JP2005089441A

JP2005089441A - 立体規則性の高いリン原子修飾ヌクレオチド類縁体の製造法

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Publication number: JP2005089441A
Application number: JP2004089150A
Authority: JP
Inventors: Kazuhiko Saigo; 和彦西郷; Takeshi Wada; 猛和田
Original assignee: Todai TLO Ltd
Current assignee: Todai TLO Ltd
Priority date: 2003-08-08
Filing date: 2004-03-25
Publication date: 2005-04-07
Also published as: WO2005014609A2; WO2005014609A3

Abstract

【課題】リン原子上の立体を制御した立体規則性の高いリン原子修飾ヌクレオチドの効率的な製造法の提供。
【解決手段】光学活性なヌクレオシド３’−ホスホロアミダイトと、ヌクレオシドとを、活性化剤を用いて縮合した後、求電子試薬との反応及び脱保護を行うことを特徴とする、一般式（４）又は（５）で表される立体規則性の高いリン原子修飾ヌクレオチド類縁体の製造法。
【化４】

【選択図】なし

Description

本発明は、立体規則性の高いリン原子修飾ヌクレオチド類縁体の製造法に関し、更に詳しくは、立体制御された光学純度の高いリン原子修飾ヌクレオチド類縁体の製造法に関するものである。

近年、遺伝子治療の分野で注目されている手法の一つに、アンチセンス法がある。アンチセンス法とは、ｍRNAに対して、相補的な塩基配列をもつアンチセンス分子を細胞内に導入し、標的のｍRNAに選択的に二重鎖を形成させることにより、翻訳を阻害し、標的とする蛋白質の合成を制御する方法である。

アンチセンス分子が生体内で有効に機能するためには、
（１）相補的なRNAに対して塩基配列特異的に結合する、
（２）相補的なRNAとの間で形成する二重鎖が安定である、
（３）相補的なRNAとの間で形成する二重鎖がRNaseHの基質となる、
（４）化学的、生化学的に安定である、
（５）高い細胞膜透過性を有している、
といった性質が求められる。これらの性質を具備するものとして、ホスホロチオエートRNA（例えば非特許文献１参照）が挙げられる。しかし、ホスホロチオエートRNAは、蛋白質と非特異的に相互作用するという問題点を有する。

一方、数あるホスフェートの中でも、特にボラノホスフェートDNAは、
（１）相補的なRNAに対して塩基配列特異的に結合する、
（２）相補的なRNAとの間で形成する二重鎖がRNaseHの基質となる、
（３）ヌクレアーゼに対する耐性が高い、
（４）塩基性条件下又は酸性条件下で安定である、
（５）天然型DNAよりも脂溶性が高いため、高い細胞膜透過性が期待できる、
といった特徴を有し、アンチセンス核酸としての応用が期待されている。

リン酸ジエステル結合に修飾を施したボラノホスフェートDNAは、リン原子上に不斉点が存在するため、その立体規則性の違いにより、異なる物性値や生化学的性質を持つと考えられる。そのため、立体規則性の高いボラノホスフェートDNAの製造法が必要である。

現在知られている製造法としては、ホスホロアミダイド法を利用する方法（例えば非特許文献２参照）と、H−ホスホネート法を利用する方法（例えば非特許文献３参照）がある。

非特許文献２の方法は、キラルなインドール−オキサザホスホリン中間体を不斉補助基として使用し、立体選択的に３価のホスファイト中間体を合成した後、ボラノ化を行なう方法である。

非特許文献３の方法は、ジアステレオマー混合物のＨ−ホスホネートをシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって立体化学的に純粋なジアステレオマーを分離し、Rp体とSp体のそれぞれに対して、in situでシリル化を行ない、３価のホスファイトを経由し、ボラノ化を行なうという方法である。この方法によって、ジアステレオマー比９８：２でボラノホスフェートDNAの合成が可能である。
Cohen, J. S. In Antisense Research and Application; Crooke, S. T.; Lebleu, B., Ed,;CRC Press Inc.: Boca Raton, 1993, 205 - 221 Jin, Y.; Just, G. Tetrahedron Lett., 1998, 39, 6433-6436 Surgueeva, Z. A.; Sergueev, D. S.; Shaw, B. R. Tetrahedron Lett. 1999, 40, 2041 - 2044

非特許文献２の方法では、ボラノ化を行なう前の３価のホスファイトの段階でジアステレオマー比が９４：６になっており、ボラノ化後のジアステレオマー比は９０：１０にとどまっている。

