JP2012510460A - リン原子修飾核酸の合成方法 - Google Patents

リン原子修飾核酸の合成方法 Download PDF

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Abstract

【課題】本明細書は、キラルＸ−ホスホネート部分を含むリン原子修飾核酸の合成方法について記載する。
【解決手段】本明細書に記載の方法は、化学的に安定なＨ−ホスホネート部分を含むアキラル分子とヌクレオシド／ヌクレオチドとの不斉反応を介して、高いジアステレオマー純度の骨格修飾核酸を提供する。
【選択図】なし

Description

本明細書は、キラルＸ−ホスホネート部分を含むリン原子修飾核酸の合成方法について記載する。本明細書に記載の方法は、化学的に安定なＨ−ホスホネート部分を含むアキラル分子とヌクレオシド／ヌクレオチドとの不斉反応を介して、高いジアステレオマー純度の骨格修飾核酸を提供する。
オリゴヌクレオチドは、治療、診断、研究、および新規なナノ材料の用途において有用である。ＤＮＡまたはＲＮＡの天然の配列の使用は、ヌクレアーゼに対するそれらの安定性によって制限される。さらに、インビトロでの研究は、結合親和性、相補的なＲＮＡに対する配列特異的結合性、ヌクレアーゼに対する安定性のようなアンチセンスヌクレオチドの特性が、リン原子の配置によって影響を受けることを示している。従って、当該分野では、リンにおいて立体制御され、そして分解に対して所望の安定性を示す一方、外因性または内因性相補的ＤＮＡ／ＲＮＡ配列に対する親和性を保持するオリゴヌクレオチドを生成する方法の必要性が存在する。これらの化合物が、固相支持体上または溶液中において容易に合成され、そしてオリゴヌクレオチドの糖または核酸塩基に対する広範な合成修飾を可能にすることの必要性が存在する。
本明細書は、リン原子修飾ポリマーおよびオリゴマー核酸の立体制御合成を記載し、いくつかの実施形態では、それは、固相支持体上で実施される。
本発明の一態様において、アキラルＨ−ホスホネート部分を含む分子と５’−ＯＨ部分を含むヌクレオシドを反応させて、縮合中間体を形成させる工程；および前記縮合中間体を、キラルＸ−ホスホネート部分を含む核酸に変換させる工程を含む、キラルＸ−ホスホネート部分を含む核酸の合成方法が提供される。
いくつかの実施形態では、アキラルＨ−ホスホネート部分を含む分子と５’−ＯＨ部分を含むヌクレオシドを反応させて縮合中間体を形成させる前記工程が、ワンポット反応である方法である。
いくつかの実施形態では、前記方法は、式１のキラルＸ−ホスホネート部分を含む核酸を提供する。
Figure 2012510460
式１の化合物のいくつかの実施形態では、Ｒ１は、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＲｄＲｄ、−Ｎ３、ハロゲン、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキル−Ｙ１−、アルケニル−Ｙ１−、アルキニル−Ｙ１−、アリール−Ｙ１−、ヘテロアリール−Ｙ１−、−Ｐ（Ｏ）（Ｒｅ）２、−ＨＰ（Ｏ）（Ｒｅ）、−ＯＲａまたは−ＳＲｃである。Ｙ１は、Ｏ、ＮＲｄ、Ｓ、またはＳｅである。Ｒａは、ブロッキング部分である。Ｒｃは、ブロッキング基である。Ｒｄの各例は、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アシル、置換シリル、カルバメート、−Ｐ（Ｏ）（Ｒｅ）２、または−ＨＰ（Ｏ）（Ｒｅ）である。Ｒｅの各例は、独立して、水素、アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、アルキル−Ｙ２−、アルケニル−Ｙ２−、アルキニル−Ｙ２−、アリール−Ｙ２−、もしくはヘテロアリール−Ｙ２−であるか、あるいはＮａ＋１、Ｌｉ＋１、もしくはＫ＋１であるカチオンである。Ｙ２は、Ｏ、ＮＲｄ、またはＳである。Ｒ２の各例は、独立して、水素、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＲｄＲｄ、−Ｎ３、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキル−Ｙ１−、アルケニル−Ｙ１−、アルキニル−Ｙ１−、アリール−Ｙ１−、ヘテロアリール−Ｙ１−、−ＯＲｂ、または−ＳＲｃであり、ここで、Ｒｂは、ブロッキング部分である。Ｂａの各例は、独立して、ブロックされているかまたはブロックされていないアデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシルまたは修飾核酸塩基である。Ｘの各例は、独立して、アルキル、アルコキシ、アリール、アルキルチオ、アシル、−ＮＲｆＲｆ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、アルケニルチオ、アルキニルチオ、−Ｓ−Ｚ＋、−Ｓｅ−Ｚ＋、または−ＢＨ３ −Ｚ＋である。Ｒｆの各例は、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、またはアリールである。Ｚ＋は、アンモニウムイオン、アルキルアンモニウムイオン、ヘテロ芳香族イミニウムイオン、またはヘテロ環イミニウムイオンであって、それらのうちいずれかは、第一級、第二級、第三級もしくは第四級であり、あるいはＺ＋は一価の金属イオンである。Ｒ３は、水素、ブロッキング基、固相支持体に接続された連結部分または核酸に接続された連結部分である；およびｎは、１〜約２００の整数である。
前記方法のいくつかの実施形態では、式１の化合物の各Ｘ−ホスホネート部分は、３１Ｐ ＮＭＲ分光法または逆相ＨＰＬＣによって測定されるとき、ジアステレオマー的に９８％を超えて純粋である。前記方法のいくつかの実施形態では、各Ｘ−ホスホネート部分は、ＲＰ配置を有する。前記方法の他の実施形態では、各Ｘ−ホスホネート部分は、ＳＰ配置を有する。前記方法の他の実施形態では、各Ｘ−ホスホネートは、独立して、ＲＰ配置またはＳＰ配置を有する。
前記方法のさらなる実施形態では、アキラルＨ−ホスホネート部分を含む分子は、式２の化合物である。
Figure 2012510460
式２において、Ｒ１は、−ＮＲｄＲｄ、−Ｎ３、ハロゲン、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキル−Ｙ１−、アルケニル−Ｙ１、アルキニル−Ｙ１−、アリール−Ｙ１−、ヘテロアリール−Ｙ１−、−Ｐ（Ｏ）（Ｒｅ）２、−ＨＰ（Ｏ）（Ｒｅ）、−ＯＲａ、または−ＳＲｃである。Ｙ１は、Ｏ、ＮＲｄ、Ｓ、またはＳｅである。Ｒａは、ブロッキング部分である。Ｒｃは、ブロッキング基である。Ｒｄの各例は、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アシル、置換シリル、カルバメート、−Ｐ（Ｏ）（Ｒｅ）２、または−ＨＰ（Ｏ）（Ｒｅ）である。Ｒｅの各例は、独立して、アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、アルキル−Ｙ２−、アルケニル−Ｙ２−、アルキニル−Ｙ２−、アリール−Ｙ２−、またはヘテロアリール−Ｙ２−である。Ｙ２は、Ｏ、ＮＲｄ、またはＳである。Ｒ２は、水素、−ＮＲｄＲｄ、Ｎ３、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキル−Ｙ１−、アルケニル−Ｙ１−、アルキニル−Ｙ１−、アリール−Ｙ１−、ヘテロアリール−Ｙ１−、−ＯＲｂ、または−ＳＲｃであり、ここで、Ｒｂは、ブロッキング部分である。Ｂａは、ブロックされているかまたはブロックされていないアデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシルもしくは修飾核酸塩基である。Ｚ＋は、アンモニウムイオン、アルキルアンモニウムイオン、ヘテロ芳香族イミニウムイオン、またはヘテロ環イミニウムイオンであって、それらのうちいずれかは、第一級、第二級、第三級もしくは第四級であり、あるいは一価の金属イオンである。
前記方法のいくつかの実施形態では、前記方法は、キラル試薬をさらに含む。前記方法のなお他の実施形態では、キラル試薬は、式３の化合物である。
Figure 2012510460
Ｗ１およびＷ２は、独立して、−ＮＧ５−、−Ｏ−、または−Ｓ−である。Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、およびＧ５は、独立して、水素、アルキル、アラルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリル、ヘタリール、もしくはアリールであり、あるいはＧ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、およびＧ５のうちの２つはＧ６であって、一緒になって、単環式もしくは多環式の、縮合もしくは非縮合の、る約２０個までの環原子の、飽和、部分不飽和もしくは不飽和の、炭素環またはヘテロ原子含有環を形成し、ならびに式中、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、およびＧ５のうち４つ以下がＧ６である。
前記方法のいくつかの実施形態では、５’−ＯＨ部分を含むヌクレオシドは、式４の化合物である。
Figure 2012510460
Ｒ２の各例は、独立して、水素、−ＮＲｄＲｄ、Ｎ３、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキル−Ｙ１−、アルケニル−Ｙ１−、アルキニル−Ｙ１−、アリール−Ｙ１−、ヘテロアリール−Ｙ１−、−ＯＲｂ、または−ＳＲｃであり、ここで、Ｒｂは、ブロッキング部分である。Ｙ１は、Ｏ、ＮＲｄ、Ｓ、またはＳｅである。Ｒｃは、ブロッキング基である。Ｒｄの各例は、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アシル、置換シリル、カルバメート、−Ｐ（Ｏ）（Ｒｅ）２、または−ＨＰ（Ｏ）（Ｒｅ）である。Ｒｅの各例は、独立して、アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、アルキル−Ｙ２−、アルケニル−Ｙ２−、アルキニル−Ｙ２−、アリール−Ｙ２−、またはヘテロアリール−Ｙ２−である。Ｙ２は、Ｏ、ＮＲｄ、またはＳである。Ｂａの各例は、独立して、ブロックされているかまたはブロックされていないアデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシルもしくは修飾核酸塩基である。ｍは、０〜ｎ−１の整数である。ｎは、１〜約２００の整数である。ＯＡは、トリチル部分、シリル部分、アセチル部分、アシル部分、アリールアシル部分、固相支持体に接続された連結部分または核酸に接続された連結部分に接続されている。ＪはＯであり、そしてＤはＨであり、あるいはＪはＳ、Ｓｅ、もしくはＢＨ３であり、そしてＤはキラル配位子Ｃｉもしくは式Ａ部分である。
Figure 2012510460
式Ａにおいて、Ｗ１およびＷ２は、独立して、ＮＨＧ５、ＯＨ、またはＳＨである。Ａは、水素、アシル、アリール、アルキル、アラルキル、またはシリル部分である。Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、およびＧ５は、独立して、水素、アルキル、アラルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、もしくはアリールであり、あるいはＧ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、およびＧ５のうちの２つはＧ６であって、一緒になって、単環式もしくは多環式の、縮合もしくは非縮合の、約２０個までの環原子の、飽和、部分不飽和もしくは不飽和の、炭素環またはヘテロ原子含有環を形成し、ならびに式中、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、およびＧ５のうち４つ以下がＧ６である。
前記方法のなお他の実施形態では、前記方法は、縮合試薬ＣＲを提供する工程であって、それによって、アキラルＨ−ホスホネート部分を含む分子が活性化され、キラル試薬と反応して、キラル中間体を形成する工程をさらに含む。
前記方法のさらなる実施形態では、縮合試薬ＣＲは、Ａｒ３ＰＬ２、（ＡｒＯ）３ＰＬ２、
Figure 2012510460
 である。
Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９およびＺ１０は、独立して、アルキル、アミノアルキル、シクロアルキル、ヘテロ環、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルキルオキシ、アリールオキシ、もしくはヘテロアリールオキシであり、あるいは式中、Ｚ２とＺ３、Ｚ５とＺ６、Ｚ７とＺ８、Ｚ８とＺ９、Ｚ９とＺ７、もしくはＺ７とＺ８とＺ９のうちのいずれかは、一緒になって、３〜２０員環の脂環またはヘテロ環を形成する。Ｑ−は対アニオンであり、Ｌは脱離基であり、そしてｗは０〜３の整数である。Ａｒは、アリール、ヘテロアリールであり、および／またはＡｒ基のうちの１つは、高分子支持体に付着している。前記方法のいくつかの実施形態では、縮合試薬ＣＲの対イオンは、Ｃｌ−、Ｂｒ−、ＢＦ４ −、ＰＦ６ −、ＴｆＯ−、Ｔｆ２Ｎ−、ＡｓＦ６ −、ＣｌＯ４ −、またはＳｂＦ６ −であり、ここで、ＴｆはＣＦ３ＳＯ２である。前記方法の他の実施形態では、縮合試薬ＣＲの脱離基は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール、イミダゾール、アルキルトリアゾール、テトラゾール、ペンタフルオロベンゼン、または１−ヒドロキシベンゾトリアゾールである。
前記方法のいくつかの実施形態では、縮合試薬は、ホスゲン、トリクロロメチルクロロホルメート、ビス（トリクロロメチル）カルボネート（ＢＴＣ）、塩化オキサリル、Ｐｈ３ＰＣｌ２、（ＰｈＯ）３ＰＣｌ２、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）ホスフィン酸クロリド（ＢｏｐＣｌ）、１，３−ジメチル−２−（３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）−２−ピロリジン−１−イル−１，３，２−ジアザホスホリジニウムヘキサフルオロホスフェート（ＭＮＴＰ）、または３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール−１−イル−トリス（ピロリジン−１−イル）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＮＴＰ）である。
Figure 2012510460
前記方法のさらなる実施形態では、前記方法は、活性化試薬ＡＲを提供する工程をさらに含む。一実施形態では、活性化試薬ＡＲは、
Figure 2012510460
 であり、式中、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５、Ｚ１６、Ｚ１７、Ｚ１８、Ｚ１９、Ｚ２０、およびＺ２１は、独立して、水素、アルキル、アミノアルキル、シクロアルキル、ヘテロ環、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルキルオキシ、アリールオキシ、もしくはヘテロアリールオキシであり、あるいは式中、Ｚ１１とＺ１２、Ｚ１１とＺ１３、Ｚ１１とＺ１４、Ｚ１２とＺ１３、Ｚ１２とＺ１４、Ｚ１３とＺ１４、Ｚ１５とＺ１６、Ｚ１５とＺ１７、Ｚ１６とＺ１７、Ｚ１８とＺ１９、もしくはＺ２０とＺ２１のうちいずれかは、一緒になって、３〜２０員環の脂環もしくはヘテロ環を形成するか、または５もしくは２０員環の芳香環を形成し；ならびにＱ−は対イオンである。ある実施形態では、活性化試薬ＡＲの対イオンは、Ｃｌ−、Ｂｒ−、ＢＦ４ −、ＰＦ６ −、ＴｆＯ−、Ｔｆ２Ｎ−、ＡｓＦ６ −、ＣｌＯ４ −、またはＳｂＦ６ −であり、ここで、ＴｆはＣＦ３ＳＯ２である。一実施形態では、活性化試薬ＡＲは、イミダゾール、４，５−ジシアノイミダゾール（ＤＣＩ）、４，５−ジクロロイミダゾール、１−フェニルイミダゾリウムトリフレート（ＰｈＩＭＴ）、ベンゾイミダゾリウムトリフレート（ＢＩＴ）、ベンズトリアゾール、３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール（ＮＴ）、テトラゾール、５−エチルチオテトラゾール、５−（４−ニトロフェニル）テトラゾール、Ｎ−シアノメチルピロリジニウムトリフレート（ＣＭＰＴ）、Ｎ−シアノメチルピペリジニウムトリフレート、Ｎ−シアノメチルジメチルアンモニウムトリフレートである。他の実施形態では、活性化試薬ＡＲは、４，５−ジシアノイミダゾール（ＤＣＩ）、１−フェニルイミダゾリウムトリフレート（ＰｈＩＭＴ）、ベンゾイミダゾリウムトリフレート（ＢＩＴ）、３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール（ＮＴ）、テトラゾール、またはＮ−シアノメチルピロリジニウムトリフレート（ＣＭＰＴ）である。
Figure 2012510460
 ある実施形態では、活性化試薬ＡＲは、Ｎ−シアノメチルピロリジニウムトリフレート（ＣＭＰＴ）である。
前記方法のいくつかの実施形態では、反応は、非プロトン性有機溶媒中で実施される。前記方法の他の実施形態では、溶媒は、アセトニトリル、ピリジン、テトラヒドロフラン、またはジクロロメタンである。前記方法の他の実施形態では、非プロトン性有機溶媒が塩基性ではない場合、塩基が、前記反応させる工程中に存在する。前記方法のいくつかの実施形態では、塩基は、ピリジン、キノリン、またはＮ，Ｎ−ジメチルアニリンである。前記方法のいくつかの実施形態では、塩基は、
Figure 2012510460
 であり、式中、Ｚ２２およびＺ２３は、独立して、アルキル、アミノアルキル、シクロアルキル、ヘテロ環、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルキルオキシ、アリールオキシ、もしくはヘテロアリールオキシであり、あるいは式中、Ｚ２２とＺ２３のいずれかは、一緒になって、３〜１０員環の脂環もしくはヘテロ環を形成する。前記方法のいくつかの実施形態では、塩基は、Ｎ−シアノメチルピロリジンである。前記方法のいくつかの実施形態では、非プロトン性有機溶媒は、無水である。前記方法の他の実施形態では、無水の非プロトン性有機溶媒は、蒸留直後のものである。前記方法のなお他の実施形態では、蒸留直後の無水の非プロトン性有機溶媒は、ピリジンである。前記方法の他の実施形態では、蒸留直後の無水の非プロトン性有機溶媒は、アセトニトリルである。
前記方法のいくつかの実施形態では、縮合中間体を式１の化合物に変換する工程は：縮合中間体を修飾して、式５の化合物を生成する工程を含む。
Figure 2012510460
式５において、Ｒ１は、−ＮＲｄＲｄ、−Ｎ３、ハロゲン、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキル−Ｙ１−、アルケニル−Ｙ１−、アルキニル−Ｙ１−、アリール−Ｙ１−、ヘテロアリール−Ｙ１−、−Ｐ（Ｏ）（Ｒｅ）２、−ＨＰ（Ｏ）（Ｒｅ）、−ＯＲａ、または−ＳＲｃである。Ｙ１は、Ｏ、ＮＲｄ、Ｓ、またはＳｅである。Ｒａは、ブロッキング部分である。Ｒｃは、ブロッキング基である。Ｒｄの各例は、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アシル、置換シリル、カルバメート、−Ｐ（Ｏ）（Ｒｅ）２、または−ＨＰ（Ｏ）（Ｒｅ）である。Ｒｅの各例は、独立して、アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、アルキル−Ｙ２−、アルケニル−Ｙ２−、アルキニル−Ｙ２−、アリール−Ｙ２−、またはヘテロアリール−Ｙ２−である。Ｙ２は、Ｏ、ＮＲｄ、またはＳである。Ｒ２の各例は、独立して、水素、−ＮＲｄＲｄ、Ｎ３、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキル−Ｙ１−、アルケニル−Ｙ１−、アルキニル−Ｙ１−、アリール−Ｙ１−、ヘテロアリール−Ｙ１−、−ＯＲｂ、または−ＳＲｃであり、ここで、Ｒｂは、ブロッキング部分である。Ｂａの各例は、独立して、ブロックされているかまたはブロックされていないアデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシルもしくは修飾核酸塩基である。Ｊの各例は、Ｓ、Ｓｅ、またはＢＨ３である。ｖは、整数１である。ＯＡは、固相支持体に接続された連結部分または核酸に接続された連結部分に接続されている。Ａは、アシル、アリール、アルキル、アラルキル、またはシリル部分である。Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、およびＧ５は、独立して、水素、アルキル、アラルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、もしくはアリールであり、あるいはＧ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、およびＧ５のうちの２つはＧ６であって、一緒になって、単環式もしくは多環式の、縮合もしくは非縮合の、約２０個までの環原子の、飽和、部分不飽和もしくは不飽和の、炭素環またはヘテロ原子含有環を形成し、ならびに式中、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、およびＧ５のうち４つ以下がＧ６である。
前記方法のいくつかの実施形態では、縮合中間体を式１の化合物に変換する工程は：縮合中間体をキャッピングする工程、およびキャッピングされた縮合中間体を修飾して、式５の化合物を生成する工程を含む。
Figure 2012510460
式５において、Ｒ１は、−ＮＲｄＲｄ、−Ｎ３、ハロゲン、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキル−Ｙ１−、アルケニル−Ｙ１−、アルキニル−Ｙ１−、アリール−Ｙ１−、ヘテロアリール−Ｙ１−、−Ｐ（Ｏ）（Ｒｅ）２、−ＨＰ（Ｏ）（Ｒｅ）、−ＯＲａ、または−ＳＲｃである。Ｙ１は、Ｏ、ＮＲｄ、Ｓ、またはＳｅである。Ｒａは、ブロッキング部分である。Ｒｃは、ブロッキング基である。Ｒｄの各例は、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アシル、置換シリル、カルバメート、−Ｐ（Ｏ）（Ｒｅ）２、または−ＨＰ（Ｏ）（Ｒｅ）である。Ｒｅの各例は、独立して、アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、アルキル−Ｙ２−、アルケニル−Ｙ２−、アルキニル−Ｙ２−、アリール−Ｙ２−、またはヘテロアリール−Ｙ２−である。Ｙ２は、Ｏ、ＮＲｄ、またはＳである。Ｒ２の各例は、独立して、水素、−ＮＲｄＲｄ、Ｎ３、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキル−Ｙ１−、アルケニル−Ｙ１−、アルキニル−Ｙ１−、アリール−Ｙ１−、ヘテロアリール−Ｙ１−、−ＯＲｂ、または−ＳＲｃであり、ここで、Ｒｂは、ブロッキング部分である。Ｂａの各例は、独立して、ブロックされているかまたはブロックされていないアデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシルもしくは修飾核酸塩基である。Ｊの各例は、Ｓ、Ｓｅ、またはＢＨ３である。ｖは、２〜ｎ−１の整数である。ＯＡは、固相支持体に接続された連結部分または核酸に接続された連結部分に接続されている。Ａは、アシル、アリール、アルキル、アラルキル、またはシリル部分である。Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、およびＧ５は、独立して、水素、アルキル、アラルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、もしくはアリールであり、あるいはＧ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、およびＧ５のうちの２つはＧ６であって、一緒になって、単環式もしくは多環式の、縮合もしくは非縮合の、約２０個までの環原子の、飽和、部分不飽和もしくは不飽和の、炭素環またはヘテロ原子含有環を形成し、ならびに式中、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、およびＧ５のうち４つ以下がＧ６である。
前記方法のいくつかの実施形態では、方法は、次の工程：（ａ）式５の化合物のＲ１を脱ブロックして、式４の化合物（式中、ｍは、少なくとも１であり、ＪはＳ、Ｓｅ、またはＢＨ３であり、そしてＤは、式Ａの部分である）を生成する工程；（ｂ）請求項１０に記載の方法を使用して、式４の化合物を反応させる工程であって、ここで、縮合中間体を変換する工程は、縮合中間体をキャッピングする工程、およびキャッピングされた縮合中間体を修飾して、式５の化合物（式中、ｖは、２より大きく、かつ約２００未満である）を生成する工程を含む工程；ならびに（ｃ）場合により、工程（ａ）および（ｂ）を反復して、式５の化合物（式中、ｖは、３より大きく、かつ約２００未満である）を形成する工程；をさらに含む。
前記方法の他の実施形態では、前記方法は、式５の化合物を式１の化合物（式中、各Ｂａ部分は、ブロックされていない。Ｒ１は、−ＯＨ、−ＳＨ、ＮＲｄＲｄ、−Ｎ３、ハロゲン、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキル−Ｙ１−、アルケニル−Ｙ１−、アルキニル−Ｙ１−、アリール−Ｙ１−、ヘテロアリール−Ｙ１−、−Ｐ（Ｏ）（Ｒｅ）２、−ＨＰ（Ｏ）（Ｒｅ）、−ＯＲａまたは−ＳＲｃである。Ｙ１は、Ｏ、ＮＲｄ、Ｓ、またはＳｅである。Ｒａは、ブロッキング部分である。Ｒｃは、ブロッキング基である。Ｒｄの各例は、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アシル、置換シリル、カルバメート、−Ｐ（Ｏ）（Ｒｅ）２、または−ＨＰ（Ｏ）（Ｒｅ）である。Ｒｅの各例は、独立して、水素、アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、アルキル−Ｙ２−、アルケニル−Ｙ２−、アルキニル−Ｙ２−、アリール−Ｙ２−、またはヘテロアリール−Ｙ２−であり、あるいはＮａ＋１、Ｌｉ＋１、もしくはＫ＋１であるカチオンである。Ｙ２は、Ｏ、ＮＲｄ、またはＳである。Ｒ２の各例は、独立して、水素、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＲｄＲｄ、−Ｎ３、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキル−Ｙ１−、アルケニル−Ｙ１−、アルキニル−Ｙ１−、アリール−Ｙ１−、ヘテロアリール−Ｙ１−、−ＯＲｂ、または−ＳＲｃであり、ここで、Ｒｂは、ブロッキング部分である。Ｒ３はＨである。Ｘの各例は、独立して、−Ｓ−Ｚ＋、−Ｓｅ−Ｚ＋、または−ＢＨ３ −Ｚ＋である。Ｚ＋は、アンモニウムイオン、アルキルアンモニウムイオン、ヘテロ芳香族イミニウムイオン、またはヘテロ環イミニウムイオンであって、それらのうちいずれかは、第一級、第二級、第三級もしくは第四級であり、あるいはＺ＋は一価の金属イオンである。）
に変換する工程をさらに含む。
前記方法のいくつかの実施形態では、縮合中間体を式１の化合物に変換する工程は、縮合中間体を酸性化して、式４の化合物（式中、ｍは少なくとも１であり、ＪはＯであり、そしてＤはＨである。）を生成する工程を含む。前記方法のいくつかの実施形態では、縮合中間体は、式Ａ’の部分を含む。
Figure 2012510460
Ａは水素であり、そしてＧ１およびＧ２は、独立して、アルキル、アラルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリール、もしくはアリールであり、そしてＧ３、Ｇ４、およびＧ５は、独立して、水素、アルキル、アラルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、もしくはアリールであり、あるいはＧ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、およびＧ５のうちの２つはＧ６であって、一緒になって、単環式もしくは多環式の、縮合もしくは非縮合の、約２０個までの環原子の、飽和、部分不飽和もしくは不飽和の、炭素環またはヘテロ原子含有環を形成し、ならびに式中、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、およびＧ５のうち４つ以下がＧ６である。
前記方法のいくつかの実施形態では、前記方法はさらに：（ａ）請求項１０に記載の方法を使用して、式４の化合物（式中、ｍは少なくとも１であり、ＪはＯであり、そしてＤはＨである）を反応させる工程であって、ここで、縮合中間体を式１の化合物に変換する工程は、縮合中間体を酸性化して、式４の化合物（式中、ｍは少なくとも２であり、かつ約２００未満であり；ＪはＯであり、そしてＤはＨである）を生成する工程を含む工程、ならびに（ｂ）場合により、工程（ａ）を反復して、式４の化合物（式中、ｍは２より大きく、かつ約２００未満である）を生成する工程；を含む。
前記方法のいくつかの実施形態では、酸性化する工程は、縮合中間体からプリンもしくはピリミジン部分を除去せずに、縮合中間体を式４の化合物に変換するのに有効な量のブレンステッドまたはルイス酸を添加する工程を含む。前記方法のなお他の実施形態では、酸性化する工程は、有機溶媒中１％トリフルオロ酢酸、有機溶媒中３％ジクロロ酢酸、または有機溶媒中３％トリクロロ酢酸を添加する工程を含む。前記方法のなお他の実施形態では、酸性化する工程は、カチオンスカベンジャーを添加する工程をさらに含む。前記方法のいくつかの実施形態では、カチオンスカベンジャーは、トリエチルシランまたはトリイソプロピルシランである。
前記方法のいくつかの実施形態では、縮合中間体を式１の化合物に変換する工程は、縮合中間体を酸性化する工程に先立って、Ｒ１を脱ブロックする工程をさらに含む。
前記方法の他の実施形態では、前記方法は、式４の化合物を修飾して、Ｘ部分を導入し、それによって、式１の化合物（式中、Ｒ３は、ブロッキング基または固相支持体に接続された連結部分である）を生成する工程をさらに含む。
前記方法のなお他の実施形態では、前記方法は、Ｘ修飾化合物を処理して、式１の化合物を生成する工程をさらに含み、式中、Ｒ１は、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＲｄＲｄ、−Ｎ３、ハロゲン、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキル−Ｙ１−、アルケニル−Ｙ１−、アルキニル−Ｙ１−、アリール−Ｙ１−、ヘテロアリール−Ｙ１−、−Ｐ（Ｏ）（Ｒｅ）２、−ＨＰ（Ｏ）（Ｒｅ）、−ＯＲａまたは−ＳＲｃである。Ｙ１は、Ｏ、ＮＲｄ、Ｓ、またはＳｅである。Ｒａは、ブロッキング部分である。Ｒｃは、ブロッキング基である。Ｒｄの各例は、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アシル、置換シリル、カルバメート、−Ｐ（Ｏ）（Ｒｅ）２、または−ＨＰ（Ｏ）（Ｒｅ）である。Ｒｅの各例は、独立して、水素、アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、アルキル−Ｙ２−、アルケニル−Ｙ２−、アルキニル−Ｙ２−、アリール−Ｙ２−、またはヘテロアリール−Ｙ２−であり、あるいはＮａ＋１、Ｌｉ＋１、もしくはＫ＋１であるカチオンであり；Ｙ２は、Ｏ、ＮＲｄ、またはＳである。Ｒ２の各例は、独立して、水素、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＲｄＲｄ、−Ｎ３、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキル−Ｙ１−、アルケニル−Ｙ１−、アルキニル−Ｙ１−、アリール−Ｙ１−、ヘテロアリール−Ｙ１−、−ＯＲｂ、または−ＳＲｃであり、ここで、Ｒｂは、ブロッキング部分である。各Ｂａ部分は、ブロックされていない。Ｒ３はＨである。Ｘの各例は、独立して、アルキル、アルコキシ、アリール、アルキルチオ、アシル、−ＮＲｆＲｆ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、アルケニルチオ、アルキニルチオ、−Ｓ−Ｚ＋、−Ｓｅ−Ｚ＋、または−ＢＨ３ −Ｚ＋である。Ｒｆの各例は、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、またはアリールである。Ｚ＋は、アンモニウムイオン、アルキルアンモニウムイオン、ヘテロ芳香族イミニウムイオン、またはヘテロ環イミニウムイオンであって、それらのうちいずれかは、第一級、第二級、第三級もしくは第四級であり、あるいはＺは一価の金属イオンである。ｎは、１より大きく、かつ約２００未満である。
前記方法のいくつかの実施形態では、修飾する工程は、ホウ素化剤、硫黄求電子剤、またはセレン求電子剤を使用して、実施される。
前記方法のいくつかの実施形態では、硫黄求電子剤は、以下の式のうちの１つを有する化合物である：
Ｓ８（式Ｂ）、Ｚ２４−Ｓ−Ｓ−Ｚ２５、またはＺ２４−Ｓ−Ｘ−Ｚ２５。
Ｚ２４およびＺ２５は、独立して、アルキル、アミノアルキル、シクロアルキル、ヘテロ環、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルキルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アシル、アミド、イミド、もしくはチオカルボニルであり、あるいはＺ２４およびＺ２５は、一緒になって、置換されていても置換されていなくてもよい３〜８員環の脂環またはヘテロ環を形成し；Ｘは、ＳＯ２、Ｏ、またはＮＲｆであり；ならびにＲｆは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、またはアリールである。
前記方法のいくつかの実施形態では、硫黄求電子剤は、式Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、またはＦの化合物である：
Figure 2012510460
前記方法のいくつかの実施形態では、セレン求電子剤は、以下の式のうちの１つを有する化合物である：
Ｓｅ（式Ｇ）、Ｚ２６−Ｓｅ−Ｓｅ−Ｚ２７、またはＺ２６−Ｓｅ−Ｘ−Ｚ２７。
Ｚ２６およびＺ２７は、独立して、アルキル、アミノアルキル、シクロアルキル、ヘテロ環、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルキルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アシル、アミド、イミド、もしくはチオカルボニルであり、あるいはＺ２６およびＺ２７は、一緒になって、置換されていても置換されていなくてもよい３〜８員環の脂環またはヘテロ環を形成し；Ｘは、ＳＯ２、Ｓ、Ｏ、またはＮＲｆであり；ならびにＲｆは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、またはアリールである。
前記方法のいくつかの実施形態では、セレン求電子剤は、式Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、またはＬの化合物である。
Figure 2012510460
前記方法のいくつかの実施形態では、ホウ素化剤は、ボラン−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＢＨ３・ＤＩＰＥＡ）、ボラン−ピリジン（ＢＨ３・Ｐｙ）、ボラン−２−クロロピリジン（ＢＨ３・ＣＰｙ）、ボラン−アニリン（ＢＨ３・Ａｎ）、ボラン−テトラヒドロフラン（ＢＨ３・ＴＨＦ）、またはボラン−ジメチルスルフィド（ＢＨ３・Ｍｅ２Ｓ）である。
前記方法のいくつかの実施形態では、修飾する工程は、シリル化試薬、続いて、硫黄求電子剤、セレン求電子剤、ホウ素化剤、アルキル化剤、アルデヒド、またはアシル化剤を使用して、実施される。
前記方法のいくつかの実施形態では、シリル化試薬は、クロロトリメチルシラン（ＴＭＳ−Ｃｌ）、トリイソプロピルシリルクロリド（ＴＥＰＳ−Ｃｌ）、ｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（ＴＢＤＭＳ−Ｃｌ）、ｔ−ブチルジフェニルシリルクロリド（ＴＢＤＰＳ−Ｃｌ）、１，１，１，３，３，３−ヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＳ）、Ｎ−トリメチルシリルジメチルアミン（ＴＭＳＤＭＡ）、Ｎ−トリメチルシリルジエチルアミン（ＴＭＳＤＥＡ）、Ｎ−トリメチルシリルアセトアミド（ＴＭＳＡ）、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（ＢＳＡ）、またはＮ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド（ＢＳＴＦＡ）である。
方法のいくつかの実施形態では、硫黄求電子剤は、以下の式のうちの１つを有する化合物である：Ｓ８（式Ｂ）、Ｚ２４−Ｓ−Ｓ−Ｚ２５、またはＺ２４−Ｓ−Ｘ−Ｚ２５、式中、Ｚ２４およびＺ２５は、独立して、アルキル、アミノアルキル、シクロアルキル、ヘテロ環、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルキルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アシル、アミド、イミド、もしくはチオカルボニルであり、あるいはＺ２４およびＺ２５は、一緒になって、置換されていても置換されていなくてもよい３〜８員環の脂環またはヘテロ環を形成し；Ｘは、ＳＯ２、Ｏ、またはＮＲｆであり；ならびにＲｆは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、またはアリールである。
前記方法のいくつかの実施形態では、硫黄求電子剤は、式Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、またはＦの化合物である：
Figure 2012510460
前記方法のいくつかの実施形態では、セレン求電子剤は、以下の式のうちの１つを有する化合物である：Ｓｅ（式Ｇ）、Ｚ２６−Ｓｅ−Ｓｅ−Ｚ２７、またはＺ２６−Ｓｅ−Ｘ−Ｚ２７、式中、Ｚ２６およびＺ２７は、独立して、アルキル、アミノアルキル、シクロアルキル、ヘテロ環、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルキルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アシル、アミド、イミド、もしくはチオカルボニルであり、あるいはＺ２６およびＺ２７は、一緒になって、置換されていても置換されていなくてもよい３〜８員環の脂環またはヘテロ環を形成し；Ｘは、ＳＯ２、Ｓ、Ｏ、またはＮＲｆであり；ならびにＲｆは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、またはアリールである。
前記方法のいくつかの実施形態では、セレン求電子剤は、式Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、またはＬの化合物である：
Figure 2012510460
前記方法のいくつかの実施形態では、ホウ素化剤は、ボラン−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＢＨ３・ＤＩＰＥＡ）、ボラン−ピリジン（ＢＨ３・Ｐｙ）、ボラン−２−クロロピリジン（ＢＨ３・ＣＰｙ）、ボラン−アニリン（ＢＨ３・Ａｎ）、ボラン−テトラヒドロフラン（ＢＨ３・ＴＨＦ）、またはボラン−ジメチルスルフィド（ＢＨ３・Ｍｅ２Ｓ）である。
前記方法のいくつかの実施形態では、アルキル化剤は、アルキルハライド、アルケニルハライド、アルキニルハライド、アルキルスルホネート、アルケニルスルホネート、またはアルキニルスルホネートである。前記方法の他の実施形態では、アルデヒドは、（パラ）−ホルムアルデヒド、アルキルアルデヒド、アルケニルアルデヒド、アルキニルアルデヒド、またはアリールアルデヒドである。
前記方法のいくつかの実施形態では、アシル化剤は、式ＭまたはＮの化合物である。
Figure 2012510460
Ｇ７は、アルキル、シクロアルキル、ヘテロ環、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルキルオキシ、アリールオキシ、またはヘテロアリールオキシでり；およびＭは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール、イミダゾール、アルキルトリアゾール、テトラゾール、ペンタフルオロベンゼン、または１−ヒドロキシベンゾトリアゾールである。
前記方法のいくつかの実施形態では、修飾する工程は、ハロゲン化試薬と反応させる工程、続いて、求核剤と反応させる工程によって、実施される。前記方法のいくつかの実施形態では、ハロゲン化試薬は、ＣＣｌ４、ＣＢｒ４、Ｃｌ２、Ｂｒ２、Ｉ２、塩化スルフリル（ＳＯ２Ｃｌ２）、ホスゲン、ビス（トリクロロメチル）カルボネート（ＢＴＣ）、一塩化硫黄、二塩化硫黄、クロラミン、ＣｕＣｌ２、Ｎ−クロロスクシンイミド（ＮＣＳ）、ＣＩ４、Ｎ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）、またはＮ−ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ）である。前記方法の他の実施形態では、求核剤は、ＮＲｆＲｆＨ、ＲｆＯＨ、またはＲｆＳＨであり、ここで、Ｒｆは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、またはアリールであり、そしてＮＲｆＲｆＨのＲｆのうち少なくとも１つは水素ではない。
前記方法のいくつかの実施形態では、キラル試薬は、式３の化合物（式中、Ｗ１はＮＨＧ５であり、そしてＷ２はＯＨである）である。前記方法のいくつかの実施形態では、キラル試薬は、式Ｏまたは式Ｐである。
Figure 2012510460
前記方法のいくつかの実施形態では、キラル試薬は、式Ｑまたは式Ｒである。
Figure 2012510460
前記方法のいくつかの実施形態では、Ｒａは、置換もしくは非置換のトリチルまたは置換シリルである。前記方法の他の実施形態では、式中、Ｒａは、置換もしくは非置換のトリチルまたは置換シリルである。前記方法の他の実施形態では、Ｒｂは、置換もしくは非置換トリチル、置換シリル、アセチル、アシル、または置換メチルエーテルである。
前記方法のいくつかの実施形態では、Ｒ３は、置換トリチル、アシル、置換シリル、または置換ベンジルであるブロッキング基である。前記方法の他の実施形態では、Ｒ３は、固相支持体に接続された連結部分である。
前記方法のいくつかの実施形態では、Ｂａ部分のブロッキング基は、ベンジル、アシル、ホルミル、ジアルキルホルムアミジニル、イソブチリル、フェノキシアセチル、またはトリチル部分であり、それらのうちいずれかは、置換されなくてもよく、もしくは置換されてもよい。前記方法のいくつかの実施形態では、Ｒ１は、−Ｎ３、−ＮＲｄＲｄ、アルキニルオキシ、または−ＯＨである。前記方法のいくつかの実施形態では、Ｒ１は、−Ｎ３、−ＮＲｄＲｄ、アルキニルオキシ、または−ＯＨである。前記方法の他の実施形態では、Ｒ２は、−ＮＲｄＲｄ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキル−Ｙ１−、アルケニル−Ｙ１−、アルキニル−Ｙ１−、アリール−Ｙ１−、またはヘテロアリール−Ｙ１−であり、そして蛍光部分または生体分子結合部分により置換される。前記方法のなお他の実施形態では、Ｒ２は、−ＮＲｄＲｄ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキル−Ｙ１−、アルケニル−Ｙ１−、アルキニル−Ｙ１−、アリール−Ｙ１−、またはヘテロアリール−Ｙ１−であり、そして蛍光部分または生体分子結合部分により置換される。
前記方法のいくつかの実施形態では、Ｒ２上の置換基は、蛍光部分である。前記方法の他の実施形態では、Ｒ２上の置換基は、ビオチンまたはアビジンである。前記方法のなお他の実施形態では、Ｒ２上の置換基は、蛍光部分である。前記方法のいくつかの実施形態では、前記Ｒ２上の置換基は、ビオチンまたはアビジンである。前記方法の他の実施形態では、Ｒ２は、−ＯＨ、−Ｎ３、水素、ハロゲン、アルコキシ、またはアルキニルオキシである。前記方法のなお他の実施形態では、Ｒ２は、−ＯＨ、−Ｎ３、水素、ハロゲン、アルコキシ、またはアルキニルオキシである。
前記方法のいくつかの実施形態では、Ｂａは、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、または２，６−ジアミノプリンである。前記方法の他の実施形態では、Ｂａは、蛍光部分または生体分子結合部分による置換によって修飾される。前記方法のなお他の実施形態では、Ｂａは、蛍光部分または生体分子結合部分による置換によって修飾される。前記方法のいくつかの実施形態では、Ｂａ上の置換基は、蛍光部分である。前記方法の他の実施形態では、Ｂａ上の置換基は、ビオチンまたはアビジンである。前記方法のなお他の実施形態では、Ｂａ上の置換基は、蛍光部分である。前記方法のいくつかの実施形態では、Ｂａ上の置換基は、ビオチンまたはアビジンである。
前記方法のいくつかの実施形態では、Ｚは、ピリジニウムイオン、トリエチルアンモニウムイオン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアンモニウムイオン、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウムイオン、ナトリウムイオン、またはカリウムイオンである。前記方法の他の実施形態では、Ｚは、ピリジニウムイオン、トリエチルアンモニウムイオン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアンモニウムイオン、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウムイオン、ナトリウムイオン、またはカリウムイオンである。前記方法のいくつかの実施形態では、Ｘは、アルキル、アルコキシ、−ＮＲｆＲｆ、−Ｓ−Ｚ＋、または−ＢＨ３ −Ｚ＋である。前記方法の他の実施形態では、Ｘは、アルキル、アルコキシ、−ＮＲｆＲｆ、−Ｓ−Ｚ＋、または−ＢＨ３ −Ｚ＋である。
前記方法の実施形態では、硫黄求電子剤は、式Ｆ、式Ｅまたは式Ｂである。前記方法のいくつかの実施形態では、硫黄求電子剤は、式Ｆ、式Ｅまたは式Ｂである。前記方法の他の実施形態では、セレン求電子剤は、式Ｇまたは式Ｌである。前記方法のなお他の実施形態では、セレン求電子剤は、式Ｇまたは式Ｌである。前記方法のいくつかの実施形態では、ホウ素化剤は、ボラン−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＢＨ３・ＤＩＰＥＡ）、ボラン−２−クロロピリジン（ＢＨ３・ＣＰｙ）、ボラン−テトラヒドロフラン（ＢＨ３・ＴＨＦ）、またはボラン−ジメチルスルフィド（ＢＨ３・Ｍｅ２Ｓ）である。前記方法の他の実施形態では、ハロゲン化剤は、ＣＣｌ４、ＣＢｒ４、Ｃｌ２、塩化スルフリル（ＳＯ２Ｃｌ２）、またはＮ−クロロスクシンイミド（ＮＣＳ）である。前記方法のなお他の実施形態では、縮合試薬は、ビス（トリクロロメチル）カルボネート（ＢＴＣ）、Ｐｈ３ＰＣｌ２、またはＮ，Ｎ’−ビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）ホスフィン酸クロリド（ＢｏｐＣｌ）である。
本発明の他の態様では、サンプル中の標的分子を同定または検出する方法が提供され、方法は、標的分子を含有することが疑わしいサンプルと、本発明の方法に従って合成される式１の核酸センサー分子とを接触させる工程を含み、ここで、シグナル発生ユニットによって発生するシグナルの変化は、前記サンプル中の前記標的の存在を示す。核酸センサー分子は、標的分子に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、複数の核酸センサー分子が存在する。いくつかの実施形態では、複数の核酸センサー分子は、異なる標的分子に特異的に結合する核酸センサー分子を含む。場合によっては、前記方法は、シグナル発生ユニットによって発生するシグナルの変化を定量して、サンプル中の標的分子の量を定量する工程をさらに含む。シグナル発生ユニットは、蛍光、表面プラズモン共鳴、蛍光消光、化学発光、干渉計測、または屈折率検出を含むが、これらに限定されない任意の種類のシグナルを検出する。
検出しようとするサンプルは、環境サンプル、バイオハザード材料、有機サンプル、薬物、毒素、フレーバー、香料、または生物学的サンプルである。生物学的サンプルは、細胞、細胞抽出物、細胞溶解物、組織、組織抽出物、体液、血清、血液または血液産物である。前記方法のいくつかの実施形態では、標的分子の存在は、病的状態の存在を示す。前記方法のいくつかの実施形態では、標的分子の存在は、所望の分子の存在を示す。
本発明の他の態様では、核酸鋳型から核酸の所望の領域を増幅する方法が提供され、方法は：（ａ）目的のコンセンサス配列に相補的な一定の（fixed）ヌクレオチド配列のある領域を有する複数の第１のＰＣＲプライマーを提供する工程；（ｂ）複数の第２のＰＣＲプライマーを提供する工程、（ｃ）第１のプライマーおよび第２のプライマーによってフランキングされる核酸領域が特異的に増幅されるように、複数の第１のプライマーのサブセットが、実質的にそれが鋳型のどこで生じようとも目的のコンセンサス配列に結合し、そして複数の第２のプライマーのサブセットが、第１のプライマーから隔たった（removed from）場所で鋳型に結合するという条件下で、複数の第１のＰＣＲプライマーおよび複数の第２のＰＣＲプライマーを使用するＰＣＲを介して、核酸鋳型を増幅する工程であって、複数の第１のＰＣＲプライマーおよび／または複数の第２のＰＣＴプライマーが本発明の方法に従って生成される式１の核酸分子である工程、を含む。
いくつかの実施態様では、鋳型は、ゲノムＤＮＡである。いくつかの実施態様では、鋳型は、真核生物のゲノムＤＮＡである。いくつかの実施態様では、鋳型は、ヒトのゲノムＤＮＡである。いくつかの実施態様では、鋳型は、原核生物のＤＮＡである。いくつかの実施形態では、鋳型は、クローニングされたゲノムＤＮＡ、ＤＮＡのサブゲノム領域、染色体、またはサブ染色体領域であるＤＮＡである。いくつかの実施態様では、鋳型は、ＲＮＡである。
文献の援用
本明細書において開示されるすべての刊行物および特許出願は、それぞれ個々の刊行物または特許出願が、あたかも具体的かつ個別に参考として組み込まれて示されているが如く、それらの全体が、同程度に参考として、本明細書に援用される。
図面の簡単な説明
本発明の新規の特徴については、添付の特許請求の範囲に詳細に記載されている。本発明の特徴および利点は、本発明の原理を利用する例示的な実施形態を記載する以下の詳細な説明、および以下の添付の図面を参考にして、より良好に理解されよう。
