CN117858963A - 流通池表面图案化 - Google Patents

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CN117858963A CN202280046987.3A CN202280046987A CN117858963A CN 117858963 A CN117858963 A CN 117858963A CN 202280046987 A CN202280046987 A CN 202280046987A CN 117858963 A CN117858963 A CN 117858963A
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Abstract

将聚合物水凝胶施加到包括由间隙区域分开的凹入部的基板的表面上。每个凹入部包括被定位在第一区域处的UV阻挡层和对UV是透明的且与该第一区域相邻的第二区域。在施加该水凝胶之前或之后，将引物组接枝到该水凝胶。该引物组包括3’封闭的不可裂解的第一和第二前引物。从这些间隙区域去除该水凝胶或接枝层。在该第二区域内的该接枝层的第一预先确定的区域处：改变这些第一前引物以引入可裂解的第一引物；以及改变这些第二前引物以引入不可裂解的第二引物。在该第一区域内的该接枝层的第二预先确定的区域处：改变这些第一前引物以引入不可裂解的第一引物；以及封闭这些第二前引物以引入可裂解的第二引物。

Description

流通池表面图案化
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年12月27日提交的美国临时申请序列号63/293,959的权益，该美国临时申请的内容全文以引用方式并入本文。
序列表的参考
随附提交的序列表据此全文以引用方式并入。文件名称是ILI236BPCT_IP-2237-PCT2_Sequence_Listing_Sequence_Listing.xml，文件的大小为18,627字节，并且文件的创建日期为2022年12月13日。
背景技术
一些可用的核酸测序平台利用边合成边测序方法。利用这种方法，合成新生链，并且以光学和/或电子方式检测生长链中每种单体(例如，核苷酸)的添加。因为模板链指导新生链的合成，人们可根据在合成期间添加到生长链的一系列核苷酸单体推断出模板DNA的序列。在一些示例中，可使用顺序配对末端测序，其中对正向链进行测序和移除，然后对反向链进行构建和测序。在其他示例中，可使用同时配对末端测序，其中同时对正向链和反向链进行测序。
发明内容
对于同时配对末端测序的一些示例，不同引物组附接到流通池表面的每个凹入部内的不同区域。本文所述的方法从附接到凹入部中的每个凹入部中的聚合物水凝胶的单个引物组(本文也称为初始引物组)开始，然后在一个或多个区域改变该引物组以在这些凹入部内产生不同引物组。在这些示例中，单个引物组的改变发生在聚合物水凝胶和单个引物组被引入凹入部中之后。因此，将相同的聚合物水凝胶施加于凹入部中的每个凹入部中。因此，聚合物水凝胶不暴露于物理图案化，这可能是挑战性的，有时是不可再现的，并且导致来自不同引物组的不平衡簇强度。
附图说明
通过参考以下具体实施方式和附图，本公开的示例的特征将变得显而易见，其中类似的附图标号对应于类似但可能不相同的部件。为了简洁起见，具有先前描述的功能的附图标号或特征可结合或可不结合它们出现的其他附图来描述。
图1A是可用于本文所公开的方法的示例中的一个示例基板构型的剖视图；
图1B是可用于本文所公开的方法的示例中的另一个示例基板构型的剖视图；
图1C是可用于本文所公开的方法的示例中的又一个示例基板构型的剖视图；
图1D是可用于本文所公开的方法的示例中的再一个示例基板构型的剖视图；
图2A是用于本文所公开的流通池的一些示例中的示例引物组的示意图；
图2B是用于本文所公开的流通池的一些示例中的另一个示例引物组的示意图；
图3A至图3G是一起说明改变单个引物组中的引物中的至少一些引物的方法的示例的示意图，其中图3A描绘了施加到限定在基板中的凹入部的第一区域的紫外(UV)光阻挡层，以及施加在UV光阻挡层上和基板的暴露区域上的接枝层(包括单个引物组)，图3B描绘了施加在图3A的接枝层上的负性光刻胶，图3C描绘了由图3B的负性光刻胶形成的使得接枝层的一部分暴露的不溶性负性光刻胶，图3D描绘了在接枝层暴露于核酸酶以去除单个引物组的引物中的一些引物之后的聚合物水凝胶的引物去除部分，图3E描绘了接枝到图3D的引物去除部分的不同引物(与单个引物组中的那些相比)，图3F描绘了去除的不溶性负性光刻胶，并且图3G描绘了在不同区域中具有不同引物的凹入部，以及不含聚合物水凝胶和不同引物的间隙区域；
图4A至图4H是一起说明改变单个引物组中的引物中的至少一些引物的方法的另一个示例的示意图，其中图4A描绘了具有多深度凹入部的基板，图4B描绘了图4A的基板上的接枝引物层(包括单个引物组)，图4C描绘了施加在图4B的接枝层上的负性光刻胶，图4D描绘了由图4C的负性光刻胶形成的使得接枝层的一部分暴露的不溶性负性光刻胶，图4E描绘了在接枝层暴露于核酸酶以去除单个引物组的引物中的一些引物之后的聚合物水凝胶的引物去除部分，图4F描绘了接枝到图4E的引物去除部分的不同引物(与单个引物组中的那些相比)，图4G描绘了去除的不溶性负性光刻胶，并且图4H描绘了在不同区域中具有不同引物的多深度凹入部，以及不含聚合物水凝胶和不同引物的间隙区域；
图5A至图5H是一起说明改变单个引物组中的引物中的至少一些引物的方法的又一个示例的示意图，其中图5A描绘了具有多深度凹入部的基板，图5B描绘了图5A的基板上的接枝底物层(包括单个引物组)，图5C描绘了施加在图5B的接枝层上的正性光刻胶，图5D描绘了由图5C的正性光刻胶形成的使得接枝层的一部分暴露的不溶性正性光刻胶，图5E描绘了在接枝层暴露于核酸酶以去除单个引物组的引物中的一些引物之后的聚合物水凝胶的引物去除部分，图5F描绘了接枝到图5E的引物去除部分的不同引物(与单个引物组中的那些相比)，图5G描绘了去除的不溶性正性光刻胶，并且图5H描绘了在不同区域中具有不同引物的多深度凹入部，以及不含聚合物水凝胶和不同引物的间隙区域；
图6A至图6I是一起说明改变单个引物组中的引物中的至少一些引物的方法的又一个示例的示意图，其中图6A描绘了嵌入在限定在基板中的凹入部的一部分中的紫外(UV)光阻挡层，以及施加在UV光阻挡层上和凹入部的暴露区域上的接枝层(包括单个引物组，其中每个引物包括耐核酸酶修饰和光可裂解的封端基团)，图6B描绘了从不覆盖UV光阻挡层的引物去除光可裂解的封端基团，图6C描绘了不覆盖UV光阻挡层的引物的部分的消化，图6D描绘了与引物的剩余部分中的一些剩余部分和覆盖UV光阻挡层的引物中的一些引物杂交的第一引物再生模板，图6E描绘了聚合酶沿第一引物再生模板的延伸，图6F描绘了与引物的剩余部分中的一些其他剩余部分和覆盖UV光阻挡层的引物中的一些其他引物杂交的第二引物再生模板，图6G描绘了聚合酶沿第二引物再生模板的延伸，图6H描绘了在第二引物再生模板去杂交之后的图6G的凹入部，并且图6I描绘了从覆盖UV光阻挡层的引物去除光可裂解的封端基团；
图7A至图7M是一起说明改变单个引物组中的引物中的至少一些引物的方法的再一个示例的示意图，其中图7A描绘了嵌入在限定在基板中的凹入部的一部分中的紫外(UV)光阻挡层，以及施加在UV光阻挡层上和凹入部的暴露区域上的接枝层(包括单个引物组，其中每个引物包括光可裂解的封端基团)，图7B描绘了从不覆盖UV光阻挡层的引物去除光可裂解的封端基团，图7C描绘了与解封闭引物中的一些解封闭引物和封闭引物中的一些封闭引物杂交的第一引物再生模板，图7D描绘了聚合酶沿与解封闭引物杂交的第一引物再生模板的延伸，图7E描绘了与解封闭引物中的一些其他解封闭引物和封闭引物中的一些其他封闭引物杂交的第二引物再生模板，图7F描绘了聚合酶沿第二引物再生模板的延伸，图7G描绘了第二引物再生模板去杂交之后的引物，图7H描绘了UV光暴露以从覆盖UV光阻挡层的引物中去除可光裂解的封端基团，图7I描绘了与解封闭引物中的一些解封闭引物杂交的第一引物再生模板，图7J描绘了聚合酶沿与覆盖UV光阻挡层的解封闭引物杂交的第一引物再生模板的延伸，图7K描绘了与解封闭引物中的一些解封闭引物杂交的第二引物再生模板，图7L描绘了聚合酶沿与覆盖UV光阻挡层的解封闭引物杂交的第二引物再生模板的延伸，并且图7M描绘了凹入部中的两个不同引物组；
图8是包括粘结在一起的两个图案化结构并且在引物组改变已经发生之前的流通池的示例的剖视图；
图9是流通池的示例的顶视图；并且
图10A是流通池的流动通道的示例的放大局部剖面图；并且
图10B是流通池的流动通道的不同示例的放大局部剖面图。
具体实施方式
本文所公开的方法产生了适合用于同时配对末端测序的流通池。每种方法利用具有与其附接的单个(初始)引物组的聚合物水凝胶，并且涉及改变单个引物组中的引物中的至少一些引物。改变引物中的至少一些引物导致不同引物组位于聚合物水凝胶的不同区域。在不同区域的引物组具有正交裂解(线性化)化学成分。正交裂解化学成分可通过附接到不同组中的不同引物的相同或不同裂解位点实现。正交裂解化学成分使得能够在一个区域中产生正向扩增子链簇并且在另一个区域中产生反向扩增子链簇。正向链和反向链在空间上是分开的，这将来自两个读段的荧光信号分开，同时允许对每个读段的同时碱基检出。
定义
应当理解，除非另外指明，否则本文所用的术语将理解为具有其在相关领域中的普通含义。下面列出本文所用的若干术语及其含义。
除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代。
术语包含、包括、容纳和这些术语的各种形式彼此同义，并且意在是同样宽泛的。
术语顶部、底部、下部、上部、上等在本文中用于描述流通池和/或流通池的各个部件。应当理解，这些方向术语并非意在暗示特定取向，而是用于指定部件之间的相对取向。方向术语的使用不应被解释为将本文所公开的示例限制于任何特定取向。
术语第一、第二等也并非意在暗示特定的取向或顺序，而是用于将一个部件与另一个部件区分开来。
应当理解，本文提供的范围包括规定范围和规定范围内的任何值或子范围，如同此类值或子范围被明确列举一样。例如，约400nm至约1pm(1000nm)的范围应被解释为不仅包括明确列举的约400nm至约1pm的限值，而且包括单个值，诸如约708nm、约945.5nm等，以及子范围，诸如约425nm至约825nm、约550nm至约940nm等。
此外，当使用“约”和/或“基本上”来描述值时，它们意在涵盖与所述值的微小变化(至多+/-10％)。
“丙烯酰胺单体”是具有结构的单体或包含丙烯酰胺基团的单体。包含丙烯酰胺基团的单体的示例包括叠氮基乙酰氨基戊基丙烯酰胺：/>和N-异丙基丙烯酰胺：/>可使用其他丙烯酰胺单体。
如本文所用，术语“活化”是指在基板例如基部支持物的表面或多层结构的最外层生成反应性基团的过程。活化可以使用硅烷化或等离子体灰化来完成。虽然附图没有描绘来自等离子体灰化的单独的硅烷化层或-OH基团，但是应当理解，活化在活化的载体或层的表面产生硅烷化层或-OH基团以将聚合物水凝胶共价附接到下面的载体或层上。
如本文所用，“醛”是包含具有结构-CHO的官能团的有机化合物，其包括羰基中心(即，碳以双键键合到氧)，其中碳原子也键合到氢和R基团，诸如烷基或其他侧链。醛的通式结构是：
如本文所用，“烷基”是指完全饱和(即，不包含双键和三键)的直链或支链烃链。烷基基团可具有1至20个碳原子。典型的烷基基团包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基等。作为示例，名称“C1-C4烷基”指示烷基链中存在一至四个碳原子，即烷基链选自甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。
如本文所用，“烯基”是指包含一个或多个双键的直链或支链烃链。烯基基团可具有2至20个碳原子。示例性烯基基团包括乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基等。
如本文所用，“炔烃”或“炔基”是指包含一个或多个三键的直链或支链烃链。炔基基团可具有2至20个碳原子。
如本文所用，“芳基”是指在环骨架中仅包含碳的芳族环或环系(即，共用两个相邻碳原子的两个或更多个稠环)。当芳基为环系时，该环系中的每个环均为芳族的。芳基基团可具有6至18个碳原子。芳基基团的示例包括苯基、萘基、薁基和蒽基。
当与单个引物组(初始引物组)结合使用时，术语“改变”意指单个引物组内的引物中的一些引物暴露于改变引物的处理，使得它们不同于单个引物组内的引物。在一个示例中，单个引物组内的引物中的一些引物被去除并用对单个引物组中的引物具有正交裂解化学成分的引物替换。在另一个示例中，将单个引物组内的引物中的一些引物暴露于3’末端解封闭/去封闭处理，随后是外切核酸酶处理，随后是延伸活动，以便引入与单个引物组中的引物的裂解化学成分正交的裂解化学成分。在又一个示例中，单个引物组中的引物不具有任何线性化化学成分，并且单个引物组的这些不同区段被顺序地暴露于延伸活动以便引入正交裂解化学成分。
“胺”或“氨基”官能团是指-NRaRb基团，其中Ra和Rb各自独立地选自氢(例如)、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳环基、C6-10芳基、5元至10元杂芳基和5元至10元杂环，如本文所定义。
如本文所用，术语“附接”是指两个事物直接或间接地彼此接合、紧固、粘附、连接或结合的状态。例如，核酸可通过共价键或非共价键附接到官能化聚合物。共价键的特征在于原子之间共享电子对。非共价键是不涉及共享电子对的物理键，并且可包括例如氢键、离子键、范德华力、亲水相互作用和疏水相互作用。
“叠氮化物”或“叠氮基”官能团是指-N3。
如本文所用，“粘结区域”是指图案化结构的要粘结到另一种材料的区域，该另一种材料可以例如为间隔层、盖、另一个图案化结构等，或者它们的组合(例如，间隔层和盖，或者间隔层和另一个图案化结构)。形成于粘结区域处的粘结可为化学粘结(如上所述)或机械粘结(例如，使用紧固件等)。
如本文所用，“碳环基”意味着在环系主链中仅含有碳原子的非芳族环状环或环系。当碳环基为环系时，两个或更多个环可以以稠合、桥接或螺接的方式接合在一起。碳环基可具有任何饱和度，前提条件是环系中的至少一个环不是芳族的。因此，碳环基包括环烷基、环烯基和环炔基。碳环基团可具有3至20个碳原子。碳环的示例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环己烯基、2,3-二氢-茚、双环[2.2.2]辛烷基、金刚烷基和螺[4.4]壬烷基。
如本文所用，术语“羧酸”或“羧基”是指-COOH。
如本文所用，“亚环烷基”是指完全饱和的碳环或环系，其经由两个连接点附接到分子的其余部分。
如本文所用，“环烯基”或“环烯烃”是指具有至少一个双键的碳环或环系，其中该环系中没有环是芳族的。示例包括环己烯基或环己烯以及降冰片烯基或降冰片烯。同样如本文所用，“杂环烯基”或“杂环烯烃”意指在环主链中具有至少一个杂原子，具有至少一个双键的碳环或环系，其中该环系中没有环是芳族的。
如本文所用，“环炔基”或“环炔烃”是指具有至少一个三键的碳环或环系，其中该环系中没有环是芳族的。一个示例为环辛炔。另一个示例为双环壬炔。同样如本文所用，“杂环炔基”或“杂环炔烃”意指在环主链中具有至少一个杂原子，具有至少一个三键的碳环或环系，其中该环系中没有环是芳族的。
如本文所用，术语“沉积”是指任何合适的施加技术，其可为手动的或自动的，并且在一些情况下，导致表面特性的改性。一般来讲，可使用气相沉积技术、涂覆技术、接枝技术等进行沉积。一些具体示例包括化学气相沉积(CVD)、喷涂(例如，超声喷涂)、旋涂、厚涂或浸涂、刮涂刀涂覆、搅打分配、流动通过涂覆(flow through coating)、气溶胶印刷、丝网印刷、微接触印刷、喷墨印刷等。
如本文所用，术语“凹入部”是指具有表面开口的基部支持物或多层堆叠的层中的离散凹面特征部，该表面开口至少部分地被基部支持物或多层堆叠的层的间隙区域围绕。凹入部可在其表面中的开口处具有多种形状中的任一种，作为示例包括圆形、椭圆形、方形、多边形、星形(具有任何数量的顶点)等。与该表面正交截取的凹入部的横截面可为弯曲的、方形、多边形、双曲线形、圆锥形、角形等。凹入部也可能具有更复杂的架结构，诸如脊、台阶特征等。
当参考项目的集合使用时，术语“每个”旨在识别集合中的单个项目，但不一定是指集合中的每个项目。如果明确公开或上下文另有明确规定，则可能会出现例外情况。
如本文所用，术语“环氧”(也称为缩水甘油基或环氧乙烷基团)是指
如本文所用，术语“流通池”旨在表示具有其中可进行反应的流动通道、用于将试剂递送到流动通道的入口以及用于从流动通道中移除试剂的出口的容器。在一些示例中，流通池适于检测在该流通池中发生的反应。例如，流通池可包括允许对阵列、光学标记分子等进行光学检测的一个或多个透明表面。
如本文所用，“流动通道”或“通道”可为限定在两个粘结部件之间的区域，该区域可选择性地接纳液体样品。在一些示例中，流动通道可以限定在两个图案化结构之间，因此可以与这些图案化结构的表面化学成分流体连通。在一些示例中，流动通道可以限定在图案化结构与盖之间，因此可以与图案化结构的表面化学成分流体连通。
