CN115298325A - 用于多阶段引物延伸反应的方法和组合物 - Google Patents

用于多阶段引物延伸反应的方法和组合物 Download PDF

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Abstract

描述了用于多阶段引物延伸反应例如多重聚合酶链式反应(PCR)和逆转录酶PCR的方法和组合物。引物延伸阶段是在各阶段之间不打开密闭容器的情况下在所述密闭容器中执行的。所述多阶段引物延伸方法和组合物在早期阶段中利用早期阶段引物并且在后期阶段中利用后期阶段引物，其中所述后期阶段引物在所述早期阶段期间被封闭而不延伸。本技术的封闭引物包含光可切割的封闭基团并且基本上是无活性的，直到封闭基团通过暴露于紫外光而被切割。所述封闭引物可以在不打开所述容器的情况下通过紫外光激活。

Description

用于多阶段引物延伸反应的方法和组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年3月26日提交的美国临时申请号62/994,989的权益，该美国临时申请的内容全文以引用方式并入。
技术领域
本公开涉及用于多阶段引物延伸反应的方法和组合物，所述多阶段引物延伸反应为例如多重聚合酶链式反应(multiplex polymerase chain reaction,PCR)和逆转录酶-PCR。
背景技术
聚合酶链式反应(PCR)是一种用于DNA序列的特异扩增方法。PCR是用于下一代测序(Next Generation Sequencing,NGS)文库制备的DNA靶扩增的有用且广泛应用的方法。具体地，引物与核酸混合物中的其靶序列杂交并延伸，之后是附加轮次的引物杂交和延伸。PCR能够指数扩增引物之间的序列，从而使PCR成为非常敏感的技术。然而，PCR可导致不希望的扩增产物。第一，如果引物结合除了它们的靶标以外的其它序列，则脱靶扩增可降低靶序列的产量。第二，PCR引物的浓度必须比靶序列高得多(以支持后面轮次的指数反应)，因此，引物有时可与其他引物相互作用，从而产生引物二聚体。第三，不同的靶序列可能以不同的效率扩增，具体取决于长度、GC含量、引物序列等。
多重PCR(Multiplex PCR,mPCR)是在延伸反应中使用许多(可能数百或数千)引物的方法。这是方便的，因为许多靶序列可以在同一试管中扩增，并且潜在地，许多靶序列可以从同一等分试样的样品扩增。然而，在mPCR中，脱靶扩增、引物二聚体形成和不均匀扩增的问题是混杂的。事实上，引物二聚体问题可能会指数地恶化，因为加入到多重反应中的每对新引物都可能潜在地与混合物中的所有其他引物相互作用。
多重PCR有潜力产生实验室中的时间和精力的相当大节省。该技术已应用于人类DNA测试的许多领域，包括基因缺失分析、突变和多态性分析、定量分析和逆转录(RT)-PCR。在传染病领域中，多重PCR已经用于病毒、细菌和寄生虫的鉴定。然而，mPCR的使用带来了若干困难，包括不良的敏感性、不良的特异性、某些特异性靶标的优先扩增和/或非预期序列的扩增。
通常，多重PCR将发生在两个分开的阶段中(即，多阶段PCR)。在第一阶段反应中，使用具有通用序列的靶特异性引物来扩增特异性靶多核苷酸，并将通用正向和反向序列添加到每个扩增子上。然后在随后的PCR扩增反应之前纯化产物，以去除未反应的靶特异性引物和其他试剂。在随后的PCR反应中，然后使用被设计用于与通用序列杂交的通用引物来扩增来自早期阶段的扩增子并添加进一步加工和鉴定目的所需的任何其他序列(例如衔接子)。
这种系统是劳动密集的。此外，靶特异性引物与通用引物之间的竞争可导致偏倚的扩增，因此有必要在早期阶段之后停止并纯化反应混合物。这可能会向所述系统中引入可能的误差和污染。因此，期望确定允许在单个反应容器中执行两个阶段的方法。此外，如果可以在不打开反应容器的情况下执行两个或更多个阶段，则这将是特别有利(例如，用于防止污染)和方便的。
在逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)中，RNA在初始阶段中被逆转录成cDNA，然后在后续阶段中，cDNA在PCR步骤中被扩增，通常用靶特异性引物扩增。RT-PCR面临与多步PCR相同的挑战，因为基因特异性引物可能在于相对较低的温度(37-60℃)下进行的cDNA合成期间非特异性地引发。特异性通常通过在两个分开的容器中执行逆转录和PCR来提高，这防止了PCR引物彼此相互作用或与用于启动cDNA合成的RT引物(例如寡聚(dT)、随机六聚体或基因特异性反向引物)相互作用。然而，在RT步骤与PCR步骤之间打开试管会增加劳动力和污染风险。
发明内容
本技术涉及用于在密闭容器中执行多阶段聚合酶链式反应的新颖方法，其中混合物包含：i)多核苷酸靶标；ii)能够进行引物延伸的早期阶段引物；iii)后期阶段引物，所述后期阶段引物在3'末端包含光可切割的封闭基团；iv)引物延伸酶；和v)任选需要的其它试剂。早期阶段引物的示例包括靶特异性引物和逆转录酶(RT)引物。靶特异性引物可包含5'区和3'区，其中所述3'区包含靶特异性序列，并且所述5'区包含通用序列。当此类靶特异性引物用于早期阶段引物延伸反应时，后期阶段引物可以是通用引物，所述通用引物包含通用序列或其部分，以及在其3'末端处的光可切割的封闭基团。在一些实施方式中，在制备混合物后密闭容器，并用混合物执行早期聚合酶链式反应以产生靶扩增子。通用引物在混合物中被解封闭以产生解封闭的通用引物，所述解封闭的通用引物包含通用序列或其部分。在一些实施方式中，在不打开容器的情况下执行解封闭步骤。用解封闭的引物和靶扩增子执行后期阶段引物延伸反应，其中解封闭的引物扩增靶扩增子。在一些实施方式中，解封闭步骤是通过将密闭容器中的通用引物暴露于紫外光来执行的。
在另一方面中，本技术涉及用于执行多阶段PCR的新颖组合物，其中所述组合物包含a)多核苷酸靶标；b)能够进行引物延伸的早期阶段引物和c)后期阶段引物，所述后期阶段引物在3'末端处包含光可切割的封闭基团。早期阶段引物的示例包括靶特异性引物和逆转录酶(RT)引物。靶特异性引物可包含5'区和3'区，其中所述3'区包含靶特异性序列，并且所述5'区包含通用序列。当此类靶特异性引物是早期阶段引物时，后期阶段引物可以是通用引物，所述通用引物包含通用序列或其部分，以及在其3'末端处的光可切割的封闭基团。在一些实施方式中，所述组合物被容纳在容器中，所述容器在制备所述组合物后封闭。通过暴露在紫外光下，后期阶段引物可以被解封闭并被激活用于PCR扩增。
在另一方面中，本技术涉及用于在密闭容器中进行多阶段RT-PCR的新颖方法，其中所述混合物包含：i)多聚核糖核苷酸(RNA)靶标；ii)早期阶段引物，所述早期阶段引物包含寡聚(dT)引物、随机引物、或用于cDNA合成的靶特异性RT引物；iii)后期阶段引物，所述后期阶段引物在其5'末端处包含靶特异性序列且在其3'末端处包含光可切割的封闭基团；iv)逆转录酶；v)DNA聚合酶；和vi)任选需要的其它试剂。在一些实施方式中，在制备混合物后密闭容器，并在PCR热循环之前在恒定温度(37-60℃)下执行逆转录。在不打开容器的情况下将靶特异性PCR引物解封，并且用解封闭的PCR引物和cDNA执行PCR步骤，其中所述解封闭的引物扩增一个或多个靶扩增子。在一些实施方式中，解封闭步骤是通过将密闭容器中的封闭的靶特异性PCR引物暴露于紫外光来执行的。
在另一方面中，本技术涉及用于在密闭容器中执行多阶段RT-PCR的新颖组合物。所述组合物包含a)多聚核糖核苷酸(RNA)靶标；b)早期阶段引物，所述早期阶段引物包含用于cDNA合成的解封闭的RT引物；和c)后期阶段引物，所述后期阶段引物包含用于后期阶段引物延伸反应的封闭引物，其中所述后期阶段引物在其3'末端处包含光可切割的封闭基团。所述封闭的后期阶段引物可以是靶特异性PCR引物、随机引物或通用引物。所述后期阶段引物可以在cDNA合成后解封闭，并通过暴露于紫外光而被激活用于PCR扩增。在一些实施方式中，所述组合物被容纳在容器中，所述容器在制备所述组合物后密闭。
附图说明
本领域技术人员将理解，下面描述的附图仅用于说明目的。附图并非旨在以任何方式限制本发明教导的范围。
图1提供了本发明多阶段PCR引物、方法和组合物的实施方式的示意图。
图2提供了反相HPLC迹线，证明了在其3'末端处具有光可切割的封闭基团的封闭通用引物的产生。
图3提供了本发明多阶段RT-PCR引物、方法和组合物的实施方式的示意图。
图4提供了反相HPLC迹线，证明了通过将引物暴露于365nm紫外光10秒钟而使PCR管中的本发明的封闭通用引物解封闭。
图5提供了Bioanalyzer 2100图像，证明了光可切割的封闭引物仅在所述引物暴露于紫外光后在PCR中延伸。
图6A和图6B提供了单容器RT-PCR反应的BioAnalyzer图像，所述单容器RT-PCR反应是在早期阶段中在封闭的后期阶段引物存在下用解封闭的RT引物进行的，所述封闭的后期阶段引物在后期阶段是解封闭的。
具体实施方式
本技术涉及多阶段引物延伸反应，例如使用解封闭的早期阶段引物和封闭的后期阶段引物的多重PCR和RT-PCR。封闭的引物在其3'末端处包含光可切割的封闭基团。多核苷酸靶标在早期阶段中进行引物延伸反应以形成产物，例如靶扩增子或靶cDNA。例如，基因组DNA可以在早期阶段中通过靶特异性引物扩增，所述靶特异性引物在3'区中包含靶特异性序列并且在5'区中包含通用序列。这种早期阶段的产物包含靶扩增子，所述靶扩增子在所述扩增子的5'末端和3'末端处包含通用序列。然后在后期阶段引物延伸反应中通过通用引物扩增靶扩增子，所述通用引物已经通过封闭基团的光切割，例如通过暴露于紫外光而被解封闭。作为另一个示例，RNA靶标可以在早期阶段中进行引物延伸以产生靶cDNA。靶cDNA可以在后期阶段中通过已经解封闭的靶特异性引物或通用引物进行引物延伸。
