleobases naturales. Ejemplos incluyen, pero no se limitan a, uracilo, timina, adenina, citosina y guanina que tienen sus grupos 5 amino respectivos protegidos con grupos protectores de acilo, 2-fluorouracilo, 2-fluorocitosina, 5-bromouracilo, 5- yodouracilo, 2,6-diaminopurina, azacitosina, analogos de pirimidina tales como pseudoisocitosina y pseudouracilo, y otras nucleobases modificadas tales como purinas sustituidas en 8, xantina o hipoxantina (siendo las dos ultimas los productos de degradacion naturales). Las nucleobases modificadas desveladas en Chiu y Rana, RNA, 2003, 9, 1034-1048, Limbach et al. Nucleic Acids Research, 1994, 22, 2183-2196 y Revankar y Rao, Comprehensive Natural 10 Products Chemistry, vol. 7, 313, tambien se contemplan como restos de Ba de formula 1.

Los compuestos representados por las siguientes formulas generales tambien se contemplan como nucleobases modificadas:

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En las formulas anteriores, R8 es un grupo alquilo, arilo, aralquilo o ariloxilalquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 15 atomos de carbono, que incluye, a modo de ejemplo solo, un grupo metilo, isopropilo, fenilo, bencilo o fenoximetilo; y 20 cada uno de R9 y R10 representa un grupo alquilo lineal o ramificada que tiene 1 a 4 atomos de carbono.

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Nucleobases modificadas tambien incluyen nucleobases de tamano expandido en las que se han anadido uno o mas anillos de benceno. Las sustituciones de bases nucleicas descritas en el catalogo de Glen Research (
www.glenresearch.com); Krueger AT et al, Acc. Chem. Res., 2007, 40, 141-150; Kool, ET, Acc. Chem. Res., 2002, 35, 936-943; Benner S.A., et al., Nat. Rev. Genet., 2005, 6, 553-543; Romesberg, F.E., et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 2003, 7, 723-733; Hirao, I., Curr. Opin. Chem. Biol., 2006, 10, 622-627, se contemplan como utiles para la sintesis de los acidos nucleicos descritos en el presente documento. Algunos ejemplos de esas nucleobases de tamano expandido se muestran a continuacion:

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En el presente documento, las nucleobases modificadas tambien engloban estructuras que no se consideran nucleobases, sino que son otros restos tales como, pero no se limitan a, anillos derivados de corrina o porfirina. Las sustituciones de bases derivadas de porfirina se han descrito en Morales-Rojas, H y Kool, ET, Org. Lett., 2002, 4, 35 4377-4380. A continuacion se muestra un ejemplo de un anillo derivado de porfirina que puede usarse como

sustitucion de base:

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Otras nucleobases modificadas tambien incluyen sustituciones de bases tales como aquellas mostradas a continuacion:

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Tambien se contemplan nucleobases modificadas que son fluorescentes. Ejemplos no limitantes de estas sustituciones de bases incluyen fenantreno, pireno, estilbeno, isoxantina, isozantopterina, terfenilo, tertiofeno, benzotertiofeno, cumarina, lumazina, estilbeno unido, benzo-uracilo y nafto-uracilo, como se muestran a continuacion:

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Las nucleobases modificadas pueden estar sin sustituir o contener sustituciones adicionales tales como heteroatomos, grupos alquilo, o restos de enlace conectados a restos fluorescentes, restos de biotina o avidina, u otra proteina o peptidos. Las nucleobases modificadas tambien incluyen ciertas 'bases universales' que no son nucleobases en el sentido mas clasico, pero funcionan similarmente a las nucleobases. Un ejemplo representativo de una base universal tal es 3-nitropirrol.

Ademas de los nucleosidos de estructura IV o IX, tambien pueden usarse otros nucleosidos en el proceso desvelado en el presente documento e incluyen nucleosidos que incorporan nucleobases modificadas, o nucleobases covalentemente unidas a azucares modificados. Algunos ejemplos de nucleosidos que incorporan nucleobases modificadas incluyen 4-acetilcitidina; 5-(carboxihidroxilmetil)uridina; 2'-O-metilcitidina; 5-carboximetilaminometil-2- tiouridina; 5-carboximetilaminometiluridina; dihidrouridina; 2'-O-metilpseudouridina; beta,D-galactosilqueosina; 2'-O- metilguanosina; N®-isopenteniladenosina; 1-metiladenosina; 1-metilpseudouridina; 1-metilguanosina; 1-metilinosina; 2,2-dimetilguanosina; 2-metiladenosina; 2-metilguanosina; N7-metilguanosina; 3-metil-citidina; 5-metilcitidina; N6- metiladenosina; 7-metilguanosina; 5-metilaminoetiluridina; 5-metoxiaminometil-2-tiouridina; beta,D-manosilqueosina; 5-metoxicarbonilmetiluridina; 5-metoxiuridina; 2-metiltio-N6-isopenteniladenosina; N-((9-beta,D-ribofuranosil-2-

metiltiopurina-6-il)carbamoil)treonina; N-((9-beta,D-ribofuranosilpurina-6-il)-N-metilcarbamoil)treonina; ester metilico de acido uridin-5-oxiacetico; acido uridin-5-oxiacetico (v); pseudouridina; queosina; 2-tiocitidina; 5-metil-2-tiouridina;

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2-tiouridina; 4-tiouridina; 5-metiluridina; 2'-O-metil-5-metiluridina; y 2'-O-metiluridina.

En algunas realizaciones, los nucleosidos incluyen analogos de nucleosidos bidclicos modificados en 6' que tienen tanto quiralidad (R) como (S) en la posicion 6' e incluyen los analogos descritos en la patente de EE.UU. N.° 7.399.845. En otras realizaciones, los nucleosidos incluyen analogos de nucleosidos bidclicos modificados en 5' que tienen tanto quiralidad (R) como (S) en la posicion 5' e incluyen los analogos descritos en la publicacion de solicitud de patente de EE.UU. N.° 20070287831.

En algunas realizaciones, las nucleobases o nucleobases modificadas comprenden restos de union a biomoleculas tales como anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, biotina, avidina, estreptavidina, ligandos de receptor o restos quelantes. En otras realizaciones, Ba es 5-bromouracilo, 5-yodouracilo o 2,6-diaminopurina. En aun otras realizaciones, Ba se modifica por sustitucion con un resto fluorescente o de union a biomolecula. En algunas realizaciones, el sustituyente en Ba es un resto fluorescente. En otras realizaciones, el sustituyente en Ba es biotina o avidina.

Azucares modificados del nucleotido/nucleosido

Los nucleotidos que existen de forma natural mas comunes son azucares de ribosa unidos a las nucleobases adenosina (A), citosina (C), guanina (G), y timina (T) o uracilo (U). Tambien se contemplan nucleotidos modificados en los que el grupo fosfato o los restos de atomos de fosforo modificados en los nucleotidos pueden unirse a diversas posiciones del azucar o azucar modificado. Como ejemplos no limitantes, el grupo fosfato o el resto de atomo de fosforo modificado puede unirse en el resto hidroxilo 2', 3', 4' o 5' de un azucar o azucar modificado. Los nucleotidos que incorporan las nucleobases modificadas descritas anteriormente tambien pueden usarse en el proceso desvelado en el presente documento. En algunas realizaciones, los nucleotidos o nucleotidos modificados que comprenden un resto -OH no protegido se usan en el proceso desvelado en el presente documento.

Ademas del resto de ribosa descrito en los Esquemas 1-4b, tambien pueden incorporarse otros azucares modificados en los acidos nucleicos desvelados en el presente documento. En algunas realizaciones, los azucares modificados contienen uno o mas sustituyentes en la posicion 2' que incluyen uno de los siguientes: F; CF3, CN, N3, NO, NO2, O-, S-, o N-alquilo; O-, S-, o N-alquenilo; O-, S- o N-alquinilo; o O-alquil-O-alquilo, O-alquil-N-alquilo o N- alquil-O-alquilo en los que el alquilo, alquenilo y alquinilo pueden ser alquilo C1-C10 o alquenilo C2-C10 y alquinilo sustituidos o sin sustituir. Ejemplos de sustituyentes incluyen, y no se limitan a, O(CH2)nOCH3 y O(CH2)nNH2, en los que n es de 1 a aproximadamente 10, MOE, DMAOE, DMAEOE. Tambien se contemplan en el presente documento azucares modificados descritos en el documento WO 2001/088198; y Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486504. En algunas realizaciones, los azucares modificados comprenden grupos sustituidos con sililo, un grupo de escision de ARN, un grupo indicador, una marca fluorescente, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocineticas de un acido nucleico, o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinamicas de un acido nucleico, y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. Las modificaciones pueden hacerse en las posiciones 2', 3', 4', 5' o 6' del azucar o azucar modificado, que incluyen la posicion 3' del azucar en el nucleotido del extremo 3' o en la posicion 5' del nucleotido del extremo 5'.

Los azucares modificados tambien incluyen mimeticos de azucar tales como restos ciclobutilo o ciclopentilo en lugar del azucar de pentofuranosilo. Patentes de Estados Unidos representativas que ensenan la preparacion de tales estructuras de azucar modificado incluyen, pero no se limitan a, las patentes de EE.UU. N.°: 4.981.957; 5.118.800; 5.319.080; y 5.359.044. Algunos azucares modificados que se contemplan incluyen

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Otros ejemplos no limitantes de azucares modificados incluyen glicerol, que forman analogos de acido nucleico de glicerol (GNa). Un ejemplo de un analogo de GNA se muestra a continuacion y se describe en Zhang, R et al., J. Am. Chem. Soc., 2008, 130, 5846-5847; Zhang L, et al., J. Am. Chem. Soc., 2005, 127, 4174-4175 y Tsai CH et al., PNAS, 2007, 14598-14603:

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dWV

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i/VW'

en la que X es como se define en el presente documento. Otro ejemplo de un analogo derivado de GNA, acido nucleico flexible (FNA) basado en el acetal aminal mixto de formil glicerol, se describe en Joyce GF et al., PNAS, 1987, 84, 4398-4402 y Heuberger BD y Switzer C, J. Am. Chem. Soc., 2008, 130, 412-413, y se muestra a continuacion:

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Grupos de bloqueo

En las reacciones descritas, es necesario en ciertas realizaciones proteger grupos funcionales reactivos, por ejemplo grupos hidroxi, amino, tiol o carboxi, donde estos se desean en el producto final, para evitar su participation no deseada en las reacciones. Se usan grupos protectores para bloquear algunos o todos los restos reactivos y prevenir que tales grupos participen en reacciones quimicas hasta que se elimine el grupo protector. En una realization, cada grupo protector puede eliminarse por un medio diferente. Grupos protectores que se escinden en condiciones de reaction totalmente dispares cumplen el requisito de elimination diferencial. En algunas realizaciones, los grupos protectores se eliminan por acido, base y/o hidrogenolisis. Grupos tales como tritilo, dimetoxitritilo, acetal y t-butildimetilsililo son labiles a los acidos y se usan en ciertas realizaciones para proteger restos reactivos con carboxi e hidroxi en presencia de grupos amino protegidos con grupos Cbz, que pueden eliminarse por hidrogenolisis, y/o grupos Fmoc, que son labiles a las bases. En otras realizaciones, se bloquean restos reactivos con acido carboxilico e hidroxi con grupos labiles a las bases tales como, pero no se limitan a, metilo, etilo y acetilo en presencia de aminas bloqueadas con grupos labiles a los acidos tales como t-butilcarbamato o con carbamatos que son tanto estables a los acidos como a las bases, pero hidroliticamente eliminables.

En otra realizacion, los restos reactivos con hidroxi se bloquean con grupos protectores hidroliticamente eliminables tales como el grupo bencilo, mientras que los grupos amina capaces de formar enlace de hidrogeno con acidos se bloquean con grupos labiles a las bases tales como Fmoc. En otra realizacion, los restos reactivos con acido carboxilico se protegen por conversion en compuestos de ester simples, o, en otra realizacion mas, se bloquean con grupos protectores oxidativamente eliminables tales como 2,4-dimetoxibencilo, mientras que grupos amino co- existentes se bloquean con grupos de bloqueo de sililo o carbamato labiles al fluoruro.

Los grupos de bloqueo de alilo son utiles en presencia de grupos protectores de acido y base ya que los primeros son estables y pueden ser posteriormente eliminados por catalizadores metalicos o de acido pi. Por ejemplo, pueden desprotegerse grupos hidroxi bloqueados con alilo con una reaccion catalizada por Pd (0) en presencia de grupos protectores de amina de t-butilcarbamato labiles a acidos o de acetato labiles a bases. Otra forma mas de grupo protector es una resina a la que esta unida un compuesto o producto intermedio. En tanto que el residuo este unido a la resina, ese grupo funcional se bloquea y no puede reaccionar. Una vez liberado de la resina, el grupo funcional esta disponible para reaccionar.

Normalmente, grupos de bloqueo/protectores son, a modo de ejemplo solo:

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acetilo

Fmoc

cr* cr'0^

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Cbz

(H,C)3C

(H3O3C'

t-butilo

TBDMS

°^rA

jfjj * (C6H5)3C—/

tritilo

pMBn

Boc

Grupos protectores representativos utiles para proteger nucleotidos durante la sintesis incluyen grupos protectores labiles a las bases y grupos protectores labiles a los acidos. Se usan grupos protectores labiles a las bases para proteger los grupos amino exodclicos de las nucleobases heterodclicas. Este tipo de proteccion se logra generalmente por acilacion. Tres grupos acilantes comunmente usados para este fin son cloruro de benzoilo, anhidrido fenoxiacetico y cloruro de isobutirilo. Estos grupos protectores son estables a las condiciones de reaccion usadas durante la sintesis de los acidos nucleicos y se escinden a tasas aproximadamente iguales durante el tratamiento con base al final de la sintesis.

En algunas realizaciones, el grupo protector en 5' es tritilo, monometoxitritilo, dimetoxitritilo, trimetoxitritilo, 2- clorotritilo, DATE, TBTr, 9-fenilxantin-9-ilo (Pixyl) o 9-(p-metoxifenil)xantin-9-ilo (MOX).

En algunas realizaciones, se incorporan restos de tiol en los compuestos de formula 1, 2, 4 o 5 y se protegen. En algunas realizaciones, los grupos protectores incluyen, pero no se limitan a, Pixyl, tritilo, bencilo, p-metoxibencilo (PMB) o terc-butilo (t-Bu).

Otros grupos protectores, mas una descripcion detallada de tecnicas aplicables a la creacion de grupos protectores y su eliminacion, se describen en Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3a Ed., John Wiley & Sons, New York, NY, 1999, y Kocienski, Protective Groups, Thieme Verlag, New York, NY, 1994.

En algunas realizaciones, R1 es -ORa, en el que Ra es tritilo sustituido o sin sustituir o sililo sustituido. En otras realizaciones, R1 es -N3, -NRdRd, alquiniloxi o -OH. En algunas realizaciones, R2 es -ORb, en el que Rb es tritilo

sustituido o sin sustituir, sililo sustituido, acetilo, acilo o eter metilico sustituido. En otras realizaciones, R2 es -NRdRd, alquilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y1-, alquenil-Y1-, alquinil-Y1-, aril-Y1-, heteroaril-Y1-, donde Y1 es O, NRd, S o Se, y esta sustituido con restos fluorescentes o de union a biomolecula. En aun otras realizaciones, el sustituyente en R2 es un resto fluorescente. En algunas realizaciones, el sustituyente en R2 es biotina o avidina. En algunas realizaciones, R2 es -OH, -N3, hidrogeno, halogeno, alcoxi o alquiniloxi.

En otras realizaciones, R3 es un grupo de bloqueo que es tritilo sustituido, acilo, sililo sustituido o bencilo sustituido. En aun otras realizaciones, R3 es un resto de enlace conectado a un soporte solido. En realizaciones adicionales, el grupo de bloqueo del resto Ba es un resto de bencilo, acilo, formilo, dialquilformamidinilo, isobutirilo, fenoxiacetilo o tritilo, cualquiera de los cuales puede estar sin sustituir o sustituido.

Metodos de uso de los acidos nucleicos que comprenden un resto de X-fosfonato quiral

Los oligonucleotidos estereodefinidos que comprenden un resto de X-fosfonato quiral que se obtienen por los metodos de la invencion son utiles en varias areas para aplicaciones debido a una combinacion de estabilidad, quiralidad definida y facilidad de sintesis. Ampliamente, los compuestos sintetizados por este metodo son utiles como terapeuticos, sondas y reactivos de diagnostico, herramientas sinteticas para producir otros productos de oligonucleotido, y materiales de nanoestructura adecuados para varios materiales nuevos y aplicaciones de calculo.

Los oligonucleotidos estereodefinidos obtenidos por los metodos de la invencion tienen estabilidad en suero mejorada con respecto a la de equivalentes de ADN/ARN naturales, y en particular, oligonucleotidos estereodefinidos de la clase de los fosforotioatos. Ademas, el isomero Sp es mas estable que el isomero Rp. En algunas realizaciones, el nivel de estabilidad en suero se modula por la introduccion de tanto todos los centros Sp como los centros Sp en posiciones seleccionadas para conferir resistencia a la degradacion. En otras realizaciones, la introduccion de estereocentros Rp y/o Sp de seleccion puede proporcionar asociacion de apareamiento de bases especifica con una diana endogena o exogena, protegiendo asi la diana del metabolismo o mejorando una reaccion biologica particular.

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Se observa estabilidad del duplex mejorada hacia ARN con oligonucleotidos de fosforotioato Rp que tienen mayor estabilidad del duplex que los oligonucleotidos Sp correspondientes, que a su vez demuestran mayor estabilidad que la del ADN/ARN natural. Se observa estabilidad del duplex mejorada hacia ARN con Sp que tiene mayor estabilidad del duplex que Rp que tiene mas estabilidad que la del ADN/ARN natural (P. Guga, Curr. Top Med. Chem., 2007, 7, 695-713).

Estas moleculas pueden ser utiles como agentes terapeuticos, en varias aplicaciones particulares. Pueden incorporarse en oligonucleotidos que tambien contienen los nucleosidos de ADN/ARN estandar, o pueden sintetizarse como secuencia enteras de los oligonucleotidos estereocontrolados obtenidos por los metodos de la invention. Algunas categorias de agentes terapeuticos incluyen, pero no se limitan a, oligonucleotidos antisentido, oligonucleotidos de antigeno que forman una triple helice con secuencias elegidas como diana para reprimir la transcription de genes no deseados y modular la expresion de proteinas y/o actividad, oligonucleotidos de senuelo, vacunas de ADN, aptameros, ribozimas, desoxirribozimas (ADNzimas o enzimas de ADN), ARNip, microARN, ARNnc (ARN no codificantes), y profarmacos modificados con P. La modulation engloba aumentar o disminuir indirecta o directamente la actividad de una proteina o la inhibition o promotion de la expresion de una proteina. Estos compuestos de acido nucleico pueden usarse para controlar la proliferation celular, replication viral, o cualquier otro proceso de senalizacion de celulas.

En un ejemplo, el campo de los terapeuticos de ARNip tiene una necesidad de especies de oligonucleotidos que puedan proporcionar estabilidad elevada contra la actividad de RNasa, con el fin de mejorar la duration de la action con respecto a la observada con ARNip compuesto de nucleosidos naturales. Adicionalmente, la formation de la helice en forma de A parece ser mas indicativa de exito en la entrada de iARN que la presencia de elementos nativos especificos en el oligonucleotido. Ambos de estos requisitos que pueden ser proporcionados por el uso de los oligonucleotidos estereocontrolados obtenidos por los metodos de la invencion pueden proporcionar estabilidad mejorada (Y-L Chiu, T.M. Rana RNA, 2003, 9,1034-1048).

Los acidos nucleicos descritos en el presente documento son utiles como agentes terapeuticos contra diversos estados de enfermedad, que incluyen el uso como agentes antivirales. Los acidos nucleicos pueden usarse como agentes para el tratamiento de enfermedades mediante la modulacion de la actividad de ADN y/o ARN. En algunas realizaciones, los acidos nucleicos pueden usarse para inhibir expresion genica especifica. Por ejemplo, los acidos nucleicos pueden ser complementarios a una secuencia de aRn mensajero (ARNm) diana especifico. Pueden usarse para inhibir la replicacion viral tales como los ortopoxvirus, virus de la variolovacuna, herpes, papiloma, gripe, citomegalovirus y otros virus. Otros ejemplos incluyen usos como compuestos antisentido contra ARN del VIH u otro ARN retroviral o para hibridar con ARNm del VIH que codifica la proteina tat, o para la region TAR del ARNm del VIH. En algunas realizaciones, los acidos nucleicos imitan la estructura secundaria de la region TAR de ARNm del VIH, y haciendo esto se unen a la proteina tat. En una realization, los acidos nucleicos se usan para inhibir la expresion de una proteina diana poniendo en contacto una celula con un compuesto de formula 1 en el que la expresion de otras proteinas en la celula no se inhibe o se inhibe de forma minima. En alguna realizacion, la inhibicion de la proteina diana se produce in vivo en un mamifero. En otras realizaciones, se administra una cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto de formula 1 para inhibir la expresion de una proteina diana.

