TW202334385A - 流體槽表面圖案化 - Google Patents

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布萊恩 Ｄ 馬瑟
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美商伊路米納有限公司
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Abstract

將聚合水凝膠施加至包括由間隙區域隔開之凹陷的基板之表面。各凹陷包括位於第一區域處之UV阻擋層，及對UV為可穿透的且鄰近於該第一區域之第二區域。在施加該水凝膠之前或之後，將引子組接枝於該水凝膠。該引子組包括3'阻斷不可裂解第一及第二前引子。將該水凝膠或經接枝層自該等間隙區域中移除。在該第二區域內之該經接枝層的第一預定區域處：該等第一前引子經改變以引入不可裂解第一引子；且該等第二前引子經阻斷以引入可裂解第二引子。在該第一區域內之該經接枝層的第二預定區域處：該等第一前引子經改變以引入不可裂解第一引子；且該等第二前引子經阻斷以引入可裂解第二引子。

Description

流體槽表面圖案化
本發明係關於用於使流體槽表面圖案化之方法及包含流體槽之套組。 相關申請案之交叉參考
本申請案主張2021年12月27日申請之美國臨時申請案序列號63/293,959之權益，該申請案之內容以全文引用之方式併入本文中。 序列表之引用
在此提交之序列表特此以全文引用之方式併入。檔案名稱為ILI229BTW_IP-2237-TW2_Sequence_Listing.xml，檔案之大小為18,800位元組，且檔案之創建日期為2022年12月13日。
一些用於對核酸定序之可用平台利用合成定序方法。藉由此方法，合成新生股，且以光學方式及/或以電子方式偵測向生長股添加各單體（例如，核苷酸）過程。由於模板股引導新生股之合成，因此吾人可在合成期間自添加至生長股之核苷酸單體系列推斷出模板DNA之序列。在一些實例中，可使用連續成對末端定序，其中對正向股進行定序及移除，且隨後對反向股進行構築及定序。在其他實例中，可使用同時成對末端定序，其中對正向股及反向股同時進行定序。
對於同時成對末端定序之一些實例，不同引子組附接至流體槽表面之各凹陷內的不同區域。本文所描述之方法以附接至凹陷中之各者中的聚合水凝膠之單一引子組（在本文中亦稱為初始引子組）開始，且隨後該引子組在一或多個區域處改變以在凹陷內產生不同引子集。在此等實施例中，在將聚合水凝膠及單一引子組引入凹陷中之後進行單一引子組之改變。由此，將相同聚合水凝膠施加於凹陷中之各者中。因此，聚合水凝膠不暴露於物理圖案化，其可具有挑戰性，有時為不可重現的，且引起來自不同引子組之不平衡的簇強度。
本文所揭示之方法產生適合用於同時成對末端定序之流體槽。各方法利用附著有單一（初始）引子組之聚合水凝膠，且涉及單一引子組中之引子中之至少一些的改變。引子中之至少一些之改變引起不同引子組位於聚合水凝膠之不同區域處。不同區域處之引子組具有正交裂解（線性化）化學性質。正交裂解化學物質可經由連接至不同組中之不同引子之相同或不同裂解位點實現。正交裂解化學反應使得能夠在一個區域中產生正向擴增子鏈之簇且在另一區域中產生反向擴增子鏈之簇。正向及反向股在空間上分開，其將螢光訊號與兩個讀段分開，同時允許對各讀段進行同時鹼基識別。
定義
應理解，除非另外規定，否則本文中所使用之術語將採用其在相關領域中之普通含義。本文中所使用之若干術語及其含義闡述於下文中。
除非上下文另外明確規定，否則單數形式「一（a/an）」及「該」包括複數個指示物。
術語包含（comprising）、包括（including）、含有（containing）及此等術語之各種形式彼此為同義的且意謂同等廣義。
術語頂部（top）、底部（bottom）、下部（lower）、上部（upper）、在上（on）等在本文中用於描述流體槽及/或流體槽之各種組件。應瞭解，此等方向性術語不意欲暗示特定取向，但用於指示組件之間的相對取向。方向性術語之使用不應解釋為將本文揭示之實施例限制於任何特定取向。
術語第一（first）、第二（second）等亦不意謂暗示特定位向或次序，而係用於將一個組件與另一組件區分開來。
應理解，本文所提供之範圍包括所陳述範圍及在所陳述範圍內的任何值或子範圍，如同明確地列舉所陳述範圍內的值或子範圍一般。舉例而言，約400 nm至約1 µm（1000 nm）之範圍應解釋為不僅包括約400 nm至約1 µm之明確列舉界限值，且亦包括個別值，諸如約708 nm、約945.5 nm等，及子範圍，諸如約425 nm至約825 nm、約550 nm至約940 nm等。
另外，當「約」及/或「實質上」用以描述值時，其意謂涵蓋所陳述值的較小變化（達至+/-10%）。
「丙烯醯胺單體（acrylamide monomer）」為具有結構 之單體或包括丙烯醯胺基之單體。包括丙烯醯胺基之單體之實例包括疊氮基乙醯胺基戊基丙烯醯胺： 及N-異丙基丙烯醯胺： 。可使用其他丙烯醯胺單體。
如本文所用，術語「活化」係指在基板表面處產生反應性基團，例如多層結構之基底支撐或最外層的方法。活化可使用矽烷化或電漿灰化來實現。儘管圖式不描繪與電漿灰化分離之矽烷化層或-OH基團，但應理解，活化在經活化支撐或層之表面處產生矽烷化層或-OH基團以將聚合水凝膠共價附接至底層支撐或層。
如本文中所使用，醛（aldehyde）為含有具有結構-CHO之官能基的有機化合物，其包括羰基中心（亦即，碳雙鍵結至氧）且碳原子亦鍵結至氫及R基團，諸如烷基或其他側鏈。醛之通用結構為： 。
如本文所用，「烷基（alkyl）」係指完全飽和（亦即不含雙鍵或參鍵）之直鏈或分支鏈烴鏈。烷基可具有1至20個碳原子。範例性烷基包括甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、三級丁基、戊基、己基及其類似者。作為一實例，名稱「C1-4烷基」指示烷基鏈中存在一至四個碳原子，亦即，烷基鏈係選自由以下者組成之群：甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、異丁基、二級丁基及三級丁基。
如本文所用，「烯基」係指含有一或多個雙鍵之直鏈或分支鏈烴鏈。烯基可具有2至20個碳原子。範例性烯基包括乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基及其類似者。
如本文中所使用，「炔烴（alkyne）」或「炔基（alkynyl）」係指含有一或多個參鍵之直鏈或分支鏈烴鏈。炔基可具有2至20個碳原子。
如本文所用，「芳基（aryl）」係指在環主鏈中僅含有碳之芳族環或環系統（亦即兩個或更多個共用兩個相鄰碳原子之稠合環）。當芳基為環系統時，該系統中之各環為芳族環。芳基可具有6至18個碳原子。芳基之實例包括苯基、萘基、薁基及蒽基。
在與單一引子組（初始引子組）結合使用時，術語「改變」意謂單一引子組中之一些引子暴露於改變引子之加工，使得引子不同於單一引子組內之引子。在一個實施例中，移除單一引子組內之一些引子且用對單一引子組中之引子具有正交裂解化學之引子替換。在另一實施例中，單一引子組內之一些引子暴露於3'端未阻斷/去阻斷處理，接著核酸外切酶處理，接著暴露延伸活性，以引入與單一引子組中之引子之裂解化學正交的裂解化學。在再一實施例中，單一引子組中之引子不具有任何線性化化學反應，且單一引子組中之此等不同區段相繼地暴露於延伸活性以引入正交裂解化學反應。
「胺」或「胺基」官能基係指如本文所定義之-NR aR b基團，其中R a及R b各自獨立地選自氫（例如 ）、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳環基、C6-10芳基、5-10員雜芳基及5-10員雜環。
如本文中所使用，術語「附接（attached）」係指兩個事物彼此直接或間接接合、緊固、黏著、連接或結合之狀態。舉例而言，核酸可藉由共價或非共價鍵附接至官能化聚合物。共價鍵之特徵在於原子之間的電子對共用。非共價鍵為不涉及電子對共用之物理鍵，並且可包括例如氫鍵、離子鍵、范德華力（van der Waals force）、親水相互作用及疏水相互作用。
「疊氮（azide）」或「疊氮基（azido）」官能基係指-N 3。
如本文中所使用，「結合區域（bonding region）」係指將結合至另一材料的圖案化結構之區域，該另一材料可例如為間隔物層、蓋板、另一圖案化結構等或其組合（例如，間隔物層及蓋板，或間隔物層及另一圖案化結構）。結合區域處所形成之結合可為化學結合（如上文所描述）或機械結合（例如，使用緊固件等）。
如本文中所使用，「碳環（carbocycle）」意謂環系統主鏈中僅含有碳原子之非芳族環狀環或環系統。當碳環為環系統時，兩個或更多個環可以稠合、橋連或螺連接方式接合在一起。碳環可具有任何飽和度，其限制條件為環系統中之至少一個環不為芳族環。因此，碳環包括環烷基、環烯基及環炔基。碳環基可具有3至20個碳原子。碳環之實例包括環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環己烯基、2,3-二氫-茚、雙環[2.2.2]辛烷基、金剛烷基及螺[4.4]壬基。
如本文中所使用，如本文中所使用之術語「羧酸（carboxylic acid）」或「羧基（carboxyl）」係指-COOH。
如本文中所使用，「伸環烷基（cycloalkylene）」意謂經由兩個附接點附接至分子之其餘部分的完全飽和碳環或環系統。
如本文中所使用，「環烯基（cycloalkenyl）」或「環烯（cycloalkene）」意謂具有至少一個雙鍵之碳環或環系統，其中環系統中並無環為芳族環。實例包括環己烯基或環己烯及降冰片烯基或降冰片烯。亦如本文中所使用，「雜環烯基（heterocycloalkenyl）」或「雜環烯（heterocycloalkene）」意謂在環主鏈中具有至少一個雜原子之碳環或環系統，其具有至少一個雙鍵，其中環系統中並無環為芳族環。
如本文中所使用，「環炔基（cycloalkynyl）」或「環炔（cycloalkyne）」意謂具有至少一個參鍵之碳環或環系統，其中環系統中並無環為芳族環。實例為環辛炔。另一實例為雙環壬炔。亦如本文中所使用，「雜環炔基（heterocycloalkynyl）」或「雜環炔（heterocycloalkyne）」意謂在環主鏈中具有至少一個雜原子之碳環或環系統，其具有至少一個參鍵，其中環系統中並無環為芳族環。
如本文中所使用，術語「沈積（depositing）」係指任何合適之塗覆技術，其可為手動或自動化的，且在一些情況下導致表面特性改變。一般而言，可使用氣相沈積技術、塗佈技術、接枝技術或其類似技術進行沈積。一些具體實例包括化學氣相沈積（chemical vapor deposition；CVD）、噴塗（例如，超音波噴塗）、旋塗、浸塗（dunk/dip coating）、刮刀塗佈、覆液分配、流通塗佈、氣溶膠列印、網版列印、微接觸列印、噴墨列印或類似者。
如本文所用，術語「凹陷」係指具有表面開口的基底支撐件或多層堆疊之層中的離散凹入特徵，該表面開口至少部分地由基底支撐件或多層堆疊之層的間隙區域包圍。凹陷在表面中其開口處可具有多種形狀中之任一者，包括例如圓形、橢圓形、正方形、多邊形、星形（具有任何數目的頂點）等。與表面正交獲得之凹陷的橫截面可為曲線、正方形、多邊形、雙曲線、圓錐形、角形等。凹陷亦可具有更複雜的架構，諸如脊線、階梯特徵等。
當參考條項之集合使用時，術語「每個（each）」意欲鑑別該集合中之單獨條項，但未必指代該集合中之每一條項。若明確揭示內容或上下文另外清楚地規定，則可存在例外狀況。
如本文中所使用，術語「環氧基（epoxy）」（亦稱為縮水甘油基或環氧乙烷基）係指 或 。
如本文中所使用，術語「流體槽（flow cell）」意欲意謂具有可進行反應之流動通道、用於將試劑遞送至流動通道之入口及用於從流動通道移除試劑之出口的容器。在一些實例中，流體槽適應偵測流體槽中發生之反應。舉例而言，流體槽可包括允許光學偵測陣列、光學標記分子或類似者之一或多個透明表面。
如本文所使用之「流道（flow channel）」或「通道（channel）」可為經界定於兩個接合組件之間的可選擇性接受液體樣本之區域。在一些實例中，流動通道可界定於兩個圖案化結構之間，且因此可與圖案化結構之表面化學物質流體連通。在其他實例中，流動通道可界定於圖案化結構與蓋板之間，且因此可與圖案化結構之表面化學物質流體連通。
如本文所用，「雜芳基」係指在環主鏈中含有一或多個雜原子，亦即除碳以外之元素，包括但不限於氮、氧氣及硫的芳族環或環系統（亦即，共用兩個相鄰原子之兩個或更多個稠環）。當雜芳基為環系統時，該系統中之各環為芳族環。雜芳基可具有5至18個環成員。
如本文所用，「雜環（heterocycle）」意謂在環主鏈中含有至少一個雜原子之非芳族環或環系統。雜環可以稠合、橋連或螺連接方式結合在一起。雜環可具有任何飽和度，其限制條件為環系統中之至少一個環不為芳族。在環系統中，雜原子可存在於非芳族或芳族環中。雜環基可具有3至20個環成員（亦即，該數目之原子構成環主鏈，包括碳原子及雜原子）。在一些實例中，（多種）雜原子為O、N或S。
如本文所用，術語「肼」或「肼基」係指-NHNH 2基團。
如本文所使用，如本文所使用之術語「腙（hydrazone）」或「腙基（hydrazonyl）」係指 基團，其中R a及R b各自獨立地選自氫、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳環基、C6-10芳基、5-10員雜芳基及5-10員雜環，如本文所定義。
如本文所用，「羥基（hydroxy）」或「羥基（hydroxyl）」係指-OH基團。
如本文所用，術語「間隙區域（interstitial region）」係指例如基礎支撐件或分開凹陷（凹面區域）之多層堆疊之層的區域。舉例而言，間隙區域可將陣列之一個凹陷與陣列之另一凹陷分隔開。彼此分隔開之兩個凹陷可為離散的，亦即彼此不物理接觸。在許多實例中，間隙區域為連續的，然而凹陷為離散的，例如如同其他方面連續的表面中所界定之複數個凹陷之情況一般。在其他實例中，間隙區域及特徵為離散的，例如，如同由各別間隙區域分離之呈溝渠形狀之複數個凹陷之情況一般。由間隙區域提供之分隔可為部分隔開或完全隔開。間隙區域可具有不同於凹陷之表面材料的表面材料。舉例而言，凹陷可具有其中之聚合物及引子組，且間隙區域可不含聚合物及引子組。
如本文中所使用，「負型光阻（negative photoresist）」係指一種光敏材料，其中暴露於特定波長之光的一部分變得不可溶於顯影劑。在此等實例中，不可溶負型光阻在顯影劑中具有低於5%溶解度。在負型光阻之情況下，曝光改變化學結構，使得材料之經暴露部分變得在顯影劑中較不可溶（相比於未經暴露部分）。雖然不可溶於顯影劑，但不可溶負型光阻可至少99%可溶於與顯影劑不同之移除劑中。移除劑可為例如在剝離過程中使用之溶劑或溶劑混合物。
相比於不可溶負型光阻，未暴露於光之負型光阻之任何部分可至少95%溶於顯影劑中。在一些實例中，未暴露於光之負型光阻之部分可至少98%，例如99%、99.5%、100%溶於顯影劑中。
如本文中所使用，「氧化腈（nitrile oxide）」意謂「R aC≡N +O -」基團，其中R a在本文中經定義。製備氧化腈之實例包括藉由用氯醛甲醯胺-T處理或經由醯亞胺基氯[RC(Cl)=NOH]之作用自醛肟或自羥胺與醛之間的反應原位產生。
如本文中所使用，「硝酮（Nitrone）」意謂 基團，其中R 1、R 2及R 3可為本文中所定義之R a及R b基團中之任一者，但R 3不為氫（H）。
如本文所用，「核苷酸」包括含氮雜環鹼基、糖及一或多種磷酸基團。核苷酸為核酸序列之單體單元。在RNA中，糖為核糖，且在DNA中，糖為去氧核糖，亦即缺乏存在於核糖中之2'位置處之羥基的糖。含氮雜環鹼基（亦即，核鹼基）可為嘌呤鹼基或嘧啶鹼基。嘌呤鹼基包括腺嘌呤（A）及鳥嘌呤（G）及其經改質之衍生物或類似物。嘧啶鹼基包括胞嘧啶（C）、胸腺嘧啶（T）及尿嘧啶（U）以及其修飾之衍生物或類似物。脫氧核糖之C-1原子鍵結至嘧啶之N-1或嘌呤之N-9。核酸類似物可具有磷酸酯主鏈、糖或核鹼基中之任一者的改變。核酸類似物之實例包括例如通用鹼基或磷酸酯-糖主鏈類似物，諸如肽核酸（peptide nucleic acid；PNA）。
在一些實例中，術語「上方（over）」可意謂一個組件或材料直接定位於另一組件或材料上。當一者直接在另一者上時，兩者彼此接觸。在其他實例中，術語「上方」可意謂一個組件或材料間接定位於另一組件或材料上。藉由間接地在……上，意謂間隙或額外組件或材料可定位於兩個組件或材料之間。
「經圖案化樹脂（patterned resin）」係指可具有經界定於其中之凹陷之任何聚合物。在本文中所揭示之一些實例中，經圖案化樹脂可具有為紫外光吸收之部分及部分取決於厚度而具有紫外光透射之其他部分。下文將進一步描述樹脂及使樹脂圖案化之技術的具體實例。
圖案化結構係指包括圖案中（例如凹陷中）之表面化學物質的單層基底支撐或具有包括表面化學物質之層的多層堆疊。表面化學物質可包括本文所揭示之聚合水凝膠及引子組，其可例如用於庫模板捕捉及擴增。
