KR102375480B1 - 인 보호기 및 이의 제조 방법 및 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명의 양태는, 긴 폴리뉴클레오타이드의 합성에서의 용도가 발견된, 인 및/또는 핵염기 보호기를 이용한 조성물을 포함한다. 단계적 커플링 수율을 증가시키는 것을 돕는 인 보호기 및/또는 산화 단계 도중에 제거될 수 있는 인 보호기가 제공된다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드 합성 동안 탈퓨린화에 대한 증가된 내성을 제공하는 본 발명의 조성물 및 방법에서의 용도가 발견된 아미딘 핵염기 보호기가 제공된다. 몇몇 경우, 본원에 개시된 방법 및 조성물은, 200개 이상의 단량체성 단위의 서열 길이를 갖는 폴리뉴클레오타이드의 합성에 인과 아미딘 핵염기 보호기의 조합을 이용한다. 또한, 본원에 개시된 하나 이상의 화합물을 사용하여 폴리뉴클레오타이드(예컨대, DNA)를 합성하는 방법이 제공된다.
Description
본 발명은 일반적으로 핵산의 합성에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은, DNA 합성에 유용한 신규한 인 보호기 및 신규한 핵염기 보호기 및 관련 화합물, 및 이의 조성물 및 방법에 관한 것이다.
관련 출원의 교차 참조
35 U.S.C. § 119(e)에 따라, 본원은, 2014년 4월 30일자로 출원된 미국 가출원 제 61/986,594 호를 우선권 주장하며, 상기 가출원의 개시내용을 본원에 참고로 인용한다.
올리고뉴클레오타이드(DNA 및 RNA의 합성 가닥)의 화학적 합성은, 정의된 화학적 구조 및 서열을 갖는 핵산의 비교적 짧은 단편의 화학적 합성이다. 이러한 기술은, 현행 실험실 실습에서의 각종 다양한 용도로 인해 매우 중요하며 유용하다. 올리고뉴클레오타이드 합성은, 목적하는 서열의 주문-제작된 올리고뉴클레오타이드에 대한 빠르고 저렴한 접근법을 제공한다. 올리고뉴클레오타이드는, 분자 생물학 및 의학에서의 다양한 용도(예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 짧은 간섭 RNA, DNA 서열분석 및 증폭을 위한 프라이머, 분자 프로브 등)가 발견되었다.
올리고뉴클레오타이드의 화학적 합성은 전형적으로, 보호된 2'-데옥시뉴클레오사이드(dA, dC, dG, 및 T), 리보뉴클레오사이드(A, C, G, 및 U), 또는 화학적으로 개질된 뉴클레오사이드(예컨대, 2-O-메틸, 2'-F, LNA 등)로부터 유도된 포스포아미다이트 방법 및 포스포아미다이트 구성 블록을 사용하여, 고상 합성으로서 3'에서 5' 방향으로 수행된다. 올리고뉴클레오타이드를 합성하기 위해, 상기 구성 블록을, 목적하는 순서의 증가하는 올리고뉴클레오타이드 쇄에 순차적으로 커플링한다. 상기 쇄 조립체를 완성하면, 생성물을 탈보호시키고, 상기 고상으로부터 용액으로 방출시키고, 수집한다(미국 특허 제 4,415,732 호; 문헌[McBride, et al. 1983 Tetrahedron Letters 24:245-248]; 및 문헌[Sinha, et al. 1984 Nuc . Acids Res . 12:4539-4557])
시아노에틸 포스포아미다이트를 사용한 DNA 합성은, 고형 지지체 상의 200량체 이하의 올리고뉴클레오타이드의 합성 및 어레이 합성을 가능하게 하는데 있어서 강력하였다. 그러나, 현재 이용가능한 화학은 더 긴 올리고뉴클레오타이드의 합성에서 어려움에 직면하였으며, 이는, 서열 내에 단일 염기 결실(SBD) 및 큰 결실(올리고뉴클레오타이드의 더 긴 분절의 결실)을 포함하는 것으로 밝혀졌다. 단일 염기 결실은 불충분한 단계적 커플링 수율로 인해 일어날 수 있으며, 올리고뉴클레오타이드 분절의 큰 결실은, 올리고뉴클레오타이드 합성 동안 유독(harsh) 화학물질의 반복된 처리에 노출된 포스포트라이에스터 연결부의 불안정성에 기인할 수 있다.
따라서, 기존의 합성 방법론의 경우, 합성될 올리고뉴클레오타이드의 길이에 따라 에러의 개수가 축적되기 때문에, 바람직하지 않은 부반응은 합성 올리고뉴클레오타이드의 길이에 대한 실제적 제한(약 200개 이하의 뉴클레오타이드 잔부)을 설정하였다(문헌[Beaucage, et al. 1992 "Advances in the Synthesis of Oligonucleotides by the Phosphoramidite Approach" Tetrahedron 48 (12): 2223]; 및 문헌[Caruthers, et al. 1987 "Synthesis of oligonucleotides using the phosphoramidite method" Biophosphates and their Analogues Synthesis , Structure , Metabolism and Activity, eds. K.S. Bruzik, W.J. Stec, Elsevier Sci. Publ., 3-21.] 참조). 서열 길이가 증가함에 따라, 목적하는 서열에서의 에러가 더 많을 가능성이 있기 때문에, 80개 초과의 염기(특히, 200개 초과의 염기) 서열을 흔히 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 단리하여 순도를 증가시키는 것이 필요하다. 더욱이, 단계적 수율 또는 커플링 효율은 합성될 수 있는 올리고뉴클레오타이드의 길이를 많이 제한한다. 올리고뉴클레오타이드의 합성에 대한 총 수율은 OY= y(n-1)로서 나타내어지며, 이때 OY는 총 수율이고, y는 단계적 커플링 수율이고, n은 올리고뉴클레오타이드의 길이, 또는 올리고뉴클레오타이드에서 뉴클레오타이드의 개수이다. 따라서, 99.7%의 커플링 수율로 합성된 200량체 올리고뉴클레오타이드는 OY= y199(이는, OY=0.997199=0.54996 또는 54.99%와 동일함)를 가질 것이며, 99.8% 커플링 효율로 합성된 200량체는 OY=0.671394 또는 67.14%를 가질 것이다. 상기 단계적 커플링 수율은, 실시예에서 제시되는 바와 같이, 이러한 긴 올리고뉴클레오타이드의 총 수율에 현저한 영향을 미치며, 여기서는, 단계적 커플링 수율의 0.1% 차이가 OY의 12% 변화를 제공한다. 결과적으로, 단계적 커플링 효율에 대한 임의의 개선은 전장 올리고뉴클레오타이드의 OY를 매우 증가시킬 것이며, 바람직하다.
올리고뉴클레오타이드의 화학적 합성에는 상당한 과제가 남아 있다. 특히, 단계적 커플링 수율을 증가시키는 신규한 인 보호기, 및/또는 산화 단계 도중에 제거되어, 상기 논의된 바와 같은 올리고뉴클레오타이드 합성 동안 포스포트라이에스터 연결부의 불안정성을 피할 수 있는 인 보호기가 필요하다. 허용가능한 순도 및 수율을 달성하면서, 통상적인 기술에 의해 제조되는 것보다 더 긴 길이의 핵산 분자를 신뢰할만하게 합성하는 새로운 접근법에 대한 중요한 충족되지 않은 요구가 존재한다.
본원은 부분적으로, 허용가능한 순도 및 수율을 달성하면서, 통상적인 기술에서 의해 제조되는 것보다 더 긴 길이의 핵산 분자를 합성하기 위한 새로운 접근법에 기초한다. 본원의 양태는, 200개 이상의 단량체성 단위의 서열 길이를 갖는 긴 폴리뉴클레오타이드(예컨대, DNA)의 합성을 제공하는 인 및/또는 핵염기 보호기를 이용한 방법 및 조성물이다.
단계적 커플링 수율을 증가시키는 것을 돕는 인 보호기 및/또는 산화 단계 도중에 제거될 수 있는 인 보호기가 제공된다. 폴리뉴클레오타이드 합성 동안 탈퓨린화에 대한 증가된 내성, 감소된 핵염기 탈보호 시간(예를 들면, 암모니아 중의 폴리뉴클레오타이드 분할 동안), 및 조질 올리고뉴클레오타이드의 증가된 순도 및 더 적은 부산물(예컨대, 핵염기 부가물)을 제공하는 본 발명의 조성물 및 방법에서의 용도가 발견된 아미딘 핵염기 보호기가 제공된다. 몇몇 경우, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 200개 이상의 단량체성 단위의 서열 길이를 갖는 폴리뉴클레오타이드의 합성에 인과 핵염기 보호기의 조합을 이용할 수 있다.
하나의 양태에서, 본원은 일반적으로 하기 화학식 I의 화합물에 관한 것이다:
상기 식에서, B는 핵염기 또는 이의 유사체이고; R1 및 R2는, 각각 독립적으로, 치환되거나 비치환된 선형, 분지형 또는 환형 알킬이거나, R1 및 R2가 함께, 5원, 6원, 7원 또는 8원 비-방향족 고리를 형성하고; R3은 산-반응성 보호기이고; R은, 벤질 알코올 유도체, 알파-메틸 아릴 알코올 유도체, 나프탈렌 알코올 유도체, 이환형 지방족 알코올 유도체 또는 융합된 고리, S-에틸티오에이트 유도체 및 아미노산 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 기이되, R은 o-메틸 벤질이 아니다.
또다른 양태에서, 본원은 일반적으로, 본원에 개시된 하나 이상의 화합물을 사용하여 폴리뉴클레오타이드(예컨대, DNA)를 합성하는 방법에 관한 것이며, 이때 합성된 DNA는 약 200개 이상의 뉴클레오타이드 길이이다.
도 1은, 인 보호기로서 1-(4-브로모페닐)에탄올을 사용하는 dT20의 합성에 대한 TIC 및 HPLC 크로마토그램 및 질량 분석을 도시하는 것이다.
도 2는, 인 보호기로서 1-메톡시-2-나프탈렌메탄올을 사용하는 dT20의 합성에 대한 TIC 및 HPLC 크로마토그램 및 질량 분석을 도시하는 것이다.
도 3은, 2-카바모일-2-시아노에틸렌-1,1-다이티올레이트 처리 하에, 인 보호기로서 2-나프탈렌메탄올을 사용하는 dT20의 합성에 대한 TIC 및 HPLC 크로마토그램 및 질량 분석을 도시하는 것이다.
도 4는, 2-카바모일-2-시아노에틸렌-1,1-다이티올레이트 처리 하에, 인 보호기로서 6-브로모-2-나프탈렌메탄올을 사용하는 dT20의 합성에 대한 TIC 및 HPLC 크로마토그램 및 질량 분석을 도시하는 것이다.
도 5는, 인 보호기로서 1-하이드록시인단-5-카보나이트릴을 사용하는 dT20의 합성에 대한 TIC 및 HPLC 크로마토그램 및 질량 분석을 도시하는 것이다.
도 6은, 2-카바모일-2-시아노에틸렌-1,1-다이티올레이트 처리 하에, 인 보호기로서 4-시아노벤질 알코올을 사용하는 dT20의 합성에 대한 TIC 및 HPLC 크로마토그램 및 질량 분석을 도시하는 것이다.
도 7은, 2-카바모일-2-시아노에틸렌-1,1-다이티올레이트 처리 하에, 인 보호기로서 3-시아노벤질 알코올을 사용하는 dT20의 합성에 대한 TIC 및 HPLC 크로마토그램 및 질량 분석을 도시하는 것이다.
도 8은, 2-카바모일-2-시아노에틸렌-1,1-다이티올레이트 처리 하에, 인 보호기로서 2-에틴일벤질 알코올을 사용하는 dT20의 합성에 대한 TIC 및 HPLC 크로마토그램 및 질량 분석을 도시하는 것이다.
도 9는, 인 보호기로서 아세틸-L-트레오닌메틸에스터를 사용하는 dT20의 합성에 대한 TIC 및 HPLC 크로마토그램 및 질량 분석을 도시하는 것이다.
도 10은, 인 보호기로서 S-에틸벤조티오에이트를 사용하는 dT20의 합성에 대한 TIC 및 HPLC 크로마토그램 및 질량 분석을 도시하는 것이다.
도 11은, 2-카바모일-2-시아노에틸렌-1,1-다이티올레이트 처리 하에, 인 보호기로서 4-시아노벤질 알코올을 사용하는 dT20의 합성에 대한 TIC 및 HPLC 크로마토그램 및 질량 분석을 도시하는 것이다.
도 12는, 인 보호기로서 아세틸-L-트레오닌메틸에스터를 사용하는 dT60의 합성에 대한 TIC 및 HPLC 크로마토그램 및 질량 분석을 도시하는 것이다.
도 13은, 인 보호기로서 S-에틸벤조티오에이트를 사용하는 dT60의 합성에 대한 TIC 및 HPLC 크로마토그램 및 질량 분석을 도시하는 것이다.
도 14는, 인 보호기로서 S-에틸벤조티오에이트를 사용하여 합성된 T60 및 표준 2-시아노에틸 포스포아미다이트를 사용하여 합성된 T60의 TIC 및 HPLC 크로마토그램 및 질량 분석의 비교를 도시하는 것이다.
도 15는, 도 1 내지 도 14에 도시된 선택된 올리고뉴클레오타이드의 합성에 사용된 관심 포스포아미다이트 화합물(22 내지 31)의 구조를 도시하는 것이다.
도 16은, 아데노신의 아미노 N-6 상에 표준 벤조일 보호기를 사용하여 합성된 d(AAT)20 60량체 올리고뉴클레오타이드의 HPLC 크로마토그램을 도시하는 것이다.
도 17은, 아데노신의 아미노 N-6 상에 N6-(N,N-다이메틸아미디노) 보호기(위) 및 N6-(1-(모폴리노)에틸리덴)-dA(아래)를 각각 사용하여 합성된 d(AAT)20 60량체 올리고뉴클레오타이드의 2개의 HPLC 크로마토그램을 도시하는 것이다.
도 18은, N4아세틸 dC 표준 보호기(위) 및 N4-(N-메틸-2-피롤리딘일리덴)- dC(아래)를 각각 사용하여 합성된 (CCT)19C3 60량체 올리고뉴클레오타이드의 2개의 HPLC 크로마토그램을 도시하는 것이다.
도 19는, N4-(1-(모폴리노) 에틸리덴)-dC를 사용하여 합성된 dC40의 HPLC 크로마토그램을 도시하는 것이다.
도 20은, 표준 N2-(이소부티릴)- dG를 사용하여 합성된 60량체 올리고뉴클레오타이드인 d(GGT)20의 HPLC 크로마토그램을 도시하는 것이다.
도 21은, N2-(N,N-다이메틸아미디노) dG(위) 및 N2-(1-(모폴리노)에틸리덴)- dG(아래)를 각각 사용하여 합성된 60량체 올리고뉴클레오타이드인 d(GGT)20의 2개의 HPLC 크로마토그램을 도시하는 것이다.
도 22는, 표준 보호기 및 아미딘 보호기를 사용하여 합성된 60량체 올리고뉴클레오타이드의 4개의 TIC 크로마토그램 비교를 도시하는 것이다. 아미딘 보호기가 사용되는 경우, 염기 부가물의 감소가 현저하였다.
도 23은, N6-(N,N-다이메틸아미디노)-dA-3'O-S-(에틸)벤조티오에이트 포스포아미다이트를 사용하여 합성된 39량체 올리고뉴클레오타이드인 d(AAT)13의 HPLC 크로마토그램을 도시하는 것이다.
도 24는, 표준 핵염기 보호기(위) 및 아미딘 보호기(아래)를 각각 사용하여 합성된 2개의 100량체 올리고뉴클레오타이드의 2개의 HPLC 크로마토그램 비교를 도시하는 것이다.
도 25는, 3'-S-(에틸)벤조티오에이트 포스포아미다이트를 사용하여 어레이 상에 합성된 200량체 폴리뉴클레오타이드, 및 N6-(N,N-다이메틸아미디노) dA(화합물 16, 17, 18, 20)의 변성 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 도시하는 것이다.
도 2는, 인 보호기로서 1-메톡시-2-나프탈렌메탄올을 사용하는 dT20의 합성에 대한 TIC 및 HPLC 크로마토그램 및 질량 분석을 도시하는 것이다.
도 3은, 2-카바모일-2-시아노에틸렌-1,1-다이티올레이트 처리 하에, 인 보호기로서 2-나프탈렌메탄올을 사용하는 dT20의 합성에 대한 TIC 및 HPLC 크로마토그램 및 질량 분석을 도시하는 것이다.
도 4는, 2-카바모일-2-시아노에틸렌-1,1-다이티올레이트 처리 하에, 인 보호기로서 6-브로모-2-나프탈렌메탄올을 사용하는 dT20의 합성에 대한 TIC 및 HPLC 크로마토그램 및 질량 분석을 도시하는 것이다.
도 5는, 인 보호기로서 1-하이드록시인단-5-카보나이트릴을 사용하는 dT20의 합성에 대한 TIC 및 HPLC 크로마토그램 및 질량 분석을 도시하는 것이다.
도 6은, 2-카바모일-2-시아노에틸렌-1,1-다이티올레이트 처리 하에, 인 보호기로서 4-시아노벤질 알코올을 사용하는 dT20의 합성에 대한 TIC 및 HPLC 크로마토그램 및 질량 분석을 도시하는 것이다.
도 7은, 2-카바모일-2-시아노에틸렌-1,1-다이티올레이트 처리 하에, 인 보호기로서 3-시아노벤질 알코올을 사용하는 dT20의 합성에 대한 TIC 및 HPLC 크로마토그램 및 질량 분석을 도시하는 것이다.
도 8은, 2-카바모일-2-시아노에틸렌-1,1-다이티올레이트 처리 하에, 인 보호기로서 2-에틴일벤질 알코올을 사용하는 dT20의 합성에 대한 TIC 및 HPLC 크로마토그램 및 질량 분석을 도시하는 것이다.
도 9는, 인 보호기로서 아세틸-L-트레오닌메틸에스터를 사용하는 dT20의 합성에 대한 TIC 및 HPLC 크로마토그램 및 질량 분석을 도시하는 것이다.
도 10은, 인 보호기로서 S-에틸벤조티오에이트를 사용하는 dT20의 합성에 대한 TIC 및 HPLC 크로마토그램 및 질량 분석을 도시하는 것이다.
도 11은, 2-카바모일-2-시아노에틸렌-1,1-다이티올레이트 처리 하에, 인 보호기로서 4-시아노벤질 알코올을 사용하는 dT20의 합성에 대한 TIC 및 HPLC 크로마토그램 및 질량 분석을 도시하는 것이다.
도 12는, 인 보호기로서 아세틸-L-트레오닌메틸에스터를 사용하는 dT60의 합성에 대한 TIC 및 HPLC 크로마토그램 및 질량 분석을 도시하는 것이다.
도 13은, 인 보호기로서 S-에틸벤조티오에이트를 사용하는 dT60의 합성에 대한 TIC 및 HPLC 크로마토그램 및 질량 분석을 도시하는 것이다.
도 14는, 인 보호기로서 S-에틸벤조티오에이트를 사용하여 합성된 T60 및 표준 2-시아노에틸 포스포아미다이트를 사용하여 합성된 T60의 TIC 및 HPLC 크로마토그램 및 질량 분석의 비교를 도시하는 것이다.
도 15는, 도 1 내지 도 14에 도시된 선택된 올리고뉴클레오타이드의 합성에 사용된 관심 포스포아미다이트 화합물(22 내지 31)의 구조를 도시하는 것이다.
도 16은, 아데노신의 아미노 N-6 상에 표준 벤조일 보호기를 사용하여 합성된 d(AAT)20 60량체 올리고뉴클레오타이드의 HPLC 크로마토그램을 도시하는 것이다.
도 17은, 아데노신의 아미노 N-6 상에 N6-(N,N-다이메틸아미디노) 보호기(위) 및 N6-(1-(모폴리노)에틸리덴)-dA(아래)를 각각 사용하여 합성된 d(AAT)20 60량체 올리고뉴클레오타이드의 2개의 HPLC 크로마토그램을 도시하는 것이다.
도 18은, N4아세틸 dC 표준 보호기(위) 및 N4-(N-메틸-2-피롤리딘일리덴)- dC(아래)를 각각 사용하여 합성된 (CCT)19C3 60량체 올리고뉴클레오타이드의 2개의 HPLC 크로마토그램을 도시하는 것이다.
도 19는, N4-(1-(모폴리노) 에틸리덴)-dC를 사용하여 합성된 dC40의 HPLC 크로마토그램을 도시하는 것이다.
도 20은, 표준 N2-(이소부티릴)- dG를 사용하여 합성된 60량체 올리고뉴클레오타이드인 d(GGT)20의 HPLC 크로마토그램을 도시하는 것이다.
도 21은, N2-(N,N-다이메틸아미디노) dG(위) 및 N2-(1-(모폴리노)에틸리덴)- dG(아래)를 각각 사용하여 합성된 60량체 올리고뉴클레오타이드인 d(GGT)20의 2개의 HPLC 크로마토그램을 도시하는 것이다.
도 22는, 표준 보호기 및 아미딘 보호기를 사용하여 합성된 60량체 올리고뉴클레오타이드의 4개의 TIC 크로마토그램 비교를 도시하는 것이다. 아미딘 보호기가 사용되는 경우, 염기 부가물의 감소가 현저하였다.
도 23은, N6-(N,N-다이메틸아미디노)-dA-3'O-S-(에틸)벤조티오에이트 포스포아미다이트를 사용하여 합성된 39량체 올리고뉴클레오타이드인 d(AAT)13의 HPLC 크로마토그램을 도시하는 것이다.
도 24는, 표준 핵염기 보호기(위) 및 아미딘 보호기(아래)를 각각 사용하여 합성된 2개의 100량체 올리고뉴클레오타이드의 2개의 HPLC 크로마토그램 비교를 도시하는 것이다.
도 25는, 3'-S-(에틸)벤조티오에이트 포스포아미다이트를 사용하여 어레이 상에 합성된 200량체 폴리뉴클레오타이드, 및 N6-(N,N-다이메틸아미디노) dA(화합물 16, 17, 18, 20)의 변성 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 도시하는 것이다.
