JP2017518966A - リン保護基ならびにそれらの調製方法および使用 - Google Patents
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Abstract
Description
米国特許法第119条(e)に基づき、本願は、2014年4月30日に出願された米国仮出願第61/986,594号の出願日への優先権を主張し、その開示は、参照により本明細書に援用されるものとする。
オリゴヌクレオチド、DNAおよびRNAの合成鎖の化学合成は、明確な化学構造および配列を有する核酸の比較的短い断片の化学合成である。その技術は、現在の研究室での研究において多様な用途があるため、非常に重要かつ有用である。オリゴヌクレオチド合成は、所望の配列のカスタムメイドオリゴヌクレオチドへの迅速かつ低価格なアクセスを提供する。オリゴヌクレオチドは、分子生物学および医薬において様々な用途、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉RNA、DNA塩基配列決定および増幅用のプライマー、分子プローブなどが確認されている。
を有する化合物に関する。
特定の官能基および化学用語の定義を以下においてより詳細に説明する。有機化学の一般的原理、ならびに、特定の官能部分および反応性は、”Organic Chemistry”,Thomas Sorrell,University Science Books,Sausalito:1999に記載されている。
本開示は、許容され得る純度および収率を達成しながら、従来技術によって生成される核酸分子よりも長さの大きい核酸分子の信頼性の高い合成の新規の方法を提供する。本開示の態様は、長さが200以上のモノマー単位の配列を有する長鎖ポリヌクレオチド(例えば、DNA)の合成を提供するリン保護基および/または核酸塩基保護基を使用する方法および組成物である。
Bは、核酸塩基またはその類似体であり;
R1およびR2は、それぞれ独立して、直鎖状、分枝状もしくは環状の置換もしくは非置換アルキルであるか、または、R1とR2は一緒になって5、6、7または8員の非芳香族環を形成しており;
R3は、酸不安定性保護基であり;
Rは、ベンジルアルコール誘導体(o−メチルベンジルを除く)、α−メチルアリールアルコール誘導体、ナフタレンアルコール誘導体、二環式脂肪族アルコール誘導体、アシルチオアルキルアルコール誘導体、S−エチルチオエート誘導体およびアミノ酸誘導体からなる群から選択されるリン保護基である]
を有する化合物に関する。
の構造式(Id)を有する。
を有する。
を有する。
を有するベンジルアルコール(o−メチルベンジルを除く)の誘導体である。Raが水素である式(II)のいくつかの実施形態において、R11は、オルト位でメチルではない。
が挙げられる。
が挙げられる。
によって説明される。
によって説明される。
を有するα−メチルアリールアルコール誘導体が挙げられる。式(III)のいくつかの実施形態において、XとYは同時に水素ではなく、また、RaとXの両方が水素である場合、Yはメチルではない。例示的なR基としては、
が挙げられる。
を有するナフタレンアルコール誘導体から誘導され得る。ある特定の場合には、R7は単一の基であり、R12は単一の基である。
が挙げられ、Rはまた、構造式(V)または(VI):
を有する二環式脂肪族アルコール誘導体から選択することができる。
が挙げられる。
が挙げられる。
を有するS−(2−ヒドロキシルエチル)ベンゾチオエート−アルコールから誘導される。
を有するS−(2−ヒドロキシルエチル)アルキルチオエート−アルコールから誘導される。
本開示の態様は、本主題の化合物を使用してポリヌクレオチドを合成する方法を含む。いくつかの実施形態において、本方法は、(a)保護されていないヒドロキシル基を有するヌクレオシド残基を用意すること;(b)ヌクレオシド残基を(例えば、本明細書に記載されているような)ヌクレオシドモノマーと接触させて、ヌクレオシドモノマーをヌクレオシド残基に共有結合させポリヌクレオチドを生成することとを含む。
Rは、水素、保護されたヒドロキシル基、フルオロ、アルコキシ、O−エチレンオキシアルキル(O−CH2CH2OR)、保護されたアミノ、保護されたアミド、または保護されたアルキルアミノであり、ここで、Rが水素である場合、支持体結合されたヌクレオシドは、DNA合成で存在するようなデオキシリボヌクレオシドであり、また、Rが保護されたヒドロキシル基である場合、支持体結合されたヌクレオシドは、RNA合成で存在するようなリボヌクレオシドであり;
Bは、核酸塩基または保護された核酸塩基、例えば、プリン塩基またはピリミジン塩基である]
を有する支持体結合されたヌクレオシド残基が提供される。
様々な5’−O−ジメトキシトリチル−2’−デオキシリボチミジン3’−O−アリールホスホラミダイトの合成
合成は、0.2マイクロモル(60マー)および1.0マイクロモル(20マー)のスケールで、Glen Researchから得たdT−CPGカラム(20マーについては500オングストローム、60マーについては1000オングストローム)を使用し、ABIモデル394自動DNA合成装置において標準DNAサイクルによって実施する。合成プロトコルは、従来のDMTホスホラミダイト法に基づいた。すべての保護されたデオキシリボチミジン3’−O−アリールホスホラミダイトを100mMの濃度で無水アセトニトリルに溶解し、合成装置の適切なポートに置いた。合成前に、支持体結合した2’−デオキシリボヌクレオシド上の5’−DMT基をジクロロメタン中の3%ジクロロ酢酸で除去した。活性化剤は、5−エチルチオ−1H−テトラゾール(無水アセトニトリル中0.25M、Glen Research,VA)であった。それぞれの縮合ステップ後、支持体を40秒間、アセトニトリルで洗浄し、失敗配列をキャッピングするために、Unicapホスホラミダイト(Glen Research,VA)をメーカーの推奨に従って使用した。酸化には、標準酸化試薬(THF/水/ピリジン中0.02Mのヨウ素)を使用した。合成後オリゴマーは、アンモニア(Macron、10〜35%アンモニアを含む溶液)で処理することによって固相支持体から切断した。いくつかの事例において、切断前に、CPGにまだ結合されているオリゴヌクレオチドを4〜8時間、2−カルバモイル−2−シアノエチレン−1,1−ジチオレートのDMF中1M溶液(1mL)で処理した。次いで、樹脂をDMFで、続いてMeOHで洗浄し、アルゴン下で乾燥し、最後に、アンモニアで切断した。切断混合物は廃棄し、固相支持体をSpeedVacで蒸発乾燥した。支持体に吸着されているODN生成物を水に溶解し、LC−MSで分析した。
20マーおよび60マーの分析を、ネガティブモードでAgilent6530精密質量Q−TOF LC/MSで実施した。データは、Agilent Mass Hunter定性分析B04.00ソフトウェアで処理した。
溶離系1
バッファーA:200mmHFIP、8mMTEA、水中5%メタノール
