KR20120052909A - 핵산 수송용 조성물 및 이의 사용 방법 - Google Patents

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Abstract

본 개시는 감소된 순 음이온성 전하를 가지기 위해 변형된 핵산 구조체에 대한 것이다. 구조체는 포스포트리에스테르 및/또는 포스포티오에이트 보호기를 포함한다. 본 개시는 또한 이러한 구조체의 제조 및 이용 방법을 제공한다.

Description

핵산 수송용 조성물 및 이의 사용 방법{NUCLEIC ACID DELIVERY COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF}
관련 출원의 교차-참조
본 출원은 2009년 6월 1일에 출원된 U.S. 가특허출원 일련번호 제61/182,832호에 대한 우선권을 주장하며, 상기 개시는 본 명세서에 참고 문헌으로 포함된다.
기술 분야
본 발명은 세포를 형질전환시키는 조성물 및 방법에 대한 것이다.
시험관내 ( in vitro ) 및 생체내 ( in vivo ) 모두에서 세포로 핵산을 수송하는 것은 다양한 재조합 바이러스 벡터, 지질 수송 시스템 및 전기천공법(electroporation)을 이용하여 수행되어 왔다. 이러한 기술들은 유전자 발현의 넉아웃(knock-out)에 의한 다양한 질병 및 장애의 치료, 유전자 치료를 위한 유전자 구조체(construct)의 제공 또는 다양한 생물학적 시스템의 연구를 위해 발견되었다.
올리고뉴클레오타이드와 같은 다중음이온성 올리고머는 세포막을 쉽게 통과하지 못한다. 배양 세포에서 이 문제를 해결하기 위해, 흡수를 돕기 위한 양이온성 지질이 음이온성 올리고뉴클레오타이드에 결합된다. 유감스럽게도, 상기 결합체는 일반적으로 세포에 독성이며, 이는 생존가능한 세포의 형질전환을 보증하기 위해 노출 시간 및 양이온성 지질의 농도 모두를 매우 조심스럽게 통제해야 함을 의미한다.
mRNAs를 선택적으로 절단하는 세포성 메커니즘으로서 RNA 간섭(RNA interference, RNAi)의 발견은 세포 배양에서 세포성 표현형의 표적화된 조작 및 지향성(directed) 치료제의 개발 능력을 실현시켰다(Behlke, Mol. Ther. 13, 644-670, 2006; Xie et al ., Drug Discov. Today 11, 67-73, 2006). 그러나, 크기 및 음(음이온성) 전하 성질로 인해, siRNAs는 세포로 들어갈 능력이 없는 거대 분자이다. 물론, siRNAs는 일반적으로 크기를 500 Da 미만으로 제한하는 막 확산성 분자의 세포 수송에 대한 리핀스키의 "5s의 법칙(Rule of 5s)"을 25배 초과한다. 결과적으로, 수송 비히클 또는 형질전환제가 부재한 경우에, 순수한 siRNA는 심지어 밀리몰의 농도라도 세포로 들어갈 수 없다(Barquinero et al ., Gene Ther. 11 Suppl 1, S3-9, 2004). siRNA 수송 문제를 풀기 위해 siRNA를 응축시키고 세포막에 구멍을 내는 양이온성 지질의 사용에 상당한 관심이 집중되었다. 널리 사용됨에도 불구하고, 형질전환 시약은 많은 세포 유형, 특히 1차 세포 및 조혈 세포 계통(T 및 B 세포, 대식 세포)으로의 효율적인 수송을 성취하지 못한다. 더욱이, 리포좀 매개 형질전환(lipofection) 시약은 자주 암 세포에서 약하고 1차 세포에서 매우 높은 범위의 다양한 정도로 세포독성을 야기한다.
요약
본 개시는 은폐된(masked) 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 살아있는 세포로 수송하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 본 개시는 음이온성 전하를 중화하는 모이어티(moiety)/기(group)를 포함하는 일시적으로 보호된 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 한 구체예에서 전하 중화 모이어티는 염기성/양이온성 전하를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 모이어티는 본 개시의 트리메스테르 보호기를 따라 1차, 2차 또는 3차 아민을 포함한다. 이들 화합물은 세포내섭취(endocytic) 또는 대음세포(macropinocytic) 메커니즘에 의해 살아있는 세포의 세포질로 들어갈 수 있다. 한 구체예에서, 세포내 환경에 노출되는 경우 포스포트리에스테르 보호/중화기는 효소 활성 또는 수동적인 세포내 방법(예를 들면, pH의 변화)에 의해 제거되도록 설계되어 RNAi 반응을 끌어낼 수 있는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 따라서, 본 개시는 치료제로서, 진단법으로서 및 연구를 위한 도구로서 유용한 올리고뉴클레오타이드 전구 약물을 제공한다.
본 개시는 RNAi를 유도하는 단일의, 가용성 리보핵 염기(RiboNucleic Basic, siRNB) 분자를 제공한다. 일부 구체예에서, siRNB 분자는 <2x104 Da인 펩티드 전달 도메인 (Peptide Transduction Domain, PTD) 세포 수송 펩티드(PTD-siRNB)에 결합한다. 세포질의 티오에스테라아제에 의해 특이적으로 제거되어 야생형 포스포디에스테르로 복귀(reversion)를 야기하는, 생물학적으로 가역적인, 아미노 이소부틸 S-아실 티오 에틸 염기성 포스포트리에스테르를 포함하는 RNB 포스포라미디트 구성 요소가 제작되었다. 자가-수송 PTD-siRNBs는 배양 내의 1차 및 형질전환된 세포의 전체 집단에서 빠른 RNAi 반응을 유도하고, 생체 내 마우스 모델에서 코 및 상부 호흡기에서 RNAi 반응을 유도한다. PTD-siRNBs는 RNAi 반응의 유도에 대한 신규한, 단일 가용성 분자 접근법을 제시한다.
본 개시는 1차 아민기(pKa >9.0)의 형성에서 RNB를 수용성으로 만들며 PTD 수송 펩티드에 의해 용액에서 빠져나가지 않는 염기성(양) 전하를 제공한다.
본 개시는 전하 중화된 올리고뉴클레오타이드의 사용을 위해 변형된 뉴클레오타이드를 제공한다. 상기 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드의 포스페이트 기에 결합된 아미노 알킬 S-아실 티오 알킬("전하 중화 모이어티" 또는 "N-SATE")을 포함한다. 중화기는 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 세포막을 통과하는 수송을 돕는다. 일단 세포에 흡수되면 중화기는 예를 들어, 내생성(endogenous) 또는 외인성(exogenous) 티오 에스테라아제에 의해 제거된다.
한 구체예에서 올리고뉴클레오타이드 예를 들어, 및 RNA 올리고뉴클레오타이드에 N-SATE의 추가를 위한 구성요소는 다음의 일반 구조를 가지는 전하 중화 모이어티를 포함한다:
Figure pct00001
여기서 R은 아미노 기 또는 1 내지 7개 원자 알킬, 치환된 알킬, 알콕시, 치환된 알콕시, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로사이클릭, 또는 아미노 기로 끝나는 치환된 헤테로사이클릭이다. 전술된 구조는 RNA 합성 반응 동안 추가되어 siRNB 분자를 생성할 수 있다.
한 구체예에서, 전하 중화 모이어티는 다음의 일반 구조를 가지는 및 N-SATE를 포함한다:
Figure pct00002
여기서 R1은 존재하거나 존재하지 않을 수 있으며, R1이 존재하는 경우, R1은 알킬, 치환된 알킬, 알콕시, 치환된 알콕시, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로사이클릭, 또는 치환된 헤테로사이클릭으로 이루어진 군에서 선택되고;
여기서 R2는 존재하거나 존재하지 않을 수 있으며, R2가 존재하는 경우, R2는 1 내지 7개 원자 알킬, 치환된 알킬, 알콕시, 치환된 알콕시, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로사이클릭, 또는 치환된 헤테로사이클릭으로 이루어진 군에서 선택된다. 한 구체예에서, 전하 중화 모이어티는 다음으로 이루어진 군에서 선택된다:
Figure pct00003
,
Figure pct00004
, 및
Figure pct00005
.
전하 중화 모이어티는 임의의 핵산 염기(즉, A, G, T, U, C)의 포스페이트 기에 결합할 수 있다. 예를 들어, 본 개시는 다음의 일반 구조를 가지는 뉴클레오타이드를 제공한다:
Figure pct00006
여기서 R1은 존재하거나 존재하지 않을 수 있으며, R1이 존재하는 경우, R1은 알킬, 치환된 알킬, 알콕시, 치환된 알콕시, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로사이클릭, 또는 치환된 헤테로사이클릭으로 이루어진 군에서 선택되고;
여기서 R2는 존재하거나 존재하지 않을 수 있으며, R2가 존재하는 경우, R2는 1 내지 7개 원자 알킬, 치환된 알킬, 알콕시, 치환된 알콕시, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로사이클릭, 또는 치환된 헤테로사이클릭으로 이루어진 군에서 선택된다. 한 구체예에서, 전하 중화 모이어티는 다음으로 이루어진 군에서 선택된다:
Figure pct00007
,
Figure pct00008
, 및
Figure pct00009
.
본 개시는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 백본(backbone)의 순(net) 음이온성 전하를 낮추는 전하 중화 모이어티(예를 들면, 포스포디에스테르 및/또는 포스포티오에이트 보호기)를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 구조체를 더욱 포함한다. 한 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 siRNA 분자를 포함한다. 그리고 또 다른 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드는 전하 중화 모이어티를 가지는 다수의 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 그리고 또 다른 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 전하 중화 모이어티를 가지는 다수의 인접한 뉴클레오타이드를 포함한다. 그리고 또 다른 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 1 이상(예를 들면, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 그 이상의 뉴클레오타이드 염기)에 의해 다른 것으로부터 격리된 전하 중화 모이어티를 가지는 다수의 뉴클레오타이드를 포함한다. 그리고 또 다른 구체예에서, 전하 중화 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 도메인에 작동가능하게 연결된 막 수송 기능을 포함하는 형질 전환 도메인에 결합되거나 작동가능하게(operably) 연결된다.
본 개시는 또한 본 명세서에 기재된 핵산 구조체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 개시는 하나 이상의 단백질 형질 전환 도메인을 핵산 구조체에 연결하는 것을 포함하는 방법을 기재한다. 한 양태에서, 하나 이상의 단백질 형질 전환 도메인은 2-5개의 단백질 형질 전환 도메인을 포함한다.
본 개시는 또한 다음을 포함하는 핵산 구조체를 생성하는 방법을 제공한다: 단백질 형질 전환 도메인을 상당하게 정제하는 단계; 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 단계; 전하 중화기를 이용하여 올리고뉴클레오타이드 상의 음이온성 전하를 전하 중화하는 단계; 그리고 올리고뉴클레오타이드를 하나 이상의 단백질 형질 전환 도메인에 연결하는 단계.
또한 본 개시의 핵산 구조체를 세포와 접촉시키는 것을 포함하는 세포의 형질전환 방법이 제공된다. 접촉은 생체내 또는 시험관내에서 일어날 수 있다.
본 개시는 또한 본 개시의 핵산 구조체를 대상에 투여하는 것을 포함하는 질병 또는 장애를 치료하는 방법을 제공하고, 여기서 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 치료적 또는 진단적 분자를 포함한다.
도 1은 세포에 의한 전하-중화된 올리고뉴클레오타이드 흡수 및 효소적인 보호기 제거(deprotection)를 도시한다.
도 2는 N-SATE 포스포트리에스테르 보호기제거를 도시한다.
도 3은 포스포라미디트가 RNA 올리고뉴클레오타이드 내로 포함되는 구체예를 나타낸다.
도 4A-B는 본 개시의 뉴클레오사이드 포스포라미디트 합성 경로를 나타낸다.
도 5는 Fmoc-N1-SATE 정제 및 특성을 나타낸다.
도 6 는 Fmoc-N1-SATE U 포스포라미디트 정제 및 특성을 나타낸다.
도 7 는 Fmoc-N1-SATE C 포스포라미디트 정제 및 특성을 나타낸다.
도 8 는 Fmoc-N1-SATE A 포스포라미디트 정제 및 특성을 나타낸다.
도 9 는 Fmoc-N2-SATE 정제 및 특성을 나타낸다.
도 10 는 Fmoc-N2-SATE U 포스포라미디트 정제 및 특성을 나타낸다.
도 11 는 Fmoc-Ala-SATE 포스포라미디트의 합성을 나타낸다.
도 12 는 Fmoc-Ala-SATE 정제 및 특성을 나타낸다.
도 13 는 Fmoc-Ala-SATE U 포스포라미디트 정제 및 특성을 나타낸다.
도 14 는 N1-U-SATE 뉴클레오타이드를 가지는 SEQ ID NO:2를 포함하는 검사 서열 및 정제 및 특성을 나타낸다.
도 15 는 N1-U-SATE 뉴클레오타이드를 가지는 SEQ ID NO:22을 포함하는 검사 서열 및 정제 및 특성을 나타낸다.
도 16 는 N1-U-SATE 뉴클레오타이드를 가지는 SEQ ID NO:23를 포함하는 GFP에 대한 RNAi 및 24 시간에서 GFP의 발현의 억제를 보여주는 용량 반응 곡선을 나타낸다.
도 17 는 N1-U-SATE 뉴클레오타이드를 가지는 SEQ ID NO:23를 포함하는 GFP에 대한 RNAi 및 48 시간에서 GFP의 발현의 억제를 보여주는 용량 반응 곡선을 나타낸다.
도 18 는 세포에서 GFP RNAi 억제를 나타낸다.
도 19 는 AS-10 N1-SATE(SEQ ID NO:24)의 HPLC 정제를 나타낸다.
도 20 는 3S-9 N1-SATE(SEQ ID NO:25)에 대한 HPLC 정제 결과를 나타낸다.
도 21 는 변성 젤분석(denaturing gel analysis)에서 S 및 AS N1-SATE 올리고뉴클레오타이드의 정제를 나타낸다.