정의
특정 작용 기의 정의 및 화학 용어가 하기 더 자세히 기술된다. 유기 화학의 일반 원칙뿐만 아니라 특정 기능성 잔기 및 반응성은 문헌["Organic Chemistry", Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito: 1999]에 기술되어 있다.
본원의 특정 화합물은 특히 기하 이성질체 또는 입체 이성질체 형태로 존재할 수 있다. 본원은, 본원의 범주 내에 드는 이러한 모든 화합물(이들의 시스- 및 트랜스-이성질체, R- 및 S-거울상 이성질체, 부분입체 이성질체, (d)-이성질체, (l)-이성질체, 라세미 혼합물 및 다른 혼합물 포함)을 포함한다. 추가적인 비대칭 탄소 원자가 치환기(예컨대, 알킬 기) 내에 존재할 수 있다. 이러한 모든 이성질체뿐만 아니라 이들의 혼합물은 본 발명의 개시내용 내에 포함되는 것으로 의도된다.
임의의 다양한 이성질체 비를 포함하는 이성질체 혼합물이 본 발명에 따라 이용될 수 있다. 예를 들어, 2개의 이성질체만 조합되는 경우, 50:50, 60:40, 70:30, 80:20, 90:10, 95:5, 96:4, 97:3, 98:2, 99:1, 또는 100:0의 이성질체 비를 포함하는 혼합물이 본원에서 고려된다. 당업자는, 더 복잡한 이성질체 혼합물의 경우 유사한 비가 고려됨을 용이하게 이해할 것이다.
예를 들어, 본 발명의 화합물의 특정 거울상 이성질체가 바람직한 경우, 이는, 비대칭 합성에 의해 또는 키랄 보조제를 사용한 유도에 의해 제조할 수 있으며, 이때 결과적인 부분입체 이성질체 혼합물을 분리하고, 보조 기를 분할하여, 순수한 목적하는 거울상 이성질체를 수득한다. 다르게는, 이러한 분자가 염기성 작용 기(예컨대, 아미노) 또는 산성 작용 기(예컨대, 카복실)를 포함하는 경우, 적절한 광학 활성 산 또는 염기로 부분입체 이성질체성 염을 형성하고, 이어서 이렇게 형성된 부분입체 이성질체들을 분별 결정화 또는 당분야에 널리 공지된 크로마토그래피 방법에 의해 분리하고, 후속적으로 순수한 거울상 이성질체를 회수한다.
본원의 이점을 고려하여, 당업자는 본원에 기술된 합성 방법이 다양한 보호기를 이용할 수 있음을 이해할 것이다. 본원에서 용어 "보호기"는, 다작용성 화합물의 또다른 반응성 부위에서 반응이 선택적으로 수행될 수 있도록, 특정 기능성 잔기(예컨대, O, S, 또는 N)가 일시적으로 차단됨을 의미한다. 바람직한 실시양태에 있어서, 보호기는 우수한 수율로 선택적으로 반응하여, 예상된 반응에 안정한 보호된 기질을 제공한다. 이러한 보호기는, 다른 작용 기는 공격하지 않고 바람직하게는 용이하게 이용가능하고 비독성인 시약에 의해 우수한 수율로 선택적으로 제거가능해야 한다. 이러한 보호기는 용이하게 분리가능한 유도체를 형성한다(더욱 바람직하게는 새로운 입체발생 중심을 생성하지 않고). 이러한 보호기는 추가 반응 부위를 피하기 위해 최소한의 추가적 반응성을 가져야 한다. 산소, 황, 질소, 및 탄소 보호기를 이용할 수 있다. 다양한 보호기의 예는 문헌[Protective Groups in Organic Synthesis, Third Ed. Greene, T.W. and Wuts, P.G., Eds., John Wiley & Sons, New York: 1999]에서 발견할 수 있다.
본원에서 사용되는 핵산 화학, 생화학, 유전학, 및 분자 생물학의 용어 및 기호는 해당 분야의 표준 논문 및 문헌, 예컨대 문헌[Kornberg and Baker, DNA Replication, Second Edition (W.H. Freeman, New York, 1992)]; 문헌[Lehninger, Biochemistry, Second Edition (Worth Publishers, New York, 1975)]; 문헌[Strachan and Read, Human molcular Genetics, Second Edition (Wiley-Liss, New York, 1999)]; 문헌[Eckstein, editor, Oligonucleotides and Analogs: A Practical Approach (Oxford University Press, New York, 1991)]; 문헌[Gait, editor, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1984)]; 문헌[Sambrook et al., molcular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989)]의 용어 및 기호를 따른다. 또한, 참고의 명확함 및 용이성을 위해 특정 용어가 하기 정의된다.
본원에 기술되는 화합물이 임의의 개수의 치환기 또는 기능성 잔기로 치환될 수 있음이 이해될 것이다.
본원에서 용어 "뉴클레오타이드" 또는 "뉴클레오타이드 잔기"는, 포스페이트 기, 당 기 및 헤테로환형 염기를 포함하는 핵산(DNA 또는 RNA 또는 이들의 유사체 중 어느 하나)의 하위-단위 뿐만 아니라 이러한 하위-단위의 유사체를 지칭한다. 다른 기(예를 들어, 보호기)가 뉴클레오타이드의 임의의 성분(들)에 부착될 수 있다.
본원에서 용어 "뉴클레오사이드" 또는 "뉴클레오사이드 잔기"는 당 기 및 헤테로환형 염기를 포함하는 핵산의 하위-단위뿐만 아니라 이러한 하위-단위의 유사체를 지칭한다. 다른 기(예를 들어, 보호기)가 뉴클레오사이드의 임의의 성분에 부착될 수 있다.
용어 "뉴클레오사이드" 및 "뉴클레오타이드"는, 공지된 퓨린 및 피리미딘 염기를 함유하는 잔기, 예를 들어 아데닌(A), 티민(T), 사이토신(C), 구아닌(G), 또는 우라실(U)뿐만 아니라, 개질된 다른 헤테로환형 염기를 함유하는 잔기를 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 개질은, 메틸화된 퓨린 또는 피리미딘, 알킬화된 퓨린 또는 피리미딘, 아실화된 퓨린 또는 피리미딘, 할로겐화된 퓨린 또는 피리미딘, 알킬화된 리보스 또는 다른 헤테로환을 포함한다. 이러한 개질은, 예를 들어 다이아미노퓨린 및 이의 유도체, 이노신 및 이의 유도체, 알킬화된 퓨린 또는 피리미딘, 아실화된 퓨린 또는 피리미딘, 티올화된 퓨린 또는 피리미딘 등을 포함하거나, 보호기, 예를 들어 아세틸, 다이플루오로아세틸, 트라이플루오로아세틸, 이소부티릴, 벤조일, 9-플루오레닐메톡시카보닐, 페녹시아세틸 및 치환된 페녹시아세틸, 다이메틸폼아미딘, 다이부틸폼아미딘, 피롤로디노아미딘,모폴리노아미딘 및 다른 아미딘 유도체, N,N-다이페닐 카바메이트 등의 첨가를 포함한다. 퓨린 또는 피리미딘은 또한 전술된 것들의 유사체일 수 있고; 적당한 유사체는 당업자에게 공지되어 있고, 관련 출전 및 문헌에 기술되어 있다. 일반적인 유사체는, 비제한적으로, 7-데아자아데닌, 1-메틸아데닌, 2-메틸아데닌, N6-메틸아데닌, N6-이소펜틸아데닌, 2-메틸티오-N6-이소펜틸아데닌, N,N-다이메틸아데닌, 8-브로모아데닌, 2-티오사이토신, 3-메틸사이토신, 5-메틸사이토신, 5-에틸사이토신, 4-아세틸사이토신, 1-메틸구아닌, 2-메틸구아닌, 7-메틸구아닌, 2,2-다이메틸구아닌, 8-브로모구아닌, 8-클로로구아닌, 8-아미노구아닌, 8-메틸구아닌, 8-티오구아닌, 5-플루오로우라실, 5- 브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요오도우라실, 5-에틸우라실, 5-프로필우라실, 5-메톡시우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 5-(카복시하이드록시메틸)우라실, 5-(메틸아미노메틸)우라실, 5-(카복시메틸아미노메틸)-우라실, 2-티오우라실, 5-메틸-2-티오우라실, 5-(2-브로모비닐)우라실, 우라실-5-옥시아세트산, 우라실-5-옥시아세트산 메틸 에스터, 슈도우라실, 1-메틸슈도우라실, 케오신, 이노신, 1-메틸이노신, 하이포잔틴, 잔틴, 2-아미노퓨린, 6-하이드록시아미노퓨린, 6-티오퓨린 및 2,6-다이아미노퓨린을 포함한다.
"핵염기"는, 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드의 헤테로환형 염기를 지칭한다.
또한, 용어 "뉴클레오사이드" 및 "뉴클레오타이드"는, 통상적인 리보오스 및 데옥시리보오스 당뿐만 아니라 다른 당도 포함하는 잔기를 포함한다. 개질된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드는 또한, 당 잔기에서의 개질물을 포함하거나(예를 들어 하나 이상의 하이드록시기가 할로겐 원자 또는 지방족 기로 치환된 것, 예를 들면 LNA로서 공지된 고정된(locked) 핵산 및 UNA(비고정된 핵산)인 2'-플루오로, 2'-O-알킬, 2'-O-에톡시메톡시), 에터, 아민 등으로 작용화된다.
본원에서 용어 "유사체"는, 문헌에서 모방체, 유도체, 유사한 구조를 갖는 것 등으로 인식되어 있는 구조적 특징부를 갖는 분자를 지칭하고, 예를 들어 비-천연(일반적으로 자연에 존재하지 않음) 뉴클레오타이드, 비-천연 뉴클레오타이드 모방체, 예를 들어 2'-개질 뉴클레오사이드, 펩타이드 핵산, 폴리고머 뉴클레오사이드 포스포네이트를 혼입한 폴리뉴클레오타이드, 및 보호기 또는 연결기와 같이 부가된 치환기를 갖는 임의의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
본원에서 용어 "핵산"은, 뉴클레오타이드, 예컨대, 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드로 구성된 임의의 길이, 예컨대, 약 2개 초과의 염기, 약 10개 초과의 염기, 약 100개 초과의 염기, 약 500개 초과의 염기, 1,000개 초과의 염기, 약 10,000 이상까지의 염기의 중합체를 지칭하며, 효소적으로 합성적으로 제조될 수 있으며(예컨대, 미국 특허 제 5,948,902 호 및 이의 인용 문헌에 기술된 바와 같은 PNA), 이는, 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기 쌍형성 상호작용에 참여할 수 있는 2개의 천연 뉴클레오타이드와 유사한 특정 서열 방식으로 천연 핵산과 하이브리드될 수 있다. 천연 뉴클레오타이드는 구아노신 및 2'-데옥시구아노신, 시티딘 및 2'-데옥시시티딘, 아데노신 및 2'-데옥시아데노신, 티미딘 및 유리딘(각각, G, dG, C, dC, A, dA 및 T, U)을 포함한다.
핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태로 존재할 수 있다. 이중 가닥 핵산은, 본원에서 "제 1" 및 "제 2" 가닥 또는 일부 다른 임의적 지정으로 지칭될 수 있는, 핵산의 2개의 상보적 가닥을 가진다. 상기 제 1 및 제 2 가닥은 개별적인 분자이며, 가닥을 제 1 또는 제 2 가닥으로서 지정하는 것은 임의적이며, 임의의 특정 방향, 작용 또는 구조를 암시하는 것이 아니다. 몇몇 예시적인 포유류의 염색체 영역(예컨대, BAC, 조립체, 염색체 등)뿐만 아니라 많은 병원균의 제 1 가닥의 뉴클레오타이드 서열은 공지되어 있으며, 예를 들어 NCBI의 진뱅크(Genbank) 데이터베이스에서 발견할 수 있다. 상기 영역의 제 2 가닥은 상기 영역의 제 1 가닥과 상보적이다.
본원에서 용어 "올리고뉴클레오타이드"는, 뉴클레오타이드(특히, 약 2 내지 500개의 뉴클레오타이드)의 단일 가닥 다량체(multimer)를 지칭한다. 올리고뉴클레오타이드는 합성되거나 효소적으로 제조될 수 있으며, 몇몇 실시양태에서, 이는 10 내지 50개의 뉴클레오타이드 길이이다. 올리고뉴클레오타이드는 리보뉴클레오타이드 단량체(즉, 올리고리보뉴클레오타이드일 수 있음) 또는 데옥시리보뉴클레오타이드 단량체를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는, 특히, 예를 들어 10 내지 20개, 21 내지 30개, 31 내지 40개, 41 내지 50개, 51 내지 60개, 61 내지 70개, 71 내지 80개, 80 내지 100개, 100 내지 150개, 150 내지 500개 또는 500개 초과의 뉴클레오타이드 길이를 포함할 수 있다.
본원에서 용어 "데옥시리보핵산" 및 "DNA"는, 뉴클레오타이드 및/또는 데옥시리보뉴클레오타이드로 구성된 핵산을 지칭한다.
본원에서 용어 "리보핵산" 및 "RNA"는, 뉴클레오타이드 및/또는 리보뉴클레오타이드로 구성된 핵산을 지칭한다.
"뉴클레오타이드간 결합" 또는 "뉴클레오타이드 결합"은, 2개의 뉴클레오사이드 잔기들 사이의 화학적 연결부, 예컨대 자연에서 발견되는 핵산 내의 포스포다이에스터 연결부, 또는 핵산 및 핵산 유사체의 합성 분야에 널리 공지된 연결부를 지칭한다. 뉴클레오타이드간 결합은 포스포 또는 포스파이트 기를 포함할 수 있고, 포스포 또는 포스파이트 기의 하나 이상의 산소 원자가 치환기 또는 보호기로 개질되거나 또다른 원자(예컨대, 황 원자, 또는 모노- 또는 다이-알킬 아미노 기의 질소 원자)로 대체된 연결부를 포함할 수 있다.
본원에서 용어 "헤테로환", "헤테로환형", "헤테로환형 기" 또는 "헤테로사이클로"는, 방향족("헤테로아릴") 또는 비방향족(예를 들어, 3 내지 13원 일환형, 7 내지 17원 이환형 또는 10 내지 20원 삼환형 고리계)을 비롯한 하나 이상의 탄소 원자-함유 고리에 하나 이상의 헤테로원자를 갖는, 전체적으로 포화되거나 부분적 또는 완전하게 불포화된 환형 기를 지칭한다. 헤테로원자를 함유하는 헤테로환형 기의 각각의 고리는 질소 원자, 산소 원자 및/또는 황 원자 중에서 선택된 1개, 2개, 3개 또는 4개의 헤테로원자를 갖되, 상기 질소 및 황 헤테로원자가 임의로 산화되고, 질소 헤테로원자가 임의로 4급화될 수 있는, 헤테로 원자를 가질 수 있다. 헤테로환형 기는 고리 또는 고리계의 임의의 헤테로원자 또는 탄소 원자에 부착될 수 있다. 다중 고리 헤테로환 중 고리는 하나 이상의 스파이로 결합을 통해 융합, 가교화, 및/또는 연결될 수도 있다. 질소-함유 염기는 헤테로환의 예이다. 다른 예로는 피페리디닐, 모르폴리닐 및 피롤리디닐을 포함한다.
용어 "전자-당김(electron-withdrawing) 기"는, 이웃 원자로부터 원자가(valence) 전자를 당기는 경향이 있는 잔기를 지칭한다(즉, 상기 치환기는 이웃 원자에 비해 음전성(electronegative)이다). 전자-당김능의 수준을 정량화하는 것은 해머트 시그마 상수(Hammett sigma constant)에 의해 제공된다. 이 공지된 상수는 다수의 문헌, 예를 들어 문헌[March, Advanced Organic Chemistry 251-59, McGraw Hill Book Company, New York, (1977)]에 개시되어 있다. 전자-당김 기로는 나이트로, 아실, 포르밀, 설폰일, 트라이플루오로메틸, 시아노, 클로라이드 등을 포함한다.
용어 "전자-공여 기"는, 이웃 원자에 원자가(valence) 전자를 제공하는 경향을 갖는 잔기를 지칭한다(즉, 이러한 치환기는 이웃 원자에 비해 덜 음전성이다). 전자-공여 기로는 아미노, 메톡시, 알킬(선형 또는 분지형 구조를 가질 수 있는 C1 -6의 알킬), C4 -9의 사이클로알킬 등을 포함한다.
본원에서 "보호기"는, 분자의 일부가 특이적인 화학 반응을 겪는 것을 억제하지만, 상기 반응의 종결 후에 분자로부터 제거가능한 종을 지칭한다. "보호기"란, 통상적인 화학적 의미에서는, 문헌[Greene, et al., "Protective Groups in Organic Synthesis," John Wiley and Sons, Second Edition, 1991]에서 교시하는 바와 같이, 요구되는 반응의 특정 조건하에서 작용성 기를 가역적으로 비반응성이도록 하는 기로서 사용된다. 목적하는 반응 후에, 보호기는 제거되어 보호된 작용기를 탈보호할 수 있다. 모든 보호기는 합성될 분자의 실질적인 부분을 분해시키지 않는 조건하에서 제거가능해야만 한다(즉, 불안정성이어야만 한다). 보호기와는 대조적으로, "캡핑기"는 분자의 분절에 영구적으로 결합되어, 상기 분절의 임의의 추가의 화학적 변형을 억제한다. 보호기에 의해 보호된 작용기는 보호기로서 지칭되는 것의 일부이거나 일부가 아닐 수도 있음에 주목해야만 한다.
본원에서 용어 "하이드록실 보호기" 또는 "O-보호기"는, 보호된 기가 하이드록실인 보호기를 지칭한다. "반응성-부위 하이드록실"은 3'-5' 폴리뉴클레오타이드 합성 동안의 말단 5'-하이드록실, 또는 5'-3' 폴리뉴클레오타이드 합성 동안 3'-하이드록실이다. "자유 반응성-부위 하이드록실"은, 폴리뉴클레오타이드 합성 동안 반응하여 뉴클레오타이드간 결합(예를 들어, 포스포르아미다이트 작용성 기)을 형성하기에 용이한 반응성-부위 하이드록실이다.
본원에서 용어 "알킬"은, (탄소수 1 내지 24, 전형적으로는 탄소수 1 내지 12의) 포화된 직쇄, 분지쇄 또는 환형 탄화수소 기를 지칭하고, 예를 들면 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, t-부틸, 펜틸, 사이클로펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, 헥실, 이소헥실, 사이클로헥실, 3-메틸펜틸, 2,2-다이메틸부틸, 및 2,3-다이메틸부틸을 지칭한다. 알킬은 "사이클로알킬"을 포함하며, 사이클로알킬은 환형 알킬 기, 예컨대 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸 및 사이클로옥틸을 지칭한다.
본원에서 용어 "알켄일"은, 달리 명시하지 않는 한, 하나 이상의 이중 결합을 함유하는 탄소수 2 내지 24, 전형적으로 탄소수 2 내지 12의 분지형, 비분지형 또는 환형(예를 들어, C5 및 C6의 경우) 탄화수소 기, 예를 들어, 에테닐, 비닐, 알릴, 옥테닐, 데세닐 등을 지칭한다. "저급 알켄일"이라는 용어는, 탄소수 2 내지 8의 탄소 원자의 알켄일 기를 의미하고, 구체적으로 비닐 및 알릴을 포함한다. "사이클로알켄일"이라는 용어는, 환형 알켄일 기를 지칭한다.
본원에서 용어 "알킨일"은, 달리 명시하지 않는 한, 하나 이상의 삼중 결합을 함유하는 탄소수 2 내지 24, 전형적으로 2 내지 12의 분지형 또는 비분지형 탄화수소 기, 예를 들어 아세틸레닐, 에티닐, n-프로피닐, 이소프로피닐, n-부티닐, 이소부티닐, t-부티닐, 옥티닐, 데시닐 등을 지칭한다. "저급 알킨일"이란, 탄소수 2 내지 8의 알킨일기를 의미하며, 예를 들어 아세틸레닐 및 프로피닐을 포함하고, "사이클로알킨일"이라는 용어는 환형 알킨일 기를 지칭한다.
본원에서 용어 "하이드로카빌"은, 알킬, 알켄일 또는 알킨일을 지칭한다. 달리 언급되지 않는 한, 용어 "하이드로카빌"은 일반적으로, 탄화수소 골격의 하나 이상의 탄소에서 하나의 수소가 치환기로 치환된 하이드로카빌 잔기를 지칭한다. 상기 치환기는, 예를 들어, 하이드록실, 할로겐, 카보닐(예를 들어, 카복실, 알콕시카보닐, 폼일, 또는 아실), 티오카보닐(예를 들어, 티오에스터, 티오아세테이트, 또는 티오포르메이트), 알콕실, 포스포릴, 포스포네이트, 포스피네이트, 아미노, 아미도, 아미딘, 이민, 시아노, 나이트로, 아지도, 설프하이드릴, 알킬티오, 설페이트, 설포네이트, 설파모닐, 설폰아미도, 설폰일, 헤테로환형, 아르알킬, 또는 방향족 또는 헤테로방향족 잔기일 수 있다. 당업자는, 탄화수소 쇄에서 치환된 잔기가, 적당한 경우, 그 자체로 치환될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 치환된 알킬의 치환기는, 아미노, 아지도, 이미노, 아미도, 포스포릴(포스포네이트 및 포스피네이트 포함), 설폰일(설페이트, 설폰아미도, 설파모일 및 설포네이트 포함), 및 실릴기뿐만 아니라, 에터, 알킬티오, 카보닐(케톤, 알데하이드, 카복실레이트, 및 에스터 포함), -CN 등의 치환된 형태 및 비치환된 형태를 포함할 수 있다. 사이클로알킬은 알킬, 알켄일, 알콕시, 알킬티오, 아미노알킬, 카보닐-치환된 알킬, -CN 등으로 추가로 치환될 수 있다.
용어 "알콕시" 또는 "알킬옥시"는, 산소에 연결된 알킬기를 의미하고, 구조식 R-O-(여기서, R은 알킬기임)로 표현될 수 있다. 그 예는 메톡시기 CH3O-이다.