非特許文献３の方法では、P−キラルなＨ−ホスホネートを得ることができるのは二量体までであるため、この方法は固相法によるオリゴマーの合成には適さない。

本発明は、リン原子上の立体を制御した立体規則性の高いリン原子修飾ヌクレオチドの効率的な製造法を提供することを課題とする。

本発明は、課題の解決手段として、一般式（１）で表される光学活性なヌクレオシド３’−ホスホロアミダイトと、一般式（２）で表されるヌクレオシドとを、一般式（３）で表される活性化剤を用いて縮合した後、求電子試薬との反応及び脱保護を行うことを特徴とする、一般式（４）又は（５）で表される立体規則性の高いリン原子修飾ヌクレオチド類縁体の製造法を提供するものである。

［一般式（１）中の記号の意味は下記のとおり。

Ｒ¹及びＲ²は同一又は異なって、水素原子、炭素数１〜３の直鎖若しくは分岐アルキル基、又は炭素数６〜１４のアリール基を示す。

Ｒ³は炭素数１〜３の直鎖又は分岐アルキル基を示す。

Ｒ²とＲ³は窒素原子と窒素原子に隣接する炭素原子と共に炭素数３〜１６の環状構造を形成しても良い。

Ｒ⁴は水酸基の保護基を示す。

Ｂｓは式：

で表されるチミン、アデニン、シトシン、グアニンあるいはそれらから誘導される基を示す。］

［一般式（２）中、Ｒ⁵は水酸基の保護基、Ｂｓは前記と同じ意味を示す。

一般式（３）中の記号の意味は下記のとおり。

Ｘ^-はＢＦ₄ ^-、ＰＦ₆ ^-、ＴｆＯ^-（ＴｆはＣＦ₃ＳＯ₂を表す。以下同じ。）、Ｔｆ₂Ｎ^-、ＡｓＦ₆ ^-又はＳｂＦ₆ ^-を示す。

Ｒ⁶及びＲ⁷は同一又は異なって、水素原子、炭素数１〜５の直鎖若しくは分岐アルキル基、又は炭素数６〜１４のアリール基を示す。

Ｒ⁶及びＲ⁷は窒素原子と共に炭素数３〜７のモノシクロ又はビシクロ構造を形成しても良い。］

［一般式（４）及び一般式（５）中の記号の意味は下記のとおり。

Ｙは炭素数１〜３の直鎖又は分岐鎖のアルキル基、炭素数１〜３の直鎖又は分岐鎖のヒドロキシアルキル基、炭素数６〜１４のアリール基、炭素数１〜５のアルキルチオ基、炭素数１~５のアシル基、又はY＝Y’Z⁺を示す（Y’はＳｅ^-、ＢＨ₃ ^-を、Z⁺はアンモニウムイオン、第１級〜第４級の低級アルキルアンモニウムイオン又は1価金属イオンを示す）。

Ｂｓは前記と同じ意味を示し、各式中の２個のＢｓは同一でも異なっていても良い。］

本発明によれば、アンチセンス分子として有効な立体規則性の高いリン原子修飾ヌクレオチド類縁体及びそのオリゴマーを高い収率で得ることができる。

以下、本発明の製造法を、縮合反応（第１反応工程）と、求電子試薬との反応及び脱保護反応（第２反応工程）に分けて説明する。第１及び第２の分け方は説明の便宜のためだけのものであり、これに限定されるものではなく、また必要に応じて精製処理等の公知の処理工程を付加することもできる。

〔第１反応工程〕
一般式（１）で表される光学活性なヌクレオシド３’−ホスホロアミダイトと、一般式（２）で表されるヌクレオシド〔以下「ヌクレオシド（２）」という〕とを、一般式（３）で表される活性化剤〔以下「活性化剤（３）」という〕の存在下で縮合反応させる。

一般式（１）で表される光学活性なヌクレオシド３’−ホスホロアミダイトは、下記のとおり、適当な１，２−アミノアルコールから公知の方法で合成することができる（例えばTetrahedron：Asymmetry, 1995, 6, 1051-1054参照）。

即ち、一般式（６）で表される光学活性な１，２−アミノアルコール〔以下「アミノアルコール（６）」という〕と、三塩化リンを反応させて得られる一般式（７）で表される光学活性なホスフィチル化剤〔以下「ホスフィチル化剤（７）」という〕と、一般式（８）で表されるヌクレオシドを反応させて得ることができる。

［式中、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴及びＢｓは、一般式（１）と同じ意味を示す。」
アミノアルコール（６）としては、（Ｓ）−及び（Ｒ）−２−メチルアミノ−１−フェニルエタノール、（１Ｒ，２Ｓ）−エフェドリン、（１Ｒ，２Ｓ）−２−メチルアミノ−１，２−ジフェニルエタノール等が挙げられる。

