JP2023518730A - 多段階プライマー伸長反応用の方法および組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応（PCR）および逆転写酵素PCRなどの多段階プライマー伸長反応用の方法および組成物について記載する。【解決手段】プライマー伸長段階を、段階の間に容器を開くことなく、閉じた容器内で行う。多段階プライマー伸長方法および組成物は、前段において前段のプライマーを、かつ、後段において後段のプライマーを利用し、その際、後段のプライマーは、前段中に伸長しないようブロックされる。本技術のブロックされたプライマーは、光開裂型保護基を備えており、紫外光への暴露により保護基が開裂されるまで、実質的に不活性となっている。ブロックされたプライマーは、容器を開くことなく、紫外光により活性化できる。【選択図】図1

Description

本願は、2020年3月26日に出願された米国特許仮出願第62/994,989号の優先権を主張するものであり、米国特許仮出願第62/994,989号の内容は、その全体が参照により組み込まれる。

本開示は、マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応（PCR）および逆転写酵素-PCRなどの多段階プライマー伸長反応用の方法および組成物に関する。

ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、DNA配列用の特有の増幅方法である。PCRは、次世代シークエンシング（NGS）ライブラリー調製（Next Generation Sequencing (NGS) library preparation）用のDNA標的増幅（DNA target amplification）用の、有用で広く適用される方法である。特に、プライマーが、核酸の混合物中でその標的配列にハイブリダイズして伸長され、次いでプライマーハイブリダイゼーションおよび伸長のさらなるラウンドが続く。PCRにより、プライマー間で配列の指数関数的増幅が可能となり、PCRは非常に感度の高い技術となっている。しかし、PCRは、不要な増幅産物につながる場合がある。第一に、プライマーが、その標的に加えて他の配列を結合した場合、的外れの増幅によって標的配列の収率が低減され得る。第二に、PCRプライマーは、（指数関数的反応（exponential reaction）の、後のラウンドを支援するために）標的配列よりもずっと高い濃度である必要があり、それゆえに、プライマーは時として他のプライマーと反応して、プライマーダイマーを生成する場合がある。第三に、異なる標的配列は、長さ、GC含有率、プライマー配列などに依存して、異なる効率で増幅する場合がある。

マルチプレックスPCR（mPCR）は、多くの（場合によっては幾百または幾千の）プライマーが伸長反応において使用される処理である。これは、多くの標的配列を同じ管内で増幅でき、かつ、場合によっては多くの標的配列を試料の同じアリコートから増幅できるので、便利である。しかし、的外れの増幅、プライマーダイマー形成、および、不均一な増幅という問題がmPCRでは組み合わさる。事実、プライマーダイマー問題は、マルチプレックス反応に付加されるプライマーの新たな対それぞれが混合物中の他のプライマーすべてと潜在的に相互作用する可能性があるため、急激に悪化する場合がある。

マルチプレックスPCRは、実験室での時間および労力のかなりの節約になる可能性を有している。この技術は、遺伝子欠失解析（gene deletion analysis）、変異および多型解析（mutation and polymorphism analysis）、定量分析、ならびに、逆転写（RT）-PCRを含む、ヒトでのDNA検査の多くの分野で適用されてきた。感染症の分野において、マルチプレックスPCRは、ウイルス、バクテリアおよび寄生生物の識別用に使用されてきた。しかし、mPCRの使用は、感度の低さ、特異性の低さ、ある特有の標的の選択的増幅（preferential amplification）、および/または、意図せぬ配列の増幅を含む、いくつかの問題を引き起こす。

通常、マルチプレックスPCRは、2つの別個の段階で起きるものである（すなわち多段階PCR）。第１の段階の反応では、ユニバーサル配列を有する標的特異的プライマーを使用して、特異的標的ポリヌクレオチドを増幅し、かつ、ユニバーサル順方向および逆方向配列を各アンプリコンへと付加する。次いで、生成物を、後のPCR増幅反応の前に精製し、未反応の標的特異的プライマーおよび他の試薬を除去する。次いで、後のPCR反応において、ユニバーサル配列にハイブリダイズするよう設計されたユニバーサルプライマーが使用されて、前段からのアンプリコンを増幅し、かつ、（アダプターなどの）さらなる処理および識別目的用に必要とされる、何らかのさらなる配列を付加する。