（ＳＰ）−４ｔｔ（ＣＤＣｌ３）の１Ｈ ＮＭＲスペクトル （ＳＰ）−４ｔｔ（ＣＤＣｌ３）の３１Ｐ ＮＭＲスペクトル （ＲＰ）−４ｔｔ（ＣＤＣｌ３）の１Ｈ ＮＭＲスペクトル （ＲＰ）−４ｔｔ（ＣＤＣｌ３）の３１Ｐ ＮＭＲスペクトル （ＳＰ）−５ｔｔの粗ＵＰＬＣ(登録商標)プロファイル Ｐｈ３ＰＣｌ２の代わりにＢＴＣを使用した（ＳＰ）−５ｔｔの粗ＵＰＬＣ(登録商標)プロファイル （ＳＰ）−５ｔｔの粗ＵＰＬＣ(登録商標)プロファイル ＰＨ３ＰＣＬ２の代わりにＢＴＣを使用した（ＳＰ）−５ｔｔの粗ＵＰＬＣ(登録商標)プロファイル （ＲＰ）−５ｔｔの粗ＵＰＬＣ(登録商標)プロファイル （ＲＰ）−５ｔｔの粗ＵＰＬＣ(登録商標)プロファイル （ＲＰ）−５ｔｔの粗ＵＰＬＣ(登録商標)プロファイル （ＳＰ）−５ｃｔの粗ＵＰＬＣ(登録商標)プロファイル （ＳＰ）−５ｃｔの粗ＵＰＬＣ(登録商標)プロファイル （ＲＰ）−５ｃｔの粗ＵＰＬＣ(登録商標)プロファイル （ＲＰ）−５ｃｔの粗ＵＰＬＣ(登録商標)プロファイル （ＳＰ）−５ａｔの粗ＵＰＬＣ(登録商標)プロファイル （ＲＰ）−５ａｔの粗ＵＰＬＣ(登録商標)プロファイル （ＳＰ）−５ｇｔの粗ＵＰＬＣ(登録商標)プロファイル （ＲＰ）−５ｇｔの粗ＵＰＬＣ(登録商標)プロファイル （ＳＰ）−５ｔｔの粗ＵＰＬＣ(登録商標)プロファイル （ＳＰ）−５ｔｔの粗ＵＰＬＣ(登録商標)プロファイル （ＳＰ）−５ｔｔの粗ＵＰＬＣ(登録商標)プロファイル （ＳＰ）−５ｔｔの粗ＵＰＬＣ(登録商標)プロファイル （ＲＰ）−５ｔｔの粗ＵＰＬＣ(登録商標)プロファイル （ＲＰ）−５ｔｔの粗ＵＰＬＣ(登録商標)プロファイル （ＳＰ）−５ｃｔの粗ＵＰＬＣ(登録商標)プロファイル （ＲＰ）−５ｃｔの粗ＵＰＬＣ(登録商標)プロファイル （ＳＰ）−５ａｔの粗ＵＰＬＣ(登録商標)プロファイル （ＳＰ）−５ａｔの粗ＵＰＬＣ(登録商標)プロファイル （ＳＰ）−５ａｔの粗ＵＰＬＣ(登録商標)プロファイル （ＲＰ）−５ａｔの粗ＵＰＬＣ(登録商標)プロファイル （ＲＰ）−５ａｔの粗ＵＰＬＣ(登録商標)プロファイル （ＳＰ）−５ｇｔの粗ＵＰＬＣ(登録商標)プロファイル （ＲＰ）−５ｇｔの粗ＵＰＬＣ(登録商標)プロファイル （ＳＰ）−７ｔｔの粗ＵＰＬＣ(登録商標)プロファイル （ＲＰ）−７ｔｔの粗ＵＰＬＣ(登録商標)プロファイル （ＳＰ）−８ｔｔの粗ＵＰＬＣ(登録商標)プロファイル （ＲＰ）−８ｔｔの粗ＵＰＬＣ(登録商標)プロファイル Ａｌｌ−（ＳＰ）−［ＴＰＳ］３Ｔの粗ＵＰＬＣ(登録商標)プロファイル Ａｌｌ−（ＳＰ）−［ＴＰＳ］３ＴのＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳスペクトル （ＳＰ，ＲＰ，ＳＰ）−［ＴＰＳ］３Ｔの粗ＵＰＬＣ(登録商標)プロファイル （ＳＰ，ＲＰ，ＳＰ）−［ＴＰＳ］３ＴのＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳスペクトル （ＲＰ，ＳＰ，ＲＰ）−［ＴＰＳ］３Ｔの粗ＵＰＬＣ(登録商標)プロファイル （ＲＰ，ＳＰ，ＲＰ）−［ＴＰＳ］３ＴのＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳスペクトル Ａｌｌ−（ＲＰ）−［ＴＰＳ］３Ｔの粗ＵＰＬＣ(登録商標)プロファイル Ａｌｌ−（ＲＰ）−［ＴＰＳ］３ＴのＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳスペクトル （ＳＰ）−９ｕＭｕの粗ＵＰＬＣ(登録商標)プロファイル （ＳＰ）−９ｕＭｕのＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳスペクトル （ＲＰ）−９ｕＭｕの粗ＵＰＬＣ(登録商標)プロファイル （ＲＰ）−９ｕＭｕのＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳスペクトル （ＳＰ）−１０ｕＦｕの粗ＵＰＬＣ(登録商標)プロファイル （ＳＰ）−１０ｕＦｕのＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳスペクトル （ＲＰ）−１０ｕＦｕの粗ＵＰＬＣ(登録商標)プロファイル （ＲＰ）−１０ｕＦｕのＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳスペクトル （ＳＰ）−１１ｎｔの粗ＵＰＬＣ(登録商標)プロファイル （ＳＰ）−１１ｎｔのＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳスペクトル （ＲＰ）−１１ｎｔの粗ＵＰＬＣ(登録商標)プロファイル （ＲＰ）−１１ｎｔのＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳスペクトル
定義
別段の定めのない限り、明細書および特許請求の範囲を含む本出願において使用される以下の用語は、下記の定義を有する。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、別段文脈が明示しない限り、複数の指示対象も含むことが留意されなければならない。別段の指示のない限り、質量分析、ＮＭＲ、ＨＰＬＣ、タンパク質化学、生化学、組み換えＤＮＡ技術および薬理学の従来の方法を用いる。本明細書において、「または」あるいは「および」の使用は、別段の定めのない限り、「および／または」を意味する。さらに、用語「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含んだ（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」のような他の形態の使用は、限定的ではない。
用語「核酸」は、ポリ−またはオリゴ−リボヌクレオチド（ＲＮＡ）およびポリ−またはオリゴ−デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）；核酸塩基および／または修飾核酸塩基のＮ−グリコシドもしくはＣ−グリコシドから誘導されるＲＮＡまたはＤＮＡ；糖および／または修飾糖から誘導される核酸；ならびにリン酸化架橋および／または修飾リン原子架橋から誘導される核酸を包含する。前記用語は、核酸塩基、修飾核酸塩基、糖、修飾糖、リン酸化架橋または修飾リン原子架橋の任意の組み合わせを含有する核酸を包含する。例には、リボース部分を含有する核酸、デオキシ−リボース部分を含有する核酸、リボースおよびデオキシリボース部分を含有する核酸、リボースおよび修飾されたリボース部分を含有する核酸が含まれるが、これらに限定されない。接頭辞であるポリ−は、約１〜約１０，０００ヌクレオチドモノマー単位を含有する核酸を指し、ここで、接頭辞であるオリゴ−は、約１〜約２００ヌクレオチドモノマー単位を含有する核酸を指す。
用語「核酸塩基」は、配列特異的様式で、１つの核酸鎖を別の相補的な鎖に結合する水素結合に関与する核酸の部分を指す。最も一般的に天然に存在する核酸塩基は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、ウラシル（Ｕ）、シトシン（Ｃ）、およびチミン（Ｔ）である。
用語「修飾核酸塩基」は、核酸塩基を置き換えることができる部分を指す。修飾核酸塩基は、核酸塩基の空間的配置、電子的特性、または他のいくつかの物理化学的特性を模倣し、そして配列特異的様式で、１つの核酸鎖を別のものに結合する水素結合の特性を保持する。修飾核酸塩基は、融解挙動、細胞内酵素による認識またはオリゴヌクレオチド二重鎖の活性に実質的に影響を及ぼすことなく、５種類の天然に存在する塩基（ウラシル、チミン、アデニン、シトシン、またはグアニン）のすべてと対を形成することができる。
用語「ヌクレオシド」は、核酸塩基または修飾核酸塩基が、糖または修飾糖に共有結合する部分を指す。
用語「糖」は、閉環および／または開環形態の単糖を指す。糖には、リボース、デオキシリボース、ペントフラノース、ペントピラノース、およびヘキソピラノース部分が含まれるが、これらに限定されない。
用語「修飾糖」は、糖を置き換えることができる部分を指す。修飾糖は、空間的配置、電子特性、または糖の他のいくつかの物理化学的特性を模倣する。
用語「ヌクレオチド」は、核酸塩基または修飾核酸塩基が、糖または修飾糖に共有結合し、糖または修飾糖が、リン酸基もしくは修飾リン原子部分に共有結合する部分を指す。
用語「キラル試薬」は、キラルまたはエナンチオピュアであり、そして核酸合成における不斉導入に使用することができる化合物を指す。
用語「キラル配位子」または「キラル補助基」は、キラルまたはエナンチオピュアであり、そして反応の立体化学的結果を制御する部分を指す。
縮合反応において、用語「縮合試薬」は、より低い反応性の部位を活性化し、そしてそれを、求核剤によってより攻撃され易くする試薬を指す。
用語「ブロッキング部分」は、官能基の反応性を一時的にマスクする基を指す。官能基は、続いて、ブロッキング部分の除去によって、脱マスクすることができる。
用語「ホウ素化剤」、「硫黄求電子剤」、「セレン求電子剤」は、リン原子における修飾のために、それぞれ、ＢＨ３、Ｓ、およびＳｅ基を導入するための修飾する工程において有用な化合物を指す。
用語「部分」は、分子の特異的セグメントまたは官能基を指す。化学部分は、しばしば、分子中に包埋されるか、または付加される化学的実体として認識される。
用語「固相支持体」は、核酸の合成大量生産を可能にする任意の支持体を指し、そして必要時に再利用することができる。本明細書において、前記用語は、核酸を合成するために実施される反応工程において用いられる媒体に不溶性であり、かつ反応基を含むように誘導体化されるポリマーを指す。
用語「連結部分」は、末端のヌクレオシドと固相支持体との間または末端のヌクレオシドと別のヌクレオシド、ヌクレオチド、もしくは核酸との間に場合により位置する任意の部分を指す。
本明細書において「処置」もしくは「処置する」または「軽減する」または「改善する」は、本明細書において互換可能に使用される。これらの用語は、治療上の利益および／または予防上の利益を含むが、これらに限定されない利益または所望の結果を得るためのアプローチを指す。治療上の利益とは、処置している基礎疾患の根治または改善を意味する。また、治療上の利益は、患者がなお、基礎疾患に罹患し得るにもかかわらず、患者において改善が観察されるような、基礎疾患に関連する１つ以上の生理学的徴候の根治または改善によって達成される。予防上の利益のために、組成物を、特定の疾患を発症する危険性がある患者、または疾患の１つ以上の生理学的徴候が報告されている患者に、たとえ、この疾患の診断がなされていなかったとしても、投与してもよい。
本明細書において「治療効果」という用語は、上記で説明するような治療上の利益および／または予防上の利益を包含する。予防効果は、疾患もしくは病態の出現を延期または排除すること、疾患もしくは病態の徴候の発生を延期または排除すること、疾患もしくは病態の進行を遅延、停止、または反転させること、あるいはそれらの任意の組み合わせを含む。
「アルキル」基は、脂肪族炭化水素基を指す。アルキル部分は、飽和アルキル基（任意の不飽和単位、例えば、炭素−炭素二重結合もしくは炭素−炭素三重結合を含有しないことを意味する）であってもよく、またはアルキル部分は、不飽和アルキル基（少なくとも１つの不飽和単位を含有することを意味する）であってもよい。アルキル部分は、飽和もしくは不飽和にかかわらず、分枝状、直鎖であるか、または環部分を含んでもよい。アルキルの付着点は、環の部分ではない炭素原子にある。
「アルキル」部分は、１〜１０個の炭素原子を有し得る（本明細書において出現する場合は常に、「１〜１０」のような数の範囲は、所与の範囲の各整数を指す；例えば、「１〜１０個の炭素原子」は、アルキル基が、１個の炭素原子、２個の炭素原子、３個の炭素原子など、１０個まで（１０個を含む）の炭素原子からなり得ることを意味するが、本定義はまた、数字の範囲は明示されない用語「アルキル」の存在をカバーする）。アルキルは、分枝状および直鎖のアルキル基の両方を含む。本明細書に記載の化合物のアルキル基は、「Ｃ１〜Ｃ６アルキル」または類似の呼称で記載され得る。単なる例として、「Ｃ１〜Ｃ６アルキル」は、アルキル鎖中に１、２、３、４、５、もしくは６個の炭素原子が存在することを示し、即ち、アルキル鎖は、メチル、エチル、プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、およびｔ−ブチルからなる群から選択される。典型的なアルキル基は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、第三級ブチル、ペンチル、ヘキシル、アリル、シクロプロピルメチル、シクロブチルメチル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシルメチルなどを含むが、これらに全く限定されない。一態様では、アルキルは、Ｃ１〜Ｃ６アルキルである。
本明細書において、用語「アリール」は、芳香環を指し、ここで、環を形成する原子のそれぞれは、炭素原子である。アリール環は、５、６、７、８、９、または９個を超える炭素原子によって形成される。アリール基は、置換または非置換である。一態様では、アリールは、フェニルまたはナフタレニルである。構造に依存して、アリール基は、モノラジカルまたはジラジカル（即ち、アリーレン基）であり得る。一態様では、アリールはＣ6〜Ｃ10アリールである。
「ヘテロアリール」または代替的に、「ヘテロ芳香族」は、窒素、酸素および硫黄から選択される１個以上の環ヘテロ原子を含み、そして単環式、二環式、三環式または四環式の環系であり得る５−〜１８−員環の芳香族ラジカル（例えば、Ｃ５〜Ｃ１３ヘテロアリール）を指す。本明細書において出現する場合は常に、「５〜１８」のような数の範囲は、所与の範囲の各整数を指す；例えば、「５〜１８個の環原子」は、ヘテロアリール基が、５個の環原子、６個の環原子など、１８個まで（１８個を含む）の環原子からなり得ることを意味する。Ｎ含有「ヘテロ芳香族」または「ヘテロアリール」部分は、環の骨格原子のうち少なくとも１個は窒素原子である芳香族基を指す。多環式ヘテロアリール基は、縮合型であってもよくまたは非縮合型であってもよい。ヘテロアリールラジカルにおけるヘテロ原子は、場合により酸化される。１個以上の窒素原子は、存在する場合、場合任意により、四級化される。ヘテロアリールは、環の任意の原子を介して、残りの分子に付着される。ヘテロアリールの例には、アゼピニル、アクリジニル、ベンゾイミダゾリル、ベンズインドリル、１，３−ベンゾジオキソリル、ベンゾフラニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾ［ｄ］チアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキセピニル、ベンゾ［ｂ］［１，４］オキサジニル、１，４−ベンゾジオキサニル、ベンゾナフトフラニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾジオキソリル、ベンゾジオキシニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾピラニル、ベンゾピラノニル、ベンゾフラニル、ベンゾフラノニル、ベンゾフラザニル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチエニル（ベンゾチオフェニル）、ベンゾチエノ［３，２−ｄ］ピリミジニル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾ［４，６］イミダゾ［１，２−ａ］ピリジニル、カルバゾリル、シンノリニル、シクロペンタ［ｄ｜ピリミジニル、６，７−ジヒドロ−５Ｈ−シクロペンタ［４，５］チエノ［２，３−ｄ］ピリミジニル、５，６−ジヒドロベンゾ［ｈ］キナゾリニル、５，６−ジヒドロベンゾ［ｈ］シンノリニル、６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［６，７］シクロヘプタ［１，２−ｃ］ピリダジニル、ジベンゾフラニル、ジベンゾチオフェニル、フラニル、フラザニル、フラノニル、フロ［３，２−ｃ］ピリジニル、５，６，７，８，９，１０−ヘキサヒドロシクロオクタ［ｄ］ピリミジニル、５，６，７，８，９，１０−ヘキサヒドロシクロオクタ［ｄ］ピリダジニル、５，６，７，８，９，１０−ヘキサヒドロシクロオクタ［ｄ］ピリジニル、イソチアゾリル、イミダゾリル、インダゾリル、インドリル、インダゾリル、イソインドリル、インドリニル、イソインドリニル、イソキノリル、インドリジニル、イソキサゾリル、５，８−メタノ−５，６，７，８−テトラヒドロキナゾリニル、ナフチリジニル、１，６−ナフチリジノニル、オキサジアゾリル、２−オキソアゼピニル、オキサゾリル、オキシラニル、５，６，６ａ，７，８，９，１０，１０ａ−オクタヒドロベンゾ［ｈ］キナゾリニル、１−フェニル−１Ｈ−ピロリル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニル、フタラジニル、プテリジニル、プリニル、ピラニル、ピロリル、ピラゾリル、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジニル、ピリジニル、ピリド［３，２−ｄ］ピリミジニル、ピリド［３，４−ｄ］ピリミジニル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピロリル、キナゾリニル、キノキサリニル、キノリニル、イソキノリニル、テトラヒドロキノリニル、５，６，７，８−テトラヒドロキナゾリニル、５，６，７，８−テトラヒドロベンゾ［４，５］チエノ［２，３−ｄ］ピリミジニル、６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−シクロヘプタ［４，５］チエノ［２，３−ｄ］ピリミジニル、５，６，７，８−テトラヒドロピリド［４，５−ｃ］ピリダジニル、チアゾリル、ジアジアゾリル、チアピラニル、トリアゾリル、テトラゾリル、トリアジニル、チエノ［２，３−ｄ］ピリミジニル、チエノ［３，２−ｄ］ピリミジニル、チエノ［２，３−ｃ］ピリジニル、およびチオフェニル（即ち、チエニル）が含まれるが、これらに限定されない。本明細書において別段の定めのない限り、ヘテロアリール部分は、独立して：アルキル、ヘテロアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、ヒドロキシ、ハロ、シアノ、ニトロ、オキソ、チオキソ、トリメチルシラニル、−ＯＲａ、−ＳＲａ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒａ、−Ｎ（Ｒａ）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲａ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒａ）２、−Ｎ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）ＯＲａ、−Ｎ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−Ｎ（Ｒａ）Ｓ（Ｏ）ｔＲａ（式中、ｔは１もしくは２である）、−Ｓ（Ｏ）ｔＯＲａ（式中、ｔは１もしくは２である）、または−Ｓ（Ｏ）ｔＮ（Ｒａ）２（式中、ｔは１もしくは２である）である１つ以上の置換基によって、場合により置換され、式中、各Ｒａは、独立して、水素、アルキル、フルオロアルキル、カルボシクリル、カルボシクリルアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキルである。
用語「脂環」は、脂肪族かつ環式の両方であるすべての炭素部分を指す。脂環基は、飽和または不飽和のいずれかであるが、芳香族の特徴を有さない１つ以上のすべての炭素環を含有する。脂環基は、置換または非置換であり、そして１〜１０個の炭素原子を含有し得る。一態様では、脂環式は、単環式シクロアルカンである。他の態様では、脂環式は、二環式シクロアルカンである。
用語「アラルキル」は、アリール基により置換されたアルキル基を指す。適切なアラルキル基は、ベンジル、ピコリルなどを含み、それらのうちすべてが、場合により置換されていてもよい。
「アシル部分」は、アルキル（Ｃ＝Ｏ）、アリール（Ｃ＝Ｏ）、またはアラルキル（Ｃ＝Ｏ）基を指す。アシル部分は、カルボニル基と炭化水素基との間のオキシ、アミノ、チオ、またはセレノである介在部分（Ｙ）を有し得る。例えば、アシル基は、アルキル−Ｙ−（Ｃ＝Ｏ）、アリール−Ｙ−（Ｃ＝Ｏ）またはアラルキル−Ｙ−（Ｃ＝Ｏ）であり得る。
「アルケニル」基は、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含有する直鎖、分枝鎖、および環式炭化水素基である。アルケニル基は置換され得る。
「アルキニル」基は、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含有する直鎖、分枝鎖、および環式炭化水素基である。アルキニル基は置換され得る。
「アルコキシ」基は、酸素に連結されたアルキル基、即ち、（アルキル）−Ｏ−基を指し、ここで、アルキルは、本明細書において定義されるとおりである。例には、メトキシ（−ＯＣＨ３）またはエトキシ（−ＯＣＨ２ＣＨ３）基が含まれる。
「アルケニルオキシ」基は、酸素に連結されたアルケニル基、即ち、（アルケニル）−Ｏ−基を指し、ここで、アルケニルは、本明細書において定義されるとおりである。
「アルキニルオキシ」基は、酸素に連結されたアルキニル基、即ち、（アルキニル）−Ｏ−基を指し、ここで、アルキニルは、本明細書において定義されるとおりである。
「アリールオキシ」基は、酸素に連結されたアリール基、即ち、（アリール）−Ｏ−基を指し、ここで、アリールは、本明細書において定義されるとおりである。例として、フェノキシ（−ＯＣ６Ｈ５）が含まれる。
用語「アルキルセレノ」は、置換セレノ基が付着しているアルキル基、即ち、（アルキル）−Ｓｅ−基を指し、ここで、アルキルは、本明細書において定義されるとおりである。
用語「アルケニルセレノ」は、置換セレノ基が付着しているアルケニル基、即ち、（アルケニル）−Ｓｅ−基を指し、ここで、アルケニルは、本明細書において定義されるとおりである。
用語「アルキニルセレノ」は、置換セレノ基が付着しているアルキニル基、即ち、（アルキニル）−Ｓｅ−基を指し、ここで、アルケニルは、本明細書において定義されるとおりである。
用語「アルキルチオ」は、架橋硫黄原子が付着しているアルキル基、即ち、（アルキル）−Ｓ−基を指し、ここで、アルキルは、本明細書において定義されるとおりである。例えば、アルキルチオは、メチルチオなどである。
用語「アルケニルチオ」は、架橋硫黄原子が付着しているアルケニル基、即ち、（アルケニル）−Ｓ−基を指し、ここで、アルケニルは、本明細書において定義されるとおりである。
用語「アルキニルチオ」は、架橋硫黄原子が付着しているアルキニル基、即ち、（アルキニル）−Ｓ−基を指し、ここで、アルケニルは、本明細書において定義されるとおりである。
用語「アルキルアミノ」は、少なくとも１つのアルキル基で置換されたアミノ基、即ち、−ＮＨ（アルキル）または−Ｎ−（アルキル）２を指し、ここで、アルキルは、本明細書において定義されるとおりである。
用語「アルケニルアミノ」は、少なくとも１つのアルケニル基で置換されたアミノ基、即ち、−ＮＨ（アルケニル）または−Ｎ−（アルケニル）２を指し、ここで、アルケニルは、本明細書において定義されるとおりである。
用語「アルキニルアミノ」は、少なくとも１つのアルキニル基で置換されたアミノ基、即ち、−ＮＨ（アルキニル）または−Ｎ−（アルキニル）２を指し、ここで、アルキニルは、本明細書において定義されるとおりである。
用語「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素を含むことが意図される。
「蛍光基」は、選択された波長を有する光で励起される場合に、異なる波長の光を発光する分子を指す。蛍光基には、インドール基、フルオレセイン、テトラメチルローダミン、テキサスレッド、ＢＯＤＩＰＹ、５−［（２−アミノエチル）アミノ］ナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、クマリンおよびルシファーイエローが含まれるが、これらに限定されない。
「アンモニウムイオン」は、化学式ＮＨ４ ＋の正に荷電した多原子カチオンである。
「アルキルアンモニウムイオン」は、その水素原子のうち少なくとも１つがアルキル基によって置き換えらたアンモニウムイオンであり、ここで、アルキルは、本明細書において定義される。例には、トリエチルアンモニウムイオン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアンモニウムイオンが含まれる。
「イミニウムイオン」は、一般構造Ｒ２Ｃ＝ＮＲ２ ＋を有する。Ｒ基は、本明細書において定義されるアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール基を指す。「ヘテロ芳香族イミニウムイオン」は、窒素およびその付着したＲ基がヘテロ芳香環を形成するイミニウムイオンを指す。「ヘテロ環イミニウムイオン」は、窒素およびその付着したＲ基がヘテロ環を形成するイミニウムイオンを指す。
用語「アミノ」または「アミン」は、−Ｎ（Ｒｈ）２ラジカル基を指し、式中、各Ｒｈは、本明細書において、別段の定めのない限り、独立して、水素、アルキル、フルオロアルキル、カルボシクリル、カルボシクリルアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキルである。−Ｎ（Ｒｆ）２基が、水素以外の２つのＲｆを有する場合、それらは、窒素原子と組み合わせて、４−、５−、６−、または７−員環を形成することができる。例えば、−Ｎ（Ｒｆ）２は、１−ピロリジニルおよび４−モルホリニルを含むが、これらに限定されないことを意味する。水素、アルキル、フルオロアルキル、カルボシクリル、カルボシクリルアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキルのうちの任意の１つ以上は、独立して、アルキル、ヘテロアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、ヒドロキシ、ハロ、シアノ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、ニトロ、トリメチルシラニル、−ＯＲ１、−ＳＲ１、−ＯＣ（Ｏ）Ｒｉ、−ＮＣＲｉ）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒｉ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲｉ、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｉ）２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｉ）２、−Ｎ（Ｒｉ）Ｃ（Ｏ）ＯＲｉ、−Ｎ（Ｒｉ）Ｃ（Ｏ）Ｒｉ、−Ｎ（Ｒｉ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｉ）２、Ｎ（Ｒｉ）Ｃ（ＮＲｉ）Ｎ（Ｒｉ）２、−Ｎ（Ｒｉ）Ｓ（０）ｔＲｉ（式中、ｔは１もしくは２である）、−Ｓ（Ｏ）ｔＯＲｆ（式中、ｔは１もしくは２である）、または−Ｓ（Ｏ）ｔＮ（Ｒｆ）２（式中、ｔは１もしくは２である）である１つ以上の置換基によって、場合により置換され、ここで、各Ｒｉは、独立して、水素、アルキル、フルオロアルキル、カルボシクリル、カルボシクリルアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキルである。
本明細書において「カルバメート」は、式−Ｃ（Ｏ）ＯＲを有するアミノ基に付着する部分を指し、式中、Ｒは、アルキル、フルオロアルキル、カルボシクリル、カルボシクリルアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキルである。例には、Ｂｏｃ（ｔｅｒｔ−ブチル−ＯＣ（Ｏ））、ＣＢｚ（ベンジル−ＯＣ（Ｏ）−）、Ｔｅｏｃ（Ｍｅ３ＳｉＣＨ２ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）−）、ａｌｌｏｃ（アリル−ＯＣ（Ｏ）−）、またはＦｍｏｃ（９−フルオレニルメチル−ＯＣ（Ｏ）−）が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書において「置換シリル」は、式Ｒ３Ｓｉ−を有する部分を指す。例には、ＴＢＤＭＳ（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）、ＴＢＤＰＳ（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）またはＴＭＳ（トリメチルシリル）が含まれるが、これらに限定されない。
用語「チオール」は、−ＳＨ基を指し、そして置換チオール基、即ち、−ＳＲｊ基を含み、式中、Ｒｊは、それぞれ独立して、本明細書において定義される置換もしくは非置換アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアラルキル、ヘテロシクリルまたはヘテロシクリルアルキル基である。
合成方法
キラルＸ−ホスホネート部分を含む核酸の合成方法の一般的考察。
本方法は、リン原子修飾核酸の効率的な合成を提供し、ここで、リン原子における立体化学的配置が制御され、それ故、立体配置が定義されたオリゴヌクレオチドを生成する。前記方法は、ジアステレオマー混合体の複雑な分離の必要性を排除し、そして容易に入手可能な安価なアキラル出発物質の使用を可能にする。本明細書において開示する合成方法は、スキーム１に示すような、式１の化合物であるリン原子修飾キラルＸ−ホスホネート部分を含む核酸を提供するための、アキラルＨ−ホスホネート部分（式２）と、ヒドロキシ基のような求核部分を含むヌクレオシド（式４−１、式中、Ｑ１は、ブロッキング基、支持体またはヌクレオチド鎖に対する連結部分のうちいずれかである）との不斉反応を含む。そのような様式では、高いジアステレオマー純度を有するヌクレオチドポリマーまたはオリゴマーが生成される。いくつかの実施形態では、核酸は、核酸塩基、糖部分、および／または保護基の修飾を含有する。
スキーム１．式１のキラルＸ−ホスホネート部分を含む核酸の合成
Figure 2012510460
式２のアキラルＨ−ホスホネート部分を含む分子と、式４−１の求核部分を含むヌクレオシドとの反応により、縮合中間体が形成され；これは、キラルＸ−ホスホネート部分を含む核酸に変換される。縮合中間体の合成は、（ａ）縮合剤による式２の化合物の活性化、（ｂ）キラル試薬との反応、それに続く（ｃ）式４−１の化合物との反応の工程を含む。一般的スキームをスキーム２に示す。キラル試薬は、キラル補助基として縮合中間体に付着する。本明細書で提供するプロセスにおいて、縮合中間体をもたらす工程（ａ）〜（ｃ）は、何ら中間体を単離することなく、即ち、同じポットまたはワンポットで実施され得る。それ故、前記プロセスは、個別の中間体の単離の必要性を回避する。本明細書に開示するプロセスは、溶液中または固相支持体上において実施することができる。反応条件に依存して、活性化試薬の添加は、縮合工程に有用であり得る。例えば、活性化試薬は、工程（ａ）〜（ｃ）が完了した後に反応に添加され得るか、または工程（ａ）〜（ｃ）と同時に反応に添加され得る。
スキーム２．縮合中間体の形成をもたらす反応工程
Figure 2012510460
１つの実施形態では、縮合中間体は、アシル、アリール、アルキル、アラルキル、またはシリル部分である部分Ａにより縮合中間体上のキラル補助基をキャッピングする工程、およびリンを修飾して、Ｓ、Ｓｅ、またはＢＨ３であるＪを導入する工程によって、式１のキラルＸホスホネート部分を含む核酸に変換され、式５−１の化合物を生成する。一実施形態（オプションＡ、スキーム３）では、キラル補助基を切断し、そしてブロッキング基を脱ブロックし、そして所望により、固相支持体から切断することによって、式５−１の化合物は、式１の化合物（式中、ＸはＳ、Ｓｅ、またはＢＨ３であり、そしてｎは１である（ダイマー））に変換される。ダイマーを形成する場合、スキーム３のキャッピング工程は、任意である。あるいは（オプションＢ、スキーム３）、縮合中間体を生成する工程を反復することによって、式５−１の化合物は、鎖伸長に供され、ここで、式２のさらなるモノマーが、オリゴヌクレオチドに添加される。キャッピング、修飾、脱ブロック、および鎖伸長の工程は、所望のｎが達成されるまで、反復される。この時点で各ホスホネートにおけるキラル補助基は切断され、残留するブロッキング基は切断されて（所望により、固相支持体から切断することを含む）、式１の化合物（式中、ＸはＳ、Ｓｅ、またはＢＨ３であり、そしてｎは２以上であり、かつ約２００未満である）を生成する。
スキーム３．経路Ａを介して縮合中間体を式１の化合物に変換する工程
Figure 2012510460
本明細書において提供する他の方法では、縮合中間体を酸性化して、Ｒ１におけるブロッキング基を除去する（これはまた、キラル補助基も除去する）ことによって、縮合中間体は、式１のキラルＸホスホネート部分を含む核酸に変換される。一実施形態（オプションＡ、スキーム４）では、式４の化合物は、修飾され、リンにおけるＸ部分が導入されて、式１の化合物が生成され、これは、脱ブロックされて、残留するブロッキング基が除去され、そして所望により、合成支持体から取り出されて、式１の化合物（式中、Ｒ３は水素であり、そしてｎは１である）を生成する。
あるいは、スキーム４（オプションＢ）における式４の化合物は、鎖伸長の工程に供され、次いで、酸性化されて、新たに添加されたヌクレオシドＲ１ブロッキング基が脱ブロックされる。鎖伸長工程およびＲ１脱ブロック工程は、ｍ回反復される。この時点で、ｍがｎ−１に等しい式４の化合物は、修飾され、各リンにおけるＸ部分が導入されて、式１の化合物が生成され、これは、脱ブロックされて、残留するブロッキング基が除去され、そして所望により、合成支持体から取り出されて、式１の化合物（式中、Ｒ３は水素であり、そしてｎは２以上であり、かつ約２００未満である）を生成する。
スキーム４．経路Ｂを介して縮合中間体を式１の化合物に変換する工程
Figure 2012510460
スキーム４のオプションＡおよびオプションＢの両方において、Ｘは、アルキル、アルコキシ、アリール、アルキルチオ、アシル、−ＮＲｆＲｆ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、アルケニルチオ、アルキニルチオ、−Ｓ−Ｚ＋、−Ｓｅ−Ｚ＋、または−ＢＨ３ −Ｚ＋であり、ここで、各Ｒｆは、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、またはアリールであり；Ｚ＋は、アンモニウムイオン、アルキルアンモニウムイオン、ヘテロ芳香族イミニウムイオン、またはヘテロ環イミニウムイオンであり、それらのうちいずれかは、第一級、第二級、第三級もしくは第四級であり、あるいはＺは、一価の金属イオンである。他の実施形態では、Ｚは、ピリジニウムイオン、トリエチルアンモニウムイオン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアンモニウムイオン、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウムイオン、ナトリウムイオン、またはカリウムイオンである。
式１のキラルＸ−ホスホネート部分を含むリン原子修飾核酸
本発明のプロセスは、以下の一般式１−１または式１−２の、キラルＸ−ホスホネート部分を含む核酸を提供する：
Figure 2012510460
式中、Ｘ−ホスホネート部分は、天然のヌクレオシド部分または非天然のヌクレオシド部分に接続し、ここで、天然のリボース環は、より大きなもしくはより小さな酸素含有環によって置き換えられ、あるいはここで、環は、非環状構造によって置き換えられ、式中、Ｗ３は、−Ｓ−、−Ｏ−、置換もしくは非置換のアミノ、アルキレン、アルケニレン、もしくはアルキニレンである。核酸の他の実施形態では、Ｘ−ホスホネート部分は、天然のヌクレオシド部分と非天然のヌクレオシド部分とを接続する。核酸のなお他の実施形態では、Ｘ−ホスホネート部分は、ヌクレオシド部分と異なる糖部分とを互いに接続する。
核酸のなお他の実施形態では、キラルＸ−ホスホネート部分を含む核酸は、式１の化合物である：
Figure 2012510460
式１において、Ｒ１は、−ＯＨ、−ＳＨ、ＮＲｄＲｄ、−Ｎ３、ハロゲン、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキル−Ｙ１−、アルケニル−Ｙ１−、アルキニル−Ｙ１−、アリール−Ｙ１−、ヘテロアリール−Ｙ１−、−Ｐ（Ｏ）（Ｒｅ）２、−ＨＰ（Ｏ）（Ｒｅ）、−ＯＲａまたは−ＳＲｃである。
Ｙ１は、Ｏ、ＮＲｄ、Ｓ、またはＳｅである。
Ｒａは、ブロッキング部分である。
Ｒｃは、ブロッキング基である。
Ｒｄの各例は、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アシル、置換シリル、カルバメート、−Ｐ（Ｏ）（Ｒｅ）２、または−ＨＰ（Ｏ）（Ｒｅ）である。
Ｒｅの各例は、独立して、水素、アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、アルキル−Ｙ２−、アルケニル−Ｙ２−、アルキニル−Ｙ２−、アリール−Ｙ２−、またはヘテロアリール−Ｙ２−であり、あるいはＮａ＋１、Ｌｉ＋１、もしくはＫ＋１であるカチオンである。
Ｙ２は、Ｏ、ＮＲｄ、またはＳである。
Ｒ２の各例は、独立して、水素、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＲｄＲｄ、−Ｎ３、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキル−Ｙ１−、アルケニル−Ｙ１−、アルキニル−Ｙ１−、アリール−Ｙ１−、ヘテロアリール−Ｙ１−、−ＯＲｂ、または−ＳＲｃであり、ここで、Ｒｂは、ブロッキング部分である。
Ｂａの各例は、独立して、ブロックされているかまたはブロックされていないアデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシルもしくは修飾核酸塩基である。
Ｘの各例は、独立して、アルキル、アルコキシ、アリール、アルキルチオ、アシル、−ＮＲｆＲｆ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、アルケニルチオ、アルキニルチオ、−Ｓ−Ｚ＋、−Ｓｅ−Ｚ＋、または−ＢＨ３ −Ｚ＋である。
Ｒｆの各例は、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、またはアリールである。
Ｚ＋は、アンモニウムイオン、アルキルアンモニウムイオン、ヘテロ芳香族イミニウムイオン、またはヘテロ環イミニウムイオンであって、それらのうちいずれかは、第一級、第二級、第三級もしくは第四級であり、あるいＺは一価の金属イオンである。
Ｒ３は、水素、ブロッキング基、固相支持体に接続された連結部分または核酸に接続された連結部分であり；ｎは、１〜約２００の整数である。
１つの実施形態では、任意のＲ２基は、例えば、蛍光部分、ビオチン部分、またはアビジン部分によって置換される。
一実施形態では、本明細書に記載の核酸は、すべてリボヌクレオチドモノマーから調製される。他の実施形態では、それは、すべてデオキシリボヌクレオチドモノマーから調製される。さらに他の実施形態では、核酸は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドモノマーの混合物から調製される。一実施形態では、核酸は、ＲＮＡおよびＤＮＡ部分の混合物である。他の実施形態では、核酸は、Ｒ２において、ＲＮＡまたはＤＮＡ核酸では見出されない置換基を含む。
Ｂａは、天然のまたは修飾核酸塩基である核酸塩基を表す。核酸塩基の各例は、独立して、ブロックされているかまたはブロックされていない。
Ｘの各例は、独立して、アルキル、アルコキシ、アリール、アルキルチオ、アシル、−ＮＲｆＲｆ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、アルケニルチオ、アルキニルチオ、−Ｓ−Ｚ＋、−Ｓｅ−Ｚ＋、または−ＢＨ３ −Ｚ＋であり、ここで、Ｒｆの各例は、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、またはアリールであり；Ｚ＋は、アンモニウムイオン、アルキルアンモニウムイオン、ヘテロ芳香族イミニウムイオン、またはヘテロ環イミニウムイオンであり、それらのうちいずれかは、第一級、第二級、第三級もしくは第四級であり、あるいはＺは、一価の金属イオンである。いくつかの実施形態では、Ｘは、アルキル、アルコキシ、−ＮＲｆＲｆ、−Ｓ−Ｚ＋、または−ＢＨ３ −Ｚ＋である。他の実施形態では、Ｚは、ピリジニウムイオン、トリエチルアンモニウムイオン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアンモニウムイオン、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウムイオン、ナトリウムイオン、またはカリウムイオンである。
Ｒ３は、水素、ブロッキング基、固相支持体に接続された連結部分または核酸に接続された連結部分であり、それらは、本明細書に記載のまたは当該技術分野において公知の方法を使用して調製される。任意の既知の方法を使用して調製されるＲ３に付着した核酸は、修飾、非修飾、または修飾および非修飾のリンの混合物であるリン原子を含み、そしてリン原子における任意の配置を含む。一実施形態では、Ｒ３は、別のヌクレオシドまたはヌクレオチドに付着された連結部分である。
Ｘ−ホスホネート部分
本明細書において、Ｘ−ホスホネート部分は、修飾されて、部分Ｘに共有結合するヌクレオシド間骨格連結のリン原子を指し、ここで、Ｘは、硫黄、セレン、アルキル、ホウ素、アシル、アミノ、チオール、またはアルコキシであり得るが、これらに限定されない。Ｘ部分は、ヌクレオシド間骨格中の酸素原子のうちの１個の置き換えによって、リン原子を修飾する。非制限的例として、２つの核酸フラグメントについて、ヌクレオシド間骨格連結を以下に示す（点線矩形枠内）。以下の左側の構造は、天然のヌクレオシド骨格連結において見出されるリン酸基を示す。以下の右側の構造は、ヌクレオシド間骨格連結としてのＸ−ホスホネート部分を示す。
Figure 2012510460
ホスホロチオエート部分は、Ｘ部分として硫黄部分を含む。ホスホロセレノエート部分は、Ｘ部分としてセレン部分を含む。アルキルホスホネート部分（例えば、メチルホスホネート）は、Ｘ部分としてアルキル基（例えば、メチル基）を含む。ボロノホスホネート部分は、Ｘ部分としてボラン基を含む。
１つの実施形態では、核酸は、骨格連結中にホスホロチオエート基を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、骨格連結中にホスホロセレノエート基を含む。他の実施形態では、核酸は、骨格連結中にアルキルホスホネート基（例えば、メチルホスホネート）を含む。なお他の実施形態では、核酸は、骨格連結中にボロノホスホネート基を含む。
各Ｘ部分は、本明細書に記載の様々なＸ部分から独立して選択することができる。これは、複数のＸ部分が１つの核酸内に存在することを可能にする。一実施形態では、核酸全体を通して、同じＸ部分が使用される。他の実施形態では、核酸全体を通して、異なるＸ部分が使用される。例えば、１つの核酸内において、Ｘ−ホスホネートのいくつかは、ホスホチオエート部分である一方、同じ核酸内の他のＸ−ホスホネートは、アルキルホスホネート部分である。リン修飾の他のバリエーションおよび改変が可能であり、そしてこれらの核酸の使用および用途に依存することは、当業者に明らかであろう。いくつかの実施形態では、Ｘ部分の選択は、核酸の生化学的特性および生物学的サンプルとのその相互作用に依存する。
Ｘ−ホスホネート部分の配置
本明細書に記載の方法は、ヌクレオシド間骨格連結中の各リン原子の配置を制御するのに有用である。キラル試薬は、Ｘ−ホスホネートにおけるキラリティーの特異的制御を可能にする。それ故、ＲＰまたはＳＰ配置のいずれかを、各合成サイクルにおいて選択することができ、核酸生成物の全体的な三次元構造の制御が可能になる。いくつかの実施形態では、ＲＰおよびＳＰ配置の選択は、核酸鎖に特定の三次元構造を付与するために行われる。
いくつかの実施形態では、各Ｘ−ホスホネート部分は、ＲＰ配置を有することができる。いくつかの実施形態では、各Ｘ−ホスホネート部分は、ＳＰ配置を有することができる。他の実施形態では、各Ｘ−ホスホネート部分は、独立して、ＲＰ配置またはＳＰ配置を有することができる。特定の実施形態では、Ｘ−ホスホネート部分は、核酸全体を通してＲＰ、ＳＰ、ＲＰまたはＳＰ、ＲＰ、ＳＰのように、ＲＰとＳＰとの間で交替する。他の特定の実施形態では、Ｘ−ホスホネート部分は、核酸全体を通してＲＰ、ＲＰ、ＳＰ、ＳＰの反復配置を含有する。なお他の実施形態では、核酸は、すべてＲＰ配置を含む。さらなる実施形態では、核酸は、すべてＳＰ部分を含む。いくつかの実施形態では、５’および３’末端のヌクレオシド間骨格連結は、ＳＰ配置のものであり、そして内部のヌクレオシド間骨格連結は、すべてＲＰ配置である。本明細書に記載の実施形態は、これらの方法を使用して、どのように配置を制御することができるかの例として役立つ。本明細書に記載の核酸は、これらの配置のパターンに限定されない。ＲＰおよびＳＰ配置の他のバリエーションおよび改変が可能であり、そして核酸の使用および用途に依存することは、当業者に明らかであろう。
Ｘ−ホスホネート配置の純度決定
核酸の各Ｘ−ホスホネート部分における配置の純度は、例えば、３１Ｐ ＮＭＲ分光法または逆相ＨＰＬＣがあるが、これらに限定されない従来の分析方法を使用して、決定される。本明細書に記載の方法を使用して、ある実施形態では、化合物の各Ｘ−ホスホネート部分は、ジアステレオマー的に８０％を超えて純粋であり得る。ある実施形態では、化合物の各Ｘ−ホスホネート部分は、ジアステレオマー的に６０％を超えて純粋であり得る。ある実施形態では、化合物の各Ｘ−ホスホネート部分は、ジアステレオマー的に７０％を超えて純粋であり得る。ある実施形態では、化合物の各Ｘ−ホスホネート部分は、ジアステレオマー的に８５％を超えて純粋であり得る。ある実施形態では、化合物の各Ｘ−ホスホネート部分は、ジアステレオマー的に９０％を超えて純粋であり得る。ある実施形態では、化合物の各Ｘ−ホスホネート部分は、ジアステレオマー的に９５％を超えて純粋であり得る。ある実施形態では、化合物の各Ｘ−ホスホネート部分は、ジアステレオマー的に９８％を超えて純粋であり得る。ある実施形態では、化合物の各Ｘ−ホスホネート部分は、ジアステレオマー的に９９％を超えて純粋であり得る。ある実施形態では、化合物の各Ｘ−ホスホネート部分は、約６０％を超えて純粋、約７０％を超えて純粋、約８０％を超えて純粋、約８３％を超えて純粋、約８４％を超えて純粋、約８５％を超えて純粋、約８６％を超えて純粋、約８７％を超えて純粋、約８８％を超えて純粋、約８９％を超えて純粋、約９０％を超えて純粋、約９１％を超えて純粋、約９２％を超えて純粋、約９３％を超えて純粋、約９４％を超えて純粋、約９５％を超えて純粋、約９６％を超えて純粋、約９７％を超えて純粋、約９８％を超えて純粋、または約９９％を超えて純粋であり得る。一実施形態では、各Ｘ−ホスホネート部分は、ジアステレオマー的に約６０％〜約９９．９％純粋であり得る。一実施形態では、各Ｘ−ホスホネート部分は、ジアステレオマー的に約６０％〜約９９％純粋であり得る。一実施形態では、各Ｘ−ホスホネート部分は、ジアステレオマー的に約６０％〜約７０％純粋であり得る。一実施形態では、各Ｘ−ホスホネート部分は、ジアステレオマー的に約７０％〜約８０％純粋であり得る。一実施形態では、各Ｘ−ホスホネート部分は、ジアステレオマー的に約８０％〜約９０％純粋であり得る。一実施形態では、各Ｘ−ホスホネート部分は、ジアステレオマー的に約８０％〜約９９％純粋であり得る。一実施形態では、各Ｘ−ホスホネート部分は、ジアステレオマー的に約８５％〜約９５％純粋であり得る。一実施形態では、各Ｘ−ホスホネート部分は、ジアステレオマー的に約９０％〜約９５％純粋であり得る。一実施形態では、各Ｘ−ホスホネート部分は、ジアステレオマー的に約９５％〜約９９％純粋であり得る。一実施形態では、各Ｘ−ホスホネート部分は、ジアステレオマー的に約９０％〜約９９．９％純粋であり得る。
他の配置より優位な特定の配置の量は、核酸の三次元構造ならびにそれらの安定性に影響を及ぼす。従って、異なる配置は、核酸の生物学的、化学的、および物理特性に影響を及ぼす。一実施形態では、核酸は、ＲＰ配置より大きな百分率のＳＰ配置を含む。他の実施形態では、核酸は、ＳＰ配置より大きな百分率のＲＰ配置を含む。他の実施形態では、核酸は、ＳＰ配置と同じ百分率のＲＰ配置を含む。一実施形態では、核酸は、０〜２０％のＲＰ配置を含むことができる。一実施形態では、核酸は、２０〜４０％のＲＰ配置を含むことができる。一実施形態では、核酸は、４０〜６０％のＲＰ配置を含むことができる。一実施形態では、核酸は、６０〜８０％のＲＰ配置を含むことができる。一実施形態では、核酸は、８０〜１００％のＲＰ配置を含むことができる。一実施形態では、核酸は、０〜２０％のＳＰ配置を含むことができる。一実施形態では、核酸は、２０〜４０％のＳＰ配置を含むことができる。一実施形態では、核酸は、４０〜６０％のＳＰ配置を含むことができる。一実施形態では、核酸は、６０〜８０％のＳＰ配置を含むことができる。一実施形態では、核酸は、８０〜１００％のＳＰ配置を含むことができる。
リン原子修飾核酸の長さ
式１のキラルＸ−ホスホネート部分を含む核酸は、約１ヌクレオシド〜約２００ヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、式１のキラルＸ−ホスホネート部分を含む核酸は、さらに組み合わされて、オリゴマーまたはポリマーになる。いくつかの実施形態では、式１の核酸は、ダイマーである。他の実施形態では、式１の核酸は、約１００ヌクレオシドまでを含む。他の実施形態では、式１の核酸は、約１５０ヌクレオシドまでを含む。他の実施形態では、式１の核酸は、約２００ヌクレオシドまでを含む。他の実施形態では、式１の核酸は、約３００ヌクレオシドまでを含む。式１のいくつかの実施形態では、式１の核酸は、１〜約２００ヌクレオシドを含む。他の実施形態では、核酸は、１〜約１５０ヌクレオシドを含む。さらなる実施形態では、核酸は、１〜約１０ヌクレオシドを含有する。他の実施形態では、核酸は、約１０〜約５０ヌクレオシドを含有する。さらなる実施形態では、核酸は、約１０〜約１００ヌクレオシドを含有する。いくつかの実施形態では、核酸は、約１〜約５ヌクレオチド、または約５〜約１０ヌクレオチド、または約５〜約１５ヌクレオチド、または約１０〜約２０ヌクレオチド、または約１５〜約２５ヌクレオチド、または約２０〜約３０ヌクレオチド、または約２５〜約３５ヌクレオチド、または約３０〜約４０ヌクレオチドを含む。式１のいくつかの実施形態では、ｎは、１〜約２００の整数である。式１のいくつかの実施形態では、ｎは、１〜約１５０の整数である。式１のいくつかの実施形態では、ｎは、１〜約１０の整数である。式１のいくつかの実施形態では、ｎは、１０〜約５０の整数である。式１のいくつかの実施形態では、ｎは、１０〜約１００の整数である。式１のいくつかの実施形態では、ｎは、約１〜約５、または約５〜約１０、または約５〜約１５、または約１０〜約２０、または約１５〜約２５、または約２０〜約３０、または約２５〜約３５、または約３０〜約４０を含む。
リン原子修飾核酸のさらなるバリエーション
式１の核酸は、一本鎖であり得る。いくつかの実施形態では、式１の核酸は、相補鎖とハイブリダイズして、二本鎖核酸を形成する。
いくつかの実施形態では、式１の核酸は、開いた線状構造を含むことができる。他の実施形態では、式１の核酸のそれぞれの末端が接続され、環状構造を形成する。