如本文所用，“杂芳基”是指在环骨架中含有一个或多个杂原子(即，除碳之外的元素，包括但不限于氮、氧和硫)的芳族环或环系(即，共用两个相邻原子的两个或更多个稠环)。当杂芳基是环系时，该环系中的每个环均是芳族的。杂芳基基团可具有5-18个环成员。
如本文所用，“杂环”意指在环主链中含有至少一个杂原子的非芳族环状环或环系。杂环可以稠合、桥接或螺接的方式接合在一起。杂环可具有任何饱和度，前提条件是环系中的至少一个环不是芳族的。在环系中，杂原子可存在于非芳族环或芳族环中。杂环基团可具有3至20个环成员(即，构成环主链的原子数，包括碳原子和杂原子)。在一些示例中，杂原子是O、N或S。
如本文所用，术语“肼”或“肼基”是指-NHNH2基团。
如本文所用，术语“腙”或“肼基”是指基团，其中Ra和Rb各自独立地选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳环基、C6-10芳基、5元至10元杂芳基和5元至10元杂环，如本文所定义。
如本文所用，“羟基”是指-OH基团。
如本文所用，术语“间隙区域”是指例如基部支持物或多层叠堆的层中将凹入部(凹形区域)隔开的区域。例如，间隙区域可将阵列的一个凹入部与阵列的另一个凹入部分开。彼此分开的两个凹入部可以是离散的，即彼此缺乏物理接触。在许多示例中，间隙区域是连续的，而凹入部是离散的，例如，如限定在其他连续表面中的多个凹入部的情况。在其他示例中，间隙区域和特征部是离散的，例如，由相应间隙区域分开的沟槽形状的多个凹入部的情况就是如此。由间隙区域提供的分离可以是部分分离或完全分离。间隙区域可具有与凹入部的表面材料不同的表面材料。例如，凹入部中可具有聚合物和引物组，并且间隙区域可不含聚合物和引物组。
如本文所用，“负性光刻胶”是指其中暴露于特定波长的光的部分变得不溶于显影剂的光敏材料。在这些示例中，不溶性负性光刻胶在显影剂中的溶解度小于5％。对于负性光刻胶，曝光会改变化学结构，从而使材料的暴露部分在显影剂中变得更难溶解(相比于未暴露部分)。不溶性负性光刻胶虽然不可溶于显影剂中，但是可以至少99％可溶于和显影剂不同的去除剂中。去除剂可以是例如在剥离过程中使用的溶剂或溶剂混合物。
与不溶性负性光刻胶相比，负性光刻胶没有暴露于光的任何部分至少95％可溶于显影剂。在一些示例中，负性光刻胶没有暴露于光的部分至少98％(例如99％、99.5％、100％)可溶于显影剂。
如本文所用，“腈氧化物”意指“RaC≡N+O”基团，其中Ra在本文定义。制备腈氧化物的示例包括通过用氯酰胺-T处理或通过碱基在酰亚胺氯[RC(CI)＝NOH]上的作用或通过羟胺与醛之间的反应由醛肟原位生成。
如本文所用，“硝酮”是指基团，其中R1、R2和R3可以是本文所定义的Ra基团和Rb基团中的任一者，不同的是R3不是氢(H)。
如本文所用，“核苷酸”包括含氮杂环碱基、糖以及一个或多个磷酸基团。核苷酸是核酸序列的单体单元。在RNA中，糖是核糖，并且在DNA中，糖是脱氧核糖，即在核糖中缺少存在于2’位置处的羟基基团的糖。含氮杂环碱基(即，核碱基)可为嘌呤碱基或嘧啶碱基。嘌呤碱基包括腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)以及它们的经修饰的衍生物或类似物。嘧啶碱基包括胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)以及它们的经修饰的衍生物或类似物。脱氧核糖的C-1原子与嘧啶的N-1或嘌呤的N-9键合。核酸类似物可具有改变的磷酸主链、糖或核碱基中的任一者。核酸类似物的示例包括例如通用碱基或磷酸-糖主链类似物，诸如肽核酸(PNA)。
在一些示例中，术语“在……上方”可表示一个部件或材料直接位于另一个部件或材料上。当一个直接在另一个上时，两个彼此接触。在其它示例中，术语“在……上方”可表示一个部件或材料间接位于另一个部件或材料上。所谓间接地，表示间隙或另外的部件或材料可位于两个部件或材料之间。
“图案化树脂”是指可具有限定于其中的凹入部的任何聚合物。在本文所公开的示例中的一些示例中，图案化树脂可具有吸收紫外光的部分和透射紫外光的其他部分，这部分取决于厚度。树脂以及用于使树脂图案化的技术的具体示例将在下文中进一步描述。
“图案化结构”是指包括图案样式的表面化学成分的单层基部支持物，或具有包括图案样式的表面化学成分的层的多层叠堆，所述图案例如在凹入部中。表面化学成分可包括聚合物水凝胶和本文所公开的引物组，其可例如用于文库模板捕获和扩增。
如本文所用，术语“多面体低聚倍半硅氧烷”是指作为二氧化硅(SiO2)和有机硅(R2SiO)之间的杂交中间体(例如RSiO1.5)的化学组合物。多面体低聚倍半硅氧烷的示例可以是如Kehagias等人在Microelectronic Engineering 86(2009)第776-778页中所述的，该文献以引用方式全文并入。在示例中，组合物是具有化学式[RSiO3/2]n的有机硅化合物，其中R基团可以是相同或不同的。多面体低聚倍半硅氧烷的示例R基团包括环氧基、叠氮化物/叠氮基、硫醇、聚(乙二醇)、降冰片烯、四嗪、丙烯酸酯和/或甲基丙烯酸酯，或另外例如烷基、芳基、烷氧基和/或卤代烷基基团。
如本文所用，“正性光刻胶”是指其中暴露于特定波长的光的部分变得可溶于显影剂的光敏材料。在这些示例中，正性光刻胶暴露于光的任何部分至少95％可溶于显影剂。在一些示例中，正性光刻胶暴露于光的部分至少98％(例如99％、99.5％、100％)可溶于显影剂。对于正性光刻胶，曝光会改变化学结构，从而使材料的暴露部分在显影剂中变得更易溶解(相比于未暴露部分)。
与可溶性正性光刻胶相比，正性光刻胶没有暴露于光的任何部分不可溶于(少于5％可溶于)显影剂。不溶性正性光刻胶虽然不可溶于显影剂中，但是可以至少99％可溶于和显影剂不同的去除剂中。在一些示例中，不溶性正性光刻胶至少98％(例如99％、99.5％、100％)可溶于去除剂。去除剂可以是在剥离过程中使用的溶剂或溶剂混合物。
如本文所用，“引物”被定义为单链核酸序列(例如，单链DNA)。本文称为扩增引物的一些引物用作模板扩增和簇生成的起点。本文称为测序引物的其它引物用作DNA合成的起点。引物的5’末端可被修饰以允许与聚合物的官能团进行偶联反应。引物长度可以是任何数目的碱基长度并且可包含多种非天然核苷酸。在示例中，测序引物为短链，范围为10至60个碱基，或20至40个碱基。术语“前引物”在本文中用于描述i)暴露于附加处理以产生完整引物的截短引物，或ii)具有位于距3’末端5个碱基至10个碱基处的光可裂解的封端基团的引物，使得在加工期间产生截短引物并且随后用于产生完整引物。另外，可裂解引物包括裂解位点，而不可裂解引物不包括裂解位点。
短语“单个引物组”是指包括两个不同单链核酸序列的多个引物或包括两个不同截短单链核酸序列的多个前引物或包括具有位于距3’末端5个碱基至10个碱基处的光可裂解的封端基团的两个不同引物的多个前引物。
如本文所用，“间隔层”是指将两个部件粘结在一起的材料。在一些示例中，间隔层可以是有助于粘结的辐射吸收材料，或者可与有助于粘结的辐射吸收材料接触。
术语“基板”是指在其上引入表面化学物的单层基部支持物或多层结构。
“硫醇”官能团是指-SH。
如本文所用，术语“四嗪”和“四嗪基”是指包含四个氮原子的六元杂芳基基团。四嗪可为任选取代的。
如本文所用，“四唑”是指包含四个氮原子的五元杂环基团。四唑可为任选取代的。
术语“透明”是指能够透射特定波长或波长范围的材料，例如，以基部支持物或层的形式。例如，该材料对用于以化学方式改变正性或负性光刻胶的波长和/或对移除3’封端基团可以是透明的。可使用透射率来量化透明度，即，落在主体上的光能与透过主体的光能的比率。透明基部支持物或透明层的透射率将取决于基部支持物或层的厚度、光的波长和其所暴露的光的剂量。在本文所公开的示例中，透明基部支持物或透明层的透射率可在0.25(25％)至1(100％)的范围内。例如，五氧化二钽(具有式Ta2O5的无机化合物)被认为是透明的，因为它对于从约0.35pm(350nm)至至少1.8pm(1800nm)范围内的波长具有从约0.25(25％)至1(100％)范围内的透射率。基部支持物或层的材料可以是纯材料、具有一些杂质的材料或材料的混合物，只要所得基部支持物或层能够具有期望的透射率即可。此外，取决于基部支持物或层的透射率，曝光的时间和/或光源的输出功率可以增加或减少，以通过透明基部支持物和/或层递送合适剂量的光能，从而实现期望的效果(例如，生成可溶性或不溶性光刻胶，去除3’封端基团等)。
基板构型
在本文所公开的方法中的每一种方法中，基板单独或与分开的UV光阻挡层组合用作图案化工具，因为图案化工具能够选择性地改变附接到基板的凹入部内的聚合物水凝胶的单个引物组。各种示例示于图1A至图1D中。
在图1A、图1B和图1C的示例中，基板10A、10B、10C是包括由间隙区域14分开的凹入部12的单层基部支持物。在这些示例中，基板10A、10B、10C可以是能够透射用于改变单个引物组的紫外光的任何材料。在一个示例中，基板10A、10B、10C能够透射可从单个引物组的暴露引物去除3’末端封端基团的紫外光。在另一个示例中，基板10A、10B、10C能够透射可使覆盖基板10A、10B、10C的光刻胶图案化的紫外光。在一些情况下，基板材料也可能够透射用于核酸测序的可见光。
在这些特定示例中，用于基板10A、10B、10C的合适材料包括硅氧烷、玻璃、改性或功能化玻璃、塑料(包括丙烯酸树脂、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚碳酸酯、环烯烃共聚物(COC)和一些聚酰胺)、二氧化硅或氧化硅(SiO2)、熔融二氧化硅、基于二氧化硅的材料、氮化硅(Si3N4)、无机玻璃、树脂等。可透射UV光的树脂的示例包括无机氧化物，诸如五氧化二钽(例如，Ta2O5)或其他一种或多种氧化钽(TaOx)、氧化铝(例如，AI2O3)、氧化硅(例如，SiO2)、氧化铪(例如，HfO2)等，或聚合物树脂，诸如基于多面体低聚倍半硅氧烷的树脂(例如，来自Hybrid Plastics的)、非多面体低聚倍半硅氧烷环氧树脂、聚(乙二醇)树脂、聚醚树脂(例如，开环环氧树脂)、丙烯酸树脂、丙烯酸酯树脂、甲基丙烯酸树脂、无定形含氟聚合物(例如，来自Bellex的/>)以及它们的组合。在一些示例中，所使用树脂的UV透射率(在所使用的预先确定的UV剂量下)的范围是从约0.5至约1，例如约0.75至约1，约0.9至约0.99。可调节树脂的厚度，使得对于所使用的UV剂量，整个树脂表现出所需的UV透射率。在一些情况下，树脂厚度为150nm或更小。
示例基板材料(例如，无机氧化物)中的一些示例基板材料可经由气相沉积、气溶胶印刷或喷墨印刷来选择性地施加，并且凹入部12可在该过程期间形成。其他示例材料，例如聚合物树脂，可被施加然后被图案化以形成凹入部12。例如，可使用合适的技术沉积聚合物树脂，诸如化学气相沉积、浸涂、浸渍涂布、旋涂、喷涂、搅打分配、超声喷涂、刮刀涂布、气溶胶印刷、丝网印刷、微接触印刷等。合适的图案化技术包括光刻、纳米压印光刻(NIL)、冲压技术、压花技术、模塑技术、微蚀刻技术、印刷技术等。
虽然在图1A、图1B和图1C中示出了两个凹入部12，但是应当理解，可设想凹入部12的许多不同布局，包括规则、重复和不规则图案。在示例中，凹入部12设置在六边形网格中，以实现紧密的堆积和改进的密度。其它布局可包括例如矩形布局、三角形布局等。在一些示例中，布局或图案可以是呈行和列的x-y格式。在一些其他示例中，布局或图案可为凹入部12和间隙区域14的重复布置。在另外的其他示例中，布局或图案可为凹入部12和间隙区域14的随机布置。
布局或图案可相对于限定区域中的凹入部12的密度(数量)来表征。例如，凹入部12可以大约2百万个/mm2的密度存在。可将密度调整为不同的密度，包括例如约100个/mm2、约1,000个/mm2、约10万个/mm2、约1百万个/mm2、约2百万个/mm2、约5百万个/mm2、约1千万个/mm2、约5千万个/mm2或更大或更小的密度。还应当理解，该密度可以介于选自上述范围的下限值中的一个值与上限值中的一个值之间，或者可以使用其它密度(在给定范围之外)。例如，高密度阵列可被表征为具有分开小于约100nm的凹入部12，中等密度阵列可被表征为具有分开约400nm至约1pm的凹入部12，并且低密度阵列可被表征为具有分开大于约1pm的凹入部12。
凹入部12的布局或图案也可根据或另选地根据平均节距，或从一个凹入部12的中心至相邻凹入部12的中心的间距(中心到中心间距)或从一个凹入部12的右边缘至相邻凹入部12的左边缘的间距(边缘到边缘间距)来表征。图案可以是规则的，使得围绕平均节距的变异系数较小，或者图案可以是非规则的，在这种情况下变异系数可以相对较大。在任一种情况下，平均节距可为例如约50nm、约0.15pm、约0.5pm、约1pm、约5pm、约10pm、约100pm或更大或更小。特定图案的平均节距可介于选自上述范围的下限值中的一个值与上限值中的一个值之间。在示例中，凹入部12具有约1.5pm的节距(中心至中心间距)。虽然已经提供了示例性平均节距值，但应当理解，可使用其他平均节距值。
每个凹入部12的大小可通过其体积、开口面积、深度和/或直径来表征。例如，体积可在约1×10-3μm3至约100μm3的范围内，例如，为约1×10-2μm3、约0.1μm3、约1μm3、约10μm3或更大或更小。又如，开口面积可在约1×10-3μm2约100μm2的范围内，例如，为约1×10-2μm2、约0.1μm2、约1μm2、至少约10μm2或更大或更小。再如，深度可在约0.1μm至约100μm的范围内，例如，为约0.5μm、约1μm、约10μm或更大或更小。又如，深度可在约0.1μm至约100μm的范围内，例如，为约0.5μm、约1μm、约10μm或更大或更小。对于又一个示例，直径或长度和宽度的范围可为约0.1μm至约100μm，例如约0.5μm、约1μm、约10μm或更大或更小。
在图1A、图1B和图1C中示出的示例中的每一个示例包括位于凹入部12的一部分上或嵌入在其中的分开的UV光阻挡层16或16’。在这些示例的任一个示例中，UV光阻挡层16、16’可以是能够吸收用于改变单个引物组的紫外光的任何材料。在一些情况下，UV光阻挡层16、16’还能够透射用于核酸测序的可见光。在这些情况下，UV光阻挡层16、16’可保留作为流通池的部件，而不是从流通池中去除。
UV光阻挡层16、16’的材料和/或材料的厚度被选择为使得层16、16’阻挡透过基板10A、10B、10C(例如，从侧面18A、18B、18C引入)的UV光的至少75％到达直接与UV光阻挡层16、16’成一直线定位的覆盖材料。用于形成UV光阻挡层16、16’的材料可以是钛、铬、铝、金或铜。在一些示例中，金属材料可至少基本上是纯的(<99％纯)。在其他示例中，只要UV光阻挡层16、16’对用于改变单个引物组的UV光是不透光的(不透明的或具有小于0.25的透射率)，就可使用所列元素或其他元素的分子或化合物。例如，可单独使用或与所列金属组合使用任何所列金属的氧化物(例如，二氧化钛、氧化铜、氧化铁、氧化钴等)。也可使用其他氧化物，诸如氧化锌或氧化铈，这取决于待使用的UV波长(因此被材料阻挡)。二氧化钛、氧化锌和氧化铈是能够吸收UV光和透射可见光的材料的示例。其他UV不透光材料包括含有UV吸收剂(诸如有机小分子(例如，芘)、染料(例如，来自ATTO-tec的ATTOTM390))的聚合物树脂，其被选择以吸收待用于该方法中的UV波长。在示例中，UV光阻挡层16、16’的厚度为至少15nm厚(例如，20nm、25nm、40nm等)。一些金属UV光阻挡层16、16’可更厚，例如具有范围从约100nm至约1000nm的厚度，以便最小化通过金属的等离子体效应。
等离子体效应可能无意地使覆盖UV光阻挡层16、16’的引物去封闭。因此，对于金属UV光阻挡层16、16’，可能期望包括有助于防止在背面UV暴露(即，从侧面18A、18B或18C引导UV光穿过基板10A、10B或10C)期间的去封闭的涂层。涂层的示例包括厚度范围从约10nm至约300nm的有机聚合物或金属氧化物材料。
在图1A和图1B所示的示例中，分开的UV光阻挡层16被定位在每个凹入部12的一部分上。如这些图中的每一个图中所描绘的，UV光阻挡层16与凹入部12的底表面20的一部分接触。UV光阻挡层16限定了用于待改变的单个引物组中的引物中的一些引物的图案，因此可施加UV光阻挡层16使得它覆盖凹入部12的一部分，包括侧壁中的一些侧壁和底部20中的一些底部，同时使凹入部12的另一部分暴露。如图1B所示，UV光阻挡层16也可被施加在间隙区域14上，该间隙区域与被涂覆的凹入部侧壁相邻。在图1A和图1B两者中，基板10A、10B的被UV光阻挡层16覆盖的部分在本文中被称为第一区域58，并且基板10B的不含UV光阻挡层16的部分在本文中被称为第二区域60。如将参考方法中的一些方法所讨论的，第一区域58对应于接枝层的预先确定的区域，其中引物中的至少一些引物将被改变。
在图1A和图1B所示的示例中，可使用与剥离技术或蚀刻技术组合的光刻过程来制造UV光阻挡层16。在其他示例中，选择性沉积技术(诸如化学气相沉积(CVD))及其变型(例如，低压CVD或LPCVD)、原子层沉积(ALD)和掩蔽技术可用于将UV光阻挡层16沉积在期望区域中。另选地，UV光阻挡层16可被施加在基板10A、10B上(包括在所有凹入部12上)，然后从期望的部分被选择性地去除(例如，经由掩蔽和蚀刻)。