如本文所用，術語「多面體寡聚矽倍半氧烷（polyhedral oligomeric silsesquioxane）」係指一種化學組合物，其為二氧化矽（SiO 2）與聚矽氧（R 2SiO）之間的混合中間物（例如RSiO 1.5）。多面體寡聚矽倍半氧烷之實例可為Kehagias等人, Microelectronic Engineering 86（2009）,第776-778頁中所描述之多面體寡聚矽倍半氧烷，該參考文獻以全文引用之方式併入。在實例中，組合物為具有化學式[RSiO 3/2] n之有機矽化合物，其中R基團可相同或不同。多面體寡聚矽倍半氧烷之範例性R基團包括環氧基、疊氮/疊氮基、硫醇、聚(乙二醇)、降冰片烯、四、丙烯酸酯及/或甲基丙烯酸酯，或此外，例如烷基、芳基、烷氧基及/或鹵烷基。
如本文所用，「正型光阻（positive photoresist）」係指一種暴露於特定波長之光的部分變得可溶於顯影劑的光敏材料。在此等實例中，正型光阻暴露於光之任何部分至少95%可溶於顯影劑中。在一些實例中，正型光阻之暴露於光之部分至少98%，例如99%、99.5%、100%可溶於顯影劑中。在正型光阻之情況下，光暴露改變化學結構，使得材料之經暴露部分變得在顯影劑中更可溶（相比於未經暴露部分）。
相比於可溶正型光阻，正型光阻未暴露於光之任何部分在顯影劑中不可溶（小於5%可溶性）。雖然不可溶於顯影劑，但不可溶正型光阻可至少99%可溶於與顯影劑不同之移除劑中。在一些實例中，不可溶正型光阻至少98%，例如99%、99.5%、100%可溶於移除劑。移除劑可為剝離過程中使用之溶劑或溶劑混合物。
如本文所用，「引子（primer）」定義為單股核酸序列（例如單股DNA）。在本文中被稱作擴增引子之一些引子充當模板擴增及叢集產生之起點。在本文中被稱作定序引子之其他引子充當DNA合成之起點。引子之5'端可經修飾以允許與聚合物之官能基發生偶合反應。引子長度可為任何數目之鹼基長且可包括多種非天然核苷酸。在一實例中，定序引子為短股，在10至60個鹼基或20至40個鹼基範圍內。術語「前引子」在本文中用於描述i）經截短引子，該引子暴露於額外加工以產生完整引子，或ii）具有來自3'端之5個鹼基至10個鹼基安置之可光裂解阻斷基團的引子，使得經截短引子在加工期間產生且隨後用於產生完整引子。另外，可裂解引子包括裂解位點，而不可裂解引子不包括裂解位點。
片語「單一引子組」係指包括兩個不同單股核酸序列之複數個引子或包括兩種不同經截短單股核酸序列之複數個前引子或包括兩種不同引子之複數個前引子，該等引子具有來自3'端之5個鹼基至10個鹼基定位之可光裂解阻斷基團。
如本文所用，「分隔層」係指使兩種組分結合於一起之材料。在一些實例中，分隔層可為有助於接合之輻射吸收材料，或可與有助於接合之輻射吸收材料接觸。
術語「基板（substrate）」係指單層基底支撐件或多層結構，在該多層結構上引入表面化學物質。
「硫醇（thiol）」官能基係指-SH。
如本文所用，術語「四」及「四基」係指包含四個氮原子之六員雜芳基。可視情況取代四。
如本文所用，「四唑」係指包括四個氮原子之五員雜環基。可視情況取代四唑。
術語「可穿透的（transparent）」係指例如呈基底支撐或層形式的能夠透射特定波長或波長範圍之材料。舉例而言，材料可對用以化學改變正型或負型光阻及/或移除3'阻斷基團之波長可穿透。可穿透度可使用透射率（亦即，落在主體上之光能與經由主體透射之光能的比率）定量。可穿透基底支撐件或可穿透層之透射率將視基底支撐件或層之厚度、光之波長及曝光其的光之劑量而定。在本文中所揭示之實例中，可穿透基底支撐件或可穿透層之透射率可在0.25（25%）至1（100%）範圍內。作為一實例，將五氧化二鉭（具有式Ta 2O 5之無機化合物）視為可穿透的，因為其透射率範圍介於約0.25（25%）至1（100%）至範圍介於約0.35 µm（350 nm）至至少1.8 µm（1800 nm）之波長。基底支撐件或層之材料可為純材料、具有一些雜質之材料或材料混合物，只要所得基底支撐件或層能夠具有所要透射率即可。另外，視基底支撐或層之透射比而定，可增加或減少光曝光之時間及/或光源之輸出功率以經由可穿透基底支撐件及/或層遞送適合的劑量之光能，從而達成所要效應（例如，產生可溶或不可溶光阻，移除3'阻斷基團等）。
基板組態
在本文所揭示之方法中之各者中，基板單獨或與單獨UV光阻擋層組合充當圖案化工具，該圖案化工具能夠實現附著至基板之凹陷內之聚合水凝膠的單一引子組之選擇性改變。圖1A至圖1D中展示不同實例。
在圖1A、圖1B及圖1C之實例中，基板10A、10B、10C為包括由間隙區域14隔開之凹陷12的單層基底支撐件。在此等實例中，基板10A、10B、10C可為能夠透射紫外光之任何材料，該紫外光欲用於改變單一引子組。在一個實例中，基板10A、10B、10C能夠透射紫外光，該紫外光可自單一引子組中之經暴露引子中移除3'端阻斷基團。在另一實例中，基板10A、10B、10C能夠傳輸紫外光，該紫外光可圖案化上覆於基板10A、10B、10C之光阻。在一些情況下，該基板材料亦可能夠傳輸將用於核酸定序中之可見光。
在此等特定實例中，用於基板10A、10B、10C之合適材料包括矽氧烷、玻璃、經改質或官能化玻璃、塑膠（包括丙烯酸類、聚對苯二甲酸伸乙酯（PET）、聚碳酸酯、環烯烴共聚物（COC）及一些聚醯胺）、二氧化矽或氧化矽（SiO 2）、熔融矽石、基於二氧化矽之材料、氮化矽（Si 3N 4）、無機玻璃、樹脂或其類似物質。可透射UV光之樹脂的實例包括無機氧化物，諸如五氧化二鉭（例如，Ta 2O 5）或其他氧化鉭（TaO x）、氧化鋁（例如，Al 2O 3）、氧化矽（例如，SiO 2）、氧化鉿（例如，HfO 2）等；或聚合樹脂，諸如基於多面體寡聚倍半矽氧烷之樹脂（例如，來自之POSS®）、非多面體寡聚倍半矽氧烷環氧樹脂、聚(乙二醇)樹脂、聚醚樹脂（例如，開環環氧樹脂）、丙烯酸樹脂、丙烯酸酯樹脂、甲基丙烯酸酯樹脂、非晶形含氟聚合物樹脂（例如，來自Bellex之CYTOP®）及其組合。在一些實例中，所使用之樹脂具有在約0.5至約1，例如約0.75至約1，約0.9至約0.99範圍內之UV透射率（在所使用之預定UV劑量下）。可調整樹脂之厚度以使得整個樹脂展現出所使用之UV劑量的所需UV透射率。在一些情況下，樹脂厚度係150 nm或更小。
一些範例性基板材料（例如，無機氧化物）可經由氣相沈積、氣溶膠印刷或噴墨印刷選擇性地施加，且凹陷12可在此方法期間形成。可應用其他範例性材料，例如聚合樹脂，且隨後圖案化以形成凹陷12。舉例而言，聚合樹脂可使用適合之技術沈積，諸如化學氣相沈積、浸塗(dip coating)、浸塗(dunk coating)、旋塗、噴塗、覆液分配、超音波噴塗、刮刀塗佈、氣溶膠印刷、網板印刷、微接觸印刷等。合適之圖案化技術包括光微影術、奈米壓印微影術（NIL）、衝壓技術、壓花技術、模製技術、微蝕刻技術等。
雖然兩個凹陷12展示於圖1A、圖1B及圖1C中，但應理解，設想凹陷12之許多不同佈局，包括規則、重複及非規則圖案。在一實例中，為了緊密堆積及提高密度，將凹陷12安置成六方柵格。其他佈局可包括（例如）矩形佈局、三角形佈局等等。在一些實例中，佈局或圖案可為呈列及行之x-y格式。在一些其他實例中，佈局或圖案可為凹陷12及間隙區域14之重複排列。在另外其他實例中，佈局或圖案可為凹陷12及間隙區域14之無規排列。
佈局或圖案可就所界定區域中之凹陷12的密度（數目）進行描繪。舉例而言，凹陷12可以大致2百萬個/mm 2之密度存在。密度可經調整達不同密度，包括例如以下密度：約100個/mm 2、約1,000個/mm 2、約10萬個/mm 2、約1百萬個/mm 2、約2百萬個/mm 2、約5百萬個/mm 2、約1千百萬個/mm 2、約5千萬個/mm 2或更大或更小。應進一步理解，密度可介於選自以上範圍之下限值中之一者與上限值中之一者之間，或可使用其他密度（給定範圍之外）。作為實例，高密度陣列的特徵可為凹陷12的間隔小於約100 nm，中等密度陣列的特徵可為凹陷12的間隔約400 nm至約1 μm，且低密度陣列的特徵可為凹陷12的間隔大於約1 μm。
凹陷12之佈局或圖案亦可或替代地就平均節距或自一個凹陷12之中心至相鄰凹陷12之中心的間距（中心至中心的間距）或自一個凹陷12之右邊緣至相鄰凹陷12之左邊緣的間距（邊緣至邊緣的間距）進行描繪。圖案可為有規則的以使得圍繞平均節距之變化係數較小，或圖案可為不規則的，在此情況下，變化係數可能相對較大。在任一情況下，平均節距可為例如約50 nm、約0.15 μm、約0.5 μm、約1 μm、約5 μm、約10 μm、約100 μm或更長或更短。特定圖案之平均節距可介於選自以上範圍之下限值中之一者與上限值中之一者之間。在一實例中，凹陷12之節距（中心至中心的間距）為約1.5 μm。儘管已提供範例性平均節距值，但應理解可使用其他平均節距值。
各凹陷12之大小可就其容積、開口面積、深度及/或直徑進行描繪。舉例而言，體積可在約1×10 −3μm 3至約100 μm 3範圍內，例如約1×10 −2μm 3、約0.1 μm 3、約1 μm 3、約10 μm 3或更大或更小。對於另一實例，開口面積可在約1×10 −3μm 2至約100 μm 2範圍內，例如約1×10 −2μm 2、約0.1 μm 2、約1 μm 2、至少約10 μm 2或更大或更小。對於又另一實例，深度可在約0.1 μm至約100 μm範圍內，例如約0.5 μm、約1 μm、約10 μm或更大或更小。對於另一實例，深度可在約0.1 μm至約100 μm範圍內，例如約0.5 μm、約1 μm、約10 μm或更大或更小。對於另一實例，直徑或長度及寬度可在約0.1 μm至約100 μm範圍內，例如約0.5 μm、約1 μm、約10 μm或更大或更小。
圖1A、圖1B及圖1C中所示之實例中之各者包括位於凹陷12之一部分上方或嵌入於凹陷之一部分中的單獨UV光阻擋層16或16'。在此等實例中之任一者中，UV光阻擋層16、16'可為能夠吸收紫外光之任何材料，該紫外光欲用於改變單一引子組。在一些情況下，UV光阻擋層16、16'亦可能夠傳輸將用於核酸定序中之可見光。在此等情況下，相較於自流體槽中移除，UV光阻擋層16、16'可保持作為流體槽之組件。
UV光阻擋層16、16'之材料及/或材料厚度經選擇，使得層16、16'阻擋透射通過基板10A、10B、10C（例如，自側18A、18B、18C引入）之UV光的至少75%到達直接與UV光阻擋層16、16'成直線定位之上覆材料。用以形成UV光阻擋層16、16'之材料可為鈦、鉻、鋁、金或銅。在一些實例中，金屬可為至少實質上純的（純度＜99%）。在其他實例中，可使用所列元素或其他元素之分子或化合物，只要UV光阻擋層16、16'對單一引子組之改變中所使用之UV光不可穿透（不可穿透或具有小於0.25之透射率）。舉例而言，可單獨或與所列金屬組合使用所列金屬中之任一者的氧化物（例如二氧化鈦、氧化銅、氧化鐵、氧化鈷等）。視待使用（且因此由材料阻斷）之UV波長而定，亦可使用其他氧化物，諸如氧化鋅或氧化鈰。二氧化鈦、氧化鋅及氧化鈰為能夠進行UV光吸收及可見光透射之材料的實例。另外其他UV不可穿透材料包括含有UV吸附劑（諸如有機小分子（例如芘））、染料（例如來自ATTO-tec之ATTO™ 390）之聚合物樹脂，其經選擇以吸收待用於製程中之UV的波長。在一實例中，UV光阻擋層16、16'之厚度至少為15 nm厚（例如，20 nm、25 nm、40 nm等）。一些金屬UV光阻擋層16、16'可能較厚，例如厚度在約100 nm至約1000 nm範圍內，以便使經由金屬之電漿子效應降至最低。
電漿效應可非刻意地去除上覆於UV光阻擋層16、16'之引子的阻斷。因此，在金屬UV光阻擋層16、16'之情況下，可能需要包括有助於防止去除在背側UV暴露期間阻斷之塗層（亦即，自側18A、側18B或側18C引導穿過基板10A、10B或10C之UV光）。塗層之實例包括厚度在約10 nm至約300 nm範圍內之有機聚合物或金屬氧化物材料。
在圖1A及圖1B中所示之實例中，單獨UV光阻擋層16安置在各凹陷12之一部分上方。如此等圖式中之各者中所描繪，UV光阻擋層16與凹陷12之底表面20之一部分接觸。UV光阻擋層16界定被改變之單一引子組中之一些引子的圖案，且因此可應用UV光阻擋層16以使得其覆蓋凹陷12之一部分，包括側壁中之一些及底部20中之一些，同時使凹陷12之另一部分暴露。如圖1B中所示，UV光阻擋層16亦可施加於與正經塗佈之凹陷側壁相鄰之間隙區域14上。在圖1A及圖1B兩者中，藉由UV光阻擋層16覆蓋之基板10A、10B之部分在本文中稱為第一區域58且不含UV光阻擋層16之基板10B之部分在本文中稱為第二區域60。如將參考方法中之一些所論述，第一區域58與經接枝層之預定區域相對應，其中引子中之至少一些將改變。
在圖1A及圖1B中所示之實例中，UV光阻擋層16可使用與剝離技術或蝕刻技術組合之光微影製程製造。在其他實例中，選擇性沈積技術（諸如，化學氣相沈積（CVD）及其變化（例如，低壓CVD或LPCVD）、原子層沈積（ALD）及遮罩技術）可用以在所要區域中沈積UV光阻擋層16。或者，UV光阻擋層16可在基板10A、10B上（包括在所有凹陷12上）施加，且隨後自所需部分選擇性移除（例如，經由遮罩及蝕刻）。
在圖1C之實例中，單獨UV光阻擋層16'嵌入於各凹陷12之一部分內。藉由「嵌入」，其意謂UV光阻擋層16之至少一部分在凹陷12之底表面20下方延伸。在一個實例中，如圖1C中所描繪，UV光阻擋層16'之表面22與凹陷12之底表面20大體上共面，且UV光阻擋層16'之其餘部分延伸至基板10C之深度中。在另一實例（圖中未描繪）中，UV光阻擋層16'可完全嵌入於基板10C中，使得UV光阻擋層16'之所有側（包括表面22）由基板10C或由將UV光阻擋層16'與聚合水凝膠分離之額外材料層覆蓋。
UV光阻擋層16'限定被改變之單一引子組中之一些引子的圖案，且因此UV光阻擋層16'可經嵌入以使得其與凹陷12之一部分對準，同時使凹陷12之另一部分暴露。換言之，UV光阻擋層16'嵌入於基板10C之第一區域58''中（特定言之，在凹陷12中），該第一區域與（待改變之經接枝層之）預定區域對應，由此基板10C之第二區域60（特定言之，在凹陷12中）不含嵌入式UV光阻擋層16'。
在圖1C中所展示的實例中，當凹陷12形成時可壓印或以其他方式界定基板10C的待製造UV光阻擋層16'的區域。選擇性沈積技術（諸如化學氣相沈積（CVD）及其變化（例如，低壓CVD或LPCVD）、原子層沈積（ALD）及遮罩技術）可用以將UV光阻擋層16'沈積於合乎需要之區域中。若UV光阻擋層16'被完全嵌入，則額外基板10C材料或額外材料層可施加於UV光阻擋層16'上方。
因為UV光阻擋層16'嵌入於基板10C內，所以可能需要選擇可阻擋用於引子組改變中之UV光且可透射用於定序中之可見光的材料。如上文所指出，此等材料之一些實例包括二氧化鈦、氧化鋅及氧化鈰。應理解，此等材料可用於UV光阻擋層16（圖1A及圖1B中所示），且因此UV光阻擋層16之此等實例可保留在最終流體槽中而不有害影響定序。
在期望保持最終流體槽中之UV光阻擋層16、16'之任何實例中，UV光阻擋層16、16'可塗佈有二氧化矽、五氧化鉭或聚合樹脂中之任一者，其中各者可經活化以能夠實現與聚合水凝膠之共價附接。此等材料中之一或多者可用作額外材料層以將UV光阻擋層16'嵌入於基板10C中。此等額外材料層可具有範圍介於約10 nm至約300 nm之總厚度。
圖1D中所展示之基板10D的實例不包括UV光阻擋層16、16'。確切而言，基板10D具有變化之厚度t 1、t 2、t 3，其中一些（例如，t 1）能夠傳輸將用於單一引子組之改變的紫外光，且其中其他者（例如，t 2、t 3）能夠吸收且因此阻斷待用於單一引子組之改變的紫外光。基板10D之紫外光可穿透部分以參考數字60'展示，且基板10D之紫外光阻擋部分以參考數字58'展示。
在此實例中，基板10D可為當暴露於特定UV光劑量時UV吸光度可藉由調整其厚度而改變的任何樹脂材料。可使用前述樹脂中之任一者，只要較厚部分（例如，具有厚度t 2及t 3之彼等部分）吸收UV光且較薄部分（例如，具有厚度t 1之彼等部分）當樹脂經由側18D暴露於預定UV光劑量時傳輸合乎需要的量之UV光以用於引子組改變。在一個實例中，具有約500 nm之較粗部分及約150 nm之較薄部分的基於多面體寡聚倍半矽氧烷之樹脂當暴露於在約30 mJ/cm 2至約60 mJ/cm 2範圍內之劑量時將分別且有效地吸收且透射UV光。可使用其他厚度，且可相應地調整UV劑量以達成較厚區域中之所要吸收及較薄區域中之透射率。
UV劑量、UV吸光常數及基板10C厚度之間的相關性可表達為： 其中D 0為改變單一引子組之所需UV劑量，D為必須施加至基板10D之實際UV劑量，k為吸收常數，且d為基板10D之較薄部分的厚度。因此，實際UV劑量（D）可表達為：
不同厚度t 1、t 2分別與定義於基板10D中之多深度凹陷12'之不同部分24、26對準，且厚度t 3與鄰近於多深度凹陷12'之間隙區域14對準。部分24為多深度凹陷12'之較深部分，且部分26為多深度凹陷12'之較淺部分。如本文中所使用，術語「較深部分」及「較淺部分」係指多深度凹陷12'內之三維（3D）空間。如例如自多深度凹陷12'之開口量測，較深部分24具有比較淺部分26更大的深度。
