JP5847700B2

JP5847700B2 - リボヌクレオシドホスホロチオエートの製造方法

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Publication number: JP5847700B2
Application number: JP2012503271A
Authority: JP
Inventors: 猛和田; 陽平額賀
Original assignee: Wave Life Sciences Japan Inc
Current assignee: Wave Life Sciences Japan Inc
Priority date: 2010-03-05
Filing date: 2011-03-04
Publication date: 2016-01-27
Anticipated expiration: 2031-03-04
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Description

本発明はリボヌクレオシドホスホロチオエートを立体選択的に製造する方法に関する。

ホスホロチオエートRNAはリン酸ジエステル結合の非架橋酸素原子の一つを硫黄原子に置換したRNA類縁体である。ホスホロチオエートRNAは天然型RNAと比べて高いヌクレアーゼ耐性及び細胞膜透過性が期待できるため、現在、RNA型核酸医薬として最も有望視されている(Mol. Cell., 6, pp.1077-1087, 2000; Biochemistry, 42, pp.7967-7975, 2003; Nucleic Acids Res., 31, pp.589-595, 2003など)。

ホスホロチオエートRNAはリン原子上にキラル中心を有することから二つの立体異性体(Rp及びSp体)が存在しており、これらの立体異性体はそれぞれ異なる生化学的及び物理学的性質を有することが知られている(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, pp.4798-4800, 1978; Biochemistry, 22, pp.1369-1377, 1983)。従って、ホスホロチオエートRNAの製造に際しては所望の立体配置を有する化合物を選択的に製造することが望まれる。しかしながら、リン原子の立体を制御しつつホスホロチオエートRNAを製造することは困難であり、効率的に立体選択的な合成を可能にする方法の提供が求められている。

ホスホロチオエートRNAの合成方法としては、酵素法(Nucleic Acids Res., 10, pp.4145-4162, 1987)、H-ホスホネート法(J. Org. Chem., 57, pp.6163-6169, 1992)、H-ホスホネート法に酵素反応を組み合わせた方法(Nucleic Aicds Res., 24, pp.3811-3820, 1996)、オキサチアホスホラン法(J. Org. Chem., 61, pp.6713-6716, 1996)が知られているが、いずれも立体選択性などの点で満足すべき方法とは言えない。

ホスホロチオエートDNAの合成方法として、光学活性1,2-アミノアルコールから誘導された光学的に純粋なヌクレオシド 3'-オキサザホスホリジン誘導体をモノマーユニットとして、求核性の小さい弱酸性の活性化剤N-(シアノメチル)ピロリジニウム・トリフレート(CMPT)を用いて縮合させる方法(オキサザホスホリジン法: J. Am. Chem. Soc., 130, pp.16031-16037, 2008)が知られている。この方法では、二環式のオキサザホスホリジンを用いることによりリン原子上での求核置換反応におけるジアステレオマー間の活性化エネルギーの差が顕著に生じ、高いジアステレオ選択性が得られる。

また、この方法は、コントロールド・ポアグラス(CPG)などの固相担体に担体させたヌクレオシド誘導体にモノマーユニットを縮合させた後、未反応の5'-水酸基及び不斉補助基の第二級アミンのキャップ化、ホスファイトの硫化、5'-末端の4,4'-ジメトキシトリチル(DMTr)基の脱保護を行う工程を含んでおり、目的の塩基配列に応じて各ステップを繰り返し行うことで長鎖ホスホロチオエートDNAを合成することができる。上記刊行物においては、立体化学的に純粋なホスホロチオエートチミジル酸10量体の合成が報告されている。

上記のオキサザホスホリジン法をホスホロチオエートRNAの合成に応用することにより立体選択的にホスホロチオエートを合成する方法が報告されている(Org. Lett., 11, pp.967-970, 2009)。この方法では、RNAの2'-水酸基の保護基として鎖長伸長反応条件において安定で中性条件下にテトラブチルアンモニウムフルオリド(TBAF)により容易に脱保護できるtert-ブチルジメチルシリル(TBDMS)基を用い、活性化剤としてCMPTを用いて四量体以上の合成に成功しており、立体選択的にall-(Rp)-[Ups]₉U及びall-(Sp)-[Ups]₉Uの合成が行われている。

しかしながら、この方法は反応性が低く、縮合効率が長鎖オリゴマーの合成には不十分であるという問題を有している。本発明者らの研究によると、CMPTによりも求核性の高い活性化剤としてベンズイミダゾリウム・トリフレート(BIT)やN-フェニルイミダゾリウム・トリフレート(PhIMT)を用いると縮合効率を改善でき、ホスホロチオエートウリジル酸10量体を立体選択的に合成することができるが、求核性の高い活性化剤を用いることによりエピマー化が進行してジアステレオ選択性が低下するという問題が生じる。

一方、オリゴリボ核酸などの核酸誘導体の製造において用いられる2'-位水酸基の保護基としてシアノエトキシメチル基(-CH₂-O-CH₂-CH₂-CN: CEM)が知られている(Org. Lett., 7, pp.3477-3480, 2005; 国際公開WO2006/22323)。この保護基は中性条件下においてフッ素イオンを作用させることにより除去可能であり、TBDMSで保護したモノマーをカップリングする場合の平均縮合収率が97%(Tetrahedron Letters, 43, pp.795-797, 2002の第795頁左欄8〜11行)であるのに対して、同様の縮合反応において99%以上の平均縮合収率を与える(Org. Lett., 7, pp.3477-3480, 2005の第3479頁右欄下から5〜3行)。なお、オキサザホスホリジン法を開示した特許文献(WO2005/92909)においては2'-位水酸基の保護基として2-(シアノエトキシ)エチル基(CEE)が例示されているが、シアノエトキシメチル基についての言及はない。

Mol. Cell., 6, pp.1077-1087, 2000 Biochemistry, 42, pp.7967-7975, 2003; Nucleic Acids Res., 31, pp.589-595, 2003 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, pp.4798-4800, 1978 Biochemistry, 22, pp.1369-1377, 1983 Nucleic Acids Res., 10, pp.4145-4162, 1987 J. Org. Chem., 57, pp.6163-6169, 1992 Nucleic Aicds Res., 24, pp.3811-3820, 1996 J. Org. Chem., 61, pp.6713-6716, 1996 J. Am. Chem. Soc., 130, pp.16031-16037, 2008 Org. Lett., 11, pp.967-970, 2009 Tetrahedron Letters, 43, pp.795-797, 2002 Org. Lett., 7, pp.3477-3480, 2005

国際公開WO2006/22323 WO2005/92909

本発明の課題は、オリゴリボヌクレオシドホスホロチオエートを立体選択的かつ効率的に合成する方法を提供することにある。

本発明者らはOrg. Lett., 11, pp.967-970, 2009に記載されたオキサザホスホリジン法によるホスホロチオエートRNAの合成方法を改良すべく鋭意研究を行った結果、RNAの2'-水酸基の保護基としてtert-ブチルジメチルシリル基に換えてシアノエトキシメチル基を用いると極めて高い縮合効率を達成することができること、及び求核性の小さい活性化剤であるN-(シアノメチル)ピロリジニウム・トリフレートを用いた場合にもジアステレオ選択性を損なうことなく長鎖オリゴリボヌクレオシドホスホロチオエートの合成に十分適用可能な高い縮合効率が得られることを見出した。また、求核性の高い活性化剤であるN-フェニルイミダゾリウム・トリフレート（PhIMT）を用いても高い立体選択性が得られ、4種類の核酸塩基を含んだ長鎖オリゴリボヌクレオシドホスホロチオエートの合成に十分適用可能な高い縮合効率を得られることを見出した。本発明は上記の知見を基にして完成されたものである。

すなわち、本発明により、下記の一般式(I)：
〔式中、R¹は水素原子又は水酸基の保護基を示し、Bsは保護基を有していてもよい核酸塩基を示し、nは0又は1以上の整数を示し、n個のXはそれぞれ独立に下記の一般式(II-Sp)又は(II-Rp)：
（式中、Bsは上記と同義であり、R²は水素原子又はシアノエトキシメチル基を示す）で表される二価の基を示す〕で表されるリボヌクレオシドホスホロチオエート又はその塩の製造方法であって、下記の一般式(III):
（式中、Bs、X、及びnは上記と同義であり、R³及びR⁴はそれぞれ独立に水酸基の保護基を示すが、いずれか片方は必要に応じてリンカーを介して結合した固相担体を示してもよい）で表される化合物に下記の一般式(IVa)又は(IVb)：
（式中、Bsは上記と同義であり、CEMはシアノエトキシメチル基を示し、R⁵は水酸基の保護基を示し、R⁶は置換基を有していてもよいアリール基を示す）で表されるオキサザホスホリジンリボヌクレオシドを縮合させた後に硫化する工程を含む方法が提供される。

上記の方法の好ましい態様によれば、R⁶がフェニル基である上記の方法；R⁵が4,4'-ジメトキシトリチル基である上記の方法；縮合を活性化剤の存在下で行う上記の方法；活性化剤としてN-(シアノメチル)ピロリジニウム・トリフレート(CMPT)又はN-フェニルイミダゾリウム・トリフレート(PhIMT)を用いる上記の方法；硫化剤としてジメチルチウラムジスルフィド(DTD)を用いる上記の方法；反応を固相法で行う上記の方法；n+1個のXが全て(II-Sp)で表される二価の基であるか、又は全て(II-Rp)で表される二価の基である上記の方法が提供される。