ヌクレオシド（８）において、Ｂｓはチミン、アデニン、シトシン又はグアニンあるいはそれらから誘導される基を示すが、具体的には、アデニン、シトシン及びグアニンのアミノ基を保護基で保護したもの等が挙げられ、更に具体的には、下記一般式で表される化合物が挙げられる。

［式中、Ｒ⁸は炭素数１〜１５の直鎖又は分岐鎖のアルキル基、アリール基、アラルキル基、アリールオキシアルキル基を示し、中でもメチル基、イソプロピル基、フェニル基、ベンジル基、フェノキシメチル基が好ましく、特にフェニル基が好ましい。また、Ｒ⁹及びＲ¹⁰は、それぞれ炭素数１〜４の直鎖又は分岐鎖のアルキル基を示し、特にメチル基が好ましい。］
ヌクレオシド（８）は、チミジン、アデノシン、シチジン、グアノシン又はそれらの誘導体の５位の水酸基を、tert−ブチルジフェニルシリル基（ＴＢＤＰＳ）、tert−ブチルジメチルシリル基（ＴＢＤＭＳ）、４，４’−ジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ）、４−メトキシトリチル基（ＭＭＴｒ）等の保護基で保護したものである。

上記のような方法で得られた一般式（１）で表される光学活性なヌクレオシド３’−ホスホロアミダイトにおいて、Ｒ¹及びＲ²としては、Ｒ¹及びＲ²のいずれか一方が水素原子で他方がフェニル基、Ｒ¹及びＲ²のいずれか一方がメチル基で他方がフェニル基、あるいはＲ¹及びＲ²が共にフェニル基の組合わせが好ましく、Ｒ¹がフェニル基、Ｒ²が水素原子の組合わせが更に好ましい。Ｒ³はメチル基が好ましい。Ｒ⁴はＴＢＤＰＳ、ＴＢＤＭＳが好ましく、ＴＢＤＰＳが更に好ましい。

ヌクレオシド（２）は、チミジン、アデノシン、シチジン、グアノシン又はそれらの誘導体の３位の水酸基を保護したものであり、Ｂｓで示されるチミン、アデニン、シトシン、グアニン又はそれらの誘導体から誘導される基は、ヌクレオシド（８）で例示したものが挙げられる。ヌクレオシド（２）とヌクレオシド（８）のＢｓは同一でも異なっていても良い。Ｒ⁵で示される水酸基の保護基としては、ＴＢＤＰＳ、ＴＢＤＭＳ，アセチル基（Ａｃ）、ベンジル基（Ｂｚ）、ＤＭＴｒ、ＭＭＴｒ等が挙げられ、ＴＢＤＭＳが好ましい。

活性化剤（３）は、一般式（１）で表される光学活性なヌクレオシド３’−ホスホロアミダイトの窒素原子に対するプロトン供給能力を有し、求核試薬としては働かないものである。

活性化剤（３）中、Ｘ^-はＢＦ₄ ^-、ＰＦ₆ ^-、ＴｆＯ^-、Ｔｆ₂Ｎ^-が好ましい。Ｒ⁶及びＲ⁷は窒素原子と共に炭素数３〜７のモノシクロ又はビシクロ構造を形成しても良く、中でも炭素数４又は５のモノシクロ又はビシクロ構造が好ましい。

活性化剤（３）は、式（11）で表されるアミンと、式（12）で表される化合物とを反応させることにより、容易に得ることができる。

［一般式（11）中、R⁶及びR⁷は前記と同じ意味を示し、一般式（12）中、Ｘ^-は一般式（３）と同じ意味を示す。］
活性化剤（３）は、特にアセトニトリルに良い溶解性を示すので、一般式（１）で表される光学活性なヌクレオシド３’−ホスホロアミダイトとヌクレオシド（２）との反応は、アセトニトリル等の溶媒中で行うことが好ましい。

一般式（１）で表される光学活性なヌクレオシド３’−ホスホロアミダイトとヌクレオシド（２）は、一般式（１）で表されるホスホロアミダイトに対し、ヌクレオシド（２）を０．５〜２．０当量倍で反応させることが好ましく、０．５〜１．２当量倍の割合で反応させることがより好ましい。反応温度は０〜４０℃が好ましい。反応圧力は１気圧が好ましい。

以上の第１反応工程により、下記の一般式（10）で表されるホスファイト〔以下「ホスファイト（10）」という〕を得ることができる。

［一般式（10）中、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵及びＢｓは一般式（１）、（２）と同じ意味を示す。］
〔第２反応工程〕
まず、第１反応工程で得られたホスファイト（10）を無水酢酸等でＮ−アセチル化した後、求電子剤と反応させて、下記の一般式（13）で表される化合物〔以下「化合物（13）」という〕を得る。

