JP2011184318A

JP2011184318A - リボヌクレシドｈ−ボラノホスホネート

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Publication number: JP2011184318A
Application number: JP2010048823A
Authority: JP
Inventors: Takeshi Wada; 猛和田; Shingo Hiura; 進吾日浦
Original assignee: University of Tokyo NUC
Current assignee: University of Tokyo NUC
Priority date: 2010-03-05
Filing date: 2010-03-05
Publication date: 2011-09-22

Abstract

【課題】ボラノホスフェート及びその他の含リン酸-ホウ素結合修飾型RNAの効率的な合成に有用なリボヌクレオシドH-ボラノホスホネート化合物を提供する。
【解決手段】下記式(I)(R¹及びR²はそれぞれ独立に水素原子又は水酸基の保護基を示し、Bsは保護基を有していてもよい核酸塩基を示す）で表されるリボヌクレオシド H-ボラノホスホネート又はその塩。

【選択図】なし

Description

本発明はリボヌクレオシドH-ボラノホスホネート及びこの化合物を用いたリボヌクレオシド誘導体の製造方法に関する。

RNA干渉(RNAi)は20 塩基対程度の低分子RNAによって遺伝子発現が抑制される生命現象であり、近年、このRNAi を利用した疾病関連遺伝子の発現を制御する人工核酸分子の開発が盛んに行われている。しかしながら、天然型RNA分子は生体内で分解酵素により容易に加水分解されてしまうため、核酸医薬として用いることはできないことから、安定性向上を目的として様々な化学修飾が施されたRNA 類縁体の合成が研究されている。なかでも、リン原子上の非架橋酸素原子の一つをボラノ基(BH₃)で置換したボラノホスフェート型RNA は分解酵素耐性、脂溶性、遺伝子発現抑制能などの点で優れた性質を示すことが報告されている(Chem. Rev., 107, pp.4746-4796, 2007; Ann. NY Acad. Sci., 1002, pp.12-29, 2003)。

ボラノホスフェート型核酸の合成法としては酵素法と化学合成法が知られている。化学合成により長鎖のボラノホスフェート型DNAを合成する方法としてはH-ホスホネート法(Acc. Che. Res., 35, pp.952-960, 2002; J. Am. Chem. Soc., 120, pp.9417-9427, 1998)、ホスホロアミダイト法(Tetrahedron Lett., 43, pp.749-751, 2002; J. Am. Chem. Soc., 128, pp.8138-8139, 2006)、及びボラノホスホロトリエステル法(J. Org. Chem., 71, pp.4262-4265, 2006; Bioorg. Med. Chem., 16, pp.9154-9160, 2008)がそれぞれ固相合成に適用されている。長鎖のボラノホスフェート型RNAについては酵素法による合成が報告されているが(J. Org. Chem., 63, pp.5769-5733, 1998; Nucleosides, Nucleotides Nucleic Acids, 24, p.943, 2005)、化学合成による長鎖のボラノホスフェート型RNAの合成は従来報告されていない。

一方、H-ホスホネート型核酸はホスホロチオエートをはじめとする様々なリン原子修飾型核酸の製造用中間体として知られているが、H-ボラノホスホネート型核酸も同様の化学変換を経てリン-ホウ素結合を含むリン原子修飾型核酸の鍵中間体として利用できるものと期待される。

H-ボラノホスホネート型DNAについては2'-デオキシヌクレオシドH-ボラノホスホネートの合成と変換反応が報告されており、2'-デオキシヌクレオシドH-ボラノホスホネートは安定に単離することができ、ボラノホスホロチオエートへの変換反応も容易に進行することが確認されてる(Chem. Commun., 18, pp.2466-2468, 2009)。しかしながら、H-ボラノホスホネート型RNAについては従来報告がない。

Chem. Rev., 107, pp.4746-4796, 2007 Ann. NY Acad. Sci., 1002, pp.12-29, 2003 Acc. Che. Res., 35, pp.952-960, 2002 J. Am. Chem. Soc., 120, pp.9417-9427, 1998 Tetrahedron Lett., 43, pp.749-751, 2002 J. Am. Chem. Soc., 128, pp.8138-8139, 2006 J. Org. Chem., 71, pp.4262-4265, 2006 Bioorg. Med. Chem., 16, pp.9154-9160, 2008 J. Org. Chem., 63, pp.5769-5733, 1998 Nucleosides, Nucleotides Nucleic Acids, 24, p.943, 2005 Chem. Commun., 18, pp.2466-2468, 2009

本発明の課題は、ボラノホスフェート及びその他の含リン酸-ホウ素結合修飾型RNAの効率的な合成に有用なリボヌクレオシドH-ボラノホスホネート化合物を提供することにある。また、本発明の別の課題は、上記のリボヌクレオシドH-ボラノホスホネート化合物を用いたオリゴリボヌクレオシド誘導体の効率的な製造方法を提供することにある。

本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、リボヌクレオシド誘導体をH-ボラノホフフィニル化することによりモノリボヌクレオシド H-ボラノホスホネートを効率的に合成することに成功した。また、このモノリボヌクレオシド H-ボラノホスホネートを用いてジリボヌクレオシドH-ボラノホスホネートを合成し、さらにボラノホスフェート誘導体及びボラノホスホロチオエート誘導体を合成することに成功した。本発明は上記の知見を基にして完成されたものである。

すなわち、本発明により、下記の一般式(I)：

（式中、R¹及びR²はそれぞれ独立に水素原子又は水酸基の保護基を示し、Bsは保護基を有していてもよい核酸塩基を示す）で表されるリボヌクレオシド H-ボラノホスホネート又はその塩が提供される。

この発明の好ましい態様によれば、R¹及びR²が異なる水酸基の保護基である上記のリボヌクレオシド H-ボラノホスホネート又はその塩；R¹が4,4'-ジメトキシトリチル基であり、R²がtert-ブチルジメチルシリル基である上記のリボヌクレオシド H-ボラノホスホネート又はその塩；Bsがそれぞれ保護基を有していてもよいアデニン、ウラシル、グアニン、又はシトシンである上記のリボヌクレオシド H-ボラノホスホネート又はその塩が提供される。

また、本発明により、上記の一般式(I)で表される化合物の製造方法であって、下記の一般式(II)：

（式中、R¹¹及びR¹²はそれぞれ独立に水酸基の保護基を示し、Bsは核酸塩基を示す）で表されるリボヌクレオシド化合物をH-ボラノホスフィニル化する工程を含む方法が提供される。