このシステムは労働集約的である。そのうえ、標的特異的プライマーとユニバーサルプライマーとの間の競合により、偏った増幅が結果として生じる場合があり、そのため、前段のあとの反応混合物を停止かつ精製する必要がある。これにより、システムにエラーおよび汚染が入り込む可能性がある。ゆえに、単一の反応容器中で両方の段階の遂行を可能にする方法を突き止めることが望ましいであろう。そのうえ、反応容器を開くことなく、2つまたはそれ以上の段階を遂行できれば、とりわけ好適（例えば汚染の防止に関して）かつ便利であろう。

逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）において、RNAは、最初の段階でcDNAへと逆転写され、次いで、cDNAが、続く段階で、通常は標的特異的プライマーにより、PCRステップにおいて増幅される。RT-PCRは、マルチステップPCRと同じ問題を抱えている。これは、遺伝子特異的プライマーが、比較的低い温度（37～60^oC）で実行されるcDNA合成中に、非特異的に準備する（prime）からである。特異性は一般に、逆転写およびPCRを2つの別個の容器で行うことにより向上する。それにより、PCRプライマーが、互いに相互作用することが、または、cDNA合成を開始するために使用される、オリゴ（dT）、ランダムヘキサマーもしくは遺伝子特異的逆方向プライマーなどのRTプライマーと、相互作用することが防止される。しかし、RTステップとPCRステップとの間で管を開くことで、労力と汚染の危険性とが増加する。

米国特許第4,439,356号明細書 米国特許第5,188,934号明細書 国際公開第2018/10842A1号明細書 米国特許第8,969,535号明細書 米国特許第9,200,319号明細書 米国特許第10,041,115号明細書

Haugland Nieman GivenおよびSchowen Orosz他 Hastings

本技術は、閉じた容器内で多段階ポリメラーゼ連鎖反応を行うための新規な方法に関し、その際、混合物は、i）ポリヌクレオチド標的、ii）プライマー伸長可能な前段のプライマー、iii）3’末端に光開裂型保護基を備える後段のプライマー、iv）プライマー伸長酵素、および、v）任意に所望される他の試薬を備えている。前段のプライマーの例には、標的特異的プライマーおよび逆転写酵素（RT）プライマーが含まれる。標的特異的プライマーは5’領域および3’領域を備えていてもよく、3’領域は標的特異的配列を備えており、5’領域はユニバーサル配列を備えている。このような標的特異的プライマーを前段のプライマー伸長反応において使用する場合、後段のプライマーは、ユニバーサル配列またはその一部およびその3’末端の光開裂型保護基を備える、ユニバーサル配列であってもよい。いくつかの実施形態では、容器は混合物の調製後に閉じられ、前段のポリメラーゼ連鎖反応が混合物で行われて、標的アンプリコンが生成される。ユニバーサルプライマーは混合物中でブロック解除されて（unblocked）、ユニバーサル配列またはその一部を備えるブロック解除されたユニバーサルプライマーが生成される。いくつかの実施形態では、ブロック解除ステップは、容器を開くことなく行われる。後段のプライマー伸長反応は、ブロック解除されたプライマーおよび標的アンプリコンで行われ、その際、ブロック解除されたプライマーは標的アンプリコンを増幅する。いくつかの実施形態では、ブロック解除ステップは、閉じた容器内で、ユニバーサルプライマーを紫外光に暴露することにより行われる。

別の局面では、本技術は、多段階PCRを行うための新規な方法に関し、組成物は、a）ポリヌクレオチド標的、b）プライマー伸長可能な前段のプライマー、および、c）3’末端に光開裂型保護基を備える後段のプライマーを備えている。前段のプライマーの例には、標的特異的プライマーおよび逆転写酵素（RT）プライマーが含まれる。標的特異的プライマーは5’領域および3’領域を備えていてもよく、3’領域は標的特異的配列を備えており、5’領域はユニバーサル配列を備えている。このような標的特異的プライマーが前段のプライマーである場合、後段のプライマーは、ユニバーサル配列またはその一部およびその3’末端の光開裂型保護基を備える、ユニバーサル配列であってもよい。いくつかの実施形態では、組成物は、当該組成物が調製された後に閉じられる容器内に収容される。紫外光に暴露することにより、後段のプライマーをブロック解除してPCR増幅のために活性化できる。