圖1A至圖1D中所展示之基板10A、10B、10C、10D被描繪為單層基底支撐件。在其他實例中，基板10A、10B、10C、10D（具有界定於其中之凹陷12或12'）可為多層結構之頂部層。在此等情況下，基板10A、10B、10C、10D可安置於能夠透射用於改變單一引子組之紫外光的底層基底支撐件上。在一些情況下，此底部基底支撐件亦能夠透射待用於核酸定序中之可見光。在此類多層結構之一個實例中，基板10A、10B、10B、10D為由玻璃支撐之圖案化樹脂。
聚合水凝膠
具有UV光阻擋層16、16'之基板10A、10B、10C及具有不同厚度t 1、t 2、t 3之基板10D可用於方法之不同實例中，該方法中之各者使用單一聚合水凝膠。
聚合水凝膠（例如在圖2A中之參考數字28處展示）可為可在吸收液體時膨脹且可在移除液體時收縮（例如藉由乾燥）之任何凝膠材料。在一實例中，聚合水凝膠包括丙烯醯胺共聚物。丙烯醯胺共聚物之一些實例由以下結構（I）表示： 其中： R A係選自由以下者組成之群：疊氮基、視情況經取代之胺基、視情況經取代之烯基、視情況經取代之炔烴、鹵素、視情況經取代之腙、視情況經取代之肼、羧基、羥基、視情況經取代之四唑、視情況經取代之四、氧化腈、硝酮、硫酸酯及硫醇； R B為H或視情況經取代之烷基； R C、R D及R E各自獨立地選自由H及視情況經取代之烷基組成的群； -(CH 2) p-中之各者可視情況經取代； p為在1至50範圍內之整數； n為1至50,000範圍內之整數；及 m為1至100,000範圍內之整數。
由結構（I）表示之丙烯醯胺共聚物之一個特定實例為聚(N-(5-疊氮基乙醯胺基戊基)丙烯醯胺-共-丙烯醯胺，PAZAM。
一般熟習此項技術者將認識到，在式（I）中重複「n」及「m」個特徵之配置係代表性的，且單體子單元可以任何次序存在於聚合物結構中（例如無規、嵌段、圖案化或其組合）。
丙烯醯胺共聚物的分子量可在約5 kDa至約1500 kDa或約10 kDa至約1000 kDa範圍內，或在特定實例中可為約312 kDa。
在一些實例中，丙烯醯胺共聚物為線性聚合物。在一些其他實例中，丙烯醯胺共聚物為輕度交聯聚合物。
在其他實例中，凝膠物質可為結構（I）之變化形式。在一個實例中，丙烯醯胺單元可經N,N-二甲基丙烯醯胺（ ）置換。在此實例中，結構（I）中之丙烯醯胺單元可經 置換，其中R D、R E及R F各自為H或C1-C6烷基，且R G及R H各自為C1-C6烷基（而非如同丙烯醯胺之情況一樣為H）。在此實例中，q可為1至100,000範圍內之整數。在另一實例中，除丙烯醯胺單元之外，可使用N,N-二甲基丙烯醯胺。在此實例中，除重複的「n」及「m」個特徵以外，結構（I）可包括 ，其中R D、R E及R F各自為H或C1-C6烷基，且R G及R H各自為C1-C6烷基。在此實例中，q可為1至100,000範圍內之整數。
作為聚合水凝膠之另一實例，結構（I）中之重複「n」個特徵可經包括具有結構（II）之雜環疊氮基之單體置換： 其中R 1為H或C1-C6烷基；R 2為H或C1-C6烷基；L為包括直鏈之連接子，該直鏈在鏈中具有2至20個選自由碳、氧及氮組成之群之原子及10個於碳原子及任何氮原子上之視情況選用之取代基；E為在鏈中包括1至4個選自由碳、氧及氮組成之群之原子及於碳原子及任何氮原子上之視情況選用之取代基的直鏈；A為經N取代之醯胺，其中H或C1-C4烷基連接至N；且Z為含氮雜環。Z之實例包括以單一環狀結構或稠合結構存在之5至10個環成員。Z之一些特定實例包括吡咯啶基、吡啶基或嘧啶基。 作為再一實例，凝膠材料可包括結構（III）及（IV）中之各者的重複單元： 及 其中R 1a、R 2a、R 1b及R 2b中之各者獨立地選自氫、視情況經取代之烷基或視情況經取代之苯基；R 3a及R 3b中之各者獨立地選自氫、視情況經取代之烷基、視情況經取代之苯基或視情況經取代之C7-C14芳烷基；且各L 1及L 2獨立地選自視情況經取代之伸烷基連接子或視情況經取代之伸雜烷基連接子。
在再一實例中，使用氮氧化物調控聚合作用形成丙烯醯胺共聚物，且因此至少一些共聚物鏈具有烷氧基胺端基。在共聚物鏈中，術語「烷氧基胺端基」係指休眠物種-ONR 1R 2，其中R 1及R 2中之各者可相同或不同，且可獨立地為直鏈或分支鏈烷基或環結構，且其中氧原子連接至共聚物鏈之其餘部分。在一些實例中，亦可例如在結構（I）中之位置R A處將烷氧基胺引入至一些重複丙烯醯胺單體中。因此，在一個實例中，結構（I）包括烷氧基胺端基；且在另一實例中，結構（I）在至少一些側鏈中包括烷氧基胺端基及烷氧基胺基團。
應理解，其他分子可用於形成聚合水凝膠，只要其能夠藉由所需化學物質，例如單一引子組官能化。聚合水凝膠之適合材料的一些實例包括官能化矽烷，諸如降艸伯烯矽烷、疊氮基矽烷、炔烴官能化矽烷、胺官能化矽烷、順丁烯二醯亞胺矽烷或具有可分別連接所要化學物質之官能基的任何其他矽烷。聚合水凝膠之適合材料的另外其他實例包括具有以下者之材料：膠態結構，諸如瓊脂糖；或聚合物網狀結構，諸如明膠；或交聯聚合物結構，諸如聚丙烯醯胺聚合物及共聚物、無矽烷丙烯醯胺（silane free acrylamide，SFA）或SFA之疊氮化形式。適合聚丙烯醯胺聚合物之實例可由丙烯醯胺及丙烯酸或含有乙烯基之丙烯酸合成，或由形成[2+2]光致環加成反應之單體合成。聚合水凝膠之適合材料之另外其他實例包括丙烯醯胺及丙烯酸酯之混合共聚物。本文中所揭示之實例中可使用多種含有丙烯酸單體（例如，丙烯醯胺、丙烯酸酯等）之聚合物架構，諸如分支鏈聚合物，包括樹枝狀聚合物（例如多臂或星形聚合物）、星形狀或星形嵌段共聚物及其類似者。舉例而言，單體（例如丙烯醯胺、含有催化劑之丙烯醯胺等）可無規或嵌段併入至樹枝狀聚合物之分支（臂）中。
聚合水凝膠之凝膠材料可使用任何適合之共聚過程形成，諸如氮氧化物調控聚合（nitroxide mediated polymerization；NMP）、可逆加成斷裂鏈轉移（reversible addition-fragmentation chain-transfer；RAFT）聚合等。
聚合水凝膠與底層基板10A、10B、10C、10D之附接可經由共價鍵結。在一些例子中，底層基板10A、10B、10C、10D可首先例如經由矽烷化或電漿灰化活化。共價連接有助於在整個流體槽壽命的各種用途期間維持所需區域中之引子。
方法
具有UV光阻擋層16、16'之基板10A、10B、10C及具有不同厚度t 1、t 2、t 3之基板10D可用於方法之不同實施例中，該等實施例中之各者涉及單一引子組之改變。方法之不同實例展示於圖3至圖7中所闡述之一系列圖式中。
圖3至圖6中所闡述之一系列圖中所示之方法大體上包括將聚合水凝膠28施加至基板10A、10B、10C或10D之表面，該基板包括由間隙區域14隔開之凹陷12或12'；在施加聚合水凝膠28之前或之後，將引子組30或30'接枝至聚合水凝膠28以形成經接枝層32或32'，該引子組30或30'包括可裂解第一引子34或34''及不可裂解第二引子36或36''；及在接枝層32或32'之預定區域38處，在凹陷12或12'中之至少一些的一部分內，改變可裂解第一引子34或34''中之一些及不可裂解第二引子36或36''中之一些以分別引入可裂解第二引子40或40''及不可裂解第一引子42或42''。
圖7中所闡述之一系列圖中所示之方法大體上包括將聚合水凝膠28施加至基板10A、10B或10C之表面，該基板包括由間隙區域14分離之凹陷12，各凹陷12包括位於第一區域處之紫外光阻擋層16'及對紫外光為可穿透的且鄰近於第一區域之第二區域；在塗覆聚合水凝膠28之前或之後，將引子組30''接枝至聚合水凝膠28以形成經接枝層32''，該引子組30''包括3'阻斷不可裂解第一前引子46及3'阻斷不可裂解第二前引子48；自間隙區域14移除聚合水凝膠28或經接枝層32''；在凹陷12中之至少一些之第二區域內的經接枝層32''之第一預定區域38處：改變3'阻斷不可裂解第一前引子46以引入可裂解第一引子34；且改變3'阻斷不可裂解第二前引子48以引入不可裂解第二引子36；及位於凹陷12中之至少一些之第一區域內的經接枝層32''之第二預定區域38'處：改變該3'阻斷不可裂解第一前引子46以引入不可裂解第一引子42；及改變該3'阻斷不可裂解第二前引子48以引入可裂解第二引子40。
本文所揭示之前引子46、48之任何實施例可用於此範例性方法中。
在參考個別系列之圖更詳細地描述該等方法中之每一者之前，通常參考圖2A及圖2B描述可裂解及不可裂解引子。在各方法開始時，將單一引子組，例如30或30'（圖2A或圖2B中未示）連接至聚合水凝膠28。在經接枝層32、32'之一或多個區域處，初始引子組30、30'使用本文所揭示之方法改變。更改之結果為兩個引子組50A、52A（圖2A）或50B、52B（圖2B）。
引子組50A、52A或50B、52B（亦即藉由本文所揭示之方法中之一者改變的彼等引子組）相關，因為一組50A、50B包括可裂解第一引子34、34'及不可裂解第二引子36、36'，且另一組52A、52B包括不可裂解第一引子42、42'及可裂解第二引子40、40'。此等引子組50A、52A或50B、52B允許單一模板股在兩個引子組50A、52A或50B、52B上放大及聚集，且亦使得能夠歸因於存在於組50A、52A或50B、52B之相對引子上之裂解基團54（圖2A）或54、54'（圖2B）在聚合水凝膠28（或經接枝層32、32'）之相鄰區域38、38'上產生正向及反向股。應瞭解，引子34'、36'、40'、42'之撇號（'）名稱並非指與引子34、36、40、42互補之序列，而是為引子類型之其他實例。
第一引子組50A、50B中之各者包括可裂解第一引子34或34'及不可裂解第二引子36或36'；且第二引子組52A、52B中之各者包括不可裂解第一引子42或42'及可裂解第二引子40或40'。
不可裂解第二引子36或36'及可裂解第一引子34或34'為寡核苷酸對，例如，在不可裂解第二引子36或36'為正向擴增引子且可裂解第一引子34或34'為反向擴增引子之情況下或在不可裂解第二引子36或36'為正向擴增引子且可裂解第一引子34或34'為反向擴增引子之情況下。在引子組50A、50B之各實施例中，可裂解第一引子34或34'包括裂解位點54，而不可裂解第二引子36或36'不包括裂解位點54。
可裂解第二引子40或40'及不可裂解第一引子42或42'亦為寡核苷酸對，例如其中可裂解第二引子40或40'為正向擴增引子且不可裂解第一引子42或42'為反向擴增引子或其中不可裂解第一引子42或42'為正向擴增引子且可裂解第二引子40或40'為反向擴增引子。在第二引子組52A、52B之各實施例中，可裂解第二引子40或40'包括裂解位點54或54'，而不可裂解第一引子42或42'不包括裂解位點54或54'。
應理解，第一引子組50A、50B之不可裂解第二引子36或36'及第二引子組52A、52B之可裂解第二引子40或40'具有相同核苷酸序列（例如兩者均為正向擴增引子），不同之處在於可裂解第二引子40或40'包括整合至核苷酸序列中或連接至核苷酸序列之連接子56中的裂解位點54或54'。類似地，除了可裂解第一引子34或34'包括整合至核苷酸序列中或連接至核苷酸序列之連接子56中的裂解位點54以外，第一引子組50A、50B之可裂解第一引子34或34及第二引子組52A、52B之不可裂解第一引子42或42'具有相同核苷酸序列（例如兩者均為反向擴增引子）。
應理解，當第一引子34及42或34'及42'為正向擴增引子時，第二引子36及40或36'及40'為反向引子，且反之亦然。
不可裂解引子36、42或36'、42'可為出於捕捉及/或擴增目的具有通用序列之任何引子，諸如P5及P7引子，或PA、PB、PC及PD引子（例如PA及PB或PA及PD等）之任何組合。
P5及P7引子之實例用於由Illumina公司出售之商業流體槽之表面上，例如在HISEQ™、HISEQX™、MISEQ™、MISEQDX™、MINISEQ™、NEXTSEQ™、NEXTSEQDX™、NOVASEQ™、ISEQ TM、GENOME ANALYZER™及其他儀器平台上。不可裂解P5引子為： 不可裂解P5：5 → 3' AATGATACGGCGACCACCGAGACTACAC（SEQ. ID. NO. 1） 不可裂解P7引子可為以下者中之任一者： 不可裂解P7 #1：5 → 3' CAAGCAGAAGACGGCATACGAAT（SEQ. ID. NO. 2） 不可裂解P7 #2：5 → 3' CAAGCAGAAGACGGCATACAGAT（SEQ. ID. NO. 3） 上述其他不可裂解引子（PA-PD）包括： 不可裂解PA 5 → 3' GCTGGCACGTCCGAACGCTTCGTTAATCCGTTGAG（SEQ. ID. NO. 4） cPA（PA'）5 → 3' CTCAACGGATTAACGAAGCGTTCGGACGTGCCAGC（SEQ. ID. NO. 5） 不可裂解PB 5 → 3' CGTCGTCTGCCATGGCGCTTCGGTGGATATGAACT（SEQ. ID. NO. 6） cPB（PB'）5 → 3' AGTTCATATCCACCGAAGCGCCATGGCAGACGACG（SEQ. ID. NO. 7） 不可裂解PC 5 → 3' ACGGCCGCTAATATCAACGCGTCGAATCCGCAACT（SEQ. ID. NO. 8） cPC（PC'）5 → 3' AGTTGCGGATTCGACGCGTTGATATTAGCGGCCGT（SEQ. ID. NO. 9） 不可裂解PD 5 → 3' GCCGCGTTACGTTAGCCGGACTATTCGATGCAGC（SEQ. ID. NO. 10） cPD（PD'）5 → 3' GCTGCATCGAATAGTCCGGCTAACGTAACGCGGC（SEQ. ID. NO. 11）
此等引子為不可裂解引子36、42或36'、42'，因為其不包括裂解位點54、54'。應理解，任何適合通用序列均可用作不可裂解引子36、42或36'、42'。
可裂解引子34、40或34'、40'之實例包括P5及P7引子或其他通用序列引子（例如PA、PB、PC、PD引子），其中相應裂解位點54、54'併入相應核酸序列中（圖2A）或併入使可裂解引子34、40或34'、40'連接至聚合水凝膠28之連接子56中（圖2B）。適合裂解位點54、54'之實例包括酶促可裂解核鹼基或化學可裂解核鹼基、經修飾核鹼基或連接子（例如核鹼基之間），如本文所描述。裂解位點54、54'之一些特定實例包括尿嘧啶、8-側氧基鳥嘌呤、烯丙基-T（具有烯丙基官能基之胸腺嘧啶核苷酸類似物）。裂解位點54、54'可在股中之任何點處併入。
可裂解引子34、40或34'、40'之一些特定實例展示如下，其中裂解位點在「n」處展示： 可裂解P5：5 → 3' AATGATACGGCGACCACCGAGAnCTACAC（SEQ. ID. NO. 12） 其中「n」為尿嘧啶或烯丙基T， 可裂解P7引子可為以下者中之任一者： P7 #1：5 → 3' CAAGCAGAAGACGGCATACGAnAT（SEQ. ID. NO. 13） P7 #2：5 → 3' CAAGCAGAAGACGGCATACnAGAT（SEQ. ID. NO. 14） P7 #3：5 → 3' CAAGCAGAAGACGGCATACnAnAT（SEQ. ID. NO. 15） 其中在該等序列中之每一者中，「n」為8-側氧基鳥嘌呤。
在本文所揭示之實例中之任一者中，起始引子組30、30'亦可包括用於捕獲庫模板接種分子之PX引子。PX模體之密度應相對較低，以便使各凹陷12、12'內之多株性降至最低。PX捕獲引子可為： PX 5 → 3' AGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGG（SEQ. ID. NO. 16） cPX（PX'）5 → 3' CCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCT（SEQ. ID. NO. 17）
圖2A及圖2B描繪附接至聚合水凝膠28之引子集50A、52A、50B、52B之不同組態。更特定言之，圖2A及圖2B描繪可使用之引子34、36或34'、36'及40、42或40'、42'的不同組態。
在圖2A中所示之實施例中，引子組50A及52A之引子34、36及40、42直接連接至聚合水凝膠28，例如無連接子56。聚合水凝膠28具有表面官能基，其可將端基固定在初始引子組30、30之引子之5'端處，且因此使用本文所揭示之方法產生之引子34、36及40、42之末端處。
此外，在圖2A中所展示之實例中，可裂解引子34、40中之各者的裂解位點54、54'併入至引子之序列中。應理解，相同類型之裂解位點54或不同類型之裂解位點54、54'可用於各別引子組50A、52A之可裂解引子34、40中。舉例而言，裂解位點54為尿嘧啶鹼基，且可裂解引子34、40分別為P5U及P7U。應瞭解，可藉由聚合酶併入之任何其他可裂解核苷酸可用作裂解位點54。尿嘧啶鹼基或其他裂解位點亦可併入PA、PB、PC及PD引子中之任一者中，以產生可裂解引子34、40。在此實施例中，寡核苷酸對34、36之不可裂解引子36可為P7，且寡核苷酸對40、42之不可裂解引子42可為P5。因此，在此實施例中，第一引子組50A包括P7、P5U且第二引子組52A包括P5、P7U。引子組50A、52A具有相對線性化化學反應，其在擴增、簇產生及線性化之後允許正向模板股形成於聚合水凝膠28之一個區域38中且反向股形成於聚合水凝膠28之另一區域38'上。
