KR20130022437A

KR20130022437A - 광분해성 화합물을 사용한, 비특이적 증폭의 감소를 위한 신규한 ｐｃｒ 방법

Info

Publication number: KR20130022437A
Application number: KR1020110083581A
Authority: KR
Inventors: 지성민; 정성욱; 정선옥; 김준호
Original assignee: 삼성전자주식회사
Priority date: 2011-08-22
Filing date: 2011-08-22
Publication date: 2013-03-07
Also published as: US20130052690A1

Abstract

비특이적 증폭을 감소시키기 위해, 광분해성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 빛 조사에 의해 중합반응의 진행 여부를 제어할 수 있도록 하는 핵산 증폭 방법, 이에 사용되는 핵산 증폭용 조성물, 건조체, 키트 및 핵산 증폭 장치가 개시된다. 개시된 광분해성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 3'-OH 또는 3'-인산기에 광분해성 보호기가 부착되며, 전자기파 조사에 의해 탈보호되어 뉴클레오티드 사슬의 신장이 진행된다.

Description

광분해성 화합물을 사용한, 비특이적 증폭의 감소를 위한 신규한 ＰＣＲ 방법{Novel PCR method for reducing non-specific amplification using photolabile compound}

비특이적 핵산 증폭을 감소시키기 위한 핵산 증폭 방법, 이에 사용되는 핵산 증폭용 조성물, 건조체, 키트 및 장치에 관한 것이다. 또한, 광분해성 보호기가 결합된 신규한 뉴클레오티드 변이체 화합물에 관한 것이다.

샘플 중에 소량으로 존재하는 특정 핵산 부분을 증폭시키는 기술은 각종 유전 질환 및 감염성 질환의 분자진단검사, 재조합 DNA 기술에 사용되는 핵산의 대량 생성 및 클로닝, 서열 결정 등 생명공학 연구 분야에서 유용하게 사용된다. 공지된 핵산 증폭 기술로는 Roche Molecular Systems의 중합효소 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction, PCR), Becton Dickinson의 사슬 치환 증폭(Strand Displacement Amplification, SDA), Qiagen의 롤링 회전 증폭(Rolling Circle Amplification, RCA), 전사 또는 역전사를 기반으로 하는 Gen-Probe inc.의 전사 매개 증폭(Transcription Mediated Amplification, TMA) 및 bioMerieux의 핵산 서열 기반 증폭(nucleic acid sequence-based amplification, NABSA) 등이 있다. 일반적으로, 이와 같은 핵산 증폭 방법은 주형 사슬에 프라이머가 부착하는 어닐링 과정과, 증폭 기술 종류에 따라 달라질 수 있는 특이적 핵산 중합효소에 의한 프라이머의 후속적 연장 과정을 포함한다.

핵산 증폭 반응에 있어서 특이성(specificity)은 표적 핵산 서열에 결합하는 프라이머의 높은 어닐링 스트린전시(stringency)에 의해 결정되며, 어닐링 스트린전시는 어닐링 온도에 가장 크게 좌우된다. 일반적으로 어닐링 온도가 높으면 완전한 매치(match) 주형에 대한 특이적 어닐링 가능성이 높아지므로 증폭 특이성이 증대하고, 어닐링 온도가 낮으면 주형-프라이머간 미스매치에 대해 내성이 발생하여 비특이적 증폭이 증가한다. 유전자 증폭에 필요한 성분들은 핵산의 초기 변성 전에 실온에서 혼합되며, 열변성 온도 미만에서 핵산은 다양한 이차 구조를 형성할 수 있으므로 (예를 들면, 주형 핵산 가닥이 헤어핀 루프(hairpin loop)를 형성할 수 있는 서열을 포함하는 경우, 프라이머가 이합체(primer-dimer)를 형성하는 경우 등), 낮은 스트린전시의 미스프라이밍(mispriming)이 발생할 수 있다. 중합 효소는 실온 범위에서도 활성을 나타내므로, 변성 온도 미만에서의 이러한 미스프라이밍은 표적 서열 외의 비특이적 증폭을 증가시킨다. 비특이적 증폭 산물은 표적 유전자 검출의 정확도를 낮출 뿐만 아니라, 목적 산물에 대한 경쟁적인 저해제로서 작용하여 결과적으로 증폭 효율을 감소시키는 원인이 된다. 이는 특히, 낮은 사본수의 표적 DNA 검출, 미량 DNA 시료의 증폭, 여러 프라이머를 동시에 사용하는 멀티플렉스(multiplex) PCR을 수행하는데 있어서 큰 문제점으로 지적되어 왔다.

특허공개 US 2010/0209973 A1 (2010. 8.19), 초록 및 청구항 1

Sharkey, David J. 등, "Antibodies as Thermolabile Switches: High Temperature Triggering for the Polymerase Chain Reaction", Bio/Technology, vol. 12, 1994.5, 506-509 페이지

비특이적 핵산 증폭을 감소시키기 위해, 광분해성 보호기(photolabile protecting group)가 부착된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 광 조사에 의해 중합 반응을 제어하는 핵산 증폭 방법을 제공한다.

또한, 광분해성 보호기가 부착된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 핵산 증폭용 조성물을 제공한다.

또한, 광분해성 보호기가 부착된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 핵산 증폭용 키트 또는 건조체를 제공한다.

또한, 광투과성 시료 수용부 및 광 조사부를 구비한 핵산 증폭용 장치를 제공한다.

또한, 광분해성 보호기가 결합된 신규한 뉴클레오시드 포스포라미다이트 단량체를 제공한다.

일 양태에서는, 핵산의 비특이적 증폭을 감소시키기 위해, 3'-히드록시기가 광분해성 보호기(photolabile protecting group)로 보호된 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 프라이머쌍을 포함하는 핵산 증폭 반응물을 제공하는 단계, 및 상기 핵산 증폭 반응물에 광분해성 보호기를 제거할 수 있는 파장 영역의 전자기파를 조사하는 단계를 포함하는 핵산 증폭 방법을 제공한다.

상기 올리고뉴클레오티드 프라이머는 표적 핵산 서열과 상보적으로 결합할 프라이밍 서열(priming sequence)을 포함하고, 상기 프라이밍 서열 3'-말단 뉴클레오시드의 3'-히드록시기가 광 조사에 의해 제거가능한(photocleavable) 광분해성 보호기로 보호된 것일 수 있다.

본 명세서에서 용어 "프라이머(primer)"는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 천연 또는 합성 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 상기 프라이머는 주형에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건 (뉴클레오티드, 핵산 중합효소, 적절한 온도 및 pH 조건 등)하에서 합성의 개시점으로 작용한다.

광분해성 프라이머를 구성하는 핵산 단량체로는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체 또는 이들의 혼합물이 프라이머의 기능을 손상시키지 않는 범위에서 사용될 수 있다. 뉴클레오티드 유사체는 올리고뉴클레오티드 사슬에 삽입되었을 때, 천연 올리고뉴클레오티드 서열과 혼성화할 수 있도록, 천연 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드와 구조적 공통점을 갖는 화합물을 지칭한다. 이러한 유사체는 천연 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드의 염기, 리보오스, 포스포디에스테르 모이어티의 일부를 치환, 수식 또는 변형시킴으로써 유도된 화합물일 수 있다. 예를 들면, 퓨린 및 피리미딘 염기 중 하나 이상의 질소가 디메톡시트리틸, 벤질, 터트-부틸, 이소부틸 등에 의해 보호되거나, 리보오스의 2'-히드록시기가 할로겐 원자 또는 지방족 알킬기 등으로 치환되거나, 에테르와 같은 작용기에 의해 보호된 뉴클레오티드를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들면, 상기 프라이머를 구성하는 단량체는 dAMP, dGMP, dCMP, 및 dTMP와 같은 천연 데옥시뉴클레오티드(dNMP)이다. 또한, 증폭의 최대 효율을 위하여, 프라이머는 단일가닥일 수 있다.

용어 "표적 핵산(targeted nucleic acid)" 또는 "주형(template)"은 증폭의 대상이 되는 핵산을 지칭한다. 용어 "핵산(nucleic acid)"은 단일가닥 또는 이중가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드 중합체, 또는 이들의 조합을 의미하며, 천연 뉴클레오티드 및 합성 뉴클레오티드를 포함한다. 따라서, 본 양태의 핵산 증폭 방법의 증폭 대상은 원핵세포 핵산, 진핵세포 핵산, 바이러스 핵산, 또는 비로이드 핵산과 같은 천연 유래 핵산 분자, 공지된 핵산 유사체 또는 화학적으로 합성가능한 핵산 분자를 포함할 수 있다.

본 양태에서, 상기 표적 또는 주형 핵산은 mRNA로부터 유래된 서열일 수 있으며, 이 경우, mRNA의 역전사 반응에 의해 합성된 cDNA를 주형으로 사용하여 증폭 반응을 수행할 수 있다. 역전사를 위해 주형 mRNA의 폴리 A 테일(poly A tail)에 혼성화되는 올리고뉴클레오티드 dT 프라이머가 이용된다. 올리고뉴클레오티드 dT 프라이머는 dTMP로 구성되며, dT 프라이머가 프라이머로 작용할 수 있는 한도 내에서 dTMP 중 하나 이상은 다른 dNMP로 대체될 수 있다. 역전사는 RNase H 활성을 갖는 역전사 효소에 의해 이루어질 수 있다.

본 양태에서, 상기 표적 또는 주형 핵산은 이중가닥 또는 단일가닥일 수 있다. 주형이 이중가닥 핵산인 경우, 이를 단일가닥 또는 부분적인 단일가닥 형태로 분리시키는 변성(denaturation) 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 변성 방법은 열, 알칼리, 포름아미드, 우레아, 및 글리콕살의 처리, 효소적 방법 (예를 들면, 헬리카아제의 적용) 및 결합 단백질 사용법 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들면, 이중가닥의 분리는 약 80 내지 약 105 ℃의 온도로 열처리하는 열변성 방법에 의해 수행될 수 있다.