上記発明の好ましい態様によれば、H-ボラノホスフィニル化をピリジミウム H-ボラノホスホネートを用いて行う上記の方法；R¹¹が4,4'-ジメトキシトリチル基であり、R¹²がtert-ブチルジメチルシリル基である上記の方法；縮合剤の存在下で行う上記の方法；縮合剤がN,N-ビス(2-オキソ-3-オキサゾリジニル)ホスフィン酸クロライド(BopCl)である上記の方法が提供される。

別の観点からは、本発明により、下記の一般式(III)：

（式中、R²¹、R²²、及びR²⁴はそれぞれ独立に水素原子又は水酸基の保護基を示し、R²³は水素原子、水酸基の保護基、又は必要に応じてリンカーを介して結合した固相担体を示し、Bsは核酸塩基を示し、nは0又は1以上の整数を示す）で表されるオリゴリボヌクレオシド H-ボラノホスホネートが提供される。

また、上記一般式(III)で表されるオリゴリボヌクレオシド H-ボラノホスホネートの製造方法であって、下記の一般式(IV)：

（式中、R²²、R²³、R²⁴、Bs、及びnは上記と同義である）で表される化合物と下記の一般式(IA)：

（式中、R²¹、R²²、及びBsは上記と同義である）で表される化合物又はその塩とを縮合する工程を含む方法も提供される。

上記の方法の好ましい態様によれば、R²¹、R²²、及びR²⁴がそれぞれ独立に水酸基の保護基であり、R²³が水酸基の保護基、又は必要に応じてリンカーを介して結合した固相担体である上記の方法；nが0又は1〜50の整数である上記の方法；nが１〜50の整数であり、R²³が必要に応じてリンカーを介して結合した固相担体である上記の方法；縮合剤として1,3-ジメチル-2-(3-ニトロ-1,2,4-トリアゾール-1-イル)-2-ピロリジン-1-イル-1,3,2-ジアザホスホリジニウム・ヘキサフルオロホスフェート(MNTP)を用いる上記の方法；塩基の存在下で行う上記の方法；塩基として1,8-ビス(ジメチルアミノ)ナフタレンを用いる上記の方法が提供される。

さらに別の観点からは、下記の一般式(V):

（式中、R³¹、R³²、及びR³⁴はそれぞれ独立に水素原子又は水酸基の保護基を示し、R³³は水素原子、水酸基の保護基、又は必要に応じてリンカーを介して結合した固相担体を示し、Bsは核酸塩基を示し、XはOH又はSHを示し、mは1以上の整数を示す）で表される化合物又はその塩の製造方法であって、下記の一般式(VI)：

（式中、R³¹、R³²、R³³、R³⁴、Bs、及びmは上記と同義である）で表される化合物を硫化剤又は酸化剤で処理する工程を含む方法が提供される。

この発明の好ましい態様によれば、酸化剤として(+)-(8,8-ジクロロカンフォリルスルホニル)-オキサジリジン(DCSO)を用いる方法；酸化剤とともに塩基を用いる上記の方法；塩基としてジイソプロピルエチルアミンを用いる上記の方法；ポジティブハロゲン試薬を用いて中間体としてハロゲン化ボラノホスホリル誘導体を経由してボラノホスフェートを製造する上記の方法；ジイソプロピルエチルアミン及び四塩化炭素をアセトニトリル-水の混合溶媒中で作用させる上記の方法；硫化剤としてイオウ(S₈)又はジメチルチウラムジスルフィド(DTD)を用いる上記の方法；硫化剤とともに塩基を用いる上記の方法；塩基としてジイソプロピルエチルアミン又は1,8-ビス(ジメチルアミノ)ナフタレンを用いる上記の方法が提供される。

本発明により提供される一般式(I)で表されるリボヌクレオシド H-ボラノホスホネートを用いることによりオリゴリボヌクレオシド H-ボラノホスホネートを簡便かつ高収率に製造することができる。本発明のリボヌクレオシド H-ボラノホスホネートを用いたオリゴリボヌクレオシド H-ボラノホスホネートの合成は固相法でも行うことができるので、長鎖のオリゴリボヌクレオシド H-ボラノホスホネートを極めて効率的に製造することができるという特徴がある。また、オリゴリボヌクレオシド H-ボラノホスホネートはボラノホスフェート型RNAやボラノホスホロチオエート型RNAなどに変換することができ、多様なリン修飾型RNAを効率的に製造することが可能である。

一般式(I)においてR¹及びR²はそれぞれ独立に水素原子又は水酸基の保護基を示す。水酸基の保護基の種類は特に限定されず、一般的には、アセチル基やフェノキシアセチル基(Pac)などのアセチル保護基、ベンジル基や4-メトキシベンジル基などのベンジル保護基、ベンゾイル基、ピバロイル基、4,4'-ジメトキシトリチル基(DMTr)などのトリチル保護基、トリメチルシリル基(TMS)やTert-ブチルジメチルシリル基(TBDMS)などのシリル保護基、2-(シアノエトキシ)エチル基(CEE)やシアノエトキシメチル基(CEM)などのエーテル保護基など適宜の保護基を1種又は2種以上組合わせて用いることができる。水酸基の保護基についてはGreenら、Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Edition, 1999, John Wiley & Sons, Inc.などの成書を参照することができる。R¹及びR²が保護基を示す場合には、合成過程において片方の保護基のみを脱離させることができるように、R¹及びR²が異なる保護基であることが好ましい。例えばトリチル保護基及びシリル保護基を組み合わせて用いることが好ましいが、R¹がトリチル保護基であり、R²がシリル保護基であることがより好ましい。特に好ましいのはR¹が4,4'-ジメトキシトリチル基であり、R²がtert-ブチルジメチルシリル基の場合である。

一般式(I)においてBsは保護基を有していてもよい核酸塩基を示す。核酸塩基としてはアデニン、ウラシル、チミン、グアニン、及びシトシンからなる群から選ばれる核酸塩基のほか、リボチミジンや5-メチルウリジンなどの任意の修飾塩基を用いてもよい。好ましくは、RNAの構成塩基であるアデニン、ウラシル、グアニン、及びシトシンからなる群から選ばれる核酸塩基を用いることができる。核酸塩基は残基となって通常の結合部位でリボースに結合することができる。他の一般式におけるBsも上記と同様である。