도 22 는 정제된 S-9N1-SATE (SEQ ID NO:25) 및 AS-10-N1-SATE (SEQ ID NO:24)가 dsRNB를 형성함을 나타낸다.
도 23 는 다양한 siRNA 억제제 및 농도의 존재에서 24 시간 GFP 발현 측정을 나타낸다(SEQ ID NOs: 24 및 25).
도 24 는 다양한 siRNA 억제제 및 농도의 존재에서 48 시간 GFP 발현 측정을 나타낸다(SEQ ID NOs: 24 및 25).
도 25 는 다양한 siRNA 억제제 및 농도의 존재에서 48 시간 GFP 발현 측정을 나타낸다(SEQ ID NOs: 24 및 25).
도 26 는 전하 보호된 siRNA 제형을 이용한 발현 억제를 나타낸다.
도 27 는 테스터 N2-SATE 포스포트리에스테르 올리고뉴클레오타이드의 합성을 나타낸다(SEQ ID NO:21).
도 28 는 9개의 전하 중화 모이어티를 포함하는 SEQ ID NO:25의 정제를 나타낸다.
도 29 는 15개의 전하 중화 모이어티를 포함하는 SEQ ID NO:25의 정제를 나타낸다.
도 30 는 SEQ ID NO:25의 보호기제거 반응을 나타낸다.
도 31 는 GFP 에 대하여, 21 mer 전하-보호된 올리고뉴클레오타이드(SEQ ID NO:23)를 이용한 RNAi 반응을 나타낸다.
도 32 는 본 개시의 전하-보호기를 이용한 전하-보호된 올리고뉴클레오타이드(SEQ ID NO:23)가 염수에서 가용성임을 나타낸다.
상세한 설명
본 명세서 및 첨부된 청구 범위에서 사용된, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥에서 달리 분명히 기재하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "PTD"의 언급은 다수의 그러한 PTDs를 포함하고 "세포"의 언급은 당업자에게 공지인 하나 이상의 세포를 포함하고 나머지도 이와 같다.
다르게 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시가 속하는 분야의 당업자가 흔히 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 등가의 방법 및 물질이 개시된 방법 및 조성물의 실시에서 사용될 수 있지만, 예시적 방법, 기기 및 물질이 본 명세서에 기재된다.
또한, "또는"의 사용은 다르게 언급되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 유사하게, "포함한다", "포함하고", "포함하는", "포함된", "포함되고" 및 "포함되는"은 서로 대체가능하며 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
다양한 구체예의 설명이 용어 "포함하는"을 사용하는 경우에, 당업자는 일부 특정한 실시예에서, 한 구체예가 문구 "~를 필수적으로 하여 구성되는" 또는 "~로 구성되는"을 이용하여 대안적으로 기재될 수 있음을 이해할 것임이 더욱 주지된다.
상기 및 본문 전체에 걸쳐 논의되는 공개들은 오로지 이들의 개시가 본 출원의 출원 일자 이전에 있기 때문에 제공된다. 이중 어떤 것도 본 발명자가 이전 개시의 덕분으로 이러한 개시를 선행할 자격이 있음을 인정하는 것으로 간주되지 않는다.
특정 생활성 물질을 세포의 내부로 수송하는 능력은 세포막에 의해 야기되는 생물학적 이용도 제한으로 인해 문제가 된다. 세포의 원형질 막은 충분히 비-극성이고 크기가 대략 500 달톤(Dalton)보다 적은 부류에 비해 그렇지 않은 분자의 세포내 흡수를 제한하는 장벽을 형성한다. 단백질의 세포 내부화(internalization)를 증진시키려는 기존의 노력은 단백질과 수용체 리간드를 융합하는 것(Ng et al ., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:10706-11, 2002) 또는 폐쇄된 리포좀 운반체로 이들을 함입(packaging)하는 것(Abu-Amer et al ., J. Biol. Chem. 276:30499-503, 2001)에 집중되어 있었다. 그러나, 이들 기술은 자주 불량한 세포 흡수 및 세포내섭취 경로로의 세포내 격리를 야기한다.
치료적 능력을 가진 다른 고도로 하전된 핵산 분자도 동일한 수송 장벽에 부딪힌다. 예를 들어, RNA 앱타머(aptamer)는 격리(sequester) 및 억제 단백질에 결합하는 높은 능력을 가지는데, 그러나 >10,000 달톤이고 고도로 하전된 경우에, 이들은 스스로 세포에 들어갈 수 있는 능력이 없거나 제한된다. 본 개시의 방법 및 조성물은 RNA 앱타머, siRNA 및 DNA 벡터의 세포내 수송을 가능하게 한다.
siRNA의 수송은 이들이 가진 음이온성 전하 및 ~14,000 달톤의 큰 크기로 인해, 인간을 비롯한 포유류에서 거대한 도전이다. 그러나, 양이온으로 하전된 펩티드 및 단백질은 올리고뉴클레오타이드에서의 진전을 야기했다. 예를 들어, 단백질 형질 전환 도메인(PTDs)을 핵산에 연결하여 올리고뉴클레오타이드 수송에 일부 진전을 제공했다. 그러나, 심지어 이들 경우에도 siRNA 및 PTD의 음이온성 및 양이온성 전하는, 개별적으로, 자주 서로를 중화시켜 양이온성 전하를 가짐으로써 증진된 흡수를 다시 감소시킨다.
본 개시는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드에 연관된 전하를 보호/중화함으로써 핵산 분자의 세포성 흡수를 촉진하고 개선하는 방법 및 조성물을 제공한다. 일부 구체예에서, 본 개시의 조성물은 흡수를 촉진하도록 핵산에 양이온성 전하를 제공한다. 다른 구체예에서, 추가적인 양이온으로 하전된 모이어티가 핵산 분자에 연결될 수 있다.
본 개시는 인간 질병을 선택적으로 치료하고 연구를 촉진하기에 유용한 서열 특이적인 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 수송을 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 개시의 조성물 및 방법은 더욱 효과적으로 siRNAs, RNA 앱타머, 및 DNA 벡터를 비롯한 올리고뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드를 대상 및 세포에 수송한다. 본 개시는 이러한 RNAi 구조체의 수송을 어렵거나 불가능하게 만드는 크기 및 전하 제한을 극복한다. 핵산(예를 들면, dsRNA)상의 음이온성 전하를 가역적으로 중화하는 것을 통해, 본 개시에 따른 포스포트리에스테르 및/또는 포스포티오에이트 보호기를 포함하는 구조체는 핵산을 시험관내 및 생체내에서 세포로 수송할 수 있다.
본 개시는 전하 중화 모이어티(예를 들면, 포스포트리에스테르 및/또는 포스포티오에이트 보호기)를 포함하는 핵산 구조체를 제공한다. 상기 구조체는 세포의 형질 전환 및 세포 조절에 유용한 조성물을 더욱 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 막 수송 기능을 포함하는 형질 전환 모이어티 도메인을 포함할 수 있고 핵산 상의 음이온성 전하를 가역적으로 중화하기에 충분한 핵산 결합 도메인을 더욱 포함할 수 있다.
본 명세서에 설명한 바와 같이 하나 이상의 제거가능한(예를 들면, 가역적으로 부착된) 전하 중화 모이어티를 핵산에 추가하는 것은 세포 형질 전환을 효과적으로 촉진할 수 있다. 서열 조성에 관계없이 임의의 핵산은 본 개시의 전하 중화 모이어티에 의해 변형될 수 있다.
본 개시는, 일부 구체예에서, 세포막 침입 및 엑소- 및 엔도뉴클레아제 분해에 대한 내성을 증진시키는 화학적 및 생물리적 특성에 기여하는 하나 이상의 생-가역적인 전하 중화 모이어티를 가지는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 본 개시는 또한 생-가역적인 보호된 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 합성을 위한 아미디트 시약을 제공한다. 더욱이, 이들 보호기는 합성 공정 동안 안정하다.
하나 이상의 생-가역적인 전하 중화 모이어티를 가지는 본 개시의 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 때때로 전구(pro)-올리고뉴클레오타이드 또는 전구-폴리뉴클레오타이드로 지칭된다. 본 개시의 구체예에서, 전구-올리고뉴클레오타이드는 세포의 지질 이중층 침입 능력은 물론이고 생체내 및 시험관내 엑소- 및 엔도뉴클레아제에 대한 내성의 개선을 가능하게 한다. 세포에서, 전하 중화 모이어티는 티오-에스테라아제의 작용 또는 환원 조건, 효소 활성(예를 들면, 내부 카복시에스테라아제)등에 의해 제거되어, 특정한 내부 핵산에 혼성화(hybridization)되거나 및/또는 이 핵산에 대한 친화도를 가지게 할 수 있는 생물학적으로 활성인 올리고뉴클레오타이드 화합물을 수득할 수 있다.
전하 중화 모이어티는 발현의 차단 또는 하향-조절(down-regulation)을 위해 특별히 설계된 유전자 또는 RNA 메신저(messenger)에 속하는 표적 서열에 상보적인 서열의 혼합된 분자 또는 합성 DNA 또는 RNA의 안티센스(antisense) 올리고뉴클레오타이드와 함께 사용될 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 표적 메신저 RNA 서열 또는, 대안적으로 표적 DNA 서열을 목표로 할 수 있고, 이들에 상보적인 핵산에 혼성화될 수 있다. 따라서, 이들 분자는 효과적으로 유전자 발현을 차단하거나 하향-조절한다.
전하 중화된 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 또한 특정 이중선(bicatenary) DNA 영역(동종퓨린/동종피리미딘 서열 또는 퓨린/피리미딘이 풍부한 서열)을 목표로 할 수 있고 따라서 삼중 나선을 형성할 수 있다. 특정한 서열에서 삼중 나선의 형성은 유전자 발현을 조절하거나 다르게는 제어하는 단백질 인자의 상호작용을 차단할 수 있고/또는 수득되는 올리고뉴클레오타이드가 활성의 기능기를 가지게 되는 경우 비가역적인 손상이 특정한 핵산 부위에 일어나도록 촉진할 수 있다.
본 명세서는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 세포로의 수송을 촉진하기 위해 사용될 수 있는 핵산 구조체, 및 이러한 구조체의 제조 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 핵산 구조체는 RNA 및/또는 DNA와 같은 핵산에 연관된 포스포디에스테르 음이온성 전하를 중화시키는 하나 이상의 전하 중화 모이어티를 포함한다. 일단 세포내에 들어가면, 전하 중화 모이어티는 디설파이드 결합 환원, 에스테르 가수분해 또는 다른 효소-매개 과정(예를 들면, 티오-에스테라아제 활성)을 비롯한 세포내 과정에 의해 구조체로부터 제거될 수 있다. 다른 구체예에서, 하나 이상의 전하 중화 모이어티를 포함하는 핵산 구조체는 하나 이상의 형질 전환 도메인 가령, 단백질 형질 전환 도메인(PTD)을 더욱 포함한다. 예를 들어, PTD는 핵산 구조체를 포함하는 올리고뉴클레오타이드(예를 들면, RNA 또는 DNA)에, 가령 5' 및/또는 3' 말단에 유리 티올 기를 통해 직접 결합될 수 있다. 예를 들어, PTD는 디설파이드 결합과 같은 생물학적으로 민감하고 가역적인 방식으로 구조체에 연결될 수 있다. 이러한 접근법은 어떠한 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 길이에도 적용될 수 있고 RNA(예를 들면, siRNA, RNA 앱타머) 또는 DNA를 세포 내로 수송할 수 있게 할 것이다.
또 다른 구체예에서, 핵산 구조체는 가역적인 보호기에 연결된 염기성 기 가령, 구아니듐 기(상단부(head group) 아르기닌과 유사, PTD의 활성 성분)를 포함할 수 있고 이를 통해 PTD에 대한 수요를 제한할 수 있다.
따라서, 본 명세서는 세포막을 넘어 핵산 서열을 수송하기 위해 전하 중화 모이어티를 포함하도록 합성된 뉴클레오타이드(예를 들면, RNA 또는 DNA)를 제공한다. 구조체는 또한 예를 들어, 염기성 기를 내포하는 하나 이상의 형질 전환 도메인 및/또는 보호기를 포함할 수 있다. 일단 세포내로 들어가면 핵산 구조체의 올리고뉴클레오타이드/폴리뉴클레오타이드는 환원 환경에 기반하여 가수분해 또는 다른 효소 활성 (예를 들면, 티오에스테라아제 활성)을 통해 비보호된/야생형 올리고뉴클레오타이드/폴리뉴클레오타이드로 복귀한다.
분리된 전하 보호된 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 구조체는 전하 중화 모이어티를 가지는 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 가리킨다.
전하-중화된 올리고뉴클레오타이드는 하기 일반식을 가지는 포스포라미디트 구조를 이용하여 합성될 수 있다:
Figure pct00010
U, T, C 또는 A 뉴클레오타이드를 포함하는 상기 구조는 RNA 합성장치에서 올리고뉴클레오타이드의 합성에 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용된 음이온성 전하 중화 모이어티 또는 기(group)는 이것이 연결된 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 전체 순(net) 음이온성 전하를 감소시킬 수 있는 분자 또는 화학기(chemical group)를 가리킨다. 본 명세서에 사용된 아미노-S-아실-티오 알킬 모이어티는 음이온성 전하-중화 모이어티이다. 이들 전하-중화 모이어티는 가역적이다. 하나 이상의 음이온성 전하-중화 모이어티 또는 기는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드와 연결될 수 있고 여기서 각각은 독립적으로 해당 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 음이온성 전하를 감소시키고 또는 양이온성 전하를 증가시키는데 기여한다. 예를 들어, 하나 이상의 전하-중화 모이어티는 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있고 "보호된 올리고뉴클레오타이드"는 하나 이상의 양이온성 형질 전환 도메인(예를 들면, PTDs)과 연결되어 구조체의 전체 순 음이온성 전하가 감소되거나 구조체의 전체 순 전하가 중성이 되거나 구조체의 전체 순 전하가 전하 중화 모이어티 및/또는 PTD가 없는 올리고뉴클레오타이드에 비해 상대적으로 양이온성이 된다.