［一般式（13）中、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｂｓは一般式（１）、（２）と同じ意味を示し、Ｙは炭素数１〜３の直鎖又は分岐鎖のアルキル基、炭素数１〜３の直鎖又は分岐鎖のヒドロキシアルキル基、炭素数６〜１４のアリール基、アルキルチオ基、アシル基、又はY＝Y’Z⁺を示し、Y’はＳｅ^-、ＢＨ₃ ^-を、Z⁺はアンモニウムイオン、第１級〜第４級の低級アルキルアンモニウムイオン又は1価金属イオンを示し、Ｒ¹¹は水素原子又は窒素原子の保護基を示す。］
Ｒ¹¹で示される窒素原子の保護基としては、アセチル基（Ａｃ）、ベンジル基（Ｂｚ）、トリメチルシリル基等が挙げられ、トリメチルシリル基が好ましいが、保護基が導入されていなくても良い。

求電子剤としては、ＢＨ₃・ＴＨＦ、ＢＨ₃・（ＣＨ₃）₂Ｓ等のホウ素化剤、ジスルフィド、ＣＨ₃Ｉ等のアルキル化剤、ＣＨ₂＝Ｏ等のアルデヒド、酸クロリド又はセレン等が挙げられる。

次に、リン酸修飾後、化合物（１３）のキラル補助物質を１，８−ジアザビシクロ［５，４，０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）等で処理して除き、一般式（14）で表される保護されたジヌクレオチドホスフェート誘導体を得る。

［一般式（14）中、Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｂｓ及びＹは一般式（１）、（２）と同じ意味を示す。］
最後に、水酸基の保護基を、（ＣＨ₃ＣＨ₂）₃Ｎ・３ＨＦ等で除くことにより、一般式（４）又は一般式（５）で表される立体規則性の高いリン原子修飾ヌクレオチド類縁体を効率的に得ることができる。

また、本発明においては、上記した第１反応工程と第２反応工程を繰り返すことにより、一般式（９）で表されるオリゴマー〔以下「オリゴマー（９）」という〕を製造することができる。

［式中、Ｙ及びＢｓは一般式（１）、（４）、（５）と同じ意味を示し、ｎは１〜１５０の整数（但し、１は含まない）を示す。構成単位中の２個のＢｓは同一でも異なっていても良い。］
オリゴマー（９）の製造は、溶液中で行っても固相上で行っても良い。固相上で行う場合は、有機高分子系担体又は無機高分子担体をベースポリマーとして用いる。有機高分子系担体としては、ポリスチレン、ポリエチレングリコール−ポリスチレングラフト重合体が挙げられ、アミノメチルポリスチレンが好ましい。無機高分子担体としては、シシカゲル担体であるコントロールドポリグラス（ＣＰＧ）が挙げられ、アミノプロピルＣＰＧが好ましい。また、リンカー部分としては、サクリネートリンカー（−ＣＯ−ＣＨ₂―ＣＨ₂―ＣＯ−）、オキサリルリンカー（−ＣＯ−ＣＯ−）が挙げられる。リンカー部分とヌクレオチドとは、エステル結合を介して結合していることが好ましい。

一般式（９）におけるｎは１〜１５０の整数を示し、好ましいｎの範囲は１０〜１００であり、より好ましい範囲は１０〜５０、更に好ましい範囲は１５〜３０である。

本発明の製造法により得られる立体規則性の高いリン原子修飾ヌクレオチド類縁体は、遺伝子治療の分野で注目されている手法の一つであるアンチセンス法に使用することができる。

本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

製造例１〔N−シアノメチルピロリジウムトリフルオロメタンスルホネートの製造；活性化剤（3）の製造〕
N―シアノメチルピロリジン０．５５１ｇ（５．００ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（５．００ｍｌ）溶液を０℃に冷却し、攪拌しつつトリフルオロメタンスルホン酸０．４４２ｍｌ（５．００ｍｍｏｌ）を滴下した後、エチルエーテル（１０ｍｌ）を加えた。