용어 "아릴"은, 특히 0 내지 4개의 헤테로원자를 포함할 수 있는 5원, 6원 및 7원 단일 또는 다중 고리 방향족 기, 예를 들어 벤젠, 피롤, 퓨란, 티오펜, 이미다졸, 옥사졸, 티아졸, 트라이아졸, 피라졸, 피리딘, 피라진, 피리다진 및 피리미딘 등을 지칭한다. 고리 구조내의 헤테로원자를 갖는 아릴 기는 또한 "아릴 헤테로환" 또는 "헤테로방향족"으로 지칭될 수 있다. "아릴"이라는 용어는, 2개 이상의 환형 고리를 갖고 2개 이상의 탄소가 인접 고리와 공통이고(이러한 고리를 "융합된 고리"로서 지칭함) 고리 중 하나 이상이 방향족인(예를 들어, 나머지 환형 고리는 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 사이클로알킨일, 아릴 및/또는 헤테로환일 수 있다) 다환형 고리계를 포함한다. 융합된 고리 아릴 기의 예는 나프탈렌이다. "저급 아릴"은 18개 이하, 예를 들어 14개 이하, 12개 이하, 10개 이하, 8개 이하, 또는 6개 이하의 탄소를 함유한다.
방향족 고리는, 하나 이상의 고리 위치에서, 치환된 하이드로카빌에 대해 전술된 바와 같은 치환기(예를 들어, 할로겐, 아자이드, 알킬, 아르알킬, 알켄일, 알키닐, 사이클로알킬, 하이드록실, 알콕실, 아미노, 나이트로, 설프하이드릴, 이미노, 아미도, 포스포네이트, 포스피네이트, 카보닐, 카복실, 실릴, 에터, 알킬티오, 설포닐, 설폰아미도, 케톤, 알데하이드, 에스터, 헤테로환형, 방향족 또는 헤테로방향족 잔기, -CF3, -CN 등)로 치환될 수 있다.
본원에서 용어 "할로겐"은, 불소, 염소, 브롬 또는 요오드를 지칭한다.
본원에서 "연결부"는, 2개의 다른 잔기에 결합된 제 1 잔기를 지칭하되, 여기서 2개의 다른 잔기는 제 1 잔기를 통해 연결된다. 전형적인 연결부로는, 에터(-O-), 옥소(-C(O)-), 아미노(-NH-), 아미도(-N-C(O)-), 티오(-S-), 포스포(-P-), 에스터(-0-C(O)-)를 포함한다.
본원에서 용어 "작용화된"은, 물질에 특이적 잔기가 결합되도록(예를 들어 물질 또는 기재가 특이적 잔기를 갖도록 개질됨) 상기 물질을 개질하는 공정을 지칭하고, 이렇게 개질된 물질(예를 들어, 분자 또는 지지체)은 작용화된 물질(예를 들어, 작용화된 분자 또는 작용화된 지지체)로서 지칭된다.
화학 구조, 기 또는 잔기를 기술하기 위해서 사용된 용어 "치환된"은, 하나 이상의 치환기를 포함하는 구조, 기 또는 잔기를 지칭한다. 본원에서 사용되는 경우, 제 1 기가 제 2 기로 "치환된" 경우, 제 2 기는 제 1 기에 부착되어, 이로서 제 1 기의 잔기(전형적으로 수소)가 제 2 기로 대체된다. 예를 들어, 알킬 기가 "R" 기를 갖는 경우, 상기 알킬 기는 표시된 위치에서 비치환된 것으로 간주되고, 수소가 할로겐으로 대체된 경우, 이는 상기 위치에서 할로겐으로 치환된 것으로 간주된다.
본원에서 용어 "치환기"는, 화학 구조에서 또다른 기를 대체하는 기를 지칭한다. 전형적인 치환기는 수소 이외의 원자(예를 들어, 할로겐), 작용성 기(예를 들어, 비제한적으로, 아미노, 설프하이드릴, 카보닐, 하이드록실, 알콕시, 카복실, 실릴, 실릴옥시, 포스페이트 등), 하이드로카빌 기, 및 하나 이상의 헤테로원자로 치환된 하이드로카빌기를 포함한다. 예시적 치환기는 알킬, 저급 알킬, 아릴, 아르알킬, 저급 알콕시, 티오알킬, 하이드록실, 티오, 머캅토, 아미노, 이미노, 할로, 시아노, 나이트로, 나이트로소, 아지드, 카복시, 설파이드, 설폭시, 포스포릴, 실릴, 실릴옥시, 보론일 및 개질된 저급 알킬을 포함한다.
"임의적" 또는 "임의적으로"란 순차로 기술된 상황이 일어날 수도 일어나지 않을 수도 있음을 의미하는 것으로, 이는 위 상황이 일어나는 경우 및 일어나지 않는 경우를 포함한다. 예를 들어, "임의로 치환된"이란 문구는, 비-수소 치환기가 있거나 없을 수도 있음을 의미하는 것으로, 따라서 이는 비-수소 치환기가 존재하는 구조 및 비-수소 치환기가 존재하지 않는 구조를 포함한다. 본원의 여러 곳에서, 잔기는 0번 이상 존재하는 것으로 기술될 수 있으며(즉, 이는, 상기 잔기가 임의적이라는 것과 같음), 또한 상기 잔기가 존재하는 실시양태 및 상기 잔기가 존재하지 않는 실시양태를 포함한다. 상기 임의적 잔기가 존재하지 않는(구조 내에 0번 존재하는) 경우, 상기 임의적 잔기에 의해 연결되게 기재된 인접 기는 서로 직접적으로 연결된다. 유사하게, 잔기는 (1) 두 개의 인접 기를 연결하는 기 또는 (2) 두 개의 인접 기를 연결하는 결합으로 기술될 수 있다. 상기 설명 (1) 및 (2)는 상기 잔기가 임의적이라는 것과 같고, 또한 상기 잔기가 존재하는 실시양태 및 상기 잔기가 존재하지 않는 실시양태를 포함한다. 상기 임의적 잔기가 존재하지 않는(구조 내에 0번 존재하는) 경우, 상기 임의적 잔기에 의해 연결되게 기재된 인접 기는 서로 직접적으로 연결된다.
"단리된" 또는 "정제된"은 일반적으로, 성분(화합물, 폴리뉴클레오타이드, 단백질, 폴리펩타이드, 염색체 등)이 (용매를 제외한) 시료의 상당 부분을 차지하도록 하는(이때 상기 성분은 자연적 또는 비-단리된 상태에서 전형적으로 발견되는 것보다 더 많이 존재함) 상기 성분의 단리를 지칭한다. 전형적으로, 상기 시료의 상당 부분은 (용매를 제외한) 상기 시료의 약 1% 이상, 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 50% 이상, 바람직하게는 약 80% 이상 또는 더욱 바람직하게는 약 90% 이상을 차지한다. 예를 들면, 단리된 RNA 시료는 전형적으로 전체 약 5% 이상의 RNA를 포함할 것이며, 여기서 퍼센트는 (용매를 제외한) 상기 시료에서의 총 RNA + 다른 성분들의 질량(예컨대, 마이크로그램)의 합으로 나눈 상기 시료에서의 총 RNA 질량(예컨대, 마이크로그램)으로 본원에서 계산된다. 관심사인 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드의 정제 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들면 겔 전기영동, 이온-교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 유동 분급(flow sorting) 및 밀도에 따른 침강이 포함된다. 전형적인 실시양태에서, 하나 이상의 뉴클레오타이드 성분은 단리된 형태로 존재하고, 더욱 전형적으로, 본 발명의 방법에 사용되기 전에 세 개가 모두 단리된 형태로 수득된다.
본원에서 (Cx-Cy)는, 일반적으로 x 내지 y개(끝값 포함)의 탄소 원자를 갖는 기를 지칭한다. 따라서, 예를 들어, C1-C6은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 탄소 원자를 갖는 기를 지칭하며, 이는 C1-C2, C1-C3, C1-C4, C1-C5, C2-C3, C2-C4, C2-C5, C2-C6, 및 유사한 조합을 포함한다. 유사하게, (C1-C20)은, 1 내지 20개(끝값 포함)의 탄소 원자의 다양한 조합, 예컨대 (C1-C6), (C1-C12) 및 (C3-C12)를 포함한다.
본원에서 용어 "공유" 또는 "공유적으로"는, 원자들 간의 화학적 결합 상호작용의 성질을 지칭한다. 공유 결합은, 원자들 간의 전자쌍의 공유를 포함하는 화학적 결합이다. 원자들이 전자를 공유하는 경우 원자들 간의 인력 및 척력의 안정한 균형이 공유 결합으로서 지칭된다. 전자의 공유는, 각각의 원자가, 가득찬 외부 쉘 균등물(이는 안정한 전자 배치에 해당함)을 달성할 수 있도록 한다. 공유 결합은 다양한 종류의 상호작용, 예컨대 σ-결합, π-결합, 금속-대-금속 결합, 아고스틱(agostic) 상호작용 및 3-중심 2전자 결합을 포함한다.
본워에서 용어 "비-공유" 또는 "비-공유적으로"는, 원자들 간의 화학적 결합의 성질을 지칭한다. 비-공유 결합은, 전자쌍의 공유를 포함하지 않는 화학적 결합 유형이며, 오히려 전자기 상호작용의 더 분산된 변형을 포함한다. 통상적으로 언급되는 4가지 유형의 비-공유 상호작용이 존재한다: 수소 결합, 이온 결합, 반 데르 발스(van der Waals) 힘 및 소수성 상호작용.
본원에서 용어 "정제된" 또는 "정제하다"는, 시료로부터 성분(예컨대, 오염물)을 제거하는 것을 지칭한다.
본원은, 허용가능한 순도 및 수율을 달성하면서, 통상적인 기술에 의해 제조되는 것보다 더 긴 길이의 핵산 분자를 신뢰할만하게 합성하는 것에 대한 새로운 접근법을 제공한다. 본원의 양태는, 200개 이상의 단량체성 단위 길이의 서열을 갖는 긴 폴리뉴클레오타이드(예컨대, DNA)의 합성을 제공하는, 인 및/또는 핵염기 보호기를 사용하는 방법 및 조성물이다.
단계적 커플링 수율을 증가시키는 것을 돕는 인 보호기 및/또는 산화 단계 도중에 제거될 수 있는 인 보호기가 제공된다. 폴리뉴클레오타이드 합성 동안 탈퓨린화되에 대한 증가된 내성, 예를 들어 암모니아 중 폴리뉴클레오타이드 분할 동안 감소된 핵염기 탈보호 시간, 및 적은 부산물(예컨대, 핵염기 부가물)과 함께 증가된 순도의 조질 올리고뉴클레오타이드를 제공하는 본 발명의 조성물 및 방법에서의 용도가 발견된 아미딘 핵염기 보호기가 제공된다. 몇몇 경우, 본원에 개시된 방법 및 조성물은, 200개 이상의 단량체성 단위 길이의 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드의 합성에 인과 핵염기 보호기의 조합을 이용할 수 있다.
본원의 양태는, 후속 산화 사이클 동안 발생하는 가수분해 반응(예컨대, 하기 반응식 참조)에 뉴클레오타이드간 결합이 덜 민감하도록 요오드 산화 동안 제거될 수 있는 새로운 인 보호기를 포함한다. 이러한 새로운 접근법은 큰 결실이 더 적은 올리고뉴클레오타이드를 유발한다.
또한, 뉴클레오타이드간 결합에 본원의 보호기를 사용하면, 포스포아미다이트의 증가된 커플링 효율의 이점을 제공한다. 고상 포스포아미다이트 DNA 합성에 가장 흔히 사용되는 인 보호기는 시아노에틸 보호기이다(문헌[Letsinger, et al. 1969 J. Am. Chem. Soc. 91(12), 3360-5]). 이러한 보호기는, 하기 반응식에 도시되는 바와 같이, 암모니아 또는 알킬 아민을 사용하여 합성이 끝날 무렵에 헤테로염기 보호기가 제거되는 동일한 조건 하에 베타-제거 반응을 통해 제거된다:
본원의 다른 양태는, 현행 시아노에틸 포스포아미다이트 화학의 실시에서 발생할 수 있는 포스포트라이에스터 뉴클레오타이드간 결합의 가수분해를 최소화하는 인 보호기의 설계이다. 대신, 요오드 산화 동안, 포스포트라이에스터 뉴클레오타이드간 중간체는 가수분해에 안정한 포스포다이에스터 뉴클레오타이드간 연결부로 전환된다(보호기의 분할에 의해). 인 보호기의 분할은, 예를 들어 50% 정도 불완전할 수 있지만, 뉴클레오타이드간 결합의 가수분해를 억제하는데 여전히 상당한 효과를 가질 수 있다. 상기 분할이 50% 초과인 것이 바람직하고, 상기 분할이 100%에 가까운 것이 더 바람직하다. 본원의 또다른 양태는, 요오드 산화 동안 50% 내지 100% 분할되고, 이어서 올리고뉴클레오타이드 합성이 끝날 무렵에, 예를 들어 티올레이트 시약 또는 이의 유도체를 사용하는 친핵성 공격에 의해 또는 염기, 염기성 아민 또는 이들의 조합을 사용하는 베타-제거 또는 알파 단편화에 의해 완전히 분할되는 보호기이다.
본원의 또다른 양태는, 요오드 산화 용액에 염기를 가하여 상기 산화 단계 동안 보호기의 분할을 촉진시키고 증가시키는 것이다. 상기 염기의 예는 t-부틸 아민, 다이이소프로필 아민, 다이에틸 아민, 트라이에틸 아민, 다이이소프로필에틸 아민, DBU 및 다른 비-친핵성 염기를 포함한다.
하나의 양태에서, 본원은 일반적으로 하기 화학식 I의 화합물에 관한 것이다:
상기 식에서,
B는 핵염기 또는 이의 유사체이고;
R1 및 R2는, 각각 독립적으로, 치환되거나 비치환된 선형, 분지형 또는 환형 알킬이거나, R1 및 R2가 함께, 5원, 6원, 7원 또는 8원 비-방향족 고리를 형성하고;
R3은 산-반응성 보호기이고;
R은, 벤질 알코올 유도체(o-메틸 벤질 제외), 알파-메틸 아릴 알코올 유도체, 나프탈렌 알코올 유도체, 이환형 지방족 알코올 유도체, 아실티오알킬 알코올 유도체, S-에틸티오에이트 유도체 및 아미노산 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 인 보호기이다.
몇몇 실시양태에서, B는 핵염기 또는 보호된 핵염기이고, 이때 상기 핵염기는 아데닌, 구아닌, 티민, 시토신 및 우라실, 및 이의 유도체 및 유사체로부터 선택된다.
임의의 편리한 보호기를 본 발명의 화합물에 이용할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, B는, 보호된 핵염기이다. 특정 실시양태에서, 상기 핵염기는 통상적인 퓨린 또는 피리미딘 염기, 예컨대, 아데닌(A), 티민(T), 시토신(C), 구아닌(G) 또는 우라실(U), 또는 이들의 보호된 형태일 수 있으며, 이때 상기 염기는, 아세틸, 다이플루오로아세틸, 트라이플루오로아세틸, 이소부티릴, 벤조일, 페녹시아세틸, 4-(t-부틸)페녹시아세틸 등과 같은 보호기로 보호된다. 특정 실시양태에서, 상기 핵염기는 아미딘 보호기(예컨대, 본원에 기술된 것)를 포함한다.
상기 퓨린 또는 피리미딘 염기는 또한 전술된 것들의 유사체일 수 있다. 적합한 유사체는, 비제한적으로, 1 -메틸아데닌, 2-메틸아데닌, N6-메틸아데닌, N6-이소펜틸아데닌, 2-메틸티오-N6-이소펜틸아데닌, N,N-다이메틸아데닌, 8-브로모아데닌, 2-티오시토신, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, 5-에틸시토신, 4-아세틸시토신, 1-메틸구아닌, 2-메틸구아닌, 7-메틸구아닌, 2,2-다이메틸구아닌, 8-브로모구아닌, 8-클로로구아닌, 8-아미노구아닌, 8-메틸구아닌, 8-티오구아닌, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요오도우라실, 5-에틸우라실, 5-프로필우라실, 5-메톡시우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 5-(카복시하이드록시메틸)우라실, 5-(메틸아미노메틸)우라실, 5-(카복시메틸아미노메틸)-우라실, 2-티오우라실, 5-메틸-2-티오우라실, 5-(2-브로모비닐)우라실, 우라실-5-옥시아세트산, 우라실-5-옥시아세트산 메틸 에스터, 슈도우라실, 1-메틸슈도우라실, 퀘우오신(queuosine), 이노신, 1-메틸이노신, 하이포잔틴, 잔틴, 2-아미노퓨린, 6-하이드록시아미노퓨린, 6-티오퓨린 및 2,6-다이아미노퓨린을 포함한다.
R1 및 R2는 동일하거나 상이할 수 있다. R1 및 R2는 둘 다 선형이거나, 둘다 분지형 또는 환형이거나, 혼합된 알킬 기일 수 있다. R1 및 R2는 둘 다 비치환된 알킬이거나, 이들 중 하나가 치환되거나, 이들 둘 다 치환될 수 있다.
몇몇 경우, R1 및 R2는 5원, 6원, 7원 또는 8원 고리 구조(하기 도시되는 고리 Q), 예를 들어, 비-방향족 고리의 성분이거나, 함께 이를 형성할 수 있다:
특정 실시양태에서, R1 및 R2는, 각각 독립적으로, 선형, 분지형 또는 환형, 치환되거나 비치환된 C1-C18 알킬이다. 특정 실시양태에서, R1 및 R2는, 각각 독립적으로, 비치환된 선형 또는 분지형 C1-C6 알킬이다. 특정 실시양태에서, R1 및 R2는, 각각 독립적으로, 선형 C1-C3 알킬(즉, 메틸, 에틸 및 프로필)이다. 특정 실시양태에서, R1 및 R2는, 각각 독립적으로, 분지형 C3-C6 알킬이다. 예를 들어, 하기 화학식 Ia의 화합물에서, R1 및 R2는 각각, 화학식 Ia에서 도시되는 바와 같이 이소프로필이거나, 이소부틸일 수 있다:
특정 실시양태에서, 고리 Q는 5원 또는 6원 비-방향족 고리이며, 이때 상기 고리는 골격 내에 0 또는 1개의 헤테로원자를 가진다. 특정 실시양태에서, 고리 Q는 골격 내에 0개의 헤테로원자를 갖는 5원 비-방향족 고리이다. 특정 실시양태에서, 고리 Q는, 치환되거나 비치환된 5원 비-방향족 사이클로알킬 고리이다.
하기 화학식 Ib는, Q가 5원 비-방향족 고리인 예시적 실시양태를 보여주며, 이때 R4는 임의의 적합한 기일 수 있으며, 예를 들어, 각각 독립적으로, 수소, 할로겐, C1-C6 알킬 및 C1-C6 알킬옥시로부터 선택된다:
특정 실시양태에서, R4는 수소이고(즉, 비치환된 고리 Q), 이러한 구조는 하기 화학식 Ic로서 도시된다:
몇몇 경우, R3은 산-반응성 보호기이다. 관심있는 R3 기의 예는, 비제한적으로, (4,4'-다이메톡시트리틸)(DMT), MMT(모노메톡시트리틸), 트라이메톡시 트리틸, 픽실(9-페닐잔틸) 및 피발로일을 포함한다(문헌[Fisher, et al. 1983 Nucleic Acids Res. 11, 1589-1599]).
몇몇 경우, R은, 벤질 알코올 유도체(o-메틸 벤질 제외), 알파-메틸 아릴 알코올 유도체, 나프탈렌 알코올 유도체, 이환형 지방족 알코올 유도체, 아실티오알킬 알코올 유도체 및 아미노산 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 기이다. 특정 경우, R은 S-(에틸)벤조티오에이트이다.
아실티오알킬 알코올 유도체는, 알킬 기에 연결된 아실화된 티올 기(예컨대, R-C(=O)S-알킬-, 이때 R은 하이드로카빌, 아릴 또는 헤테로아릴임)를 포함한다. 특정 경우, 아실티오알킬 알코올 유도체의 알킬 기는 에틸 기이다. 본원에서 용어 "S-에틸티오에이트" 및 "아실티오에틸"은 상호교환적으로 사용된다. 몇몇 실시양태에서, 아실티오알킬 알코올 유도체는 S-에틸티오에이트 유도체이다. 특정 경우, 아실티오알킬 알코올 유도체는 S-(에틸)벤조티오에이트이다. 특정 실시양태에서, 본원의 화합물은 하기 화학식 Id의 구조를 가진다:
상기 식에서, R7은, 각각 독립적으로, 수소, 할로겐, 하이드로카빌(예컨대, C1-C6 알킬, C2-C6 알켄일, C2-C6 알킨일) 및 알킬옥시로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 본원의 화합물은 하기 화학식 Ie의 구조를 가진다:
상기 식에서, R7은, 각각 독립적으로, 수소, 할로겐, 하이드로카빌(예컨대, C1-C6 알킬, C2-C6 알켄일, C2-C6 알킨일) 및 알킬옥시로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 본원의 화합물은 하기 화학식 If의 구조를 가진다:
상기 식에서, R8은 지방족 기이다.
특정 실시양태에서, R(상기 화학식 Ia 내지 Ic에서)은 하기 화학식 II의 구조를 갖는 벤질 알코올의 유도체(o-메틸 벤질 제외)이다:
상기 식에서, Ra는 수소 또는 알킬이고; R11은, 각각 독립적으로, 수소, 알킬, 알콕시, 알킬-S-, 시아노, 메틸시아노 또는 할로겐이고; n은 1, 2, 또는 3이다. Ra가 수소인 화학식 II의 몇몇 실시양태에서, R11은 오르쏘-위치에서 메틸이 아니다.
R이 선택될 수 있는 예시적 기는 벤질 알코올의 유도체, 예컨대 하기로부터 선택될 수 있다:
상기 식에서, R6은, 각각 독립적으로, 수소, 할로겐, 시아노, 메틸시아노, 및 하이드로카빌(예컨대, C1-C6 알킬, C2-C6 알켄일, C2-C6 알킨일)로부터 선택된다.