バッファーB:水中90%メタノール
溶離系2
バッファーA:5mMジブチルアンモニウムアセテート、水中5%有機成分
バッファーB:5mMジブチルアンモニウムアセテート、有機成分中10%水
有機成分:1:1アセトニトリル:2−イソプロパノール
(27)
2−カルバモイル−2−シアノエチレン−1,1−ジチオレート処理した、リン保護基として4−シアノベンジルアルコールを使用するdT20のTIC、DADクロマトグラムおよび質量分析を図11に示す。
リン保護基としてアセチル−L−トレオニンメチルエステルを使用するdT60のTIC、DADクロマトグラムおよび質量分析を図12に示す。
リン保護基としてS−エチルベンゾチオエートを使用するdT60のTIC、DADクロマトグラムおよび質量分析を図13に示す。
N,N−ジメチルアセトアミドジエチルアセタール:
N,N−ジメチルアセトアミドジエチルアセタールは、McBride,L.J;Kierzek,R.;Beaucage,S.L.;Caruthers,M.H.J.Am.Chem.Soc.,1986,108,2040−2048の手順に従って合成した。
N−メチル−2−ピロリジノン(26mL、273mmol)および硫酸ジメチル(26mL、278mmol)の混合物を撹拌し、90℃で90分加熱し、次いで、室温まで冷却した。25%メタノール性ナトリウムメトキシド65mLおよびメタノール135mLを含有する溶液をおよそ10℃で、1時間かけてアルゴン下で添加した。沈殿した白色の固体を濾過し、溶媒を減圧下で濃縮した。黄色の油状残留物をジエチルエーテル250mLに溶解し、さらに1時間撹拌し、次いで、沈殿した固体を再び濾過した。固体をジエチルエーテルで洗浄した。エーテルを濃縮した後、残留物を真空で蒸留して、浅黄色の液体として化合物を得た:収率14.8g(37%)。CHCl3中の1H NMRは文献によるものである。
4−アセチルモルホリン(32mL、278mmol)および硫酸ジメチル(26mL、278mmol)の混合物を撹拌し、90℃で60分間加熱し、次いで、室温まで冷却した。25%メタノール性ナトリウムメトキシド65mLおよびメタノール135mLを含有する溶液をおよそ10℃で、2時間にわたりアルゴン下で添加した。沈殿した白色の固体を濾過し、溶媒を減圧下で濃縮した。黄色の油状残留物をジエチルエーテル250mLに溶解し、さらに1時間撹拌し、次いで、沈殿した固体を再び濾過した。固体をジエチルエーテルで洗浄した。エーテルを濃縮した後、残留物を反応の次のステップに使用した。粗製油状物の重量は22gであった。
スキーム1は、(i)4−(1,1−ジメトキシエチル)モルホリン、室温、一晩;(ii)4,4−ジメトキシトリチルクロリド、ピリジン、N,N−ジイソプロピルエチルアミン(2時間);(iii)N,N−ジイソプロピル−シアノエチルホスホラミダイトクロリド、N,N−ジイソプロピルエチルアミン、CH2Cl2(2時間)の条件下における化合物(3)の合成を示す。
2.69g(10mmol)の2’−デオキシアデノシン一水和物を、3回ピリジンと共蒸発させ、無水メタノール20mLに懸濁した。10gの4−(1,1−ジメトキシエチル)モルホリンを、アルゴン下で、撹拌しながらゆっくりと添加した。反応を、一晩継続させた。反応後、メタノールを回転蒸発によって除去した。粘性残留物をジエチルエーテルで数回洗浄して、非粘性の白色の粉末を得た。化合物を、溶離液としてCHCl3を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによってさらに精製した。メタノール(0〜10%)を勾配として使用した。溶媒を除去した後、純粋な化合物(1)が白色の泡状物として出現した。収率: 3.19 g (88%), Rf (CHCl3/MeOH 10/2 v/v): 0.43, 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ8.22 (s, 1H), 7.54 (s, 1H), 5.77 (t, J=6.11 Hz, 1H), 4.03 (d, J= 6.4 Hz, 1H), 3.88 (m, 2H), 3.64 (m, 1H), 3.37 (m, 4H. O(CH2)2), 2.83 (m, 4H, N(CH2)2), 2.51-2.29(m, 2H), 1.73 (s, 3H, C-CH3).13C NMR (CDCl3, 400 MHz): δ160.85, 154.22, 152.01, 147.94, 138.21, 122.11, 88.22, 83.19, 71.53, 68.12, 62.41, 46.36, 40.11, 22.38.
4−N−(1−(ジメチルアミノ)エチリデン)−2’−デオキシアデノシン(1)(3.19g 0.0088mole)を無水ピリジン(25mL)に溶解し、作製した溶液をアルゴンで飽和した。N,N−ジイソプロピルエチルアミン(6.42g、0.05mole、8.65mL)を溶液に添加し、10分間、アルゴン下で撹拌した。ジ−p−メトキシトリチルクロリド(2.95g、0.0088mole)の無水ピリジン25mL中溶液を、アルゴン下で調製した。DMT−Cl溶液を、アルゴンの連続流を用いて1の溶液に移した。反応を、アルゴン下で連続撹拌しながら2時間継続させた。溶液を濃縮し、ジクロロメタン100mLでさらに希釈した。混合物を、NaHCO3飽和水溶液(100mL)で3回洗浄した。有機相をNaCl飽和水溶液(100mL)でさらに洗浄した。有機相を無水Na2SO4で乾燥した。化合物を、3%トリエチルアミンを含むCH2Cl2(MeOHを勾配として使用、0〜2%)のシリカゲルカラムクロマトグラフィーによってさらに精製した。溶媒を除去した後、化合物(2)が白色の泡状物として出現した。収率: 4.54 g (78%); Rf (CH2Cl2/MeOH 10/0.5 v/v): 0.41; 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ8.48 (s, 1H), 7.76 (s, 1H), 7.3-6.6 (m, 13H, アリール), 5.84 (t, J = 6.31 Hz, 1H), 4.13 (d, J= 7.3 Hz, 1H), 3.93 (m, 2H), 3.76 (s, 6H, (O-CH3)2), 3.54 (m, 1H), 3.33 (m, 4H. O(CH2)2), 2.91 (m, 4H, N(CH2)2), 2.55-2.31(m, 2H), 1.61 (s, 3H, C-CH3).. 13C NMR (CDCl3, 400 MHz): δ167.15, 157.62, 154.41, 150.37, 147.54, 140.22, 140.14, 133.97, 130.21, 128.33, 124.32, 122.38, 112.76, 91.22, 86.92, 80.27, 74.22, 67.21, 62.12, 59.37, 47.28, 41.19, 23.3.