生じた固体を吸引ろ過によって集め、エチルエーテル（１ｍｌ×３回）で洗浄した後、減圧下で乾燥し白色粉末状の目的物１１．１ｇ（４．２７ｍｍｏｌ、収率８５％）を得た。
・ＩＲ（ＫＢｒ）ν_max：2996, 2841, 2651, 2477, 2347, 2282, 1637, 1462, 1437, 1269, 1228, 1168, 1033, 985, 911, 849, 761, 641 cm^-1
・¹Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ₃ＣＮ）δ：8.16(br,1H), 4.30(s,2H), 3.50(br,4H), 2.14〜2.09(m,4H)
・¹³Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤ₃ＣＮ）δ：121.2(q,¹J_CF=320Hz), 55.9, 42.0, 23.5
製造例２〔（５Ｒ）−２−クロロ−３−メチル−５−フェニル−１，３，２−オキサアザホスホリジンの製造；ホスフィチル化剤（7）の製造〕
（Ｒ）−２−メチルアミノ−１−フェニルエタノール〔アミノアルコール（6）〕２．２７ｇ（１５．０ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン５．５８ｍｌ（４０．０ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（２０．０ｍｌ）溶液を、０℃に冷却した三塩化リン１．７５ｍｌ（２０．０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２０．０ｍｌ）溶液に対して、攪拌しつつ滴下し、温度を室温にして３０分間攪拌した。

生じた塩をグラスフィルターでアルゴン雰囲気下ろ過し、ＴＨＦ（１ｍｌ×３回）で洗浄した。ろ液を濃縮し、残渣を減圧下で蒸留することにより、無色透明液体の目的物２．５９ｇ（１２．０ｍｍｏｌ、収率６０％）を得た。
・¹Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ：7.08〜7.05(m,6H), 6.91〜6.81 (m,4H), 6.15(br,4H),6.15(d,J=8.3Hz,1H),4.64(dd,J_HH=8.3Hz,³J_HP=4.2Hz,1H),2.64(d,³J_HP=15.3Hz,3H)
・³¹Ｐ−ＮＭＲ（１２１ＭＨｚ,ＣＤＣｌ₃）δ：171.7
製造例３〔（２Ｒ,５Ｒ）−２−（５’−Ｏ−tert−ブチルジフェニルシリルチミジン−３’−イル）−３−メチル−５−フェニル−１，３，２−オキサアザホスホリジンの製造；一般式（1）の化合物の製造〕
５’−Ｏ−tert−ブチルジフェニルシリルチミジン〔ヌクレオシド（8）〕２．１８ｇ（４．５５ｍｍｏｌ）をピリジン及びトルエンで共沸乾燥し、ＴＨＦ７．５０ｍｌに溶解した。これに、トリエチルアミン３．１７ｍｌ（２２．７３ｍｍｏｌ）を加え、−７８℃に冷却した。

この溶液に、アルゴン雰囲気下、製造例２で得られた化合物〔ホスフィチル化剤（7）〕のＴＨＦ溶液７．５ｍｌ（４．５５ｍｍｏｌ）滴下した後、室温で３０分間攪拌し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液７５ｍｌ及びクロロホルム７５ｍｌを加えた。

有機相を分離後、飽和炭酸水素ナトリウム溶液（７５ｍｌ×２回）で洗浄し、集めた洗浄液をクロロホルム（７５ｍｌ×２回）で抽出した。次に、集めた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過し、減圧下で濃縮した。

残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル−トリエチルアミン、３０：７０：３、v/v/v）で分離精製した。得られたフラクションを集めて飽和炭酸水素ナトリウム溶液（１００ｍｌ）で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過し、減圧下で濃縮することにより無色非晶質である目的物９５７．０ｍｇ（収率３２％）を得た。
・¹Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ：8.12（br,1H）,7.66〜7.62（m,4H）,7.46〜7.16（m,12H）,6.39（dd,J=2.4,5.7Hz,1H）,5.55（dd,J=6.9,7.2Hz,1H）,4.95〜4.90（m,1H）,4.04〜4.02（m,1H）,3.95（dd,²J_H=18.2Hz,³J_H=1.1Hz,1H）,3.89（dd,²J_H=18.2Hz,³J_H=1.1Hz,1H）,3.51〜3.46（m,1H）,2.93〜2.86（m,1H）,2.75〜2.71（d,J=6Hz,3H）,2.46〜2.40（m,1H）,2.28〜2.17（m,1H）,1.58（d,J=0.6Hz,3H）,1.10（s,9H）
・³¹Ｐ−ＮＭＲ（１２１ＭＨｚ,ＣＤＣｌ₃）δ：143.5(s)
実施例１〔（Ｒ）トリエチルアンモニウム５’−Ｏ−tert−ブチルジフェニルシリルチミジン−３’−イル３’−Ｏ−ブチルジメチルシリルチミジン−５’−イルボラノフォスフェートの製造〕
製造例３で得られた化合物〔一般式（1）の化合物〕４９．５ｍｇ（７５μｍｏｌ）と３’−Ｏ−tert−ブチルジメチルシリルチミジン〔ヌクレオシド（2）〕１７．８ｍｇ（５０μｍｏｌ）とを五酸化二リン存在下で１２時間乾燥した。

