JP2015093853A - ボラノホスフェート化合物、及び核酸オリゴマー - Google Patents
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Abstract
【解決手段】下記一般式(I)で示されるボラノホスフェート化合物(一般式(I)中、R1は水素原子又は水酸基の保護基を表し、Bsは保護基を有してもよい核酸塩基を表し、X+はカウンターカチオンを表す。)
【選択図】なし
Description
また、本発明は、上記核酸オリゴマーを合成するのに適した新規ボラノホスフェート化合物を提供することを他の課題とする。
<1> 下記一般式(I)で示されるボラノホスフェート化合物。
<2> 一般式(I)におけるBsが、アデニン、ウラシル、グアニン、チミン又はシトシンである<1>に記載のボラノホスフェート化合物。
<3> 一般式(I)におけるR1が、水酸基の保護基である<1>又は<2>に記載のボラノホスフェート化合物。
<4> 少なくとも2つの塩基からなる塩基配列を有し、かつ、該塩基配列に含まれる少なくとも1つの塩基が、<1>〜<3>のいずれか1つに記載のボラノホスフェート化合物に由来するヌクレオシド構造中の塩基である核酸オリゴマー。
<5> 一般式(II)で示される構造及び一般式(III)で示される構造のうち少なくとも1つを有する<4>に記載の核酸オリゴマー。
また、本発明によれば、上記核酸オリゴマーを合成するのに適した新規ボラノホスフェート化合物を提供することができる。
また、本発明の核酸オリゴマーは、少なくとも2つの塩基からなる塩基配列を有し、かつ、塩基配列に含まれる少なくとも1つの塩基が、一般式(I)で示されるボラノホスフェート化合物に由来するヌクレオシド構造中の塩基である核酸オリゴマーである。
本発明において「モノマー」とは、核酸オリゴマーを製造する際に、核酸オリゴマーのヌクレオシド単位を導入するため使用される核酸を意味する。
また本明細書において「〜」は、その前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を示すものとする。
さらに本明細書において組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
以下、本発明について説明する。
本発明のLNA修飾ボラノホスフェート化合物は、下記一般式(I)で示される。一般式(I)中、R1は水素原子又は水酸基の保護基を表し、Bsは保護基を有してもよい核酸塩基を表し、X+はカウンターカチオンを表す。
緩衝溶液を添加するのは、反応を停止する前に反応溶媒を留去すると副生成物の酸性によって保護基が脱離する場合があるからである。
本発明のLNA修飾ボラノホスフェート化合物(3a−d)は、例えば、以下のスキーム1に従って製造される。なお、スキーム1では、縮合剤としてN,N−ビス(2−オキソ−3−オキサゾリジニル)ホスフィン酸クロライド(Bop−Cl)を用いている。また、出発物質として、H−ボラノホスフィニル化剤(2)及びリボース構造の3位の炭素原子に水酸基が結合したLNA修飾デオキシリボ核酸の誘導体(1a−d)を用いている。
LNA修飾ボラノホスフェート化合物(3a−d)は、LNA修飾デオキシリボ核酸の誘導体(1a−d)をH−ボラノホスフィニル化剤(2)によりH−ボラノホスフェート化することによって製造することができる。
本発明の核酸オリゴマーは、少なくとも2つの塩基からなる塩基配列を有し、かつ、塩基配列に含まれる少なくとも一つの塩基が、一般式(I)で示されるLNA修飾ボラノホスフェート化合物に由来するヌクレオシド構造中の塩基である核酸オリゴマーである。核酸オリゴマーは、LNA修飾ボラノホスフェート化合物をモノマーの1つとして用いて、このモノマーを縮合することにより得られる構造を有する。
核酸オリゴマーの塩基配列は、標的核酸の塩基配列に基づいて設定される。二重鎖形成能の観点から、核酸オリゴマーの塩基配列は、標的核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列となるように適宜選択されるが、場合によって、異なる塩基を1つ以上含む塩基配列であってもよい。