核酸内では、各単位の糖成分は、同じまたは異なる糖を含む。いくつかの実施形態では、糖は、修飾糖または置換されている糖である。いくつかの実施形態では、糖は、すべてリボース糖部分である。いくつかの実施形態では、糖は、すべてデオキシリボース糖部分である。他の実施形態では、糖は、すべてペントフラノース、ペントピラノース、またはヘキソピラノース部分である。さらなる実施形態では、糖成分は、閉環構造または開放構造を含む。
核酸構造内で、リン原子架橋は、一般に、核酸のヌクレオシド間骨格を形成するとされる。核酸中のヌクレオシド間骨格連結は、２’〜５’リン原子架橋、３’〜５’リン原子架橋、５’〜３’リン原子架橋、および３’〜２’リン原子架橋、ならびに米国特許第６，６０８，１８６号およびJoyce, G.F. Nature, 2002, 418, 214-220に記載の４’−２’架橋を含み、そしてこれらに限定されない。ヌクレオシド間骨格連結におけるこれらのバリエーションの非制限的例を、以下に示す：
Figure 2012510460
糖または修飾糖の成分に依存して、以下に示され、そしてXu, L. et al,J. Med. Chem., 2005, 48, 4177-4181に記載されている、メチレンビスホスホネート架橋を含み、そしてこれらに限定されない他のタイプのリン原子架橋もまた企図される。
Figure 2012510460
式１の核酸は、同じまたは異なる核酸塩基を含むことができる。いくつかの実施形態では、式１の核酸は、同じ核酸塩基を含む。他の実施形態では、式１の核酸は、すべて異なる核酸塩基を含む。他の実施形態では、式１の核酸は、天然に存在する核酸塩基を含む。いくつかの実施形態では、式１の核酸は、修飾核酸塩基を含む。さらに他の実施形態では、核酸は、天然に見出される核酸の核酸塩基配列を模倣する核酸塩基を含有する。いくつかの実施形態では、式１の核酸は、天然に存在する核酸塩基および修飾核酸塩基の混合物を含む。
アキラルＨ−ホスホネート部分を含む分子
アキラルＨ−ホスホネート部分を含む分子は、式２の化合物である：
Figure 2012510460
式２において、Ｒ１は、−ＮＲｄＲｄ、−Ｎ３、ハロゲン、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキル−Ｙ１−、アルケニル−Ｙ１−、アルキニル−Ｙ１−、アリール−Ｙ１−、ヘテロアリール−Ｙ１−、−Ｐ（Ｏ）（Ｒｅ）２、−ＨＰ（Ｏ）（Ｒｅ）、−ＯＲａ、または−ＳＲｃである。
Ｙ１は、Ｏ、ＮＲｄ、Ｓ、またはＳｅである。
Ｒａは、ブロッキング部分である。
Ｒｃは、ブロッキング基である。
Ｒｄの各例は、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アシル、置換シリル、カルバメート、−Ｐ（Ｏ）（Ｒｅ）２、または−ＨＰ（Ｏ）（Ｒｅ）である。
Ｒｅの各例は、独立して、アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、アルキル−Ｙ２−、アルケニル−Ｙ２−、アルキニル−Ｙ２−、アリール−Ｙ２−、またはヘテロアリール−Ｙ２−である。
Ｙ２は、Ｏ、ＮＲｄ、またはＳである。
Ｒ２は、水素、−ＮＲｄＲｄ、Ｎ３、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキル−Ｙ１−、アルケニル−Ｙ１−、アルキニル−Ｙ１−、アリール−Ｙ１−、ヘテロアリール−Ｙ１−、−ＯＲｂ、または−ＳＲｃであり、ここで、Ｒｂは、ブロッキング部分である。
Ｂａは、ブロックされているかまたはブロックされていないアデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシルもしくは修飾核酸塩基である。
Ｚ＋は、アンモニウムイオン、アルキルアンモニウムイオン、ヘテロ芳香族イミニウムイオン、またはヘテロ環イミニウムイオンであって、それらのうちいずれかは、第一級、第二級、第三級もしくは第四級であり、あるいは一価の金属イオンである。
いくつかの実施形態では、Ｚは、ピリジニウムイオン、トリエチルアンモニウムイオン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアンモニウムイオン、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウムイオン、ナトリウムイオン、またはカリウムイオンである。
いくつかの実施態様では、糖は、リボース環である。他の実施形態では、糖は、デオキシリボース、ペントフラノース、ペントピラノース、またはヘキソピラノース部分である。他の実施態様では、糖は、修飾糖である。いくつかの実施形態では、糖は、グリセロール類似体または置換を伴う糖である。
Ｈ−ホスホネートヌクレオシドモノマーは、容易に調製され、かつ安定である。それらの調製方法については、既に記載されている（例えば、Froehler, B.C. Methods in Molecular Biology. In Protocols for Oligonucleotides and Analogs; Agrawal, S., Ed.; Humana: Totowa, 1993; vol 20, p 63-80を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、ヌクレオシドモノマーは、３’位に、ヌクレオシドに付着されたアキラルＨ−ホスホネート部分を含む。なおさらなる実施形態では、ヌクレオシドモノマーは、介在連結部分を介して３’位のヌクレオシド部分に付着されたアキラルＨ−ホスホネート部分を含む。特定の実施形態では、介在連結部分は、メチレン基である（例えば、国際公開第２００１／０２４１５号パンフレットを参照のこと）。いくつかの実施形態では、Ｈ−ホスホネート部分は、ヌクレオシドモノマーの２’位に付着する。他の実施形態では、ヌクレオシドモノマーは、５’位に、ヌクレオシドに付着したアキラルＨ−ホスホネート部分を含む。
遊離の求核部分を伴う化合物
遊離の求核部分を含む化合物は、式４−１の化合物であり、そしてキラル中間体のリン中心において反応する。リンにおける求核基または部分による攻撃の方向は、キラル中間体（縮合中間体）上のキラル補助基の置換基に依存する。ある実施形態では、活性化試薬の添加は、遊離の求核部分を含む化合物が、キラル中間体のリン中心における反応を助けるのに有用であり得る。
Figure 2012510460
いくつかの実施形態では、遊離の求核部分を含む化合物は、本明細書に記載の方法を使用して予め調製された核酸であるか、またはそれは、核酸合成の他の既知の方法を使用して調製される。一実施形態では、遊離の求核部分を含む化合物は、単一のヌクレオシドモノマーを含む。他の実施形態では、遊離の求核部分を含む化合物は、１を超えるヌクレオシド単位を含む。いくつかの実施形態では、遊離の求核部分を含む化合物は、鎖伸長工程の生成物である。なお他の実施形態では、遊離の求核部分を含む化合物は、オリゴマーである。さらなる実施形態では、遊離の求核部分を含む化合物は、ポリマーである。いくつかの実施形態では、遊離の求核部分を含む化合物は、遊離の求核部分としてヒドロキシル基を含む。いくつかの実施形態では、遊離の求核部分を含む化合物は、遊離の求核部分としてアミノ基を含む。いくつかの実施形態では、遊離の求核部分を含む化合物は、遊離の求核部分としてチオール基を含む。
いくつかの実施形態では、遊離の求核部分を含む化合物は、ヌクレオシド糖の任意の位置に求核部分を含む。いくつかの実施形態では、求核部分は、糖の５’位に局在する。いくつかの実施形態では、求核部分は、糖の４’位に局在する。いくつかの実施形態では、求核部分は、糖の３’位に局在する。
いくつかの実施形態では、求核部分は、糖の２’位に局在する。
いくつかの実施形態では、式４−１の化合物は、５’−ＯＨ部分を含むヌクレオシドであり、そして式４の化合物である。
Figure 2012510460
式４において、Ｒ２の各例は、独立して、水素、−ＮＲｄＲｄ、Ｎ３、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキル−Ｙ１−、アルケニル−Ｙ１−、アルキニル−Ｙ１−、アリール−Ｙ１−、ヘテロアリール−Ｙ１−、−ＯＲｂ、または−ＳＲｃであり、ここで、Ｒｂは、ブロッキング部分である。
Ｙ１は、Ｏ、ＮＲｄ、Ｓ、またはＳｅである。
Ｒｃは、ブロッキング基である。
Ｒｄの各例は、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アシル、置換シリル、カルバメート、−Ｐ（Ｏ）（Ｒｅ）２、または−ＨＰ（Ｏ）（Ｒｅ）である。
Ｒｅの各例は、独立して、アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、アルキル−Ｙ２−、アルケニル−Ｙ２−、アルキニル−Ｙ２−、アリール−Ｙ２−、またはヘテロアリール−Ｙ２−である。
Ｙ２は、Ｏ、ＮＲｄ、またはＳである。
Ｂａの各例は、独立して、ブロックされているかまたはブロックされていないアデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシルもしくは修飾核酸塩基である。
ｍは、０〜ｎ−１の整数である。
ｎは、１〜約２００の整数である。
ＯＡは、トリチル部分、シリル部分、アセチル部分、アシル部分、アリールアシル部分、固相支持体に接続された連結部分または核酸に接続された連結部分に接続されている。
ＪはＯであり、そしてＤはＨであり、あるいはＪはＳ、Ｓｅ、もしくはＢＨ３であり、そしてＤはキラル配位子Ｃｉもしくは式Ａ部分である。
Figure 2012510460
 式中、Ｗ１およびＷ２は、独立して、ＮＨＧ５、ＯＨ、またはＳＨである。
Ａは、水素、アシル、アリール、アルキル、アラルキル、またはシリル部分である。
Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、およびＧ５は、独立して、水素、アルキル、アラルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリール、もしくはアリールであり、あるいはＧ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、およびＧ５のうちの２つはＧ６であって、一緒になって、単環式もしくは多環式の、縮合もしくは非縮合の、約２０個までの環原子の、飽和、部分不飽和もしくは不飽和の、炭素環またはヘテロ原子含有環を形成し、ならびに式中、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、およびＧ５のうち４つ以下がＧ６である。
他の実施形態では、式中、Ｊは、Ｓ、Ｓｅ、またはＢＨ３であり、そしてＤは、式Ａ−Ｉの部分である；
Figure 2012510460
 式中、Ｕ１、Ｕ３、Ｕ２、ｒ、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ４、Ｗ１、Ｗ２、Ａは、式３−１について本明細書において定義されるとおりである。式Ａ−Ｉのある実施形態では、Ａは水素である。
いくつかの実施形態では、式４の５’−ＯＨ部分を含むヌクレオシドは、本明細書に記載の先の鎖伸長サイクル由来の中間体である。なお他の実施形態では、式４の化合物は、別の既知の核酸合成方法由来の中間体である。いくつかの実施形態では、式４の化合物は、固相支持体に付着される。他の実施形態では、式４の化合物は、固相支持体に付着されず、そして溶媒または溶液中で遊離である。
ある実施形態では、ｍは０であり、そして式４の化合物は、単一のヌクレオシド単位であり、そして核酸の第１のヌクレオシドとみなされる。ある実施形態では、ｍは０であり、そして式４の化合物は、３’−酸素を介して別の核酸に付着したヌクレオシド単位である。他の実施形態では、ｍは０より大きく、そして式４の化合物は、５’−ＯＨ部分を含むポリマーまたはオリゴマー核酸である。他の実施形態では、ｍは０より大きく、そして式４の化合物は、先の鎖伸長サイクルの最終生成物である。いくつかの実施形態では、ｍが０より大きい場合、式４の化合物は、３’位またはヌクレオシド上の別の位置のいずれかにおける連結を介して、ヌクレオチドにさらに付着されるヌクレオシドである。
式４の化合物が別のヌクレオチドまたは核酸に付着される場合、リン酸ヌクレオシド間骨格連結は、２’〜５’リン原子架橋、３’ 〜５’リン原子架橋、５’ 〜３’リン原子架橋、および３’ 〜２’リン原子架橋ならびに４’ 〜２’架橋を含み、そしてこれらに限定されない。リン酸ヌクレオシド間骨格連結は、メチレンビスホスホネート架橋を含むがこれに限定されない他のタイプのリン原子架橋を含むことが企図される。
式１の核酸は、同じまたは異なる核酸塩基を含む。いくつかの実施形態では、式１の核酸は、同じ核酸塩基を含む。他の実施形態では、式１の核酸は、異なる核酸塩基を含む。他の実施形態では、式１の核酸は、天然に存在する核酸塩基を含む。いくつかの実施形態では、式１の核酸は、修飾核酸塩基を含む。なお他の実施形態では、核酸は、天然に見出される核酸の核酸塩基配列を模倣する核酸塩基を含有する。いくつかの実施形態では、式１の核酸は、天然に存在する核酸塩基および修飾核酸塩基の混合物を含む。
遊離の求核部分を含む化合物は、溶液中で遊離である。いくつかの実施形態では、遊離の求核部分を含む化合物は、固相支持体に付着されない。これにより、溶液中で核酸を合成することが可能である（液相合成または溶液相合成）。あるいは、遊離の求核部分を含む化合物は、固相支持体のような別の部分に予め付着される。いくつかの実施形態では、遊離の求核部分を含む化合物は、ヌクレオシドの３’ヒドロキシルにおいて固相支持体に付着される。核酸の固相支持体への付着は、固相合成を使用する合成を可能にする。核酸合成中、固相支持体に付着された化合物は、１回または反復される伸長サイクルにおいて様々な試薬で処理されて、個々の核酸単位を伴って成長する核酸鎖の段階的伸長を達成する。精製工程は、典型的には、完全に集成された核酸配列が合成されるまで行われない。様々なタイプの固相支持体材料が公知であり、そして核酸、タンパク質、およびオリゴ糖の合成に使用される。いくつかの実施形態では、遊離の求核部分を含む化合物は、連結部分を介して固相支持体に付着される。他の実施形態では、遊離の求核部分を含む化合物は、連結部分を伴わずに固相支持体に付着される。
遊離の求核部分を含む化合物は、糖、置換糖、または修飾糖を含む。いくつかの実施態様では、糖は、リボース糖である。いくつかの実施態様では、糖は、デオキシリボース糖である。いくつかの実施形態では、遊離の求核部分を含む化合物は、リボース糖およびデオキシリボース糖の混合物を含む。他の実施形態では、糖は、ペントフラノース、ペントピラノース、ヘキソピラノース部分またはそれらの混合物である。さらなる実施形態では、糖は、閉環構造、開放構造、またはそれらの混合物を含む。
非保護−ＯＨ部分を含むヌクレオシド反応物は、糖コア上の任意の位置に非保護−ＯＨ基を含有し得る。一実施形態では、アキラルＨ−ホスホネート部分は、５’ＯＨ−部分を含むヌクレオシドと縮合して、縮合中間体を形成する。他の実施形態では、アキラルＨ−ホスホネート部分は、４’ＯＨ−部分を含むヌクレオシドと縮合して、縮合中間体を形成する。他の実施形態では、アキラルＨ−ホスホネート部分は、３’ＯＨ−部分を含むヌクレオシドと縮合して、縮合中間体を形成する。さらに他の実施形態では、アキラルＨ−ホスホネート部分は、２’ＯＨ−部分を含むヌクレオシドと縮合して、縮合中間体を形成する。
いくつかの実施形態では、縮合中間体を酸性化する工程は、式４の化合物（式中、ｍは少なくとも１である）を生成する。他の実施形態では、縮合中間体は、式Ａの部分に等価である式Ａ’の部分を含み、式中、Ａは水素であり、そして式中、Ｇ１およびＧ２は、独立して、アルキル、アラルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリール、もしくはアリールであり、そしてＧ３、Ｇ４、およびＧ５は、独立して、水素、アルキル、アラルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、もしくはアリールであり、あるいはＧ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、およびＧ５のうちの２つはＧ６であって、一緒になって、単環式もしくは多環式の、縮合もしくは非縮合の、約２０個までの環原子の、飽和、部分不飽和もしくは不飽和の、炭素環またはヘテロ原子含有環を形成し、ならびに式中、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、およびＧ５のうち４つ以下がＧ６である。
合成方法の詳細な考察
核酸鎖の伸長は、３’から５’への方向で実施することができる。一実施形態では、核酸は、化学反応の反復サイクルで、５’−末端の遊離のヒドロキシルから合成される。あるいは、核酸鎖の伸長は、５’から３’への方向で実施することができる。ある実施形態では、核酸は、化学反応の反復サイクルで、３’−末端の遊離のヒドロキシルから合成される。
核酸の合成方法の一実施形態を、スキーム５（経路Ａ）に示す。本明細書に記載の方法は、スキーム、事象の順序、または例示されたその中間体に限定されないことが理解される。スキーム５に記載の一実施形態では、式２のアキラルＨ−ホスホネートが縮合試薬で処理されて、構造ＩＩの中間体を形成する。一実施形態では、活性化試薬は、縮合工程中に反応混合物に添加される。活性化試薬の使用は、反応に使用される溶媒のような反応条件に依存する。構造ＩＩの中間体は、単離せず、そして同じポットにおいて、キラル試薬で処理して、構造ＩＩＩのキラル中間体を形成させる。構造ＩＩＩの中間体は、単離されず、そして同じポットにおいて、ヌクレオシドまたは構造ＩＶの修飾ヌクレオシドとの反応を経て、構造Ｖのキラルホスファイト化合物を提供する。いくつかの実施形態では、構造Ｖを溶媒に抽出して、それを副生成物、不純物、および／または試薬から単離する。他の実施形態では、前記方法を固相合成を介して実施する場合、構造Ｖの化合物を含む固相支持体を、副生成物、不純物、および／または試薬から濾過分離する。最終核酸がダイマーより大きい場合、構造Ｖの化合物中のキラル補助基を、ブロッキング基でキャッピングして、構造ＶＩの化合物を提供する。最終核酸がダイマーである場合、キャッピング工程は必要ではない。構造ＶＩの化合物を、求電子剤との反応によって修飾して、構造ＶＩＩの化合物を提供する。構造ＶＩＩの、修飾されキャッピングされた縮合中間体を脱ブロックして、成長している核酸鎖の５’−末端におけるブロッキング基を除去し、構造ＩＶの化合物を提供する。構造ＩＶの化合物を、場合により、鎖伸長サイクルに再入させて、縮合中間体、キャッピングされた縮合中間体、修飾され、キャッピングされた縮合中間体、および５’脱保護され、修飾され、キャッピングされた中間体を形成させる。少なくとも１ラウンドの鎖伸長サイクル後、５’脱保護され、修飾され、キャッピングされた中間体を、キラル補助配位子および他の保護基、例えば、核酸塩基、修飾核酸塩基、糖および修飾された糖保護基の除去によってさらに脱ブロックして、式１の核酸を提供する。他の実施形態では、５’−ＯＨ部分を含むヌクレオシドは、本明細書に記載の先の鎖伸長サイクル由来の中間体である。なお他の実施形態では、５’−ＯＨ部分を含むヌクレオシドは、他の既知の核酸合成方法から得られる中間体である。第１のヌクレオシドによる合成のサイクル後、脱保護された−ＯＨ部分を含有するヌクレオシド、ヌクレオチド、または核酸は、以後の伸長サイクルに使用することができる。固相支持体を使用する実施形態では、次いで、リン原子修飾核酸を、固相支持体から切断する。所定の実施形態では、核酸を、精製目的のために固相支持体上に付着させたままにし、次いで、精製後に固相支持体から切断する。一実施形態では、スキーム５（経路Ａ）に記載の合成は、式Ａのキラル補助配位子のＧ１およびＧ２位が水素である場合に有用である。なお他の実施形態では、構造ＩＩＩ〜ＶＩＩの化合物は、式Ａの部分の代わりに式Ａ−Ｉの部分を含む。
スキーム５．経路Ａを介する式１のキラルＸ−ホスホネート部分を含む核酸の合成
Figure 2012510460
スキーム６（経路Ｂ）に記載の他の実施形態では、式２のアキラルＨ−ホスホネートが縮合試薬で処理されて、構造ＩＩの中間体を形成する。一実施形態では、活性化試薬は、縮合工程中に反応混合物に添加される。活性化試薬の使用は、反応に使用される溶媒のような反応条件に依存する。構造ＩＩの中間体は、単離せず、そして同じポットにおいて、キラル試薬で処理して、構造ＩＩＩのキラル中間体を形成させる。構造ＩＩＩの中間体は、単離されず、そして同じポットにおいて、ヌクレオシドまたは構造ＩＸの修飾ヌクレオシドとの反応を経て、構造Ｘのキラルホスファイト化合物を提供する。いくつかの実施形態では、構造Ｘを溶媒に抽出して、それを副生成物、不純物、および／または試薬から単離する。他の実施形態では、方法を固相合成を介して実施する場合、構造Ｘの化合物を含む固相支持体を、副生成物、不純物、および／または試薬から濾過分離する。構造Ｘの化合物を、酸で処理して、成長している核酸鎖（構造ＸＩ）の５’−末端におけるブロッキング基を除去する。酸性化する工程もまた、キラル補助配位子を除去して、構造ＩＸの化合物を提供する。５’−脱ブロックされた中間体を、場合により、鎖伸長サイクルに再入させて、ブロックされた５’−末端を含有する縮合中間体を形成させ、次いで、これを酸性化して、５’−末端ブロッキング基およびキラル補助配位子を除去する。少なくとも１ラウンドの鎖伸長サイクル後、５’脱保護された中間体は、修飾する工程を経て、各リン原子に結合した部分Ｘが導入されて、構造ＸＩＩの化合物を提供する。修飾中間体を、残留する保護基、例えば、核酸塩基、修飾核酸塩基、糖または修飾糖の除去によって脱ブロックし、保護基を除去して、式１の核酸を提供する。他の実施形態では、５’−ＯＨ部分を含むヌクレオシドは、本明細書に記載の先の鎖伸長サイクル由来の中間体である。なお他の実施形態では、５’−ＯＨ部分を含むヌクレオシドは、他の既知の核酸合成方法から得られる中間体である。第１のヌクレオシドによる合成のサイクル後、脱保護された−ＯＨ部分を含有するヌクレオシド、ヌクレオチド、または核酸は、以後の伸長サイクルに使用することができる。固相支持体を使用する実施形態では、次いで、リン原子修飾核酸を、固相支持体から切断する。所定の実施形態では、核酸を、精製目的のために固相支持体上に付着させたままにし、次いで、精製後に固相支持体から切断する。一実施形態では、スキーム６（ルートＢ）に記載の合成は、式Ａのキラル補助配位子のＧ１およびＧ２位が水素ではない場合に有用である。いくつかの実施形態では、構造ＩＩＩ、Ｘ、およびＸＩの化合物は、式Ａの部分の代わりに式Ａ−Ｉの部分を含む。
スキーム６．経路Ｂを介する式１のキラルＸ−ホスホネート部分を含む核酸の合成
Figure 2012510460
逆方向の５’−３’核酸合成
あるいは、式１のキラルＸ−ホスホネート部分を含む核酸は、５’から３’の方向へ合成される。固相支持体が使用される実施形態では、核酸を、成長している核酸のその５’末端を介して、固相支持体に付着させ、それによって、酵素反応（例えば、ライゲーションおよび重合）を含む反応のために、３’基を提示する。いくつかの実施形態では、この配向は、５’位においてアキラルＨ−ホスホネート部分および３’位において保護されたヒドロキシル基を含むヌクレオシドモノマーを調製することによって、操作される。ある実施形態では、核酸は、スキーム７に従って合成される。スキーム７において、−Ｒ４は、上記で定義された−ＯＲｂであるか、または合成の最後のサイクルでは、本明細書において定義されるＲ１に等価であるＲ４である。
スキーム７．式１のキラルＸ−ホスホネート部分を含む核酸の５’から３’への合成。
Figure 2012510460
スキーム７に記載の実施形態では、式ＩｒのアキラルＨ−ホスホネートが縮合試薬で処理されて、構造ＩＩｒの中間体を形成する。構造ＩＩｒの中間体は、単離せず、そして同じポットにおいて、キラル試薬で処理して、構造ＩＩＩｒの中間体を形成させる。一実施形態では、活性化試薬は、縮合工程中に使用される。活性化試薬の使用は、反応に使用される溶媒のような反応条件に依存する。構造ＩＩＩｒの中間体は、単離されず、そして同じポットにおいて、ヌクレオシドまたは構造ＸＩＩＩの修飾ヌクレオシドとの反応を経て、構造ＸＩＶのキラルホスファイト化合物を提供する。いくつかの実施形態では、構造ＸＩＶを溶媒に抽出して、それを副生成物、不純物、および／または試薬から単離する。他の実施形態では、方法を固相合成を介して実施する場合、構造ＸＩＶの化合物を含む固相支持体を、副生成物、不純物、および／または試薬から濾過分離する。構造ＸＩＶの化合物を、酸で処理して、成長している核酸鎖（構造ＸＶ）の３’−末端におけるブロッキング基を除去する。酸性化する工程もまた、キラル補助配位子を除去して、構造ＸＩＩＩの化合物を提供する。３’−脱ブロックされた中間体を、場合により、鎖伸長サイクルに再入させて、ブロックされた３’−末端を含有する縮合中間体を形成させ、次いで、これを酸性化して、３’−末端ブロッキング基およびキラル補助配位子を除去する。少なくとも１ラウンドの鎖伸長サイクル後、３’脱保護された中間体は、修飾する工程を経て、各リン原子に結合した部分Ｘが導入されて、構造ＸＶＩの化合物を提供する。修飾中間体を、残留する保護基、例えば、核酸塩基、修飾核酸塩基、糖または修飾糖の除去によって脱ブロックし、保護基を除去して、式１の核酸を提供する。他の実施形態では、３’−ＯＨ部分を含むヌクレオシドは、本明細書に記載の先の鎖伸長サイクル由来の中間体である。なお他の実施形態では、３’−ＯＨ部分を含むヌクレオシドは、他の既知の核酸合成方法から得られる中間体である。第１のヌクレオシドによる合成のサイクル後、脱保護された−ＯＨ部分を含有するヌクレオシド、ヌクレオチド、または核酸は、以後の伸長サイクルに使用することができる。固相支持体を使用する実施形態では、次いで、リン原子修飾核酸を、５’末端に局在する固相支持体から切断することができる。所定の実施形態では、核酸を、場合により、精製目的のために固相支持体上に付着させたままにし、次いで、精製後に固相支持体から切断することができる。一態様では、スキーム７に記載の合成は、式Ａのキラル補助配位子のＧ１およびＧ２位の両方が水素ではない場合に有用である。逆方向の５’から３’への合成は、経路Ａの工程に類似の機構で、スキーム７の同じ出発物質を使用して、達成することができる。いくつかの実施形態では、構造ＩＩＩｒ、ＸＩＶ、およびＸＶの化合物は、式Ａの部分の代わりに式Ａ−Ｉの部分を含む。
鎖伸長サイクル
リン原子修飾核酸の立体選択的合成は、鎖伸長サイクルを含む。鎖伸長サイクルは、核酸に添加しようとする次の単位（例えば、アキラルＨ−ホスホネート部分を含む分子）である化合物と別の遊離の求核部分を含む化合物（例えば、ヒドロキシル部分）との間の縮合反応から開始する。いくつかの実施形態では、遊離の求核部分を含む化合物は、モノマーヌクレオシドである。他の実施形態では、遊離の求核部分を含む化合物は、本明細書に記載の先の鎖伸長サイクル由来の核酸オリゴマーまたはプライマーである。他の実施形態では、遊離の求核部分を含む化合物は、当該技術分野において公知の他の方法を使用して実施される鎖伸長サイクル由来の核酸オリゴマーまたはポリマーである。
鎖伸長サイクルのラウンドの数は、合成する核酸の長さによって決定される。いくつかの実施形態では、鎖伸長サイクルは、１回生じる。他の実施形態では、鎖伸長サイクルは、１回を超えて反復され、個々のヌクレオチド単位を伴う成長しているオリゴヌクレオチド鎖単位の段階的伸長を達成する。
一実施形態では、核酸がダイマーである場合、１ラウンドの鎖伸長サイクルが必要である。他の実施形態では、核酸が１０ヌクレオシド単位を含む場合、９ラウンドの鎖伸長サイクルが必要である。さらに他のの実施形態では、さらなる２０ヌクレオシド単位がプレ合成された核酸鎖に付加される場合、２０ラウンドの鎖伸長サイクルが必要である。鎖伸長サイクルの回数は、核酸の目標の長さについて調整することができることが当業者に理解されよう。本明細書に記載の方法によって合成される核酸は、本明細書に記載の鎖伸長サイクルの回数よって限定されない。
Ｘ−ホスホネート部分を導入するための経路Ａを介して得られる縮合中間体の修飾。
スキーム８．経路Ａを介する縮合中間体の修飾。
Figure 2012510460
式５の化合物において、Ｒ１は、−ＮＲｄＲｄ、−Ｎ３、ハロゲン、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキル−Ｙ１−、アルケニル−Ｙ１−、アルキニル−Ｙ１−、アリール−Ｙ１−、ヘテロアリール−Ｙ１−、−Ｐ（Ｏ）（Ｒｅ）２、−ＨＰ（Ｏ）（Ｒｅ）、−ＯＲａ、または−ＳＲｃである。
Ｙ１はＯ、ＮＲｄ、Ｓ、またはＳｅである；Ｒａはブロッキング部分である。
Ｒｃは、ブロッキング基である。
Ｒｄの各例は、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アシル、置換シリル、カルバメート、−Ｐ（Ｏ）（Ｒｅ）２、または−ＨＰ（Ｏ）（Ｒｅ）である。
Ｒｅの各例は、独立して、アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、アルキル−Ｙ２−、アルケニル−Ｙ２−、アルキニル−Ｙ２−、アリール−Ｙ２−、またはヘテロアリール−Ｙ２−である。
Ｙ２は、Ｏ、ＮＲｄ、またはＳである。
Ｒ２の各例は、独立して水素、−ＮＲｄＲｄ、Ｎ３、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキル−Ｙ１−、アルケニル−Ｙ１−、アルキニル−Ｙ１−、アリール−Ｙ１−、ヘテロアリール−Ｙ１−、−ＯＲｂ、または−ＳＲｃであり、ここで、Ｒｂは、ブロッキング部分である。
Ｂａの各例は、独立して、ブロックされているかまたはブロックされていないアデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシルもしくは修飾核酸塩基である。
Ｊの各例は、Ｓ、Ｓｅ、またはＢＨ３である；ｖは、１〜ｎ−１の整数である。
ＯＡは、固相支持体に接続された連結部分または核酸に接続された連結部分に接続されている。
Ａは、アシル、アリール、アルキル、アラルキル、またはシリル部分である；ならびにＧ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、およびＧ５は、独立して、水素、アルキル、アラルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、もしくはアリールであり、あるいはＧ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、およびＧ５のうちの２つはＧ６であって、一緒になって、単環式もしくは多環式の、縮合もしくは非縮合の、約２０個までの環原子の、飽和、部分不飽和もしくは不飽和の、炭素環またはヘテロ原子含有環を形成し、ならびに式中、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、およびＧ５のうち４つ以下がＧ６である。
いくつかの実施形態では、式５の化合物は、リン原子に付着した式Ａ−Ｉの部分を含む。他の実施形態では、式５の化合物は、リン原子に付着された式Ａの部分を含む。経路Ａに例示した方法では、新たなヌクレオシドの付加から得られる縮合中間体は、キャッピングされて、構造Ｖの化合物を生成し、次いで、リンにおいて修飾されて、Ｓ、Ｓｅ、またはＢＨ３であるＪを導入して、式５の化合物（式中、ｖは、１〜ｎ−１の整数である）を生成する。式５の化合物は、処理されて、キャッピングされたキラル補助基を切断し、そして残留するブロッキング基を脱ブロックするか、またはそれは、鎖伸長のさらなるサイクルおよびリン修飾に供されるかのいずれかである。最終核酸がダイマーである場合、キャッピングは必要ではない。構造Ｖの一実施形態では、Ａは、水素、アシル、アリール、アルキル、アラルキル、またはシリル部分である。スキーム９の一実施形態では、新たなヌクレオシド付加から得られる縮合中間体は、構造Ｖの化合物を生成するためにキャッピングされず、ここで、ｖは０である。ｖが０であるこの構造Ｖは、次いで、リンにおいて修飾されて、Ｓ、Ｓｅ、またはＢＨ３であるＪを導入し、式５の化合物（式中、ｖは、０の整数である）を生成する。
いくつかの実施形態では、修飾剤は、硫黄求電子剤、セレン求電子剤、またはホウ素化剤である。
いくつかの実施形態では、硫黄求電子剤は、以下の式のうちの１つを有する化合物である：
Ｓ８（式Ｂ）、Ｚ２４−Ｓ−Ｓ−Ｚ２５、またはＺ２４−Ｓ−Ｘ−Ｚ２５、
式中、Ｚ２４およびＺ２５は、独立して、アルキル、アミノアルキル、シクロアルキル、ヘテロ環、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルキルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アシル、アミド、イミド、もしくはチオカルボニルであり、あるいはＺ２４およびＺ２５は、一緒になって、置換されていても置換されていなくてもよい３〜８員環の脂環またはヘテロ環を形成し；Ｘは、ＳＯ２、Ｏ、またはＮＲｆであり；ならびにＲｆは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、またはアリールである。他の実施形態では、硫黄求電子剤は、式Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、またはＦの化合物である：
Figure 2012510460

他の実施形態では、硫黄求電子剤は、式Ｆ、式Ｅまたは式Ｂである。
いくつかの実施形態では、セレン求電子剤は、以下の式のうちの１つを有する化合物である：
Ｓｅ（式Ｇ）、Ｚ２６−Ｓｅ−Ｓｅ−Ｚ２７、またはＺ２６−Ｓｅ−Ｘ−Ｚ２７、
式中、Ｚ２６およびＺ２７は、独立して、アルキル、アミノアルキル、シクロアルキル、ヘテロ環、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルキルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アシル、アミド、イミド、もしくはチオカルボニルであるか、あるいはＺ２６およびＺ２７は、一緒になって、置換されていても置換されていなくてもよい３〜８員環の脂環またはヘテロ環を形成し；Ｘは、ＳＯ２、Ｓ、Ｏ、またはＮＲｆであり；ならびにＲｆは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、またはアリールである。
他の実施形態では、セレン求電子剤は、式Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、またはＬの化合物である：
Figure 2012510460
いくつかの実施形態では、セレン求電子剤は、式Ｇまたは式Ｌである。
いくつかの実施形態では、ホウ素化剤は、ボラン−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＢＨ３・ＤＩＰＥＡ）、ボラン−ピリジン（ＢＨ３・Ｐｙ）、ボラン−２−クロロピリジン（ＢＨ３・ＣＰｙ）、ボラン−アニリン（ＢＨ３・Ａｎ）、ボラン−テトラヒドロフラン（ＢＨ３・ＴＨＦ）、またはボラン−ジメチルスルフィド（ＢＨ３・Ｍｅ２Ｓ）、アニリン−シアノボラン、トリフェニルホスフィンカルボアルコキシボランである。
他の実施形態では、ホウ素化剤は、ボラン−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＢＨ３・ＤＩＰＥＡ）、ボラン−２−クロロピリジン（ＢＨ３・ＣＰｙ）、ボラン−テトラヒドロフラン（ＢＨ３・ＴＨＦ）、またはボラン−ジメチルスルフィド（ＢＨ３・Ｍｅ２Ｓ）である。
さらなる実施形態では、経路Ａを介して得られる縮合中間体の修飾後、式５の化合物を、Ｒ１位において脱ブロックして、式４の化合物（式中、ｍは、少なくとも１であり、Ｊは、Ｓ、Ｓｅ、またはＢＨ３であり、そしてＤは、式Ａの部分である）を生成する。いくつかの実施形態では、Ｒ１の脱ブロック後、式４の化合物（式中、Ｄは、式Ａ−Ｉの部分である）が生成する。式４の化合物を、構造ＩＩＩのヌクレオシドと反応させ、縮合中間体を生成する。縮合中間体を変換する工程は：縮合中間体をキャッピングする工程、およびキャッピングされた縮合中間体を修飾して、式５の化合物を生成する工程を含む。式５の化合物のいくつかの実施形態では、ｖは、２より大きく、かつ約２００未満である。Ｒ１位で脱ブロックする工程、構造ＩＩＩのヌクレオシドと反応させる工程、キャッピングする工程、および修飾する工程は、場合により反復されて、式５の化合物（式中、ｖは、整数１だけ増加する）を形成する。式５の化合物のいくつかの実施形態では、ｖは、３より大きく、かつ約２００未満である。
さらなる実施形態では、式５の化合物は、式１の化合物に変換され、式中、いくつかの実施形態では、各Ｂａ部分は、ブロックされていない。他の実施形態では、式５の化合物は、式１の化合物に変換され、式中、すべてのＢａ部分が、ブロックされていないわけではない。
Ｒ１は、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＲｄＲｄ、−Ｎ３、ハロゲン、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキル−Ｙ１−、アルケニル−Ｙ１−、アルキニル−Ｙ１−、アリール−Ｙ１−、ヘテロアリール−Ｙ１−、−Ｐ（Ｏ）（Ｒｅ）２、−ＨＰ（Ｏ）（Ｒｅ）、−ＯＲａ、または−ＳＲｃであり；ここで、Ｙ１は、Ｏ、ＮＲｄ、Ｓ、もしくはＳｅであり、Ｒａはブロッキング部分であり、そしてＲｃはブロッキング基である。いくつかの実施形態では、Ｒ１は、脱ブロックされている。なお他の実施形態では、Ｒ１は、脱ブロックされたままである。
Ｒｄの各例は、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、置換シリル、カルバメート、−Ｐ（Ｏ）（ＲＣ）２、または−ＨＰ（Ｏ）（ＲＣ）であり、そしてＲｃの各例は、独立して、水素、アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、アルキル−Ｙ２−、アルケニル−Ｙ２−、アルキニル−Ｙ２−、アリール−Ｙ２−、またはヘテロアリール−Ｙ２−であり、あるいはＮａ＋１、Ｌｉ＋１、もしくはＫ＋１であるカチオンであり、ここで、Ｙ２は、Ｏ、ＮＲｄ、またはＳである。
Ｒ２の各例は、独立して、水素、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＲｄＲｄ、Ｎ３、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキル−Ｙ１−、アルケニル−Ｙ１−、アルキニル−Ｙ１−、アリール−Ｙ１−、ヘテロアリール−Ｙ１−である。
いくつかの実施形態では、Ｒは、Ｈである。他の実施形態では、Ｒ３は、ブロッキング基、または固相支持体、ヌクレオシド、ヌクレオチド、もしくは核酸に接続された連結部分である。いくつかの実施形態では、Ｘの各例は、独立して、−Ｓ−Ｚ＋、−Ｓｅ−Ｚ＋、または−ＢＨ３ −Ｚ＋であり；およびＺ＋は、アンモニウムイオン、アルキルアンモニウムイオン、ヘテロ芳香族イミニウムイオン、またはヘテロ環イミニウムイオンであって、それらのうちいずれかは、第一級、第二級、第三級もしくは第四級であり、あるいはＺ＋は一価の金属イオンである。
Ｘ−ホスホネート部分を導入するための経路Ｂを介して得られる式４の化合物の修飾
経路Ｂを介して得られる式４の化合物を修飾するために使用される方法を、反応スキーム９ａおよび９ｂに例示する。ホスホネートおよびホスファイトは、互変異性化し、そして平衡で存在することが公知である。ホスファイト互変異性体は、ホスホネート互変異性体ほど安定ではない。極めて強力なＰ＝Ｏ結合のため、平衡は、天然の条件下で、ホスホネート互変異性体側に存在する。酸性条件下では、ホスホネートのホスホリル基は、可逆的にプロトン化される。中間体におけるＰ−Ｈ結合の切断は、ゆっくりと生じて、ホスファイト中間体を生成する。次いで、反応スキーム９ａおよび９ｂに示される試薬を使用して、構造ＩＸを修飾して、構造ＸＩＩを形成させる。
反応スキーム９ａ．リンにおける初期のハロゲン化を使用し、経路Ｂを介して合成される中間体におけるリンの修飾
Figure 2012510460
 反応スキーム９ｂ．初期のシリル化を使用し、経路Ｂを介して合成される中間体におけるリンの修飾
Figure 2012510460
いくつかの実施形態では、修飾する工程は、構造ＩＸとハロゲン化試薬とを反応させ、続いて、求核剤と反応させることによって、実施される（スキーム９ａ）。特定の実施形態では、ハロゲン化試薬は、ＣＣｌ４、ＣＢｒ４、Ｃｌ２、Ｂｒ２、Ｉ２、塩化スルフリル（ＳＯ２Ｃｌ２）、ホスゲン、ビス（トリクロロメチル）カルボネート（ＢＴＣ）、一塩化硫黄、二塩化硫黄、クロラミン、ＣｕＣｌ２、Ｎ−クロロスクシンイミド（ＮＣＳ）、Ｎ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）、またはＮ−ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ）である。他の特定の実施形態、ハロゲン化剤は、ＣＣｌ４、ＣＢｒ４、Ｃｌ２、塩化スルフリル（ＳＯ２Ｃｌ２）、またはＮ−クロロスクシンイミド（ＮＣＳ）である。いくつかの実施形態では、求核剤は、第一級もしくは第二級アミン、アルコール、またはチオールである。他の実施形態では、求核剤は、ＮＲｆＲｆＨ、ＲｆＯＨ、またはＲｆＳＨであり、ここで、Ｒｆは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、またはアリールであり、そしてＮＲｆＲｆＨのＲｆのうち少なくとも１つは水素ではない。
修飾する工程はまた、構造ＩＸをシリル化試薬と反応させる工程、続いて、硫黄求電子剤、セレン求電子剤、ホウ素化剤、アルキル化剤、アルデヒド、またはアシル化剤と反応させる工程によって、実施することができる（スキーム９ｂ）。
特定の実施形態では、シリル化試薬は、クロロトリメチルシラン（ＴＭＳ−Ｃｌ）、トリイソプロピルシリルクロリド（ＴＩＰＳ−Ｃｌ）、ｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（ＴＢＤＭＳ−Ｃｌ）、ｔ−ブチルジフェニルシリルクロリド（ＴＢＤＰＳ−Ｃｌ）、１，１，１，３，３，３−ヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＳ）、Ｎ−トリメチルシリルジメチルアミン（ＴＭＳＤＭＡ）、Ｎ−トリメチルシリルジエチルアミン（ＴＭＳＤＥＡ）、Ｎ−トリメチルシリルアセトアミド（ＴＭＳＡ）、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（ＢＳＡ）、またはＮ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド（ＢＳＴＦＡ）である。
他の特定の実施形態では、硫黄求電子剤は、以下の式のうちの１つを有する化合物である：
Ｓ８（式Ｂ）、Ｚ２４−Ｓ−Ｓ−Ｚ２５、またはＺ２４−Ｓ−Ｘ−Ｚ２５、
式中、Ｚ２４およびＺ２５は、独立して、アルキル、アミノアルキル、シクロアルキル、ヘテロ環、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルキルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アシル、アミド、イミド、もしくはチオカルボニルであり、あるいはＺ２４およびＺ２５は、一緒になって、置換されていても置換されていなくてもよい３〜８員環の脂環またはヘテロ環を形成し；Ｘは、ＳＯ２、Ｏ、またはＮＲｆであり；ならびにＲｆは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、またはアリールである。他の実施形態では、硫黄求電子剤は、式Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、またはＦの化合物である：
Figure 2012510460
他の実施形態では、硫黄求電子剤は、式Ｆ、式Ｅまたは式Ｂである。
いくつかの実施形態では、セレン求電子剤は、以下の式のうちの１つを有する化合物である：
Ｓｅ（式Ｇ）、Ｚ２６−Ｓｅ−Ｓｅ−Ｚ２７、またはＺ２６−Ｓｅ−Ｘ−Ｚ２７、
式中、Ｚ２６およびＺ２７は、独立して、アルキル、アミノアルキル、シクロアルキル、ヘテロ環、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルキルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アシル、アミド、イミド、もしくはチオカルボニルであり、あるいはＺ２６およびＺ２７は、一緒になって、置換されていても置換されていなくてもよい３〜８員環の脂環またはヘテロ環を形成し；Ｘは、ＳＯ２、Ｓ、Ｏ、またはＮＲｆであり；ならびにＲｆは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、またはアリールである。
他のいくつかの実施形態では、セレン求電子剤は、式Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、またはＬの化合物である：
Figure 2012510460
いくつかの実施形態では、セレン求電子剤は、式Ｇまたは式Ｌである。
いくつかの実施形態では、ホウ素化剤は、ボラン−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＢＨ３・ＤＩＰＥＡ）、ボラン−ピリジン（ＢＨ３・Ｐｙ）、ボラン−２−クロロピリジン（ＢＨ３・ＣＰｙ）、ボラン−アニリン（ＢＨ３・Ａｎ）、ボラン−テトラヒドロフラン（ＢＨ３・ＴＨＦ）、またはボラン−ジメチルスルフィド（ＢＨ３・Ｍｅ２Ｓ）、アニリン−シアノボラン、トリフェニルホスフィンカルボアルコキシボランである。他の実施形態では、ホウ素化剤は、ボラン−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＢＨ３・ＤＩＰＥＡ）、ボラン−２−クロロピリジン（ＢＨ３・ＣＰｙ）、ボラン−テトラヒドロフラン（ＢＨ３・ＴＨＦ）、またはボラン−ジメチルスルフィド（ＢＨ３・Ｍｅ２Ｓ）である。
他の実施形態では、アルキル化剤は、アルキルハライド、アルケニルハライド、アルキニルハライド、アルキルスルホネート、アルケニルスルホネート、またはアルキニルスルホネートである。
他の実施形態では、アルデヒドは、（パラ）−ホルムアルデヒド、アルキルアルデヒド、アルケニルアルデヒド、アルキニルアルデヒド、またはアリールアルデヒドである。
なお他の実施形態では、アシル化剤は、式ＭまたはＮの化合物である：
Figure 2012510460
 式中、Ｇ７は、アルキル、シクロアルキル、ヘテロ環、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルキルオキシ、アリールオキシ、またはヘテロアリールオキシであり；およびＭは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール、イミダゾール、アルキルトリアゾール、テトラゾール、ペンタフルオロベンゼン、または１−ヒドロキシベンゾトリアゾールである。
さらなる実施形態では、酸性化する工程後、ｍは少なくとも１であり、ＪはＯであり、そしてＤはＨである式４の化合物を、構造ＩＩＩのヌクレオシドと反応させて、縮合中間体を形成させ、これは、酸性化する工程によって変換されて、式４の化合物（式中、ｍは少なくとも２であり、かつ約２００未満である；ＪはＯであり、そしてＤはＨである）を生成する。他の実施形態では、場合任意により、式４の化合物を、構造ＩＩＩのヌクレオシドとさらに反応させ、縮合中間体を形成させ、続いて、酸性化する。構造ＩＩＩのヌクレオシドと反応させる工程および酸性化する工程は、成長している鎖における所望の数の単位が達成されるまで、反復される。いくつかの実施形態では、式４の化合物（式中、ｍは、整数１だけ増加される）が生成する。いくつかの実施形態では、ｍが２より大きく、かつ約２００未満である式４の化合物が生成される。いくつかの実施形態では、縮合中間体は、式Ａの部分の代わりに式Ａ−Ｉの部分を含む。
さらなる実施形態では、式４の化合物が修飾されて、Ｘ部分を導入し、それによって、式１の化合物を生成する。式１の化合物の実施形態では、Ｒ３は、ブロッキング基、または固相支持体に接続された連結部分である。他の実施形態では、Ｒ１は、脱ブロックされている。なお他の実施形態では、式１の化合物は、Ｒ１がブロックされたままであるように、処理される。なおさらなる実施形態では、式１の化合物は、Ｒ１が、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＲｄＲｄ、−Ｎ３、ハロゲン、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキル−Ｙ１−、アルケニル−Ｙ１−、アルキニル−Ｙ１−、アリール−Ｙ１−、ヘテロアリール−Ｙ１−、−Ｐ（Ｏ）（Ｒｅ）２、−ＨＰ（Ｏ）（Ｒｅ）、−ＯＲａ、または−ＳＲｃであるように処理され；ここで、Ｙ１は、Ｏ、ＮＲｄ、Ｓ、またはＳｅであり、Ｒａは、ブロッキング部分であり、そしてＲｃは、ブロッキング基であり、Ｒｄの各例は、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アシル、置換シリル、カルバメート、−Ｐ（Ｏ）（Ｒｅ）２、またはＨＰ（Ｏ）（Ｒｃ）であり、そしてＲｅの各例は、独立して、水素、アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、アルキル−Ｙ２−、アルケニル−Ｙ２−、アルキニル−Ｙ２−、アリール−Ｙ２−、またはヘテロアリール−Ｙ２−であり、あるいはＮａ＋１、Ｌｉ＋１、もしくはＫ＋１であるカチオンであり、ここで、Ｙ２は、Ｏ、ＮＲｄ、またはＳである。
Ｒ２の各例は、独立して、水素、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＲｄＲｄ、Ｎ３、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキル−Ｙ１−、アルケニル−Ｙ１−、アルキニル−Ｙ１−、アリール−Ｙ１−、ヘテロアリール−Ｙ１−である。いくつかの実施形態では、Ｒ２は、脱ブロックされている。なお他の実施形態では、Ｒ２は、脱ブロックされたままである。
いくつかの実施形態では、各Ｂａ部分はブロックされていない。他の実施形態では、すべてのＢａ部分が、ブロックされていないわけではない。他の実施形態では、Ｒ３は、Ｈである。いくつかの実施形態では、Ｒ３は、ブロッキング基、または固相支持体、ヌクレオシド、ヌクレオチド、もしくは核酸に接続された連結部分である。いくつかの実施形態では、Ｘの各例は、独立して、アルキル、アルコキシ、アリール、アルキルチオ、アシル、−ＮＲｆＲｆ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、アルケニルチオ、アルキニルチオ、−Ｓ−Ｚ＋、−Ｓｅ−Ｚ＋、または−ＢＨ３ −Ｚ＋である；Ｒｆの各例は、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、またはアリールであり；Ｚ＋は、アンモニウムイオン、アルキルアンモニウムイオン、ヘテロ芳香族イミニウムイオン、またはヘテロ環イミニウムイオンであり、それらのうちいずれかは、第一級、第二級、第三級もしくは第四級であり、あるいはＺ＋は、一価の金属イオンである。
本発明の方法において使用される反応条件および試薬
条件