5’−O−(ジ−p−メトキシトリチル)−4−N−(1−モルホリノエチリデンアミノ)−2’−デオキシアデノシン(2)(1.66g、0.0025mole)を10mLの無水CH2Cl2に溶解した。N,N−ジイソプロピルエチルアミン(6mL)を、アルゴンの連続流と撹拌を用いて溶液に添加した。N,N−ジイソプロピル−O−シアノエチルクロロホスホラミダイト(590mg、0.0025mole)を溶液に添加し、反応をアルゴン下で2時間継続した。反応の終了後、溶液を、飽和NaHCO3水溶液30mLに注ぎ入れ、CH2Cl2(3×10mL)で抽出した。合わせた有機相をNa2SO4で乾燥し、溶媒を蒸発させた。得られた油状物を、3%トリエチルアミンを含有するCH2Cl2を使用したカラムクロマトグラフィーによって精製して、白色の泡状物として最終化合物(3)を得た。化合物を、冷却ヘキサン沈殿によってジクロロメタン溶液からさらに精製した。収率: 1.51 g (71%). Rf (CH2Cl2/MeOH 10/0.5 v/v): 0.44, 31P NMR (CDCl3, 400 MHz):δ148.74, 147.91 (ジアステレオ異性体).
2−N−(1−(ジメチルアミノ)エチリデン)−2’−デオキシグアノシンは、小修飾による文献の手順に従って合成した(Lu,J.;Khdour,O.M.;Armstrong,J.S.;Hecht,S.M.Bioorg.Med.Chem.,2010,18,7628−7638)。2’−デオキシグアノシン脱水物(3.66g 12mmol)を無水エタノールに懸濁した。N,N−ジメチルアセトアミドジエチルアセタール(7.8g、44mmol)を連続撹拌しながら懸濁液に添加した。混合物を、溶液が均質化されるまで(浅黄色)、1時間、およそ70℃まで温めた。撹拌を24時間継続した。エタノールを減圧下で回転蒸発によって除去した。粘性残留物を、残留物が非粘性の固体になるまで、ジエチルエーテルで数回洗浄した。化合物を、溶離液としてCHCl3を使用して、カラムクロマトグラフィーによってさらに精製した。メタノールを勾配(0〜20%)として使用した。最初に化合物が溶出した。カラムフラクションの溶媒を除去した後、化合物(4)が泡状物として出現した。収率: 1.95 g (48%); Rf (CHCl3/MeOH 10/2 v/v): 0.38; 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ8.02 (s, 1H), 6.34 (t, J = 6.8 Hz, 1H), 5.84 (m, 1H), 4.75 (s, 1H), 4.14 (d, J= 6.6 Hz, 1H), 4.14 (s, 1H), 3.86 (m, 2H), 3.5 (m, 2H), 3.16 (s, 6H, N(CH3)2), 2.71-2.19(m, 2H), 2.21 (s, 3H, C-CH3).13C NMR (CDCl3, 400 MHz): δ162.25, 158.66, 156.26, 147.26, 138.10, 88.70, 86.26, 71.67, 62.61, 40.95, 38.18, 30.29, 17.00; ESI MS: 337.1521 [MH]+
2−N−(1−(ジメチルアミノ)エチリデン)−2’−デオキシグアノシン(4)(3.98g 0.0118mole)を無水ピリジン(25mL)に溶解し、作製した溶液をアルゴンで飽和した。N,N−ジイソプロピルエチルアミン(6.42g、0.05mole、8.65mL)をこの溶液に添加し、アルゴン下で10分間撹拌した。無水ピリジン25mL中のジ−p−メトキシトリチルクロリド(4.2g、0.012mole)溶液をアルゴン下で調製した。DMT−Cl溶液を、アルゴンの連続流下で(4)の溶液に移した。反応を、アルゴン下で撹拌を続けながら2時間継続した。溶液を濃縮し、ジクロロメタン100mLでさらに希釈した。混合物をNaHCO3飽和水溶液(100mL)で3回洗浄した。有機相をNaCl飽和水溶液(100mL)でさらに洗浄した。有機相を無水Na2SO4で乾燥した。化合物を、3%トリエチルアミンを含有するCH2Cl2(MeOHを、勾配として使用、0〜5%)のシリカゲルカラムクロマトグラフィーによってさらに精製した。溶媒を除去した後、化合物(5)が泡状物として出現した。収率: 5.51 g (73%); Rf (CH2Cl2/MeOH 10/0.5 v/v): 0.31; 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ7.71 (s, 1H), 7.4-6.8 (m, 13H, アリール), 6.33 (t, J=7 Hz, 1H) 4.59 (m, 1H), 4.11 (m, 1H), 3.78 (s, 6H, (O-CH3)2), 3.6-3.2 (m, 4H), 3.12(s, 6H, N(CH3)2), 2.55 (m, 2H), 2.21 (s, 3H, C-CH3). 13C NMR (CDCl3, 400 MHz): δ162.27, 158.55, 156.39, 147.78, 144.53, 135.86, 130.01, 127.90, 126.91, 119.30, 113.20, 86.55, 85.52, 82.97, 72.47, 64.20, 55.26, 40.83, 38.56, 37.87, 30.20, 16.85, 7.94; ESI MS: 639.3019 [MH]+
5’−O−(ジ−p−メトキシトリチル)−2−N−(1−(ジメチルアミノ)エチリデン)−2’−デオキシグアノシン(5)(596mg、0.93mmole)を10mLの無水CH2Cl2に溶解した。N,N−ジイソプロピルエチルアミン(1mL)を、アルゴンの連続流と撹拌を用いて溶液に添加した。N,N−ジイソプロピル−O−シアノエチルクロロホスホラミダイト(440mg、1.86mmol)をこの溶液に添加し、反応をアルゴン下で2時間継続した。反応の終了後、溶液を飽和NaHCO3水溶液30mLに注ぎ入れ、CH2Cl2(3×10mL)で抽出した。合わせた有機相をNa2SO4で乾燥し、溶媒を蒸発させた。得られた油状物を、3%トリエチルアミンを含有するCH2Cl2を使用したカラムクロマトグラフィーにより精製して、淡黄色の泡状物として最終化合物(6)を得た。収率: 0.74 g (94%).Rf (CH2Cl2/MeOH 10/0.6 v/v): 0.45; 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ11.98 (s, 1H), 7.81 (d, J=8Hz, 1H), 7.48-6.77 (m, 13H, アリール), 6.21 (t, J=6.9 Hz, 1H), 4.83 (m, 1H), 4.11 (m, 1H), 3.78 (s, 6H, (O-CH3)2), 3.6-3.2 (m, 4H), 3.12 (s, 6H, N(CH3)2), 2.55 (m, 2H), 2.21 (s, 3H, C-CH3).31P NMR (CDCl3, 400 MHz):δ148.36, 147.86 (ジアステレオ異性体).