图1呈现了本技术的多阶段PCR方法的示意图。所呈现的PCR方法可以在密闭容器中执行，所述密闭容器容纳有多核苷酸靶标、包含通用序列的靶特异性引物和3'封闭的可光切割通用引物，所述3'封闭的可光切割通用引物在其3'末端处含有光可切割的封闭基团。
图1示出了在早期阶段PCR中通过靶特异性正向和反向引物对多核苷酸靶标的扩增。正向引物包含将与靶标杂交的靶特异性序列，以及指示为标签1的通用序列，并且反向引物也包含将与靶标杂交的靶特异性序列，以及不同的被指示为标签2的通用序列。多核苷酸靶标在早期阶段PCR中的扩增产生了靶扩增子，所述靶扩增子包含多核苷酸靶序列，并且还包含分别在所述靶扩增子的5'末端和3'末端处的通用序列标签1和2(或其互补序列)。早期阶段PCR扩增通常是多重PCR扩增，其中通过多组靶特异性引物并行扩增多个靶标。例示性靶特异性引物组可从Agilent's SureMASTR technology获得，例如BRCA MASTR DXAssay。
图1还示出了用一组3'封闭的光可切割通用引物对靶扩增子进行的后期阶段扩增。在本技术中，图1所示的正向通用引物包含在其3'末端处的光可切割的封闭基团；3'区域，所述3'区域包含通用序列标签1或其部分的序列以及在5'区域中的衔接子序列，所述衔接子序列被指示为衔接子1。图1所示的反向通用引物包含在其3'末端处的光可切割的封闭基团；3'区域，所述3'区域包含通用序列标签2或其部分的序列；分子标识序列，所述分子标识序列被指示为MID1；以及在5'区域中的衔接子序列，所述衔接子序列表示为衔接子2。正向和反向通用引物中的光可切割的封闭基团用终止符号表示。封闭的通用引物在早期阶段PCR期间存在于反应混合物中，但在它们被解封闭之前对于PCR扩增基本上是无活性的。封闭的通用引物可以通过暴露于紫外光而被解封闭和激活，以用于后期阶段PCR扩增。在暴露于紫外光后，解封闭的通用引物对PCR扩增有活性。如图1所示，后期阶段扩增导致早期扩增子普遍扩增以产生后期阶段扩增子。因此，后期阶段的通用扩增的扩增子包含靶特异性引物和通用引物的序列(例如，衔接子1和衔接子2的序列)。
由于本技术的封闭的通用引物可以通过暴露于紫外光而解封闭以在PCR的早期阶段之后添加所述通用引物，因此所述通用引物可以在早期阶段PCR期间存在于mPCR反应混合物中，而不干扰初始靶扩增。令人惊讶的是，封闭的通用引物在早期阶段中基本上无活性，但在后期阶段中对PCR有活性。此外，封闭基团的光可切割性质允许通过将整个容纳有PCR混合物的容器暴露于紫外光而使通用引物被解封闭和激活。这种解封闭能力是方便且非常有益的，因为它减少或避免了引入污染，因为在早期阶段PCR之后，无需打开PCR混合物容器来添加通用引物就可以执行后期阶段PCR。
例如，在PCR的早期阶段完成后，3'封闭的光可切割通用引物可以通过暴露于紫外光例如365nm光而被解封闭。暴露于紫外光可以以任何合适的方式执行。可以例如通过将PCR容器从热循环仪上取下，并将其放置在紫外光源(例如紫外光箱)上来执行解封闭。或者，可以改进PCR热循环仪以直接施加紫外(UV)光。在一种情况下，当通用引物保留在同一个密闭的PCR反应容器中时，可以施加紫外光来使所述通用引物解封闭。接下来，相同的密闭PCR反应容器可以用现在已解封闭的通用引物进入扩增的后期阶段。
在另一个方面中，本技术涉及多阶段RT-PCR，其中后期阶段引物包含靶特异性引物，所述靶特异性引物在其3'末端处包含光可切割的封闭基团。多核糖核苷酸靶标在第一阶段中通过逆转录酶和解封闭的RT引物(例如寡聚(dT)引物、随机引物或靶特异性反向引物)进行逆转录。早期阶段引物延伸反应的产物是靶cDNA。在后期阶段PCR期间，可以通过后期阶段引物(例如已经通过封闭基团的光切割而被解封闭的靶特异性引物)来扩增靶cDNA。
图3示出了本技术的多阶段RT-PCR的示意图。所呈现的RT-PCR可以在容纳有多聚核糖核苷酸靶标、解封闭的RT引物和包含3'光可切割的封闭基团的靶特异性引物的密闭容器中执行。靶特异性引物中的光可切割的封闭基团用终止符号表示。图3示出了在封闭的靶特异性引物存在下，通过解封闭的反向引物对多聚核糖核苷酸靶标的早期阶段逆转录。图3还示出了在已经通过暴露于紫外光去除3'封闭基团后，靶扩增子的后期阶段扩增。
在一些实施方式中，本技术的光可切割的封闭基团连接至合适的报告分子，例如荧光团。在其他实施方式中，本技术的光可切割的封闭基团不连接至报告分子。设想到的是本技术的光可切割的封闭基团将适当地起作用，而无论它们是否包括荧光团，仅需要存在光可切割的封闭基团即可。
此外，由于本技术的光可切割的封闭基团通过暴露于紫外光而被去除，所以本发明的封闭基团不影响引物延伸酶的功能。因此，本技术的光可切割的封闭基团可与标准PCR和RT-PCR组分(例如聚合酶、核苷酸(dNTP)和缓冲剂)兼容使用。
在进一步详细描述例示性实施方式之前，阐述了以下定义和解释，以说明和定义说明书中使用的术语的含义和范围。
数值范围包含限定该范围的数值。除非另有说明，否则核酸以5'至3'取向从左至右书写；氨基酸序列分别以氨基至羧基的取向从左至右书写。
除非另外指明，否则本技术可以采用在本领域的技术范围内的有机化学、聚合物技术、分子生物学(包括重组技术)、细胞生物学、生物化学和免疫学的技术和描述。此类技术包括聚合物阵列合成、杂交、连接、和使用标签检测杂交。
如本文所用，除非上下文另外明确指出，否则单数形式的“一”、“一个(种)(a/an)”和“所述(the)”包括复数指代物。例如，术语“一个引物”是指一个或多个引物，即单个引物和多个引物。“多个”含有至少两个成员。在某些情况下，多个可以具有至少10个、至少100个、至少100个、至少10,000个、至少100,000个、至少106个、至少107个、至少108个或至少109个或更多个成员。
还应当注意，权利要求书可以被起草为排除任何任选的要素。因此，本声明旨在用作使用与权利要求要素的叙述有关的诸如“单独”、“仅”等排他性术语或使用“否定”限制的在先基础。
如说明书和所附权利要求书中所使用的，并且除了它们的普通含义之外，术语“基本上”或“实质上”是指在本领域普通技术人员可接受的限度或程度内。例如，“基本上无活性”意指本领域技术人员认为活性水平可忽略不计。
如本文所用的术语“样品”涉及含有一种或多种感兴趣的多核苷酸或片段的材料或材料混合物。在一些实施方式中，所述术语是指任何含有DNA、RNA或其它多核苷酸的植物、动物或病毒材料，例如从患者(包括但不限于血浆、血清、脑脊液、淋巴、泪液、唾液和组织切片)、从保存的组织(例如FFPE切片)或从体外细胞培养成分分离的组织或流体，以及来自环境的样品。任何含有核酸(例如，来自组织培养细胞或来自组织样品的基因组DNA)的样品都可以在本技术中采用。
如本文所用的术语“核酸样品”表示含有核酸的样品。核酸样品可能是复杂的，因为它们含有多个不同的含有序列的分子。来自哺乳动物(例如，小鼠或人)的核酸样品是复杂样品的类型。复杂样品可能具有大于104、105、106或107个不同的核酸分子。此外，复杂样品可能仅包含几个分子，其中所述分子总共具有大于104、105、106或107个或更多个核苷酸。术语“复杂性”通常指群体中，例如片段、衔接子或衔接子连接的片段的群体中不同序列的总数。例如，如果群体具有4个不同的序列，则该群体的复杂性为4。取决于期望的结果，群体可以具有为至少4、至少8、至少16、至少100、至少1,000、至少10,000或至少100,000或更高的复杂性。
术语“核苷酸”是指天然存在的核苷酸，包括鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶(分别为G、C、A、T和U)，以及经修饰的嘧啶和嘌呤衍生物和其它非天然存在的部分，所述经修饰的嘧啶和嘌呤衍生物和其它非天然存在的部分不仅含有已知的嘌呤和嘧啶碱基，还含有其它已被修饰的杂环碱基。此类修饰包括甲基化的嘌呤或嘧啶、酰化的嘌呤或嘧啶、烷基化的核糖或其他杂环。此外，术语“核苷酸”包括含有半抗原或荧光标记的那些部分，并且不仅可含有常规的核糖和脱氧核糖，还可含有其他糖。经修饰的核苷酸还包括糖部分上的修饰，例如，其中羟基中的一个或多个羟基被卤素原子或脂肪族基团取代，被官能化为醚、胺等。
术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互换使用，以描述由核苷酸(例如，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)构成的任何长度(例如，大于约2个碱基、大于约10个碱基、大于约100个碱基、大于约500个碱基、大于1000个碱基、高达约10,000个或更多个碱基)的含核苷酸的聚合物，并且可以天然地、化学地、酶促地或合成地产生。该术语包括具有PNA、LNA或UNA的聚合物。DNA和RNA分别具有脱氧核糖和核糖主链，而PNA的主链由通过肽键连接的重复的N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元构成。在PNA中，各种嘌呤和嘧啶碱基通过亚甲基羰基键连接至主链。锁核酸(locked nucleic acid,LNA)，通常被称为不可接近的RNA，是经修饰的RNA核苷酸。LNA核苷酸的核糖部分被用连接2'氧和4'碳的额外桥修饰。该桥将核糖“锁定”在3'-内切(北)构象中，所述构象通常在A-型双链体中发现。只要需要，LNA核苷酸就可以与寡核苷酸中的DNA或RNA残基混合。术语“非结构化核酸”或“UNA”是指含有非天然核苷酸的核酸，所述非天然核苷酸以降低的稳定性彼此结合。例如，非结构化核酸可以含有G'残基和C'残基，其中这些残基对应于G和C的非天然存在的形式，即类似物，所述残基以降低的稳定性与彼此碱基配对，但保留了分别与天然存在的C和G残基碱基配对的能力。