ここに、モレキュラーシーブ（ＭＳ３Ａ）で８時間乾燥させた製造例１で得られた化合物〔活性化剤（3）〕２００μｌ（１００μｍｏｌ）の０．５Ｍアセトニトリル溶液をアルゴン雰囲気下で加え、５分静置した。

その後、１．０４Ｍボランテトラヒドロフラン錯体のテトラヒロドフラン溶液（求電子試薬）０．５ｍｌ（５００μｌ）を加えた。添加後１０分間静置し、減圧下でアセトニトリルと過剰のボラノ化剤を留去した。その後、１，８−ジアザビシクロ［５，４，０］ウンデカ−７−エン７４．６μｌ（５００μｍｏｌ）を加え、５０℃で２６時間放置した。

その後、室温に戻し、クロロホルム１０ｍｌで希釈し、ｐＨ＝７．０の０．２Ｍリン酸緩衝液１０ｍｌで洗浄した。洗浄液をクロロホルム（１０ｍｌ×３回）で抽出した後、集めた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過し、減圧下で濃縮した。

残渣を薄相クロマトグラフィー（ジクロロメタン：メタノール：トリメチルアミン＝９９：１：０．５、v/v/vで３回、９６：４：０．５、v/v/vで２回）で分離精製し、得られた生成物をクロロホルム／１Ｍトリエチルアンモニウム酢酸緩衝液により塩交換することで（脱保護）、無色非晶質である目的物２５．６ｍｇ（収率５１％）を得た。
・¹Ｈ−ＮＭＲ（300ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ：9．3〜8.8（br,1H）,7.69〜7.64（m,6H）,7.52〜7.36（m,6H）,6.44〜6.31（m,2H）,5.19〜5.10（m,1H）,4.39（s,1H）,3.98〜3.89（m,4H）,3.06（q,J=7.2Hz,6H）,2.59〜2.56（m,1H）,2.25〜2.20（m,1H）,1.98（s,1H）,1.56（s,3H）,1.32（t,J=6.9Hz,9H）,1.10（s,9H）,0.87（s,9H）,0.05（s,6H）,1.0〜0（br,3H）
・³¹Ｐ−ＮＭＲ（121ＭＨｚ,ＣＤＣｌ₃）δ：95.0(br)
実施例２〔（Ｒ）トリエチルアンモニウムチミジン−３’−イルチミジン−５'−イル−ボラノフォスフェートの製造〕
実施例１で得られた化合物２５．６ｍｇ（２５．５μｍｍｏｌ）をピリジン及びトルエンで共沸乾燥し、トリエチルアミン−３フッ化水素（５００μｌ）に溶解した。この溶液を室温で２４時間攪拌した後、０．１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液３ｍｌを加え、逆相カラムクロマトグラフィー〔０．１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ＝７．０）アセトニトリル０〜１０％の線形的グラディエント〕により精製し、無色非晶質である目的物１０．６ｍｇ（収率６１％）を得た。
・¹Ｈ−ＮＭＲ（300ＭＨｚ，Ｄ₂Ｏ）δ：7.69（s,1H）,7.63（s,1H）,6.30〜6.18（m,2H）,4.87（br,1H）,4.55〜4.54（m,1H）,4.14〜4.05（m,4H）,3.80〜3.77（m,2H）,3.18（q,J=3.6Hz,6H）,2.49〜2.46（m,1H）,1.90（s,3H）,1.87（s,3H）,1.27（t,J=7.2Hz,9H）,1.0〜0（br,3H）
・³¹Ｐ−ＮＭＲ（121ＭＨｚ,Ｄ₂Ｏ）δ：93.0(br)
実施例３
5’-O-〔ビス（4-メトキシフェニル）フェニルメチル〕-3’-O-〔（2R,5R）-3-メチル-5-フェニル-1,3,2-オキサザホスホリジン-2-イル〕-2’-デオキシアデノシン[(Rp)-1]の製造
5’-O-〔ビス（4-メトキシフェニル）フェニルメチル〕-2’-デオキシアデノシン（0.80 g, 1.50 mmol）をピリジン、トルエンと繰り返し共沸することによって乾燥し、THF（7.50 ml）溶液とした。

これにトリエチルアミン（1.47 ml, 10.5 mmol）を加え、−78 °Cに冷却した後、アルゴン雰囲気下、下記式15の0.22 M THF溶液（10.0 ml, 2.25 mmol）を滴下した。反応混合物を−78℃に保ったまま１時間撹拌した後、飽和重曹水（75 ml）及びクロロホルム（75 ml）を加えた。