核酸塩基が保護基を有する場合、保護基の種類は特に限定されないが、アミノ基を有する核酸塩基を用いる場合にはアミノ基を保護することができる。例えば、アミノ基を有する核酸塩基であるアデニン、グアニン、及びシトシンのアミノ基を保護することが好ましい場合があり、保護基として、例えばベンゾイル基、4-メトキシベンゾイル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、フェニルアセチル基、フェノキシアセチル基、4-tert-ブチルフェノキシアセチル基、4-イソプロピルフェノキシアセチル基、(ジメチルアミノ)メチレン基などを用いることができる。他の一般式におけるBsも上記と同様である。

一般式(I)で表されるリボヌクレオシド H-ボラノホスホネートの塩の種類は特に限定されないが、例えば、有機アミンの塩などが好ましく、より好ましくは、例えばトリエチルアミン塩などの三級アルキルアミン化合物の塩を用いることができる。一般式(I)で表されるリボヌクレオシド H-ボラノホスホネートとしては光学的に純粋な化合物、ラセミ体、又はジアステレオ混合物など任意の形態の物質であってもよい。また、一般式(I)で表されるリボヌクレオシド H-ボラノホスホネート又はその塩は、水和物や溶媒和物の形態であってもよい。

一般式(I)で表されるリボヌクレオシド H-ボラノホスホネートは、上記一般式(II)で表されるリボヌクレオシド化合物をH-ボラノホスフィニル化することにより製造することができ、必要に応じてその後に脱保護工程を付加することができる。一般式(II)におけるR¹¹及びR¹²はぞれぞれ一般式(I)で表されるリボヌクレオシド H-ボラノホスホネートにおけるR¹及びR²の保護基と同様である。R¹¹及びR¹²が異なる保護基であることが好ましく、例えばトリチル保護基及びシリル保護基を組み合わせて用いることが好ましいが、R¹¹がトリチル保護基であり、R¹²がシリル保護基であることがより好ましい。特に好ましいのはR¹¹が4,4'-ジメトキシトリチル基であり、R¹²がtert-ブチルジメチルシリル基の場合である。

H-ボラノホスフィニル化剤の種類は特に限定されないが、例えばピリジミウム H-ボラノホスホネート(Chem. Commun., 18, pp.2466-2468, 2009)などのH-ボラノホスホネートの有機アミン塩を用いて行うことができる。ピリジミウム H-ボラノホスホネートを用いる場合には反応を縮合剤の存在下で行ってもよい。また、反応を縮合剤及び求核触媒の存在下で行うこともできる。縮合剤としては、例えばN,N-ビス(2-オキソ-3-オキサゾリジニル)ホスフィン酸クロライド(BopCl)や3-ニトロ-1,2,4-トリアゾール-1-イル-トリス(ピロリジン-1-イル)ホスホニウム・ヘキサフルオロホスフェート(PyNTP)などを用いることができ、求核触媒としては、例えば3-ニトロ-1,2,4-トリアゾールなどを用いることができる。求核触媒の非存在下で縮合剤のみで反応を行うことが副反応の進行を抑制するなどの観点から一般的には好ましい。

反応は氷冷下から室温程度の温度で数分から数時間程度で完了する。反応溶媒の種類は特に限定されないが、ピリジミウム H-ボラノホスホネートを用いる場合には無水ピリジン中で反応を行うことが好ましい。反応終了後、反応溶液をクロロホルムなどの不活性有機溶媒で希釈し、炭酸水素トリエチルアンモニウム(TAEB)バッファーなどを用いて系中に生じた塩化ピリジミウムを中和して反応を停止することができる。反応を停止する前にピリジンなどの反応溶媒を留去すると塩化ピリジミウムの酸性によって保護基が脱離する場合がある。例えば5'-水酸基の保護基としてDMTr基を用い、3'-水酸基の保護基としてTBDMS基を導入したリボヌクレオシド誘導体を縮合剤BopClの存在下でピリジミウム H-ボラノホスホネートによりH-ボラノホスフィニル化することができる。得られた一般式(I)で表されるリボヌクレオシド H-ボラノホスホネートから必要に応じて核酸塩基及び／又は水酸基の保護基を脱離することができるが、保護基の脱離条件は保護基の種類に応じて当業者に適宜選択可能である。

一般式(I)で表されるリボヌクレオシド H-ボラノホスホネートを用いて一般式(III)で表されるオリゴリボヌクレオシド H-ボラノホスホネートを製造することができる。一般式(III)において、R²¹、R²²、及びR²⁴はそれぞれ独立に水素原子又は水酸基の保護基を示す。水酸基の保護基は上記のR¹及びR²について説明したものと同様であり、異なる条件で保護基の脱離を行うことができるようにそれぞれ異なる保護基を用いることが好ましい。例えば、R²¹が4,4'-ジメトキシトリチル基であり、R²²がtert-ブチルジメチルシリル基であり、R²⁴がフェノキシアセチル基である場合などが好ましい。

R²³は水素原子、水酸基の保護基、又は必要に応じてリンカーを介して結合した固相担体を示す。水酸基の保護基としてはR¹及びR²について説明したものと同様のものを用いることができる。R²³が固相担体又はリンカーを介して結合した固相担体を示す場合、固相担体の種類は特に限定されず、核酸誘導体の合成において固相担体として用いることができるものであれば任意の固相担体を用いることが可能である。リンカーの種類や長さも特に制限されず、当業者が適宜選択できる。例えば固相担体として定孔ガラス(controlled pore glass: CPG)、オキサリル化−定孔ガラス(Nucleic Acids Res., 19, 1527, 1991など)、TentaGel支持体-アミノポリエチレングリコール誘導体化支持体(Tetrahedron Letters, 34, 3373, 1993など)、高架橋アミノメチルポリスチレン（highly cross-linked polystyrene: HCP, Tetrahedron Letters, 32, 4096, 1991）、Poros-ポリスチレン／ジビニルベンゼンのコポリマーなどを挙げることができ、リンカーとしては、例えば、3-アミノプロピル基、スクシニル基、2,2'-ジエタノールスルホニル基、ロングチェーンアルキルアミノ基(LCAA)などを挙げることができる。nは0又は1以上の整数を示すが、好ましくはnは100以下の整数、より好ましくは50以下の整数、さらに好ましくは40以下の整数である。