본 양태에서 사용되는 올리고뉴클레오티드 프라이머는 표적 핵산 분자의 어느 한 위치에 상보적인 뉴클레오티드 서열, 즉 프라이밍 서열을 갖는다. 용어 "상보적인(complementary)"은 본 명세서에서 "실질적으로 상보적인(substantially complementary)"의 의미로서 사용되며, 이는 소정의 어닐링 조건 하에서 프라이머가 주형 또는 표적 핵산 서열에 선택적으로 혼성화(hybidization)할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미한다. 따라서, 상기 프라이머는 프라이머로서의 작용을 할 수 있는 범위 내에서, 주형에 대한 하나 또는 그 이상의 미스매치(mismatch)를 가질 수 있는 것으로 이해될 것이다. 특히, 프라이머의 5'-말단은 표적 서열에 대한 어닐링의 특이성을 결정하는데 비교적 영향을 적게 미치므로, 주형에 대하여 비상보적인 추가적인 서열, 예를 들면 제한 효소 위치 및 프로모터 서열을 갖도록 변형될 수 있다 (McPherson and Moller, 2000). 일 구체예에서, 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머는 주형의 특정한 위치에 완전히 상보적인, 즉 미스매치되는 염기서열이 없는 뉴클레오티드 서열을 갖는다.

용어 "프라이밍(priming)" 또는 "어닐링(annealing)"은 주형 핵산에 올리고 뉴클레오티드 또는 프라이머가 상보적으로 병치되는 것을 의미하며, 중합효소가 프라이머의 말단로부터 뉴클레오티드를 중합시켜 주형 또는 그의 일부분에 상보적인 서열을 갖는 핵산 분자를 생성하도록 하는 전제 조건이 된다. 따라서, 본 양태에 있어서 사용되는 용어 "프라이밍 서열(priming sequence)"은 프라이머의 신장 후에 표적 핵산만이 생성되도록 특이성을 부여하기에 충분한 길이를 갖는, 표적 핵산 서열에 대해 실질적으로 상보적인 서열을 의미한다.

상기 올리고뉴클레오티드 프라이머의 길이는 중합효소의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 개시시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 하며, 온도, 주형 핵산 서열, 응용 분야, 프라이머의 소스(source)와 같은 다수의 인자에 따라 당업자에 의해 선택될 수 있다. 특히, 본 양태에서 사용되는 프라이머의 길이는, 어닐링의 온도 조건 및 주형에 혼성화하는데 필요한 특이성을 부여하는 뉴클레오티드 수를 고려하여 결정할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 프라이머를 구성하는 뉴클레오티드의 수가 많을수록 표적 서열에 대한 특이성이 높으며, 주형에 대한 프라이머의 어닐링 온도가 증가한다. 일 구체예에서, 프라이밍 서열의 길이는 최소 6 뉴클레오티드이며, 이 길이는 프라이머 어닐링에 있어서 최소 길이 요건으로 판단된다. 전체 프라이머의 길이는 12 내지 100 뉴클레오티드일 수 있고, 예를 들면, 15 내지 40 뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 "광분해성 보호기(photolabile/photocleavable protecting group)"는 빛의 조사 또는 노광에 의해 제거되기 전까지 반응성 있는 작용기에 부착되어, 원하지 않는 반응으로부터 상기 작용기를 보호하는 화학적 모이어티를 의미한다. 상기 보호되는 작용기는 예를 들면, 히드록시기일 수 있으며, 이 경우 광분해성 보호기는 광 조사에 의해 제거가능한 히드록시기 보호기일 수 있다. 본 양태에서, 광분해성 보호기는 프라이머 3' 말단 부위 뉴클레오시드의 3'-히드록시기에 부착되어 빛의 조사 전까지 다른 뉴클레오티드 단량체와의 중합 반응을 차단시키는 기능을 수행한다.

또한, 용어 "광분해성 화합물(photolabile/photocleavable compound)"은 상기 광분해성 보호기가 부착된 화합물, 예를 들면, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 단량체, 올리고뉴클레오티드 등을 총칭하는 것으로 이해된다. 본 명세서에서, "광분해성 화합물"은 일반적으로 리보오스 또는 데옥시리보오스의 3번 탄소 위치에 결합된 히드록시기에 광분해성 보호기가 부착 또는 결합된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 단량체 및 올리고뉴클레오티드를 의미하며, 특히, "광분해성 프라이머(photolabile/photocleavable primer)"는 3' 말단 부위 뉴클레오티드의 3'-OH가 광분해성 보호기로 보호된, 올리고뉴클레오티드 프라이머를 지칭한다. 광분해성 보호기가 제거(또는 절단)되어 반응성 있는 작용기가 노출되고 화학반응이 일어날 수 있는 상태로 전환되는 것을 "탈보호(deprotection)"라 지칭한다. 본 명세서에서, 탈보호는 프라이머로부터 광분해성 보호기가 해리되어 3'-히드록시기가 복원됨으로써 중합반응이 진행될 수 있도록 프라이머가 활성화되는 것을 의미한다. 탈보호 반응은 상기 작용기를 포함하는 분자에 손상 또는 변화를 야기하지 않는 일정한 조건 하에서 수행될 수 있다.

본 양태에서 사용되는 광분해성 보호기는, 핵산 중합 반응이 수행되는 조건, 예를 들면 PCR의 경우 열변성(denaturation) 온도 범위에서 물리화학적으로 안정한 모이어티일 수 있다. 또한, 상기 보호기는 적절한 파장대의 빛이 조사되면, 중합 반응의 정확한 제어를 위해 비교적 짧은 시간, 예를 들면, 수 초 내지 수 분 이내에 광분해반응에 의해 제거가능한 것일 수 있다. 또한, 상기 광분해성 보호기는 프라이머로부터 절단된 후, 반응성이 높은 분해 산물, 또는 분석 데이터에 백그라운드(background)를 유발할 수 있는 부산물을 생성하지 않는 것이 바람직하다.

상기 조건들을 충족하는 임의의 광분해성 보호기가 광분해성 올리고뉴클레오티드 프라이머의 제조에 사용될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 광분해성 보호기는 2-니트로벤질 유도체 (G. Ciamician and P. Silber, Chem . Ber . 1901, 34, 2040) 또는 o-니트로벤질옥시 유도체와 같은 니트로 방향족 화합물, 벤조인 유도체 (M. C. Pirrung and L. Fallon, J. Org. Chem. 1998, 63, 241) 또는 벤질 술포닐 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서 사용될 수 있는 니트로 방향족 화합물은 예를 들면, NVOC (6-니트로베라트릴옥시카르보닐(6-nitroveratryloxycarbonyl), NBOC (2-니트로벤질옥시카르보닐), MeNPOC(2-(3,4-메틸렌디옥시-2-니트로페닐)옥시카르보닐), NPPOC (2-(2-니트로페닐)프로필옥시카르보닐), NPES(2-(2-니트로페닐)에틸술포닐), NPPS (2-(2-니트로페닐)프로필술포닐), MeNPPOC(2-(3,4-메틸렌디옥시-2-니트로페닐)프로필옥시카르보닐), PhNPPOC (2-(5-페닐-2-니트로페닐)-프로필옥시카르보닐), NBTEOC (o-니트로벤질티오에틸옥시카르보닐), NPAC (o-니트로페닐아미노카르보닐), NPOC (o-니트로페녹시카르보닐), MeNMOC (α-메틸-8-니트로나프틸메톡시카르보닐), o-니트로페닐티오에틸옥시카르보닐 또는 DDZ(α,α-디메틸디메톡시벤질옥시카르보닐)를 포함한다. 또다른 구체예에서, 상기 광분해성 보호기는 니트로 방향족 화합물 외에, PYMOC (1-파이레닐메틸옥시카르보닐), ANMOC (안트라세닐-메틸옥시카르보닐), DMT (디메톡시트리릴) 등일 수 있다.

이러한 광분해성 보호기를 뉴클레오티드의 3'-OH 위치에 도입하는 방법은 예를 들면, M. Beier 등에 의한, Helv Chim Acta 2001, 84, 2089에 개시된 방법 등을 참조할 수 있다. 상기 문헌들에 개시된 내용은 참조에 의해 본 명세서에 전체로서 포함된다.

예를 들면, 본 양태에서 사용되는 광분해성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 3'-OH가 광분해성 보호기로 보호된 뉴클레오시드 단량체를 프라이밍 서열을 포함하는 신생 올리고뉴클레오티드와 축합시켜 통상의 올리고뉴클레오티드 합성 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 중합 반응은 당업계에 공지된 포스포라미다이트 화학 반응에 의해 수행될 수 있다. 이러한 경우, 광분해성 보호기로 보호된 뉴클레오시드 단량체는 5'-포스포라미다이트 뉴클레오시드 단량체로서, 신생 올리고뉴클레오티드의 3'-말단히드록시기가 상기 5'-포스포라미다이트 단량체의 디알킬아민기를 치환함으로써 5'-> 3' 방향으로의 축합 반응이 이루어진다 (도 2).

상기 광분해성 올리고뉴클레오티드 프라이머의 합성은 용액 또는 고체 기판 상에서 이루어질 수 있다. 용액 중에서 이루어지는 경우, 신생 올리고뉴클레오티드는 약 0.001 M 내지 1.0 M의 농도로 존재하며, 3'-OH가 보호된 뉴클레오시드 단량체는 상기 올리고뉴클레오티드에 대해 약 1.1 내지 약 2 당량의 농도로 존재할 수 있다. 합성이 고체 기판 상에서 이루어지는 경우, 고체 기판과 신생 올리고뉴클레오티드를 연결하는 링커가 이용될 수 있으며, 합성이 종결되었을 때 표준 방법, 예를 들면 수산화암모늄 농축 용액으로 0.5 내지 16시간 동안 처리하여, 고체 지지체로부터 분리시킬 수 있다. 추가적으로, 생성된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이온교환 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 및 적절한 용매 중에서의 침전 등 하나 이상의 방법에 따라 공지된 방법으로 정제할 수 있다.