본 개시는 전하-중화 모이어티, 이러한 전하-중화 모이어티를 포함하는 뉴클레오타이드 및 이러한 전하-중화 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 한 구체예에서, 전하 중화 모이어티는 다음 일반식을 가진다:
Figure pct00011
(본 명세서에서는 일반적으로 N-SATE로 지칭됨) 여기서 R1은 존재하거나 존재하지 않을 수 있으며, R1이 존재하는 경우, R1은 알킬, 치환된 알킬, 알콕시, 치환된 알콕시, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로사이클릭, 또는 치환된 헤테로사이클릭으로 이루어진 군에서 선택되고;
여기서 R2는 존재하거나 존재하지 않을 수 있으며, R2가 존재하는 경우, R2는 1 내지 7개 원자 알킬, 치환된 알킬, 알콕시, 치환된 알콕시, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로사이클릭, 또는 치환된 헤테로사이클릭으로 이루어진 군에서 선택되고, 여기서 X는 전하-중화 모이어티가 핵산 백본에 연결된 부분이고, 여기서 R3은 H, H2 또는 보호기이다. 한 구체예에서, 전하 중화 모이어티(N-SATE)는
Figure pct00012
를 포함하고
여기서 R1은 존재하거나 존재하지 않을 수 있으며, R1이 존재하는 경우, R1은 알킬, 치환된 알킬, 알콕시, 치환된 알콕시, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로사이클릭, 또는 치환된 헤테로사이클릭으로 이루어진 군에서 선택되고;
여기서 R2는 존재하거나 존재하지 않을 수 있으며, R2가 존재하는 경우, R2는 1 내지 7개 원자 알킬, 치환된 알킬, 알콕시, 치환된 알콕시, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로사이클릭, 또는 치환된 헤테로사이클릭으로 이루어진 군에서 선택되고, 여기서 X는 핵산 백본이다.
한 구체예에서, 전하 중화 모이어티는 다음으로 이루어진 군에서 선택된다:
Figure pct00013
,
Figure pct00014
, 및
Figure pct00015
.
그리고 또 다른 구체예에서, 보호기를 포함하는 전하-중화 모이어티(N-SATE)는 다음 중에서 선택된다:
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Alloc-2-아미노- Alloc-3-아미노- Alloc-3-아미노-
2,2-디메틸- 2,2-디메틸- 2,2-디메틸-
에타노익 S-아실 프로파닉 S- 프로파닉 S-
티오에틸 아실 티오에틸 아실 티오부틸
포스포트리에스테르 포스포트리에스테르 포스포트리에스테르
(Alloc N1-SATE) (Alloc-N2-SATE) (Alloc-N2-SATB)
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Alloc-2-아미노- 페닐아세틸-3- 페닐아세틸-4-
2,2-디메틸- 아미노-2,2-디메틸 아미노-2,2-
부타노익 S-아실 프로파닉 S-아실 디메틸-
티오에틸 티오에틸 포스포- 부타노익 S-아실
포스포트리에스테르 트리에스테르 티오에틸 포스-
(Alloc-N3-SATE) (PhAc-N2-SATE) 트리메스테르
(PhAc-N3-SATE)
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
아세틸-알라닌-2- 아세틸-알라닌-3- Fmoc-2-아미노-2-
아미노-2,2-디메틸 디메틸-프로파닉 메틸-에타노익 S-
S-아실 티오에틸 S-아실 티오에틸 아실 티오에틸
포스포트리에스테르 포스포트리에스테르 포스포트리에스테르
(Ac-Ala-N1-SATE) (Ac-Ala-N2-SATE) (Fmoc-N0-SATE)
Figure pct00025
Figure pct00026
Fmoc-2-아미노-2,2- Fmoc-3-아미노-2,2-
디메틸-에타노익 디메틸-프로파닉
S-아실 티오에틸 S-아실 티오에틸
포스포트리에스테르 포스포트리에스테르
(Fmoc-N1-SATE) (Fmoc-N2-SATE)
다양한 화학기의 간략한 설명이 하기에 기재된다. 기의 선택은 당업자에게 매우 명백할 입체 장애(steric hindrance)를 기반으로 한다. 또한, 최종 구조는 일반 양이온성 전하를 가지거나 중성이어야 한다. 전술한 조건에 맞는 이들 기의 선택은 다시 당업자에게 쉽게 명백할 것이다.
알킬 기는 직쇄형, 분지형 및 환형 알킬 기를 포함한다. 알킬 기는 1 내지 20개의 탄소 원자를 가지는 부류를 포함한다. 알킬 기는 1 내지 3개의 탄소 원자를 가지는 소형 알킬 기를 포함한다. 알킬 기는 4-10개의 탄소 원자를 가지는 중간 길이 알킬 기를 포함한다. 알킬 기는 10개 이상의 탄소 원자, 특히 10-20개의 탄소 원자를 가지는 긴 알킬 기를 포함한다. 환형 알킬 기는 하나 이상의 고리를 가지는 알킬 기를 포함한다. 환형 알킬 기는 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9- 또는 10-원 탄소 고리를 가지는 알킬 기 및 특히 3-, 4-, 5-, 6-, 또는 7-원 고리를 가지는 알킬 기를 포함한다. 환형 알킬 기 내의 탄소 고리는 또한 알킬 기를 지닐 수 있다. 환형 알킬 기는 이환형 및 삼환형 알킬 기를 포함할 수 있다. 알킬 기는 선택적으로 치환된 알킬 기를 포함할 수 있다. 치환된 알킬 기는 그 중에서도 다시 선택적으로 치환될 수 있는 아릴 기로 치환된 알킬 기를 포함한다. 구체적인 알킬 기는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소-프로필, 사이클로프로필, n-부틸, s-부틸, t-부틸, 사이클로부틸, n-펜틸, 분지형-펜틸, 사이클로펜틸, n-헥실, 분지형 헥실, 및 사이클로헥실 기를 포함하며, 상기 모두는 선택적으로 치환된다.
알케닐 기는 직쇄형, 분지형 및 환형 알케닐 기를 포함한다. 알케닐 기는 1, 2개 또는 그 이상의 이중 결합을 가지는 알케닐 기 및 둘 이상의 이중 결합이 복합된 이중 결합인 알케닐 기를 포함한다. 알케닐 기는 2 내지 20개의 탄소 원자를 가지는 알케닐 기를 포함한다. 알케닐 기는 2 내지 3개의 탄소 원자를 가지는 소형 알킬 기를 포함한다. 알케닐 기는 4-10개의 탄소 원자를 가지는 중간 길이 알케닐 기를 포함한다. 알케닐 기는 10개 이상의 탄소 원자, 특히 10-20개의 탄소 원자를 가지는 긴 알케닐 기를 포함한다. 환형 알케닐 기는 하나 이상의 고리를 가지는 알케닐 기를 포함한다. 환형 알케닐 기는 이중 결합이 고리내에 존재하거나 고리에 부착된 알케닐 기 내에 존재하는 알케닐 기를 포함한다. 환형 알케닐 기는 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9- 또는 10-원 탄소 고리 및 특히 3-, 4-, 5-, 6- 또는 7-원 고리를 가지는 알케닐 기를 포함한다. 환형 알케닐 기 내의 탄소 고리는 또한 알킬 기를 지닐 수 있다. 환형 알케닐 기는 이환형 및 삼환형 알킬 기를 포함할 수 있다. 알케닐 기는 선택적으로 치환된다. 치환된 알케닐 기는 그 중에서도 다시 선택적으로 치환될 수 있는 알킬 또는 아릴 기로 치환된 알케닐 기를 포함한다. 구체적인 알케닐 기는 에테닐, 프로프-1-에닐, 프로프-2-에닐, 사이클로프로프-1-에닐, 부트-1-에닐, 부트-2-에닐, 사이클로부트-1-에닐, 사이클로부트-2-에닐, 펜트-1-에닐, 펜트-2-에닐, 분지형 펜테닐, 사이클로펜트-1-에닐, 헥스-1-에닐, 분지형 헥세닐, 사이클로헥세닐을 포함하며, 상기 모두는 선택적으로 치환된다.
아릴 기는 하나 이상의 5- 또는 6-원 방향족 또는 헤테로방향족 고리를 가지는 기를 포함한다. 아릴 기는 하나 이상의 융합된 방향족 고리를 내포할 수 있다. 헤테로방향족 고리는 고리 내에 하나 이상의 N, O 또는 S 원자를 포함할 수 있다. 헤테로방향족 고리는 하나, 둘 또는 세 개의 N을 가지는 부류, 하나 또는 두 개의 O를 가지는 부류, 및 하나 또는 두 개의 S를 가지는 부류를 포함할 수 있다. 아릴 기는 선택적으로 치환된다. 치환된 아릴 기는 그 중에서도 다시 선택적으로 치환될 수 있는 알킬 또는 알케닐 기로 치환된 아릴 기를 포함한다. 구체적인 아릴 기는 페닐 기, 바이페닐 기, 피리디닐 기, 및 나프틸 기를 포함하며, 상기 모두는 선택적으로 치환된다.
아릴알킬 기는 하나 이상의 아릴 기로 치환된 알킬 기이고 여기서 알킬 기는 선택적으로 추가적인 치환기를 지니며 아릴 기는 선택적으로 치환된다. 구체적인 알킬아릴 기는 페닐-치환된 알킬 기, 예를 들면, 페닐메틸 기이다.
알킬아릴 기는 하나 이상의 알킬 기로 치환된 아릴 기이고 여기서 알킬 기는 선택적으로 추가적인 치환기를 지니며 아릴 기는 선택적으로 치환된다. 구체적인 알킬아릴 기는 알킬-치환된 페닐 기 가령, 메틸페닐이다.
고리는 선택적으로 치환된 사이클로알킬 기, 선택적으로 치환된 사이클로알케닐 기 또는 방향족 기일 수 있다. 고리는 3, 4, 5, 6, 7개 또는 그 이상의 탄소를 내포할 수 있다. 고리는 방향족 고리 내의 하나, 둘 또는 세 개의 탄소가 N, O 또는 S로 대체된 헤테로방향족일 수 있다. 고리는 고리 내의 하나 이상의 CH2 기가 O, N, NH, 또는 S로 대체된 헤테로알킬 또는 헤테로알케닐일 수 있다.
임의의 알킬, 알케닐 및 아릴 기의 선택적인 치환은 다음 치환기 중의 하나 이상으로 된 치환을 포함한다: 할로겐, --CN, --COOR, --OR, --COR, --OCOOR, --CON(R)2, --OCON(R)2, --N(R)2, --NO2, --SR, --SO2R, --SO2N(R)2 또는 --SOR 기. 알킬 기의 선택적인 치환은 하나 이상의 알케닐 기, 아릴 기 또는 둘 모두로의 치환을 포함하고, 여기서 알케닐 기 또는 아릴 기는 선택적으로 치환된다. 알케닐 기의 선택적인 치환은 하나 이상의 알킬 기, 아릴 기, 또는 둘 모두로의 치환을 포함하고, 여기서 알킬 기 또는 아릴 기는 선택적으로 치환된다. 아릴 기의 선택적인 치환은 하나 이상의 알킬 기, 알케닐 기, 또는 둘 모두로의 아릴 고리의 치환을 포함하고, 여기서 알킬 기 또는 알케닐 기는 선택적으로 치환된다.
알킬, 알케닐 및 아릴 기에 대한 선택적인 치환기는 그 중에서도 다음을 포함한다:
--COOR 여기서 상기 R은 수소 또는 알킬 기 또는 아릴 기이고, 더욱 상세하게는 상기 R은 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 또는 페닐 기이고, 상기 모두는 선택적으로 치환되고;
--COR 여기서 상기 R은 수소, 또는 알킬 기 또는 아릴 기이고, 더욱 상세하게는 상기 R는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 또는 페닐 기이고, 상기 모든 기는 선택적으로 치환되고;
--CON(R)2 여기서 각각의 R은, 서로 다른 R과 독립적으로, 수소 또는 알킬 기 또는 아릴 기이고, 더욱 상세하게는 상기 R은 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 또는 페닐 기이고 상기 모든 기는 선택적으로 치환되고; R 및 R은 하나 이상의 이중 결합을 내포할 수 있는 고리를 형성할 수 있고;
--OCON(R)2 여기서 각각의 R은, 서로 다른 R과 독립적으로, 수소 또는 알킬 기 또는 아릴 기이고, 더욱 상세하게는 상기 R은 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 또는 페닐 기이고, 상기 모든 기는 선택적으로 치환되고; R 및 R은 하나 이상의 이중 결합을 내포할 수 있는 고리를 형성할 수 있고;
--N(R)2 여기서 각각의 R은, 서로 다른 R과 독립적으로, 수소, 또는 알킬 기, 아실 기 또는 아릴 기이고, 더욱 상세하게는 상기 R은 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 또는 페닐 또는 아세틸 기 상기 모두는 선택적으로 치환되고; 또는 R 및 R은 하나 이상의 이중 결합을 내포할 수 있는 고리를 형성할 수 있다.
--SR, --SO2R, 또는 --SOR 여기서 상기 R은 알킬 기 또는 아릴 기이고, 더욱 상세하게는 상기 R은 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 페닐 기이고, 상기 모두는 선택적으로 치환되고; -SR, R에 있어서, R은 수소일 수 있고;
--OCOOR 여기서 상기 R은 알킬 기 또는 아릴 기이고;
--SO2N(R)2 여기서 상기 R은 수소, 알킬 기, 또는 아릴 기이고 R 및 R은 고리를 형성할 수 있고;
--OR 여기서 상기 R=H, 알킬, 아릴, 또는 아실이고; 예를 들어, R은 --OCOR*를 수득하는 아실일 수 있고, 상기 R*는 수소 또는 알킬 기 또는 아릴 기이고, 더욱 상세하게는 상기 R*는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 또는 페닐 기이고, 상기 모든 기는 선택적으로 치환된다.