アキラルＨ−ホスホネート部分を含む分子および５’−ＯＨ部分を含むヌクレオシドを反応させて、縮合中間体を形成させる工程は、何ら中間体を単離することなく、行うことができる。いくつかの実施形態では、アキラルＨ−ホスホネート部分を含む分子および５’−ＯＨ部分を含むヌクレオシドを反応させて、縮合中間体を形成させる工程は、ワンポット反応で行われる。ある実施形態では、アキラルＨ−ホスホネート部分を含む分子、縮合試薬、キラル試薬、および遊離の求核部分を含む化合物が、異なる時間に反応混合物に添加される。他の実施形態では、アキラルＨ−ホスホネート部分を含む分子、縮合試薬、およびキラル試薬は、同じ反応容器または同じポット中に存在する。他の実施形態では、アキラルＨ−ホスホネート部分を含む分子、縮合試薬、キラル試薬、および遊離の求核部分を含む化合物が、同じ反応または同じポット中に存在する。これは、反応を、中間体の単離を伴わずに実施することを可能にし、そして時間を消耗する工程を排除し、経済的かつ効率的な合成が得られる。特定の実施形態では、アキラルＨ−ホスホネート、縮合試薬、キラルアミノアルコール、５’−ＯＨヌクレオシドは、反応中に同時に存在する。さらなる実施形態では、縮合のためのキラル中間体の形成は、インサイチュで形成され、そして縮合反応に先立って単離されない。他の実施形態では、アキラルＨ−ホスホネート部分を含む分子は、キラル中間体と遊離の５’−ＯＨ部分を含む化合物とを反応させる場合に使用されるものとは異なる反応容器における縮合試薬、キラル試薬との反応によって活性化されている。ある実施形態では、活性化試薬は、縮合工程中に添加される。一実施形態では、アキラルＨ−ホスホネート部分、縮合試薬、およびキラル試薬が共に混合された後、活性化試薬が添加される。他の実施形態では、活性化試薬は、アキラルＨ−ホスホネート部分、縮合試薬、およびキラル試薬と共に添加される。反応条件に依存して、活性化試薬は、合成中、例えば、縮合工程において、有用であり得る。例えば、ピリジンが、プレ活性化または縮合工程において塩基として使用される場合、ピリジンは、求核性触媒（即ち、活性化因子）として作用するため、ＣＭＰＴのような活性化試薬は、存在する必要はない。ピリジンほど求核性ではないＮ−シアノメチルピロリジン（ＣＭＰ）のような塩基が、縮合工程において使用される場合、ＣＭＰＴのような活性化試薬の使用が、活性化試薬として追加され得る。
固相支持体上での合成
いくつかの実施形態では、核酸の合成は、溶液中で実施される。他の実施形態では、核酸の合成は、固相上で実施される。固相支持体の反応基は、保護されていなくてもよく、または保護されていてもよい。オリゴヌクレオチド合成中、固相支持体は、いくらかの合成サイクルにおいて、様々な試薬で処理されて、個々のヌクレオチド単位の成長オリゴヌクレオチド鎖の段階的伸長を達成する。固相支持体に直接連結される鎖の末端のヌクレオシド単位は、本明細書において「第１のヌクレオシド」と呼ばれる。第１のヌクレオシドは、リンカー部分、即ち、固相支持体のポリマーおよびヌクレオシドの両方への共有結合を伴うジラジカルを介して、固相支持体に結合される。リンカーは、オリゴヌクレオチド鎖を集成するために実施される合成サイクル中に無傷（ｉｎｔａｃｔ）で留まり、そして鎖の集成後に切断されて、支持体からオリゴヌクレオチドを遊離させる。
固相核酸合成のための固相支持体には、例えば、米国特許第４，６５９，７７４号、同第５，１４１，８１３号、同第４，４５８，０６６号；Caruthersの米国特許第４，４１５，７３２号、同第４，４５８，０６６号、同第４，５００，７０７号、同第４，６６８，７７７号、同第４，９７３，６７９号、および同第５，１３２，４１８号；Andrusらの米国特許第５，０４７，５２４号、同第５，２６２，５３０号；ならびにKosterの米国特許第４，７２５，６７７号（Ｒｅ３４，０６９号として再発行）において記載の支持体が含まれる。いくつかの実施形態では、固相は、有機ポリマー支持体である。他の実施形態では、固相は、無機ポリマー支持体である。いくつかの実施形態では、有機ポリマー支持体は、ポリスチレン、アミノメチルポリスチレン、ポリエチレングリコール−ポリスチレングラフト共重合体、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、ポリビニルアルコール、高架橋ポリマー（ＨＣＰ）、または他の合成ポリマー、セルロースおよびデンプンのような炭水化物もしくは他のポリマー性炭水化物、または他の有機ポリマーおよび任意の共重合体、複合材料あるいは上記の無機または有機材料の組み合わせである。他の実施形態では、無機ポリマー支持体は、シリカゲル支持体、またはアミノプロピルＣＰＧであるシリカ、アルミナ、制御されたポリガラス（ＣＰＧ）である。他の有用な固相支持体には、フルオラス固相支持体（例えば、国際公開第２００５／０７０８５９号パンフレットを参照のこと）、長鎖アルキルアミン（ＬＣＡＡ）制御された多孔質ガラス（ＣＰＧ）固相支持体（例えば、S. P. Adams, K. S. Kavka, E. J. Wykes, S. B. Holder and G. R. Galluppi, J. Am. Chem. Soc., 1983, 105, 661-663；G. R. Gough, M. J. Bruden and P. T. Gilham, Tetrahedron Lett., 1981, 22, 4177-4180を参照のこと）が含まれる。膜支持体および高分子膜（例えば、Innovation and Perspectives in Solid Phase Synthesis, Peptides, Proteins and Nucleic Acids, ch 21 pp 157-162, 1994, Ed. Roger Eptonおよび米国特許第４，９２３，９０１号を参照のこと）もまた、核酸の合成に有用である。一旦、形成されれば、膜は、核酸合成に使用するために化学的に官能化することができる。官能基の膜への付着では、膜に付着されたリンカーまたはスペーサー基の使用は、膜と合成された鎖との間の立体障害を最小限にするために使用され得る。
他の適切な固相支持体には、固相方法論に使用するために適切であることが当該技術分野において一般的に公知であるものが含まれ、例えば、PrimerTM200支持体、制御された多孔質ガラス（ＣＰＧ）、オキサリル−制御された多孔質ガラス（例えば、Alul, et al., Nucleic Acids Research, 1991, 19, 1527を参照のこと）としてのガラス固体、TentaGel Support−アミノポリエチレングリコール誘導体化支持体（例えば、Wright, et al., Tetrahedron Lett., 1993, 34, 3373を参照のこと）、およびポリスチレン／ジビニルベンゼンのＰｏｒｏｓ−ａ共重合体が含まれる。
表面活性化ポリマーは、いくらかの固相支持体媒体上での天然および修飾核酸およびタンパク質の合成における使用について、実証されている。固相支持体材料は、多孔性において適切に均質な任意のポリマーであり得、十分なアミン含有量を有し、そして完全性を失うことなく、任意の付随操作を経験するのに十分に可撓性である。適切な選択された材料の例には、ナイロン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリテトラフルオロエチレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、およびニトロセルロースが含まれる。他の材料も、研究者の設計に依存して固相支持体として役立ち得る。いくつかの設計について考慮すると、例えば、被覆金属、特に、金または白金を選択することができる（例えば、米国特許出願公開第２００１００５５７６１号を参照のこと）。オリゴヌクレオチド合成の一実施形態では、例えば、ヌクレオシドは、ヒドロキシルまたはアミノ残基によって官能化される固相支持体にアンカーされる。あるいは、固相支持体は、誘導体化されて、トリメトキシトリチル基（ＴＭＴ）のような酸に不安定なトリアルコキシトリチル基を提供する。理論にとらわれるものではないが、トリアルコキシトリチル保護基の存在は、ＤＮＡ合成機において一般的に使用される条件下で初期の脱トリチルを可能にすることが予想される。水性アンモニアを伴う溶液中オリゴヌクレオチド材料のより速い放出のために、場合により、ジグリコエート（diglycoate）リンカーが、支持体に導入される。
連結部分
連結部分またはリンカーは、場合により使用されて、固相支持体を遊離の求核部分を含む化合物に接続する。固相支持体を、固相合成技術における最初のヌクレオシド分子の官能基（例えば、ヒドロキシル基）に接続することに役立つ短い分子のような適切なリンカーが公知である。いくつかの実施形態では、連結部分は、スクシンアミド酸リンカー、もしくはスクシネートリンカー（−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ−）、またはオキサリルリンカー（−ＣＯ−ＣＯ−）である。他の実施形態では、連結部分およびヌクレオシドは、エステル結合を介して、共に結合される。他の実施形態では、連結部分およびヌクレオシドは、アミド結合を介して、共に結合される。さらなる実施形態では、連結部分は、ヌクレオシドを別のヌクレオチドまたは核酸に接続する。適切なリンカーについては、例えば、Oligonucleotides And Analogues A Practical Approach, Ekstein, F. Ed., IRL Press, N.Y., 1991, Chapter 1に記載されている。
リンカー部分は、遊離の求核部分を含む化合物を別のヌクレオシド、ヌクレオチド、または核酸に接続するために使用される。いくつかの実施形態では、連結部分は、ホスホジエステル連結である。他の実施形態では、連結部分は、Ｈ−ホスホネート部分である。なお他の実施形態では、連結部分は、Ｘ−ホスホネート部分である。
合成のための溶媒
核酸の合成は、非プロトン性有機溶媒中で実施される。いくつかの実施形態では、溶媒は、アセトニトリル、ピリジン、テトラヒドロフラン、またはジクロロメタンである。いくつかの実施形態では、非プロトン性有機溶媒が塩基性ではない場合、塩基は、反応工程中に存在する。塩基が存在するいくつかの実施形態では、塩基は、ピリジン、キノリン、またはＮ，Ｎ−ジメチルアニリンまたはＮ−シアノメチルピロリジンである。塩基の他の例には、ピロリジン、ピペリジン、Ｎ−メチルピロリジン、ピリジン、キノリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリンまたはＮ−シアノメチルピロリジンが含まれる。前記方法のいくつかの実施形態では、塩基は、
Figure 2012510460
 であり、式中、Ｚ２２およびＺ２３は、独立して、アルキル、アミノアルキル、シクロアルキル、ヘテロ環、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルキルオキシ、アリールオキシ、もしくはヘテロアリールオキシであるか、または式中、Ｚ２２およびＺ２３のいずれかは、一緒になって、３〜１０員環の脂環もしくはヘテロ環を形成する。前記方法のいくつかの実施形態では、塩基は、Ｎ−シアノメチルピロリジンである。いくつかの実施形態では、非プロトン性有機溶媒は、無水である。他の実施形態では、無水の非プロトン性有機溶媒は、蒸留直後のものである（freshly distilled）。いくつかの実施形態では、蒸留直後の無水の非プロトン性有機溶媒は、ピリジンである。他の実施形態では、蒸留直後の無水の非プロトン性有機溶媒は、テトラヒドロフランである。他の実施形態では、蒸留直後の無水の非プロトン性有機溶媒は、アセトニトリルである。溶媒は、２つを超える溶媒の組み合わせであり得る。合成にどの溶媒を使用するかに依存して、活性化試薬の添加が有用である。
ブロッキング基を除去するための酸性化条件
ブロッキング基を除去するための酸性化は、ブレンステッドおよびルイス酸によって達成される。いくつかの実施形態では、Ｒ１ブロッキング基を除去するために、酸性化が使用される。有用なブレンステッド酸は、有機溶媒または水（８０％酢酸の場合）中−０．６（トリフルオロ酢酸）〜４．７６（酢酸）のｐＫａ（水中２５℃）値を有する、カルボン酸、アルキルスルホン酸、アリールスルホン酸、リン酸およびその誘導体、ホスホン酸およびその誘導体、アルキルホスホン酸およびそれらの誘導体、アリールホスホン酸およびそれらの誘導体、ホスフィン酸、ジアルキルホスフィン酸、ならびにジアリールホスフィン酸である。酸性化工程において使用される酸（１〜８０％）の濃度は、酸の酸性度に依存する。強酸条件により、脱プリン／脱ピリミジンが得られ、ここで、プリニルまたはピリミジニル塩基が、リボース環から切断されるため、酸性強度について、考慮しなければならない。
Figure 2012510460
いくつかの実施形態では、酸性化は、有機溶媒中のルイス酸によって達成される。有用なルイス酸は、ＺｎＸ２であり、式中、Ｘは、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、またはＣＦ３ＳＯ３である。
いくつかの実施形態では、酸性化する工程は、縮合中間体からプリン部分を除去せずに、縮合中間体を式４の化合物に変換するのに有効な量のブレンステッドまたはルイス酸を添加する工程を含む。
酸性化する工程において有用である酸にはまた、有機溶媒中１０％リン酸、有機溶媒中１０％塩酸、有機溶媒中１％トリフルオロ酢酸、有機溶媒中３％ジクロロ酢酸または水中８０％酢酸が含まれるが、これらに限定されない。前記プロセスにおいて使用される任意のブレンステッドまたはルイス酸の濃度は、酸の濃度が、糖部分からの核酸塩基の切断を引き起こす濃度を超えないように、選択される。
いくつかの実施形態では、酸性化は、有機溶媒中１％トリフルオロ酢酸を添加する工程含む。いくつかの実施形態では、酸性化は、有機溶媒中約０．１％〜約８％トリフルオロ酢酸を添加する工程を含む。他の実施形態では、酸性化は、有機溶媒中３％ジクロロ酢酸を添加する工程を含む。他の実施形態では、酸性化は、有機溶媒中約０．１％〜約１０％トリクロロ酢酸を添加する工程を含む。なお他の実施形態では、酸性化は、有機溶媒中３％ジクロロ酢酸を添加する工程を含む。なお他の実施形態では、酸性化は、有機溶媒中約０．１％〜約１０％トリクロロ酢酸を添加する工程を含む。いくつかの実施形態では、酸性化は、水中８０％酢酸を添加する工程を含む。いくつかの実施形態では、酸性化は、水中約５０％〜約９０％、または約５０％〜約８０％、約５０％〜約７０％、約５０％〜約６０％、約７０％〜約９０％酢酸を添加する工程を含む。いくつかの実施形態では、酸性化は、酸性溶媒へのカチオンスカベンジャーのさらなる添加を含む。特定の実施形態では、カチオンスカベンジャーは、トリエチルシランまたはトリイソプロピルシランであり得る。いくつかの実施形態では、Ｒ１は、縮合中間体を酸性化する工程に先立って脱ブロックされる。いくつかの実施形態では、Ｒ１は、有機溶媒中１％トリフルオロ酢酸を添加する工程含む酸性化によって、脱ブロックされる。いくつかの実施形態では、Ｒ１は、有機溶媒中３％ジクロロ酢酸を添加する工程含む酸性化によって、脱ブロックされる。いくつかの実施形態では、Ｒ１は、有機溶媒中３％トリクロロ酢酸を添加する工程含む酸性化によって、脱ブロックされる。
ブロッキング部分または基の除去。
核酸塩基または糖部分に局在するヒドロキシルまたはアミノ部分の官能基は、合成中、ブロッキング（保護）基（部分）で日常的にブロックされ、その後、脱ブロックされる。一般に、ブロッキング基は、特定の反応条件に対する分子の化学官能基を不活にし、そして後に、分子の残りの部分を実質的に損傷することなく、分子中のそのような官能基から除去することができる（例えば、Green and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2nd Ed., John Wiley & Sons, New York, 1991を参照のこと）。例えば、アミノ基は、フタルイミド、９−フルドレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）、トリフェニルメチルスルフェニル、ｔ−ＢＯＣ、４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）、４−メトキシトリチル（ＭＭＴｒ）、９−フェニルキサンチン−９−イル（Ｐｉｘｙｌ）、トリチル（Ｔｒ）、または９−（ｐ−メトキシフェニル）キサンチン−９−イル（ＭＯＸ）のような窒素ブロッキング基でブロックすることができる。カルボキシル基は、アセチル基として保護され得る。ヒドロキシ基は、例えば、テトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）、ｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、１−［（２−クロロ−４−メチル）フェニル］−４−メトキシピペリジン−４−イル（Ｃｔｍｐ）、１−（２−フルオロフェニル）−４−メトキシピペリジン−４−イル（Ｆｐｍｐ）、１−（２−クロロエトキシ）エチル、３−メトキシ−１，５−ジカルボメトキシペンタン−３−イル（ＭＤＰ）、ビス（２−アセトキシエトキシ）メチル（ＡＣＥ）、トリイソプロピルシリルオキシメチル（ＴＯＭ）、１−（２−シアノエトキシ）エチル（ＣＥＥ）、２−シアノエトキシメチル（ＣＥＭ）、［４−（Ｎ−ジクロロアセチル−Ｎ−メチルアミノ）ベンジルオキシ］メチル、２−シアノエチル（ＣＮ）、ピバロイルオキシメチル（ＰｉｖＯＭ）、レブニルオキシメチル（levunyloxymethyl）（ＡＬＥ）で保護することができる。他の代表的なヒドロキシルブロッキング基についても記載されている（例えば、Beaucage et al., Tetrahedron, 1992, 46, 2223を参照のこと）。いくつかの実施形態では、ヒドロキシルブロッキング基は、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、トリメトキシトリチル、９−フェニルキサンチン−９−イル（Ｐｉｘｙｌ）および９−（ｐ−メトキシフェニル）キサンチン−９−イル（ＭＯＸ）のような酸に不安定な基である。化学官能基はまた、前駆体の形態で含まれることによって、ブロックされ得る。それ故、アジド基は容易にアミンに変換されるため、アジド基は、アミンのブロックされた形態とみなすことができる。核酸合成において利用されるさらなる代表的な保護基は、公知である（例えば、Agrawal et al., Protocols for Oligonucleotide Conjugates, Eds., Humana Press, New Jersey, 1994, Vol. 26, pp. 1-72を参照のこと）。
様々な方法が、公知であり、そして核酸からのブロッキング基の除去のために使用されている。いくつかの実施形態では、すべてのブロッキング基が除去される。他の実施形態では、ブロッキング基が部分的に除去される。なお他の実施形態では、反応条件を調整して、所定の部分上のブロッキング基を除去することができる。Ｒ２がブロッキング基である所定の実施形態では、Ｒ２におけるブロッキング基の除去は、Ｒ１におけるブロッキング基の除去とは独立（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）している。Ｒ１およびＲ２におけるブロッキング基は、合成工程中無傷のままであり、そして鎖の集成後にまとめて除去される。いくつかの実施形態では、Ｒ２ブロッキング基は、固相支持体からの核酸の切断および核酸塩基ブロッキング基の除去と同時に除去される。特定の実施形態では、Ｒ１におけるブロッキング基が除去される一方、Ｒ２および核酸塩基におけるブロッキング基は、無傷のままである。Ｒ１におけるブロッキング基は、第一級アミン、第二級アミン、またはそれらの混合物のような有機塩基により、固相支持体上で切断可能である。Ｒ１位の脱ブロックは、一般に、フロントエンドの脱保護と称される。
ある実施形態では、核酸塩基ブロッキング基は、存在する場合、酸性試薬によるそれぞれの核酸の集成後に切断可能である。他の実施形態では、核酸塩基ブロッキング基のうち１つ以上は、酸性条件下または塩基性条件下のいずれでも切断可能ではなく、例えば、フッ化塩またはフッ化水素酸錯体により切断可能である。さらに他の実施形態では、核酸塩基ブロッキング基のうち１つ以上は、塩基または塩基性溶媒の存在下でのそれぞれの核酸の集成後に切断可能であり、そしてここで、核酸塩基ブロッキング基は、アミンによるフロントエンドの脱保護工程の条件に対して安定である。
いくつかの実施形態では、核酸塩基に対するブロッキング基は、必要とされない。他の実施形態では、核酸塩基に対するブロッキング基は、必要とされる。なお他の実施形態では、所定の核酸塩基は、ブロッキング基を必要とする一方、他の核酸塩基は、ブロッキング基を必要としない。核酸塩基がブロックされる実施形態では、ブロッキング基は、フロントエンドにおいてブロッキング基を除去するのに適切な条件下で、完全にまたは部分的にのいずれかで除去される。例えば、Ｒ１は、ＯＲａを示し得、式中、Ｒａはアシルであり、そしてＢａは、イソブチリル、アセチルまたは４−（ｔｅｒｔブチルフェノキシ）アセチルを含むが、これらに限定されないアシル基でブロックされたグアニンを指す。Ｒ１におけるアシル基およびＢａは、同じ脱ブロック工程中で除去されるかまたは部分的に除去される。
試薬
縮合試薬
本発明の方法に有用な縮合試薬（ＣＲ）は、次の一般式のうちの１つを有する：Ａｒ３ＰＬ２、および（ＡｒＯ）３ＰＬ２、
Figure 2012510460
 式中、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９およびＺ１０は、独立して、アルキル、アミノアルキル、シクロアルキル、ヘテロ環、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルキルオキシ、アリールオキシ、もしくはヘテロアリールオキシから選択され、あるいは式中、Ｚ２とＺ３、Ｚ５とＺ６、Ｚ７とＺ８、Ｚ８とＺ９、Ｚ９とＺ７、もしくはＺ７とＺ８とＺ９のうちのいずれかは、一緒になって、３〜２０員環の脂環またはヘテロ環を形成し；Ｑ−は、対アニオンであり；ｗは、０〜３の整数であり；Ｌは、脱離基であり；ならびにＡｒは、アリール、ヘテロアリールであり、および／またはＡｒ基のうちの１つは、高分子支持体に付着されている。
いくつかの実施形態では、縮合試薬ＣＲの対イオンは、Ｃｌ−、Ｂｒ−、ＢＦ４ −、ＰＦ６ −、ＴｆＯ−、Ｔｆ２Ｎ−、ＡｓＦ６ −、ＣｌＯ４ −、またはＳｂＦ６ −であり、ここで、ＴｆはＣＦ３ＳＯ２である。いくつかの実施形態では、縮合試薬ＣＲの脱離基は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール、イミダゾール、アルキルトリアゾール、テトラゾール、ペンタフルオロベンゼン、または１−ヒドロキシベンゾトリアゾールである。
前記プロセスにおいて使用することができる縮合剤の例には、ペンタフルオロベンゾイルクロリド、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、１−メシチレンスルホニル−３−ニトロトリアゾール（ＭＳＮＴ）、１−エチル３−（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ−ＨＣｌ）、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）ホスフィン酸クロリド（ＢｏｐＣｌ）、２−（１Ｈ−７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、およびＯ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、ＤＩＰＣＤＩ；Ｎ，Ｎ’−ビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）ホスフィン酸ブロミド（ＢｏｐＢｒ）、１，３−ジメチル−２−（３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール−１−ｙｌ）−２−ピロリジン−１−イル−１，３，２−ジアザホスホリジニウムヘキサフルオロホスフェート（ＭＮＴＰ）、３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール−１−イル−トリス（ピロリジン−１−イル）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＮＴＰ）、ブロモトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢｒＯＰ）；Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）；テトラメチルフルオロホルムアミジニウムヘキサフルオロホスフェート（ＴＦＦＨ）；（ＰｈＯ）３ＰＣｌ２、およびビス（トリクロロメチル）カルボネート（ＢＴＣ）が含まれるが、これらに限定されない。所定の実施形態では、縮合試薬ＣＲの対イオンは、Ｃｌ−、Ｂｒ−、ＢＦ４ −、ＰＦ６ −、ＴｆＯ−、Ｔｆ２Ｎ−、ＡｓＦ６ −、ＣｌＯ４ −、またはＳｂＦ６ −であり、ここで、ＴｆはＣＦ３ＳＯ２である。
本発明の他の実施形態では、縮合試薬は、１−（２，４，６−トリイソプロピルベンゼンスルホニル）−５−（ピリジン−２−イル）テトラゾリド、ピバロイルクロリド、ブロモトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）ホスフィン酸クロリド（ＢｏｐＣｌ）、（ＰｈＯ）３ＰＣｌ２、もしくは２−クロロ−５，５−ジメチル−２−オキソ−１，３，２−ジオキサホスフィナン、ビス（トリクロロメチル）カルボネート（ＢＴＣ）、またはＰｈ３ＰＣｌ２である。一実施形態では、縮合試薬は、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）ホスフィン酸クロリド（ＢｏｐＣｌ）である。一実施形態では、縮合試薬は、ビス（トリクロロメチル）カルボネート（ＢＴＣ）である。一実施形態では、縮合試薬は、Ｐｈ３ＰＣｌ２である。他の既知の縮合試薬については、既に記載されている（例えば、国際公開第２００６／０６６２６０号パンフレットを参照のこと）。
他の実施形態では、縮合試薬は、１，３−ジメチル−２−（３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）−２−ピロリジン−１−イル−１，３，２−ジアザホスホリジニウムヘキサフルオロホスフェート（ＭＮＴＰ）、３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール−１−イル−トリス（ピロリジン−１−イル）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＮＴＰ）、ビス（トリクロロメチル）カルボネート（ＢＴＣ）、（ＰｈＯ）３ＰＣｌ２、またはＰｈ３ＰＣｌ２である。
Figure 2012510460
活性化試薬
本明細書において有用な活性化試薬は、遊離の求核部分を含む化合物との反応のためにキラル中間体を活性化することが可能な強力なプロトン供与能を有するべきである。一実施形態では、キラル中間体は、スキーム５もしくは６に示される構造ＩＩＩであるか、またはスキーム７に示される構造ＩＩＩｒである。活性化試薬は、Ｗ１が窒素である場合、構造ＩＩＩまたはＩＩＩｒの窒素原子をプロトン化することによって、作用する。活性化試薬の使用は、合成に使用される溶媒に依存する。
本発明の方法に有用な活性化試薬（ＡＲ）は、以下の一般式のうちの１つを有する：
Figure 2012510460
 Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５、Ｚ１６、Ｚ１７、Ｚ１８、Ｚ１９、Ｚ２０、およびＺ２１は、独立して、水素、アルキル、アミノアルキル、シクロアルキル、ヘテロ環、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルキルオキシ、アリールオキシ、もしくはヘテロアリールオキシであり、あるいは式中、Ｚ１１とＺ１２、Ｚ１１とＺ１３、Ｚ１１とＺ１４、Ｚ１２とＺ１３、Ｚ１２とＺ１４、Ｚ１３とＺ１４、Ｚ１５とＺ１６、Ｚ１５とＺ１７、Ｚ１６とＺ１７、Ｚ１８とＺ１９、もしくはＺ２０とＺ２１のうちいずれかは、一緒になって、３〜２０員環の脂環もしくはヘテロ環を形成するか、または５もしくは２０員環の芳香環を形成する。Ｑ−は、対イオンである。前記方法のいくつかの実施形態では、活性化試薬ＡＲの対イオンは、Ｃｌ−、Ｂｒ−、ＢＦ４ −、ＰＦ６ −、ＴｆＯ−、Ｔｆ２Ｎ−、ＡｓＦ６ −、ＣｌＯ４ −、またはＳｂＦ６ −であり、ここで、ＴｆはＣＦ３ＳＯ２である。
前記方法のいくつかの実施形態では、活性化試薬は、イミダゾール、４，５−ジシアノイミダゾール（ＤＣＩ）、４，５−ジクロロイミダゾール、１−フェニルイミダゾリウムトリフレート（ＰｈＩＭＴ）、ベンゾイミダゾリウムトリフレート（ＢＩＴ）、ベンズトリアゾール、３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール（ＮＴ）、テトラゾール、５−エチルチオテトラゾール、５−（４−ニトロフェニル）テトラゾール、Ｎ−シアノメチルピロリジニウムトリフレート（ＣＭＰＴ）、Ｎ−シアノメチルピペリジニウムトリフレート、Ｎ−シアノメチルジメチルアンモニウムトリフレートである。
前記方法のいくつかの実施形態では、活性化試薬は、４，５−ジシアノイミダゾール（ＤＣＩ）、１−フェニルイミダゾリウムトリフレート（ＰｈＩＭＴ）、ベンゾイミダゾリウムトリフレート（ＢＩＴ）、３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール（ＮＴ）、テトラゾール、またはＮ−シアノメチルピロリジニウムトリフレート（ＣＭＰＴ）である。
Figure 2012510460
方法のいくつかの実施形態では、活性化試薬は、Ｎ−シアノメチルピロリジニウムトリフレート（ＣＭＰＴ）である。
キラル試薬
本発明の方法では、Ｘ−ホスホネート連結の生成において立体選択性を付与するために、キラル試薬が使用される。異なる多くのキラル補助基が、このプロセスにおいて使用され得、これらは、式３−Ｉの化合物であって、式中、Ｗ１、およびＷ２は、−Ｏ−、−Ｓ−、または−ＮＧ５−のいずれかであり、これらは、Ｈ−ホスホネート出発物質、式２の化合物と反応して、スキーム５および６の構造ＩＩＩに示されるようなキラル中間体を形成することが可能である。
Figure 2012510460
Ｕ１およびＵ３は、単結合、二重結合もしくは三重結合を介して、存在する場合Ｕ２に結合し、またはｒが０である場合は相互に結合する、炭素原子である。Ｕ２は、−Ｃ−、−ＣＧ８−、−ＣＧ８Ｇ８−、−ＮＧ８−、−Ｎ−、−Ｏ−、または−Ｓ−であり、式中、ｒは、０〜５の整数であり、そして２個以下のヘテロ原子が隣接する。Ｕ２のうち任意の１つがＣである場合、三重結合は、ＣであるＵ２の第２の事例との間、またはＵ１もしくはＵ３のうち一方に対して形成されなければならない。同様に、Ｕ２のうちいずれか１つがＣＧ８である場合、二重結合は、−ＣＧ８−もしくは−Ｎ−であるＵ２の第２の事例との間、またはＵ１もしくはＵ３のうち一方に対して形成される。
例えば、いくつかの実施形態では、−Ｕ１−（Ｕ２）ｒ−Ｕ３−は、−ＣＧ３Ｇ４−ＣＧ１Ｇ２−である。いくつかの実施形態では、−Ｕ１−（Ｕ２）ｒ−Ｕ３−は、−ＣＧ３＝ＣＧ１−である。いくつかの実施形態では、−Ｕ１−（Ｕ２）ｒ−Ｕ３−は、−Ｃ≡Ｃ−である。いくつかの実施形態では、−Ｕ１−（Ｕ２）ｒ−Ｕ３−は、−ＣＧ３＝ＣＧ８−ＣＧ１Ｇ２−である。いくつかの実施形態では、−Ｕ１−（Ｕ２）ｒ−Ｕ３−は、−ＣＧ３Ｇ４−Ｏ−ＣＧ１Ｇ２−である。いくつかの実施形態では、−Ｕ１−（Ｕ２）ｒ−Ｕ３−は、−ＣＧ３Ｇ４−ＮＧ８−ＣＧ１Ｇ２−である。いくつかの実施形態では、−Ｕ１−（Ｕ２）ｒ−Ｕ３−は、−ＣＧ３Ｇ４−Ｎ−ＣＧ２−である。いくつかの実施形態では、−Ｕ１−（Ｕ２）ｒ−Ｕ３−は、−ＣＧ３Ｇ４−Ｎ＝ＣＧ８−ＣＧ１Ｇ２−である。
Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５、およびＧ８は、独立して、水素、アルキル、アラルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリル、ヘタリール、もしくはアリールであり、あるいはＧ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、およびＧ５のうちの２つはＧ６であって、一緒になって、単環式もしくは多環式の、縮合もしくは非縮合の、約２０個までの環原子の、飽和、部分不飽和もしくは不飽和の、炭素環またはヘテロ原子含有環を形成し、そして縮合するかまたは縮合しない。いくつかの実施形態では、そのように形成される環は、オキソ、チオキソ、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアリール、またはアリール部分によって、置換される。いくつかの実施形態では、Ｇ６のうち２つを一緒にして形成される環が置換される場合、それは、反応中に立体選択性を付与するの十分に嵩高い部分によって置換される。
例えば、いくつかの実施形態では、Ｇ６のうち２つを一緒にして形成される環は、シクロペンチル、ピロリル、シクロプロピル、シクロヘキセニル、シクロペンテニル、テトラヒドロピラニル、またはピペラジニルである。
本発明のいくつかの実施形態では、キラル試薬は、式３の化合物である。
Figure 2012510460
式３のいくつかの実施形態では、Ｗ１およびＷ２は、独立して、−ＮＧ５−、−Ｏ−、または−Ｓ−であり；Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、およびＧ５は、独立して、水素、アルキル、アラルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリル、ヘタリール、もしくはアリールであり、あるいはＧ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、およびＧ５のうちの２つはＧ６であり、一緒になって、単環式もしくは多環式の、縮合もしくは非縮合の、約２０個までの環原子の、飽和、部分不飽和もしくは不飽和の、炭素環またはヘテロ原子含有環を形成し、ならびに、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、およびＧ５のうち４つ以下がＧ６である。式３’の化合物と同様に、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、またはＧ５のうちいずれかは、オキソ、チオキソ、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアリール、またはアリール部分によって置換される。いくつかの実施形態では、そのような置換は、Ｘ−ホスホネート生成において立体選択性を導入する。
本発明のいくつかの実施形態では、キラル試薬は、以下の式のうちの１つを有する：
Figure 2012510460
いくつかの実施形態では、キラル試薬は、アミノアルコールである。他のいくつかの実施形態では、キラル試薬は、アミノチオールである。なお他の実施形態では、キラル試薬は、アミノフェノールである。いくつかの実施形態では、キラル試薬は、（Ｓ）−および（Ｒ）−２−メチルアミノ−１−フェニルエタノール、（１Ｒ，２Ｓ）−エフェドリン、または（１Ｒ，２Ｓ）−２−メチルアミノ−１，２−ジフェニルエタノールである。
本発明の他の実施形態では、キラル試薬は、以下の式のうちの１つの化合物である。
Figure 2012510460
キラル試薬の選択、例えば、式Ｏによって表される異性体またはその立体異性体、式Ｐは、リンにおけるキラリティーの特定の制御を可能にする。それ故、ＲＰまたはＳＰ配置のいずれかを、各合成サイクルにおいて選択することができ、核酸生成物の全体的な三次元構造の制御が可能になる。本発明のいくつかの実施形態では、核酸生成物は、すべてＲＰ立体中心を有する。本発明のいくつかの実施形態では、核酸生成物は、すべてＳＰ立体中心を有する。いくつかの実施形態では、ＲＰおよびＳＰ中心の選択は、核酸鎖に特定の三次元構造を付与するために行われる。
核酸塩基および修飾核酸塩基
式１における核酸塩基Ｂａは、天然の核酸塩基、または天然の核酸塩基から誘導される修飾核酸塩基である。例には、アシル保護基によって保護されたそれらのそれぞれのアミノ基を有するウラシル、チミン、アデニン、シトシン、およびグアニン、２−フルオロウラシル、２−フルオロシトシン、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、２，６−ジアミノプリン、アザシトシン、プソイドイソシトシンおよびプソイドウラシルのようなピリミジン類似体、ならびに８−置換プリン、キサンチン、またはヒポキサンチン（後者の２つは、天然の分解産物である）のような他の修飾核酸塩基が含まれるが、これらに限定されない。Chiu and Rana, RNA, 2003, 9, 1034-1048, Limbach et al. Nucleic Acids Research, 1994, 22, 2183-2196およびRevankar and Rao, Comprehensive Natural Products Chemistry, vol.7, 313において開示される修飾核酸塩基もまた、式１のＢａ部分として企図される。
以下の一般式によって表される化合物もまた、修飾核酸塩基として企図される：

Figure 2012510460
上記の式では、Ｒ８は、１〜１５個の炭素原子を有する線状もしくは分枝状アルキル、アリール、アラルキル、またはアリールオキシルアルキル基であり、単なる例として、メチル、イソプロピル、フェニル、ベンジル、またはフェノキシメチル基が含まれ；ならびにＲ９およびＲ１０のそれぞれは、１〜４個の炭素原子を有する線状または分枝状アルキル基を表す。
修飾核酸塩基にはまた、１つ以上のベンゼン環が付加されている、拡大されたサイズの核酸塩基が含まれる。Glen Research catalog (www.glenresearch.com)；Krueger AT et al, Ace. Chem. Res., 2007, 40, 141-150;Kool, ET, Ace. Chem. Res., 2002, 55, 936-943；Benner S.A., et al., Nat. Rev. Genet., 2005, 6, 553-543；Romesberg, F.E., et al., Curr. Opin. Chem. Biol, 2003, 7, 723-733;Hirao, I., Curr. Opin. Chem. Biol., 2006, 10, 622-627に記載の核塩基の置き換えは、本明細書に記載の核酸の合成に有用であると考えられる。これらの拡大されたサイズの核酸塩基のいくつかの例を以下に示す：
Figure 2012510460
本明細書において、修飾核酸塩基はまた、核酸塩基とはみなされないが、コリンまたはポルフィリンから誘導される環のような、但し、これらに限定されない他の部分である構造を包含する。ポルフィリンから誘導される塩基の置き換えについては、Morales-Rojas, H and Kool, ET, Org. Lett., 2002, 4, 4377-4380に記載されている。塩基の置き換えとして使用することができるポルフィリンから誘導される環の例を、以下に示す：
Figure 2012510460
他の修飾核酸塩基にはまた、以下に示すような塩基の置き換えが含まれる：
Figure 2012510460
蛍光性である修飾核酸塩基もまた企図される。これらの塩基の置き換えの非制限的例には、以下に示すような：フェナントレン、ピレン、スチルベン、イソキサンチン、イソザントプテリン、ターフェニル、ターチオフェン、ベンゾターチオフェン、クマリン、ルマジン、テザー化スチルベン、ベンゾ−ウラシル、およびナフト−ウラシルが含まれる。
Figure 2012510460
修飾核酸塩基は、非置換であり得るか、あるいはヘテロ原子、アルキル基、または蛍光部分、ビオチンもしくはアビジン部分、または他のタンパク質もしくはペプチドに接続された連結部分のようなさらなる置換を含有し得る。修飾核酸塩基はまた、最も古典的な意味では核酸塩基ではないが、核酸塩基と同様に機能する所定の「普遍的（universal）塩基」を含む。そのような普遍的塩基の１つの代表例は、３−ニトロピロールである。
構造ＩＶまたはＩＸのヌクレオシドに加えて、他のヌクレオシドもまた、本明細書において開示するプロセスにおいて使用され得、そして修飾核酸塩基、または修飾糖に共有結合した核酸塩基を組み込んだヌクレオシドを含み得る。修飾核酸塩基を組み込んだヌクレオシドのいくつかの例には、４−アセチルシチジン；５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウリジン；２’−Ｏ−メチルシチジン；５−カルボキシメチルアミノメチル−２チオウリジン；５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン；ジヒドロウリジン；２’−Ｏ−メチルプソイドウリジン；β，Ｄ−ガラクトシルケウオシン；２’−０−メチルグアノシン；Ｎ６−イソペンテニルアデノシン；１−メチルアデノシン；１−メチルプソイドウリジン；１−メチルグアノシン；１−メチルイノシン；２，２−ジメチルグアノシン；２−メチルアデノシン；２−メチルグアノシン；Ｎ７−メチルグアノシン；３−メチル−シチジン；５−メチルシチジン；Ｎ６−メチルアデノシン；７−メチルグアノシン；５−メチルアミノエチルウリジン；５−メトキシアミノメチル−２−チオウリジン；β，Ｄ−マンノシルケウオシン；５−メトキシカルボニルメチルウリジン；５−メトキシウリジン；２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデノシン；Ｎ−（（９−β，Ｄ−リボフラノシル−２−メチルチオプリン−６−イル）カルバモイル）スレオニン；Ｎ−（（９−β，Ｄ−リボフラノシルプリン−６−イル）−Ｎ−メチルカルバモイル）スレオニン；ウリジン−５−オキシ酢酸メチルエステル；ウリジン−５−オキシ酢酸（ｖ）；プソイドウリジン；ケウオシン；２−チオシチジン；５−メチル−２−チオウリジン；２−チオウリジン；４−チオウリジン；５−メチルウリジン；２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン；および２’−Ｏ−メチルウリジンが含まれる。
いくつかの実施形態では、ヌクレオシドには、６’−位において（Ｒ）または（Ｓ）−キラリティーのいずれかを有する６’−修飾二環式ヌクレオシド類似体が含まれ、そして米国特許第７，３９９，８４５号に記載の類似体が含まれる。他の実施形態では、ヌクレオシドには、５’−位において（Ｒ）または（５）−キラリティーのいずれかを有する５’−修飾二環式ヌクレオシド類似体が含まれ、そして米国特許出願公開第２００７０２８７８３１号に記載の類似体が含まれる。
いくつかの実施形態では、核酸塩基または修飾核酸塩基は、抗体、抗体フラグメント、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、受容体配位子、またはキレート部分のような生体分子結合性部分を含む。他の実施形態では、Ｂａは、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、または２，６−ジアミノプリンである。なお他の実施形態では、Ｂａは、蛍光部分または生体分子結合部分による置換によって修飾される。いくつかの実施形態では、Ｂａ上の置換基は、蛍光部分である。他の実施形態では、Ｂａ上の置換基は、ビオチンまたはアビジンである。
ヌクレオチド／ヌクレオシドの修飾糖
最も一般的に天然に存在するヌクレオチドは、核酸塩基アデノシン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、およびチミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ）に連結されたリボース糖である。ヌクレオチドのリン酸基または修飾リン原子部分が、糖または修飾糖の様々な位置に連結することができる、修飾ヌクレオチドも企図される。非制限的例として、リン酸基または修飾リン原子部分は、糖または修飾糖の２’、３’、４’もしくは５’ヒドロキシル部分に連結することができる。上記の修飾核酸塩基を組み込むヌクレオチドもまた、本明細書において開示するプロセスにおいて使用することができる。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドまたは保護されていない−ＯＨ部分を含む修飾ヌクレオチドは、本明細書において開示するプロセスにおいて使用される。
スキーム１−４ｂに記載のリボース部分に加えて、他の修飾糖もまた、本明細書において開示する核酸に組み込まれ得る。いくつかの実施形態では、修飾糖は、２’位において、次のうちの１つを含む１つ以上の置換基を含有する：Ｆ；ＣＦ３、ＣＮ、Ｎ３、ＮＯ、ＮＯ２、Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキル、Ｏ−アルキル−Ｎ−アルキルもしくはＮ−アルキル−Ｏ−アルキルであり、ここで、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ１０アルキルもしくはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであり得る。置換基の例は、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、およびＯ（ＣＨ２）ｎＮＨ２（ここで、ｎは１〜約１０である）、ＭＯＥ、ＤＭＡＯＥ、ＤＭＡＥＯＥが含まれ、そしてこれらに制限されない。また、国際公開第２００１／０８８１９８号パンフレット；およびMartin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504に記載の修飾糖も企図される。いくつかの実施形態では、修飾糖は、置換シリル基、ＲＮＡ切断基、レポーター基、蛍光標識、インターカレーター、核酸の薬物動態特性を改善するための基、または核酸の薬力学的特性を改善するための基、および類似の特性を有する他の置換基を含む。修飾は、３’−末端ヌクレオチド上の糖の３’位もしくは５’−末端ヌクレオチドの５’位を含む糖または修飾糖の２’、３’、４’、５’、もしくは６’位において行われ得る。
修飾糖はまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチルまたはシクロペンチル部分のような糖疑似物を含む。そのような修飾糖構造の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第４，９８１，９５７号；同第５，１１８，８００号；同第５，３１９，０８０号；および同第５，３５９，０４４号が含まれるが、これらに限定されない。以下を含むいくつかの修飾糖が企図される。
Figure 2012510460
修飾糖の他の非制限的例には、グリセロール核酸（ＧＮＡ）類似体を形成するグリセロールが含まれる。ＧＮＡ類似体の１つの例は、以下に示され、そしてZhang, R et al., J. Am. Chem. Soc., 2008, 130, 5846-5847；Zhang L, et al., J. Am. Chem. Soc., 2005, 127, 4174-4175およびTsai CH et al., PNAS, 2007, 14598-14603に記載されている：
Figure 2012510460
 式中、Ｘは、本明細書において定義されるとおりである。ＧＮＡ誘導性類似体、ホルミルグリセロールの混合型アセタールアミナールに基づく可撓性核酸（ＦＮＡ）の他の例は、Joyce GF et al., PNAS, 1987, 84, 4398-4402およびHeuberger BD and Switzer C, J. Am. Chem. Soc., 2008, 130, 412-413に記載されており、そして以下に示される：
Figure 2012510460
ブロッキング基
記載の反応では、所定の実施形態において、反応性官能基（例えば、最終生成物において所望されるヒドロキシ、アミノ、チオールまたはカルボキシ基）を、反応においてそれらの所望されない参入を回避するために、保護する必要がある。保護基は、任意のまたはすべての反応性部分をブロックし、そして保護基が除去されるまで、そのような基の化学反応への参入を回避するために使用される。一実施形態では、各保護基は、異なる手段によって除去可能である。完全に異なる反応条件下で切断される保護基は、特異な除去の要件を満たす。いくつかの実施形態では、保護基は、酸、塩基、および／または水素化分解によって除去される。トリチル、ジメトキシトリチル、アセタールおよびｔ−ブチルジメチルシリルのような基は、酸に不安定であり、所定の実施形態において、水素化分解によって除去可能でＣｂｚ基、および／または塩基に不安定であるＦｍｏｃ基で保護されたアミノ基の存在下で、カルボキシおよびヒドロキシ反応性部分を保護するために使用される。他の実施形態では、カルボン酸およびヒドロキシ反応性部分は、ｔ−ブチルカルバメートのような酸に不安定な基または酸および塩基の両方に安定であるが加水分解により除去可能であるカルバメートでブロックされたアミンの存在下で、メチル、エチル、およびアセチルのような、但し、これらに限定されない塩基に不安定な基でブロックされる。
他の実施形態では、ヒドロキシ反応性部分は、ベンジル基のような加水分解により除去可能な保護基でブロックされる一方、酸との水素結合が可能なアミン基が、Ｆｍｏｃのような塩基に不安定な基でブロックされる。他の実施形態では、カルボン酸反応性部分は、簡単なエステル化合物への変換によって保護されるか、またはそれらは、さらに他の実施形態において、２，４−ジメトキシベンジルのような酸化により除去可能な保護基でブロックされる一方、共存するアミノ基は、フッ化物に不安定なシリルまたはカルバメートブロッキング基でブロックされる。
アリルブロッキング基は安定であり、続いて、金属またはπ酸触媒により除去可能であり得るため、酸および塩基保護基の存在下で有用である。例えば、アリル−ブロックされたヒドロキシ基は、酸に不安定なｔ−ブチルカルバメートまたは塩基に不安定なアセテートアミン保護基の存在下で、Ｐｄ（０）−触媒による反応により脱保護することができる。保護基のさらに他の形態は、化合物または中間体が付着する樹脂である。残基が樹脂に付着している限り、官能基はブロックされ、そして反応することができない。一旦、樹脂から遊離すると、官能基は、反応に利用することが可能である。
典型的には、ブロッキング／保護基は、単なる例として、以下のものがある：
Figure 2012510460
合成中のヌクレオチドを保護するのに有用な代表的な保護基には、塩基に不安定な保護基および酸に不安定な保護基が含まれる。塩基に不安定な保護基は、ヘテロ環核酸塩基の環外アミノ基を保護するために使用される。このタイプの保護は、一般的に、アシル化によって達成される。この目的のための一般的に使用される３つのアシル化基は、塩化ベンゾイル、フェノキシ無水酢酸、およびイソブチリルクロリドである。これらの保護基は、核酸合成中に使用される反応条件に安定であり、そして合成終了時の塩基処理中に、ほぼ等しい割合で切断される。
いくつかの実施形態では、５’−保護基は、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、トリメトキシトリチル、２−クロロトリチル、ＤＡＴＥ、ＴＢＴｒ、９−フェニルキサンチン−９−イル（Ｐｉｘｙｌ）、または９−（ｐ−メトキシフェニル）キサンチン−９−イル（ＭＯＸ）である。