別の観点からは、本発明により、上記の一般式(I)（式中、R¹、Bs、n、及びXは上記と同義であり、ただしR²はシアノエトキシメチル基を示す）で表されるリボヌクレオシドホスホロチオエート又はその塩が提供される。
また、本発明により、上記の一般式(IVa)又は(IVb)（式中、Bs、CEM、R⁵、及びR⁶は上記と同義である）で表されるオキサザホスホリジンリボヌクレオシドが提供される。

本発明の方法によりオリゴリボヌクレオシドホスホロチオエートを立体選択的かつ効率的に合成することができる。本発明の方法によれば、立体選択的に極めて高い縮合効率を達成することができることから、固相法に適用することにより長鎖のオリゴリボヌクレオシドホスホロチオエートを高収率で製造することが可能になる。

例6で得られたホスホロチオエートRNA4量体のHPLCプロファイルを示した図である。例6で得られたホスホロチオエートRNA2量体のHPLCプロファイルを示した図である。例7で得られたホスホロチオエートRNA12量体のHPLCプロファイルを示した図である。ホスホロチオエートRNA 12量体の酵素耐性を調べた結果を示した図である。 All-(Rp)及び(Sp)-(CpsApsGpsU)₃-r(ApoCpoUpoG)₃の融解曲線を示した図である。例12で得られたホスホロチオエートRNA 12量体のHPLCプロファイルを示した図である。

一般式(I)においてR¹は水素原子又は水酸基の保護基を示す。水酸基の保護基の種類は特に限定されず、一般的には、アセチル基やフェノキシアセチル基(Pac)などのアセチル保護基、ベンジル基や4-メトキシベンジル基などのベンジル保護基、ベンゾイル基、ピバロイル基、4,4'-ジメトキシトリチル基(DMTr)などのトリチル保護基、トリメチルシリル基(TMS)やTert-ブチルジメチルシリル基(TBDMS)などのシリル保護基、2-(シアノエトキシ)エチル基(CEE)やシアノエトキシメチル基(CEM)などのエーテル保護基など適宜の保護基を用いることができる。水酸基の保護基についてはGreenら、Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Edition, 1999, John Wiley & Sons, Inc.などの成書を参照することができる。R¹が保護基を示す場合には、合成過程においてこの保護基又は他の保護基を選択的に脱離させることができるように、R¹の保護基は他の保護基とは異なる保護基であることが好ましい。R¹の保護基としては、例えばトリチル保護基を用いることが好ましく、4,4'-ジメトキシトリチル基を用いることがより好ましい。

Bsは保護基を有していてもよい核酸塩基を示す。核酸塩基としてはアデニン、ウラシル、チミン、グアニン、及びシトシンからなる群から選ばれる核酸塩基のほか、リボチミジンや5-メチルウリジンなどの任意の修飾塩基を用いてもよい。好ましくは、RNAの構成塩基であるアデニン、ウラシル、グアニン、及びシトシンからなる群から選ばれる核酸塩基を用いることができる。核酸塩基は残基となって通常の結合部位でリボースに結合することができる。他の一般式におけるBsも上記と同様である。

核酸塩基が保護基を有する場合、保護基の種類は特に限定されないが、アミノ基を有する核酸塩基を用いる場合にはアミノ基を保護することができる。例えば、アミノ基を有する核酸塩基であるアデニン、グアニン、及びシトシンのアミノ基を保護することが好ましい場合があり、保護基として、例えばベンゾイル基、4-メトキシベンゾイル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、フェニルアセチル基、フェノキシアセチル基、4-tert-ブチルフェノキシアセチル基、4-イソプロピルフェノキシアセチル基、(ジメチルアミノ)メチレン基などを用いることができる。他の一般式におけるBsも上記と同様である。一般式(I)で表されるリボヌクレオシドホスホロチオエート又はその塩が有するn+2個のBsはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。

nは0又は1以上の整数を示すが、好ましくはnは100以下の整数、より好ましくは50以下の整数、さらに好ましくは40以下の整数である。一般式(I)において、n個のXはそれぞれ独立に上記の一般式(II-Sp)又は(II-Rp)で表される二価の基を示すが、上記で説明したのと同様にn個のXに含まれるn個のBsはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。R²は水素原子又はシアノエトキシメチル基を示すが、R²は水素原子である化合物は、本発明の合成方法によりR²がシアノエトキシメチル基であるリボヌクレオシドホスホロチオエートを製造した後に、シアノエトキシメチル基を脱離することにより製造することができる。

一般式(I)で表されるリボヌクレオシドホスホロチオエートの塩の種類は特に限定されないが、例えば、アンモニウム塩や有機アミンの塩のほか、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩などの金属塩などが好ましく、より好ましくは、例えばアンモニウム塩やトリエチルアミン塩などの三級アルキルアミン化合物の塩やナトリウム塩などを用いることができる。一般式(I)で表されるリボヌクレオシドホスホロチオエート又はその塩は、水和物や溶媒和物の形態であってもよい。一般式(I)で表されるリボヌクレオシドホスホロチオエートにおいて立体表記は絶対配置を示すが、本発明の方法により、一般式(I)で表されるリボヌクレオシドホスホロチオエートの光学対掌体を製造することも可能である。

一般式(I)で表されるリボヌクレオシドホスホロチオエートは、上記の一般式(III)で表される化合物に対して、上記の一般式(IVa)又は(IVb)で表されるオキサザホスホリジンリボヌクレオシドを縮合させた後に硫化することにより製造することができる。一般式(III)においてR³及びR⁴はそれぞれ独立に水酸基の保護基を示す。水酸基の保護基は上記に説明したとおりであり、目的に応じて適宜の保護基を選択することができるが、R³及びR⁴が示す保護基は同一でも異なっていてもよい。また、固相法を行う場合には、R³及びR⁴のうちのいずれか片方が必要に応じてリンカーを介して結合する固相担体であってもよい。この場合、残りの一方には一般的な水酸基の保護基を用いることができる。

固相担体の種類は特に限定されず、核酸誘導体の合成において固相担体として用いることができるものであれば任意の固相担体を用いることが可能である。リンカーの種類や長さも特に制限されず、当業者が適宜選択できる。例えば固相担体として定孔ガラス(controlled pore glass: CPG)、オキサリル化−定孔ガラス(Nucleic Acids Res., 19, 1527, 1991など)、TentaGel支持体-アミノポリエチレングリコール誘導体化支持体(Tetrahedron Letters, 34, 3373, 1993など)、Poros-ポリスチレン／ジビニルベンゼンのコポリマーなどを挙げることができ、特に好ましい固相担体として高架橋アミノメチルポリスチレン(highly cross-linked polystyrene: HCP, Tetrahedron Letters, 32, 4096, 1991)などを用いることができる。リンカーとしては、例えば、3-アミノプロピル基、スクシニル基、2,2'-ジエタノールスルホニル基、ロングチェーンアルキルアミノ基(LCAA)などを挙げることができる。

一般式(IVa)又は(IVb)で表されるオキサザホスホリジンリボヌクレオシドにおいてR⁵は水酸基の保護基を示すが、水酸基の保護基は上記に説明したとおりであり、目的に応じて適宜の保護基を選択することができる。例えばトリチル保護基を用いることが好ましく、4,4'-ジメトキシトリチル基を用いることがより好ましい。R⁶は置換基を有していてもよいアリール基を示す。アリール基としては単環性又は縮合多環性のアリール基を用いることができるが、好ましくはフェニル基を用いることができる。フェニル基にはアルキル基、アルコキシ基、ハロゲン原子などの置換基が1個又は2個以上存在していてもよい。好ましくはR⁶として無置換フェニル基を用いることができる。

上記の縮合反応及び硫化反応はJ. Am. Chem. Soc., 130, pp.16031-16037, 2008、Org. Lett., 11, pp.967-970, 2009、及びWO2005/92909に記載された条件を参照しつつ行うことができる。上記特許文献(WO2005/92909)の開示の全てを参照により本明細書の開示に含める。縮合反応の効率を高めるために縮合反応を活性化剤の存在下で行うことができる。活性化剤の種類は特に限定されないが、本発明の方法は極めて反応性が高いことから、例えば求核性の低いN-(シアノメチル)ピロリジニウム・トリフレート(CMPT)などを用いても立体選択性を損なうことなく縮合効率の大幅な改善を達成できる。また、求核性の高い活性化剤であるN-フェニルイミダゾリウム・トリフレート(PhIMT)を用いても高い立体選択性が得られ、4種類の核酸塩基を含んだ長鎖オリゴリボヌクレオシドホスホロチオエートの合成に十分適用可能な高い縮合効率を得られる。硫化剤も特に限定されないが、例えばジメチルチウラムジスルフィド(DTD)などを用いることができる。

上記の方法において、n+1個のXとして(II-Sp)で表される二価の基又は(II-Rp)で表される二価の基を任意の個数で組み合わせることができるが、n+1個のXの全てが(II-Sp)で表される二価の基であるか、又は全てが(II-Rp)で表される二価の基である一般式(I)のリボヌクレオシドホスホロチオエートを製造することが好ましい。

上記の一般式(III)で表される化合物に対して、上記の一般式(IVa)又は(IVb)で表されるオキサザホスホリジンリボヌクレオシドを縮合させた後に硫化することにより一般式(I)で表されるリボヌクレオシドホスホロチオエートを製造した後、得られたリボヌクレオシドホスホロチオエートを出発原料として用いて上記の一般式(IVa)又は(IVb)で表されるオキサザホスホリジンリボヌクレオシドを縮合させた後に硫化することにより、リボヌクレオシドホスホロチオエート単位(X)を一つ増加させた化合物を製造することができ、さらに得られた化合物を出発原料として用い、上記の一般式(IVa)又は(IVb)で表されるオキサザホスホリジンリボヌクレオシドを縮合させた後に硫化することにより、リボヌクレオシドホスホロチオエート単位(X)をさらに一つ増加させることができる。この反応を繰り返して行うことにより、所望のn+1個のリボヌクレオシドホスホロチオエート単位(X)を有する一般式(I)で表されるリボヌクレオシドホスホロチオエートを製造することができる。