术语“碱基”是指通常在核酸及其天然的、经取代的、经修饰的或经工程化的变体或类似物中发现的类型的经取代或未取代的含氮母体杂芳环，其能够与适当互补的碱基形成沃森-克里克(Watson-Crick)和/或胡斯坦(Hoogsteen)氢键。
术语“接头”是指一个或多个二价基团，所述一个或多个二价基团作为两个其它基团之间共价键合的分子桥，例如-C(O)NH-、-C(O)O-、-NH-、-S-、-S(O)n，其中n是0、1或2、-O-、-OP(O)(OH)O-、-OP(O)(O-)O-、烷二基、烯二基、炔二基、芳烯二基、杂芳二基，以及它们的组合。接头可以具有侧接的侧链或侧接的官能团(或两者)。
术语“报告分子”是指能够直接或间接地产生可检测信号的化学部分。报告分子的示例包括荧光染料基团、放射性标记或通过化学发光或生物发光手段影响信号的基团。荧光染料基团的示例包括咕吨、荧光素、罗丹明、氟硼二吡咯(BODIPY)、花菁、香豆素、芘、酞菁、藻胆蛋白、ALEXA FLUOR 350、ALEXA FLUOR 405、ALEXA FLUOR 430、ALEXA FLUOR 488、ALEXA FLUOR 514、ALEXA FLUOR 532、ALEXA FLUOR 546、ALEXA FLUOR 555、ALEXA FLUOR568、ALEXA FLUOR 568、ALEXA FLUOR 594、ALEXA FLUOR 610、ALEXA FLUOR 633、ALEXAFLUOR 647、ALEXA FLUOR 660、ALEXA FLUOR 680、ALEXA FLUOR 700、ALEXA FLUOR 750和方酸染料。可在本发明的一些实施方式中使用的荧光染料报告分子的其他示例公开于Haugland,2005和美国专利号4,439,356和5,188,934中，所述文献以引用方式并入本文。在本发明的一些实施方式中，可以用作报告分子的放射性标记的示例是本领域中众所周知的，例如35S、3H、32P或33P。通过化学发光或生物发光手段起作用并且可用作本发明的一些实施方式中的报告分子的报告分子的示例描述于Nieman,1989；Given&Schowen,1989；Orosz等人，1996；和Hastings,1983中，该等文献以引用方式并入本文。
如本文所用的术语“寡核苷酸”表示核苷酸的单链多聚体，其长度通常为约2个至200个核苷酸，通常至多500个核苷酸。寡核苷酸可以是合成的或者可以是酶促制备的，并且在一些实施方式中长度为30个至150个核苷酸。寡核苷酸可以含有核糖核苷酸单体(即，可以是寡核糖核苷酸)或脱氧核糖核苷酸单体，或者核糖核苷酸单体和脱氧核糖核苷酸单体两者。在一些实施方式中，本发明寡核苷酸的长度可以是例如10个至20个、11个至30个、31个至40个、41个至50个、51个至60个、61个至70个、71个至80个、80个至100个、100个至150个或150个至200个核苷酸。
术语“引物”是指天然或合成的寡核苷酸，其在与多核苷酸模板(例如多核苷酸靶标)形成双链体时能够充当核酸合成的起始点，并从其3'末端沿着模板延伸，以便形成延伸的双链体。如本文所用的术语“延伸”是指通过使用引物延伸酶添加核苷酸来延伸引物。如果与核酸退火的引物被延伸，则所述核酸充当延伸反应的模板。延伸过程期间添加的核苷酸的序列由多核苷酸模板的序列确定。引物可以通过引物延伸酶例如DNA聚合酶和逆转录酶来延伸。逆转录酶是RNA依赖性DNA聚合酶，其掺入了与RNA模板相反的脱氧核苷酸。所得的cDNA(互补DNA)可以在通过DNA依赖性DNA聚合酶的后期阶段PCR中充当DNA模板。引物的长度通常与其在引物延伸产物合成中的用途兼容，并且通常长度在介于8个至100个核苷酸之间，例如10个至75个、15个至60个、15个至40个、18个至30个、20个至40个、21个至50个、22个至45个、25个至40个等的范围内，更典型地在介于18-40个、20-35个、21-30个核苷酸长之间的范围内，以及所述范围之间的任何长度。典型的引物长度可以在介于10-50个核苷酸长之间的范围内，例如15-45个、18-40个、20-30个、21-25个等，以及所述范围之间的任何长度。在一些实施方式中，引物的长度通常不大于约10个、12个、15个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个或70个核苷酸。
用于扩增的引物通常是单链的，但也可以以双链形式提供至混合物。如果是双链的，则引物在用于制备延伸产物之前通常首先经处理以分离其链。因此，引物与模板互补，并通过氢键或与模板杂交而形成复合物，以得到引物/模板复合物供用于通过聚合酶进行的合成的起始，所述引物/模板复合物在DNA合成的过程中通过添加在其3'末端处连接的与所述模板互补的共价键合的碱基而延伸。术语“反向引物”和“正向引物”是指与双链DNA分子中的不同链杂交的引物，其中通过聚合酶进行的引物的延伸是在朝向另一个引物的方向上。cDNA合成可以由逆转录酶(RT)引物引发。例如，包含一系列脱氧胸苷核苷酸的寡核苷酸(寡聚(dT))可以与RNA转录物的3'聚A尾退火。或者，RT引物可以与RNA内的多个序列特异性位点退火(靶特异性引物)。随机引物也可以用作RT引物。
一“对”引物是指被设计用于扩增双链多核苷酸靶标的正向和反向引物。在一些实施方式中，本发明的组合物、方法和试剂盒包含高度多重化的靶特异性引物组，例如至少5对，或者至少10对、或至少20对、或至少50对、或至少100对、或至少200对、或至少500对、或至少1,000对、或至少2,000对、或至少5,000对、或至少10,000对，或至少20,000对或更多对靶特异性引物。
术语“引物延伸试剂”是指在多核苷酸分子例如多核苷酸靶标上执行引物延伸反应(例如聚合酶链式反应(PCR))所需或适合用于其的任何试剂。引物延伸试剂通常包括引物、热稳定的聚合酶或逆转录酶、以及核苷酸与适当缓冲剂的混合物。取决于所用的酶，也可能存在离子(例如，Mg2+)。cDNA合成由反向引物引发，与RNA转录物(寡聚(dT))的3'聚A尾退火，或与RNA内的多个序列特异性位点退火(随机聚体(randomer)、靶特异性引物)。
如本文所用，术语“通用序列”指一组或群体中两种或更多种核酸分子共有的序列，优选是一组或群体中基本上所有的核酸分子共有的序列，其中核酸分子也具有与彼此不同的部分(例如一组多核苷酸靶扩增子中的靶部分)。通用序列可以存在于分子组或群体的不同成员中，从而允许不同分子的共同加工。通用序列的非限制性示例包括与流动池的捕获序列相同或互补的序列。类似地，通用序列可以允许使用与通用序列的一部分(例如，通用引物结合位点)互补的通用扩增引物群体来扩增多个不同的核酸。
在一些实施方式中，目前描述的靶特异性引物具有包含通用序列的5'区域，使得通用序列或其互补序列可以掺入到在早期PCR阶段中产生的靶扩增子中。在后期PCR阶段中使用已解封闭并与通用序列杂交的封闭通用引物进行的后续扩增可用于通用地扩增PCR混合物中存在的靶扩增子。
涉及核酸序列中位置的术语“上游”和“……的5'”可互换使用以指核酸序列中更靠近序列的5'端的相对位置。涉及核酸序列中位置的术语“下游”和“……的3'”可互换使用以指核酸序列中更靠近序列的3'端的相对位置。
如本文所用，术语“杂交”是指核酸链通过碱基配对与互补链结合的任何过程。术语“杂交”还涵盖此类过程，在所述过程中核酸链在正常杂交条件下与第二条互补核酸链退火并形成稳定的双链体(同源双链体或异源双链体)，并且在相同的正常杂交条件下不与无关的核酸分子形成稳定的双链体。如本文所用的术语“双链体”或“双链的”描述了碱基配对的(即杂交在一起的)两个互补多核苷酸。双链体的形成是通过在杂交反应中退火两条互补的核酸链来完成的。杂交过程可以通过以下方式变得高度特异：调节发生杂交反应的杂交条件(通常称为杂交严格性)，使得除非两条核酸链在特定序列中含有一定数量的基本上或完全互补的核苷酸，否则所述两条核酸链之间的杂交将不会形成稳定的双链体。对于任何给定的杂交反应,“正常杂交”或“正常严格条件”是容易确定的。
术语“互补的”是指在高严格条件下与彼此杂交的两个核酸。术语“完全互补”是指双链体，在所述双链体中核酸中的一个核酸的每个碱基与另一个核酸中的互补核苷酸碱基配对。在许多情况下，互补的两条序列具有至少10个，例如至少12个或15个具有互补性的核苷酸。相反，如果两个核酸“不互补”，则它们不会与彼此杂交，但是可以容许有一些序列匹配，即小于100％的非互补程度，只要所述两条链在本发明方法中使用并如上所定义的条件下保持单链形式即可。
术语“扩增”是指合成与模板核酸(例如多核苷酸靶标)的一条或两条链互补的核酸分子的过程。扩增核酸分子可以包括使模板核酸变性，在低于引物解链温度的温度下使引物与模板核酸退火，以及从引物酶促延伸以产生扩增产物。变性、退火和延伸步骤均可执行一次或多次。在某些情况下，执行变性、退火和延伸步骤多次，使得扩增产物的量不断增加，往往是指数倍地增加，尽管本发明方法不需要指数扩增。扩增通常需要存在脱氧核糖核苷三磷酸、DNA聚合酶和用于实现聚合酶的最佳活性的适当缓冲剂和/或辅因子。术语“扩增产物”或“扩增子”是指由如本文所定义的扩增过程产生的核酸序列。逆转录是线性扩增反应，所述线性扩增反应采用专门的DNA聚合酶(逆转录酶)，以使用脱氧核糖核苷三磷酸将RNA拷贝成cDNA(互补DNA)。当在单个容器中执行RT-PCR时，缓冲剂和辅因子必须支持逆转录酶和PCR酶两者的最佳活性。