別の局面では、本技術は、閉じた容器内で多段階RT-PCRを行うための新規な方法に関し、混合物は、i）ポリヌクレオチド（RNA）標的、ii）cDNA合成用にオリゴ（dT）プライマー、ランダムプライマーまたは標的特異的RTプライマーを備える、前段のプライマー、iii）5’末端に標的特異的配列を、かつ、3’末端に光開裂型保護基を備える、後段のプライマー、iv）逆転写酵素、v）DNAポリメラーゼ、および、vi）任意に所望される他の試薬を備えている。いくつかの実施形態では、容器は混合物の調製後に閉じられ、PCR熱サイクリングの前に、定温（37～60^oC）で逆転写が行われる。標的特異的PCRプライマーは、容器を開くことなくブロック解除され、PCRステップは、ブロック解除されたPCRプライマーおよびcDNAで行われ、その際、ブロック解除されたプライマーが、1つまたは複数の標的アンプリコンを増幅する。いくつかの実施形態では、ブロック解除ステップは、閉じた容器内で、ブロックされた標的特異的PCRプライマーを紫外光に暴露することにより行われる。

別の局面では、本技術は、閉じた容器内で多段階RT-PCRを行うための新規な組成物に関する。組成物は、a）ポリリボヌクレオチド（RNA）標的と、b）cDNA合成用のブロック解除されたRTプライマーを備える、前段のプライマーと、c）後段のプライマー伸長反応用に、ブロックされたプライマーを備える、後段のプライマーとを備え、その際、後段のプライマーは、その3’末端に光開裂型保護基を備えている。ブロックされた後段のプライマーは、標的特異的PCRプライマー、ランダムプライマーまたはユニバーサルプライマーであってもよい。後段のプライマーを、紫外光に暴露することにより、cDNA合成後にブロック解除してPCR増幅のために活性化することができる。いくつかの実施形態では、組成物は、当該組成物が調製された後に閉じられる容器内に収容される。

当業者であれば、以下に説明する図面が、単に例示のためのものであることを理解するであろう。図面は、いかなる仕方でも、本教示の範囲を限定することを意図していない。

本多段階PCRプライマー、方法および組成物の実施形態の模式図を示す。 その3’末端に光開裂型保護基を有するブロックされたユニバーサルプライマーの生成を実証する、逆相HPLCトレース（reverse phase HPLC trace）を示す。 本多段階RT-PCRプライマー、方法および組成物の実施形態の模式図を示す。 プライマーを365nmの紫外光に10秒間暴露することにより、PCR管内の本ブロックされたユニバーサルプライマーのブロック解除を実証する、逆相HPLCトレースを示す。 光開裂型のブロックされたプライマー（photocleavable blocked primer）が、プライマーの紫外光への暴露後にのみ、PCRにおいて伸長されたことを実証する、バイオアナライザー2100の画像を示す。 ブロックされた後段のプライマーの存在下で、前段において、ブロック解除されたRTプライマーで行った、単一容器でのRT-PCR反応のバイオアナライザー画像を示す。ブロックされた後段のプライマーは、後段用にブロック解除された。 ブロックされた後段のプライマーの存在下で、前段において、ブロック解除されたRTプライマーで行った、単一容器でのRT-PCR反応のバイオアナライザー画像を示す。ブロックされた後段のプライマーは、後段用にブロック解除された。

本技術は、ブロック解除された前段のプライマーとブロックされた後段のプライマーとを使用する、マルチプレックスPCRおよびRT-PCRなどの多段階プライマー伸長反応に関する。ブロックされたプライマーは、その3’末端に光開裂型保護基を含んでいる。ポリヌクレオチド標的は、前段でプライマー伸長反応を施されて、標的アンプリコンまたは標的cDNAなどの生成物を形成する。例えば、ゲノムDNAは、3’領域に標的特異的配列を、かつ、5’領域にユニバーサル配列を備える、標的特異的プライマーにより、前段において増幅することができる。この前段の生成物は、アンプリコンの5’および3’末端にユニバーサル配列を備える標的アンプリコンを備えている。次いで、標的アンプリコンは、紫外光への暴露によるなどの保護基の光開裂によりブロック解除されているユニバーサルプライマーにより、後段のプライマー伸長反応において増幅される。別の例として、RNA標的は、前段においてプライマー伸長を施されて、標的cDNAを生成することができる。標的cDNAには、ブロック解除されている標的特異的プライマーまたはユニバーサルプライマーにより、後段においてプライマー伸長を施すことができる。