上記一般式(III)で表されるオリゴリボヌクレオシド H-ボラノホスホネートは上記一般式(IV)で表される化合物と一般式(IA)で表されるリボヌクレオシド H-ボラノホスホネート又はその塩とを縮合することにより製造することができる。反応は、一般的には塩基の存在下で縮合剤を用いて行うことができる。塩基の種類は特に限定されず、例えば1,8-ビス(ジメチルアミノ)ナフタレン(DMAN)、2,2,6,6-テトラメチルピペリジン(TMP)、又はジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)などを用いることができるが、副反応の抑制の観点から1,8-ビス(ジメチルアミノ)ナフタレンを用いることが好ましい場合がある。縮合剤としては、例えばN,N-ビス(2-オキソ-3-オキサゾリジニル)ホスフィン酸クロライド、3-ニトロ-1,2,4-トリアゾール-1-イル-トリス(ピロリジン-1-イル)ホスホニウム・ヘキサフルオロホスフェート(PyNTP)、又は1,3-ジメチル-2-(3-ニトロ-1,2,4-トリアゾール-1-イル)-2-ピロリジン-1-イル-1,3,2-ジアザホスホリジニウム・ヘキサフルオロホスフェート(MNTP)などを用いることができるが、副作用の抑制の観点から1,3-ジメチル-2-(3-ニトロ-1,2,4-トリアゾール-1-イル)-2-ピロリジン-1-イル-1,3,2-ジアザホスホリジニウム・ヘキサフルオロホスフェートを用いることが好ましい場合がある。

反応は一般的にはアセトニトリルなどの不活性溶媒中で氷冷下から室温程度の温度で数分から数時間で完了する。得られた一般式(III)で表されるオリゴリボヌクレオシド H-ボラノホスホネートを出発原料として用い、一般式(IA)で表されるリボヌクレオシド H-ボラノホスホネート又はその塩を縮合させることにより、リボヌクレオシドH-ボラノホスホネート単位を一つ増加させた化合物を製造することができ、さらに得られた化合物を出発原料として用い、一般式(IA)で表されるリボヌクレオシド H-ボラノホスホネート又はその塩を縮合させることにより、リボヌクレオシドH-ボラノホスホネート単位をさらに一つ増加させることができる。この反応を繰り返して行うことにより、所望の数のリボヌクレオシドH-ボラノホスホネート単位を有するオリゴリボヌクレオシド H-ボラノホスホネートを製造することができる。

上記の繰り返しによるオリゴリボヌクレオシド H-ボラノホスホネートの製造は、好ましくは固相法により行うことができる。固相法によるオリゴ核酸合成法を応用して自動合成機を用いて合成を行うことも可能である。固相法に関しては種々の文献を利用することができ、当業者であれば適宜の条件を容易に選択することが可能である。例えば、固相法を行うにあたりキャップ化や固相担体からの切り出しの条件も当業者であれば適宜選択できる。

このようにして製造されるオリゴリボヌクレオシド H-ボラノホスホネートはオリゴリボヌクレオシド H-ボラノホスフェート若しくはその塩又はオリゴリボヌクレオシド H-ボラノホスホロチオエート若しくはその塩へと変換することができる。オリゴリボヌクレオシド H-ボラノホスフェートを製造するための酸化剤としては、例えば(+)-(8,8-ジクロロカンフォリルスルホニル)-オキサジリジン(DCSO)などを用いることができるが、これに限定されるわけではない。酸化反応は塩基の存在下で行ってもよい。例えばジイソプロピルエチルアミンなどの存在下で行うこともできる。あるいはポジティブハロゲン試薬を用いて中間体としてハロゲン化ボラノホスホリル誘導体を経由してボラノホスフェートを製造することもできる。例えば、ヨウ素をピリジン-水混合溶媒中で作用させる方法や、ジイソプロピルエチルアミン及び四塩化炭素をアセトニトリル-水の混合溶媒中で作用させる方法などを用いることができるが、副反応の抑制の観点からは後者の方法が好ましい場合がある。

オリゴリボヌクレオシド H-ボラノホスホロチオエートの製造に用いる硫化剤の種類も特に限定されないが、例えばイオウ(S₈)、ジメチルチウラムジスルフィド(DTD)、ビューケージ試薬(3H-1,2-ベンゾジチオール-3-オン 1,1-ジオキサイド)などを用いることができるが、副反応の抑制の観点からはイオウ(S₈)又はジメチルチウラムジスルフィドなどを用いることが好ましい場合がある。硫化剤を作用させるにあたり塩基を用いることもできる。塩基の種類も特に限定されないが、例えばジイソプロピルエチルアミンや1,8-ビス(ジメチルアミノ)ナフタレンなどが好ましい。酸化反応及び硫化反応は、例えばアセトニトリルなどの不活性溶媒中で氷冷下から室温程度の温度で数分から数時間で完了する。

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。実施例中、U^BzはN³-ベンゾイルウリジン-5'-イル基、NEt₃はトリエチルアミンを示し、その他の略号は上記説明中のものと同義である。
例1

(a)トリエチルアンモニウム 5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-(tert-ブチルジメチルシリル)-N⁶-アセチルアデノシン-3'-H-ボラノホスホネートジアステレオ混合物((Sp)-及び(Rp)-ジアステレオマー混合物)
5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-(tert-ブチルジメチルシリル)-N⁶-アセチルアデノシン 38.4 mg (52.9 μmol)とピリジミウム H-ボラノホスホネート 16.1 mg (110 μmol)をアルゴン雰囲気下にピリジン(1 ml×3)で共沸乾燥してピリジン（0.5 ml）に溶解した。攪拌しつつBopCl 26.5 mg (104 μmol)を加え、室温下で1時間攪拌した。溶液をクロロホルム5 mlで希釈後、1M TEABバッファー (10 ml×1)で洗浄した。水相をCHCl₃(20 ml×3)で抽出し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロルメタン中、トリエチルアミン 0.2%、メタノール 0-1%)で分離精製することにより目的化合物を得た。収率70%。無色泡状固体。

¹H NMR (CDCl₃) δ 13.00 (s, 1H), 8.58-8.51 (m, 2H), 8.22, 98.16 (s, s, 1H), 7.47-7.20 (m, 8H), 6.82-6.77 (m, 5H), 6.18-6.13 (m, 1H), 5.06-4.96 (m, 2H), 4.50-4.49 (m, 1H), 3.77 (s, 6H), 3.51-3.58 (m, 2H), 2.96 (q, J=7.0Hz, 6H), 2.61, 2.60 (s, s, 3H), 1.24 (t, J=7.0Hz, 9H), 0.87-0.67 (m, 9H), 0.07- -0.16 (m, 6H)
³¹P NMR (121.5 MHz, CDCl₃) δ 109.9-103.8 (m)
¹³C NMR (75.5 MHz, CDCl₃) δ 170.2, 158.5, 152.3, 152.2, 151.3, 151.1, 148.9, 148.9, 144.6, 144.6, 141.8, 141.5, 135.7, 135.6, 135.5, 130.2, 130.1, 130.1, 129.3, 128.2, 127.9, 127.8, 126.9, 122.1, 113.6, 113.2, 113.1, 88.7, 88.2, 86.7, 86.5, 84.0, 83.8, 75.6, 74.6, 74.5, 74.3, 63.0, 55.2, 45.2, 29.7, 25.7, 25.6, 17.9, 141.1, 8.5, -4.6, -4.7
ESI-HRMS:m/z calcd for C₃₉H₅₀BN₅O₈PSi- [(M - H⁺)^-] 786.3265, found 786.3235.