在图1C的示例中，分开的UV光阻挡层16’被嵌入在每个凹入部12的一部分内。所谓“嵌入”意指UV光阻挡层16’的至少一部分在凹入部12的底表面20下方延伸。在一个示例中，如图1C中所描绘的，UV光阻挡层16’的表面22与凹入部12的底表面20基本上共面，并且UV光阻挡层16’的其余部分延伸到基板10C的深度中。在另一个示例中(图中未描绘)，UV光阻挡层16’可完全嵌入在基板10C中，使得UV光阻挡层16’的所有侧面(包括表面22)由基板10C或由将UV光阻挡层16’与聚合物水凝胶分离的附加材料层覆盖。
UV光阻挡层16’限定用于待改变的单个引物组中的引物中的一些引物的图案，因此UV光阻挡层16’可被嵌入使得它与凹入部12的一部分对准，同时使凹入部12的另一部分暴露。换句话讲，UV光阻挡层16’被嵌入在基板10C的与(待改变的接枝层的)预先确定的区域对应的第一区域58”中(特别地，在凹入部12中)，由此基板10C的第二区域60(特别地，在凹入部12中)没有嵌入的UV光阻挡层16’。
在图1C所示的示例中，当形成凹入部12时，可以压印或以其他方式限定基板10C的其中待制造UV光阻挡层16’的区域。选择性沉积技术(诸如化学气相沉积(CVD))及其变型(例如，低压CVD或LPCVD)、原子层沉积(ALD)和掩蔽技术可用于将UV光阻挡层16沉积在期望区域中。如果要完全嵌入UV光阻挡层16’，则可将附加基板10C材料或附加材料层施加在UV光阻挡层16’上。
因为UV光阻挡层16’嵌入在基板10C内，所以可能期望选择可阻挡用于引物组改变的UV光并且可透射用于测序的可见光的材料。如上所述，这些材料的一些示例包括二氧化钛、氧化锌和氧化铈。应当理解，这些材料可用于UV光阻挡层16(如图1A和图1B所示)，因此UV光阻挡层16的这些示例可保留在最终流通池中而不会有害地影响测序。
在其中期望将UV光阻挡层16、16’保持在最终流通池中的任何示例中，UV光阻挡层16、16’可涂覆有二氧化硅、五氧化二钽或任何聚合物树脂，这些聚合物树脂中的每一种聚合物树脂可被活化以实现与聚合物水凝胶的共价附接。这些材料中的一种或多种材料可用作附加材料层以将UV光阻挡层16’嵌入在基板10C中。这些附加材料层可具有约10nm至约300nm范围内的总厚度。
图1D中所示的基板10D的示例不包括UV光阻挡层16、16’。相反，基板10D具有不同的厚度t1、t2、t3，其中一些厚度(例如，t1)能够透射用于改变单个引物组的紫外光，并且另一些厚度(例如，t2、t3)能够吸收并因此阻挡用于改变单个引物组的紫外光。基板10D的紫外光透射部分用附图标记60’表示，并且基板10D的紫外光阻挡部分用附图标记58’表示。
在该示例中，基板10D可以是当暴露于特定UV光剂量时其UV吸光度可通过调整其厚度而改变的任何树脂材料。可使用先前所列树脂中的任一种树脂，只要当树脂通过侧面18D暴露于预先确定的UV光剂量时，较厚部分(例如，具有厚度t2和t3的那些部分)吸收UV光，并且较薄部分(例如，具有厚度t1的那些部分)透射用于引物组改变的期望量的UV光。在一个示例中，当暴露于范围从约30mJ/cm2至约60mJ/cm2的剂量时，具有约500nm的较厚部分和约150nm的较薄部分的非多面体低聚倍半硅氧烷环氧树脂将分别且有效地吸收和透射UV光。可使用其他厚度，并且可相应地调节UV剂量以实现在较厚区域中的期望吸收和在较薄区域中的透射。
UV剂量、UV吸收常数和基板10C厚度之间的相关性可表示为：
D0＝D×exp(-kd)
其中D0是改变单个引物组所需的UV剂量，D是必须施加到基板10D的实际UV剂量，k是吸收常数，并且d是基板10D的较薄部分的厚度。因此，实际UV剂量(D)可表示为：
D＝D0/exp(-kd)
变化的厚度t1、t2分别与限定在基板10D中的多深度凹入部12’的不同部分24、26对准，并且厚度t3与邻近多深度凹入部12’的间隙区域14对准。部分24是多深度凹入部12’的深部分，并且部分26是多深度凹入部12’的浅部分。如本文所用，术语“深部分”和“浅部分”是指多深度凹入部12’内的三维(3D)空间。当例如从多深度凹入部12’的开口测量时，深部分24具有比浅部分26大的深度。
图1A至图1D所示的基板10A、10B、10C、10D被描绘为单层基部支持物。在其他示例中，基板10A、10B、10C、10D(具有限定在其中的凹入部12或12’)可以是多层结构的顶层。在这些情况下，基板10A、10B、10C、10D可定位在能够透射用于改变单个引物组的紫外光的下面的基部支持物上。在一些情况下，这种下面的基部支持物还能够透射用于核酸测序的可见光。在这种多层结构的一个示例中，基板10A、10B、10B、10D是由玻璃支撑的图案化树脂。
聚合物水凝胶
具有UV光阻挡层16、16’的基板10A、10B、10C和具有不同厚度t1、t2、t3的基板10D可用于该方法的不同示例中，这些示例中的每个示例使用单个聚合物水凝胶。
聚合物水凝胶(例如，图2A中的附图标记28所示)可以是任何凝胶材料，当摄取液体时该凝胶材料可溶胀，并且当例如通过干燥去除液体时该凝胶材料可收缩。在示例中，聚合物水凝胶包括丙烯酰胺共聚物。丙烯酰胺共聚物的一些示例由以下结构(I)表示：
其中：
RA选自叠氮基、任选地取代的氨基、任选地取代的烯基、任选地取代的炔烃、卤素、任选地取代的腙、任选地取代的肼、羧基、羟基、任选地取代的四唑、任选地取代的四嗪、腈氧化物、硝酮、硫酸盐和硫醇；
RB为H或任选地取代的烷基；
Rc、RD和RE各自独立地选自H和任选地取代的烷基；
-(CH2)P-中的每一者可任选地被取代；
p为在1至50范围内的整数；
n为在1至50,000范围内的整数；并且
m为在1至100,000范围内的整数。
由结构(I)表示的丙烯酰胺共聚物的一个具体示例是聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺，PAZAM。
本领域的普通技术人员将认识到，结构(I)中反复出现的“n”和“m”特征的布置是代表性的，并且单体亚单元可以任何顺序存在于聚合物结构中(例如，无规、嵌段、图案化或它们的组合)。
丙烯酰胺共聚物的分子量可以在约5kDa至约1500kDa或者约10kDa至约1000kDa的范围内，或者在一个具体示例中可以为约312kDa。
在一些示例中，丙烯酰胺共聚物是线型聚合物。在一些其他的示例中，丙烯酰胺共聚物为轻度交联聚合物。
在其他示例中，凝胶材料可以是结构(I)的变型。在一个示例中，丙烯酰胺单元可用N,N-二甲基丙烯酰胺替换。在该示例中，结构(I)中的丙烯酰胺单元可用/>替代，其中RD、RE和RF各自为H或C1-C6烷基，并且RG和RH各自为C1-C6烷基(而不是丙烯酰胺情况下的H)。在该示例中，q可为1至100,000范围内的整数。在另一个示例中，除了丙烯酰胺单元之外，还可使用N,N-二甲基丙烯酰胺。在该示例中，除了反复出现的“n”和“m”特征之外，结构(I)还可包括/>其中RD、RE和RF各自为H或C1-C6烷基，并且RG和RH各自为C1-C6烷基。在该示例中，q可为1至100,000范围内的整数。
作为聚合物水凝胶的另一个示例，结构(I)中重复出现的“n”特征可用包括具有结构(II)的杂环叠氮基基团的单体替换：
其中R1为H或C1-C6烷基；R2为H或C1-C6烷基；L为包括直链的连接基，其具有2至20个选自碳、氧和氮的原子以及链中的碳和任何氮原子上的10个任选取代基；E为直链，其包括1至4个选自由碳、氧和氮组成的组的原子以及链中的碳和任何氮原子上的任选取代基；A为具有附接到N上的H或C1-C4烷基的N取代的酰胺；并且Z为含氮杂环。Z的示例包括作为单个环状结构或稠合结构存在的5至10个含碳环成员。Z的一些具体示例包括吡咯烷基、吡啶基或嘧啶基。作为又一个示例，该凝胶材料可以包括结构(III)和(IV)各自的重复单元：
其中R1a、R2a、R1b和R2b中的每一者独立地选自氢、任选地取代的烷基或任选地取代的苯基；R3a和R3b中的每一者独立地选自氢、任选地取代的烷基、任选地取代的苯基或任选地取代的C7-C14芳烷基；并且每个L1和L2独立地选自任选地取代的亚烷基连接基或任选地取代的杂亚烷基连接基。
在又一个示例中，使用硝基氧介导的聚合形成丙烯酰胺共聚物，并且因此至少一些共聚物链具有烷氧基胺端基。在共聚物链中，术语“烷氧基胺端基”是指休眠种-ONR1R2，其中R1和R2中的每一者可以相同或不同，并且可独立地为直链或支链烷基或环结构，并且其中氧原子附接到共聚物链的其余部分。在一些示例中，还可以将烷氧基胺引入到一些重复出现的丙烯酰胺单体中，例如在结构(I)的位置RA处。因此，在一个示例中，结构(I)包括烷氧基胺端基；并且在另一个示例中，结构(I)包括烷氧基胺端基和至少一些侧链中的烷氧基胺基团。
应当理解，可使用其他分子来形成聚合物水凝胶，只要它们能够被期望的化学物质(例如，单个引物组)官能化。聚合物水凝胶的合适材料的一些示例包括官能化硅烷，诸如降冰片烯硅烷、叠氮硅烷、炔官能化硅烷、胺官能化硅烷、马来酰亚胺硅烷，或者具有可以相应地附接期望的化学物质的官能团的任何其他硅烷。聚合物水凝胶的合适材料的其他示例包括具有胶态结构的那些，诸如琼脂糖；或具有聚合物网状结构的那些，诸如明胶；或具有交联聚合物结构的那些，诸如聚丙烯酰胺聚合物和共聚物、不含硅烷的丙烯酰胺(SFA)或SFA的叠氮化版本。合适的聚丙烯酰胺聚合物的示例可由丙烯酰胺和丙烯酸或含有乙烯基基团的丙烯酸合成，或由形成[2+2]光环加成反应的单体合成。聚合物水凝胶的合适材料的其他示例包括丙烯酰胺和丙烯酸酯的混合共聚物。含有丙烯酸类单体(例如，丙烯酰胺、丙烯酸酯等)的多种聚合物架构可以用于本文所公开的示例中，诸如支链聚合物，包括树枝状聚合物(例如，多臂聚合物或星型聚合物)、星形或星型嵌段聚合物等。例如，可以将单体(例如，丙烯酰胺、包含催化剂的丙烯酰胺等)无规地或以嵌段掺入树枝状聚合物的支链(臂)中。
聚合物水凝胶的凝胶材料可使用任何合适的共聚方法形成，诸如硝基氧介导的聚合(NMP)、可逆加成-断裂链转移(RAFT)聚合等。
聚合物水凝胶与下面的基板10A、10B、10C、10D的附接可通过共价键。在一些情况下，可首先例如通过硅烷化或等离子体灰化来激活下面的基板10A、10B、10C、10D。共价连接有助于在流通池的整个寿命中在各种用途期间将引物维持在期望的区域中。
方法
具有UV光阻挡层16、16’的基板10A、10B、10C和具有不同厚度t1、t2、t3的基板10D可用于该方法的不同示例中，这些示例中的每个示例涉及改变单个引物组。该方法的不同示例在图3至图7中列出的一系列图中示出。
图3至图6中列出的一系列图中所示的方法通常包括将聚合物水凝胶28施加到包括由间隙区域14分开的凹入部12或12’的基板10A、10B、10C或10D的表面上；在施加聚合物水凝胶28之前或之后，将引物组30或30’接枝到聚合物水凝胶28上以形成接枝层32或32’，引物组30或30’包括可裂解的第一引物34或34”和不可裂解的第二引物36或36”；以及在凹入部12或12’中的至少一些凹入部的一部分内的接枝层32或32’的预先确定的区域38处，改变可裂解的第一引物34或34”中的一些第一引物和不可裂解的第二引物36或36”中的一些第二引物以分别引入可裂解的第二引物40或40”和不可裂解的第一引物42或42”。
图7中列出的一系列图中所示的方法通常包括将聚合物水凝胶28施加到包括由间隙区域14分开的凹入部12的基板10A、10B或10C的表面上，每个凹入部12包括被定位在第一区域处的紫外光阻挡层16’和对紫外光是透明的且与第一区域相邻的第二区域；在施加聚合物水凝胶28之前或之后，将引物组30”接枝到聚合物水凝胶28以形成接枝层32”，引物组30”包括3’封闭的不可裂解的第一前引物46和3’封闭的不可裂解的第二前引物48；从间隙区域14去除聚合物水凝胶28或接枝层32”；在凹入部12中的至少一些凹入部的第二区域内的接枝层32”的第一预先确定的区域38处：改变3’封闭的不可裂解的第一前引物46以引入可裂解的第一引物34；以及改变3’封闭的不可裂解的第二前引物48以引入不可裂解的第二引物36；以及在凹入部12中的至少一些凹入部的第一区域内的接枝层32”的第二预先确定的区域38’处：改变3’封闭的不可裂解的第一前引物46以引入不可裂解的第一引物42；以及改变3’封闭的不可裂解的第二前引物48以引入可裂解的第二引物40。
本文所公开的前引物46、48的任何示例可用于该示例方法中。
在参考各系列图更详细地描述这些方法中的每种方法之前，参照图2A和图2B一般性地描述可裂解和不可裂解引物。在每种方法开始时，将单个引物组，例如30或30’(图2A或图2B中未显示)附接到聚合物水凝胶28。在接枝层32、32’的一个或多个区域处，使用本文所公开的方法改变初始引物组30、30’。改变的结果是两个引物组50A、52A(图2A)或50B、52B(图2B)。
引物组50A、52A或50B、52B(即，通过本文所公开的方法中的一种方法改变的那些)是相关的，因为一组50A、50B包括可裂解的第一引物34、34’和不可裂解的第二引物36、36’，并且另一组52A、52B包括不可裂解的第一引物42、42’和可裂解的第二引物40、40’。这些引物组50A、52A或50B、52B允许单个模板链被扩增并跨两个引物组50A、52A或50B、52B成簇，并且还使得能够在聚合物水凝胶28(或接枝层32、32’)的相邻区域38、38’上产生正向和反向链，这是由于在组50A、52A或50B、52B的相对引物上存在裂解基团54(图2A)或54、54’(图2B)。应当理解，引物34’、36’、40’、42’的引物(’)名称不是指引物34、36、40、42的互补序列，而是引物类型的另外的示例。
第一引物组50A、50B中的每一者包括可裂解的第一引物34或34’和不可裂解的第二引物36或36’；第二引物组52A、52B中的每一者包括不可裂解的第一引物42或42’和可裂解的第二引物40或40’。
不可裂解的第二引物36或36’和可裂解的第一引物34或34’是寡核苷酸对，例如，其中不可裂解的第二引物36或36’是正向扩增引物，并且可裂解的第一引物34或34’是反向扩增引物，或者其中不可裂解的第二引物36或36’是正向扩增引物，并且可裂解的第一引物34或34’是反向扩增引物。在第一引物组50A、50B的每个示例中，可裂解的第一引物34或34’包括裂解位点54，而不可裂解的第二引物36或36’不包括裂解位点54。
可裂解的第二引物40或40’和不可裂解的第一引物42或42’也是寡核苷酸对，例如，其中可裂解的第二引物40或40’是正向扩增引物，并且不可裂解的第一引物42或42’是反向扩增引物，或者其中不可裂解的第一引物42或42’是正向扩增引物，并且可裂解的第二引物40或40’是反向扩增引物。在第二引物组52A’、52B’的每个示例中，可裂解的第二引物40或40’包括可裂解位点54或54’，而不可裂解的第一引物42或42’不包括可裂解位点54或54’。
应当理解，第一引物组50A、50B的不可裂解的第二引物36或36’和第二引物组52A、52B的可裂解的第二引物40或40’具有相同的核苷酸序列(例如，两者都是正向扩增引物)，不同的是可裂解的第二引物40或40’包括整合到核苷酸序列中或整合到与核苷酸序列附接的接头56中的裂解位点54或54’。类似地，第一引物组50A、50B的可裂解的第一引物34或34’和第二引物组52A、52B的不可裂解的第一引物42或42’具有相同的核苷酸序列(例如，两者都是反向扩增引物)，不同的是可裂解的第一引物34或34’包括整合到核苷酸序列中或整合到与核苷酸序列附接的接头56中的裂解位点54。
应当理解，当第一引物34和42或34’和42’是正向扩增引物时，第二引物36和40或36’和40’是反向引物，反之亦然。
不可裂解的引物36、42或36’、42’可以是具有用于捕获和/或扩增目的的通用序列的任何引物，诸如P5和P7引物或者PA、PB、PC和PD引物的任何组合(例如，PA和PB、或PA和PD等)。
P5引物和P7引物的示例用在由Illumina Inc.销售的商用流通池的表面上，用于例如在HISEQTM、HISEQXTM、MISEQTM、MISEQDXTM、MINISEQTM、NEXTSEQTM、NEXTSEQDXTM、NOVASEQTM、ISEQTM、GENOME ANALYZERTM和其他仪器平台上进行测序。不可裂解的P5引物是：
不可裂解的P5：5’→3’
AATGATACGGCGACCACCGAGACTACAC(SEQ.ID.NO.1)
不可裂解的P7引物可以是以下中的任一种：
不可裂解的P7#1：5’→3’
CAAGCAGAAGACGGCATACGAAT(SEQ.ID.NO.2)
不可裂解的P7#2：5’→3’
CAAGCAGAAGACGGCATACAGAT(SEQ.ID.NO.3)
上述其他不可裂解的引物(PA-PD)包括：
不可裂解的PA 5’→3’
GCTGGCACGTCCGAACGCTTCGTTAATCCGTTGAG
(SEQ.ID.NO.4)
cPA(PA’)5’→3’
CTCAACGGATTAACGAAGCGTTCGGACGTGCCAGC
(SEQ.ID.NO.5)
不可裂解的PB 5’→3’