いくつかの実施形態では、チオール部分は、式１、２、４、または５の化合物に組み込まれ、そして保護される。いくつかの実施形態では、保護基には、Ｐｉｘｙｌ、トリチル、ベンジル、ｐ−メトキシベンジル（ＰＭＢ）、またはｔｅｒｔ−ブチル（ｔ−Ｂｕ）が含まれるが、これらに限定されない。
他の保護基、加えて、保護基の作製に適用可能な技術の詳細な説明およびそれらの除去については、Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Ed., John Wiley & Sons, New York, NY, 1999、およびKocienski, Protective Groups, Thieme Verlag, New York, NY, 1994に記載されており、それらは、そのような開示内容について、本明細書において参考として援用される。
いくつかの実施形態では、Ｒ１は、−ＯＲａであって、式中、Ｒａは、置換もしくは非置換のトリチルまたは置換シリルである。他の実施形態では、Ｒ１は、−Ｎ３、−ＮＲｄＲｄ、アルキニルオキシ、または−ＯＨである。いくつかの実施形態では、Ｒ２は、−ＯＲｂであり、式中、Ｒｂは、置換もしくは非置換トリチル、置換シリル、アセチル、アシル、または置換メチルエーテルである。他の実施形態では、Ｒ２は、−ＮＲｄＲｄ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキル−Ｙ１−、アルケニル−Ｙ１−、アルキニル−Ｙ１−、アリール−Ｙ１−、ヘテロアリール−Ｙ１−であり、ここで、Ｙ１は、Ｏ、ＮＲｄ、Ｓ、またはＳｅであり、そして蛍光部分または生体分子結合部分により置換される。なお他の実施形態では、Ｒ２上の置換基は、蛍光部分である。いくつかの実施形態では、Ｒ２上の置換基は、ビオチンまたはアビジンである。いくつかの実施形態では、Ｒ２は、−ＯＨ、−Ｎ３、水素、ハロゲン、アルコキシ、またはアルキニルオキシである。
他の実施形態では、Ｒ３は、置換トリチル、アシル、置換シリル、または置換ベンジルであるブロッキング基である。なお他の実施形態では、Ｒ３は、固相支持体に接続された連結部分である。さらなる実施形態では、Ｂａ部分のブロッキング基は、ベンジル、アシル、ホルミル、ジアルキルホルムアミジニル、イソブチリル、フェノキシアセチル、またはトリチル部分であり、それらのうちいずれかは、置換されていなくてもよく、もしくは置換されていてもよい。
キラルＸ−ホスホネート部分を含む核酸の使用方法
本発明の方法によって得られるキラルＸ−ホスホネート部分を含む立体配置が定義されたオリゴヌクレオチドは、安定性、定義されたキラリティーおよび合成の容易さの組み合わせのため、多くの領域の用途において有用である。概して、本方法によって合成される化合物は、治療、診断用プローブおよび試薬、他のオリゴヌクレオチド生成物を生成するための合成ツール、ならびに多様な新規の材料および計算用途に適切なナノ構造材料として有用である。
本発明の立体配置が定義されたオリゴヌクレオチドは、特に、ホスホロチオネートのクラスの立体配置が定義されたオリゴヌクレオチドは、天然のＤＮＡ／ＲＮＡ等価物より改善された血清安定性を有する。さらに、ＳＰ異性体は、ＲＰ異性体より安定である。いくつかの実施形態では、血清安定性のレベルは、すべてＳＰ中心を導入、または選択された位置にＳＰ中心を導入、のいずれかによってモジュレートされて、分解に対する耐性を付与する。他の実施形態では、選択可能なＲＰおよび／またはＳＰ立体中心の導入は、内因性または外因性の標的との特異的塩基対形成会合を提供し得、それ故、代謝から標的を保護するかまたは特定の生物学的反応を増強する。
ＲＮａｓｅＨ活性化はまた、立体制御されたホスホロチオエート核酸類似体の存在によってモジュレートされ、天然のＤＮＡ／ＲＮＡは、ＲＰ立体異性体より影響を受け易く、対応するＳＰ異性体より影響を受けやすい。
対応するＳＰオリゴヌクレオチドより大きな二重鎖安定性を有するＲＰホスホロチオエート型オリゴヌクレオチドに伴ってＲＮＡに対する改善された二重鎖安定性が示され、これは、天然のＤＮＡ／ＲＮＡより高い安定性を実証する。天然のＤＮＡ／ＲＮＡを超える安定性を有するＲＰより大きな二重鎖安定性を有するＳＰに伴って、ＤＮＡに対する改善された二重鎖安定性が示される（P. Guga, Curr. Top Med. Chem., 2007, 7, 695-713）。
これらの分子は、多くの特定の用途において、治療剤として有用であり得る。それらは、標準的なＤＮＡ／ＲＮＡヌクレオシドもまた含有するオリゴヌクレオチドに組み込まれ得るか、またはそれらは、本発明の立体制御されたオリゴヌクレオチドの全配列として合成され得る。治療剤のいくつかのカテゴリーには、アンチセンスオリゴヌクレオチド、標的にした配列と三重螺旋を形成して、所望されない遺伝子の転写を抑制し、そしてタンパク質発現および／または活性をモジュレートするアンチジーンオリゴヌクレオチド、デコイオリゴヌクレオチド、ＤＮＡワクチン、アプタマー、リボザイム、デオキシリボザイム（ＤＮＡザイムもしくはＤＮＡ酵素）、ｓｉＲＮＡｓ、マイクロＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ（非コーディングＲＮＡｓ）、ならびにＰ−修飾プロドラッグが含まれるが、これらに限定されない。モジュレーションは、間接的または直接的に、タンパク質の活性を増加または減少すること、あるいはタンパク質の発現の阻害もしくは促進を包含する。これらの核酸化合物を使用して、細胞増殖、ウイルスの複製、または他の任意の細胞シグナリングプロセスを制御することができる。
一実施例では、ｓｉＲＮＡ治療の分野は、天然のヌクレオシドからなるｓｉＲＮＡにおいて認められるもの超えて作用期間を改善するために、ＲＮａｓｅ活性に対する増加した安定性を付与することができるオリゴヌクレオチド種の必要性を有する。さらに、Ａ型螺旋形成は、オリゴヌクレオチド上の特定の天然のエレメントの存在よりも、侵入ＲＮＡｉの成功をより明確に表すようである。これらの要件は、両方とも本発明の立体制御されたオリゴヌクレオチドの使用によって付与され得、増強された安定性を提供し得る（Y-L Chiu, T.M. Rana RNA, 2003, 9,1034-1048）。
本明細書に記載の核酸は、抗ウイルス剤としての使用を含む様々な病態に対する治療剤として有用である。核酸は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ活性のモジュレーションを介して、疾患の処置のための薬剤として使用され得る。いくつかの実施形態では、核酸は、特定の遺伝子発現を阻害するために、使用され得る。例えば、核酸は、特定の標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列に相補的であり得る。それらは、オルソポックスウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペス、パピローマ、インフルエンザ、サイトメガロウイルスおよび他のウイルスのようなウイルスの複製を阻害するために使用され得る。他の例には、ＨＩＶ ＲＮＡまたは他のレトロウイルスＲＮＡに対するアンチセンス化合物として、あるいはｔａｔタンパク質をコードするＨＩＶ ｍＲＮＡ、もしくはＨＩＶ ｍＲＮＡのＴＡＲ領域にハイブリダイズさせるための使用が含まれる。いくつかの実施形態では、核酸は、ＨＩＶ ｍＲＮＡのＴＡＲ領域の二次構造を模倣し、そしてそうすることによってｔａｔタンパク質に結合する。ある実施形態では、核酸は、細胞と式１の化合物とを接触させることによって、標的タンパク質の発現を阻害するために使用され、ここで、細胞における他のタンパク質の発現は、阻害されないか、または最小限に阻害される。いくつかの実施形態では、標的タンパク質阻害は、哺乳動物においてインビボで生じる。他の実施形態では、治療有効量の式１の化合物が、標的タンパク質の発現を阻害するために投与される。
発現をモジュレートすることができるタンパク質の他の例には、Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）タンパク質、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼＩ、アポリポタンパク質Ｂ、グルカゴン受容体、Ａｕｒｏｒａ Ｂ、アシルＣｏＡコレステロールアシルトランスフェラーゼ−２、ｃ−反応性タンパク質、タンパク質のＳＴＡＴ（シグナル伝達性転写因子）ファミリー、およびＭＤＲ Ｐ−糖タンパク質が含まれる。核酸は、タンパク質ホスファターゼＩＢ（ＰＴＰ１Ｂ）発現、ＲＮＡ依存性ＲＮＡウイルスポリメラーゼを阻害するために、使用され得る。核酸は、癌細胞におけるアポトーシスのような事象を誘導するか、またはアポトーシスをより受け易い細胞を作製するために使用され得る。核酸は、タンパク質の活性をモジュレートするために使用され得る。例えば、それは、多剤耐性（ＭＤＲ）ＲＮＡ分子に対するＲＮａｓｅＨ活性をモジュレートするのに役立ち得る。
本明細書に記載の核酸は、高コレステロール血症、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、ＡＩＤＳまたはＨＩＶのようなレトロウイルス性疾患、他のウイルス感染、子宮内感染、および癌を含むが、これらに限定されない適応症を処置するために有用である。
治療剤として使用する場合、本明細書に記載の核酸は、医薬組成物として投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、治療有効量の式１のキラルＸ−ホスホネート部分を含む核酸、またはその薬学的に許容できる塩、ならびに薬学的に許容できる希釈剤、薬学的に許容できる賦形剤、および薬学的に許容できるキャリアから選択される少なくとも１つの薬学的に許容できる不活性成分を含む。他の実施形態では、医薬組成物は、静脈内注入、経口投与、頬側投与、吸入、経鼻投与、局所投与、眼内投与または耳内投与のために処方される。さらなる実施形態では、医薬組成物は、錠剤、ピル、カプセル、液体、吸入剤、経鼻スプレー溶液、坐剤、懸濁液、ゲル、コロイド、分散剤、懸濁液、溶液、乳液、軟膏、ローション、点眼剤または点耳剤である。
本発明の方法によって合成される化合物が有用である第２のカテゴリーは、プライマーまたはプローブとしてである。前記方法は、配列（天然および非天然）、ならびにリン中心における立体化学の全体的制御を提供するため、任意の特定の分子を、特異的に生成することができる。さらに、さらなるＲＮａｓｅ耐性は、エクスビボまたはインビボ条件下で強固な分子を提供する。本発明の立体配置が定義されたオリゴヌクレオチドは、消化、ライゲーション、および核酸の重合のようなリン原子に関与する酵素反応機構の調査のためのプローブとして使用することができる。このクラスの分子は、リボザイムおよびデオキシリボザイム反応機構の調査のためのプローブとして使用することができる。それらはまた、ＲＮＡｉおよび他の非コーディングＲＮＡ仲介遺伝子サイレンシング機構の調査のためのプローブとしてまたはタンパク質−核酸相互作用の分析のためのプローブとして機能することができる。選択したＲＰまたはＳＰリン立体中心を組み込むことによって三次元構造を定義する能力は、新規のクラスのいわゆる分子標識の設計を可能にする。
本合成方法は、狭義の組の天然の核酸塩基に限定されないため、修飾核酸塩基または塩基もしくは糖もしくは末端に対する他の修飾は、核酸、タンパク質および溶液中の任意の生物学的もしくは化学的物質のプローブまたはセンサーとしての、このクラスのオリゴヌクレオチドの使用を可能にする。同様に、それらを、天然のＤＮＡ／ＲＮＡの代わりに、標準的な検出方法を使用して、修飾核酸塩基を伴わずに使用してもよい。これらはいずれも、診断アッセイの一部として組み込まれ得る。
そのような診断試験は、生物学的液体、組織、無傷の細胞または単離された細胞成分を使用して、実施することができる。遺伝子発現阻害に関して、診断用途では、核酸の相補鎖とハイブリダイズする核酸の能力を利用する。ハイブリダイゼーションは、ワトソン−クリックおよび／またはＲＮＡもしくはＤＮＡに対するフーグスティーン塩基対を介した、オリゴマー化合物の配列特異的水素結合である。そのような塩基対の塩基を、相互に相補的であると言う。核酸は、身体の状態、例えば、動物における罹患状態を分析するために使用され得る。それらは、サンプル中のアデノウイルスもしくはインフルエンザウイルスの同定またはインターカレート剤またはプローブとして使用され得る。例えば、それらは、ＤＮＡメチル化を検出するか、またはタンパク質のような他の細胞成分とのＤＮＡ相互作用を探索するために使用され得る。
本発明の他の態様では、サンプル中の標的分子を同定または検出する方法が提供され、前記方法は、標的分子を含有することが疑わしいサンプルと、本発明の方法に従って合成される式１の核酸センサー分子とを接触させる工程を含み、ここで、シグナル発生ユニットによって発生するシグナルの変化は、サンプル中の標的の存在を示す。核酸センサー分子は、標的分子に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、複数の核酸センサー分子が存在する。いくつかの実施形態では、複数の核酸センサー分子は、異なる標的分子に特異的に結合する核酸センサー分子を含む。場合によって、前記方法は、シグナル発生ユニットによって発生するシグナルの変化を定量して、サンプル中の標的分子の量を定量する工程をさらに含む。シグナル発生ユニットは、蛍光、表面プラズモン共鳴、蛍光消光、化学発光、干渉計測、または屈折率検出を含むが、これらに限定されない任意の種類のシグナルを検出する。
検出しようとするサンプルは、環境サンプル、バイオハザード材料、有機サンプル、薬物、毒素、フレーバー、香料、または生物学的サンプルである。生物学的サンプルは、細胞、細胞抽出物、細胞溶解物、組織、組織抽出物、体液、血清、血液または血液産物である。前記方法のいくつかの実施形態では、標的分子の存在は、病的状態の存在を示す。前記方法のいくつかの実施形態では、標的分子の存在は、所望の分子の存在を示す。
関連する使用において、本発明の方法によって提供される立体配置が定義されたオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲのためのプライマーとして、またはポリメラーゼを使用するＤＮＡ／ＲＮＡ合成のための鋳型もしくはプライマーとして有用である。融解温度は、生成物オリゴヌクレオチドのリンにおけるＲＰまたはＳｐキラリティーの選択導入に依存して、特定の用途について最適化され得る。
本発明の他の態様では、核酸鋳型から核酸の所望の領域を増幅する方法が提供され、前記方法は：（ａ）目的のコンセンサス配列に相補的な一定のヌクレオチド配列のある領域を有する複数の第１のＰＣＲプライマーを提供する工程；（ｂ）複数の第２のＰＣＲプライマーを提供する工程、（ｃ）第１のプライマーおよび第２のプライマーによってフランキングされる核酸領域が特異的に増幅されるように、複数の第１のプライマーのサブセットが、実質的にそれが鋳型のどこで生じようとも目的のコンセンサス配列に結合し、そして複数の第２のプライマーのサブセットが、第１のプライマーから隔たった場所で鋳型に結合するという条件下で、複数の第１のＰＣＲプライマーおよび複数の第２のＰＣＲプライマーを使用するＰＣＲを介して、核酸鋳型を増幅する工程であって、複数の第１のＰＣＲプライマーおよび／または複数の第２のＰＣＴプライマーは本発明の方法に従って生成される式１の核酸分子である工程、を含む。
いくつかの実施態様では、鋳型は、ゲノムＤＮＡである。いくつかの実施態様では、鋳型は、真核生物のゲノムＤＮＡである。いくつかの実施態様では、鋳型は、ヒトのゲノムＤＮＡである。いくつかの実施態様では、鋳型は、原核生物のＤＮＡである。いくつかの実施形態では、鋳型は、クローニングされたゲノムＤＮＡ、ＤＮＡのサブゲノム領域、染色体、またはサブ染色体領域であるＤＮＡである。いくつかの実施態様では、鋳型は、ＲＮＡである。
立体配置が定義されたオリゴヌクレオチドはまた、それらの増加した安定性ならびにそれらの生物学的標的の認識および結合を保持する能力により、ＤＮＡチップおよびオリゴヌクレオチドマイクロアレイのための物質としても有用である。それらはまた、無細胞タンパク質合成におけるｔＲＮＡおよびｍＲＮＡのような天然の核酸に代わる安定化されたオリゴヌクレオチドとして、使用してもよい。
安定性、非天然の部分を含む分子組成、および構造をすべて同じ合成内において制御する能力が有用であるさらなる領域は、ＤＮＡナノ材料設計における適用のための領域である。本発明の立体配置が定義されたオリゴヌクレオチドは、二重鎖、三重鎖、四重鎖、および他のさらに高次の構造からなる核酸ナノ構造の構築のための物質として、使用してもよい。本方法によって生成される分子における他の有機部分を組み込む能力は、特定の非天然のさらに高次の構造を設計することによるナノ材料の適用をもたらす。設計のインビボでの安定性および可撓性は、例えば、ＤＮＡコンピュータにおけるこれらの分子の使用を可能にする。さらに、有機分子にキレートまたは導電する金属は、本発明の立体配置が定義されたオリゴヌクレオチドに組み込まれ得、そして電子デバイスにおけるＤＮＡナノワイヤーまたはＤＮＡ／ＲＮＡナノ機器としてのそれらの使用をもたらし得る（F.A. Aldate, A.L. Palmer, Science, 2008, 321, 1795-1799）。
一般的情報：
本明細書におけるすべてのＮＭＲスペクトルは、Ｖａｒｉａｎ Ｍｅｒｃｕｒｙ ３００上で記録した。１Ｈ ＮＭＲスペクトルは、３００ＭＨｚにおいて、ＣＤＣｌ３中、内部標準としてテトラメチルシラン（ＴＭＳ）（δ０．０）を用いて入手した。３１Ｐ ＮＭＲスペクトルは、１２１．５ＭＨｚにおいて、外部標準として８５％Ｈ３ＰＯ４（δ０．０）を用いて入手した。ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｖｏｙａｇｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ４３２７上で記録した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーは、Ｋａｎｔｏシリカゲル６０Ｎ（球状、中性、６３〜２１０μｍ）を使用して、行った。分析ＴＬＣは、Ｍｅｒｃｋ Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０−Ｆ２５４プレート上で実施した。乾燥有機溶媒は、使用前に、適切な手順によって調製した。他の有機溶媒は、試薬用であり、そのまま使用した。ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ（登録商標）は、ＢＥＨ Ｃ１８（１．７μｍ、２．１×１５０ｍｍ）を使用して行った。ｄＴＴ、ｄＣＴ、ｄＡＴ、ｄＧＴ、ｒＵＯＭｅＵ、およびｒＵＦＵホスホロチオエートダイマーの収量は、それぞれ、天然のｄＴＴ（１６８００）、ｄＣＴ（１５２００）、ｄＡＴ（２２８００）、ｄＧＴ（２００００）、ｒＵＵ（１９６００）、ｒＵＵ（１９６００）ダイマーについての近値のモル吸光係数を用いて、２６０ｎｍにおけるＵＶ吸収測定により決定した。
略称：
ｂｚ：ベンゾイル
ビューケージ試薬：３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシド
ＢＳＡ：Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド
ＢＴＣ：ビス（トリクロロメチル）カルボネート
ｃｅ：シアノエチル
ＣＦ３ＣＯＩｍ：Ｎ−トリフルオロアセチルイミダゾール
ＣＭＰ：Ｎ−シアノメチルピロリジン
ＣＭＰＴ：Ｎ−シアノメチルピロリジニウムトリフルオロメタンスルホネート
ＣＰＧ：制御された多孔質ガラス
ＤＢＵ：１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン
ＤＣＡ：ジクロロ酢酸
ＤＣＭ：ジクロロメタン、ＣＨ２Ｃｌ２
ＤＭＡｃ：Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド
ＤＭＡＮ：１，８−ビス（ジメチルアミノ）ナフタレン
ＤＭＴｒ：４，４’−ジメトキシトリチル
ＤＴＤ：Ｎ，Ｎ’−ジメチルチウラムジスルフィド
ＨＣＰ：高架橋ポリスチレン
ｐａｃ：フェノキシアセチル
ＴＢＳ：ｔ−ブチルジメチルシリル
ＴＢＤＰＳ：ｔ−ブチルジフェニルシリル
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
Ｌ−２：本明細書における式Ｐと同じ
Ｄ−２：本明細書における式Ｏと同じ
Ｌ−６：本明細書における式Ｒと同じ
Ｄ−６：本明細書における式Ｑと同じ
実施例１：経路Ａを介するホスホロチオエートダイマー、（ＳＰ）−１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウムＮ３−ベンゾイル−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）チミジン−３’−イルＮ３−ベンゾイル−３’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）チミジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＳＰ）−４ｔｔ］の溶液合成
８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウムＮ３−ベンゾイル−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）チミジン−３’−イルホスホネート（１ｔ）（９６．０ｍｇ、１２０μｍｏｌ）を、乾燥ピリジンとの反復共エバポレーションによって乾燥し、次いで、乾燥ピリジン（２ｍＬ）に溶解した。ＢＴＣ（２９．７ｍｇ １００μｍｏｌ）を添加し、そして混合物を、１０分間、撹拌した。乾燥ピリジンとの反復的共エバポレーションによって調製し、そして乾燥ピリジン（１ｍＬ）に溶解したアミノアルコールＬ−２（２１．３ｍｇ、１２０（μｍｏｌ）溶液を、シリンジを介して反応混合物に滴下し、そして混合物を、５分間、アルゴン雰囲気下で撹拌した。乾燥ピリジンとの反復共エバポレーションによって調製し、そしてピリジン（５００μｍｏｌ）に溶解したＮ３−ベンゾイル−３’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）チミジン（３ｔ）の溶液に、シリンジを介して、反応混合物を添加した。３０分後、ＤＴＤ（４２．５ｍｇ、１２０μｍｏｌ）を、反応混合物に添加した。さらなる５分後、溶媒を、低圧下でエバポレートした。濃ＮＨ３−ＥｔＯＨ（４０ｍＬ；３：１ｖ／ｖ）を残渣に添加し、そして混合物を、１２時間、室温で撹拌した。混合物を低圧下で濃縮して、乾燥させた。粗混合物を、ＣＨＣｌ３（１５ｍＬ）で希釈し、そして０．２Ｍトリエチルアンモニウムヒドロゲンカルボネート（２０ｍＬ）で洗浄した。水層を、ＣＨＣｌ３（４×１５ｍＬ）で逆抽出した。合わせた有機層を、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、そして低圧下で濃縮して、乾燥させた。残渣を、ＰＴＬＣにより精製した。生成物を、ＣＨＣｌ３（５ｍＬ）に溶解し、０．２Ｍ１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウムヒドロゲンカルボネート緩衝液（１０ｍＬ）で洗浄し、そしてＣＨＣｌ３（３×５ｍＬ）で逆抽出した。合わせた有機層を、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、そして濃縮して、乾燥させ、白色のフォームとして（Ｓｐ）４ｔｔ（４１．８ｍｇ、９８％収率、ＲＰ：ＳＰ＝９：９１）を得た。１Ｈおよび３１Ｐ ＮＭＲスペクトル（それぞれ、図１および２）は、従来のＨ−ホスホネート法によって合成された対照サンプルのスペクトルと同一であった。３１Ｐ ＮＭＲ（１２１．５ＭＨｚ、ＣＤＣ１３）δ ５７．４（ＲＰ異性体：５７．９）。合成スキームをスキーム１０に示す。
Figure 2012510460
 スキーム１０．スキーム５（経路Ａ）におけるＤＮＡダイマーの溶液合成
実施例２：経路Ａを介するホスホロチオエートダイマー、（ＳＰ）−１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７エニウム６−Ｎ−ベンゾイル−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）−デオキシアデノシン−３’−イル３’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）チミジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＳＰ）−４ａｔ］の溶液合成
（ＳＰ）−４ａｔは、（ＳＰ）−４ｔｔについて上記した反応工程を使用して、１ｔの代わりに、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウム６−Ｎ−ベンゾイル−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）−デオキシアデノシン−３’−イルホスホネート（１ａ）から得られる。
実施例３：経路Ａを介するホスホロチオエートダイマー、（ＳＰ）−１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウム４−Ｎ−ベンゾイル−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）−デオキシシチジン−３’−イル３’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）チミジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＳＰ）−４ｃｔ］の溶液合成
（ＳＰ）−４ｃｔは、（ＳＰ）−４ｔｔについて上記した反応工程を使用して、１ｔの代わりに、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウム４−Ｎ−ベンゾイル−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）−デオキシシチジン−３’−イルホスホネート（１ｃ）から得られる。
実施例４：経路Ａを介するホスホロチオエートダイマー、（ＳＰ）−１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７エニウム２−Ｎ−フェノキシアセチル−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）デオキシグアノシン−３’−イル３’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）チミジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＳＰ）−４ｇｔ］の溶液合成
（Ｓｐ）−４ｇｔは、（Ｓｐ）−４ｔｔについて上記した反応工程を使用して、１ｔの代わりに、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウム２−Ｎ−フェノキシアセチル−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）デオキシグアノシン−３’−イルホスホネート（１ｇ）から得られる。
実施例５：経路Ａを介するホスホロチオエートダイマー、（ＲＰ）−１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウムＮ３−ベンゾイル−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）チミジン−３’−イルＮ３−ベンゾイル−３’−Ｏ−（ｔｅｒｔブチルジメチルシリル）チミジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＲＰ）−４ｔｔ］の溶液合成
（（ＲＰ）−４ｔｔは、実施例１の（Ｓｐ）−４ｔｔに類似の様式で、Ｌ−２の代わりにアミノアルコールＤ−２を使用することによって、白色フォーム（９３％収率、ＲＰ：ＳＰ＝９５：５）として得た。１Ｈおよび３１Ｐ ＮＭＲスペクトルを、それぞれ、図３および４に示す。３１Ｐ ＮＭＲ（１２１．５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３） δ５７．６（ＳＰ異性体：５７．３。
Figure 2012510460
実施例６：経路Ａを介するホスホロチオエートダイマー、（ＲＰ）−１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウム６−Ｎ−ベンゾイル−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）デオキシアデノシン−３’−イル３’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）チミジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＲＰ）−４ａｔ］の溶液合成
（ＲＰ）−４ａｔは、実施例２における上記の変換を介して、化合物１ａおよびＬ−２の代わりにキラル試薬としてアミノアルコールＤ−２を使用して、生成される。
実施例７：経路Ａを介するホスホロチオエートダイマー、（ＲＰ）−１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７エニウム４−Ｎ−ベンゾイル−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）デオキシシチジン−３’−イル３’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）チミジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＲＰ）−４ｃｔ］の溶液合成
（ＲＰ）−４ｃｔは、実施例３における上記の変換を介して、化合物１ｃおよびＬ−２の代わりにキラル試薬としてアミノアルコールＤ−２を使用して、生成される。
実施例８：経路Ａを介するホスホロチオエートダイマー、（ＲＰ）−１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７エニウム２−Ｎ−フェノキシアセチル−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）デオキシグアノシン−３’−イル３’−Ｏ−（ｔｅｒｔブチルジメチルシリル）チミジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＲＰ）−４ｇｔ］の溶液合成
（ＲＰ）−４ｇｔは、実施例４における上記の変換を介して、化合物１ｇおよびＬ−２の代わりにキラル試薬としてアミノアルコールＤ−２を使用して、生成される。
実施例９：（ＳＰ）−アンモニウムチミジン−３’−イルチミジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＳＰ）−５ｔｔ］を形成させるための脱保護
（ＳＰ）−４ｔｔ（５０μｍｏｌ）を、乾燥ピリジンおよび乾燥トルエンとの反復共エバポレーションによって乾燥し、次いで、トリエチルアミントリヒドロフロリド（５００μＬ）に溶解する。混合物を、１５時間、室温で撹拌する。次いで、０．１Ｍアンモニウムアセテート緩衝液（２．５ｍＬ）を混合物に添加し、そして混合物をＥｔ２Ｏ（３×３ｍＬ）で洗浄する。合わせた有機層を、０．１Ｍアンモニウムアセテート緩衝液（３ｍＬ）で逆抽出する。次いで、合わせた水層を、低圧下で濃縮して、乾燥させ、そして残渣を、逆相カラムクロマトグラフィー［０．１Ｍアンモニウムアセテート緩衝液（ｐＨ７．０）中アセトニトリル０〜１０％の直線勾配］によって、精製して、（ＳＰ）−５ｔｔを得る。脱保護スキームをスキーム１１に示す。
スキーム１１．脱保護
Figure 2012510460
実施例１０：（ＳＰ）−アンモニウムデオキシアデノシン−３’−イルチミジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＳＰ）−５ａｔ］を形成させるための脱保護
（ＳＰ）−５ａｔは、（ＳＰ）−４ｔｔの代わりに（ＳＰ）−４ａｔを使用して、実施例９において上記したように生成される。
実施例１１：（Ｓｐ）−アンモニウムデオキシシチジン−３’−イルチミジン−５’−イルホスホロチオエート［（Ｓｐ）−５ｃｔ］を形成させるための脱保護
（ＳＰ）−５ｃｔは、（ＳＰ）−４ｔｔの代わりに（ＳＰ）−４ｃｔを使用して、実施例９において上記したように生成される。
実施例１２：（Ｓｐ）−アンモニウムデオキシグアノシン−３’−イルチミジン−５’−イルホスホロチオエート［（Ｓｐ）−５ｇｔ］を形成させるための脱保護
（ＳＰ）−５ｇｔは、（ＳＰ）−４ｔｔの代わりに（ＳＰ）−４ｇｔを使用して、実施例９において上記したように生成される。
実施例１３：（ＲＰ）−アンモニウムチミジン−３’−イルチミジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＲＰ）−５ｔｔ］を形成させるための脱保護
（ＲＰ）−５ｔｔは、（ＳＰ）−５ｔｔと同様の様式で、（ＳＰ）−４ｔｔの代わりに（ＲＰ）−４ｔｔを使用して、実施例９において上記したように生成される。
実施例１４：（ＲＰ）−アンモニウムデオキシアデノシン−３’−イルチミジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＲＰ）−５ａｔ］を形成させるための脱保護
（ＲＰ）−５ａｔは、（ＳＰ）−４ｔｔの代わりに（ＲＰ）−４ａｔを使用して、実施例９において上記したように生成される。
実施例１５：（ＲＰ）−アンモニウムデオキシシチジン−３’−イルチミジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＲＰ）−５ｃｔ］を形成させるための脱保護
（ＲＰ）−５ｃｔは、（ＳＰ）−４ｔｔの代わりに（ＲＰ）−４ｃｔを使用して、実施例９において上記したように生成される。
実施例１６：（ＲＰ）−アンモニウムデオキシグアノシン−３’−イルチミジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＲＰ）−５ｇｔ］を形成させるための脱保護
（ＲＰ）−５ｇｔは、（ＳＰ）−５ｔｔと同様の様式で、（ＳＰ）−４ｔｔの代わりに（ＲＰ）−４ｇｔを使用して、実施例９において上記したように生成される。
実施例１７：経路Ｂを介する（ＲＰ）−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）チミジン−３’−イル３’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）チミジン−５’−イルＨ−ホスホネート［（ＲＰ）−７ｔｔ］の合成
１ｔ（１００μｍｏｌ）を、乾燥ピリジンとの反復共エバポレーションによって乾燥し、次いで、乾燥ピリジン（１ｍＬ）に溶解する。Ｎ，Ｎ’−ビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）ホスフィン酸クロリド（ＢｏｐＣｌ；５００μｍｏｌ）を添加し、そして混合物を、５分間、撹拌する。混合物に、乾燥ピリジンとの共エバポレーションによって乾燥し、そして乾燥ピリジン（１ｍＬ）に溶解したアミノアルコール（（αＲ、２Ｓ）−６）（１００μｍｏｌ）の溶液を、シリンジを介して滴下で添加し、そして混合物を、５分間、アルゴン下で撹拌する。３’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）チミジンを、乾燥ピリジンとの反復共エバポレーションを使用して乾燥し、そして１００μｍｏｌのピリジンに溶解する。上記の混合物を、カニューレを介して、乾燥（１００μｍｏｌ）ピリジン中３’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）チミジン３ｔの溶液に添加する。１５分後、混合物を低圧下で濃縮する。残渣を、ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）で希釈し、そして飽和ＮａＨＣＯ３（３×５ｍＬ）で洗浄する。合わせた水層を、ＣＨ２Ｃｌ２（２×５ｍＬ）で逆抽出する。合わせた有機層を、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、そして低圧下で濃縮して、約１ｍＬにする。残渣を、シリンジを介して滴下で、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）中撹拌した１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）溶液に０℃で添加する。さらに５時間後、混合物を乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）で希釈し、そして飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２×１００ｍＬ）で洗浄する。合わせた水層を、ＣＨ２Ｃｌ２（２×１００ｍＬ）で逆抽出する。合わせた有機層を、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、そして低圧下で濃縮して、乾燥させ、粗（ＲＰ）−７ｔｔを得る。合成スキームをスキーム１２に示す。
スキーム１２．スキーム６（経路Ｂ）におけるＤＮＡ類似体の合成
Figure 2012510460
実施例１８：経路Ｂを介する（ＲＰ）−６−Ｎ−ベンゾイル−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）デオキシアデノシン−３’−イル３’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）チミジン−５’−イルＨ−ホスホネート［（ＲＰ）−７ａｔ］の合成
粗（ＲＰ）−７ａｔは、１ｔの代わりに１ａを使用して、実施例１７に記載のように生成される。
実施例１９：経路Ｂを介する（ＲＰ）−４−Ｎ−ベンゾイル−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）デオキシシチジン−３’−イル３’−Ｏ（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）チミジン−５’−イルＨ−ホスホネート［（ＲＰ）−７ｃｔ］の合成
粗（ＲＰ）−７ｃｔは、１ｔの代わりに１ｃを使用して、実施例１７に記載のように生成される。
実施例２０：経路Ｂを介する（ＲＰ）−２−Ｎ−フェノキシアセチル−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）デオキシグアノシン−３’−イル３’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）チミジン−５’−イルＨ−ホスホネート［（ＲＰ）−７ｇｔ］の合成
粗（ＲＰ）−７ｇｔは、１ｔの代わりに１ｇを使用して、実施例１７に記載のように生成される。
実施例２１：経路Ｂを介する（ＳＰ）−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）チミジン−３’−イル３’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）チミジン−５’−イルＨ−ホスホネート［（ＳＰ）−７ｔｔ］の合成
粗（ＳＰ）−７ｔｔは、キラル試薬として（αＲ、２Ｓ）−６の代わりに（αＳ、２Ｒ）−６を使用して、実施例１７に記載のように生成される。
実施例２２：経路Ｂを介する（ＳＰ）−６−Ｎ−ベンゾイル−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）デオキシアデノシン−３’−イル３’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）チミジン−５’−イルＨ−ホスホネート［（ＳＰ）−７ａｔ］の合成
粗（ＳＰ）−７ａｔは、化合物１ａ、およびキラル試薬として（αＲ、２Ｓ）−６の代わりに（αＳ、２Ｒ）−６を使用して、実施例１７に記載のように生成される。
実施例２３：経路Ｂを介する（ＳＰ）−４−Ｎ−ベンゾイル−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）デオキシシチジン−３’−イル３’−Ｏ（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）チミジン−５’−イルＨ−ホスホネート［（ＳＰ）−７ｃｔ］の合成
粗（ＳＰ）−７ｃｔは、化合物１ｃ、およびキラル試薬として（αＲ、２Ｓ）−６の代わりに（αＳ、２Ｒ）−６を使用して、実施例１７に記載のように生成される。
実施例２４：経路Ｂを介する（ＳＰ）−２−Ｎ−フェノキシアセチル−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）デオキシグアノシン−３’−イル３’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）チミジン−５’−イルＨ−ホスホネート［（ＳＰ）−７ｇｔ］の合成
粗（ＳＰ）−７ｇｔは、化合物１ｇ、およびキラル試薬として化合物（αＲ、２Ｓ）−６の代わりに化合物（αＳ、２Ｒ）−６を使用して、実施例１７に記載のように生成される。
実施例２５：一般スキーム１３に示される（ＲＰ）−アンモニウムチミジン−３’−イルチミジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＲＰ）−５ｔｔ］を生成するための修飾
（ＳＰ）−７ｔｔを、乾燥ピリジンおよび乾燥トルエンとの反復共エバポレーションによって乾燥し、次いで、ＣＨ３ＣＮ（１ｍＬ）に溶解する。Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（ＢＳＡ；１００μＬ）を添加する。１分後、Ｎ，Ｎ’−ジメチルチウラムジスルフィド（ＤＴＤ；１２０μｍｏｌ）を添加する。さらに３分間後、混合物を、低圧下で濃縮して、乾燥させ、粗（ＲＰ）−４ｔｔを得る。次いで、粗（ＲＰ）−４ｔｔを、トリエチルアミントリヒドロフロリド（１ｍＬ）に溶解する。混合物を、１５時間、室温で撹拌する。次いで、０．１Ｍアンモニウムアセテート緩衝液（５ｍＬ）を混合物に添加し、そして混合物をＥｔ２Ｏ（３×５ｍＬ）で洗浄する。合わせた有機層を、０．１Ｍアンモニウムアセテート緩衝液（５ｍＬ）で逆抽出する。次いで、合わせた水層を、低圧下で濃縮して、乾燥させ、そして残渣を、逆相カラムクロマトグラフィー［０．１Ｍアンモニウムアセテート緩衝液（ｐＨ７．０）中アセトニトリル０〜１０％の直線勾配］によって、精製して、（ＲＰ）−５ｔｔを得た。修飾工程をスキーム１３に示す。
スキーム１３．硫黄を導入するためのリンにおける修飾
Figure 2012510460
実施例２６：（ＲＰ）−アンモニウムデオキシアデノシン−３’−イルチミジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＲＰ）−５ａｔ］を生成するための修飾
（ＲＰ）−５ａｔは、（ＳＰ）−７ｔｔの代わりに（ＳＰ）−７ａｔを使用して、実施例２５に記載のように生成される。
実施例２７：（ＲＰ）−アンモニウムデオキシシチジン−３’−イルチミジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＲＰ）−５ｃｔ］を生成するための修飾
（ＲＰ）−５ｃｔは、（ＳＰ）−７ｔｔの代わりに（ＳＰ）−７ｃｔを使用して、実施例２５に記載のように生成される。
実施例２８：（ＲＰ）−アンモニウムデオキシグアノシン−３’−イルチミジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＲＰ）−５ｇｔ］を生成するための修飾
（ＲＰ）−５ｇｔは、（ＳＰ）−７ｔｔの代わりに（ＳＰ）−７ｇｔを使用して、実施例２５に記載のように生成される。
実施例２９：（Ｓｐ）−アンモニウムチミジン−３’−イルチミジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＳＰ）−５ｔｔ］を生成するための修飾
（ＳＰ）−５ｔｔは、（ＳＰ）−７ｔｔの代わりに（ＲＰ）−７ｔｔを使用して、実施例２５に記載のように生成される。
実施例３０：（ＳＰ）−アンモニウムデオキシアデノシン−３’−イルチミジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＳＰ）−５ａｔ］を生成するための修飾
（ＳＰ）−５ａｔは、（ＳＰ）−７ｔｔの代わりに（ＲＰ）−７ａｔを使用して、実施例２５に記載のように生成される。
実施例３１：（ＳＰ）−アンモニウムデオキシシチジン−３’−イルチミジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＳＰ）−５ｃｔ］を生成するための修飾
（ＳＰ）−５ｃｔは、（ＳＰ）−７ｔｔの代わりに（ＲＰ）−７ｃｔを使用して、実施例２５に記載のように生成される。
実施例３２：（ＳＰ）−アンモニウムデオキシグアノシン−３’−イルチミジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＳＰ）−５ｇｔ］を生成するための修飾
（ＳＰ）−５ｇｔは、（ＳＰ）−７ｔｔの代わりに（ＲＰ）−７ｇｔを使用して、実施例２５に記載のように生成される。
実施例３３：経路Ａを介するＲＮＡアナログダイマー、（ＳＰ）−１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウム５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）−２’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）ウリジン−３’−イル２’，３’−Ｏ−ビス（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）ウリジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＳＰ）−１０ｕｕ］の合成。
１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウム５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）−２’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）ウリジン−３’−イルホスホネート（８ｕ）（１００μｍｏｌ）を、乾燥ピリジンとの反復共エバポレーションによって乾燥し、次いで、乾燥ピリジン（１ｍＬ）に溶解する。Ｎ，Ｎ’−ビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）ホスフィン酸クロリド（ＢｏｐＣｌ；５００μｍｏｌ）を添加し、そして混合物を、５分間、撹拌する。混合物に、乾燥ピリジンとの反復共エバポレーションによって乾燥し、そして乾燥ピリジン（１ｍＬ）に溶解したアミノアルコール（Ｌ−２）（１００μｍｏｌ）の溶液を、シリンジを介して滴下で添加し、そして混合物を、５分間、アルゴン下で撹拌する。２’，３’−Ｏ−ビス（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）ウリジン９ｕを、乾燥ピリジンとの反復共エバポレーションによって乾燥し、そして１００μｍｏｌのピリジンに溶解する。次いで、上記の混合物を、カニューレを介して２’，３’−Ｏ−ビス（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）ウリジン９ｕ（１００μｍｏｌ）の溶液に添加する。１０分後、Ｎ−トリフルオロアセチルイミダゾール（ＣＦ３ＣＯＩｍ；２００μｍｏｌ）を添加する。さらに３０秒間後、Ｎ，Ｎ’−ジメチルチウラムジスルフィド（ＤＴＤ；１２０ｎｍｏｌ）を添加する。さらに３分間後、混合物を減圧下で乾燥する。残渣に、濃ＮＨ３−ＥｔＯＨ（３：１、ｖ／ｖ、１０ｍＬ）を添加し、そして混合物を１２時間、撹拌し、次いで低圧下で濃縮して、乾燥させる。次いで、混合物を、ＣＨＣｌ３（５ｍＬ）で希釈し、そして０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０、５ｍＬ）で洗浄した。合わせた水層を、ＣＨ２Ｃｌ２（２×５ｍＬ）で逆抽出する。合わせた有機層を、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、そして低圧下で濃縮して、乾燥させる。残渣を、ＰＴＬＣにより精製する。生成物を、ＣＨＣｌ３（５ｍＬ）に溶解し、０．２Ｍの１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウムビカルボネート緩衝液（５ｍＬ）で洗浄し、そしてＣＨＣｌ３（２×５ｍＬ）で逆抽出した。合わせた有機層を、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、そして濃縮して、乾燥させて、（ＳＰ）−１０ｕｕを得る。合成スキームをスキーム１４に示す。
スキーム１４．スキーム５（経路Ａ）におけるＲＮＡ類似体の合成
Figure 2012510460
実施例３４：経路Ａを介するＲＮＡアナログダイマー、（ＳＰ）−１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウム６−Ｎ−ベンゾイル−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）−２’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）アデノシン−３’−イル２’，３’−Ｏ−ビス（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）ウリジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＳＰ）−１０ａｕ］の合成
（ＳＰ）−１０ａｕは、８ｕの代わりに１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウム６−Ｎ−ベンゾイル−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）−２’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）アデノシン−３’−イルホスホネート（８ａ）を使用して、実施例３３に記載のように生成される。
実施例３５：経路Ａを介するＲＮＡアナログダイマー、（ＳＰ）−１，８−ジアザビシクロｔ５．４．０］ウンデカ−７−エニウム４−Ｎ−ベンゾイル−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）−２’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）シチジン−３’−イル２’，３’−Ｏ−ビス（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）ウリジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＳＰ）−１０ｃｕ］の合成
（ＳＰ）−１０ｃｕは、８ｕの代わりに１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウム４−Ｎ−ベンゾイル−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）−２’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）シチジン−３’−イルホスホネート（８ｃ）を使用して、実施例３３に記載のように生成される。