在圖2B中所示之實施例中，引子組50B及52B之引子34'、36'及40'、42'經由連接子56連接至聚合水凝膠28。聚合水凝膠28具有表面官能基，其可將連接子56之端基固定在初始引子組30、30'之引子之5'端處，且因此使用本文所揭示之方法產生之引子34'、36'及40'、42'之末端處。
合適的連接子46之實例可包括核酸連接子（例如，10個核苷酸或更少）或非核酸連接子，諸如聚乙二醇鏈、烷基或碳鏈、具有鄰二醇之脂族連接子、肽連接子等。核酸連接子之實例為聚T間隔子，但亦可使用其他核苷酸。在一個實例中，間隔子為6T至10T間隔子。以下為包括具有末端炔烴基團之非核酸連接子的核苷酸之一些實施例（其中B為核鹼基且「寡核苷酸」為引子序列）：
在圖2B中所示之實施例中，引子34'、42'具有相同序列（例如P5）及相同或不同連接子56。引子42為不可裂解的，而引子34包括併入連接子56中之裂解位點54。亦在此實施例中，引子36'、40'具有相同序列（例如P7）及相同或不同連接子56。引子36'為不可裂解的，且引子40'包括併入連接子56中之裂解位點54或54'。相同類型之裂解位點54或不同類型之裂解位點54、54'可用於可裂解引子34'、40'之連接子56中。引子組50B、52B具有相對線性化化學反應，其在擴增、簇產生及線性化之後允許正向模板股形成於聚合水凝膠28之一個區域38中且反向股形成於聚合水凝膠28之另一區域38'上。
儘管裂解位點54或54、54'展示為圖2B中之連接子56之一部分，但應瞭解引子34'、40'之裂解位點54或54、54'可併入引子序列而非連接子56中。
在圖2A及圖2B中所示之實施例中，引子34、36及40、42或34'、36'及40'、42'與聚合水凝膠28之附接使引子34、36及40、42或34'、36'及40'、42'之模板特異性部分自由退火至其同源模板且3'羥基不含引子延伸。
雖然圖2A或圖2B中未展示，但可裂解第一引子34及不可裂解第二引子36可包括核酸酶抗性修飾。此等範例性引子之實例以元件符號34''及36''展示於圖6A中。核酸酶耐受性修飾（圖6A中之參考數字68）為鍵、核苷酸類似物或對核酸序列之某一其他改變，使得核酸酶抗性引子34''及36''對核酸外切酶及/或核酸內切酶之3'→5'酶活性具有抗性。適合的核酸酶修飾68之實例包括硫代磷酸酯鍵、甲基膦酸酯、肽核酸、啉基、2'-O-甲基及包括胺基磷酸酯C3間隔基之核苷酸。
在可裂解第一核酸酶抗性引子34''之一些實例中，核酸酶抗性修飾68相對於裂解位點54定位5'，該裂解位點相對於3'可光裂解阻斷基團定位5'（圖6A中之參考數字70）。在3'可光裂解阻斷基團70自身不賦予核酸酶抗性之情況下，可裂解第一核酸酶抗性引子34''亦可包括相對於可光裂解阻斷基團70定位3'之第二核酸酶抗性修飾（未示出）。在不可裂解第二核酸酶抗性引子36''之一些實例中，核酸酶抗性修飾68相對於3'端位於5'。在3'可光裂解阻斷基團70自身不賦予核酸酶抗性之情況下，不可裂解第二核酸酶抗性引子36''亦可包括相對於光可裂解阻斷基團70定位3'之第二核酸酶抗性修飾（未示出）。在此等情況中之任一者中，核酸酶抗性修飾68之位置應在核酸酶消化/裂解之後保留足以雜交及延伸之引子序列。如所指出，可將單一核酸酶抗性修飾68或多個核酸酶抗性修飾68併入至相應引子34''、36''中。作為可裂解第一核酸酶抗性引子34''之一個實例，三個或更多個硫代磷酸酯鍵可在相對於裂解位點54之位置5'的位置處開始的一列中併入。此硫代磷酸酯鍵之數目可增加可裂解第一核酸酶抗性引子34''之核酸酶抗性。
可裂解第一核酸酶抗性引子34''及不可裂解第二核酸酶抗性引子36''中之各者包括3'可光裂解阻斷基團70。3'可光裂解阻斷基團70可連接於引子34''、36''之3'端處之核苷酸中之糖分子的3'氧原子。可使用經由暴露於紫外光而可移除的任何阻斷基團。不同3'可光裂解阻斷基團之實例包括（ （其中B為鹼基）及 （其各自可在約300 nm至約365 nm範圍內之波長下裂解）。3'光可裂解阻斷基團70為可移除的，如參考圖6A至圖6I中所展示之方法所描述。
現將描述用於產生引子組50A、52A或50B、52B之方法。
圖3A至圖3G描繪方法之一個實例。此實例係藉由基板10B之實例來描繪，但應理解，可使用基板10A。
如參考圖1B所描述，基板10B係紫外光可穿透基板，且UV光阻擋層16係紫外光吸收材料。在施加聚合水凝膠28之前，圖3A至圖3G中所展示之方法之一些實例涉及將紫外光阻擋層16選擇性地施加至基板10B之第一區域58，該第一區域與（待改變之經接枝層32之）預定區域相對應，由此，基板10B之第二區域60，包括凹陷12中之至少一些的第二部分，其不含UV光阻擋層16。替代地，UV光阻擋層16可使用參考圖1B所描述之方法中之任一者產生。在圖1B及圖3A中所示之實施例中，與該一半相鄰之凹陷12及間隙區域14之約二分之一塗佈有紫外光阻擋層16且與該一半相鄰之凹陷12及間隙區域14之另一半不含UV光阻擋層16。
在此範例性方法中，聚合水凝膠28施加在基板10B及UV光阻擋層16上，且在施加聚合水凝膠28之前或之後，將初始引子組30接枝至聚合水凝膠28。可使用本文所揭示之聚合水凝膠28之任何實施例，且初始引子組30包括可裂解第一引子34或34'及不可裂解第二引子36或36'。引子34、36顯示於圖3A至圖3G中。
在一個實例中，施加聚合水凝膠28，且隨後將初始引子組30接枝至其上。聚合水凝膠28可存在於混合物（例如，用水或乙醇及水）中。混合物可隨後使用旋塗、或浸漬或浸塗、或在正壓或負壓下使材料流動、或另一適合沈積技術塗覆至基板10B及UV光阻擋層16。此等類型之技術將全面沈積聚合水凝膠28。取決於聚合水凝膠28之化學性質，所施加混合物可暴露於固化製程。在一實例中，固化可在室溫（例如約25℃）至約95℃範圍內之溫度下進行約1毫秒至約若干天範圍內之時間。
儘管圖3A至3G中未展示，但在方法之一些實施例中，聚合水凝膠28可在引子34、36接枝之前自間隙區域14移除。
拋光製程可藉由化學漿料（包括例如研磨劑、緩衝劑、螯合劑、界面活性劑及/或分散劑）執行，該化學漿料可自間隙區域14移除聚合水凝膠28而不有害影響區域14處之底層基板10B。替代地，可藉由不包括研磨粒子之溶液執行研磨。
化學漿料可用於化學機械拋光系統中以拋光間隙區域14之表面。拋光頭/墊或其他拋光工具能夠拋光可存在於間隙區域14上方之聚合水凝膠28，同時使聚合水凝膠28至少實質上完整留在凹陷12中。作為實例，拋光頭可為Strasbaugh ViPRR II拋光頭。
可在拋光之後進行清潔及乾燥製程。清潔製程可利用水浴及音波處理。水浴可維持在範圍介於約22℃至約30℃內之相對較低溫度下。乾燥製程可涉及旋轉乾燥或經由另一適合技術來乾燥。
在此實施例中，隨後可將初始引子組30之引子34、36接枝至聚合水凝膠28。作為實例，可藉由流通沈積（例如，使用暫時結合蓋板）、浸塗、噴塗、覆液分配或藉由另一合適方法來實現接枝。此等範例性技術中之各者可利用引子溶液或混合物，其可包括引子34、36、水、緩衝劑及催化劑。在接枝方法中之任一者下，引子34、36連接至聚合水凝膠28之反應性基團。
在另一實例中，將引子34、36接枝至聚合水凝膠28，且隨後施加且預接枝聚合水凝膠。在此等實例中，不進行額外引子接枝。在方法之此等實施例中，預接枝聚合水凝膠28可在進行引子改變之前自間隙區域14移除。
圖3A描繪施加於基板10B之暴露表面及UV光阻擋層16上方之接枝層32。例如，當基板10B已如本文所描述般活化（例如，使用矽烷化或電漿灰化）時，接枝層32可共價鍵結至基板10B。
在圖3A至圖3G之方法中，改變可裂解第一引子34中之一些及不可裂解第二引子36中之一些以引入可裂解第二引子40及不可裂解第一引子42涉及：將負型光阻62沈積於經接枝層32（圖3B）上方；引導紫外光穿過該基板10B（來自側18B），由此負型光阻62之上覆於第二區域60之部分變為上覆於第二區域60處之經接枝層32的不可溶負型光阻62'，及覆蓋第一區域58之負型光阻62之部分（例如62''）保持可溶（圖3B）；移除負型光阻之可溶部分62''，由此暴露接枝層32之預定區域38（圖3C）；使經接枝層32之預定區域38暴露於核酸酶以消化一些可裂解第一引子34及一些不可裂解第二引子36且產生經接枝層32之引子耗乏部分64（圖3D）；及將可裂解第二引子40及不可裂解第一引子42接枝引子耗乏部分64（圖3E）。
如圖3B中所示，負型光阻62沈積於接枝層32上方。可使用本文所闡述之沈積技術中之任一者。適合的負型光阻62之實例包括NR®系列光阻（可購自Futurrex）。其他適合的負型光阻62包括SU-8系列及KMPR®系列（其兩者均可購自Kayaku Advanced Materials公司）或UVN™系列（可購自DuPont）。
負型光阻62隨後經由基板10B暴露於紫外光劑量，其中光自側18B引入。UV光阻擋層16阻擋光到達覆蓋UV光阻擋層16之負型光阻62，且因此此部分保持可溶。因此，可溶負型光阻62''上覆於基板10B之第一部分58。負型光阻62之其餘部分暴露於光且因此變得不可溶。因此，可溶負型光阻62''上覆於基板10B之第二部分60。
圖3C描繪移除可溶性負型光阻62''時。可使用任何適合顯影劑移除可溶負型光阻62''。用於負型光阻之適合顯影劑之實例包括鹼性水溶液，諸如經稀釋之氫氧化鈉、經稀釋之氫氧化鉀或無金屬離子有機氫氧化四甲銨（TMAH）之水溶液。可溶負型光阻62''之移除使經接枝層32之預定區域38暴露，其中引子34、36將變更。
在此範例性方法中，引子34、36改變涉及移除一些可裂解第一引子34及一些不可裂解第二引子36及用具有正交裂解化學之引子40、42替換此等引子34、36。在此範例性方法中，經接枝層32之預定區域38暴露於核酸酶以消化此區域38處之至少一些可裂解第一引子34及至少一些不可裂解第二引子36。核酸酶為酶，諸如核酸外切酶或核酸內切酶。核酸酶具有3'→5'活性。在一實例中，核酸酶係選自由以下者組成之群：核酸酶P1、核酸酶BAL-31、DNA酶I及微球菌核酸內切酶I、核酸外切酶I、核酸外切酶T、核酸外切酶VII、綠豆核酸酶及核酸外切酶V。如圖3C中所示，核酸酶自預定區域38消化引子34、36中之一些或全部。此產生接枝層32之引子耗乏部分64，如圖3D中所示。應理解，經接枝層32之引子耗乏部分64為聚合水凝膠28，因為已移除引子34、36。由不可溶負型光阻62'覆蓋之引子34、36保持完整，因為其不暴露於核酸酶。加熱可用於去活化一些核酸酶。
可進行洗滌製程以自表面移除核酸酶及任何經消化之引子34、36。洗滌製程可涉及具有界面活性劑之水（例如，來自Croda之TWEEN® 20（聚乙二醇脫水山梨糖醇單月桂酸酯））。
隨後將可裂解第二引子40及不可裂解第一引子42接枝至先前接枝層32之引子耗乏部分64（亦即，移除引子34、36之聚合水凝膠28）。此展示於圖3E中。雖然可裂解第二引子40及不可裂解第一引子42展示於圖3E中，但應理解，可使用可裂解第二引子40'及不可裂解第一引子42'。引子40、42可使用本文所闡述之接枝技術中之任一者接枝。引子40、42在引子耗乏部分64處連接至聚合水凝膠28之殘餘官能基（例如疊氮化物）（其與預定區域38相對應）。
因為引子40、42在引子耗乏部分64處連接至聚合水凝膠28之殘餘官能基（例如疊氮基），所以阻斷分子不引入經接枝層32之任何部分。先前已使用阻斷分子使聚合水凝膠28之殘餘官能基失活，因此隨後經接枝引子不連接至聚合水凝膠28。然而，已發現此等阻斷分子在光阻下擴散，其可就位以保護聚合水凝膠28之其他區域，且因此可在可能需要後續引子接枝時不活化殘餘官能基。藉由不利用阻斷分子，此範例性方法避免與此類分子相關之潛在挑戰。另外，用於此範例性方法中的核酸酶為大體積的且較不易於能夠在不可溶負型光阻62下擴散。因此，因為覆蓋基板10B之區域60的聚合水凝膠28之引子34、36及殘餘官能基由不可溶負型光阻62'覆蓋，所以其實質上不受消化及引子40、42接枝影響。
在一些實施例中，使經接枝層32之預定區域38暴露於核酸酶以產生引子耗乏部分64及使可裂解第二引子40及不可裂解第一引子42接枝於引子耗乏部分64均在具有約0.5 M鹽至約5 M鹽之鹽溶液中進行。適合之水性鹽溶液的實例包括約0.5 M氯化鈉至約5 M氯化鈉、約0.5 M硫酸鈉至約2 M硫酸鈉、約0.5 M氯化鉀至約3 M氯化鉀、約0.5 M Na 3C 6H 5O 7檸檬酸鈉至約2 M檸檬酸鈉、約0.5 M碳酸鈉至約2 M碳酸鈉、或約0.5 M磷酸鈉至約2 M磷酸鈉。鹽溶液有助於使聚合水凝膠28去膨脹，且因此進一步降低核酸酶在不可溶負型光阻62'下面擴散之可能性。當使用高鹽條件時，可能需要使用鹽抗性核酸酶，諸如來自ArcticZymes之鹽活性核酸酶（SAN）。
現參看圖3F及圖3G，該方法可進一步包括移除不可溶負型光阻62'，由此暴露第二區域60處之經接枝層32；及自間隙區域14移除可裂解第一引子34、不可裂解第二引子36、可裂解第二引子40及不可裂解第一引子42。
可經由剝離製程移除不可溶負型光阻62'。剝離製程可涉及用於所使用之負型光阻62之類型的適合的移除劑。作為實例，固化不可溶負型光阻62'可藉由諸如二甲亞碸（DMSO）之移除可用音波處理、丙酮洗滌或基於NMP（N-甲基-2-吡咯啶酮）之剝離劑洗滌來剝離。此移除製程使底層接枝層32（亦即接枝有引子34、36之聚合水凝膠28）完整。
在方法之一些實施例中，在自間隙區域14移除可裂解第一引子34、不可裂解第二引子36、可裂解第二引子40及不可裂解第一引子42之前（如參考圖3G所描述），該方法進一步包含移除紫外光阻擋層16，其中至少50%之可裂解第二引子40及不可裂解第一引子42保持完整。移除紫外光阻擋層16可涉及移除紫外光阻擋層16且增加殘餘聚合水凝膠28與底層基板10B之間的黏著力之製程。
紫外光阻擋層16可藉由濕式蝕刻製程移除，該濕式蝕刻製程視紫外光阻擋層16之材料而定。在一實例中，可藉由在不存在包括攪拌或音波處理之機械應力的情況下暴露於1-2% KOH溶液或碳酸鈉緩衝液（pH約10）約3分鐘至5分鐘來蝕刻紫外光阻擋層16（例如，具有約30 nm厚度之鋁）。蝕刻製程可藉由稀釋蝕刻劑且增加製程之持續時間而減緩，此可改進聚合水凝膠28之保持性。移除紫外光阻擋層16不會移除聚合水凝膠28（或與其連接之引子40、42），而是在區域58處暴露基板10B之表面。底層基板10B亦可對濕式蝕刻製程呈惰性。
移除紫外光阻擋層16在基板10B之表面與區域58處之聚合水凝膠28之間產生間隙。可執行多種方法以增加聚合水凝膠28與區域58處之基板表面之間的黏著力。
以下為可用於增大聚合水凝膠28與區域58處之基板表面之間的黏著力之方法的實例。
在一個實例中，提高聚合水凝膠28與區域58處之基板表面之間的黏著力涉及加熱聚合水凝膠28及區域58處之基板表面。加熱可加速聚合水凝膠28與區域58處之基板表面之間的共價鍵結。在一實例中，加熱可在約55℃至約65℃範圍內之溫度下進行，持續在約25分鐘至約35分鐘範圍內之時間。在另一實例中，加熱可在約60℃之溫度下執行約30分鐘之時間。
在另一實例中，增加聚合水凝膠28與區域58處之基板表面之間的黏著力涉及將保護塗層（未示出）塗覆於聚合水凝膠28上方（其中附接有引子40、42及34、36）；加熱區域58處之聚合水凝膠28及基板表面；及移除保護塗層。保護性塗層可使用水溶液產生，該水溶液包括至多約15%（質量/體積）之選自由以下者組成之群的水溶性材料：聚乙烯醇/聚乙二醇接枝共聚物（其一個實例包括可購自BASF公司之KOLLICOAT® IR）、蔗糖、聚丙烯醯胺、聚葡萄糖（例如，200,000 Da之分子量）、聚丙烯醯胺（例如，40,000 Da、200,000 Da等之分子量）、聚乙二醇、乙二胺四乙酸鈉鹽（亦即，EDTA）、具有乙二胺四乙酸之參(羥基甲基)胺基甲烷、(參(2-羧基乙基)膦)、參(3-羥丙基三唑基甲基)胺、岩基啡啉二磺酸二鈉鹽、羥基官能聚合物、丙三醇或鹽水檸檬酸鈉。可使用任何適合之沈積技術來施加水溶液。在施加水溶液之後，可加熱水溶液以蒸發水且形成保護性塗層。針對增加聚合水凝膠28與區域58處之基板表面之間的黏著力所描述之加熱製程可在保護塗層就地之情況下執行。可隨後藉由在所需時間暴露於水移除保護塗層。
在另一實例中，增加聚合水凝膠28與區域58處之基板表面之間的黏著涉及選擇性地矽烷化區域58處之基板表面。為了選擇性矽烷化，可使用包括可附接至聚合水凝膠28之官能基的官能基及可附接至基板表面之官能基的矽烷。適合矽烷之實例包括炔基矽烷及降冰片烯矽烷。胺基矽烷或炔基矽烷可附接至聚合水凝膠28之疊氮基官能基。降冰片烯矽烷可分別附接至官能化層之疊氮官能基或四。炔基矽烷可包括環炔不飽和部分，諸如O-炔丙基)-N-(三乙氧基矽烷基丙基)胺基甲酸酯、環辛炔、環辛炔衍生物或雙環壬炔（例如雙環[6.1.0]壬-4-炔或其衍生物、雙環[6.1.0]壬-2-炔或雙環[6.1.0]壬-3-炔)。降冰片烯矽烷可為降冰片烯衍生物，例如包括氧或氮而非碳原子中之一者的（雜）降冰片烯。降冰片烯矽烷之一個實例包括[(5-雙環[2.2.1]庚-2-烯基)乙基]三甲氧基矽烷。