上記の繰り返しによるリボヌクレオシドホスホロチオエートの製造は、好ましくは固相法により行うことができる。固相法によるオリゴ核酸合成法を応用して自動合成機を用いて合成を行うことも可能である。固相法に関しては種々の文献を利用することができ、当業者であれば適宜の条件を容易に選択することが可能である。例えば、固相法を行うにあたりキャップ化や固相担体からの切り出しの条件も当業者であれば適宜選択できる。

シアノエトキシメチル基の脱保護はテトラブチルアンモニウムフルオリド(TBAF)により選択的に行うことができる(Nucleic Acids Res., 35, pp.3287-3296, 2007)。脱保護に際して副生するアクリロニトリルが核酸塩基に付加するのを抑制するために、アクリロニトリルの捕捉剤としてニトロメタンを少量(例えば0.5%程度)加えることにより副反応を抑制して高収率で脱保護を行うことができる。

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
例１
(a)O⁶-シアノエチル-N²-フェノキシアセチル-3',5'-O-(di-tert-ブチルシランジイル)-2'-O-(2-シアノエトキシメチル) グアノシン

N²-フェノキシアセチル-3',5'-O-(テトライソプロピルジシロキサン-1,3-ジイル)-2'-O-(2-シアノエトキシメチル)グアノシン (11.175 g, 14.9 mmol) をトルエン、ジクロルメタンで繰り返し共沸することにより乾燥してジクロルメタン溶液 (100 ml) とした。N,N-ジメチルアミノピリジン(DMAP, 0.092 g, 0.75 mmol)、トリエチルアミン (8.3 ml, 59.6 mmol) 及びメシチレンスルホニルクロリド (3.920 g, 17.9 mmol) を加え、室温で30分撹拌した。反応混合物を飽和重曹水 (30 ml x 3)で洗浄し、集めた洗液をジクロルメタン (30 ml x 2) で抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣をトルエン、ジクロルメタンで繰り返し共沸することにより乾燥してジクロルメタン溶液 (100 ml) とした。これを0 ℃まで冷却し、N-メチルモリホリン (15.9 ml, 149 mmol) を加えて、0 ℃のまま20分撹拌した。これに2-シアノエタノール (10.1 ml, 149 mmol)、1,8-ジアザビシクロ[5,4,0]ウンデク-7-エン(BDU, 3.3 ml, 22.1 mmol) を加え、0 ℃ で25分撹拌した後、1 M KH₂PO₄水溶液 (50 ml) を加えた。有機層を分離後、1 M KH₂PO₄水溶液 (50 ml x 2) で洗浄し、集めた洗液をジクロルメタン (30 ml x 2) で抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー [200 g シリカゲル, 酢酸エチル-ヘキサン (50:50, v/v → 100:0, v/v)] によって精製した。これを飽和重曹水 (30 ml x 3)で洗浄し、集めた洗液をジクロルメタン (30 ml x 2) で抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過し、減圧下濃縮することで目的物 (6.200 g, 52%) を得た。無色非晶質。

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 8.92 (H, br.s, 2-NH), 8.31 (H, s, 8-H), 7.38-7.40 (2H, m, m of Pac), 6.98-7.11 (3H, m, o, p of Pac), 6.16 (H, s, 1'-H), 5.10, 5.20 (H, 2d, ³J = 7.2 Hz, -OCH₂of CEM), 4.77-4.85 (3H, m, 2'-H, -OCH₂ of Ce), 4.69 (2H, s, -CH₂ of Pac), 4.53 (H, dd, ³J = 4.2, 9.3Hz, 3'-H), 4.29-4.35 (2H, m, -OCH₂O of CEM), 4.01-4.08 (2H, m, 5'-H), 3.81-3.92 (H, m, 4'-H), 3.02 (2H, t, ³J = 6.8Hz, -CH₂CN of Ce), 2.61-2.66 (2H, m, -CH₂CN of CEM), 0.95-1.12 (32H, m, t-Bu)

(b)O⁶-シアノエチル-N²-フェノキシアセチル-2'-O-(2-シアノエトキシメチル) グアノシン

O⁶-シアノエチル-N²-フェノキシアセチル-3',5'-O-(di-tert-ブチルシランジイル)-2'-O-(2-シアノエトキシメチル) グアノシン (5.280 g, 6.6 mmol) をトルエン, テトラヒドロフランで繰り返し共沸することにより乾燥してテトラヒドロフラン溶液 (35 ml) とした。これを35 ℃ まで加熱し、トリエチルアミン・3HF (1.3 ml, 8.0 mmol) を慎重に滴下して、35 ℃のまま4.5時間撹拌した。0 ℃に冷却後、水を5 mlを加え、反応混合物を0 ℃のまま1時間撹拌した。反応混合物中のテトラヒドロフランを減圧留去した後、ジエチルエーテルを7.5 ml加えて、室温で1時間撹拌した。生成した沈殿物を吸引ろ過により回収し、ジエチルエーテル (3 ml x 3) で洗浄後、減圧下溶媒を留去した。これをメタノール (40 ml) で再結晶した後、得られたものをジエチルエーテル (3 ml x 3) で洗浄し、減圧下溶媒を留去することで目的物 (2.105 g, 57 %) を得た。無色非晶質。
¹H NMR (300 MHz, 重DMSO) δ 8.57 (H, s, 8-H), 7.28-7.33 (2H, m, m of Pac), 6.93-6.96 (3H, m, o. p of Pac), 6.09 (H, d, ³J = 6.0Hz, 1'-H), 5.39-5.41 (H, m, 2'-H), 5.11 (2H, t, ³J = 5.3Hz, -CH₂ of Pac), 5.05 (H, br.s, 3'-OH), 4.67-4.78 (3H, m, 5'-OH, -OCH₂O of CEM), 4.36 (1H, ddd, ³J = 3.6, 3.6, 4.7Hz, 3'-H), 3.98 (H, d,³J = 3.6Hz, 4'-H), 3.57-3.72 (3H, m, 5'-H, -OCH₂ of Ce), 3.32-3.48 (2H, m, -OCH₂ of CEM), 3.16-3.22 (2H, m, -CH₂CN of Ce), 2.50-2.66 (2H, m, -CH₂CN of CEM)

(c)O⁶-シアノエチル-N²-フェノキシアセチル-5'-O-(4,4'-ジメトキシトリチル)-2'-O-(2-シアノエトキシメチル)グアノシン
O⁶-シアノエチル-N²-フェノキシアセチル-2'-O-(2-シアノエトキシメチル)グアノシン (1.633 g, 3.0 mmol) をピリジンで繰り返し共沸することにより乾燥してピリジン溶媒 (10 ml) とした。これを0℃に冷却し、4,4'-ジメトキシトリチル(DMTr)クロリド (1.197 g, 3.5 mmol) を加えた。室温に戻しながら2時間撹拌した後、メタノール (5 ml) を加えて、減圧下溶媒を留去し、クロロホルム溶液 (50 ml) とした。これを飽和重曹水 (30 ml x 3) で洗浄して、集めた洗液をクロロホルム (20ml x 3) で抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー [55 g of シリカゲル, 酢酸エチル-ヘキサン-ピリジン (25:75:0.5, v/v/v → 100:0:0.5, v/v/v)] により精製することで目的物 (2.467 g, 98%) を得た。無色非晶質。
¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 8.88 (H, s, 2-NH), 8.10 (H, s, 8-H), 6.99-7.42 (14H, m, Ph, m to OMe of DMTr, Ph of Pac), 6.79 (4H, d, ³J = 8.1Hz, o to OMe of DMTr), 6.24 (H, d, ³J = 3.9Hz, 1'-H), 5.01 (H, d, ³J = 7.2Hz, -OCH₂ of CEM), 4.95 (H, d, ³J = 6.9Hz, -OCH₂ of CEM), 4.79-4.90 (3H, m, 2'-H, -OCH₂ of Ce), 4.65 (2H, br.s, -CH₂ of Pac), 4.26 (H, d,³J = 3.3Hz, 3'-H), 3.65-3.78 (9H, m, -OMe of DMTr, -OCH₂O of CEM, 4'-H), 3.49 (2H, s, 5'-H), 3.36 (H, br.s, 3'-OH), 3.02 (2H, t, ³J = 6.6 Hz, -CH₂CN of Ce), 2.50 (2H, t, ³J = 6.2Hz, -CH₂CN of CEM)

例2
(a)5'-O-(4,4'-ジメトキシトリチル)-3'-O-[(2R,4S,5R)-5-フェニル-テトラヒドロ-1H,3H-ピロロ[1,2-c]-1,3,2-オキサザホスホリジン-2-イル]-2'-O-(2-シアノエトキシメチル)ウリジン [(Rp)]
5'-O-(4,4'-ジメトキシトリチル)-2'-O-(2-シアノエトキシメチル)ウリジン (0.630 g, 1.0 mmol) をピリジン、トルエンと繰り返し共沸することにより乾燥してテトラヒドロフラン溶液 (5 ml) とした。これにトリエチルアミン (1.0 ml, 7.1 mmol) を加え、- 78 ℃に冷却後、(4S,5R)-オキサザホスホリジンクロリドの0.5 M テトラヒドロフラン溶液 (6 ml, 3.0 mmol) を- 78 ℃のまま慎重に滴下した。室温に戻しながら1.5時間撹拌した後、クロロホルム (400 ml) で希釈し、飽和重曹水 (100 ml) を加えた。有機層を分離後、飽和重曹水 (100 ml x 2) で洗浄し、集めた洗液をクロロホルム (30 ml x 2) で抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー [15 g NH シリカゲル, トルエン-酢酸エチル-トリエチルアミン (60:40:0.1, v/v/v) ] により精製した。目的物を含むフラクションを集め、飽和重曹水 (100 ml) で洗浄した後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過し、減圧下濃縮することで目的物 (0.520 g, 62%) を得た。無色非晶質。