특히, R이 유도될 수 있는 예시적 기는 하기를 포함한다:
상기 식에서, R9는 수소, 할로겐, 시아노, 시아노에틸, C1-C6 알킬, C1-C6 알킬옥시, 나이트로 및 다른 전자-당김 기로부터 선택되고, R7은, 독립적으로 수소, 할로겐, 하이드로카빌(예컨대, C1-C6 알킬, C2-C6 알켄일, C2-C6 알킨일), 알킬옥시 및 전자-당김 기로부터 선택되는 하나 이상의 치환기이다.
몇몇 실시양태에서, R은 하기 구조로 기술된다:
상기 식에서, R7은, 각각 독립적으로, 수소, 할로겐, 하이드로카빌(예컨대, C1-C6 알킬, C2-C6 알켄일, C2-C6 알킨일), 알킬옥시 및 전자-당김 기로부터 선택되는 하나 이상의 치환기이다.
특정 실시양태에서, R은 하기 구조로 기술된다:
상기 식에서, R9는 수소, 할로겐, 시아노, 시아노에틸, C1-C6 알킬, C1-C6 알킬옥시, 나이트로 및 전자-당김 기로부터 선택된다.
R이 유도될 수 있는 예시적 기는 또한, 하기 화학식 III의 구조를 갖는 알파-메틸 아릴 알코올 유도체를 포함한다:
상기 식에서, X는 수소, 할로겐, 시아노 또는 트라이플루오로메틸이고; Y는 수소, 알킬, 할로알킬 또는 알콕시알킬이고; Ra는 수소 또는 알킬이다.
화학식 III의 몇몇 실시양태에서, X 및 Y가 동시에 수소는 아니며, Ra 및 X가 둘 다 수소인 경우, Y는 메틸이 아니다. 예시적인 R 기는 하기를 포함한다:
상기 식에서, R9는 할로겐, 시아노, 또는 트라이플루오로메틸이고; R10은 수소, 할로겐, C1-C6 알킬, C1-C6 알킬옥시, 나이트로 및 다른 전자-당김 기로부터 선택된다.
R은 또한, 하기 화학식 IV의 구조를 갖는 나프탈렌 알코올 유도체로부터 유도될 수 있다:
상기 식에서, R7은, 각각 독립적으로, 수소, 할로겐, 시아노, 메틸시아노, 하이드로카빌(예컨대, C1-C6 알킬, C2-C6 알켄일, C2-C6 알킨일) 및 알킬옥시로부터 선택되는 하나 이상의 기이고; R5는 수소 및 하이드로카빌(예컨대, C1-C6 알킬, C2-C6 알켄일, C2-C6 알킨일)로부터 선택되고; R12는, 각각 독립적으로, 수소 및 알콕시로부터 선택되는 하나 이상의 기이다.
특정 경우, R7은 단일 기이고, R12는 단일 기이다.
R이 유도될 수 있는 예시적 기는 또한 하기를 포함한다:
상기 식에서, R7은, 각각 독립적으로, 수소, 할로겐, 시아노, 메틸시아노, C1-C6 알킬 및 C1-C6 알킬옥시로부터 선택되고; R5는 독립적으로 수소 및 하이드로카빌(예컨대, C1-C6 알킬, C2-C6 알켄일, C2-C6 알킨일)로부터 선택되고; R13은 C1-C6 알킬이다.
R은 또한, 하기 화학식 V 또는 VI의 구조를 갖는 이환형 지방족 알코올 유도체로부터 선택될 수 있다:
상기 식에서,
R14는 수소, 할로겐, C1-C6 알킬 및 C1-C6 알킬옥시로부터 선택되고; R15 및 R16은, 각각 독립적으로, 수소, 시아노, 시아노메틸, 알콕시 또는 할로겐이고, m은 1 또는 2이다.
R이 유도될 수 있는 예시적 기는 또한 하기를 포함한다:
상기 식에서, R14는 수소, 할로겐, C1-C6 알킬 및 C1-C6 알킬옥시로부터 선택되고; R15는 수소, 할로겐 또는 C1-C6 알콕시이고; R16은 수소, 시아노 또는 할로겐이다.
추가적으로, R이 선택될 수 있는 예시적 기는 하기를 포함한다:
상기 식에서, R7은 각각 수소, 할로겐, 시아노, 메틸시아노, C1-C6 알킬 및 C1-C6 알킬옥시로부터 선택되고; R8은 지방족 기이다.
몇몇 실시양태에서, R은, 하기 구조를 갖는 S-(2-하이드록실에틸)벤조티오에이트-알코올로부터 유도된다:
상기 식에서, R7은 수소, 할로겐, 시아노, 메틸시아노, C1-C6 알킬 또는 C1-C6 알킬옥시이다.
몇몇 실시양태에서, R은, 하기 구조를 갖는 S-(2-하이드록실에틸)알킬티오에이트-알코올로부터 유도된다:
상기 식에서, R8은 지방족 기이다.
추가적으로, R이 선택될 수 있는 예시적 기는 하기를 포함한다:
방법
본원의 양태는, 본 발명의 화합물을 사용하여 폴리뉴클레오타이드를 합성하는 방법을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은, (a) 비보호된 하이드록실 기를 갖는 뉴클레오사이드 잔부를 제공하는 단계; 및 (b) 상기 뉴클레오사이드 잔부를 뉴클레오사이드 단량체(예컨대, 본원에 기술된 것)와 접촉시켜, 상기 뉴클레오사이드 단량체를 상기 뉴클레오사이드 잔부에 공유 결합시키고, 폴리뉴클레오타이드를 생성하는 단계를 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 추가로, 상기 폴리뉴클레오타이드를 산화제에 노출시키는 단계를 포함한다. 임의의 편리한 산화제를 사용할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 추가로, 상기 핵산을 예를 들어 탈보호제에 노출시켜, 말단 보호기(예컨대, 본원에 기술된 바와 같은 3' 또는 5'-산-반응성(acid labile) 보호기)를 탈보호시켜, 추가의 커플링 반응을 수행할 수 있는 자유 하이드록실 말단을 생성하는 단계를 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 추가로, 상기 접촉 단계를 적어도 1회 반복하는 것을 포함한다. 상기 방법의 단계들은, 목적하는 길이의 폴리뉴클레오타이드가 수득될 때까지 반복될 수 있다. 몇몇 경우, 폴리뉴클레오타이드 합성의 사이클은, 목적하는 길이 및 서열의 폴리뉴클레오타이드(예컨대, DNA)가 수득될 때까지, 200회 이상, 예컨대 250회 이상, 300회 이상, 400회 이상, 500회 이상, 600회 이상, 700회 이상, 800회 이상, 900회 이상, 1000회 이상, 또는 심지어 그 이상 반복된다.
상기 방법의 몇몇 실시양태에서, 상기 뉴클레오사이드 잔부는 고형 지지체에 공유 결합된다. 임의의 편리한 지지체가 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 관심있는 지지체는, 비제한적으로, 편평한 표면, 예컨대 어레이, 비드 등을 포함한다. 적합한 고형 지지체는 몇몇 경우 중합체성이며, 다양한 형태 및 조성을 가질 수 있으며, 천연 물질, 합성적으로 개질된 천연 물질 또는 합성 물질로부터 유도될 수 있다. 적합한 지지체의 예는, 비제한적으로, 다당류 예컨대 아가로스(예컨대, 파마시아(Pharmacia)로부터 세파로스(Sepharose, 등록상표)로서 시판되는 것) 및 덱스트란(예컨대, 역시 파마시아로부터 상표명 세파덱스(Sephadex, 등록상표) 및 세파크릴(Sephacryl, 등록상표) 하에 시판되는 것), 폴리아크릴아마이드, 폴리스타이렌, 폴리비닐 알코올, 하이드록시에틸 메타크릴레이트와 메틸 메타크릴레이트의 공중합체, 실리카, 테플론, 유리 등을 포함한다. 기재 표면 상에서 합성될 상기 폴리뉴클레오타이드의 초기 단량체는, 몇몇 경우, 표면 친수성 기에, 예컨대, 실리카 기재 상에 존재하는 표면 하이드록실 잔기에 다시 결합되는 연결 잔기에 결합된다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 상기 방법은 추가로, 상기 고형 지지체로부터 상기 핵산을 분할하여, 자유 폴리뉴클레오타이드(예컨대, 자유 핵산)를 수득하는 단계를 포함한다.
임의의 편리한 폴리뉴클레오타이드 합성 방법, 전략 및 화학을 개조하여, 본 발명의 조성물 및 방법에 사용할 수 있다. 개조하여 본 발명의 방법에 사용할 수 있는 관심있는 폴리뉴클레오타이드 합성 화학 및 방법은, 비제한적으로, 포스포아미다이트, H-포스포네이트, 포스포다이에스터, 포스포트라이에스터, 및 포스파이트 트라이에스터를 포함하며, 이러한 방법 및 물질은 문헌[S. L. Beaucage et al. (1981) Tetrahedron Lett. 22:1859]; 델린저(Dellinger) 등의 미국 특허 제 6,222,030 호; 델린저 등의 미국 특허 출원 공개 제 US2002/0058802 A1 호; 및 문헌[Seio et al. (2001) Tetrahedron Lett. 42 (49):8657-8660]에 기술되어 있다.
특정 실시양태에서, 하기 구조를 갖는, 지지체-결합된 뉴클레오사이드 잔부가 제공된다:
상기 식에서,
R은, 수소, 보호된 하이드록실 기, 플루오로, 알콕시, O-에틸렌옥시알킬(O-CH2CH2OR), 보호된 아미노, 보호된 아미도, 또는 보호된 알킬아미노이고, 여기서 R이 수소인 경우, 지지체-결합된 뉴클레오사이드는, DNA 합성에서 존재하는 데옥시리보뉴클레오사이드이고, R이, 보호된 하이드록실 기인 경우, 지지체-결합된 뉴클레오사이드는, RNA 합성에서 존재하는 리보뉴클레오사이드이고;
B는 핵염기 또는 보호된 핵염기, 예컨대 퓨린 또는 피리미딘 염기이다.
특정 실시양태에서, 상기 핵염기는 통상적인 퓨린 또는 피리미딘 염기, 예컨대, 아데닌(A), 티민(T), 시토신(C), 구아닌(G) 또는 우라실(U), 또는 이들의 보호된 형태일 수 있으며, 상기 염기는, 아세틸, 다이플루오로아세틸, 트라이플루오로아세틸, 이소부티릴, 벤조일 등과 같은 보호기로 보호된다. 퓨린 또는 피리미딘 염기는 또한 전술된 것들의 유사체일 수 있다. 적합한 유사체는, 비제한적으로, 1-메틸아데닌, 2-메틸아데닌, N6-메틸아데닌, N6-이소펜틸아데닌, 2-메틸티오-N6-이소펜틸아데닌, N,N-다이메틸아데닌, 8-브로모아데닌, 2-티오시토신, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, 5-에틸시토신, 4-아세틸시토신, 1-메틸구아닌, 2-메틸구아닌, 7-메틸구아닌, 2,2-다이메틸구아닌, 8-브로모구아닌, 8-클로로구아닌, 8-아미노구아닌, 8-메틸구아닌, 8-티오구아닌, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요오도우라실, 5-에틸우라실, 5-프로필우라실, 5-메톡시우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 5-(카복시하이드록시메틸)우라실, 5-(메틸아미노메틸)우라실, 5-(카복시메틸아미노메틸)-우라실, 2-티오우라실, 5-메틸-2-티오우라실, 5-(2-브로모비닐)우라실, 우라실-5-옥시아세트산, 우라실-5-옥시아세트산 메틸 에스터, 슈도우라실, 1-메틸슈도우라실, 퀘우오신, 이노신, 1-메틸이노신, 하이포잔틴, 잔틴, 2-아미노퓨린, 6-하이드록시아미노퓨린, 6-티오퓨린 및 2,6-다이아미노퓨린을 포함한다.
또다른 양태에서, 본원은, 본원에 개시된 하나 이상의 화합물을 사용하여 DNA를 합성하는 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, 상기 합성된 핵산(예컨대, DNA)은 약 150개 이상의 뉴클레오타이드, 예컨대 약 155개 이상의 뉴클레오타이드, 약 160개 이상의 뉴클레오타이드, 약 165개 이상의 뉴클레오타이드, 약 170개 이상의 뉴클레오타이드, 약 175개 이상의 뉴클레오타이드, 약 180개 이상의 뉴클레오타이드, 약 185개 이상의 뉴클레오타이드, 약 190개 이상의 뉴클레오타이드, 약 195개 이상의 뉴클레오타이드, 약 200개 이상의 뉴클레오타이드, 약 205개 이상의 뉴클레오타이드, 약 210개 이상의 뉴클레오타이드, 약 215개 이상의 뉴클레오타이드, 약 220개 이상의 뉴클레오타이드, 약 225개 이상의 뉴클레오타이드, 약 230개 이상의 뉴클레오타이드, 약 240개 이상의 뉴클레오타이드, 약 250개 이상의 뉴클레오타이드, 약 255개 이상의 뉴클레오타이드, 약 260개 이상의 뉴클레오타이드, 약 270개 이상의 뉴클레오타이드, 약 280개 이상의 뉴클레오타이드, 약 300개 이상의 뉴클레오타이드의 서열을 가진다. 몇몇 경우, 전술된 임의의 실시양태에서, 상기 합성된 핵산(예컨대, DNA)은 약 500개 이하의 뉴클레오타이드, 예컨대 약 400개 이하의 뉴클레오타이드, 또는 약 300개 이하의 뉴클레오타이드를 갖는 서열을 가진다. 특정 실시양태에서, 상기 합성된 DNA는 약 200개 이상의 뉴클레오타이드의 서열을 가진다. 특정 실시양태에서, 상기 합성된 DNA는 약 150개 내지 약 500개의 뉴클레오타이드, 예컨대 약 150개 내지 약 400개의 뉴클레오타이드, 약 150개 내지 약 300개의 뉴클레오타이드, 또는 약 200개 내지 약 300개의 뉴클레오타이드의 서열을 가진다.
특정 실시양태에서, 상기 합성된 DNA는 약 200량체 내지 약 1,000량체(예컨대, 특히 약 200량체 내지 약 800량체, 약 200량체 내지 약 500량체, 약 300량체 내지 약 800량체, 약 300량체 내지 약 500량체 포함)의 길이이다. 특정 실시양태에서, 상기 합성된 DNA는 100개의 뉴클레오타이드 당 2개 이하의 단일 뉴클레오타이드 결실을 가진다. 특정 실시양태에서, 상기 합성된 DNA는 100개의 뉴클레오타이드 당 1개 이하의 단일 뉴클레오타이드 결실을 가진다.
몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 추가로, 제 1 자유 핵산을 제 2 자유 핵산과 커플링시켜, 특히 약 300개 내지 약 10,000개의 뉴클레오타이드를 포함하는 길이를 갖는 연장된 자유 핵산을 수득하는 단계를 포함한다. 본원에서 용어 "연장된 자유 핵산"은, 본 발명의 선형 단계적 합성 방법을 이용하여 합성된 핵산 단편의 단편 축합에 의해 제조되는 자유 핵산을 지칭한다. 임의의 편리한 핵산 단편 커플링 방법을 이용하여, 본 발명의 선형 단계적 합성 방법에 의해 제조된 관심있는 핵산 단편으로부터 더 큰 연장된 핵산 분자를 조립할 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 추가로, 하나 이상의 추가의 자유 핵산을 상기 연장된 자유 핵산에 커플링(예컨대, 단편 축합)하여, 유전자를 생성하는 단계를 포함한다.
본원의 양태는 또한, 본 발명의 방법의 핵산 생성물을 포함한다. 본 발명의 방법의 핵산 생성물, 예컨대, RNA, DNA는, 특정 실시양태에서 200개 이상, 예컨대 250개 이상, 300개 이상, 350개 이상, 400개 이상, 450개 이상, 500개 이상, 또는 그 이상의 단량체성 단위 길이 범위로 크기가 변할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 상기 핵산 생성물은 200 내지 1000개의 단량체성 단위 길이, 예컨대, 특히, 200 내지 500개의 단량체성 단위 길이, 예컨대 200 내지 400개 또는 300 내지 500개의 단량체성 단위 길이이다. 특정 실시양태에서, 상기 핵산 생성물은 100개의 뉴클레오타이드 당 1개 이하(예컨대, 150개 뉴클레오타이드에서 1개)의 단일 뉴클레오타이드 결실을 가지며, 다중 뉴클레오타이드 결실은 갖지 않는다.
전술된 바와 같이, 본원의 합성 방법은, 화학적 개체가 결합될 수 있는 표면을 갖는 고형 지지체 상에서 수행될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 합성되는 복수개의 올리고뉴클레오타이드가, 동일한 고형 지지체에 직접적으로 또는 간접적으로 부착되어, 어레이의 부분을 형성할 수 있다. "어레이"는, 각각의 서열의 위치가 공지되도록, 공간적으로 정의되고 물리적으로 어드레싱가능하게 각각 배열된 공지된 단량체성 서열의 개별적 분자들의 집합이다. 어레이 상에 포함될 수 있는 분자 또는 "특징부"의 개수는 대개, 기재의 표면적, 특징부의 크기 및 특징부들 간의 간격으로 결정될 것이며, 이때 어레이 표면은, 비-특징부 영역으로 나타내어지는 국부 배경 영역을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 어레이는 수십만 이상까지의 특징부/cm2, 예컨대 2,500 내지 200,000개의 특징부/cm2의 밀도를 가질 수 있다. 상기 특징부는 기재에 공유 결합되거나 공유 결합되지 않을 수 있다. 상호교환적으로 사용되는 "어레이" 또는 "화학적 어레이"는, 특정 화학적 잔기(들)(예를 들어, 리간드, 예를 들면 생고분자(biopolymer), 예컨대 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 서열(핵산), 폴리펩타이드(예컨대, 단백질), 탄수화물, 지질 등)를 갖는 어드레싱가능한 영역들의 임의의 1차원, 2차원 또는 실질적으로 2차원(뿐만 아니라 3차원) 배열을 포함한다. 어레이는, 어레이 상의 특정한 사전결정된 위치(즉, "어드레스")에서의 영역(즉, 어레이의 "특징부" 또는 "스팟")이 특정 표적 또는 표적의 부류를 감지하도록(그러나, 특징부는 상기 특징부의 비-표적을 부수적으로 감지할 수 있음), 상이한 잔기들(예컨대, 상이한 폴리뉴클레오타이드 서열)의 복수개의 영역을 포함하는 경우 "어드레싱가능하다". 어레이 특징부는 전형적으로 개재 공간에 의해 분리되지만, 그렇지 않아도 된다. 어레이의 경우에서, "표적"은, 다양한 영역에서 기재에 결합되는 프로브("표적 프로브")에 의해 검출되는, 이동 상(전형적으로, 유체) 중의 잔기로서 언급될 것이다. 그러나, "표적" 또는 "프로브" 중 하나는, 나머지 하나에 의해 평가되는 것일 수 있다(따라서, 이들 중 하나는, 나머지 하나와 결합함으로서 평가되는 분석물(예컨대, 폴리뉴클레오타이드)의 미공지 혼합물일 수 있음).
몇몇 실시양태에서, 어레이는 마이크로유체 장치의 부분이며, 2차원 또는 3차원이다. 상기 어레이를 포함하는 고형 지지체는 실질적으로 편평하거나, 복수개의 마이크로구조, 예컨대 웰, 채널 및 마이크로채널, 상승식 칼럼 또는 포스트를 포함할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 합성되는 올리고뉴클레오타이드는 비드에 직접적으로 또는 간접적으로 부착된다. 비드는 임의적으로, 웰 또는 채널의 어레이 내에 놓일 수 있다. 적합한 고형 지지체는 다양한 형태 및 조성을 가질 수 있으며, 천연 물질, 합성적으로 개질된 천연 물질 또는 합성 물질로부터 유도될 수 있다.
적합한 지지체 물질의 예는, 비제한적으로, 실리카, 규소 및 규소 옥사이드(반도체 제작에 사용되는 임의의 물질 포함), 테플론, 유리, 다당류 예컨대 아가로스(예컨대, 파마시아로부터의 세파로스(등록상표)) 및 덱스트란(예컨대, 파마시아로부터의 세파덱스(등록상표) 및 세파크릴(등록상표)), 폴리아크릴아마이드, 폴리스타이렌, 폴리비닐 알코올, 하이드록시에틸 메타크릴레이트와 메틸 메타크릴레이트의 공중합체 등을 포함한다. 기재 표면 상에 합성될 올리고뉴클레오타이드의 초기 단량체는 전형적으로 연결 잔기에 결합되며, 이는 다시, 실리카 기재 상에 존재하는 표면 친수성 기, 예컨대 표면 하이드록실 잔기에 결합된다. 몇몇 실시양태에서, 유니버셜(universal) 링커가 사용된다. 몇몇 다른 실시양태에서, 상기 초기 단량체는, 예를 들어 표면 하이드록실 잔기와 직접 반응한다. 다르게는, 올리고뉴클레오타이드는 먼저 본원에 따라 합성되고, 당분야에 공지된 임의의 방법에 의해 합성후 고형 기재에 부착된다. 따라서, 본 개시내용을 사용하여 올리고뉴클레오타이드의 어레이를 제조할 수 있으며, 이때 올리고뉴클레오타이드는 어레이 상에 합성되거나, 합성후 어레이 기재에 부착된다.