术语“标识序列”是指这样的核苷酸序列，所述核苷酸序列可用于a)鉴别和/或追踪反应中多核苷酸的来源，b)计算初始分子被测序的次数，以及c)与来自同一分子的不同链的序列读段配对。
术语“衔接子”是指在测序准备中附接至多核苷酸、多核苷酸靶标或靶扩增子的核酸。衔接子可以通过引物延伸、连接或其他技术附接。衔接子可以是单链或双链的，并且其可包含DNA、RNA和/或人工核苷酸。衔接子可以位于多核苷酸的末端处，或者其可以位于中间或内部部分中。衔接子可向多核苷酸添加一个或多个功能区，例如提供用于后期阶段引物延伸阶段或用于测序的引物结合位点，或提供标识序列。举例来说，衔接子可以包含通用引物和/或通用引发位点，包括用于测序的引发位点和/或用于NGS测序系统的捕获位点。
术语“多核苷酸靶标”是指感兴趣的多核苷酸。分离的多核苷酸靶分子是指不含其他多核苷酸靶分子的组合物中存在的单一分子。
术语“区域”是指可为单链或双链的核苷酸序列。
术语的其他定义可能出现在整个说明书中或者根据说明书进行理解。
靶特异性引物和通用引物的精确核苷酸序列通常对本技术并不重要，并且可由用户基于本公开的教导进行选择。
除非另有定义，否则本文使用的技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
本文提及的所有专利和出版物，包括此类专利和出版物中公开的所有序列，都明确以引用方式并入。
作为一方面，本公开提供了一种用于通过在容器中制备引物延伸混合物来在密闭容器中执行多阶段引物延伸反应的方法，其中所述混合物包含：i)多核苷酸靶标；ii)解封闭的引物；和iii)封闭的引物。混合物将通常包含其他引物延伸试剂，例如脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)、DNA聚合酶或其他引物延伸酶以及缓冲剂。在一些实施方式中，解封闭的引物或封闭的引物包括靶特异性引物。靶特异性引物包含5'区和3'区，其中所述3'区包含靶特异性序列，并且所述5'区包含通用序列。通用引物包含通用序列或其互补序列，以及在其3'末端处的光可切割的封闭基团。在一些实施方式中，在制备混合物后密闭容器，并用混合物执行早期聚合酶链式反应以产生靶扩增子或靶cDNA。封闭的引物可以在混合物中被解封闭，以产生包含通用序列或其互补序列的解封闭的引物。在一些实施方式中，在不打开容器的情况下执行解封闭。可以用解封闭的引物和靶扩增子或靶cDNA执行后期阶段引物延伸反应，其中解封闭的引物扩增靶扩增子。在一些实施方式中，解封闭和/或后期阶段引物延伸反应是通过从封闭的通用引物中光切割封闭基团来执行的，例如通过将密闭容器中的封闭引物暴露于紫外光。
在另外的方面中，本技术涉及用于执行引物延伸反应的新颖组合物，其中所述组合物包含a)多核苷酸靶标；b)用于早期阶段的解封闭的引物；和c)用于后期阶段的封闭的引物。在一些方面中，靶特异性引物包含5'区和3'区，其中3'区包含靶特异性序列，并且5'区包含通用序列。在其它方面中，通用引物包含通用序列或其一部分，以及光可切割的封闭基团。在一些方面中，所述组合物是在容器中制备的，所述容器在制备所述组合物后密闭。在其他方面中，通用引物是通过暴露于紫外光或其他光切割技术而被解封闭的。
在其他方面中，本技术涉及一种用于实践如上所述的本发明方法的试剂盒。在一些实施方式中，所述试剂盒可以包含用于如上所述的多阶段引物延伸反应的组合物。在一些实施方式中，所述试剂盒可包含混合物，所述混合物包含解封闭的引物(例如靶特异性引物或逆转录酶引物)，以及封闭的引物(例如通用引物或靶特异性引物)。在一些实施方式中，所述试剂盒包括容器，所述容器容纳有解封闭的靶特异性引物和封闭的通用引物的混合物。
在一些实施方式中，所述试剂盒包括容器，所述容器容纳有解封闭的RT引物和封闭的靶特异性引物的混合物。
在本发明方法和组合物的一些实施方式中，早期阶段引物以在0.01μM至0.5μM范围内的浓度存在，并且后期阶段引物以在0.2μM至1μM范围内的浓度存在。在多重PCR的一些实施方式中，靶特异性引物以在0.01μM至0.5μM范围内的浓度存在，并且通用引物以在0.2μM至1μM范围内的浓度存在。在RT-PCR的一些实施方式中，RT引物以在0.01μM至0.5μM范围内的浓度存在，并且封闭的靶特异性引物以在0.2μM至1μM范围内的浓度存在。
所述组合物、方法和试剂盒可用于对多核苷酸靶标(例如基因组DNA；线粒体DNA，信使RNA，微小RNA)执行多阶段引物延伸反应。多核苷酸靶标可以从几乎任何生物体(包括但不限于植物、动物(例如，爬行动物、哺乳动物、昆虫、蠕虫、鱼等))、组织样品、细菌、真菌(例如，酵母)、噬菌体、病毒、尸体组织、考古/古代样品等获得。在一些实施方式中，样品可以含有来自哺乳动物细胞(例如，人、小鼠、大鼠或猴细胞)的多核苷酸靶标。样品可以从培养细胞或临床样品细胞(例如，组织活检、刮取或灌洗)或法医样品细胞(例如，在犯罪现场收集的样品的细胞)获得。在一些实施方式中，多核苷酸靶标可以从生物样品(例如细胞、组织、体液和粪便)获得。感兴趣的体液包括但不限于血液、血清、血浆、唾液、粘液、粘液质、脑脊液、胸膜液、泪液、乳导管液、淋巴、痰、滑液、尿、羊水和精液。在特定实施方式中，体液可以从受试者，例如人类获得。
在一些实施方式中，多核苷酸靶标包括从临床样品获得的DNA或RNA，所述临床样品是例如患有或被怀疑患有疾病或病症(例如癌症、炎性疾病)或妊娠的患者。在一些实施方式中，可以通过从存档的患者样品(例如，福尔马林固定的石蜡包埋组织样品)中提取多核苷酸靶标来制备样品。在一些实施方式中，患者样品可以是来自体液(例如，外周血)的无细胞循环DNA样品。在一些实施方式中，在本发明方法的早期阶段中使用的多核苷酸靶标是事先没有进行变性的未扩增DNA。在其他实施方式中，样品中的多核苷酸靶标可能已经部分片段化(例如，如在FFPE样品和循环无细胞DNA(cfDNA)(例如ctDNA)的情况下)。在一些实施方式中，所述组合物、方法和试剂盒可用于对来自RNA的多核苷酸靶标执行多阶段RT-PCR，所述RNA包括聚A分级mRNA，来自几乎任何生物体或样品类型。
包含封闭的3'末端的后期阶段引物
在一些实施方式中，后期阶段引物是根据式I的化合物：
Figure BDA0003846959920000181
其中R1是H或OH。
式I中的碱基是胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤或鸟嘌呤，或它们的经修饰的嘧啶和嘌呤衍生物。所述碱基可以是通常在核酸及其天然的、经取代的、经修饰的或经工程化的变体或类似物中发现的类型的任何经取代或未取代的含氮母体杂芳环，其能够与适当互补的碱基形成沃森-克里克和/或胡斯坦氢键。
式I中可切割的终止部分是赋予化合物聚合酶终止性质的基团。在一些实施方式中，可切割的终止部分是根据下式的部分或者它们的盐、互变异构体或旋光异构体：
Figure BDA0003846959920000191
其中R3是烷基(C≤8)或经取代的烷基(C1-8)；R4是氢、羟基、卤素、氨基、硝基、氰基、叠氮基或巯基；烷基(C≤6)、酰基(C≤6)、烷氧基(C≤6)、酰氧基(C≤6)、烷基氨基(C≤6)、二烷基氨基(C≤6)、酰氨基(C≤6)，或这些基团中的任何基团的经取代形式；R5和R6各自独立地为：氢、羟基、卤素、氨基、硝基、氰基、叠氮基或巯基；烷基(C≤6)、烯基(C≤6)、炔基(C≤6)、芳基(C≤6)、芳烷基(C≤8)、杂芳基(C≤6)、酰基(C≤6)、烷氧基(C≤6)、酰氧基(C≤6)、烷基氨基(C≤6)、二烷基氨基(C≤6)、酰氨基(C≤6)，或这些基团中的任何基团的经取代形式；下式的基团：
Figure BDA0003846959920000192
其中X是-O-、-S-、或-NH-；或烷二基(C≤12)、烯二基(C≤12)、炔二基(C≤12)，或这些基团中的任何基团的经取代形式；Y是-O-、-NH-、烷二基(C≤12)或经取代的烷二基(C≤12)；n是0-6的整数；并且m是0-6的整数；或者接头-报告分子。
式I中的任选接头是一个或多个二价基团，所述一个或多个二价基团作为两个其它基团之间共价键合的分子桥，例如-C(O)NH-、-C(O)O-、-NH-、-S-、-S(O)n，其中n是0、1或2、-O-、-OP(O)(OH)O-、-OP(O)(O-)O-、烷二基、烯二基、炔二基、芳烯二基、杂芳二基，以及它们的组合。一些接头具有侧接的侧链或侧接的官能团(或两者)。任选的报告分子是能够直接或间接地产生可检测信号的化学部分。报告分子的示例包括荧光染料基团、放射性标记或通过化学发光或生物发光手段影响信号的基团。在一些实施方式中，报告分子选自由以下项组成的组：呫吨、荧光素、罗丹明、氟硼二吡咯、花菁、香豆素、芘、酞菁、藻胆蛋白、以及它们的衍生物。
式I中的引物是能够与多核苷酸靶标形成双链体的寡核苷酸。在一些实施方式中，引物的长度为8个至100个核苷酸，或者长度为10个至75个、15个至60个、15个至40个、18个至30个、20个至40个、21个至50个、22个至45个、或25个至40个核苷酸，或者本文所公开的另一范围内的另一长度。