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 8.07 (H, d, ³J = 8.1, 6-H) 7.24-7.28 (14H, m, 5''-Ph, m to OMe of DMTr, Ph of DMTr), 6.76-6.82 (4H, m, o to OMe of DMTr), 5.95 (H, d,³J = 1.2Hz, 1'-H), 5.75 (H, d, ³J = 6.6Hz, 5''-H), 5.16 (H, d, ³J = 8.1Hz, 5-H), 4.96, 5.01 (2H, 2d, ³J = 7.2Hz, -OCH₂of CEM), 4.89 (H, ddd, ³J = 6.9, 6.9, 8.4Hz, 3'-H), 4.35 (H, dd, ³J = 1.2, 4.8Hz, 2'-H), 4.21 (H, d, ³J = 8.1Hz, 4'-H), 3.87-3.94 (3H, m, 4''-H, -OCH₂O of CEM), 3.74, 3.77 (6H, 2s, -OMe of DMTr), 3.52-3.60 (3H, m, 5'-H, 6''-H), 3.07-3.13 (H, m , 6''-H), 2.67 (2H, ddd, ³J = 2.7, 6.5, 6.5Hz, -CH₂CN of CEM), 1.56-1.62 (2H, m, 7''-H), 0.94-1.28 (2H, m, 8''-H)
³¹P NMR (121 MHz, CDCl₃) δ 158.2

(b)N⁶-アセチル-5'-O-(4,4'-ジメトキシトリチル)-3'-O-[(2R,4S,5R)-5-フェニル-テトラヒドロ-1H,3H-ピロロ[1,2-c]-1,3,2-オキサザホスホリジン-2-イル]-2'-O-(2-シアノエトキシメチル)アデノシン [(Rp)].
N⁶-アセチル-5'-O-(4,4'-ジメトキシトリチル)-2'-O-(2-シアノエトキシメチル)アデノシン (0.695 g, 1.0 mmol) にトリエチルアミン (1.0 ml, 7.1 mmol)、(4S,5R)-オキサザホスホリジンクロリドの0.5M テトラヒドロフラン溶液 (6 ml, 3.0 mmol) を加えて、室温で2時間撹拌した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー [25 g NH シリカゲル, トルエン-酢酸エチル-トリエチルアミン (20:10:0.03, v/v/v)] により精製することで目的物 (0.443 g, 49%) を得た。無色非晶質。

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 8.77 (H, br.s, 6-NH), 8.61 (H, s, 2-H), 8.26 (H, s, 8-H), 7.20-7.45 (14H, m, 5''-Ph, m to OMe of DMTr, Ph of DMTr), 6.80 (4H, d, ³J = 9.0Hz, o to OMe of DMTr), 6.24 (H, d, ³J = 4.8Hz, 1'-H), 5.77 (H, d, ³J = 6.3Hz, 5''-H) , 4.95-5.06 (2H, m, 2'-H, 3'-H), 4.73, 4.83 (2H, 2d, ³J = 7.2Hz, -OCH₂ of CEM), 4.40 (H, dd, ³J = 3.0, 6.0Hz, 4'-H), 3.83-3.92 (H, m, 4''-H), 3.78 (6H, s, -OMe of DMTr), 3.38-3.65 (3H, m, 6'-H, -OCH₂O of CEM), 3.41 (H, dd, ³J = 3.3, 10.5Hz, 5'-H), 3.06-3.18 (H, m, 6''-H), 2.60 (3H, s, Ac), 2.36 (2H, m, -CH₂CN of CEM), 1.59-1.69 (2H, m, 7''-H), 0.88-1.28 (2H, .m, 8''-H)
³¹P NMR (121 MHz, CDCl₃) δ 157.0

(c)N⁴-アセチル-5'-O-(4,4'-ジメトキシトリチル)-3'-O-[(2R,4S,5R)-5-フェニル-テトラヒドロ-1H,3H-ピロロ[1,2-c]-1,3,2-オキサザホスホリジン-2-イル]-2'-O-(2-シアノエトキシメチル)シチジン [(Rp)].
N⁴-アセチル-5'-O-(4,4'-ジメトキシトリチル)-2'-O-(2-シアノエトキシメチル)シチジン (1.010 g, 1.5 mmol) にトリエチルアミン (1.5 ml, 10.5 mmol)、(4S,5R)-オキサザホスホリジンクロリドの0.5M テトラヒドロフラン溶液 (9.0 ml, 4.5 mmol) を加えて、室温で1.5時間撹拌した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー [粗生成物 0.30 g, 3.0 g NH シリカゲル, ヘキサン-酢酸エチル-トリエチルアミン (20:10:0.03, v/v/v → 10:30:0.04, v/v/v)] 、[粗生成物 0.30 g, 3.0 g NH シリカゲル, ヘキサン-酢酸エチル-トリエチルアミン (20:10:0.03, v/v/v → 10:20:0.03, v/v/v)] 及び [粗生成物 1.23 g, 12.3 g NH シリカゲル, ヘキサン-酢酸エチル-トリエチルアミン (20:10:0.03, v/v/v → 10:20:0.03, v/v/v)] により精製することで目的物 (0.693 g, 53%)を得た。黄色非晶質。

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 9.68 (H, br.s, 4-NH), 8.54 (H, d, ³J = 7.5Hz, 6-H), 7.22-7.42 (14H, m, 5''-Ph, m to OMe of DMTr, Ph of DMTr), 6.88 (H, d, ³J = 7.5Hz, 5-H), 6.77-6.84 (4H, m, o to OMe of DMTr), 5.94 (H, s, 1'-H), 5.72 (H, d, ³J = 6.3Hz, 5''-H) , 4.98, 5.15 (2H, 2d, ³J = 6.9Hz, -OCH₂ of CEM), 4.84 (H, ddd, ³J = 4.8, 9.3, 9.3Hz, 3'-H), , 4.26-4.33 (2H, m, 2'-H , 4'-H), 3.86-3.96 (3H, m, 4''-H, -OCH₂O of CEM), 3.75, 3.78 (6H, 2s, -OMe of DMTr), 3.50-3.69 (3H, m, 5'-H, 6''-H), 3.04-3.15 (H, m , 6''-H), 2.59-2.78 (2H, m, -CH₂CN of CEM), 2.24 (3H, s, Ac), 1.51-1.67 (2H, m, 7''-H), 0.86-1.28 (2H, m, 8''-H)
³¹P NMR (121 MHz, CDCl₃) δ 158.0

(d)O⁶-シアノエチル-N²-フェノキシアセチル-5'-O-(4,4'-ジメトキシトリチル)--3'-O-[(2S,4R,5S)-5-フェニル-テトラヒドロ-1H,3H-ピロロ[1,2-c]-1,3,2-オキサザホスホリジン-2-イル]2'-O-(2-シアノエトキシメチル) グアノシン [(Rp)].
O⁶-シアノエチル-N²-フェノキシアセチル-5'-O-(4,4'-ジメトキシトリチル)-2'-O-(2-シアノエトキシメチル) グアノシン (0.856 g, 1.0 mmol) にトリエチルアミン (1.0 ml, 7.1 mmol)、(4S,5R)-オキサザホスホリジンクロリドの0.5M テトラヒドロフラン溶液 (6.0 ml, 3.0 mmol) を加えて、室温で2時間撹拌した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー [20 g NH シリカゲル, トルエン-酢酸エチル-トリエチルアミン (80:20:0.1, v/v/v) ] により精製することで目的物 (0.447 g, 42%)を得た。無色非晶質。
¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 8.79 (H, br.s, 2-NH), 8.10 (H, s, 8-H), 7.00-7.42 (19H, m, 5''-Ph, m to OMe of DMTr, Ph of DMTr, Ph of Pac), 6.76 (2H, d, ³J = 6.6Hz, o to OMe of DMTr), 6.23 (H, d, ³J = 5.1Hz, 1'-H), 5.74 (H, d, ³J = 6.3Hz, 5''-H), 4.82-5.01 (6H, m, 2'-H, 3'-H, -OCH₂ of CEM, -OCH₂ of Ce), 4.63 (2H, s, -CH₂ of Pac), 4.35 (H, d, ³J = 2.7Hz, 4'-H), 3.44-3.90 (12H, m, 5'-H, 4''-H, 6''-H, -OCH₂O of CEM, OMe of DMTr), 3.04-3.19 (3H, m, 6''-H, -CH₂CN of Ce), 2.48 (2H, t, ³J = 6.3Hz, -CH₂CN of CEM), 1.59-1.66 (2H, m, 7''-H), 0.88-1.29 (2H, m, 8''-H)
³¹P NMR (121 MHz, CDCl₃) δ 156.8