Otros ejemplos de proteinas donde la expresion puede modularse incluyen proteinas cinasa Jun del extremo N (JNK), diacilglicerol aciltransferasa I, apolipoproteina B, receptor de glucagon, Aurora B, acil CoA colesterol aciltransferasa-2, proteina c reactiva, familia de proteinas STAT (transductores de senales y activadores de la transcripcion) y P-glucoproteina MDR. Los acidos nucleicos pueden usarse para inhibir la expresion de la proteina fosfatasa 1B (PTP1B), polimerasa viral de ARN dependiente de ARN. Los acidos nucleicos pueden usarse para inducir acontecimientos tales como apoptosis en celulas cancerosas o para hacer una celula mas susceptible a la apoptosis. Los acidos nucleicos pueden usarse para modular actividades de proteinas. Por ejemplo, pueden ayudar a modular la actividad de RNasa H en moleculas de ARN multirresistentes a farmacos (MDR).

Los acidos nucleicos descritos en el presente documento son utiles para tratar indicaciones que incluyen, pero no se limitan a, hipercolesterolemia, sindrome respiratorio agudo grave (SARS), enfermedades retrovirales tales como SIDA o VIH, otras infecciones virales, infecciones intrauterinas y cancer.

Cuando se usa como terapeutico, el acido nucleico descrito en el presente documento se administra como una composition farmaceutica. En algunas realizaciones, la composition farmaceutica comprende una cantidad terapeuticamente eficaz de un acido nucleico que comprende un resto de X-fosfonato quiral de formula 1, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, y al menos un principio inactivo farmaceuticamente aceptable seleccionado de diluyentes farmaceuticamente aceptables, excipientes farmaceuticamente aceptables y vehiculos farmaceuticamente aceptables. En otra realizacion, la composicion farmaceutica se formula para inyeccion intravenosa, administration por via oral, administration por via oral, inhalation, administration nasal, administration

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topica, administracion oftalmica o administracion otica. En realizaciones adicionales, la composition farmaceutica es un comprimido, una pfldora, una capsula, un Kquido, un inhalante, una solution de espray nasal, un supositorio, una suspension, un gel, un coloide, una dispersion, una suspension, una solucion, una emulsion, una pomada, una locion, un colirio o una gota otica.

Una segunda categoria donde los compuestos sintetizados por los metodos de la invention son utiles es como cebadores o sondas. Como el metodo proporciona control total de secuencia, natural y no natural, y de estereoquimica en el centro de fosforo, puede producirse especificamente cualquier molecula especifica. Adicionalmente, la resistencia a RNasa adicional proporciona moleculas que son robustas en condiciones ex vivo o in vivo. Los oligonucleotidos estereodefinidos obtenidos por los metodos de la invencion pueden usarse como sondas para la investigacion de mecanismos de reaccion enzimatica que implican atomos de fosforo tales como la digestion, ligation y polimerizacion de acidos nucleicos. Esta clase de moleculas puede usarse como sondas para la investigation de mecanismos de reaction de ribozimas y desoxirribozimas. Tambien pueden funcionar de sondas para la investigacion de iARN y otros mecanismos de silenciamiento genico mediados por ARN no codificante como sondas para el analisis de interacciones protema-acido nucleico. La capacidad para definir la estructura tridimensional que incorpora estereocentros de fosforo Rp o Sp seleccionados permite la posibilidad de disenar novedosas clases de las llamadas balizas moleculares.

Como este metodo de sintesis no se limita al estrecho conjunto de nucleobases naturales, nucleobases modificadas u otras modificaciones a la base o azucar o extremos permite el uso de esta clase de oligonucleotidos como sondas o sensores para acidos nucleicos, proteinas y cualquier sustancia biologica o quimica en solucion. Tambien pueden usarse similarmente, sin nucleobases modificadas, usando metodos de detection estandar en lugar de ADN/ARN natural. Cualquiera de estos puede incorporarse como parte de un ensayo de diagnostico.

Tales pruebas de diagnostico pueden realizarse usando fluidos biologicos, tejidos, celulas intactas o componentes celulares aislados. Al igual que con la inhibition de la expresion genica, las aplicaciones de diagnostico utilizan la capacidad de los acidos nucleicos para hibridarse con una hebra complementaria de acido nucleico. La hibridacion es el enlace de hidrogeno especifico de secuencia de compuestos oligomericos mediante pares de bases de Watson-Crick y/u Hoogsteen a ARN o ADN. Se dice que las bases de tales pares de bases son complementarias entre si. Los acidos nucleicos pueden usarse para analizar estados corporales, por ejemplo, estados enfermos en animales. Pueden usarse para la identification de adenovirus o virus de la gripe en una muestra o como agentes intercalantes o sondas. Por ejemplo, pueden usarse para detectar metilacion de ADN o sondar interacciones de ADN con otros componentes celulares tales como proteinas.

Se describe un metodo se proporciona de identificacion o deteccion de una molecula diana en una muestra, comprendiendo el metodo: poner en contacto una muestra que se sospecha que contiene una molecula diana con una molecula sensora de acido nucleico de formula 1, sintetizada segun los metodos de la invencion, en el que un cambio en una senal generada por una unidad generadora de senales indica la presencia de dicha diana en dicha muestra. La molecula sensora de acido nucleico se une especificamente con la molecula diana. En algunas realizaciones hay una pluralidad de moleculas sensoras de acido nucleico. En algunas realizaciones, la pluralidad de moleculas sensoras de acido nucleico comprende moleculas sensoras de acido nucleico que se unen especificamente a diferentes moleculas diana. En algunos casos, el metodo comprende ademas cuantificar el cambio en la senal generado por la unidad generadora de senales para cuantificar la cantidad de molecula diana en la muestra. La unidad generadora de senales detecta cualquier tipo de senal, que incluye, pero no se limita a, fluorescencia, resonancia de plasmones superficiales, extincion de fluorescencia, quimioluminiscencia, interferometria o deteccion del indice de refraction.

En un uso relacionado, los oligonucleotidos estereodefinidos proporcionados por los metodos de la invencion son utiles como cebadores para PCR o como moldes o cebadores para la sintesis de ADN/ARN usando polimerasas. Las temperaturas de fusion pueden optimizarse para una aplicacion particular dependiendo de la introduction seleccionada de quiralidad Rp o Sp en el fosforo en el oligonucleotido producto.

Se proporciona un metodo de amplification de regiones deseadas de de acido nucleico de un molde de acido nucleico que comprende: (a) proporcionar una pluralidad de primeros cebadores de PCR que tienen una region de secuencia de nucleotidos fija complementaria a una secuencia consenso de interes; (b) proporcionar una pluralidad de segundos cebadores de PCR, (c) amplificar el molde de acido nucleico mediante PCr usando la pluralidad de primeros cebadores de PCR y la pluralidad de segundos cebadores de PCR en condiciones en las que un subconjunto de la pluralidad de primeros cebadores se une a la secuencia consenso de interes sustancialmente donde quiera que se produzca en el molde, y un subconjunto de la pluralidad de segunda cebadores se une al molde en localizaciones eliminadas de los primeros cebadores de forma que las regiones de acido nucleico flanqueadas

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En algunas realizaciones, el molde es ADN genomico. En algunas realizaciones, el molde es ADN genomico eucariota. En algunas realizaciones, el molde es ADN genomico humano. En algunas realizaciones, el molde es ADN procariota. En algunas realizaciones, el molde es ADN que es un ADN genomico clonado, una region de ADN subgenomica, un cromosoma o una region subcromosomica. En algunas realizaciones, el molde es ARN.

Los oligonucleotidos estereodefinidos tambien son utiles, debido a su elevada estabilidad y su capacidad para retener el reconocimiento y la union con sus dianas biologicas, como sustancias para chips de ADN y micromatrices de oligonucleotidos. Tambien pueden usarse como oligonucleotidos estabilizados alternativos a los acidos nucleicos naturales tales como ARNt y ARNm en la sintesis de proteinas libres de celulas.

Es util un area adicional donde la capacidad para controlar la estabilidad, composicion molecular que incluye restos no naturales, y estructura, todos dentro de la misma sintesis, para aplicaciones dentro del diseno de nanomateriales de ADN. Los oligonucleotidos estereodefinidos obtenidos por los metodos de la invencion pueden usarse como sustancias para la construccion de nano-estructuras de acido nucleico que consisten en estructuras duplex, triplex, cuadruplex, y otras de orden superior. La capacidad para incorporar otros restos organicos en las moleculas producidas por estos metodos conduce a aplicaciones en nanomateriales que disenan estructura de orden superior no natural especifica. La estabilidad in vivo y la flexibilidad del diseno permitiran que el uso de estas moleculas en, por ejemplo, ordenadores de ADN. Adicionalmente, pueden incorporarse moleculas organicas quelantes o conductoras de metales en los estereodefinidos obtenidos por los metodos de la invencion y conducir a su uso como nano-hilos de ADN en dispositivos electronicos o nano-maquinas de ADN/ARN (F.A. Aldate, A.L. Palmer, Science, 2008, 321, 1795-1799).

Ejemplos

Informacion general:

Todos los espectros de RMN en el presente documento se registraron en un Varian Mercury 300. Los espectros de RMN 1H se obtuvieron a 300 MHz con tetrametilsilano (TMS) (5 0,0) como patron interno en CDCl3. Los espectros de RMN 31P se obtuvieron a 121,5 MHz con 85 % de H3PO4 (5 0,0) como patron externo. Se registraron Em-MALDI TOF en un Applied Biosystems Voyager System 4327. La cromatografia en columna de gel de silice se llevo a cabo usando gel de silice 60N de Kanto (esferico, neutro, 63-210 |jm). Se realizo CCF analitica en placas Kieselgel 60- F254 de Merck. Se prepararon disolventes organicos secos por procedimientos apropiados antes de uso. Los otros disolventes organicos fueron de calidad reactivo y se usaron como se recibieron. Se llevo a cabo ACQUITY UPLC® usando BEH C18 (1,7 jm, 2,1 * 150 mm). El rendimiento de los dimeros de fosforotioato dTT, dCT, dAT, dGT, rUoMeU y rUFU se determino por mediciones de absorbancia UV a 260 nm con los coeficientes de extincion molar de valores aproximados para los dimeros naturales dTT (16800), dCT (15200), dAT (22800), dGT (20000), rUU (19600), rUU (19600), respectivamente.

Abreviaturas:

bz: benzoilo

reactivo de Beaucage: 1,1-dioxido de 3H-1,2-benzoditiol-3-ona BSA: N,O-bis(trimetilsilil)acetamida BTC: bis(triclorometil)carbonato ce: cianoetilo

CF3COIm: N-trifluoroacetilimidazol CMP: N-cianometilpirrolidina

CMPT: trifluorometanosulfonato de N-cianometilpirrolidinio

CPG: vidrio de poro controlado

DBU: 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno

DCA: acido dicloroacetico

DCM: diclorometano, CH2Cl2

DMAc: N,N-dimetilacetamida

DMAN: 1,8-bis(dimetilamino)naftaleno

DMTr: 4,4'-dimetoxitritilo

DTD: disulfuro de N,N-dimetiltiuram

HCP: poliestireno altamente reticulado

pac: fenoxiacetilo

TBS: t-butildimetilsililo

TBDPS: t-butildifenilsililo

TFA: acido trifluoroacetico

L-2: mismo que la formula P en el presente documento

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D-2: mismo que la formula O en el presente documento L-6: mismo que la formula R en el presente documento D-6: mismo que la formula Q en el presente documento

Ejemplo 1: Sintesis en solucion de un dimero de fosforotioato, N3-benzoil-5'-O-(terc-butildifenilsilil)timidin-3'-il N3- benzoil-3'-O-(ferc-butildimetilsilil)timidin-5'-ilfosfo rotioato de (Sp)-1 ,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-enio [(Sp)-4tt]

mediante la Ruta A

Se seco N3-benzoil-5'-O-(terc-butildifenilsilil)timidin-3'-ilfosfonato de 8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-enio (1t) (96,0 mg, 120 |jmoles) por coevaporaciones repetidas con piridina seca y entonces se disolvio en piridina seca (2 ml). Se anadio BTC (29,7 mg 100 jmoles), y la mezcla se agito durante 10 min. Se anadio una solucion de aminoalcohol L-2 (21,3 mg, 120 jmoles), que se preparo por coevaporaciones repetidas con piridina seca y se disolvio en piridina seca (1 ml), a la mezcla de reaccion gota a gota mediante una jeringa, y la mezcla se agito durante 5 min bajo atmosfera de argon. A la solucion de N3-benzoil-3'-O-(terc-butildimetilsilil)timidina (3t), que se preparo por coevaporaciones repetidas con piridina seca y se disolvio en piridina (500 jmoles), se anadio la mezcla de reaccion mediante una jeringa. Despues de 30 min, se anadio DTD (42,5 mg, 120 jmoles) a la mezcla de reaccion. Tras 5 min adicionales, el disolvente se evaporo a presion reducida. Se anadio NH3 concentrado-EtOH (40 ml; 3:1, v/v) al residuo, y la mezcla se agito durante 12 h a temperatura ambiente. La mezcla se concentro a sequedad a presion reducida. La mezcla en bruto se diluyo con CHCl3 (15 ml), y se lavo con hidrogenocarbonato de trietilamonio 0,2 M (20 ml). La fase acuosa se retro-extrajo con CHCl3 (4 x 15 ml). Las fases organicas combinadas se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron a sequedad a presion reducida. El residuo se purifico por PTLC. El producto se disolvio en CHCl3 (5 ml), se lavo con tampon hidrogenocarbonato de 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-enio 0,2 M (10 ml) y se retro-extrajo con CHCl3 (3 * 5 ml). Las fases organicas combinadas se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron a sequedad proporcionando (Sp)-4tt (41,8 mg, rendimiento del 98 %, Rp:Sp = 9:91) como una espuma blanca. Los espectros de RMN 1H y 31P (Figura 1 y 2, respectivamente) fueron identicos a aquellos de una muestra de control sintetizada por el metodo de H-fosfonato convencional. RMN 31P (121,5 MHz, CDCb) 5 57,4 (isomero Rp: 57,9). El esquema sintetico se muestra en el Esquema 10.

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Esquema 10. Sintesis en solucion de un dimero de ADN como en el Esquema 5 (Ruta A).

Ejemplo 2: Sintesis en solucion de un dimero de fosforotioato, 6-N-benzoil-5'-O-(ferc-butildifenilsilil)-desoxiadenosin- 3'-il 3'-O-(terc-butildimetilsilil)timidin-5'-ilfosforotioato de (Sp)-1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-enio [(Sp)-4at] mediante la Ruta A.

Se obtiene (Sp)-4at a partir de 6-N-benzoil-5'-O-(terc-butildifenilsilil)-desoxiadenosin-3'-ilfosfonato de 1,8- diazabiciclo[5.4.0]undec-7-enio (1a) en lugar de 1t, usando las etapas de reaccion descritas anteriormente para (Sp)- 4tt.

Ejemplo 3: Sintesis en solucion de un dimero de fosforotioato, 4-N-benzoil-5'-O-(terc-butildifenilsilil)-desoxicitidin-3'-il 3'-O-(terc-butildimetilsilil)timidin-5'-ilfosforotioato de (Sp)-1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-enio [(Sp)-4ct] mediante la Ruta A.

Se obtiene (Sp)-4ct a partir de 4-N-benzoil-5'-O-(terc-butildifenilsilil)-desoxicitidin-3'-ilfosfonato de 1,8- diazabiciclo[5.4.0]undec-7-enio (1c) ,en lugar de 1t, usando las etapas de reaccion descritas anteriormente para (Sp)-4tt.

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Ejemplo 4: Smtesis en solucion de un d^ero de fosforotioato, 2-N-fenoxiacetil-5'-O-(ferc-

butildifenilsilil)desoxiguanosin-3'-il 3'-O-(ferc-butildimetilsilil)timidin-5'-ilfosforotioato de (Sp)-1 ,8-

diazabiciclo[5.4.0]undec-7-enio [(Sp)-4gt] mediante la Ruta A.

Se obtiene (Sp)-4gt a partir de 2-N-fenoxiacetil-5'-O-(ferc-butildifenilsilil)desoxiguanosin-3'-ilfosfonato de 1,8- diazabiciclo[5.4.0]undec-7-enio (1g) en lugar de 1t, usando las etapas de reaccion descritas anteriormente para (Sp)- 4tt.

Ejemplo 5: Smtesis en solucion de un dimero de fosforotioato, N3-benzoil-5'-O-(terc-butildifenilsilil)timidin-3'-il N3- benzoil-3'-O-(ferc-butildimetilsilil)timidin-5'-ilfosforotioato de (Rp)-1 ,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-enio [(Rp)-4tt]

mediante la Ruta A.

Se obtuvo (Rp)-4tt como una espuma blanca (rendimiento del 93 %, Rp:Sp = 95:5) usando aminoalcohol D-2 en lugar de L-2 de un modo similar a (Sp)-4tt en el Ejemplo 1. Los espectros de RMN de 1H y 31P se muestran en las Figuras 3 y 4, respectivamente. RMN 31P (121,5 MHz, CDCb) 5 57,6 (Sp isomero: 57,3.

imagen73

D-2

Ejemplo 6: Smtesis en solucion de un dimero de fosforotioato, 6-N-benzoil-5'-O-(ferc-butildifenilsilil)desoxiadenosin- 3'-il 3'-O-(ferc-butildimetilsilil)timidin-5'-ilfosforotioato de (Rp)-1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-enio [(Rp)-4at] mediante la Ruta A.

Se produce (Rp)-4at mediante las transformaciones descritas anteriormente en el Ejemplo 2 usando el compuesto 1a y el aminoalcohol D-2 como reactivo quiral, en lugar de L-2.

Ejemplo 7: Smtesis en solucion de un dimero de fosforotioato, 4-N-benzoil-5'-O-(ferc-butildifenilsilil)desoxicitidin-3'-il 3'-O-(ferc-butildimetilsilil)timidin-5'-ilfosforotioato de (Rp)-1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-enio [(Rp)-4ct] mediante la Ruta A.

Se produce (Rp)-4ct mediante las transformaciones descritas anteriormente en el Ejemplo 3 usando el compuesto 1c y el aminoalcohol D-2 como reactivo quiral, en lugar de L-2.

Ejemplo 8: Smtesis en solucion de un dimero de fosforotioato, 2-N-fenoxiacetil-5'-O-(terc-

butildifenilsilil)desoxiguanosin-3'-il 3'-O-(ferc-butildimetilsilil)timidin-5'-ilfosforotioato de (Rp)-1 ,8-

diazabiciclo[5.4.0]undec-7-enio [(Rp)-4gt] mediante la Ruta A.

Se produce (Rp)-4gt mediante las transformaciones descritas anteriormente en el Ejemplo 4 usando el compuesto 1 g y el aminoalcohol D-2 como reactivo quiral, en lugar de L-2.

Ejemplo 9: Desproteccion para formar timidin-3'-il timidin-5'-ilfosforotioato de (Sp)-amonio [(Sp)-5tt].

Se seca (Sp)-4tt (50 |jmoles) por coevaporaciones repetidas con piridina seca y tolueno seco, y entonces se disuelve en trifluorhidrato de trietilamina (500 jl). La mezcla se agita durante 15 h a temperatura ambiente. Entonces se anade un tampon acetato de amonio 0,1 M (2,5 ml) a la mezcla, y la mezcla se lava con Et2O (3 * 3 ml). Las fases organicas combinadas se retro-extraen con tampon acetato de amonio 0,1 M (3 ml). Las fases acuosas combinadas se concentran entonces a sequedad a presion reducida, y el residuo se purifica por cromatografia en columna de fase inversa [un gradiente lineal de acetonitrilo 0-10 % en tampon acetato de amonio 0,1 M (pH 7,0)] proporcionando (Sp)-5tt. El esquema de desproteccion se muestra en el Esquema 11.

Esquema 11. Desproteccion

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Ejemplo 10: Desproteccion para formar desoxiadenosin-3'-il timidin-5'-ilfosforotioato de (Sp)-amonio [(Sp)-5at].

Se produce (Sp)-5at como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 9 usando (Sp)-4at en lugar de (Sp)-4tt.

Ejemplo 11: Desproteccion para formar desoxicitidin-3'-il timidin-5'-ilfosforotioato de (Sp)-amonio [(Sp)-5ct].