일 구체예에서, 본 양태에 따른 핵산 증폭 방법에 사용되는 광분해성 올리고뉴클레오티드 프라이머의 3'-말단 부위 뉴클레오시드는 하기 화학식 1로 표시될 수 있다:

식 중,

상기 B는 아데닌, 시토신, 구아닌, 티민, 우라실, 또는 변형된 핵산 염기이고,

상기 R은 수소, 할로겐, 하이드록실기, -OR₁ 또는 -SR₁일 수 있고, 상기 R₁은 C₁-C₆알킬, C₂-C₆알케닐, 아세탈, 또는 실릴에테르일 수 있으며,

상기 PL은 본 명세서에서 정의된 바와 같은 광분해성 보호기(photolabile protecting group)를 나타낸다.

상기 화학식 1에서, B는 핵산을 구성하는 피리미딘 또는 퓨린 염기로서, 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민 및 우라실과 같은 천연 핵산 염기 및 이들을 변형체를 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 B는 표적 서열이 데옥시리보뉴클레오티드 사슬인 경우 아데닌, 시토신, 구아닌 및 티민으로 이루어진 군에서 선택될 수 있고, 표적 서열이 리보뉴클레오티드 사슬인 경우 아데닌, 시토신, 구아닌 및 우라실로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 또다른 구체예에서, 상기 B는 표적 핵산 서열과 상보적인 염기쌍을 형성할 수 있는, 아데닌, 시토신, 구아닌, 티민, 또는 우라실의 변형체일 수 있다. 이러한 변형체의 예는 7-데아자구아니딘, 7-데아자-8-아자구아니딘, 5-프로피닐시토신, 5-프로피닐우라실, 7-데아자아제닌, 7-데아자-8-아자아데닌, 7-데아자7-옥소퓨린, 6-옥소퓨린, 3-데아자아데노신, 2-옥소-5-메틸피라미딘, 4-옥소-5-메틸피리미딘, 2-아미노퓨린, 5-플루오로우라실, 2,6-디아미노퓨린, 8-아미노퓨린, 4-트리아졸로-5-메틸티민, 4-트리아졸로-5-메틸우라실, 하이포잔틴, 5-메틸시토신, 또는 5-아미노-4-이미다졸카르복시산아미드 등을 포함하나 이에 제한되지 않으며, 공지된 임의의 다른 핵산 염기 변형체가 사용될 수 있다.

상기 핵산 염기는 유리된 형태 또는 적절한 보호기에 의해 보호된 형태일 수 있다. 특히 일차 아미노기를 갖는 피리미딘 또는 퓨린 염기 (예를 들면, 아데닌, 시토신 및 구아닌)의 경우, 예를 들면, 카르보닐을 포함한 보호기에 의해 보호된 형태일 수 있다. 상기 카르보닐 보호기는 페녹시아세틸 또는 디메틸 포름아미디노(foramidino) 라디칼 등을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 또한, 특정한 염기에 대해 특이적인 보호기가 사용될 수 있다. 예를 들면, 아데닌의 경우 벤조일 또는 p-니트로페닐 에톡시 카르보닐(p-NPEOC) 라디칼이 사용될 수 있고, 구아닌의 경우 p-NPEOC 라디칼, 이소부티로일(isobutyroyl) 또는 p-니트로페닐에틸(p-NPE) 보호기가 사용될 수 있으며, 시토신의 경우 p-NPEOC 라디칼, 벤조일 또는 에소부티로일 보호기가 사용될 수 있다.

상기 R은 수소, 할로겐, 하이드록실기, 및 하이드록실 또는 티올의 보호된 형태(-OR₁ 또는 -SR₁)로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. R이 -OR₁ 또는 -SR₁인 경우, 상기 R₁은 뉴클레오티드 화합물에서 통상적으로 사용되는 히드록시기 또는 티올 보호기를 나타낸다. 일 구체예에서, R₁은 알킬, 알케닐, 아세탈 또는 살릴에테르로부터 선택된 보호기로서, 보다 구체적으로는 C₁-C₆알킬, C₂-C₆알케닐, 아세탈, 또는 실릴에테르일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "알킬"은 일반적으로 탄소수 1 내지 20의, 선형 또는 분지형의 비고리형 1가 포화 탄화수소 라디칼을 의미하며, 예를 들면, C₁-C₈ 알킬일 수 있다. 용어 "알케닐"은 하나 이상의 탄소-탄소 이중결합을 포함하는 불포화 탄화수소 라디칼로서, 선형, 분지형 사슬 또는 고리형의 라디칼을 포함하며, 예를 들면, C₂-C₈ 알케닐일 수 있다. 예를 들면, 본 양태에 있어서 상기 R은 O-메틸 라디칼, O-에틸 라디칼, O-알릴 라디칼, O-테트라히드로피라닐, O-메톡시테트라하이드로피라닐 라디칼 및 O-t-부틸디메틸실릴 라디칼로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.

본 양태에 따른 핵산 증폭 방법에서, "핵산 증폭 반응물"은 핵산 증폭에 필수적인 성분, 즉 프라이머, 핵산 중합효소 및 반응 기질(NTP)을 포함하는 조성물을 지칭한다. 상기 프라이머, 중합효소 및 NTP의 종류 및 함량은 증폭되는 주형 핵산의 종류, 길이, 증폭 기술, 목적 등에 따라 당업자가 적절하게 선택할 수 있다. 본 양태의 핵산 증폭 방법에서, 상기 핵산 증폭 반응물은 앞에서 정의된 광분해성 올리고뉴클레오티드 프라이머가 사용되는 점을 제외하고는, 통상의 핵산 증폭 반응에 사용되는 반응혼합물과 마찬가지의 조성을 가질 수 있다.

본 양태에 따른 핵산 증폭 방법은 광분해성 프라이머를 포함하는 상기 핵산 증폭 반응물에, 광분해성 보호기를 제거할 수 있는 파장대의 전자기파를 조사하는 단계를 포함한다.

전자기파의 조사는 올리고뉴클레오티드 프라이머의 3'-말단을 탈보호시킴으로써 중합 반응을 개시하는 기능을 수행한다. 광분해성 보호기의 흡수 파장에 해당하는 전자기파가 조사되면, 광분해반응에 의해 프라이머의 보호기가 제거되어 활성 작용기인 3'-OH가 복원되며, 뉴클레오티드 합성이 개시될 수 있는 상태가 된다 (도 1). 종래의 핵산 증폭 기술에서, 중합 반응의 제어는 반응계 온도 조절에 따른 물리적 성상, 화학적 반응성, 효소 활성의 변화 등에 의존하여 정확한 제어가 어려운 문제가 있었다. 본 양태에 따른 핵산 증폭 방법은 광분해성 프라이머가 포함된 핵산 증폭 반응물에 조작자가 원하는 임의의 시점에 빛을 조사함으로써 온도 또는 중합효소의 활성화 여부와 무관하게 중합반응 진행 여부를 결정할 수 있으며, 증폭 조건의 보다 정밀한 제어가 가능하도록 한다.

광 조사에 의해 프라이머를 활성화하여 중합반응을 제어하는 기술은 중합 조건의 최적화가 요구되는 다양한 영역에서 광범위하게 응용될 수 있다. 예를 들면, 본 양태에 따른 핵산 증폭 방법은 비특이적 증폭 산물을 감소시키기 위한 목적으로 사용될 수 있다. 일 구체예에서, 광분해성 프라이머를 포함하는 증폭 반응물에, 표적 핵산 서열과 높은 스트린전시의 어닐링을 달성하는 조건 (예를 들면, 고온 조건)에서 전자기파를 조사하여, 미스프라이밍에 기인한 비특이적 핵산 증폭을 현저하게 감소시킬 수 있다. 이는 특히 비특이적 증폭이 문제되는 멀티플렉스 PCR, 또는 핵산 서열의 길이가 길거나 GC 함량이 높은 경우 유용할 수 있다.

또다른 구체예에서, 상기 핵산 증폭 방법은 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 수행될 수 있으며, 비특이적 증폭 산물의 억제 목적으로 반응계가 일정한 온도 이상에 도달한 후 전자기파를 조사하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 전자기파 조사는 반응계가 주형의 열변성 온도에 도달한 후에 실시될 수 있다. PCR에서 DNA 중합효소는 실온에서도 활성을 가지므로, 가온 전이라도 중합에 필요한 필수 성분들이 혼합되면 증폭 반응이 이루어질 수 있다. 따라서, 가열 전 혼합 단계에서 프라이머의 이합체(dimmer) 또는 주형 핵산의 2차 구조(hairpin loop 등) 형성 등에 기인한 비특이적 어닐링 및 그에 기인한 부차적 증폭산물의 생성이 문제되었다. 그러나, 본 구체예에서는 빛을 조사하기 전까지는 프라이머가 불활성 상태이므로 증폭이 일어나지 않으며, 열변성에 의해 DNA 이중나선이 분리된 후 빛을 조사함으로써 비특이적 어닐링 및 증폭 산물을 감소시키는데 기여할 수 있다. 본 발명자들은 광분해성 프라이머를 사용하여 PCR 반응물을 제조하고, PCR 열주기를 개시하기 전 반응계 온도를 상승시킨 상태에서 빛 조사를 실시한 결과, 광분해성 보호기가 부착되지 않은 일반 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 경우에 비하여 증폭의 특이도가 크게 향상된 것을 확인하였다 (실시예 3).