例3
例2と同様にして4R,5S-オキサザホスホリジンクロリドを用いて以下の化合物を合成した。
(a)5'-O-(4,4'-ジメトキシトリチル)-3'-O-[(2S,4R,5S)-5-フェニル-テトラヒドロ-1H,3H-ピロロ[1,2-c]-1,3,2-オキサザホスホリジン-2-イル]-2'-O-(2-シアノエトキシメチル)ウリジン [(Sp)].
5'-O-(4,4'-ジメトキシトリチル)-2'-O-(2-シアノエトキシメチル)ウリジン (0.944 g, 1.5 mmol) にトリエチルアミン (1.5 ml, 10.5 mmol)、4R,5S-オキサザホスホリジンクロリドの0.5M テトラヒドロフラン溶液 (9.3 ml, 4.7 mmol) を加えて、室温で1.5時間撹拌した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー [粗生成物 0.30 g, 3 g NH シリカゲル, ヘキサン-酢酸エチル-トリエチルアミン (20:10:0.03, v/v/v → 10:10:0.02, v/v/v)]、[粗生成物 1.40 g, 5.5 x 27 cm, 3.0 g NH シリカゲル, ヘキサン-酢酸エチル-トリエチルアミン (20:10:0.03, v/v/v → 10:20:0.03, v/v/v)] により精製することで目的物 (0.900 g, 71%) を得た。無色非晶質。

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 9.24 (H, br.s, 3-NH), 8.11 (H, d, 6-H), 7.24-7.41 (14H, m, 5''-Ph, m to OMe of DMTr, Ph of DMTr), 6.85 (4H, dd, ³J = 2.1, 9.0Hz, o to OMe of DMTr), 5.98 (H, d, ³J = 1.5Hz, 1'-H), 5.79 (H, d, ³J = 6.3Hz, 5''-H), 5.20 (2H, d, ³J = 8.4Hz, 5-H), δ4.81-4.89 (3H, m, 3'-H, -OCH₂O of CEM), 4.25-4.32 (2H, m, 2'-H, 4'-H), 3.68-3.87 (9H, m, 4''-H, -OCH₂ of CEM, -OMe of DMTr), 3.41-3.54 (3H, m, 5'-H, 6''-H), 3.03-3.14 (H, m, 6''-H), 2.46-2.51 (2H, ddd, ³J = 1.8, 6.0, 6.0Hz, -CH₂CN of CEM), 1.59-1.68 (2H, m, 7''-H), 0.88-1.28 (2H, m, 8''-H)
³¹P NMR (121 MHz, CDCl₃) δ 159.4

(b)N⁶-アセチル-5'-O-(4,4'-ジメトキシトリチル)-3'-O-[(2S,4R,5S)-5-フェニル-テトラヒドロ-1H,3H-ピロロ[1,2-c]-1,3,2-オキサザホスホリジン-2-イル]-2'-O-(2-シアノエトキシメチル)アデノシン [(Sp)]
N⁶-アセチル-5'-O-(4,4'-ジメトキシトリチル)-2'-O-(2-シアノエトキシメチル)アデノシン (0.698 g, 1.0 mmol) にトリエチルアミン (1.0 ml, 7.1 mmol)、(4R,5S)-オキサザホスホリジンクロリドの0.5M テトラヒドロフラン溶液 (6.0 ml, 3.0 mmol) を加えて、室温で2時間撹拌した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー[13 g NH シリカゲル, トルエン-酢酸エチル-トリエチルアミン (50:50:0.1, v/v/v)] により精製することで目的物 (0.462 g, 51%) を得た。無色非晶質。

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 8.77 (H, br.s, 6-NH), 8.61 (H, s, 2-H), 8.21 (H, s, 8-H), 7.16-7.42 (14H, m, 5''-Ph, m to OMe of DMTr, Ph of DMTr), 6.76 (4H, d, ³J = 6.9Hz, o to OMe of DMTr), 6.22 (H, d, ³J = 5.1Hz, 1'-H), 5.79 (H, d, ³J = 6.6Hz, 5''-H) , 5.07 (H, dd, ³J = 5.1, 5.1Hz, 2'-H), 4.98 (H, ddd, ³J = 4.5, 4.5, 9.6Hz, 3'-H), 4.85, 4.89 (2H, 2d, ³J = 7.2Hz, -OCH₂ of CEM), 4.36 (H, dd, ³J = 3.9, 8.1Hz, 4'-H), 3.49-3.94 (9H, m, 4''-H, 6''-H, -OCH₂O of CEM, -OMe of DMTr), 3.03-3.15 (H, m, 6''-H), 2.61 (3H, s, Ac), 2.48 (2H, t, ³J = 6.3Hz, -CH₂CN of CEM), 1.56-1.66 (2H, m, 7''-H), 0.89-1.28 (2H, .m, 8''-H)
³¹P NMR (121 MHz, CDCl₃) δ 156.1

(c)N⁶-アセチル-5'-O-(4,4'-ジメトキシトリチル)-3'-O-[(2R,4S,5R)-5-フェニル-テトラヒドロ-1H,3H-ピロロ[1,2-c]-1,3,2-オキサザホスホリジン-2-イル]-2'-O-(2-シアノエトキシメチル)シチジン [(Sp)].
N⁴-アセチル-5'-O-(4,4'-ジメトキシトリチル)-2'-O-(2-シアノエトキシメチル)シチジン (0.671 g, 1.0 mmol) にトリエチルアミン (1.0 ml, 7.1 mmol)、(4R,5S)-オキサザホスホリジンクロリドの0.5M テトラヒドロフラン溶液 (6.0 ml, 3.0 mmol) を加えて、室温で1.5時間撹拌した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー [14 g NH シリカゲル, トルエン-酢酸エチル-トリエチルアミン (10:20:0.03, v/v/v)] により精製することで目的物 (0.655 g, 75%) を得た。黄色非晶質。

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 9.58 (H, br.s, 4-NH), 8.61 (H, d, ³J = 7.2Hz, 6-H), 7.22-7.44 (14H, m, 5''-Ph, m to OMe of DMTr, Ph of DMTr), 6.99 (H, d, ³J = 7.8Hz, 5-H), 6.86 (4H, dd, ³J = 1.8, 8.7Hz, o to OMe of DMTr), 5.98 (H, s, 1'-H), 5.78 (H, d, ³J = 6.3Hz, 5''-H) , 4.95, 5.04 (2H, 2d, ³J = 6.9Hz, -CH₂O of CEM), 4.78 (H, ddd, ³J = 4.8, 9.3, 9.3Hz, 3'-H), 4.27-4.34 (H, m, 2'-H, 4'-H), 3.73-3.88 (9H, m, 4''-H, -OCH₂O of CEM, -OMe of DMTr), 3.39-3.56 (3H, m, 5'-H, 6''-H), 3.00-3.12 (H, m , 6''-H), 2.49 (2H, t, ³J = 6.9Hz, -CH₂CN of CEM), 2.24 (3H, s, Ac), 1.58-1.67 (2H, m, 7''-H), 0.86-1.28 (2H, m, 8''-H)
³¹P NMR (121 MHz, CDCl₃) δ 159.0

(d)O⁶-シアノエチル-N²-フェノキシアセチル-5'-O-(4,4'-ジメトキシトリチル)-3'-O-[(2R,4S,5R)-5-フェニル-テトラヒドロ-1H,3H-ピロロ[1,2-c]-1,3,2-オキサザホスホリジン-2-イル]2'-O-(2-シアノエトキシメチル) グアノシン [(Sp)].
O⁶-シアノエチル-N²-フェノキシアセチル-5'-O-(4,4'-ジメトキシトリチル)-2'-O-(2-シアノエトキシメチル) グアノシン (1.280 g, 1.5 mmol) にトリエチルアミン (1.5 ml, 10.5 mmol)、4R,5S-オキサザホスホリジンクロリドの0.5M テトラヒドロフラン溶液 (9.0 ml, 4.5 mmol) を加えて、室温で1.5時間撹拌した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー [粗生成物 0.30 g, 3.0 g NH シリカゲル, ヘキサン-酢酸エチル-トリエチルアミン (30:10:0.04, v/v/v → 10:20:0.03, v/v/v)] 、[粗生成物 1.5 g, 15 g NH シリカゲル, ヘキサン-酢酸エチル-トリエチルアミン (30:10:0.04, v/v/v → 10:20:0.03, v/v/v)] により精製することで目的物 (0.865 g, 54%) を得た。無色非晶質。

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 8.77 (H, br.s, 2-NH), 8.13 (H, s, 8-H), 6.98-7.45 (19H, m, 5''-Ph, m to OMe of DMTr, Ph of DMTr, Ph of Pac), 6.76 (2H, d, ³J = 6.6Hz, o to OMe of DMTr), 7.80 (H, d, ³J = 4.8Hz, 1'-H), 5.76 (H, d, ³J = 6.6Hz, 5''-H), 4.75-4.99 (6H, m, 2'-H, 3'-H, -OCH₂ of CEM, -OCH₂ of Ce), 4.62 (2H, s, -CH₂ of Pac), 4.39 (H, d, ³J = 3.3Hz, 4'-H), 3.77-3.90 (7H, m, 4''-H, OMe of DMTr), 3.42-3.62 (6H, m, 5'-H, 6''-H, -OCH₂O of CEM) 3.03-3.19 (3H, m, 6''-H, -CH₂CN of Ce), 2.34 (2H, t, ³J = 6.3Hz, -CH₂CN of CEM), 1.59-1.75 (2H, m, 7''-H), 0.88-1.28 (2H, m, 8''-H)
³¹P NMR (121 MHz, CDCl₃) δ 156.8

例2及び3の反応では目的物のリボヌクレオシドオキサザホスホリジンがいずれも高いジアステレオ選択性で得られた。

例4
(a)(Rp)-又は(Sp)-リボヌクレオシドオキサザホスホリジンをモノマーユニットとして用いて、ホスホロチオエートRNA2量体を立体選択的に固相合成した。反応工程を以下に示す。