2’−デオキシグアノシン水和物2.85g(10mmol)を、3回ピリジンで共蒸発させ、無水メタノール20mLに懸濁した。12gの4−(1,1−ジメトキシエチル)モルホリンをアルゴン下で撹拌しながらゆっくりと添加した。反応を、溶液が均質で浅黄色になるまで、60℃で一晩、継続した。反応後、メタノールを回転蒸発により除去した。粘性の残留物をジエチルエーテルで数回洗浄して、非粘性の白色の固体を得た。化合物を、溶離液としてCHCl3を使用したシリカゲルカラムクロマトグラフィーによってさらに精製した。メタノール(0〜20%)を勾配として使用した。溶媒を除去した後、純粋な化合物(7)が白色の泡状物として出現した。収率: 3.31 g (82%), Rf (CHCl3/MeOH 10/2 v/v): 0.32, 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ7.92 (s, 1H), 6.04 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 5.67 (m, 1H), 4.17 (d, J= 5.8 Hz, 1H), 3.84 (m, 2H), 3.52 (m, 2H), 3.43 (m, 4H. O(CH2)2), 2.96 (m, 4H, N(CH2)2), 2.71-2.19(m, 2H), 2.03 (s, 3H, C-CH3).13C NMR (CDCl3, 400 MHz): δ160.15, 157.26, 154.51, 148.34, 137.11, 87.85, 84.16, 70.28, 66.22, 45.86, 42.35, 38.38, 29.69, 16.80.
2−N−(1−(モルホリノ)エチリデン)−2’−デオキシグアノシン(7)(3.31g 0.0087mole)を無水ピリジン(25mL)に溶解し、作製した溶液をアルゴンで飽和した。N,N−ジイソプロピルエチルアミン(6.42g、0.05mole、8.65mL)を溶液に添加し、アルゴン下で10分間撹拌した。無水ピリジン25mL中のジ−p−メトキシトリチルクロリド(2.9g、0.0087mole)溶液をアルゴン下で調製した。DMT−Cl溶液を、アルゴンの連続流を用いて(10)の溶液に移した。反応を、アルゴン下で撹拌しながら3時間継続した。溶液を濃縮し、ジクロロメタン100mLでさらに希釈した。混合物をNaHCO3飽和水溶液(100mL)で3回洗浄した。有機相をNaCl飽和水溶液(100mL)でさらに洗浄した。有機相を無水Na2SO4で乾燥した。化合物を、3%トリエチルアミンを含有するCH2Cl2(MeOHを勾配として使用、0〜5%)においてカラムクロマトグラフィーによって精製した。溶媒を除去した後、化合物(8)が白色の泡状物として出現した。収率: 4.89 g (83%); Rf (CH2Cl2/MeOH 10/0.5 v/v): 0.36; 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ7.78 (s, 1H), 7.3-6.6 (m, 13H, アリール), 6.03 (t, J=6.8 Hz, 1H) 4.59 (m, 1H), 3.84 (s, 6H, (O-CH3)2), 3.7-3.4 (m, 4H), 3.33 (m, 4H, O(CH2)2), 3.02(m, 4H, N(CH2)2), 2.55 (m, 2H), 2.16 (s, 3H, C-CH3). 13C NMR (CDCl3, 400 MHz): δ168.22, 160.29, 158.89, 156.19, 148.18, 143.23, 137.16, 132.11, 128.10, 127.21, 123.22, 120.24, 118.60, 113.28, 89.03, 86.55, 85.12, 82.27, 72.47, 66.90, 56.26, 45.83, 37.66, 32.87, 30.20, 16.95.
5’−O−(ジ−p−メトキシトリチル)−2−N−(1−(モルホリノ)エチリデン)−2’−デオキシグアノシン(8)(1.7g、0.0025mole)を10mLの無水CH2Cl2に溶解した。N,N−ジイソプロピルエチルアミン(6mL)をアルゴンの連続流と撹拌を用いて溶液に添加した。N,N−ジイソプロピル−O−シアノエチルクロロホスホラミダイト(590mg、0.0025mole)をこの溶液に添加し、反応をアルゴン下で2時間継続した。反応終了後、溶液を飽和NaHCO3水溶液30mLに注ぎ入れ、CH2Cl2(3×10mL)で抽出した。合わせた有機相をNa2SO4で乾燥し、溶媒を蒸発させた。得られた油状物は、3%トリエチルアミンを含有するCH2Cl2を使用したカラムクロマトグラフィーによって精製して、白色の泡状物として最終化合物を得た。化合物(9)を、冷却ヘキサン沈殿によってジクロロメタン溶液からさらに精製した。収率: 1.62 g (77%). Rf (CH2Cl2/MeOH 10/0.7 v/v): 0.49, 31P NMR (CDCl3, 400 MHz):δ147.56, 146.86 (ジアステレオ異性体).