Se produce (Sp)-5ct como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 9 usando (Sp)-4ct en lugar de (Sp)-4tt.

Ejemplo 12: Desproteccion para formar desoxiguanosin-3'-il timidin-5'-ilfosforotioato de (Sp)-amonio [(Sp)-5gt].

Se produce (Sp)-5gt como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 9 usando (Sp)-4gt en lugar de (Sp)-4tt en.

Ejemplo 13: Desproteccion para formar timidin-3'-il timidin-5'-ilfosforotioato de (Rp)-amonio [(Rp)-5tt].

Se produce (Rp)-5tt como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 9 usando (Rp)-4tt en lugar de (Sp)-4tt de una manera similar a (Sp)-5tt.

Ejemplo 14: Desproteccion para formar desoxiadenosin-3'-il timidin-5'-ilfosforotioato de (Rp)-amonio [(Rp)-5at].

Se produce (Rp)-5at como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 9 usando (Rp)-4at en lugar de (Sp)-4tt.

Ejemplo 15: Desproteccion para formar desoxicitidin-3'-il timidin-5'-ilfosforotioato de (Rp)-amonio [(Rp)-5ct].

Se produce (Rp)-5ct como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 9 usando (Rp)-4ct en lugar de (Sp)-4tt.

Ejemplo 16: Desproteccion para formar desoxiguanosin-3'-il timidin-5'-ilfosforotioato de (Rp)-amonio [(Rp)-5gt].

Se produce (Rp)-5gt como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 9 usando (Rp)-4gt en lugar de (Sp)-4tt de una manera similar a (Sp)-5tt.

Ejemplo 17: Sintesis de H-fosfonato de (Rp)-5'-O-(ferc-butildifenilsilil)timidin-3'-il 3'-O-(ferc-butildimetilsilil)timidin-5'- ilo [(Rp)-7tt] mediante la Ruta B.

Se seca 1t (100 |jmoles) por coevaporaciones repetidas con piridina seca y entonces se disuelve en piridina seca (1 ml). Se anade cloruro W,W-bis(2-oxo-3-oxazolidinil)fosfmico (BopCl; 500 jmoles), y la mezcla se agita durante 5 min. A la mezcla se anade gota a gota una solucion de aminoalcohol ((aR, 2S)-6) (l 00 jmoles), que se ha secado por coevaporaciones con piridina seca y se disuelve en piridina seca (1 ml), mediante una jeringa, y la mezcla se agita durante 5 min bajo argon. Se seca 3'-O-(terc-butildimetilsilil)timidina usando coevaporaciones repetidas con piridina seca y se disuelve en 100 jmoles de piridina. La mezcla anterior se anade mediante canula a la solucion de 3'-O- (terc-butildimetilsilil)timidina 3t en piridina seca (100 jmoles). Despues de 15 min, la mezcla se concentra a presion reducida. El residuo se diluye con CH2CE (5 ml) y se lava con NaHCO3 saturado (3 * 5 ml). Las fases acuosas combinadas se retro-extraen con CH2Ch (2 * 5 ml). Las fases organicas combinadas se secan sobre Na2SO4, se filtran y se concentran a aprox. 1 ml a presion reducida. El residuo se anade gota a gota mediante una jeringa a una solucion con agitacion de 1 % de acido trifluoroacetico (TFA) en CH2Cl2 seco (20 ml) a 0 °C. Despues de 5 min adicionales, la mezcla se diluye con CH2Ch seco (100 ml) y se lava con soluciones acuosas saturadas de NaHCO3 (2 * 100 ml). Las fases acuosas combinadas se retro-extraen con CH2Ch (2 * 100 ml). Las fases organicas combinadas se secan sobre Na2SO4, se filtran y se concentran a sequedad a presion reducida proporcionando (Rp)- 7tt en bruto. El esquema sintetico se muestra en el Esquema 12.

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Esquema 12. Smtesis de analogos de ADN como en el Esquema 6 (Ruta B).

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Ejemplo 18: Smtesis de H-fosfonato de (Rp)-6-H-benzoil-5'-O-(terc-butildifenilsilil)desoxiadenosin-3'-il 3'-O-(terc- butildimetilsilil)timidin-5,-ilo [(Rp)-7at] mediante la Ruta B.

Se produce (Rp)-7at en bruto como se describe en el Ejemplo 17 usando 1a en lugar de 1t.

Ejemplo 19: Smtesis de H-fosfonato de (Rp)-4-H-benzoil-5'-O-(terc-butildifenilsilil)desoxicitidin-3'-il 3'-O-(terc- butildimetilsilil)timidin-5'-ilo [(Rp)-7ct] mediante la Ruta B.

Se produce (Rp)-7ct en bruto como se describe en el Ejemplo 17 usando 1c en lugar de 1t.

Ejemplo 20: Smtesis de H-fosfonato de (Rp)-2-H-fenoxiacetil-5'-O-(terc-butildifenilsilil)desoxiguanosin-3'-il 3'-O-(terc- butildimetilsilil)timidin-5'-ilo [(Rp)-7gt] mediante la Ruta B.

Se produce (Rp)-7gt en bruto como se describe en el Ejemplo 17 usando 1g en lugar de 1t.

Ejemplo 21: Smtesis de H-fosfonato de (Sp)-5'-O-(terc-butildifenilsilil)timidin-3'-il 3'-O-(terc-butildimetilsilil)timidin-5'- ilo [(SP)-7tt] mediante la Ruta B.

Se produce (Sp)-7tt en bruto como se describe en el Ejemplo 17 usando (aS, 2R)-6 en lugar de (aR, 2S)-6 como reactivo quiral.

Ejemplo 22: Smtesis de H-fosfonato de (Sp)-6-H-benzoil-5'-O-(terc-butildifenilsilil)desoxiadenosin-3'-il 3'-O-(terc- butildimetilsilil)timidin-5'-ilo [(Sp)-7at] mediante la Ruta B.

Se produce (Sp)-7at en bruto como se describe en el Ejemplo 17 usando el compuesto 1a y (aS, 2R)-6 en lugar de (aR, 2S)-6 como reactivo quiral.

Ejemplo 23: Smtesis de H-fosfonato de (Sp)-4-H-benzoil-5'-O-(terc-butildifenilsilil)desoxicitidin-3'-il 3'-O-(terc- butildimetilsilil)timidin-5'-ilo [(SP)-7ct] mediante la Ruta B.

Se produce (Sp)-7ct en bruto como se describe en el Ejemplo 17 usando el compuesto 1c y (aS, 2R)-6 en lugar de (aR, 2S)-6 como reactivo quiral.

Ejemplo 24: Smtesis de H-fosfonato de (Sp)-2-H-fenoxiacetil-5'-O-(terc-butildifenilsilil)desoxiguanosin-3'-il 3'-O-(terc- butildimetilsilil)timidin-5'-ilo [(Sp)-7gt] mediante la Ruta B.

Se produce (Sp)-7gt en bruto como se describe en el Ejemplo 17 usando el compuesto 1g en lugar de 1t y el compuesto (aS, 2R)-6 en lugar del compuesto (aR, 2S)-6 como reactivo quiral.

Ejemplo 25: Modification para producir timidin-3'-il timidin-5'-ilfosforotioato de (Rp)-amonio [(Rp)-5tt] como se muestra en Esquema general 13.

Se seca (Sp)-7tt por coevaporaciones repetidas con piridina seca y tolueno seco, y entonces se disuelve en CH3CN (1 ml). Se anade N,O-bis(trimetilsilil)acetamida (BSA; 100 pl). Despues de 1 min, se anade disulfuro de H,H'- dimetiltiuram (DTD; 120 pmoles). Despues de 3 min adicionales, la mezcla se concentra a sequedad a presion reducida dando (Rp)-4tt en bruto. Entonces, se disuelve (Rp)-4tt en bruto en trifluorhidrato de trietilamina (1 ml). La mezcla se agita durante 15 h a temperatura ambiente. Entonces se anade un tampon acetato de amonio 0,1 M (5

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ml) a la mezcla, y la mezcla se lava con Et2O (3 * 5 ml). Las fases organicas combinadas se retro-extraen con tampon acetato de amonio 0,1 M (5 ml). Las fases acuosas combinadas se concentran entonces a sequedad a presion reducida, y el residuo se purifica por cromatografia en columna de fase inversa [un gradiente lineal de acetonitrilo 0-10 % en tampon acetato de amonio 0,1 M (pH 7,0)] proporcionando (Rp)-5tt. Las etapas de modification se muestran en el Esquema 13.

Esquema 13. Modificacion en el fosforo para introducir azufre.

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Ejemplo 26: Modificacion para producir desoxiadenosin-3'-il timidin-5'-ilfosforotioato de (Rp)-amonio [(Rp)-5at].

Se produce (Rp)-5at como se describe en el Ejemplo 25 usando (Sp)-7at en lugar de (Sp)-7tt.

Ejemplo 27: Modificacion para producir desoxicitidin-3'-il timidin-5'-ilfosforotioato de (Rp)-amonio [ (Rp)-5ct].

Se produce (Rp)-5ct como se describe en el Ejemplo 25 usando (Sp)-7ct en lugar de (Sp)-7tt.

Ejemplo 28: Modificacion para producir desoxiguanosin-3'-il timidin-5'-ilfosforotioato de (Rp)-amonio [(Rp)-5gt].

Se produce (Rp)-5gt como se describe en el Ejemplo 25 usando (Sp)-7gt en lugar de (Sp)-7tt.

Ejemplo 29: Modificacion para producir timidin-3'-il timidin-5'-ilfosforotioato de (Sp)-amonio [(Sp)-5tt].

Se produce (Sp)-5tt como se describe en el Ejemplo 25 usando (Rp)-7tt en lugar de (Sp)-7tt.

Ejemplo 30: Modificacion para producir desoxiadenosin-3'-il timidin-5'-ilfosforotioato de (Sp)-amonio [(Sp)-5at].

Se produce (Sp)-5at como se describe en el Ejemplo 25 usando (Rp)-7at en lugar de (Sp)-7tt.

Ejemplo 31: Modificacion para producir desoxicitidin-3'-il timidin-5'-ilfosforotioato de (Sp)-amonio [(Sp)-5ct].

Se produce (Sp)-5ct como se describe en el Ejemplo 25 usando (Rp)-7ct en lugar de (Sp)-7tt.

Ejemplo 32: Modificacion para producir desoxiguanosin-3'-il timidin-5'-ilfosforotioato de (Sp)-amonio [(Sp)-5gt].

Se produce (Sp)-5gt como se describe en el Ejemplo 25 usando (Rp)-7gt en lugar de (Sp)-7tt.

Ejemplo 33: Sintesis de un dimero de analogo de ARN, 5'-O-(ferc-butildifenilsilil)-2'-O-(ferc-butildimetilsilil)uridin-3'-il 2',3'-O-bis(ferc-butildimetilsilil)uridin-5'-ilfosforotioato de (Sp)-1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-enio [(Sp)-10uu] mediante la Ruta A.

Se seca 5'-O-(ferc-butildifenilsilil)-2'-O-(ferc-butildimetilsilil)uridin-3'-ilfosfonato de 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-enio (8u) (100 |jmoles) por coevaporaciones repetidas con piridina seca y entonces se disuelve en piridina seca (1 ml). Se anade cloruro N,N'-bis(2-oxo-3-oxazolidinil)fosfinico (BopCl; 500 jmoles) y la mezcla se agita durante 5 min. A la mezcla se anade gota a gota una solution de aminoalcohol (L-2) (100 jmoles), que se ha secado por coevaporaciones repetidas con piridina seca y se disolvio en piridina seca (1 ml), mediante una jeringa, y la mezcla se agita durante 5 min bajo argon. Se seca 2',3'-O-bis(terc-butildimetilsilil)uridina 9u por coevaporaciones repetidas con piridina seca y se disuelve en 100 jmoles de piridina. Entonces, la mezcla anterior se anade mediante canula en la solucion de 2',3'-O-bis(terc-butildimetilsilil)uridina 9u (100 jmoles). Despues de 10 min, se anade N- trifluoroacetilimidazol (CF3COIm; 200 jmoles). Despues de 30 s adicionales, se anade disulfuro de N,N'- dimetiltiuram (DTD; 120 jmoles). Despues de 3 min adicionales, la mezcla se seca a vacio. Al residuo se anade NH3 conc.-EtOH (3:1, v/v, 10 ml), y la mezcla se agita durante 12 h, y entonces se concentra a sequedad a presion reducida. Entonces, la mezcla se diluye con CHCl3 (5 ml), y se lava con tampon fosfato 0,2 M (pH 7,0, 5 ml). Las fases acuosas se retro-extraen con CHCb (2 * 5 ml). Las fases organicas combinadas se secan sobre Na2SO4, se filtran y se concentran a sequedad a presion reducida. El residuo se purifica por PTLC. El producto se disuelve en CHCl3 (5 ml), se lava con tampon bicarbonato de 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-enio 0,2 M (5 ml) y se retro-extrae con CHCl3 (2 * 5 ml). Las fases organicas combinadas se secan sobre Na2SO4, se filtran y se concentran a

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sequedad proporcionando (Sp)-10uu. El esquema sintetico se muestra en el Esquema 14.

Esquema 14. Sintesis de analogos de ARN como en el Esquema 5 (Ruta A).

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Ejemplo 34: Sintesis de un dimero de analogo de ARN, 6-W-benzoil-5'-O-(ferc-butildifenilsilil)-2'-O-(ferc-

butildimetilsilil)adenosin-3'-M 2',3'-O-bis(terc-butildimetilsilil)uridin-5'-ilfosforotioato de (Sp)-1 ,8-

diazabiciclo[5.4.0]undec-7-enio [(Sp)-10au] mediante la Ruta A.

Se produce (Sp)-10au como se describe en el Ejemplo 33 usando 6-W-benzoil-5'-O-(terc-butildifenilsilil)-2'-O-(terc- butildimetilsilil)adenosin-3'-ilfosfonato de 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-enio (8a) en lugar de 8u.

Ejemplo 35: Sintesis de un dimero de analogo de ARN, 4-W-benzoil-5'-O-(ferc-butildifenilsilil)-2'-O-(ferc-

butildimetilsilil)citidin-3'-il 2',3'-O-bis(terc-butildimetilsilil)uridin-5'-ilfosforotioato de (Sp)-1 ,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7- enio [(Sp)-10cu] mediante la Ruta A.

Se produce (Sp)-10cu como se describe en el Ejemplo 33 usando 4-W-benzoil-5'-O-(ferc-butildifenilsilil)-2'-O-(terc- butildimetilsilil)citidin-3'-ilfosfonato de 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-enio (8c) en lugar de 8u.

Ejemplo 36: Smtesis de un dimero de analogo de ARN, 2-W-fenoxiacetil-5'-O-(ferc-butildifenilsilil)-2'-O-(ferc- butildimetilsilil)guanosin-3'-il 2',3'-O-bis(terc-butildimetilsilil)uridin-5'-ilfosforotioato de (Sp)-1 ,8-

diazabiciclo[5.4.0]undec-7-enio [(Sp)-10gu] mediante la Ruta A.

Se produce (Sp)-10gu como se describe en el Ejemplo 33 usando 2-W-fenoxiacetil-5'-O-(ferc-butildifenilsilil)-2'-O- (terc-butildimetilsilil)guanosin-3'-ilfosfonato de 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-enio (8g) en lugar de 8u.

Ejemplo 37: Sintesis de un dimero de analogo de ARN, 5'-O-(terc-butildifenilsilil)-2'-O-(ferc-butildimetilsilil)uridin-3'-il 2',3'-O-bis(terc-butildimetilsilil)uridin-5'-ilfosforotioato de (Rp)-1 ,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-enio [(Rp)-1 0uu]

mediante la Ruta A.

Se produce (Rp)-10uu como se describe en el Ejemplo 33 usando el reactivo quiral D-2 en lugar del reactivo quiral L- 2.

Ejemplo 38: Sintesis de un dimero de analogo de ARN, 6-W-benzoil-5'-O-(terc-butildifenilsilil)-2'-O-(terc-

butildimetilsilil)adenosin-3'-il 2',3'-O-bis(terc-butildimetilsilil)uridin-5'-ilfosforotioato de (Rp)-1 ,8-

diazabiciclo[5.4.0]undec-7-enio [(Rp)-10au] mediante la Ruta A.

Se produce (Rp)-10au como se describe en el Ejemplo 33 usando 8a en lugar de 8u y el reactivo quiral D-2 en lugar del reactivo quiral L-2.

Ejemplo 39: Sintesis de un dimero de analogo de ARN, 4-W-benzoil-5'-O-(terc-butildifenilsilil)-2'-O-(terc-

butildimetilsilil)citidin-3'-il 2',3'-O-bis(terc-butildimetilsilil)uridin-5'-ilfosforotioato de (Rp)-1 ,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7- enio [(Rp)-10cu] mediante la Ruta A.

Se produce (Rp)-10cu como se describe en el Ejemplo 33 usando 8c en lugar de 8u y el reactivo quiral D-2 en lugar del reactivo quiral L-2.

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Ejemplo 40: Smtesis de un dimero de analogo de ARN, 2-N-fenoxiacetil-5'-O-(ferc-butildifenilsilil)-2'-O-(fen> butildimetilsilil)guanosin-3'-il 2',3'-O-bis(ferc-butildimetilsilil)uridin-5'-ilfosforotioato de (Rp)-1 ,8-

diazabiciclo[5.4.0]undec-7-enio [(Rp)-10gu] mediante la Ruta A.

Se produce (Rp)-10gu como se describe en el Ejemplo 33 usando 8g en lugar de 8u y el reactivo quiral D-2 en lugar del reactivo quiral L-2.

Ejemplo 41: Desproteccion para formar uridin-3'-il uridin-5'-ilfosforotioato de (Sp)-trietilamonio [(Sp)-1 1 uu].

Se seca (Sp)-10uu (50 jmoles) por coevaporaciones repetidas con piridina seca y tolueno seco, y entonces se disuelve en solucion de fluoruro de tetrabutilamonio 1 M (TBAF) en THF seco (500 |jl). La mezcla se agita durante 12 h a temperatura ambiente. Se anade una solucion de tampon acetato de trietilamonio 0,05 M (pH 6,9, 2,5 ml) a la mezcla, y la mezcla se lava con Et2O (3 * 3 ml). Las fases organicas combinadas se retro-extraen con tampon acetato de trietilamonio 0,05 M (3 ml). Las fases acuosas combinadas se concentran entonces a sequedad a presion reducida, y el residuo se purifica por cromatografia en columna de fase inversa [un gradiente lineal de acetonitrilo 010 % en tampon acetato de trietilamonio 0,1 M (pH 6,9)] proporcionando (Sp)-11uu. El esquema de desproteccion se muestra en el Esquema 15.

Esquema 15. Desproteccion como en el Esquema 5 (Ruta A).

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Ejemplo 42: Desproteccion para formar adenosin-3'-il uridin-5'-ilfosforotioato de (Sp)-trietilamonio [(Sp)-11au].

Se produce (Sp)-1 1 au como se describe en el Ejemplo 41 usando (Sp)-1 0au en lugar de (Sp)-10uu.

Ejemplo 43: Desproteccion para formar citidin-3'-il uridin-5'-ilfosforotioato de (Sp)-trietilamonio [(Sp)-11cu].

Se produce (Sp)-1 1 cu como se describe en el Ejemplo 41 usando (Sp)-1 0cu en lugar de (Sp)-10uu.

Ejemplo 44: Desproteccion para formar guanosin-3'-il uridin-5'-ilfosforotioato de (Sp)-trietilamonio [(Sp)-11gu].

Se produce (Sp)-1 1gu como se describe en el Ejemplo 41 usando (Sp)-1 0gu en lugar de (Sp)-10uu.

Ejemplo 45: Desproteccion para formar uridin-3'-il uridin-5'-ilfosforotioato de (Rp)-trietilamonio [(Rp)-1 1 uu].

Se produce (Rp)-11uu como se describe en el Ejemplo 41 usando (Rp)-10uu en lugar de (Sp)-10uu.

Ejemplo 46: Desproteccion para formar adenosin-3'-il uridin-5'-ilfosforotioato de (Rp)-trietilamonio [(Rp)-11au].

Se produce (Rp)-1 1 au como se describe en el Ejemplo 41 usando (Rp)-1 0au en lugar de (Sp)-10uu.

Ejemplo 47: Desproteccion para formar citidin-3'-il uridin-5'-ilfosforotioato de (Rp)-trietilamonio [(Rp)-11cu].

Se produce (Rp)-1 1 cu como se describe en el Ejemplo 41 usando (Rp)-1 0cu en lugar de (Sp)-10uu.