구체적인 치환된 알킬 기는 할로알킬 기, 특히 트리할로메틸 기 및 구체적으로는 트리플루오로메틸 기를 포함한다. 구체적인 치환된 아릴 기는 모노-, 디-, 트리, 테트라- 및 펜타할로-치환된 페닐 기; 모노-, 디-, 트리-, 테트라-, 펜타-, 헥사-, 및 헵타-할로-치환된 나프탈렌 기; 3- 또는 4-할로-치환된 페닐 기, 3- 또는 4-알킬-치환된 페닐 기, 3- 또는 4-알콕시-치환된 페닐 기, 3- 또는 4-RCO-치환된 페닐, 5- 또는 6-할로-치환된 나프탈렌 기를 포함한다. 더욱 상세하게는, 치환된 아릴 기는 아세틸페닐 기, 특히 4-아세틸페닐 기; 플루오로페닐 기, 특히 3-플루오로페닐 및 4-플루오로페닐 기; 클로로페닐 기, 특히 3-클로로페닐 및 4-클로로페닐 기; 메틸페닐 기, 특히 4-메틸페닐 기, 및 메톡시페닐 기, 특히 4-메톡시페닐 기를 포함한다.
올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드가 PTD에 연결된 경우에, 음이온으로 하전된 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 전하 중화는 양이온으로 하전된 PTD를 유리시켜 세포 표면과 생산적으로 상호작용하게 하고 또한 결합체(conjugate)의 응집을 방지한다. 예를 들어, 노출된 양이온성으로 하전된 PTD는 세포 표면과 상호작용하고 대음세포작용(macropinocytosis)을 유도한다. 올리고뉴클레오타이드는 세포질 내로 방출된다. 일단 세포내로 들어가면, 전하 중화기(예를 들면, 아미노-S-아실 티오 알킬)는 세포성 과정, 가령, 환원 효소, 산화 효소, 환원제, 산화제 또는 에스테라아제에 의해 절단될 수 있고, 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 비보호는 핵산을 이의 자연적인 배열 형태로 복귀할 수 있게 한다.
본 명세서에 사용된, 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 도메인과 상호교환적으로 사용되는 핵산 도메인은 임의의 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드(예를 들면, 리보자임, 안티센스 분자, siRNA, dsRNA, 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드 등)일 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 비록 일부 경우에는, 예를 들면, 포스포라미데이트, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 또는 O-메틸포스포로아미디트 결합(Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press를 참조)를 비롯한 대안적인 백본; 및 펩티드 핵산 백본 및 결합을 가질 수 있는 핵산 유사체가 포함되지만 일반적으로 포스포디에스테르 결합을 내포한다. 다른 유사 핵산은 U.S. Pat. Nos. 5,235,033 및 5,034,506, 및 Chapters 6 and 7, ASC Symposium Series 580, Carbohydrate Modifications in Antisense Research, Sanghui & Cook, eds에 기재된 것들을 비롯하여 양(positive)의 백본; 비-이온성 백본, 및 비-리보오스 백본을 가진 핵산을 포함한다. 하나 이상의 카보사이클릭 당(sugar)을 내포하는 핵산이 또한 핵산의 하나의 정의에 포함된다. 많은 이유로 인해, 예를 들면 생리적인 환경에서 이들 분자의 안정성 및 반감기를 증가시키기 위해 리보오스-포스페이트 백본을 변형시킬 수 있다. 자연 발생적 핵산 및 유사체의 혼합물은 용어 올리고뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드에 의해 포괄되며; 대안적으로, 상이한 핵산 유사체의 혼합물, 및 자연 발생적 핵산 및 유사체의 혼합물이 만들어질 수 있다. 또한, RNN, RNB, DNA, 및 RNA의 혼성물(hybrid)이 사용될 수 있다. dsDNA, ssDNA, dsRNA, siRNA이 용어 올리고뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드에 의해 포괄된다.
폴리뉴클레오타이드는 임의 개수의 공유적으로 결합된 뉴클레오타이드 단량체로 만들어진 중합체 화합물을 가리키며, DNA 및 RNA 분자와 같은 핵산 분자를 포함하며, 단일- 이중- 및 삼중-가닥으로 이들 분자를 포함하고, 전형적으로 비교적 작은 수(약 30을 넘지 않는, 예를 들면, 약 5-10개, 10-20개 또는 20-30개)의 뉴클레오타이드 염기를 가지는 것으로 구별되는 "올리고뉴클레오타이드"로 흔히 지칭되는 폴리뉴클레오타이드의 군을 포함하는 것이 분명하게 의도된다.
본 명세서에 사용된, 용어 "siRNA"은 "짧은 간섭 RNA(short interfering RNA)"에 대한 약어이고, 또한 종종 "소형 간섭 RNA(small interfering RNA)" 또는 "침묵 RNA(silencing RNA)"으로 공지이며, 진핵 생물에서 전사후(post-transcriptional) 서열-특이적 유전자 침묵을 야기하는 RNA 간섭(RNAi) 경로에 관여하는 약 19-25개 뉴클레오타이드-길이의 이중-가닥 리보핵산 분자의 부류를 가리킨다.
용어 "dsRNA"은 "이중-가닥 RNA"에 대한 약어이고 본 명세서에서 사용된 바와 같이 두 개의 상보적 RNA 가닥을 가지는 리보핵산 분자를 가리키며 상기 분자는 적어도 약 26개의 뉴클레오타이드 길이이고, 더욱 전형적으로는 적어도 약 50 내지 약 100개의 뉴클레오타이드 길이로서 siRNA와는 분명하게 길이로 구별된다.
상기 기재된 바와 같이, 핵산은 유전체 및 cDNA를 모두 포함하는 DNA, RNA 또는 혼성체(hybrid)일 수 있고, 여기서 핵산은 데옥시리보- 및 리보-뉴클레오타이드의 조합, 및 우라실, 아데닌, 티민, 시토신, 구아닌, 이노신, 잔틴 하이포잔틴, 이소시토신, 이소구아닌, 등을 비롯한 염기의 조합을 내포할 수 있다. 본 명세서에서 사용된, 용어 "뉴클레오사이드"은 뉴클레오타이드 및 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드 유사체, 및 아미노 변형된 뉴클레오사이드와 같은 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 또한, "뉴클레오사이드"은 비-자연 발생적 유사체 구조를 포함한다. 따라서, 예를 들면 각각 염기를 내포하는 개별적인 펩티드 핵산의 단위는 본 명세서에서 뉴클레오사이드로 지칭된다.
본 명세서에 기재된 핵산 구조체의 핵산 도메인은 임의의 특정 서열에 제한되지 않는다. 진단, 치료제 및 연구에 유용한 임의 개수의 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드가 본 개시의 방법 및 조성물에서 사용될 수 있다. 당업자는 다양한 출처에서 올리고뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드를 입수할 수 있다. 예를 들어, 유전체의 단편은 분리될 수 있고 분리된 폴리뉴클레오타이드는 아미노 S-아실 티오 알킬 전하 중화 모이어티를 이용하여 전체의 순 음이온성 전하를 낮추기 위해 본 개시에 따라 변형될 수 있거나 예를 들어, 당해 분야에 공지인 핵산 합성 기술을 이용하는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 연장을 위한 원료 물질로 사용될 수 있다.
올리고뉴클레오타이드를 제조하기 위한 포스포라미디트 화학의 실시는 M. Caruthers 및 S. Beaucage 등의 공개 문서로부터 공지이다. 미국 특허: Nos. 4,458,066, 4,500,707, 5,132,418, 4,415,732, 4,668,777, 4,973,679, 5,278,302, 5,153,319, 5,218,103, 5,268,464, 5,000,307, 5,319,079, 4,659,774, 4,672,110, 4,517,338, 4,725,677 및 Re. 34,069, 상기 각각은 본 명세서에 참고 문헌으로 포함되며, 올리고뉴클레오타이드의 합성 방법을 기재한다. 추가적으로, 포스포라미디트 화학의 실시는 Beaucage 및 Iyer에 의해 Beaucage, S. L. and Iyer, R. P., Tetrahedron, 1992, 48, 2223-2311 및 Beaucage, S. L. and Iyer, R. P., Tetrahedron, 1993, 49, 6123-6194, 또는 이들 문서에 언급된 참고문헌에서 체계적으로 리뷰되었고, 상기 모두는 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다.
핵산 합성 장치는 시판되며 이들의 사용은 바람직할 수 있는 적정한 길이의 거의 어떠한 올리고뉴클레오타이드의 생성에도 효과적인 것으로 당업자에 의해 일반적으로 이해된다.
포스포라미디트 화학의 실시에서 유용한 5'OH 당 차단기는 트리틸, 모노메톡시트리틸, 디메톡시트리틸 및 트리메톡시트리틸, 특히 디메톡시트리틸(DMTr)이다. 포스포라미디트 화학의 실시에서 유용한 포스파이트 활성화기, 즉, NR2는 디알킬 치환된 질소 기 및 질소 헤테로사이클이다. 한 접근법은 디-이소프로필아미노 활성화기의 사용을 포함한다.
올리고뉴클레오타이드는 머메이드(Mermade)-6 고체상 자동화 올리고뉴클레오타이드 합성 장치 또는 임의의 흔히 사용가능한 자동화 올리고뉴클레오타이드 합성 장치에 의해 합성될 수 있다. 예를 들어, M. Caruthers, Oligonucleotides: Antisense Inhibitors of Gene Expression., pp. 7-24, J. S. Cohen, ed. (CRC Press, Inc. Boca Raton, Fla., 1989) 또는 Oligonucleotide synthesis, a practical approach, Ed. M. J. Gait, IRL Press, 1984; "Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach", Ed. F. Eckstein, IRL Press, 1991에 기재된 트리에스테르, 포스포라미디트, 또는 수소 포스포네이트 커플링(coupling) 화학이 이들 합성 장치에서 활용되어 바람직한 올리고뉴클레오타이드를 제공한다. 예를 들어, Journal of American Chemical Society, 1990, 112, 1253-1255에 기재된 보케이지(Beaucage) 시약, 또는 Beaucage et al., Tetrahedron Letters,1981, 22, 1859-1862에 기재된 원소 황이 포스포라미디트 또는 수소 포스포네이트 화학과 함께 사용되어 치환된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오타이드를 제공한다. 예를 들어, 본 명세서에서 언급한 보호기를 포함하는 시약은 보호가 요구되는 수많은 적용 분야에서 사용될 수 있다. 그러한 적용 분야는 고체상 및 용액상 모두의, 올리고-합성, 폴리뉴클레오타이드 합성 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드의 유사체의 사용이 또한 본 개시에 포함되며 본 명세서에 개시된 보호기를 내포하는 올리고뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오사이드 유사체를 제공한다. 따라서 용어 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드, 데옥시뉴클레오사이드 및 데옥시뉴클레오타이드는 일반적으로 본 명세서에 기재된 부류와 같은 유사체를 포함한다. 이들 유사체는 자연 발생적 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드와 동일한 일부 구조적인 특징을 가지므로 올리고뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오사이드 서열에 포함되는 경우에, 이들은 용액에서 자연 발생적 올리고뉴클레오타이드 서열과 혼성될 수 있는 분자들이다. 전형적으로, 이들 유사체는 자연 발생적 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드로부터 염기, 리보오스 또는 포스포디에스테르 모이어티를 교체 및/또는 변형시켜 파생된다. 이러한 변화는 원하는 대로 혼성 형태를 안정화하거나 탈안정화하기 위해서거나 상보적 핵산 서열과의 혼성에 특이성을 증진하기 위해서 특별히 고안될 수 있다.
예를 들어, 올리고뉴클레오타이드에 포함되기 위해 구조기가 선택적으로 뉴클레오사이드의 리보오스 또는 염기에, 가령, 리보오스 2'-0 위치에 메틸, 프로필 또는 알릴 기가, 또는 2'-O 기를 치환하는 플루오로 기가, 또는 리보뉴클레오사이드 염기 상에 브로모 기가 첨가된다. 포스포라미디트 화학과 함께 사용하기 위한, 2'-데옥시 아미디트, 2'-O-메틸 아미디트 및 2'-O-하이드록실 아미디트를 비롯한 다양한 아미디트 시약을 시중에서 구입할 수 있다. 이러한 합성을 위해 임의의 다른 수단이 또한 활용될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드의 실제적 합성은 당업자의 능력범위 내에서 행해진다. 유사한 기술을 사용하여 포스포로티오에이트, 메틸 포스포네이트 및 알킬화 유도체와 같은 다른 올리고뉴클레오타이드를 제조하는 것이 또한 공지이다. 유사한 기술 및 시판되는 변형된 아미디트 및 다공성 유리 분체(controlled-pore glass, CPG) 제품, 가령, 비오틴, Cy3, 플루오레세인, 아크리딘 또는 소랄렌-변형된 아미디트 및/또는 CPG (Glen Research, Sterling Va.로부터 입수가능)을 사용하여 형광 표지된, 비오틴화된 또는 다른 복합된 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 것이 또한 공지이다.
비록 본 명세서에 기재된 포스포트리에스테르 중화/보호기가 핵산 도메인의 음이온성 전하의 중화에 유용함에도 불구하고, 올리고뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드의 흡수를 더욱 촉진시키기 위해 보호된 핵산 도메인에 연결된 양이온으로 하전된 추가적인 모이어티가 사용될 수 있다. 진핵 세포의 원형질 막을 효율적으로 통과할 수 있는 여러 단백질의 최근 발견은 펩티드 형질 전환 도메인을 파생시키게 된 신규한 부류의 단백질의 규명을 가져왔다.