図1は、本技術の多段階PCR法の模式図を示している。図示したPCR法は、ポリヌクレオチド標的と、ユニバーサル配列を備える標的特異的プライマーと、その3’末端に光開裂型保護基を備える、3’ブロックされた光開裂型ユニバーサルプライマー（3’ blocked photocleavable universal primer）とを収容する閉じた容器内で行うことができる。

図1は、標的特異的順方向および逆方向プライマーによる、前段のPCRにおける、ポリヌクレオチド標的の増幅を示している。順方向プライマーは、タグ1として示す、標的およびユニバーサル配列へとハイブリダイズすることになる標的特異的配列を備えており、逆方向プライマーも、タグ2として示す、標的および別のユニバーサル配列へとハイブリダイズすることになる標的特異的配列を備えている。前段のPCRにおけるポリヌクレオチド標的の増幅により、ポリヌクレオチド標的配列を備え、かつ、当該標的アンプリコンの5’および3’末端にそれぞれユニバーサル配列タグ1および2（または、その補足物）をさらに備える標的アンプリコンが生成される。前段のPCR増幅は通常、複数の標的が、複数のセットの標的特異的プライマーにより、並行して増幅される、マルチプレックスPCR増幅である。標的特異的プライマーの例示的なセットが、BRCA MASTR DXアッセイなど、アジレント社のSureMASTR技術により利用可能となっている。

図1は、3’ブロックされた光開裂型ユニバーサルプライマーのセットを有する標的アンプリコンの後段の増幅をも示している。本技術において、図1に示す順方向ユニバーサルプライマーは、その3’末端にある光開裂型保護基と、ユニバーサル配列タグ1またはその一部の配列を備える3’領域と、5’領域における、アダプター1として示すアダプター配列とを含んでいる。図1に示す逆方向ユニバーサルプライマーは、その3’末端にある光開裂型保護基と、ユニバーサル配列タグ2またはその一部の配列を備える3’領域と、MID 1として示す分子識別子と、5’領域にある、アダプター2として示すアダプター配列とを含んでいる。順方向および逆方向ユニバーサルプライマーにおける光開裂型保護基を、中止という標示により示す。ブロックされたユニバーサルプライマーが、前段のPCRの間、反応混合物中に存在するが、ブロック解除されるまで、PCR増幅に対して実質的に不活性である。ブロックされたユニバーサルプライマーを、紫外光への暴露により、ブロック解除して後段のPCR増幅のために活性化することができる。紫外光への暴露後に、ブロック解除されたユニバーサルプライマーは、PCR増幅に対して活性となっている。図1に示すように、後段のPCR増幅は、前のアンプリコンのユニバーサル増幅という結果になり、後段のアンプリコンを生成する。したがって、後段のユニバーサルに増幅されたアンプリコンは、標的特異的プライマーおよびユニバーサルプライマーの配列（例えば、アダプター1およびアダプター2配列）を備えている。

本技術のブロックされたユニバーサルプライマーは、紫外光への暴露によりブロック解除して、PCRの前段後にユニバーサルプライマーを付加することができるので、ユニバーサルプライマーは、最初の標的増幅を妨げることなく、前段のPCR中に、mPCR反応混合物中に存在することができる。驚くべきことに、ブロックされたユニバーサルプライマーは、前段において実質的に不活性であるが、後段においてPCRのために活性にされる。また、PCR混合物収容容器全体を紫外光に暴露することにより、保護基の光開裂性によって、ユニバーサルプライマーをブロック解除して活性化することができる。このブロック解除能力は、汚染が入り込むのを低減または回避するため、便利かつ極めて有益である。なぜなら、後段のPCRを、前段のPCR後にPCR混合物容器を開いてユニバーサルプライマーを付加することなく行うことができるからである。