在一些实施方式中，通用引物包含选自由以下项组成的组的3'末端核苷酸：(a)5-[(S)-1-(5-甲氧基-2-硝基苯基)-2,2-二甲基-丙氧基]甲基-2'-脱氧-尿苷、(b)5-[(S)-1-(5-甲氧基-2-硝基苯基)-2,2-二甲基-丙氧基]甲基-2'-脱氧-腺苷、(c)5-[(S)-1-(5-甲氧基-2-硝基苯基)-2,2-二甲基-丙氧基]甲基-2'-脱氧-鸟苷、(d)5-[(S)-1-(5-甲氧基-2-硝基苯基)-2,2-二甲基-丙氧基]甲基-2'-脱氧-胞苷、(e)5-[(S)-1-(5-甲氧基-2-硝基苯基)-2,2-二甲基-丙氧基]甲基-2'-脱氧-胸苷以及它们的混合物，其中核苷任选地被接头和/或报告分子取代。例示性混合物包括以下物质的混合物：核苷酸(a)和(b)；核苷酸(a)、(b)和(c)；核苷酸(a)、(b)、(c)和(d)；核苷酸(a)、(b)、(c)、(d)和(e)；核苷酸(b)和(c)；核苷酸(b)、(c)和(d)；核苷酸(b)、(c)、(d)和(e)；核苷酸(a)和(c)；核苷酸(a)和(d)；核苷酸(a)和(e)；核苷酸(a)、(b)和(d)；核苷酸(a)、(c)和(d)；核苷酸(a)、(c)、(d)和(e)；核苷酸(a)、(b)、(d)和(e)；核苷酸(a)、(b)、(c)和(e)；核苷酸(b)和(d)；核苷酸(c)和(d)；核苷酸(b)和(e)；核苷酸(c)和(e)；核苷酸(b)、(c)和(e)；核苷酸(b)、(d)和(e)；核苷酸(c)、(d)和(e)；核苷酸(d)和(e)；以及任何其他混合物。
用于多重和多阶段PCR的方法、组合物和试剂盒
作为另一方面，本公开提供了用于提高多重核酸扩增的效率的方法和组合物。本公开还涉及用于提高多阶段核酸扩增的效率，特别是被设计为在同一反应混合物或容器中顺序发生的两个或更多个扩增反应的性能的试剂和方法。特别地，提供了具有减少的引物二聚体和异常扩增产物形成的组合物。在UV解封闭之前，封闭的引物不形成任何可延伸的双链体。在UV解封闭之后，它们变成了能够进行引物延伸的引物。此类引物在早期和后期扩增反应发生在单一反应混合物或容器中的情况下特别有用。在WO2018/10842A1中存在与多重和多阶段PCR扩增反应相关的附加信息以及与其相关的试剂，该专利据此全文以引用方式并入。
在另一方面中，本技术涉及使用解封闭的RT引物作为早期阶段引物并使用封闭的引物作为后期阶段引物进行多阶段RT-PCR。例如，后期阶段引物可包含靶特异性引物，所述靶特异性引物在其3'末端处包含光可切割的封闭基团。在一些实施方式中，多聚核糖核苷酸靶标在早期阶段中通过逆转录酶用解封闭的RT引物进行逆转录，以产生靶cDNA。RT引物的示例包括寡聚(dT)引物、随机聚体(N6-Nn，其中n可以是整数，例如7、8、9、或10)、或靶特异性RT引物。然后，在后期阶段PCR期间扩增靶cDNA，例如通过已经通过封闭基团的光切割解封闭的靶特异性引物。
本技术特别涉及多重核酸扩增，在所述多重核酸扩增中并行地扩增两个或更多个靶序列。这通常通过在单一核酸扩增反应中包括多于一对多核苷酸靶特异性引物来实现。
本技术还涉及多阶段核酸扩增，在所述多阶段核酸扩增中发生了两个或更多个不同的扩增反应。通常，早期扩增反应利用扩增多核苷酸靶分子的靶特异性引物。靶特异性引物包含5'区和3'区，其中所述3'区包含靶特异性序列，并且所述5'区包含通用序列。随着反应的进行，通用序列被掺入到扩增产物中。在后期扩增反应中，包含足以与通用序列的互补序列杂交的通用序列或其部分的通用引物被用于扩增来自早期扩增的扩增产物。
本发明方法将通常在每个阶段内包括多个引物延伸循环。例如，早期阶段可以包括至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个引物延伸循环，和/或至多20个、18个、16个、14个、12个或更少个PCR循环。类似地，后期阶段可以包括至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个引物延伸循环和/或至多20个、18个、16个、14个、12个或更少个引物延伸循环。本发明方法还可以包括在早期阶段和/或后期阶段之前或之后的附加引物延伸阶段。例如，在早期阶段之前可以是引物延伸阶段，以便为早期阶段提供更高量的输入多核苷酸，并且后期阶段之后可以是PCR阶段，以便为测序或其他应用提供更高量的输出多核苷酸。
在一些实施方式中，这种后期扩增涉及通用引物，所述通用引物掺入了进一步下游加工和鉴定目的潜在需要的附加序列。因此，通用扩增是通过以下事实管制的：后期扩增是独立于被扩增的初始靶分子的特定靶序列执行的。通用扩增依赖于将附加序列(如本文所述的通用序列)掺入到来自早期扩增反应的扩增产物中，所述附加序列可在后期扩增中充当引物结合位点。因此，后期扩增中引物的引物区对应于通用序列。包含此类引物区的引物在本文中被称为“通用引物”。
本技术的通用引物在其3'末端处包含光可切割的封闭基团。封闭的通用引物对于PCR扩增是无活性的，即使它们在PCR扩增阶段期间存在也如此。由于本技术的3'封闭基团是光可切割的，因此可以通过将封闭的通用引物暴露于紫外光或其他光切割技术来去除它们。紫外光暴露去除了封闭基团，并产生了对PCR扩增有活性的通用引物。因此，本技术的通用引物可以存在，但是在靶特异性PCR扩增的早期阶段期间被封闭且基本上无活性，然后在通用PCR扩增的后期阶段之前通过暴露于紫外光而被激活。
待通过本技术扩增的多核苷酸靶标通常不受限制。使用本技术的试剂和方法可以扩增任何合适的多核苷酸靶分子。可以靶向多个不同的多核苷酸靶分子。这可能涉及使用多个多核苷酸靶特异性引物对。因此，术语多核苷酸靶标通常是指待扩增的核酸分子的所需序列，无论是作为扩增开始前存在的初始多核苷酸靶分子的部分，还是作为扩增期间产生的多核苷酸靶扩增子分子。
多核苷酸靶标是包含或衍生自DNA分子或RNA分子的分子。如上所述，RNA可以从与DNA相同的样品类型获得。RNA可以是信使RNA(mRNA)、微小RNA(miRNA)等。在一些实施方式中，使用逆转录酶对RNA进行逆转录以形成互补DNA(cDNA)分子，然后所述cDNA分子可以使用本技术进行扩增。
本技术的靶特异性引物对被设计用于扩增多核苷酸靶标，并且通常掺入通用序列。通用序列不与初始多核苷酸靶分子杂交。这种功能由靶特异性引物的靶特异性3'区提供。然而，一旦通用序列已经被包含在扩增产物中，它们(或它们的互补序列)就可以在后期扩增步骤中充当与通用引物杂交的引物结合位点。
根据一些实施方式，用于通用扩增的后期PCR阶段也可用于在后期扩增子中包含一个或多个衔接子序列。衔接子序列可以是用于下游加工的任何合适的序列。下游加工允许从样品中检测和/或定量多核苷酸靶标或其扩增子。例如，与固定在合适的固体表面上的寡核苷酸互补的衔接子序列允许固定掺入了此类衔接子的序列。其他应用依赖于与液体中的寡核苷酸杂交的衔接子。衔接子可用于基于阵列或基于测序的分析。在一些实施方式中，衔接子序列可以是用于高通量核酸测序的任何合适的衔接子序列。此类测序通常并且优选地使用下一代测序(NGS)平台执行。
在一些实施方式中，通用引物进一步包含一个或多个引物结合位点。例如，第一(或正向)通用引物可包含第一引物结合位点，并且第二(或反向)通用引物可包含第二引物结合位点，其中第一引物结合位点和第二引物结合位点被配置为与不同的引物结合(例如，第一引物结合位点和第二引物结合位点不具有基本上相同的序列，而是基本上互补的)。第一引物结合位点和/或第二引物结合位点可以是测序引物结合位点、捕获引物结合位点、或它们的组合。例如，第一通用引物可以包含第一流动池扩增引物结合位点，并且第二通用引物可以包含第二流动池扩增引物结合位点。在一些实施方式中，当第一引物结合位点是测序引物结合位点时，第一通用引物进一步包含在第一引物结合位点上游的标识序列。例如，第一通用引物可以包含在标识序列上游的通用捕获序列。在一些实施方式中，当第二引物结合位点是测序引物结合位点时，第二通用引物进一步包含在第二引物结合位点下游的索引。例如，第二通用引物可以包含在标识序列下游的通用捕获序列或其互补序列。在一些实施方式中，当第一通用引物不包含索引时，通用捕获位点在第一引物结合位点的上游。
在一些实施方式中，本技术的各种引物也可用于向扩增产物中添加一个或多个标识序列(也称为索引或条形码)。对于涉及在早期扩增中使用的靶特异性引物的本技术的一些方面，样品标识序列和/或分子标识序列被有利地包含在引物中。在特定实施方式中，标识序列的长度可在2个至36个核苷酸、或6个至30个核苷酸、或8个至20个核苷酸的范围中。在一些实施方式中，标识序列可以含有“简并碱基区”或“DBR”，其中术语“简并碱基区”和“DBR”是指一种类型的分子标识序列，所述类型的分子标识序列的复杂性足以帮助人们区分已经添加了DBR的片段。
术语“样品标识序列”是指一类可以添加到多核苷酸的标识序列，其中所述序列标识多核苷酸的来源(即，多核苷酸所来源于的样品)。在使用中，用不同的样品标识序列标记每个样品(例如，一个序列被附加到每个样品，其中不同的样品被附加到不同的序列)，并且合并经标记的样品。在对合并的样品测序后，样品标识序列可用于鉴定序列的来源。术语“分子标识序列”是指一类可以添加到多核苷酸的标识序列，其中所述序列标识单独的多核苷酸或其扩增子。
在一些实施方式中，通用引物包含第一通用引物和第二通用引物，其中第一通用引物以5'至3'的次序包含：(i)第一衔接子序列；(ii)分子标识序列；(iii)与第一通用序列的至少一部分相同(在5'至3'方向上)的通用引物区；并且第二通用引物以5'至3'的次序包含：(i)第二衔接子序列；(ii)样品标识序列；(iii)与第二通用序列的至少一部分相同(在5'至3'方向上)的通用引物区。
在一些实施方式中，本技术提供了用于在单一反应混合物中执行多重和多阶段PCR反应的方法。在一些实施方式中，从PCR混合物中的多核苷酸靶标开始直至且包括产生含有通用序列的相关扩增产物的所有扩增步骤(即，早期和后期PCR阶段)都在不需要分离、去除或添加组分的情况下进行。在一些实施方式中，不需要在不含通用引物的混合物中执行靶特异性扩增阶段，或者在早期阶段与后期阶段之间添加通用引物，或者在通用扩增之前纯化早期扩增产物。在一些实施方式中，在进行早期扩增阶段之前，将所述方法所需的所有PCR试剂(即以产生进一步的扩增产物)组合。因此，所述方法可以在单一反应容器中执行，并且在添加所有PCR反应混合物组分后不需要打开容器。一旦反应混合物已经形成(除了执行扩增本身，例如热循环以外)直到通用扩增产物已经产生，不需要进一步操纵或打开反应容器。因此，本发明方法可以被认为是“密闭容器”方法。本发明方法是非常有利的，因为用户不需要在早期阶段与后期阶段之间添加通用引物。