実施例３６：経路Ａを介するＲＮＡアナログダイマー、（Ｓｐ）−１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウム２−Ｎ−フェノキシアセチル−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）−２’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）グアノシン−３’−イル２，３’−Ｏ−ビス（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）ウリジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＳＰ）−１０ｇｕ］の合成
（ＳＰ）−１０ｇｕは、８ｕの代わりに１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウム２−Ｎ−フェノキシアセチル−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）−２’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）グアノシン−３’−イルホスホネート（８ｇ）を使用して、実施例３３に記載のように生成される。
実施例３７：経路Ａを介するＲＮＡアナログダイマー、（ＲＰ）−１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウム５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）−２’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）ウリジン−３’−イル２’，３’−Ｏ−ビス（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）ウリジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＲＰ）−１０ｕｕ］の合成
（ＲＰ）−１０ｕｕは、キラル試薬Ｌ−２の代わりにキラル試薬Ｄ−２を使用して、実施例３３に記載のように生成される。
実施例３８：経路Ａを介するＲＮＡアナログダイマー、（ＲＰ）−１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウム６−Ｎ−ベンゾイル−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）−２’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）アデノシン−３’−イル２’，３’−Ｏ−ビス（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）ウリジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＲＰ）−１０ａｕ］の合成
（ＲＰ）−１０ａｕは、８ｕの代わりに８ａおよびキラル試薬Ｌ−２の代わりにキラル試薬Ｄ−２を使用して、実施例３３に記載のように生成される。
実施例３９：経路Ａを介するＲＮＡアナログダイマー、（ＲＰ）−１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウム４−Ｎ−ベンゾイル−５’−０−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）−２’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）シチジン−３’−イル２’，３’−Ｏ−ビス（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）ウリジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＲＰ）−１０ｃｕ］の合成
（ＲＰ）−１０ｃｕは、８ｕの代わりに８ｃおよびキラル試薬Ｌ−２の代わりにキラル試薬Ｄ−２を使用して、実施例３３に記載のように生成される。
実施例４０：経路Ａを介するＲＮＡアナログダイマー、（ＲＰ）−１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウム２−Ｎ−フェノキシアセチル−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）−２’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）グアノシン−３’−イル２’，３’−Ｏ−ビス（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）ウリジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＲＰ）−１０ｇｕ］の合成
（ＲＰ）−１０ｇｕは、８ｕの代わりに８ｇおよびキラル試薬Ｌ−２の代わりにキラル試薬Ｄ−２を使用して、実施例３３に記載のように生成される。
実施例４１：（ＳＰ）−トリエチルアンモニウムウリジン−３’−イルウリジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＳＰ）−１１ｕｕ］を形成させるための脱保護
（ＳＰ）−１０ｕｕ（５０μｍｏｌ）を、乾燥ピリジンおよび乾燥トルエンとの反復共エバポレーションによって乾燥し、次いで、乾燥ＴＨＦ（５００μＬ）中１Ｍテトラブチルアンモニウムフロリド（ＴＢＡＦ）溶液に溶解する。混合物を、１２時間、室温で撹拌する。０．０５Ｍトリエチルアンモニウムアセテート緩衝液溶液（ｐＨ６．９、２．５ｍＬ）を混合物に添加し、そして混合物をＥｔ２Ｏ（３×３ｍＬ）で洗浄する。合わせた有機層を、０．０５Ｍトリエチルアンモニウムアセテート緩衝液（３ｍＬ）で逆抽出する。次いで、合わせた水層を、低圧下で濃縮して、乾燥させ、そして残渣を、逆相カラムクロマトグラフィー［０．１Ｍトリエチルアンモニウムアセテート緩衝液（ｐＨ６．９）中アセトニトリル０〜１０％の直線勾配］によって、精製して、（ＳＰ）−１１ｕｕを得る。脱保護スキームをスキーム１５に示す。
スキーム１５．スキーム５（経路Ａ）における脱保護
Figure 2012510460
実施例４２：（ＳＰ）−トリエチルアンモニウムアデノシン−３’−イルウリジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＳＰ）−１１ａｕ］を形成させるための脱保護
（ＳＰ）−１１ａｕは、（ＳＰ）−１０ｕｕの代わりに（ＳＰ）−１０ａｕを使用して、実施例４１に記載のように生成される。
実施例４３：（ＳＰ）−トリエチルアンモニウムシチジン−３’−イルウリジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＳＰ）−１１ｃｕ］を形成させるための脱保護
（ＳＰ）−１１ｃｕは、（ＳＰ）−１０ｕｕの代わりに（ＳＰ）−１０ｃｕを使用して、実施例４１に記載のように生成される。
実施例４４：（ＳＰ）−トリエチルアンモニウムグアノシン−３’−イルウリジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＳＰ）−１１ｇｕ］を形成させるための脱保護
（ＳＰ）−１１ｇｕは、（ＳＰ）−１０ｕｕの代わりに（ＳＰ）−１０ｇｕを使用して、実施例４１に記載のように生成される。
実施例４５：（ＲＰ）−トリエチルアンモニウムウリジン−３’−イルウリジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＲＰ）−１１ｕｕ］を形成させるための脱保護
（ＲＰ）−１１ｕｕは、（ＳＰ）−１０ｕｕの代わりに（ＲＰ）−１０ｕｕを使用して、実施例４１に記載のように生成される。
実施例４６：（ＲＰ）−トリエチルアンモニウムアデノシン−３’−イルウリジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＲＰ）−１１ａｕ］を形成させるための脱保護
（ＲＰ）−１１ａｕは、（ＳＰ）−１０ｕｕの代わりに（ＲＰ）−１０ａｕを使用して、実施例４１に記載のように生成される。
実施例４７：（ＲＰ）−トリエチルアンモニウムシチジン−３’−イルウリジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＲＰ）−１１ｃｕ］を形成させるための脱保護
（ＲＰ）−１１ｃｕは、（ＳＰ）−１０ｕｕの代わりに（ＲＰ）−１０ｃｕを使用して、実施例４１に記載のように生成される。
実施例４８：（ＲＰ）−トリエチルアンモニウムグアノシン−３’−イルウリジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＲＰ）−１１ｇｕ］を形成させるための脱保護
（ＲＰ）−１１ｇｕは、（ＳＰ）−１０ｕｕの代わりに（ＲＰ）−１０ｇｕを使用して、実施例４１に記載のように生成される。
実施例４９：経路Ｂを介するＲＮＡアナログダイマー、（ＲＰ）−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）−２’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）ウリジン−３’−イル２’，３’−Ｏ−ビス（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）ウリジン−５’−イルＨ−ホスホネート［（ＲＰ）−１２ｕｕ］の合成
８ｕ（１００μｍｏｌ）を、乾燥ピリジンとの反復共エバポレーションによって乾燥し、次いで、乾燥ピリジン（１ｍＬ）に溶解する。Ｎ，Ｎ’−ビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）ホスフィン酸クロリド（ＢｏｐＣｌ；５００μｍｏｌ）を添加し、そして混合物を、５分間、撹拌する。混合物に、乾燥ピリジンとの共エバポレーションによって乾燥し、そして乾燥ピリジン（１ｍＬ）に溶解したアミノアルコール（（αＲ、２Ｓ）−６）（１００μｍｏｌ）の溶液を、シリンジを介して滴下し、そして混合物を、５分間、アルゴン下で撹拌する。次いで、混合物を、乾燥ピリジンとの反復共エバポレーションおよびピリジンへの溶解により調製した９ｕ（１００μｍｏｌ）の溶液に、カニューレを介して添加する。１５分後、混合物を低圧下で濃縮する。残渣を、ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）で希釈し、そして飽和ＮａＨＣＯ３（３×５ｍＬ）で洗浄する。合わせた水層を、ＣＨ２Ｃｌ２（２×５ｍＬ）で逆抽出する。合わせた有機層を、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、そして低圧下で濃縮して、約１ｍＬにする。残渣を、シリンジを介して滴下で、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）中撹拌した１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）溶液に０℃で添加する。さらに５時間後、混合物を乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）で希釈し、そして飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２×１００ｍＬ）で洗浄する。合わせた水層を、ＣＨ２Ｃｌ２（２×１００ｍＬ）で逆抽出する。合わせた有機層を、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、そして低圧下で濃縮して、乾燥させ、粗（ＲＰ）−１２ｕｕを得、３１Ｐ ＮＭＲによって分析する。合成スキームをスキーム１６に示す。
スキーム１６．スキーム６（経路Ｂ）を介するＲＮＡ類似体の合成
Figure 2012510460
実施例５０：経路Ｂを介するＲＮＡアナログダイマー、（ＲＰ）−６−Ｎ−ベンゾイル−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）２’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）アデノシン−３’−イル２’，３’−Ｏ−ビス（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）ウリジン−５’−イルＨ−ホスホネート［（ＲＰ）−１２ａｕ］の合成
粗（ＲＰ）−１２ａｕは、８ｕの代わりに８ａを使用して、実施例４９に記載のように生成される。
実施例５１：経路Ｂを介するＲＮＡアナログダイマー、（ＲＰ）−４−Ｎ−ベンゾイル−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）２’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）シチジン−３’−イル２’，３’−Ｏ−ビス（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）ウリジン−５’−イルＨ−ホスホネート［（ＲＰ）１２ｃｕ］の合成
粗（ＲＰ）−１２ｃｕは、８ｕの代わりに８ｃを使用して、実施例４９に記載のように生成される。
実施例５２：経路Ｂを介するＲＮＡアナログダイマー、（ＲＰ）−２−Ｎ−フェノキシアセチル−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）−２’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）グアノシン−３’−イル２’，３’−Ｏ−ビス（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）ウリジン−５’−イルＨ−ホスホネート［（ＲＰ）−１２ｇｕ］の合成
粗（ＲＰ）−１２ｇｕは、８ｕの代わりに８ｇを使用して、実施例４９に記載のように生成される。
実施例５３：経路Ｂを介するＲＮＡアナログダイマー、（ＳＰ）−５’−０−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）−２’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）ウリジン−３’−イル２’，３’−Ｏ−ビス（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）ウリジン−５’−イルＨ−ホスホネート［（ＳＰ）−１２ｕｕ］の合成
粗（ＳＰ）−１２ｕｕは、キラル試薬（αＲ、２Ｓ）−６の代わりにキラル試薬（αＳ、２Ｒ）−６を使用して、実施例４９に記載のように生成される。
実施例５４：経路Ｂを介するＲＮＡアナログダイマー、（Ｓｐ）−６−Ｎ−ベンゾイル−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）２’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）アデノシン−３’−イル２’，３’−Ｏ−ビス（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）ウリジン−５’−イルＨ−ホスホネート［（ＳＰ）−１２ａｕ］の合成
粗（ＳＰ）−１２ａｕは、８ｕの代わりに８ａおよびキラル試薬（αＲ、２Ｓ）−６の代わりにキラル試薬（αＳ、２Ｒ）−６を使用して、実施例４９に記載のように生成される。
実施例５５：経路Ｂを介するＲＮＡアナログダイマー、（ＳＰ）−４−Ｎ−ベンゾイル−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）−２’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）シチジン−３’−イル２’，３’−Ｏ−ビス（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）ウリジン−５’−イルＨ−ホスホネート［（ＳＰ）１２ｃｕ］の合成
粗（ＳＰ）−１２ｃｕは、８ｕの代わりに８ｃおよびキラル試薬（αＲ、２Ｓ）−６の代わりにキラル試薬（αＳ、２Ｒ）−６を使用して、実施例４９に記載のように生成される。
実施例５６：経路Ｂを介するＲＮＡアナログダイマー、（ＳＰ）−２−Ｎ−フェノキシアセチル−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）−２’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）グアノシン−３’−イル２’，３’−Ｏ−ビス（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）ウリジン−５’−イルＨ−ホスホネート［（ＳＰ）−１２ｇｕ］の合成
粗（ＳＰ）−１２ｇｕは、８ｕの代わりに８ｇおよびキラル試薬（αＲ、２Ｓ）−６の代わりにキラル試薬（αＳ、２Ｒ）−６を使用して、実施例４９に記載のように生成される。
実施例５７：（ＲＰ）−トリエチルアンモニウムウリジン−３’−イルウリジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＲＰ）−１１ｕｕ］を形成させるための修飾
（ＳＰ）−１２ｕｕを、乾燥ピリジンおよび乾燥トルエンとの反復共エバポレーションによって乾燥し、次いで、ＣＨ３ＣＮ（１ｍＬ）に溶解する。Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（ＢＳＡ；１００μＬ）を添加する。１分後、Ｎ，Ｎ’−ジメチルチウラムジスルフィド（ＤＴＤ；１２０μｍｏｌ）を添加する。さらに３分間後、混合物を、低圧下で濃縮して、乾燥させ、粗（ＲＰ）−１０ｕｕを得る。次いで、粗（ＲＰ）−１０ｕｕを、乾燥ＴＨＦ（１ｍＬ）中１Ｍテトラブチルアンモニウムフロリド（ＴＢＡＦ）溶液に溶解する。混合物を、１２時間、室温で撹拌する。０．０５Ｍトリエチルアンモニウムアセテート緩衝液溶液（ｐＨ６．９、５ｍＬ）を混合物に添加し、そして混合物をＥｔ２Ｏ（３×５ｍＬ）で洗浄する。合わせた有機層を、０．０５Ｍトリエチルアンモニウムアセテート緩衝液（５ｍＬ）で逆抽出する。次いで、合わせた水層を、低圧下で濃縮して、乾燥させ、そして残渣を、逆相カラムクロマトグラフィー［０．１Ｍトリエチルアンモニウムアセテート緩衝液（ｐＨ６．９）中アセトニトリル０〜１０％の直線勾配］によって、精製して、（ＲＰ）−１１ｕｕを得る。修飾スキームをスキーム１７に示す。
スキーム１７．キラルホスホロチオエートの合成
Figure 2012510460
実施例５８：（ＲＰ）−トリエチルアンモニウムアデノシン−３’−イルウリジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＲＰ）−１１ａｕ］を形成させるための修飾
（ＲＰ）−１１ａｕは、（ＳＰ）−１２ｕｕの代わりに（ＳＰ）−１２ａｕを使用して、実施例５７に記載のように生成される。
実施例５９：（ＲＰ）−トリエチルアンモニウムシチジン−３’−イルウリジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＲＰ）−１１ｃｕ］を形成させるための修飾
（ＲＰ）−１１ｃｕは、（ＲＰ）−１２ｕｕの代わりに（ＲＰ）−１２ｃｕを使用して、実施例５７に記載のように生成される。
実施例６０：（ＲＰ）−トリエチルアンモニウムグアノシン−３’−イルウリジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＲＰ）−１１ｇｕ］を形成させるための修飾
（ＲＰ）−１１ｇｕは、（ＳＰ）−１２ｕｕの代わりに（ＳＰ）−１２ｇｕを使用して、実施例５７に記載のように生成される。
実施例６１：（ＳＰ）−トリエチルアンモニウムウリジン−３’−イルウリジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＳＰ）−１１ｕｕ］を形成させるための修飾
（ＳＰ）−１１ｕｕは、（ＳＰ）−１２ｕｕの代わりに（ＲＰ）−１２ｕｕを使用して、実施例５７に記載のように生成される。
実施例６２：（ＳＰ）−トリエチルアンモニウムアデノシン−３’−イルウリジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＳＰ）−１１ａｕ］を形成させるための修飾
（ＳＰ）−１１ａｕは、（ＳＰ）−１２ｕｕの代わりに（ＲＰ）−１２ａｕを使用して、実施例５７に記載のように生成される。
実施例６３：（Ｓｐ）−トリエチルアンモニウムシチジン−３’−イルウリジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＳＰ）−１１ｃｕ］を形成させるための修飾
（ＳＰ）−１１ｃｕは、（ＳＰ）−１２ｕｕの代わりに（ＲＰ）−１２ｃｕを使用して、実施例５７に記載のように生成される。
実施例６４：（Ｓｐ）−トリエチルアンモニウムグアノシン−３’−イルウリジン−５’−イルホスホロチオエート［（Ｓｐ）−１１ｇｕ］を形成させるための修飾
（ＲＰ）−１１ｇｕは、（ＲＰ）−１１ｕｕと同様の様式で、（ＳＰ）−１２ｕｕの代わりに（ＲＰ）−１２ｇｕを使用して、実施例５７に記載のように生成される。
実施例６５：スキーム５（経路Ａ）を介するＸ−ホスホネート部分を有するＤＮＡ類似体の固相合成
スクシニルリンカーを介した５’−Ｏ−（ＤＭＴｒ）チミジン−負荷ＨＣＰまたはＣＰＧ樹脂（０．５μｍｏｌ）を、合成に使用する。鎖伸長を、表１工程を反復することによって実施する。鎖伸長後、５’−Ｏ−ＤＭＴｒ基を、ＣＨ２Ｃｌ２中３％ＤＣＡによる処理（３×５秒間）によって除去し、そしてＣＨ２Ｃｌ２で洗浄する。次いで、ＨＣＰまたはＣＰＧ樹脂上のオリゴマーを、２５％ＮＨ３−ピリジン（９：１、ｖ／ｖ）で、１５時間、５５℃で処理して、キラル補助基および核酸塩基の保護基を除去し、そしてまた、ＨＣＰまたはＣＰＧ樹脂からオリゴマーを遊離させる。ＨＣＰまたはＣＰＧ樹脂を、濾過によって除去し、そしてＨ２Ｏで洗浄する。濾過物を濃縮して、乾燥させる。残渣をＨ２Ｏに溶解し、Ｅｔ２Ｏで洗浄し、そして合わせた洗浄物を、Ｈ２Ｏで逆抽出する。合わせた水層を濃縮して、乾燥させる。得られる粗生成物を、逆相ＨＰＬＣによって、０．１Ｍアンモニウムアセテート緩衝液（ｐＨ７．０）中０〜２０％アセトニトリルの直線勾配で、６０分間、５０℃、０．５ｍｌ／分の速度で分析および／または精製して、立体規則性（stereoregular）Ｘ−ホスホネートＤＮＡを得る。
Figure 2012510460
＊表１の工程３におけるプレ活性化モノマーの調製：１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウム５’−Ｏ−（ＤＭＴｒ）−２’−デオキシリボヌクレオシド−３’−イルホスホネートを、乾燥ピリジンとの反復共エバポレーションによって乾燥し、次いで、乾燥ピリジンに溶解する。ＢｏｐＣｌを溶液に添加し、そして混合物を、５分間、撹拌する。混合物に、乾燥ピリジンとの反復共エバポレーションによって乾燥し、そして乾燥ピリジンに溶解したアミノアルコール（Ｌ−２またはＤ−２）の溶液を、シリンジを介して滴下し、そして混合物を、５分間、アルゴン下で撹拌する。
Ａｌｌ−（ＲＰ）−［ＴＰＳ］９Ｔ（ホスホロチオエート）
上記の典型的な手順に従って、ＲＰ−ＨＰＬＣによる粗生成物の１０分の１の精製後、ＨＣＰに結合した５’−Ｏ−（ＤＭＴｒ）チミジン３’−Ｏ−スクシネート（０．５μｍｏｌ）により、ａｌｌ−（ＲＰ）−［ＴＰＳ］９Ｔ［７％淡色効果の仮定に基づき１．５２Ａ２６０単位、１７．７ｎｍｏｌ（３５％）：ＵＶ（Ｈ２Ｏ）αｍａｘ２６７ｎｍ、αｍｉｎ２３６ｎｍ］が得られる。精製されたオリゴマーの＜４％が、３７℃で１時間のヌクレアーゼＰＩとのインキュベーションにより消化される。
実施例６６：スキーム６（経路Ｂ）を介するＸ−ホスホネート部分を有するＤＮＡ類似体の固相合成
５’−Ｏ−ＤＭＴｒ基の除去のために、スクシニルまたはオキサリルリンカーを介した５’−Ｏ−（ＤＭＴｒ）チミジン−負荷ＣＰＧ樹脂を、ＣＨ２Ｃｌ２中１％ＴＦＡで処理（３×５秒間）し、ＣＨ２Ｃ１２および乾燥ピリジンで洗浄し、そして減圧下で乾燥する。鎖伸長を、以下の工程（ａ）および（ｂ）を反復することによって実施する。（ａ）乾燥ピリジン中対応するプレ活性化モノマー＊（０．２Ｍ）を含有する溶液を使用するアルゴン下でのカップリング反応（１０分間）。縮合後、固相支持体を、乾燥ピリジンおよびＣＨ２Ｃ１２で洗浄する。（ｂ）ＣＨ２Ｃｌ２−Ｅｔ３ＳｉＨ（１：１、ｖ／ｖ）中１％ＴＦＡによる処理（３×５秒間）、ならびにその後のＣＨ２Ｃ１２および乾燥ピリジンによる洗浄による５’−Ｏ−ＤＭＴｒ基およびキラル補助基の同時の除去。樹脂上の得られるオリゴヌクレオシドＨ−ホスホネートを、以下に記載のように、Ｘ−ホスホネートＤＮＡに変換する。
＊プレ活性化モノマーの調製：１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウム５’−Ｏ−（ＤＭＴｒ）−２’−デオキシリボヌクレオシド−３’−イルホスホネートを、乾燥ピリジンとの反復共エバポレーションによって乾燥し、次いで、乾燥ピリジンに溶解する。ＢｏｐＣｌを溶液に添加し、そして混合物を、５分間、撹拌する。混合物に、乾燥ピリジンとの反復共エバポレーションによって乾燥し、そして乾燥ピリジンに溶解したアミノアルコール（Ｌ−６またはＤ−６）の溶液を、シリンジを介して滴下し、そして混合物を、５分間、アルゴン下で撹拌する。
ホスホロチオエート（Ｘ＝Ｓ−）
上記のように得られるスクシニルリンカーを介したＣＰＧ樹脂に負荷されたオリゴヌクレオシドＨ−ホスホネートを、ＣＳ２−ピリジン−トリエチルアミン（３５：３５：１、ｖ／ｖ／ｖ）中１０ｗｔ％Ｓ８により、ＲＴで３時間、処理し、そして連続して、ＣＳ２、ピリジン、およびＣＨ３ＣＮで洗浄する。樹脂を、２５％ＮＨ３水溶液により、ＲＴで１２時間処理し、そしてＨ２Ｏで洗浄する。水溶液を合わせ、そして低圧下で濃縮して、乾燥させ、そして樹脂を、ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製して、立体選択的ホスホロチオエートＤＮＡが得られる。
ボラノホスフェート（Ｘ＝ＢＨ３ −）
乾燥ＤＭＦ、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（ＢＳＡ）、およびＢＨ３・ＳＭｅ２を、上記のように得られるオキサリルリンカーを介してＣＰＧ樹脂に負荷されたオリゴヌクレオシドＨ−ホスホネートにＲＴで添加する。１５分後、樹脂を、連続的にＤＭＦ、ＣＨ３ＣＮ、およびＣＨ３ＯＨで洗浄する。次いで、樹脂を、ＣＨ３ＯＨ中飽和ＮＨ３溶液により、ＲＴで１２時間処理し、そしてＣＨ３ＯＨで洗浄する。ＣＨ３ＯＨ溶液を合わせ、そして低圧下で濃縮して、乾燥させ、そして樹脂を、ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製して、立体選択的ボラノホスフェートＤＮＡが得られる。
ヒドロキシメチルホスホネート（Ｘ＝ＣＨ２ＯＨ）
上記のように得られるオキサリルリンカーを介してＣＰＧ樹脂に負荷されたオリゴヌクレオシドＨ−ホスホネートを、ピリジン−１−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）（１：９、ｖ／ｖ）中０．１Ｍトリメチルシリルクロリド（ＴＭＳＣｌ）により、ＲＴで１０分間、そして気体ホルムアルデヒドにより、ＲＴで３０分間、処理し、次いで、ＮＭＰ、およびＣＨ３ＣＮで洗浄する。次いで、樹脂を、２５％ＮＨ３水溶液により、ＲＴで１２時間処理し、そしてＨ２Ｏで洗浄する。合わせた水溶液を、低圧下で濃縮して、乾燥させ、そして樹脂を、ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製して、立体選択的ヒドロキシメチルホスホネートＤＮＡが得られる。
ホスホロアミダート（Ｘ＝ＮＨ２）
上記のように得られるオキサリルリンカーを介してＣＰＧ樹脂に負荷されたオリゴヌクレオシドＨ−ホスホネートを、ＣＣｌ４−１，４−ジオキサン（４：１、ｖ／ｖ）中飽和ＮＨ３溶液により、０℃で３０分間、処理し、そして１，４−ジオキサンで洗浄する。合わせた有機溶液を、低圧下で濃縮して、乾燥させ、２５％ＮＨ３水溶液により、ＲＴで１２時間処理し、そしてＨ２Ｏで洗浄する。合わせた水溶液を、低圧下で濃縮して、乾燥させ、そして樹脂を、ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製して、立体選択的ホスホロアミダートＤＮＡが得られる。
Ｎ−プロピルホスホロアミダート（Ｘ＝ＮＨＰｒ）
上記のように得られるオキサリルリンカーを介してＣＰＧ樹脂に負荷されたオリゴヌクレオシドＨ−ホスホネートを、ＣＣｌ４−プロピルアミン（９：１、ｖ／ｖ）により、ＲＴで１時間、処理し、そしてＣＨ３ＯＨで洗浄する。合わせた有機溶液を、低圧下で濃縮して、乾燥させ、２５％ＮＨ３水溶液により、ＲＴで１２時間処理し、そしてＨ２Ｏで洗浄する。合わせた水溶液を、低圧下で濃縮して、乾燥させ、そして樹脂を、ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製して、立体選択的Ｎ−プロピルホスホロアミダートＤＮＡが得られる。
Ｎ−［（２−ジメチルアミノ）エチル］ホスホロアミダート［Ｘ＝ＮＨ（ＣＨ２）２ＮＭｅ２］
上記のように得られるオキサリルリンカーを介してＣＰＧ樹脂に負荷されたオリゴヌクレオシドＨ−ホスホネートを、ＣＣｌ４−２−ジメチルアミノエチルアミン（９：１、ｖ／ｖ）により、ＲＴで１時間、処理し、そしてＣＨ３ＣＮで洗浄する。合わせた有機溶液を、低圧下で濃縮して、乾燥させ、２５％ＮＨ３水溶液により、ＲＴで１２時間処理し、そしてＨ２Ｏで洗浄する。合わせた水溶液を、低圧下で濃縮して、乾燥させ、そして樹脂を、ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製して、立体選択的Ｎ−［（２−ジメチルアミノ）エチル］ホスホロアミダートＤＮＡが得られる。
実施例６７：ａｌｌ−（ＳＰ）−ｄ［ＣＳＡＳＧＳＴ］（ホスホロチオエート）の合成
対応するオリゴヌクレオシドＨ−ホスホネートを、スクシニルリンカーを介してＣＰＧ樹脂上で上記のように合成し、そしてＢＳＡ−ＣＨ３ＣＮ（１：８、ｖ／ｖ）中ビューケージ試薬の０．２Ｍ溶液によりＲＴで３０分間、処理し、そして樹脂をＣＨ３ＣＮで洗浄する。次いで、樹脂を、２５％ＮＨ３水溶液により、ＲＴで１２時間処理し、そしてＨ２Ｏで洗浄する。合わせた水溶液を、低圧下で濃縮して、乾燥させ、そして樹脂を、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより、分析および特徴付けする。ＲＰ−ＨＰＬＣを、μＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ５μｍＣ１８カラム（１００Å、３．９ｍｍ×１５０ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ）を使用して、０．１Ｍアンモニウムアセテート緩衝液（ｐＨ７．０）中０〜２０％アセトニトリルの直線勾配で、６０分間、５０℃で、０．５ｍＬ／分の流速で実施する。
実施例６８：ａｌｌ−（ＲＰ）−ｄ［ＣＳＡＳＧＳＴ］（ホスホロチオエート）の合成
対応するオリゴヌクレオシドＨ−ホスホネートを、スクシニルリンカーを介してＣＰＧ樹脂上で上記のように合成し、そしてＢＳＡ−ＣＨ３ＣＮ（１：８、ｖ／ｖ）（０．２ｍＬ）中ビューケージ試薬の０．２Ｍ溶液によりＲＴで３０分間、処理し、そして樹脂をＣＨ３ＣＮで洗浄する。樹脂を、２５％ＮＨ３水溶液により、ＲＴで１２時間処理し、そしてＨ２Ｏで洗浄する。合わせた水溶液を、低圧下で濃縮して、乾燥させ、そして樹脂を、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより、分析および特徴付けする。ＲＰ−ＨＰＬＣを、μＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ５μｍＣ１８カラム（１００Å、３．９ｍｍ×１５０ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ）を使用して、０．１Ｍアンモニウムアセテート緩衝液（ｐＨ７．０）中０〜２０％アセトニトリルの直線勾配で、６０分間、５０℃で、０．５ｍＬ／分の流速で実施する。
実施例６９：ａｌｌ−（ＳＰ）−［ＴＳ］９Ｔ（ホスホロチオエート）の合成
対応するオリゴヌクレオシドＨ−ホスホネートを、スクシニルリンカーを介してＣＰＧ樹脂上で上記のように合成し、そしてＢＳＡ−ＣＨ３ＣＮ（１：８、ｖ／ｖ）（０．２ｍＬ）中ビューケージ試薬の０．２Ｍ溶液によりＲＴで３０分間、処理し、そして樹脂をＣＨ３ＣＮで洗浄する。ＣＰＧ樹脂を、２５％ＮＨ３水溶液（５ｍＬ）により、ＲＴで２４時間処理し、そしてＨ２Ｏで洗浄する。合わせた水溶液を、低圧下で濃縮して、乾燥させ、そして樹脂を、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより、分析および特徴付けする。ＲＰ−ＨＰＬＣを、μＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ５μｍＣ１８カラム（１００Å、３．９ｍｍ×１５０ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ）を使用して、０．１Ｍアンモニウムアセテート緩衝液（ｐＨ７．０）中０〜２０％アセトニトリルの直線勾配で、８０分間、３０℃で、０．５ｍＬ／分の流速で実施する。
実施例７０：ａｌｌ（ＲＰ）−［ＴＳ］９Ｔ（ホスホロチオエート）の合成
対応するオリゴヌクレオシドＨ−ホスホネートを、スクシニルリンカーを介してＣＰＧ樹脂上で上記のように合成し、そしてＢＳＡ−ＣＨ３ＣＮ（１：８、ｖ／ｖ）（０．２ｍＬ）中ビューケージ試薬の０．２Ｍ溶液によりＲＴで３０分間、処理し、そして樹脂をＣＨ３ＣＮで洗浄する。樹脂を、２５％ＮＨ３水溶液（５ｍＬ）により、ＲＴで２４時間処理し、そしてＨ２Ｏで洗浄する。合わせた水溶液を、低圧下で濃縮して、乾燥させ、そして樹脂を、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより、分析および特徴付けする。ＲＰ−ＨＰＬＣを、μＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ５μｍＣ１８カラム（１００Å、３．９ｍｍ×１５０ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ）を使用して、０．１Ｍアンモニウムアセテート緩衝液（ｐＨ７．０）中０〜２０％アセトニトリルの直線勾配で、８０分間、３０℃で、０．５ｍＬ／分の流速で実施する。
実施例７１：ａｌ（ＲＰ）−［ＴＢ］３Ｔ（ボラノホスフェート）の合成
対応するオリゴヌクレオシドＨ−ホスホネートを、スクシニルリンカーを介してＣＰＧ樹脂上で上記のように合成し、そして乾燥ＤＭＦ（０．８ｍＬ）、ＢＳＡ（０．１ｍＬ）およびＢＨ３・Ｓ（ＣＨ３）２（０．１ｍＬ）の混合物によりＲＴで１５分間、処理し、そして樹脂を、連続的に、ＤＭＦ、ＣＨ３ＣＮ、およびＣＨ３ＯＨで洗浄する。次いで、樹脂を、ＣＨ３ＯＨ（５ｍＬ）中ＮＨ３の飽和溶液により、ＲＴで２時間処理し、そしてＣＨ３ＯＨで洗浄する。合わせた有機溶液を、低圧下で濃縮して、乾燥させ、そして樹脂を、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより、分析および特徴付けする。ＲＰ−ＨＰＬＣを、ＰＥＧＡＳＩＬ ＯＤＳ５μｍ（１２０Å、４．０ｍｍ×１５０ｍｍ）（Ｓｅｎｓｈｕ Ｐａｋ）を使用して、０．１Ｍアンモニウムアセテート緩衝液（ｐＨ７．０）中０〜２０％アセトニトリルの直線勾配で、６０分間、３０℃で、０．５ｍＬ／分の流速で実施する。
実施例７２：ａｌｌ−（Ｓｐ）−［ＴＢ］３Ｔ（ボラノホスフェート）の合成
対応するオリゴヌクレオシドＨ−ホスホネートを、スクシニルリンカーを介してＣＰＧ樹脂上で上記のように合成し、そして乾燥ＤＭＦ（０．８ｍＬ）、ＢＳＡ（１ｍＬ）およびＢＨ３・Ｓ（ＣＨ３）２（０．１ｍＬ）の混合物によりＲＴで１５分間、処理し、そして樹脂を、連続的に、ＤＭＦ、ＣＨ３ＣＮ、およびＣＨ３ＯＨで洗浄する。次いで、樹脂を、ＣＨ３ＯＨ（５ｍＬ）中ＮＨ３の飽和溶液により、ＲＴで２時間処理し、そしてＣＨ３ＯＨで洗浄する。合わせた有機溶液を、低圧下で濃縮して、乾燥させ、そして樹脂を、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより、分析および特徴付けする。ＲＰ−ＨＰＬＣを、ＰＥＧＡＳＩＬ ＯＤＳ５μｍ（１２０Å、４．０ｍｍ×１５０ｍｍ）（Ｓｅｎｓｈｕ Ｐａｋ）を使用して、０．１Ｍアンモニウムアセテート緩衝液（ｐＨ７．０）中０〜２０％アセトニトリルの直線勾配で、６０分間、３０℃で、０．５ｍＬ／分の流速で実施する。
実施例７３：ａｌｌ−（ＳＰ）−［ＴＮ］３Ｔ（Ｎ−［（２−ジメチルアミノ）エチル］ホスホロアミダート）の合成
対応するオリゴヌクレオシドＨ−ホスホネートを、オキサリルリンカーを介してＣＰＧ樹脂上で上記のように合成し、そしてＣＣｌ４−２−ジメチルアミノエチルアミン（９：１、ｖ／ｖ）により、ＲＴで１時間、処理し、そしてＣＨ３ＣＮで洗浄する。合わせた有機溶液を、低圧下で濃縮して、乾燥させ、そして樹脂を、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより、分析および特徴付けする。ＲＰ−ＨＰＬＣを、ＰＥＧＡＳＩＬ ＯＤＳ５μｍ（１２０Å、４．０ｍｍ×１５０ｍｍ）（Ｓｅｎｓｈｕ Ｐａｋ）を使用して、０．１Ｍトリエチルアンモニウムアセテート緩衝液（ｐＨ７．０）中０〜２０％アセトニトリルの直線勾配で、６０分間、３０℃で、０．５ｍＬ／分の流速で実施する。
実施例７４：ａｌｌ−（ＲＰ）−［ＴＮ］３Ｔ（Ｎ−［（２−ジメチルアミノ）エチル］ホスホロアミダート）の合成
対応するオリゴヌクレオシドＨ−ホスホネートを、オキサリルリンカーを介してＣＰＧ樹脂上で上記のように合成し、そしてＣＣｌ４−２−ジメチルアミノエチルアミン（９：１、ｖ／ｖ）により、ＲＴで１時間、処理し、そしてＣＨ３ＣＮで洗浄する。合わせた有機溶液を、低圧下で濃縮して、乾燥させ、そして樹脂を、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより、分析および特徴付けする。ＲＰ−ＨＰＬＣを、ＰＥＧＡＳＩＬ ＯＤＳ５μｍ（１２０Å、４．０ｍｍ×１５０ｍｍ）（Ｓｅｎｓｈｕ Ｐａｋ）を使用して、０．１Ｍトリエチルアンモニウムアセテート緩衝液（ｐＨ７．０）中０〜２０％アセトニトリルの直線勾配で、６０分間、３０℃で、０．５ｍＬ／分の流速で実施する。
実施例７５：スキーム５（経路Ａ）を介するＸ−ホスホネートＲＮＡの固相合成の一般的手順
スクシニルリンカーを介した５’−Ｏ−（ＤＭＴｒ）ウリジン−負荷ＨＣＰまたはＣＰＧ樹脂を、合成に使用する。鎖伸長を、表２工程を反復することによって実施する。鎖伸長後、５’−Ｏ−ＤＭＴｒ基を、ＣＨ２Ｃｌ２中３％ＤＣＡによる処理によって除去し、そしてＣＨ２Ｃｌ２およびＥｔＯＨで洗浄する。次いで、樹脂を、２５％ＮＨ３水溶液−ＥｔＯＨ（３：１、ｖ／ｖ）により２時間、室温で処理し、そして濾過により取り出す。濾過物を、２５％ＮＨ３水溶液−ＥｔＯＨ（３：１、ｖ／ｖ）で希釈し、そして密閉したフラスコ中で、４８時間、室温で置く。溶液を低圧下で濃縮し、そして残渣をＲＰ−ＨＰＬＣにより精製する。所望の２’−Ｏ−ＴＢＳ−保護Ｘ−ホスホネートＲＮＡを含有する画分を、回収し、そして凍結乾燥する。残渣を、乾燥ＴＨＦ中１ＭのＴＢＡＦ溶液により２４時間、室温で処理する。０．０５ＭのＴＥＡＡ緩衝溶液（ｐＨ６．９）を添加し、そしてＴＨＦを、エバポレーションによって除去する。残渣を、Ｓｅｐ−ｐａｋＣ１８カートリッジで脱塩し、そしてＲＰ−ＨＰＬＣによって精製し、立体規則性ＸホスホネートＲＮＡを得る。
Figure 2012510460
＊表２の工程３におけるプレ活性化モノマーの調製：１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウム５’−Ｏ−（ＤＭＴｒ）−２’−Ｏ−（ＴＢＳ）−リボヌクレオシド−３’−イルホスホネートを、乾燥ピリジンとの反復共エバポレーションによって乾燥し、次いで、乾燥ピリジンに溶解する。ＢｏｐＣｌを溶液に添加し、そして混合物を、５分間、撹拌する。混合物に、乾燥ピリジンとの反復共エバポレーションであり、そして乾燥ピリジンに溶解したアミノアルコール（Ｌ−２またはＤ−２）の溶液を、シリンジを介して滴下で添加し、そして混合物を、５分間、アルゴン下で撹拌する。
実施例７６：スキーム６（経路Ｂ）を介するＸ−ホスホネートＲＮＡの固相合成の一般的手順
合成Ｈ−ホスホネートＲＮＡを合成するための手順。５’−Ｏ−ＤＭＴｒ基の除去のために、スクシニルまたはオキサリルリンカーを介した５’−Ｏ−（ＤＭＴｒ）ウリジン−負荷ＣＰＧ樹脂を、ＣＨ２Ｃｌ２中１％ＴＦＡで処理（３×５秒間）し、ＣＨ２Ｃｌ２および乾燥ピリジンで洗浄し、そして減圧下で乾燥する。鎖伸長を、以下の工程（ａ）および（ｂ）を反復することによって実施する。（ａ）乾燥ピリジン中対応するプレ活性化モノマー＊（０．２Ｍ）を含有する溶液を使用するアルゴン下でのカップリング反応（１０分間）。縮合後、固相支持体を、乾燥ピリジンおよびＣＨ２Ｃｌ２で洗浄する。（ｂ）ＣＨ２Ｃｌ２−Ｅｔ３ＳｉＨ（１：１、ｖ／ｖ）中１％ＴＦＡによる処理（３×５秒間）、およびその後のＣＨ２Ｃｌ２および乾燥ピリジンによる洗浄による５’−Ｏ−ＤＭＴｒ基およびキラル補助基の同時の除去。樹脂上の得られるオリゴヌクレオシドＨ−ホスホネートを、以下に記載のように、骨格修飾ＲＮＡ類似体に変換する。
＊プレ活性化モノマーの調製：
１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウム５’−Ｏ−（ＤＭＴｒ）−２’−Ｏ−（ＴＢＳ）−リボヌクレオシド−３’−イルホスホネートを、乾燥ピリジンとの反復共エバポレーションによって乾燥し、次いで、乾燥ピリジンに溶解する。ＢｏｐＣｌを溶液に添加し、そして混合物を、５分間、撹拌する。混合物に、乾燥ピリジンとの反復共エバポレーションによって乾燥し、そして乾燥ピリジンに溶解したアミノアルコール（Ｌ−６またはＤ−６）の溶液を、シリンジを介して滴下し、そして混合物を、５分間、アルゴン下で撹拌する。
ホスホロチオエート（Ｘ＝Ｓ−）
上記のように得られるスクシニルリンカーを介してＣＰＧ樹脂に負荷されたオリゴヌクレオシドＨ−ホスホネートを、ＣＳ２−ピリジン−トリエチルアミン（３５：３５：１、ｖ／ｖ／ｖ）中１０ｗｔ％Ｓ８により、ＲＴで３時間、処理し、そして連続して、ＣＳ２、ピリジン、およびＥｔＯＨで洗浄する。次いで、樹脂を、２５％ＮＨ３水溶液−ＥｔＯＨ（３：１、ｖ／ｖ）により２時間、室温で処理し、そして濾過により取り出す。濾過物を、２５％ＮＨ３水溶液−ＥｔＯＨ（３：１、ｖ／ｖ）で希釈し、そして密閉したフラスコ中で、１２時間、室温で置く。溶液を低圧下で濃縮し、そして残渣をＲＰ−ＨＰＬＣにより精製する。所望の２’−Ｏ−ＴＢＳ−保護ホスホロチオエートＲＮＡを含有する画分を、回収し、そして凍結乾燥する。残渣を、乾燥ＴＨＦ中１ＭのＴＢＡＦ溶液により２４時間、室温で処理する。０．０５ＭのＴＥＡＡ緩衝溶液（ｐＨ６．９）を添加し、そしてＴＨＦを、エバポレーションによって除去する。残渣を、Ｓｅｐ−ｐａｋＣ１８カートリッジで脱塩し、そしてＲＰ−ＨＰＬＣによって精製し、立体規則性ホスホロチオエートＲＮＡを得る。
ボラノホスフェート（Ｘ＝ＢＨ３ −）
乾燥ＤＭＦ、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（ＢＳＡ）、およびＢＨ３・ＳＭｅ２を、上記のように得られるオキサリルリンカーを介してＣＰＧ樹脂に負荷されたオリゴヌクレオシドＨ−ホスホネートにＲＴで添加する。１５分後、樹脂を、連続的にＤＭＦ、ＣＨ３ＣＮ、およびＥｔＯＨで洗浄する。次いで、樹脂を、２５％ＮＨ３水溶液−ＥｔＯＨ（３：１、ｖ／ｖ）により２時間、室温で処理し、そして濾過により取り出す。濾過物を、２５％ＮＨ３水溶液−ＥｔＯＨ（３：１、ｖ／ｖ）で希釈し、そして密閉したフラスコ中で、１２時間、室温で置く。溶液を低圧下で濃縮し、そして残渣をＲＰ−ＨＰＬＣにより精製する。所望の２’−Ｏ−ＴＢＳ−保護ボラノホスフェートＲＮＡを含有する画分を、回収し、そして凍結乾燥する。残渣を、乾燥ＴＨＦ中１ＭのＴＢＡＦ溶液により２４時間、室温で処理する。０．０５ＭのＴＥＡＡ緩衝溶液（ｐＨ６．９）を添加し、そしてＴＨＦを、エバポレーションによって除去する。残渣を、Ｓｅｐ−ｐａｋＣ１８カートリッジで脱塩し、そしてＲＰ−ＨＰＬＣによって精製し、立体規則性ボラノホスフェートＲＮＡを得る。
ヒドロキシメチルホスホネート（Ｘ＝ＣＨ２ＯＨ）
上記のように得られるオキサリルリンカーを介してＣＰＧ樹脂に負荷されたオリゴヌクレオシドＨ−ホスホネートを、ピリジン−１−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）（１：９、ｖ／ｖ）中０．１Ｍトリメチルシリルクロリド（ＴＭＳＣｌ）により、ＲＴで１０分間、そして気体ホルムアルデヒドにより、ＲＴで３０分間、処理し、次いで、ＮＭＰ、およびＥｔＯＨで洗浄する。次いで、樹脂を、２５％ＮＨ３水溶液−ＥｔＯＨ（３：１、ｖ／ｖ）により２時間、室温で処理し、そして濾過により取り出す。濾過物を、２５％ＮＨ３水溶液−ＥｔＯＨ（３：１、ｖ／ｖ）で希釈し、そして密閉したフラスコ中で、１２時間、室温で置く。溶液を低圧下で濃縮し、そして残渣をＲＰ−ＨＰＬＣにより精製する。所望の２’−Ｏ−ＴＢＳ−保護ヒドロキシメチルホスホネートＲＮＡを含有する画分を、回収し、そして凍結乾燥する。残渣を、乾燥ＴＨＦ中１ＭのＴＢＡＦ溶液により２４時間、室温で処理する。０．０５ＭのＴＥＡＡ緩衝溶液（ｐＨ６．９）を添加し、そしてＴＨＦを、エバポレーションによって除去する。残渣を、Ｓｅｐ−ｐａｋＣ１８カートリッジで脱塩し、そしてＲＰ−ＨＰＬＣによって精製し、立体規則性ヒドロキシメチルホスホネートＲＮＡを得る。
ホスホロアミダート（Ｘ＝ＮＨ２）
上記のように得られるオキサリルリンカーを介してＣＰＧ樹脂に負荷されたオリゴヌクレオシドＨ−ホスホネートを、ＣＣｌ４−１，４−ジオキサン（４：１、ｖ／ｖ）中飽和ＮＨ３溶液により、０℃で３０分間、処理し、そして１，４−ジオキサンで洗浄する。合わせた有機溶液を、低圧下で濃縮して、乾燥させる。濾過物を、２５％ＮＨ３水溶液−ＥｔＯＨ（３：１、ｖ／ｖ）で希釈し、そして密閉したフラスコ中で、１２時間、室温で置く。溶液を低圧下で濃縮し、そして残渣をＲＰ−ＨＰＬＣにより精製する。所望の２’−Ｏ−ＴＢＳ−保護ホスホロアミダートＲＮＡを含有する画分を、回収し、そして凍結乾燥する。残渣を、乾燥ＴＨＦ中１ＭのＴＢＡＦ溶液により２４時間、室温で処理する。０．０５ＭのＴＥＡＡ緩衝溶液（ｐＨ６．９）を添加し、そしてＴＨＦを、エバポレーションによって除去する。残渣を、Ｓｅｐ−ｐａｋＣ１８カートリッジで脱塩し、そしてＲＰ−ＨＰＬＣによって精製し、立体規則性ホスホロアミダートＲＮＡを得る。
Ｎ−プロピルホスホロアミダート（Ｘ＝ＮＨＰｒ）
上記のように得られるオキサリルリンカーを介してＣＰＧ樹脂に負荷されたオリゴヌクレオシドＨ−ホスホネートを、ＣＣｌ４−プロピルアミン（９：１、ｖ／ｖ）により、ＲＴで１時間、処理し、そしてＣＨ３ＯＨで洗浄する。合わせた有機溶液を、低圧下で濃縮して、乾燥させる。濾過物を、２５％ＮＨ３水溶液−ＥｔＯＨ（３：１、ｖ／ｖ）で希釈し、そして密閉したフラスコ中で、１２時間、室温で置く。溶液を低圧下で濃縮し、そして残渣をＲＰ−ＨＰＬＣにより精製する。所望の２’−Ｏ−ＴＢＳ−保護Ｎ−プロピルホスホロアミダートＲＮＡを含有する画分を回収し、そして凍結乾燥する。残渣を、乾燥ＴＨＦ中１ＭのＴＢＡＦ溶液により２４時間、室温で処理する。０．０５ＭのＴＥＡＡ緩衝溶液（ｐＨ６．９）を添加し、そしてＴＨＦを、エバポレーションによって除去する。残渣を、Ｓｅｐ−ｐａｋＣ１８カートリッジで脱塩し、そしてＲＰ−ＨＰＬＣによって精製し、立体規則性Ｎ−プロピルホスホロアミダートＲＮＡを得る。
Ｎ−［（２−ジメチルアミノ）エチル］ホスホロアミダート［Ｘ＝ＮＨ（ＣＨ２）２ＮＭｅ２］
上記のように得られるオキサリルリンカーを介してＣＰＧ樹脂に負荷されたオリゴヌクレオシドＨ−ホスホネートを、ＣＣｌ４−２−ジメチルアミノエチルアミン（９：１、ｖ／ｖ）により、ＲＴで１時間、処理し、そしてＣＨ３ＣＮで洗浄する。合わせた有機溶液を、低圧下で濃縮して、乾燥させる。濾過物を、２５％ＮＨ３水溶液−ＥｔＯＨ（３：１、ｖ／ｖ）で希釈し、そして密閉したフラスコ中で、１２時間、室温で置く。溶液を低圧下で濃縮し、そして残渣をＲＰ−ＨＰＬＣにより精製する。所望の２’−Ｏ−ＴＢＳ−保護Ｎ−［（２−ジメチルアミノ）エチル］ホスホロアミダートＲＮＡを含有する画分を、回収し、そして凍結乾燥する。残渣を、乾燥ＴＨＦ中１ＭのＴＢＡＦ溶液により２４時間、室温で処理する。０．０５ＭのＴＥＡＡ緩衝溶液（ｐＨ６．９）を添加し、そしてＴＨＦを、エバポレーションによって除去する。残渣を、Ｓｅｐ−ｐａｋＣ１８カートリッジで脱塩し、そしてＲＰ−ＨＰＬＣによって精製し、立体規則性Ｎ−［（２−ジメチルアミノ）エチル］ホスホロアミダートＲＮＡを得る。
実施例７７：固相合成；プレ活性化モノマー溶液の調製のための一般的手順
適切なＨ−ホスホネートモノエステルを、乾燥ピリジンおよび乾燥トルエンとの反復共エバポレーションにより乾燥し、次いで、乾燥溶媒に溶解する。溶液に、縮合試薬を、滴下し、そして１０分間、撹拌する。次いで、アミノアルコールを添加し、そしてさらに１０分間、撹拌して、プレ活性化モノマー溶液を得る。
実施例７８：経路Ａを介するホスホロチオエートダイマー、（Ｓｐ）−アンモニウムチミジン−３’−イルチミジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＳＰ）−５ｔｔ］の固相合成
Figure 2012510460
スクシニルリンカーを介したＮ３−ベンゾイル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジン−負荷ＨＣＰ樹脂（１６．４ｍｇ；３０．５μｍｏｌ／ｇ、０．５μｍｏｌ）を、３％ＤＣＡ／ＤＣＭ（３×１ｍＬ）で処理し、次いで、ＤＣＭ（３×１ｍＬ）および乾燥ＭｅＣＮ（３×１ｍＬ）で洗浄した。樹脂を低圧下で乾燥した（＞５分間）後、プレ活性化モノマー溶液（２５０μＬ、２５μｍｏｌ；８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウムＮ３−ベンゾイル−５’−Ｏ（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジン−３’−イルホスホネート（Ｈ−ホスホネートモノエステルについて２５μｍｏｌ）、ＭｅＣＮ−ピリジン（溶媒について９：１、ｖ／ｖ）、Ｐｈ３ＰＣｌ２（縮合試薬について６２．５μｍｏｌ）、およびＬ−２（アミノアルコールについて３０μｍｏｌからなる）を添加した。２分間、撹拌し、反応溶液を除去し、そして樹脂を、ＭｅＣＮ（３×１ｍＬ）で洗浄し、そして低圧下で乾燥した（＞５分間）。修飾工程では、樹脂上の得られる中間体を、０．３ＭのＤＴＤ／ＭｅＣＮ（５００μＬ、１５０μｍｏｌ）で５分間の処理により硫化し、次いで、樹脂を、ＭｅＣＮ（３×１ｍＬ）およびＤＣＭ（３×１ｍＬ）で洗浄した。５’−Ｏ−ＤＭＴｒ基を、３％ＤＣＡ／ＤＣＭ（３×１ｍＬ）での処理によって除去し、そして樹脂を、ＤＣＭ（３×１ｍＬ）で洗浄した。次いで、樹脂上のホスホロチオエートダイマーを、２５％ＮＨ３（１ｍＬ）で、１２時間、５５℃で処理して、キラル補助基および核酸塩基の保護基を除去し、そしてまた、樹脂からダイマーを遊離させる。樹脂を、濾過によって取り出し、そしてＨ２Ｏで洗浄した。濾過物を濃縮して、乾燥させた。残渣を、Ｈ２Ｏ（２ｍＬ）に溶解し、Ｅｔ２Ｏ（３×２ｍＬ）で洗浄し、そして合わせた洗浄物を、Ｈ２Ｏ（２ｍＬ）で逆抽出した。合わせた水層を濃縮して、乾燥させた。得られる粗生成物を、逆相ＵＰＬＣ（登録商標）により、０．１Ｍアンモニウムアセテート緩衝液（ｐＨ７．０）中０〜２０％ＭｅＯＨの直線勾配で、１５分間、５５℃で、０．４ｍｌ／分の速度で、分析した。生成物は、従来のＨ−ホスホネート法によって合成される対照サンプルと同一であった。（ＳＰ）−５ｔｔの収率は９７％（ＲＰ：ＳＰ＝２：９８）であった。保持時間：１３．４分（（ＲＰ）−５ｔｔ：１２．３分）。一般的スキームをスキーム１８に示す。ＵＰＬＣプロファイルを図５Ａに示す。（ＳＰ）−５ｔｔの別の合成では、ＢＴＣ（２０μｍｏｌ）を、Ｐｈ３ＰＣｌ２（６２．５μｍｏｌ）の代わりに使用した。生成物は、従来のＨ−ホスホネート法によって合成される対照サンプルと同一であった。（ＳＰ）−５ｔｔの収率は９５％収率（ＲＰ：ＳＰ＝３：９７）であった。保持時間：１３．５分（（ＲＰ）−５ｔｔ：１２．４分）。ＵＰＬＣプロファイルを図５Ｂに示す。