Ejemplo 48: Desproteccion para formar guanosin-3'-il uridin-5'-ilfosforotioato de (Rp)-trietilamonio [(Rp)-11gu].

Se produce (Rp)-11gu como se describe en el Ejemplo 41 usando (Rp)-10gu en lugar de (Sp)-10uu.

Ejemplo 49: Smtesis de un dimero de analogo de ARN, H-fosfonato de (Rp)-5'-O-(ferc-butildifenilsilil)-2'-O-(ferc- butildimetilsilil)uridin-3'-il 2',3'-O-bis(terc-butildimetilsilil)uridin-5'-ilo [(Rp)-12uu] mediante la Ruta B.

Se seca 8u (100 jmoles) por coevaporaciones repetidas con piridina seca y entonces se disuelve en piridina seca (1 ml). Se anade cloruro W,W-bis(2-oxo-3-oxazolidinil)fosfmico (BopCl; 500 jmoles), y la mezcla se agita durante 5 min. A la mezcla se anade gota a gota una solucion de aminoalcohol ((aR, 2S)-6) (100 jmoles), que se seca por coevaporaciones con piridina seca y se disuelve en piridina seca (1 ml), mediante una jeringa, y la mezcla se agita durante 5 min bajo argon. Entonces la mezcla se anade mediante canula en una solucion de 9u (100 jmoles), que se prepara por coevaporaciones repetidas con piridina seca y solucion en piridina. Despues de 15 min, la mezcla se

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concentra a presion reducida. El residuo se diluye con CH2CI2 (5 ml) y se lava con NaHCO3 saturado (3 * 5 ml). Las fases acuosas combinadas se retro-extraen con CH2Cl2 (2 * 5 ml). Las fases organicas combinadas se secan sobre Na2SO4, se filtran y se concentran a aprox. 1 ml a presion reducida. El residuo se anade gota a gota mediante una jeringa a una solucion con agitacion de 1 % de acido trifluoroacetico (TFA) en CH2Ch seco (20 ml) a 0 °C. Despues de 5 min adicionales, la mezcla se diluye con CH2Ch seco (100 ml) y se lava con soluciones acuosas saturadas de NaHCO3 (2 * 100 ml). Las fases acuosas combinadas se retro-extraen con CH2Ch (2 * 100 ml). Las fases organicas combinadas se secan sobre Na2SO4, se filtran y se concentran a sequedad a presion reducida proporcionando (Rp)- 12uu en bruto, que se analiza por RMN 31P. El esquema sintetico se muestra en el Esquema 16.

Esquema 16. Sintesis de analogos de ARN mediante el Esquema 6 (Ruta B).

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piridina

‘O HDBU

1 % de TFA/CH2CI2

TBSO OTBS

Ejemplo 50: Srntesis de un dimero de analogo de ARN, H-fosfonato de (Rp)-6-N-benzoil-5'-O-(ferc-butildifenilsilil)-2'- O-(ferc-butildimetilsilil)adenosin-3'-il 2',3'-O-bis(ferc-butildimetilsilil)uridin-5'-ilo [(Rp)-12au] mediante la Ruta B.

Se produce (Rp)-12au en bruto como se describe en el Ejemplo 49 usando 8a en lugar de 8u.

Ejemplo 51: Sintesis de un dimero de analogo de ARN, H-fosfonato de (Rp)-4-N-benzoil-5'-O-(terc-butildifenilsilil)-2'- O-(terc-butildimetilsilil)citidin-3'-il 2',3'-O-bis(terc-butildimetilsilil)uridin-5'-ilo [(Rp)-12cu] mediante la Ruta B.

Se produce (Rp)-12cu en bruto como se describe en el Ejemplo 49 usando 8c en lugar de 8u.

Ejemplo 52: Sintesis de un dimero de analogo de ARN, H-fosfonato de (Rp)-2-N-fenoxiacetil-5'-O-(ferc- butildifenilsilil)-2'-O-(terc-butildimetilsilil)guanosin-3'-il 2',3'-O-bis(terc-butildimetilsilil)uridin-5'-ilo [(Rp)-12gu] mediante la Ruta B.

Se produce (Rp)-12gu en bruto como se describe en el Ejemplo 49 usando 8g en lugar de 8u.

Ejemplo 53: Sintesis de un dimero de analogo de ARN, H-fosfonato de (Sp)-5'-O-(terc-butildifenilsilil)-2'-O-(terc- butildimetilsilil)uridin-3'-il 2',3'-O-bis(terc-butildimetilsilil)uridin-5'-ilo [(Sp)-12uu] mediante la Ruta B.

Se produce (Sp)-12uu en bruto como se describe en el Ejemplo 49 usando el reactivo quiral (aS, 2R)-6 en lugar del reactivo quiral (aR, 2S)-6.

Ejemplo 54: Sintesis de un dimero de analogo de ARN, H-fosfonato de (Sp)-6-N-benzoil-5'-O-(terc-butildifenilsilil)-2'- O-(terc-butildimetilsilil)adenosin-3'-il 2',3'-O-bis(terc-butildimetilsilil)uridin-5'-ilo [(Sp)-12au] mediante la Ruta B.

Se produce (Sp)-12au en bruto como se describe en el Ejemplo 49 usando 8a en lugar de 8u y el reactivo quiral (aS, 2R)-6 en lugar del reactivo quiral (aR, 2S)-6.

Ejemplo 55: Sintesis de un dimero de analogo de ARN, H-fosfonato de (Sp)-4-N-benzoil-5'-O-(terc-butildifenilsilil)-2'- O-(terc-butildimetilsilil)citidin-3'-il 2',3'-O-bis(terc-butildimetilsilil)uridin-5'-ilo [(Sp)-12cu] mediante la Ruta B.

Se produce (Sp)-12cu en bruto como se describe en el Ejemplo 49 usando 8c en lugar de 8u y el reactivo quiral (aS, 2R)-6 en lugar del reactivo quiral (aR, 2S)-6.

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Ejemplo 56: Smtesis de un dimero de analogo de ARN, H-fosfonato de (Sp)-2-N-fenoxiacetil-5'-O-(ferc- butildifenilsilil)-2'-O-(ferc-butildimetilsilil)guanosin-3'-il 2',3'-O-bis(ferc-butildimetilsilil)uridin-5'-ilo [(Sp)-12gu] mediante la Ruta B.

Se produce (Sp)-12gu en bruto como se describe en el Ejemplo 49 usando 8g en lugar de 8u y el reactivo quiral (aS, 2R)-6 en lugar del reactivo quiral (aR, 2S)-6.

Ejemplo 57: Modification para formar uridin-3'-il uridin-5'-ilfosforotioato de (Rp)-trietilamonio [(Rp)-11uu].

Se seca (Sp)-12uu por coevaporacion repetida con piridina seca y tolueno seco, y entonces se disuelve en CH3CN (1 ml). Se anade N,O-bis(trimetilsilil)acetamida (BSA; 100 |jl). Despues de 1 min, se anade disulfuro de N,W- dimetiltiuram (DTD; 120 jmoles). Despues de 3 min adicionales, la mezcla se concentra a sequedad a presion reducida dando (Rp)-10uu en bruto. Entonces, se disuelve (Rp)-10uu en bruto en solution de fluoruro de tetrabutilamonio 1 M (TBAF) en THF seco (1 ml). La mezcla se agita durante 12 h a temperatura ambiente. Se anade una solucion de tampon acetato de trietilamonio 0,05 M (pH 6,9, 5 ml) a la mezcla, y la mezcla se lava con Et2O (3 * 5 ml). Las fases organicas combinadas se retro-extraen con tampon acetato de trietilamonio 0,05 M (5 ml). Las fases acuosas combinadas se concentran entonces a sequedad a presion reducida, y el residuo se purifica por cromatografia en columna de fase inversa [un gradiente lineal de acetonitrilo 0-10 % en tampon acetato de trietilamonio 0,1 M (pH 6,9)] proporcionando (Rp)-11uu. El esquema de modificacion se muestra en el Esquema 17.

Esquema 17. Smtesis de fosforotioato quiral.

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Ejemplo 58: Modificacion para formar adenosin-3'-il uridin-5'-ilfosforotioato de (Rp)-trietilamonio [(Rp)-11au].

Se produce (Rp)-11au como se describe en el Ejemplo 57 usando (Sp)-12au en lugar de (Sp)-12uu.

Ejemplo 59: Modificacion para formar citidin-3'-il uridin-5'-ilfosforotioato de (Rp)-trietilamonio [(Rp)-11cu].

Se produce (Rp)-11cu como se describe en el Ejemplo 57 usando (Rp)-12cu en lugar de (Rp)-12uu.

Ejemplo 60: Modificacion para formar guanosin-3'-il uridin-5'-ilfosforotioato de (Rp)-trietilamonio [(Rp)-11gu].

Se produce (Rp)-11gu como se describe en el Ejemplo 57 usando (Sp)-12gu en lugar de (Sp)-12uu.

Ejemplo 61: Modificacion para formar uridin-3'-il uridin-5'-ilfosforotioato de (Sp)-trietilamonio [(Sp)-11uu].

Se produce (Sp)-11uu como se describe en el Ejemplo 57 usando (Rp)-12uu en lugar de (Sp)-12uu.

Ejemplo 62: Modificacion para formar adenosin-3'-il uridin-5'-ilfosforotioato de (Sp)-trietilamonio [(Sp)-11au].

Se produce (Sp)-11au como se describe en el Ejemplo 57 usando (Rp)-12au en lugar de (Sp)-12uu.

Ejemplo 63: Modificacion para formar citidin-3'-il uridin-5'-ilfosforotioato de (Sp)-trietilamonio [(Sp)-11cu].

Se produce (Sp)-11cu como se describe en el Ejemplo 57 usando (Rp)-12cu en lugar de (Sp)-12uu.

Ejemplo 64: Modificacion para formar guanosin-3'-il uridin-5'-ilfosforotioato de (Sp)-trietilamonio [(Sp)-11gu].

Se produce (Sp)-11gu como se describe en el Ejemplo 57 usando (Rp)-12gu en lugar de (Sp)-12uu de una manera similar a (Rp)-11uu.

Ejemplo 65: Smtesis en fase solida de analogos de ADN que tienen restos de X-fosfonato mediante el Esquema 5 (Ruta A).

Se usa resina HCP o CPG cargada con 5'-O-(DMTr)timidina (0,5 jmoles) mediante un conector de succinilo para la smtesis. El alargamiento de cadena se realiza repitiendo las etapas en la Tabla 1. Despues del alargamiento de

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cadena, el grupo 5'-O-DMTr se elimina mediante tratamiento con 3 % de DCA en CH2CI2 (3 x 5 s) y se lava con CH2CI2. El oligomero sobre la resina HCP o CPG se trata entonces con 25 % de NH3-piridina (9:1, v/v) durante 15 h a 55 °C para eliminar los auxiliares quirales y los grupos protectores de las nucleobases y tambien para liberar el oligomero de la resina HCP o CPG. La resina HCP o CPG se elimina por filtracion y se lava con H2O. El filtrado se concentra a sequedad. El residuo se disuelve en H2O, se lava con Et2O, y los lavados combinados se retro-extraen con H2O. Las fases acuosas combinadas se concentran a sequedad. El producto en bruto resultante se analiza y/o purifica por HPLC de fase inversa con un gradiente lineal de 0-20 % de acetonitrilo en tampon de acetato de amonio

,1 M (pH 7,0) durante 60 min a 50: °C a una tasa de 0,5 ml/min proporcionando ADN de X-fosfonato estereoregular. Tabla 1.

etapa: Operacion reactivos y disolvente tiempo

1: destritilacion 3 % de DCA en CH2Cl2 3 x 30 s

2: lavado (i) CH2Cl2 (ii) piridina seca (iii) secar a vacio. -

3: acoplamiento monomero pre-activado (0,2 M)* en piridina seca 15 min

4: lavado (i) piridina seca (ii) CH3CN seco (iii) secar a vacio. -

5: transformacion electrofilo de azufre, electrofilo de selenio o agente de borano 5 min

6: lavado (i) THF seco (ii) secar a vacio. -

7: termination CF3COIm - 2,6-lutidina - THF seco (1:1:8, v/v/v) bajo argon 30 s

8: lavado (i) THF seco (ii) CH2Cl2 -

* preparacion de monomero pre-activado en la etapa 3 de la Tabla 1: Se seca 5'-O-(DMTr)-2'- desoxirribonucleosido-3'-ilfosfonato de 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-enio por coevaporaciones repetidas con piridina seca y entonces se disuelve en piridina seca. Se anade BopCl a la solucion, y la mezcla se agita durante 5 min. A la mezcla se anade gota a gota una solucion de aminoalcohol (L-2 o D-2), que se seca por coevaporaciones repetidas con piridina seca y se disuelve en piridina seca, mediante una jeringa, y la mezcla se agita durante 5 min bajo argon.______________________________________________________________

All-(Rp)-[Tps]9T (fosforotioato).

Segun el procedimiento tipico descrito anteriormente, 3'-O-succinato de 5'-O-(DMTr)timidina unido a HCP (0,5 |jmoles) da all-(Rp)-[Tps]9T [1,52 unidades de A260, 17,7 nmoles (35 %) basado en la suposicion de 7 % de hipocromicidad: UV (H2O) a,ax 267 nm, a,™ 236 nm] despues de la purificacion de un decimo del producto en bruto por RP-HPLC. <4 % del oligomero purificado se digiere por incubacion con nucleasa P1 durante 1 h a 37 °C.

Ejemplo 66: Sintesis en fase solida de analogos de ADN que tienen restos de X-fosfonato mediante el Esquema 6 (Ruta B).

Se trata resina CPG cargada con 5'-O-(DMTr)timidina mediante un conector de succinilo u oxalilo con 1 % de TFA en CH2Cl2 (3 x 5 s) para la eliminacion del grupo 5'-O-DMTr, se lava con CH2Ch y piridina seca y se seca a vacio. El alargamiento de cadena se realiza repitiendo las siguientes etapas (a) y (b). (a) Reaccion de acoplamiento usando una solucion que contiene el monomero pre-activado* correspondiente (0,2 M) en piridina seca (10 min) bajo argon. Despues de la condensacion, el soporte solido se lava con piridina seca y CH2Ch. (b) Eliminacion del grupo 5'-O- DMTr y el auxiliar quiral simultaneamente mediante tratamiento con 1 % de TFA en CH2Ch-Et3SiH (1:1, v/v) (3 x 5 s), y lavados posteriores con CH2Cl2 y piridina seca. Los H-fosfonatos de oligonucleosido resultantes sobre la resina se convierten en ADN de X-fosfonato como se describe mas adelante.

* preparacion de monomero pre-activado: Se seca 5'-O-(DMTr)-2'-desoxirribonucleosido-3'-ilfosfonato de 1,8- diazabiciclo[5.4.0]undec-7-enio por coevaporaciones repetidas con piridina seca y entonces se disuelve en piridina seca. Se anade BopCl a la solucion, y la mezcla se agita durante 5 min. A la mezcla se anade gota a gota una solucion de aminoalcohol (L-6 o D-6), que se seca por coevaporacion repetida con piridina seca y se disuelve en piridina seca, mediante una jeringa, y la mezcla se agita durante 5 min bajo argon.

Fosforotioato (X = S-).

Se trata H-fosfonato de oligonucleosido cargado en una resina CPG mediante un conector de succinilo obtenido como antes con 10 % en peso de S8 en CS2-piridina-trietilamina (35:35:1, v/v/v) a TA durante 3 h, y se lava sucesivamente con CS2, piridina y CH3CN. La resina se trata con una solucion acuosa al 25 % de NH3 a TA durante 12 h, y se lava con H2O. Las soluciones acuosas se combinan y se concentran a sequedad a presion reducida, y el residuo se purifica por RP-HPLC proporcionando ADN de fosforotioato estereoregulado.

Boranofosfato (X = BH3-).

Se anaden DMF seca, N,O-bis(trimetilsilil)acetamida (BSA) y BH3-SMe2 al H-fosfonato de oligonucleosido cargado en una resina CPG mediante un conector de oxalilo obtenido como antes a TA. Despues de 15 min, la resina se lava sucesivamente con DMF, CH3CN y CH3OH. La resina se trata entonces con una solucion saturada de NH3 en CH3OH a TA durante 12 h, y se lava con CH3OH. Las soluciones de CH3OH se combinan y se concentran a sequedad a presion reducida, y el residuo se purifica por RP-HPLC proporcionando ADN de boranofosfato

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estereoregulado.

Hidroximetilfosfonato (X = CH2OH).

Se trata H-fosfonato de oligonucleosido cargado en una resina CPG mediante un conector de oxalilo obtenido como antes con cloruro de trimetilsililo 0,1 M (TMSCl) en piridina-1-metil-2-pirrolidona (NMP) (1:9, v/v) a TA durante 10 min, y con formaldehido gaseoso a TA durante 30 min, y entonces se lava con NMP y CH3CN. La resina se trata entonces con una solucion acuosa al 25 % de NH3 a TA durante 12 h, y se lava con H2O. Las soluciones acuosas combinadas se concentran a sequedad a presion reducida, y el residuo se purifica por RP-HPLC proporcionando ADN de hidroximetilfosfonato estereoregulado.

Fosforamidato (X = NH2).

Se trata H-fosfonato de oligonucleosido cargado en una resina CPG mediante un conector de oxalilo obtenido como antes con una solucion saturada de NH3 en CCl4-1,4-dioxano (4:1, v/v) a 0 °C durante 30 min, y se lava con 1,4- dioxano. Las soluciones organicas combinadas se concentran a sequedad a presion reducida, se tratan con una solucion acuosa al 25 % de NH3 a TA durante 12 h y se lavan con H2O. Las soluciones acuosas combinadas se concentran a sequedad a presion reducida, y el residuo se purifica por RP-HPLC proporcionando ADN de fosforamidato estereoregulado.

N-propilfosforamidato (X = NHPr).

Se trata H-fosfonato de oligonucleosido cargado en una resina CPG mediante un conector de oxalilo obtenido como antes con CCl4-propilamina (9:1, v/v) a TA durante 1 h, y se lava con CH3OH. Las soluciones organicas combinadas se concentran a sequedad a presion reducida, se tratan con una solucion acuosa al 25 % de NH3 a TA durante 12 h y se lavan con H2O. Las soluciones acuosas combinadas se concentran a sequedad a presion reducida, y el residuo se purifica por RP-HPLC proporcionando ADN de N-propilfosforamidato estereoregulado.

N-[(2-dimetilamino)etil]fosforamidato [X = NH(CH2)2NMe2].

Se trata H-fosfonato de oligonucleosido cargado en una resina CPG mediante un conector de oxalilo obtenido como antes con CCl4-2-dimetilaminoetilamina (9:1, v/v) a TA durante 1 h, y se lava con CH3CN. Las soluciones organicas combinadas se concentran a sequedad a presion reducida, se tratan con una solucion acuosa al 25 % de NH3 a TA durante 12 h y se lavan con H2O. Las soluciones acuosas combinadas se concentran a sequedad a presion reducida, y el residuo se purifica por RP-HPLC proporcionando ADN de N-[(2-dimetilamino)etil]fosforamidato estereoregulado.

Ejemplo 67: Sintesis de all-(Sp)-d[CsAsGsT] (fosforotioato).

Se sintetiza el H-fosfonato de oligonucleosido correspondiente en una resina CPG mediante un conector de succinilo como se ha descrito anteriormente, y se trata con una solucion 0,2 M de reactivo de Beaucage en BSA-CH3CN (1:8, v/v) a TA durante 30 min, y la resina se lava con CH3CN. La resina se trata entonces con una solucion acuosa al 25 % de NH3 a TA durante 12 h y se lava con H2O. Las soluciones acuosas combinadas se concentran a sequedad a presion reducida, y el residuo se analiza y caracteriza por RP-HPLC y EM-MALDI TOF. La RP-HPLC se realiza con un gradiente lineal de 0-20 % de acetonitrilo en tampon de acetato de amonio 0,1 M (pH 7,0) durante 60 min a 50 °C a un caudal de 0,5 ml/min usando una columna uBondasphere 5 jum C18 (100 A, 3,9 mm * 150 mm) (Waters).

Ejemplo 68: Sintesis de all-(Rp)-d[CsAsGsT] (fosforotioato).

Se sintetiza el H-fosfonato de oligonucleosido correspondiente en una resina CPG mediante un conector de succinilo como se ha descrito anteriormente, y se trata con una solucion 0,2 M de reactivo de Beaucage en BSA-CH3CN (1:8, v/v) (0,2 ml) a TA durante 30 min, y la resina se lava con CH3CN. La resina se trata con una solucion acuosa al 25 % de NH3 (5 ml) a TA durante 12 h, y se lava con H2O. Las soluciones acuosas combinadas se concentran a sequedad a presion reducida, y el residuo se analiza y caracteriza por RP-HPLC y EM-MALDI TOF. La RP-HPLC se realiza con un gradiente lineal de 0-20 % de acetonitrilo en tampon acetato de amonio 0,1 M (pH 7,0) durante 60 min a 50 °C a un caudal de 0,5 ml/min usando una columna uBondasphere 5 um C18 (100 A, 3,9 mm * 150 mm) (Waters).