在一些实施方式中，从混合物中的多核苷酸靶标开始直至且包括产生含有通用序列的相关靶扩增产物的所有引物延伸阶段(即，早期阶段和晚期阶段引物延伸阶段两者)都是在不需要分离、去除或添加组分的情况下进行的。在一些实施方式中，不需要在不含通用引物的混合物中执行靶特异性扩增阶段，或者在早期阶段与后期阶段之间添加通用引物，或者在通用扩增之前纯化早期靶扩增产物。在一些实施方式中，在进行早期扩增阶段之前，将所述方法所需的所有引物延伸试剂(即以产生进一步的扩增产物)组合。因此，本发明方法可以在单一反应容器中执行，并且在添加反应混合物组分的所有组分后不需要打开容器。一旦反应混合物已经形成(除了执行扩增本身，例如热循环以外)直到通用扩增产物已经产生，不需要进一步操纵或打开反应容器。因此，本发明方法可以被认为是“密闭容器”方法。本发明方法是非常有利的，因为用户不需要在早期阶段与后期阶段之间添加后期阶段引物。
本发明方法还涵盖在生成通用扩增产物后(即在通用扩增或后期阶段扩增后)执行附加步骤。此类方法不限于相同的反应混合物或反应容器。此类方法可以涉及检测多核苷酸靶分子，任选地对多核苷酸靶分子进行定量。在一些实施方式中，本技术的方法用于鉴定和任选地定量特定多核苷酸靶分子。在其他实施方式中，所述方法进一步包括对另外的扩增产物进行测序。测序通常以大规模并行方式执行，例如通过使用下一代测序(NGS)技术。测序可以在与本技术的扩增反应不同的反应混合物中进行。
本技术还涉及多阶段RT-PCR反应，在所述多阶段RT-PCR反应中在单一容器中发生两个或更多个不同的扩增反应。通过用光可切割的封闭基团封闭靶特异性PCR引物的3'末端，独立于PCR执行cDNA合成。cDNA合成是在对逆转录酶最佳的恒定温度下执行的，不受PCR引物的干扰，否则所述PCR引物会非特异性地相互作用以产生引物二聚体和其它人工产物。因此，本技术的靶特异性PCR引物可以存在，但在cDNA合成期间是基本上无活性的，然后在后期阶段引物延伸反应(例如PCR)之前通过暴露于紫外光而被激活。如上文针对多阶段mPCR反应所述，RT-PCR方法可以在单一容器中执行，而无需进一步操纵。
本公开还提供了用于实践如本文所述的本发明方法的试剂盒。在一些实施方式中，所述试剂盒可包含用于如上所述的多阶段PCR的组合物。在一些实施方式中，所述试剂盒可包含PCR混合物，所述PCR混合物包含靶特异性引物和封闭的通用引物，所述封闭的通用引物在其3'末端处具有光可切割的封闭基团。靶特异性引物和封闭的通用引物可以在单一容器中的混合物中。本技术的试剂盒可另外包含用于执行多阶段PCR的合适试剂(例如，缓冲剂等)。所述试剂盒的各种组分可以存在于单独的容器中，或者根据需要，可以将某些相容的组分预组合到单一容器中。除了上述试剂之外，所述试剂盒还可容纳有在上述方法中使用的任何附加组分，例如一种或多种酶和/或缓冲剂等。
在一些实施方式中，所述试剂盒可以包含用于如上所述的多阶段RT-PCR的组合物。在一些实施方式中，所述试剂盒可以包含RT-PCR混合物，所述RT-PCR混合物包含cDNA合成引物(寡聚(dT)或随机聚体)和靶特异性引物，所述靶特异性引物在其3'末端处具有光可切割的封闭基团。cDNA合成和封闭的靶特异性引物可以在单一容器中的混合物中。本技术的试剂盒可以另外包含用于执行多阶段RT-PCR的合适试剂，所述合适试剂可以以任何上述形式提供。
除了上述组分之外，所述试剂盒还可以包括用于使用试剂盒的组分实践本发明方法的使用说明，即用于进行多核苷酸靶标的多阶段扩增的使用说明。用于实践本发明方法的使用说明可以记录在合适的记录介质上。例如，使用说明可以印刷在基材，例如纸或塑料等上。因此，使用说明可以作为包装插页存在于试剂盒中，存在于试剂盒容器或其部件的标签中(即，与包装或子包装相关联)等。在其他实施方式中，使用说明作为电子存储数据文件存在于合适的计算机可读存储介质，例如CD-ROM、软磁盘等上。在其他实施方式中，试剂盒中不存在实际的使用说明，但是提供了用于从远程来源(例如，通过互联网)获得使用说明的方法。这种实施方式的一个示例是试剂盒，所述试剂盒包括可以查看使用说明和/或下载使用说明的网址。如同所述使用说明一样，这种用于获得所述使用说明的手段被记录在合适的基材上。
光可切割的封闭基团
本技术涉及引物，所述引物在3'末端处被光可切割的封闭基团可逆地封闭。这些封闭的引物可以在早期阶段引物延伸反应期间存在，但在该阶段期间被阻断延伸。在它们被解封闭后，它们变得能够在后期阶段引物延伸反应中延伸。本发明技术的光可切割的封闭基团包括附接至后期阶段引物的3'末端的核苷酸，在所述3'末端处所述核苷酸阻断PCR扩增。封闭的引物对于PCR扩增是基本上无活性的，直到它们通过暴露于紫外光或其他光切割技术而被解封闭和激活。各种光可切割的封闭基团可以被包含在后期阶段引物中，例如在美国专利号8,969,535、9,200,319和10,041,115中描述的那些，所述美国专利全文以引用方式并入本文。设想到的是本发明的后期阶段引物可在其3'末端处包含任何光可切割的封闭基团，使得后期阶段引物在被解封闭之前对PCR扩增基本上无活性。在一些实施方式中，光可切割的封闭基团具有约90％至约100％的封闭效率。
光可切割的封闭基团被设计为可逆地阻断和终止DNA合成，然后通过暴露于紫外光而被有效地切割，从而激活引物。在一些实施方式中，光可切割的封闭基团是核苷酸化合物的形式，所述核苷酸化合物含有碱基腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或其经修饰的嘧啶和嘌呤衍生物，例如7-羟基-7-脱氮-腺嘌呤/鸟嘌呤。在其他实施方式中，可切割基团可以被衍生化以包括报告分子，例如染料。在一些实施方式中，碱基腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或其经修饰的嘧啶和嘌呤衍生物可以共价附接至光可切割的保护基团，例如2-硝基苄基。在一些实施方式中，2-硝基苄基被衍生化以增强其对DNA合成的终止。在一些实施方式中，光可切割的保护基团，例如2-硝基苄基，也可以通过与光可切割的保护基团共价连接而用荧光染料衍生化。
在一些实施方式中，光可切割的封闭基团包含与2-硝基苄基共价附接的核苷碱基，并且2-硝基苄基的α碳位置任选被一个烷基或芳基取代。在其他实施方式中，2-硝基苄基被官能化以增强终止和阻断性质以及光催化的去保护速率。在其他实施方式中，附接至碱基的2-硝基苄基和经α碳取代的2-硝基苄基的终止和阻断性质甚至在核糖上的3'-OH基团被解封闭时发生。在一些实施方式中，选择被许多商业上可获得的DNA聚合酶良好耐受的光可切割的封闭基团。在一些实施方式中，经α碳取代的2-硝基苄基也可以被衍生化以包括所选择的荧光染料或其他报告分子。
制备光可切割的封闭基团的方法
光可切割的封闭基团是核苷酸化合物的形式，所述核苷酸化合物包含光可切割的保护基团，所述光可切割的保护基团被设计用于终止DNA合成以及快速切割。它们与引物前体组合并添加到引物前体的3'末端，例如通过用DNA聚合酶与模板退火进行引物前体的单碱基延伸，或者替代地通过用末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidetransferase,TdT)以模板非依赖性方式进行引物前体的单碱基延伸。因此，包含光可切割的封闭基团的通用引物对于进一步延伸是无活性的。
在另一个实施方式中，包含光可切割的封闭基团的核苷酸是根据下式的化合物，所述化合物可以附接至通用引物的3'末端：
Figure BDA0003846959920000291
其中R1是H或OH，R2是H、单磷酸根、二磷酸根、三磷酸根或α-硫代三磷酸根，碱基是胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤或鸟嘌呤，或其经修饰的嘧啶和嘌呤衍生物，可切割的终止部分是赋予化合物聚合酶终止性质的基团，任选的接头是双官能基团。式II中的碱基是胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤或鸟嘌呤，或其经修饰的嘧啶和嘌呤衍生物。如上所述，碱基可以是通常在核酸及其天然的、经取代的、经修饰的或经工程化的变体或类似物中发现的类型的任何经取代或未取代的含氮母体杂芳环，其能够与适当互补的碱基形成沃森-克里克和/或胡斯坦氢键。
式II中可切割的终止部分是赋予化合物聚合酶终止性质的基团。式I中的任选接头是一个或多个二价基团，所述一个或多个二价基团作为两个其它基团之间共价键合的分子桥。任选的报告分子是能够直接或间接地产生可检测信号的化学部分。可切割的终止部分、任选的接头和任选的报告分子的示例在上文关于式I阐述，并且那些例示性的可切割的终止部分、任选的接头和任选的报告分子也可以被掺入式II中。
实施例
实施例1：光可切割的3'封闭引物的生产
在本实施例中，合成在其3'末端处具有封闭基团的引物。通过执行引物前体的单碱基延伸来生产光可切割的封闭引物。将引物前体(Numb1-1)与DNA模板退火，并通过单碱基延伸将包含光可切割的封闭基团(LT-dG)的核苷酸掺入引物前体的3'末端处。通过反相高效液相色谱法(reverse-phase high performance liquid chromatography,HPLC)纯化和分析产物。图2示出了添加LT-dG之前退火的引物和模板的产物作为最左边的峰、添加LT-dG的引物的单碱基延伸产物作为中间的峰，并且在最右边的峰中是过量和未掺入的LT-dG。