將矽烷引入至聚合水凝膠28可溶解（例如吸收）之水性或其他基於溶劑之溶液中，且在矽烷與各別官能基之間進行適當反應。可使用任何適合之技術，例如旋塗或本文所揭示之其他沈積方法塗覆基於水性或溶劑之矽烷溶液。或者，氣相沈積（例如YES方法）可用於純矽烷（亦即不在溶液中）。
如圖3G中所示，可裂解第一引子34、不可裂解第二引子36、可裂解第二引子40及不可裂解第一引子42可隨後自間隙區域14移除。可使用如本文所描述之拋光製程自間隙區域14移除引子34、36、40、42及底層聚合水凝膠28。應理解，若其尚未在聚合水凝膠28施加之後且在引子34、36接枝之前或緊接在施加預接枝聚合水凝膠28之後進行，則可在該方法中此時進行拋光製程。
所得結構展示於圖3G中，其包括在凹陷12之空間分離區域處具有兩個不同引子組50A、52A之聚合水凝膠28。
在一些實例中，紫外光阻擋層16亦對待用於定序操作中之可見光為可穿透的。在此等實例中，如本文參考圖3F所描述，可不移除紫外光阻擋層16。在此等實例中，可能需要UV光阻擋層16共形地塗佈至基板10B之區域58，以使得其不填充如圖3A中所示之凹陷12之部分，而是與凹陷12之部分處的表面對準，如圖1B中所示。因此，當進行拋光時，自間隙區域14移除引子40、42及聚合水凝膠28，但保持在凹陷12之部分中的紫外光阻擋層16上方。或者，可能需要在紫外光阻擋層16留存於凹陷12中時使用基板10A。
在另外其他實例中，圖3A至圖3G中所展示之方法之經修改版本可運用圖1C中所展示之基板10C執行。在此實例中（如參考圖1C所描述），基板10C係紫外光可穿透基板，其包括嵌入於基板10C之與預定區域38對應之第一區域58中的紫外光阻擋及可見光可穿透層（UV光阻擋層16'之一個實例），藉以基板10C之第二區域60，包括凹陷12中之至少一些的第二部分，其不含嵌入式紫外光阻擋及可見光可穿透層16'。UV光阻擋層16'可完全嵌入於基板材料中，或可具有施加於UV光阻擋層16'上方之額外材料層。
在此範例性方法中，改變可裂解第一引子34中之一些及不可裂解第二引子36中之一些以引入可裂解第二引子40及不可裂解第一引子42涉及將負型光阻62沈積於經接枝層32上（如參考圖3B所描述）；引導紫外光穿過該基板10C（自側18C），由此覆蓋第二區域60之負型光阻62之一部分變為上覆於第二區域60處之接枝層32的不可溶負型光阻62，且上覆於第一區域58之負型光阻62之另一部分（例如62''）保持可溶（如參考圖3B所描述）；移除負型光阻之可溶部分62''，由此暴露經接枝層32之預定區域38（如參考圖3C所描述）；使經接枝層32之預定區域38暴露於核酸酶以消化可裂解第一引子34中之一些及不可裂解第二引子36中之一些且產生接枝層32之引子耗乏部分64（如參考圖3D所描述）；及使可裂解第二引子40及不可裂解第一引子42接枝於引子耗乏部分64（如參考圖3E所描述）。
當使用包括UV光阻擋及可見光可穿透層16'之基板10C時，圖3A至圖3G中所展示之方法的經修改版本並不包括層16'之移除。實際上，層16'保持在安置於基板10C與連接至引子40、42之聚合水凝膠28之改變部分之間的流體槽中。
圖3A至圖3G中所展示之方法之修改版本進一步包括移除不可溶負型光阻62'，由此暴露第二區域60處之經接枝層32（如參考圖3F所描述）；及自間隙區域14移除可裂解第一引子34、不可裂解第二引子36、可裂解第二引子40及不可裂解第一引子42（連同聚合水凝膠28）。
圖4A至圖4H描繪方法之另一實例。此實例利用基板10D。因而，如參看圖1D所描述，基板10D對可見光為可穿透的；各凹陷為包括鄰接於較淺部分26之較深部分24的多深度凹陷12'；各多深度凹陷12'之較深部分24上覆於基板10D之紫外光可穿透部分60'（具有厚度t 1）；且各多深度凹陷12'之間隙區域14及較淺部分26上覆於基板10D之紫外光阻擋部分58'（具有厚度t 3及t 2）。包括單一多深度凹陷12'之基板10D之一部分展示於圖4A中。
如圖4B中所示，聚合水凝膠28施加在基板10D上，且在施加聚合水凝膠28之前或之後，將初始引子組30接枝至聚合水凝膠28。可使用本文所揭示之聚合水凝膠28之任何實施例，且初始引子組30包括可裂解第一引子34或34'及不可裂解第二引子36或36'。引子34、36顯示於圖4B至圖4H中。
在一個實例中，施加聚合水凝膠28，且隨後將初始引子組30接枝至其上。此等製程可如參看圖3A所描述而執行。在另一實例中，將引子34、36接枝至聚合水凝膠28，且隨後將預接枝聚合水凝膠施加至基板10D且固化。
在此範例性方法中，改變可裂解第一引子34中之一些及不可裂解第二引子36中之一些以引入可裂解第二引子40及不可裂解第一引子42涉及：將負型光阻62沈積於經接枝層32上方（圖4C）；引導紫外光穿過該基板10D（自側18D），從而在較深部分24中之負型光阻62之部分變成上覆於較深部分24處之經接枝層32的不可溶負型光阻62'，及負型光阻62之上覆於間隙區域14及較淺部分26中之部分（例如62''）保持可溶（圖4C及圖4D）；移除負型光阻之可溶部分62''，由此暴露經接枝層32之預定區域38（圖4D）；使該經接枝層32之該預定區域38暴露於核酸酶以消化該等可裂解第一引子34中之該一些及該等不可裂解第二引子36中之該一些，且產生（先前）經接枝層32之引子耗乏部分64（圖4E）；及將該等可裂解第二引子40及該等不可裂解第一引子42接枝於該引子耗乏部分64（圖4F）。
圖4C中所展示的負型光阻62可為本文中所闡述的實例中的任一者，且可使用本文中所揭示的技術中的任一者加以應用。如圖4D中所展示，紫外光可經由側18D引入且被引導穿過基板10D。具有厚度t 2及厚度t 3的基板10D的部分58'吸收光，且因此阻擋光到達較淺部分26及間隙區域14中的負型光阻62。因此，可溶負型光阻62''覆蓋較淺部分26及間隙區域14。負型光阻62之剩餘部分（亦即，上覆於具有厚度t 1之基板10D之部分60'）暴露於光且因此變得不可溶。因此，不可溶負型光阻62'存在於較深部分24中且上覆於基板10D之部分60'。
隨後如圖4D所示使用本文中所闡述之顯影劑中之任一者移除可溶負型光阻62''。可溶負型光阻62''之移除使經接枝層32之預定區域38暴露，其中引子34、36將變更。
在此範例性方法中，引子34、36改變涉及移除一些可裂解第一引子34及一些不可裂解第二引子36及用具有正交裂解化學之引子40、42替換此等引子34、36。引子34、36移除可如參考圖3D所描述進行，其中核酸酶用於消化一些可裂解第一引子34及一些不可裂解第二引子36。由此產生經接枝層32之引子耗乏部分64。應理解，經接枝層32之引子耗乏部分64為聚合水凝膠28，因為已移除引子34、36。在此實施例中，引子耗乏部分64處於較淺部分26中及在間隙區域14上方，如圖4E中所示。此外，在此實例中，由不可溶負型光阻62'覆蓋之引子34、36在其不暴露於核酸酶時保持完整。
隨後使可裂解第二引子40及不可裂解第一引子42接枝於引子耗乏部分64，如圖4F中所示。引子40、42接枝可如參考圖3E所定義進行。
在此範例性方法中，使經接枝層32之預定區域38暴露於核酸酶以產生引子耗乏部分64及使可裂解第二引子40及不可裂解第一引子42接枝於引子耗乏部分64可在本文所描述之具有約0.5 M鹽至約5 M鹽之鹽溶液中之任一者中進行。可能需要使用具有高鹽條件之鹽耐受性核酸酶。
圖4A至圖4H中所示之方法亦包括移除不可溶負型光阻62'，由此暴露較深部分24處之經接枝層32（圖4G）；及自間隙區域14移除可裂解第二引子40及不可裂解第一引子42（圖4H）。可使用任何適合之移除劑經由剝離製程移除不可溶負型光阻62'，例如如參考圖3F所描述。可使用例如如參考圖3G所描述之拋光製程自間隙區域14移除引子40、42及底層聚合水凝膠28。
所得結構展示於圖4H中，其包括在多深度凹陷12'之空間分離區域處具有兩種不同引子組50A、52A之聚合水凝膠28。
圖5A至圖5H描繪方法之又一實例。此實例利用基板10D且類似於圖4A至圖4H中所描述之方法，不同之處在於使用正型光阻66替代負型光阻62。
圖5A中所展示之基板10D與圖4A中所展示及描述之基板相同。
如圖5B中所示，聚合水凝膠28施加在基板10D上，且在施加聚合水凝膠28之前或之後，將初始引子組30接枝至聚合水凝膠28。可使用本文所揭示之聚合水凝膠28之任何實施例，且初始引子組30包括可裂解第一引子34或34'及不可裂解第二引子36或36'。引子34、36顯示於圖5B至圖5H中。
在一個實例中，施加聚合水凝膠28，且隨後將初始引子組30接枝至其上。此等製程可如參看圖3A所描述而執行。在另一實例中，將引子34、36接枝至聚合水凝膠28，且隨後將預接枝聚合水凝膠施加至基板10D且固化。
在此範例性方法中，改變該等可裂解第一引子34中之該一些及該等不可裂解第二引子36中之該一些以引入該等可裂解第二引子40及該等不可裂解第一引子42涉及：將正型光阻66沈積於經接枝層32上方（圖5C）；引導紫外光穿過該基板10D（自側18D），從而正型光阻66之上覆於間隙區域14及較淺部分26中之部分變為上覆於間隙區域14及較淺部分26處之經接枝層32的不可溶正型光阻66'，且該等較深部分24中之正型光阻66之部分（例如，66''）變得可溶（圖5C及圖5D）；移除正型光阻之可溶部分66''，由此暴露經接枝層32之預定區域38（圖5D）；使該經接枝層32之該預定區域38暴露於核酸酶以消化該等可裂解第一引子34中之該一些及該等不可裂解第二引子36中之該一些，且產生該經接枝層32之引子耗乏部分64（圖5E）；及將該等可裂解第二引子40及該等不可裂解第一引子42接枝於該引子耗乏部分64（圖5F）。
所施加之正型光阻66展示於圖5C中。合適的正型光阻之實例包括MICROPOSIT® S1800系列或AZ® 1500系列，兩者均可獲自Kayaku Advanced Materials公司。合適的正型光阻之另一實例為SPR™-220（來自DuPont）。正型光阻66可使用本文中所揭示的技術中的任一者來應用。
如圖5D中所展示，紫外光可經由側18D引入且被引導穿過基板10D。具有厚度t 2及厚度t 3的基板10D的部分58'吸收光，且因此阻擋光到達較淺部分26及間隙區域14中的正型光阻66。此等部分變得不可溶，且因此不可溶正型光阻66'上覆於較淺部分26及間隙區域14。正型光阻66的其餘部分（亦即，上覆於具有厚度t 1的基板10D的部分60）曝光於光，且因此變得可溶。因此，可溶正型光阻66''存在於較深部分24中且上覆於基板10D之部分60'。
隨後使用用於正型光阻66之合適顯影劑移除可溶正型光阻66''，如圖5D處所展示。用於正型光阻66之適合顯影劑之實例包括鹼性水溶液，諸如經稀釋之氫氧化鈉、經稀釋之氫氧化鉀或無金屬離子有機氫氧化四甲銨（TMAH）之水溶液。可溶正型光阻66''之移除使經接枝層32之預定區域38暴露，其中引子34、36將變更。
在此範例性方法中，引子34、36改變涉及移除一些可裂解第一引子34及一些不可裂解第二引子36及用具有正交裂解化學之引子40、42替換此等引子34、36。引子34、36移除可如參考圖3D所描述進行，其中核酸酶用於消化一些可裂解第一引子34及一些不可裂解第二引子36。由此產生經接枝層32之引子耗乏部分64。應理解，經接枝層32之引子耗乏部分64為聚合水凝膠28，因為已移除引子34、36。在此實施例中，引子耗乏部分64處於較深部分24中，如圖5E中所示。此外，在此實例中，由不可溶正型光阻66''覆蓋之引子34、36在其不暴露於核酸酶時保持完整。
可裂解第二引子40及不可裂解第一引子42隨後接枝至引子耗乏部分64，如圖5F中所示。引子40、42接枝可如參考圖3E所定義進行。
在此範例性方法中，使經接枝層32之預定區域38暴露於核酸酶以產生引子耗乏部分64及使可裂解第二引子40及不可裂解第一引子42接枝於引子耗乏部分64可在本文所描述之具有約0.5 M鹽至約5 M鹽之鹽溶液中之任一者中進行。
圖5A至圖5H中所示之方法亦包括移除不可溶正型光阻66'，由此暴露間隙區域14及較淺部分26處之經接枝層32（圖5G）；及自間隙區域14移除可裂解第一引子34及不可裂解第二引子36（圖5H）。可經由剝離製程使用用於不可溶正型光阻66'之任何適合的移除劑移除不可溶正型光阻66'。適合之移除劑的實例包括具有音波處理之二甲亞碸（DMSO）、丙酮洗滌、丙二醇單甲醚乙酸酯洗滌或基於NMP（N-甲基-2-吡咯啶酮）之汽提器洗滌。可使用例如如參考圖3G所描述之拋光製程自間隙區域14移除引子34、36及底層聚合水凝膠28。
所得結構展示於圖5H中，其包括在多深度凹陷12'之空間分離區域處具有兩種不同引子組50A、52A之聚合水凝膠28。
由圖3系列到圖5系列中所展示之方法得出的圖案化結構（例如，圖3G、圖4H及圖5H中所展示之圖案化結構之一部分）可接合至另一圖案化結構或蓋以形成流體槽之實例。基板10A、10B、10C、10D可在其周邊及/或通道（其中之每一者包括複數個凹陷12、12'）之間具有可用以附接兩種圖案化結構或圖案化結構及蓋的結合區域。接合過程及流體槽之細節在下文在標題為「流體槽」之部分中進一步詳細描述。
圖6系列及圖7系列中所示之方法使用與圖3系列至圖5系列中所示之方法不同的初始引子組30'及30''。圖6系列及圖7系列中所示之方法可在兩個圖案化結構（例如各凹陷12中具有聚合水凝膠28及引子組30'或30''之基板）已接合在一起之後或在一個圖案化結構已接合至蓋之後進行。因此，流通方法可用於進行圖6系列及圖7系列中所示之引子改變。此部分歸因於以下事實：材料不需要在引子改變之後自間隙區域14移除且因為光阻不用於此等方法中。具有兩個接合之圖案化結構74、74'且在改變初始引子組30'、30''之前的流體槽72之實施例大體上展示於圖8中。在圖6系列及圖7系列的整個描述中將參考圖8；然而，如上文所提及，接合製程及流體槽72之細節在下文名為「流體槽」之段落中進一步詳細地描述。
圖6A至圖6I中所示之方法利用引子組30。如本文所描述，引子組30'中之可裂解第一引子34''中之各者包括3'可光裂解阻斷基團70及位於裂解位點54之5'處且與裂解位點相距預定距離之核酸酶抗性修飾68，及不可裂解第二引子36''中之每一者包括3'可光裂解阻斷基團70及無裂解位點54之核酸酶抗性修飾68。此等引子34''、36''展示於圖6A中。在圖6A中，各凹陷12包括位於第一區域58'處之紫外光阻擋層16'（或若使用基板10A或10B，則為16），且各凹陷12之第二區域60''對紫外光為可穿透的，其中第二區域60''與預定區域38相對應（其中將進行至少一些引子改變）。
儘管圖6A至圖6I中未展示，但此方法實例涉及產生圖案化結構74、74'（圖8），將圖案化結構74、74'接合在一起或將一個圖案化結構74及蓋（未圖示）接合在一起，且隨後在流體槽72中執行引子34''、36''改變。
為了產生各圖案化結構74、74'，凹陷12定義於基板10A、10B或10C中，且將UV光阻擋層16或16'併入（例如塗覆、嵌入等）至基板10A、10B、10C之第一區域58、58'中，如參考圖1A、圖1B或圖1C所描述。隨後，塗覆經接枝層32'。在此範例性方法中，塗覆經接枝層32'涉及將經接枝層32'引入凹陷12及間隙區域14；及自間隙區域14移除經接枝層32'。本文所揭示之聚合水凝膠28之任何實例使用任何適合之沈積技術應用於基板10A、10B或10C上，且在應用聚合水凝膠28之前或之後，使用任何適合之接枝技術將初始引子組30'接枝至聚合水凝膠28。經接枝層32'可隨後使用本文所揭示之拋光製程自間隙區域14移除。所得經圖案化結構74、74'包括各凹陷12內之經接枝層32'及不含經接枝層32'之間隙區域14。圖案化結構74之一個凹陷12展示於圖6A中。
在圖6A至圖6I中所展示之實施例中，改變一些可裂解第一引子34''及一些不可裂解第二引子36''以引入可裂解第二引子40''及不可裂解第一引子42''涉及相繼地改變一些可裂解第一引子34''以引入不可裂解第一引子42''及改變一些不可裂解第二引子36''以引入可裂解第二引子40。
可裂解第一核酸酶抗性引子34''之改變展示於圖6B至圖6E中，且不可裂解第二核酸酶抗性引子36''之改變展示於圖6F至圖6H中。
改變一些可裂解第一核酸酶抗性引子34''（圖6B）以引入不可裂解第一引子42''（圖6E）涉及：引導紫外光穿過該基板10C（自側18C），從而自可裂解第一引子34''及上覆於第二區域60''之不可裂解第二引子36''移除3'可光裂解阻斷基團70，從而上覆於第一區域58'之可裂解第一引子34''及不可裂解第二引子36''保持阻斷（圖6B）；使該經接枝層32'暴露於核酸外切酶，從而消化上覆於該第二區域60''之該等可裂解第一引子34''及該等不可裂解第二引子36''的部分，其中該等經消化部分包括對應3'端至該核酸酶抗性修飾68（圖6C）；使第一引子再生模板76分別與上覆於第二區域60''的可裂解第一核酸酶抗性引子34''之剩餘部分78'及上覆於第一區域58'的可裂解第一核酸酶抗性引子34''雜交（圖6D）；使用包括胸腺嘧啶鹼基之核苷酸混合物，在可裂解第一核酸酶抗性引子34''之剩餘部分78'處沿第一引子再生模板76起始聚合酶延伸以產生不可裂解第一核酸酶抗性引子42''（圖6E）；及使第一引子再生模板76去雜交。