예를 들어, 아미노 S-아실 티오 알킬 모이어티(SATE)를 이용한 음이온성 핵산(예를 들면, RNA 분자)의 전하 중화가 흡수를 촉진한다. 전하 중화된 음이온성 핵산이 PTD에 연결된 구체예에서, 음이온성으로 하전된 핵산의 전하 중화는 양이온성 PTD를 유리시켜 막을 투과하게 할 뿐 아니라 순 양이온성 전하로 인해 결합체의 응집이 방지된다. PTD의 노출된 유리 양이온성 전하는 이후 효과적으로 세포 표면과 상호작용할 수 있고, 대음세포작용을 유도하고 마크로피노솜(macropinosome)에서 나와 세포질로 갈 수 있다. 일단 세포내에 들어오면, 포스포트리에스테르 및/또는 포스포티오에이트 보호기(들)은 세포질에서 구조체로부터 제거를 가능하게 하는 세포내 과정, 가령 디설파이드 결합의 환원 또는 에스테르 가수분해에 의해 제거될 수 있다. 한 구체예에서, 전하 중화기의 제거는 티오-에스테라아제의 활성을 이용한다. 예를 들어, dsRNA를 포함하는 핵산 구조체는 이후 RNAse III-유사 리보뉴클레아제인 다이서(Dicer)에 의해 가수 분해될 수 있고, 이를 통해 표적 유전자를 침묵시키는 siRNA를 방출한다.
많은 단백질 형질 전환 도메인/펩티드가 당해 분야에 공지이고 트랜스도메인(예를 들면, 화물(cargo) 분자)에 연결된 이형(heterologous) 분자의 흡수를 촉진하는 것으로 입증되었다. 이러한 형질 전환 도메인은 대음세포작용이라 지칭되는 과정을 통해 흡수를 촉진한다. 대음세포작용은 모든 세포가 수행하는 비선택적인 형태의 세포내 섭취(endocytosis)이다.
이들 단백질 중에서도 가장 잘 규명된 것은 초파리(Drosophila) 호메오단백질 안테나페디아 전사 단백질(AntHD) (Joliot et al ., New Biol. 3:1121-34, 1991; Joliot et al ., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:1864-8, 1991; Le Roux et al ., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:9120-4, 1993), 단순포진 바이러스(herpes simplex virus) 구조 단백질 VP22(Elliott and O'Hare, Cell 88:223-33, 1997), HIV-1 전사 활성화 TAT 단백질 (Green and Loewenstein, Cell 55:1179-1188, 1988; Frankel and Pabo, Cell 55:1189-1193, 1988), 및 더욱 최근에는 프리온 단백질의 양이온성 N-말단 도메인이다. 이들 단백질은 원형질 막을 통과할 수 있을 뿐 아니라 효소인 β-갈락토시다아제와 같은 다른 단백질의 부착으로 이들 복합체의 세포 흡수를 촉진하기에 충분했다. 이러한 키메라 단백질은 세포질 및 핵 내에서 생물학적으로 활성인 형태로 존재한다. 상기 과정의 특성은 이들 융합 폴리펩티드의 흡수가 빠르며, 자주 수용체 독립적인 방식으로 수분 내에 발생함을 나타냈다. 더욱이, 이들 단백질의 형질 전환은 세포 유형에 구애받지 않는 것으로 보이며 명백한 독성이 없이 배양되는 세포의 100%를 효율적으로 형질 전환시킬 수 있다(Nagahara et al., Nat. Med. 4:1449-52, 1998). 전체-길이 단백질 외에도, 단백질 형질 전환 도메인이 또한 DNA(Abu-Amer, supra), 안티센스 올리고뉴클레오타이드(Astriab-Fisher et al ., Pharm. Res, 19:744-54, 2002), 소형 분자 (Polyakov et al ., Bioconjug. Chem. 11:762-71, 2000) 및 심지어 무기 40 나노미터 철 입자(Dodd et al ., J. Immunol. Methods 256:89-105, 2001; Wunderbaldinger et al ., Bioconjug. Chem. 13:264-8, 2002; Lewin et al ., Nat. Biotechnol. 18:410-4, 2000; Josephson et al ., Bioconjug., Chem. 10:186-91, 1999)의 세포내 흡수를 유도하기 위해 성공적으로 사용되었고 이 과정에 분명한 크기 제한이 없음을 암시했다. 형질 전환 도메인을 이용한 효과적인 형질 전환은 부분적으로, PTD-화물 구조체 상의 전체 분자 전하에 의해 제한된다.
이형 분자(예를 들면, 폴리뉴클레오타이드, 소형 분자, 또는 단백질)과 단백질 형질 전환 도메인(PTD)의 융합은 농도-의존적인 방식으로 여러 상이한 세포로의 이들의 형질 전환을 유발하기에 충분하다. 더욱이, 단백질 수송을 위한 이 기술은 DNA 및 약제 기반 기술과 연관된 많은 문제를 극복하는 것으로 보인다.
PTD는 전형적으로 양이온성 성질을 가진다. 이들 양이온성 단백질 형질 전환 도메인은 이들과 연결된 화물을 지니는 지질 뗏목(lipid raft) 엔도좀 내로 이동하고 엔도좀 소포의 붕괴를 통해 이들의 화물을 세포질로 방출한다. 일반적으로, 본 개시의 핵산 구조체의 형질 전환 도메인은 융합 분자를 형질 전환할 수 있거나 융합 분자의 형질 전환을 도울 수 있는 거의 어떠한 합성 또는 자연-발생적 아미노산 서열도 될 수 있다. 전형적으로, 형질 전환 도메인은 양이온으로 하전된다. 예를 들어, 형질 전환은 본 개시에 따라 포스포트리에스테르 및/또는 포스포티오에이트 보호기 및 포스포트리에스테르 및/또는 포스포티오에이트 보호기를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드와 N-말단 또는 C-말단으로 연결된 HIV TAT 단백질이나 이의 단편과 같은 단백질 서열을 포함하는 핵산 구조체를 사용하여 성취될 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 핵산은 포스포트리에스테르 및/또는 포스포티오에이트 보호기를 포함할 수 있고 또한 이중 가닥 RNA 결합 도메인(예를 들면, DRBD)을 포함할 수 있다. 형질 전환 단백질 도메인은 예를 들어, 안테나페디아 호메오도메인 또는 HSV VP22 서열, 프리온 단백질의 N-말단 단편 또는 당해 분야에 공지인 것들 중의 적절한 형질 전환 단편일 수 있다.
전하-중화된 핵산 분자에 연결될 수 있는 PTD의 유형 및 크기는 요구되는 형질 전환의 정도를 비롯한 몇 가지 파라미터에 영향을 받을 것이다. PTDs는 세포의 적어도 약 20%, 25%, 50%, 75%, 80%, 90%, 95%, 98% 99% 또는 100%를 형질 전환시킬 수 있을 것이다. 전형적으로 형질 전환된 세포의 백분율로 표현되는 형질 전환 효율은 여러 통상적인 방법으로 결정될 수 있다.
PTDs는 세포 내의 적어도 피코몰 양의 융합 분자를 지원하는 세포 흡수 및 방출율(종종 개별적으로 k 1 및 k 2 로 지칭됨)을 보여줄 것이다. PTD 및 임의의 화물의 흡수 및 방출율은 탐지가능한-표지된 융합 분자를 이용하는 표준 역학 분석에 의해 쉽게 결정되거나, 적어도 추정될 수 있다. 전형적으로, 흡수율 대 방출율의 비는 약 5 내지 약 100사이의 범위, 최대 약 1000일 것이다.
한 구체예에서, 본 개시의 방법 및 조성물에서 유용한 PTD는 실질적인 알파-나선도(helicity)를 특징으로 하는 펩티드를 포함한다. PTD가 상당한 알파-나선도를 나타내는 경우 형질 전환이 최적화되는 것이 발견되었다. 또 다른 구체예에서, PTD는 펩티드의 적어도 한 면을 따라 실질적으로 배열된 염기성 아미노산 잔기를 내포하는 서열을 포함한다. 본 개시의 PTD 도메인은 자연 발생적 펩티드 또는 합성 펩티드일 수 있다.
본 개시의 한 구체예에서, PTD는 나선형 원기둥을 따라 아르기닌(Arg) 잔기를 가지는 강한 알파 나선 구조를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 그리고 또 다른 구체예에서, PTD 도메인은 다음의 일반식으로 표현되는 펩티드를 포함한다: B1-X1-X2-X3-B2-X4-X5-B3 (SEQ ID NO:1) 여기서 B1, B2 및 B3는 각각 독립적으로 동일하거나 상이한 염기성 아미노산이고; X1, X2, X3, X4 및 X5는 각각 독립적으로 동일하거나 상이한 알파-나선 강화 아미노산이다. 또 다른 구체예에서, PTD 도메인은 다음의 일반식으로 표현된다: B1-X1-X2-B2-B3-X3-X4-B4 (SEQ ID NO:2) 여기서 B1, B2, B3, 및 B4는 각각 독립적으로 동일하거나 상이한 염기성 아미노산이고; X1, X2, X3, 및 X4는 각각 독립적으로 동일하거나 상이한 알파-나선 강화 아미노산이다.
추가적으로 PTD 도메인은 염기성 잔기, 예를 들면, 리신(Lys) 또는 아르기닌(Arg)을 포함하고, "비틀림(kink)"을 도메인에 도입하기에 충분한 적어도 하나의 프롤린(Pro) 잔기를 더욱 포함한다. 이러한 도메인의 예는 프리온의 형질 전환 도메인을 포함한다. 예를 들어, 이러한 펩티드는 KKRPKPG (SEQ ID NO:3)를 포함한다.
한 구체예에서, 도메인은 다음의 서열로 표현되는 펩티드이다: X-X-R-X-(P/X)-(B/X)-B-(P/X)-X-B-(B/X) (SEQ ID NO:4), 여기서 X는 알라닌과 같은 임의의 알파 나선 강화 잔기이고; P/X는 프롤린이거나 앞서 명시된 것과 같은 X이고; B는 염기성 아미노산 잔기, 예를 들면, 아르기닌(Arg) 또는 리신(Lys)이고; R는 아르기닌(Arg)이고 B/X는 B이거나 앞서 명시된 것과 같은 X이다.
또 다른 구체예에서 PTD는 양이온성이고, 7 및 10개 사이의 아미노산으로 구성되며 화학식 K-X1-R-X2-X1 (SEQ ID NO:5)를 가지고, 여기서 X1는 R 또는 K이고 X2는 임의의 아미노산이다. 이러한 펩티드의 한 예는 RKKRRQRRR (SEQ ID NO:6)를 포함한다.
추가적인 형질 전환 도메인은 적어도 TAT의 아미노산 49 내지 56, 최대 약 전체-길이 TAT 서열(예를 들면, SEQ ID NO:7를 참조)을 포함하는 TAT 단편을 포함한다. TAT 단편은 단편의 알파-나선도를 증가시키기에 충분한 하나 이상의 아미노산 변화를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 상기 도입되는 아미노산 변화는 공지인 알파-나선 강화 아미노산의 추가를 포함할 것이다. 대안적으로, 아미노산 변화는 알파 나선 형성 또는 안정성을 방해하는 하나 이상의 아미노산이 TAT 단편으로부터 제거되는 것을 포함할 것이다. 더욱 특정한 구체예에서, TAT 단편은 알파-나선 강화 아미노산을 이용한 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함할 것이다. 비록 일부 경우에 재조합 DNA 접근법이 사용될 수 있지만 TAT 단편 또는 다른 PTD는 전형적으로 표준 펩티드 합성 기술에 의해 만들어질 것이다.
본 개시의 핵산 구조체에 사용될 수 있는 추가적인 형질 전환 단백질(PTDs)은 TAT 49-56 서열이 변형되어 서열 내의 적어도 두 개의 염기성 아미노산이 TAT 단편의 적어도 한 면을 따라 실질적으로 배열되는 TAT 단편을 포함한다. 예시적 TAT 단편은 TAT의 적어도 아미노산 49-56 내에 적어도 하나의 명시된 아미노산 치환을 포함하고 상기 치환은 단편의 적어도 한 면 및 전형적으로는 TAT 49-56 서열을 따라 49-56 서열의 염기성 아미노산 잔기를 배열한다.
추가적인 형질 전환 단백질은 TAT 49-56 서열이 알파-나선 강화 아미노산으로의 적어도 하나의 치환을 포함하는 TAT 단편을 포함한다. 한 구체예에서, 치환은 TAT 단편의 적어도 두 개의 염기성 아미노산 잔기가 TAT 단편의 적어도 한 면을 따라 실질적으로 배열되도록 선택된다. 더욱 특정한 구체예에서, 치환은 TAT 49-56 서열의 적어도 두 개의 염기성 아미노산 잔기가 상기 서열의 적어도 한 면을 따라 실질적으로 배열되도록 선택된다.
PTD의 추가적인 예는 AntHD, TAT, VP22, 양이온성 프리온 단백질 도메인, poly-Arg, AGRKKRRQRRR (SEQ ID NO:14), YARKARRQARR (SEQ ID NO:15), YARAAARQARA (SEQ ID NO:16), YARAARRAARR (SEQ ID NO:17), YARAARRAARA (SEQ ID NO:18), YARRRRRRRRR (SEQ ID NO:19), YAAARRRRRRR (SEQ ID NO:20) 및 기능성 단편 및 이들의 변형체를 포함한다. 본 개시는 한 구체예에서, 전하 중화된 핵산과 함께 TAT 및 poly-Arg와 같은 PTDs의 사용을 조합하는 방법 및 조성물을 제공한다. 전하 중화는 구조체에서 핵산(예를 들면, 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드)의 전반적인 음이온성 전하가 환원되고, 포스포트리에스테르 및/또는 포스포티오에이트 보호기 또는 포스포트리에스테르 및/또는 포스포티오에이트 보호기와 핵산 (즉, "화물")도메인 상의 음이온성 전하를 중화할 수 있는 결합 도메인 및/또는 단백질 형질 전환 도메인이 부재하는 동일한 핵산보다 중화되거나 더욱 양이온성이 되는것을 의미한다.
또한 키메라 PTD 도메인이 포함된다. 이러한 키메라 형질 전환 단백질은 부분적으로 적어도 두 개의 상이한 형질 전환 단백질을 포함한다. 예를 들어, 키메라 형질 전환 단백질은 두 개의 상이한 TAT 단편, 예를 들면, HIV-1에서 하나와 HIV-2에서 다른 하나, 또는 프리온 단백질에서 하나와 HIV에서 하나가 융합되어 형성될 수 있다.