实施例2：光可切割的封闭引物可以通过紫外光解封闭
在本实施例中，评估了解封闭在其3'末端处具有封闭基团的引物的能力。图4示出了HPLC迹线，说明了在3'末端处具有光可切割的封闭基团的HPLC纯化的通用引物(右边的主峰)和在365nm UV光暴露10秒后的通用引物(左边的峰)。增加的HPLC迁移率是由于通过紫外光从引物的3'末端切割掉了光可切割的封闭基团。这表明本技术的光可切割的封闭引物可以通过紫外光有效地解封闭，然后有能力通过DNA聚合酶延伸。
实施例3：只有在暴露于紫外光后，光可切割的封闭引物才能在PCR中延伸
在本实施例中，评估了用于PCR扩增的封闭引物的使用。图5示出了三种PCR产物的Bioanalyzer 2100图像。标记为“使用解封闭的引物的PCR”的泳道是针对阳性对照，显示了使用解封闭的引物(Numb1-FP和Numb1-RP)的305bp gDNA片段的扩增产物。记为“使用封闭引物的PCR”的泳道是针对使用解封闭的反向引物(Numb1-RP))和光可切割的封闭正向引物(Numb1-F*)的尝试的PCR。这种泳道由于封闭引物不能在PCR扩增中延伸而显示出最小的PCR扩增。标记为“使用暴露于UV的封闭引物的PCR”的泳道是针对在通过暴露于紫外光下切割掉正向引物(Numb1-F*)上的封闭基团后，使用解封闭的反向引物和光可切割的封闭正向引物的PCR。这种泳道显示了PCR产物的扩增，因为正向引物被解封闭并且变得能够在PCR扩增中延伸。这些结果表明，本技术的封闭引物在PCR扩增中不延伸，但可以通过暴露于紫外光而被解封闭和激活以在PCR扩增中延伸。
实施例4：只有在暴露于紫外光后，光可切割的封闭引物才能在RT-PCR中延伸
在本实施例中，在RT-PCR中评估了封闭的靶特异性引物的使用，作为多阶段引物延伸反应的另一个实施方式。图6示出了来自单一容器RT-PCR反应的产物的Bioanalyzer2100图像，所述单一容器RT-PCR反应是用光可切割的封闭的β-肌动蛋白反向引物(小图A；R*)或光可切割的封闭的Numb1正向引物(小图B；F*)进行的。在cDNA合成与热循环之间，将封闭的试管暴露于UV达3分钟。在没有UV暴露的情况下，在任何一种测定中都没有生成靶特异性产物，表明β-肌动蛋白R*和Numb1 F*在cDNA合成和PCR步骤两者期间都保持无活性。对于β-肌动蛋白，附加对照显示，在UV暴露与初始PCR变性步骤(未示出)之间的时段中，逆转录从β-肌动蛋白R*被引发。非特异性相互作用可以在此短时间范围期间通过在高温下执行UV暴露来防止。结果显示，封闭的靶特异性引物仅在暴露于紫外光后在RT-PCR中延伸。
例示性实施方式
根据当前公开的主题提供的例示性实施方式包括但不限于以下：
实施方式1.一种在密闭容器中执行多阶段引物延伸反应的方法。所述方法包括a)在容器中制备引物延伸混合物，其中所述混合物包含i)多核苷酸靶标；ii)能够进行引物延伸的早期阶段引物；iii)后期阶段引物，所述后期阶段引物在3'末端处包含光可切割的封闭基团；iv)引物延伸酶；和v)引物延伸试剂。在制备所述混合物后密闭所述容器。所述方法还包括b)用所述早期阶段引物执行早期阶段引物延伸反应以产生靶扩增子或靶cDNA。所述方法包括c)将所述后期阶段引物解封闭以产生解封闭的后期阶段引物，其中所述解封闭步骤是在不打开所述容器的情况下执行的。所述方法还包括d)用所述解封闭的后期阶段引物和所述靶扩增子或靶cDNA执行后期阶段引物延伸反应。所述解封闭的后期阶段引物与所述靶扩增子或靶cDNA杂交并延伸。
实施方式2.根据实施方式1所述的方法，其中所述早期阶段引物包括含有5'区和3'区的靶特异性引物，其中所述3'区包含靶特异性序列，并且所述5'区包含通用序列。
实施方式3.根据实施方式2所述的方法，其中所述后期阶段引物包含通用引物，所述通用引物包含所述通用序列或其部分。
实施方式4.根据实施方式1至3中任一项所述的方法，其中所述早期阶段引物包括逆转录酶(RT)引物。
实施方式5.根据实施方式4所述的方法，其中所述后期阶段引物包括靶特异性引物。
实施方式6.根据实施方式1至5中任一项所述的方法，其中所述解封闭步骤(c)包括将所述密闭容器中的所述后期阶段引物暴露于紫外光。
实施方式7.根据实施方式1至6中任一项所述的方法，其中所述封闭的引物是根据式I的化合物：
Figure BDA0003846959920000321
Figure BDA0003846959920000331
其中R1是H或OH；碱基是胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤或鸟嘌呤，或其经修饰的嘧啶和嘌呤衍生物；可切割的终止部分是赋予所述化合物聚合酶终止性质的基团；任选的接头是二价基团；任选的报告分子是能够直接或间接地产生可检测信号的化学部分；并且引物是能够与多核苷酸靶标形成双链体的寡核苷酸。
实施方式8.根据实施方式7所述的方法，其中所述可切割的终止部分是根据下式的部分或它们的盐、互变异构体或旋光异构体：
Figure BDA0003846959920000332
其中：
R3是烷基(C≤8)或经取代的烷基(C1-8)；
R4是氢、羟基、卤素、氨基、硝基、氰基、叠氮基或巯基；烷基(C≤6)、酰基(C≤6)、烷氧基(C≤6)、酰氧基(C≤6)、烷基氨基(C≤6)、二烷基氨基(C≤6)、酰氨基(C≤6)，或这些基团中的任何基团的经取代形式；
R5和R6各自独立地为：氢、羟基、卤素、氨基、硝基、氰基、叠氮基或巯基；烷基(C≤6)、烯基(C≤6)、炔基(C≤6)、芳基(C≤6)、芳烷基(C≤8)、杂芳基(C≤6)、酰基(C≤6)、烷氧基(C≤6)、酰氧基(C≤6)、烷基氨基(C≤6)、二烷基氨基(C≤6)、酰氨基(C≤6)，或这些基团中的任何基团的经取代形式；下式的基团：
Figure BDA0003846959920000341
X是-O-、-S-、或-NH-；或烷二基(C≤12)、烯二基(C≤12)、炔二基(C≤12)，或这些基团中的任何基团的经取代形式；
Y是-O-、-NH-、烷二基(C≤12)或经取代的烷二基(C≤12)；n是0-6的整数；并且
m是0-6的整数；或者接头-报告分子。
实施方式9.根据实施方式7所述的方法，其中所述可切割的终止部分包括2-硝基苄基取代基。
实施方式10.根据实施方式7至9中任一项所述的方法，其中所述引物选自长度介于8个核苷酸至100个核苷酸之间的寡核苷酸。
实施方式11.根据实施方式7至10中任一项所述的方法，其中所述碱基选自由以下项组成的组：腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、它们的经修饰的嘧啶和嘌呤衍生物，以及它们的混合物。
实施方式12.一种用于执行多阶段引物延伸反应的组合物，所述组合物包含a)多核苷酸靶标；b)能够进行引物延伸的早期阶段引物；和c)后期阶段引物，所述后期阶段引物在3'末端处包含光可切割的封闭基团，其中所述组合物在制备所述组合物时密闭的容器中。
实施方式13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述后期阶段引物被配置用于通过暴露于紫外光来解封闭。
实施方式14.根据实施方式12至13中任一项所述的组合物，其中所述光可切割的封闭基团具有约90％至约100％的封闭效率。
实施方式15.根据实施方式12至14中任一项所述的组合物，所述组合物包含至少5对靶特异性引物，或者至少5对靶特异性引物，或者至少10对、或至少20对、或至少50对、或至少100对、或至少200对、或至少500对、或至少1,000对、或至少2,000对、或至少5,000对、或至少10,000对、或至少20,000对靶特异性引物。
实施方式16.根据实施方式12至15中任一项所述的组合物，所述早期阶段引物以0.01μM至0.5μM的浓度存在，并且所述后期阶段引物以0.2μM至1μM的浓度存在。
实施方式17.根据实施方式12至16中任一项所述的组合物，其中所述后期阶段引物包含选自由以下项组成的组的3'末端核苷酸：
5-[(S)-1-(5-甲氧基-2-硝基苯基)-2,2-二甲基-丙氧基]甲基-2'-脱氧-尿苷，
5-[(S)-1-(5-甲氧基-2-硝基苯基)-2,2-二甲基-丙氧基]甲基-2'-脱氧-腺苷，
5-[(S)-1-(5-甲氧基-2-硝基苯基)-2,2-二甲基-丙氧基]甲基-2'-脱氧-鸟苷，
5-[(S)-1-(5-甲氧基-2-硝基苯基)-2,2-二甲基-丙氧基]甲基-2'-脱氧-胞苷，
5-[(S)-1-(5-甲氧基-2-硝基苯基)-2,2-二甲基-丙氧基]甲基-2'-脱氧-胸苷，
以及它们的混合物，包括前述核苷酸中的任何两者、三者、四者或五者的混合物。
实施方式18.一种制备光可切割的封闭引物的方法，所述方法包括：a)提供具有3'末端的引物前体；以及b)i)形成所述引物前体与模板杂交的双链体，其中所述模板具有相对于所述引物前体的3'末端的至少一个核苷酸的5'突出端；以及通过用DNA聚合酶掺入包含光可切割的封闭基团的核苷酸，来使所述引物前体在其3'末端处延伸；或者ii)通过用模板非依赖性DNA聚合酶掺入包含光可切割的封闭基团的核苷酸，来使所述引物前体在其3'末端处延伸。
实施方式19.根据权利要求18所述的方法，其中所述包含光可切割的封闭基团的核苷酸是式II的化合物：
Figure BDA0003846959920000361
其中R1是H或OH；R2是H、单磷酸根、二磷酸根、三磷酸根或α硫代三磷酸根；碱基是胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤或鸟嘌呤，或其经修饰的嘧啶和嘌呤衍生物；可切割的终止部分是赋予化合物聚合酶终止性质的基团；任选的接头是二价基团；任选的报告分子是能够直接或间接地产生可检测信号的化学部分。