有機相を分離後、飽和重曹水で洗浄（75 ml×2）し、集めた洗液をクロロホルム（75 ml ×2）で抽出した。集めた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー〔2.5 × 16 cm,シリカゲル50g,ジクロロメタン−ヘキサン−ピリジン−トリエチルアミン（57:29:14:2, v/v/v/v）〕で分離精製した。

(Rp)-1を含むフラクションを集め、飽和重曹水水溶液（100 ml）で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過し、減圧下濃縮乾燥して、下記式の(Rp)-1（469.1 mg, 44％）を得た。薄黄色非晶質。
¹H-NMR (CDCl₃) δ 8.28 (s, 1H), 7.98 (s, 1H), 7.40 - 7.13 (m, 9H), 6.76 - 6.73 (m, 4H), 6.46 - 6.42 (t, 1H), 6.02 (s, 1H), 5.59 - 5.57 (br, 2H), 5.04 - 4.99 (m, 1H), 4.23 - 4.20 (m, 1H), 3.72 - 3.53 (m, 6H), 3.53 - 3.49 (m, 1H), 3.41 - 3.34 (m, 1H), 2.96 - 2.84 (m, 2H), 2.71, 2.67 (d, 3H), 2.63 - 2.55 (m, 1H). ³¹P-NMR (CDCl₃) δ 141.4.

実施例４
5’-O-〔ビス（4-メトキシフェニル）フェニルメチル〕-3’-O-〔（2R,5R）-3-メチル-5-フェニル-1,3,2-オキサザホスホリジン-2-イル〕-2’-デオキシシチジン[(Rp)-2]の製造
5’-O-〔ビス（4-メトキシフェニル）フェニルメチル〕-2’-デオキシシチジン（0.79 g, 1.50 mmol）をピリジン、トルエンと繰り返し共沸することによって乾燥し、THF (7.50 ml) 溶液とした。

これにトリエチルアミン（1.47 ml, 10.5mmol）を加え、−78 °Cに冷却した後、アルゴン雰囲気下、上記の15の0.22 M THF溶液（10.0 ml, 2.25 mmol）を滴下した。反応混合物を−78℃に保ったまま１時間撹拌した後、飽和重曹水（75 ml）及びクロロホルム（75 ml）を加えた。

有機相を分離後、飽和重曹水で洗浄（75 ml×2）し、集めた洗液をクロロホルム（75ml×2）で抽出した。集めた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー〔2.5×16cm,シリカゲル50g,ジクロロメタン−ヘキサン−ピリジン−トリエチルアミン（71:14:14:2, v/v/v/v）〕で分離精製した。

(Rp)-2を含むフラクションを集め、飽和重曹水水溶液 (100 ml) で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過し、減圧下濃縮乾燥して、下記式の(Rp)-2（452.1 mg, 42％）を得た。薄黄色非晶質。
¹H-NMR (CDCl₃) δ 7.89, 7.87 (d, 1H), 7.40 - 7.10 (m, 9H), 6.79 - 6.77 (m, 4H), 6.28 - 6.24 (t, 1H), 5.52 - 5.43 (m, 2H), 4.87 - 4.82 (m, 1H), 4.06 - 4.05 (m, 1H), 3.77 - 3.66 (m, 4H), 3.46 - 3.41 (m, 3H), 2.87 - 2.82 (m, 1H), 2.69, 2.65 (d, 3H), 2.58 - 2.34 (m, 1H), 2.32 - 2.23 (m, 1H).³¹P-NMR (CDCl₃) δ 143.5.

実施例５
5’-O-〔ビス（4-メトキシフェニル）フェニルメチル〕-3’-O-〔（2R,5R）-3-メチル-5-フェニル-1,3,2-オキサザホスホリジン-2-イル〕-2’-デオキシグアノシン[(Rp)-3]の製造
5’-O-〔ビス（4-メトキシフェニル）フェニルメチル〕-2’-デオキシグアノシン（0.85g,1.50mmol）をピリジン、トルエンと繰り返し共沸することによって乾燥し、THF （7.50 ml）溶液とした。

これにトリエチルアミン（1.47 ml, 10.5 mmol）を加え、−78 °Cに冷却した後、アルゴン雰囲気下、上記の15の0.22 M THF溶液（10.0 ml, 2.25 mmol）を滴下した。反応混合物を−78℃に保ったまま１時間30分撹拌した後、飽和重曹水（75 ml）及びクロロホルム（75ml）を加えた。