이와 같은 빛 조사에 의한 증폭반응의 용이한 제어는 프라이머의 간단한 화학적 수식에 의한 것으로, 본 양태에서 광분해성 보호기는 본래의 필수 구성 요소인 프라이머 자체에 결합되므로 반응물의 안정성에 영향을 미치지 않는다. 또한, 비특이적 증폭을 억제하기 위한 효소, 항체 및 기타 화학적 첨가 물질 (차단막으로 사용되는 오일, 왁스, 또는 촉진제 목적의 여러 유기 용매 (PEG, DMSO, 글리세롤 등))이 요구되지 않으므로, 핵산 증폭에 사용되는 반응물, 장치 및 공정의 제작 과정이 간단하다. 또한, 첨가 물질의 양, 첨가 시기의 미차에 따른 재현성 문제, 첨가 물질에 기인한 백그라운드 (비-DNA-함유 밴드), 불순물 처리 등의 문제가 발생하지 않아, 검출 및 분석 효율이 개선된다.

본 양태에서, 조사되는 전자기파의 파장은 광분해성 보호기의 흡수 파장에 따라 당업자에 의해 결정되며, 핵산 분자의 안정성을 고려하여 약 300 nm 내지 약 450 nm 파장 영역, 예를 들면, 자외/가시광(UV/VIS) 영역에서 선택될 수 있다. 일 구체예에서, 광분해성 프라이머의 탈보호에 사용되는 전자기파의 파장은 약 330 nm 내지 약 400 nm의 범위일 수 있다. 예를 들면, 사용되는 광분해성 보호기가 MeNPOC (2-(3,4-메틸렌디옥시-2-니트로페닐)옥시카르보닐), NPPOC (2-(2-니트로페닐)프로필옥시카르보닐), NPES(2-(2-니트로페닐)에틸술포닐), NPPS(2-(2-니트로페닐)프로필술포닐), MeNPPOC (2-(3,4-메틸렌디옥시-2-니트로페닐)프로필옥시카르보닐), PhNPPOC (2-(5-페닐l-2-니트로페닐)-프로필옥시카르보닐), DMBOC (디메톡시벤조이닐옥시카르보닐), 또는 DMT (디메틸트리틸)인 경우, 약 340 nm 내지 약 380 nm의 파장을 갖는 전자기파를 조사하여 프라이머를 탈보호시킬 수 있다.

상기 전자기파의 조사 또는 노광은 광분해성 보호기를 제거할 수 있는 파장의 빛을 방사하는 임의의 광원을 사용하여 수행될 수 있다. 상기 광원은 예를 들면, 고압 수은 램프(high pressure mercury lamp), 초고압 수은 램프, 메탈 할라이드(metal halide) 램프, 할로겐 램프, 갈륨(gallium) 램프, 제논(xenon) 램프, 백열 램프(incandescent source), 레이저, 또는 레이저 다이오드 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일 구체예에서, 전자기파 조사는 예를 들면, I-line (약 365 nm 파장)을 방사하는 고압 수은 램프를 사용하여 수행될 수 있다.

평행 광원(collimated light source)을 사용하지 않는 경우, 빛의 분산을 방지하기 위해 다중층 또는 두꺼운 층의 마스크를 사용할 수 있다. 또한 필요한 경우, 하나 이상의 차단 필터를 사용하여 목적 파장대의 상한 및 하한을 벗어나는 전자기파를 차단시킬 수 있다. 예를 들면 Pyrex^?필터 등을 사용하여, 핵산 염기를 손상시킬 수 있는 300 nm 미만의 단파장대의 빛을 차단할 수 있다.

상기 빛의 조사는 통상적으로 광분해 매질로서, 수성 용매, 알코올성 용매, 수-알코올 혼합 용매 또는 수-유기성 혼합 용매와 같은, 히드록시 용매(hydroxylic solvent) 또는 프로톤성 용매(protic solvent)의 존재 하에서 수행될 수 있다. 상기 광분해 매질은 선택적으로, 과산화수소와 같은, 친핵성 소거기(scavenger)를 포함할 수 있다. 또한, 통상적으로 광분해반응은 중성 또는 염기성의 pH 조건에서 수행될 수 있다. 이와 같이, 광분해성 프라이머 또는 이를 포함하는 핵산 증폭용 반응혼합물에 빛을 조사하거나 노광시켜 보호기를 제거하는 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려진 통상의 광분해 탈보호 기법을 사용하여 수행될 수 있다.

본 양태에서, 전자기파 조사는 목적 달성에 적합한 임의의 시점에 이루어질 수 있다. 예를 들면, 전자기파 조사는 핵산 증폭을 수행하기 위한 필수 성분인 주형 핵산, 프라이머, 중합 효소 및 반응기질(NTP)이 혼합되어 중합 반응의 진행이 가능하게 된 이후이면 어느 때나 수행될 수 있다. 조사 횟수는 1회 또는 복수회일 수 있으며, 규칙적 또는 불규칙적으로 이루어질 수 있다.

전자기파 조사 시간은 광분해성 보호기의 분해 반감기, 흡수 파장, 광원, 용매, 반응물 농도 등을 고려하여 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 양태의 핵산 증폭 방법에서, 예를 들면, 광분해 반감기가 수 초 내지 수 분인 보호기가 사용될 수 있으며, 전자기파 조사 시간은 예를 들면 약 10초 내지 약 10분 범위일 수 있다. 일 구체예에서, 핵산 증폭은 PCR에 의해 수행될 수 있으며, 증폭 효율을 증대시키기 위해 광분해반응 반감기가 약 1분 이내인 광분해성 보호기, 예를 들면, MeNPOC, PYMOC, ANMOC 등이 사용될 수 있다. 이러한 경우 약 15분 내지 약 40분의 사전 열처리 시간이 요구되는 종래의 핫스타트 PCR에 비해 증폭 속도를 향상시킬 수 있으며, 증폭 시간 지연으로 인한 불필요한 부산물의 생성을 억제할 수 있다.

본 양태에 따른 핵산 증폭 방법은 프라이머가 관여하는, 당업계에 공지된 다양한 핵산 증폭 기법에 적용될 수 있다. 상기 기법은 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR), 리가아제 연쇄 반응, 중합효소 리가아제 연쇄 반응, Gap-LCR (WO90/01069), 교정 연쇄 반응, 3SR (Kwoh 등, PNAS, 미국, 86:1173(1989)) 및 NASBA (US 5130238) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들면, 본 양태에서 핵산 증폭은 PCR에 의해 실시될 수 있다. 상기 PCR 방법은 예를 들면, Allele-specific PCR, Assembly PCR, Asymmetric PCR, Colony PCR, Emulsion PCR, Fast PCR, Gap Extension Ligation PCR (GEXL-PCR), Helicase-dependent amplification, Hot-start PCR, Intersequence-specific (ISSR) PCR, Inverse PCR, Ligation-mediated PCR, Linear-After-The-Exponential PCR (LATE-PCR), Methylation-specific PCR (MSP), Multiplex Ligation -dependent Probe Amplification (MLPA), Multiplex PCR, Nested PCR, Overlap-extension PCR, PAN-AC, Quantitative PCR (Q-PCR), Quantitative real-time PCR (QRT-PCR), Real-Time PCR, Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE PCR), Single molecule amplification PCR (SMA PCR), Thermal assymetric interlaced PCR (TAIL-PCR), Touch down PCR, Single molecule amplification PCR (SMA PCR) 또는 역전사 PCR (RT-PCR) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

일 구체예에서, 상기 핵산 증폭 방법은 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 수행되며, 상기 방법은,

3'-히드록시기가 광분해성 보호기로 보호된 올리고뉴클레오티드 프라이머(쌍)을 포함하는 PCR 반응물을 제공하는 단계;

상기 프라이머로부터 광분해성 보호기를 제거하기에 적합한 파장의 전자기 조사(electromagnetic irradiation)를 수행하는 단계;

주형 DNA를 변성(denaturation)시키는 단계;

프라이머를 상기 주형 DNA에 혼성화(annealing)시키는 단계; 및

혼성화된 프라이머를 연장(elongation)시키는 단계를 포함할 수 있다.

상기 용어 "PCR 반응물"은 PCR에 의한 중합 반응의 진행에 필수적인 구성 성분, 즉, 주형 핵산, DNA 중합효소, 프라이머(쌍), Mg² ⁺ 및 dNTP를 포함하는 핵산 증폭용 반응물을 지칭한다. 상기 반응물은 모든 성분들을 동시에 혼합하여 제조된 형태이거나, 또는 일부 성분만이 사전 혼합되고 나머지 성분들은 후속적으로 첨가되는 형태로 제조될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 경우, 상기 PCR 반응물은 3'-OH가 광분해성 보호기로 보호된 올리고뉴클레오티드 프라이머(쌍)가 사용된다는 점을 제외하고는 통상적으로 사용되는 PCR 반응물과 마찬가지의 조성을 갖는다. 상기 필수 성분 및 기타 첨가 물질의 구체적인 종류 및 함량은 반응의 목적에 따라 당업자에 의해 적절하게 구성될 수 있다.

상기 전자기파 조사 단계는 상기 광분해성 프라이머로부터 광분해성 보호기를 절단시키기에 적합한 파장의 전자기파를 조사하여 3'-말단을 탈보호시키는 단계를 포함한다. 상기 조사되는 전자기파의 파장은 사용되는 광분해성 보호기의 흡수 파장에 따라 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 상기 파장은 핵산 염기의 안정성 등을 고려하여, UV/VIS 영역, 또는 약 300 nm 내지 약 450 nm, 예를 들면 약 340 nm 내지 약 380 nm의 범위에서 선택될 수 있다. 조사 시간은 광분해성 보호기의 종류, 광원, 용매, 기질 농도 등을 고려하여 당업자가 적절하게 조절할 수 있다. PCR의 경우, 증폭 속도를 증대시키기 위해, 광분해반응의 반감기가 비교적 짧은 보호기를 사용하여 전자기 조사 시간을 단축시킬 수 있다.