例えば、PCRの前段が完了した後に、3’ブロックされた光開裂型ユニバーサルプライマーを、365nmの光などの紫外光への暴露により、ブロック解除できるであろう。紫外光への暴露は、任意の適切なやり方で行うことができる。ブロック解除は、例えば、熱サイクラー（thermo-cycler）からPCR容器を除去し、それを紫外線ボックス（ultraviolet light box）などの紫外光源上に置くことにより行ってもよい。あるいは、PCR熱サイクラーを修正して、UV光を直接印加してもよい。ある場合には、同じ閉じられたPCR反応容器内にユニバーサルプライマーがある間に、紫外光を印加してユニバーサルプライマーをブロック解除してもよい。次いで、同じ閉じられたPCR反応容器は、今やブロック解除されているユニバーサルプライマーで、後段の増幅へと進むことができる。

別の局面では、本技術は、後段のプライマーが、その3’末端に光開裂型保護基を含む標的特異的プライマーを備えている、多段階RT-PCRに関する。ポリリボヌクレオチド標的は、逆転写酵素と、オリゴ（dT）プライマー、ランダムプライマーまたは標的特異的逆方向プライマーなどの、ブロック解除されたRTプライマーとにより、第１の段階において逆転写される。前段のプライマー伸長反応の生成物は標的cDNAである。標的cDNAは、後段のPCR中に、保護基の光開裂によりブロック解除されている標的特異的プライマーなどの後段のプライマーにより、増幅できる。

図3は、本技術の多段階RT-PCRの模式図を示している。図示したRT-PCRは、ポリリボヌクレオチド標的と、ブロック解除されたRTプライマーと、3’光開裂型保護基を備える標的特異的プライマーとを収容する、閉じた容器内で行うことができる。標的特異的プライマー中の光開裂型保護基を、中止という標示により示す。図3は、ブロックされた標的特異的プライマーの存在下での、ブロック解除された逆方向プライマーによる、ポリリボヌクレオチド標的の前段の逆転写を示している。図3は、紫外光への暴露により3’保護基が除去された後の、標的アンプリコンの後段の増幅をも示している。

いくつかの実施形態では、本技術の光開裂型保護基は、フルオロフォアなどの適切なレポーターに接続されている。他の実施形態では、本技術の光開裂型保護基は、レポーターに接続されていない。本技術の光開裂型保護基が、フルオロフォアを含んでいるか否かで適切に機能することになり、光開裂型保護基の存在を必要とするのみであることが考えられる。

また、本技術の光開裂型保護基は、紫外光への暴露により除去されるので、本保護基は、プライマー伸長酵素の機能に影響しない。したがって、本技術の光開裂型保護基は、ポリメラーゼ酵素、ヌクレオチド（dNTP）およびバッファーなどの標準のPCRおよびRT-PCR成分との使用に適合している。

例示的な実施形態を、より詳細に説明する前に、説明中で使用する用語の意味および範囲を例示および定義するために、以下の定義および解説を記載する。

数値範囲は、範囲を規定する数字を含んでいる。特に断りのない限り、それぞれ、核酸は5’から3’の方向に、左から右へと記述され、アミノ酸配列はアミノからカルボキシの方向に、左から右へと記述される。

本技術は、特に断りのない限り、有機化学、ポリマー技術、（組み換え技術を含む）分子生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の技術および説明を採用してもよく、これらは当該技術の範囲内にある。このような技術は、ポリマーアレイ合成、ハイブリダイゼーション、ライゲーション（ligation）、および、標識を使用したハイブリダイゼーションの検出を含んでいる。

本明細書で使用する際、「1つの」および「上記」といった単数の形態は、文脈が明らかに別の意味を示していない限り、複数の対象を含んでいる。例えば、「1つのプライマー」という用語は、1つまたはそれ以上のプライマー、すなわち、単独のプライマーおよび複数のプライマーを含んでいる。「複数の」には、少なくとも2つの要素が含まれる。ある場合、複数は、少なくとも10、少なくとも100、少なくとも100、少なくとも10,000、少なくとも100,000、少なくとも10⁶、少なくとも10⁷、少なくとも10⁸、または、少なくとも10⁹、または、より多くの要素を含んでいてもよい。

いずれかの任意の要素を除外するように請求項を記述してもよいことに、さらに留意されたい。そのように、この文面は、請求項の要素の詳述または「消極的な」限定の使用に関連し、「のみ」、「だけ」などの排他的な術語の使用について、先行する根拠（antecedent basis）となるよう意図されている。