(b)トリエチルアンモニウム 5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-(tert-ブチルジメチルシリル)-N⁴-アセチルシチジン-3'-H-ボラノホスホネートジアステレオ混合物((Sp)-及び(Rp)-ジアステレオマー混合物)

74.19 mg (105.7 μmol)とピリジミウム H-ボラノホスホネート 32.56 mg (7.62μmol)をアルゴン雰囲気下にピリジン(0.5 ml×3)で共沸乾燥してピリジン（1 ml）に溶解した。攪拌しつつBopCl 51.04 mg (200.5 μmol)を加え、室温下で1時間攪拌した。溶液をクロロホルム5 mlで希釈後、1M TEABバッファー (20 ml×1)で洗浄した。水相をクロロホルム(50 ml×1, 5 ml×3)で抽出し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロルメタン中、トリエチルアミン0.2%、メタノール 0-3%)で分離精製することにより、目的化合物を得た。収率74%。無色泡状固体。

¹H NMR (CDCl₃) δ 12.45 (s, 1H), 9.93, 9.84 (s, s, 1H), 8.48-843 (m, 1H), 7.43-7.26 (m, 8H), 7.00-6.95 (m, 1H), 6.86-6.83 (m, 5H), 5.85-5.81 (m, 1H), 4.69 (m, 1H), 4.49-4.45 (m, 1H), 4.41-4.38 (m, 1H), 3.79 (s, 6H), 3.61-3.55 (m, 2H), 3.02 (q, J=7.1Hz, 6H), 2.26 (s, 3H) (t, J=7.1Hz, 9H), 0.90 (s, 9H), 0.22-0.15 (m, 6H)
³¹P NMR (121.5 MHz, CDCl₃,) δ 110.0-105.9 (m), 104.6-100.2 (m)
¹³C NMR (75.5 MHz, CDCl₃) δ 170.6, 162.6, 162.5, 158.6, 158.6, 155.2, 144.9, 144.8, 144.4, 144.3, 135.5, 135.4, 135.3, 135.2, 130.3, 130.2, 128.3, 128.2, 128.0, 127.9, 113.6, 113.3, 113.2, 96.3, 91.6, 91.2, 87.0, 86.9, 81.4, 81.0, 77.2, 76.0, 74.5, 73.1, 73.0, 69.7, 66.7, 60.9, 55.2, 52.9, 45.5, 29.7, 25.8, 25.8, 25.0, 181.1, 8.5, -4.5, -4.7, -4.8, -5.0
ESI-HRMS:m/z calcd for C₃₈H₅₀BN₃O₉PSi- [(M - H⁺)^-] 762.3153, found 762.3132.

(c)トリエチルアンモニウム 5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-(tert-ブチルジメチルシリル)-O⁶-シアノエチル-N²-フェノキシアセチルグアノシン-H-ボラノホスホネートジアステレオ混合物((Sp)-及び(Rp)-ジアステレオマー混合物)
5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-(tert-ブチルジメチルシリル)-O⁶-シアノエチル-N²-フェノキシアセチルグアノシン 45.2 mg (51.0 μmol)とピリジミウム H-ボラノホスホネート 15.6 mg (107 μmol)をアルゴン雰囲気下にピリジン(1 ml×3)で共沸乾燥してピリジン（5 ml）に溶解した。攪拌しつつBopCl 25.7 mg (101 μmol)を加え、室温下で1時間攪拌した。溶液をクロロホルム10 mlで希釈後、1M TEABバッファー (20 ml×1)で洗浄した。水相をクロロホルム(10 ml×3)で抽出し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロルメタン中、トリエチルアミン 0.2%、メタノール 0-2%)で分離精製することにより、目的化合物を得た。収率91%。無色泡状固体。

¹H NMR (CDCl₃) δ 12.94 (s, 1H), 8.74 (s, 1H), 8.07 (s, 1H), 7.44-7.42 (m, 2H), 7.67-7.62 (m, H), 7.37-7.18 (m, H), 7.07-6.96 (m, H), 6.80-6.59 (m, 1H), 6.11-6.09 (m, 1H), 4.96-4.93 (m, 1H), 4.86-4.82 (m, 1H), 4.78-4.77 (m, 1H), 4.60 (s, 2H), 4.48 (m, 1H), 3.76 (s, 6H), 3.12-3.08 (m, 2H), 2.99 (q, J=7.4Hz, 6H), 1.26 (t, J=7.4Hz, 9H), 0.81(s, 9H), 0.07, -0.12 (s, s, 6H)
³¹P NMR (121.5 MHz, CDCl₃,) δ 110.1-103.1 (m)
¹³C NMR (75.5 MHz, CDCl₃) δ 165.7, 159.5, 158.4, 156.9, 152.9, 150.7, 144.5, 141.0, 135.5, 130.0, 129.7, 128.0, 127.7, 126.8, 122.1, 118.5, 116.9, 114.7, 113.5, 113.1, 113.0, 88.3, 96.4, 83.8, 74.7, 74.3, 67.5, 63.2, 61.8, 55.1, 45.1, 25.5, 17.9, 17.8, 8.4, -4.8, -5.2
ESI-HRMS:m/z calcd for C₃₉H₅₀BN₅O₈PSi- [(M - H⁺)^-] 786.3265, found 786.3235.