본 발명의 효율성 및 용이성으로 인해, 올리고뉴클레오타이드 합성을 소규모로 또는 대규모로 수행할 수 있다. 따라서, (하나의 용기 내에서) 본 발명의 방법의 1회의 완전한 수행으로 제조된 올리고뉴클레오타이드의 양은 1 마이크로그램 미만, 또는 수 마이크로그램, 수십 마이크로그램, 수백 마이크로그램, 또는 심지어 수 킬로그램일 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 본원의 방법 및 조성물에 의해 핵산의 어레이가 합성된다. 몇몇 실시양태에서, 상기 핵산은 어레이-기반 용도(예컨대 예를 들어 유전자 발현, 세포 유전학, 유전형 분석, 전사체(transcript) 또는 엑손 프로파일링 등)에서의 이의 용도를 위해 상기 어레이에 대한 부착을 유지한다. 다른 실시양태에서, 상기 핵산은 고형 지지체로부터 모두(또는, 때때로 단지 부분 집합으로) 방출되어, 핵산의 라이브러리(들) 또는 풀(pool)(이는, 고형 지지체로부터의 분할 이전 또는 이후에 임의적으로 증폭될 수 있음)을 생성한다. 핵산의 풀 또는 라이브러리는, 예를 들어 선택적 표적 풍부화를 위한 미끼(baits)로서 사용되거나, 동일반응계 내 하이브리드와 분석(예컨대 o-피쉬(FISH)) 또는 다른 하이브리드화 분석, 다중화 부위-지향성 돌연변이유발, 다중화 게놈 공학 및 가속화된 진화(MAGE); siRNA, shRNA, miRNA를 코딩하는 라이브러리를 사용한 유전자 녹아웃(knockout); CRISPR RNAs 및/또는 Cas 단백질을 코딩하는 핵산의 라이브러리를 사용한 게놈 공학을 위한 프로브로서 사용되거나, 유전자 또는 유전자 단편을 코딩하는 핵산은 또한 더 긴 DNA 단편, 유전자 및/또는 게놈으로 조립되고 결찰될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 조립된 핵산은, 약 300개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,000개의 뉴클레오타이드 길이를 갖는 DNA이다. 다른 실시양태에서, 조립된 핵산의 길이는, 특정 실시양태에서 300개 이상, 예컨대 400개 이상, 1,000개 이상, 2,000개 이상, 3,000개 이상, 4,000개 이상, 5,000개 이상, 6,000개 이상, 8,000개 이상, 10,000개 이상, 또는 심지어 그 이상의 뉴클레오타이드 길이 범위로 크기가 다를 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물 및 방법을 사용하여 제조된 핵산의 라이브러리가 제공된다. 상기 라이브러리의 몇몇 실시양태에서, 상기 라이브러리는 복수개의 핵산을 포함하며, 이때 각각의 핵산은 본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 방법에 의해 합성된다. 또한, 약 300개 내지 약 10,000개의 뉴클레오타이드 길이를 갖는 복수개의 핵산을 포함하는 라이브러리가 제공되며, 이때 각각의 핵산은 본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 방법에 의해 합성된 조립된 핵산 단편으로 구성된다. 상기 핵산은 자유 핵산일 수 있다. 복수개의 핵산들은, 관심있는 유전자를 함께 정의하는 서열을 가질 수 있다. 상기 라이브러리의 복수개의 핵산은, 예를 들어 단편 커플링의 임의의 편리한 방법을 사용하여 유전자로 조립될 수 있다.
상기 핵산 생성물은 다양한 용도, 예컨대 연구, 진단 및 치료 용도가 발견되었다. 예를 들어, 상기 핵산 생성물은, 예를 들면 유전체학, 세포 전학, 표적 풍부화 및 서열분석, 부위-지향성 돌연변이유발, 합성 생물학, 유전자 합성, 예를 들어, 프로브, 프라이머, 유전자 단편, DNA/RNA 어레이, 핵산의 라이브러리로서의 유전자 조립체로서의 용도가 발견되었다. 진단 용도, 예컨대 유전체학, 세포 유전학, 종양학, 감염성 질환, 비-외과적 태아기 검사(NIPT), 표적 풍부화 및 서열분석와 관련하여, 상기 핵산 생성물은 또한 프로브(예를 들어, 올리고피쉬(oligoFISH)), 프라이머, 유전자 단편, 전사체, DNA/RNA 어레이, 핵산의 라이브러리, 전사체 또는 진단 프로토콜에 사용되는 다른 시약의 라이브러리로서의 용도가 발견될 수 있다. 치료 용도와 관련하여, 상기 핵산 생성물은 유전자 치료 용도에서의 임의의 DNA, RNA 또는 다른 핵산 치료제(예컨대, 안티센스 핵산), 유전자 편집, 개재 RNA(즉, iRNA 또는 RNAi) 용도 등에서의 용도가 발견되었다.
실시예
하기 실시예는 본원에 기술된 화합물(22 내지 54)의 일반적 합성 전략을 예시하는 것이다.
다양한 5'-O-
다이메톡시트리틸
-2'-
데옥시리보티미딘
3'-O-
아릴포스포아미다이트의
합성
자석 교반 막대 및 격막을 장착한 화염-건조된 250-mL 슐렌크(Schlenk) 플라스크 내에서 아르곤 하에, 비스(N,N-다이이소프로필아미노) 클로로포스핀(켐 진스(Chem Genes), 0.019 mol, 5.20 g)을 무수 다이클로로메탄(20 mL)에 용해시켰다. 이 용액에, 5'-O-다이메톡시트리틸-2'-데옥시리보티미딘(켐 진스 , 0.019 mol, 1.0 당량)을 가했다. 2'-데옥시리보뉴클레오사이드가 완전히 용해되었을 때, N,N-다이이소프로필에틸아민(시그마 알드리치(Sigma Aldrich), 0.057 mol, 3.0 당량)을 가하고, 이 혼합물을 아르곤 하에 실온에서 30분 동안 교반하였다. 30분 후 31P NMR 스펙트럼은, 출발 물질에서 생성물로의 완전한 전환을 나타냈다. 진공 중에서 용매를 제거한 후, 조 생성물을, 헥산 중의 50 내지 90% 에틸 아세테이트 구배(1% 트라이에틸아민 함유)를 사용하여 크로마토그래피로 단리하였다. 31P NMR (CDCl3): δ 115.9 (s).
100 mL 환저 플라스크 내에서 5'-O-다이메톡시트리틸-2'-데옥시리보티미딘 3'-O-포스포로디아미다이트(2.58 mmol, 2 g) 및 상기 아릴 알코올(1.0 당량)을 무수 다이클로로메탄(15 mL)에 가하고, 아르곤 하에 실온에서 교반하였다. 이 혼합물에 1H-에틸티오테트라졸(무수 아세토나이트릴 중의 0.25 M, 글렌 리서치(Glen Research)(미국 버지니아주), 1.0 당량)을 시린지를 통해 15분의 기간에 걸쳐 가하고, TLC가 출발 물질로부터 더 높은 유동점(running spot)으로의 완전한 전환을 나타낼 때까지, 이 혼합물을 질소 하에 실온에서 교반하였다. 용매를 진공 중에서 제거하고, 조 생성물을, 헥산 중의 50 내지 90% 에틸 아세테이트 구배(1% 트라이에틸아민 함유)를 사용하여 크로마토그래피로 단리하였다.
다양한 5'-O-
다이메톡시트리틸
-2'-
데옥시리보티미딘
3'-O-S-(에틸)
벤조티오에이트
-
피롤리딘일포스포아미다이트의
합성
100 mL 환저 플라스크 내에서 트리스(1-피롤리딘일)포스핀(0.016 mol, 4 g)을 무수 다이클로로메탄(20 mL)에 용해시키고, 아르곤 하에 실온에서 교반하였다. 이 용액에, 5'-O-다이메톡시트리틸-2'-데옥시리보티미딘(켐 진스 , 0.016 mol, 1.0 당량)을 가했다. 마지막에, 이 혼합물에 1H-에틸티오테트라졸(무수 아세토나이트릴 중의 0.25 M, 글렌 리서치(미국, 버지니아주), 1.0 당량)을 시린지를 통해 15분의 기간에 걸쳐 적가하고, 이 혼합물을 질소 하에 실온에서 30분 동안 교반하였을 때, 31P NMR 스펙트럼은 출발 물질에서 생성물로의 완전한 전환을 나타냈다. 용매를 진공 중에서 제거하고, 조 생성물을, 다이클로로메탄 중의 30 내지 60% 에틸 아세테이트 구배(1% 트라이에틸아민 함유)를 사용하여 크로마토그래피로 단리하였다 . 31P NMR (CDCl3): δ 135.2 (s).
100 mL 환저 플라스크 내에서 5'-O-다이메톡시트리틸-2'-데옥시리보티미딘 3'-O- 비스(1-피롤리딘일)포스포로디아미다이트(2.80 mmol, 2 g) 및 상기 티오에스터(1.0 당량)를 무수 다이클로로메탄(15 mL)에 용해시키고, 아르곤 하에 실온에서 교반하였다. 이 혼합물에 1H-에틸티오테트라졸(무수 아세토나이트릴 중의 0.25 M, 글렌 리서치(미국, 버지니아주), 1.0 당량)를 시린지를 통해 15분의 기간에 걸쳐 적가하고, TLC가 출발 물질로부터 더 높은 유동점으로의 완전한 전환을 나타낼 때까지, 이 혼합물을 질소 하에 실온에서 교반하였다. 용매를 진공 중에서 제거하고, 조 생성물을, 다이클로로메탄 중의 30 내지 60% 에틸 아세테이트 구배(1% 트라이에틸아민 함유)를 사용하여 크로마토그래피로 단리하였다. 31P NMR (CDCl3): δ 144.1, 144.3 (d)
고상
올리고뉴클레오타이드
합성에 대한 일반 절차
합성은, ABI 모델 394 자동화 DNA 합성기 상에서 표준 DNA 사이클에 따라, 글렌 리서치로부터의 dT-CPG 칼럼(20량체의 경우 500 옹스트롬, 및 60량체의 경우 1000 옹스트롬)을 사용하여, 0.2 마이크로몰(60량체) 및 1.0 마이크로몰(20량체) 크기로 수행하였다. 합성 프로토콜은 통상적인 DMT 포스포아미다이트 방법에 기초하였다. 보호된 데옥시리보티미딘 3'-O-아릴포스포아미다이트를 모두 100 mM의 농도로 무수 아세토나이트릴에 용해시키고, 합성기의 적절한 포트 상에 놓았다. 합성 이전에, 지지체-결합된 2'-데옥시리보뉴클레오사이드 상의 5'-DMT 기를 다이클로로메탄 중의 3% 다이클로로아세트산으로 제거하였다. 활성제는 5-에틸티오-1H-테트라졸(무수 아세토나이트릴 중의 0.25 M, 글렌 리서치(미국, 버지니아주))이었다. 각각의 농축 단계 이후에, 지지체를 아세토나이트릴로 40초 동안 세척하고, 유니캡(Unicap) 포스포아미다이트(글렌 리서치(미국, 버지니아주))를, 캡핑 불량 서열에 대한 제조사의 권고사항에 따라 사용하였다. 표준 산화 시약(THF/물/피리딘 중의 0.02 M 요오드)을 산화에 사용하였다. 합성후 올리고머를 암모니아(마크론(Macron), 10 내지 35% 암모니아를 갖는 용액)를 사용한 처리에 의해 고형 지지체로부터 분할하였다. 몇몇 경우, 분할 이전에, 여전히 CPG에 결합된 상기 올리고뉴클레오타이드를 DMF(1mL) 중의 2-카바모일-2-시아노에틸렌-1,1-다이티올레이트의 1 M 용액으로 4 내지 8시간 동안 처리하였다. 이어서, 레진을 DMF 및 이어서 MeOH로 세척하고, 아르곤 하에 건조하고, 최종적으로 암모니아로 분할하였다. 이 분할 혼합물을 버리고, 스피드백(SpeedVac) 내에서 고형 지지체를 증발 건조시켰다. 상기 지지체 상에 흡착된 ODN 생성물을 물에 용해시키고, LC-MS로 분석하였다.
조질
올리고뉴클레오타이드의
LC
-
MS
분석
20량체 및 60량체의 분석을, 애질런트(Agilent) 6530 애큐리트-매스(Accurate-Mass) Q-TOF LC/MS 상에서 네거티브 방식으로 수행하였다. 데이터를, 애질런트 매스 헌터(Agilent Mass Hunter) 정성 분석 B 04.00 소프트웨어를 사용하여 처리하였다.
2개의 상이한 역상 칼럼을 사용하였다: 20량체 분석의 경우 액큐어티(ACQUITY) UPLC BEH C18, 1.7 μm, 2.1 X 100nm 칼럼, 및 60량체 분석의 경우 액큐어티 UPLC PrST C4, 1.7 μm, 2.1 mm X 150 mm 칼럼. 1개 초과의 용리액 시스템 및 몇가지 구배를 사용하였다:
용리액
시스템 1
완충액 A: 200mmHFIP, 8mMTEA, 물 중의 5% 메탄올,
완충액 B: 물 중의 90%메탄올.
용리액
시스템
2
완충액 A: 5mM 다이부틸암모늄 아세테이트, 물 중의 5% 유기 성분,
완충액 B: 5mM 다이부틸암모늄 아세테이트, 유기 성분 중의 10% 물,
유기 성분: 아세토나이트릴: 2-이소프로판올(1:1).
| 구배 1 | ||
| 시간(분) | 완충액 B(%) | 유동(mL/분) |
| 0.0 | 5.0 | 0.2 |
| 3.0 | 5.0 | 0.2 |
| 30.0 | 50.0 | 0.2 |
| 45.0 | 80.0 | 0.2 |
| 47.0 | 5.0 | 0.2 |
| 70.0 | 5.0 | 0.2 |
| 구배 2 | ||
| 시간(분) | 완충액 B(%) | 유동(mL/분) |
| 0.0 | 15.0 | 0.2 |
| 15.0 | 25.0 | 0.2 |
| 30.0 | 45.0 | 0.2 |
| 35.0 | 60.0 | 0.2 |
| 40.0 | 15.0 | 0.2 |
| 45.0 | 15.0 | 0.2 |
| 구배 3 | ||
| 시간(분) | 완충액 B(%) | 유동(mL/분) |
| 0.0 | 5.0 | 0.2 |
| 30.0 | 25.0 | 0.2 |
| 35.0 | 60.0 | 0.2 |
| 40.0 | 10.0 | 0.2 |
| 45.0 | 5.0 | 0.2 |
| 50.0 | 5.0 | 0.2 |
모든 시료를 네거티브 모드로 작동시켰으며, 하기는 사용된 모든 질량 매개변수의 목록이다.
| 공급원 매개변수 | |||||
| AJS ESI (seg) | AJS Exp | MS TOF (Exp) | |||
| 기체 온도 | 325 oC | V 캡 | 3800 V | 단편화기 | 175 V |
| 건조 기체 | 9 l/분 | 노즐 전압 (exp) | 100 V | 스키머 | 65 V |
| 분무기 | 20 psig | 팔중극 RF Vpp | 750 V | ||
| 시트 기체 온도 | 250 oC | ||||
| 시트 기체 유동 | 11 l/분 | ||||
모든 시료를 매스헌터(MassHunter) 정성 분석 소프트웨어로 처리하여, 총 이온 크로마토그램(TIC), DAD 크로마토그램 및 추출된 이온 크로마토그램(EIC)으로서 다양한 신호 유형으로부터 크로마토그램을 추출하였다.
하기 실시예는, 본원에 기술된 포스포아미다이트(22 내지 31)를 사용한 20량체 및 60량체 분석을 예시하는 것이다. 특히, 각각의 올리고뉴클레오타이드를 TIC, DAD 및 EIC 크로마토그램으로 분석하였다.
5'-O-
다이메톡시트리틸
-2'-
데옥시리보티미딘
3'-O-α-메틸-p-
브로모벤질포스포아미다이트(
22)를 사용한
dT
20
인 보호기로서 1-(4-브로모페닐)에탄올을 사용한, dT20의 TIC, DAD 크로마토그램 및 질량 분석을 도 1에 도시한다.
5'-O-
다이메톡시트리틸
-2'-
데옥시리보티미딘
3'-O-1-
메톡시나프탈렌
포스포아
미다이트(23)을 사용한
dT
20
인 보호기로서 1-메톡시-2-나프탈렌메탄올을 사용한, dT20의 TIC, DAD 크로마토그램 및 질량 분석을 도 2에 도시한다.
5'-O-
다이메톡시트리틸
-2'-
데옥시리보티미딘
3'-O-
나프탈렌포스포아미다이트(
24)를 사용한
dT
20
2-카바모일-2-시아노에틸렌-1,1-다이티올레이트 처리 하에, 인 보호기로서 2-나프탈렌메탄올을 사용한, dT20의 TIC, DAD 크로마토그램 및 질량 분석을 도 3에 도시한다.
5'-O-
다이메톡시트리틸
-2'-
데옥시리보티미딘
3'-O-6-
브로모
-2-
나프탈렌포스포아미다이트
(25)를
사용한
dT
20
2-카바모일-2-시아노에틸렌-1,1-다이티올레이트 처리 하에, 인 보호기로서 6-브로모-2-나프탈렌메탄올을 사용한, dT20의 TIC, DAD 크로마토그램 및 질량 분석을 도 4에 도시한다.
5'-O-
다이메톡시트리틸
-2'-
데옥시리보티미딘
3'-O-1-인단-5-
카보나이트릴포스포아미다이트(
26)를 사용한
dT
20
인 보호기로서 1-하이드록시인단-5-카보나이트릴을 사용한, dT20의 TIC, DAD 크로마토그램 및 질량 분석을 도 5에 도시한다.
5'-O-
다이메톡시트리틸
-2'-
데옥시리보티미딘
3'-O-4-
시아노벤질포스포아미다이트(
27)를 사용한
dT
20
2-카바모일-2-시아노에틸렌-1,1-다이티올레이트 처리 하에, 인 보호기로서 4-시아노벤질 알코올을 사용한, dT20의 TIC, DAD 크로마토그램 및 질량 분석을 도 6에 도시한다.
5'-O-
다이메톡시트리틸
-2'-
데옥시리보티미딘
3'-O-3-
시아노벤질포스포아미다이트(
28)를 사용한
dT
20
2-카바모일-2-시아노에틸렌-1,1-다이티올레이트 처리 하에, 인 보호기로서 3-시아노벤질 알코올을 사용한, dT20의 TIC, DAD 크로마토그램 및 질량 분석을 도 7에 도시한다.
5'-O-
다이메톡시트리틸
-2'-
데옥시리보티미딘
3'-O-2-
에틴일벤질포스포아미다이트(
29)를 사용한
dT
20
2-카바모일-2-시아노에틸렌-1,1-다이티올레이트 처리 하에, 인 보호기로서 2-에틴일벤질 알코올을 사용한, dT20의 TIC, DAD 크로마토그램 및 질량 분석을 도 8에 도시한다.
5'-O-
다이메톡시트리틸
-2'-
데옥시리보티미딘
3'-O-아세틸-L-
트레오닌메틸에
스터포스포아미다이트(30)를 사용한
dT
20
인 보호기로서 아세틸-L-트레오닌메틸에스터를 사용한, dT20의 TIC, DAD 크로마토그램 및 질량 분석을 도 9에 도시한다.
5'-O-
다이메톡시트리틸
-2'-
데옥시리보티미딘
3'-O- S-
에틸벤조티오에이트
-
피롤리딘일포스포아미다이트(
31)를 사용한
dT
20
인 보호기로서 S-에틸벤조티오에이트를 사용한, dT20의 DAD 크로마토그램 및 질량 분석을 도 10에 도시한다.
5'-O-
다이메톡시트리틸
-2'-
데옥시리보티미딘
3'-O-4-
시아노벤질포스포아미다이트(
27)를 사용한
dT
60
2-카바모일-2-시아노에틸렌-1,1-다이티올레이트 처리 하에, 인 보호기로서 4-시아노벤질 알코올을 사용한, dT60의 TIC, DAD 크로마토그램 및 질량 분석을 도 11에 도시한다.
5'-O-
다이메톡시트리틸
-2'-
데옥시리보티미딘
3'-O-아세틸-L-
트레오닌메틸에스터포스포아미다이트(
30)를 사용한
dT
60
인 보호기로서 아세틸-L-트레오닌메틸에스터를 사용한, dT60의 TIC, DAD 크로마토그램 및 질량 분석을 도 12에 도시한다.
5'-O-
다이메톡시트리틸
-2'-
데옥시리보티미딘
3'-O- S-
에틸벤조티오에이트
-
피롤리딘일포스포아미다이트(
31)를 사용한
dT
60
인 보호기로서 S-에틸벤조티오에이트를 사용한, dT60의 TIC, DAD 크로마토그램 및 질량 분석을 도 13에 도시한다.
인 보호기로서 S-에틸벤조티오에이트를 사용하여 합성된 T60과, 표준 2-시아노에틸 포스포아미다이트를 사용하여 합성된 T60의 비교를 도 14에 도시한다.
하기 실시예는 본원에 기술된 추가적 화합물(1 내지 15)의 일반 합성 전략을 예시하는 것이다.
물질 및 방법: 5'-다이메톡시트리틸-N6-다이메틸아미노아세트아미딘-2'-데옥시아데노신,3'-[(2-시아노에틸)-(N,N-다이이소프로필)]-포스포아미다이트 DMA-dA-CE, 아데노신 수화물, 구아노신 수화물, 시티딘 수화물, 다이메톡시트리틸 클로라이드는 켐 진스로부터 구입하고, 5'-다이메톡시트리틸-N4-아세틸-2'-데옥시시티딘,3'-[(2-시아노에틸)-(N,N-다이이소프로필)]-포스포아미다이트(Ac-dC-CE), 5'-다이메톡시트리틸-N2-이소부티릴-2'-데옥시구아노신,3'-[(2-시아노에틸)-(N,N-다이이소프로필)]-포스포아미다이트 iBu-dG-CE, dT-CE, dT-CPG 칼럼(1 μmol), dC-CPG 칼럼(1 μmol), 아세토나이트릴 중 0.45M 에틸티오-테트라졸, CAP Mix A(THF/피리딘/Ac2O) 및 CAP Mix B(THF 중 16% MeIm), THF/피리딘/H2O 중 0.02M I2, 다이클로로메탄 중 3% 트라이클로로아세트산, 건조 아세토나이트릴은 글렌 리서치로부터 구입하였다. 4-아세틸모폴린, N,N-다이메틸 아세트아마이드 다이에틸 아세탈, N-메틸피롤리돈, N,N-다이이소프로필에틸아민, 건조 피리딘, 다이메틸 설페이트, NaOMe는 시그마-알드리치로부터 구입하였다.