전자기파 조사는 약 30 ℃ 내지 약 100 ℃의 온도 범위에서 수행될 수 있으며, 상기 온도는 빛 조사 시기, 주형의 길이, 특이도 수준 등에 따라 가변적일 수 있다. 일 구체예에서, 전자기파 조사는 약 30 ℃ 내지 약 60 ℃의 가온 조건에서 실시될 수 있다. 또다른 구체예에서, 상기 전자기파 조사는 DNA 이중가닥의 분리를 위한 초기 열변성 과정을 거친 후에, 약 90 ℃ 내지 약 97 ℃의 고온에서 이루어질 수 있다.

상기 변성 단계는 열, 초음파 등 주형 DNA의 이중나선을 분리시키기 위한 임의의 수단을 이용하여 수행될 수 있다. 일 구체예에서, DNA의 변성은 PCR 반응물을 예정된 온도까지 가열시키는 열변성에 의해 수행된다. 변성 온도는 DNA의 길이 및 구아닌/시토신 함량에 따라, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 온도가 높을수록 단일가닥으로의 분리가 잘 이행되지만 특정 온도 이상에서는 중합효소의 활성이 저하될 수 있으므로, 상기 변성 온도는 중합효소로서 Taq DNA 폴리머라제를 사용하는 경우, 예를 들면, 약 90 ℃ 내지 약 97 ℃ 범위일 수 있다. 열변성-어닐링-연장으로 이루어지는 일련의 PCR 열주기가 시작되기 전에, 소정의 시간, 예를 들면 수 초 내지 수 분의 10분의 초기 열변성 단계를 거칠 수 있다. 열주기 중에 반복되는 열변성 단계는 이보다 짧은 시간, 예를 들면, 약 1초 내지 약 30초에 걸쳐 수행될 수 있다.

본 구체예에서, 상기 전자기파 조사는 상기 초기 열변성 단계와 동시에, 또는 열변성 단계와 별도로 수행될 수 있다. 별도로 수행되는 경우, 전자기파 조사는 가열 전 또는 열변성 온도에 도달한 후 모두 가능하다. 다만, 비특이적 증폭 산물의 생성을 감소시킬 목적으로 저온에서 중합 반응이 진행되는 것을 방지할 필요가 있는 경우, 전자기파 조사는 초기 열변성 단계를 거친 후, 또는 적어도 상기 열변성 단계와 동시에 수행될 수 있다. 열변성 단계가 수행되는 고온 조건에서는 표적 서열과의 미스프라이밍, 주형 DNA의 2차 구조 형성, 프라이머 이합체(dimer)화 등이 현저하게 감소하므로, 비특이적 증폭이 발생할 확률이 낮아진다.

상기 혼성화 또는 어닐링 단계는 올리고뉴클레오티드 프라이머가 주형의 일부분에 혼성화되어 이중가닥을 형성하기에 적합한 조건 하에서 실시될 수 있다. 온도, 시간과 같은 어닐링 조건은 프라이머의 염기 서열 (GC 함량), 녹는점(T_m) 및 길이를 고려하여 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 일 구체예에서, 어닐링 단계는 약 50 ℃ 내지 약 72 ℃, 예를 들면 약 55 ℃ 내지 약 62 ℃의 온도에서 실시될 수 있다. 어닐링 온도가 높을수록 표적 서열과 완전한 매치를 갖는 특이적 혼성화 비율이 증가하므로, 비특이적 증폭을 감소시킬 목적으로 표적 핵산 서열과 프라이머 간의 미스매치를 감소시키는 높은 스트린전시 조건(고온 조건)이 선택될 수 있다.

상기 프라이머의 연장 단계에서, 온도 및 시간은 DNA 중합 효소의 활성 온도, 주형 DNA의 농도, 증폭 단편의 크기 등에 따라 당업자가 적절하게 선택할 수 있다. 예를 들면, 열안정성 Taq DNA 폴리머라아제를 사용하는 경우, 연장 단계는 상기 효소의 최적 활성 온도인 약 68 ℃ 내지 약 75 ℃, 예를 들면 약 72 ℃에서 약 30초 내지 약 1분에 걸쳐 수행될 수 있으며, PCR 산물의 크기나 반응 성분의 농도가 낮은 경우 시간을 증가시킬 수 있다. 또한, 마지막 주기에서는 수 분, 예를 들면 약 2분 내지 약 10분 정도로 시간을 충분히 줄 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 PCR 방법은,

ⅰ) 주형 DNA, 광분해성 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍, Taq DNA 폴리머라아제, 마그네슘염 및 dNTP를 포함하는 PCR 반응물을 형성하는 단계;

ⅱ) 약 30 ℃ 내지 약 100 ℃에서, 상기 반응물에 전자기 조사를 수행하는 단계;

ⅲ) 약 90 ℃ 내지 약 97 ℃에서, DNA를 초기 변성시키는 단계;

ⅳ) 열변성-어닐링-프라이머 연장으로 이루어지는 열주기를 반복수행하는 단계; 및

ⅴ) 약 68 ℃ 내지 약 75 ℃에서 가온하는 추가적인 연장 단계를 포함할 수 있다.

상기 열변성-어닐링-프라이머 연장 단계로 이루어지는 PCR 주기는 10회 내지 50회 반복될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 필요에 따라, 상기 열주기 단계 중 2 이상의 단계가 구분되지 않고 하나의 단계로 동시에 수행될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 어닐링 단계 및 프라이머 연장 단계는 동일한 온도 조건, 예를 들면 약 60 ℃에서 동시에 수행될 수 있고, 이 경우 PCR 열주기는 열변성 단계 및 어닐링/연장 단계의 2단계로 구성된다.

추가적인 구체예에서, 상기 핵산 증폭 방법은 동일 반응에서 2종 이상의 프라이머쌍을 이용하여 2종 이상의 표적 서열을 증폭하는 개선된 방법을 제공한다. 다수의 표적 서열을 증폭시키는 공지된 방법으로 멀티플렉스 PCR(multiplex PCR) (Chamberlain 등, 1988)이 이용되며, 일반적으로, 10종 이상의 표적 서열을 증폭하기 위한 PCR 조건을 설정하는 것은 매우 어려운 것으로 간주된다. 본 구체예에 따른 핵산 증폭 방법은, 완전한 DNA-DNA 매치를 가능하게 하는 충분히 높은 어닐링 온도에 도달했을 때 빛을 조사하여 중합을 개시함으로써 중폭 특이성을 개선하는 효과를 나타내므로, 멀티플렉스 PCR 조건의 최적화에 이상적이다. 멀티플렉스 PCR에 대한 상기 핵산 증폭 방법의 적용은, 2종 이상의 표적 핵산 서열 및 프라이머쌍을 이용하는 것을 제외하고는, 전술한 핵산 서열의 증폭 방법에 따라 실시될 수 있다.

또다른 구체예에서, 상기 핵산 증폭 방법은 mRNA를 주형으로 하여 표적 핵산 서열을 선택적으로 증폭하는 방법으로서, mRNA의 역전사 단계, 및 그로부터 제조된 cDNA를 주형으로 하여 전술한 핵산 증폭 방법을 실시하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 역전사 단계는, i) 주형 유도 효소적 데옥시리보핵산 합성에 적합한 조건 하에서, 주형 mRNA의 폴리 A 테일(poly A tail)에 혼성화되는 올리고뉴클레오티드 dT 프라이머와 상기 mRNA를 접촉시키는 단계, 및 ii) 상기 올리고뉴클레오티드 dT 프라이머가 혼성화되는 상기 mRNA를 역전사시켜, 그에 대해 상보적인 DNA 가닥을 생성하는 단계를 포함할 수 있다.

또다른 양태에서는, 본 명세서에서 정의된 바와 같은 3'-히드록시기가 광분해성 보호기로 보호된 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 프라이머쌍을 포함하는 핵산 증폭용 조성물을 제공한다.

본 양태에 따른 핵산 증폭용 조성물은 일반적으로 사용되는 프라이머(쌍) 대신에 광분해성 올리고뉴클레오티드 프라이머(쌍)이 첨가되는 것을 제외하고는, 통상적으로 증폭 반응에 사용되는 반응 조성물과 마찬가지의 구성을 갖는다. 따라서 상기 핵산 증폭용 조성물은, 본 명세서에서 정의된 바와 같은 광분해성 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 프라이머쌍 외에, 핵산 중합효소, 표적 핵산 서열을 구성하는 반응기질 (뉴클레오티드 트리포스페이트(NTP) 또는 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(dNTP)), 및 마그네슘 이온(Mg² ⁺) 공급원을 포함하는 완충 용액으로 이루어질 수 있다.

예를 들면, 상기 핵산 증폭용 조성물은 PCR용 조성물일 수 있다. 상기 PCR용 조성물은 광분해성 올리고뉴클레오티드 프라이머가 사용되는 것을 제외하면 통상의 PCR 반응물과 유사한 조성을 갖는다. 일 구체예에서, 상기 PCR용 조성물은 (i) 표적 서열의 일부분에 혼성화되는 광분해성 올리고뉴클레오티드 프라이머(쌍), (ⅱ) 증폭 반응이 수행되는 온도에서 내열성인 DNA 중합효소, (ⅲ) 마그네슘염, 및 (ⅳ) 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(dNTP)를 포함할 수 있다.

상기 PCR용 조성물 중 광분해성 프라이머의 양은 통상적인 PCR에서 첨가되는 프라이머 양과 마찬가지로, 시료의 농도 등을 고려하여 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 50 ㎕의 반응 용량 중에 사용되는 프라이머의 양은 약 1 내지 약 1000 pmol일 수 있다.