PTDs는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 비롯한 임의 개수의 다른 분자와 연결되거나 융합될 수 있다. 대안적으로, 핵산 구조체 또는 PTD는 핵산 결합 도메인, 표적화 모이어티 등을 비롯한 다른 분자 개체에 결합될 수 있다. 예를 들어, 둘 이상의 PTDs(예를 들면, 1-5개, 2-4개, 전형적으로 3개)는 하나 이상의 다른 도메인(예를 들면, 핵산 도메인 또는 펩티드 링커)에 의해 이어지게 또는 격리되어 연결될 수 있다. 핵산 결합 도메인은 음이온성 전하를 환원하여 PTD 도메인의 양이온성 전하가 세포막으로 형질 전환/통과하기에 충분하도록 함으로써 핵산(보호기를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함함)을 포함하는 융합 구조체의 흡수를 촉진할 수 있다. 음이온성 전하 중화기를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드에 융합될 수 있다는 것과 핵산 결합 도메인에 더욱 연결될 수 있음이 이해될 것이다. 예시적인 RNA 결합 단백질(예를 들면, DRBD)은 히스톤, RDE-4 단백질, 또는 프로타민을 포함한다. 추가적인 dsRNA 결합 단백질(괄호는 이들의 조회 번호)은 다음을 포함한다: PKR (AAA36409, AAA61926, Q03963), TRBP (P97473, AAA36765), PACT (AAC25672, AAA49947, NP609646), 슈타우펜(Staufen) (AAD17531, AAF98119, AAD17529, P25159), NFAR1 (AF167569), NFAR2 (AF167570, AAF31446, AAC71052, AAA19960, AAA19961, AAG22859), SPNR (AAK20832, AAF59924, A57284), RHA (CAA71668, AAC05725, AAF57297), NREBP (AAK07692, AAF23120, AAF54409, T33856), 카나댑틴(kanadaptin) (AAK29177, AAB88191, AAF55582, NP499172, NP198700, BAB19354), HYL1 (NP563850), 하이포내스틱 리프스(hyponastic leaves) (CAC05659, BAB00641), ADAR1 (AAB97118, P55266, AAK16102, AAB51687, AF051275), ADAR2 P78563, P51400, AAK17102, AAF63702), ADAR3 (AAF78094, AAB41862, AAF76894), TENR (XP059592, CAA59168), RNaseIII (AAF80558, AAF59169, Z81070Q02555/S55784, PO5797), 및 다이서 (BAA78691, AF408401, AAF56056, S44849, AAF03534, Q9884), RDE-4 (AY071926), FLJ20399 (NP060273, BAB26260), CG1434 (AAF48360, EAA12065, CAA21662), CG13139 (XP059208, XP143416, XP110450, AAF52926, EEA14824), DGCRK6 (BAB83032, XP110167) CG1800 (AAF57175, EAA08039), FLJ20036 (AAH22270, XP134159), MRP-L45 (BAB14234, XP129893), CG2109 (AAF52025), CG12493 (NP647927), CG10630 (AAF50777), CG17686 (AAD50502), T22A3.5 (CAB03384) 및 조회 번호 EAA14308.
융합 폴리펩티드 및 본 개시의 방법에서 사용될 수 있는 펩티드 링커는 전형적으로 최대 약 20 또는 30개 아미노산, 흔히 최대 약 10 또는 15개 아미노산, 및 더욱 흔하게는 약 1 내지 5개의 아미노산을 포함할 것이다. 링커 서열은 일반적으로 유연하여 융합 분자를 단일의 획일적인 입체 구조에 제한시키지 않는다. 링커 서열은 예를 들면, 핵산 결합 도메인 및/또는 핵산 도메인으로부터 PTD 도메인을 격리시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 펩티드 링커 서열은 분자적인 유연성을 제공하기 위해 위치할 수 있다. 링커 모이어티의 길이는 PTD 도메인 융합 구조체를 포함하는 폴리펩티드의 생물학적 활성을 최적화하기 위해 선택되며 실험을 많이 하지 않고도 실증적으로 결정될 수 있다. 링커 모이어티는 PTD가 핵산과 또는 그 반대로 자유롭게 상호작용할 수 있도록 충분히 길고 충분히 유연해야 한다. 링커 모이어티의 예는 --Gly--Gly--, GGGGS (SEQ ID NO:8), (GGGGS)N (SEQ ID NO:8, 반복됨), GKSSGSGSESKS (SEQ ID NO:9), GSTSGSGKSSEGKG (SEQ ID NO:10), GSTSGSGKSSEGSGSTKG (SEQ ID NO:11), GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO:12), 또는 EGKSSGSGSESKEF (SEQ ID NO:13)이다. 연결 모이어티는 예를 들어, Huston et al ., Proc. Nat'l Acad. Sci 85:5879, 1988; Whitlow et al ., Protein Engineering 6:989, 1993; 및 Newton et al ., Biochemistry 35:545, 1996 에 기재된다. 다른 적절한 펩티드 링커는 U.S. Pat. Nos. 4,751,180 및 4,935,233에 기재된 부류이며, 상기 문헌은 본 명세서에 참고 문헌으로 포함된다.
본 개시의 방법, 조성물, 및 융합 폴리펩티드는 시험관내 및 생체내에서 모두 세포에 의한 핵산 분자의 강화된 흡수 및 방출을 제공한다.
용어 "치료적"은 일반적인 의미로 사용되며 치료제, 예방제, 및 대체제(replacement agent)를 포함한다. 치료적 분자의 예는 세포 주기 조절제; 사이클린 단백질 억제제, 가령, 사이클린 G1 및 사이클린 D1 유전자에 대한 안티센스 폴리뉴클레오타이드; 절단되어 예를 들어, 표피 생장 인자(EGF), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 에리쓰로포이에틴, G-CSF, GM-CSF, TGF-α, TGF-β, 및 섬유아세포 성장 인자와 같은 특정한 성장 인자를 목표로 하는 siRNA 분자를 제공할 수 있는 dsRNA; 인터류킨 1 내지 13 및 종양 괴사 인자를 포함하지만 이에 제한되지 않는 사이토카인; 항응고제, 항혈소판제; TNF 수용체 도메인 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
이러한 방법 및 조성물을 이용하여, 다양한 질병 및 장애를 치료할 수 있다. 예를 들어, 종양 세포의 성장이 항-종양 siRNA의 수송으로 억제되고, 저해되거나, 파괴될 수 있다.
따라서, 본 개시가 임의의 특정한 형질 전환 도메인 또는 올리고뉴클레오타이드/폴리뉴클레오타이드에 제한되지 않음이 이해되어야 한다. 임의의 음이온으로 하전된 핵산(예를 들면, dsRNA, siRNA 등)이 본 개시의 방법 및 조성물을 이용하여 수송될 수 있다.
본 개시에 사용된 폴리펩티드(예를 들면, 융합 폴리펩티드 또는 전체 길이 융합 폴리펩티드의 특정 도메인과 관련하여)는 아미노산의 L-광학 이성질체 또는 D-광학 이성질체 중 하나를 포함하거나 둘 모두의 조합을 포함할 수 있다. 본 개시에 사용될 수 있는 폴리펩티드는 변형된 서열, 가령, 당단백질, 레트로-인버소(retro-inverso) 폴리펩티드, D-아미노산 변형된 폴리펩티드, 등을 포함한다. 폴리펩티드는 자연 발생적 단백질뿐 아니라 재조합되거나 합성적으로 합성된 부류를 포함한다. "단편"은 폴리펩티드의 한 부분이다. 용어 "단편"은 적어도 하나의 유용한 항원결정부(epitope) 또는 기능적인 도메인을 나타내는 폴리펩티드의 한 부분을 가리킨다. 용어 "기능적 단편"은 폴리펩티드 중에서 활성을 가지는 폴리펩티드의 단편을 가리킨다. 예를 들어, PTD의 기능적인 단편은 형질 전환 활성을 가지는 단편을 포함한다.
일부 구체예에서, 레트로-인버소 펩티드가 사용된다. "레트로-인버소"는 아미노-카복시 역위(inversion)뿐 아니라 하나 이상의 아미노산의 거울상체 변화(즉, 좌선성(levantory, L)에서 우선성(dextrorotary, D)으로)를 의미한다. 본 개시의 폴리펩티드는 예를 들어, 아미노산 서열의 아미노-카복시 역위, 하나 이상의 D-아미노산을 포함하는 아미노-카복시 역위, 및 하나 이상의 D-아미노산을 내포하는 비-역위된 서열을 포괄한다. 안정하며 생(bio)활성을 가지는 레트로-인버소 펩티드유사체(peptidomimetics)가 Brugidou et al . (Biochem. Biophys. Res. Comm. 214(2): 685-693, 1995) 및 Chorev et al. (Trends Biotechnol. 13(10): 438-445, 1995)에 기재된 것과 같이 고안될 수 있다.
본 개시는 또한 본 개시의 융합 단백질 구조체를 인코딩(encoding)하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 이러한 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 PTD 도메인, 및/또는 핵산 결합 도메인(예를 들면, DRBD)을 인코딩하는 서열을 포함한다. 폴리뉴클레오타이드는 또한 하나 이상의 PTD 및/또는 핵산 결합 도메인을 격리시키는 링커 도메인을 인코딩할 수 있다. 한 양태에서 둘 이상의 PTD 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드가 제조되고 이후 전하 환원된/보호된 올리고뉴클레오타이드 또는 N-SATE를 포함하는 폴리뉴클레오타이드에 연결된다.
폴리뉴클레오타이드 구조체는 바람직한 벡터에 포함될 수 있다(즉, 복제될 수 있다). 발현의 목적을 위해, 본 개시의 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 재조합 발현 벡터에 삽입될 수 있다. 용어 "재조합 발현 벡터"는 본 개시의 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 삽입 또는 포함시켜 조작된 플라스미드, 바이러스, 또는 다른 공지된 운반체를 가리킨다. 발현 벡터는 전형적으로 복제시발점(origin of replication), 프로모터(promoter)뿐 아니라 형질전환된 세포의 표현형 선별을 가능케하는 특정한 유전자를 포함한다. 이러한 용도에 적절한 벡터는 박테리아에서 발현을 위한 T7-기반 발현 벡터(Rosenberg et al ., Gene, 56:125, 1987), 포유류 세포에서 발현을 위한 pMSXND 발현 벡터(Lee and Nathans, J. Biol. Chem., 263:3521, 1988), 곤충 세포에서 발현을 위한 바큘로바이러스-유래 벡터, 꽃양배추 모자이크 바이러스, CaMV, 및 식물에서 발현을 위한 담배 모자이크 바이러스, TMV을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
활용되는 벡터에 따라, 항시발현(constitutive) 및 유도성(inducible) 프로모터, 전사 증폭 인자, 전사 종결자, 등을 비롯한 임의 개수의 적절한 전사 및 번역 인자(조절 서열)가 발현 벡터에서 사용될 수 있다(예를 들면, Bitter et al ., Methods in Enzymology, 153:516-544, 1987를 참조). 이들 인자들은 당해 분야에 공지이다.
용어 "작동가능하게 연결된" 및 "작동가능하게 결합된"은 본 명세서에서 각각 독립적인 생물학적 기능을 가지는 두 가지 다르게 구별되는 도메인의 화학적 또는 물리적 결합을 넓게 가리키기 위해 상호교환적으로 사용된다. 예를 들어, 작동가능한 연결은 조절 서열 및 조절 서열에 의해 조절되는 폴리뉴클레오타이드 간의 기능적인 결합을 가리킨다. 또 다른 양태에서, 작동가능한 연결은 바람직한 조건하에 각각의 도메인이 이의 독립적인 생물학적 활성을 가지도록 하는 핵산 도메인 및 형질 전환 도메인의 연합을 가리킨다. 작동가능한 연결은 또한 각각의 도메인이 프레임 내에서(in-frame) 연결되어 요구되는 폴리펩티드 서열의 발생시키도록 하는 융합 폴리펩티드의 인코딩된 도메인 간의 연결을 가리킨다.
효모(yeast)에서, 항시발현 또는 유도성 프로모터를 포함하는 많은 벡터가 사용될 수 있다(예를 들면, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Ed. Ausubel et al ., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, Ch. 13, 1988; Grant et al ., "Expression and Secretion Vectors for Yeast," in Methods in Enzymology, Eds. Wu & Grossman, Acad. Press, N.Y., Vol. 153, pp.516-544, 1987; Glover, DNA Cloning, Vol. II, IRL Press, Wash., D.C., Ch. 3, 1986; "Bitter, Heterologous Gene Expression in Yeast," Methods in Enzymology, Eds. Berger & Kimmel, Acad. Press, N.Y., Vol. 152, pp. 673-684, 1987; 및 The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Eds. Strathern et al ., Cold Spring Harbor Press, Vols. I and II, 1982를 참조). ADH 또는 LEU2와 같은 항시발현 효모 프로모터, 또는 GAL과 같은 유도성 프로모터가 사용될 수 있다("Cloning in Yeast," Ch. 3, R. Rothstein In: DNA Cloning Vol.11, A Practical Approach, Ed. DM Glover, IRL Press, Wash., D.C., 1986). 대안적으로, 외부 DNA 서열을 효모 염색체 안으로 통합하는 것을 촉진하는 벡터가 사용될 수 있다.