CGTCGTCTGCCATGGCGCTTCGGTGGATATGAACT
(SEQ.ID.NO.6)
cPB(PB’)5’→3’
AGTTCATATCCACCGAAGCGCCATGGCAGACGACG
(SEQ.ID.NO.7)
不可裂解的PC 5’→3’
ACGGCCGCTAATATCAACGCGTCGAATCCGCAACT
(SEQ.ID.NO.8)
cPC(PC’)5’→3’
AGTTGCGGATTCGACGCGTTGATATTAGCGGCCGT
(SEQ.ID.NO.9)
不可裂解的PD 5’→3’
GCCGCGTTACGTTAGCCGGACTATTCGATGCAGC
(SEQ.ID.NO.10)
cPD(PD’)5’→3’
GCTGCATCGAATAGTCCGGCTAACGTAACGCGGC
(SEQ.ID.NO.11)
这些引物是不可裂解的引物36、42或36’、42’，因为它们不包括裂解位点54、54’。应当理解，任何合适的通用序列均可以用作不可裂解的引物36、42或36’、42’。
可裂解的引物34、40或34’、40’的示例包括P5和P7引物或其他通用序列引物(例如，PA、PB、PC、PD引物)，其中相应的裂解位点54、54’掺入相应的核酸序列中(图2A)，或掺入将可裂解的引物34、40或34’、40’附接到聚合物水凝胶28的接头56中(图2B)。合适的裂解位点54、54’的示例包括酶促可裂解的核碱基或化学可裂解的核碱基、经修饰的核碱基，或者接头(例如，核碱基之间的接头)，如本文所述。裂解位点54、54’的一些具体示例包括尿嘧啶、8-氧代鸟嘌呤、烯丙基-T(具有烯丙基官能团的胸腺嘧啶核苷酸类似物)。裂解位点54、54’可在链中的任何点处掺入。
可裂解的引物34、40或34’、40’的一些具体示例显示如下，其中裂解位点示于“n”处：
可裂解的P5：5’→3’
AATGATACGGCGACCACCGAGAnCTACAC(SEQ.ID.NO.12)
其中“n”是尿嘧啶或烯丙基T
可裂解的P7引物可以是以下中的任一种：
P7#1：5’→3’
CAAGCAGAAGACGGCATACGAnAT(SEQ.ID.NO.13)
P7#2：5’→3’
CAAGCAGAAGACGGCATACnAGAT(SEQ.ID.NO.14)
P7#3：5’→3’
CAAGCAGAAGACGGCATACnAnAT(SEQ.ID.NO.15)
其中“n”是每个序列中的8-氧代鸟嘌呤。
在本文所公开的示例中的任何示例中，初始引物组30、30’还可包括用于捕获文库模板接种分子的PX引物。PX基序的密度应当相对低，以便使每个凹入部12、12’内的多克隆性最小化。PX捕获引物可以是：
PX 5’→3’
AGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGG(SEQ.ID.NO.16)
cPX(PX’)5’→3’
CCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCT(SEQ.ID.NO.17)
图2A和图2B描绘了附接到聚合物水凝胶28的引物组50A、52A、50B、52B的不同构型。更具体地，图2A和图2B描绘了可使用的引物34、36或34’、36’和40、42或40’、42’的不同构型。
在图2A所示的示例中，引物组50A和52A的引物34、36和40、42直接附接到聚合物水凝胶28，例如，无需接头56。聚合物水凝胶28具有表面官能团，这些表面官能团可将端基固定在初始引物组30、30’的引物的5’末端，因此固定在使用本文所公开的方法产生的引物34、36和40、42的该末端。
同样在图2A所示的示例中，可裂解的引物34、40各自的裂解位点54、54’掺入引物的序列中。应当理解，在相应引物组50A、52A的可裂解引物34、40中可使用相同类型的裂解位点54或不同类型的裂解位点54、54’。例如，裂解位点54是尿嘧啶碱基，并且可裂解的引物34、40分别是P5U和P7U。应当理解，可被聚合酶掺入的任何其他可裂解的核苷酸可用作裂解位点54。尿嘧啶碱基或其他裂解位点也可掺入PA、PB、PC和PD引物中的任一种以产生可裂解的引物34、40。在该示例中，寡核苷酸对34、36的不可裂解的引物36可以是P7，并且寡核苷酸对40、42的不可裂解的引物42可以是P5。因此，在该示例中，第一引物组50A包括P7、P5U，并且第二引物组52A包括P5、P7U。引物组50A、52A具有相反的直链化化学物质，其在扩增、簇生成和直链化之后，允许在聚合物水凝胶28的一个区域38中形成正向模板链，并允许在聚合物凝胶28的另一个区域38’上形成反向链。
在图2B所示的示例中，引物组50B和52B的引物34’、36’和40’、42’通过接头56附接到聚合物水凝胶28。聚合物水凝胶28具有表面官能团，这些表面官能团可将接头56的端基固定在初始引物组30、30’的引物的5’末端，因此固定在使用本文所公开的方法产生的引物34’、36’和40’、42’的该末端。
合适接头46的示例可以包括核酸接头(例如，10个核苷酸或更少)，或者非核酸接头，诸如聚乙二醇链、烷基基团或碳链、具有邻二醇的脂肪族接头、肽接头等。核酸接头的一个示例是聚T间隔区，但是也可以使用其他核苷酸。在一个示例中，间隔区是6T至10T间隔区。以下是核苷酸的一些示例，包括具有末端炔烃基团的非核酸接头(其中B是核碱基并且“寡核苷酸”是引物序列)：
在图2B所示的示例中，引物34’、42’具有相同的序列(例如，P5)以及相同或不同的接头56。引物42’是不可裂解的，而引物34’包括掺入接头56中的裂解位点54。同样在该示例中，引物36’、40’具有相同的序列(例如，P7)以及相同或不同的接头56。引物36’是不可裂解的，并且引物40’包括掺入接头56中的裂解位点54或54’。在可裂解的引物34’、40’的接头56中可使用相同类型的裂解位点54或不同类型的裂解位点54、54’。引物组50B、52B具有相反的直链化化学物质，其在扩增、簇生成和直链化之后，允许在聚合物水凝胶28的一个区域38中形成正向模板链，并允许在聚合物凝胶28的另一个区域38’上形成反向链。
虽然裂解位点54或54、54’在图2B中示为接头56的一部分，但是应当理解，引物34’、40’的裂解位点54或54、54’可掺入到引物序列中而非接头56中。
在图2A和图2B所示的示例中，引物34、36和40、42或34’、36’和40’、42’与聚合物水凝胶28的附接使引物34、36和40、42或34’、36’和40’、42’的模板特异性部分自由地与其同源模板退火，而3’羟基自由地用于引物延伸。
虽然在图2A或图2B中未示出，但可裂解的第一引物34和不可裂解的第二引物36可包括耐核酸酶修饰。这些示例引物的示例在图6A中以附图标记34”和36”示出。耐核酸酶修饰(图6A中的附图标记68)是核酸序列的键、核苷酸类似物或一些其他改变，使得耐核酸酶引物34”和36”对外切核酸酶和/或内切核酸酶的3’→5’酶活性具有抗性。合适的耐核酸酶修饰68的示例包括硫代磷酸酯键、膦酸甲酯、肽核酸、吗啉代、2’-O-甲基和包括亚磷酰胺C3间隔区的核苷酸。
在可裂解的第一耐核酸酶引物34”的一些示例中，耐核酸酶修饰68相对于裂解位点54被定位在5’处，该裂解位点相对于3’光可裂解的封端基团被定位在5’处(图6A中的附图标记70)。在其中3’光可裂解的封端基团70本身不赋予耐核酸酶的情况下，可裂解的第一耐核酸酶引物34”还可包括相对于光可裂解的封端基团70被定位在3’的第二耐核酸酶修饰(未示出)。在不可裂解的第二耐核酸酶引物36”的一些示例中，耐核酸酶修饰68相对于3’末端被定位在5’处。在其中3’光可裂解的封端基团70本身不赋予耐核酸酶的情况下，不可裂解的第二耐核酸酶引物36”还可包括相对于光可裂解的封端基团70被定位在3’的第二耐核酸酶修饰(未示出)。在这些情况中的任何情况下，耐核酸酶修饰68的位置应当在核酸酶消化/裂解之后留下足够的引物序列用于杂交和延伸。如所指出的，单个耐核酸酶修饰68或多个耐核酸酶修饰68可被掺入到相应引物34”、36”中。作为可裂解的第一耐核酸酶引物34”的一个示例，三个或更多个硫代磷酸酯键可在相对于裂解位点54的位置为5’的位置处开始以排掺入。该数量的硫代磷酸酯键可增加可裂解的第一耐核酸酶引物34”的耐核酸酶。
可裂解的第一耐核酸酶引物34”和不可裂解的第二耐核酸酶引物36”中的每一者包括3’光可裂解的封端基团70。3’光可裂解的封端基团70可连接到引物34”、36”的3’末端的核苷酸中糖分子的3’氧原子。可使用可经由暴露于紫外光而可去除的任何封端基团。不同的3’光可裂解的封端基团的示例包括(
(其中B是碱基)和
(它们各自在约300nm至约365nm的波长范围内是光可裂解的)。3’光可裂解的封端基团70是可移除的，如参考图6A至图6I中所示的方法所述。
现在将描述用于产生引物组50A、52A或50B、52B的方法。
图3A至图3G描绘了该方法的一个示例。该示例以基板10B为例进行描述，但是应当理解，也可使用基板10A。
如参考图1B所述，基板10B是紫外光透明基板，并且UV光阻挡层16是紫外光吸收材料。在施加聚合物水凝胶28之前，图3A至图3G中所示的方法的一些示例涉及将紫外光阻挡层16选择性地施加到基板10B的与(待改变的接枝层32的)预先确定的区域对应的第一区域58，由此基板10B的第二区域60(包括凹入部12中的至少一些凹入部的第二部分)不含UV光阻挡层16。另选地，可使用参考图1B所述的方法中的任何方法产生UV光阻挡层16。在图1B和图3A所示的示例中，凹入部12的大约一半和与该一半相邻的间隙区域14涂覆有紫外光阻挡层16，并且凹入部12的另一半和与该一半相邻的间隙区域14没有紫外光阻挡层16。
在该示例方法中，将聚合物水凝胶28施加到基板10B和UV光阻挡层16上，并且在施加聚合物水凝胶28之前或之后，将初始引物组30接枝到聚合物水凝胶28上。可使用本文所公开的聚合物水凝胶28的任何示例，并且初始引物组30包括可裂解的第一引物34或34’和不可裂解的第二引物36或36’。引物34、36示于图3A至图3G中。
在一个示例中，施加聚合物水凝胶28，然后将初始引物组30接枝到其上。聚合物水凝胶28可存在于混合物(例如，与水的混合物或与乙醇和水的混合物)中。然后可使用旋涂或者浸渍或浸涂或者正压或负压下材料流或者另一种合适的沉积技术将混合物施加到基板10B和UV光阻挡层16。这些类型的技术覆盖地沉积聚合物水凝胶28。根据聚合物水凝胶28的化学性质，可将所施加的混合物暴露于固化过程。在示例中，固化可在室温(例如，约25℃)至约95℃范围内的温度下进行约1毫秒至约几天范围内的时间。
虽然在图3A至图3G中未示出，但是在这些方法的一些示例中，可在引物34、36接枝之前从间隙区域14去除聚合物水凝胶28。
该抛光过程可用化学浆料(包含例如研磨剂、缓冲剂、螯合剂、表面活性剂和/或分散剂)来进行，该化学浆料可从间隙区域14去除聚合物水凝胶28，而不会对区域14下面的基板10B造成有害影响。另选地，可利用不包括磨料颗粒的溶液执行抛光。
该化学浆料可用于化学机械抛光系统，以对间隙区域14的表面进行抛光。抛光头/抛光垫或其他抛光工具能够对可能存在于间隙区域14上方的聚合物水凝胶28进行抛光，与此同时在凹入部12中留下至少基本上完整的聚合物水凝胶28。例如，抛光头可以是Strasbaugh ViPRR II抛光头。
清洁和干燥过程可在抛光之后进行。清洁过程可利用水浴和超声处理。水浴可维持在约22℃至约30℃范围内的相对较低的温度。干燥过程可包括旋转干燥，或经由另一种合适技术进行的干燥。
在该示例中，然后可将初始引物组30的引物34、36接枝到聚合物水凝胶28上。作为示例，接枝可以通过以下方式来实现：流通式沉积(例如，使用暂时性结合的盖)、泡涂、喷涂、搅打分配，或通过另一种合适的方法。这些示例技术中的每一种技术可利用引物溶液或混合物，该引物溶液或混合物可包括引物34、36；水；缓冲液；和催化剂。对于接枝方法中的任一种接枝方法，引物34、36附接到聚合物水凝胶28的反应性基团。
在另一个示例中，将引物34、36接枝到聚合物水凝胶28上，然后施加并固化预接枝的聚合物水凝胶。在这些示例中，不进行另外的引物接枝。在该方法的这些示例中，预接枝的聚合物水凝胶28可在进行引物改变之前从间隙区域14中去除。
图3A描绘了施加在基板10B的暴露表面上和UV光阻挡层16上的接枝层32。接枝层32可与基板10B共价结合，例如当基板10B已如本文所述活化时(例如，使用硅烷化或等离子体灰化)。
在图3A至图3G的方法中，改变可裂解的第一引物34中的一些第一引物和不可裂解的第二引物36中的一些第二引物以引入可裂解的第二引物40和不可裂解的第一引物42包括：在接枝层32上沉积负性光刻胶62(图3B)；引导紫外光穿过基板10B(从侧面18B)，由此覆盖第二区域60的负性光刻胶62的部分变成覆盖第二区域60处的接枝层32的不溶性负性光刻胶62’，并且覆盖第一区域58的负性光刻胶62的部分(例如62”)保持可溶(图3B)；去除负性光刻胶的可溶部分62”，从而暴露接枝层32的预先确定的区域38(图3C)；将接枝层32的预先确定的区域38暴露于核酸酶以消化可裂解的第一引物34中的一些第一引物和一些不可裂解的第二引物36中的第二引物并产生接枝层32的引物耗尽部分64(图3D)；以及将可裂解的第二引物40和不可裂解的第一引物42接枝到引物耗尽部分64(图3E)。
如图3B所示，负性光刻胶62沉积在接枝层32上。可使用本文列出的沉积技术中的任一种沉积技术。合适的负性光刻胶62的示例包括系列光刻胶(购自Futurrex)。其他合适的负性光刻胶62包括SU-8系列和/>系列(两者均购自Kayaku AdvancedMaterials,Inc.)，或UVNTM系列(购自DuPont)。
然后将负性光刻胶62暴露于穿过基板10B的紫外光剂量，其中从侧面18B引入光。UV光阻挡层16阻挡光到达覆盖UV光阻挡层16的负性光刻胶62，因此该部分保持可溶。因此，可溶性负性光刻胶62”覆盖基板10B的第一部分58”。负性光刻胶62的剩余部分暴露于光，因此变得不可溶。因此，不溶性负性光刻胶62’覆盖基板10B的第二部分60。
图3C描绘了当可溶负性光刻胶62”被去除时的情况。可溶负性光刻胶62”可使用任何合适的显影剂去除。用于负性光刻胶的合适显影剂的示例包括碱性水溶液，诸如稀释的氢氧化钠、稀释的氢氧化钾，或者不含金属离子的有机TMAH(四甲基氢氧化铵)的水溶液。可溶性负性光刻胶62”的去除暴露出接枝层32的预先确定的区域38，其中引物34、36将被改变。
在该示例方法中，引物34、36改变涉及去除可裂解的第一引物34中的一些第一引物和不可裂解的第二引物36中的一些第二引物，并用具有正交裂解化学成分的引物40、42替代这些引物34、36。在该示例方法中，将接枝层32的预先确定的区域38暴露于核酸酶以消化该区域38处的可裂解的第一引物34中的至少一些第一引物和不可裂解的第二引物36中的至少一些第二引物。核酸酶是酶，诸如核酸外切酶或核酸内切酶。核酸酶具有3’→5’活性。在示例中，核酸酶选自核酸酶P1、核酸酶BAL-31、DNA酶I和微球菌核酸酶、外切核酸酶I、热不稳定外切核酸酶I、外切核酸酶T、外切核酸酶VII、绿豆核酸酶和外切核酸酶V。如图3C所示，核酸酶消化来自预先确定的区域38的引物34、36中的一些或全部引物。这产生了接枝层32的引物耗尽部分64，如图3D所示。应当理解，接枝层32的引物耗尽部分64是聚合物水凝胶28，因为引物34、36已经被去除。被不溶性负性光刻胶62’覆盖的引物34、36保持完整，因为它们不暴露于核酸酶。加热可用于使一些核酸酶失活。
可进行洗涤过程以从表面去除核酸酶和任何消化的引物34、36。洗涤过程可涉及具有表面活性剂(例如，来自Croda的20(聚乙二醇脱水山梨糖醇单月桂酸酯))的水。
然后将可裂解的第二引物40和不可裂解的第一引物42接枝到先前的接枝层32的引物耗尽部分64(即，其中引物34、36被去除的聚合物水凝胶28)。这在图3E中示出。虽然可裂解的第二引物40和不可裂解的第一引物42示于图3E中，但是应当理解可使用可裂解的第二引物40’和不可裂解的第一引物42’。引物40、42可使用本文列出的接枝技术中的任何接枝技术进行接枝。引物40、42在引物耗尽部分64(其对应于预先确定的区域38)处附接到聚合物水凝胶28的残余官能团(例如，叠氮化物)。
因为引物40、42在引物耗尽部分64处附接到聚合物水凝胶28的残余官能团(例如，叠氮化物)，所以封端分子没有被引入到接枝层32的任何部分。封端分子先前已用于使聚合物水凝胶28的残余官能团失活，使得随后的接枝引物不附接到聚合物水凝胶28。然而，已发现这些封端分子在光刻胶下扩散，这些光刻胶可处于适当位置以保护聚合物水凝胶28的其他区域，因此可使残余官能团失活，其中可能已期望随后的引物接枝。通过不利用封端分子，该示例方法避免了与此类分子相关联的潜在挑战。另外，在该示例方法中使用的核酸酶体积大，并且不太容易在不溶性负性光刻胶62’下扩散。因此，因为覆盖基板10B的区域60的引物34、36和聚合物水凝胶28的残余官能团被不溶性负性光刻胶62’覆盖，所以它们基本上被屏蔽而不被消化和引物40、42接枝。