Ejemplo 69: Sintesis de all-(Sp)-[Ts]9T (fosforotioato).

Se sintetiza el H-fosfonato de oligonucleosido correspondiente en una resina CPG mediante un conector de succinilo como se ha descrito anteriormente, y se trata con una solucion 0,2 M de reactivo de Beaucage en BSA-CH3CN (1:8, v/v) (0,2 ml) a TA durante 30 min, y la resina se lava con CH3CN. La resina CPG se trata con una solucion acuosa al 25 % de NH3 (5 ml) a TA durante 24 h, y se lava con H2O. Las soluciones acuosas combinadas se concentran a sequedad a presion reducida, y el residuo se analiza y caracteriza por RP-HPLC y EM-MALDI TOF. La RP-HPLC se realiza con un gradiente lineal de 0-20 % de acetonitrilo en tampon de acetato de amonio 0,1 M (pH 7,0) durante 80 min a 30 °C a un caudal de 0,5 ml/min usando una columna uBondasphere 5 um C18 (100 A, 3,9 mm * 150 mm)

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(Waters).

Ejemplo 70: Smtesis de all (Rp)-[Ts]9T (fosforotioato).

Se sintetiza el H-fosfonato de oligonucleosido correspondiente en una resina CPG mediante un conector de succinilo como se ha descrito anteriormente, y se trata con una solucion 0,2 M de reactivo de Beaucage en BSA-CH3CN (1:8, v/v) (0,2 ml) a TA durante 30 min, y la resina se lava con CH3CN. La resina se trata con una solucion acuosa al 25 % de NH3 (5 ml) a TA durante 24 h, y se lava con H2O. Las soluciones acuosas combinadas se concentran a sequedad a presion reducida, y el residuo se analiza y caracteriza por RP-HPLC y EM-MALDI TOF. La RP-HPLC se realiza con un gradiente lineal de 0-20 % de acetonitrilo en tampon de acetato de amonio 0,1 M (pH 7,0) durante 80 min a 30 °C a un caudal de 0,5 ml/min usando una columna uBondasphere 5 um C18 (100 A, 3,9 mm * 150 mm) (Waters).

Ejemplo 71: Smtesis de all-(Rp)-[TB]3T (boranofosfato).

Se sintetiza el H-fosfonato de oligonucleosido correspondiente en una resina CPG mediante un conector de succinilo como se ha descrito anteriormente, y se trata con una mezcla de DMF seca (0,8 ml), BSA (0,1 ml) y BH3-S(CH3)2 (0,1 ml) a TA durante 15 min, y la resina se lava sucesivamente con DMF, CH3CN y CH3OH. La resina se trata entonces con una solucion saturada de NH3 en CH3OH (5 ml) a TA durante 2 h, y se lava con CH3OH. Las soluciones organicas combinadas se concentran a sequedad a presion reducida, y el residuo se analiza y caracteriza por RP-HPLC y EM-MALDI TOF. La RP-HPLC se realiza con un gradiente lineal de 0-20 % de

acetonitrilo en tampon de acetato de amonio 0,1 M (pH 7,0) durante 60 min a 30 °C a un caudal de 0,5 ml/min

usando una PEGASlL ODS 5 |jm (120 A, 4,0 mm * 150 mm) (Senshu Pak).

Ejemplo 72: Smtesis de all-(Sp)-[TB]3T (boranofosfato).

Se sintetiza el H-fosfonato de oligonucleosido correspondiente en una resina CPG mediante un conector de succinilo como se ha descrito anteriormente, y se trata con una mezcla de DMF seca (0,8 ml), BSA (0,1 ml) y BH3'S(CH3)2 (0,1 ml) a TA durante 15 min, y la resina se lava sucesivamente con DMF, CH3CN y CH3OH. La resina se trata entonces con una solucion saturada de NH3 en CH3OH (5 ml) a TA durante 2 h, y se lava con CH3OH. Las soluciones organicas combinadas se concentran a sequedad a presion reducida, y el residuo se analiza y caracteriza por RP-HPLC y EM-MALDI TOF. La RP-HPLC se realiza con un gradiente lineal de 0-20 % de

usando una PEGASlL ODS 5 um (120 A, 4,0 mm * 150 mm) (Senshu Pak).

Ejemplo 73: Smtesis de all- (Sp)-[Tn]3T (N-[(2-dimetilamino)etil]fosforamidato).

Se sintetiza el H-fosfonato de oligonucleosido correspondiente en una resina CPG mediante un conector de oxalilo como se ha descrito anteriormente, y se trata con CCl4-2-dimetilaminoetilamina (9:1, v/v) a TA durante 1 h, y se lava con CH3CN. Las soluciones organicas combinadas se concentran a sequedad a presion reducida, y el residuo se analiza y caracteriza por RP-HPLC y EM-MALDI TOF. La RP-HPLC se realiza con un gradiente lineal de 0-20 % de acetonitrilo en tampon acetato de trietilamonio 0,1 M (pH 7,0) durante 60 min a 30 °C a un caudal de 0,5 ml/min usando una PEGASlL ODS 5 um (120 A, 4,0 mm * 150 mm) (Senshu Pak).

Ejemplo 74: Smtesis de all-(Rp)-[TN]3T (N-[(2-dimetilamino)etil]fosforamidato).

Ejemplo 75: Un procedimiento general para la smtesis en fase solida de ARN de X-fosfonato mediante el Esquema 5 (Ruta A).

Se usa resina HCP o CPG cargada con 5'-O-(DMTr)uridina mediante un conector de succinilo para la smtesis. El alargamiento de cadena se realiza repitiendo las etapas en la Tabla 2. Despues del alargamiento de cadena el grupo 5'-O-DMTr se elimina mediante tratamiento con 3 % de DCA en CH2Ch y la resina se lava sucesivamente con CH2Cl2 y EtOH. La resina se trata entonces con una solucion acuosa al 25 % de NH3-EtOH (3:1, v/v) durante 2 h a temperatura ambiente y se elimina por filtracion. El filtrado se diluye con una solucion acuosa al 25 % de NH3-EtOH (3:1, v/v) y se pone en un matraz hermeticamente sellado durante 48 h a temperatura ambiente. La solucion se concentra a presion reducida, y el residuo se purifica por RP-HPLC. Se recogen las fracciones que contienen los ARN de X-fosfonato protegidos con 2'-O-TBS deseados y se liofilizan. El residuo se trata con una solucion 1 M de TBAF en THF seco durante 24 h a temperatura ambiente. Se anade una solucion de tampon TEAA 0,05 M (pH 6,9), y el THF se elimina mediante evaporation. El residuo se desala con un cartucho Sep-pak C18, y se purifica por rP- HPLC proporcionando ARN de X-fosfonato estereoregular.

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Tabla 2.

etapa: Operation reactivos y disolvente tiempo

1: destritilacion 3 % de DCA en CH2Cl2 4 x 30 s

2: lavado (i) CH2Cl2 (ii) piridina seca (iii) secar a vacio. -

3: acoplamiento monomero pre-activado (0,2 M)* en piridina seca 15 min

4: lavado (i) piridina seca (ii) CH3CN seco (iii) secar a vacio. -

5: transformation electrofilo de azufre, electrofilo de selenio o agente de borano 5 min

6: lavado (i) THF seco (ii) secar a vacio. -

7: terminacion CF3COIm - 2,6-lutidina - THF seco (1:1:8, v/v/v) bajo argon 30 s

8: lavado (i) THF seco (ii) CH2Cl2 -

* preparacion de monomero pre-activado en la etapa 3 de la Tabla 2: Se seca 5'-O-(DMTr)-2'-O-(TBS)- ribonucleosido-3'-ilfosfonato de 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-enio por coevaporaciones repetidas con piridina seca y entonces se disuelve en piridina seca. Se anade BopCI a la solucion, y la mezcla se agita durante 5 min. A la mezcla se anade gota a gota una solucion de aminoalcohol (L-2 o D-2), que se coevaporaciones repetidas con piridina seca y se disuelve en piridina seca, mediante una jeringa, y la mezcla se agita durante 5 min bajo argon.______________________________________________________

Ejemplo 76: Un procedimiento general para la sintesis en fase solida de ARN de X-fosfonato mediante el Esquema 6 (Ruta B).

Procedimiento para la sintesis de ARN de H-fosfonato. Se trata resina CPG cargada con 5'-O-(DMTr)uridina mediante un conector de succinilo u oxalilo con 1 % de TFA en CH2Cl2 (3 * 5 s) para la eliminacion del grupo 5'-O- DMTr, se lava con CH2Cl2 y piridina seca y se seca a vacio. El alargamiento de cadena se realiza repitiendo las siguientes etapas (a) y (b). (a) Reaccion de acoplamiento usando una solucion que contiene el monomero pre- activado* correspondiente (0,2 M) en piridina seca (10 min) bajo argon. Despues de la condensacion, el soporte solido se lava con piridina seca y CH2Cl2. (b) Eliminacion del grupo 5'-O-DMTr y el auxiliar quiral simultaneamente mediante tratamiento con 1 % de TFA en CH2Ch-Et3SiH (1:1, v/v) (3 * 5 s), y lavados posteriores con CH2Ch y piridina seca. Los H-fosfonatos de oligonucleosido resultantes en la resina se convierten en analogos de ARN modificados en el esqueleto como se describe a continuation.

*preparacion de monomero pre-activado

Se seca 5'-O-(DMTr)-2'-O-(TBS)-ribonucleosido-3'-ilfosfonato de 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-enio por

coevaporaciones repetidas con piridina seca y entonces se disuelve en piridina seca. Se anade BopCl a la solucion, y la mezcla se agita durante 5 min. A la mezcla se anade gota a gota una solucion de aminoalcohol (L-6 o D-6), que se seca por coevaporaciones repetidas con piridina seca y se disuelve en piridina seca, mediante una jeringa, y la mezcla se agita durante 5 min bajo argon.

Fosforotioato (X = S-).

Se trata H-fosfonato de oligonucleosido cargado en una resina CPG mediante un conector de succinilo obtenido como antes con 10 % en peso de S8 en CS2-piridina-trietilamina (35:35:1, v/v/v) a TA durante 3 h, y se lava sucesivamente con CS2, piridina y EtOH. La resina se trata entonces con una solucion acuosa al 25 % de NH3-EtOH (3:1, v/v) durante 2 h a temperatura ambiente y se elimina por filtration. El filtrado se diluye con una solucion acuosa al 25 % de NH3-EtOH (3:1, v/v) y se pone en un matraz hermeticamente sellado durante 12 h a temperatura ambiente. La solucion se concentra a presion reducida, y el residuo se purifica por RP-HPLC. Se recogen y liofilizan las fracciones que contienen los ARN de fosforotioato protegidos con 2'-O-TBS deseados. El residuo se trata con una solucion 1 M de TBAF en THF seco durante 24 h a temperatura ambiente. Se anade una solucion de tampon TEAA 0,05 M (pH 6,9), y se elimina el THF mediante evaporation. El residuo se desala con un cartucho Sep-pak C18, y se purifica por RP-HPLC proporcionando ARN de fosforotioato estereoregular.

Boranofosfato (X = BH3-).

Se anaden DMF seca, N,O-bis(trimetilsilil)acetamida (BSA) y BH3-SMe2 al H-fosfonato de oligonucleosido cargado en una resina CPG mediante un conector de oxalilo obtenido como antes a TA. Despues de 15 min, la resina se lava sucesivamente con DMF, CH3CN y EtOH. La resina se trata entonces con una solucion acuosa al 25 % de NH3- EtOH (3:1, v/v) durante 2 h a temperatura ambiente y se elimina por filtracion. El filtrado se diluye con una solucion acuosa al 25 % de NH3-EtOH (3:1, v/v) y se pone en un matraz hermeticamente sellado durante 12 h a temperatura ambiente. La solucion se concentra a presion reducida, y el residuo se purifica por RP-HPLC. Se recogen y liofilizan las fracciones que contienen los ARN de boranofosfato protegidos con 2'-O-TBS deseados. El residuo se trata con una solucion 1 M de TBAF en THF seco durante 24 h a temperatura ambiente. Se anade una solucion de tampon TEAA 0,05 M (pH 6,9), y el THF se elimina mediante evaporacion. El residuo se desala con un cartucho Sep-pak C18, y se purifica por RP-HPLC proporcionando ARN de boranofosfato estereoregular.

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Hidroximetilfosfonato (X = CH2OH).

Se trata H-fosfonato de oligonucleosido cargado en una resina CPG mediante un conector de oxalilo obtenido como antes con cloruro de trimetilsililo 0,1 M (TMSCl) en piridina-1-metil-2-pirrolidona (NMP) (1:9, v/v) a TA durante 10 min, y con formaldehido gaseoso a TA durante 30 min, y entonces se lava con NMP y EtOH. La resina se trata entonces con una solucion acuosa al 25 % de NH3-EtOH (3:1, v/v) durante 2 h a temperatura ambiente y se elimina por filtracion. El filtrado se diluye con una solucion acuosa al 25 % de NH3-EtOH (3:1, v/v) y se pone en un matraz hermeticamente sellado durante 12 h a temperatura ambiente. La solucion se concentra a presion reducida, y el residuo se purifica por RP-HPLC. Se recogen y liofilizan las fracciones que contienen los ARN de hidroximetilfosfonato protegidos con 2'-O-TBS deseados. El residuo se trata con una solucion 1 M de TBAF en THF seco durante 24 h a temperatura ambiente. Se anade una solucion de tampon TEAA 0,05 M (pH 6,9), y el THF se elimina mediante evaporacion. El residuo se desala con un cartucho Sep-pak C18, y se purifica por RP-HPLC proporcionando ARN de hidroximetilfosfonato estereoregular.

Fosforamidato (X = NH2).

Se trata H-fosfonato de oligonucleosido cargado en una resina CPG mediante un conector de oxalilo obtenido con una solucion saturada de NH3 en CCU-1,4-dioxano (4:1, v/v) a 0 °C durante 30 min, y se lava con 1,4-dioxano. Las soluciones organicas combinadas se concentran a sequedad a presion reducida. El filtrado se diluye con una solucion acuosa al 25 % de NH3-EtOH (3:1, v/v) y se pone en un matraz hermeticamente sellado durante 12 h a temperatura ambiente. La solucion se concentra a presion reducida, y el residuo se purifica por RP-HPLC. Se recogen y liofilizan las fracciones que contienen los ARN de fosforamidato protegidos con 2'-O-TBS deseados. El residuo se trata con una solucion 1 M de TBAF en THF seco durante 24 h a temperatura ambiente. Se anade una solucion de tampon TEAA 0,05 M (pH 6,9), y el THF se elimina mediante evaporacion. El residuo se desala con un cartucho Sep-pak C18, y se purifica por RP-HPLC proporcionando ARN de fosforamidato estereoregular.

N-propilfosforamidato (X = NHPr).

Se trata H-fosfonato de oligonucleosido cargado en una resina CPG mediante un conector de oxalilo obtenido con CCl4-propilamina (9:1, v/v) a TA durante 1 h, y se lava con CH3OH. Las soluciones organicas combinadas se concentran a sequedad a presion reducida. El filtrado se diluye con una solucion acuosa al 25 % de NH3-EtOH (3:1, v/v) y se pone en un matraz hermeticamente sellado durante 12 h a temperatura ambiente. La solucion se concentra a presion reducida, y el residuo se purifica por RP-HPLC. Se recogen y liofilizan las fracciones que contienen los aRn de N-propilfosforamidato protegidas con 2'-O-TBS deseados. El residuo se trata con una solucion 1 M de TBAF en THF seco durante 24 h a temperatura ambiente. Se anade una solucion de tampon TEAA 0,05 M (pH 6,9), y el THF se elimina mediante evaporacion. El residuo se desala con un cartucho Sep-pak C18, y se purifica por RP-HPLC proporcionando ARN de N-propilfosforamidato estereoregular.

N-[(2-dimetilamino)etil]fosforamidato [X = NH(CH2)2NMe2].

Se trata H-fosfonato de oligonucleosido cargado en una resina CPG mediante un conector de oxalilo obtenido con CCl4-2-dimetilaminoetilamina (9:1, v/v) a TA durante 1 h, y se lava con CH3CN. Las soluciones organicas combinadas se concentran a sequedad a presion reducida. El filtrado se diluye con una solucion acuosa al 25 % de NH3-EtOH (3:1, v/v) y se pone en un matraz hermeticamente sellado durante 12 h a temperatura ambiente. La solucion se concentra a presion reducida, y el residuo se purifica por RP-HPLC. Se recogen y liofilizan las fracciones que contienen los ARN de N-[(2-dimetilamino)etil]fosforamidato protegidos con 2'-O-TBS deseados. El residuo se trata con una solucion 1 M de TBAF en THF seco durante 24 h a temperatura ambiente. Se anade una solucion de tampon TEAA 0,05 M (pH 6,9), y el THF se elimina mediante evaporacion. El residuo se desala con un cartucho Sep-pak C18, y se purifica por RP-HPLC proporcionando ARN de N-[(2-dimetilamino)etil]fosforamidato estereoregular.

Ejemplo 77: Sintesis en fase solida; Procedimiento general para la preparacion de solucion de monomero pre- activado

Se seco monoester de H-fosfonato apropiado por coevaporaciones repetidas con piridina seca y tolueno seco, entonces se disolvio en disolvente seco. A la solucion se anadio gota a gota reactivo de condensation, y se agito durante 10 min. Entonces se anadio aminoalcohol y se agito durante 10 min adicionales dando la solucion de monomero pre-activado.

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Se trato resina HCP cargada con N3-benzoil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)timidina (16,4 mg; 30,5 pmol/g, 0,5 pmoles) mediante un conector de succinilo con 3 % de DCA / DCM (3 * 1 ml), entonces se lavo con DCM (3 * 1 ml) y MeCN seco (3 * 1 ml). Despues de secarse la resina a presion reducida (>5 min), se anadio solucion de monomero pre- activado (250 pl, 25 pmoles; que consistia en N3-benzoil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)timidin-3'-ilfosfonato de 8- diazabiciclo[5.4.0]undec-7-enio (25 pmoles, para monoester de H-fosfonato), MeCN-piridina (9:1, v/v, para disolvente), Ph3PCl2 (62,5 pmoles, para reactivo de condensation) y L-2 (30 pmoles, para aminoalcohol). Agitandose durante 2 min, la solucion de reaction se elimino, y la resina se lavo con MeCN (3 x 1 ml) y se seco a presion reducida (>5 min). Para la etapa de modification, el producto intermedio resultante sobre la resina se sulfurizo mediante tratamiento con DTD 0,3 M / MeCN (500 pl, 150 pmoles) durante 5 min, la resina se lavo entonces con MeCN (3 * 1 ml) y DCM (3 * 1 ml). El grupo 5'-O-DMTr se elimino mediante tratamiento con 3 % de DCA / DCM (3 * 1 ml), y la resina se lavo con DCM (3 * 1 ml). El dimero de fosforotioato sobre la resina se trato entonces con 25 % de NH3 (1 ml) durante 12 h a 55 °C para eliminar el auxiliar quiral y los grupos protectores de las nucleobases y tambien para liberar el dimero de la resina. La resina se elimino por filtration y se lavo con H2O. El filtrado se concentro a sequedad. El residuo se disolvio en H2O (2 ml), se lavo con Et2O (3 * 2 ml), y los lavados combinados se retro-extrajeron con H2O (2 ml). Las fases acuosas combinadas se concentraron a sequedad. El producto en bruto resultante se analizo por UPLC® de fase inversa con un gradiente lineal de 0-20 % de MeOH en tampon acetato de amonio 0,1 M (pH 7,0) durante 15 min a 55 °C a una tasa de 0,4 ml/min. El producto fue identico al de una muestra de control sintetizada por el metodo de H-fosfonato convencional. El rendimiento de (Sp)-5tt fue del 97 % (Rp:Sp = 2:98). Tiempo de retention: 13,4 min ((Rp)-5tt: 12,3 min). El Esquema general se muestra en el Esquema 18. El perfil de UPLC se muestra en la Figura 5A. En otra sintesis de (Sp)-5tt, se uso BTC (20 pmoles) en lugar de Ph3PCh (62,5 pmoles). El producto fue identico al de una muestra de control sintetizada por el metodo de H-fosfonato convencional. El rendimiento de (Sp)-5tt fue del 95 % de rendimiento (Rp:Sp = 3:97). Tiempo de retencion: 13,5 min ((Rp)-5tt: 12,4 min). El perfil de UPLC se muestra en la Figura 5B.