DNA 합성 및 LCMS 연구: DNA를, 394 RNA/DNA 합성기(어플라이드 바이오시스템(Applied Biosystem), 0.2 mmol 방법) 내에서 합성하였다. 포스포아미다이트 방법의 P(III) 화학을 이용하여, 탈보호, 활성화 및 커플링, 산화 및 캡핑의 표준 4개의 사이클로 DNA를 합성하였다. 다이클로로메탄 중의 3% 트라이클로로아세트산을 탈보호에 사용하고, 아세토나이트릴 중 0.45M 에틸티오-테트라졸을 활성화제로서 사용하였다. THF/피리딘 중 0.02M I2를 아미다이트로부터 포스페이트로의 산화에 사용하였다. THF/피리딘/Ac2O 및 THF 중 16% N-메틸이미다졸을 사용하여, 커플링에 실패한 서열을 캡핑하였다. 제어된 기공 유리(CPG)를 고정상으로서 사용하였다. 더 짧은 DNA는 500Å 기공 크기의 CPG 상에서 1 mmol 규모로 합성하고, 더 긴 서열(20 bp 초과)은 1000Å 기공 크기의 CPG 상에서 0.2 mmol 규모로 합성하였다. CPG를 55℃에서 밤새도록 28 내지 30% NH4OH로 처리함으로써, DNA를 고형 지지체로부터 분할하였다. 그러나, NH4OH의 분할 및 탈보호 효율은, 주위 온도 내지 55℃의 다양한 온도에서 2시간 내지 밤새도록 아세트아미딘 및 모폴리노아세트아미딘 보호기에 대해 연구하였다.
분할된 DNA를, 5% 아세토나이트릴을 함유하는 H2O 내로 추출하고, 여과하였다. 여과된 DNA를 LCMS 연구에 직접 사용하였다. LCMS 스펙트럼은 애질런트(Agilent) 6500 Q-TOF LC/MS 시스템에서 기록하였다. LC/MS는, 용리액 완충액 시스템으로서 다이부틸암모늄 아세테이트/이소프로필 알코올(IPA)/아세토나이트릴(ACN)을 사용하여 기록하였다. 완충액의 조성: 완충액 A: 5 mM 다이부틸암모늄아세테이트 + 5% IPA:ACN(1:1), 완충액 B: 5 mM 다이부틸암모늄 아세테이트 + 90% IPA:ACN(1:1). 다이부틸암모늄 아세테이트를 이동 상으로 선택하여, 더 큰 전하 상태의 질량 스펙트럼 신호를 감소시켰다. 이는, 목적하는 질량의 DNA의 EIC 스펙트럼을 추출하는 것을 도왔다. DNA의 목적하는 스펙트럼을 애질런트 매스헌터 워크스테이션(Agilent MassHunter Workstation) 정성 분석 B.06.00으로 분석하였다. 목적하는 질량의 올리고머의 EIC 스펙트럼을, DNA 또는 부가물의 정확한 질량 값 및 계산된 질량 값을 입력함으로써 TIC 크로마토그램으로부터 추출하였다.
핵염기
보호를 위한 전구체 시약의 합성
N,N - 다이메틸아세트아마이드 다이에틸 아세탈:
N,N-다이메틸아세트아마이드 다이에틸 아세탈을 문헌[McBride, L. J; Kierzek, R.; Beaucage, S. L.; Caruthers, M. H. J. Am. Chem. Soc., 1986, 108, 2040-2048]의 절차에 따라 합성하였다.
2,2-다이메톡시-1- 메틸피롤리딘(문헌[Lu, J.; Khdour, O. M.; Armstrong, J. S.; Hecht, S. M. Bioorg. Med. Chem., 2010, 18, 7628-7638]):
N-메틸-2-피롤리디논(26 mL, 273 mmol)과 다이메틸 설페이트(26 mL, 278 mmol)의 혼합물을 교반하고, 90℃에서 90분 동안 가열하고, 이어서 실온으로 냉각하였다. 여기에, 65 mL의 25% 메탄올성 나트륨 메톡사이드 및 135 mL의 메탄올을 함유하는 용액을 약 10℃에서 아르곤 하에 1시간의 기간에 걸쳐 가했다. 침전된 백색 고체를 여과하고, 용매를 감압 하에 농축하였다. 황색 오일성 잔사를 250 mL의 다이에틸에터에 용해시키고, 또다시 1시간 동안 교반하고, 이어서 침전된 고체를 다시 여과하였다. 고체를 다이에틸에터로 세척하였다. 상기 에터를 농축한 후, 잔사를 진공 중에서 증류시켜, 표제 화합물을 연황색 액체로서 수득하였다. 수율: 14.8 g (37%). CHCl3 중 1H NMR은 문헌을 따랐다.
4-(1,1- 다이메톡시에틸 ) 모폴린의 합성(문헌[Feng R., -L; Gong, P.; Fang, L.; Hong, W. Chem. Res. Chinese U, 2005, 21, 177-192)]:
4-아세틸모폴린(32 mL, 278 mmol)과 다이메틸 설페이트(26 mL, 278 mmol)의 혼합물을 교반하고, 90℃에서 60분 동안 가열하고, 이어서 실온으로 냉각하였다. 여기에, 65 mL의 25% 메탄올성 나트륨 메톡사이드 및 135 mL의 메탄올을 함유하는 용액을 약 10℃에서 아르곤 하에 2시간의 기간에 걸쳐 가했다. 침전된 백색 고체를 여과하고, 용매를 감압 하에 농축하였다. 황색 오일성 잔사를 250 mL의 다이에틸에터에 용해시키고, 또다시 1시간 동안 교반하고, 이어서 침전된 고체를 다시 여과하였다. 고체를 다이에틸에터로 세척하였다. 상기 에터를 농축한 후, 잔사를 반응의 다름 단계에 사용하였다. 조질 오일의 중량은 22 g이었다.
dA
,
dC
,
dG
,
dT
3'-(2-
시아노에틸
)-N,N-
다이이소프로필포스포아미다이트의
합성
하기 반응식 1은, 하기 조건 하에 화합물 (3)의 합성을 도시하는 것이다: (i) 4-(1,1-다이메톡시에틸)모폴린, RT, 밤새도록; (ii) 4,4-다이메톡시트리틸클로라이드, 피리딘, N,N-다이이소프로필에틸아민(2h); (iii) N,N-다이이소프로필-시아노에틸 포스포아미다이트클로라이드, N,N-다이이소프로필에틸아민, CH2Cl2(2h).
[반응식 1]
6-
N
-(1-(
모폴리노
)
에틸리덴
)-2'-
데옥시아데노신(
1):
2.69 g(10 mmol)의 2'-데옥시아데노신 모노수화물을 피리딘과 함께 3회 동시 증발시키고, 20 mL의 건조 메탄올에 현탁시켰다. 아르곤 하에 일정하게 교반하면서, 10 g의 4-(1,1-다이메톡시에틸)모폴린을 천천히 가했다. 밤새도록 계속 반응시켰다. 반응 후, 회전식 증발에 의해 메탄올을 제거하였다. 점착성 잔사를 다이에틸 에터로 수차례 세척하여, 비-점착성 백색 분말을 수득하였다. 이 화합물을, 용리액으로서 CHCl3를 사용하여 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하였다. 메탄올을 구배(0 내지 10%)로서 사용하였다. 용매를 제거한 후, 순수한 화합물 (1)이 백색 거품으로서 나타났다. 수율: 3.19 g (88%), Rf (CHCl3/MeOH 10/2 v/v): 0.43, 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δd8.22 (s, 1H), 7.54 (s, 1H), 5.77 (t, J=6.11 Hz, 1H), 4.03 (d, J= 6.4 Hz, 1H), 3.88 (m, 2H), 3.64 (m, 1H), 3.37 (m, 4H. O(CH2)2), 2.83 (m, 4H, N(CH2)2), 2.51-2.29(m, 2H), 1.73 (s, 3H, C-CH3).13C NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 160.85, 154.22, 152.01, 147.94, 138.21, 122.11, 88.22, 83.19, 71.53, 68.12, 62.41, 46.36, 40.11, 22.38.
5'- O -( 다이 - p - 메톡시트리틸 )-6- N -(1-( 모폴리노 ) 에틸리덴 )-2'- 데옥시아데노신( 2):
4-N-(l-(다이메틸아미노)에틸리덴)-2'-데옥시아데노신(1)(3.19 g 0.0088 mol)을 건조 피리딘(25 mL)에 용해시키고, 이 용액을 아르곤으로 포화시켰다. N,N-다이이소프로필에틸아민(6.42 g, 0.05 mol, 8.65 mL)을 이 용액에 가하고, 아르곤 하에 10분 동안 교반하였다. 25 mL의 건조 피리딘 중의 다이-p-메톡시트리틸클로라이드(2.95 g, 0.0088 mol)의 용액을 아르곤 하에 제조하였다. 이 DMT-Cl 용액을 아르곤의 연속적인 유동 하에 화합물 (1)의 용액으로 옮겼다. 아르곤 하에 일정하게 교반하면서, 2시간 동안 계속 반응시켰다. 이 용액을 농축하고, 100 mL의 다이클로로메탄으로 추가로 희석하였다. 이 혼합물을 NaHCO3의 포화된 수용액(100 mL)으로 3회 세척하였다. 유기 상을 NaCl의 포화된 수용액(100 mL)으로 추가로 세척하였다. 유기 상을 무수 Na2SO4 상에서 건조하였다. 이 화합물을, CH2Cl2 중 3% 트라이에틸아민(MeOH를 0 내지 2% 구배로서 사용함)을 사용하여 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피로 추가로 정제하였다. 용매를 제거한 후, 화합물 (2)가 백색 거품으로서 나타났다. 수율: 4.54 g (78%); Rf (CH2Cl2/MeOH 10/0.5 v/v): 0.41; 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 8.48 (s, 1H), 7.76 (s, 1H), 7.3-6.6 (m, 13H, 아릴), 5.84 (t, J = 6.31 Hz, 1H), 4.13 (d, J= 7.3 Hz, 1H), 3.93 (m, 2H), 3.76 (s, 6H, (O-CH3)2), 3.54 (m, 1H), 3.33 (m, 4H. O(CH2)2), 2.91 (m, 4H, N(CH2)2), 2.55-2.31(m, 2H), 1.61 (s, 3H, C-CH3). 13C NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 167.15, 157.62, 154.41, 150.37, 147.54, 140.22, 140.14, 133.97, 130.21, 128.33, 124.32, 122.38, 112.76, 91.22, 86.92, 80.27, 74.22, 67.21, 62.12, 59.37, 47.28, 41.19, 23.3.
5'-
O
-(
다이
-
p
-
메톡시트리틸
)-6-
N
-(1-(
모폴리노
)
에틸리덴
)-2'-
데옥시아데노신
-2-시
아노에
틸-
N,N
-
다이이소프로필포스포아미다이트(
3):
5'-O-(다이-p-메톡시트리틸)-4-N-(1-모폴리노에틸리덴아미노)-2'-데옥시아데노신(2)(1.66 g, 0.0025 mol)을 10 mL의 건조 CH2Cl2에 용해시켰다. 아르곤의 연속적인 유동 및 교반 하에, N,N-다이이소프로필에틸아민(6 mL)을 이 용액에 가했다. N,N-다이이소프로필-O-시아노에틸클로로포스포아미다이트(590 mg, 0.0025mol)를 이 용액에 가하고, 아르곤 하에 2시간 동안 계속 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 이 용액을 30 mL의 포화된 수성 NaHCO3 용액에 붓고, CH2Cl2(3 x 10 mL)로 추출하였다. 합친 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조하고, 용매를 증발시켰다. 생성 오일을, CH2Cl2(3% 트라이에틸아민 함유)를 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 정제하여, 최종 화합물 (3)을 백색 거품으로서 수득하였다. 이 화합물을, 다이클로로메탄 용액으로부터의 차가운 헥산 침전에 의해 추가로 정제하였다. 수율: 1.51 g (71%). Rf (CH2Cl2/MeOH 10/0.5 v/v): 0.44, 31P NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 148.74, 147.91 (부분입체 이성질체).
하기 반응식 2는 하기 조건에 따른 화합물 (9)의 합성을 도시하는 것이다: (i) N,N-다이메틸아세트아마이드 다이에틸 아세탈, 에탄올, 60℃, 24 h; (ii) 4,4-다이메톡시트리틸클로라이드, 피리딘, N,N-다이이소프로필에틸아민, RT, 2h); (iii) N,N-다이이소프로필-시아노에틸 포스포아미다이트클로라이드, N,N-다이이소프로필에틸아민, CH2Cl2(2h); (iv) 4-(1,1-다이메톡시에틸)모폴린, 60℃, 밤새도록; (v) 4,4-다이메톡시트리틸클로라이드, 피리딘, N,N-다이이소프로필에틸아민(3h); (vi) N,N-다이이소프로필-시아노에틸 포스포아미다이트클로라이드, N,N-다이이소프로필에틸아민, CH2Cl2(2h).
[반응식 2]
2- N -(l-( 다이메틸아미노 ) 에틸리덴 )-2'- 데옥시구아노신( 4):
2-N-(l-(다이메틸아미노)에틸리덴)-2'-데옥시구아노신을, 약간의 변형을 사용하여 문헌에 따라 합성하였다(문헌[Lu, J.; Khdour, O. M.; Armstrong, J. S.; Hecht, S. M. Bioorg. Med. Chem., 2010, 18, 7628-7638]). 2'-데옥시구아노신 탈수화물(3.66 g 12 mmol)을 건조 에탄올에 현탁시켰다. 일정한 교반 하에, N,N-다이메틸아세트아마이드 다이에틸 아세탈(7.8 g, 44 mmol)을 이 현탁액에 가했다. 용액이 균질해질(연황색) 때까지, 이 혼합물을 약 70℃로 1시간 동안 가온하였다. 24시간 동안 계속 교반하였다. 감압 하에 회전식 증발에 의해 에탄올을 제거하였다. 점착성 잔사를, 잔사가 끈적해지지 않을 때까지 다이에틸에터로 수차례 세척하였다. 이 화합물을, 용리액으로서 CHCl3를 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 추가로 정제하였다. 메탄올을 구배(0 내지 20%)로서 사용하였다. 상기 화합물이 먼저 용리되었다. 칼럼 분획의 용매를 제거한 후, 화합물 (4)가 거품으로서 나타났다. 수율: 1.95 g (48%); Rf (CHCl3/MeOH 10/2 v/v): 0.38; 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 8.02 (s, 1H), 6.34 (t, J = 6.8 Hz, 1H), 5.84 (m, 1H), 4.75 (s, 1H), 4.14 (d, J= 6.6 Hz, 1H), 4.14 (s, 1H), 3.86 (m, 2H), 3.5 (m, 2H), 3.16 (s, 6H, N(CH3)2), 2.71-2.19(m, 2H), 2.21 (s, 3H, C-CH3).13C NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 162.25, 158.66, 156.26, 147.26, 138.10, 88.70, 86.26, 71.67, 62.61, 40.95, 38.18, 30.29, 17.00; ESI MS: 337.1521 [MH]+.
5'- O -( 다이 - p - 메톡시트리틸 )-2- N -(l-( 다이메틸아미노 ) 에틸리덴 )-2'- 데옥시구아노신( 5):
2-N-(l-(다이메틸아미노)에틸리덴)-2'-데옥시구아노신(4)(3.98 g 0.0118 mol)을 건조 피리딘(25 mL)에 용해시키고, 이 용액을 아르곤으로 포화시켰다. N,N-다이이소프로필에틸아민(6.42 g, 0.05 mol, 8.65 mL)을 이 용액에 가하고, 아르곤 하에 10분 동안 교반하였다. 25 mL의 건조 피리딘 중의 다이-p-메톡시트리틸클로라이드(4.2 g, 0.012 mol)의 용액을 아르곤 하에 제조하였다. 이 DMT-Cl 용액을 아르곤의 연속적인 유동 하에 화합물 (4)의 용액에 옮겼다. 아르곤 하에 일정하게 교반하면서, 2시간 동안 계속 반응시켰다. 이 용액을 농축하고, 100 mL의 다이클로로메탄으로 추가로 희석하였다. 이 혼합물을 NaHCO3의 포화된 수용액(100 mL)으로 3회 세척하였다. 유기 상을 NaCl의 포화된 수용액(100 mL)으로 추가로 세척하였다. 유기 상을 무수 Na2SO4 상에서 건조하였다. 이 화합물을, CH2Cl2 중 3% 트라이에틸아민(MeOH를 0 내지 5% 구배로서 사용함)을 사용하여 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피로 추가로 정제하였다. 용매를 제거한 후, 화합물 (5)가 거품으로서 나타났다. 수율: 5.51 g (73%); Rf (CH2Cl2/MeOH 10/0.5 v/v): 0.31; 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 7.71 (s, 1H), 7.4-6.8 (m, 13H, 아릴), 6.33 (t, J=7 Hz, 1H) 4.59 (m, 1H), 4.11 (m, 1H), 3.78 (s, 6H, (O-CH3)2), 3.6-3.2 (m, 4H), 3.12(s, 6H, N(CH3)2), 2.55 (m, 2H), 2.21 (s, 3H, C-CH3). 13C NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 162.27, 158.55, 156.39, 147.78, 144.53, 135.86, 130.01, 127.90, 126.91, 119.30, 113.20, 86.55, 85.52, 82.97, 72.47, 64.20, 55.26, 40.83, 38.56, 37.87, 30.20, 16.85, 7.94; ESI MS: 639.3019 [MH]+.
5'-
O
-(
다이
-
p
-
메톡시트리틸
)-2-
N
-(l-(
다이메틸아미노
)
에틸리덴
)-2'-
데옥시구아노신
-2-
시아노에틸
-
N,N
-
다이이소프로필포스포아미다이트(
6):
5'-O-(다이-p-메톡시트리틸)-2-N-(l-(다이메틸아미노)에틸리덴)-2'-데옥시구아노신(5)(596 mg, 0.93 mmol)을 10 mL의 건조 CH2Cl2에 용해시켰다. 아르곤의 연속적인 유동 및 교반 하에, N,N-다이이소프로필에틸아민(1 mL) 이 용액에 가했다. N,N-다이이소프로필-O-시아노에틸클로로포스포아미다이트(440 mg, 1.86 mmol)를 이 용액에 가하고, 아르곤 하에 2시간 동안 계속 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 이 용액을 30 mL의 포화된 수성 NaHCO3 용액에 붓고, CH2Cl2(3 x 10 mL)로 추출하였다. 합친 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조하고, 용매를 증발시켰다. 생성 오일을, CH2Cl2(3% 트라이에틸아민 함유)를 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 정제하여, 최종 화합물 (6)을 연황색 거품으로서 수득하였다. 수율: 0.74 g (94%).Rf (CH2Cl2/MeOH 10/0.6 v/v): 0.45; 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 11.98 (s, 1H), 7.81 (d, J=8Hz, 1H), 7.48-6.77 (m, 13H, 아릴), 6.21 (t, J=6.9 Hz, 1H), 4.83 (m, 1H), 4.11 (m, 1H), 3.78 (s, 6H, (O-CH3)2), 3.6-3.2 (m, 4H), 3.12 (s, 6H, N(CH3)2), 2.55 (m, 2H), 2.21 (s, 3H, C-CH3).31P NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 148.36, 147.86 (부분입체 이성질체).
2-
N
-(1-(
모폴리노
)
에틸리덴
)-2'-
데옥시구아노신(
7):
2.85 g(10 mmol)의 2'-데옥시구아노신 수화물을 피리딘과 함께 3회 동시-증발시키고, 20 mL의 건조 메탄올에 현탁시켰다. 아르곤 하의 일정한 교반 하에 12 g의 4-(1,1-다이메톡시에틸)모폴린을 천천히 가했다. 용액이 균질해져서 색상이 연황색이 될 때까지, 60℃에서 밤새도록 계속 반응시켰다. 반응 후, 메탄올을 회전식 증발에 의해 제거하였다. 점착성 잔사를 다이에틸에터로 수차례 세척하여, 비-점착성 백색 고체를 수득하였다. 이 화합물을, 용리액으로서 CHCl3를 사용하여, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피로 추가로 정제하였다. 메탄올을 구배(0 내지 20%)로서 사용하였다. 용매를 제거한 후, 순수한 화합물(7)이 백색 거품으로서 나타났다. 수율: 3.31 g (82%), Rf (CHCl3/MeOH 10/2 v/v): 0.32, 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 7.92 (s, 1H), 6.04 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 5.67 (m, 1H), 4.17 (d, J= 5.8 Hz, 1H), 3.84 (m, 2H), 3.52 (m, 2H), 3.43 (m, 4H. O(CH2)2), 2.96 (m, 4H, N(CH2)2), 2.71-2.19(m, 2H), 2.03 (s, 3H, C-CH3).13C NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 160.15, 157.26, 154.51, 148.34, 137.11, 87.85, 84.16, 70.28, 66.22, 45.86, 42.35, 38.38, 29.69, 16.80.
5'- O -( 다이 - p - 메톡시트리틸 )-2- N -(1-( 모폴리노 ) 에틸리덴 )-2'- 데옥시구아노신( 8):
2-N-(l-(모폴리노)에틸리덴)-2'-데옥시구아노신(7)(3.31 g 0.0087 mol)을 건조 피리딘(25 mL)에 용해시키고, 이 용액을 아르곤으로 포화시켰다. N,N-다이이소프로필에틸아민(6.42 g, 0.05 mol, 8.65 mL)을 이 용액에 가하고, 아르곤 하에 10분 동안 교반하였다. 25 mL의 건조 피리딘 중의 다이-p-메톡시트리틸클로라이드(2.9 g, 0.0087 mol)의 용액을 아르곤 하에 제조하였다. 이 DMT-Cl 용액을 아르곤의 일정한 유동 하에 화합물 (10)의 용액에 옮겼다. 아르곤 하의 일정한 교반 하에 3시간 동안 계속 반응시켰다. 이 용액을 농축하고, 100 mL의 다이클로로메탄으로 추가로 희석하였다. 이 혼합물을 NaHCO3의 포화된 수용액(100 mL)으로 3회 세척하였다. 유기 상을 NaCl의 포화된 수용액(100 mL)으로 추가로 세척하였다. 유기 상을 무수 Na2SO4 상에서 건조하였다. 이 화합물을, CH2Cl2 중의 3% 트라이에틸아민(MeOH를 0 내지 5% 구배로서 사용함)을 사용하여 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피로 추가로 정제하였다. 용매를 제거한 후, 화합물 (8)이 백색 거품으로서 나타났다. 수율: 4.89 g (83%); Rf (CH2Cl2/MeOH 10/0.5 v/v): 0.36; 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 7.78 (s, 1H), 7.3-6.6 (m, 13H, 아릴), 6.03 (t, J=6.8 Hz, 1H) 4.59 (m, 1H), 3.84 (s, 6H, (O-CH3)2), 3.7-3.4 (m, 4H), 3.33 (m, 4H, O(CH2)2), 3.02(m, 4H, N(CH2)2), 2.55 (m, 2H), 2.16 (s, 3H, C-CH3). 13C NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 168.22, 160.29, 158.89, 156.19, 148.18, 143.23, 137.16, 132.11, 128.10, 127.21, 123.22, 120.24, 118.60, 113.28, 89.03, 86.55, 85.12, 82.27, 72.47, 66.90, 56.26, 45.83, 37.66, 32.87, 30.20, 16.95.