(d)トリエチルアンモニウム 5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-(tert-ブチルジメチルシリル)-N³-ベンゾイルウリジン-3'-H-ボラノホスホネートジアステレオ混合物((Sp)-及び(Rp)-ジアステレオマー混合物)
5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-(tert-ブチルジメチルシリル)-N³-ベンゾイルウリジン 0.761 g (1.00 mmol)とピリジミウム H-ボラノホスホネート 0.291 g (2.00 mmol)をアルゴン雰囲気下にピリジン(2 ml×3)で共沸乾燥してピリジン（50 ml）に溶解した。攪拌しつつBopCl 0.511 g (2.00 mmol)を加え、室温下で2時間攪拌した。溶液をクロロホルム100 mlで希釈後、1M TEABバッファー (50 ml×1)で洗浄した。水相をクロロホルム(30 ml×3)で抽出し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロルメタン中、トリエチルアミン 0.2%、メタノール 1 - 3%)で分離精製することにより、目的化合物を得た。収率82%。無色泡状固体。

¹H NMR (CDCl₃) δ 12.84 (s, 1H), 8.19, 8.14 (d, J=8.3Hz, d, J=8.3Hz, 1H), 7.95-7.93 (m, 2H), 7.67-7.62 (m, 1H), 7.54-7.40 (m, 4H), 7.35-7.22 (m, 7H), 6.88-6.84 (m, 4H), 5.95-5.89 (m, 1H), 5.28, 5.24 (d, J=8.3Hz, d, J=8.3Hz, 1H), 4.85-4.75 (m, 1H), 4.93-4.87 (m, 1H), 4.52-4.47 (m, 1H), 4.43-4.38 (m, 1H), 3.80 (s, 6H), 3.68-3.48 (m, 2H), 2.99 (q, J=7.4Hz, 6H), 1.26 (t, J=7.4Hz, 9H), 0.89-0.86 (m, 9H), 0.17-0.14 (m, 6H)
³¹P NMR (121.5 MHz,CDCl₃,) δ 110.6-106.3 (m), 105.6-100.6 (m)
¹³C NMR (75.5 MHz, CDCl₃) δ 168.9, 168.9, 162.3, 158.7, 158.6, 149.3, 149.1, 144.4, 144.3, 140.4, 135.3, 135.2, 135.0, 134.9, 1320, 131.4, 130.6, 130.3, 130.2, 130.1, 129.1, 128.6, 128.3, 128.1, 128.0, 127.3, 127.2, 113.4, 113.3, 101.8, 101.6, 89.8, 89.0, 87.3, 87.1, 83.2, 82.1, 77.2, 75.8, 75.0, 74.2, 71.5, 61.9, 61.4, 55.2, 45.3, 25.7, 25.7, 18.0, 8.5, -4.5, -4.7, -4.8, -4.8
ESI-HRMS:m/z calcd for C₄₃H₅₁BN₂O₁₀PSi- [(M - H⁺)^-] 825.3144, found 825.3168.

(e)トリエチルアンモニウム 5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-(tert-ブチルジメチルシリル)-ウリジン-3'-H-ボラノホスホネートジアステレオ混合物((Sp)-及び(Rp)-ジアステレオマー混合物)
5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-(tert-ブチルジメチルシリル)-ウリジン 0.207 g (3.13 mmol)とピリジミウム H-ボラノホスホネート 0.989 g (7.62 mmol)をアルゴン雰囲気下にピリジン(15 ml×3)で共沸乾燥してピリジン（50 ml）に溶解した。攪拌しつつBopCl 1.936 g (7.60 mmol)を加え、室温下で4.5時間攪拌した。溶液をクロロホルム100 mlで希釈後、1M TEABバッファー (50 ml×1)で洗浄した。水相をクロロホルム(50 ml×3)で抽出し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロルメタン中、トリエチルアミン 0.5%、メタノール 0.5%)で分離精製することにより、目的化合物を得た。収率74%。無色泡状固体。

¹H NMR (CDCl₃) δ 12.58 (s, 1H), 10.02, 9.95 (s, s, 1H), 8.00, 7.99 (d, J=8.3Hz, d, J=8.0Hz, 1H), 7.42-7.37 (m, 2H), 7.34-7.19 (m, 7H), 6.86-6.81 (m, 4H), 5.87-5.85 (m, 1H), 5.20, 5.15 (d, J=8.0Hz, d, J=8.3Hz, 1H), 4.85-4.75 (m, 1H), 4.45-4.40 (m, 1H), 4.36-4.35 (m, 1H), 3.78, 3.77 (s, s, 6H), 3.62-3.42 (m, 2H), 3.00 (q, J=7.4Hz, 6H), 1.23 (t, J=7.4Hz, 9H), 0.91-0.89 (m, 9H), 0.17-0.14 (m, 6H)
³¹P NMR (121.5 MHz,CDCl₃,) δ 110.8-106.4 (m), 104.3-99.8 (m)
¹³C NMR (75.5 MHz, CDCl₃) δ 163.4, 158.6, 158.6, 150.4, 150.2, 144.4, 144.4, 140.3, 140.2, 135.4, 135.2, 135.1, 135.0, 130.3, 130.1, 128.3, 128.1, 128.0, 127.9, 113.6, 113.3, 113.2, 113.2, 101.8, 101.7, 89.8, 89.0, 87.2, 87.0, 82.5, 81.6, 77.4, 77.2, 77.0, 76.6, 75.7, 74.6, 74.3, 74.2, 71.3, 61.6, 61.5, 55.2, 45.2, 25.7, 25.6, 18.0, 18.0, 8.5, -4.6, -4.7, -4.9, -4.9
ESI-HRMS:m/z calcd for C₃₆H₄₇BN₂O₉PSi- [(M - H⁺)^-] 721.2887, found 721.2860.

例2

(a)5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-(tert-ブチルジメチルシリル)-N³-ベンゾイルウリジン-3'-イル 2',3'-O,O-ジフェノキシアセチル-N³-ベンゾイルウリジン-5'-イル H-ボラノホスホネートジアステレオ混合物((Sp)-及び(Rp)-ジアステレオマー混合物)
トリエチルアンモニウム 5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-(tert-ブチルジメチルシリル)-N³-ベンゾイルウリジン-3'-H-ボラノホスホネート 0.390 g (0.416 ｍmol)、2',3'-O,O-ジフェノキシアセチル-N3-ベンゾイルウリジン 0.213 g (0.346 ｍmol)をアルゴン雰囲気下にアセトニトリル(5ml×2)で共沸乾燥し、DMAN 0.534 g (2.49 mmol)を加え、アセトニトリル10ml に溶解した。BopCl 0.229 g (0.879 mmol)を加えて室温下で25分攪拌した。クロロホルム 10mlで希釈後、リン酸バッファーで洗浄した。水相をクロロホルム (5 ml ×3)で抽出し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。粗精製物をジクロルメタン 5 mlに溶解してヘキサン300mlを加え、生じた固形物を濾別した。固形物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロルメタン中、酢酸エチル 0-15%)で分離精製することにより、目的化合物を得た。収率43%。無色泡状固体。