在一些示例中，将接枝层32的预先确定的区域38暴露于核酸酶以产生引物耗尽部分64，以及将可裂解的第二引物40和不可裂解的第一引物42接枝于引物耗尽部分64均在具有约0.5M盐至约5M盐的盐溶液中进行。合适的盐水溶液的示例包括约0.5M氯化钠至约5M氯化钠、约0.5M硫酸钠至约2M硫酸钠、约0.5M氯化钾至约3M氯化钾、约0.5M Na3C6H5O7柠檬酸钠至约2M柠檬酸钠、约0.5M碳酸钠至约2M碳酸钠或约0.5M磷酸钠至约2M磷酸钠。盐溶液有助于使聚合物水凝胶28去溶胀，从而进一步降低核酸酶在不溶性负性光刻胶62’下面扩散的可能性。当使用高盐条件时，可能需要使用耐盐核酸酶，诸如来自ArcticZymes的盐活性核酸酶(SAN)。
现在参考图3F和图3G，该方法还可包括去除不溶性负性光刻胶62’，从而暴露第二区域60处的接枝层32；以及从间隙区域14去除可裂解的第一引物34、不可裂解的第二引物36、可裂解的第二引物40和不可裂解的第一引物42。
不溶性负性光刻胶62’可经由剥离过程去除。剥离过程可涉及用于所使用的负性光刻胶62的类型的合适移除剂。例如，固化的、不溶性负性光刻胶62’可用去除剂诸如二甲基亚砜(DMSO)通过超声处理、丙酮洗涤或基于NMP(N-甲基-2-吡咯烷酮)的剥离剂洗涤来剥离。该去除过程使下面的接枝层32(即，具有接枝于其上的引物34、36的聚合物水凝胶28)保持完整。
在该方法的一些示例中，在从间隙区域14去除可裂解的第一引物34、不可裂解的第二引物36、可裂解的第二引物40和不可裂解的第一引物42之前(如参考图3G所述)，该方法还包括去除紫外光阻挡层16，由此至少50％的可裂解的第二引物40和不可裂解的第一引物42保持完整。紫外光阻挡层16的去除可涉及去除紫外光阻挡层16并增加剩余的聚合物水凝胶28和下面的基板10B之间的粘附性的过程。
紫外光阻挡层16可通过湿法蚀刻过程去除，这取决于紫外光阻挡层16的材料。在示例中，紫外光阻挡层16(例如，具有约30nm厚度的铝)可通过暴露于1％至2％KOH溶液或碳酸钠缓冲液(pH为约10)中约3分钟至5分钟来蚀刻，而没有包括搅拌或超声处理的机械应力。可通过稀释蚀刻剂和增加蚀刻过程的持续时间来减慢蚀刻过程，这可改善聚合物水凝胶28的保留。紫外光阻挡层16的去除并不去除聚合物水凝胶28(或与其附接的引物40、42)，但是在区域58处暴露基板10B的表面。下面的基板10B也可对湿法蚀刻过程是惰性的。
紫外光阻挡层16的去除在基板10B的表面和区域58处的聚合物水凝胶28之间产生间隙。可进行多种方法来增加聚合物水凝胶28和区域58处的基板表面之间的粘附性。
以下是可用于增加聚合物水凝胶28和区域58处的基板表面之间的粘附性的方法的示例。
在一个示例中，增加聚合物水凝胶28和区域58处的基板表面之间的粘附性涉及加热聚合物水凝胶28和区域58处的基板表面。加热可加速聚合物水凝胶28和区域58处的基板表面之间的共价键合。在示例中，加热可在约55℃至约65℃范围内的温度下进行约25分钟至约35分钟范围内的时间。在另一个示例中，加热可在约60℃的温度下进行约30分钟的时间。
在另一个示例中，增加聚合物水凝胶28和区域58处的基板表面之间的粘附性涉及在聚合物水凝胶28上施加保护性涂层(未示出)(附接有引物40、42和34、36)；加热聚合物水凝胶28和区域58处的基板表面；以及去除保护涂层。保护涂层可使用水溶液产生，该水溶液包括高达约15％(质量比体积)的水溶性材料，该材料选自聚乙烯醇聚乙烯醇、聚乙烯醇/聚乙二醇接枝共聚物(其一个示例包括购自BASF Corp.的IR)、蔗糖、聚丙烯酰胺、葡聚糖(例如，分子量为200,000Da)、聚丙烯酰胺(例如，分子量为40,000Da、200,000Da等)、聚乙二醇、乙二胺四乙酸钠盐(即，EDTA)、三(羟甲基)氨基甲烷与乙二胺四乙酸、(三(2-羧乙基)膦)、三(3-羟丙基三唑甲基)胺、红菲咯啉二磺酸二钠盐、羟基官能聚合物、甘油或柠檬酸钠盐水。可使用任何合适的沉积技术来施加水溶液。在施加水溶液之后，可将其加热以蒸发水并形成保护涂层。所描述的用于增加聚合物水凝胶28和区域58处的基板表面之间的粘附性的加热过程可在保护涂层处于适当位置的情况下进行。然后可通过在期望的时间暴露于水来去除保护涂层。
在又一个示例中，增加聚合物水凝胶28和区域58处的基板表面之间的粘附性涉及选择性硅烷化区域58处的基板表面。对于选择性硅烷化，可使用硅烷，该硅烷包括可附接到聚合物水凝胶28的官能团的官能团和可附接到基板表面的官能团。合适的硅烷的示例包括炔基硅烷和降冰片烯硅烷。氨基硅烷或炔基硅烷可附接到聚合物水凝胶28的叠氮化物官能团。降冰片烯硅烷可分别附接到官能化层的叠氮化物官能团或四嗪。炔基硅烷可包括环炔烃不饱和部分，诸如O-炔丙基-N-(三乙氧基甲硅烷基丙基)氨基甲酸酯、环辛炔、环辛炔衍生物或双环壬炔(例如，双环[6.1.0]壬-4-炔或其衍生物、双环[6.1.0]壬-2-炔或双环[6.1.0]壬-3-炔)。降冰片烯硅烷可以是降冰片烯衍生物，例如取代碳原子之一而包含氧或氮的(杂)降冰片烯。降冰片烯硅烷的示例包括[(5-双环[2.2.1]庚-2-烯基)乙基]三甲氧基硅烷。
将硅烷引入到聚合物水凝胶28可摄取(例如，吸收)的水性或其他溶剂基溶液中，并且在硅烷和相应官能团之间发生适当反应。可使用任何合适的技术(例如，旋涂或本文所公开的其他沉积方法)来施加水性或溶剂基硅烷溶液。另选地，气相沉积(例如，YES方法)可用于纯硅烷(即，不在溶液中)。
如图3G所示，可裂解的第一引物34、不可裂解的第二引物36、可裂解的第二引物40和不可裂解的第一引物42然后可从间隙区域14去除。引物34、36、40、42和下面的聚合物水凝胶28可使用如本文所述的抛光过程从间隙区域14去除。应当理解，如果抛光过程没有在聚合物水凝胶28施加之后和引物34、36接枝之前或者在施加预接枝的聚合物水凝胶28之后立即进行，则可在该方法的这一点处进行。
所得结构示于图3G中，其包括在凹入部12的空间上分开的区域处具有两种不同引物组50A、52A的聚合物水凝胶28。
在一些示例中，紫外光阻挡层16对于在测序操作中使用的可见光也是透明的。在这些示例中，紫外光阻挡层16可不被移除，如本文参考图3F所述。在这些示例中，可能期望将UV光阻挡层16共形涂覆到基板10B的区域58，使得其不填充凹入部12如图3A中所示的部分，而是与凹入部12如图1B中所示的部分处的表面对准。因此，当进行抛光时，引物40、42和聚合物水凝胶28从间隙区域14被去除，但保留在凹入部12的部分中的紫外光阻挡层16上。另选地，在紫外线阻挡层16保留在凹入部12内的情况下，也可使用基板10A。
在其他示例中，图3A至图3G所示的方法的修改版本可利用图1C所示的基板10C来进行。在该示例中(如参考图1C所述)，基板10C是紫外光透明基板，其包括嵌入在基板10C的与预先确定的区域38对应的第一区域58中的紫外光阻挡和可见光透明层(UV光阻挡层16’的一个示例)，由此基板10C的第二区域60(包括凹入部12中的至少一些凹入部的第二部分)没有嵌入的紫外光阻挡和可见光透明层16’。UV光阻挡层16’可完全嵌入在基板材料中，或者可具有施加在UV光阻挡层16’上的附加材料层。
在该示例方法中，改变可裂解的第一引物34中的一些第一引物和不可裂解的第二引物36中的一些第二引物以引入可裂解的第二引物40和不可裂解的第一引物42包括：在接枝层32上沉积负性光刻胶62(如参考图3B所述)；引导紫外光穿过基板10C(从侧面18C)，由此覆盖第二区域60的负性光刻胶62的部分变成覆盖第二区域60处的接枝层32的不溶性负性光刻胶62’，并且覆盖第一区域58的负性光刻胶62的另一个部分(例如62”)保持可溶(如参考图3B所述)；去除负性光刻胶的可溶部分62”，从而暴露接枝层32的预先确定的区域38(如参考图3C所述)；将接枝层32的预先确定的区域38暴露于核酸酶以消化可裂解的第一引物34中的一些第一引物和一些不可裂解的第二引物36中的第二引物并产生接枝层32的引物耗尽部分64(如参考图3D所述)；以及将可裂解的第二引物40和不可裂解的第一引物42接枝到引物耗尽部分64(如参考图3E所述)。
当使用包括UV光阻挡和可见光透明层16’的基板10C时，图3A至图3G所示的方法的修改版本不包括层16’的去除。相反，层16’保留在被定位在基板10C和聚合物水凝胶28的附接到引物40、42的改变部分之间的流通池中。
图3A至图3G中所示的方法的修改版本还包括去除不溶性负性光刻胶62’，从而暴露第二区域60处的接枝层32(如参考图3F所述)；以及从间隙区域14去除可裂解的第一引物34、不可裂解的第二引物36、可裂解的第二引物40和不可裂解的第一引物42(连同聚合物水凝胶28)。
图4A至图4H描绘了该方法的另一个示例。本实施例利用基板10D。这样，如参考图1D所述，基板10D对于可见光是透明的；每个凹入部是多深度凹入部12’，其包括与浅部分26相邻的深部分24；每个多深度凹入部12’的深部分24覆盖基板10D(具有厚度h)的紫外光透明部分60’；并且每个多深度凹入部12’的间隙区域14和浅部分26覆盖基板10D的紫外光阻挡部分58’(具有厚度t3和t2)。图4A中示出了包括基板10D的单个多深度凹入部12’的一部分。
如图4B所示，将聚合物水凝胶28施加到基板10D上，并且在施加聚合物水凝胶28之前或之后，将初始引物组30接枝到聚合物水凝胶28上。可使用本文所公开的聚合物水凝胶28的任何示例，并且初始引物组30包括可裂解的第一引物34或34’和不可裂解的第二引物36或36’。引物34、36示于图4B至图4H中。
在一个示例中，施加聚合物水凝胶28，然后将初始引物组30接枝到其上。这些过程可如参考图3A所述来进行。在另一个示例中，将引物34、36接枝到聚合物水凝胶28上，然后将预接枝的聚合物水凝胶施加到基板10D上并固化。
在该示例方法中，改变可裂解的第一引物34中的一些第一引物和不可裂解的第二引物36中的一些第二引物以引入可裂解的第二引物40和不可裂解的第一引物42包括：在接枝层32上沉积负性光刻胶62(图4C)；引导紫外光穿过基板10D(从侧面18D)，由此深部分24中的负性光刻胶62的部分变成覆盖深部分24处的接枝层32的不溶性负性光刻胶62’，并且覆盖间隙区域14并且处于浅部分26中的负性光刻胶62的部分(例如，62”)保持可溶(图4C和图4D)；去除负性光刻胶的可溶部分62”，从而暴露接枝层32的预先确定的区域38(图4D)；将接枝层32的预先确定的区域38暴露于核酸酶以消化可裂解的第一引物34中的一些第一引物和一些不可裂解的第二引物36中的第二引物并产生(先前的)接枝层32的引物耗尽部分64(图4E)；以及将可裂解的第二引物40和不可裂解的第一引物42接枝到引物耗尽部分64(图4F)。
示于图4C中的负性光刻胶62可以是本文列出的任何示例，并且可使用本文所公开的技术中的任何技术来施加。如图4D所示，紫外光可通过侧面18D被引入并且被引导穿过基板10D。具有厚度t2和t3的基板10D的部分58’吸收光，因此阻挡光到达浅部分26和间隙区域14中的负性光刻胶62。因此，可溶性负性光刻胶62”覆盖浅部分26和间隙区域14。负性光刻胶62的剩余部分，即覆盖具有厚度t1的基板10D的部分60’的剩余部分，暴露于光并且因此变得不可溶。因此，不溶性负性光刻胶62’存在于深部分24中并覆盖基板10D的部分60’。
然后，如图4D所示，使用本文列出的显影剂中的任何显影剂去除可溶性负性光刻胶62”。可溶性负性光刻胶62”的去除暴露出接枝层32的预先确定的区域38，其中引物34、36将被改变。
在该示例方法中，引物34、36改变涉及去除可裂解的第一引物34中的一些第一引物和不可裂解的第二引物36中的一些第二引物，并用具有正交裂解化学成分的引物40、42替代这些引物34、36。可如参考图3D所述进行引物34、36的去除，其中核酸酶用于消化可裂解的第一引物34中的一些第一引物和不可裂解的第二引物36中的一些第二引物。这产生了接枝层32的引物耗尽部分64。应当理解，接枝层32的引物耗尽部分64是聚合物水凝胶28，因为引物34、36已经被去除。在该示例中，如图4E所示，引物耗尽部分64位于浅部分26中和间隙区域14上。同样在该示例中，被不溶性负性光刻胶62’覆盖的引物34、36保持完整，因为它们不暴露于核酸酶。
然后将可裂解的第二引物40和不可裂解的第一引物42接枝到引物耗尽部分64，如图4F所示。引物40、42接枝可如参考图3E所定义的那样进行。
在该示例方法中，将接枝层32的预先确定的区域38暴露于核酸酶以产生引物耗尽部分64，以及将可裂解的第二引物40和不可裂解的第一引物42接枝到引物耗尽部分64均可在本文所述的具有约0.5M盐至约5M盐的任何盐溶液中进行。在高盐条件下使用耐盐核酸酶可能是理想的。
图4A至图4H中所示的方法还包括去除不溶性负性光刻胶62’，从而在深部分24处暴露接枝层32(图4G)；以及从间隙区域14去除可裂解的第二引物40和不可裂解的第一引物42(图4H)。不溶性负性光刻胶62’可使用任何合适的去除剂经由剥离过程去除，例如，如参考图3F所述。引物40、42和下面的聚合物水凝胶28可使用抛光过程从间隙区域14中去除，例如，如参考图3G所述。
所得结构示于图4H中，其包括在多深度凹入部12’内的空间上分开的区域处具有两种不同引物组50A、52A的聚合物水凝胶28。
图5A至图5H描绘了该方法的又一个示例。该示例利用基板10D并且类似于图4A至图4H中所述的方法，不同之处在于使用正性光刻胶66代替负性光刻胶62。
图5A所示的基板10D与图4A所示和所述的基板相同。
如图5B所示，将聚合物水凝胶28施加到基板10D上，并且在施加聚合物水凝胶28之前或之后，将初始引物组30接枝到聚合物水凝胶28上。可使用本文所公开的聚合物水凝胶28的任何示例，并且初始引物组30包括可裂解的第一引物34或34’和不可裂解的第二引物36或36’。引物34、36示于图5B至图5H中。
在一个示例中，施加聚合物水凝胶28，然后将初始引物组30接枝到其上。这些过程可如参考图3A所述来进行。在另一个示例中，将引物34、36接枝到聚合物水凝胶28上，然后将预接枝的聚合物水凝胶施加到基板10D上并固化。
在该示例方法中，改变可裂解的第一引物34中的一些第一引物和不可裂解的第二引物36中的一些第二引物以引入可裂解的第二引物40和不可裂解的第一引物42包括：在接枝层32上沉积正性光刻胶66(图5C)；引导紫外光穿过基板10D(从侧面18D)，由此正性光刻胶66的覆盖间隙区域14并且处于浅部分26中的部分变成覆盖间隙区域14和浅部分26处的接枝层32的不溶性正性光刻胶66’，并且深部分24中的正性光刻胶66的部分(例如，66”)变成可溶(图5C和图5D)；去除正性光刻胶的可溶部分66”，从而暴露接枝层32的预先确定的区域38(图5D)；将接枝层32的预先确定的区域38暴露于核酸酶以消化可裂解的第一引物34中的一些第一引物和一些不可裂解的第二引物36中的第二引物并产生接枝层32的引物耗尽部分64(图5E)；以及将可裂解的第二引物40和不可裂解的第一引物42接枝到引物耗尽部分64(图5F)。
所施加的正性光刻胶66示于图5C中。合适的正性光刻胶的示例包括S1800系列或/>1500系列，两者均购自Kayaku Advanced Materials,Inc.。合适的正性光刻胶的另一个示例为SPRTM-220(来自DuPont)。正性光刻胶66可使用本文所公开的技术中的任何技术来施加。
如图5D所示，紫外光可通过侧面18D被引入并且被引导穿过基板10D。具有厚度t2和t3的基板10D的部分58’吸收光，因此阻挡光到达浅部分26中的正性光刻胶66并且覆盖间隙区域14。这些部分变得不可溶，因此不可溶正性光刻胶66’覆盖浅部分26和间隙区域14。正性光刻胶66的剩余部分，即覆盖具有厚度t1的基板10D的部分60’的剩余部分，暴露于光并且因此变得可溶。因此，可溶性正性光刻胶66”存在于深部分24中并覆盖基板10D的部分60”。
然后，如图5D所示，使用用于正性光刻胶66的合适显影剂来去除可溶性正性光刻胶66”。用于正性光刻胶66的合适显影剂的示例包括碱性水溶液，诸如稀释的氢氧化钠、稀释的氢氧化钾，或者不含金属离子的有机TMAH(四甲基氢氧化铵)的水溶液。可溶性正性光刻胶66”的去除暴露出接枝层32的预先确定的区域38，其中引物34、36将被改变。
在该示例方法中，引物34、36改变涉及去除可裂解的第一引物34中的一些第一引物和不可裂解的第二引物36中的一些第二引物，并用具有正交裂解化学成分的引物40、42替代这些引物34、36。可如参考图3D所述进行引物34、36的去除，其中核酸酶用于消化可裂解的第一引物34中的一些第一引物和不可裂解的第二引物36中的一些第二引物。这产生了接枝层32的引物耗尽部分64。应当理解，接枝层32的引物耗尽部分64是聚合物水凝胶28，因为引物34、36已经被去除。在该示例中，如图5E所示，引物耗尽部分64位于深部分24中。同样在该示例中，被不溶性正性光刻胶66’覆盖的引物34、36保持完整，因为它们不暴露于核酸酶。
然后将可裂解的第二引物40和不可裂解的第一引物42接枝到引物耗尽部分64，如图5F所示。引物40、42接枝可如参考图3E所定义的那样进行。
在该示例方法中，将接枝层32的预先确定的区域38暴露于核酸酶以产生引物耗尽部分64，以及将可裂解的第二引物40和不可裂解的第一引物42接枝到引物耗尽部分64均可在本文所述的具有约0.5M盐至约5M盐的任何盐溶液中进行。