상기 DNA 중합효소는, 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소를 포함한다. 열안정성 DNA 중합효소는 예를 들면, 써머스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus, Taq), 써머스 루베르(Thermus ruber), 써머스 써모필루스(Thermus thermophilus, Tth), 써머스 필리포르미스(Thermus filiformis), 써미스 플라부스(Thermis flavus), 써머스 락테우스(Thermus lacteus), 써머스 루벤스(Thermus rubens), 써모코커스 리테랄리스(Thermococcus literalis), 바실루스 스테아로써모필루스(Bacilus stearothermophilus), 메타노써머스 페르비두스(Methanothermus fervidus) 또는 파이로코커스 퓨리오수스(Pyrococcus furiosus, Pfu)로부터 얻어지는 중합효소일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들면, 본 구체예에서 사용되는 열안정성 DNA 중합효소는 Taq 폴리머라아제일 수 있다. 상기 중합효소 대부분은 박테리아 자체로부터 분리되거나 또는 상업적으로 구입할 수 있다.

상기 PCR용 조성물은 마그네슘 이온 공급원 및 dNTP를 포함하는 완충 용액을 사용하여 제조될 수 있다.

본 구체예에서, 상기 조성물에 포함되는 마그네슘 이온 공급원은 증폭 반응 조건에서 용해 또는 해리되어 Mg² ⁺를 제공할 수 있는 마그네슘염을 의미한다. 상기 마그네슘염은, 염화마그네슘, 마그네슘 아세테이트 또는 황산 마그네슘 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 상기 마그네슘염은 PCR 반응물 중 약 1 내지 약 20 mM, 예를 들면 약 2 내지 약 10 mM의 최종 농도에 도달하도록 하는 양으로 첨가될 수 있다.

상기 조성물은 DNA 신장 반응용 기질로서 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(dNTP) (dATP, dGTP, dCTP, 및 dTTP)를 포함할 수 있다. 또한, DNA 중합효소에 대한 기질로 작용가능한 범위에서 dNTP의 유사체를 사용할 수 있으며, 그의 예는 7-데아자(deaza)-dGTP, 아미노기를 갖는 dUTP 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. PCR 반응액 중 dNTP는 과량으로 제공될 수 있으며, "과량"은 증폭반응이 dNTP의 농도에 실질적으로 제한되지 않을 정도의 양을 의미한다. 일 구체예에서, 상기 dNTP는 PCR 반응액 중 약 0.1 mM 내지 약 3.0 mM, 예를 들면 약 0.2 mM 내지 약 2.7 mM의 최종 농도가 되도록 첨가될 수 있다. dNTP 최종 농도가 약 4 mM 이상인 경우, 중합 효소 활성이 약 20 내지 30 % 저해될 수 있다.

본 양태에 따른 PCR용 조성물에 사용될 수 있는 완충 성분은 트리신(Tricine), 바이신(Bicine), MOPS, HEPES, TAPS, TES, PIPES, MES, 또는 Tris-염산염 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 통상적으로, 트리신 또는 인산염 (예를 들면, 인산나트륨 및 인산칼륨)을 포함하는 완충액이 사용될 수 있다. 반응 온도가 고온인 경우에는, 온도에 따른 pH 변화가 거의 없는 바이신 완충액이 사용될 수 있다. PCR 반응액 중 완충 성분의 최종 농도는 약 5 mM 내지 약 100 mM, 예를 들면 약 20 mM 내지 약 50 mM 범위일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 또한, PCR 반응액의 최종 pH는 약 6.0 내지 약 9.5, 예를 들면 pH 약 7.0 내지 약 9.2 범위일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일 구체예에서, pH 7.0 내지 8.0에 25 내지 50 mM의 인산칼륨을 함유하는 완충액이 사용될 수 있다.

또다른 양태에서는, 광분해성 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 프라이머쌍을 포함하는 PCR용 건조체를 제공한다. 상기 PCR용 건조체는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 광분해성 올리고뉴클레오티드 프라이머(쌍)을 포함하는 PCR용 조성물을 반응 튜브 내에서 건조시킴으로써 제조될 수 있다. 상기 건조체는 광분해성 올리고뉴클레오티드 프라이머 외에 예를 들면, DNA 중합효소, 마그네슘 이온 공급원 및 4종의 dNTP를 함유할 수 있으며, 필요에 따라, 주형 핵산, 프로브, 형광 염료, PPase 등을 추가로 함유할 수 있다.

추가적인 양태에서, 광분해성 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 프라이머쌍을 포함하는 PCR용 키트를 제공한다. 상기 PCR용 키트는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 광분해성 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 프라이머쌍, DNA 중합효소, 마그네슘염 및 4종의 dNTP의 혼합물을 포함하거나, 또는 상기 성분들이 PCR 개시 후에 혼합되도록 구성된 키트일 수 있다.

또다른 양태에서는, 광분해성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 핵산 증폭을 수행하기 위한, 광투과성 시료 수용부 및 광 조사부를 구비한 핵산 증폭 장치를 제공한다.

일 구체예에서, 상기 핵산 증폭 장치는 PCR 장치일 수 있다. 상기 PCR 장치는, 광투과성 시료 수용부 및 시료에 전자기파를 조사하기 위한 광 조사부를 구비한 것을 제외하고는 통상의 PCR 장치와 유사한 구성을 갖는다. 상기 광투과성 시료 수용부는, 빛이 투과할 수 있는 투명한 재질로 이루어진 시료 수용 용기, 예를 들면 튜브 또는 관으로 구성될 수 있다. 광 조사부는, 상기 광투과성 수용부 내의 시료상에 전자기파를 조사할 수 있는 통상적인 광학계로 구성될 수 있다. 예를 들면, 상기 광 조사부는

조사광을 발하는 광원;

상기 광원이 이어 배치되어 조사광을 집광하는 렌즈; 및

상기 렌즈에 이어 배치되어 조사광의 목적 파장대 성분을 투과시키는 필터부를 포함할 수 있다.

상기 광원은 광분해성 보호기의 흡수 파장대, 예를 들면 300 nm 내지 450 nm 파장 범위의 빛을 방사하는 광원일 수 있다. 상기 광원은 예를 들면, 레이저, 발광 다이오드(LED), 금속 할라이드 램프, 할로겐 램프, 백열 램프, 갈륨 램프, 고압 수은 램프 및 초고압 수은 램프로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 광원에서 방사된 조사광은 순차적으로 배치된 집광 렌즈 및 필터부를 통과한다. 상기 필터부는 유입된 조사광에서 광분해성 보호기의 흡수 파장대의 빛은 통과시키고, 그 외의 빛은 차단하도록 구성될 수 있다. 이에 따라 상기 필터부는 통과대역(pass-band)의 상한 및 하한을 벗어난 빛을 차단하는 2개의 차단 필터를 포함할 수 있다.

상기 PCR 장치는 PCR 반응의 개시 후 최초 열변성 온도에 도달한 이후에 광 조사가 이루어지도록 상기 시료 수용부와 상기 광 조사부 사이에 배치된, 조사 제어부를 추가적으로 구비할 수 있다. 상기 조사 제어부는 시료 수용부의 내부 온도가 조작자에 의해 미리 설정된 열변성 온도에 도달하면 이를 감지하는 센서 및 상기 광 조사부의 광원에 신호를 보내어 전자기파를 조사하도록 하는 일련의 신호 전달계를 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 조사 제어부는 예를 들면, 시료 수용부의 내부 온도가 94 ℃에 도달했을 때 광원에 신호를 보내도록 구성될 수 있다.

본 발명은 또한, 전술된 광분해성 프라이머의 제조, 이를 이용한 핵산 증폭 방법, 핵산 증폭용 조성물 또는 키트 등에 사용할 수 있는, 하기 화학식 2를 갖는 신규한 뉴클레오시드 포스포라미다이트 유사체를 제공한다.

식 중,

상기 B는 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민, 우라실 또는 변형된 염기이고;

상기 R은 수소, 할로겐, 하이드록실기, -OR₁ 또는 -SR₁이고, 상기 R₁은 C₁-C₆알킬, C₂-C₆알케닐, 아세탈, 또는 실릴에테르이고;

상기 R₂는 H 또는 히드록시 보호기이고;

상기 R₃ 및 R₄는 각각 독립적으로, 지방족 C₁-C₈ 알킬, C₂-C₈ 알케닐, 아릴기, 또는 아랄킬기이거나, 또는 이들이 결합된 질소와 함께 아자헤테로시클릴기를 형성하고;

상기 PL은 광분해성 보호기를 나타낸다.

상기 식 (Ⅱ)의 포스포라미다이트 뉴클레오시드에 있어서, 상기 B, R, R₁ 및 PL에 대한 정의는 전술된 바와 같다.

상기 R₂에 있어서 "히드록시 보호기"는, 당해 기술분야에 있는 통상의 기술자에게 알려져 있다. 통상적인 히드록시 보호기의 예는 Green 등에 의한, Protective Groups in Organic Synthesis (1991), John Wiley & Sons, inc., 309-405 pp를 참조할 수 있으며, 이 개시 내용은 전체로서 본 명세서에 통합된다. 개시된 화합물에서 사용되는 히드록시 보호기는 C₁ _-6알킬, C₁ _-6알콕시알킬, 아실, 아랄킬, 알킬술포닐, 아릴술포닐, C₁ _-6알킬기로 치환된 실릴, 알콕시카르보닐, 아릴옥시카르보닐, 아랄콕시카르보닐, 또는 테트라히드로피라닐 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들면, 상기 히드록시 보호기는 아세틸, 벤조일, 디메톡시벤조일, 트리메틸실릴, t-부틸디메틸실릴기, 벤질옥시카르보닐, 또는 테트라히드로피라닐일 수 있다.