固相担体としてCPG、リンカーとしてサクシニルリンカーを用い、固相担体上のウリジンの5'-水酸基とモノマーユニットを求核性の小さい活性化剤であるCMPTで縮合させた後、生成したホスファイトをDTDで硫化し、濃アンモニア-エタノール（3:1, v/v）で処理して固相担体から切り出し、不斉補助基と核酸塩基部位の保護基の脱保護を行うことで立体選択的に2量体を合成した。二量体の定量を容易にする目的でCEM基を残した状態でRP-HPLCで分析し、縮合効率及びジアステレオ選択性を算出した。その結果、オリゴマー合成に十分に応用可能な高い縮合効率で、かつ高いジアステレオ選択性で縮合反応が進行することが確認できた。また、本反応は縮合反応が5分程度で完了しており、TBDMS基を用いる従来の反応では二量体の縮合に15分を要したのと比べて極めて反応性が高いことが確認された。

(b)上記(a)と同様にして、ホスホロチオエートRNA4量体（All-(Rp)-[Ups]₃U、All-(Sp)-[Ups]₃U、All-(Rp)-ApsGpsCpsU、及びAll-(Sp)-ApsGpsCpsU）を合成した。反応工程を以下に示す。

活性化剤CMPTを用いて縮合させた後、未反応の5'-水酸基、不斉補助基のアミノ基をそれぞれトリフルオロアセチルイミダゾール(CF₃CO-Im)を用いてキャップ化した。キャップ化は目的とする配列以外の合成を抑制するとともに、不斉補助基のアミノ基をアシル化することで塩基性を低下させ、反応系中の酸性度を保持する目的で行った。続いて、DTDによりホスファイトの硫化、5'-末端のDMTr基の除去(3% DCA)を行い、さらにモノマーユニットを縮合させた。一連の鎖長伸長サイクルを繰り返し行うことで目的の塩基配列を有するホスホロチオエート4量体を合成した。最後に濃アンモニア-エタノール (3:1, v/v) の塩基性条件下で固相担体から切り出し、保護基の除去を行った。結果を以下の表3に示す。比較のため、従来法により2'-水酸基の保護基をTBDMS基として同様にCMPTを用いてAll-(Rp)-ApsGpsCpsUの合成を行った場合の平均縮合効率は77%であった。

(c)上記と同様にしてホスホロチオエートRNA12量体としてAll-(Rp), (Sp)-[Ups]₁₁Uを合成した。反応工程を以下に示す。

合成後、DMTr定量から算出した平均縮合収率はRp体、Sp体ともに99%であった。求核性の小さいCMPTを用いてRNAオリゴマーの合成を行っても、良好な平均縮合効率が得られた。濃アンモニア-EtOH (3:1, v/v)で4時間処理してオリゴマーを固相担体から切り出した後、ろ過により固相担体を除去し、再度アンモニア処理をして保護基を脱保護した。その後、反応液の溶媒を2ml程度まで留去してからCEM基及びDMTr基を残した状態でRP-HPLCにより分析した。目的物と思われるメインピークを分取精製し、滅菌水で凍結乾燥を3回繰り返すことにより脱塩した後、0.5% ニトロメタンを加えた0.5 M TBAF溶液で5時間処理してCEM基を脱保護した。Sep-Pak精製によりTBAFを除去し、凍結乾燥により溶媒を留去した。その後、80%酢酸溶液で1時間処理してDMTr基を脱保護した。Sep-Pak精製により脱塩し、RP-HPLCにより目的物と思われるメインピークを分取精製し、滅菌水で凍結乾燥を3回繰り返すことにより脱塩し、目的物を得た。MALDI-TOF-MASにより同定を行い、目的物であることを確認した。

All-(Rp)-(Ups)₁₁U 12mer
単離収率は12%。（収率は吸光係数ε₂₆₀ = 120320 (/M/cm)を用いて算出）
MALDI-TOF MAS : m/z calcd for C₁₀₈H₁₃₁N₂₄O₈₃P₁₁S₁₁ ^- [(M - H)^-] 3785.09, found 3788.62
All-(Sp)-(Ups)₁₁U 12mer
単離収率は 14%。（収率は吸光係数ε₂₆₀ = 120320 (/M/cm)を用いて算出）
MALDI-TOF MAS : m/z calcd for C₁₀₈H₁₃₁N₂₄O₈₃P₁₁S₁₁ ^- [(M - H)^-] 3785.09, found 3789.25

例5
4種類の核酸塩基を含んだ All-(Rp), (Sp)-(CpsApsGpsU)₃を合成した。DMTr定量により平均縮合効率を算出した結果、平均縮合効率はRp体90%, Sp体93%であった。メインピークをRP-HPLCにより分取精製した後、TBAFによりCEM基を除去し、MALDI-TOF-MASにより目的物であることを確認した。
All-(Sp)-[CpsApsGpsU]₃ 単離収率 1% (吸光係数 ε₂₆₀ = 124000(/M/cm)を用いて算出)
MALDI-TOF-MASS: m/z calcd for C₁₁₄H₁₄₁N₄₅O₇₁P₁₁S₁₁ ^- [(M - H)^-] 3968.29, found 3970.75.

All-(Sp)-[Ups]₁₁U の製造に比べて単離収率が低下する理由はシチジンモノマーの反応性が低いことにあると推定されたことから、シチジンモノマーを用いる縮合反応を2回繰り返し行うことでAll-(Rp)-(CpsApsGpsU)₃ を同様に合成したところ(シチジンモノマーについてダブルカップリング、15 min x 2）、シチジンモノマーとの縮合効率はそれぞれ10%ほど向上し、DMTr+定量から算出した12量体の平均縮合収率は92%に改善された。メインピークをRP-HPLCにより分取精製した後、TBAFによりCEM基を除去し、MALDI-TOF-MASにより目的物であることを確認した。
All-(Rp)-[CpsApsGpsU]₃ 単離収率 1% (吸光係数 ε₂₆₀ = 124000(/M/cm)を用いて算出)
MALDI-TOF-MASS: m/z calcd for C₁₁₄H₁₄₁N₄₅O₇₁P₁₁S₁₁ ^- [(M - H)^-] 3968.29, found 3969.15.

例6：活性化剤の検討
ホスホロチオエートRNAのRNAi医薬としての応用を目指し、核酸自動合成機による大量合成を考えた場合、ダブルカップリングは実用的な方法とはいえず、また得られた縮合効率もRNAオリゴマー合成に不十分であり、さらにシチジンモノマーの反応性を改善しなければなければならない。シチジンモノマーユニットの縮合反応効率を向上させる目的として、縮合反応に用いる活性化剤を検討した。活性化剤の検討は、2'-水酸基にTBDMS基を導入した先行研究において、高い縮合反応効率を実現している酸・アゾール複合体 N-フェニルイミダゾリウムトリフレート(PhIMT)を活性化剤としてモデル配列All-(Rp)-CpsCpsCpsU 4量体を合成することにより行った。

求核性の高いPhIMTを活性化剤として4量体を合成した。HPLCプロファイルを図1に示す。4量体を合成後、DMTr定量から算出した平均縮合効率は89%と、求核性の小さいCMPTと比較して縮合反応効率が大幅に向上し、オリゴマー合成に十分適応可能な良好な反応性を示した(entry 2)。しかしながら、PhIMTは求核性の高い活性化剤であることから、エピマー化が進行する可能性がある。そこで、次に、PhIMTを活性化剤としてUpsU 2量体を合成し、各ジアステレオマーの立体選択性を見積もった。2量体のHPLCプロファイルを図2に示す。

PhIMTを活性化剤として(Rp), (Sp)-UpsU 2量体を合成することにより、縮合反応時の立体選択性を算出した。立体選択性は、RP-HPLCにより分析したときの保持時間から、ジアステレオマーを同定して見積もった。その結果、HPLC profileのArea値から求めた立体選択性は、Rp体では98.0%、Sp体では99.7%であった。(entry 1-2)CEM基を保護基とした本合成条件においても、良好な立体選択性を発現することがわかった。
以上の条件検討から、活性化剤としてPhIMTを用いることにより、縮合反応効率が向上し、良好な立体選択性を発現することがわかった。この結果は、RNAオリゴマー合成に適用するのに十分である考え、次にPhIMTを活性化剤として、4種類の核酸塩基を含んだRNAオリゴマーを合成することにした。

例7：PhIMTを活性化剤としたAll-(Rp), (Sp)-(CpsApsGpsU)₃ 12量体の合成
縮合反応における活性化剤を検討した結果、求核性の高い活性化剤であるPhIMTを用いると、シチジンモノマーユニットの反応性が大幅に向上し、RNAオリゴマー合成に十分適応可能な縮合効率、立体選択性を発現した。そこで、活性化剤をCMPTからPhIMTに変更して、4種類の核酸塩基を含んだホスホロチオエートRNAオリゴマー合成を行った。

PhIMT を活性化剤として、All-(Rp), (Sp)-(CpsApsGpsU)₃ 12量体の固相合成を行った。得られた12量体のHPLCプロファイルを図3に示す。その結果、Rp 体、Sp 体ともに、シチジン導入工程における縮合反応効率を、10%程度向上させることに成功した(表7：entry2, 5)。次に、目的物と思われるピークをRP-HPLCにより分取精製した後、滅菌水で凍結乾燥を3回繰り返した。以上、求核性の高い活性化剤であるPhIMTを用いた場合、シチジンモノマーの反応性が大幅に向上し、非常に良好な縮合効率でホスホロチオエートRNAオリゴマーを立体選択的に合成可能であることが示された。