¹H NMR (CDCl₃) δ7.94-7.91 (m, 4H), 7.67-7.7.59 (m, 2H), 7.49-7.44 (m, 4H), 7.34-7.7.16 (m, 15H), 7.01-6.78 (m, 10H), 6.11-6.03 (m, 2H), 5.91-5.88 (m, 1H), 5.83-5.77 (m, 1H), 5.54-5..36 (m, 3H), 5.14-5.10 (m, 1H), 4.97-4.93 (m, 1H), 4.68-3.99 (m, 9H), 3.81, 3.80 (s, s, 6H), 3.59-3.45 (m, 2H), 0.91-0.90 (m, 9H), 0.19-0.12 (m, 6H)
³¹P NMR (121.5 MHz,CDCl₃,) δ 138.1 (br), 135.2 (br)
¹³C NMR (75.5 MHz, CDCl₃) δ 168.4, 168.0, 161.8, 161.4, 158.9, 157.3, 149.5, 149.2, 149.0, 143.8, 140.2, 139.7, 139.0, 136.4, 135.2, 134.5, 131.3, 130.5, 130.0, 129.7, 129.1, 128.2, 128.0, 127.5, 122.1, 114.5, 113.5, 103.7, 103.2, 102.9, 90.2, 87.9, 87.5, 87.1, 83.2, 83.0, 80.4, 79.8, 79.5, 77.2, 74.8, 74.6, 73.7, 73.2, 70.3, 69.9, 68.4, 68.2, 64.6, 62.8, 55.3, 25.6, 18.0, 17.8, -4.5

例3

(a)トリエチルアンモニウム 5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-(tert-ブチルジメチルシリル)-N³-ベンゾイルウリジン-3'-イル 2',3'-O,O-ジフェノキシアセチル-N³-ベンゾイルウリジン-5'-イルボラノホスホロチオエートジアステレオ混合物((Sp)-及び(Rp)-ジアステレオマー混合物)
DMANは258 mg (1.2 mmol)をアセトニトリル2ml中に溶解させ、活性化させたMS 3Aを用いて一晩乾燥したものを用いた。トリエチルアンモニウム 5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-(tert-ブチルジメチルシリル)-N³-ベンゾイルウリジン-3'-H-ボラノホスホネート 47.15 mg (50 μmol)、2',3'-O,O-ジフェノキシアセチル-N³-ベンゾイルウリジン 36.05 mg (60 μmol)と0.6 Mの DMAN/アセトニトリル溶液0.5 ml (0.3 mmol)をアルゴン雰囲気下にアセトニトリル(1ml×3)で共沸乾燥してアセトニトリル（2 ml）に溶解した。攪拌しつつMNTP 31.3 mg (125 μmol)を加え、室温下で15分攪拌した。溶液をアセトニトリル10mlで希釈後、ヘキサン(30ml×1)で洗浄した。アセトニトリル層を回収し、溶媒留去後酢酸エチル15 mlを加えて濾別した。濾液を溶媒留去後、アセトニトリル1.5mlに溶解した。DIPEA 52.3μl (0.3 mmol)、H₂O 17.8 μl (1 mmol)、四塩化炭素 97.4 μl (1 mmol)をアセトニトリル1 mlに溶解させ、この混合溶液0.5 mlを添加した。室温下で5分攪拌し、溶媒を留去した。粗精製物をゲル濾過クロマトグラフィー(ジクロルメタン中、トリエチルアミン 0.2%)により分離精製し、その後シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロルメタン中、トリエチルアミン 0.2%、メタノール 0-3%)で分離精製を行った。目的物を含むフラクションを回収し、ジクロルメタン 20mlに溶解して1M TEABバッファー20 mlで洗浄した。水相をジクロルメタン(5 ml×3)で抽出し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を留去することにより目的化合物を得た。収率33 %。無色泡状固体。

¹H NMR (CDCl₃) δ8.25-8.20 (m, 1H), 8.06-7.92 (m, 5H), 7.64-7.03 (m, 17H), 7.00-6.76 (m, 10H), 6.28-6.19 (m, 1H), 6.00-5.83 (m, 1H), 5.62-5.58 (m, 2H), 5.04 (m, 1H), 4.73-4.12 (m, 9H), 3.78, 3.3.77 (s, s, 6H), 3.64-3.48 (m, 2H), 3.09 (q, 7.3Hz), 1.25 (t, J=7.3Hz) 0.90-0.89 (s, 9H), 0.19-0.07 (m, 6H)
³¹P NMR (121.5 MHz,CDCl₃,) δ 168.1-161.7 (m)
ESI-HRMS:m/z calcd for C₇₅H₇₇BN₄O₂₀PSSi- [(M - H⁺)^-] 1455.4557, found 1455.4440.

(b)トリエチルアンモニウム 5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-(tert-ブチルジメチルシリル)-N³-ベンゾイルウリジン-3'-イル 2',3'-O,O-ジフェノキシアセチル-N³-ベンゾイルウリジン-5'-イルボラノホスフェートジアステレオ混合物((Sp)-及び(Rp)-ジアステレオマー混合物)

DMANは258 mg (1.2 mmol)をアセトニトリル2ml中に溶解させ、活性化させたMS 3Aを用いて一晩乾燥したものを用いた。トリエチルアンモニウム 5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-(tert-ブチルジメチルシリル)-N³-ベンゾイルウリジン-3'-H-ボラノホスホネート 46.65 mg (50 μmol)、2',3'-O,O-ジフェノキシアセチル-N³-ベンゾイルウリジン 37.20 mg (60 μmol)と0.6 Mの DMAN/アセトニトリル溶液0.5 ml (0.3 mmol)をアルゴン雰囲気下にアセトニトリル(2ml×2)で共沸乾燥してアセトニトリル（1 ml）に溶解した。攪拌しつつMNTP 55.93 mg (125.6 μmol)を加え、室温下で15分攪拌した。溶液をアセトニトリル10 mlで希釈後、ヘキサン(20ml×2)で洗浄した。アセトニトリル層を回収し、溶媒留去後酢酸エチル10 mlを加えて濾別した。濾液を溶媒留去後、アセトニトリル1.5 mlに溶解した。DIPEA 52.3μl (0.3 mmol)、H₂O 17.8 μl (1 mmol)、四塩化炭素 97.4 μl (1 mmol)をアセトニトリル1 mlに溶解し、この混合溶液0.5 mlを添加した。室温下で5 分攪拌し、溶媒を留去した。粗精製物をゲル濾過クロマトグラフィー(ジクロルメタン中、トリエチルアミン 0.2%)により分離精製し、その後シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロルメタン中、トリエチルアミン 0.2%、メタノール 0-1%)で分離精製を行った。目的物を含むフラクションを回収し、ジクロルメタン 10 mlに溶解し、1M TEABバッファー20 mlで洗浄した。水相をジクロルメタン(5 ml×3)で抽出し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を留去することにより目的化合物を得た。収率55%。無色泡状固体。