有機相を分離後、飽和重曹水で洗浄（75 ml×2）し、集めた洗液をクロロホルム（75ml×2）で抽出した。集めた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー〔2.5×16cm,シリカゲル50g,ジクロロメタン−ピリジン−トリエチルアミン（83:17:2, v/v/v）〕で分離精製した。

(Rp)-3を含むフラクションを集め、飽和重曹水水溶液（100ml）で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過し、減圧下濃縮乾燥して、下記式の(Rp)-3（332.7mg,30％）を得た。薄黄色非晶質。
¹H-NMR (CDCl₃) δ 11.0 - 10.4 (br, 1H), 7.84 (s, 1H), 7.34 - 7.19 (m, 9H), 6.81 - 6.78 (m, 4H), 6.48 (br, 1H), 6.15 - 6.11 (m, 1H), 5.59 - 5.54 (m, 1H), 4.85 - 4.80 (m, 1H), 3.95 - 3.93(m, 1H), 3.71 - 3.68 (m, 4H), 3.48 - 3.35 (m, 1H), 2.85 - 2.71 (m, 1H), 2.58 - 2.48 (m, 3H), 2.38 - 2.27 (m, 1H). ³¹P-NMR (CDCl₃) δ 137.5.

Claims

一般式（１）で表される光学活性なヌクレオシド３’−ホスホロアミダイトと、一般式（２）で表されるヌクレオシドとを、一般式（３）で表される活性化剤を用いて縮合した後、求電子試薬との反応及び脱保護を行うことを特徴とする、一般式（４）又は（５）で表される立体規則性の高いリン原子修飾ヌクレオチド類縁体の製造法。

［一般式（１）中の記号の意味は下記のとおり。
Ｒ¹及びＲ²は同一又は異なっていてもよい、水素原子、炭素数１〜３の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基、又は炭素数６〜１４のアリール基を示す。
Ｒ³は炭素数１〜３の直鎖又は分岐アルキル基を示す。
Ｒ²とＲ³は窒素原子と窒素原子に隣接する炭素原子と共に炭素数３〜１６の環状構造を形成しても良い。
Ｒ⁴は水酸基の保護基を示す。
Ｂｓは式：

で表されるチミン、アデニン、シトシン、グアニンあるいはそれらから誘導される基を示す。］

［一般式（２）中、Ｒ⁵は水酸基の保護基、Ｂｓは一般式（１）と同じ意味を示す。
一般式（３）中の記号の意味は下記のとおり。
Ｘ^-はＢＦ₄ ^-、ＰＦ₆ ^-、ＴｆＯ^-（ＴｆはＣＦ₃ＳＯ₂を表す。以下同じ。）、Ｔｆ₂Ｎ^-、ＡｓＦ₆ ^-又はＳｂＦ₆ ^-を示す。
Ｒ⁶及びＲ⁷は同一又は異なっていてもよい、水素原子、炭素数１〜５の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基、又は炭素数６〜１４のアリール基を示す。
Ｒ⁶及びＲ⁷は窒素原子と共に炭素数３〜７のモノシクロ又はビシクロ構造を形成しても良い。］

［一般式（４）及び一般式（５）中の記号の意味は下記のとおり。
Ｙは炭素数１〜３の直鎖又は分岐鎖のアルキル基、炭素数１〜３の直鎖又は分岐鎖のヒドロキシアルキル基、炭素数６〜１４のアリール基、炭素数１〜５のアルキルチオ基、炭素数１~５のアシル基、又はY＝Y’Z⁺を示す（Y’はＳｅ^-、ＢＨ₃ ^-を、Z⁺はアンモニウムイオン、第１級〜第４級の低級アルキルアンモニウムイオン又は1価金属イオンを示す）。
Ｂｓは一般式（１）と同じ意味を示し、各式中の２個のＢｓは同一でも異なっていても良い。］
一般式（１）で表される光学活性なヌクレオシド３’−ホスホロアミダイトが、一般式（６）で表される光学活性な１，２−アミノアルコールと三塩化リンを反応させて得られる一般式（７）で表される光学活性なホスフィチル化剤と、一般式（８）で表されるヌクレオシドを反応させて得られるものである請求項１記載の製造法。

［式中、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴及びＢｓは、一般式（１）と同じ意味を示す。」
請求項１記載の製造法における反応を繰り返すことを特徴とする、一般式（９）で表される立体規則性の高いリン原子修飾ヌクレオチド類縁体の製造法。

［式中、Ｙ及びＢｓは一般式（１）、（４）、（５）と同じ意味を示し、ｎは１〜１５０の整数（但し、１は含まない）を示す。］