5'-
O
-(
다이
-
p
-
메톡시트리틸
)-2-
N
-(
1(모폴리노)에틸리덴
)-2'-
데옥시구아노신
-2-시
아노에
틸-
N,N
-
다이이소프로필포스포아미다이트(
9):
5'-O-(다이-p-메톡시트리틸)-2-N-(1-(모폴리노)에틸리덴)-2'-데옥시구아노신(8)(1.7 g, 0.0025 mol)을 10 mL의 건조 CH2Cl2에 용해시켰다. N,N-다이이소프로필에틸아민(6 mL)을 아르곤의 연속적인 유동 및 교반 하에 이 용액에 가했다. N,N-다이이소프로필-O-시아노에틸클로로포스포아미다이트(590 mg, 0.0025mol)를 이 용액에 가하고, 아르곤 하에 2시간 동안 계속 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 이 용액을 30 mL의 포화된 수성 NaHCO3 용액에 붓고, CH2Cl2(3 x 10 mL)로 추출하였다. 합친 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조하고, 용매를 증발시켰다. 생성 오일을, CH2Cl2(3% 트라이에틸아민 함유)를 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 정제하여, 최종 화합물을 백색 거품으로서 수득하였다. 화합물 (9)를, 다이클로로메탄 용액으로부터 차가운 헥산 침전에 의해 추가로 정제하였다. 수율: 1.62 g (77%). Rf (CH2Cl2/MeOH 10/0.7 v/v): 0.49, 31P NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 147.56, 146.86 (부분입체 이성질체).
하기 반응식 3은 하기 조건에 따른 화합물 (15)의 합성을 도시하는 것이다: (i) 2,2-다이메톡시-1-메틸피롤리딘, 메탄올, RT (3h); (ii) 4,4-다이메톡시트리틸클로라이드, 피리딘, N,N-다이이소프로필에틸아민(2h); (iii) N,N-다이이소프로필-시아노에틸 포스포아미다이트클로라이드, N,N-다이이소프로필에틸아민, CH2Cl2(2h); (iv) 4-(1,1-다이메톡시에틸)모폴린, RT, 밤새도록; (v) 4,4-다이메톡시트리틸클로라이드, 피리딘, N,N-다이이소프로필에틸아민(2h); (vi) N,N-다이이소프로필-시아노에틸 포스포아미다이트클로라이드, N,N-다이이소프로필에틸아민, CH2Cl2(2h).
[반응식 3]
4-N-(N-
메틸피롤리딘
-2-일리덴)-2'-
데옥시시티딘(
10)의 합성:
2.5 g(10 mmol)의 2'-데옥시시티딘 수화물(2a)을 20 mL의 건조 메탄올에 현탁시켰다. 여기에 3.8 g(26 mmol)의 2,2-다이메톡시-1-메틸피롤리딘을 아르곤 하의 일정한 교반 하에 천천히 가했다. 용액이 균질해지고 색상이 연황색이 될 때까지, 3시간 동안 계속 반응시켰다. 반응 후, 메탄올을 회전식 증발에 의해 제거하였다. 점착성 잔사를 다이에틸에터로 수차례 세척하여 비-점착성 고체를 수득하였다. 이 화합물을, 용리액으로서 CH2Cl2를 사용하여 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피로 추가로 정제하였다. 메탄올을 구배(0 내지 20%)로서 사용하였다. 용매를 제거한 후, 순수한 화합물이 백색 거품으로서 나타났다. 수율: 2.61 g (85%); Rf (CH2Cl2/MeOH 10/2 v/v): 0.3; 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 7.91 (d, J=7.8 Hz, 1H), 6.13 (t, J=7.1 Hz, 1H), 6.03 (d, J=8 Hz, 1H), 4.55 (m, 1H), 4.01 (m, 1H), 3.88 (m, 2H), 3.48 (m, 2H), 3.11 (m, 2H), 3.05 (, 3H), 2.41 (m, 2H), 2.06 (m, 2H); 13C NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 172.20, 169.00, 156.74, 141.98, 103.40, 87.53, 70.17, 61.71, 51.71, 40.56, 31.93, 30.53, 19.71; ESI MS: 309.1583 [MH]+.
5'-
O
-(
다이
-
p
-
메톡시트리틸
)-4-N-(N-
메틸피롤리딘
-2-
일리덴
)-2'-
데옥시시티
딘(11)의 합성:
4.2 g(0.0136 mol)의 4-N-(N-메틸피롤리딘-2-일리덴)-2'-데옥시시티딘(10)을 25 mL의 건조 피리딘에 용해시켰다. 9.88 mL의 N,N-다이이소프로필에틸아민을 아르곤 하에 이 용액에 가하고, 10분 동안 교반하였다. 여기에, 25 mL의 건조 피리딘에 용해된 4.8 g(0.0143 mol)의 DMT-Cl을 아르곤 하의 일정한 교반 하에 가했다. 2시간 동안 계속 반응시켰다. 이 용액을 농축하고, 100 mL의 다이클로로메탄으로 추가로 희석하였다. 이 혼합물을 NaHCO3의 포화된 수용액(100 mL)으로 3회 세척하였다. 유기 상을 NaCl의 포화된 수용액(100 mL)으로 추가로 세척하였다. 유기 상을 무수 Na2SO4 상에서 건조하였다. 이 화합물을, CH2Cl2 중의 3% 트라이에틸아민(MeOH를 0 내지 5% 구배로서 사용함)을 사용하여 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피로 추가로 정제하였다. 용매를 제거한 후, 화합물 (11)이 연황색 거품으로서 나타났다. 수율: 6.48 g (78%); Rf (CH2Cl2/MeOH 10/0.5 v/v): 0.4; 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 7.90 (d, 1H), 7.44-6.80 (m, 13H, 아릴), 6.42 (t, J=6.8 Hz, 1H), 5.81 (d, J=8 Hz, 1H), 4.54 (m, 1H), 4.15 (m, 1H), 3.80 (s, 6H, (O-CH3)2), 3.70-3.40 (m, 4H), 3.15 (t, J=6.8 Hz, 2H), 3.03 (s, 3H, N-CH3), 2.68 (m, 2H), 2.21 (m, 2H). 13C NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 172.09, 169.02, 158.53, 156.59, 144.54, 140.50, 130.10, 128.17, 127.91, 126.91, 113.22, 103.17, 86.64, 86.44, 86.01, 71.52, 63.31, 55.24, 51.55, 42.03, 31.82, 30.63, 19.71; ESI MS: 611.2997 [MH]+.
5'-
O
-(
다이
-
p
-
메톡시트리틸
)-4-
N
-(
N
-
메틸피롤리딘
-2-
일리덴
)-2'-
데옥시시티딘
-2-
시아노에틸
-
N,N
-
다이이소프로필포스포아미다이트(
12)
5'-O-(다이-p-메톡시트리틸)-4-N-(N-메틸피롤리딘-2-일리덴)-2'-데옥시시티딘(11)(456 mg, 0.75mmol)를 10 mL의 건조 CH2Cl2에 용해시켰다. N,N-다이이소프로필에틸아민(1 mL)을 아르곤의 연속적인 유동 및 교반 하에 이 용액에 가했다. N,N-다이이소프로필-O-시아노에틸클로로포스포아미다이트(350 mg, 1.48mmol)를 이 용액에 가하고, 아르곤 하에 2시간 동안 계속 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 이 용액을 30 mL의 포화된 수성 NaHCO3 용액에 붓고, CH2Cl2(3 x 10 mL)로 추출하였다. 합친 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조하고, 용매를 증발시켰다. 생성 오일을 CH2Cl2 (3% 트라이에틸아민 함유)를 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 정제하여, 최종 화합물 (12)을 연황색 거품으로서 수득하였다. 수율: 0.53 g (87%). Rf (CH2Cl2/MeOH 10/0.8 v/v): 0.5; 31P NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 149.48, 148.78 (부분입체 이성질체).
4-
N
-(1-(
모폴리노
)
에틸리덴
)-2'-
데옥시시티딘(
13):
2.45 g(10 mmol)의 2'-데옥시시티딘 모노수화물을 피리딘과 함께 3회 동시-증발시키고, 20 mL의 건조 메탄올에 현탁시켰다. 여기에 10 g의 4-(1,1-다이메톡시에틸)모폴린을 아르곤 하의 일정한 교반 하에 천천히 가했다. 밤새도록 반응시켰다. 반응 후, 메탄올을 회전식 증발에 의해 제거하였다. 점착성 잔사를, 비-점착성 백색 분말이 수득될 때까지 다이에틸에터로 수차례 세척하였다. 이 화합물을, 용리액으로서 CHCl3를 사용하여 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피로 추가로 정제하였다. 메탄올을 구배(0 내지 10%)로서 사용하였다. 용매를 제거한 후, 순수한 화합물 (13)이 백색 거품으로서 나타났다. 수율: 3.0 g (88%), Rf (CHCl3/MeOH 10/2 v/v): 0.38; 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 7.53 (d, J=6.3 Hz, 1H), 6.01 (t, J=6.7 Hz, 1H), 5.27 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 4.35 (m, 1H), 3.91 (m, 1H), 3.88 (m, 2H), 3.55 (m, 4H, O(CH2)2), 2.91 (m, 4H, N(CH2)2), 2.5-2.3(m, 2H), 1.73 (s, 3H, C-CH3).13C NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 163.85, 160.12, 153.81, 142.14, 108.11, 92.17, 84.72, 71.60, 67.08, 60.40, 44.78, 40.92, 22.98.
5'- O -( 다이 - p - 메톡시트리틸 )-4- N -(1-( 모폴리노 ) 에틸리덴 )-2'- 데옥시시티딘( 14):
4-N-(l-((모폴리노)에틸리덴))-2'-데옥시시티딘(13)(2.98 g 0.0088 mol)을 건조 피리딘(25 mL)에 용해시키고, 이 용액을 아르곤으로 포화시켰다. N,N-다이이소프로필에틸아민(6.42 g, 0.05 mol, 8.65 mL)을 이 용액에 가하고, 아르곤 하에 10분 동안 교반하였다. 25 mL의 건조 피리딘 중의 다이-p-메톡시트리틸클로라이드(2.95 g, 0.0088 mol)의 용액을 아르곤 하에 제조하였다. 이 DMT-Cl 용액을 아르곤의 일정한 유동 하에 화합물 (16)의 용액에 옮겼다. 아르곤 하에 일정하게 교반하면서, 2시간 동안 계속 반응시켰다. 이 용액을 농축하고, 100 mL의 다이클로로메탄으로 추가로 희석하였다. 이 혼합물을 NaHCO3의 포화된 수용액(100 mL)으로 3회 세척하였다. 유기 상을 NaCl의 포화된 수용액(100 mL)으로 추가로 세척하였다. 유기 상을 무수 Na2SO4 상에서 건조하였다. 이 화합물을, CH2Cl2 중의 3% 트라이에틸아민(MeOH를 0 내지 2% 구배로서 사용함)를 사용하여 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피로 추가로 정제하였다. 용매를 제거한 후, 화합물 (14)가 백색 거품으로서 나타났다. 수율: 4.25 g (75%); Rf (CH2Cl2/MeOH 10/0.5 v/v): 0.38; 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 7.5-6.7 (m, 14H, 아릴), 6.05 (t, J=6.7 Hz, 1H), 5.17 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 4.47 (m, 1H), 4.13 (m, 1H), 3.95 (m, 2H), 3.71 (s, 6H, (O-CH3)2), 3.48 (m, 4H, O(CH2)2), 2.87 (m, 4H, N(CH2)2), 2.6-2.3(m, 2H), 1.67 (s, 3H, C-CH3); 13C NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 164.75, 161.32, 158.07, 151.71, 147.11, 142.34, 136.21, 129.88, 127.62, 125.65, 115.23, 109.11, 92.17, 87.02, 84.72, 71.60, 68.09, 61.38, 54.28, 44.71, 41.22, 21.61.
5'-
O
-(
다이
-
p
-
메톡시트리틸
)-4-
N
-(1-(
모폴리노
)
에틸리덴
)-2'-
데옥시시티딘
-2-시
아노에
틸-
N,N
-
다이이소프로필포스포아미다이트(
15):
5'-O-(다이-p-메톡시트리틸)-4-N-(1-모폴리노에틸리덴아미노)-2'-데옥시시티딘(14)(1.60 g, 0.0025 mol)을 10 mL의 건조 CH2Cl2에 용해시켰다. N,N-다이이소프로필에틸아민(6 mL)을 아르곤의 연속적인 유동 및 교반 하에 이 용액에 가했다. N,N-다이이소프로필-O-시아노에틸클로로포스포아미다이트(590 mg, 0.0025mol)를 이 용액에 가하고, 아르곤 하에 2시간 동안 계속 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 이 용액을 30 mL의 포화된 수성 NaHCO3 용액에 붓고, CH2Cl2(3 x 10 mL)로 추출하였다. 합친 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조하고, 용매를 증발시켰다. 생성 오일을 CH2Cl2(3% 트라이에틸아민 함유)를 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 정제하여, 최종 화합물을 백색 거품으로서 수득하였다. 화합물 (15)를, 다이클로로메탄 용액으로부터의 차가운 헥산 추출에 의해 추가로 정제하였다. 수율: 1.4 g (66%). Rf (CH2Cl2/MeOH 10/0.5 v/v): 0.4, 31P NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 147.39, 146.13 (부분입체 이성질체).
하기 실시예는 본원에 기술된 화합물(16 내지 21)의 일반적 합성 전략을 예시하는 것이다.
5'-O-다이메톡시트리틸-2'-데옥시리보뉴클레오사이드-3'-O-S-에틸벤조티오에이트-피롤리딘일포스포아미다이트의 합성
250 mL 환저 플라스크 내에서 비스(1-피롤리딘일)클로로포스핀(0.016 mol, 4 g)을 무수 다이클로로메탄(20 mL)에 용해시키고, 트라이에틸아민(1 당량)을 이 용액에 가하고, 아르곤 하에 실온에서 교반하였다. 마지막에, 5'-O-다이메톡시트리틸-2'-데옥시리보뉴클레오사이드(0.016 mol, 1.0 당량)를 이 용액에 가했다. 이 혼합물을 질소 하에 실온에서 30분 동안 교반하였을 때, 31P NMR 스펙트럼은 출발 물질에서 생성물로의 완전한 전환을 나타냈다. 이 시점에, 에틸 티오살리실레이트(1.0 당량)를 이 혼합물에 적가하고, 적하 직후 1H-에틸티오테트라졸(무수 아세토나이트릴 중의 0.25 M, 글렌 리서치(미국, 버지니아주), 0.5 당량)을 시린지를 통해 15분의 기간에 걸쳐 가했다. 31P NMR 스펙트럼이 포스포로디아미다이트의 완전한 전환을 나타낼 때까지, 이 혼합물을 질소 하에 실온에서 교반하였다. 용매를 진공 중에서 제거하고, 조 생성물을, 에틸 아세테이트 중의 0 내지 60% 아세토나이트릴(2% 트라이메틸아민 함유) 구배를 사용하여 애질런트 분취용 HPLC SD-1 시스템으로 단리하였다. 하기 반응식은 전술된 합성을 도시하는 것이다:
화합물 (16): 5'-O-다이메톡시트리틸-2'-데옥시리보티미딘-3'-O-S-에틸벤조티오에이트-피롤리딘일포스포아미다이트. 31P NMR (CD3CN): δ 143.22, 142.57(d). ESI-MS (m/z): 계산치: 826.2922 (M+H)+, 검출치: 826.2921 (M+H)+.
화합물 (17): 5'-O-다이메톡시트리틸- N6-(N,N-다이메틸아미디노)-2'-데옥시리보아데노신-3'-O-S-에틸벤조티오에이트-피롤리딘일포스포아미다이트. 31P NMR (CD3CN): δ 142.92, 142.79(d). ESI-MS (m/z): 계산치: 904.3616 (M+H)+, 검출치: 904.3607 (M+H)+.
화합물 (18): 5'-O-다이메톡시트리틸- N4-아세틸-2'-데옥시리보시티딘 -3'-O-S-에틸벤조티오에이트-피롤리딘일포스포아미다이트. 31P NMR (CD3CN): δ 143.70, 143.17(d). ESI-MS (m/z): 계산치: 853.3031 (M+H)+, 검출치: 853.3035 (M+H)+.
화합물 (19): 5'-O-다이메톡시트리틸- N4-(N-메틸-2-피롤리딘일리덴)-2'-데옥시리보시티딘 -3'-O-S-에틸벤조티오에이트-피롤리딘일포스포아미다이트. 31P NMR (CD3CN): δ 143.41, 142.80(d). ESI-MS (m/z): 계산치: 892.3504 (M+H)+, 검출치: 853.3506 (M+H)+.
화합물 (20): 5'-O-다이메톡시트리틸- N2-이소부티릴-2'-데옥시리보구아노신-3'-O-S-에틸벤조티오에이트-피롤리딘일포스포아미다이트. 31P NMR (CD3CN): δ 143.17, 143.13(d). ESI-MS (m/z): 계산치: 921.3406 (M+H)+, 검출치: 921.3385 (M+H)+.
화합물 (21): 5'-O-다이메톡시트리틸- N2-(N,N-다이메틸아미디노)-2'-데옥시리보구아노신-3'-O-S-에틸벤조티오에이트-피롤리딘일포스포아미다이트. 31P NMR (CD3CN): δ 142.92, 142.79(d). ESI-MS (m/z): 계산치: 920.3566 (M+H)+, 검출치: 920.3561 (M+H)+.
어레이의 합성
DNA 마이크로어레이를, 문헌[Leproust et al. in Nucleic Acids Research (2010), Vol. 38(8), pp 2522-2540]에 기술된 애질런트 제조 방법에 따라 애질런트 어레이 기록기 상에서 제조하였다. A,G,C,T의 세트를 함유하고 178 내지 202개 범위의 뉴클레오타이드 길이를 갖는 5,528개의 독특한 올리고뉴클레오타이드 서열의 세트를 화합물 T(16), C(18), A(17) 및 G(20)를 사용하여 합성하였다. 상기 올리고뉴클레오타이드를, 실릴화된 6.625x6 인치 웨이퍼 상의 분할가능 연결기 상에서 동일반응계 내 합성하였다. 합성이 끝날 무렵에, 상기 올리고뉴클레오타이드를 탈보호하고, 실온에서 밤새도록 암모니아 기체 처리하여 개별적인 슬라이드로부터 분할하였다. 상기 올리고뉴클레오타이드의 서열은, 일루미나 미시크(Illumina MiSeq) 시스템 상의 서열분석을 수행하는데 필요한,
5' 어댑터(Adapter)= 29개의 뉴클레오타이드,
서열분석 프라이머= 32개의 뉴클레오타이드,
바코드= 16개의 염기,
문의(query) 서열= 76 또는 100개의 염기,
3' 어댑터= 25 뉴클레오타이드
를 포함하였다.
서열 분석은, 일체성 및 전장 서열의 존재를 확인하였다. 추가적으로, 단일 200량체 올리고뉴클레오타이드 서열인 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCGACAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCGACGTTCCCAGGATACTTATAGGAGGGGCAAACCTCTTCTCTAGAGTCGCTGGTCCTATCCAGTAAACCACTTGGTTAATGTAAGAGGCCCGCCTTTCGATCAGAAACGTCTGGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTGT-3'(서열번호 1)을 동일한 프로토콜 및 동일한 포스포아미다이트 화합물(T(16), A(17), C(18) 및 G(20))을 사용하여 어레이 상에서 합성하였다. 상기 어레이로부터의 탈보호 및 분할은 전술된 바와 같이 수행하였다. 생성물의 변성 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동은, 200량체의 성공적인 합성을 확인하였다(도 25).
본원 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서, 달리 명시적으로 언급되지 않는 한, 단수는 복수의 지시 대상을 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 기술적 및 과학적 용어는 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 등가의 임의의 방법 및 물질도 본원의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 기술된다. 본원에 언급된 방법은, 개시된 특정 순서에 더하여, 논리적으로 가능한 임의의 순서로 수행될 수 있다.
참고문헌의 인용
다른 문헌, 예컨대 특허, 특허출원, 특허공개, 잡지, 책, 논문, 웹 내용물에 대한 참고 및 인용이 본원에서 수행되었다. 이러한 모든 문헌은 모든 목적을 위하여 이의 전체내용이 본원에 참고로 인용된다. 본원에 참고로 인용되는 것으로 언급되지만 본원에 명백히 제시된 정의, 언급 또는 다른 개시내용 자료와 상충되는 임의의 자료 또는 이의 부분은 인용된 자료와 본 개시내용의 자료가 상충되지 않는 정도로만 혼입된다. 상충되는 경우, 이러한 상충은, 바람직한 개시내용으로서 본원 개시내용에 우호적으로 해결되어야 한다.