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DMTrO-

DMTrO

Esquema 18. Sintesis en fase solida general de dimeros de fosforotioato mediante la Ruta A

BP""

DMTrO

L-OD

activacion aminoalcohol

°:X°- *

disolvente seco

H O HDBU

Thbz

HO—| t

1) sulfurizacion

2) hr

3)NH3Conc. S O

condensacion

55 °C, 12 h

Ejemplo 79: Sintesis en fase solida de un dimero de fosforotioato, timidin-3'-il timidin-5'-ilfosforotioato de (Sp)- amonio [(SP)-5tt].

Se trato resina HCP cargada con N3-benzoil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)timidina (16,4 mg; 30,5 pmol/g, 0,5 pmoles) mediante un conector de succinilo con 3 % de DCA / DCM (3 * 1 ml), entonces se lavo con DCM (3 * 1 ml) y MeCN seco (3 * 1 ml). Despues de secarse la resina a presion reducida (>5 min), se anadio solucion de monomero pre- activado (200 pl, 25 pmoles; que consiste en N3-benzoil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)timidin-3'-ilfosfonato de 8- diazabiciclo[5.4.0]undec-7-enio (25 pmoles, para monoester de H-fosfonato), MeCN-CMP (9:1, v/v, para disolvente), Ph3PCl2 (62,5 pmoles, para reactivo de condensacion) y L-2 (30 pmoles, para aminoalcohol)), seguido de la adicion

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de CMPT 5 M / MeCN (50 |jl, 250 |jmoles, para reactivo de activacion). Agitandose durante 10 min, la solucion de reaccion se elimino, y la resina se lavo con MeCN (3 * 1 ml), se seco a presion reducida (>5 min). El producto intermedio resultante sobre la resina se sulfurizo mediante tratamiento con DTD 0,3 M / MeCN (500 jl, 150 jmoles) durante 5 min, entonces la resina se lavo con MeCN (3 * 1 ml) y DCM (3 * 1 ml). El grupo 5'-O-DMTr se elimino mediante tratamiento con 3 % de DCA / DCM (3 * 1 ml), y se lavo con DCM (3 * 1 ml). El dimero de fosforotioato sobre la resina se trato entonces con 25 % de NH3 (1 ml) durante 12 h a 55 °C para eliminar el auxiliar quiral y los grupos protectores de las nucleobases y tambien para liberar el dimero de la resina. La resina se elimino por filtracion y se lavo con H2O. El filtrado se concentro a sequedad. El residuo se disolvio en H2O (2 ml), se lavo con Et2O (3 * 2 ml), y los lavados combinados se retro-extrajeron con H2O (2 ml). Las fases acuosas combinadas se concentraron a sequedad. El producto en bruto resultante se analizo por UPLC® de fase inversa con un gradiente lineal de 0-20 % de MeOH en tampon acetato de amonio 0,1 M (pH 7,0) durante 15 min a 55 °C a una tasa de 0,4 ml/min. El producto fue identico al de una muestra de control sintetizada por el metodo de H-fosfonato convencional. El rendimiento de (Sp)-5tt tuvo un rendimiento del 98 % (Rp:Sp = 1:99). Tiempo de retencion: 13,5 min ((Rp)-5tt: 12,4 min). El perfil de UPLC se muestra en la Figura 6A. Este compuesto tambien se obtuvo usando "BTC (16 jmoles) y L-2 (26 jmoles)" en lugar de "Ph3PCh (62,5 jmoles) y L-2 (30 jmoles)" en un modo similar descrito. El producto fue identico al de una muestra de control sintetizada por el metodo de H-fosfonato convencional. El rendimiento de (Sp)- 5tt fue del 95 % de rendimiento (Rp:Sp = 1:99). Tiempo de retencion: 13,5 min ((Rp)-5tt: 12,4 min). El perfil de UPLC se muestra en la Figura 6B.

Ejemplo 80: Sintesis en fase solida de un dimero de fosforotioato, timidin-3'-il timidin-5'-ilfosforotioato de (Rp)- amonio [(Rp)-5tt] mediante la Ruta A.

Este compuesto se obtuvo usando "D-2 (30 jmoles)" en lugar de "L-2 (30 jmoles)" de un modo similar al "Ejemplo 78". El producto fue identico al de una muestra de control sintetizada por el metodo de H-fosfonato convencional. El rendimiento de (Rp)-5tt fue del 98 % (Rp:Sp = 97:3). Tiempo de retencion: 12,2 min ((Sp)-5tt: 13,5 min). El perfil de UPLC se muestra en la Figura 7A. En otra sintesis de (Rp)-5tt, se uso BTC (20 jmoles) en lugar de Ph3PCl2 (62,5 jmoles). El producto fue identico al de una muestra de control sintetizada por el metodo de H-fosfonato convencional. El rendimiento de (Rp)-5tt fue del 97 % (Rp:Sp = 95:5). Tiempo de retencion: 12,3 min ((Sp)-5tt: 13,6 min). El perfil de UPLC se muestra en la Figura 7B.

Ejemplo 81: Sintesis en fase solida de un dimero de fosforotioato, timidin-3'-il timidin-5'-ilfosforotioato de (Rp)- amonio [(Rp)-5tt] mediante la Ruta A.

Este compuesto se obtuvo usando "D-2 (30 jmoles)" en lugar de "L-2 (30 jmoles)" de un modo similar al "Ejemplo 79". El producto fue identico al de una muestra de control sintetizada por el metodo de H-fosfonato convencional. El rendimiento de (Rp)-5tt fue del 98 % (Rp:Sp = 98:2). Tiempo de retencion: 12,3 min ((Sp)-5tt: 13,6 min). El perfil de UPLC se muestra en la Figura 8.

Ejemplo 82: Sintesis en fase solida de un dimero de fosforotioato, 2'-desoxicitidin-3'-il timidin-5'-ilfosforotioato de (Sp)-amonio [(Sp)-5ct] mediante la Ruta A.

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Este compuesto se obtuvo usando "4-W-benzoil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-desoxicitidin-3'-ilfosfonato de 8- diazabiciclo[5.4.0]undec-7-enio (25 jmoles)" en lugar de "N3-benzoil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)timidin-3'-ilfosfonato de 8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-enio (25 jmoles)" de un modo similar al Ejemplo 78. El producto fue identico al de una muestra de control sintetizada por el metodo de H-fosfonato convencional. El rendimiento de (Sp)-5ct fue rendimiento del 98 % (Rp:Sp = 3:97). Tiempo de retencion: 9,7 min ((Rp)-5ct: 8,7 min). El perfil de UPLC se muestra en la Figura 9A. Este compuesto tambien se obtuvo usando "BTC (16 jmoles) y L-2 (26 jmoles)" en lugar de "Ph3PCh (62,5 jmoles) y L-2 (30 jmoles)" como se describio. El producto fue identico al de una muestra de control sintetizada por el metodo de H-fosfonato convencional. El rendimiento de (Sp)-5ct fue del 94 % (Rp:Sp = 3:97). Tiempo de retencion: 9,7 min ((Rp)-5ct: 8,7 min). El perfil de UPLC se muestra en la Figura 9B.

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Este compuesto se obtuvo usando "D-2 (30 jmoles)" en lugar de "L-2 (30 |jmoles)" de un modo similar al experimento para el Ejemplo 82, Figura 9A. El producto fue identico al de una muestra de control sintetizada por el metodo de H-fosfonato convencional. El rendimiento de (Rp)-5ct fue del 98 % (Rp:Sp = 97:3). Tiempo de retencion: 8,6 min ((Sp)-5ct: 9,7 min). El perfil de UPLC se muestra en la Figura 10A. Este compuesto tambien se obtuvo usando "D-2 (30 jmoles)" en lugar de "L-2 (30 jmoles)" de un modo similar al Ejemplo 82, Figura 9B. El rendimiento de (Rp)-5ct fue del 87 % (Rp:Sp = 98:2). Tiempo de retencion: 8,6 min ((Sp)-5ct: 9,8 min). El perfil de UPLC se muestra en la Figura 10B.

Ejemplo 84: Sintesis en fase solida de un dimero de fosforotioato, 2'-desoxiadenin-3'-il timidin-5'-ilfosforotioato de (Sp)-amonio [(Sp)-5at] mediante la Ruta A.

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Este compuesto se obtuvo usando "6-W,W-dibenzoil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-desoxiadenin-3'-ilfosfonato de 8- diazabiciclo[5.4.0]undec-7-enio (25 jmoles)" en lugar de "N®-benzoil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)timidin-3'-ilfosfonato de 8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-enio (25 jmoles)" de un modo similar al Ejemplo 78. El producto fue identico al de una muestra de control sintetizada por el metodo de H-fosfonato convencional. El rendimiento de (Sp)-5at fue del 96 % de rendimiento (Rp:Sp = 1:99). Tiempo de retencion: 14,0 min ((Rp)-5at: 12,6 min). El perfil de UPLC se muestra en la Figura 11.

Ejemplo 85: Sintesis en fase solida de un dimero de fosforotioato, 2'-desoxiadenin-3'-il timidin-5'-ilfosforotioato de (Rp)-amonio [(Rp)-5at] mediante la Ruta A.

Este compuesto se obtuvo usando "D-2 (30 jmoles)" en lugar de "L-2 (30 jmoles)" de un modo similar al Ejemplo 83. El producto fue identico al de una muestra de control sintetizada por el metodo de H-fosfonato convencional. El rendimiento de (Rp)-5at fue del 96 % (Rp:Sp = 96:4). Tiempo de retencion: 12,5 min ((Sp)-5at: 14,1 min). El perfil de UPLC se muestra en la Figura 12.

Ejemplo 86: Sintesis en fase solida de un dimero de fosforotioato, 2'-desoxiguanin-3'-il timidin-5'-ilfosforotioato de (Sp)-amonio [(Sp)-5gt] mediante la Ruta A.

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Este compuesto se obtuvo usando "O6-cianoetil-2-N-fenoxiacetil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-desoxiguanin-3'- ilfosfonato de 8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-enio (25 jmoles)" en lugar de " N®-benzoil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)timidin- 3'-ilfosfonato de 8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-enio (25 jmoles)" de un modo similar al Ejemplo 78. El producto fue identico al de una muestra de control sintetizada por el metodo de H-fosfonato convencional. El rendimiento de (Sp)- 5gt fue del 96 % (Rp:Sp = 2:98). Tiempo de retencion: 11,5 min ((Rp)-5gt: 10,3 min). El perfil de UPLC se muestra en la Figura 13.

Ejemplo 87: Sintesis en fase solida de un dimero de fosforotioato, 2'-desoxiguanin-3'-il timidin-5'-ilfosforotioato de (Rp)-amonio [(Rp)-5gt] mediante la Ruta A.

Este compuesto se obtuvo usando "D-2 (30 jmoles)" en lugar de "L-2 (30 jmoles)" de un modo similar al Ejemplo 86. El producto fue identico al de una muestra de control sintetizada por el metodo de H-fosfonato convencional. El rendimiento de (Rp)-5gt fue del 96 % (Rp:Sp = 97:3). Tiempo de retencion: 10,3 min ((Sp)-5gt: 11,6 min). El perfil de

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UPLC se muestra en la Figura 14.

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Se trato resina HCP cargada con N3-benzoil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)timidina (16,4 mg; 30,5 |jmol/g, 0,5 |jmoles) mediante un conector de succinilo con 1 % de TFA / DCM (3 * 1 ml) para la elimination del grupo 5'-O-DMT r, se lavo con DCM (3 * 1 ml) y MeCN seco (3 * 1 ml), y se seco a vado. Se anadio solution de monomero pre-activado (200 jl, 50 jmoles; que consiste en N3-benzoil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)timidin-3'-ilfosfonato de 8-diazabiciclo[5.4.0]undec- 7-enio (50 jmoles, para monoester de H-fosfonato), MeCN-CMp (9:1, v/v, para disolvente), Ph3PCh (125 jmoles, para reactivo de condensation) y L-6 (52 jmoles, para aminoalcohol)), seguido de la adicion de CMPT 5 M / MeCN (50 jl, 250 jmoles). Agitandose durante 2 min, la solucion de reaction se elimino, y la resina se lavo con MeCN (3 * 1 ml), DCM (3 * 1 ml) y se seco a presion reducida (>5 min). El grupo 5'-O-DMTr y el auxiliar quiral se eliminaron simultaneamente mediante tratamiento con 1 % de TFA en DCM (3 * 1 ml), se lavaron con DCM (3 * 1 ml) y MeCN seco (3 * 1 ml), y se secaron a vado. El producto intermedio resultante sobre la resina se sulfurizo mediante tratamiento con la mezcla de solucion de reactivo de Beaucage 0,2 M / MeCN (200 jl, 40 jmoles) y BSA (25 jl, 100 jmoles) durante 20 min, la resina se lavo entonces con MeCN (3 * 1 ml). El dimero de fosforotioato sobre la resina se trato entonces con 25 % de NH3-EtOH (2 ml, 4:1, v/v) durante 12 h a temperatura ambiente para eliminar los grupos protectores de las nucleobases y tambien para liberar el dimero de la resina. La resina se elimino por filtration y se lavo con H2O. El filtrado se concentro a sequedad. El residuo se disolvio en H2O (2 ml), se lavo con Et2O (3 * 2 ml) y los lavados combinados se retro-extrajeron con H2O (2 ml). Las fases acuosas combinadas se concentraron a sequedad. El producto en bruto resultante se analizo por UPLC® de fase inversa con un gradiente lineal de 0-20 % de MeOH en tampon acetato de amonio 0,1 M (pH 7,0) durante 15 min a 55 °C a una tasa de 0,4 ml/min. El producto fue identico al de una muestra de control sintetizada por el metodo de H-fosfonato convencional. El rendimiento de (Sp)-5tt fue del 96 % (Rp:Sp = 4:96). Tiempo de retention: 13,5 min ((Rp)-5tt: 12,4 min). El perfil de UPLC se muestra en la Figura 15A.

En una sintesis alternativa, este compuesto tambien se obtuvo usando "BTC (32 jmoles)" en lugar de "Ph3PCl2 (125 jmoles)" en una manera similar a como se describio. El producto fue identico al de una muestra de control sintetizada por el metodo de H-fosfonato convencional. El rendimiento de (Sp)-5tt fue del 96 % (Rp:Sp = 5:95). Tiempo de retencion: 13,4 min ((Rp)-5tt: 12,3 min). El perfil de UPLC se muestra en la Figura 15B.

Ejemplo 89: Sintesis en fase solida de un dimero de fosforotioato, timidin-3'-il timidin-5'-ilfosforotioato de (Sp)- amonio [(Sp)-5tt] mediante la Ruta B.

En otra sintesis alternativa, se obtuvo [(Sp)-5tt) usando "N3-benzoil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)timidin-3'-ilfosfonato de 8- diazabiciclo[5.4.0]undec-7-enio (25 jmoles), bTc (16 jmoles) y L-6 (26 jmoles))" en lugar de "N3-benzoil-5'-O-(4,4'- dimetoxitritil)timidin-3'-ilfosfonato de 8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-enio (50 jmoles), Ph3PCl2 (125 jmoles) y L-6 (52 jmoles)" de un modo similar a la Figura 15A, Ejemplo 88. El Esquema general se muestra en el Esquema 19. El producto fue identico al de una muestra de control sintetizada por el metodo de H-fosfonato convencional. El rendimiento de (Sp)-5tt fue del 93 % (Rp:Sp = 6:94). Tiempo de retencion: 13,5 min ((Rp)-5tt: 12,4 min). El perfil de UPLC se muestra en la Figura 16A. Este compuesto se obtuvo usando "DTD 0,2 M / MeCN (200 jl, 80 jmoles)" en lugar de "reactivo de Beaucage 0,2 M / MeCN (200 jl, 40 jmoles)" en una manera similar a como se describio. El producto fue identico al de una muestra de control sintetizada por el metodo de H-fosfonato convencional. El rendimiento de (Sp)-5tt fue del 95 % (Rp:Sp = 6:94). Tiempo de retencion: 13,5 min ((Rp)-5tt: 12,4 min). El perfil de UPLC se muestra en la Figura 16B.

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Esquema 19

L-o D-

activacion aminoalcohol

disolvente seco ta

HO—I _ B

°'>r°

X' "'On _ Th OH

X = S‘, BH3',NR1R2

Ejemplo 90: Sintesis en fase solida de un d^ero de fosforotioato, timidin-3'-il timidin-5'-ilfosforotioato de (Rp)- amonio [(Rp)-5tt] mediante la Ruta B.

Este compuesto se obtuvo usando "D-6 (52 ^moles)" en lugar de "L-6 (52 ^moles)" de un modo similar a los metodos en el Ejemplo 88, Figura 15A. El producto fue identico al de una muestra de control sintetizada por el metodo de H-fosfonato convencional. El rendimiento de (Rp)-5tt fue del 95 % (Rp:Sp = 97:3). Tiempo de retencion:

12.3 min ((Sp)-5tt: 13,6 min). El perfil de UPLC se muestra en la Figura 17A.

Este compuesto se obtuvo usando "D-6 (52 ^moles)" en lugar de "L-6 (52 ^moles)" de un modo similar a los metodos en el Ejemplo 88, Figura 15B. El producto fue identico al de una muestra de control sintetizada por el metodo de H-fosfonato convencional. El rendimiento de (Rp)-5tt fue del 94 % (Rp:Sp = 97:3). Tiempo de retencion:

12.3 min ((Sp)-5tt: 13,6 min). El perfil de UPLC se muestra en la Figura 17B.

Ejemplo 91: Sintesis en fase solida de un dimero de fosforotioato, 2'-desoxicitidin-3'-il timidin-5'-ilfosforotioato de (Sp)-amonio [(Sp)-5ct] mediante la Ruta B.

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Este compuesto se obtuvo usando "4-W-benzoil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-desoxicitidin-3'-ilfosfonato de 8- diazabiciclo[5.4.0]undec-7-enio (50 ^moles)" en lugar de " N3-benzoil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)timidin-3'-ilfosfonato de 8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-enio (50 ^moles)" de un modo similar al Ejemplo 88. El producto fue identico al de una muestra de control sintetizada por el metodo de H-fosfonato convencional. El rendimiento de (Sp)-5ct fue del 95 % (Rp.Sp = 4:96). Tiempo de retencion: 9,7 min ((Rp)-5ct: 8,7 min). El perfil de UPLC se muestra en la Figura 18.

Ejemplo 92: Sintesis en fase solida de un dimero de fosforotioato, 2'-desoxicitidin-3'-il timidin-5'-ilfosforotioato de (Rp)-amonio [(Rp)-5ct] mediante la Ruta B.

Este compuesto se obtuvo usando "D-6 (52 ^moles)" en lugar de "L-6 (52 ^moles)" de un modo similar al Ejemplo 91. El producto fue identico al de una muestra de control sintetizada por el metodo de H-fosfonato convencional. El rendimiento de (Rp)-5ct fue del 96 % (Rp:Sp = 97:3). Tiempo de retencion: 8,6 min ((Sp)-5ct: 9,8 min). El perfil de UPLC se muestra en la Figura 19.

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DMTrO—I „ BP™

u*prV- +

H' OHDBU

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Este compuesto se obtuvo usando "6-N,W-dibenzoil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-desoxiadenin-3'-ilfosfonato de 8- diazabiciclo[5.4.0]undec-7-enio (50 |jmoles)" en lugar de "N3-benzoil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)timidin-3'-ilfosfonato de 8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-enio (50 jmoles)" de un modo similar al Ejemplo 88. El producto fue identico al de una muestra de control sintetizada por el metodo de H-fosfonato convencional. El rendimiento de (Sp)-5at fue del 95 % de rendimiento, Rp:Sp = 5:95. Tiempo de retencion: 14,0 min ((Rp)-5at: 12,5 min). El perfil de UPLC se muestra en la Figura 20A.

Este compuesto tambien se obtuvo usando "BTC (32 jmoles)" en lugar de "Ph3PCl2 (125 jmoles)" de un modo similar al metodo descrito en este ejemplo para la Figura 20A. El producto fue identico al de una muestra de control sintetizada por el metodo de H-fosfonato convencional. El rendimiento de (Sp)-5at fue del 94 % (Rp:Sp = 5:95). Tiempo de retencion: 13,9 min ((Rp)-5at: 12,5 min). El perfil de UPLC se muestra en la Figura 20B.

Ejemplo 94: Sintesis en fase solida de un dimero de fosforotioato, 2'-desoxiadenin-3'-il timidin-5'-ilfosforotioato de (Sp)-amonio [(Sp)-5at] mediante la Ruta B.