スキーム１８：経路Ａを介するホスホロチオエートダイマーの一般的固相合成
Figure 2012510460
実施例７９：ホスホロチオエートダイマー、（Ｓｐ）−アンモニウムチミジン−３’−イルチミジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＳＰ）−５ｔｔ］の固相合成
スクシニルリンカーを介したＮ３−ベンゾイル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジン−負荷ＨＣＰ樹脂（１６．４ｍｇ；３０．５μｍｏｌ／ｇ、０．５μｍｏｌ）を、３％ＤＣＡ／ＤＣＭ（３×１ｍＬ）で処理し、次いで、ＤＣＭ（３×１ｍＬ）および乾燥ＭｅＣＮ（３×１ｍＬ）で洗浄した。樹脂を低圧下で乾燥した（＞５分間）後、プレ活性化モノマー溶液（２００μＬ、２５μｍｏｌ；８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウムＮ３−ベンゾイル−５’−Ｏ（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジン−３’−イルホスホネート（Ｈ−ホスホネートモノエステルについて２５μｍｏｌ）、ＭｅＣＮ−ＣＭＰ（溶媒について９：１、ｖ／ｖ）、Ｐｈ３ＰＣｌ２（縮合試薬について６２．５μｍｏｌ）、およびＬ−２（アミノアルコールについて３０μｍｏｌ）を添加し、続いて、５ＭのＣＭＰＴ／ＭｅＣＮ（活性化試薬について５０μＬ、２５０μｍｏｌ）を添加した。１０分間、撹拌し、反応溶液を除去し、そして樹脂を、ＭｅＣＮ（３×１ｍＬ）で洗浄し、低圧下で乾燥した（＞５分間）。樹脂上の得られる中間体を、０．３ＭのＤＴＤ／ＭｅＣＮ（５００μＬ、１５０μｍｏｌ）で５分間の処理により硫化し、次いで、樹脂を、ＭｅＣＮ（３×１ｍＬ）およびＤＣＭ（３×１ｍＬ）で洗浄した。５’−Ｏ−ＤＭＴｒ基を、３％ＤＣＡ／ＤＣＭ（３×１ｍＬ）での処理によって除去し、そしてＤＣＭ（３×１ｍＬ）で洗浄した。次いで、樹脂上のホスホロチオエートダイマーを、２５％ＮＨ３（１ｍＬ）で、１２時間、５５℃で処理して、キラル補助基および核酸塩基の保護基を除去し、そしてまた、樹脂からダイマーを遊離させる。樹脂を、濾過によって取り出し、そしてＨ２Ｏで洗浄した。濾過物を濃縮して、乾燥させた。残渣を、Ｈ２Ｏ（２ｍＬ）に溶解し、Ｅｔ２Ｏ（３×２ｍＬ）で洗浄し、そして合わせた洗浄物を、Ｈ２Ｏ（２ｍＬ）で逆抽出した。合わせた水層を濃縮して、乾燥させた。得られる粗生成物を、逆相ＵＰＬＣ（登録商標）により、０．１Ｍアンモニウムアセテート緩衝液（ｐＨ７．０）中０〜２０％ＭｅＯＨの直線勾配で、１５分間、５５℃で、０．４ｍｌ／分の速度で、分析した。生成物は、従来のＨ−ホスホネート法によって合成される対照サンプルと同一であった。（ＳＰ）−５ｔｔの収率は９８％収率（ＲＰ：ＳＰ＝１：９９）であった。保持時間：１３．５分（（ＲＰ）−５ｔｔ：１２．４分）。ＵＰＬＣプロファイルを図６Ａに示す。この化合物はまた、記載の類似の様式で、「Ｐｈ３ＰＣｌ２（６２．５μｍｏｌ）およびＬ−２（３０μｍｏｌ）」の代わりに、「ＢＴＣ（１６μｍｏｌ）およびＬ−２（２６μｍｏｌ）」を使用しても得られた。生成物は、従来のＨ−ホスホネート法によって合成される対照サンプルと同一であった。（ＳＰ）−５ｔｔの収率は９５％収率（ＲＰ：ＳＰ＝１：９９）であった。保持時間：１３．５分（（ＲＰ）−５ｔｔ：１２．４分）。ＵＰＬＣプロファイルを図６Ｂに示す。
実施例８０：経路Ａを介するホスホロチオエートダイマー、（ＲＰ）−アンモニウムチミジン−３’−イルチミジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＲＰ）−５ｔｔ］の固相合成
この化合物は、「実施例７８」に類似の様式で、「Ｌ−２（３０μｍｏｌ）」の代わりに「Ｄ−２（３０μｍｏｌ）」を使用することによって、得た。生成物は、従来のＨ−ホスホネート法によって合成される対照サンプルと同一であった。（ＲＰ）−５ｔｔの収率は９８％（ＲＰ：ＳＰ＝９７：３）であった。保持時間：１２．２分（（ＳＰ）−５ｔｔ：１３．５分）。ＵＰＬＣプロファイルを図７Ａに示す。（ＲＰ）−５ｔｔの別の合成では、ＢＴＣ（２０μｍｏｌ）を、Ｐｈ３ＰＣｌ２（６２．５μｍｏｌ）の代わりに使用した。生成物は、従来のＨ−ホスホネート法によって合成される対照サンプルと同一であった。（ＲＰ）−５ｔｔの収率は９７％（ＲＰ：ＳＰ＝９５：５）であった。保持時間：１２．３分（（ＳＰ）−５ｔｔ：１３．６分）。ＵＰＬＣプロファイルを図７Ｂに示す。
実施例８１：経路Ａを介するホスホロチオエートダイマー、（ＲＰ）−アンモニウムチミジン−３’−イルチミジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＲＰ）−５ｔｔ］の固相合成
この化合物は、「実施例７９」に類似の様式で、「Ｌ−２（３０μｍｏｌ）」の代わりに「Ｄ−２（３０μｍｏｌ）」を使用することによって得た。生成物は、従来のＨ−ホスホネート法によって合成される対照サンプルと同一であった。（ＲＰ）−５ｔｔの収率は９８％（ＲＰ：ＳＰ＝９８：２）であった。保持時間：１２．３分（（ＳＰ）−５ｔｔ：１３．６分）。ＵＰＬＣプロファイルを図８に示す。
実施例８２：経路Ａを介するホスホロチオエートダイマー、（ＳＰ）−アンモニウム２’−デオキシシチジン−３’−イルチミジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＳＰ−５ｃｔ］の固相合成
Figure 2012510460
 この化合物は、実施例７８に類似の様式で、「８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウムＮ３−ベンゾイル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジン−３’−イルホスホネート（２５μｍｏｌ）」の代わりに、「８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウム４−Ｎ−ベンゾイル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジン−３’−イルホスホネート（２５μｍｏｌ）」を使用して得た。生成物は、従来のＨ−ホスホネート法によって合成される対照サンプルと同一であった。（ＳＰ）−５ｃｔの収率は９８％収率（ＲＰ：ＳＰ＝３：９７）であった。保持時間：９．７分（（ＲＰ）−５ｃｔ：８．７分）。ＵＰＬＣプロファイルを図９Ａに示す。この化合物はまた、記載のようにして「Ｐｈ３ＰＣｌ２（６２．５μｍｏｌ）およびＬ−２（３０μｍｏｌ）」の代わりに、「ＢＴＣ（１６μｍｏｌ）およびＬ−２（２６μｍｏｌ）」を使用しても得られた。生成物は、従来のＨ−ホスホネート法によって合成される対照サンプルと同一であった。（ＳＰ）−５ｃｔの収率は９４％（ＲＰ：ＳＰ＝３：９７）であった。保持時間：９．７分（（ＲＰ）−５ｃｔ：８．７分）。ＵＰＬＣプロファイルを図９Ｂに示す。
実施例８３：経路Ａを介するホスホロチオエートダイマー、（ＲＰ）−アンモニウム２’−デオキシシチジン−３’−イルチミジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＲＰ−５ｃｔ］の固相合成
この化合物は、実施例８２の実験、図９Ａに類似の様式で、「Ｌ−２（３０μｍｏｌ）」の代わりに「Ｄ−２（３０（μｍｏｌ）」を使用することによって得た。生成物は、従来のＨ−ホスホネート法によって合成される対照サンプルと同一であった。（ＲＰ）−５ｃｔの収率は９８％（ＲＰ：ＳＰ＝９７：３）であった。保持時間：８．６分（（ＳＰ）−５ｃｔ：９．７分）。ＵＰＬＣプロファイルを図１０Ａに示す。この化合物は、実施例８２、図９Ｂに類似の様式で、「Ｌ−２（３０μｍｏｌ）」の代わりに「Ｄ−２（３０（μｍｏｌ）」を使用することによって得た。（ＲＰ）−５ｃｔの収率は８７％（ＲＰ：ＳＰ＝９８：２）であった。保持時間：８．６分（（ＳＰ）−５ｃｔ：９．８分）。ＵＰＬＣプロファイルを図１０Ｂに示す。
実施例８４：経路Ａを介するホスホロチオエートダイマー、（Ｓｐ）−アンモニウム２’−デオキシアデニン−３’−イルチミジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＳＰ）−５ａｔ］の固相合成
Figure 2012510460
 この化合物は、実施例７８に類似の様式で、「８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７エニウムＮ３−ベンゾイル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジン−３’−イルホスホネート（２５μｍｏｌ）」の代わりに、「８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウム６−Ｎ，Ｎ−ジベンゾイル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシアデニン−３’−イルホスホネート（２５μｍｏｌ）」を使用して得た。生成物は、従来のＨ−ホスホネート法によって合成される対照サンプルと同一であった。（ＳＰ）−５ａｔの収率は９６％収率（ＲＰ：ＳＰ＝１：９９）であった。保持時間：１４．０分（（ＲＰ）−５ａｔ：１２．６分）。ＵＰＬＣプロファイルを図１１に示す。
実施例８５：経路Ａを介するホスホロチオエートダイマー、（ＲＰ）−アンモニウム２’−デオキシアデニン−３’−イルチミジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＲＰ−５ａｔ］の固相合成
この化合物は、実施例８３に類似の様式で、「Ｌ−２（３０μｍｏｌ）」の代わりに「Ｄ−２（３０μｍｏｌ）」を使用することによって得た。生成物は、従来のＨ−ホスホネート法によって合成される対照サンプルと同一であった。（ＲＰ）−５ａｔの収率は９６％（ＲＰ：ＳＰ＝９６：４）であった。保持時間：１２．５分（（Ｓｐ−５ａｔ：１４．１分）。ＵＰＬＣプロファイルを図１２に示す。
実施例８６：経路Ａを介するホスホロチオエートダイマー、（ＳＰ）−アンモニウム２’−デオキシグアニン−３’−イルチミジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＳＰ）−５ｇｔ］の固相合成
Figure 2012510460
 この化合物は、実施例７８に類似の様式で、「８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウムＮ３−ベンゾイル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジン−３’−イルホスホネート（２５μｍｏｌ）」の代わりに、「８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウムＯ６−シアノエチル−２−Ｎ−フェノキシアセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシグアニン−３’−イルホスホネート（２５μｍｏｌ）」を使用して得た。生成物は、従来のＨ−ホスホネート法によって合成される対照サンプルと同一であった。（ＳＰ）−５ｇｔの収率は９６％（ＲＰ：ＳＰ＝２：９８）であった。保持時間：１１．５分（（ＲＰ）−５ｇｔ：１０．３分）。ＵＰＬＣプロファイルを図１３に示す。
実施例８７：経路Ａを介するホスホロチオエートダイマー、（ＲＰ）−アンモニウム２’−デオキシグアニン−３’−イルチミジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＲＰ）−５ｇｔ］の固相合成
この化合物は、実施例８６に類似の様式で、「Ｌ−２（３０μｍｏｌ）」の代わりに「Ｄ−２（３０μｍｏｌ）」を使用することによって得た。生成物は、従来のＨ−ホスホネート法によって合成される対照サンプルと同一であった。（ＲＰ）−５ｇｔの収率は９６％（ＲＰ：ＳＰ＝９７：３）であった。保持時間：１０．３分（（ＳＰ）−５ｇｔ：１１．６分）。ＵＰＬＣプロファイルを図１４に示す。
実施例８８：経路Ｂを介するホスホロチオエートダイマー、（ＳＰ）−アンモニウムチミジン−３’−イルチミジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＳＰ）−５ｔｔ］の固相合成
Figure 2012510460
 スクシニルリンカーを介したＮ３−ベンゾイル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジン−負荷ＨＣＰ樹脂（１６．４ｍｇ；３０．５μｍｏｌ／ｇ、０．５μｍｏｌ）を、５’−Ｏ−ＤＭＴｒ基の除去のために、１％ＴＦＡ／ＤＣＭ（３×１ｍＬ）で処理し、ＤＣＭ（３×１ｍＬ）および乾燥ＭｅＣＮ（３×１ｍＬ）で洗浄し、減圧下で乾燥させた。プレ活性化モノマー溶液（２００μＬ、５０μｍｏｌ；８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウムＮ３−ベンゾイル−５’−Ｏ（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジン−３’−イルホスホネート（Ｈ−ホスホネートモノエステルについて５０μｍｏｌ）、ＭｅＣＮ−ＣＭＰ（溶媒について９：１、ｖ／ｖ）、Ｐｈ３ＰＣｌ２（縮合試薬について１２５μｍｏｌ）、およびＬ−６（アミノアルコールについて５２μｍｏｌからなる）を添加し、続いて、５ＭのＣＭＰＴ／ＭｅＣＮ（５０μＬ、２５０μｍｏｌ）を添加した。２分間、撹拌し、反応溶液を除去し、そして樹脂を、ＭｅＣＮ（３×１ｍＬ）、ＤＣＭ（３×１ｍＬ）で洗浄し、そして低圧下で乾燥した（＞５分間）。５’−Ｏ−ＤＭＴｒ基およびキラル補助基を、ＤＣＭ中１％ＴＦＡ（３×１ｍＬ）の処理により同時に除去し、ＤＣＭ（３×１ｍＬ）および乾燥ＭｅＣＮ（３×１ｍＬ）で洗浄し、そして減圧下で乾燥させた。樹脂上の得られる中間体を、０．２Ｍビューケージ試薬／ＭｅＣＮ（２００μＬ、４０μｍｏｌ）およびＢＳＡ（２５μｌ、１００μｍｏｌ）の溶液混合物での２０分間の処理により硫化し、次いで、樹脂を、ＭｅＣＮ（３×１ｍＬ）で洗浄した。次いで、樹脂上のホスホロチオエートダイマーを、２５％ＮＨ３−ＥｔＯＨ（２ｍＬ、４：１、ｖ／ｖ）で、１２時間、室温で処理して、核酸塩基の保護基を除去し、そしてまた、樹脂からダイマーを遊離させる。樹脂を、濾過によって取り出し、そしてＨ２Ｏで洗浄した。濾過物を濃縮して、乾燥させた。残渣を、Ｈ２Ｏ（２ｍＬ）に溶解し、Ｅｔ２Ｏ（３×２ｍＬ）で洗浄し、そして合わせた洗浄物を、Ｈ２Ｏ（２ｍＬ）で逆抽出した。合わせた水層を濃縮して、乾燥させた。得られる粗生成物を、逆相ＵＰＬＣ（登録商標）により、０．１Ｍアンモニウムアセテート緩衝液（ｐＨ７．０）中０〜２０％ＭｅＯＨの直線勾配で、１５分間、５５℃で、０．４ｍｌ／分の速度で、分析した。生成物は、従来のＨ−ホスホネート法によって合成される対照サンプルと同一であった。（ＳＰ）−５ｔｔの収率は９６％（ＲＰ：ＳＰ＝４：９６）であった。保持時間：１３．５分（（ＲＰ）−５ｔｔ：１２．４分）。ＵＰＬＣプロファイルを図１５Ａに示す。
別の合成では、この化合物はまた、記載の類似の様式で「Ｐｈ３ＰＣｌ２（１２５μｍｏｌ）」の代わりに「ＢＴＣ（３２μｍｏｌ）」を使用することによっても得られる。生成物は、従来のＨ−ホスホネート法によって合成される対照サンプルと同一であった。（ＳＰ）−５ｔｔの収率は９６％（ＲＰ：ＳＰ＝５：９５）であった。保持時間：１３．４分（（ＲＰ）−５ｔｔ：１２．３分）。ＵＰＬＣプロファイルを図１５Ｂに示す。
実施例８９：経路Ｂを介するホスホロチオエートダイマー、（ＳＰ）−アンモニウムチミジン−３’−イルチミジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＳＰ）−５ｔｔ］の固相合成
他の別の合成では、［（ＳＰ）−５ｔｔ］は、図１５Ａ、実施例８８に類似の様式で、「８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウムＮ３−ベンゾイル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジン３’−イルホスホネート（５０μｍｏｌ）、Ｐｈ３ＰＣｌ２（１２５μｍｏｌ）、およびＬ−６（５２μｍｏｌ）」の代わりに、「８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウムＮ３−ベンゾイル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジン−３’−イルホスホネート（２５μｍｏｌ）、ＢＴＣ（１６μｍｏｌ）、およびＬ−６（２６μｍｏｌ））」を使用しても得られた。一般的スキームをスキーム１９に示す。生成物は、従来のＨ−ホスホネート法によって合成される対照サンプルと同一であった。（ＳＰ）−５ｔｔの収率は９３％（ＲＰ：ＳＰ＝６：９４）であった。保持時間：１３．５分（（ＲＰ）−５ｔｔ：１２．４分）。ＵＰＬＣプロファイルを図１６Ａに示す。この化合物は、記載の類似の様式で、「０．２Ｍビューケージ試薬／ＭｅＣＮ（２００μＬ、４０μｍｏｌ）」の代わりに、「０．２ＭのＤＴＤ／ＭｅＣＮ（２００μＬ、８０μｍｏｌ）」を使用して得られた。生成物は、従来のＨ−ホスホネート法によって合成される対照サンプルと同一であった。（ＳＰ）−５ｔｔの収率は９５％（ＲＰ：ＳＰ＝６：９４）であった。保持時間：１３．５分（（ＲＰ）−５ｔｔ：１２．４分）。ＵＰＬＣプロファイルを図１６Ｂに示す。
スキーム１９．
Figure 2012510460
実施例９０：経路Ｂを介するホスホロチオエートダイマー、（ＲＰ）−アンモニウムチミジン−３’−イルチミジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＲＰ）−５ｔｔ］の固相合成
この化合物は、実施例８８の方法、図１５Ａに類似の様式で、「Ｌ−６（５２μｍｏｌ）」の代わりに「Ｄ−６（５２μｍｏｌ）」を使用することによって得た。生成物は、従来のＨ−ホスホネート法によって合成される対照サンプルと同一であった。（ＲＰ）−５ｔｔの収率は９５％（ＲＰ：ＳＰ＝９７：３）であった。保持時間：１２．３分（（ＳＰ）−５ｔｔ：１３．６分）。ＵＰＬＣプロファイルを図１７Ａに示す。
この化合物は、実施例８８の方法、図１５Ｂに類似の様式で、「Ｌ−６（５２μｍｏｌ）」の代わりに「Ｄ−６（５２μｍｏｌ）」を使用することによって得た。生成物は、従来のＨ−ホスホネート法によって合成される対照サンプルと同一であった。（ＲＰ）−５ｔｔの収率は９４％（ＲＰ：ＳＰ＝９７：３）であった。保持時間：１２．３分（（ＳＰ）−５ｔｔ：１３．６分）。ＵＰＬＣプロファイルを図１７Ｂに示す。
実施例９１：経路Ｂを介するホスホロチオエートダイマー、（ＳＰ）−アンモニウム２’−デオキシシチジン−３’−イルチミジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＳＰ）−５ｃｔ］の固相合成
Figure 2012510460
 この化合物は、実施例８８に類似の様式で、「８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウムＮ３−ベンゾイル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジン−３’−イルホスホネート（５０μｍｏｌ）」の代わりに、「８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウム４−Ｎ−ベンゾイル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジン−３’−イルホスホネート（５０μｍｏｌ）」を使用して得た。生成物は、従来のＨ−ホスホネート法によって合成される対照サンプルと同一であった。（ＳＰ）−５ｃｔの収率は９５％（ＲＰ：ＳＰ＝４：９６）であった。保持時間：９．７分（（ＲＰ）−５ｃｔ：８．７分）。ＵＰＬＣプロファイルを図１８に示す。
実施例９２：経路Ｂを介するホスホロチオエートダイマー、（ＲＰ）−アンモニウム２’−デオキシシチジン−３’−イルチミジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＲＰ）−５ｃｔ］の固相合成
この化合物は、実施例９１に類似の様式で、「Ｌ−６（５２μｍｏｌ）」の代わりに「Ｄ−６（５２μｍｏｌ）」を使用することによって得た。生成物は、従来のＨ−ホスホネート法によって合成される対照サンプルと同一であった。（ＲＰ）−５ｃｔの収率は９６％（ＲＰ：ＳＰ＝９７：３）であった。保持時間：８．６分（（ＳＰ）−５ｃｔ：９．８分）。ＵＰＬＣプロファイルを図１９に示す。
実施例９３：経路Ｂを介するホスホロチオエートダイマー、（ＳＰ）−アンモニウム２’−デオキシアデニン−３’−イルチミジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＳＰ）−５ａｔ］の固相合成
Figure 2012510460
 この化合物は、実施例８８に類似の様式で、「８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウムＮ３−ベンゾイル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジン−３’−イルホスホネート（５０μｍｏｌ）」の代わりに、「８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウム６−Ｎ，Ｎ−ジベンゾイル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシアデニン−３’−イルホスホネート（５０μｍｏｌ）」を使用して得た。生成物は、従来のＨ−ホスホネート法によって合成される対照サンプルと同一であった。（ＳＰ）−５ａｔの収率は９５％収率（ＲＰ：ＳＰ＝５：９５）であった。保持時間：１４．０分（（ＲＰ）−５ａｔ：１２．５分）。ＵＰＬＣプロファイルを図２０Ａに示す。
この化合物は、図２０Ａについて本実施例に記載の方法に類似の様式で、「Ｐｈ３ＰＣｌ２（１２５μｍｏｌ）」の代わりに「ＢＴＣ（３２μｍｏｌ）」を使用することによって得た。生成物は、従来のＨ−ホスホネート法によって合成される対照サンプルと同一であった。（ＳＰ）−５ａｔの収率は９４％（ＲＰ：ＳＰ＝５：９５）であった。保持時間：１３．９分（（ＲＰ）−５ａｔ：１２．５分）。ＵＰＬＣプロファイルを図２０Ｂに示す。
実施例９４：経路Ｂを介するホスホロチオエートダイマー、（ＳＰ）−アンモニウム２’−デオキシアデニン−３’−イルチミジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＳＰ）−５ａｔ］の固相合成
この化合物は、実施例８８に類似の様式で、「８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウムＮ３−ベンゾイル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジン−３’−イルホスホネート（５０μｍｏｌ）」の代わりに、「８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウム６−Ｎ−（（ジメチルアミノ）メチレン）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシアデニン−３’−イルホスホネート（５０μｍｏｌ）」を使用して得た。生成物は、従来のＨ−ホスホネート法によって合成される対照サンプルと同一であった。（ＳＰ）−５ａｔの収率は９１％収率（ＲＰ：ＳＰ＝５：９５）であった。保持時間：１３．９分（（ＲＰ）−５ａｔ：１２．５分）。ＵＰＬＣプロファイルを図２１に示す。
実施例９５：経路Ｂを介するホスホロチオエートダイマー、（ＲＰ）−アンモニウム２’−デオキシアデニン−３’−イルチミジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＲＰ）−５ａｔ］の固相合成
この化合物は、実施例９３の方法、図２０Ａに類似の様式で、「Ｌ−６（５２μｍｏｌ）」の代わりに「Ｄ−６（５２μｍｏｌ）」を使用することによって得た。生成物は、従来のＨ−ホスホネート法によって合成される対照サンプルと同一であった。（ＲＰ）−５ａｔの収率は９６％収率（ＲＰ：ＳＰ＝９７：３）であった。保持時間：１２．５分（（ＳＰ）−５ａｔ：１４．０分）。ＵＰＬＣプロファイルを図２２Ａに示す。
この化合物は、実施例９３の方法、図２０Ｂに類似の様式で、「Ｌ−６（５２μｍｏｌ）」の代わりに「Ｄ−６（５２μｍｏｌ）」を使用することによって得た。生成物は、従来のＨ−ホスホネート法によって合成される対照サンプルと同一であった。（ＲＰ）−５ａｔの収率は９４％（ＲＰ：ＳＰ＝９５：５）であった。保持時間：１２．４分（（ＲＰ）−５ａｔ：１４．０分）。ＵＰＬＣプロファイルを図２２Ｂに示す。
実施例９６：経路Ｂを介するホスホロチオエートダイマー、（ＳＰ）−アンモニウム２’−デオキシグアニン−３’−イルチミジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＳＰ）−５ｇｔ］の固相合成
この化合物は、実施例８８に類似の様式で、「８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウムＮ３−ベンゾイル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジン−３’−イルホスホネート（５０μｍｏｌ）」の代わりに、「８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウムＯ６−シアノエチル−２−Ｎ−フェノキシアセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシグアニン−３’−イルホスホネート（５０μｍｏｌ）」を使用して得た。生成物は、従来のＨ−ホスホネート法によって合成される対照サンプルと同一であった。（ＳＰ）−５ｇｔの収率は９５％（ＲＰ：ＳＰ＝６：９４）であった。保持時間：１１．５分（（ＲＰ）−５ｇｔ：１０．３分）。ＵＰＬＣプロファイルを図２３に示す。
実施例９７：経路Ｂを介するホスホロチオエートダイマー、（ＲＰ）−アンモニウム２’−デオキシグアニン−３’−イルチミジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＲＰ）−５ｇｔ］の固相合成
この化合物は、実施例９６に類似の様式で、「Ｌ−２（５２μｍｏｌ）」の代わりに「Ｄ−２（５２μｍｏｌ）」を使用することによって得た。生成物は、従来のＨ−ホスホネート法によって合成される対照サンプルと同一であった。（ＲＰ）−５ｇｔの収率は９５％（ＲＰ：ＳＰ＝９４：６）であった。保持時間：１０．３分（（ＳＰ）−５ｇｔ：１１．６分）。ＵＰＬＣプロファイルを図２４に示す。
実施例９８：経路Ｂを介するボラノホスフェート（Ｂｏｒａｎｏｐｈｏｓｈａｔｅ）ダイマー、（ＳＰ）−アンモニウムチミジン−３’−イルチミジン−５’−イルボラノホスフェート［（ＳＰ）−７ｔｔ］の固相合成
Figure 2012510460
 スクシニルリンカーを介したＮ３−ベンゾイル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジン−負荷ＨＣＰ樹脂（１６．４ｍｇ；３０．５μｍｏｌ／ｇ、０．５μｍｏｌ）を、５’−Ｏ−ＤＭＴｒ基の除去のために、１％ＴＦＡ／ＤＣＭ（３×１ｍＬ）で処理し、ＤＣＭ（３×１ｍＬ）および乾燥ＭｅＣＮ（３×１ｍＬ）で洗浄し、減圧下で乾燥させた。プレ活性化モノマー溶液（２００μＬ、５０μｍｏｌ；８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウムＮ３−ベンゾイル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジン−３’−イルホスホネート（Ｈ−ホスホネートモノエステルについて５０μｍｏｌ）、ＭｅＣＮ−ＣＭＰ（溶媒について９：１、ｖ／ｖ）、ＢＴＣ（縮合試薬について３２μｍｏｌ）、およびＤ−６（アミノアルコールについて５２μｍｏｌからなる）を添加し、続いて、５ＭのＣＭＰＴ／ＭｅＣＮ（５０μＬ、２５０μｍｏｌ）を添加した。２分間、撹拌し、反応溶液を除去し、そして樹脂を、ＭｅＣＮ（３×１ｍＬ）、ＤＣＭ（３×１ｍＬ）で洗浄し、そして低圧下で乾燥した（＞５分間）。５’−Ｏ−ＤＭＴｒ基およびキラル補助基を、ＤＣＭ中１％ＴＦＡ（３×１ｍＬ）の処理により同時に除去し、ＤＣＭ（３×１ｍＬ）および乾燥ＭｅＣＮ（３×１ｍＬ）で洗浄し、そして減圧下で乾燥させた。樹脂上の得られる中間体を、ＢＨ３−ＳＭｅ２−ＢＳＡ−ＤＭＡｃ（１ｍＬ、１：１：８、ｖ／ｖ／ｖ）の混合物による１５分間の処理によって、ホウ素化し、次いで、樹脂を、ＤＭＡｃ（３×１ｍＬ）、ＭｅＣＮ（３×１ｍＬ）、およびＭｅＯＨ（３×１ｍＬ）で洗浄した。次いで、樹脂上のボラノホスフェートダイマーを、２ＭのＮＨ３／ＥｔＯＨ（２ｍＬ）で、１２時間、室温で処理して、核酸塩基の保護基を除去し、そしてまた、樹脂からダイマーを遊離させた。樹脂を、濾過によって除去し、そしてＭｅＯＨで洗浄した。濾過物を濃縮して、乾燥させた。残渣を、Ｈ２Ｏ（２ｍＬ）に溶解し、Ｅｔ２Ｏ（３×２ｍＬ）で洗浄し、そして合わせた洗浄物を、Ｈ２Ｏ（２ｍＬ）で逆抽出した。合わせた水層を濃縮して、乾燥させた。得られる粗生成物を、逆相ＵＰＬＣ（登録商標）により、０．１Ｍアンモニウムアセテート緩衝液（ｐＨ７．０）中０〜１５％ＭｅＣＮの直線勾配で、１５分間、６０℃で、０．５ｍｌ／分の速度で、分析した。生成物は、従来のＨ−ホスホネート法によって合成される対照サンプルと同一であった。（ＳＰ）−７ｔｔの収率を、天然のＴＴダイマーの近値のモル吸光係数（１６８００）を用いて２６０ｎｍにおけるＵＶ吸収測定によって決定した。（ＳＰ）−７ｔｔの収率は８９％（ＲＰ：ＳＰ＝４：９６）であった。保持時間：９．６分（（ＲＰ）−７ｔｔ：９．８分）。ＵＰＬＣプロファイルを図２５に示す。
実施例９９：経路Ｂを介するボラノホスフェート（Ｂｏｒａｎｏｐｈｏｓｈａｔｅ）ダイマー、（ＲＰ）−アンモニウムチミジン−３’−イルチミジン−５’−イルボラノホスフェート［（ＲＰ）−７ｔｔ］の固相合成
この化合物は、実施例９８に類似の様式で、「Ｄ−２（５２μｍｏｌ）」の代わりに「Ｌ−２（５２μｍｏｌ）」を使用することによって、得た。生成物は、従来のＨ−ホスホネート法によって合成される対照サンプルと同一であった。（ＲＰ）−７ｔｔの収率を、天然のＴＴダイマーの近値のモル吸光係数（１６８００）を伴う２６０ｎｍにおけるＵＶ吸収測定によって決定した。（ＲＰ）−７ｔｔの収率は９０％収率（ＲＰ：ＳＰ＝９５：５）であった。保持時間：９．８分（（ＳＰ）−７ｔｔ：９．７分）。ＵＰＬＣプロファイルを図２６に示す。
実施例１００：経路Ｂを介するＮ−［（２−ジメチルアミノ）エチル］ホスホロアミダートダイマー、（ＳＰ）−チミジン−３’−イルチミジン−５’−イルＮ−［（２−ジメチルアミノ）エチル］ホスホロアミダート［（ＳＰ）−８ｔｔ］の固相合成
Figure 2012510460
 スクシニルリンカーを介したＮ３−ベンゾイル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジン−負荷ＨＣＰ樹脂（１６．４ｍｇ；３０．５μｍｏｌ／ｇ、０．５μｍｏｌ）を、５’−Ｏ−ＤＭＴｒ基の除去のために、１％ＴＦＡ／ＤＣＭ（３×１ｍＬ）で処理し、ＤＣＭ（３×１ｍＬ）および乾燥ＭｅＣＮ（３×１ｍＬ）で洗浄し、減圧下で乾燥させた。プレ活性化モノマー溶液（２００μＬ、５０μｍｏｌ；８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウムＮ３−ベンゾイル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジン−３’−イルホスホネート（Ｈ−ホスホネートモノエステルについて５０μｍｏｌ）、ＭｅＣＮ−ＣＭＰ（溶媒について９：１、ｖ／ｖ）、ＢＴＣ（縮合試薬について３２μｍｏｌ）、およびＬ−６（アミノアルコールについて５２μｍｏｌからなる）を添加し、続いて、５ＭのＣＭＰＴ／ＭｅＣＮ（５０μＬ、２５０μｍｏｌ）を添加した。２分間、撹拌し、反応溶液を除去し、そして樹脂を、ＭｅＣＮ（３×１ｍＬ）、ＤＣＭ（３×１ｍＬ）で洗浄し、そして低圧下で乾燥した（＞５分間）。５’−Ｏ−ＤＭＴｒ基およびキラル補助基を、ＤＣＭ中１％ＴＦＡ（３×１ｍＬ）の処理により同時に除去し、そして樹脂を、ＤＣＭ（３×１ｍＬ）および乾燥ＭｅＣＮ（３×１ｍＬ）で洗浄し、そして減圧下で乾燥させた。樹脂上の得られる中間体を、ＣＣｌ４−Ｍｅ２Ｎ（ＣＨ２）２ＮＨ２（１ｍＬ、１：９、ｖ／ｖ）の混合物による３０分間の処理によってアミド化し、次いで、樹脂を、ＤＣＭ（３×１ｍＬ）で洗浄した。次いで、樹脂上のホスホロアミダートダイマーを、２ＭのＮＨ３／ＥｔＯＨ（２ｍＬ）で、１２時間、室温で処理して、核酸塩基の保護基を除去し、そしてまた、樹脂からダイマーを遊離させた。樹脂を、濾過によって除去し、そしてＭｅＯＨで洗浄した。濾過物を濃縮して、乾燥させた。残渣を、Ｈ２Ｏ（２ｍＬ）に溶解し、Ｅｔ２Ｏ（３×２ｍＬ）で洗浄し、そして合わせた洗浄物を、Ｈ２Ｏ（２ｍＬ）で逆抽出した。合わせた水層を濃縮して、乾燥させた。得られる粗生成物を、逆相ＵＰＬＣ（登録商標）により、０．１Ｍアンモニウムアセテート緩衝液（ｐＨ７．０）中０〜２０％ＭｅＯＨの直線勾配で、１５分間、５５℃で、０．４ｍｌ／分の速度で、分析した。生成物は、従来のＨ−ホスホネート法によって合成される対照サンプルと同一であった。（ＳＰ）−８ｔｔの収率を、天然のＴＴダイマーの近値のモル吸光係数（１６８００）を用いて２６０ｎｍにおけるＵＶ吸収測定によって決定した。（ＳＰ）−８ｔｔの収率は９０％（ＲＰ：ＳＰ＝６：９４）であった。保持時間：１０．３分（（ＲＰ）−８ｔｔ：９．６分）。ＵＰＬＣプロファイルを図２７に示す。
実施例１０１：経路Ｂを介するＮ−［（２−ジメチルアミノ）エチル］ホスホロアミダートダイマー、（ＲＰ）−チミジン−３’−イルチミジン−５’−イルＮ−［（２−ジメチルアミノ）エチル］ホスホロアミダート［（ＲＰ）−８ｔｔ］の固相合成
この化合物は、実施例１００に類似の様式で、「Ｌ−２（５２μｍｏｌ）」の代わりに「Ｄ−２（５２μｍｏｌ）」を使用することによって、得た。生成物は、従来のＨ−ホスホネート法によって合成される対照サンプルと同一であった。（ＲＰ）−８ｔｔの収率を、天然のＴＴダイマーの近値のモル吸光係数（１６８００）を用いた２６０ｎｍにおけるＵＶ吸収測定によって決定した。（ＲＰ）−８ｔｔの収率は８６％収率（ＲＰ：ＳＰ＝９６：４）であった。保持時間：９．６分（（ＳＰ）−８ｔｔ：１０．３分）。ＵＰＬＣプロファイルを図２８に示す。
実施例１０２：経路Ａを介するホスホロチオエートテトラマー、Ａｌｌ−（ＳＰ）−［ＴＰＳ］３Ｔ（ホスホロチオエート）の固相合成
スクシニルリンカーを介した５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジン−負荷ＨＣＰ樹脂（０．５μｍｏｌ）を、合成に使用した。表３の工程を反復することによって、鎖伸長を実施した。鎖伸長後、５’−Ｏ−ＤＭＴｒ基を、３％ＤＣＡ／ＤＣＭ（３×１ｍＬ）での処理によって除去し、そしてＤＣＭ（３×１ｍＬ）で洗浄した。次いで、樹脂上のホスホロチオエートテトラマーを、２５％ＮＨ３で、１２時間、５５℃で処理して、キラル補助基および核酸塩基の保護基を除去し、そしてまた、樹脂からテトラマーを遊離させた。樹脂を、濾過によって除去し、そしてＨ２Ｏで洗浄した。濾過物を濃縮して、乾燥させた。残渣を、Ｈ２Ｏ（２ｍＬ）に溶解し、Ｅｔ２Ｏ（３×２ｍＬ）で洗浄し、そして合わせた洗浄物を、Ｈ２Ｏ（２ｍＬ）で逆抽出した。合わせた水層を濃縮して、乾燥させた。得られる粗生成物を、逆相ＵＰＬＣ（登録商標）により、０．１Ｍアンモニウムアセテート緩衝液（ｐＨ７．０）中０〜３０％ＭｅＯＨの直線勾配で、３０分間、５５℃で、０．４ｍｌ／分の速度で、分析した。生成物は、従来のホスホルアミダイト法によって合成される対照サンプルと同一であった。生成物の収率を、天然のＴ４テトラマーの近値のモル吸光係数（３３０００）を用いた２６０ｎｍにおけるＵＶ吸収測定によって決定した。平均的なカップリング収率は、９６％であり、光学純度は、９６％（平均：９９％）であった。保持時間：２３．０分；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ）ｍ／ｚ Ｃ４０Ｈ５２Ｎ８Ｏ２３Ｐ３Ｓ３［Ｍ−Ｈ］−の理論値１２０１．１５、実測値１２００．９７。ＵＰＬＣプロファイルを図２９に示す。
Figure 2012510460
＊「プレ活性化（ＲＰ）−または（Ｓｐ）−モノマー溶液」の調製：
８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウムＮ３−ベンゾイル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジン−３’−イルホスホネート（２５μｍｏｌ）を、乾燥ピリジンおよび乾燥トルエンとの反復共エバポレーションによって乾燥し、次いで、乾燥ＭｅＣＮ−ＣＭＰ（９：１、ｖ／ｖ）に溶解した。溶液に、Ｐｈ３ＰＣｌ２（６２．５μｍｏｌ）を添加し、そして１０分間、撹拌した。次いで、Ｌ−２（３０μｍｏｌ；「ＳＰ」溶液ではＤ−２）を添加し、そしてさらに１０分間、撹拌して、プレ活性化モノマー溶液を得た。
実施例１０３：経路Ａを介するホスホロチオエートテトラマー、（ＳＰ、ＲＰ、ＳＰ）−［ＴＰＳ］３Ｔ（ホスホロチオエート）の固相合成
この化合物は、実施例１０２のＡｌｌ−（ＳＰ）−［ＴＰＳ］３Ｔに類似の様式で得られた。生成物の収率を、天然のＴ４テトラマーの近値のモル吸光係数（３３０００）を用いた２６０ｎｍにおけるＵＶ吸収測定によって決定した。生成物は、従来のホスホルアミダイト法によって合成される対照サンプルと同一であった。平均的なカップリング収率は、９６％であり、光学純度は、９４％（平均：９８％）である。保持時間：２２．３分；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ）ｍ／ｚ Ｃ４０Ｈ５２Ｎ８Ｏ２３Ｐ３Ｓ３ ［Ｍ−Ｈ］−の理論値１２０１．１５、実測値１２００．９７。ＵＰＬＣプロファイルを図３０に示す。
実施例１０４：経路Ａを介するホスホロチオエートテトラマー、（ＲＰ、ＳＰ、Ｒｐ）−［ＴＰＳ］３Ｔ（ホスホロチオエート）の固相合成
この化合物は、実施例１０２のＡｌｌ−（ＳＰ）−［ＴＰＳ］３Ｔに類似の様式で得られた。生成物の収率を、天然のＴ４テトラマーの近値のモル吸光係数（３３０００）を用いた２６０ｎｍにおけるＵＶ吸収測定によって決定した。生成物は、従来のホスホルアミダイト法によって合成される対照サンプルと同一であった。平均的なカップリング収率は、９７％であり、光学純度は、９６％（平均：９９％）である。保持時間：２１．７分；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ）ｍ／ｚ Ｃ４０Ｈ５２Ｎ８Ｏ２３Ｐ３Ｓ３［Ｍ−Ｈ］−の理論値１２０１．１５、実測値１２００．９６。ＵＰＬＣプロファイルを図３１に示す。
実施例１０５：経路Ａを介するホスホロチオエートテトラマー、Ａｌｌ−（ＲＰ）−［ＴＰＳ］３Ｔ（ホスホロチオエート）の固相合成
この化合物は、Ａｌｌ−（ＳＰ）−［ＴＰＳ］３Ｔに類似の様式で得られた。生成物の収率を、天然のＴ４テトラマーの近値のモル吸光係数（３３０００）を用いた２６０ｎｍにおけるＵＶ吸収測定によって決定した。生成物は、従来のホスホルアミダイト法によって合成される対照サンプルと同一であった。平均的なカップリング収率は、９５％であり、光学純度は、９２％（平均：９７％）である。保持時間：１９．１分；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ）ｍ／ｚ Ｃ４０Ｈ５２Ｎ８Ｏ２３Ｐ３Ｓ３［Ｍ−Ｈ］−の理論値１２０１．１５、実測値１２００．９２。ＵＰＬＣプロファイルを図３２に示す。
実施例１０６：経路Ａを介するＲＮＡホスホロチオエートテトラマー、（ＳＰ）−アンモニウム２’−Ｏ−メチルウリジン−３’−イルウリジン−５’−イルホスホロチオエート［（Ｓｐ）−９ｕＭｕ］の固相合成
Figure 2012510460
 スクシニルリンカーを介した２’−Ｏ−アセチル−Ｎ３−ベンゾイル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン−負荷ＣＰＧ樹脂（２１．４ｍｇ；２３．４μｍｏｌ／ｇ、０．５μｍｏｌ）を、３％ＤＣＡ／ＤＣＭ（３×１ｍＬ）で処理し、次いで、ＤＣＭ（３×１ｍＬ）および乾燥ＭｅＣＮ（３×１ｍＬ）で洗浄した。樹脂を低圧下で乾燥した（＞５分間）後、プレ活性化モノマー溶液（２５０μＬ、２５μｍｏｌ；８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウムＮ３−ベンゾイル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−メチルウリジン−３’−イルホスホネート（Ｈ−ホスホネートモノエステルについて２５μｍｏｌ）、ＭｅＣＮ−ピリジン（溶媒について９：１、ｖ／ｖ）、Ｐｈ３Ｃｌ２（縮合試薬について６２．５μｍｏｌ）、およびＬ−２（アミノアルコールについて３０μｍｏｌからなる）を添加した。５分間、撹拌し、反応溶液を除去し、そして樹脂を、ＭｅＣＮ（３×１ｍＬ）で洗浄し、低圧下で乾燥した（＞５分間）。得られる中間体を、０．３ＭのＤＴＤ／ＭｅＣＮ（５００μＬ、１５０μｍｏｌ）で５分間の処理により硫化し、次いで、ＭｅＣＮ（３×１ｍＬ）およびＤＣＭ（３×１ｍＬ）で洗浄した。５’−Ｏ−ＤＭＴｒ基を、３％ＤＣＡ／ＤＣＭ（３×１ｍＬ）での処理によって除去し、そしてＤＣＭ（３×１ｍＬ）で洗浄した。次いで、樹脂上のホスホロチオエートダイマーを、２５％ＮＨ３（１ｍＬ）で、１２時間、５５℃で処理して、キラル補助基および核酸塩基の保護基を除去し、そしてまた、樹脂からダイマーを遊離させる。樹脂を、濾過によって除去し、そしてＨ２Ｏで洗浄した。濾過物を濃縮して、乾燥させた。残渣を、Ｈ２Ｏ（２ｍＬ）に溶解し、Ｅｔ２Ｏ（３×２ｍＬ）で洗浄し、そして合わせた洗浄物を、Ｈ２Ｏ（２ｍＬ）で逆抽出した。合わせた水層を濃縮して、乾燥させた。得られる粗生成物を、逆相ＵＰＬＣ（登録商標）により、０．１Ｍアンモニウムアセテート緩衝液（ｐＨ７．０）中０〜２０％ＭｅＯＨの直線勾配で、１５分間、５５℃で、０．４ｍｌ／分の速度で、分析した。（ＳＰ）−９ｕＭｕの収率は９５％（ＲＰ：ＳＰ＝２：９８）であった。保持時間：１０．２分、（（ＲＰ）−９ｕＭｕ：９．３分）；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ）ｍ／ｚ Ｃ１９Ｈ２４Ｎ４Ｏ１３ＰＳ［Ｍ−Ｈ］−の理論値５７９．０８、実測値５７８．９２。ＵＰＬＣプロファイルを図３３に示す。
実施例１０７：経路Ａを介するＲＮＡホスホロチオエートテトラマー、（ＲＰ）−アンモニウム２’−Ｏ−メチルウリジン−３’−イルウリジン−５’−イルホスホロチオエート［（Ｒｐ）−９ｕＭｕ］の固相合成
この化合物は、実施例１０６に類似の様式で、「Ｌ−２（３０μｍｏｌ）」の代わりに「Ｄ−２（３０μｍｏｌ）」を使用することによって、得た。（ＲＰ）−９ｕＭｕの収率は９４％（ＲＰ：ＳＰ＝９５：５）であった。保持時間：９．３分（（ＳＰ）−９ｕＭｕ：１０．３分）；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ）ｍ／ｚ Ｃ１９Ｈ２４Ｎ４Ｏ１３ＰＳ［Ｍ−Ｈ］−の理論値５７９．０８、実測値５７８．９７。ＵＰＬＣプロファイルを図３４に示す。
実施例１０８：経路Ａを介するＲＮＡホスホロチオエートテトラマー、（ＳＰ）−アンモニウム２’−デオキシ−２’−フルオロウリジン−３’−イルウリジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＳＰ）−１０ｕＦｕ］の固相合成
Figure 2012510460
 この化合物は、実施例１０６に類似の様式で、「８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウムＮ３−ベンゾイル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−メチルウリジン−３’−イルホスホネート（２５μｍｏｌ）」の代わりに、「８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウムＮ３−ベンゾイル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシ−２’−フルオロウリジン−３’−イルホスホレート（２５μｍｏｌ）」を使用して得た。（ＳＰ）−１０ｕＦｕの収率は９３％（ＲＰ：ＳＰ＝１：９９）であった。保持時間：１０．６分（（ＲＰ）−１０ｕＦｕ：８．５分）；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ）ｍ／ｚ Ｃ１８Ｈ２１ＦＮ４Ｏ1２ＰＳ ［Ｍ−Ｈ］−の理論値 ５６７．０６、実測値５６６．９６。ＵＰＬＣプロファイルを図３５に示す。
実施例１０９：経路Ａを介するＲＮＡホスホロチオエートテトラマー、（ＲＰ）−アンモニウム２’−デオキシ−２’−フルオロウリジン−３’−イルウリジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＲＰ）−１０ｕＦｕ］の固相合成
この化合物は、実施例１０８に類似の様式で、「Ｌ−２（３０μｍｏｌ）」の代わりに「Ｄ−２（３０μｍｏｌ）」を使用することによって得た。（ＲＰ）−１０ｕＦｕの収率は９２％収率（ＲＰ：ＳＰ＝９６：４）であった。保持時間：８．４分（（ＳＰ）−１０ｕＦｕ：１０．７分）；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ）ｍ／ｚ Ｃ１８Ｈ２１ＦＮ４Ｏ１２ＰＳ ［Ｍ−Ｈ］−の理論値５６７．０６、実測値５６６．９７。ＵＰＬＣプロファイルを図３６に示す。
実施例１１０：経路Ａを介する非天然の核酸塩基（ＳＰ）−アンモニウム１−（３−ニトロピロール−イル）−２−デオキシリボフラノース−３−イルチミジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＳＰ）−１１ｎｔ］の液相合成
Figure 2012510460
 この化合物は、実施例７８に類似の様式で、「８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウムＮ３−ベンゾイル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジン−３’−イルホスホネート（２５μｍｏｌ）」の代わりに、「８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウム５−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−１−（３−ニトロピロール−１−イル）−２−デオキシリボフラノース−３−イルホスホネート（２５μｍｏｌ）」を使用して得た。生成物の収率を、天然のＣＴダイマーの近値のモル吸光係数（１５２００）を用いた２６０ｎｍにおけるＵＶ吸収測定によって決定した。（ＳＰ）−１１ｎｔの収率は、９８％収率であった。保持時間：１６．３分。（ＲＰ）−１１ｎｔは、解像することできなかった；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ）ｍ／ｚ Ｃ１９Ｈ２４Ｎ４Ｏ１１ＰＳ ［Ｍ−Ｈ］−の理論値５４７．０９、実測値５４７．０２。ＵＰＬＣプロファイルを図３７に示す。
実施例１１１：経路Ａを介する非天然の核酸塩基（ＲＰ）−アンモニウム１−（３−ニトロピロール−イル）−２−デオキシリボフラノース−３−イルチミジン−５’−イルホスホロチオエート［（ＲＰ）−１１ｎｔ］の液相合成
この化合物は、実施例１１０に類似の様式で、「Ｌ−２（３０μｍｏｌ）」の代わりに「Ｄ−２（３０μｍｏｌ）」を使用することによって得た。生成物の収率を、天然のＣＴダイマーの近値のモル吸光係数（１５２００）を用いた２６０ｎｍにおけるＵＶ吸収測定によって決定した。（ＲＰ）−１１ｎｔの収率は、９７％収率であった。保持時間：１６．１分。（ＳＰ）−１１ｎｔは、解像することできなかった；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ）ｍ／ｚ Ｃ１９Ｈ２４Ｎ４Ｏ１１ＰＳ ［Ｍ−Ｈ］−の理論値５４７．０９、実測値５４７．０１。ＵＰＬＣプロファイルを図３８に示す。
本発明の好適な実施形態を本明細書において示し、そして説明してきたが、そのような実施形態は、単に例示として提供されることが、当業者には明らかであろう。当業者であれば、本発明から逸脱することなく、今後、多くのバリエーション、変更、および置換に思い至るであろう。本発明の実践において、本明細書に記載の本発明の実施形態に対する様々な代替物を用い得ることが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲を規定すること、ならびにこれらの特許請求の範囲内の方法および構造およびそれらの等価物もそれらによって含まれることが意図される。

Claims (115)

  1. アキラルＨ−ホスホネート部分を含む分子と５’−ＯＨ部分を含むヌクレオシドを反応させて、縮合中間体を形成する工程；および前記縮合中間体をキラルＸ−ホスホネート部分を含む核酸に変換する工程を含む、キラルＸ−ホスホネート部分を含む核酸の合成方法。
  2. 前記アキラルＨ−ホスホネート部分を含む分子と５’−ＯＨ部分を含むヌクレオシドを反応させて、縮合中間体を形成する工程が、ワンポット反応である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記キラルＸ−ホスホネート部分を含む核酸が、式１：
    Figure 2012510460
     （式中、Ｒ１は、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＲｄＲｄ、−Ｎ３、ハロゲン、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキル−Ｙ１−、アルケニル−Ｙ１−、アルキニル−Ｙ１−、アリール−Ｙ１−、ヘテロアリール−Ｙ１−、−Ｐ（Ｏ）（Ｒｅ）２、−ＨＰ（Ｏ）（Ｒｅ）、−ＯＲａまたは−ＳＲｃであり；
    Ｙ１は、Ｏ、ＮＲｄ、Ｓ、またはＳｅであり；
    Ｒａは、ブロッキング部分であり；
    Ｒｃは、ブロッキング基であり；
    Ｒｄの各例は、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アシル、置換シリル、カルバメート、−Ｐ（Ｏ）（Ｒｅ）２、または−ＨＰ（Ｏ）（Ｒｅ）であり；