圖6B描繪經由基板10C之側18C引入紫外光。UV光之波長足以自可裂解第一引子34''及暴露於光之不可裂解第二引子36''移除3'可光裂解阻斷基團70。在此實例中，UV光在第二區域60''處透射穿過基板10C。因此，第二區域60''處之可裂解第一引子34''及不可裂解第二引子36''暴露於UV光，此觸發3'可光裂解阻斷基團70之移除。未阻斷引子分別以元件符號78及80顯示。相比之下，UV光阻斷層16'阻斷光到達第一區域58'處之可裂解第一引子34''及不可裂解第二引子36''，且因此此等引子34''、36''保持3'阻斷。應理解，UV光亦可透射穿過間隙區域14處之基板10C，因為不存在UV光阻擋層16'。
在引子34''、36''在第二區域60''中為3'未阻斷之後，經接枝層32'暴露於核酸外切酶。如所描述，在此實例中，核酸酶為核酸外切酶；其實例包括核酸外切酶I、不耐熱性核酸外切酶I、核酸外切酶T、核酸外切酶VII、綠豆核酸酶及核酸外切酶V。由於核酸酶具有3'→5'活性，因此其能夠消化上覆於第二區域60之未阻斷可裂解第一核酸酶抗性引子78之一部分及未阻斷不可裂解第二核酸酶抗性引子80的一部分。經消化部分自未阻斷引子78、80之對應的3'端延伸至核酸酶抗性修飾68。核酸酶抗性修飾68對核酸酶消化/裂解不敏感。因此，相對於核酸酶抗性修飾68定位5'之未阻斷可裂解第一引子78及未阻斷不可裂解第二引子80的彼等部分受保護免於核酸酶消化/裂解。引子中在消化之後剩餘之部分展示於圖6C中之元件符號78及80處。上覆於第一區域58之引子34''、36''之3'可光裂解阻斷基團70阻斷核酸外切酶之3'→5'活性，且因此此等引子34''、36''保持完整，如圖6C中所示。
可將洗滌溶液引入至流體槽72中以移除核酸外切酶及經消化部分。
隨後將第一引子再生模板76引入至流體槽72中。各第一引子再生模板76為可裂解第一核酸酶抗性引子34''之序列的補充序列。因此，各第一引子再生模板76包括與剩餘引子78'互補之第一部分82及與經消化之部分互補之第二部分84。在使得第一引子再生模板76能夠與剩餘引子78'及在第一區域58'處保持完整的可裂解第一核酸酶抗性引子34''雜交的條件下引入第一引子再生模板76。雜交引子再生模板76展示於圖6D中。
隨後將含有不可裂解核苷酸及聚合酶之核苷酸混合物引入至流體槽72中。不可裂解核苷酸包括以下鹼基：腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤及胸腺嘧啶。可使用可接受不可裂解核苷酸且可在引子78'之3'端處成功地併入不可裂解核苷酸鹼基的任何聚合酶。範例性聚合酶包括：來自A族之彼等聚合酶，諸如Bsu聚合酶、Bst聚合酶、Taq聚合酶、T7聚合酶及許多其他者；來自B族及B2之聚合酶，諸如Phi29聚合酶及其他高度進行型聚合酶（族B2）、Pfu聚合酶（族B）、KOD聚合酶（族B）、9oN（族B）及許多其他者；來自C族之聚合酶，諸如大腸桿菌DNA PolIII族及許多其他者；來自D族之聚合酶，諸如強烈火球菌DNA Pol II，及許多其他者；來自X族之聚合酶，諸如DNA Polμ、DNA Polβ、DNA Polσ及許多其他者。核苷酸混合物亦可包括液體載劑，諸如水及/或離子鹽緩衝液流體，例如毫莫耳濃度至莫耳濃度之檸檬酸鹽水、氯化鈉、氯化鉀、磷酸鹽緩衝鹽水等，及/或其他緩衝液，諸如參(羥甲基)胺基甲烷（tris(hydroxymethyl)aminomethane，TRIS）或(4-(2-羥乙基)-1-哌乙磺酸)（(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid），HEPES）。液體載劑亦可包括意欲用於擴展反應之催化金屬，諸如Mg 2+、Mn 2+等。可使用單一催化金屬或催化金屬之組合，且總量可在約0.01 mM至約100 mM範圍內。
流體槽72之溫度可經調節以起始模板擴展反應。聚合酶能夠使用第一引子再生模板76之第二部分84作為模板延伸引子78'之3'端。因為i）延伸反應藉由第一引子再生模板76之第二部分84導引，ii）第二部分84與經消化之未阻斷可裂解第一核酸酶抗性引子78之部分互補，且iii）使用不可裂解核苷酸，沿第二部分84之聚合酶延伸產生無裂解位點54之第一核酸酶抗性引子。因此，聚合酶延伸產生不可裂解第一核酸酶抗性引子42''，其包括核酸酶抗性修飾68但不包括裂解位點54。
雖然第一引子再生模板76中之一些可雜合至第一區域58'處之完整可裂解第一核酸酶抗性引子34''，但聚合酶延伸不出現在此等引子34''處。
一旦產生不可裂解第一核酸酶抗性引子42''（圖6E），第一引子再生模板76就去雜交（亦即，變性）且自流體槽72移除（例如，使用洗滌溶液）。
第二區域60''處之不可裂解第二核酸酶抗性引子36''隨後經改變以引入可裂解第二核酸酶抗性引子42。更特定言之，在第二區域60''中未阻斷及消化不可裂解第二核酸酶抗性引子36''之後殘留的引子80'隨後經改變以引入可裂解第二核酸酶抗性引子42''。此改變涉及：分別使第二引子再生模板86與上覆於第二區域60''的不可裂解第二核酸酶抗性引子（亦即引子80'）之剩餘部分及上覆於第一區域58'的不可裂解第二核酸酶抗性引子36''雜交（圖6F）；使用包括可裂解鹼基之核苷酸混合物，在不可裂解第二核酸酶抗性引子（亦即，引子80'）之剩餘部分處沿第二引子再生模板86啟動聚合酶延伸以產生可裂解第二核酸酶抗性引子40''（圖6G）；及使第二引子再生模板86去雜交（圖6H）。
各第二引子再生模板86為不可裂解第二核酸酶抗性引子36''之序列的補充序列。因此，各第二引子再生模板86包括與剩餘引子80'互補之第一部分88及與經消化之部分互補之第二部分90。在使得第二引子再生模板86能夠在第二區域60''處與剩餘引子80'雜交且與在第一區域58'處保持完整的不可裂解第二核酸酶抗性引子36''雜交的條件下引入第二引子再生模板86。雜交之引子再生模板86展示於圖6F中。
含有可裂解核苷酸、其他不可裂解核苷酸及聚合酶之另一核苷酸混合物隨後引入至流體槽72中。可裂解核苷酸包括尿嘧啶鹼基或8-側氧基鳥嘌呤或可藉由聚合酶併入之任何其他可裂解核苷酸。此混合物中之其他不可裂解核苷酸包括以下鹼基：腺嘌呤、胞嘧啶及鳥嘌呤。可使用可接受此等核苷酸且可在引子80'之3'端處成功地併入此等核苷酸鹼基的任何聚合酶。核苷酸混合物之此實例亦可包括本文所闡述之液體載劑之任何實例。
流體槽72之溫度可經調節以起始模板擴展反應。聚合酶能夠使用第二引子再生模板86之第二部分90作為模板延伸剩餘引子80'之3'端。因為i）延伸反應藉由第二引子再生模板86之第二部分90引導，ii）第二部分90與經消化之未阻斷可裂解第二核酸酶抗性引子80之部分互補，及iii）使用可裂解核苷酸，沿第二部分90之聚合酶延伸產生具有裂解位點54之第二核酸酶抗性引子。因此，此聚合酶延伸產生可裂解第二核酸酶抗性引子40''，其包括裂解位點54及核酸酶抗性修飾68。可裂解第二核酸酶抗性引子40''展示於圖6G中。
雖然第二引子再生模板86中之一些可雜合至第一區域58'處之完整第二不可裂解核酸酶抗性引子36''，但聚合酶延伸不出現在此等引子36''處。
一旦產生可裂解第二核酸酶抗性引子40''（圖6G），便使第二引子再生模板86去雜交（亦即，變性）且自流體槽72移除，如圖6H中所示。
在進行參考圖6A至圖6G中所描述之引子改變之後，第一區域58'包括可裂解第一核酸酶抗性引子34''及不可裂解第二核酸酶抗性引子36''，且第二區域60''包括不可裂解第一核酸酶抗性引子42''及可裂解第二核酸酶抗性引子40''。
如圖6H中所示，可裂解第一核酸酶抗性引子34''及不可裂解第二核酸酶抗性引子36''仍包括3'可光裂解阻斷基團70。此等基團70可藉由暴露於紫外光來移除（參見圖6I）。因此，方法之一些實例涉及將紫外光導引於基板10C之表面（圖案化結構74或74'之部分）處，從而自上覆於第一區域58'之可裂解第一引子34''及不可裂解第二引子36''移除3'可光裂解阻斷基團70。UV曝光移除其餘3'可光裂解阻斷基團70，如圖6I中所描繪。
當流體槽72包括UV可穿透蓋時，UV光可朝向基板10C之表面處的可裂解第一核酸酶抗性引子34''及不可裂解第二核酸酶抗性引子36''導引通過蓋板。
替代地，流體槽72可包括兩個圖案化結構74、74'（如圖8中所展示）。在一個實例中，可藉由將紫外光引導通過側18C、18C 2兩者來執行最終未阻斷製程，因為在區域60''處透射穿過基板10C之UV光可到達相對圖案化結構74'之引子組30' 2，且在區域60'' 2處透射穿過第二基板10C 2之UV光可到達相對圖案化結構74之引子組30'。在另一實例中，可在將紫外光導引通過一側18C或18C 2之前移除UV光吸收層16'、16' 2（或層16，若使用基板10A或10B）。UV光吸收層16'、16' 2可如參考圖3系列所描述移除，其中濕式蝕刻以流通方式執行且之後為本文所描述之黏著促進製程中之一者。蝕刻劑可經由輸入埠94（圖8）引入，且隨後移除之UV光阻擋層16'、16' 2可經由輸出埠96自流體槽72移除（圖8）。在移除UV光阻擋層16'、16' 2之後，可將紫外光導引穿過一側18C或18C 2，其中紫外光透射穿過基板10C或10C 2以在兩個表面處暴露引子34''、36''。
移除3'可光裂解阻斷基團70產生未阻斷可裂解第一核酸酶抗性引子78及未阻斷不可裂解第二核酸酶抗性引子80。未阻斷可裂解第一核酸酶抗性引子78類似於參考圖2A所描述之可裂解第一引子34，不同之處在於其亦包括核酸酶抗性修飾68。類似地，未阻斷不可裂解第二核酸酶抗性引子80類似於參考圖2A所描述之不可裂解第二引子36，其例外之處在於其亦包括核酸酶抗性修飾68。因此，最終流體槽在不同區域58''、60''處包括兩個不同引子組50C、52C。
當參考圖6A至圖6I所展示及描述之方法用如圖8中所展示之兩個經接合圖案化結構74、74'執行時，可在執行圖6B中所描述之未阻擋時涉及額外製程。
如圖8中所示，圖案化結構74（且因此其基板10C）為包括與圖案化結構74相對之第二圖案化結構74'（且因此與基板10C相對之第二基板10C 2）的流體槽72之部分。如圖8中所示，第二基板10C 2包括由第二間隙區域14 2分隔開之第二凹陷12 2，其中各第二凹陷12 2包括第二紫外光阻擋層16' 2，及應用於第二基板10C 2之表面之第二接枝層32' 2或32'' 2，第二接枝層32' 2或32'' 2包括第二聚合水凝膠28 2及附接於其上之第二引子組30' 2或30'' 2。在涉及圖6A至圖6H之方法的實施例中，第二引子組30' 2包括可裂解第一核酸酶抗性引子34''及不可裂解第二核酸酶抗性引子36''。
當圖8之流體槽72用於圖6A至圖6I之方法中時，在將紫外光引導穿過基板10C、10C 2（用於如參考圖6B所描述之未阻斷）之前，該方法進一步包含將紫外光吸收材料引入流體槽72中；且在導引紫外光穿過基板10C、10C 2之後（用於如參考圖6B所描述之未阻斷），該方法進一步包含自流體槽72移除紫外光吸收材料。紫外光吸收材料之實例為碳黑之膠態分散液、其他UV吸收顏料或順磁珠粒。
紫外光吸收材料（及任何其他流體）可經由輸入埠（或入口）94導引至流體槽72之流動通道92中且可經由輸出埠（或出口）96自流動通道92移除。
如參考圖6B所描述，在未阻斷期間，經由基板10C之側18C引入紫外光。當使用兩個經圖案化結構74、74'時，應將紫外光導引穿過各別基板10C、10C 2之兩側18C及18C 2。UV光將能夠透射穿過基板10C、10C 2，且將藉由各別UV光阻擋層16'、16' 2阻擋。若紫外光吸收材料不存在於流動通道92中，則在區域60''處透射穿過基板10C之UV光可到達另一基板10C 2之引子組30' 2，且在區域60'' 2處透射穿過第二基板10C 2之UV光可到達基板10C之引子組30'。此為非所需的，因為分別位於區域58''及58'' 2中之引子34''、36''及引子34'' 2、36'' 2在該方法中此時不應脫阻斷且因此不應暴露於紫外光。紫外光吸收材料可阻擋透射穿過基板10C及10C 2之光到達相對基板10C 2及10C。
現參考圖7A至圖7M，該方法之此實施例利用引子組30''。引子組30''包括3'阻斷不可裂解第一前引子46及3'阻斷不可裂解第二前引子48。在一個實施例中，3'阻斷不可裂解第一前引子46包括不可裂解第一引子36之截斷序列，該截斷序列不包括裂解位點54或3'端核苷酸，且亦包括在截斷序列之3'端處的3'可光裂解阻斷基團70。在此實施例中，3'阻斷不可裂解第二前引子48包括可裂解第二引子40之截短序列，該截斷序列不包括裂解位點54或3'端核苷酸，且亦包括在截短序列之3'端處的3'可光裂解阻斷基團70。在一個實施例中，引子組30''包括截短P5序列及截短P7序列，且此等序列均不包括裂解位點54。此等前引子46、48展示於圖7A中。在另一實施例中，前引子46、48可為完全不可裂解引子序列（例如P5及P7），其中各別可光裂解阻斷基團70位於距離3'端5個鹼基至10個鹼基，使得截短引子在處理期間產生且隨後用於產生完全可裂解或不可裂解引子。
在圖7A中，各凹陷12包括位於第一區域58'處之紫外光阻擋層16'（或若使用基板10A或10B，則為16），且各凹陷12之第二區域60''對紫外光為可穿透的，其中第二區域60''與預定區域38相對應（其中將進行至少一些引子改變）。
儘管圖7A至圖7M中未展示，但此方法實例涉及產生圖案化結構74、74'（圖8），將圖案化結構74、74'接合在一起或將一個圖案化結構74及蓋（未圖示）接合在一起，且隨後在流體槽72中執行前引子46、48改變。
為了產生各圖案化結構74、74'，凹陷12定義於基板10A、10B或10C中，且將UV光阻擋層16或16'併入（例如塗覆、嵌入等）至基板10A、10B、10C之第一區域58、58'中，如參考圖1A、圖1B或圖1C所描述。隨後，塗覆經接枝層32''。在此範例性方法中，塗覆經接枝層32''涉及將經接枝層32''引入凹陷12及間隙區域14；及自間隙區域14移除經接枝層32''。使用任何適合之沈積技術將本文所揭示之聚合水凝膠28之任何實例應用於基板10A、10B或10C上，且在應用聚合水凝膠28之前或之後，使用任何適合之接枝技術將初始引子組30''（包括前引子46、48）接枝至聚合水凝膠28。在一個實例中，在接枝前引子46、48之前及在施加聚合水凝膠28之後，該方法包括使用本文所揭示之拋光製程自間隙區域14移除聚合水凝膠28。隨後將前引子46、48接枝於凹陷12中之聚合水凝膠28。在另一實施例中，將前引子46、48接枝至聚合水凝膠28（在將其塗覆至基板10C之前或之後），且該方法包括使用本文所揭示之拋光製程自間隙區域14移除經接枝層32''。所得經圖案化結構74、74'包括各凹陷12內之經接枝層32''及不含經接枝層32''之間隙區域14。圖案化結構74之一個凹陷12展示於圖7A中。
在圖7A至圖7M中所示之實施例中，在凹陷12中之至少一些的第二區域60''內之經接枝層32''的第一預定區域38處：改變3'阻斷不可裂解第一前引子46以引入可裂解第一引子34；且改變3'阻斷不可裂解第二前引子48以引入不可裂解第二引子36。亦在圖7A至圖7M中所示之實施例中，在凹陷12中之至少一些之第一區域58''內經接枝層32''之第二預定區域38'處：改變3'阻斷不可裂解第一前引子46以引入不可裂解第一引子42；且改變3'阻斷不可裂解第二前引子48以引入可裂解第二引子40。第一預定區域38處之前引子46、48之改變展示於圖7B至圖7G中，且第二預定區域38'處的前引子46、48之改變展示於圖7H至圖7M中。
3'阻斷不可裂解第一前引子46之改變以在凹陷12中之至少一些的第二區域60''內在經接枝層32''之第一預定區域38處引入可裂解第一引子34涉及：引導紫外光穿過該基板10C，從而將3'可光裂解阻斷基團70 i）自3'阻斷不可裂解第一前引子46移除，以產生上覆於第二區域60''之未阻斷不可裂解第一前引子98及ii）自3'阻斷不可裂解第二前引子48，以產生上覆於該第二區域60''的未阻斷不可裂解第二前引子100，從而使上覆於第一區域58''之3'阻斷不可裂解第一前引子46及3'阻斷不可裂解第二前引子48保持阻斷（圖7B）；使第一引子產生模板76'分別與上覆於第二區域60''的未阻斷不可裂解第一前引子98及上覆於第一區域58''的3'阻斷不可裂解第二引子46雜交（圖7C）；使用包括可裂解鹼基（例如，尿嘧啶鹼基或8-側氧基鳥嘌呤或可藉由聚合酶併入之任何其他可裂解核苷酸）之核苷酸混合物，在未阻斷不可裂解第一前引子98之3'端處沿第一引子產生模板76'起始聚合酶延伸以產生可裂解第一引子34（圖7D）；及使第一引子產生模板76'去雜交（圖7E）。
圖7B描繪經由基板10C之側18C引入紫外光。UV光之波長足以自暴露於光之不可裂解第一前引子46及不可裂解第二前引子48移除3'可光裂解阻斷基團70。在此實例中，UV光在側18C處引入且在第二區域60''處透射穿過基板10C。因此，第二區域60''處之不可裂解第一前引子46及不可裂解第二前引子48暴露於UV光，此觸發3'可光裂解阻斷基團70之移除。未阻斷不可裂解第一前引子及未阻斷不可裂解第二前引子分別以元件符號98及100展示。相比之下，UV光阻擋層16'阻斷光在第一區域58''處到達不可裂解第一前引子46及不可裂解第二前引子48，且因此此等前引子46、48保持3'阻斷。