求核性の高いPhIMTを活性化剤とした4種類の核酸塩基を含んだホスホロチオエートRNAのオリゴマー合成では、2'-水酸基の保護基として立体的に小さいCEM基を用いた場合、立体障害の大きな保護基であるTBDMS基を使用した従来法よりも10%程度高い縮合効率が得られた。(entry1-2)
このように、シチジンモノマーユニットの反応性は、塩基部位の塩基性度だけではなく、2'-水酸基の立体的な環境により大きく変化することがわかった。ホスホロチオエートRNAオリゴマー合成において十分な縮合反応効率を獲得するには、求核性の高い活性化剤とともに、2'-水酸基の保護基として立体的に小さなCEM基を用いることが極めて重要であることが示された。

例8：ホスホロチオエートRNA 12量体の合成から脱保護
ホスホロチオエートRNA12量体としてAll-(Rp), (Sp)-(CpsApsGpsU)₃ 12量体を合成した。合成後、DMTr定量から算出した平均縮合収率は、Rp体は94%、Sp体は97%であった。求核性の高い活性化剤であるPhIMTを用いてRNAオリゴマーの合成を行うことで、良好な平均縮合効率が得られた。濃アンモニア-EtOH (3:1, v/v) で4 時間処理してオリゴマーを固相担体からの切り出した後、ろ過により固相担体を除去し、再度アンモニア処理をして保護基を脱保護した。その後、反応液の溶媒を2ml程度まで留去してからCEM基及びDMTr基を残した状態でRP-HPLCにより分析した。目的物と思われるメインピークを分取精製し、滅菌水で凍結乾燥を3回繰り返すことにより脱塩した後、0.5% ニトロメタンを加えた0.5M TBAF溶液で5時間処理してCEM基を脱保護した。Sep-Pak精製によりTBAFを除去し、凍結乾燥により溶媒を留去した。その後、80%酢酸溶液で1時間処理してDMTr基を脱保護した。Sep-Pak精製により脱塩し、RP-HPLCにより目的物と思われるメインピークを分取精製し、滅菌水で凍結乾燥を3回繰り返すことにより脱塩し、目的物を得た。MALDI-TOF MASにより同定を行い、目的物であることを確認した。
All-(Rp)-(CpsApsGpsU)₃ 12mer
単離収率は5%。（収率は吸光係数ε₂₆₀ = 124000 (/M/cm)を用いて算出）
MALDI-TOF MAS : m/z calcd for C₁₀₈H₁₃₁N₂₄O₈₃P₁₁S₁₁ ^- [(M - H)^-] 3968.29, found 3971.19
All-(Sp)-(CpsApsGpsU)₃ 12mer
単離収率は10%。（収率は吸光係数ε₂₆₀ = 124000 (/M/cm)を用いて算出）
MALDI-TOF MAS : m/z calcd for C₁₀₈H₁₃₁N₂₄O₈₃P₁₁S₁₁ ^- [(M - H)^-] 3968.29, found 3972.53

上記反応における固相合成は以下の工程(i)-(viii)を繰り返すことにより行なった。
(i) 3% ジクロロ酢酸(DCA)/ジクロルメタン; 15 s x 4
(ii) 洗浄 (ジクロルメタンに続きアセトニトリル) 及び乾燥
(iii) 縮合 (0.13 M モノマー及び無水アセトニトリル中1M CMPT及び1M PhIMT); 5-15min (1回又は2回)
(iv) 洗浄 (CH₃CN) 及び乾燥
(v) キャップ化 (0.5 M CF₃CO-Im 及び無水テトラヒドロフラン中 1 M 1,8-ビス(ジメチルアミノ)ナフタレン(DMAN)); 30 s
(vi) 洗浄 (テトラヒドロフラン) 及び乾燥
(vii) 硫化 (無水アセトニトリル中0.3 M ジメチルチウラムジスルフィド(DTD)); 10 min
(viii) 洗浄 (CH₃CN) 及び乾燥

縮合時間は2量体では5 min、4量体のうち[Ups]₃Uでは10 min、ApsGpsCpsU では15 min、12量体については15 minとした。キャップ化は4量体、12量体の合成において行った。各ステップを繰り返すことで鎖長伸長した後、5'-O-DMTr基を残した状態又は除去した状態でアンモニア処理を行った。5'-O-DMTr 基の除去は、3% DCA/ジクロルメタン (15 s x 4) 処理により行い、ジクロルメタンにて洗浄した。続いて濃アンモニア-エタノール (3:1, v/v) (6 ml) を加え、密栓した後、2量体については3時間、4量体については8時間又は12時間、12量体については48時間アンモニア処理を行なった。

2量体、4量体に関しては、アンモニアを留去した後、凍結乾燥してものに滅菌水を加え、ろ過をしてRP-HPLC (Senshu-Pak C18; 2量体条件A, 4量体条件 B) により分析した。12量体に関しては、溶液が2 ml程度になるまで減圧留去した後、RP-HPLC (Senshu-Pak C18 又は Waters C18; 12量体条件 C 又は条件 D ) により分析した。4量体、12量体に関しては、RP-HPLCにより分取精製を行い、残渣を滅菌水を用いて凍結乾燥を3回繰り返すことにより脱塩を行なった後、4量体に関しては0.5% CH₃NO₂を加えた0.5 M TBAF/ DMSO (1.0 ml) 溶液中で4時間室温で撹拌し、12量体に関しては0.5% CH₃NO₂を加えた0.5 M TBAF/ DMSO (400 μl) 溶液中で5時間室温で撹拌した。0.1 M TEAA buffer (pH 7) (40 ml) を加えて反応を停止し、4量体に関してはRP-HPLC (Senshu-Pak C18; 条件 B) 、12量体に関してはRP-HPLC (Senshu-Pak C18 又は Waters C18; 条件 D) により分析した。

逆相HPLC (RP-HPLC)にはPEGASIL ODS 5 μm column (120Å , 4.0 mm × 150 mm) (Senshu Pak) 又はμBondasphere C18 5μm column (100 A, 3.9 mm × 150 mm) (Waters)をカラムとして用いた。溶出条件として条件 A (0-20% アセトニトリル/0.1 M トリエチルアンモニウムアセテート (TEAA) バッファー (pH 7.0)、30℃、60 min、0.5 mL/min), 条件 B (0-30% アセトニトリル/0.1 M トリエチルアンモニウムアセテート (TEAA) バッファー (pH 7.0)、30℃、90 min、0.5 mL/min), 条件 C (0-25% アセトニトリル/0.1 M TEAA バッファー (pH 7.0)、30℃、75 min、0.5 mL/min、条件 D (0-75% アセトニトリル/0.1 M TEAA バッファー (pH 7.0)、30℃、75 min、0.5 mL/min)及び条件 E (0-30% アセトニトリル/0.1 M TEAA バッファー (pH 7.0)、30℃、60 min、0.5 mL/min)を用いた。

12量体に関しては、Sep-Pak(登録商標) tC18を用い80% アセトニトリル水溶液で溶出することで脱塩を行なった。得られた12量体を含む溶液を凍結乾燥した後、80% 酢酸溶液中で1時間室温で撹拌した。2M TEAAバッファー(pH 7) (20ml) を加えて反応を停止し、Sep-Pak(登録商標) tC18を用い40% アセトニトリル水溶液で溶出することで脱塩を行なった。得られた溶液のアセトニトリルを減圧留去した後、RP-HPLC (Senshu-Pak C18又はWaters C18; 条件 D) により分析した。12量体をRP-HPLCにより分取精製し、滅菌水で凍結乾燥を三回繰り返し脱塩した後、目的とするRNAオリゴマーを得た。得られたRNAオリゴマーは、MALDI-TOF-MASSにより目的物を同定した。

例9
CEM基の脱保護条件を検討した。

CEM基はTBAFにより選択的に除去されるが、TBAFによる脱保護反応の際にホスホロチオエートの脱硫が数%観測される場合がある。この理由は、不斉補助基の残渣が触媒として働き、脱硫反応を促進していることにあると考えられる。RP-HPLCにより分取精製を行うことで、脱硫を大幅に抑制可能であることから、4量体を分取精製した後に脱保護反応に付した。文献(Nucleic Acids Res., 35, pp.3287-3296, 2007)記載の方法に従って0.5M TBAFで処理することによりCEM基を脱保護した。その際、脱CEM化反応の際の副生成物であるアクリロニトリルが核酸塩基部位に付加するのを抑制するためにニトロメタンを0.5%添加した。脱保護反応後にRP-HPLCにより分析を行ったところ、脱保護反応は定量的に進行しており、核酸塩基部位の修飾や脱硫などの副反応は認められなかった。

例10：ホスホロチオエートRNAの酵素耐性
nP1による酵素分解については、単離精製した(CpsApsGpsU)₃12 量体 (1.0 nmol)、nP1 (1 unit)、50mM CH₃COONa、1mM ZnCl₂を含む水溶液 (20 μl、pH 7.2) を16h、37℃で恒温放置した。0.1M TEAA バッファー (pH 7) (80 μl) を加えた後、1分間、100℃で恒温放置して酵素を失活させた。残渣をろ過した後、RP-HPLC (Senshu-Pak C18 又は Waters C18 ; 条件 E) により分析した。
SVPDEによる酵素分解については、単離精製した(CpsApsGpsU)₃12量体(1.0 nmol)、SVPDE (0.1 x 10^-3 unit)、100mM Tris-HCl、15mM MgCl₂を含む水溶液 (20 μl、pH 8.5) を16時間、37℃で恒温放置した。0.1M TEAA バッファー (pH 7) (80 μl) を加えた後、1分間、100℃で恒温放置して酵素を失活させた。残渣をろ過した後、RP-HPLC (Senshu-Pak C18 又は Waters C18 ; 条件 E) により分析した。
Snake venom ホスホジエステラーゼはSigmaより、ヌクレアーゼ P1はYamasaより購入したものを用いた。