图5A至图5H中所示的方法还包括去除不溶性正性光刻胶66’，从而在间隙区域14和浅部分26处暴露接枝层32(图5G)；以及从间隙区域14去除可裂解的第一引物34和不可裂解的第二引物36(图5H)。不溶性正性光刻胶66’可经由剥离过程使用用于不溶性正性光刻胶66’的任何合适的去除剂来去除。合适的去除剂的示例包括二甲基亚砜(DMSO)通过超声处理、丙酮洗液、丙二醇单甲醚乙酸酯洗液或基于NMP(N-甲基-2-吡咯烷酮)的剥离剂洗涤。引物34、36和下面的聚合物水凝胶28可使用例如如参考图3G所述的抛光过程从间隙区域14去除。
所得结构示于图5H中，其包括在多深度凹入部12’内的空间上分开的区域处具有两种不同引物组50A、52A的聚合物水凝胶28。
由图3系列至图5系列中所示的方法产生的图案化结构(例如，其一部分示于图3G、图4H和图5H中)可粘结至另一个图案化结构或粘结至盖以形成流通池的示例。基板10A、10B、10C、10D可在其周边处和/或在通道(这些通道中的每个通道包括多个凹入部12、12’)之间具有粘结区域，该粘结区域可用于附接两个图案化结构或图案化结构和盖。粘结过程和流通池的细节在下文名称为“流通池”的部分中进一步详细描述。
图6系列和图7系列中所示的方法使用与图3系列至图5系列中所示的方法不同的初始引物组30’和30”。图6系列和图7系列中所示的方法可在两个图案化结构(例如，在每个凹入部12中具有聚合物水凝胶28和引物组30’或30”的基板)已经粘结在一起之后或在一个图案化结构已经粘结到盖之后进行。因此，流动通过方法可用于进行图6系列和图7系列中所示的引物改变。这部分是由于以下事实：在引物改变之后不需要从间隙区域14去除材料，并且因为在这些方法中不使用光刻胶。具有两个粘结的图案化结构74、74’并且在改变初始引物组30’、30”之前的流通池72的示例大体示于图8中。图8将在图6系列和图7系列的整个描述中被引用；然而，如上所述，粘结过程和流通池72的细节在下文名称为“流通池”的部分中进一步详细地描述。
图6A至图6I所示的方法利用引物组30’。如本文所述，引物组30’中的可裂解的第一引物34”中的每个第一引物包括被定位在裂解位点54的5’处并且距该裂解位点预先确定的距离的3’光可裂解的封端基团70和耐核酸酶修饰68，并且不可裂解的第二引物36”中的每个第二引物包括没有裂解位点54的3’光可裂解的封端基团70和耐核酸酶修饰68。这些引物34、36示于图6A中。在图6A中，每个凹入部12包括被定位在第一区域58”处的紫外光阻挡层16’(或者如果使用基板10A或10B则为16)，并且每个凹入部12的第二区域60”对紫外光是透明的，其中第二区域60”对应于预先确定的区域38(其中将发生至少一些引物改变)。
虽然在图6A至图6I中未示出，但是该方法的示例涉及生成图案化结构74、74’(图8)，将图案化结构74、74’粘结在一起或者将一个图案化结构74和盖(未示出)粘结在一起，然后在流通池72中执行引物34”、36”改变。
为了产生每个图案化结构74、74’，在基板10A、10B或10C中限定凹入部12，并且将UV光阻挡层16或16’掺入(例如，施加、嵌入等)到基板10A、10B、10C的第一区域58、58”中，如参考图1A、图1B或图1C所述。然后，施加接枝层32’。在该示例方法中，施加接枝层32’涉及将接枝层32’引入凹入部12和间隙区域14；以及从间隙区域14去除接枝层32’。使用任何合适的沉积技术将本文所公开的聚合物水凝胶28的任何示例施加到基板10A、10B或10C上，并且在施加聚合物水凝胶28之前或之后，使用任何合适的接枝技术将初始引物组30’接枝到聚合物水凝胶28上。然后可使用本文所公开的抛光过程从间隙区域14去除接枝层32’。所得的图案化结构74、74’包括在每个凹入部12内的接枝层32’和不含接枝层32’的间隙区域14。图案化结构74的一个凹入部12示于图6A中。
在图6A至图6I所示的示例中，改变可裂解的第一引物34”中的一些第一引物和不可裂解的第二引物36”中的一些第二引物以引入可裂解的第二引物40”和不可裂解的第一引物42”涉及顺序改变可裂解的第一引物34”中的一些第一引物以引入不可裂解的第一引物42”和改变不可裂解的第二引物36”中的一些第二引物以引入可裂解的第二引物40”。
可裂解的第一耐核酸酶引物34”的改变示于图6B至图6E中，并且不可裂解的第二耐核酸酶引物36”的改变示于图6F至图6H中。
改变可裂解的第一耐核酸酶引物34”中的一些第一耐核酸酶引物(图6B)以引入不可裂解的第一引物42”(图6E)涉及：引导紫外光穿过基板10C(从侧面18C)，从而从覆盖第二区域60”的可裂解的第一引物34”和不可裂解的第二引物36”去除3’光可裂解的封端基团70，由此覆盖第一区域58”的可裂解的第一引物34”和不可裂解的第二引物36”保持被封闭(图6B)；将接枝层32’暴露于外切核酸酶，从而消化可裂解的第一引物34”和不可裂解的第二引物36”的覆盖第二区域60”的部分，其中消化部分包括从相应3’末端至耐核酸酶修饰68(图6C)；使第一引物再生模板76分别与可裂解的第一耐核酸酶引物34的覆盖第二区域60”的剩余部分78’杂交以及与覆盖第一区域58”的可裂解的第一耐核酸酶引物34”杂交(图6D)；使用包含胸腺嘧啶碱基的核苷酸混合物，在可裂解的第一耐核酸酶引物34的剩余部分78’处发起聚合酶沿第一引物再生模板76的延伸以产生不可裂解的第一耐核酸酶引物42”(图6E)；以及使第一引物再生模板76去杂交。
图6B描绘了通过基板10C的侧面18C引入紫外光。UV光的波长足以从暴露于光的可裂解的第一引物34”和不可裂解的第二引物36”去除3’光可裂解的封端基团70。在该示例中，UV光在第二区域60”处透过基板10C。因此，可裂解的第一引物34”和不可裂解的第二引物36”在第二区域60”处暴露于UV光，这触发了3’光可裂解的封端基团70的去除。解封闭引物分别以附图标记78和80表示。相反，UV光阻挡层16’在第一区域58”处阻挡光到达可裂解的第一引物34”和不可裂解的第二引物36”，因此这些引物34”、36”保持3’被封闭。应当理解，UV光也可在间隙区域14处透过基板10C，因为不存在UV光阻挡层16’。
在第二区域60”中的引物34”、36”在3’处被解封闭之后，将接枝层32’暴露于外切核酸酶。如所指出的，在该示例中，核酸酶作为外切核酸酶；其示例包括外切核酸酶I、热不稳定外切核酸酶I、外切核酸酶T、外切核酸酶VII、绿豆核酸酶和外切核酸酶V。由于核酸酶具有3’→5’活性，其能够消化覆盖第二区域60”的解封闭的可裂解的第一耐核酸酶引物78的一部分和解封闭的不可裂解的第二耐核酸酶引物80的一部分。被消化的部分从解封闭引物78、80的相应3’末端延伸至耐核酸酶修饰68。耐核酸酶修饰68对核酸酶消化/裂解不敏感。因此，解封闭的可裂解的第一引物78和解封闭的不可裂解的第二引物80的相对于耐核酸酶修饰68被定位在5’处的这些部分被保护免受核酸酶消化/裂解。消化之后剩余的引物的部分在图6C中以附图标记78’和80’示出。覆盖第一区域58”的引物34”、36”的3’光可裂解的封端基团70”封闭外切核酸酶的3’→5’活性，因此这些引物34”、36”保持完整，如图6C所示。
可将洗涤溶液引入流通池72中以除去外切核酸酶和消化部分。
然后将第一引物再生模板76引入流通池72中。每个第一引物再生模板76是可裂解的第一耐核酸酶引物34的序列的互补物。因此，每个第一引物再生模板76包括与剩余引物78’互补的第一部分82和与被消化的部分互补的第二部分84。在使得第一引物再生模板76能够与剩余引物78’和在第一区域58处保持完整的可裂解的第一耐核酸酶引物34”杂交的条件下，引入第一引物再生模板76。杂交的引物再生模板76示于图6D中。
然后将含有不可裂解的核苷酸的核苷酸混合物和聚合酶引入流通池72中。不可裂解的核苷酸包括以下碱基：腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶。可使用可接受不可裂解的核苷酸并且可成功地将不可裂解的核苷酸的碱基掺入引物78’的3’末端的任何聚合酶。示例聚合酶包括来自家族A的那些聚合酶，诸如Bsu聚合酶、Bst聚合酶、Taq聚合酶、T7聚合酶和许多其他聚合酶；来自家族B和B2的聚合酶，诸如Phi29聚合酶和其他高度加工性聚合酶(家族B2)、Pfu聚合酶(家族B)、KOD聚合酶(家族B)、9oN(家族B)和许多其他聚合酶；来自家族C的聚合酶，诸如大肠杆菌DNA Pol III，以及许多其他来自家族D的聚合酶，诸如激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)DNA Pol II和许多其他聚合酶；来自家族X的聚合酶，诸如DNAPolμ、DNA Polβ、DNA Polσ和许多其他聚合酶。核苷酸混合物还可包括液体载体，诸如水和/或离子盐缓冲液，例如毫摩尔至摩尔浓度的柠檬酸盐溶液、氯化钠、氯化钾、磷酸盐缓冲盐水等，和其他缓冲液，诸如三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)或(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)(HEPES)。液体载体还可包括旨在用于延伸反应的催化金属，诸如Mg2+、Mn2+等。可使用单一催化金属或催化金属的组合，并且总量可在约0.01mM至约100mM的范围内。
可调节流通池72的温度以引发模板延伸反应。聚合酶使得能够使用第一引物再生模板76的第二部分84作为模板来延伸引物78’的3’末端。因为i)延伸反应由第一引物再生模板76的第二部分84引导，ii)第二部分84与解封闭的可裂解的第一耐核酸酶引物78的被消化的部分互补，并且iii)使用不可裂解的核苷酸，聚合酶沿第二部分84的延伸产生没有裂解位点54的第一耐核酸酶引物。因此，聚合酶延伸产生了不可裂解的第一耐核酸酶引物42”，其包括耐核酸酶修饰68但不包括裂解位点54。
虽然第一引物再生模板76中的一些第一引物再生模板可与在第一区域58”处完整的可裂解的第一耐核酸酶引物34”杂交，但在这些引物34”处不发生聚合酶延伸。
一旦产生了不可裂解的第一耐核酸酶引物42”(图6E)，第一引物再生模板76就被去杂交(即变性)并从流通池72中去除(例如，使用洗涤溶液)。
然后改变在第二区域60”处的不可裂解的第二耐核酸酶引物36”以引入可裂解的第二耐核酸酶引物42”。更具体地，然后改变在第二区域60”中的不可裂解的第二耐核酸酶引物36”的解封闭和消化之后保留的引物80’以引入可裂解的第二耐核酸酶引物42”。这种改变涉及：使第二引物再生模板86分别与不可裂解的第二耐核酸酶引物(即，引物80’)的覆盖第二区域60”的剩余部分杂交以及与覆盖第一区域58”的不可裂解的第二耐核酸酶引物36”杂交(图6F)；使用包含可裂解的碱基的核苷酸混合物，在不可裂解的第二耐核酸酶引物(即，引物80’)的剩余部分处发起聚合酶沿第二引物再生模板86的延伸，以产生可裂解的第二耐核酸酶引物40”(图6G)；以及使第二引物再生模板86去杂交(图6H)。
每个第二引物再生模板86是不可裂解的第二耐核酸酶引物36”的序列的互补物。因此，每个第二引物再生模板86包括与剩余引物80’互补的第一部分88和与被消化的部分互补的第二部分90。在使得第二引物再生模板86能够与在第二区域60”处的剩余引物80’杂交以及与在第一区域58”处保持完整的不可裂解的第二耐核酸酶引物36”杂交的条件下，引入第二引物再生模板86。杂交的引物再生模板86示于图6F中。
然后将含有可裂解的核苷酸、其他不可裂解的核苷酸和聚合酶的另一种核苷酸混合物引入流通池72中。可裂解的核苷酸包括尿嘧啶碱基或8-氧代鸟嘌呤或通过聚合酶掺入的任何其他可裂解核苷酸。该混合物中其他不可裂解的核苷酸包括以下碱基：腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。可使用可接受这些核苷酸并且可成功地在引物80’的3’末端掺入这些核苷酸的碱基的任何聚合酶。核苷酸混合物的该示例还可包括本文列出的液体载体的任何示例。
可调节流通池72的温度以引发模板延伸反应。聚合酶使得能够使用第二引物再生模板86的第二部分90作为模板来延伸剩余引物80’的3’末端。因为i)延伸反应由第二引物再生模板86的第二部分90引导，ii)第二部分90与解封闭的可裂解的第二耐核酸酶引物80的被消化的部分互补，并且iii)使用可裂解的核苷酸，聚合酶沿第二部分90的延伸产生具有裂解位点54的第二耐核酸酶引物。因此，该聚合酶延伸产生了可裂解的第二耐核酸酶引物40”，其包括裂解位点54和耐核酸酶修饰68。可裂解的第二耐核酸酶引物40”示于图6G中。
虽然第二引物再生模板86中的一些第二引物再生模板可与在第一区域58”处完整的第二不可裂解的耐核酸酶引物36”杂交，但在这些引物36”处不发生聚合酶延伸。
一旦产生了可裂解的第二耐核酸酶引物40”(图6G)，第二引物再生模板86就被去杂交(即变性)并从流通池72中去除，如图6H所示。
在进行参考图6A至图6G描述的引物改变之后，第一区域58”包括可裂解的第一耐核酸酶引物34”和不可裂解的第二耐核酸酶引物36”，并且第二区域60”包括不可裂解的第一耐核酸酶引物42”和可裂解的第二耐核酸酶引物40”。
如图6H所示，可裂解的第一耐核酸酶引物34”和不可裂解的第二耐核酸酶引物36”仍包括3’光可裂解的阻断基团70。这些基团70可通过暴露于紫外光而被去除(参见图61)。因此，该方法的一些示例涉及将紫外光引导至基板10C的表面(图案化结构74或74’的一部分)，从而从覆盖第一区域58”的可裂解的第一引物34”和”不可裂解的第二引物36”去除3’光可裂解的封端基团70。如图6I所描绘的，UV光暴露去除了剩余的3’光可裂解的封端基团70。
当流通池72包括UV透明盖时，UV光可通过盖朝向基板10C的表面处的可裂解的第一耐核酸酶引物34”和不可裂解的第二耐核酸酶引物36”。
另选地，流通池72可包括两个图案化结构74、74’(如图8所示)。在一个示例中，可通过引导紫外光穿过侧面18C、I8C2两者来进行最终解封闭过程，因为在区域60”处透过基板10C的UV光可到达相对的图案化结构74”的引物组30’2，并且在区域60”2处透过第二基板10C2的UV光可到达相对的图案化结构74的引物组30”。在另一个示例中，UV光吸收层16’、16’2(或层16，如果使用基板10A或10B的话)可在引导紫外光穿过一个侧面18C或18C2之前被去除。UV光阻挡层16’、16’2可如参考图3系列所述的那样被去除，其中湿蚀刻以流通方式进行并且遵循本文所述的粘附促进过程之一。蚀刻剂可经由输入端口94引入(图8)，然后可经由输出端口96从流通池72去除所去除的UV光阻挡层16’、16’2(图8)。在UV光阻挡层16’、16’2被去除之后，紫外光可被引导穿过一个侧面18C或18C2，在那里它透过基板10C或10C2以暴露两个表面处的引物34”、36”。
去除3’光可裂解的封端基团70产生了解封闭的可裂解的第一耐核酸酶引物78和解封闭的不可裂解的第二耐核酸酶引物80。解封闭的可裂解的第一耐核酸酶引物78类似于参考图2A所述的可裂解的第一引物34，不同的是它们还包括耐核酸酶修饰68。类似地，解封闭的不可裂解的第二耐核酸酶引物80类似于参考图2A所述的不可裂解的第二引物36，不同的是它们还包括耐核酸酶修饰68。因此，最终流通池在不同区域58”、60”处包括两个不同的引物组50C、52C。
当参考图6A至图6I所示和所述的方法用两个粘结的图案化结构74、74’进行时，如图8所示，当进行图6B中所述的解封闭时，可涉及附加过程。
如图8所示，图案化结构74(以及因此其基板10C)是流通池72的一部分，包括与图案化结构74相对的第二图案化结构74’(以及因此与基板10C相对的第二基板10C2)。如图8所示，第二基板10C2包括由第二间隙区域142分开的第二凹入部122，其中每个第二凹入部122包括第二紫外光阻挡层16’2和施加在第二基板10C2的表面的第二接枝层32’2或32”2，第二接枝层32’2或32”2包括第二聚合物水凝胶282和与其附接的第二引物组30’2或30”2。在涉及图6A至图6H的方法的示例中，第二引物组30’2包括可裂解的第一耐核酸酶引物34”和不可裂解的第二耐核酸酶引物36”。
当在图6A至图6I的方法中使用图8的流通池72时，在引导紫外光穿过基板10C、10C2之前(用于如参考图6B所述的解封闭)，该方法还包括将紫外光吸收材料引入流通池72中；以及在引导紫外光穿过基板10C、10C2之后(用于如参考图6B所述的解封闭)，该方法还包括将紫外光吸收材料从流通池72中去除。紫外光吸收材料的示例是炭黑、其他UV吸收颜料或顺磁珠的胶态分散体。
紫外光吸收材料(和任何其他流体)可通过输入端口(或入口)94被引导到流通池72的流动通道92中，并且可通过输出端口(或出口)96从流动通道92去除。
如参考图6B所述，在解封闭期间，通过基板10C的侧面18C引入紫外光。当使用两个图案化结构74、74’时，紫外光应当被引导穿过相应基板10C、10C2的两个侧面18C和18C2。UV光将能够透过基板10C、10C2并且将被相应UV光阻挡层16’、16’2阻挡。在流动通道92中不存在紫外光吸收材料的情况下，透过区域60”处的基板10C的UV光能够到达另一基板10C2的引物组30’2，并且透过区域60”2的第二基板10C2的UV光能够到达基板10C的引物组30’。这是不希望的，因为分别位于区域58”和58”2中的引物34”、36”和引物34”2、36”2在该方法的这一点上不应被解封闭，因此不应暴露于紫外光。紫外光吸收材料可阻挡透过基板10C和10C2的光到达相对的基板10C2和10C。