該方法可進一步包括在3'端處使未阻斷不可裂解第一前引子及未阻斷不可裂解第二前引子98、100去磷酸化。磷酸酯阻斷之3'端可藉由引入具有3'-磷酸酶活性之酶（例如，T4噬菌體聚核苷酸激酶（PNK）或鹼性磷酸酶（AP或ALP））去磷酸化。此等酶處理磷酸酯末端，將其轉化成3'-羥基且使其準備好用於改變引子。
隨後將第一引子再生模板76'引入至流體槽72中。各第一引子再生模板76'為可裂解第一引子34及不可裂解第一引子42之序列的補充序列。在未阻斷不可裂解第一前引子98之延伸期間所用的核苷酸混合物將指示所產生之引子為可裂解的抑或不可裂解的。因此，各第一引子再生模板76'包括與未阻斷不可裂解第一前引子98之序列（其為可裂解第一引子34及不可裂解第一引子42之截短版本）互補的第一部分82'及與可裂解第一引子34之其餘部分及不可裂解第一引子42之其餘部分互補的第二部分84'。在使得第一引子再生模板76'能夠與未阻斷不可裂解第一前引子98及不可裂解第一前引子46雜交的條件下引入第一引子再生模板76'，該等不可裂解第一前引子在第一區域58''處保持完整。雜交引子再生模板76'展示於圖7C中。
含有可裂解核苷酸、其他不可裂解核苷酸及聚合酶之核苷酸混合物隨後引入至流體槽72中。可裂解核苷酸包括尿嘧啶鹼基或8-側氧基鳥嘌呤或可藉由聚合酶併入之任何其他可裂解核苷酸。此混合物中之其他不可裂解核苷酸包括以下鹼基：腺嘌呤、胞嘧啶及鳥嘌呤。可使用可接受此等核苷酸且可在未阻斷不可裂解第一前引子98之3'端處成功地併入此等核苷酸鹼基的任何聚合酶。核苷酸混合物之此實例亦可包括本文所闡述之液體載劑及催化性金屬之任何實例。
流體槽72之溫度可經調節以起始模板擴展反應。聚合酶能夠使用第一引子再生模板76'之第二部分84'作為模板延伸未阻斷不可裂解第一前引子98之3'端。因為i）延伸反應藉由第一引子再生模板76'之第二部分84'導引，ii）第二部分84'與可裂解第一引子34之缺失部分互補，且iii）可裂解核苷酸用於核苷酸混合物，沿第二部分84'之聚合酶延伸產生具有裂解位點54之可裂解第一引子34。可裂解第一引子34展示於圖7D中。
雖然第一引子再生模板76'中之一些可在第一區域58''處與完整第一前引子46雜交，但聚合酶延伸不出現在此等前引子46處。
在產生可裂解第一引子34（圖7D）後，使第一引子再生模板76'去雜交（亦即，變性）且自流體槽72移除（例如，使用洗滌溶液）。
3'阻斷不可裂解第二前引子48已無阻斷，如參考圖7B所示且描述，且隨後改變。改變3'阻斷不可裂解第二前引子48以在凹陷12中之至少一些的第二區域60''內之經接枝層32''的第一預定區域38處引入不可裂解第二引子36涉及：使第二引子產生模板86'分別與上覆於第二區域60''之未阻斷不可裂解第二前引子100及上覆於第一區域58''之3'阻斷不可裂解第二前引子48雜交（圖7E）；使用包括胸腺嘧啶鹼基之核苷酸混合物，在未阻斷不可裂解第二前引子100之3'端處沿第二引子產生模板86'起始聚合酶延伸以產生不可裂解第二引子36（圖7F）；且使第二引子產生模板86'去雜交（圖7G）。
各第二引子再生模板86'為不可裂解第二引子36及可裂解第二引子40之序列的補充序列。在未阻斷不可裂解第二前引子100之延伸期間所用的核苷酸混合物將指示所產生之引子為可裂解的抑或不可裂解的。因此，各第二引子再生模板86'包括與未阻斷不可裂解第二前引子100之序列（其為不可裂解第二引子36及可裂解第二引子40之截短版本）互補的第一部分88'及與不可裂解第二引子36之其餘部分及可裂解第二引子40之其餘部分互補的第二部分90'。在使得第二引子再生模板86'能夠與第二區域60''處的未阻斷不可裂解第二前引子100及第一區域58''處保持完整的第二前引子48雜交的條件下引入第二引子再生模板86'。雜交之引子再生模板86'展示於圖7E中。
將含有不可裂解核苷酸及聚合酶之核苷酸混合物引入至流體槽72中。不可裂解核苷酸包括以下鹼基：腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤及胸腺嘧啶。可使用任何聚合酶，其可接受不可裂解核苷酸，且可在未阻斷不可裂解第二前引子100之3'端處成功地併入不可裂解核苷酸鹼基。核苷酸混合物之此實例亦可包括本文所闡述之液體載劑及催化性金屬之任何實例。
流體槽72之溫度可經調節以起始模板擴展反應。聚合酶能夠使用第二引子再生模板86'之第二部分90'作為模板延伸未阻斷不可裂解第二前引子100之3'端。因為i）延伸反應由第二引子再生模板86'之第二部分90'引導，ii）第二部分90'與不可裂解第一引子36之缺失部分互補，且iii）使用不可裂解核苷酸，沿第二部分90'之聚合酶延伸產生第二不可裂解引子36而無任何裂解位點54。不可裂解第二引子36顯示於圖7F中。
雖然第二引子再生模板86'中之一些可雜合至第一區域58''處之完整第二前引子48，但聚合酶延伸不會出現在此等前引子48處。
在產生不可裂解第二引子36之後（圖7F），使第二引子再生模板86'去雜交（亦即變性）且自流體槽72移除（例如使用洗滌溶液）。
如圖7G中所示，經接枝層32''之預定區域38處的前引子46、48兩者已改變以引入可裂解第一引子34及不可裂解第二引子36。由此在凹陷12之一個區域內引入引子組50A。
亦如圖7G中所展示，經接枝層32''之預定區域38'處的前引子46、48兩者保持未改變，且因此保持用3'可光裂解阻斷基團70阻斷。此等前引子46、48可暴露於未阻斷處理，使得其可改變以將可裂解第二引子40及不可裂解第一引子42引入預定區域38。因此，該方法進一步包括將紫外光引導於基板10C的表面處（如圖7H中所示），從而將3'可光裂解阻斷基團70自以下者中移除：i）3'阻斷不可裂解第一前引子46，以產生上覆於第一區域58''之未阻斷不可裂解第一前引子98，及ii）3'阻斷不可裂解第二前引子48，以產生上覆於第一區域58''之未阻斷不可裂解第二前引子100。紫外光可經選擇具有適合波長以起始未阻斷/去阻斷。
當流體槽72包括UV可穿透蓋時，UV光可朝向基板10C之表面處之第一及第二前引子46、48導引通過蓋。
替代地，流體槽72可包括兩個圖案化結構74、74'（如圖8中所展示）。在一個實例中，可藉由將紫外光引導通過側18C、18C 2兩者來執行未阻斷製程，因為在區域60''處透射穿過基板10C之UV光可到達相對圖案化結構74'之引子組30' 2，且在區域60'' 2處透射穿過第二基板10C 2之UV光可到達相對圖案化結構74之引子組30。在另一實例中，可在將紫外光導引通過一側18C或18C 2之前移除UV光吸收層16'、16' 2（或層16，若使用基板10A或10B）。UV光吸收層16'、16' 2可如參考圖3系列所描述移除，其中濕式蝕刻以流通方式執行且之後為本文所描述之黏著促進製程中之一者。蝕刻劑可經由輸入埠94（圖8）引入，且隨後移除之UV光阻擋層16'、16' 2可經由輸出埠96自流體槽72移除（圖8）。在移除UV光阻擋層16'、16' 2之後，可將紫外光導引通過一側18C或18C 2，其中該紫外光透射通過基板10C或10C 2以在兩個表面處暴露第一及第二前引子46、48。
3'可光裂解阻斷基團70之移除在第一區域58''處產生未阻斷第一前引子98及未阻斷第二前引子100，如圖7H中所示。該方法可進一步包括在3'端處使未阻斷不可裂解第一前引子及未阻斷不可裂解第二前引子98、100去磷酸化。磷酸酯阻斷之3'端可藉由引入具有3'-磷酸酶活性之酶（例如，T4噬菌體聚核苷酸激酶（PNK）或鹼性磷酸酶（AP或ALP））去磷酸化。此等酶處理磷酸酯末端，將其轉化成3'-羥基且使其準備好用於改變引子。
未阻斷第一前引子98及未阻斷第二前引子100準備好在經接枝層32''之第二預定區域38'處改變。
隨後改變第二預定區域38'處之3'阻斷不可裂解第二前引子48，該第二預定區域已如參考圖7H所示及描述未阻斷。在凹陷12中之至少一些之第一區域58''內經接枝層32''之第二預定區域38'處，改變3'阻斷不可裂解第一前引子以引入不可裂解第一引子42涉及：使第一引子產生模板76'分別與上覆於第一區域58''的未阻斷不可裂解第一前引子98及上覆於第二區域60''的可裂解第一引子34雜交（圖7I）；在未阻斷不可裂解第一前引子98之3'端處沿第一引子產生模板76'起始聚合酶延伸以產生不可裂解第一引子42（圖7J）；及使第一引子產生模板76'去雜交（圖7K）。
第一引子再生模板76'再次引入至流體槽72中。如上文所提及，各第一引子再生模板76'為可裂解第一引子34及不可裂解第一引子42之序列的補充序列，且在未阻斷不可裂解第一前引子98延伸期間所用之核苷酸混合物將指示所產生引子為可裂解的抑或不可裂解的。在使得第一引子再生模板76'能夠與第一區域58''處之未阻斷不可裂解第一前引子98及第二區域60''處產生之可裂解第一引子34雜交的條件下引入第一引子再生模板76'。雜交引子再生模板76'展示於圖7I中。
在此實施例中，引入至流體槽72中之核苷酸混合物包括不可裂解核苷酸及聚合酶。不可裂解核苷酸包括以下鹼基：腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤及胸腺嘧啶。可使用任何聚合酶，其可接受此等核苷酸且可在第一區域58''處之未阻斷不可裂解第一前引子98之3'端處成功地併入此等核苷酸鹼基。核苷酸混合物之此實例亦可包括本文所闡述之液體載劑及催化性金屬之任何實例。
流體槽72之溫度可經調節以起始模板擴展反應。聚合酶能夠使用第一引子再生模板76'之第二部分84'作為模板延伸未阻斷不可裂解第一前引子98之3'端。因為i）延伸反應藉由第一引子再生模板76'之第二部分84'引導，ii）第二部分84'與不可裂解第一引子42之缺失部分互補，且iii）使用不可裂解核苷酸，沿第二部分84'之聚合酶延伸產生不可裂解第一引子42而無裂解位點54。不可裂解第一引子42展示於圖7J中。
雖然第一引子再生模板76'中之一些可雜合至第二區域60''處之完整可裂解第一引子34，但聚合酶延伸不出現在此等可裂解第一引子34處。
在第一區域58''中產生不可裂解第一引子42（圖7J）之後，使第一引子再生模板76'去雜交（亦即，變性）且自流體槽72移除（例如，使用洗滌溶液）。
隨後改變已如參考圖7H所示及描述未阻斷之第一區域58''處之3'阻斷不可裂解第二前引子48。在凹陷12中之至少一些之第一區域58''內經接枝層32''之第二預定區域38'處，改變3'阻斷不可裂解第二前引子48以引入可裂解第二引子40涉及：使第二引子產生模板86'分別與上覆於第一區域58''的未阻斷不可裂解第二前引子100及上覆於第二區域60''的不可裂解第二引子36雜交（圖7K）；使用包括可裂解鹼基之核苷酸混合物，在未阻斷不可裂解第二前引子100之3'端處沿第二引子產生模板86'起始聚合酶延伸以產生可裂解第二引子40（圖7L）；且使第二引子產生模板86'去雜交（圖7M）。
再次將第二引子再生模板86'引入至流體槽72中，如圖7K處所展示。如上文所提及，各第二引子再生模板86'為不可裂解第二引子36及可裂解第二引子40之序列的補充序列，且在未阻斷不可裂解第二前引子100延伸期間所用之核苷酸混合物將指示所產生之引子為可裂解的抑或不可裂解的。在使得第二引子再生模板86'能夠與第一區域58''處之未阻斷不可裂解第二前引子100雜交且與第二區域60''處產生之不可裂解第二引子36雜交的條件下引入第二引子再生模板86'。雜交引子再生模板86'展示於圖7K中。
在此實施例中，引入至流體槽72中之核苷酸混合物包括可裂解核苷酸、其他不可裂解核苷酸及聚合酶。可裂解核苷酸包括尿嘧啶鹼基或可藉由聚合酶併入之任何其他可裂解核苷酸。其他不可裂解核苷酸包括以下鹼基：腺嘌呤、胞嘧啶及鳥嘌呤。可使用任何聚合酶，其可接受此等核苷酸且可在第一區域58''處、在未阻斷不可裂解第二前引子100之3'端處成功地併入此等核苷酸鹼基。核苷酸混合物之此實例亦可包括本文所闡述之液體載劑及催化性金屬之任何實例。
流體槽72之溫度可經調節以起始模板擴展反應。聚合酶能夠使用第二引子再生模板86'之第二部分90'作為模板延伸未阻斷不可裂解第二前引子100之3'端。因為i）延伸反應由第二引子再生模板86'之第二部分90'引導，ii）第二部分90'與可裂解第二引子40之缺失部分互補，且iii）使用可裂解核苷酸，沿第二部分90'之聚合酶延伸產生具有裂解位點54之可裂解第二引子40。可裂解第二引子40展示於圖7L中。
雖然第二引子再生模板86'中之一些可雜合至第二區域60''處之完整不可裂解第二引子36，但聚合酶延伸不會出現在此等不可裂解第二引子36處。
在第一區域58''中產生可裂解第二引子40（圖7L）後，使第二引子再生模板86'去雜交（亦即，變性）且自流體槽72移除（例如，使用洗滌溶液）。
如圖7M中所示，經接枝層32''之第二預定區域38'處的前引子46、48兩者已改變以引入不可裂解第一引子42及可裂解第二引子40。此將引子組50B引入凹陷12之另一區域內。
在圖7A至圖7M之方法中使用圖8之流體槽72時，在引導紫外光穿過基板10C、10C 2之前（用於在如參考圖7B所描述之區域60''中未阻擋前引子46、48），該方法進一步包含將紫外光吸收材料引入至流體槽72中；及在引導紫外光穿過基板10C、10C 2之後，該方法進一步包含自流體槽72移除紫外光吸收材料。可使用本文中所揭示之吸收紫外光之材料的任何實例。
紫外光吸收材料（及任何其他流體）可經由輸入埠（或入口）94導引至流體槽72之流動通道92中且可經由輸出埠（或出口）96自流動通道92移除。
如參考圖7B所描述，在未阻斷期間，經由基板10C之側18C引入紫外光。當使用兩個經圖案化結構74、74'時，應將紫外光導引穿過各別基板10C、10C 2之兩側18C及18C 2。UV光將能夠透射穿過基板10C、10C 2，且將藉由各別UV光阻擋層16'、16' 2阻擋。若紫外光吸收材料不存在於流動通道92中，則在區域60''處透射穿過基板10C之UV光可到達另一基板10C 2之引子組30' 2，且在區域60'' 2處透射穿過第二基板10C 2之UV光可到達基板10C之引子組30'。此為非所需的，因為分別位於區域58''及58'' 2中之前引子46、48及引子46 2、48 2在該方法中此時不應脫除阻擋且因此不應暴露於紫外光。流動通道92中之紫外光吸收材料可阻斷透射穿過基板10C及10C 2之光到達相對基板10C 2及10C。
在本文所揭示之範例性方法中之任一者中，經接枝層32、32'、32''之預定區域38（其中將進行至少一些引子改變）可佔凹陷12、12'中之至少一些中的每一者的約二分之一（1/2）。
流體槽
如所提及，圖8說明包括接合在一起之兩個經圖案化結構74、74'的實例流體槽72。儘管未展示，但應理解，經圖案化結構74可鍵結於UV可穿透蓋以產生流體槽之另一實施例。
界定於經圖案化結構74、74'之間的流動通道92與入口/輸入埠94及出口/輸出埠96流體連通。入口94允許流體引入至流動通道92中，且出口96允許流體自流動通道92提取。入口94及出口96中之每一者流體連接至流體控制系統（包括例如儲集器、泵、閥門、廢料容器及其類似物），其控制流體引入及排出。
各流動通道12之入口94及出口96可安置於流體槽72之相對側（如圖8中所示）、流體槽72之相對端或沿實現所需流體流動之流動通道92之長度及寬度的任何位置處。
可在接合區域B、B 2處將經圖案化結構74、74'接合在一起。在圖8中所示之實施例中，接合區域B、B 2與間隙區域14、14 2對應，該等間隙區域位於經圖案化結構74、74'之周邊。分離材料102可塗覆至接合區域B、B 2以將經圖案化結構74、74'緊固在一起。此分離材料102材料36界定流動通道92之壁的至少一部分。任何適合之分離材料102，諸如黏著劑、有助於接合之輻射吸收材料等可用於將經圖案化結構74、74'接合在一起。
圖8中所示之經圖案化結構74、74'之結構包括界定於基板10C、10C 2中之凹陷12、12 2及安置於凹陷12、12 2中之經接枝層32'或32''及32' 2或32'' 2。在最終流體槽72中，可根據參考圖6系列或圖7系列所描述之方法改變初始引子組30'或30''。或者，流體槽72中之各凹陷12或12'之架構可類似於圖3G，或圖4H，或圖5H中所示之架構。
圖8中所展示之流體槽72包括界定於兩個接合之圖案化結構74、74'之間的單一流動通道92。其他流體槽可藉由若干流動通道92產生。在圖9中自俯視圖展示具有八個不同流動通道92之流體槽72'之實例。雖然展示八個流動通道92，但應理解，任何數目個流動通道92可包括於流體槽72'中（例如，四個流動通道92等）。
當包括多個流動通道92時，各包括其自身入口94及出口96。各流動通道92之入口94及出口96可安置於如圖9中所示之流體槽72的相對端。各別流動通道92之入口94及出口96可替代地沿著流動通道92之長度及寬度安置於任何位置以實現所需流體流動。
在圖9中所展示之實例中，各流動通道92可自彼此流動通道92隔開以使得引入至流動通道92中之流體不流動至鄰近流動通道92中。在此實例中，接合區域B可包括分離流動通道92之基板10A、10B、10C、10D之周邊及基板10A、10B、10C、10D之非圖案化區域。
流動通道92內之架構的實例描繪於圖10A及圖10B中。