Claims (19)

1.一种在密闭容器中执行多阶段引物延伸反应的方法，所述方法包括：
a)在容器中制备引物延伸混合物，其中所述混合物包含：
i)多核苷酸靶标；
ii)能够进行引物延伸的早期阶段引物；
iii)后期阶段引物，所述后期阶段引物在3'末端处包含光可切割的封闭基团；
iv)引物延伸酶；以及
v)引物延伸试剂，
其中在制备所述混合物后封闭所述容器；
b)用所述早期阶段引物执行早期阶段引物延伸反应以产生靶扩增子或靶cDNA；
c)将所述后期阶段引物解封闭以产生解封闭的后期阶段引物，其中所述解封闭步骤是在不打开所述容器的情况下执行的；以及
d)用所述解封闭的后期阶段引物和所述靶扩增子或靶cDNA执行后期阶段引物延伸反应，
其中所述解封闭的后期阶段引物与所述靶扩增子或靶cDNA杂交并延伸。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述早期阶段引物包括含有5'区和3'区的靶特异性引物，其中所述3'区包含靶特异性序列，并且所述5'区包含通用序列。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述后期阶段引物包含通用引物，所述通用引物包含所述通用序列或其部分。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述早期阶段引物包括逆转录酶(RT)引物。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述后期阶段引物包括靶特异性引物。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述解封闭步骤(c)包括将所述密闭容器中的所述后期阶段引物暴露于紫外光。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述封闭的引物是根据式I的化合物：
Figure FDA0003846959910000021
其中：
R1是H或OH；
碱基是胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤或鸟嘌呤，或它们的经修饰的嘧啶和嘌呤衍生物；
可切割的终止部分是赋予所述化合物聚合酶终止性质的基团；
任选的接头是二价基团；
任选的报告分子是能够直接或间接地产生可检测信号的化学部分；并且
引物是能够与多核苷酸靶标形成双链体的寡核苷酸。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述可切割的终止部分是根据下式的部分或它们的盐、互变异构体或旋光异构体：
Figure FDA0003846959910000031
其中：
R3是烷基(C≤8)或经取代的烷基(C1-8)；
R4是氢、羟基、卤素、氨基、硝基、氰基、叠氮基或巯基；烷基(C≤6)、酰基(C≤6)、烷氧基(C≤6)、酰氧基(C≤6)、烷基氨基(C≤6)、二烷基氨基(C≤6)、酰氨基(C≤6)，或这些基团中的任何基团的经取代形式；
R5和R6各自独立地为：氢、羟基、卤素、氨基、硝基、氰基、叠氮基或巯基；烷基(C≤6)、烯基(C≤6)、炔基(C≤6)、芳基(C≤6)、芳烷基(C≤8)、杂芳基(C≤6)、酰基(C≤6)、烷氧基(C≤6)、酰氧基(C≤6)、烷基氨基(C≤6)、二烷基氨基(C≤6)、酰氨基(C≤6)，或这些基团中的任何基团的经取代形式；下式的基团：
Figure FDA0003846959910000032
X是-O-、-S-、或-NH-；或烷二基(C≤12)、烯二基(C≤12)、炔二基(C≤12)，或这些基团中的任何基团的经取代形式；
Y是-O-、-NH-、烷二基(C≤12)或经取代的烷二基(C≤12)；n是0-6的整数；并且
m是0-6的整数；或者接头-报告分子。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述可切割的终止部分包括2-硝基苄基取代基。
10.根据权利要求7所述的方法，其中所述引物选自长度介于8个核苷酸至100个核苷酸之间的寡核苷酸。
11.根据权利要求7所述的方法，其中所述碱基选自由以下项组成的组：腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、它们的经修饰的嘧啶和嘌呤衍生物，以及它们的混合物。
12.一种用于执行多阶段引物延伸反应的组合物，所述组合物包含：
a)多核苷酸靶标，
b)能够进行引物延伸的早期阶段引物；
c)后期阶段引物，所述后期阶段引物在3'末端处包含光可切割的封闭基团，并且
其中所述组合物在制备所述组合物时封闭的容器中。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述后期阶段引物被配置用于通过暴露于紫外光来解封闭。
14.根据权利要求12所述的组合物，其中所述光可切割的封闭基团具有约90％至约100％的封闭效率。
15.根据权利要求12所述的组合物，所述组合物包含至少5对靶特异性引物，或者至少5对靶特异性引物，或者至少10对、或至少20对、或至少50对、或至少100对、或至少200对、或至少500对、或至少1,000对、或至少2,000对、或至少5,000对、或至少10,000对、或至少20,000对靶特异性引物。
16.根据权利要求12所述的组合物，所述早期阶段引物以0.01μM至0.5μM的浓度存在，并且所述后期阶段引物以0.2μM至1μM的浓度存在。
17.根据权利要求16所述的组合物，其中所述后期阶段引物包含选自由以下项组成的组的3'末端核苷酸：
5-[(S)-1-(5-甲氧基-2-硝基苯基)-2,2-二甲基-丙氧基]甲基-2'-脱氧-尿苷，
5-[(S)-1-(5-甲氧基-2-硝基苯基)-2,2-二甲基-丙氧基]甲基-2'-脱氧-腺苷，
5-[(S)-1-(5-甲氧基-2-硝基苯基)-2,2-二甲基-丙氧基]甲基-2'-脱氧-鸟苷，
5-[(S)-1-(5-甲氧基-2-硝基苯基)-2,2-二甲基-丙氧基]甲基-2'-脱氧-胞苷，
5-[(S)-1-(5-甲氧基-2-硝基苯基)-2,2-二甲基-丙氧基]甲基-2'-脱氧-胸苷，
以及它们的混合物。
18.一种制备光可切割的封闭引物的方法，所述方法包括：
a)提供具有3'末端的引物前体；以及
b)i)形成所述引物前体与模板杂交的双链体，其中所述模板具有相对于所述引物前体的3'末端的至少一个核苷酸的5'突出端；以及通过用DNA聚合酶掺入包含光可切割的封闭基团的核苷酸，来使所述引物前体在其3'末端处延伸；或者
ii)通过用模板非依赖性DNA聚合酶掺入包含光可切割的封闭基团的核苷酸，来使所述引物前体在其3'末端处延伸。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述包含光可切割的封闭基团的核苷酸是式II的化合物：
Figure FDA0003846959910000051
其中：
R1是H或OH；
R2是H、单磷酸根、二磷酸根、三磷酸根或α-硫代三磷酸根；
碱基是胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤或鸟嘌呤，或它们的经修饰的嘧啶和嘌呤衍生物；
可切割的终止部分是赋予所述化合物聚合酶终止性质的基团；
任选的接头是二价基团；并且
任选的报告分子是能够直接或间接地产生可检测信号的化学部分。
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CN101068932B (zh) * 2004-10-27 2013-02-13 塞弗德公司 封闭系统多阶段核酸扩增反应
ES2376202T3 (es) * 2006-07-31 2012-03-09 Wanli Bi Amplificación de �?cidos nucleicos usando un oligonucleótido modificado reversiblemente.
US7897737B2 (en) * 2006-12-05 2011-03-01 Lasergen, Inc. 3′-OH unblocked, nucleotides and nucleosides, base modified with photocleavable, terminating groups and methods for their use in DNA sequencing
GB0712882D0 (en) * 2007-07-03 2007-08-15 Leicester University Of Nucleic acid amplification
KR101677772B1 (ko) * 2008-06-11 2016-11-18 레이저젠, 인코퍼레이티드 뉴클레오타이드 및 뉴클레오사이드 그리고 시퀀싱에서의 이들의 이용 방법
KR20130022437A (ko) * 2011-08-22 2013-03-07 삼성전자주식회사 광분해성 화합물을 사용한, 비특이적 증폭의 감소를 위한 신규한 ｐｃｒ 방법
US11371087B2 (en) * 2016-06-10 2022-06-28 Takara Bio Usa, Inc. Methods and compositions employing blocked primers

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