Este compuesto se obtuvo usando "6-W-((dimetilamino)metilene)-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-desoxiadenin-3'- ilfosfonato de 8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-enio (50 jmoles)" en lugar de "N3-benzoil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)timidin- 3'-ilfosfonato de 8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-enio (50 jmoles)" de un modo similar al Ejemplo 88. El producto fue identico al de una muestra de control sintetizada por el metodo de H-fosfonato convencional. El rendimiento de (Sp)- 5at fue del 91 % de rendimiento, Rp:Sp = 5:95. Tiempo de retencion: 13,9 min ((Rp)-5at: 12,5 min). El perfil de UPLC se muestra en la Figura 21.

Ejemplo 95: Sintesis en fase solida de un dimero de fosforotioato, 2'-desoxiadenin-3'-il timidin-5'-ilfosforotioato de (Rp)-amonio [(Rp)-5at] mediante la Ruta B.

Este compuesto se obtuvo usando "D-6 (52 jmoles)" en lugar de "L-6 (52 jmoles)" de un modo similar al metodo para el Ejemplo 93, Figura 20A. El producto fue identico al de una muestra de control sintetizada por el metodo de H- fosfonato convencional. El rendimiento de (Rp)-5at fue del 96 % de rendimiento, Rp:Sp = 97:3. Tiempo de retencion: 12,5 min ((Sp)-5at: 14,0 min). El perfil de UPlC se muestra en la Figura 22A.

Este compuesto se obtuvo usando "D-6 (52 jmoles)" en lugar de "L-6 (52 jmoles)" de un modo similar al metodo para el Ejemplo 93, Figura 20B. El producto fue identico al de una muestra de control sintetizada por el metodo de H- fosfonato convencional. El rendimiento de (Rp)-5at fue del 94 % (Rp:Sp = 95:5). Tiempo de retencion: 12,4 min ((Rp)- 5at: 14,0 min). El perfil de UPLC se muestra en la Figura 22B.

Ejemplo 96: Sintesis en fase solida de un dimero de fosforotioato, 2'-desoxiguanin-3'-il timidin-5'-ilfosforotioato de (Sp)-amonio [(Sp)-5gt] mediante la Ruta B.

Este compuesto se obtuvo usando "O6-cianoetil-2-N-fenoxiacetil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-desoxiguanin-3'- ilfosfonato de 8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-enio (50 jmoles)" en lugar de "N3-benzoil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)timidin- 3'-ilfosfonato de 8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-enio (50 jmoles)" de un modo similar al Ejemplo 88. El producto fue identico al de una muestra de control sintetizada por el metodo de H-fosfonato convencional. El rendimiento de (Sp)- 5gt fue del 95 % (Rp:Sp = 6:94). Tiempo de retencion: 11,5 min ((Rp)-5gt: 10,3 min). El perfil de UPLC se muestra en la Figura 23.

Ejemplo 97: Sintesis en fase solida de un dimero de fosforotioato, 2'-desoxiguanin-3'-il timidin-5'-ilfosforotioato de (Rp)-amonio [(Rp)-5gt] mediante la Ruta B.

Este compuesto se obtuvo usando "D-2 (52 jmoles)" en lugar de "L-2 (52 jmoles)" de un modo similar al Ejemplo 96. El producto fue identico al de una muestra de control sintetizada por el metodo de H-fosfonato convencional. El rendimiento de (Rp)-5gt fue del 95 % (Rp:Sp = 94:6). Tiempo de retencion: 10,3 min ((Sp)-5gt: 11,6 min). El perfil de UPLC se muestra en la Figura 24.

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Se trato resina HCP cargada con N3-benzoil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)timidina (16,4 mg; 30,5 |jmol/g, 0,5 jmoles) mediante un conector de succinilo con 1 % de TFA / DCM (3 * 1 ml) para la elimination del grupo 5'-O-DMT r, se lavo con DCM (3 * 1 ml) y MeCN seco (3 * 1 ml), y se seco a vado. Se anadio solution de monomero pre-activado (200 jl, 50 jmoles; que consiste en N3-benzoil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)timidin-3'-ilfosfonato de 8-diazabiciclo[5.4.0]undec- 7-enio (50 jmoles, para monoester de H-fosfonato), MeCN-CMp (9:1, v/v, para disolvente), BTC (32 jmoles, para reactivo de condensation) y D-6 (52 jmoles, para aminoalcohol)), seguido de la adicion de CMPT 5 M / MeCN (50 jl, 250 jmoles). Agitandose durante 2 min, la solucion de reaction se elimino, y la resina se lavo con MeCN (3 * 1 ml), DCM (3 * 1 ml) y se seco a presion reducida (>5 min). El grupo 5-O-DMTr y el auxiliar quiral se eliminaron simultaneamente mediante tratamiento con 1 % de tFa en DCM (3 * 1 ml), y la resina se lavo con DCM (3 * 1 ml) y MeCN seco (3 * 1 ml), y se seco a vado. El producto intermedio resultante sobre la resina se boro mediante tratamiento con una mezcla de BH3-SMe2-BSA-DMAc (1 ml, 1:1:8, v/v/v) durante 15 min, la resina se lavo entonces con DMAc (3 * 1 ml), MeCN (3 * 1 ml) y MeOH (3 * 1 ml). El dimero de boranofosfato sobre la resina se trato entonces con NH3 2 M / EtOH (2 ml) durante 12 h a temperatura ambiente para eliminar los grupos protectores de las nucleobases y tambien para liberar el dimero de la resina. La resina se elimino por filtration y se lavo con MeOH. El filtrado se concentro a sequedad. El residuo se disolvio en H2O (2 ml), se lavo con Et2O (3 * 2 ml) y los lavados combinados se retro-extrajeron con H2O (2 ml). Las fases acuosas combinadas se concentraron a sequedad. El producto en bruto resultante se analizo por UPLC® de fase inversa con un gradiente lineal de 0-15 % de MeCN en tampon acetato de amonio 0,1 M (pH 7,0) durante 15 min a 60 °C a una tasa de 0,5 ml/min. El producto fue identico al de una muestra de control sintetizada por el metodo de H-fosfonato convencional. El rendimiento de (Sp)-7tt se determino por una medicion de absorbancia de UV a 260 nm con el coeficiente de extincion molar de un valor aproximado para el dimero TT natural (16800). El rendimiento de (Sp)-7tt fue del 89 % (Rp:Sp = 4:96). Tiempo de retention: 9,6 min ((Rp)-7tt: 9,8 min). El perfil de UPLC se muestra en la Figura 25.

Ejemplo 99: Sintesis en fase solida de un dimero de boranofosfato, timidin-3'-il timidin-5'-il boranofosfato de (Rp)- amonio [(Rp)-7tt] mediante la Ruta B

Este compuesto se obtuvo usando "L-2 (52 jmoles)" en lugar de "D-2 (52 jmoles)" de un modo similar al Ejemplo 98. El producto fue identico al de una muestra de control sintetizada por el metodo de H-fosfonato convencional. El rendimiento de (Rp)-7tt se determino por una medicion de absorbancia de UV a 260 nm con el coeficiente de extincion molar de un valor aproximado para el dimero TT natural (16800). El rendimiento de (Rp)-7tt fue del 90 % de rendimiento, Rp:Sp = 95:5. Tiempo de retencion: 9,8 min ((Sp)-7tt: 9,7 min). El perfil de UPLC se muestra en la Figura 26.

Ejemplo 100: Sintesis en fase solida de un dimero de N-[(2-dimetilamino)etil]fosforamidato, N-[(2- dimetilamino)etil]fosforamidato de (Sp)-timidin-3'-il timidin-5'-ilo [(Sp)-8tt] mediante la Ruta B

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Se trato resina HCP cargada con N3-benzoil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)timidina (16,4 mg; 30,5 jmol/g, 0,5 jmoles) mediante un conector de succinilo con 1 % de TFA / DCM (3 * 1 ml) para la eliminacion del grupo 5'-O-DMT r, se lavo con DCM (3 * 1 ml) y MeCN seco (3 * 1 ml), y se seco a vado. Se anadio solucion de monomero pre-activado (200 jl, 50 jmoles; que consiste en N3-benzoil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)timidin-3'-ilfosfonato de 8-diazabiciclo[5.4.0]undec- 7-enio (50 jmoles, para monoester de H-fosfonato), MeCN-CMp (9:1, v/v, para disolvente), BTC (32 jmoles, para reactivo de condensacion) y L-6 (52 jmoles, para aminoalcohol)), seguido de la adicion de CMPT 5 M / MeCN (50 jl,

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250 |jmoles). Agitandose durante 2 min, la solucion de reaccion se elimino, y la resina se lavo con MeCN (3 * 1 ml), DCM (3 * 1 ml) y se seco a presion reducida (>5 min). El grupo 5'-O-DMTr y el auxiliar quiral se eliminaron simultaneamente mediante tratamiento con 1 % de TFA en DCM (3 * 1 ml), y la resina se lavo con DCM (3 * 1 ml) y MeCN seco (3 * 1 ml), y se seco a vado. El producto intermedio resultante sobre la resina se amido mediante tratamiento con una mezcla de CCl4-Me2N(CH2)2NH2 (1 ml, 1:9, v/v) durante 30 min, la resina se lavo entonces con DCM (3 * 1 ml). El dimero de fosforamidato sobre la resina se trato entonces con NH3 2 M / EtOH (2 ml) durante 12 h a temperatura ambiente para eliminar los grupos protectores de las nucleobases y tambien para liberar el dimero de la resina. La resina se elimino por filtracion y se lavo con MeOH. El filtrado se concentro a sequedad. El residuo se disolvio en H2O (2 ml), se lavo con Et2O (3 * 2 ml), y los lavados combinados se retro-extrajeron con H2O (2 ml). Las fases acuosas combinadas se concentraron a sequedad. El producto en bruto resultante se analizo por UPLC® de fase inversa con un gradiente lineal de 0-20 % de MeOH en tampon acetato de amonio 0,1 M (pH 7,0) durante 15 min a 55 °C a una tasa de 0,4 ml/min. El producto fue identico al de una muestra de control sintetizada por el metodo de H-fosfonato convencional. El rendimiento de (Sp)-8tt se determino por una medicion de absorbancia de UV a 260 nm con el coeficiente de extincion molar de un valor aproximado para el dimero TT natural (16800). El rendimiento de (Sp)-8tt fue del 90 % (Rp:Sp = 6:94). Tiempo de retention: 10,3 min ((Rp)-8tt: 9,6 min). El perfil de UPLC se muestra en la Figura 27.

Ejemplo 101: Sintesis en fase solida de un dimero de N-[(2-dimetilamino)etil]fosforamidato, N-[(2- dimetilamino)etil]fosforamidato de (Rp)-ti midin-3'-il timidin-5'-ilo [(Rp)-8tt] mediante la Ruta B

Este compuesto se obtuvo usando "D-2 (52 jmoles)" en lugar de "L-2 (52 jmoles)" de un modo similar al Ejemplo 100. El producto fue identico al de una muestra de control sintetizada por el metodo de H-fosfonato convencional. El rendimiento de (Rp)-8tt se determino por una medicion de absorbancia de UV a 260 nm con el coeficiente de extincion molar de un valor aproximado para el dimero TT natural (16800). El rendimiento de (Rp)-8tt fue del 86 % de rendimiento, Rp:Sp = 96:4. Tiempo de retencion: 9,6 min ((Sp)-8tt: 10,3 min). El perfil de UPLC se muestra en la Figura 28.

Ejemplo 102: Sintesis en fase solida de un tetramero de fosforotioato, AII-(Sp)-[Tps]3T (fosforotioato) mediante la Ruta A

Se uso resina HCP cargada con 5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)timidina (0,5 jmoles) mediante un conector de succinilo para la sintesis. Repitiendo las etapas en la Tabla 3 se realiza el alargamiento de cadena. Despues del alargamiento de cadena, el grupo 5'-O-DMTr se elimino mediante tratamiento con 3 % de DCA / DCM (3 * 1 ml) y se lavo con DCM (3 * 1 ml). El tetramero de fosforotioato sobre la resina se trato entonces con 25 % de NH3 durante 12 h a 55 °C para eliminar los auxiliares quirales y los grupos protectores de las nucleobases y tambien para liberar el tetramero de la resina. La resina se elimino por filtracion y se lavo con H2O. El filtrado se concentro a sequedad. El residuo se disolvio en H2O (2 ml), se lavo con Et2O (3 * 2 ml), y los lavados combinados se retro-extrajeron con H2O (2 ml). Las fases acuosas combinadas se concentraron a sequedad. El producto en bruto resultante se analizo por UPLC® de fase inversa con un gradiente lineal de 0-30 % de MeOH en tampon acetato de amonio 0,1 M (pH 7,0) durante 30 min a 55 °C a una tasa de 0,4 ml/min. El producto fue identico al de una muestra de control sintetizada por el metodo de fosforamidito convencional. El rendimiento del producto se determino por una medicion de absorbancia de UV a 260 nm con el coeficiente de extincion molar de un valor aproximado para el tetramero T4 natural (33000). El rendimiento del acoplamiento promedio fue del 96 %, la pureza optica fue del 96 % (promedio: 99 %). Tiempo de retencion: 23,0 min; EM (EM-MALDI TOF) m/z Calcd para C40H52N8O23P3S3 [M-H]-1201,15, hallado 1200,97. El perfil de UPLC se muestra en la Figura 29.

Tabla 3.

etapa: operacion reactivos y disolventes tiempo

1: destritilacion 3 % de DCA/DCM 3 * 30 s

2: lavado (i) DCM (ii) MeCN seco (iii) secar a vado. -

3: acoplamiento CMPT 5 M / MeCN (50 jl, 250 jmoles) solucion de monomero (Rp) o (Sp) pre-activado (200 jl, 25 jmoles)* 5 min

4: lavado (i) MeCN (ii) secar a vado. -

5: terminacion (i) CF3COIm 0,5 M / THF seco (ii) DMAN 1 M / THF seco 30 s

6: lavado (i) MeCN seco (ii) secar a vado. -

7: sulfurizacion DTD 0,3 M / MeCN 5 min

8: lavado (i) MeCN (ii) DCM -

* Preparation de "solucion de monomero (Rp) o (Sp) pre-activado"

Se seco N3-benzoil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)timidin-3'-ilfosfonato de 8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-enio (25 jmoles) por coevaporaciones repetidas con piridina seca y tolueno seco, entonces se disolvio en MeCN seco-CMP (9:1, v/v). A la solucion se anadio Ph3PCl2 (62,5 jmoles) y se agito durante 10 min. Entonces se anadio L-2 (30 jmoles; D-2 para solucion "Sp") y se agito durante 10 min adicionales para dar una solucion de monomero pre-activado.

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Ejemplo 103: Smtesis en fase solida de un tetramero de fosforotioato, (Sp, Rp, Sp)-[Tps]3T (fosforotioato) mediante la Ruta A

Este compuesto se obtuvo de un modo similar a AII-(Sp)-[Tps]3T en el Ejemplo 102. El rendimiento del producto se determino por una medicion de absorbancia de UV a 260 nm con el coeficiente de extincion molar de un valor aproximado para el tetramero T4 natural (33000). El producto fue identico al de una muestra de control sintetizada por el metodo de fosforamidito convencional. El rendimiento del acoplamiento promedio es del 96 %, la pureza optica es del 94 % (promedio: 98 %). Tiempo de retencion: 22,3 min; EM (EM-MALDI TOF) m/z Calcd para C40H52N8O23P3S3 [M-H]- 1201,15, hallado 1200,97. El perfil de UPLC se muestra en la Figura 30.

Ejemplo 104: Sintesis en fase solida de un tetramero de fosforotioato, (Rp, Sp, Rp)-[Tps]3T (fosforotioato) mediante la Ruta A

Este compuesto se obtuvo de un modo similar a AII-(Sp)-[Tps]3T en el Ejemplo 102. El rendimiento del producto se determino por una medicion de absorbancia de UV a 260 nm con el coeficiente de extincion molar de un valor aproximado para el tetramero T4 natural (33000). El producto fue identico al de una muestra de control sintetizada por el metodo de fosforamidito convencional. El rendimiento del acoplamiento promedio es del 97 %, la pureza optica es del 96 % (promedio: 99 %). Tiempo de retencion: 21,7 min; EM (EM-MALDI TOF) m/z Calcd para C40H52N8O23P3S3 [M-H]- 1201,15, hallado 1200,96. El perfil de UPLC se muestra en la Figura 31.

Ejemplo 105: Sintesis en fase solida de un tetramero de fosforotioato, AII-(Rp)-[Tps]3T (fosforotioato) mediante la Ruta A

Este compuesto se obtuvo de un modo similar a AII-(Sp)-[Tps]3T. El rendimiento del producto se determino por una medicion de absorbancia de UV a 260 nm con el coeficiente de extincion molar de un valor aproximado para el tetramero T4 natural (33000). El producto fue identico al de una muestra de control sintetizada por el metodo de fosforamidito convencional. El rendimiento del acoplamiento promedio es del 95 %, la pureza optica es del 92 % (promedio: 97 %). Tiempo de retencion: 19,1 min; EM (EM-MaLDI TOF) m/z Calcd para C40H52N8O23P3S3 [M-H]- 1201,15, hallado 1200,92. El perfil de UPLC se muestra en la Figura 32.

Ejemplo 106: Sintesis en fase solida de un tetramero de fosforotioato de ARN, 2'-O-metiluridin-3'-il uridin-5'- ilfosforotioato de (Sp)-amonio [(Sp)-9umu] mediante la Ruta A

imagen93

Se trato resina CPG cargada con 2'-O-acetil-N3-benzoil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)uridina (21,4 mg; 23,4 |jmol/g, 0,5 |jmoles) mediante un conector de succinilo con 3 % de DCA / DCM (3 * 1 ml), entonces se lavo con DCM (3 * 1 ml) y MeCN seco (3 * 1 ml). Despues de secarse la resina a presion reducida (>5 min), se anadio solucion de monomero pre-activado (250 jl, 25 jmoles; que consiste en N3-benzoil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-O-metiluridin-3'- ilfosfonato de 8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-enio (25 jmoles, para monoester de H-fosfonato), MeCN-piridina (9:1, v/v, para disolvente), Ph3PCl2 (62,5 jmoles, para reactivo de condensation) y L-2 (30 jmoles, para aminoalcohol)). Agitandose durante 5 min, la solucion de reaction se elimino, y la resina se lavo con MeCN (3 * 1 ml), se seco a presion reducida (>5 min). El producto intermedio resultante se sulfurizo mediante tratamiento con DTD 0,3 M / MeCN (500 jl, 150 jmoles) durante 5 min, entonces se lavo con MeCN (3 * 1 ml) y DCM (3 * 1 ml). El grupo 5'-O- DMT r se elimino mediante tratamiento con 3 % de DCA / DCM (3 * 1 ml) y se lavo con DCM (3 * 1 ml). El dimero de fosforotioato sobre la resina se trato entonces con 25 % de NH3 (1 ml) durante 12 h a 55 °C para eliminar el auxiliar quiral y los grupos protectores de las nucleobases y tambien para liberar el dimero de la resina. La resina se elimino por filtration y se lavo con H2O. El filtrado se concentro a sequedad. El residuo se disolvio en H2O (2 ml), se lavo con Et2O (3 * 2 ml), y los lavados combinados se retro-extrajeron con H2O (2 ml). Las fases acuosas combinadas se concentraron a sequedad. El producto en bruto resultante se analizo por UPLC® de fase inversa con un gradiente lineal de 0-20 % de MeOH en tampon acetato de amonio 0,1 M (pH 7,0) durante 15 min a 55 °C a una tasa de 0,4 ml/min. El rendimiento de (Sp)-9umu fue del 95 % (Rp:Sp = 2:98). Tiempo de retencion: 10,2 min ((Rp)-9umu: 9,3 min); EM (EM-MALDI TOF) m/z Calcd para C19H24N4O13PS [M-H]- 579,08, hallado 578,92. El perfil de UPLC se muestra en la Figura 33.

5

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Este compuesto se obtuvo usando "D-2 (30 |jmoles)" en lugar de "L-2 (30 jmoles)" de un modo similar al Ejemplo 106. El rendimiento de (Rp)-9umu fue del 94 % (Rp:Sp = 95:5). Tiempo de retencion: 9,3 min ((Sp)-9umu: 10,3 min); EM (EM-MALDI TOF) m/z Calcd para C19H24N4O13PS [M-H]-579,08, hallado 578,97. El perfil de UPLC se muestra en la Figura 34.