核酸オリゴマーを得る際に用いる他のモノマーについては特に制限はなく、例えば、以下の一般式(IV)で表されるボラノホスフェート化合物(以下、LNA未修飾ボラノホスフェート化合物」と称する)、一般式(V)で表される核酸、一般式(VI)で表されるLNA修飾核酸などを挙げることができる。
前記縮合工程では、縮合剤を用いることができる。
縮合剤としては、例えば、N,N−ビス(2−オキソ−3−オキサゾニル)ホスフィン酸クロライド、3−ニトロ−1,2,4−トリアゾール−1−イル−トリス(ピロリジン−1−イル)ホスホニウム・ヘキサフルオロホスフェート(PyNTP)、又は1,3、−ジメチル−2−(3−ニトロ−1,2,4−トリアゾール−1−イル)−2−ピロリジン−1−イル−1,2,3−ジアザホスホリジウム・ヘキサフルオロホスフェート(MNTP)等を挙げることができる。このうち、副反応を抑制し、かつ反応が速やかに完結する観点から、MNTPが好ましい。
塩基性化合物としては、例えば、1,8−ビス(ジメチルアミノ)ナフタレン(DMAN)、2,2,6,6−テトラメチルピペリジン(TMP)、ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)、2,6−ルチジン、2,4,6−トリメチルピリジン等を挙げることができる。このうち、副反応を抑制する観点から、2,6−ルチジンが好ましい。
固相反応により核酸オリゴマーを製造する場合、核酸オリゴマーの3’末端の塩基を含むモノマーは、リボース構造の3’位の炭素原子に結合する酸素原子を介して、固相担体と結合することができる。この場合、モノマーと固相担体との間には、必要に応じてリンカーが存在してもよい。
酸化剤としては、例えば、(+)−カンフォリルスルホニルオキサジリジン(CSO)(+)−(8,8−ジクロロカンフォリルスルホニル)−オキサジリジン(DCSO)、メチルエチルケトン過酸化物、及びポジティブハロゲン試薬(四塩化炭素、四臭化炭素、ヨウ素、N−クロロスクシンイミド、N−ブロモスクシンイミド、N−ヨードスクシンイミド等)などを挙げることができる。
酸化反応は塩基性化合物存在下で行ってもよい。塩基性化合物としては、例えば、ジイソプロピルエチルアミン等を挙げることができる。
前記第1の保護基脱離工程には、脱保護剤を用いることができる。第1の保護基脱離工程で使用し得る脱保護剤としては、例えば、ハロゲン化アルキルカルボン酸等を挙げることができる。ハロゲン化アルキルカルボン酸としては、例えば、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、ジクロロ酢酸等を挙げることができる。保護基を有する核酸オリゴマーが2〜100当量の脱保護剤と反応することが好ましい。
第2の保護基脱離工程では、例えば、モノマー又は核酸オリゴマーをアンモニア水で処理することができる。第2の保護基脱離工程で用いられるアンモニア水としては、例えば、25質量%アンモニア水又は25質量%アンモニア水−エタノール混合溶液(3:1、v/v)が挙げられる。
他のモノマー(4)の有するR6は、水酸基、保護基を有する水酸基、ハロゲン原子(例えば、フッ素原子)、又はアルコキシ基(例えば、メトキシ基)を表す。R6が保護基を有する水酸基を表す場合、その保護基は、一般式(I)中のR1の表す水酸基の保護基と同義である。
核酸オリゴマー(LNAPBH−DNA(二量体))(5a−d)中のR11及びBproは、各々一般式(I)中のR1及びLNA修飾ボラノホスフェート化合物(3a−d)中のBproと同義である。
核酸オリゴマー(5a−d)は、その後、標的核酸と相補鎖な塩基配列となるように、モノマーを適宜選択し、この反応を繰り返して行うことにより、所望の配列を有する核酸オリゴマーを得ることができる。
核酸オリゴマー(LNAPBO−ODN(二量体))(6a−d)中のR11、R6及びBproは、各々核酸オリゴマー(LNAPBH−DNA(二量体))(5a−d)中のR11、R6及びBproと同義である。