合成した各ホスホロチオエートRNA 12量体の酵素耐性を確認することにより、リン原子の絶対立体配置を決定した。酵素は、3'-exo-ヌクレアーゼであるSVPDE と endo-ヌクレアーゼである nP1 の 2 種類を立体決定に使用した。SVPDEはRp体のホスホロチオエートジエステル結合を、nP1はSp体を選択的に加水分解する酵素として知られている。各オリゴマーは、上記の実験方法に示すように、37℃、16時間、恒温放置して酵素反応させた。その後、酵素を失活させてから、RP-HPLC により分析した。
その結果、All-(Rp)-(Ups)₁₁U 12量体及び All-(Rp)-(CpsApsGpsU)₃ 12量体では、SVPDE によりオリゴマーが全て酵素分解され、また All-(Sp)-(Ups)₁₁U 12量体及び All-(Sp)-(CpsApsGpsU)3 12量体では、nP1 によりオリゴマーが全て酵素分解された。結果を図4に示す。この結果から、合成したRNAオリゴマーの絶対立体配置がそれぞれRp 体、Sp 体であることが示された。

例11：四種類の核酸塩基を含んだホスホロチオエートRNAの二重鎖融解温度（Tm）の解析
r(CAGU)₃ - r(ACUG)₃ 二重鎖融解温度の測定方法
単離精製したAll-(Rp)-(CpsApsGpsU)₃又はAll-(Sp)-(CpsApsGpsU)₃ 又はstereo-random (CpsApsGpsU)₃ 又は (CpoApoGpoU)₃と(ApoCpoUpoG)₃各々0.45 nmolを、10mM リン酸、100mM NaCl、及び0.1mM EDTAを含む水溶液 (200 μl、pH 7) に溶かした。オリゴマー溶液を減圧下、10分間脱気したのち8連セルに165 μl加え、室温から5℃/分の速度で90℃まで上昇させた後、90℃の状態を10分間保持し、-2℃/分の速度で0℃になるまで温度を下降させ、アニーリングを行なった。オリゴマー溶液を0℃で90 分間静置した後、窒素気流下、0.5℃/分の速度で90℃まで温度を上昇させながら、0.5℃ 間隔で260 nmにおける吸光度を測定した。

本合成法により合成したAll-(Rp), (Sp)-(CpsApsGpsU)₃ 12量体が、相補的配列をもつ天然型RNA 12量体の間で形成する二重鎖の融解温度（Tm）を測定した。リン原子の絶対立体配置が、二重鎖形成能に与える影響について詳細に解析するため、天然型RNA 12量体とリン原子の立体が制御されていない立体制御されていない(CpsApsGpsU)₃ RNA 12量体についても、二重鎖形成能を評価した。二重鎖融解温度は、より生理条件に近い10mM リン酸バッファー、100mM NaClの緩衝液で測定した。結果を図5及び表9に示す。

All-(Rp)-(CpsApsGpsU)₃ 12量体が形成する二重鎖のTm値は、65.38℃であり、天然型RNAが形成する二重鎖よりも3.7℃高く、4種類の核酸塩基を含んだRp体は天然型RNAよりも安定な二重鎖を形成することがわかった。一方、All-(Sp)-(CpsApsGpsU)₃ 12量体が形成する二重鎖のTm値は、50.94℃と天然型RNAが形成する二重鎖よりも10.71℃低く、不安定化することがわかった。また、立体制御していないホスホロチオエートRNAの二重鎖のTm値は、57.48℃となり、天然型RNAよりも若干ながら不安定ではあるが、Rp体とSp体のちょうど中間の二重鎖形成能をもった。以上、各絶対立体配置間のホスホロチオエートRNAの二重鎖形成能をまとめると以下のようになる。
二重鎖安定性
All-(Rp)-PS-RNA > 天然型 RNA > ランダム PS-RNA > All-(Sp)-PS-RNA

例12：核酸自動固相合成機によるホスホロチオエートRNA 12量体の合成
オキサザホスホリジンモノマーユニットを用いて、立体制御されたホスホロチオエートRNAオリゴマーの合成を自動固相合成機で行った。立体選択的に合成されたホスホロチオエートRNAのRNAi医薬への応用を踏まえると、簡便で再現性の高い自動固相合成機によりRNAオリゴマーを大量合成することを可能とする工程を確立することが非常に重要である。そこで、以前に手動固相合成で検討した4種類の核酸塩基を含んだホスホロチオエートRNA 12量体の合成を自動固相合成機により行った。自動固相合成機は、Applied Biosystems社製のExpedite 8909 Nucleic Acid Synthesis Systemを使用した。

自動固相合成では、サクシニルリンカーを介してHCPに担持させた5'-O-(DMTr)uridine (0.25 μmol) を用いた。縮合時間は、15 分とした。各ステップを繰り返すことで鎖長伸長した。続いて、DMTr基を残した状態でカラムに濃アンモニア-EtOH (3:1, v/v) (4 ml) を加え、4h、25℃で固相担体から切り出した後、15 mlファルコンチューブに濃アンモニア-EtOH (3:1, v/v) (5 ml) で洗浄しながら移し、44時間、25℃で恒温放置した。続いて、アンモニアを溶液が2ml程度になるまで溶媒留去した後、RP-HPLC (Senshu-Pak C18 又は Waters C18; 12 量体条件 D ) により分析した。その結果、目的物がメインピークで得られ、自動固相合成機においても問題なく各ステップにおいて良好な縮合効率で縮合反応が進行することがわかった。その後、RP-HPLCにより分取精製を行い、残渣を滅菌水を用いて凍結乾燥を3回繰り返すことにより脱塩を行なった。得られた12量体のHPLCプロファイルを図6に示す。

Claims

下記の一般式(I)：
〔式中、Ｒ¹は水素原子又は下記置換基群Ａから選ばれるいずれかの水酸基の保護基を示し、Ｂｓは下記置換基群Ｂから選ばれるいずれかの保護基を有していてもよい核酸塩基を示し、ｎは０又は１以上の整数を示し、ｎ個のＸはそれぞれ独立に下記の一般式(ＩＩ-Ｓｐ)又は(ＩＩ-Ｒｐ)：

（式中、Ｂｓは上記と同義であり、Ｒ^２は水素原子又はシアノエトキシメチル基を示す）で表される二価の基を示す〕で表されるリボヌクレオシドホスホロチオエート又はその塩の製造方法であって、下記の一般式(III):

（式中、Ｂｓ、Ｘ、及びｎは上記と同義であり、Ｒ^３及びＲ^４はそれぞれ独立に水酸基の保護基を示すが、いずれか片方は必要に応じてリンカーを介して結合した固相担体を示してもよい）で表される化合物に下記の一般式(ＩＶａ)又は(ＩＶｂ):

（式中、Ｂｓは上記と同義であり、ＣＥＭはシアノエトキシメチル基を示し、Ｒ⁵は水酸基の保護基を示し、Ｒ^６は置換基を有していてもよいアリール基を示す）で表されるオキサザホスホリジンリボヌクレオシドを縮合させた後に硫化する工程を含む方法。

置換基群Ａ：アセチル基，フェノキシアセチル基，ベンジル基，４−メトキシベンジル基，ベンゾイル基，ピバロイル基，４,４'−ジメトキシトリチル基(ＤＭＴｒ)，トリメチルシリル基(ＴＭＳ)，Ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基(ＴＢＤＭＳ)，２−(シアノエトキシ)エチル基(ＣＥＥ)，及びシアノエトキシメチル基(ＣＥＭ)。

置換基群Ｂ：ベンゾイル基，4-メトキシベンゾイル基，アセチル基，プロピオニル基，ブチリル基，イソブチリル基，フェニルアセチル基，フェノキシアセチル基，４−tert−ブチルフェノキシアセチル基，４−イソプロピルフェノキシアセチル基，及び(ジメチルアミノ)メチレン基。
Ｒ^６がフェニル基である請求項１に記載の方法。
Ｒ^５が４,４'-ジメトキシトリチル基である請求項１又は２に記載の方法。
縮合を活性化剤の存在下で行う請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
活性化剤としてＮ−(シアノメチル)ピロリジニウム・トリフレート又はＮ−フェニルイミダゾリウム・トリフレートを用いる請求項４に記載の方法。
硫化剤としてジメチルチウラムジスルフィドを用いる請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
一般式（ＩＩＩ）においてｎが０である化合物を出発原料として用いて上記工程をｎ+１回繰り返す工程を含む請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
反応を固相法で行う請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
必要に応じてリンカーを介して固相担体に結合した一般式(III)においてｎが０である化合物を用いる請求項８に記載の方法。
ｎ+１個のＸが全て(II-Sp)で表される二価の基であるか、又は全て(II-Rp)で表される二価の基である請求項１ないし９のいずれか１項に記載の方法。
請求項１に記載の一般式(I)（式中、Ｒ^１、Ｂｓ、ｎ、及びＸは上記と同義であり、ただしＲ²はシアノエトキシメチル基を示す）で表されるリボヌクレオシドホスホロチオエート又はその塩。
請求項１に記載の一般式(ＩＶａ)又は(ＩＶｂ)（式中、Ｂｓ、ＣＥＭ、Ｒ^５、及びＲ^６は上記と同義である）で表されるオキサザホスホリジンリボヌクレオシド。