明細書および添付の特許請求の範囲において使用する際、かつ、その通常の意味に加えて、「実質的な」または「実質的に」という用語は、当業者にとって受け入れられる限度または程度内であることを意味する。例えば、「実質的に不活性」は、活動の水準を無視できると当業者がみなす、という意味である。

「試料」という用語は、本明細書で使用される際、対象となる1つまたはそれ以上のポリヌクレオチドまたは断片を含む材料または材料の混合物に関する。いくつかの実施形態では、この用語は、（血漿、血清、脳脊髄液（cerebrospinal fluid）、リンパ、涙、唾液および組織切片を制限なしに含む）患者から、（FFPE切片などの）保存された組織から、または、試験管内の細胞培養成分から分離された例えば組織または流体、ならびに、環境からの試料などの、DNA、RNA、または、他のポリヌクレオチドを含む、いずれかの植物、動物またはウイルス材料を指している。核酸を含むいずれかの試料（例えば組織培養細胞からの、または組織の試料からのゲノムDNA）を、本技術で採用してもよい。

「核酸試料」という用語は、本明細書で使用する際、核酸を含む試料を意味する。核酸試料は、配列を含む複数の異なる分子を含んでいるという点で、複合されていてもよい。哺乳類（例えば、マウスまたはヒト）からの核酸試料は、種類が複合試料となる。複合試料は、10⁴、10⁵、10⁶または10⁷よりも多くの異なる核酸分子を有していてもよい。また、複合試料は2、3の分子のみを備えていてもよく、その際、分子は一括して、10⁴、10⁵、10⁶または10⁷よりも多くのヌクレオチドを有している。「複合性（complexity）」という用語は一般に、（断片、アダプター、または、アダプター結紮断片（adapter-ligated fragment）などの）母集団における異なる配列の総数を指す。例えば、母集団が4つの異なる配列を有している場合、その母集団は、4の複合性を有していることになる。母集団は、所望の結果に応じて、少なくとも4、少なくとも8、少なくとも16、少なくとも100、少なくとも1,000、少なくとも10,000、または、少なくとも100,000、またはそれ以上の複合性を有していてもよい。

「ヌクレオチド」という用語は、グアニン、シトシン、アデニン、チミン、ウラシル（それぞれG、C、A、TおよびU）を、かつ、修飾ピリミジンおよびプリン誘導体（modified pyrimidine and purine derivative）、ならびに、公知のプリンおよびピリミジン塩基だけでなく、修飾されている他の複素環塩基をも含む他の天然に存在しない部分を含む、天然に存在するヌクレオチドを指す。このような修飾には、メチル化プリンもしくはピリミジン、アシル化プリンもしくはピリミジン、アルキル化リボース、または、他の複素環が含まれる。くわえて、「ヌクレオチド」という用語は、ハプテンまたは蛍光標識を含むこれらの部分を含んでおり、かつ、従来のリボースおよびデオキシリボース糖だけでなく、他の糖をも同様に含んでいてもよい。修飾ヌクレオチドも、糖部分上の修飾を含んでいる。例えば、その際、1つまたはそれ以上のヒドロキシル基が、ハロゲン原子または脂肪族基に置換されており、エーテル、アミンなどとして官能化されている。

「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、任意の長さ（ヌクレオチド（例えばデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド）で構成される、例えば約2個の塩基を超える、約10個の塩基を超える、約100個の塩基を超える、約500個の塩基を超える、約1000個の塩基を超える、約10,000個までまたはそれ以上の塩基）の、ヌクレオチドを含むポリマーを説明するために、本明細書において互換性のある仕方で使用されており、かつ、天然に、化学的に、酵素的に、または合成的に生成されていてもよい。この用語は、PNA、LNAまたはUNAを有するポリマーを含んでいる。DNAおよびRNAがそれぞれ、デオキシリボースおよびリボース糖骨格を有しているのに対し、PNAの骨格は、ペプチド結合により連結された繰り返しN-（2-アミノエチル）-グリシン単位（repeating N-(2-aminoethyl)-glycine units）で形成されている。PNAでは、さまざまなプリンおよびピリミジン塩基が、メチレンカルボニル結合により、骨格に連結されている。しばしばインアクセシブルRNAと呼ばれるロック核酸（LNA）は、修飾RNAヌクレオチドである。LNAヌクレオチドのリボース部分は、2'酸素および4'炭素を接続する追加の架橋により修飾されている。架橋は、3'-エンド（ノース）構造（3'-endo (North) conformation）中のリボースを「ロックする」が、これはしばしばA型二本鎖中に見られる。LNAヌクレオチドは、所望の場合はいつでも、オリゴヌクレオチド中のDNAまたはRNA残基と混合することができる。「非構造化核酸（unstructured nucleic acid）」すなわち「UNA」という用語は、安定性が低下した状態で互いに結合する非天然ヌクレオチドを含む核酸のことである。例えば、非構造化核酸は、G’残基およびC’残基を含んでいてもよく、これらの残基は、安定性が低下した状態で互いに塩基対合する（base pair）GおよびCの天然に存在しない形態（すなわち類似体）に対応するが、天然に存在するCおよびG残基とそれぞれ塩基対合する能力を保持している。