    Ｒｅの各例は、独立して、水素、アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、アルキル−Ｙ２−、アルケニル−Ｙ２−、アルキニル−Ｙ２−、アリール−Ｙ２−、またはヘテロアリール−Ｙ２−、あるいはＮａ＋１、Ｌｉ＋１、もしくはＫ＋１であるカチオンであり；
    Ｙ２は、Ｏ、ＮＲｄ、またはＳであり；
    Ｒ２の各例は、独立して、水素、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＲｄＲｄ、−Ｎ３、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキル−Ｙ１−、アルケニル−Ｙ１−、アルキニル−Ｙ１−、アリール−Ｙ１−、ヘテロアリール−Ｙ１−、−ＯＲｂ、または−ＳＲｃであり、ここで、Ｒｂは、ブロッキング部分であり；
    Ｂａの各例は、独立して、ブロックされているかまたはブロックされていないアデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシルもしくは修飾核酸塩基であり；
    Ｘの各例は、独立して、アルキル、アルコキシ、アリール、アルキルチオ、アシル、−ＮＲｆＲｆ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、アルケニルチオ、アルキニルチオ、−Ｓ−Ｚ＋、−Ｓｅ−Ｚ＋、または−ＢＨ３ −Ｚ＋であり；
    Ｒｆの各例は、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、またはアリールであり；
    Ｚ＋は、アンモニウムイオン、アルキルアンモニウムイオン、ヘテロ芳香族イミニウムイオン、またはヘテロ環イミニウムイオンであって、それらのうちいずれかは、第一級、第二級、第三級もしくは第四級であり、あるいはＺ＋は一価の金属イオンであり；
    Ｒ３は、水素、ブロッキング基、固相支持体に接続された連結部分または核酸に接続された連結部分であり；およびｎは、１〜約２００の整数である）
    の化合物である、請求項１に記載の方法。
  4. 式１の前記化合物の各Ｘ−ホスホネート部分が、３１Ｐ ＮＭＲ分光法または逆相ＨＰＬＣによって測定されるとき、ジアステレオマー的に９８％を超えて純粋である、請求項３に記載の方法。
  5. 各Ｘ−ホスホネート部分がＲＰ配置を有する、請求項３に記載の方法。
  6. 各Ｘ−ホスホネート部分がＳＰ配置を有する、請求項３に記載の方法。
  7. 各Ｘ−ホスホネートが、独立して、Ｒｐ配置またはＳＰ配置を有する、請求項３に記載の方法。
  8. 前記アキラルＨ−ホスホネート部分を含む分子が、式２：
    Figure 2012510460
     （式中、Ｒ１は、−ＮＲｄＲｄ、−Ｎ３、ハロゲン、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキル−Ｙ１−、アルケニル−Ｙ１−、アルキニル−Ｙ１−、アリール−Ｙ１−、ヘテロアリール−Ｙ１−、−Ｐ（Ｏ）（Ｒｅ）２、−ＨＰ（Ｏ）（Ｒｅ）、−ＯＲａ、または−ＳＲｃであり；
    Ｙ１は、Ｏ、ＮＲｄ、Ｓ、またはＳｅであり；
    Ｒａは、ブロッキング部分であり；
    Ｒｃは、ブロッキング基であり；
    Ｒｄの各例は、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アシル、置換シリル、カルバメート、−Ｐ（Ｏ）（Ｒｅ）２、または−ＨＰ（Ｏ）（Ｒｅ）であり；
    Ｒｅの各例は、独立して、アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、アルキル−Ｙ２−、アルケニル−Ｙ２−、アルキニル−Ｙ２−、アリール−Ｙ２−、またはヘテロアリール−Ｙ２−であり；
    Ｙ２は、Ｏ、ＮＲｄ、またはＳであり；
    Ｒ２は、水素、−ＮＲｄＲｄ、−Ｎ３、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキル−Ｙ１−、アルケニル−Ｙ１−、アルキニル−Ｙ１−、アリール−Ｙ１−、ヘテロアリール−Ｙ１−、−ＯＲｂ、または−ＳＲｃであり、ここで、Ｒｂは、ブロッキング部分であり；および
    Ｂａは、ブロックされているかまたはブロックされていないアデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシルもしくは修飾核酸塩基であり；および
    Ｚ＋は、アンモニウムイオン、アルキルアンモニウムイオン、ヘテロ芳香族イミニウムイオン、またはヘテロ環イミニウムイオンであって、それらのうちいずれかは、第一級、第二級、第三級もしくは第四級であり、あるいは一価の金属イオンである）
    の化合物である、請求項１に記載の方法。
  9. キラル試薬をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  10. 前記キラル試薬が、式３：
    Figure 2012510460
     （式中、Ｗ１およびＷ２は、独立して、−ＮＧ５−、−Ｏ−、または−Ｓ−であり；
    Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、およびＧ５は、独立して、水素、アルキル、アラルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリル、ヘタリール、もしくはアリールであるか、またはＧ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、およびＧ５のうちの２つはＧ６であって、一緒になって、単環式もしくは多環式の、縮合もしくは非縮合の、約２０個までの環原子の、飽和、部分不飽和もしくは不飽和の炭素環またはヘテロ原子含有環を形成し、ならびに式中、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、およびＧ５のうち４つ以下がＧ６である）
    の化合物である、請求項９に記載の方法。
  11. 前記５’−ＯＨ部分を含むヌクレオシドが、式４：
    Figure 2012510460
     （式中、Ｒ２の各例は、独立して、水素、−ＮＲｄＲｄ、−Ｎ３、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキル−Ｙ１−、アルケニル−Ｙ１−、アルキニル−Ｙ１−、アリール−Ｙ１−、ヘテロアリール−Ｙ１−、−ＯＲｂ、または−ＳＲｃでり、ここで、Ｒｂは、ブロッキング部分であり；
    Ｙ１は、Ｏ、ＮＲｄ、Ｓ、またはＳｅであり；
    Ｒｃは、ブロッキング基であり；
    Ｒｄの各例は、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アシル、置換シリル、カルバメート、−Ｐ（Ｏ）（Ｒｅ）２、または−ＨＰ（Ｏ）（Ｒｅ）であり；
    Ｒｅの各例は、独立して、アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、アルキル−Ｙ２−、アルケニル−Ｙ２−、アルキニル−Ｙ２−、アリール−Ｙ２−、またはヘテロアリール−Ｙ２−であり；
    Ｙ２は、Ｏ、ＮＲｄ、またはＳであり；
    Ｂａの各例は、独立して、ブロックされているかまたはブロックされていないアデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシルもしくは修飾核酸塩基であり；
    ｍは、０〜ｎ−１の整数であり；
    ｎは、１〜約２００の整数であり；
    ＯＡは、トリチル部分、シリル部分、アセチル部分、アシル部分、アリールアシル部分、固相支持体に接続された連結部分または核酸に接続された連結部分に接続されており；
    ＪはＯであり、そしてＤはＨであり、あるいはＪはＳ、Ｓｅ、もしくはＢＨ３であり、そしてＤはキラル配位子Ｃｉもしくは式Ａ：
    Figure 2012510460
     （式中、Ｗ１およびＷ２は、独立して、ＮＨＧ５、ＯＨ、またはＳＨであり；
    Ａは、水素、アシル、アリール、アルキル、アラルキル、またはシリル部分であり；ならびに
    式中、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、およびＧ５は、独立して、水素、アルキル、アラルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、もしくはアリールであるか、またはＧ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、およびＧ５のうちの２つはＧ６であって、一緒になって、単環式もしくは多環式の、縮合もしくは非縮合の、約２０個までの環原子の、飽和、部分不飽和もしくは不飽和の、炭素環またはヘテロ原子含有環を形成し、ならびに式中、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、およびＧ５のうち４つ以下がＧ６である）
    の部分である）
    の化合物である、請求項１に記載の方法。
  12. 縮合試薬ＣＲを提供する工程であって、それによって、前記アキラルＨ−ホスホネート部分を含む分子が活性化され、前記キラル試薬と反応して、キラル中間体を形成する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  13. 前記縮合試薬ＣＲが、Ａｒ３ＰＬ２、（ＡｒＯ）３ＰＬ２、
    Figure 2012510460
     であり、式中、
    Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９およびＺ１０は、独立して、アルキル、アミノアルキル、シクロアルキル、ヘテロ環、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルキルオキシ、アリールオキシ、もしくはヘテロアリールオキシであるか、あるいは式中、Ｚ２とＺ３、Ｚ５とＺ６、Ｚ７とＺ８、Ｚ８とＺ９、Ｚ９とＺ７、もしくはＺ７とＺ８とＺ９のうちのいずれかは、一緒になって、３〜２０員環の脂環またはヘテロ環を形成し；
    Ｑ−は、対アニオンであり；
    Ｌは、脱離基であり；
    ｗは、０〜３の整数であり；ならびに
    Ａｒは、アリール、ヘテロアリールであり、および／またはＡｒ基のうちの１つは、前記高分子支持体に付着している、
    請求項１２に記載の方法。
  14. 前記縮合試薬ＣＲの対イオンが、Ｃｌ−、Ｂｒ−、ＢＦ４ −、ＰＦ６ −、ＴｆＯ−、Ｔｆ２Ｎ−、ＡｓＦ６ −、ＣｌＯ４ −、またはＳｂＦ６ −であり、ここで、ＴｆはＣＦ３ＳＯ２である、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記縮合試薬ＣＲの脱離基が、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール、イミダゾール、アルキルトリアゾール、テトラゾール、ペンタフルオロベンゼン、または１−ヒドロキシベンゾトリアゾールである、請求項１３に記載の方法。
  16. 前記縮合試薬が、ビス（トリクロロメチル）カルボネート（ＢＴＣ）、（ＰｈＯ）３ＰＣｌ２、Ｐｈ３ＰＣｌ２、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）ホスフィン酸クロリド（ＢｏｐＣｌ）、１，３−ジメチル−２−（３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール−１−ｙｌ）−２−ピロリジン−１−イル−１，３，２−ジアザホスホリジニウムヘキサフルオロホスフェート（ＭＮＴＰ）、または３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール−１−イル−トリス（ピロリジン−１−イル）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＮＴＰ）
    Figure 2012510460
     である、請求項１２に記載の方法。
  17. 活性化試薬ＡＲを提供する工程をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
  18. 前記活性化試薬ＡＲが、
    Figure 2012510460
     であり、式中、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５、Ｚ１６、Ｚ１７、Ｚ１８、Ｚ１９、Ｚ２０、およびＺ２１は、独立して、水素、アルキル、アミノアルキル、シクロアルキル、ヘテロ環、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルキルオキシ、アリールオキシ、もしくはヘテロアリールオキシであるか、あるいは式中、Ｚ１１とＺ１２、Ｚ１１とＺ１３、Ｚ１１とＺ１４、Ｚ１２とＺ１３、Ｚ１２とＺ１４、Ｚ１３とＺ１４、Ｚ１５とＺ１６、Ｚ１５とＺ１７、Ｚ１６とＺ１７、Ｚ１８とＺ１９、もしくはＺ２０とＺ２１のうちいずれかは、一緒になって、３〜２０員環の脂環もしくはヘテロ環を形成するか、または５もしくは２０員環の芳香環を形成し；
    ならびにＱ−は対イオンである、
    請求項１７に記載の方法。
  19. 前記活性化試薬ＡＲの対イオンが、Ｃｌ−、Ｂｒ−、ＢＦ４ −、ＰＦ６ −、ＴｆＯ−、Ｔｆ２Ｎ−、ＡｓＦ６ −、ＣｌＯ４ −、またはＳｂＦ６ −であり、ここで、ＴｆはＣＦ３ＳＯ２である、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記活性化試薬ＡＲが、イミダゾール、４，５−ジシアノイミダゾール（ＤＣＩ）、４，５−ジクロロイミダゾール、１−フェニルイミダゾリウムトリフレート（ＰｈＩＭＴ）、ベンゾイミダゾリウムトリフレート（ＢＩＴ）、ベンズトリアゾール、３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール（ＮＴ）、テトラゾール、５−エチルチオテトラゾール、５−（４−ニトロフェニル）テトラゾール、Ｎ−シアノメチルピロリジニウムトリフレート（ＣＭＰＴ）、Ｎ−シアノメチルピペリジニウムトリフレート、Ｎ−シアノメチルジメチルアンモニウムトリフレートである、請求項１７に記載の方法。
  21. 前記活性化試薬ＡＲが、４，５−ジシアノイミダゾール（ＤＣＩ）、１−フェニルイミダゾリウムトリフレート（ＰｈＩＭＴ）、ベンゾイミダゾリウムトリフレート（ＢＩＴ）、３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール（ＮＴ）、テトラゾール、またはＮ−シアノメチルピロリジニウムトリフレート（ＣＭＰＴ）
    Figure 2012510460
     である、請求項１７に記載の方法。
  22. 前記活性化試薬ＡＲが、Ｎ−シアノメチルピロリジニウムトリフレート（ＣＭＰＴ）である、請求項１７に記載の方法。
  23. 前記反応させる工程が、非プロトン性有機溶媒中で実施される、請求項１に記載の方法。
  24. 前記溶媒が、アセトニトリル、ピリジン、テトラヒドロフラン、またはジクロロメタンである、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記非プロトン性有機溶媒が塩基性ではない場合、塩基が前記反応させる工程中に存在する、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記塩基が、ピリジン、キノリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリンまたはＮ−シアノメチルピロリジンである、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記塩基が
    Figure 2012510460
     （式中、Ｚ２２およびＺ２３は、独立して、アルキル、アミノアルキル、シクロアルキル、ヘテロ環、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルキルオキシ、アリールオキシ、もしくはヘテロアリールオキシであり、あるいは式中、Ｚ２２およびＺ２３のいずれかは、一緒になって、３〜１０員環の脂環もしくはヘテロ環を形成する）
    である、請求項２５に記載の方法。
  28. 前記塩基が、Ｎ−シアノメチルピロリジンである、請求項２５に記載の方法。
  29. 前記非プロトン性有機溶媒が、無水である、請求項２３に記載の方法。
  30. 前記無水非プロトン性有機溶媒が、蒸留直後のものである、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記蒸留直後の無水非プロトン性有機溶媒が、ピリジンまたはアセトニトリルである、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記縮合中間体を式１の化合物に変換する工程が、前記縮合中間体をキャッピングする工程、および前記キャッピングされた縮合中間体を修飾して、式５：
    Figure 2012510460
     （式中、Ｒ１は、−ＮＲｄＲｄ、−Ｎ３、ハロゲン、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキル−Ｙ１−、アルケニル−Ｙ１−、アルキニル−Ｙ１−、アリール−Ｙ１−、ヘテロアリール−Ｙ１−、−Ｐ（Ｏ）（Ｒｅ）２、−ＨＰ（Ｏ）（Ｒｅ）、−ＯＲａ、または−ＳＲｃであり；
    Ｙ１は、Ｏ、ＮＲｄ、Ｓ、またはＳｅであり；
    Ｒａは、ブロッキング部分であり；
    Ｒｃは、ブロッキング基であり；
    Ｒｄの各例は、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アシル、置換シリル、カルバメート、−Ｐ（Ｏ）（Ｒｅ）２、または−ＨＰ（Ｏ）（Ｒｅ）であり；
    Ｒｅの各例は、独立して、アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、アルキル−Ｙ２−、アルケニル−Ｙ２−、アルキニル−Ｙ２−、アリール−Ｙ２−、またはヘテロアリール−Ｙ２−であり；
    Ｙ２は、Ｏ、ＮＲｄ、またはＳであり；
    Ｒ２の各例は、独立して、水素、−ＮＲｄＲｄ、−Ｎ３、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキル−Ｙ１−、アルケニル−Ｙ１−、アルキニル−Ｙ１−、アリール−Ｙ１−、ヘテロアリール−Ｙ１−、−ＯＲｂ、または−ＳＲｃであり、ここで、Ｒｂは、ブロッキング部分であり；
    Ｂａの各例は、独立して、ブロックされているかまたはブロックされていないアデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシルもしくは修飾核酸塩基であり；
    Ｊの各例は、Ｓ、Ｓｅ、またはＢＨ３であり；
    ｖは、２〜ｎ−１の整数であり；
    ＯＡは、固相支持体に接続された連結部分または核酸に接続された連結部分に接続されており；
    Ａは、アシル、アリール、アルキル、アラルキル、またはシリル部分であり；ならびに
    Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、およびＧ５は、独立して、水素、アルキル、アラルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、もしくはアリールであり、あるいはＧ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、およびＧ５のうちの２つはＧ６であって、一緒になって、単環式もしくは多環式の、縮合もしくは非縮合の、約２０個までの環原子の、飽和、部分不飽和もしくは不飽和の、炭素環またはヘテロ原子含有環を形成し、ならびに式中、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、およびＧ５のうち４つ以下がＧ６である）
    の化合物を生成する工程を含む、請求項１に記載の方法。
  33. 以下の工程：（ａ）前記式５の化合物のＲ１を脱ブロックして、式４の化合物（式中、ｍは、少なくとも１であり、ＪはＳ、Ｓｅ、またはＢＨ３であり、そしてＤは、式Ａの部分である）を生成する工程；（ｂ）請求項１０に記載の方法を使用して、式４の前記化合物を反応させる工程であって、ここで、前記縮合中間体を変換する工程は、前記縮合中間体をキャッピングする工程、および前記キャッピングされた縮合中間体を修飾して、式５の化合物（式中、ｖは、２より大きく、かつ約２００未満である）を生成する工程を含む工程；ならびに（ｃ）場合により、工程（ａ）および（ｂ）を反復して、式５の化合物（式中、ｖは、３より大きく、かつ約２００未満である）を形成する工程、
    をさらに含む、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記式５の化合物を前記式１の化合物（式中、各Ｂａ部分は、ブロックされておらず；Ｒ１は、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＲｄＲｄ、−Ｎ３、ハロゲン、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキル−Ｙ１−、アルケニル−Ｙ１−、アルキニル−Ｙ１−、アリール−Ｙ１−、ヘテロアリール−Ｙ１−、Ｐ（Ｏ）（Ｒｃ）２、−ＨＰ（Ｏ）（Ｒｃ）、−ＯＲａ、または−ＳＲｃであり；
    Ｙ１は、Ｏ、ＮＲｄ、Ｓ、またはＳｅであり；
    Ｒａは、ブロッキング部分であり；
    Ｒｃは、ブロッキング基であり；
    Ｒｄの各例は、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アシル、置換シリル、カルバメート、−Ｐ（Ｏ）（Ｒｅ）２、または−ＨＰ（Ｏ）（Ｒｅ）であり；
    Ｒｅの各例は、独立して、水素、アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、アルキル−Ｙ２−、アルケニル−Ｙ２−、アルキニル−Ｙ２−、アリール−Ｙ２−、またはヘテロアリール−Ｙ２−であり、あるいはＮａ＋１、Ｌｉ＋１、もしくはＫ＋１であるカチオンであり；
    Ｙ２は、Ｏ、ＮＲｄ、またはＳであり；
    Ｒ２の各例は、独立して、水素、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＲｄＲｄ、−Ｎ３、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキル−Ｙ１−、アルケニル−Ｙ１−、アルキニル−Ｙ１−、アリール−Ｙ１−、ヘテロアリール−Ｙ１−であり；
    Ｒ３はＨであり；
    Ｘの各例は、独立して、−Ｓ−Ｚ＋、−Ｓｅ−Ｚ＋、または−ＢＨ３−Ｚ＋であり；および
    Ｚ＋は、アンモニウムイオン、アルキルアンモニウムイオン、ヘテロ芳香族イミニウムイオン、またはヘテロ環イミニウムイオンであり、それらのうちいずれかは、第一級、第二級、第三級もしくは第四級であり、あるいはＺ＋は一価の金属イオンである）
    に変換する工程をさらに含む、請求項３２または３３に記載の方法。
  35. 前記縮合中間体を式１の化合物に変換する工程が、前記縮合中間体を酸性化して、式４の化合物（式中、ｍは少なくとも１であり、ＪはＯであり、そしてＤはＨである）を生成する工程を含む、請求項１に記載の方法。
  36. 前記縮合中間体が、式Ａ’：
    Figure 2012510460
     （式中、Ａは水素であり；ならびに
    式中、Ｇ１およびＧ２は、独立して、アルキル、アラルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリール、もしくはアリールであり、そしてＧ３、Ｇ４、およびＧ５は、独立して、水素、アルキル、アラルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、もしくはアリールであり、あるいはＧ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、およびＧ５のうちの２つはＧ６であって、一緒になって、単環式もしくは多環式の、縮合もしくは非縮合の、約２０個までの環原子の、飽和、部分不飽和もしくは不飽和の、炭素環またはヘテロ原子含有環を形成し、ならびに式中、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、およびＧ５のうち４つ以下がＧ６である）
    の部分を含む、請求項３５に記載の方法。
  37. （ａ）請求項１０に記載の方法を使用して、式４の前記化合物（式中、ｍは少なくとも１であり、ＪはＯであり、そしてＤはＨである）を反応させる工程であって、ここで、前記縮合中間体を式１の化合物に変換する工程が、前記縮合中間体を酸性化して、式４の化合物（式中、ｍは少なくとも２であり、かつ約２００未満であり；ＪはＯであり、そしてＤはＨである）を生成する工程を含む工程、ならびに（ｂ）場合により、工程（ａ）を反復して、式４の化合物（式中、ｍは２より大きく、かつ約２００未満である）を生成する工程、をさらに含む、請求項３５に記載の方法。
  38. 前記酸性化する工程が、前記縮合中間体からプリンもしくはピリミジン部分を除去せずに、前記縮合中間体を式４の前記化合物に変換するのに有効な量のブレンステッドまたはルイス酸を添加する工程を含む、請求項３５または３７に記載の方法。
  39. 前記酸性化する工程が、有機溶媒中１％トリフルオロ酢酸、有機溶媒中３％ジクロロ酢酸、または有機溶媒中３％トリクロロ酢酸を、添加する工程を含む、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記酸性化する工程が、カチオンスカベンジャーを添加する工程をさらに含む、請求項３５または３７に記載の方法。
  41. 前記カチオンスカベンジャーが、トリエチルシランまたはトリイソプロピルシランである、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記縮合中間体を式１の化合物に変換する工程が、前記縮合中間体を酸性化する工程に先立って、Ｒ１を脱ブロックする工程をさらに含む、請求項３５または３７に記載の方法。
  43. 前記式４の化合物を修飾して、Ｘ部分を導入し、それによって、式１の化合物（式中、Ｒ３は、ブロッキング基または固相支持体に接続された連結部分である）を生成する工程をさらに含む、請求項３５または３７に記載の方法。
  44. 請求項３５に記載の生成物を処理して、式１の化合物（式中、Ｒ１は、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＲｄＲｄ、−Ｎ３、ハロゲン、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキル−Ｙ１−、アルケニル−Ｙ１−、アルキニル−Ｙ１−、アリール−Ｙ１−、ヘテロアリール−Ｙ１−、−Ｐ（Ｏ）（Ｒｅ）２、−ＨＰ（Ｏ）（Ｒｅ）、−ＯＲａまたは−ＳＲｃであり；
    Ｙ１は、Ｏ、ＮＲｄ、Ｓ、またはＳｅであり；
    Ｒａは、ブロッキング部分であり；
    Ｒｃは、ブロッキング基であり；
    Ｒｄの各例は、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アシル、置換シリル、カルバメート、−Ｐ（Ｏ）（Ｒｅ）２、または−ＨＰ（Ｏ）（Ｒｅ）であり；
    Ｒｅの各例は、独立して、水素、アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、アルキル−Ｙ２−、アルケニル−Ｙ２−、アルキニル−Ｙ２−、アリール−Ｙ２−、またはヘテロアリール−Ｙ２−であり、あるいはＮａ＋１、Ｌｉ＋１、もしくはＫ＋１であるカチオンであり；
    Ｙ２は、Ｏ、ＮＲｄ、またはＳであり；
    Ｒ２の各例は、独立して、水素、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＲｄＲｄ、−Ｎ３、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキル−Ｙ１−、アルケニル−Ｙ１−、アルキニル−Ｙ１−、アリール−Ｙ１−、ヘテロアリール−Ｙ１−であり；
    各Ｂａ部分は、ブロックされておらず；
    Ｒ３はＨであり；
    Ｘの各例は、独立して、アルキル、アルコキシ、アリール、アルキルチオ、アシル、−ＮＲｆＲｆ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、アルケニルチオ、アルキニルチオ、−Ｓ−Ｚ＋、−Ｓｅ−Ｚ＋、または−ＢＨ３−Ｚ＋であり；
    Ｒｆの各例は、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、またはアリールであり；
    Ｚ＋は、アンモニウムイオン、アルキルアンモニウムイオン、ヘテロ芳香族イミニウムイオン、またはヘテロ環イミニウムイオンであって、それらのうちいずれかは、第一級、第二級、第三級もしくは第四級であり、あるいはＺ＋は一価の金属イオンであり；および
    ｎは、１より大きく、かつ約２００未満である）
    を生成する工程をさらに含む、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記修飾する工程が、ホウ素化剤、硫黄求電子剤、またはセレン求電子剤を使用して、実施される、請求項３２または３３に記載の方法。
  46. 前記硫黄求電子剤が、以下の式：
    Ｓ８（式Ｂ）、Ｚ２４−Ｓ−Ｓ−Ｚ２５、またはＺ２４−Ｓ−Ｘ−Ｚ２５、
    （式中、Ｚ２４およびＺ２５は、独立して、アルキル、アミノアルキル、シクロアルキル、ヘテロ環、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルキルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アシル、アミド、イミド、もしくはチオカルボニルでありか、あるいはＺ２４およびＺ２５は、一緒になって、置換されていても置換されていなくてもよい３〜８員環の脂環またはヘテロ環を形成し；
    Ｘは、ＳＯ２、Ｏ、またはＮＲｆであり；ならびにＲｆは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、またはアリールである）
    のうちの１つを有する化合物である、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記硫黄求電子剤が、式Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、またはＦ：
    Figure 2012510460
     の化合物である、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記セレン求電子剤が、以下の式：
    Ｓｅ（式Ｇ）、Ｚ２６−Ｓｅ−Ｓｅ−Ｚ２７、またはＺ２６−Ｓｅ−Ｘ−Ｚ２７、
    （式中、Ｚ２６およびＺ２７は、独立して、アルキル、アミノアルキル、シクロアルキル、ヘテロ環、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルキルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アシル、アミド、イミド、もしくはチオカルボニルであり、あるいはＺ２６およびＺ２７は、一緒になって、置換されていても置換されていなくてもよい３〜８員環の脂環またはヘテロ環を形成し；
    Ｘは、ＳＯ２、Ｏ、ＳまたはＮＲｆであり；およびＲｆは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、またはアリールである）
    のうちの１つを有する化合物である、請求項４５に記載の方法。
  49. 前記セレン求電子剤が、式Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、またはＬ
    Figure 2012510460
     の化合物である、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記ホウ素化剤が、ボラン−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＢＨ３・ＤＩＰＥＡ）、ボラン−ピリジン（ＢＨ３・Ｐｙ）、ボラン−２−クロロピリジン（ＢＨ３・ＣＰｙ）、ボラン−アニリン（ＢＨ３・Ａｎ）、ボラン−テトラヒドロフラン（ＢＨ３・ＴＨＦ）、またはボラン−ジメチルスルフィド（ＢＨ３・Ｍｅ２Ｓ）である、請求項４５に記載の方法。
  51. 前記修飾する工程が、シリル化試薬、続いて、硫黄求電子剤、セレン求電子剤、ホウ素化剤、アルキル化剤、アルデヒド、またはアシル化剤を使用して、実施される、請求項４３に記載の方法。
  52. 前記シリル化試薬が、クロロトリメチルシラン（ＴＭＳ−Ｃｌ）、トリイソプロピルシリルクロリド（ＴＩＰＳ−Ｃｌ）、ｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（ＴＢＤＭＳ−Ｃｌ）、ｔ−ブチルジフェニルシリルクロリド（ＴＢＤＰＳ−Ｃｌ）、１，１，１，３，３，３−ヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＳ）、Ｎ−トリメチルシリルジメチルアミン（ＴＭＳＤＭＡ）、Ｎ−トリメチルシリルジエチルアミン（ＴＭＳＤＥＡ）、Ｎ−トリメチルシリルアセトアミド（ＴＭＳＡ）、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（ＢＳＡ）、またはＮ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド（ＢＳＴＦＡ）である、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記硫黄求電子剤が、以下の式：
    Ｓ８（式Ｂ）、Ｚ２４−Ｓ−Ｓ−Ｚ２５、またはＺ２４−Ｓ−Ｘ−Ｚ２５、
    （式中、Ｚ２４およびＺ２５は、独立して、アルキル、アミノアルキル、シクロアルキル、ヘテロ環、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルキルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アシル、アミド、イミド、もしくはチオカルボニルであり、あるいはＺ２４およびＺ２５は、一緒になって、置換されていても置換されていなくてもよい３〜８員環の脂環またはヘテロ環を形成し；
    Ｘは、ＳＯ２、Ｏ、またはＮＲｆであり；ならびにＲｆは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、またはアリールである）
    のうちの１つを有する化合物である、請求項５１に記載の方法。
  54. 前記硫黄求電子剤が、式Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、またはＦ：
    Figure 2012510460
     の化合物である、請求項５３に記載の方法。
  55. 前記セレン求電子剤が、以下の式：
    Ｓｅ（式Ｇ）、Ｚ２６−Ｓｅ−Ｓｅ−Ｚ２７、またはＺ２６−Ｓｅ−Ｘ−Ｚ２７、
    （式中、Ｚ２６およびＺ２７は、独立して、アルキル、アミノアルキル、シクロアルキル、ヘテロ環、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルキルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アシル、アミド、イミド、もしくはチオカルボニルであり、あるいはＺ２６およびＺ２７は、一緒になって、置換されていても置換されていなくてもよい３〜８員環の脂環またはヘテロ環を形成し；
    Ｘは、ＳＯ２、Ｓ、Ｏ、またはＮＲｆであり；ならびにＲｆは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、またはアリールである）
    のうちの１つを有する化合物である、請求項５１に記載の方法。
  56. 前記セレン求電子剤が、式Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、またはＬ
    Figure 2012510460
     の化合物である、請求項５１に記載の方法。
  57. 前記ホウ素化剤が、ボラン−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＢＨ３・ＤＩＰＥＡ）、ボラン−ピリジン（ＢＨ３・Ｐｙ）、ボラン−２−クロロピリジン（ＢＨ３・ＣＰｙ）、ボラン−アニリン（ＢＨ３・Ａｎ）、ボラン−テトラヒドロフラン（ＢＨ３・ＴＨＦ）、またはボラン−ジメチルスルフィド（ＢＨ３・Ｍｅ２Ｓ）である、請求項５１に記載の方法。
  58. 前記アルキル化剤が、アルキルハライド、アルケニルハライド、アルキニルハライド、アルキルスルホネート、アルケニルスルホネート、またはアルキニルスルホネートである、請求項５１に記載の方法。
  59. 前記アルデヒドが、（パラ）−ホルムアルデヒド、アルキルアルデヒド、アルケニルアルデヒド、アルキニルアルデヒド、またはアリールアルデヒドである、請求項５１に記載の方法。
  60. 前記アシル化剤が、式ＭまたはＮ：
    Figure 2012510460
     （式中、Ｇ７は、アルキル、シクロアルキル、ヘテロ環、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルキルオキシ、アリールオキシ、またはヘテロアリールオキシであり；および
    Ｍは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール、イミダゾール、アルキルトリアゾール、テトラゾール、ペンタフルオロベンゼン、または１−ヒドロキシベンゾトリアゾールである）
    の化合物である、請求項５１に記載の方法。
  61. 前記修飾する工程が、ハロゲン化試薬と反応させる工程、続いて、求核剤と反応させる工程によって実施される、請求項４３に記載の方法。
  62. 前記ハロゲン化試薬が、ＣＣｌ４、ＣＢｒ４、Ｃｌ２、Ｂｒ２、Ｉ２、塩化スルフリル（ＳＯ２Ｃｌ２）、ホスゲン、ビス（トリクロロメチル）カルボネート（ＢＴＣ）、一塩化硫黄、二塩化硫黄、クロラミン、ＣｕＣｌ２、Ｎ−クロロスクシンイミド（ＮＣＳ）、ＣＩ４、Ｎ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）、またはＮ−ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ）である、請求項６１に記載の方法。
  63. 前記求核剤が、ＮＲｆＲｆＨ、ＲｆＯＨ、またはＲｆＳＨであり、ここで、Ｒｆは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、またはアリールであり、そしてＮＲｆＲｆＨのＲｆのうち少なくとも１つは水素ではない、請求項６１に記載の方法。
  64. 前記キラル試薬が、前記式３の化合物（式中、Ｗ１はＮＨＧ５であり、そしてＷ２はＯである）である、請求項１０に記載の方法。
  65. 前記キラル試薬が、式Ｏまたは式Ｐ：
    Figure 2012510460
     である、請求項１０に記載の方法。
  66. 前記キラル試薬が、式Ｑまたは式Ｒ：
    Figure 2012510460
     である、請求項１０に記載の方法。
  67. Ｒａが、置換もしくは非置換のトリチルまたは置換シリルである、請求項３、８、３２、または３４に記載の方法。
  68. Ｒａが、置換もしくは非置換のトリチルまたは置換シリルである、請求項４４に記載の方法。
  69. Ｒｂが、置換もしくは非置換のトリチル、置換シリル、アセチル、アシル、または置換メチルエーテルである、請求項３、８、１１、または３２に記載の方法。
  70. Ｒ３が、置換トリチル、アシル、置換シリル、または置換ベンジルであるブロッキング基である、請求項３に記載の方法。
  71. Ｒ３が、固相支持体に接続された連結部分である、請求項３に記載の方法。
  72. 前記Ｂａ部分のブロッキング基が、ベンジル、アシル、ホルミル、ジアルキルホルムアミジニル、イソブチリル、フェノキシアセチル、またはトリチル部分であり、それらのうちいずれかは、置換されなくてもよく、もしくは置換されてもよい、請求項３、８、１１、または３２に記載の方法。
  73. Ｒ１が、−Ｎ３、−ＮＲｄＲｄ、アルキニルオキシ、または−ＯＨである、請求項３、８、または３４に記載の方法。
  74. Ｒ１が、−Ｎ３、−ＮＲｄＲｄ、アルキニルオキシ、または−ＯＨである、請求項４３に記載の方法。
  75. Ｒ２が、−ＮＲｄＲｄ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキル−Ｙ１−、アルケニル−Ｙ１−、アルキニル−Ｙ１−、アリール−Ｙ１−、ヘテロアリール−Ｙ１であり、そして蛍光部分または生体分子結合部分によって置換される、請求項３、８、１１、３２、または３４に記載の方法。
  76. Ｒ２が、−ＮＲｄＲｄ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキル−Ｙ１−、アルケニル−Ｙ１−、アルキニル−Ｙ１−、アリール−Ｙ１−、ヘテロアリール−Ｙ１であり、そして蛍光部分または生体分子結合部分により置換される、請求項４３に記載の方法。
  77. 前記Ｒ２上の置換基が、蛍光部分である、請求項７５に記載の方法。
  78. 前記Ｒ２上の置換基が、ビオチンまたはアビジンである、請求項７５に記載の方法。
  79. 前記Ｒ２上の置換基が、蛍光部分である、請求項７６に記載の方法。
  80. 前記Ｒ２上の置換基が、ビオチンまたはアビジンである、請求項７６に記載の方法。
  81. Ｒ２が、−ＯＨ、−Ｎ３、水素、ハロゲン、アルコキシ、またはアルキニルオキシである、請求項３、８、１１、３２、３４、または４３に記載の方法。
  82. Ｒ２が、−ＯＨ、−Ｎ３、水素、ハロゲン、アルコキシ、またはアルキニルオキシである、請求項３、８、１１、３２、または３４のいずれか一項に記載の方法。
  83. Ｂａが、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、または２，６−ジアミノプリンである、請求項４３に記載の方法。
  84. Ｂａが、蛍光部分または生体分子結合部分による置換によって修飾される、請求項３、８、１１、３２、または３４に記載の方法。
  85. Ｂａが、蛍光部分または生体分子結合部分による置換によって修飾される、請求項４３に記載の方法。
  86. 前記Ｂａ上の置換基が、蛍光部分である、請求項８４に記載の方法。
  87. 前記Ｂａ上の置換基が、ビオチンまたはアビジンである、請求項８４に記載の方法。
  88. 前記Ｂａ上の置換基が、蛍光部分である、請求項８５に記載の方法。
  89. 前記Ｂａ上の置換基が、ビオチンまたはアビジンである、請求項８５に記載の方法。
  90. Ｚが、ピリジニウムイオン、トリエチルアンモニウムイオン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアンモニウムイオン、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウムイオン、ナトリウムイオン、またはカリウムイオンである、請求項３、８、または３４に記載の方法。
  91. Ｚが、ピリジニウムイオン、トリエチルアンモニウムイオン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアンモニウムイオン、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エニウムイオン、ナトリウムイオン、またはカリウムイオンである、請求項４３に記載の方法。
  92. Ｘが、アルキル、アルコキシ、−ＮＲｆＲｆ、−Ｓ−Ｚ＋、または−ＢＨ３−Ｚ＋である、請求項３または３４に記載の方法。
  93. Ｘが、アルキル、アルコキシ、−ＮＲｆＲｆ、−Ｓ−Ｚ＋、または−ＢＨ３−Ｚ＋である、請求項４３に記載の方法。
  94. 前記硫黄求電子剤が、式Ｆ、式Ｅまたは式Ｂである、請求項４７に記載の方法。
  95. 前記硫黄求電子剤が、式Ｆ、式Ｅまたは式Ｂである、請求項５４に記載の方法。
  96. 前記セレン求電子剤が、式Ｇまたは式Ｊである、請求項４９に記載の方法。
  97. 前記セレン求電子剤が、式Ｇまたは式Ｊである、請求項５６に記載の方法。
  98. 前記ホウ素化剤が、ボラン−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＢＨ３・ＤＩＰＥＡ）、ボラン−２−クロロピリジン（ＢＨ３・ＣＰｙ）、ボラン−テトラヒドロフラン（ＢＨ３・ＴＨＦ）、またはボラン−ジメチルスルフィド（ＢＨ３・Ｍｅ２Ｓ）である、請求項５０または５７に記載の方法。
  99. 前記ハロゲン化剤が、ＣＣｌ４、ＣＢｒ４、Ｃｌ２、塩化スルフリル（ＳＯ２Ｃｌ２）、またはＮ−クロロスクシンイミド（ＮＣＳ）である、請求項６２に記載の方法。
  100. 前記縮合試薬が、ビス（トリクロロメチル）カルボネート（ＢＴＣ）、（ＰｈＯ）３ＰＣｌ２、Ｐｈ３ＰＣｌ２、またはＮ，Ｎ−ビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）ホスフィン酸クロリド（ＢｏｐＣｌ）である、請求項１６に記載の方法。
  101. サンプル中の標的分子を同定または検出する方法であって、標的分子を含有することが疑わしいサンプルと、請求項３に記載の核酸センサー分子とを接触させる工程を含み、ここで、シグナル発生ユニットによって発生するシグナルの変化が前記サンプル中の前記標的の存在を示す方法。
  102. 前記シグナル発生ユニットによって発生するシグナルの変化を定量して、前記サンプル中の標的分子の量を定量する工程をさらに含む、請求項１０１に記載の方法。
  103. 前記シグナル発生ユニットが、蛍光、表面プラズモン共鳴、蛍光消光、化学発光、干渉計測、または屈折率検出を検出する、請求項１０１に記載の方法。
  104. 前記サンプルが、環境サンプル、バイオハザード材料、有機サンプル、薬物、毒素、フレーバー、香料、または生物学的サンプルである、請求項１０１に記載の方法。
  105. 前記サンプルが、細胞、細胞抽出物、細胞溶解物、組織、組織抽出物、体液、血清、血液、または血液産物である生物学的サンプルである、請求項１０１に記載の方法。
  106. 前記核酸センサー分子が、前記標的分子に特異的に結合する、請求項１０１に記載の方法。
  107. 前記標的分子の存在が、病的状態の存在を示す、請求項１０１に記載の方法。
  108. （ａ）目的のコンセンサス配列に相補的な一定のヌクレオチド配列のある領域を有する複数の第１のＰＣＲプライマーを提供する工程；（ｂ）複数の第２のＰＣＲプライマーを提供する工程、（ｃ）前記第１のプライマーおよび前記第２のプライマーによってフランキングされる核酸領域が特異的に増幅されるように、複数の第１のプライマーのサブセットが、実質的にそれが鋳型のどこで生じようとも前記目的のコンセンサス配列に結合し、そして複数の第２のプライマーのサブセットが、前記第１のプライマーから隔たった場所で前記鋳型に結合するという条件下で、複数の第１のＰＣＲプライマーおよび複数の第２のＰＣＲプライマーを使用する前記ＰＣＲを介して、核酸鋳型を増幅する工程であって、複数の第１のＰＣＲプライマーおよび／または複数の第２のＰＣＴプライマーが請求項３に記載の核酸分子である工程、
    を含む、核酸鋳型から核酸の所望の領域を増幅する方法。
  109. 前記鋳型がゲノムＤＮＡである、請求項１０８に記載の方法。
  110. 前記鋳型が真核生物のゲノムＤＮＡである、請求項１０８に記載の方法。
  111. 前記鋳型がヒトのゲノムＤＮＡである、請求項１０８に記載の方法。
  112. 前記鋳型が原核生物のＤＮＡである、請求項１０８に記載の方法。
  113. 前記鋳型が、クローニングされたゲノムＤＮＡ、ＤＮＡのサブゲノム領域、染色体、またはサブ染色体領域であるＤＮＡである、請求項１０８に記載の方法。
  114. 前記鋳型がＲＮＡである、請求項１０８に記載の方法。
  115. 前記縮合中間体を式１の化合物に変換する工程が、前記縮合中間体を修飾して、式５：
    Figure 2012510460
     （式中、Ｒ１は、−ＮＲｄＲｄ、−Ｎ３、ハロゲン、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキル−Ｙ１−、アルケニル−Ｙ１−、アルキニル−Ｙ１−、アリール−Ｙ１−、ヘテロアリール−Ｙ１−、−Ｐ（Ｏ）（Ｒｅ）２、−ＨＰ（Ｏ）（Ｒｅ）、−ＯＲａ、または−ＳＲｃであり；
    Ｙ１は、Ｏ、ＮＲｄ、Ｓ、またはＳｅであり；
    Ｒａは、ブロッキング部分であり；
    Ｒcは、ブロッキング基であり；
    Ｒｄの各例は、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アシル、置換シリル、カルバメート、−Ｐ（Ｏ）（Ｒｅ）２、または−ＨＰ（Ｏ）（Ｒｅ）であり；
    Ｒｅの各例は、独立して、アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、アルキル−Ｙ２−、アルケニル−Ｙ２−、アルキニル−Ｙ２−、アリール−Ｙ２−、またはヘテロアリール−Ｙ２−であり；
    Ｙ２は、Ｏ、ＮＲｄ、またはＳであり；
    Ｒ２の各例は、独立して、水素、−ＮＲｄＲｄ、−Ｎ３、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキル−Ｙ１−、アルケニル−Ｙ１−、アルキニル−Ｙ１−、アリール−Ｙ１−、ヘテロアリール−Ｙ１−、−ＯＲｂ、または−ＳＲｃであり、ここで、Ｒｂは、ブロッキング部分であり；
    Ｂａの各例は、独立して、ブロックされているかまたはブロックされていないアデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシルもしくは修飾核酸塩基であり；
    Ｊの各例は、Ｓ、Ｓｅ、またはＢＨ３であり；
    ｖは、整数１であり；
    ＯＡは、固相支持体に接続された連結部分または核酸に接続された連結部分に接続されており；
    Ａは、アシル、アリール、アルキル、アラルキル、またはシリル部分であり；ならびに
    Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、およびＧ５は、独立して、水素、アルキル、アラルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、もしくはアリールであり、あるいはＧ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、およびＧ５のうちの２つはＧ６であって、一緒になって、単環式もしくは多環式の、縮合もしくは非縮合の、約２０個までの環原子の、飽和、部分不飽和もしくは不飽和の、炭素環またはヘテロ原子含有環を形成し、ならびに式中、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、およびＧ５のうち４つ以下がＧ６である）
    の化合物を生成する工程を含む、請求項１に記載の方法。
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