现在参考图7A至图7M，该方法的示例利用引物组30”。引物组30”包括3’封闭的不可裂解的第一前引物46和3’封闭的不可裂解的第二前引物48。在一个示例中，3’封闭的不可裂解的第一前引物46包括不包括裂解位点54或3’末端核苷酸的可裂解的第一引物36的截短序列，并且还在截短序列的3’末端处包括3’光可裂解的封端基团70。在该示例中，3’封闭的不可裂解的第二前引物48包括不包括裂解位点54或3’末端核苷酸的可裂解的第二引物40的截短序列，并且还在截短序列的3’末端处包括3’光可裂解的封端基团70。在一个示例中，引物组30”包括截短的P5序列和截短的P7序列，并且这些序列都不包括裂解位点54。这些前引物46、48示于图7A中。在另一个示例中，前引物46、48可以是完整的不可裂解的引物序列(例如，P5和P7)，其中相应光可裂解的封端基团70被定位在距离3’末端5个碱基至10个碱基处，使得在加工期间产生截短引物，并且随后用于产生完整的可裂解或不可裂解的引物。
在图7A中，每个凹入部12包括被定位在第一区域58”处的紫外光阻挡层16’(或者如果使用基板10A或10B则为16)，并且每个凹入部12的第二区域60”对紫外光是透明的，其中第二区域60”对应于预先确定的区域38(其中将发生至少一些引物改变)。
虽然在图7A至图7M中未示出，但是该方法的示例涉及生成图案化结构74、74’(图8)，将图案化结构74、74’粘结在一起或者将一个图案化结构74和盖(未示出)粘结在一起，然后在流通池72中执行前引物46、48改变。
为了产生每个图案化结构74、74’，在基板10A、10B或10C中限定凹入部12，并且将UV光阻挡层16或16’掺入(例如，施加、嵌入等)到基板10A、10B、10C的第一区域58、58”中，如参考图1A、图1B或图1C所述。然后，施加接枝层32”。在该示例方法中，施加接枝层32”涉及将接枝层32”引入凹入部12和间隙区域14；以及从间隙区域14去除接枝层32”。使用任何合适的沉积技术将本文所公开的聚合物水凝胶28的任何示例施加到基板10A、10B或10C上，并且在施加聚合物水凝胶28之前或之后，使用任何合适的接枝技术将初始引物组30”(包括前引物46、48)接枝到聚合物水凝胶28上。在一个示例中，在接枝前引物46、48之前并且在施加聚合物水凝胶28之后，该方法包括使用在本文所公开的抛光过程从间隙区域14去除聚合物水凝胶28。然后将前引物46、48接枝到凹入部12中的聚合物水凝胶28。在另一个示例中，将前引物46、48接枝到聚合物水凝胶28(在将其施加到基板10C上之前或之后)，并且该方法包括使用本文所公开的抛光过程从间隙区域14去除接枝层32”。所得的图案化结构74、74’包括在每个凹入部12内的接枝层32”和不含接枝层32”的间隙区域14。图案化结构74的一个凹入部12示于图7A中。
在图7A至图7M所示的示例中，在凹入部12中的至少一些凹入部的第二区域60”内的接枝层32”的第一预先确定的区域38处：改变3’封闭的不可裂解的第一前引物46以引入可裂解的第一引物34；改变3’封闭的不可裂解的第二前引物48以引入不可裂解的第二引物36。同样在图7A至图7M所示的示例中，在凹入部12中的至少一些凹入部的第一区域58”内的接枝层32”的第二预先确定的区域38处：改变3’封闭的不可裂解的第一前引物46以引入不可裂解的第一引物42；改变3’封闭的不可裂解的第二前引物48以引入可裂解的第二引物40。第一预先确定的区域38处的前引物46、48的改变示于图7B至图7G中，并且第二预先确定的区域38’处的前引物46、48的改变示于图7H至图7M中。
改变3’封闭的不可裂解的第一前引物46以在凹入部12中的至少一些凹入部的第二区域60”的接枝层32”的第一预先确定的区域38处引入可裂解的第一引物34涉及引导紫外光穿过基板10C，从而从以下中去除3’光可裂解的封端基团70：i)从3’封闭的不可裂解的第一前引物46，以生成覆盖第二区域60”的解封闭的不可裂解的第一前引物98，以及ii)从3’封闭的不可裂解的第二前引物48，以生成覆盖第二区域60”的解封闭的不可裂解的第二前引物100，由此覆盖第一区域58”的3’封闭的不可裂解的第一前引物46和3’封闭的不可裂解的第二前引物48保持封闭(图7B)；使第一引物产生模板76’分别与覆盖第二区域60”的解封闭的不可裂解的第一前引物98杂交以及与覆盖第一区域58”的3’封闭的不可裂解的第二引物46杂交(图7C)；使用包含可裂解的碱基(例如，尿嘧啶碱基或8-氧代鸟嘌呤或可通过聚合酶掺入的任何其他可裂解的核苷酸)的核苷酸混合物，引发聚合酶沿第一引物产生模板76’在解封闭的不可裂解的第一前引物98的3’末端的延伸以产生可裂解的第一引物34(图7D)；以及使第一引物产生模板76’去杂交(图7E)。
图7B描绘了通过基板10C的侧面18C引入紫外光。UV光的波长足以从暴露于光的不可裂解的第一前引物46和不可裂解的第二前引物48去除3’光可裂解的封端基团70。在该示例中，UV光在侧面18C处被引入并且在第二区域60”处透过基板10C。因此，不可裂解的第一前引物46和不可裂解的第二前引物48在第二区域60”处暴露于UV光，这触发了3’光可裂解的封端基团70的去除。解封闭的不可裂解的第一前引物和解封闭的不可裂解的第二前引物分别以附图标记98和100示出。相反，UV光阻挡层16’在第一区域58”处阻挡光到达不可裂解的第一前引物46和不可裂解的第二前引物48，因此这些引物46、48保持3’被封闭。
该方法还可包括在3’末端处去磷酸化解封闭的不可裂解的第一前引物和解封闭的不可裂解的第二前引物98、100。可通过引入具有3’-磷酸酶活性的酶(例如，T4噬菌体多核苷酸激酶(PNK)或碱性磷酸酶(AP或ALP))将磷酸终止的3’末端去磷酸化。这些酶处理磷酸酯末端，将它们转化成3’-羟基并使它们准备用于引物改变。
然后将第一引物再生模板76’引入流通池72中。每个第一引物再生模板76’是可裂解的第一引物34和不可裂解的第一引物42的序列的互补物。在解封闭的不可裂解的第一前引物98的延伸期间使用的核苷酸混合物将决定所产生的引物是可裂解的还是不可裂解的。因此，每个第一引物再生模板76’包括与解封闭的不可裂解的第一前引物98(其是可裂解的第一引物34和不可裂解的第一引物42的截短版本)的序列互补的第一部分82’和与可裂解的第一引物34的剩余部分和不可裂解的第一引物42的剩余部分互补的第二部分84’。在使得第一引物再生模板76’能够与解封闭的不可裂解的第一前引物98杂交以及与在第一区域58”处保持完整的不可裂解的第一前引物46杂交的条件下，引入第一引物再生模板76’。杂交的引物再生模板76’示于图7C中。
然后将含有可裂解的核苷酸、其他不可裂解的核苷酸和聚合酶的核苷酸混合物引入流通池72中。可裂解的核苷酸包括尿嘧啶碱基或8-氧代鸟嘌呤或通过聚合酶掺入的任何其他可裂解核苷酸。该混合物中其他不可裂解的核苷酸包括以下碱基：腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。可使用可接受这些核苷酸并且可成功地在解封闭的不可裂解的第一前引物98的3’末端处掺入这些核苷酸的碱基的任何聚合酶。核苷酸混合物的该示例还可包括本文列出的液体载体和催化金属的任何示例。
可调节流通池72的温度以引发模板延伸反应。聚合酶使得能够使用第一引物再生模板76’的第二部分84’作为模板延伸解封闭的不可裂解的第一前引物98的3’末端。因为i)延伸反应由第一引物再生模板76’的第二部分84’引导，ii)第二部分84’与可裂解的第一引物34的缺失部分互补，并且iii)在核苷酸混合物中使用可裂解的核苷酸，聚合酶沿第二部分84’的延伸产生具有裂解位点54的可裂解的第一引物34。可裂解的第一引物34示于图7D中。
虽然第一引物再生模板76’中的一些第一引物再生模板可与在第一区域58”处完整的第一前引物46杂交，但在这些前引物46处不发生聚合酶延伸。
一旦产生了可裂解的第一引物34(图7D)，第一引物再生模板76’就被去杂交(即变性)并从流通池72中去除(例如，使用洗涤溶液)。
3’封闭的不可裂解的第二前引物48，其已经如图7B所示和所述解封闭，然后被改变。改变3’封闭的不可裂解的第二前引物48以在凹入部12中的至少一些凹入部的第二区域60”内的接枝层32”的第一预先确定的区域38处引入不可裂解的第二引物36涉及：使第二引物产生模板86’分别与覆盖第二区域60”的解封闭的不可裂解的第二前引物100杂交以及与覆盖第一区域58”的3’封闭的不可裂解的第二前引物48杂交(图7E)；使用包含胸腺嘧啶碱基的核苷酸混合物，在解封闭的不可裂解的第二前引物100的3’末端处引发聚合酶沿第二引物产生模板86’的延伸以产生不可裂解的第二引物36(图7F)；以及使第二引物产生模板86’去杂交(图7G)。
每个第二引物再生模板86’是不可裂解的第二引物36和可裂解的第二引物40的序列的互补物。在解封闭的不可裂解的第二前引物100的延伸期间使用的核苷酸混合物将决定所产生的引物是可裂解的还是不可裂解的。因此，每个第二引物再生模板86’包括与解封闭的不可裂解的第二前引物100(其是不可裂解的第二引物36和可裂解的第二引物40的截短版本)的序列互补的第一部分88’和与不可裂解的第二引物36的剩余部分和可裂解的第二引物40的剩余部分互补的第二部分90’。在使得第二引物再生模板86’能够与在第二区域60”处的解封闭的不可裂解的第二前引物100杂交以及与在第一区域58”处保持完整的第二前引物48杂交的条件下，引入第二引物再生模板86’。杂交的引物再生模板86示于图7E中。
将含有不可裂解的核苷酸的核苷酸混合物和聚合酶引入流通池72中。不可裂解的核苷酸包括以下碱基：腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶。可使用可接受不可裂解的核苷酸并且可成功地在解封闭的不可裂解的第二前引物100的3’末端处掺入不可裂解核苷酸的碱基的任何聚合酶。核苷酸混合物的该示例还可包括本文列出的液体载体和催化金属的任何示例。
可调节流通池72的温度以引发模板延伸反应。聚合酶使得能够使用第二引物再生模板86’的第二部分90’作为模板延伸解封闭的不可裂解的第二前引物100的3’末端。因为i)延伸反应由第二引物再生模板86’的第二部分90’引导，ii)第二部分90’与不可裂解的第一引物36的缺失部分互补，并且iii)使用不可裂解的核苷酸，聚合酶沿第二部分90’的延伸产生没有任何裂解位点54的第二不可裂解的引物36。不可裂解的第二引物36示于图7F中。
虽然第二引物再生模板86’中的一些第二引物再生模板可与在第一区域58”处完整的第二前引物48杂交，但在这些前引物48处不发生聚合酶延伸。
一旦产生了不可裂解的第二引物36(图7F)，第二引物再生模板86’就被去杂交(即变性)并从流通池72中去除(例如，使用洗涤溶液)。
如图7G所示，在接枝层32的预先确定的区域38处的两个前引物46、48已经被改变以引入可裂解的第一引物34和不可裂解的第二引物36。由此，将引物组50A引入凹入部12的一个区域内。
同样如图7G所示，在接枝层32”的预先确定的区域38’处的两个前引物46、48保持不变，因此保持被3’光可裂解的封端基团70封闭。这些前引物46、48可暴露于解封闭处理，使得它们可被改变以将可裂解的第二引物40和不可裂解的第一引物42引入到预先确定的区域38’。因此，该方法还包括将紫外光引导至基板10C的表面(如图7H所示)，从而从以下中去除3’光可裂解的封端基团70：i)从3’封闭的不可裂解的第一前引物46，以产生覆盖第一区域58”的解封闭的不可裂解的第一前引物98，以及ii)从3’封闭的不可裂解的第二前引物48，以产生覆盖第一区域58”的解封闭的不可裂解的第二前引物100。可选择具有合适波长的紫外光以引发解封闭/去封闭。
当流通池72包括UV透明盖时，UV光可被引导穿过盖朝向基板10C的表面处的第一和第二前引物46、48。
另选地，流通池72可包括两个图案化结构74、74’(如图8所示)。在一个示例中，可通过引导紫外光穿过侧面18C、18C2两者来进行解封闭过程，因为在区域60”处透过基板10C的UV光可到达相对的图案化结构74’的引物组30”2，并且在区域60”2处透过第二基板10C2的UV光可到达相对的图案化结构74的引物组30”。在另一个示例中，UV光吸收层16’、16’2(或层16，如果使用基板10A或10B的话)可在引导紫外光穿过一个侧面18C或18C2之前被去除。UV光阻挡层16’、16’2可如参考图3系列所述的那样被去除，其中湿蚀刻以流通方式进行并且遵循本文所述的粘附促进过程之一。蚀刻剂可经由输入端口94引入(图8)，然后可经由输出端口96从流通池72去除所去除的UV光阻挡层16’、16’2(图8)。在UV光阻挡层16’、16’2被去除之后，紫外光可被引导穿过一个侧面18C或18C2，在那里它透过基板10C或10C2以暴露两个表面处的第一和第二前引物46、48。
3’光可裂解的封端基团70的去除在第一区域58”处产生解封闭的第一前引物98和解封闭的第二前引物100，如图7H所示。该方法还可包括在3’末端处去磷酸化解封闭的不可裂解的第一前引物和解封闭的不可裂解的第二前引物98、100。可通过引入具有3’-磷酸酶活性的酶(例如，T4噬菌体多核苷酸激酶(PNK)或碱性磷酸酶(AP或ALP))将磷酸终止的3’末端去磷酸化。这些酶处理磷酸酯末端，将它们转化成3’-羟基并使它们准备用于引物改变。
解封闭的第一前引物98和解封闭的第二前引物100准备用于在接枝层32”的第二预先确定的区域38’处改变。
然后改变在第二预先确定的区域38’处的3’封闭的不可裂解的第二前引物48，其已经如图7H所示和所述的那样解封闭。在凹入部12中的至少一些凹入部的第一区域58”内的接枝层32”的第二预先确定的区域38’处，改变3’封闭的不可裂解的第一前引物以引入不可裂解的第一引物42涉及：使第一引物产生模板76’分别与覆盖第一区域58”的解封闭的不可裂解的第一前引物98杂交以及与覆盖第二区域60”的可裂解的第一引物34杂交(图71)；在解封闭的不可裂解的第一前引物98的3’末端处引发聚合酶沿第一引物产生模板76’的延伸以产生不可裂解的第一引物42(图7J)；以及使第一引物产生模板76’去杂交(图7K)。
将第一引物再生模板76’再次引入流通池72中。如上所述，每个第一引物再生模板76’是可裂解的第一引物34和不可裂解的第一引物42的序列的互补物，并且在解封闭的不可裂解的第一前引物98的延伸期间使用的核苷酸混合物将决定所产生的引物是可裂解的还是不可裂解的。在使得第一引物再生模板76’能够与在第一区域58”处的解封闭的不可裂解的第一前引物98杂交以及与在第二区域60”处产生的可裂解的第一引物34杂交的条件下，引入第一引物再生模板76’。杂交的引物再生模板76’示于图7I中。
在该示例中，引入流通池72中的核苷酸混合物包括不可裂解的核苷酸和聚合酶。不可裂解的核苷酸包括以下碱基：腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶。可使用可接受这些核苷酸并且可成功地在第一区域58”处的解封闭的不可裂解的第一前引物98的3’末端处掺入这些核苷酸的碱基的任何聚合酶。核苷酸混合物的该示例还可包括本文列出的液体载体和催化金属的任何示例。
可调节流通池72的温度以引发模板延伸反应。聚合酶使得能够使用第一引物再生模板76’的第二部分84’作为模板延伸解封闭的不可裂解的第一前引物98的3’末端。因为i)延伸反应由第一引物再生模板76’的第二部分84’引导，ii)第二部分84’与不可裂解的第一引物42的缺失部分互补，并且iii)使用不可裂解的核苷酸，聚合酶沿第二部分84’的延伸产生没有裂解位点54的不可裂解的第一引物42。不可裂解的第一引物42示于图7J中。
虽然第一引物再生模板76’中的一些第一引物再生模板可与在第二区域60”处完整的可裂解的第一引物34杂交，但在这些可裂解的第一引物34处不发生聚合酶延伸。
一旦在第一区域58”中产生了不可裂解的第一引物42(图7J)，第一引物再生模板76’就被去杂交(即变性)并从流通池72中去除(例如，使用洗涤溶液)。
然后改变在第一区域58”处的3’封闭的不可裂解的第二前引物48，其已经如图7H所示和所述的那样解封闭。在凹入部12中的至少一些凹入部的第一区域58”内的接枝层32”的第二预先确定的区域38’处，改变3’封闭的不可裂解的第二前引物48以引入可裂解的第二引物40涉及：使第二引物产生模板86’分别与覆盖第一区域58”的解封闭的不可裂解的第二前引物100杂交以及与覆盖第二区域60”的不可裂解的第二引物36杂交(图7K)；使用包含可裂解的碱基的核苷酸混合物，在解封闭的不可裂解的第二前引物100的3’末端处引发聚合酶沿第二引物产生模板86’的延伸以产生可裂解的第二引物40(图7L)；以及使第二引物产生模板86’去杂交(图7M)。