2’−デオキシシチジン水和物(2a)2.5g(10mmol)を無水メタノール20mLに懸濁した。2,2−ジメトキシ−1−メチルピロリジン3.8g(26mmol)をアルゴン下で撹拌しながらゆっくりと添加した。反応を、溶液が均質で浅黄色になるまで3時間継続した。反応後、メタノールを回転蒸発によって除去した。粘性残留物をジエチルエーテルで数回洗浄して、非粘性の固体を得た。化合物を、溶離液としてCH2Cl2を使用したシリカゲルカラムクロマトグラフィーによってさらに精製した。メタノール(0〜20%)を勾配として使用した。溶媒を除去した後、純粋な化合物が白色の泡状物として出現した。収率: 2.61 g (85%); Rf (CH2Cl2/MeOH 10/2 v/v): 0.3; 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ7.91 (d, J=7.8 Hz, 1H), 6.13 (t, J=7.1 Hz, 1H), 6.03 (d, J=8 Hz, 1H), 4.55 (m, 1H), 4.01 (m, 1H), 3.88 (m, 2H), 3.48 (m, 2H), 3.11 (m, 2H), 3.05 (, 3H), 2.41 (m, 2H), 2.06 (m, 2H); 13C NMR (CDCl3, 400 MHz): δ172.20, 169.00, 156.74, 141.98, 103.40, 87.53, 70.17, 61.71, 51.71, 40.56, 31.93, 30.53, 19.71; ESI MS: 309.1583 [MH]+
4−N−(N−メチルピロリジン−2−イリデン)−2’−デオキシシチジン(10)4.2g(0.0136mole)を無水ピリジン25mLに溶解した。N,N−ジイソプロピルエチルアミン9.88mLをアルゴン下でこの溶液に添加し、10分間撹拌した。4.8g(0.0143mole)のDMT−Clをアルゴン下で撹拌しながら無水ピリジン25mLに溶解した。反応を、2時間継続した。溶液を濃縮し、ジクロロメタン100mLでさらに希釈した。混合物をNaHCO3飽和水溶液(100mL)で3回洗浄した。有機相をNaCl飽和水溶液(100mL)でさらに洗浄した。有機相を無水Na2SO4で乾燥した。化合物を、3%トリエチルアミンを含有するCH2Cl2(MeOHを勾配として使用、0〜5%)においてカラムクロマトグラフィーにより精製した。溶媒を除去した後、化合物(11)が浅黄色の泡状物として出現した。収率: 6.48 g (78%); Rf (CH2Cl2/MeOH 10/0.5 v/v): 0.4; 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ7.90 (d, 1H), 7.44-6.80 (m, 13H, アリール), 6.42 (t, J=6.8 Hz, 1H), 5.81 (d, J=8 Hz, 1H), 4.54 (m, 1H), 4.15 (m, 1H), 3.80 (s, 6H, (O-CH3)2), 3.70-3.40 (m, 4H), 3.15 (t, J=6.8 Hz, 2H), 3.03 (s, 3H, N-CH3), 2.68 (m, 2H), 2.21 (m, 2H). 13C NMR (CDCl3, 400 MHz): δ172.09, 169.02, 158.53, 156.59, 144.54, 140.50, 130.10, 128.17, 127.91, 126.91, 113.22, 103.17, 86.64, 86.44, 86.01, 71.52, 63.31, 55.24, 51.55, 42.03, 31.82, 30.63, 19.71; ESI MS: 611.2997 [MH]+
5’−O−(ジ−p−メトキシトリチル)−4−N−(N−メチルピロリジン−2−イリデン)−2’−デオキシシチジン(11)(456mg、0.75mmole)を10mLの無水CH2Cl2に溶解した。N,N−ジイソプロピルエチルアミン(1mL)をアルゴンの連続流と撹拌を用いてこの溶液に添加した。N,N−ジイソプロピル−O−シアノエチルクロロホスホラミダイト(350mg、1.48mmol)をこの溶液に添加し、反応をアルゴン下で2時間継続した。反応終了後、溶液を飽和NaHCO3水溶液30mLに注ぎ入れ、CH2Cl2(3×10mL)で抽出した。合わせた有機相をNa2SO4で乾燥し、溶媒を蒸発させた。得られた油状物を、3%トリエチルアミンを含有するCH2Cl2を使用したカラムクロマトグラフィーによって精製して、淡黄色の泡状物として最終化合物(12)を得た。収率: 0.53 g (87%). Rf (CH2Cl2/MeOH 10/0.8 v/v): 0.5; 31P NMR (CDCl3, 400 MHz):δ149.48, 148.78 (ジアステレオ異性体)
2’−デオキシシチジン一水和物2.45g(10mmol)を3回ピリジンで共蒸発させ、無水メタノール20mLに懸濁した。10gの4−(1,1−ジメトキシエチル)モルホリンをアルゴン下で撹拌しながらゆっくりと添加した。反応を一晩継続した。反応後、メタノールを回転蒸発によって除去した。非粘性の白色の粉末が得られるまで、粘性残留物をジエチルエーテルで数回洗浄した。化合物を、溶離液としてCHCl3を使用したシリカゲルカラムクロマトグラフィーによってさらに精製した。メタノール(0〜10%)を勾配として使用した。溶媒を除去した後、純粋な化合物(13)が白色の泡状物として出現した。収率: 3.0 g (88%), Rf (CHCl3/MeOH 10/2 v/v): 0.38; 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ7.53 (d, J=6.3 Hz, 1H), 6.01 (t, J=6.7 Hz, 1H), 5.27 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 4.35 (m, 1H), 3.91 (m, 1H), 3.88 (m, 2H), 3.55 (m, 4H, O(CH2)2), 2.91 (m, 4H, N(CH2)2), 2.5-2.3(m, 2H), 1.73 (s, 3H, C-CH3).13C NMR (CDCl3, 400 MHz): δ163.85, 160.12, 153.81, 142.14, 108.11, 92.17, 84.72, 71.60, 67.08, 60.40, 44.78, 40.92, 22.98.