各種分析器は以下に示した機種を用いた。
1H−核磁気共鳴スペクトル(1H−NMR):バリアン Mercury 300(300MHz)
13C−核磁気共鳴スペクトル(13C−NMR):バリアン Mercury 300(75MHz)
31P−核磁気共鳴スペクトル(31P−NMR):バリアン Mercury 300(121.5MHz)
なお、1H−NMRにはテトラメチルシラン(TMS)を、13C−NMRにはCDCl3(δ77.16ppm)を内部標準として用い、31P−NMRは85%H3PO4を外部標準として用いた。
紫外可視分光光度計:JASCO V−550 UV/VIS spectrophotometer
イオン交換HPLC:GE Healthcare AKTA purifier 10S
カラムクロマトグラフィーに充填するシリカゲルには、KANTO CHEMICALのSilica Gel 60Nを用いた。
逆相HPLCに使用したカラム(分析):water μ−BOUNDASPHERE,C18 5μm,100Å,3.9mm×159mm
イオン交換HPLCに使用したカラム(分析・分取):GE Healthcare MiniQTM 4.6/50PE, 3μm,4.6mm×50mm)
以下、スキーム4に従って、LNA修飾ボラノホスフェート化合物(9)を合成した。
ESI−HRMS:Calcd forC39H39BN2O10P−[M−H]−;737.2441,found;737.2443.
下記スキーム5に従って、上記化合物(7)に代えてデオキシリボ核酸(10a−d)を用いること以外はLNA修飾ボラノホスフェート化合物と同様にして、アデニン、グアニン、シトシンまたはチミンの各塩基を有するLNA未修飾ボラノホスフェート化合物(11a−d)をそれぞれ合成した。
アポB(apoB)蛋白質をコードするmRNAの一部、アポB蛋白質mRNA(3’−CGU AAC CAU AAG−5’:相補鎖RNA、配列番号1)(アポ蛋白質B−100:Nature,2006,Vol.441,pp111−114)と、対応するアポB蛋白質DNA(3’−CGT AAC CAT AAG−5’:相補鎖DNA、配列番号2)を標的核酸として選択した。相補鎖RNA及び相補鎖DNAの塩基配列に相補的な塩基配列を有し、LNA修飾ボラノホスフェート化合物由来の塩基を含むアンチセンス分子、LNAPBO−ODNを以下のようにして合成した。
その後、洗浄後の固相担体に対して、25%アンモニア水−エタノール(3:1、v/v)を50℃下12時間反応させることで、核酸塩基部位の保護基の除去と固相担体からの核酸オリゴマーの切り出しを行った。固相担体をろ別し、ろ液を回収した後、減圧留去した。残留物を4mLのH2Oに溶解し、クロロホルム(500μL)で6回洗浄した。
収率7%。MALDI−TOF MS: Calcd for [M−H]−; 3767.02, found; 3767.06.
LNAPBO−ODNと同様にして標的核酸(アポB蛋白質)の塩基配列と相補的な配列となるようにN4−イソブチリルシチジンと、アデニン、グアニン、チミン又はシトシンを塩基として有するLNA未修飾ボラノホスフェート化合物(11a−d)を用いて、順次、保護基を有する水酸基の脱保護反応、縮合反応を12量体が得られるまで繰り返し行った後、酸化反応及び核酸塩基の脱保護反応を行い、PBO−DNA(12量体)を得た。
得られたPBO−DNA(12量体)を含む溶液を、25%NH3 −エタノール水溶液(3:1 v/v)で処理し、エタノール(2ml×4)で洗浄した。水溶液は減圧下で溶媒を留去した。残渣を水(4ml)に溶解し、クロロホルム(500μL×6)で洗浄した。逆相HPLCにて分離精製した。逆相HPLC及び分離精製は、30℃で、0〜60%アセトニトリルの0.1M 酢酸トリメチルアンモニウム緩衝溶液(pH7.0)を流速0.5ml/分で60分間行われた。
収率44%。MALDI−TOF MS: Calcd for [M−H]−; 3627.05, found; 3626.82.