발현 벡터는 숙주 세포를 형질전환하기 위해 사용될 수 있다. "형질전환"은 세포에 외생성 폴리뉴클레오타이드를 포함시키고 난 후에 세포에 유도된 영구적인 유전적 변화를 의미한다. 세포가 포유류 세포인 경우에, 영구적인 유전적 변화는 일반적으로 세포의 유전자에 폴리뉴클레오타이드를 도입하여 성취된다. "형질전환된 세포" 또는 "재조합 숙주 세포"는 분자 생물학 기술을 사용하여 본 개시의 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 도입된 세포(또는 이의 조상 세포)를 의미한다. 숙주 세포의 형질전환은 당업자에 공지인 통상적인 기술에 의해 수행될 수 있다. 숙주가 E. coli와 같은 원핵 세포인 경우에, 폴리뉴클레오타이드 흡수가 가능한 반응능(competent) 세포는 급속 생장기(exponential growth phase) 이후에 수득되고 이후 당해 분야에 공지인 CaCl2 방법에 의해 처리된 세포로부터 제조될 수 있다. 대안적으로, MgCl2 또는 RbCl이 사용될 수 있다. 형질전환은 또한 숙주 세포의 원형질체(protoplast)를 형성한 이후에 또는 전기천공법에 의해 수행될 수 있다.
본 개시의 융합 폴리펩티드는 원핵 생물에서 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 발현을 통해 제작될 수 있다. 이들은 본 개시의 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA, 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 박테리아와 같은 미생물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 구조체는 대량으로 E. coli에서 발현될 수 있다. 박테리아로부터의 정제는 서열이 니켈-킬레이트 크로마토그래피에 의한 한-단계 정제를 위한 표식(tag)을 포함하는 경우 간소화된다. 따라서, 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 또한 융합 폴리펩티드의 분리를 간소화하기 위해 표식을 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리히스티딘 표식, 예를 들면, 6개의 히스티딘 잔기로 된 표식이 융합 폴리펩티드의 아미노 말단 끝에 포함될 수 있다. 폴리히스티딘 표식은 단백질을 니켈-킬레이트 크로마토그래피를 이용하여 단일 단계로 편리하게 분리할 수 있게 한다. 본 개시의 융합 폴리펩티드는 또한 단백질 회수를 돕기 위한 절단 부위를 내포하도록 제작될 수 있고 상기 절단 부위는 상기 논의된 링커 모이어티의 일부일 수 있다. 요구되는 펩티드 링커를 인코딩하는 DNA 서열은 및 PTD를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 핵산 결합 도메인에 따른 이의 단편과 동일한 리딩 프레임 사이에 삽입될 수 있고, 상기 PTD는 또한 요구되는 핵산(예를 들면, dsRNA, DNA, siRNA, 등)에 임의의 적절한 통상적인 기술을 이용하여 연결될 수 있다. 예를 들어, 링커를 인코딩하는 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오타이드는 두 개의 코딩(coding) 폴리뉴클레오타이드 사이에 연결될 수 있다. 특정한 구체예에서, 본 개시의 폴리뉴클레오타이드는 링커에 의해 격리된 둘 내지 네 개의 분리된 도메인(예를 들면, 하나 이상의 PTD 도메인 및 하나 이상의 핵산 도메인)을 포함하는 융합 폴리펩티드를 인코딩할 것이다. 일부 구체예에서, 일단 정제되면, 다수의 PTD를 포함하는 융합 폴리펩티드는 음이온성 전하 중화기 또는 다른 음이온성 전하 환원 기를 포함하는 올리고뉴클레오타이드와 연합되거나 연결된다.
숙주 세포가 진핵 세포인 경우에, 칼슘 포스페이트 공침법, 또는 미량주사법, 전기천공법, 리포좀으로 감싼 플라스미드의 삽입과 같은 통상적인 기계적인 절차, 또는 바이러스 벡터와 같은 DNA의 형질전환 방법이 사용될 수 있다. 진핵 세포는 또한 PTD-본 개시의 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 단순 포진 티미딘 카이네이즈 유전자와 같은 선별가능한 표현형을 인코딩하는 두 번째 폴리뉴클레오타이드 분자로 공형질전환될 수 있다. 또 다른 방법은 일시적으로 진핵 세포를 감염시키거나 형질전환시켜서 융합 폴리펩티드를 발현하기 위해 유인원 바이러스 40(SV40) 또는 소 유두종 바이러스와 같은 진핵 바이러스성 벡터를 이용하는 것이다(예를 들면, Eukaryotic Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Gluzman ed., 1982를 참조).
진핵 시스템, 및 전형적으로는 포유류 발현 시스템은 발현된 포유류 단백질의 바람직한 번역-후 변형이 일어날 수 있게 한다. 1차 전사물의 바람직한 처리, 글라이코실화, 인산화를 위한 세포 작용 체계, 및 유리하게는 융합 생성물의 분비 체계를 가진 진핵 세포가 본 개시의 PTD-융합 폴리펩티드의 발현을 위한 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 이러한 숙주 세포주는 CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, Jurkat, HEK-293, 및 WI38를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
장기적이고, 고-수율인 재조합 단백질의 제조를 위해, 안정된 발현이 사용된다. 바이러스성 복제시발점을 가지는 발현 벡터를 이용하는 대신에, 숙주 세포는 적절한 발현 제어 인자(예를 들면, 프로모터, 증폭자, 서열, 전사 종결자, 폴리아데닐화 부위, 등)으로 제어된 본 개시의 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 cDNA, 및 선별가능한 표지자(marker)로 형질전환될 수 있다. 재조합 플라스미드 내의 선별가능한 표지자는 선별성(예를 들면, 사이토톡신 내성에 의한)을 부여하며 세포에서 플라스미드가 세포의 염색체에 안정적으로 접합되게 하고 증가하여 다시, 복제되고 세포주 내에 더욱 늘어날 수 있는 부위(foci)를 형성하게 한다. 예를 들어, 외부 DNA의 도입에 따라, 조작된 세포를 1-2 일 동안 완전 배지에서 자라게 하고, 이후 선별성 배지로 이동할 수 있다. 단순 포진 바이러스 티미딘 카이네이즈(Wigler et al ., 세포, 11:223, 1977), 하이포잔틴-구아닌 포스포리보실 전이 효소(Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48:2026, 1962)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 많은 선별 시스템이 사용될 수 있고, 아데닌 포스포리보실 전이 효소(Lowy et al., 세포, 22:817, 1980) 유전자가 각각 tk-, hgprt- 또는 aprt- 세포에서 활용될 수 있다. 또한, 항대사 내성이 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr (Wigler et al ., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:3567, 1980; O'Hare et al ., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8:1527, 1981); 마이코페놀릭 애시드에 대한 내성을 부여하는 gpt (Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:2072, 1981); 아미노글리코사이드 G-418에 대한 내성을 부여하는 neo (Colberre-Garapin et al ., J. Mol. Biol., 150:1, 1981); 및 하이그로마이신 유전자에 대한 내성을 부여하는 hygro (Santerre et al ., Gene, 30:147, 1984)에 대한 선별의 기초로 사용될 수 있다. 추가적인 선별가능한 유전자, 즉 세포가 트립토판 대신에 인돌을 활용할 수 있게 하는 trpB; 히스티딘 대신에 히스티놀을 활용할 수 있게 하는 hisD(Hartman & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:8047, 1988); 및 오르니틴 데카복실라아제 억제제, 2-(디플루오로메틸)-DL-오르니틴, DFMO에 대한 내성을 부여하는 ODC (오르니틴 데카복실라아제)(McConlogue L., In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, ed., 1987)가 기재되었다.
미생물에서 아니면 진핵생물에서 발현된 본 개시의 PTD-융합 폴리펩티드의 분리 및 정제를 위한 기술은 임의의 통상적인 수단에 의해, 가령, 예를 들어, 제조용 크로마토그래피 분리 및 단일클론 또는 다중클론 항체 또는 항원의 사용을 포함하는 것과 같은 면역 분리에 의한 것일 수 있다.
본 개시의 융합 폴리펩티드는 많은 질병 및 장애의 치료 및/또는 진단을 위한 음이온으로 하전된 핵산 분자(예를 들면, dsRNA, siRNA, DNA, 안티센스, 리보자임 등)의 수송에 유용하다. 예를 들어, 융합 폴리펩티드는 세포 증식적 장애의 치료에 사용될 수 있고, 여기서 보호된 올리고- 또는 폴리뉴클레오타이드는 단독으로 또는 세포 증식을 유도하는 표적 유전자에 대한 PTD와 연합으로 세포막을 통과할 수 있도록 가역적으로 변형된다. PTD 도메인은 핵산 구조체의 전체 순 양이온성 전하를 증가시키거나 전체 순 음이온성 전하를 감소시켜 세포에 의한 흡수를 촉진한다. 따라서, 구조체는 세포 증식적 장애를 가지는 세포의 치료에 유용하다. 유사하게는, 본 개시의 구조체는 염증성 질병 및 장애, 감염, 혈관의 질환 및 장애 등을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
한 구체예에서, 본 개시의 구조체는 PTD의 대안으로 또는 PTD외에 추가적으로 표적화 도메인을 포함할 수 있다. 표적화 도메인은 수용체, 수용체 리간드 또는 동족 결합 도메인을 발현하는 특정 세포 유형에 구조체를 지정하는데 유용한 항체일 수 있다.
따라서, 본 개시는 음이온성 전하(전하 중화된 올리고뉴클레오타이드)를 감소시키는 N-SATE 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 제공한다. 본 개시는 또한 융합 단백질을 포함하는PTD를 비롯한 PTD에 연결된 전하-중화된 올리고뉴클레오타이드를 제공한다. 본 개시는 또한 RNA 결합 도메인 단백질을 포함하는 전하-중화된 올리고뉴클레오타이드를 제공한다. 일부 구체예에서, PTDs 및 RNA 결합 도메인 단백질의 조합은 전하-중화된 올리고뉴클레오타이드에 연결되거나 이들로 구성된다. 일반적으로 이러한 전하 중화된 올리고뉴클레오타이드 및 구조체는 (i) 감소된 음이온성 전하, (ii) 중성 전하, 또는 (iii) 양이온성 전하를 가진다.
본 개시의 폴리뉴클레오타이드의 수송은 세포를 당업자에 공지인 다양한 방법을 이용하여 폴리뉴클레오타이드와 접촉시키는 것으로 성취될 수 있다. N-SATE를 단독으로 또는 PTD와 함께 포함하는 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드는 일반적으로 중성 또는 양이온성 전하를 가지기 때문에, 폴리뉴클레오타이드는 세포막을 통과할 수 있다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드가 본 명세서의 다른 곳에서 더욱 자세히 기재된 바와 같이 다양한 담체, 분산제 등과 함께 조성된다.
비록 융합 폴리펩티드가 약제학적 조성물로서 단독으로 투여될 수 있지만, 본 개시의 전형적인 구조체는 약제학적으로 허용가능한 담체를 이용하여 조성될 것이다.
본 개시에 따른 약제학적 조성물은 담체, 부형제, 및 첨가물 또는 보조제를 이용하여 전하-보호된 올리고뉴클레오타이드 또는 본 개시의 구조체를 대상에 투여하기 적절한 형태로 포함하도록 제조될 수 있다. 자주 사용되는 담체 또는 보조제는 마그네슘 카보네이트, 티타늄 디옥사이드, 락토오즈, 만니톨 및 다른 당, 탈크, 우유 단백질, 젤라틴, 녹말, 비타민, 셀룰로오스 및 이의 유도체, 동물성 및 식물성 오일, 폴리에틸렌 글라이콜 및 무균수, 알코올, 글리세롤, 및 폴리하이드릭 알코올과 같은 용매를 포함한다. 정맥주사용 비히클(vehicle)은 액체 및 영앵 보충액을 포함한다. 보존제는 항균제, 항-산화제, 킬레이트제, 및 불활성 가스를 포함한다. 다른 약제학적으로 허용가능한 담체는 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th ed., Easton: Mack Publishing Co., 1405-1412, 1461-1487 (1975), 및 The National Formulary XIV., 14th ed., Washington: American Pharmaceutical Association (1975)에 기재된 것 과 같은, 염분, 보존제, 완충제 등을 비롯한 수성 용액, 무-독성 부형제를 포함하며, 상기 문헌은 본 명세서에 참고 문헌으로 포함된다. 약제학적 조성물의 다양한 성분들의 pH 및 정확한 농도는 당해 분야에 일상적인 기술에 따라 조정된다. Goodman and Gilman's, The Pharmacological Basis for Therapeutics(7th ed.)를 참조하라.
본 개시에 따른 약제학적 조성물은 국소적으로 또는 전신으로 투여될 수 있다. "치료적으로 효과적인 용량"은 질병 또는 장애의 징후를 예방하기 위해, 치유하기 위해, 또는 적어도 부분적으로 정지시키기 위해 (예를 들면, 세포성 증식을 억제하기 위해) 충분한 본 개시에 따른 융합 폴리펩티드의 양을 의미한다. 이 용도를 위한 유효량은 물론, 질병의 중증도 및 대상의 체중 및 일반적인 상태에 의존적일 것이다. 전형적으로, 시험관내에서 사용된 용량은 약제학적 조성물의 원위치(in situ) 투여에 유용한 양에 대해 유용한 길잡이를 제공할 수 있고, 동물 모델이 특정 장애의 치료를 위한 효과적인 용량를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 다양한 고려들이 예를 들면, Langer, Science, 249: 1527, (1990); Gilman et al. (eds.) (1990)에 기재되고, 상기 각각은 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다.
본 명세서에 사용된, "치료적 유효량의 투여"는 대상에 본 개시의 약제학적 조성물을 조성물이 이의 의도된 치료적 기능을 수행할 수 있도록 하는 제공하거나 적용하는 방법을 포함하는 것으로 의도된다. 치료적 유효량은 대상에서 감염의 정도, 개인의 나이, 성별, 및 체중과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 용법은 최적의 치료 결과를 제공하기 위해 조정될 수 있다. 예를 들어, 수 개의 나눠진 용량이 매일 투여될 수 있거나 용량은 치료 상황의 긴급성에 의해 지시되는 바와 같이 비레적으로 감소될 수 있다.