圖10A中之架構包括位於UV可穿透基底支撐件104上方之基板10D。各多深度凹陷12'包括具有分別附接於多深度凹陷12'之較深部分24及較淺部分26內之不同引子組50A、52A（或50B、52B）的聚合水凝膠28。此架構可如參看圖4序列或圖5序列所描述而形成。在圖10A之實例中，類似圖案化結構或蓋可結合至基板10D。
圖10B中之架構包括移除UV光阻擋層16、16'之基板10A、10B、10C。各凹陷12包括分別附接在空間分離區域處之具有不同引子組50A、52A（或50B、52B或50C、52C）之聚合水凝膠28。凹陷12由間隙區域14隔開。此架構可如參看圖3系列、或圖6系列、或圖7系列所描述而形成。在圖10B之實施例中，類似圖案化結構或蓋可結合至基板10A、10B、10C。
使用流體槽之方法
包括附接至聚合水凝膠28之不同區域的不同引子組50A、52A或50B、52B或50C、52C的本文所揭示之流體槽72、72'之實例可同時用於成對端讀取定序方法中。在此方法中，庫模板接種於凹陷12、12'內且跨越50A、52A或50B、52B或50C、52C擴增。正向及反向股產生於凹陷12、12'內。組50A、52A或50B、52B或50C、52C之正交裂解化學物質使得反向股線能夠自一個區域（例如，區域38）裂解，而向前股線自另一鄰近區域（例如，區域38'）裂解。因此，正向股之集群可產生於一個區域（例如區域38）中且反向股之集群可產生於另一區域（例如區域38'）中。該等叢集可同時定序（例如使用合成定序法），且空間分離使得能夠獲得同時成對末端讀取。
套組
套組中可包括流體槽72、72'之任何實例。
套組之一個實例包括流體槽72、72'，其包括：基板10A、10B、10C、10D，其包括由間隙區域14分離之凹陷12、12'；施加於凹陷12、12'中之各者內的聚合水凝膠28；及接枝至聚合水凝膠28之引子組30、30'，該引子組30、30'包括可裂解第一引子34、34'及不可裂解第二引子36、36'；及核酸酶，以消化該等可裂解第一引子34、34'中之一些及該等不可裂解第二引子36、36'中之一些，且產生經接枝層32、32'之引子耗乏部分64；及以下者中之一：引子混合物，其包括可裂解第二引子40、40'及不可裂解第一引子42、42'；或第一引子再生模板76；及第二引子再生模板86。
套組之另一實例包括流體槽72、72'，其包括：基板10A、10B、10C、10D，其包括由間隙區域14分離之凹陷12、12'；施加於凹陷12、12'中之每一者內的聚合水凝膠28；及接枝至聚合水凝膠28之引子組30''，該引子組30''包括3'阻斷不可裂解第一前引子46及3'阻斷不可裂解第二前引子48；第一引子產生模板76；第二引子產生模板86；第一核苷酸混合物，其包括可裂解鹼基及不可裂解鹼基；及第二核苷酸混合物，其包括不可裂解鹼基。
其他注意事項
應瞭解，前述概念及下文所更詳細地論述之額外概念的所有組合（限制條件為此等概念並不彼此不相容）預期為本文中所揭示之發明標的之部分。詳言之，涵蓋出現在本發明結尾處的所主張主題的所有組合作為本文所揭示之本發明主題的一部分。亦應瞭解，本文中明確採用的亦可出現在以引用方式併入之任何揭示內容中之術語應符合與本文中所揭示之特定概念大部分一致的含義。
本說明書通篇提及「一個實施例（one example）」、「另一實施例（another example）」、「一實施例（an example）」等時意謂結合該實施例描述之特定要素（例如特徵、結構及/或特性）包括於本文所描述之至少一個實施例中，且可或可不存在於其他實施例中。另外，應理解，除非上下文另外明確規定，否則關於任何實例所描述之要素可在各種實例中以任何合適方式組合。
雖然已詳細地描述了若干實例，但應理解，所揭示實例可加以修改。因此，先前描述應視為非限制性的。
10A,10B,10C,10D:基板 12,12':凹陷，多深度凹陷 14:間隙區域 16,16’:UV光阻擋層 18A,18B,18C,18D:引入UV光的基板側 20:凹陷的底表面 22:UV光阻擋層的表面 24:較深部分 26:較淺部分 28:聚合水凝膠 30:單一引子組 32,32’:經接枝層 34,34’,34’’:可裂解第一引子 36,36’,36’’:不可裂解第二引子 38,38’,38’’:預定區域 40,40’,40’’:可裂解第二引子 42,42’,42’’:不可裂解第一引子 46:3'阻斷不可裂解第一前引子 48:3'阻斷不可裂解第二前引子 50A,50B:改變後的引子組 52A,52B:改變後的引子組 54,54’:裂解基團 56:連接子 58,58’’:基板的第一區域 58':基板的光阻擋部分 60,60’’:基板的第二區域 60’:基板的光可穿透部分 62:負型光阻 62’:不可溶負型光阻 62’’:可溶負型光阻 64:引子耗乏部分 66:正型光阻 66’:不可溶正型光阻 66’’:可溶正型光阻 68:核酸酶抗性修飾 70:3'可光裂解阻斷基團 72:流體槽 74,74’:圖案化結構 76,76’:第一引子再生模板 78,80:未阻斷引子（即，未阻斷可裂解第一核酸酶抗性引子，未阻斷可裂解第二核酸酶抗性引子） 78’,80’:未阻斷引子的剩餘部分 82,82’:第一引子再生模板的第一部分 84,82’:第一引子再生模板的第二部分 86,86’:第二引子再生模板 88:第二引子再生模板的第一部分 90:第二引子再生模板的第二部分 92:流動通道 94:流體槽入口 96:流體槽出口 98:去阻斷第一前引子 100:去阻斷第二前引子 102:分離材料 104:UV可穿透基底支撐件
參考以下實施方式及圖式，本發明之實例之特徵將變得顯而易見，在圖式中，類似的參考數字對應於類似但或許不相同的組件。出於簡潔起見，具有先前所描述功能之參考數字或特徵可以或可不結合出現該等參考數字或特徵之其他附圖來描述。
[圖1A]為可用於本文所揭示之方法之實例中的一個範例性基板組態之橫截面圖；
[圖1B]為可用於本文所揭示之方法之實例中的另一範例性基板組態之橫截面圖；
[圖1C]為可用於本文所揭示之方法之實例中的再一範例性基板組態之橫截面圖；
[圖1D]為可用於本文所揭示之方法之實例中的又一範例性基板組態之橫截面圖；
[圖2A]為用於本文所揭示之流體槽之一些實例中的範例性引子組之示意圖；
[圖2B]為用於本文所揭示之流體槽之一些實例中的另一範例性引子組之示意圖；
[圖3A]至[圖3G]為一起繪示改變單一引子組中之引子中之至少一些的方法之實例的示意圖，其中圖3A描繪施加至定義於基板中之凹陷之第一區域的紫外（UV）光阻擋層，及施加於UV光阻擋層上方及基板之暴露區域上方之經接枝層（包括單一引子組），圖3B描繪施加於圖3A之經接枝層上之負型光阻，圖3C描繪由圖3B之負型光阻形成的不可溶負型光阻，使得暴露經接枝層之一部分，圖3D描繪經接枝層暴露於核酸酶以移除單一引子組之引子中之一些之後，聚合水凝膠之引子耗乏部分，圖3E描繪接枝於圖3D之引子耗乏部分之不同引子（與單一引子組中之彼等引子相比），圖3F描繪移除之不可溶負型光阻，及圖3G描繪不同區域中具有不同引子之凹陷，及不含聚合水凝膠及不含不同引子之間隙區域；
[圖4A]至[圖4H]為一起繪示改變單一引子組中之引子中之至少一些的方法之另一實例的示意圖，其中圖4A描繪具有多深度凹陷之基板，圖4B描繪圖4A之基板上之經接枝底塗層（包括單一引子組），圖4C描繪塗覆於圖4B之經接枝層上之負型光阻，圖4D描繪由圖4C之負型光阻形成之不可溶負型光阻，使得經接枝層之一部分暴露，圖4E描繪經接枝層暴露於核酸酶以移除單一引子組之引子中之一些之後，聚合水凝膠之引子耗乏部分，圖4F描繪接枝於圖4E之引子耗乏部分之不同引子（與單一引子組中之彼等引子相比），圖4G描繪移除之不可溶負型光阻，且圖4H描繪在不同區域中具有不同引子之多深度凹陷及不含聚合水凝膠及不含不同引子之間隙區域；
[圖5A]至[圖5H]為一起繪示改變單一引子組中之引子中之至少一些的方法之另一實例的示意圖，其中圖5A描繪具有多深度凹陷之基板，圖5B描繪圖5A之基板上之經接枝底塗層（包括單一引子組），圖5C描繪塗覆於圖5B之經接枝層上之正型光阻，圖5D描繪由圖5C之正型光阻形成之不可溶正型光阻，使得經接枝層之一部分暴露，圖5E描繪經接枝層暴露於核酸酶以移除單一引子組之引子中之一些之後，聚合水凝膠之引子耗乏部分，圖5F描繪接枝於圖5E之引子耗乏部分之不同引子（與單一引子組中之彼等引子相比），圖5G描繪移除之不可溶正型光阻，且圖5H描繪在不同區域中具有不同引子之多深度凹陷及不含聚合水凝膠及不含不同引子之間隙區域；
[圖6A]至[圖6I]為一起繪示改變單一引子組中之引子中之至少一些的方法之再一實例的示意圖，其中圖6A描繪嵌入於定義於基板中之凹陷之一部分中的紫外（UV）光阻擋層，且施加於UV光阻擋層上方及凹陷之暴露區域上方之經接枝層（包括單一引子組，其中各引子包括核酸酶抗性修飾及可光裂解阻斷基團），圖6B描繪自不上覆於UV光阻擋層之引子中移除可光裂解阻斷基團，圖6C描繪引子中不上覆於UV光阻擋層之部分的消化，圖6D描繪與引子之一些剩餘部分及上覆於UV光阻擋層之一些引子雜交的第一引子再生模板，圖6E描繪沿第一引子再生模板之聚合酶延伸，圖6F描繪與引子之剩餘部分中的一些其他者及上覆於UV光阻擋層之引子中的一些其他者雜交的第二引子再生模板，圖6G描繪沿著第二引子再生模板之聚合酶延伸，圖6H描繪在第二引子再生模板去雜交之後圖6G之凹陷，且圖6I描繪自上覆於UV光阻擋層之引子移除可光裂解阻斷基團；
[圖7A]至[圖7M]為一起繪示改變單一引子組中之引子中之至少一些的方法之另一實例的示意圖，其中圖7A描繪嵌入於定義於基板中之凹陷之一部分中的紫外（UV）光阻擋層，且施加於UV光阻擋層上方及凹陷之暴露區域上方之經接枝層（包括單一引子組，其中各引子包括可光裂解阻斷基團），圖7B描繪自不上覆於UV光阻擋層之引子中移除可光裂解阻斷基團，圖7C描繪與一些未阻斷（unblocked）引子及一些阻斷（blocked）引子雜交之第一引子再生模板，圖7D描繪沿著與未阻斷引子雜交之第一引子再生模板之聚合酶延伸，圖7E描繪與未阻斷引子中之一些其他者及阻斷引子中之一些其他者雜交的第二引子再生模板，圖7F描繪沿著第二引子再生模板之聚合酶延伸，圖7G描繪在第二引子再生模板去雜交之後的引子，圖7H描繪用以自上覆於UV光阻擋層之引子中移除可光裂解阻斷基團之UV光暴露，圖7I描繪與一些未阻斷引子雜交之第一引子再生模板，圖7J描繪與上覆於UV光阻擋層之未阻斷引子雜交之沿著第一引子再生模板之聚合酶延伸，圖7K描繪與一些未阻斷引子雜交之第二引子再生模板，圖7L描繪與上覆於UV光阻擋層之未阻斷引子雜交的沿著第二引子再生模板之聚合酶延伸，且圖7M描繪凹陷中之兩種不同引子組；
[圖8]為包括接合在一起且在出現引子組改變之前的兩個圖案化結構之流體槽之實例的截面視圖；
[圖9]係流體槽之實例之俯視圖；及
[圖10A]為流體槽之流體通道之實例的放大及部分剖視圖；
[圖10B]為流體槽之流體通道之不同實例的放大及部分剖視圖。
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10A:基板
12:凹陷，多深度凹陷
14:間隙區域
16:UV光阻擋層
18A:引入UV光的基板側
20:凹陷的底表面
58:基板的第一區域
60:基板的第二區域

Claims (9)

  1. 一種方法，其包含： 將聚合水凝膠施加至基板之表面，該基板包括由間隙區域隔開之凹陷，各凹陷包括位於第一區域之紫外光阻擋層及對紫外光為可穿透的且鄰近於該第一區域之第二區域； 在施加該聚合水凝膠之前或之後，將引子組接枝於該聚合水凝膠以形成經接枝層，該引子組包括3'阻斷（blocked）不可裂解第一前引子及3'阻斷不可裂解第二前引子； 自該等間隙區域中移除該聚合水凝膠或該經接枝層； 在該等凹陷中之至少一些的第二區域內之經接枝層的第一預定區域處： 改變該等3'阻斷不可裂解第一前引子以引入可裂解第一引子；及 改變該等3'阻斷不可裂解第二前引子以引入不可裂解第二引子；及 在該等凹陷中之至少一些的第一區域內之經接枝層的第二預定區域處： 改變該等3'阻斷不可裂解第一前引子以引入不可裂解第一引子；及 改變該等3'阻斷不可裂解第二前引子以引入可裂解第二引子。
  2. 如請求項1之方法，其中： 在該等凹陷中之至少一些的第二區域內之經接枝層的該第一預定區域處，改變該等3'阻斷不可裂解第一前引子以引入可裂解第一引子涉及： 引導紫外光穿過該基板，從而將3'可光裂解阻斷基團自以下者中移除：i）該等3'阻斷不可裂解第一前引子，以產生覆蓋於該第二區域上之未阻斷不可裂解第一前引子，及ii）該等3'阻斷不可裂解第二前引子，以產生覆蓋於該第二區域上之未阻斷不可裂解第二前引子，從而使覆蓋於該第一區域上之該等3'阻斷不可裂解第一前引子及該等3'阻斷不可裂解第二前引子保持阻斷； 使第一引子產生模板分別與覆蓋於該第二區域上之該等未阻斷不可裂解第一前引子及覆蓋於該第一區域上之該等3'阻斷不可裂解第二引子雜交； 使用包括可裂解鹼基之核苷酸混合物，在該等未阻斷不可裂解第一前引子之3'端處沿著該等第一引子產生模板啟動聚合酶延伸以產生該等可裂解第一引子；及 使該等第一引子產生模板去雜交；及 在該等凹陷中之至少一些的第二區域內之經接枝層的該第一預定區域處，改變該等3'阻斷不可裂解第二前引子以引入不可裂解第二引子涉及： 使第二引子產生模板分別與覆蓋於該第二區域上之該等未阻斷不可裂解第二前引子及覆蓋於該第一區域上之該等3'阻斷不可裂解第二前引子雜交； 使用包括胸腺嘧啶鹼基之核苷酸混合物，在該等未阻斷不可裂解第二前引子之3'端處沿著該等第二引子產生模板啟動聚合酶延伸以產生該等不可裂解第二引子；及 使該等第二引子產生模板去雜交。
  3. 如請求項2之方法，其中： 該基板為包括與該基板相對之第二基板的流體槽的一部分，該第二基板包括由第二間隙區域隔開之第二凹陷，其中各第二凹陷包括第二紫外光阻擋層，及施加至所述第二基板之凹陷的第二接枝層，該第二接枝層包括第二聚合水凝膠及與其連接之第二引子組，該第二引子組包括該等3'阻斷不可裂解第一前引子及該等3'阻斷不可裂解第二前引子； 在引導該紫外光穿過該基板之前，該方法進一步包含將紫外光吸收材料引入至該流體槽中；及 在引導該紫外光穿過該基板之後，該方法進一步包含自該流體槽中移除該紫外光吸收材料。
  4. 如請求項2之方法，其進一步包含將紫外光引導於該基板之表面處，從而自以下者中移除3'可光裂解阻斷基團：i）該等3'阻斷不可裂解第一前引子，以產生覆蓋於該第一區域上之未阻斷不可裂解第一前引子，及ii）該等3'阻斷不可裂解第二前引子，以產生覆蓋於該第一區域上之未阻斷不可裂解第二前引子。
  5. 如請求項4之方法，其中： 在該等凹陷中之至少一些的第一區域內之經接枝層的該第二預定區域處，改變該等3'阻斷不可裂解第一前引子以引入不可裂解第一引子涉及： 使第一引子產生模板分別與覆蓋於該第一區域上之該等未阻斷不可裂解第一前引子及覆蓋於該第二區域上之該等可裂解第一引子雜交； 在該等未阻斷不可裂解第一前引子之3'端處沿著該等第一引子產生模板啟動聚合酶延伸以產生該等不可裂解第一引子；及 使該等第一引子產生模板去雜交；及 在該等凹陷中之至少一些的第一區域內之經接枝層的該第二預定區域處，改變該等3'阻斷不可裂解第二前引子以引入可裂解第二引子涉及： 使第二引子產生模板分別與覆蓋於該第一區域上之該等未阻斷不可裂解第二前引子及覆蓋於該第二區域上之該等不可裂解第二引子雜交； 使用包括可裂解鹼基之核苷酸混合物，在該等未阻斷不可裂解第二前引子之3'端處沿著該等第二引子產生模板啟動聚合酶延伸以產生該等可裂解第二引子；及 使該等第二引子產生模板去雜交。
  6. 如請求項4之方法，其中： 該基板為包括與該基板相對之第二基板的流體槽的一部分，該第二基板包括由第二間隙區域隔開之第二凹陷，其中各第二凹陷包括第二紫外光阻擋層，及施加至所述第二基板之凹陷的第二接枝層，該第二接枝層包括第二聚合水凝膠及與其連接之第二引子組，該第二引子組包括該等3'阻斷不可裂解第一前引子及該等3'阻斷不可裂解第二前引子；及 在將該紫外光引導於該基板之表面處之前，該方法進一步包含移除該紫外光阻擋層及該第二紫外光阻擋層。
  7. 如請求項4之方法，其中： 該基板為包括與該基板相對之第二基板的流體槽的一部分，該第二基板包括由第二間隙區域隔開之第二凹陷，其中各第二凹陷包括第二紫外光阻擋層，及施加至所述第二基板之凹陷的第二接枝層，該第二接枝層包括第二聚合水凝膠及與其連接之第二引子組，該第二引子組包括該等3'阻斷不可裂解第一前引子及該等3'阻斷不可裂解第二前引子；及 將該紫外光引導於該基板之表面處亦將該第二基板暴露於該紫外光。
  8. 一種套組，其包含： 流體槽，其包括： 基板，其包括由間隙區域隔開之凹陷； 施加在該等凹陷中之各者內的聚合水凝膠；及 接枝至該聚合水凝膠之引子組，該引子組包括3'阻斷不可裂解第一前引子及3'阻斷不可裂解第二前引子； 第一引子產生模板； 第二引子產生模板； 第一核苷酸混合物，其包括可裂解鹼基及不可裂解鹼基；及 第二核苷酸混合物，其包括不可裂解鹼基。
  9. 如請求項8之套組，其中該流體槽在該基板與預定區域對應的區域中包括紫外光阻擋層，於該預定區域中該等3'阻斷不可裂解第一前引子及3'阻斷不可裂解第二前引子將被改變。
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