¹H NMR (CDCl₃) δ8.22 (d, J=8.3Hz, 1H), 7.96-7.91 (m, 5H), 7.69-7.58 (m, 2H), 7.51-7.16 (m, 17H), 6.99-6.76 (m, 10H), 6.31-6.29 (m, 1H), 6.10-6.08 (m, 1H), 5.94-5.91 (m, 1H), 5.73-5.71 (m, 1H), 5.61-5.57 (m, 1H), 5.39 (d, J=8.3Hz, 1H), 4.81-4.79 (m, 1H), 4.65-4.05 (m, 9H), 3.80, 3.80 (s, s, 6H), 3.66-3.42 (m, 2H), 2.92 (q, 7.3Hz), 1.18 (t, J=7.3Hz) 0.90 (s, 9H), 0.19-0.14(m, 6H)
³¹P NMR (121.5 MHz,CDCl₃,) δ 98.0-92.5 (m)
¹³C NMR (75.5 MHz, CDCl₃) δ 168.7, 168.6, 168.0, 167.9, 162.1, 161.8, 158.8, 158.7, 157.4, 149.7, 149.5, 144.2, 140.3, 135.0, 134.7, 131.3, 130.5, 134.7, 131.3, 130.5, 130.2, 130.1, 129.7, 129.5, 129.1, 129.1, 128.1, 127.3, 122.1, 121.8, 114.6, 114.5, 113.4, 113.4, 103.5, 102.3, 87.6, 87.4, 85.3, 84.3, 82.7, 77.2, 75.1, 74.4, 73.7, 73.0, 64.7, 64.3, 63.5, 61.7, 55.3, 45.7, 29.7, 25.7, 18.0, 8.5, -4.4, -4.8
ESI-HRMS:m/z calcd for C₇₅H₇₇BN₄O₂₁PSi- [(M - H⁺)^-] 1439.4686, found 1439.4736.

Claims

下記の一般式(I)：

（式中、R¹及びR²はそれぞれ独立に水素原子又は水酸基の保護基を示し、Bsは保護基を有していてもよい核酸塩基を示す）で表されるリボヌクレオシド H-ボラノホスホネート又はその塩。
Bsがそれぞれ保護基を有していてもよいアデニン、ウラシル、グアニン、又はシトシンである請求項１に記載のリボヌクレオシド H-ボラノホスホネート又はその塩。
R¹が4,4'-ジメトキシトリチル基であり、R²がtert-ブチルジメチルシリル基である請求項１又は２に記載のリボヌクレオシド H-ボラノホスホネート又はその塩。
請求項１ないし３のいずれか１項に記載の一般式(I)で表されるリボヌクレオシド H-ボラノホスホネート又はその塩の製造方法であって、下記の一般式(II)：

（式中、R¹¹及びR¹²はそれぞれ独立に水酸基の保護基を示し、Bsは核酸塩基を示す）で表されるリボヌクレオシド化合物をH-ボラノホスフィニル化する工程を含む方法。
H-ボラノホスフィニル化をピリジミウム H-ボラノホスホネートを用いて行う請求項４に記載の方法。
縮合剤の存在下で行う請求項４又は５に記載の方法。
縮合剤がN,N-ビス(2-オキソ-3-オキサゾリジニル)ホスフィン酸クロライドである請求項６に記載の方法。
下記の一般式(III)：

（式中、R²¹、R²²、及びR²⁴はそれぞれ独立に水素原子又は水酸基の保護基を示し、R²³は水素原子、水酸基の保護基、又は必要に応じてリンカーを介して結合した固相担体を示し、Bsは核酸塩基を示し、nは0又は1以上の整数を示す）で表されるオリゴリボヌクレオシド H-ボラノホスホネート。
請求項８に記載の一般式(III)で表されるオリゴリボヌクレオシド H-ボラノホスホネートの製造方法であって、下記の一般式(IV)：

（式中、R²²、R²³、R²⁴、Bs、及びnは上記と同義である）で表される化合物と下記の一般式(IA)：

（式中、R²¹、R²²、及びBsは上記と同義である）で表される化合物又はその塩とを縮合する工程を含む方法。
nが0又は1〜50の整数である請求項９に記載の方法。
縮合剤として1,3-ジメチル-2-(3-ニトロ-1,2,4-トリアゾール-1-イル)-2-ピロリジン-1-イル-1,3,2-ジアザホスホリジニウム・ヘキサフルオロホスフェートを用いる請求項９又は１０に記載の方法。
塩基の存在下で行う請求項９ないし１１のいずれか１項に記載の方法。
塩基として1,8-ビス(ジメチルアミノ)ナフタレンを用いる請求項１２に記載の方法。
下記の一般式(V):

（式中、R³¹、R³²、及びR³⁴はそれぞれ独立に水素原子又は水酸基の保護基を示し、R³³は水素原子、水酸基の保護基、又は必要に応じてリンカーを介して結合した固相担体を示し、Bsは核酸塩基を示し、XはOH又はSHを示し、mは1以上の整数を示す）で表される化合物又はその塩の製造方法であって、下記の一般式(VI)：

（式中、R³¹、R³²、R³³、R³⁴、Bs、及びmは上記と同義である）で表される化合物を硫化剤又は酸化剤で処理する工程を含む方法。
酸化剤として(+)-(8,8-ジクロロカンフォリルスルホニル)-オキサジリジンを用いる請求項１４に記載の方法。
ポジティブハロゲン試薬を用いて中間体としてハロゲン化ボラノホスホリル誘導体を経由して一般式(V)で表される化合物を製造する請求項１４に記載の方法。
硫化剤としてイオウ又はジメチルチウラムジスルフィドを用いる請求項１４に記載の方法。
硫化剤とともに塩基を用いる請求項１７に記載の方法。