상기 R₃ 및 R₄에 대해 기재된 지방족 알킬 및 알케닐의 정의는 전술된 바와 같다. R₃ 및 R₄가 각각 알킬인 경우, 이들은 이소프로필일 수 있다. 상기 정의에서 사용된 용어 "아릴"은 방향족 탄화수소 고리 (예를 들면, 페닐), 하나 이상의 방향족 탄화수소 고리에 융합된 방향족 탄화수소 고리 시스템 (예를 들면, 나프틸 또는 안트라세닐), 또는 하나 이상의 비방향족 탄화수소 고리에 융합된 방향족 탄화수소 고리 시스템 (예를 들면, 1,2,3,4-테트라히드로나프틸)을 포함한다. 용어 "아랄킬"은 알킬기, 예를 들면 C₁-C₆ 알킬기에 의해 질소에 결합된 아릴기 (예를 들면, 벤질)를 지칭한다. 또한, 용어 "헤테로시클릴"은 헤테로아릴기 및 헤테로알리시클릴기를 포함한다. 헤테로아릴기는 황, 질소 또는 산소로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로 원자를 포함하는 5원 또는 6원 방향족 고리를 지칭하고, 헤테로알리시클릴기는 황, 질소 또는 산소로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로 원자를 포함하는 5원 또는 6원 비방향족 고리를 지칭한다. 본 발명에서 사용되는 헤테로시클릴의 예는, 모르폴리닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 티오모르폴리닐, 피롤리디닐, 티아졸리디닐, 테트라히드로티에닐, 아제티디닐, 테트라히드로퓨릴, 디옥사닐 및 디옥세파닐 티에닐, 피리딜, 티아디아졸릴, 옥사디아졸릴, 인다졸릴, 퓨란, 피롤릴, 이미다졸릴, 벤즈이미다졸릴, 인돌릴, 테트라히드로인돌릴, 아자인돌릴, 인다졸릴, 퀴놀리닐, 이미다조피리디닐, 퓨린, 피롤롤[2,3-d]피리미디닐 및 피라졸로[3,4-d]피리미디닐을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에서, 상기 언급된 알킬, 알케닐, 아릴 또는 헤테로시클릴 기는 선택적으로는 하나 이상의 치환체에 의해 치환된 기일 수 있다, 적절한 치환체는 할로겐, 히드록시, 시아노, 니트로, C₁ _- ₆알킬기, 할로겐화 C₁ _-6알킬기(예를 들면, 트리플루오로메틸), C₁ _- ₆알콕시, 할로겐화 C₁ _- ₆알콕시, 벤질 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

상기 식 (Ⅱ)의 화합물은 공지된 포스포라미다이트 합성법에 따라 올리고뉴클레오티드의 제조에 사용될 수 있다. 특히, 상기 화합물은 3'-포스포라미다이트에서 인산 모이어티의 산소에 광분해성 보호기가 부착된 것을 특징으로 하는 광분해성 포스포라미다이트 뉴클레오시드로서, 핵산 증폭용 광분해성 프라이머의 제조에 사용될 수 있다. 이와 같이 3'-말단 뉴클레오시드의 인산기에 광분해성 보호기가 부착된 프라이머가 상보적 염기 서열을 갖는 핵산 사슬에 혼성화(또는 어닐링)되는 경우, 상기 광분해성 보호기는 이중 나선 구조의 외측에 위치하여 중합효소가 인산기에 접근할 수 없도록 공간적 장애 그룹을 형성한다. 프라이머를 포함한 시료에 적절한 파장의 전자기파를 조사하면, 광분해성 보호기가 절단되어 중합효소가 활성 부위인 3'-말단 인산에 접근하고, 중합이 개시된다 (도 2). 따라서, 본 발명에 따른 식 (Ⅱ)의 화합물은 전술된 바와 유사한 원리에 의해, 광 조사에 의해 중합을 보다 정밀하게 제어하고, 비특이적 증폭 산물을 감소시키는데 기여할 수 있다.

따라서, 개시된 발명의 일 양태는, 상기 식 (Ⅱ)의 화합물이 3'-말단에 도입된, 광분해성 올리고뉴클레오티드 프라이머에 관한 것이다. 또한 다른 양태는, 상기 프라이머를 포함하는 증폭 반응물에 빛을 조사하는 단계를 포함하는 핵산 증폭 방법에 관한 것이다. 또다른 양태는 상기 프라이머(쌍)를 포함하는 핵산 증폭용 조성물 및 키트에 관한 것이다. 상기 프라이머, 핵산 증폭 방법, 조성물 및 키트는, 프라이머의 3'-말단 부위에 도입된 광분해성 뉴클레오시드 구조를 제외하고는 전술된 프라이머, 핵산 증폭 방법, 조성물 및 키트와 마찬가지의 구성을 가질 수 있으며, 당업자에 의해 적절하게 변형가능하다.

본 명세서에서 사용되는 모든 기술 용어는 달리 정의되지 않는 이상, 관련 기술 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 균등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

개시된 광분해성 화합물을 사용하여 핵산 증폭을 수행하는 경우, 빛의 조사에 의해 활성 부위를 탈보호시킴으로써 중합반응의 진행을 보다 높은 정확도로 제어할 수 있다. 특히, 광분해성 프라이머를 사용한 핵산 증폭 방법에 있어서, 보다 높은 스트린전시의 어닐링을 달성할 수 있는 조건에서 빛을 조사함으로써 미스프라이밍 및 이에 기인한 비특이적 증폭의 억제를 달성할 수 있다.

나아가, 개시된 광분해성 화합물을 사용한 핵산 증폭 방법은 핵산의 열변성 여부와 무관하게 조작자가 선택한 임의의 시점에 핵산 중합을 개시시킬 수 있다. 따라서, 핫스타트 PCR의 대안으로서 비특이적 증폭을 억제하는 것 외에도, 핵산 중합 시기의 제어가 요구되는 다양한 상황 및 분야에 있어서 광범위한 응용이 가능하다.

도 1은 3'-히드록시기에 광분해성 보호기가 부착된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용한 핵산 중합 방법에서, 빛 조사에 의해 보호기가 제거되어 뉴클레오티드 사슬이 신장되는 과정을 도시한다.
도 2는 3'-히드록시기에 광분해성 보호기가 부착된 5-포스포라미다이트 뉴클레오시드를 사용하여 광분해성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제작하는 방법을 도시한다.
도 3은 3'-인산기에 광분해성 보호기가 부착된 포스포라미다이트 뉴클레오시드로 제조된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용한 핵산 중합 방법에서, 빛 조사에 의해 보호기가 제거되어 뉴클레오티드 사슬이 신장되는 과정을 도시한다.

이하, 개시된 발명을 하기 제조예 및 실험예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다.

실시예 1: 3'-히드록시기가 광분해성 보호기로 보호된 올리고뉴클레오티드 프라이머의 합성

3'-말단에 광분해성 뉴클레오시드 포스포라미다이트 단량체가 도입된, 정방향 프라이머의 서열이 5'-ACGAGTAGATGCTCAATA-3'(mecA_Ⅱ F, 서열번호 1)이고, 역방향 프라이머 서열이 5'-GGAATAATGACGCTATGAT-3' (mecA_Ⅱ R, 서열번호 2)인 프라이머 세트, 정방향 서열이 5'-TGATGCGGGTTGTGTTAATTGA-3' MREJ F, 서열번호 3)이고, 역방향 서열이 5'-TCCACATCTCATTAAATTTTTAAATTATACACA-3' MREJ R, 서열번호 4)인 프라이머 세트, 및 프로브 FAM AGAGCATTTAAGATTATGCG (서열번호 5) 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 상기 올리고뉴클레오티드의 합성은 제노텍㈜에서 표준 포스포라미다이트 화학 프로토콜에 따라 수행하였다.

실시예 2: 3'- 인산기가 광분해성 보호기로 보호된 포스포라미다이트 뉴클레오시드 단량체의 합성

5'-OH가 보호된 뉴클레오시드 단량체를 유기 염기의 존재 하에서 광분해성 보호기가 결합된 포스포로클로리다이트(phosphorochloridite)와 반응시켜 상응하는 포스포라미다이트 뉴클레오시드를 제조하였다.

이와 같이 합성된 포스포라미다이트 뉴클레오시드 단량체를, 표준 포스포라미다이트 화학 프로토콜에 따라 신생 올리고뉴클레오티드 사슬에 중합시킴으로써 3'-인산기가 보호된 광분해성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제조할 수 있다.

실시예 3: PCR 에서 비특이적 증폭 억제 효과

3-1. 광분해성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 PCR 용 조성물의 제조

하기 조성을 갖는 PCR 반응액을 제조하였다: TaKaRa Z-Taq™ (2.5 units/μl), 10 x Z-Taq Buffer (Mg² ⁺ 30 mM 포함), dNTP Mixture (dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP 각각 2.5 mM)를 사용하였고, 정방향 프라이머 1 μM, 역방향 프라이머 1 μM, 및 프로브 400 nM의 최종 농도가 되도록 혼합하였다. PCR 반응에 사용한 Taq DNA 폴리머라아제의 첨가량은 제품에 사용되는 매뉴얼의 지시에 따랐다. 이와 같이 제조된 반응액을 0.2 ㎛ 필터로 여과시킨 후에, 주형 DNA를 농도별로 첨가하였다. 본 실시예의 PCR에 사용한 주형은 MRSA 세포주로부터 추출한 gDNA (genomic DNA)였다. gDNA 추출은 인트론바이오테크놀로지사의 G-spin Genomic DNA 추출 키트 (세포/조직용)를 사용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 실시하였다. 본 실시예에서 사용한 PCR의 증폭 대상 유전자는 100 내지 200 bp의 크기를 가진다.