Ejemplo 108: Sintesis en fase solida de un tetramero de fosforotioato de ARN, 2'-desoxi-2'-fluorouridin-3'-il uridin-5'- ilfosforotioato de (Sp)-amonio [(Sp)-10ufu] mediante la Ruta A

imagen94

Este compuesto se obtuvo usando "N3-benzoil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-desoxi-2'-fluorouridin-3'-ilfosfonato de 8- diazabiciclo[5.4.0]undec-7-enio (25 jmoles)" en lugar de "W®-benzoil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-O-metiluridin-3'- ilfosfonato de 8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-enio (25 jmoles)" de un modo similar al Ejemplo 106. El rendimiento de (Sp)-10ufu fue del 93 % (Rp:Sp = 1:99). Tiempo de retencion: 10,6 min ((Rp)-10ufu: 8,5 min); EM (EM-MALDI TOF) m/z Calcd para C18H21FN4O12PS [M-H]- 567,06, hallado 566,96. El perfil de UPLC se muestra en la Figura 35.

Ejemplo 109: Sintesis en fase solida de un tetramero de fosforotioato de ARN, 2'-desoxi-2'-fluorouridin-3'-il uridin-5'- ilfosforotioato de (Rp)-amonio [(Rp)-10ufu] mediante la Ruta A

Este compuesto se obtuvo usando "D-2 (30 jmoles)" en lugar de "L-2 (30 jmoles)" de un modo similar al Ejemplo 108. El rendimiento de (Rp)-10ufu fue del 92 % de rendimiento, Rp:Sp = 96:4. Tiempo de retencion: 8,4 min ((Sp)- 10ufu: 10,7 min); EM (EM-MALDI TOF) m/z Calcd para C18H21FN4O12PS [M-H]- 567,06, hallado 566,97. El perfil de UPLC se muestra en la Figura 36.

Ejemplo 110: Disolucion-fase sintesis de nucleobase no natural, 1-(3-nitropirrol-1-il)-2-desoxiribofuranos-3-il timidin- 5'-ilfosforotioato de (Sp)-amonio [(Sp)-11nt] mediante la Ruta A

imagen95

11nt

Este compuesto se obtuvo usando "5-O-(4,4'-dimetoxitritil)-1-(3-nitropirrol-1-il)-2-desoxiribofuranos-3-ilfosfonato de 8- diazabiciclo[5.4.0]undec-7-enio (25 jmoles)" en lugar de " N3-benzoil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)timidin-3'-ilfosfonato de 8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-enio (25 jmoles)" de un modo similar al Ejemplo 78. El rendimiento del producto se determino por una medicion de absorbancia de UV a 260 nm con el coeficiente de extincion molar de un valor aproximado para el dimero CT natural (15200). El rendimiento de (Sp)-11nt fue rendimiento del 98 %. Tiempo de retencion: 16,3 min. (Rp)-11nt no pudo resolverse; EM (EM-MALDI TOF) m/z Calcd para C19H24N4O11PS [m-H]- 547,09, hallado 547,02. El perfil de UPLC se muestra en la Figura 37.

Ejemplo 111: Sintesis en fase de solucion de nucleobase no natural, 1-(3-nitropirrol-1-il)-2-desoxiribofuranos-3-il timidin-5'-ilfosforotioato de (Rp)-amonio [(Rp)-11nt] mediante la Ruta A

Este compuesto se obtuvo usando "D-2 (30 jmoles)" en lugar de "L-2 (30 jmoles)" de un modo similar al Ejemplo 110. El rendimiento del producto se determino por una medicion de absorbancia de UV a 260 nm con el coeficiente de extincion molar de un valor aproximado para el dimero CT natural (15200). El rendimiento de (Rp)-11nt fue del 97 % de rendimiento. Tiempo de retencion: 16,1 min. (Sp)-11nt no pudo resolverse; EM (EM-MALDI TOF) m/z Calcd para C19H24N4O11PS [M-H]- 547,09, hallado 547,01. El perfil de UPLC se muestra en la Figura 38.

Aunque se han mostrado y descrito realizaciones preferidas de la presente invencion en el presente documento, sera obvio para aquellos expertos en la materia que tales realizaciones se proporcionan a modo de ejemplo solo. Se pretende que las siguientes reivindicaciones definan el alcance de la invencion y que asi se cubran metodos y estructuras dentro del alcance de estas reivindicaciones.

5

Claims

5

10

15

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25

30

35

40

45

50

REIVINDICACIONES

1. Un metodo para una smtesis de un acido nucleico que comprende un resto de fosfonato quiral, comprendiendo el metodo:

hacer reaccionar un nucleosido que comprende un resto de H-fosfonato aquiral, un reactivo quiral y un nucleosido que comprende un resto 5'-OH, para formar un producto intermedio de oligonucleotido; y convertir el producto intermedio de oligonucleotido en el acido nucleico que comprende un resto de fosfonato quiral;

en el que:

el acido nucleico que comprende un resto de fosfonato quiral es un compuesto de formula 1:

imagen1

OR3

Formula 1

en la que:

R1 es -OH, -SH, -NRdRd, -N3, halogeno, hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y1-, alquenil-Y1-, alquinil- Y1-, aril-Y1-, heteroaril-Y1-, -P(O)(Re)2, -HP(O)(Re), -ORa o -SRc;

Y1 es O, NRd, S o Se;

Ra es un resto de bloqueo;

Rc es un grupo de bloqueo;

cada caso de Rd es independientemente hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, acilo, sililo sustituido, carbamato, -P(O)(Re)2 o -HP(O)(Re);

cada caso de Re es independientemente hidrogeno, alquilo, arilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y2-, alquenil-Y2-, alquinil-Y2-, aril-Y2- o heteroaril-Y2-, o un cation que es Na+1, Li+1 o K+1;

Y2 es O, S o NRd; en donde cada caso de Rd en Y2 es independientemente hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, acilo, sililo sustituido, carbamato;

cada caso de R2 es independientemente hidrogeno, -OH, -SH, -NRdRd, -N3, halogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y1-, alquenil-Y1-, alquinil-Y1-, aril-Y1-, heteroaril-Y1-, -ORb o -SRc, en donde Rb es un resto de bloqueo;

cada caso de Ba es independientemente una adenina bloqueada o no bloqueada, citosina, guanina, timina, uracilo o nucleobase modificada;

cada caso de X es independientemente alquilo, alcoxi, arilo, alquiltio, acilo, -NRfRf, alqueniloxi, alquiniloxi, alqueniltio, alquiniltio, -S-Z+, -Se-Z+ o -BH3-Z+;

cada caso de Rf es independientemente hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo o arilo;

Z+ es ion amonio, ion alquilamonio, ion imino heteroaromatico o ion imino heterociclico, cualquiera de los cuales es primario, secundario, terciario o cuaternario, o Z+ es un ion metalico monovalente;

R3 es hidrogeno, un grupo de bloqueo, un resto de enlace conectado a un soporte solido o un resto de enlace conectado a un acido nucleico; y n es un numero entero de 1 a 200; y en donde cada resto estereogenico del compuesto de formula 1 tiene opcionalmente mas del 98 % de pureza diaestereomerica como se ha determinado por espectroscopia de RMN 31P o HPLC de fase inversa;

el nucleosido que comprende un resto de H-fosfonato aquiral es un compuesto de formula 2:

imagen2

en la que:

5

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15

20

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R1 es -NRdRd, -N3, halogeno, hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y1-, alquenil-Y1-, alquinil-Y1-, aril-Y1-, heteroaril-Y1-, -P(O)(Re)2, -HP(O)(Re), -ORa o -SRc;

Y1 es O, NRd, S o Se;

R3 es un resto de bloqueo;

Rc es un grupo de bloqueo;

cada caso de Rd es independientemente hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, acilo, sililo sustituido, carbamato, -P(O)(Re)2 o -HP(O)(Re);

cada caso de Re es independientemente alquilo, arilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y2-, alquenil-Y2-, alquinil-Y2-, aril-Y2- o heteroaril-Y2-;

Y2 es O, S o NRd; en donde cada caso de Rd en Y2 es independientemente hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, acilo, sililo sustituido, carbamato;

R2 es hidrogeno, -NRdRd, -N3, halogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y1-, alquenil-Y1-, alquinil-Y1-, aril-Y1-, heteroaril-Y1-, -ORb o -SRc, en donde Rb es un resto de bloqueo; y

Ba es una adenina bloqueada o no bloqueada, citosina, guanina, timina, uracilo o nucleobase modificada; y Z+ es ion amonio, ion alquilamonio, ion imino heteroaromatico o ion imino heterociclico, cualquiera de los cuales es primario, secundario, terciario o cuaternario, o un ion metalico monovalente;

el reactivo quiral es un compuesto de formula 3:

imagen3

G3 G2 Formula 3

en la que:

W1 y W2 son independientemente -NG5-, -O- o -S-;

G1, G2, G3, G4 y G5 son independientemente hidrogeno, alquilo, aralquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heterociclilo, heteroarilo o arilo, o dos de G1, G2, G3, G4 y G5 son independientemente G6, en donde dos G6 se toman conjuntamente para formar un anillo carbociclico saturado, parcialmente insaturado o insaturado, o que contiene un heteroatomo de hasta 20 atomos de anillo que es monociclico o policiclico, condensado o no condensado, y

en donde no mas de cuatro de G1, G2, G3, G4 y G5 son G6;

el nucleosido que comprende un resto 5'-OH es un compuesto de formula 4:

imagen4

Oa

Y

Formula 4

en la que:

cada caso de R2 es independientemente hidrogeno, -NRdRd, -N3, halogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, alquil- Y1-, alquenil-Y1-, alquinil-Y1-, aril-Y1-, heteroaril-Y1-, -ORb o -SRc, en donde Rb es un resto de bloqueo;

Y1 es O, NRd, S o Se;

Rc es un grupo de bloqueo;

cada caso de Rd es independientemente hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, acilo, sililo sustituido, carbamato, -P(O)(Re)2 o -HP(O)(Re);

cada caso de Re es independientemente alquilo, arilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y2-, alquenil-Y2-, alquinil-Y2-, aril-Y2- o heteroaril-Y2-;

Y2 es O, S o NRd; en donde cada caso de Rd en Y2 es independientemente hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, acilo, sililo sustituido, carbamato;

cada caso de Ba es independientemente una adenina bloqueada o no bloqueada, citosina, guanina, timina, uracilo o nucleobase modificada; m es un numero entero de 0 a n-1;

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n es un numero entero de 1 a 200;

Oa esta conectado a un resto de tritilo, un resto de sililo, un resto de acetilo, un resto de acilo, un resto de arilacilo, un resto de enlace conectado a un soporte solido o un resto de enlace conectado a un acido nucleico;

J es O y D es H, o J es S, Se o BH3 y D es un ligando quiral o un resto de formula A:

imagen5

Formula A

en la que:

Wi y W2 son independientemente NHG5, OH o SH;

A es hidrogeno, resto de acilo, arilo, alquilo, aralquilo o sililo; y

en la que G1, G2, G3, G4 y G5 son independientemente hidrogeno, alquilo, aralquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heterociclilo, heteroarilo o arilo, o dos de G1, G2, G3, G4 y G5 son independientemente G6, en donde dos G6 se toman conjuntamente para formar un anillo carbociclico saturado, parcialmente insaturado o insaturado, o que contiene un heteroatomo de hasta 20 atomos de anillo que es monociclico o policiclico, condensado o no condensado, y en donde no mas de cuatro de G1, G2, G3, G4 y G5 son G6; y el producto intermedio de oligonucleotido tiene la estructura de:

imagen6

en la que:

Wi y W2 son independientemente NHG5, OH o SH;

imagen7

G1, G2, G3, G4 y G5 son independientemente hidrogeno, alquilo, aralquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heterociclilo, heteroarilo o arilo, o dos de G1, G2, G3, G4 y G5 son independientemente G6, en donde dos G6 se toman conjuntamente para formar un anillo carbociclico saturado, parcialmente insaturado o insaturado, o que contiene un heteroatomo de hasta 20 atomos de anillo que es monociclico o polidclico, condensado o no condensado, y en donde no mas de cuatro de G1, G2, G3, G4 y G5 son G6;

R1 es -OH, -SH, -NRdRd, -N3, halogeno, hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y1-, alquenil-Y1-, alquinil- Y1-, aril-Y1-, heteroaril-Y1-, -P(O)(Re)2, -HP(O)(Re), -ORa o -SRc;

Y1 es O, NRd, S o Se;

R3 es un resto de bloqueo;

Rc es un grupo de bloqueo;

cada caso de Rd es independientemente hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, acilo, sililo sustituido, carbamato, -P(O)(Re)2 o -HP(O)(Re);

cada caso de Re es independientemente hidrogeno, alquilo, arilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y2-, alquenil-Y2-, alquinil-Y2-, aril-Y2- o heteroaril-Y2-;

Y2 es O, S o NRd; en donde cada caso de Rd en Y2 es independientemente hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, acilo, sililo sustituido, carbamato;

cada caso de R2 es independientemente hidrogeno, -OH, -SH, -NRdRd, -N3, halogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y1-, alquenil-Y1-, alquinil-Y1-, aril-Y1-, heteroaril-Y1-, -ORb o -SRc, en donde Rb es un resto de bloqueo;

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cada caso de Ba es independientemente una adenina bloqueada o no bloqueada, citosina, guanina, timina, uracilo o nucleobase modificada; y

R3 es hidrogeno, un grupo de bloqueo, un resto de enlace conectado a un soporte solido o un resto de enlace conectado a un acido nucleico.
2. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la etapa de hacer reaccionar el nucleosido que comprende un resto de H-fosfonato aquiral, un reactivo quiral y el nucleosido que comprende un resto 5'-OH para formar un producto intermedio de oligonucleotido es una reaccion de una sola etapa.
3. El metodo de la reivindicacion 1, que comprende ademas proporcionar un reactivo de condensacion Cr por el cual el nucleosido que comprende un resto de H-fosfonato aquiral se activa para reaccionar con el reactivo quiral para formar un producto intermedio quiral, y opcionalmente que comprende ademas proporcionar un reactivo de activacion Ar,

en el que Cr tiene una de las siguientes formulas generales: Ar3PL2 y (ArO)3PL2.

imagen8

en las que Z1, Z2, Z3, Z4, Z5, Z6, Z7, Z8, Z9 y Z10 estan seleccionados independientemente de alquilo,

aminoalquilo, cicloalquilo, heterodclico, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, alquiloxi, ariloxi o heteroariloxi,

o en las que cualquiera de Z2 y Z3, Z5 y Z6, Z7 y Z8, Z8 y Z9, Z9 y Z7 o Z7 y Z8 y Z9 se toman conjuntamente para formar un anillo alidclico o heterodclico de 3 a 20 miembros;

Q- es un contraion; w es un numero entero de 0 a 3;

L es un grupo saliente; y

en las que Ar es arilo o heteroarilo, y opcionalmente esta unido al soporte de polimero;

en el que Ar tiene una de las siguientes formulas generales:

imagen9

Z11, Z12, Z13, Z14, Z15, Z16, Z17, Z18, Z19, Z20 y Z21 son independientemente hidrogeno, alquilo, aminoalquilo,

cicloalquilo, heterodclico, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, alquiloxi, ariloxi o heteroariloxi, o en donde cualquiera de Z11 y Z12, Z11 y Z13, Z11 y Z14, Z12 y Z13, Z12 y Z14, Z13 y Z14, Z15 y Z16, Z15 y Z17, Z16 y Z17, Z18 y Z19 o Z20 y Z21 se toman conjuntamente para formar un anillo alidclico o heterodclico de 3 a 20 miembros, o para formar un anillo aromatico de 5 o 20 miembros; y Q- es un contraion.
4. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la reaccion se realiza en un disolvente organico aprotico.
5. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la etapa de convertir el producto intermedio de oligonucleotido en un compuesto de formula 1 comprende:

terminacion del producto intermedio de oligonucleotido y modificacion del producto intermedio de oligonucleotido terminado para producir un compuesto de formula 5:

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en la que:

R1 es -NRdRd, -N3, halogeno, hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y1-, alquenil-Y1-, alquinil-Y1-, aril-Y1-, heteroaril-Y1-,-P(O)(Re)2, -HP(O)(Re), -ORa o -SRc;

Y1 es O, NRd, S o Se;

Ra es un resto de bloqueo;

Rc es un grupo de bloqueo;

cada caso de Rd es independientemente hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, acilo, sililo sustituido, carbamato, -P(O)(Re)2 o -HP(O)(Re);

cada caso de Re es independientemente alquilo, arilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y2-, alquenil-Y2-, alquinil-Y2-, aril-Y2- o heteroaril-Y2-;

Y2 es O, S o NRd; en donde cada caso de Rd en Y2 es independientemente hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, acilo, sililo sustituido, carbamato;

cada caso de R2 es independientemente hidrogeno, -NRdRd, -N3, halogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, alquil-

Y1-, alquenil-Y1-, alquinil-Y1-, aril-Y1-, heteroaril-Y1-, -ORb o SRc, en donde Rb es un resto de bloqueo;

cada caso de Ba es independientemente una adenina bloqueada o no bloqueada, citosina, guanina, timina,

uracilo o nucleobase modificada;

cada caso de J es S, Se o BH3;

v es un numero entero de 2 a n-1;

Oa esta conectado a un resto de enlace conectado a un soporte solido o un resto de enlace conectado a un acido nucleico;

A es un resto de acilo, arilo, alquilo, aralquilo o sililo; y

G1, G2, G3, G4 y G5 son independientemente hidrogeno, alquilo, aralquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heterociclilo, heteroarilo o arilo, o dos de G1, G2, G3, G4 y G5 son independientemente G6, en donde dos G6 se toman conjuntamente para formar un anillo carbociclico saturado, parcialmente insaturado o insaturado, o que contiene heteroatomo de hasta aproximadamente 20 atomos de anillo que es monociclico o policiclico, condensado o no condensado, y en donde no mas de cuatro de G1, G2, G3, G4 y G5 son G6.
6. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la etapa de convertir el producto intermedio de oligonucleotido en un compuesto de formula 1 comprende acidificar el producto intermedio de oligonucleotido para producir un compuesto de formula 4, en donde m es al menos uno, J es O y D es H.
7. El metodo de la reivindicacion 6, que comprende ademas la etapa de modificar el compuesto de formula 4 para introducir un resto X produciendo asi un compuesto de formula 1 en donde R3 es un grupo de bloqueo o un resto de enlace conectado a un soporte solido.
8. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la etapa de modificacion se realiza usando un agente de boracion, un electrofilo de azufre o un electrofilo de selenio.
9. El metodo de la reivindicacion 7, en el que la etapa de modificacion se realiza:

(i) usando un reactivo de sililacion seguido de un electrofilo de azufre, un electrofilo de selenio, un agente de boracion, un agente alquilante, un aldehido o un agente acilante, o

(ii) haciendo reaccionar con un reactivo de halogenacion seguido de hacer reaccionar con un nucleofilo.
10. El metodo de la reivindicacion 5, en el que Ra es tritilo sustituido o sin sustituir o sililo sustituido; o en el que:

(i) Rb es tritilo sustituido o sin sustituir, sililo sustituido, acetilo, acilo o eter metilico sustituido,

(ii) el grupo de bloqueo del resto Ba es un resto de bencilo, acilo, formilo, dialquilformamidinilo, isobutirilo, fenoxiacetilo o tritilo, cualquiera de los cuales puede estar sin sustituir o sustituido, o

(iii) R2 es -NRdRd, alquilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y1-, alquenil-Y1-, alquinil-Y1-, aril-Y1-, heteroaril-Y1 y esta sustituido con restos fluorescentes o de union a biomolecula; o en donde:

(i) R3 es un grupo de bloqueo que es tritilo sustituido, acilo, sililo sustituido o bencilo sustituido, o

(ii) X es alquilo, alcoxi, -NRfRf, -S-Z+ o -BH3-Z+; o en donde:

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(i) R1 es -N3, -NRdRd, alquiniloxi u -OH, o

(ii) Z es ion piridinio, ion trietilamonio, ion N,N-diisopropiletilamonio, ion 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7- enio, ion sodio o ion potasio.
11. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que R1 es -OH o -ORa.
12. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que cada caso de Rd es

independientemente hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, acilo, sililo sustituido o carbamato.
13. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que cada caso de Re es

independientemente alquilo, arilo, alquenilo o alquinilo.
14. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que Y2 es O o S.
15. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que cada caso de X es

independientemente alquiltio, alqueniltio, alquiniltio o -S-Z+.
16. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que n es un numero entero de 10 a 100.
17. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que n es un numero entero de 15 a 25.
18. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que Wi es NHG5 y W2 es O y en el que el

reactivo quiral es el compuesto de formula 3.
19. El metodo de la reivindicacion 1, en el que el reactivo quiral es la formula Q o la formula R:

imagen11

Formula Q Formula R
20. El metodo de la reivindicacion 1, en el que el reactivo quiral es la formula O o la formula P:

imagen12

Formula O

imagen13

Formula P