4−N−(1−((モルホリノ)エチリデン))−2’−デオキシシチジン(13)(2.98g 0.0088mole)を無水ピリジン(25mL)に溶解し、作製した溶液をアルゴンで飽和させた。N,N−ジイソプロピルエチルアミン(6.42g、0.05mole、8.65mL)をこの溶液に添加し、アルゴン下で10分間撹拌した。無水ピリジン25mL中のジ−p−メトキシトリチルクロリド(2.95g、0.0088mole)溶液をアルゴン下で調製した。DMT−Cl溶液を、アルゴンの連続流を用いて16の溶液に移した。この反応を、アルゴン下で撹拌しながら2時間継続した。溶液を濃縮し、ジクロロメタン100mLでさらに希釈した。この混合物をNaHCO3飽和水溶液(100mL)で3回洗浄した。有機相をNaCl飽和水溶液(100mL)でさらに洗浄した。有機相を無水Na2SO4で乾燥した。化合物は、3%トリエチルアミンを含有するCH2Cl2(MeOHを勾配として使用、0〜2%)においてシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。溶媒を除去した後、化合物(14)が白色の泡状物として出現した。収率: 4.25 g (75%); Rf (CH2Cl2/MeOH 10/0.5 v/v): 0.38; 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ7.5-6.7 (m, 14H, アリール), 6.05 (t, J=6.7 Hz, 1H), 5.17 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 4.47 (m, 1H), 4.13 (m, 1H), 3.95 (m, 2H), 3.71 (s, 6H, (O-CH3)2), 3.48 (m, 4H, O(CH2)2), 2.87 (m, 4H, N(CH2)2), 2.6-2.3(m, 2H), 1.67 (s, 3H, C-CH3); 13C NMR (CDCl3, 400 MHz): δ164.75, 161.32, 158.07, 151.71, 147.11, 142.34, 136.21, 129.88, 127.62, 125.65, 115.23, 109.11, 92.17, 87.02, 84.72, 71.60, 68.09, 61.38, 54.28, 44.71, 41.22, 21.61.
5’−O−(ジ−p−メトキシトリチル)−4−N−(1−モルホリノエチリデンアミノ)−2’−デオキシシチジン(14)(1.60g、0.0025mole)を10mLの無水CH2Cl2に溶解した。N,N−ジイソプロピルエチルアミン(6mL)をアルゴン連続流と撹拌を用いてこの溶液に添加した。N,N−ジイソプロピル−O−シアノエチルクロロホスホラミダイト(590mg、0.0025mole)をこの溶液に添加し、反応をアルゴン下で2時間継続した。反応終了後、この溶液を飽和NaHCO3水溶液30mLに注ぎ入れ、CH2Cl2(3×10mL)で抽出した。合わせた有機相をNa2SO4で乾燥し、溶媒を蒸発させた。得られた油状物は、3%トリエチルアミンを含有するCH2Cl2を使用したカラムクロマトグラフィーによって精製して、白色の泡状物として最終化合物を得た。化合物(15)は、冷却ヘキサン沈殿によって、ジクロロメタン溶液からさらに精製した。収率: 1.4 g (66%). Rf (CH2Cl2/MeOH 10/0.5 v/v): 0.4, 31P NMR (CDCl3, 400 MHz):δ147.39, 146.13 (ジアステレオ異性体).
5’−O−ジメトキシトリチル−2’−デオキシリボヌクレオシド−3’−O−S−エチルベンゾチオエート−ピロリジニルホスホラミダイトの合成
DNAマイクロアレイは、Leproust et al.in Nucleic Acids Research (2010),Vol.38(8),pp 2522−2540に記載されているAgilent製造方法に従って、Agilentアレイライター上で製造した。A、G、C、Tを含有しており、178〜202ヌクレオチド長の範囲である、5,528ユニークオリゴヌクレオチド配列のセットは、化合物T(16)、C(18)、A(17)およびG(20)を用いて合成した。オリゴヌクレオチドは、ウェハ内のシリル化された6.625x6上の切断可能リンカー上でインサイチュ合成した。合成の終了時に、オリゴヌクレオチドを脱保護し、室温で一晩実施されたアンモニアガス処理によって個々のスライドから切断した。Illumina MiSeq系での配列決定分析の実施には、
・5’アダプター=29ヌクレオチド
・配列決定プライマー=32ヌクレオチド
・バーコード=16塩基
・照会配列=76塩基または100塩基
・3’アダプター=25ヌクレオチド
を含むオリゴヌクレオチドの配列が必要であった。配列分析によって完全長配列の完全性および存在を確認した。さらに、単一200マーオリゴヌクレオチド配列5’−AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCGACAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCGACGTTCCCAGGATACTTATAGGAGGGGCAAACCTCTTCTCTAGAGTCGCTGGTCCTATCCAGTAAACCACTTGGTTAATGTAAGAGGCCCGCCTTTCGATCAGAAACGTCTGGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTGT−3’(配列番号1)を同一プロトコルおよび同一ホスホラミダイト化合物T(16)、A(17)、C(18)およびG(20)を使用してアレイ上で合成した。脱保護およびアレイからの切断は、上述のようにして実施した。生成物の変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により200マーの合成の成功を確認した(図25)。
他の文献、例えば、特許、特許出願、特許公報、雑誌、書籍、論文、ウェブコンテンツなどの参照および引用を本開示で行っている。このようなすべての文献は、これにより、あらゆる目的のためにそれらの全体を参照することによって本明細書に援用する。参照によって本明細書に援用することを述べているが、本明細書に明示的に記載されている既存の定義、記述または別の開示資料と抵触する任意の事項またはそれらの一部は、援用事項と本開示の事項との間に抵触が生じない範囲でのみ援用される。抵触が生じた場合には、抵触は、好ましい開示としての本開示に対し有利に解決されるものとする。
本明細書に開示されている代表的な実施例は本発明の説明を補うものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、また限定するものと解釈されるべきでない。実際、本明細書に提示および開示されているものに加えて、本発明の様々な変更およびそれらの多くのさらなる実施形態は、以下の実施例を含む本文書の全内容ならびに本明細書に引用されている科学文献および特許文献から当業者には明らかであろう。本明細書に記載されている実施例は、その様々な実施形態およびそれらの均等物において本発明の実施に適し得る重要なさらなる情報、例示およびガイダンスを含んでいる。
本開示の態様は、構造式(I):