균등론
본원에 개시된 대표적인 실시예는 본 발명의 설명을 돕는 것으로 의도되며, 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않으며, 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 간주되어서는 안 된다. 실제로, 본원에 제시되거나 기술된 바에 더하여, 본 발명의 다양한 변형 및 이의 많은 추가 양태가, 하기 실시예 및 본원에 인용된 과학 및 특허 문헌의 전문으로부터 당업자에게 자명할 것이다. 이러한 실시예는, 본 발명의 다양한 실시양태 및 등가물로서 본 발명의 실시에 대해 변경될 수 있는 중요한 부가적인 정보, 예시 및 안내를 포함한다.
실시양태
본원의 양태는 하기 화학식 I의 화합물을 포함한다:
상기 식에서, B는 핵염기 또는 이의 유사체이고; R1 및 R2는, 각각 독립적으로, 치환되거나 비치환된 선형, 분지형 또는 환형 알킬이거나, R1 및 R2가 함께, 5원, 6원, 7원 또는 8원 비-방향족 고리를 형성하고; R3은 산-반응성 보호기이고; R은, 벤질 알코올 유도체, 알파-메틸 아릴 알코올 유도체, 나프탈렌 알코올 유도체, 이환형 지방족 알코올 유도체, S-에틸티오에이트 및 아미노산 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 기이되, R은 o-메틸 벤질이 아니다.
상기 화합물의 몇몇 실시양태에서, B는 핵염기 또는 보호된 핵염기이고, 이때 상기 핵염기는 아데닌, 구아닌, 티민, 시토신 및 우라실로부터 선택되고; R3은, DMT, MMT, TMT, 픽실 및 피발로일로부터 선택되는 기이다. 상기 화합물의 몇몇 실시양태에서, R1 및 R2는, 각각 독립적으로, 치환되거나 비치환된 선형, 분지형 또는 환형 C1-C18 알킬이다. 상기 화합물의 몇몇 실시양태에서, R1 및 R2는, 각각 독립적으로, 비치환된 선형 또는 분지형 C1-C6 알킬이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 화합물은 하기 화학식 Ia의 구조를 가진다:
상기 화합물의 몇몇 실시양태에서, R1 및 R2는 함께 5원 또는 6원 비-방향족 고리를 형성하고, 이때 상기 고리는 골격 내에 0 또는 1개의 헤테로원자를 가진다. 상기 화합물의 몇몇 실시양태에서, R1 및 R2는 함께, 골격 내에 0개의 헤테로원자를 갖는 5원 비-방향족 고리를 형성한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 화합물 하기 화학식 Ib의 구조를 가진다:
상기 식에서, R4는 각각 수소, 할로겐, C1-C6 알킬 및 C1-C6 알킬옥시로부터 선택된다. 몇몇 실시양태에서, 상기 화합물 하기 화학식 Ic의 구조를 가진다:
몇몇 실시양태에서, 상기 화합물 하기 화학식 Id의 구조를 가진다:
상기 식에서, R7은, 각각 독립적으로, 수소, 할로겐, C1-C6 알킬 또는 C1-C6 알킬옥시이다.
몇몇 실시양태에서, 상기 화합물 하기 화학식 If의 구조를 가진다:
상기 식에서, R8은 지방족 기이다.
상기 화합물의 몇몇 실시양태에서, R은, 하기 화학식 II의 구조를 갖는 벤질 알코올의 유도체이다:
상기 식에서, Ra는 수소 또는 알킬이고; R11은, 각각 독립적으로, 수소, 알킬, 알콕시, 알킬-S-, 시아노, 메틸시아노 또는 할로겐이고; n은 1, 2 또는 3이다.
상기 화합물의 몇몇 실시양태에서, R은, 하기로부터 선택되는 벤질 알코올의 유도체이다:
상기 식에서, R6은, 각각 독립적으로, 수소, 할로겐, 시아노, 메틸시아노 및 하이드로카빌로부터 선택된다. 상기 화합물의 몇몇 실시양태에서, R은, 하기 구조를 갖는 벤질 알코올의 유도체이다:
상기 식에서, R7은, 각각 독립적으로, 수소, 할로겐, C1-C6 알킬, C1-C6 알킬옥시 및 전자-당김 기로부터 선택되는 하나 이상의 치환기이다.
상기 화합물의 몇몇 실시양태에서, R은, 하기 화학식 III의 구조를 갖는 알파-메틸 아릴 알코올의 유도체이다:
상기 식에서, X는 수소, 할로겐, 시아노, 메틸시아노 또는 트라이플루오로메틸이고; Y는 수소, 알킬, 할로알킬 또는 알콕시알킬이고; Ra는 수소 또는 알킬이다.
상기 화합물의 몇몇 실시양태에서, R은, 하기로부터 선택되는 알파-메틸 아릴 알코올의 유도체이다:
상기 식에서, R9는 할로겐, 시아노 또는 트라이플루오로메틸이고; R10은 수소, 할로겐,C1-C6 알킬 및 C1-C6 알킬옥시로부터 선택된다.
상기 화합물의 몇몇 실시양태에서, R은, 하기 화학식 IV의 구조를 갖는 나프탈렌 알코올의 유도체이다:
상기 식에서, R7은 수소, 할로겐, C1-C6 알킬 및 C1-C6 알킬옥시로부터 선택되고; R5는 수소 및 하이드로카빌로부터 선택되고; R12는 수소 및 알콕시로부터 선택된다.
상기 화합물의 몇몇 실시양태에서, R은, 하기로부터 선택되는 나프탈렌 알코올의 유도체이다:
상기 식에서, R13은 C1-C6 알킬이다.
상기 화합물의 몇몇 실시양태에서, R은, 하기 화학식 V 또는 VI의 구조를 갖는 이환형 지방족 알코올의 유도체이다:
상기 식에서, R14는 수소, 할로겐, C1-C6 알킬 및 C1-C6 알킬옥시로부터 선택되고; R15 및 R16은, 각각 독립적으로, 수소, 시아노, 알콕시 또는 할로겐이고; m은 1 또는 2이다.
상기 화합물의 몇몇 실시양태에서, R은, 하기로부터 선택되는 이환형 지방족 알코올의 유도체이다:
상기 식에서, R14는 수소, 할로겐, C1-C6 알킬 또는 C1-C6 알킬옥시이고; R15는 수소, 할로겐 또는 C1-C6 알콕시이고; R16은 수소, 시아노 또는 할로겐이다.
상기 화합물의 몇몇 실시양태에서, R은 하기와 같다:
상기 식에서, R7은 수소, 할로겐, 하이드로카빌 및 알킬옥시로부터 선택된다.
상기 화합물의 몇몇 실시양태에서, R은 하기로부터 선택된다:
상기 화합물의 몇몇 실시양태에서, R은 하기와 같다:
상기 식에서, R7은 수소, 할로겐, C1-C6 알킬 또는 C1-C6 알킬옥시이다.
상기 화합물의 몇몇 실시양태에서, R은 하기와 같다:
상기 식에서, R8은 지방족 기이다.
상기 화합물의 몇몇 실시양태에서, B는 아미딘 핵염기 보호기를 포함한다. 상기 화합물의 몇몇 실시양태에서, 상기 아미딘 핵염기 보호기는 아세트아미딘 보호기이다. 상기 화합물의 몇몇 실시양태에서, 상기 아세트아미딘 보호기는, 하기 구조로 기술된다:
상기 식에서, R21 및 R22는, 각각 독립적으로, 알킬, 치환된 알킬이거나, R21 및 R22가 환형으로 연결되어, 치환되거나 비치환된 5원 또는 6원 헤테로환을 형성한다. 상기 화합물의 몇몇 실시양태에서, R21 및 R22는 메틸이다. 상기 화합물의 몇몇 실시양태에서, R21 및 R22는 환형으로 연결되어, 치환되거나 비치환된 5원 또는 6원 헤테로환을 형성하고, 이때 상기 헤테로환은, 모폴린, 피페리딘 및 피롤리딘으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
상기 화합물의 몇몇 실시양태에서, 아세트아미딘 보호기는 하기 구조로 기술된다:
상기 화합물의 몇몇 실시양태에서, B는 하기 구조로 기술된다:
상기 화합물의 몇몇 실시양태에서, R은 하기와 같다:
상기 식에서, R7은 수소, 할로겐, 하이드로카빌 및 알킬옥시로부터 선택된다.
또한, 하기 화학식 VII의 구조를 갖는 화합물이 제공된다:
상기 식에서, R1 및 R2는 각각 이소프로필이거나, R1 및 R2가 함께, 이들이 부착되는 N을 갖는 피롤리딘 헤테로환형 고리를 형성하고; R3은 산-반응성 보호기이고; R'는, 시아노에틸 기 및 메틸 기로부터 선택되는 기고; B는, 하기로부터 선택되는 보호된 핵염기이다:
또한, 폴리뉴클레오타이드를 합성하는 방법이 제공되며, 상기 방법은, (a) 비보호된 하이드록실 기를 갖는 뉴클레오사이드 잔부를 제공하는 단계; 및 (b) 상기 뉴클레오사이드 잔부를 뉴클레오사이드 단량체(예컨대, 본원에 기술된 것)와 접촉시켜, 상기 뉴클레오사이드 단량체를 상기 뉴클레오사이드 잔부에 공유 결합시키고, 폴리뉴클레오타이드를 생성하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 추가로, 상기 폴리뉴클레오타이드를 산화제에 노출시키는 단계를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 추가로, 상기 핵산을 탈보호제에 노출시키는 단계를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 추가로, 상기 접촉 단계를 1회 이상 반복하는 것을 포함한다. 상기 방법의 몇몇 실시양태에서, 상기 뉴클레오사이드 잔부는 고형 지지체에 공유 결합된다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 추가로, 상기 핵산을 상기 고형 지지체로부터 분할하여, 자유 핵산을 생성하는 단계를 포함한다. 상기 방법의 몇몇 실시양태에서, 상기 핵산은, 약 200개 이상의 뉴클레오타이드의 서열을 갖는 DNA이다. 상기 방법의 몇몇 실시양태에서, 상기 핵산은 약 200개 내지 약 1,000개의 뉴클레오타이드 길이를 갖는 DNA이다. 상기 방법의 몇몇 실시양태에서, 상기 DNA는 약 300개 내지 약 500개의 뉴클레오타이드 길이를 가진다. 상기 방법의 몇몇 실시양태에서, 상기 DNA는 100개의 뉴클레오타이드 당 2개 미만의 단일 뉴클레오타이드 결실을 가진다. 상기 방법의 몇몇 실시양태에서, 상기 DNA는 100개의 뉴클레오타이드 당 1개 이하의 단일 뉴클레오타이드 결실을 가진다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 추가로, 제 1 자유 핵산을 제 2 자유 핵산과 커플링시켜, 약 300개 내지 약 10,000개의 뉴클레오타이드 길이를 갖는 연장된 자유 핵산을 생성하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 추가로, 하나 이상의 추가의 자유 핵산을 상기 연장된 자유 핵산에 커플링시켜, 유전자를 생성하는 단계를 포함한다.
또한, 전술된 본 발명의 방법 중 임의의 하나에 의해 제조된 핵산 생성물이 제공된다. 또한, 전술된 본 발명의 방법 중 임의의 하나에 의해 합성된 핵산의 어레이가 제공된다. 또한, 전술된 본 발명의 방법 중 임의의 하나에 의해 합성된 복수개의 핵산을 포함하는 라이브러리가 제공된다. 또한, 약 300개 내지 약 10,000개의 뉴클레오타이드 길이를 갖는 복수개의 핵산을 포함하는 라이브러리가 제공되며, 이때 핵산은 각각, 전술된 본 발명의 방법 중 임의의 하나에 의해 합성된 조힙된 핵산 단편으로 구성된다. 상기 라이브러리의 몇몇 실시양태에서, 상기 복수개의 핵산은 유전자로 조립된다.
Claims (51)
- 하기 화학식 I의 구조를 갖는 화합물:
(I)
상기 식에서,
B는 핵염기 또는 이의 유사체이고, 아미딘 핵염기 보호기를 포함하며, 상기 보호기가 하기 구조로 기술되고:
상기 식에서,
R21 및 R22는, 각각 독립적으로, 알킬 또는 치환된 알킬이거나, R21 및 R22가 환형으로 연결되어, 치환되거나 비치환된 5원 또는 6원 헤테로환을 형성하고;
R1 및 R2는, 각각 독립적으로, 치환되거나 비치환된 선형, 분지형 또는 환형 알킬이거나, R1 및 R2가 함께, 5원, 6원, 7원 또는 8원 비-방향족 고리를 형성하고;
R3은 산-반응성(acid-labile) 보호기이고;
R은, 벤질 알코올 유도체, 알파-메틸 아릴 알코올 유도체, 나프탈렌 알코올 유도체, 이환형 지방족 알코올 유도체, S-에틸티오에이트 알코올 유도체 및 아미노산 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 기이되, R은 o-메틸 벤질이 아니다. - 제 1 항에 있어서,
B가 핵염기 또는 보호된 핵염기이고, 이때 상기 핵염기는 아데닌, 구아닌, 티민, 시토신 및 우라실로부터 선택되고;
R3이, DMT, MMT, TMT, 픽실 및 피발로일로부터 선택되는 기인, 화합물. - 제 1 항에 있어서,
R1 및 R2가, 각각 독립적으로, 치환되거나 비치환된 선형, 분지형 또는 환형 C1-C18 알킬인, 화합물. - 제 3 항에 있어서,
R1 및 R2가, 각각 독립적으로, 비치환된 선형 또는 분지형 C1-C6 알킬인, 화합물. - 제 4 항에 있어서,
하기 화학식 Ia의 구조를 갖는 화합물:
(Ia).
- 제 1 항에 있어서,
R1 및 R2가 함께, 5원 또는 6원 비-방향족 고리를 형성하고, 이때 상기 고리는 골격 내에 0 또는 1개의 헤테로원자를 갖는, 화합물. - 제 6 항에 있어서,
R1 및 R2가 함께, 골격 내에 0 헤테로원자를 갖는 5원 비-방향족 고리를 형성하는, 화합물. - 제 1 항에 있어서,
하기 화학식 Ib의 구조를 갖는 화합물:
(Ib)
상기 식에서,
R4는 각각 수소, 할로겐, C1-C6 알킬 및 C1-C6 알킬옥시로부터 선택된다. - 제 8 항에 있어서,
하기 화학식 Ic의 구조를 갖는 화합물:
(Ic).
- 제 8 항에 있어서,
하기 화학식 Id의 구조를 갖는 화합물:
(Id)
상기 식에서,
R7은, 각각 독립적으로, 수소, 할로겐, C1-C6 알킬 또는 C1-C6 알킬옥시이다. - 제 8 항에 있어서,
하기 화학식 If의 구조를 갖는 화합물:
(If)
상기 식에서,
R8은 지방족 기이다. - 제 1 항에 있어서,
R이, 하기 화학식 II의 구조를 갖는 벤질 알코올의 유도체인, 화합물:
(II)
상기 식에서.
Ra는 수소 또는 알킬이고;
R11은, 각각 독립적으로, 수소, 알킬, 알콕시, 알킬-S-, 시아노, 메틸시아노 또는 할로겐이고;
n은 1, 2 또는 3이다. - 제 12 항에 있어서,
R이, 하기로부터 선택되는 벤질 알코올의 유도체인, 화합물:
상기 식에서,
R6은, 각각 독립적으로, 수소, 할로겐, 시아노, 메틸시아노 및 하이드로카빌로부터 선택된다. - 제 12 항에 있어서,
R이, 하기 구조를 갖는 벤질 알코올의 유도체인, 화합물:
상기 식에서,
R7은, 각각 독립적으로, 수소, 할로겐, C1-C6 알킬, C1-C6 알킬옥시 및 전자-당김 기(electron withdrawing group)로부터 선택되는 하나 이상의 치환기이다. - 제 1 항에 있어서,
R이, 하기 화학식 III의 구조를 갖는 알파-메틸 아릴 알코올의 유도체인, 화합물:
(III)
상기 식에서,
X는 수소, 할로겐, 시아노, 메틸시아노 또는 트라이플루오로메틸이고;
Y는 수소, 알킬, 할로알킬 또는 알콕시알킬이고;
Ra는 수소 또는 알킬이다. - 제 15 항에 있어서,
R이, 하기로부터 선택되는 알파-메틸 아릴 알코올의 유도체인, 화합물:
상기 식에서,
R9는 할로겐, 시아노 또는 트라이플루오로메틸이고;
R10은 수소, 할로겐, C1-C6 알킬 및 C1-C6 알킬옥시로부터 선택된다. - 제 1 항에 있어서,
R이, 하기 화학식 IV의 구조를 갖는 나프탈렌 알코올의 유도체인, 화합물:
(IV)
상기 식에서,
R7은 수소, 할로겐, C1-C6 알킬 및 C1-C6 알킬옥시로부터 선택되고;
R5는 수소 및 하이드로카빌로부터 선택되고;
R12는 수소 및 알콕시로부터 선택된다. - 제 17 항에 있어서,
R이, 하기로부터 선택되는 나프탈렌 알코올의 유도체인, 화합물:
상기 식에서,
R13은 C1-C6 알킬이다. - 제 1 항에 있어서,
R이, 하기 화학식 V 또는 VI의 구조를 갖는 이환형 지방족 알코올의 유도체인, 화합물:
상기 식에서,
R14는 수소, 할로겐, C1-C6 알킬 및 C1-C6 알킬옥시로부터 선택되고;
R15 및 R16은, 각각 독립적으로, 수소, 시아노, 알콕시 또는 할로겐이고;
m은 1 또는 2이다. - 제 19 항에 있어서,
R이, 하기로부터 선택되는 이환형 지방족 알코올의 유도체인, 화합물:
상기 식에서,
R14는 수소, 할로겐, C1-C6 알킬 또는 C1-C6 알킬옥시이고;
R15는 수소, 할로겐 또는 C1-C6 알콕시이고;
R16은 수소, 시아노 또는 할로겐이다. - 제 1 항에 있어서,
R이이고, 이때 R7은 수소, 할로겐, 하이드로카빌 및 알킬옥시로부터 선택되는, 화합물.
- 제 1 항에 있어서,
R이로부터 선택되는, 화합물.
- 제 1 항에 있어서,
R이이고, 이때 R7은 수소, 할로겐, C1-C6 알킬 또는 C1-C6 알킬옥시인, 화합물.
- 제 1 항에 있어서,
R이이고, 이때 R8은 지방족 기인, 화합물.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제 1 항에 있어서,
R21 및 R22가 메틸인, 화합물. - 제 1 항에 있어서,
R21 및 R22가 환형으로 연결되어, 치환되거나 비치환된 5원 또는 6원 헤테로환을 형성하고, 이때 상기 헤테로환은 모폴린, 피페리딘 및 피롤리딘으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 화합물. - 제 1 항에 있어서,
상기 보호기가 하기 구조로 기술되는, 화합물:
.
- 제 1 항에 있어서,
B가 하기 구조 중 하나로 기술되는, 화합물:
.
- 제 31 항에 있어서,
R이이고, 이때 R7은 수소, 할로겐, 하이드로카빌 및 알킬옥시로부터 선택되는, 화합물.
- 화기 화학식 VII의 구조를 갖는 화합물:
(VII)
상기 식에서,
R1 및 R2는 각각 이소프로필이거나, R1 및 R2가 함께, 이들이 부착되는 N을 갖는 피롤리딘 헤테로환형 고리를 형성하고;
R3은 산-반응성 보호기이고;
R'는, 시아노에틸 기 및 메틸 기로부터 선택되는 기이고;
B는,
로부터 선택되는 보호된 핵염기이다. - (a) 비보호된 하이드록실 기를 갖는 뉴클레오사이드 잔부(residue)를 제공하는 단계; 및
(b) 상기 뉴클레오사이드 잔부를 제 1 항 내지 제 24 항 및 제 28 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항의 뉴클레오사이드 단량체와 접촉시켜, 상기 뉴클레오사이드 단량체를 상기 뉴클레오사이드 잔부에 공유 결합시키고, 폴리뉴클레오타이드를 생성하는 단계
를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드의 합성 방법. - 제 34 항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오타이드를 산화제에 노출시키는 단계를 추가로 포함하는 방법. - 제 34 항에 있어서,
핵산을 탈보호제에 노출시키는 단계를 추가로 포함하는 방법. - 제 34 항에 있어서,
상기 접촉을 1회 이상 반복하는 단계를 추가로 포함하는 방법. - 제 34 항에 있어서,
상기 뉴클레오사이드 잔부가 고형 지지체에 공유 결합된 것인, 방법. - 제 38 항에 있어서,
상기 고형 지지체로부터 핵산을 분할하여 자유 핵산을 생성하는 단계를 추가로 포함하는 방법. - 제 39 항에 있어서,
상기 핵산이, 200개 이상의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA인, 방법. - 제 40 항에 있어서,
상기 핵산이, 200개 내지 1,000개의 뉴클레오타이드 길이를 갖는 DNA인, 방법. - 제 41 항에 있어서,
상기 DNA가 300개 내지 500개의 뉴클레오타이드 길이를 갖는, 방법. - 제 40 항에 있어서,
상기 DNA가 100개의 뉴클레오타이드 당 1개 이하의 단일 뉴클레오타이드 결실(deletion)을 갖는, 방법. - 제 39 항에 있어서,
제 1 자유 핵산을 제 2 자유 핵산과 커플링시켜, 300개 내지 10,000개의 뉴클레오타이드 길이를 갖는 연장된 자유 핵산을 생성하는 단계를 추가로 포함하는 방법. - 제 39 항에 있어서,
하나 이상의 추가의 자유 핵산을 상기 연장된 자유 핵산에 커플링시켜 유전자를 생성하는 단계를 추가로 포함하는 방법. - 제 34 항에 따른 방법에 의해 제조된 핵산 생성물.
- 제 34 항에 따른 방법에 의해 합성된 핵산의 어레이.
- 제 34 항에 따른 방법에 의해 합성된 복수개의 핵산을 포함하는 라이브러리.
- 300개 내지 10,000개의 뉴클레오타이드 길이를 갖는 복수개의 핵산을 포함하는 라이브러리로서, 각각의 핵산이, 제 34 항에 따른 방법에 의해 합성된 조립된 핵산 단편으로 구성된, 라이브러리.
- 제 49 항에 있어서,
상기 복수개의 핵산이 유전자로 조립되는, 라이브러리. - 제 44 항에 따른 방법에 의해 제조된 핵산 생성물.
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