시험군에는 실시예 1에 따라 제조된 3'-OH가 보호된 광분해성 프라이머 세트를 첨가하였으며, 음성대조군으로는 동일한 프라이밍 서열을 갖는 일반 프라이머 세트를, 양성대조군으로는 동일한 프라이밍 서열을 갖는 공지된 thermolabile 프라이머 세트를 첨가한 PCR 반응액을 사용하였다.

3-2. 광분해성 프라이머 사용에 의한 비특이적 증폭 억제 효과의 측정

앞에서 제조된 각각의 반응액 1.2 ㎕를 PCR 기기인 TMC 2000(thermocycler) (삼성전자)에 적재하여 PCR을 실시하였다. 기본적인 반응 조건은 다음과 같았다:

-- 95 ℃에서, 20초 (1 사이클)

-- 95 ℃에서, 1초 (45 사이클)

-- 60 ℃에서, 5초 (45 사이클).

95 ℃에서의 초기 열변성 단계 전에, 시험군 및 대조군들을 각각 다른 온도 조건에서 노광시켰다. 광원으로는 365 nm 파장의 I-line을 조사하는 수은등 레이저를 사용하였으며, 빛을 조사하지 않는 군의 경우, 차광 조건에서 반응액 제조 및 PCR 반응을 수행하였다. 증폭 반응이 종료된 후에, 증폭 산물을 저온에서 방치하여 냉각시켰다. 1% 아가로오스 겔 상에서 전기영동을 실시하여 PCR 산물을 분석하였다.

전기영동 결과, 빛 조사를 실시하지 않은 군에서는 핵산 중합 반응이 진행되지 않은 반면, 그 밖의 군에서는 약 100 내지 200 bp 크기의 PCR 증폭 산물이 생성되었다. 특히 3'-말단이 광분해성 보호기로 보호된 프라이머 세트를 사용한 군에서는 일반 프라이머를 사용한 음성대조군 및 양성대조군에 비해 비특이 증폭 산물의 생성이 크게 감소한 것을 확인하였다. 또한, 이러한 비특이 증폭의 감소 경향은 빛 조사를 실시한 온도가 높을수록 더욱 현저하게 나타났다.

상기 특정한 실시 양태는 본원발명에 대한 이해를 돕기 위한 예시의 목적으로 기재된 것으로, 어떤 의미로든 발명의 범위가 이들에 의해 제한되는 것은 아니다. 따라서, 발명의 사상과 범위에서 벗어나지 않는 다양한 변형이 이루어질 수 있으며, 본원 발명은 하기 청구범위에 의해서만 제한된다.

Claims

3'-히드록시기가 광분해성 보호기로 보호된 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 프라이머쌍을 포함하는 핵산 증폭 반응물을 제공하는 단계; 및 상기 핵산 증폭 반응물에, 상기 프라이머로부터 광분해성 보호기를 제거할 수 있는 파장 영역의 전자기파를 조사하는 단계를 포함하는 핵산 증폭 방법.
제1항에 있어서, 상기 전자기파 조사 단계는 300 nm 내지 450 nm 파장 범위의 전자기 조사에 의해 수행되는 것인 핵산 증폭 방법.
제1항에 있어서, 상기 광분해성 보호기는 2-니트로벤질 유도체, o-니트로벤질옥시 유도체, 벤조인 유도체, 및 벤질 술포닐 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 핵산 증폭 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 증폭은 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 수행되며,
3'-히드록시기가 광분해성 보호기로 보호된 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 프라이머쌍을 포함하는 PCR 반응물을 제공하는 단계;
상기 프라이머로부터 광분해성 보호기를 제거할 수 있는 UV/VIS 영역 전자기파를 조사하는 단계;
주형 DNA를 변성(denaturation)시키는 단계;
상기 프라이머를 주형에 혼성화(annealing)시키는 단계; 및
혼성화된 프라이머를 연장(elongation)시키는 단계를 포함하는 것인 핵산 증폭 방법.
제4항에 있어서, 상기 프라이머의 광분해성 보호기는 MeNPOC(2-(3,4-메틸렌디옥시-2-니트로페닐)옥시카르보닐), NPPOC(2-(2-니트로페닐)프로필옥시카르보닐), NPES(2-(2-니트로페닐)에틸술포닐), NPPS(2-(2-니트로페닐)프로필술포닐), MeNPPOC (2-(3,4-메틸렌디옥시-2-니트로페닐)프로필옥시카르보닐), PhNPPOC(2-(5-페닐l-2-니트로페닐)-프로필옥시카르보닐), DMBOC(디메톡시벤조이닐옥시카르보닐) 및 DMT(디메틸트리틸)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 핵산 증폭 방법.
제4항에 있어서, 상기 전자기파 조사 단계는 30 ℃ 내지 100 ℃ 범위의 온도에서 수행되는 것인 핵산 증폭 방법.
제6항에 있어서, 상기 전자기파 조사 단계는 90 ℃ 내지 97 ℃의 고온 조건에서 수행되는 것인 핵산 증폭 방법.
제4항에 있어서, 상기 전자기파 조사 단계는 상기 변성 단계와 동시에 수행되거나 또는 상기 변성 단계와 별도로 수행될 수 있는 것인 핵산 증폭 방법.
제4항에 있어서, 상기 전자기파는 I-line인 것인 핵산 증폭 방법.
3'-히드록시기가 광분해성 보호기로 보호된 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 프라이머쌍을 포함하는 PCR용 키트(kit).
3'-히드록시기가 광분해성 보호기로 보호된 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 프라이머쌍을 포함하는 PCR용 건조체.
3'-히드록시기가 광분해성 보호기로 보호된 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 프라이머쌍을 포함하는 핵산 증폭용 조성물.
제12항에 있어서, 상기 광분해성 보호기는 300 nm 내지 450 nm 파장 영역의 전자기파 조사에 의해 제거가능한 기인 것인 핵산 증폭용 조성물.
제12항에 있어서, 상기 광분해성 보호기는 2-니트로벤질 유도체, o-니트로벤질옥시 유도체, 벤조인 유도체, 및 벤질 술포닐 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 핵산 증폭용 조성물.
제12항에 있어서, 상기 광분해성 보호기는 NVOC (6-니트로베라트릴옥시카르보닐(6-nitroveratryloxycarbonyl), NBOC (2-니트로벤질옥시카르보닐), MeNPOC(2-(3,4-메틸렌디옥시-2-니트로페닐)옥시카르보닐), NPPOC (2-(2-니트로페닐)프로필옥시카르보닐), NPES(2-(2-니트로페닐)에틸술포닐), NPPS (2-(2-니트로페닐)프로필술포닐), MeNPPOC(2-(3,4-메틸렌디옥시-2-니트로페닐)프로필옥시카르보닐), PhNPPOC (2-(5-페닐-2-니트로페닐)-프로필옥시카르보닐), NBTEOC (o-니트로벤질티오에틸옥시카르보닐), NPAC (o-니트로페닐아미노카르보닐), NPOC (o-니트로페녹시카르보닐), MeNMOC (α-메틸-8-니트로나프틸메톡시카르보닐), o-니트로페닐티오에틸옥시카르보닐, DDZ (α,α-디메틸디메톡시벤질옥시카르보닐), PYMOC (1-파이레닐메틸옥시카르보닐), ANMOC (안트라세닐-메틸옥시카르보닐) 및 DMT (디메톡시트리틸)로 이루어진 군에서 선택되는 것인 핵산 증폭용 조성물.
제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 PCR용 조성물이고, 3'-히드록시기가 광분해성 보호기로 보호된 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 프라이머쌍, DNA 중합효소, Mg² ⁺의 공급원 및 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트(dNTP)를 포함하는 것인 핵산 증폭용 조성물.
광투과성 시료 수용부 및 광 조사부를 구비하며, 상기 광 조사부는
UV/VIS 영역 전자기파를 방사하는 광원;
상기 광원에 이어 배치되어 조사광을 집광하는 렌즈; 및
상기 렌즈에 이어 배치되어 조사광의 목적 파장대를 투과시키는 필터부를 포함하고, 상기 시료 수용부는 UV/VIS 영역 전자기파가 투과할 수 있는 재질로 이루어진 시료 용기를 포함하는 것인, 3'-히드록시기가 광분해성 보호기로 보호된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 핵산 증폭을 수행하기 위한 핵산 증폭 장치.
제17항에 있어서, 상기 시료 수용부와 상기 광 조사부 사이에 배치된 조사 제어부를 구비하며, 상기 조사 제어부는 시료 수용부의 온도를 감지하는 센서 및 감지된 온도에 따라 광원에 신호를 전달하도록 구성된 신호 전달계를 추가적으로 포함하는 것인 핵산 증폭 장치.
하기 식으로 표시되며:

식 중,
상기 B는 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민, 우라실 또는 변형된 핵산 염기이고;
상기 R은 수소, 할로겐, 히드록시, -OR₁ 또는 -SR₁이고, 상기 R₁은 C₁-C₆알킬, C₂-C₆알케닐, 아세탈, 또는 실릴에테르이고;
상기 R₂는 H, 히드록시 보호기 또는 뉴클레오티드 사슬이고;
상기 R₃ 및 R₄는 각각 독립적으로, 지방족 C₁-C₈ 알킬, C₂-C₈ 알케닐, 아릴, 또는 아랄킬이거나, 또는 이들이 결합된 질소와 함께 헤테로시클릴 기를 형성하고;
상기 PL은 전자기 조사에 의해 제거되는 광분해성 보호기(photolabile protecting group)인 포스포라미다이트 뉴클레오시드 화합물.
3'-말단에 제19항에 따른 포스포라미다이트 뉴클레오시드가 하나 이상 배치된 것을 특징으로 하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드 프라이머.