将第二引物再生模板86’再次引入流通池72中，如图7K处所示。如上所述，每个第二引物再生模板86’是不可裂解的第二引物36和可裂解的第二引物40的序列的互补物，并且在解封闭的不可裂解的第二前引物100的延伸期间使用的核苷酸混合物将决定所产生的引物是可裂解的还是不可裂解的。在使得第二引物再生模板86’能够与在第一区域58”处的解封闭的不可裂解的第一前引物100杂交以及与在第二区域60”处产生的不可裂解的第二引物36杂交的条件下，引入第二引物再生模板86’。杂交的引物再生模板86示于图7K中。
在该示例中，引入流通池72中的核苷酸混合物包括可裂解的核苷酸、其他不可裂解的核苷酸和聚合酶。可裂解的核苷酸包括尿嘧啶碱基或通过聚合酶掺入的任何其他可裂解核苷酸。其他不可裂解的核苷酸包括以下碱基：腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。可使用可接受这些核苷酸并且可成功地在第一区域58”处的解封闭的不可裂解的第二前引物100的3’末端处掺入这些核苷酸的碱基的任何聚合酶。核苷酸混合物的该示例还可包括本文列出的液体载体和催化金属的任何示例。
可调节流通池72的温度以引发模板延伸反应。聚合酶使得能够使用第二引物再生模板86’的第二部分90’作为模板延伸解封闭的不可裂解的第二前引物100的3’末端。因为i)延伸反应由第二引物再生模板86’的第二部分90’引导，ii)第二部分90’与可裂解的第二引物40的缺失部分互补，并且iii)使用可裂解的核苷酸，聚合酶沿第二部分90’的延伸产生具有裂解位点54的可裂解的第二引物40。可裂解的第二引物40示于图7L中。
虽然第二引物再生模板86’中的一些第二引物再生模板可与在第二区域60”处完整的不可裂解的第二引物36杂交，但在这些不可裂解的第二引物36处不发生聚合酶延伸。
一旦在第一区域58”中产生了可裂解的第二引物40(图7L)，第二引物再生模板86’就被去杂交(即变性)并从流通池72中去除(例如，使用洗涤溶液)。
如图7M所示，在接枝层32的第二预先确定的区域38’处的两个前引物46、48已经被改变以引入不可裂解的第一引物42和可裂解的第二引物40。由此，将引物组50B引入凹入部12的另一个区域内。
当在图7A至图7M的方法中使用图8的流通池72时，在引导紫外光穿过基板10C、10C2之前(用于如参考图7B所述的解封闭区域60”中的前引物46、48)，该方法还包括将紫外光吸收材料引入流通池72中；以及在引导紫外光穿过基板10C、10C2之后，该方法还包括将紫外光吸收材料从流通池72中去除。可使用本文所公开的紫外光吸收材料的任何示例。
紫外光吸收材料(和任何其他流体)可通过输入端口(或入口)94被引导到流通池72的流动通道92中，并且可通过输出端口(或出口)96从流动通道92去除。
如参考图7B所述，在解封闭期间，通过基板10C的侧面18C引入紫外光。当使用两个图案化结构74、74’时，紫外光应当被引导穿过相应基板10C、10C2的两个侧面18C和18C2。UV光将能够透过基板10C、10C2并且将被相应UV光阻挡层16’、16’2阻挡。在流动通道92中不存在紫外光吸收材料的情况下，透过区域60”处的基板10C的UV光能够到达另一基板10C2的引物组30’2，并且透过区域60”2的第二基板10C2的UV光能够到达基板10C的引物组30”。这是不希望的，因为分别位于区域58”和58”2中的前引物46、48和引物462、482在该方法的这一点上不应被解封闭，因此不应暴露于紫外光。流动通道92中紫外光吸收材料可阻挡透过基板10C和10C2的光到达相对的基板10C2和10C。
在本文所公开的示例方法中的任一种示例方法中，接枝层32、32’、32”的预先确定的区域38(其中至少一些引物改变将发生)可构成凹入部12、12’中的至少一些凹入部中的每一个凹入部的约一半(1/2)。
流通池
如所提到的，图8示出了包括粘结在一起的两个图案化结构74、74’的示例流通池72。虽然未示出，但是应当理解，图案化结构74可粘结到UV透明盖以产生流通池的另一个示例。
限定在图案化结构74、74’之间的流动通道92与入口/输入端口94和出口/输出端口96流体连通。入口94允许将流体引入到流动通道92中，出口96允许从流动通道92中引出流体。入口94和出口96中的每一者与流体控制系统(包括例如，储器、泵、阀、废物容器等)流体连接，该流体控制系统控制流体引入和排出。
每个流动通道12的入口94和出口96可被定位在流通池72的相对侧处(如图8所示)、在流通池72的相对端处、或沿流动通道92的长度和宽度的任何位置处，这使得能够实现期望的流体流动。
图案化结构74、74’可在粘结区域B、B2处粘结在一起。在图8所示的示例中，粘结区域B、B2对应于位于图案化结构74、74’的周边处的间隙区域14、142。可将分开的材料102施加到粘结区域B、B2以将图案化结构74、74’固定在一起。该分开的材料102、材料36限定流动通道92的壁的至少一部分。可使用任何合适的单独材料102(诸如粘合剂、有助于粘结的辐射吸收材料等)将图案化结构74’、74”粘结在一起。
图8中所示的图案化结构74、74’的架构包括在基板10C、10C2中限定的凹入部12、122以及被定位在凹入部12、122中的接枝层32’或32”和32’2或32”2。在最终流通池72中，初始引物组30’或30”可根据参考图6系列或图7系列描述的方法改变。另选地，流通池72中每个凹入部12或12’的构架可类似于图3G、或图4H、或图5H中所示的结构。
图8中所示的流通池72包括限定在两个粘结的图案化结构74、74’之间的单个流动通道92。其他流通池可用几个流动通道92产生。在图9中从顶视图示出了具有八个不同流动通道92的流通池72’的示例。虽然示出了八个流动通道92，但是应当理解，流通池72中可包括任何数量的流动通道92(例如，四个流动通道92等)。
当包括多个流动通道92时，每个流动通道包括其自己的入口94和出口96。每个流动通道92的入口94和出口96可被定位在流通池72’的相对端，如图9所示。相应流动通道92的入口94和出口96可另选地沿流动通道92的长度和宽度定位在能够实现所需流体流动的任何位置。
在图9所示的示例中，每个流动通道92可与流动通道92互相分离，使得引入流动通道92中的流体不会流到相邻的流动通道92中。在该示例中，粘结区域B可包括基板10A、10B、10C、10D的周边和基板10A、10B、10C、10D的使流动通道92分开的非图案化区域。
流动通道92内的架构的示例在图10A和图10B中描绘。
图10A中的架构包括定位在UV透明基部支持物104上的基板10D。每个多深度凹入部12’包括具有不同引物组50A、52A(或50B、52B)的聚合物水凝胶28，这些引物组分别附接在多深度凹入部12’的深部分24和浅部分26内。该架构可如参考图4系列或图5系列所述的那样形成。在图10A的示例中，类似的图案化结构或盖可粘结至基板10D。
图10B中的架构包括基板10A、10B、10C，其中去除了UV光阻挡层16、16’。每个凹入部12包括聚合物水凝胶28，其中不同引物组50A、52A(或50B、52B或50C、52C)分别附接在空间上分开的区域。凹入部12由间隙区域14分开。该架构可如参考图3系列、或图6系列、或图7系列所述的那样形成。在图10B的示例中，类似的图案化结构或盖可粘结到基板10A、10B、10C。
使用流通池的方法
本文所公开的流通池72、72’的示例，包括附接到聚合物水凝胶28的不同区域的不同引物组50A、52A或50B、52B或50C、52C，可用于同时成对的末端读取测序方法中。在该方法中，将文库模板接种在凹入部12、12’内，并跨50A、52A或50B、52B或50C、52C扩增。正向和反向链在凹入部12、12’内产生。组50A、52A或50B、52B或50C、52C的正交裂解化学成分使得能够从一个区域(例如区域38)裂解反向链，而从另一个相邻区域(例如，区域38’)裂解正向链。因此，可在一个区域(例如，区域38)中产生正向链簇，并且可在另一个区域(例如，在区域38’)中产生反向链簇。簇可同时测序(例如，使用边合成边测序方法)，并且空间分开使得能够获得同时成对的末端读取。
试剂盒
流通池72、72’的任何示例都可包括在试剂盒中。
试剂盒的一个示例包括流通池72、72’，该流通池包括：基板10A、10B、10C、10D，该基板包括由间隙区域14分开的凹入部12、12’；聚合物水凝胶28，该聚合物水凝胶施加在凹入部12、12’中的每个凹入部内；引物组30、30’，该引物组接枝到聚合物水凝胶28，该引物组30、30’包括可裂解的第一引物34、34’和不可裂解的第二引物36、36’；和核酸酶，该核酸酶消化可裂解的第一引物34、34’中的一些第一引物和不可裂解的第二引物36、36’中的一些第二引物并产生接枝层32、32’的引物耗尽部分64；和以下中的任一项：引物混合物，该引物混合物包括可裂解的第二引物40、40’和不可裂解的第一引物42、42’；或第一引物再生模板76；和第二引物再生模板86。
试剂盒的另一个示例包括流通池72、72’，该流通池包括：基板10A、10B、10C、10D，该基板包括由间隙区域14分开的凹入部12、12’；聚合物水凝胶28，该聚合物水凝胶施加在凹入部12、12’中的每个凹入部内；和引物组30”，该引物组接枝到聚合物水凝胶28，该引物组30”包括3’封闭的不可裂解的第一前引物46和3’封闭的不可裂解的第二前引物48；第一引物产生模板76；第二引物产生模板86；第一核苷酸混合物，该第一核苷酸混合物包括可裂解的碱基和不可裂解的碱基；和第二核苷酸混合物，该第二核苷酸混合物包括不可裂解的碱基。
附加说明
应当理解，前述概念和下文更详细讨论的附加概念(假设此类概念不相互矛盾)的所有组合都被设想为是本文所公开的发明主题的一部分。具体地讲，出现在本公开末尾的要求保护的主题的所有组合都被设想为是本文所公开的发明主题的一部分。还应当理解，本文明确采用的也可出现在以引用方式并入的任何公开中的术语应被赋予与本文所公开的特定概念最一致的含义。
本说明书通篇提及的“一个示例”、“另一个示例”、“一种示例”等意指结合该示例描述的特定元素(例如，特征、结构和/或特性)包括在本文所述的至少一个示例中，并且可存在于或不存在于其他示例中。此外，应当理解，用于任何示例的所述元素可以任何合适的方式组合在各种示例中，除非上下文另有明确说明。
虽然已经详细描述了若干示例，但是应当理解，可以对所公开的示例进行修改。因此，上述说明应被认为是非限制性的。

Claims (9)

1.一种方法，所述方法包括：
将聚合物水凝胶施加到包括由间隙区域分开的凹入部的基板的表面上，每个凹入部包括被定位在第一区域处的紫外光阻挡层和对紫外光是透明的且与所述第一区域相邻的第二区域；
在施加所述聚合物水凝胶之前或之后，将引物组接枝到所述聚合物水凝胶以形成接枝层，所述引物组包括3’封闭的不可裂解的第一前引物和3’封闭的不可裂解的第二前引物；
从所述间隙区域去除所述聚合物水凝胶或所述接枝层；
在所述凹入部中的至少一些凹入部的所述第二区域内的所述接枝层的第一预先确定的区域处：
改变所述3’封闭的不可裂解的第一前引物以引入可裂解的第一引物；以及
改变所述3’封闭的不可裂解的第二前引物以引入不可裂解的第二引物；以及
在所述凹入部中的至少一些凹入部的所述第一区域内的所述接枝层的第二预先确定的区域处：
改变所述3’封闭的不可裂解的第一前引物以引入不可裂解的第一引物；以及
改变所述3’封闭的不可裂解的第二前引物以引入可裂解的第二引物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中：
在所述凹入部中的至少一些凹入部的所述第二区域内的所述接枝层的所述第一预先确定的区域处，改变所述3’封闭的不可裂解的第一前引物以引入可裂解的第一引物涉及：
引导紫外光穿过所述基板，从而从以下中去除3’光可裂解的封端基团：i)从所述3’封闭的不可裂解的第一前引物，以生成覆盖所述第二区域的解封闭的不可裂解的第一前引物，以及ii)从所述3’封闭的不可裂解的第二前引物，以生成覆盖所述第二区域的解封闭的不可裂解的第二前引物，由此覆盖所述第一区域的所述3’封闭的不可裂解的第一前引物和所述3’封闭的不可裂解的第二前引物保持封闭；
使第一引物产生模板分别与覆盖所述第二区域的所述解封闭的不可裂解的第一前引物杂交以及与覆盖所述第一区域的所述3’封闭的不可裂解的第二引物杂交；
使用包含可裂解的碱基的核苷酸混合物，在所述解封闭的不可裂解的第一前引物的3’末端处引发聚合酶沿所述第一引物产生模板的延伸以产生所述可裂解的第一引物；以及
使所述第一引物产生模板去杂交；以及
在所述凹入部中的至少一些凹入部的所述第二区域内的所述接枝层的所述第一预先确定的区域处，改变所述3’封闭的不可裂解的第二前引物以引入不可裂解的第二引物涉及：
使第二引物产生模板分别与覆盖所述第二区域的所述解封闭的不可裂解的第二前引物杂交以及与覆盖所述第一区域的所述3’封闭的不可裂解的第二前引物杂交；
使用包含胸腺嘧啶碱基的核苷酸混合物，在所述解封闭的不可裂解的第二前引物的3’末端处引发聚合酶沿所述第二引物产生模板的延伸以产生所述不可裂解的第二引物；以及
使所述第二引物产生模板去杂交。
3.根据权利要求2所述的方法，其中：
所述基板是流通池的一部分，所述流通池包括与所述基板相对的第二基板，所述第二基板包括由第二间隙区域分开的第二凹入部，其中每个第二凹入部包括第二紫外光阻挡层和施加到所述第二基板的所述凹入部的第二接枝层，所述第二接枝层包括第二聚合物水凝胶和与其附接的第二引物组，所述第二引物组包括所述3’封闭的不可裂解的第一前引物和所述3’封闭的不可裂解的第二前引物；
在引导所述紫外光穿过所述基板之前，所述方法还包括将紫外光吸收材料引入所述流通池中；以及
在引导所述紫外光穿过所述基板之后，所述方法还包括从所述流通池中去除所述紫外光吸收材料。
4.根据权利要求2所述的方法，所述方法还包括将紫外光引导至所述基板的所述表面，从而从以下中去除3’光可裂解的封端基团：i)从所述3’封闭的不可裂解的第一前引物，以产生覆盖所述第一区域的解封闭的不可裂解的第一前引物，以及ii)从所述3’封闭的不可裂解的第二前引物，以产生覆盖所述第一区域的解封闭的不可裂解的第二前引物。
5.根据权利要求4所述的方法，其中：
在所述凹入部中的至少一些凹入部的所述第一区域内的所述接枝层的所述第二预先确定的区域处，改变所述3’封闭的不可裂解的第一前引物以引入不可裂解的第一引物涉及：
使第一引物产生模板分别与覆盖所述第一区域的所述解封闭的不可裂解的第一前引物杂交以及与覆盖所述第二区域的所述可裂解的第一引物杂交；
在所述解封闭的不可裂解的第一前引物的3’末端处引发聚合酶沿所述第一引物产生模板的延伸以产生所述不可裂解的第一引物；以及
使所述第一引物产生模板去杂交；以及
在所述凹入部中的至少一些凹入部的所述第一区域内的所述接枝层的所述第二预先确定的区域处，改变所述3’封闭的不可裂解的第二前引物以引入可裂解的第二引物涉及：
使第二引物产生模板分别与覆盖所述第一区域的所述解封闭的不可裂解的第二前引物杂交以及与覆盖所述第二区域的所述不可裂解的第二引物杂交；
使用包含可裂解的碱基的核苷酸混合物，在所述解封闭的不可裂解的第二前引物的3’末端处引发聚合酶沿所述第二引物产生模板的延伸以产生所述可裂解的第二引物；以及
使所述第二引物产生模板去杂交。
6.根据权利要求4所述的方法，其中：
所述基板是流通池的一部分，所述流通池包括与所述基板相对的第二基板，所述第二基板包括由第二间隙区域分开的第二凹入部，其中每个第二凹入部包括第二紫外光阻挡层和施加到所述第二基板的所述凹入部的第二接枝层，所述第二接枝层包括第二聚合物水凝胶和与其附接的第二引物组，所述第二引物组包括所述3’封闭的不可裂解的第一前引物和所述3’封闭的不可裂解的第二前引物；以及
在将所述紫外光引导至所述基板的所述表面之前，所述方法还包括去除所述紫外光阻挡层和所述第二紫外光阻挡层。
7.根据权利要求4所述的方法，其中：
所述基板是流通池的一部分，所述流通池包括与所述基板相对的第二基板，所述第二基板包括由第二间隙区域分开的第二凹入部，其中每个第二凹入部包括第二紫外光阻挡层和施加到所述第二基板的所述凹入部的第二接枝层，所述第二接枝层包括第二聚合物水凝胶和与其附接的第二引物组，所述第二引物组包括所述3’封闭的不可裂解的第一前引物和所述3’封闭的不可裂解的第二前引物；以及
将所述紫外光引导至所述基板的所述表面还将所述第二基板暴露于所述紫外光。
8.一种试剂盒，所述试剂盒包括：
流通池，所述流通池包括：
基板，所述基板包括由间隙区域分开的凹入部；
聚合物水凝胶，所述聚合物水凝胶施加在所述凹入部中的每个凹入部内；和
引物组，所述引物组接枝到所述聚合物水凝胶，所述引物组包括3’封闭的不可裂解的第一前引物和3’封闭的不可裂解的第二前引物；
第一引物产生模板；
第二引物产生模板；
第一核苷酸混合物，所述第一核苷酸混合物包括可裂解的碱基和不可裂解的碱基；和
第二核苷酸混合物，所述第二核苷酸混合物包括不可裂解的碱基。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其中所述流通池在对应于预先确定的区域的所述基板的区域中包括紫外光阻挡层，其中所述3’封闭的不可裂解的第一前引物和3’封闭的不可裂解的第二前引物将被改变。
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