약제학적 조성물은 주사(예를 들면, 피하, 정맥주사, 등), 경구 투여, 흡입, 피부 침투 적용, 또는 직장 투여에 의한 것과 같은 편리한 방식으로 투여될 수 있다. 투여의 경로에 따라, 약제학적 조성물은 약제학적 조성물을 불활성화할 수 있는 효소, 산, 및 다른 자연적인 조건의 작용으로부터 약제학적 조성물을 보호하기 위해 물질로 코팅될 수 있다. 약제학적 조성물은 또한 비경구적으로 또는 복막내로 투여될 수 있다. 현탁액이 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글라이콜, 및 이의 혼합물에서, 및 오일에서 제조될 수 있다. 저장 및 사용의 일반적인 조건하에, 이들 제형은 미생물의 성장을 방지하기 위한 보존제를 포함할 수 있다.
주사용으로 적절한 약제학적 조성물은 무균 수용액 (물에 녹는 경우) 또는 현탁액 및 무균 주사 용액 또는 현탁액의 빠른 제조를 위한 무균 분말을 포함한다. 조성물은 전형적으로 무균이고 용이한 주사가능성이 존재하는 정도까지 액체일 것이다. 전형적으로 조성물은 제조 및 저장의 조건하에 안정하며 박테리아 및 균류와 같은 미생물의 오염 작용에 반하도록 보존될 것이다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글라이콜, 및 액체 폴리에틸렌 글라이콜, 등), 이들의 적절한 혼합물, 및 식물성 오일을 포함하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 바람직한 유동성은 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산의 경우에는 요구되는 입자 크기의 유지에 의해 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항생제 및 항균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르빅 애시드, 티메로살, 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들어, 당 그리고 만니톨, 소르비톨, 또는 소듐 클로라이드와 같은 폴리알코올이 조성물에 사용된다. 주사 조성물의 흡수 지연은 조성물내에 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함함으로써 달성될 수 있다.
무균 주사 용액은 적절한 용매에서 상기 열거한 성분 중의 하나 또는 조합을 이용하여 요구되는 양으로 약제학적 조성물을 포함함으로써 제조될 수 있고, 필요한 경우에, 여과 멸균으로 이어질 수 있다. 일반적으로, 약제학적 조성물을 염기성 분산 매질 및 상기 열거한 성분 중의 요구되는 다른 성분을 가지는 무균 비히클에 포함함으로써 현탁액이 제조된다.
약제학적 조성물은 예를 들어, 불활성 희석제 또는 동화가능 식용 담체와 함께 경구로 투여될 수 있다. 약제학적 조성물 및 다른 성분은 경성 또는 연성-외피 젤라틴 캡슐에 주입되거나, 정제로 압축되거나, 대상의 음식에 직접 포함될 수 있다. 경구 치료적 투여를 위해, 약제학적 조성물은 부형제와 함께 포함될 수 있고 삼킬 수 있는 정제, 경구 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서, 현탁제, 시럽, 웨이퍼, 등의 형태로 사용될 수 있다. 이러한 조성물 및 제조물은 활성 화합물을 적어도 1중량%로 포함해야 한다. 조성물 및 제조물의 백분율은 물론, 다양할 수 있으며 편리하게는 단위의 약 5중량% 내지 약 80중량% 사이일 수 있다.
정제, 트로키, 환약, 캡슐, 등은 또한 다음을 포함할 수 있다: 결합제, 가령 검 트래거캔스, 아카시아, 옥수수 녹말, 또는 젤라틴; 부형제 가령 디칼슘 포스페이트; 붕해제, 가령 옥수수 녹말, 감자 녹말, 알기닉 애시드, 등; 활택제, 가령 마그네슘 스테아레이트; 및 감미제, 가령 수크로스, 락토오즈 또는 사카린, 또는 착향제 가령 페퍼민트, 노루발풀(wintergreen) 오일, 또는 체리향. 복용 단위 형태가 캡슐인 경우에, 상기 유형의 물질 외에도 액체 담체가 포함될 수 있다. 다양한 다른 물질이 코팅으로서 또는 다르게는 복용 단위의 물질적 형태를 변형시키기 위해 존재할 수 있다. 예를 들어, 정제, 환약, 또는 캡슐은 셸락(shellac), 당, 또는 둘 모두로 코팅될 수 있다. 시럽 또는 엘릭서는 작용제, 감미제로서 수크로스, 보존제로서 메틸 및 프로필 파라벤, 색소, 및 체리 및 오렌지 향과 같은 향료를 포함할 수 있다. 물론, 임의의 복용 단위 형태를 제조하는데 사용되는 임의의 물질은 약제학적으로 순수해야 하며 활용되는 양에 있어서 실질적으로 무-독성이어야 한다. 또한, 약제학적 조성물은 지효성(sustained-release) 제조물 및 제형에 포함될 수 있다.
따라서, "약제학적으로 허용가능한 담체"는 용매, 분산 매질, 코팅제, 항생제 및 항균제, 등장화제 및 흡수 지연제, 등을 포함하는 것으로 의도된다. 약제학적으로 활성인 물질에 대한 이러한 매질 및 작용제의 사용은 당해 분야에 매우 공지이다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 약제학적 조성물과 혼화(compatible)되지 않는 경우가 아닌 한, 치료적 조성물 및 치료 방법에서 이의 용도가 포함된다. 보조적인 활성 화합물이 또한 조성물에 포함될 수 있다.
투여의 편이 및 용량의 균일성을 위해 비경구적 조성물인 복용 단위 형태로 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본 명세서에 사용된 "복용 단위 형태"은 치료되어야 할 대상을 위한 단일 복용에 적절한 물리적으로 별개인 단위를 가리키며; 소정량의 약제학적 조성물을 포함하는 각각의 단위는 필요한 약제학적 담체와 연합으로 바람직한 치료적 효과를 만들기 위해 산출된다. 본 개시의 복용 단위 형태를 위한 요구 조건은 약제학적 조성물 및 달성하려는 특정 치료적 효과의 특성과 연관된다.
주요한 약제학적 조성물은 편리성 및 효과적인 투여를 위해 허용가능한 복용 단위 내의 적절한 약제학적으로 허용가능한 담체와 유효량으로 화합된다. 보조적인 활성 성분을 포함하는 조성물의 경우에, 용량은 일반적인 용량 및 상기 성분의 투여 방식에 따라 결정된다.
실시예
합성 및 사용을 위한 다양한 실시예가 첨부된 도면에 제시된다. 또한, 본 개시는 음이온성 올리고뉴클레오타이드와 연관된 전하를 중화하기 위한 다음의 포스포라미디트 및 구조를 제공한다.
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Figure pct00053
Figure pct00054
Figure pct00055
Figure pct00056
Figure pct00057
Figure pct00058
본 개시의 많은 구체예가 기재되었다. 그러나, 본 개시의 사상 및 범위에서 벗어나지 않고 다양한 변형이 이루어질 수 있음이 이해될 것이다. 따라서, 다른 구체예들이 다음 청구항의 범위 내에 속한다.
SEQUENCE LISTING <110> The Regents of the University of California Dowdy, Steven F. Meade, Bryan Gogoi, Khirud <120> NUCLEIC ACID DELIVERY COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF <130> 00015-100WO1 <140> Not yet assigned <141> 2010-06-01 <150> US 61/182,832 <151> 2009-06-01 <160> 25 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Transduction Domain Consensus Sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa is a basic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(4) <223> Xaa is an alpha-helix enhacing amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is a basic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(7) <223> Xaa is an alpha-helix enhancing amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is a basic amino acid <400> 1 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Transduction Domain Consensus Sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa is a basic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(3) <223> Xaa is an alpha-helix <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(5) <223> Xaa is basic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(7) <223> Xaa is an alpha-helix enhancing amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is a basic amino acid <400> 2 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Transduction Domain <400> 3 Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly 1 5 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Transduction Domain Consensus Sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(2) <223> Xaa is an alpha-helical enhancing amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is an alpha-helical enhancing amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is P or an alpha-helical enhancing amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is a basic amino acid or an alpha-helical enhancing amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is a basic 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Ser 1 5 10 15 Gln Pro Lys Thr Ala Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Lys Lys Cys Cys Phe 20 25 30 His Cys Gln Val Cys Phe Ile Thr Lys Ala Leu Gly Ile Ser Tyr Gly 35 40 45 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Gly Ser Gln Thr 50 55 60 His Gln Val Ser Leu Ser Lys Gln Pro Thr Ser Gln Ser Arg Gly Asp 65 70 75 80 Pro Thr Gly Pro Lys Glu 85 <210> 8 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide Linker <400> 8 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 9 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide Linker <400> 9 Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser 1 5 10 <210> 10 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide Linker <400> 10 Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Lys Gly 1 5 10 <210> 11 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide Linker <400> 11 Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Ser Gly Ser Thr 1 5 10 15 Lys Gly <210> 12 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide Linker <400> 12 Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr 1 5 10 15 Lys Gly <210> 13 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide Linker <400> 13 Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Glu Phe 1 5 10 <210> 14 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PTD sequence <400> 14 Ala Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 15 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PTD sequence <400> 15 Tyr Ala Arg Lys Ala Arg Arg Gln Ala Arg Arg 1 5 10 <210> 16 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PTD sequence <400> 16 Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala 1 5 10 <210> 17 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PTD sequence <400> 17 Tyr Ala Arg Ala Ala Arg Arg Ala Ala Arg Arg 1 5 10 <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PTD sequence <400> 18 Tyr Ala Arg Ala Ala Arg Arg Ala Ala Arg Ala 1 5 10 <210> 19 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PTD sequence <400> 19 Tyr Ala Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 20 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PTD sequence <400> 20 Tyr Ala Ala Ala Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized oligonucleotide <400> 21 tttttttttt tttttuuutt 20 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized oligonucleotide <400> 22 tuggugaugg acucgugggu c 21 <210> 23 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized oligonucleotide <400> 23 ccacuaccug agcacccagt ttuggugaug gacucguggg uc 42 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized oligonucleotide <400> 24 cugggugcuc agguaguggt t 21 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized oligonucleotide <400> 25 ccacuaccug agcacccagt t 21

Claims (19)

  1. 뉴클레오타이드의 포스페이트 기에 결합된 아미노 알킬 S-아실 티오 알킬 (N-SATE) 모이어티를 포함하는 뉴클레오타이드 화합물.
  2. 제1항에 있어서, N-SATE 모이어티는 다음 일반 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는 뉴클레오타이드:
    Figure pct00059

    여기서 R1은 존재하거나 존재하지 않을 수 있으며, R1이 존재하는 경우, R1은 알킬, 치환된 알킬, 알콕시, 치환된 알콕시, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로사이클릭, 또는 치환된 헤테로사이클릭으로 이루어진 군에서 선택되고;
    여기서 R2는 존재하거나 존재하지 않을 수 있으며, R2가 존재하는 경우, R2는 1 내지 7개 원자 알킬, 치환된 알킬, 알콕시, 치환된 알콕시, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로사이클릭, 또는 치환된 헤테로사이클릭으로 이루어진 군에서 선택됨.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, N-SATE 모이어티는 다음으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 뉴클레오타이드:
    Figure pct00060
    ,
    Figure pct00061
    및
    Figure pct00062
    .
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, N-SATE 모이어티는 임의의 핵산 염기 A, G, C, T 또는 U의 포스페이트 기에 결합된 것을 특징으로 하는 뉴클레오타이드 화합물.
  5. 제1항, 제2항 또는 제4항에 있어서, 뉴클레오타이드가 다른 뉴클레오타이드에 포스페이트 결합을 통해 연결된 경우 연결된 백본은 다음의 일반 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는 뉴클레오타이드:
    Figure pct00063

    여기서 R1은 존재하거나 존재하지 않을 수 있으며, R1이 존재하는 경우, R1은 알킬, 치환된 알킬, 알콕시, 치환된 알콕시, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로사이클릭, 또는 치환된 헤테로사이클릭으로 이루어진 군에서 선택되고;
    여기서 R2는 존재하거나 존재하지 않을 수 있으며, R2가 존재하는 경우, R2는 1 내지 7개 원자 알킬, 치환된 알킬, 알콕시, 치환된 알콕시, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로사이클릭, 또는 치환된 헤테로사이클릭으로 이루어진 군에서 선택됨.
  6. 제5항에 있어서, N-SATE 모이어티는 다음으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 뉴클레오타이드:
    Figure pct00064
    ,
    Figure pct00065
    및
    Figure pct00066
    .
  7. 제1항의 N-SATE 모이어티를 가지는 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드.
  8. 제7항에 있어서, N-SATE 모이어티가 없는 동일한 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드와 비교할 때, 중성 또는 더 많은 양이온성 전하을 포함하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드.
  9. 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 백본(backbone)의 순(net) 음이온성 전하를 감소시키는 아미노 알킬 S-아실 티오 알킬(N-SATE) 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드.
  10. 제7항에 있어서, siRNA 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드는 N-SATE 모이어티를 가지는 다수의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드.
  12. 제9항 또는 제10항에 있어서, N-SATE 모이어티를 가지는 다수의 인접한 뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드.
  13. 제9항 또는 제10항에 있어서, 하나 이상의 뉴클레오타이드 염기에 의해 다른 하나와 분리된 N-SATE 모이어티를 가지는 다수의 뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드.
  14. 제9항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 도메인에 결합되거나 작동가능하게(operably) 연결된 막 수송 기능을 포함하는 적어도 하나의 단백질 형질 전환 도메인(PTD)을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드.
  15. 제14항에 있어서, 다수의 단백질 형질 전환 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드.
  16. 제9항의 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 약제학적 조성물.
  17. 제9항의 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 또는 제16항의 약제학적 조성물을 세포와 접촉시키는 것을 포함하는, 시험관내 또는 생체내에서 세포에 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 수송하는 방법.
  18. 아래의 일반 구조를 가지는 포스포라미디트를 이용하여 합성 장치에서 올리고뉴클레오타이드를 화학적으로 합성하는 것을 포함하는, 제9항의 전하 중화되거나 양이온으로 하전된 올리고뉴클레오타이드를 만드는 방법
    Figure pct00067
    .
  19. 제18항에 있어서, 합성 장치는 RNA 합성 장치인 것을 특징으로 하는 방법.
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