相補鎖DNAの最終モル数が0.60nmolとなるように、及び上記合成方法で得たLNAPBO−ODN(12量体)の最終濃度が4.0μMとなるように、相補鎖DNA及びLNAPBO−ODN(12量体)を10mM NaH2PO4−Na2HPO4緩衝溶液(pH7.0)に溶解し、測定試料を調製した。この測定試料の塩濃度を100mM NaClに調整した。その後、測定試料を光路長1cmのセルに入れ、可視紫外分光光度計により260nmにおける吸光度を、0.5℃/minの速度で温度を0℃から90℃まで変化させて測定した。そして、100mM NaClにおける相補鎖DNAとLNAPBO−ODN(12量体)との融解曲線を得た。その結果を図2(A)に示す。この融解曲線から、二重鎖融解温度(Tm)を得た。その結果を表1に示す。
なお、融解温度(Tm)は、中線法で求めた。具体的には、得られた融解曲線の前遷移領域及び後遷移領域にそれぞれにおいて2点を指定し、回帰計算によりベースラインを求め、2つのベースラインの中線と融解曲線との交点を融解温度とした。
LNAPBO−ODN(12量体)に代えて、標的核酸と相補的な塩基配列を有する天然型DNAを用いた以外は、実施例1と同様にして、100mM又は1Mの塩濃度における相補鎖DNA又は相補鎖mRNAと天然型DNAとの融解曲線を得て、二重鎖融解温度を決定した。それらの結果を図2〜図3及び表1に示す。
LNAPBO−ODN(12量体)に代えて、標的核酸と相補的な塩基配列を有するPBO−DNA(12量体)を用いた以外は、実施例1と同様にして、100mM又は1Mの塩濃度における相補鎖DNA又は相補鎖mRNAとPBO−DNA(12量体)との融解曲線を得て、二重鎖融解温度を決定した。それらの結果を図2〜図3及び表1に示す。
従って、本発明によれば、従来のボラノホスフェート型核酸オリゴマーと比較して、相補鎖との二重鎖形成能に優れた核酸オリゴマーと、この核酸オリゴマーを合成するのに適した新規ボラノホスフェート化合物を提供することができる。
Claims (5)
- 下記一般式(I)で示されるボラノホスフェート化合物。
(一般式(I)中、R1は水素原子又は水酸基の保護基を表し、Bsは保護基を有してもよい核酸塩基を表し、X+はカウンターカチオンを表す。) - 一般式(I)におけるBsが、アデニン、ウラシル、グアニン、チミン又はシトシンである請求項1に記載のボラノホスフェート化合物。
- 一般式(I)におけるR1が、水酸基の保護基である請求項1又は請求項2に記載のボラノホスフェート化合物。
- 少なくとも2つの塩基からなる塩基配列を有し、かつ、該塩基配列に含まれる少なくとも1つの塩基が、請求項1〜請求項3のいずれか1項に記載のボラノホスフェート化合物に由来するヌクレオシド構造中の塩基である核酸オリゴマー。
- 一般式(II)で示される構造及び一般式(III)で示される構造のうち少なくとも1つを有する請求項4に記載の核酸オリゴマー。
(一般式(II)中、R1は水素原子又は水酸基の保護基を表す。一般式(II)及び一般式(III)中、Bsは保護基を有してもよい核酸塩基を表し、X+はカウンターカチオンを表す。)
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