を有する化合物を含む。
を有する。いくつかの実施形態において、本化合物は、式Ic:
を有する。
を有する。
を有するベンジルアルコールの誘導体である。
から選択されるベンジルアルコールの誘導体である。本化合物のいくつかの実施形態において、Rは、構造:
を有するベンジルアルコールの誘導体である。
を有するα−メチルアリールアルコールの誘導体である。
から選択されるα−メチルアリールアルコールの誘導体である。
を有するナフタレンアルコールの誘導体である。
から選択されるナフタレンアルコールの誘導体である。
を有する二環式脂肪族アルコールの誘導体である。
から選択される二環式脂肪族アルコールの誘導体である。
である。
である。
である。
により示される。本化合物のいくつかの実施形態において、R21およびR22はメチルである。本化合物のいくつかの実施形態において、R21とR22は環状的に連結して5もしくは6員の置換もしくは非置換複素環を形成しており、ここで、複素環は、モルホリン、ピペリジンおよびピロリジンからなる群から選択される。
である。
を有する化合物を提供する。
Claims (51)
- 構造式(I):
Bは、核酸塩基またはその類似体であり;
R1およびR2は、それぞれ独立して、直鎖状、分枝状もしくは環状の置換もしくは非置換アルキルであるか、または、R1とR2は一緒になって、5、6、7もしくは8員の非芳香族環を形成しており;
R3は、酸不安定性保護基であり;
Rは、ベンジルアルコール誘導体、α−メチルアリールアルコール誘導体、ナフタレンアルコール誘導体、二環式脂肪族アルコール誘導体、S−エチルチオエートアルコール誘導体およびアミノ酸誘導体からなる群から選択される基であり、ただし、Rはo−メチルベンジルではない]
を有する化合物。 - Bが核酸塩基または保護された核酸塩基であり、ここで、前記核酸塩基はアデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシルから選択され;
R3がDMT、MMT、TMT、ピキシルおよびピバロイルから選択される基である、
請求項1に記載の化合物。 - R1およびR2が、それぞれ独立して、直鎖状、分枝状もしくは環状の置換もしくは非置換C1〜C18アルキルである、請求項1に記載の化合物。
- R1およびR2が、それぞれ独立して、直鎖状または分枝状の非置換C1〜C6アルキルである、請求項3に記載の化合物。
- 構造式(Ia):
- R1とR2が、一緒になって、5または6員の非芳香族環を形成しており、ここで、前記環は骨格中に0または1個のヘテロ原子を有する、請求項1に記載の化合物。
- R1とR2が、一緒になって、骨格中に0個のヘテロ原子を有する5員の非芳香族環を形成している、請求項6に記載の化合物。
- 構造式(Ib):
を有する、請求項1に記載の化合物。 - 式Ic:
- 構造式(Id):
を有する、請求項8に記載の化合物。 - 構造式(If):
を有する、請求項8に記載の化合物。 - Rが、構造式(II):
Raは、水素またはアルキルであり;
R11は、それぞれ独立して、水素、アルキル、アルコキシ、アルキル−S−、シアノ、メチルシアノまたはハロゲンであり;
nは、1、2または3である]
を有するベンジルアルコールの誘導体である、請求項1から9のいずれか1項に記載の化合物。 - Rが、
から選択されるベンジルアルコールの誘導体である、請求項12に記載の化合物。 - Rが、構造:
を有するベンジルアルコールの誘導体である、請求項12に記載の化合物。 - Rが、構造式(III):
を有するα−メチルアリールアルコールの誘導体である、請求項1から9のいずれか1項に記載の化合物。 - Rが、
R9は、ハロゲン、シアノまたはトリフルオロメチルであり;
R10は、水素、ハロゲン、C1〜C6アルキルおよびC1〜C6アルキルオキシから選択される]
から選択されるα−メチルアリールアルコールの誘導体である、請求項15に記載の化合物。 - Rが、構造式(IV):
を有するナフタレンアルコールの誘導体である、請求項1から9のいずれか1項に記載の化合物。 - Rが、
から選択されるナフタレンアルコールの誘導体である、請求項17に記載の化合物。 - Rが、構造式(V)または(VI):
を有する二環式脂肪族アルコールの誘導体である、請求項1から9のいずれか1項に記載の化合物。 - Rが、
R14は、水素、ハロゲン、C1〜C6アルキルまたはC1〜C6アルキルオキシであり;
R15は、水素、ハロゲンまたはC1〜C6アルコキシであり;
R16は、水素、シアノまたはハロゲンである]
から選択される二環式脂肪族アルコールの誘導体である、請求項19に記載の化合物。 - Rが、
である、請求項1から9のいずれか1項に記載の化合物。 - Rが、
- Rが、
である、請求項1に記載の化合物。 - Rが
である、請求項1に記載の化合物。 - 前記Bがアミジン核酸塩基保護基を含む、請求項1から24のいずれか1項に記載の化合物。
- 前記アミジン核酸塩基保護基がアセトアミジン保護基である、請求項25に記載の化合物。
- 前記アセトアミジン保護基が以下の構造:
により示される、請求項26に記載の化合物。 - R21およびR22がメチルである、請求項27に記載の化合物。
- R21とR22が環状的に連結して5もしくは6員の置換もしくは非置換複素環を形成しており、ここで、前記複素環がモルホリン、ピペリジンおよびピロリジンからなる群から選択される、請求項27に記載の化合物。
- 前記アセトアミジン保護基が以下の構造:
- Bが、以下の構造:
- Rが、
である、請求項31に記載の化合物。 - 構造式(VII):
R1およびR2はそれぞれイソプロピルであるか、またはR1とR2は、一緒になって、それらが結合されているNとともにピロリジン複素環を形成しており;
R3は、酸不安定性保護基であり;
R'は、シアノエチル基およびメチル基から選択される基であり;
Bは、
を有する化合物。 - ポリヌクレオチドを合成する方法であって、
(a)保護されていないヒドロキシル基を有するヌクレオシド残基を用意することと;
(b)前記ヌクレオシド残基を請求項1から28のいずれか1項に記載のヌクレオシドモノマーと接触させて、前記ヌクレオシドモノマーを前記ヌクレオシド残基に共有結合させ前記ポリヌクレオチドを生成することと
を含む、方法。 - 前記ポリヌクレオチドを酸化剤に曝露することをさらに含む、請求項34に記載の方法。
- 前記核酸を脱保護剤に曝露することをさらに含む、請求項34に記載の方法。
- 接触するステップを少なくとも1回繰り返すことをさらに含む、請求項34に記載の方法。
- 前記ヌクレオシド残基が固相支持体に共有結合されている、請求項34に記載の方法。
- 前記核酸を前記固相支持体から切断して、遊離核酸を生成させることをさらに含む、請求項38に記載の方法。
- 前記核酸が、少なくとも約200ヌクレオチドの配列を有するDNAである、請求項39に記載の方法。
- 前記核酸が、約200ヌクレオチド〜約1,000ヌクレオチドの長さを有するDNAである、請求項40に記載の方法。
- 前記DNAが約300ヌクレオチド〜約500ヌクレオチドの長さを有する、請求項41に記載の方法。
- 前記DNAが100ヌクレオチド当たり1つ以下の単一ヌクレオチド欠失を有する、請求項40に記載の方法。
- 第1の遊離核酸を第2の遊離核酸とカップリングさせて、約300ヌクレオチド〜約10,000ヌクレオチドの長さを有する伸長された遊離核酸を生成することをさらに含む、請求項39に記載の方法。
- 1つまたは複数のさらなる遊離核酸を前記伸長された遊離核酸にカップリングさせて、遺伝子を生成することをさらに含む、請求項39に記載の方法。
- 請求項34から45のいずれか1項の方法によって生成される核酸生成物。
- 請求項34から43のいずれか1項の方法によって合成される核酸のアレイ。
- 請求項34から45のいずれか1項の方法によって合成される複数の核酸を含むライブラリー。
- 約300ヌクレオチド〜約10,000ヌクレオチドの長さを有する複数の核酸を含むライブラリーであって、ここで、それぞれの核酸が請求項34から45のいずれか1項の方法によって合成された、構築された核酸断片から構成されている、ライブラリー。
- 前記複数の核酸が遺伝子へ構築される、請求項47に記載のライブライリー。
- 請求項44または45に記載の方法によって生成される核酸生成物。
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Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6251695A (ja) * | 1985-08-29 | 1987-03-06 | Yuki Gosei Yakuhin Kogyo Kk | ホスホロアミダイト類の合成法 |
JPH02503911A (ja) * | 1987-03-27 | 1990-11-15 | エッチ.エム.ブック | ポリ(デオキシリボヌクレオチド)、及びその医薬組成物、用途及び製造方法 |
WO1999055717A1 (en) * | 1998-04-24 | 1999-11-04 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Processes for the synthesis of oligomeric compounds |
JP2000507928A (ja) * | 1996-06-10 | 2000-06-27 | サントル・ナショナル・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・シャンティフィック(セ・エヌ・エール・エス) | ホスホトリエステルオリゴヌクレオチド、アミダイト、およびそれらの調製法 |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4415732A (en) | 1981-03-27 | 1983-11-15 | University Patents, Inc. | Phosphoramidite compounds and processes |
US5948902A (en) | 1997-11-20 | 1999-09-07 | South Alabama Medical Science Foundation | Antisense oligonucleotides to human serine/threonine protein phosphatase genes |
US6020475A (en) * | 1998-02-10 | 2000-02-01 | Isis Pharmeuticals, Inc. | Process for the synthesis of oligomeric compounds |
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US6222030B1 (en) | 1998-08-03 | 2001-04-24 | Agilent Technologies, Inc. | Solid phase synthesis of oligonucleotides using carbonate protecting groups and alpha-effect nucleophile deprotection |
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Patent Citations (4)
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---|---|---|---|---|
JPS6251695A (ja) * | 1985-08-29 | 1987-03-06 | Yuki Gosei Yakuhin Kogyo Kk | ホスホロアミダイト類の合成法 |
JPH02503911A (ja) * | 1987-03-27 | 1990-11-15 | エッチ.エム.ブック | ポリ(デオキシリボヌクレオチド)、及びその医薬組成物、用途及び製造方法 |
JP2000507928A (ja) * | 1996-06-10 | 2000-06-27 | サントル・ナショナル・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・シャンティフィック(セ・エヌ・エール・エス) | ホスホトリエステルオリゴヌクレオチド、アミダイト、およびそれらの調製法 |
WO1999055717A1 (en) * | 1998-04-24 | 1999-11-04 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Processes for the synthesis of oligomeric compounds |
Non-Patent Citations (8)
Title |
---|
BIOORG. MED. CHEM. LETT., vol. 14, JPN6019016840, 2004, pages 6031 - 6034, ISSN: 0004031662 * |
BIOORG. MED. CHEM. LETT., vol. 7, JPN6019016854, 1997, pages 871 - 876, ISSN: 0004031668 * |
COLLECT. CZECH. CHEM. COMMUN., vol. 61, JPN6019016846, 1996, pages 114 - 115, ISSN: 0004031664 * |
J. AM. CHEM. SOC., vol. 108, JPN6019016839, 1986, pages 2040 - 2048, ISSN: 0004031661 * |
J. ORG. CHEM., vol. 50, JPN6019016848, 1985, pages 2019 - 2025, ISSN: 0004031665 * |
TETRAHEDRON LETT., vol. 25, JPN6019016850, 1984, pages 5513 - 5516, ISSN: 0004031666 * |
TETRAHEDRON LETT., vol. 25, JPN6019016851, 1984, pages 375 - 378, ISSN: 0004031667 * |
TETRAHEDRON, vol. 55, JPN6019016843, 1999, pages 9481 - 9500, ISSN: 0004031663 * |
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