「塩基」という用語は、核酸中に一般に見られる種類の置換または非置換窒素含有親芳香族複素環を、かつ、適切に相補的な塩基を有するワトソンクリックおよび/またはフーグスティーン水素結合を形成できる、それの天然の、置換された、修飾された、または、変更されたバリアントまたは類似体を指す。

「リンカー」という用語は、1つまたはそれ以上の二価の基であって、―C(O)NH―、―C(O)O―、―NH―、―S―、―S(O)n（式中、nは0、1または2である）、―O―、―OP(O)(OH)O―、―OP(O)(O^-)O―、アルカンジイル、アルケンジイル、アルキンジイル、アレーンジイル、ヘテロアレーンジイル、および、それらの組み合わせなどの2つの他の基の間で共有結合された分子架橋として機能するものを指す。リンカーは、ペンダント側鎖またはペンダント官能基（またはその両方）を有していてもよい。

「レポーター」という用語は、検知可能な信号を直接的または間接的に生成できる、化学的部分を指す。レポーターの例には、化学発光または生物発光手段を通じて信号を発する、蛍光染料基、放射性標識または基が含まれる。蛍光染料基の例には、zanthene、フルオレセイン、ローダミン、BODIPY、シアニン、クマリン、ピレン、フタロシアニン、フィコビリタンパク質、ALEXA FLUOR 350、ALEXA FLUOR 405、ALEXA FLUOR 430、ALEXA FLUOR 488、ALEXA FLUOR 514、ALEXA FLUOR 532、ALEXA FLUOR 546、ALEXA FLUOR 555、ALEXA FLUOR 568、ALEXA FLUOR 568、ALEXA FLUOR 594、ALEXA FLUOR 610、ALEXA FLUOR 633、ALEXA FLUOR 647、ALEXA FLUOR 660、ALEXA FLUOR 680、ALEXA FLUOR 700、ALEXA FLUOR 750、および、スクアライン染料が含まれる。本発明のいくつかの実施形態で使用してもよい蛍光染料レポーターの追加の例が、非特許文献１（2005年）ならびに特許文献１および特許文献２に開示されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。本発明のいくつかの実施形態でレポーターとして使用してもよい放射性標識の例は、当該技術分野で公知の³⁵S、³H、³²Pまたは³³Pなどである。化学発光または生物発光手段により機能し、本発明のいくつかの実施形態でレポーターとして使用してもよいレポーターの例は、非特許文献２（1989年）、非特許文献３（1989年）、非特許文献４（1996年）および非特許文献５（1983年）に記載されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。

「オリゴヌクレオチド」という用語は、本明細書で使用する際、長さが一般に約2～200のヌクレオチドから一般に最大500のヌクレオチドまでの、ヌクレオチドの一本鎖マルチマーを意味する。オリゴヌクレオチドは、合成であっても、酵素的に形成されていてもよく、いくつかの実施形態では、長さが一般に約30～150のヌクレオチドとなっている。オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチドモノマー（すなわち、オリゴリボヌクレオチドであっても）、または、デオキシリボヌクレオチドモノマー、または、リボヌクレオチドモノマーおよびデオキシリボヌクレオチドモノマーの両方を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、本オリゴヌクレオチドは、例えば長さが10～20、11～30、31～40、41～50、51～60、61～70、71～80、80～100、100～150または150～200のヌクレオチドであってもよい。

「プライマー」という用語は、ポリヌクレオチド標的などのポリヌクレオチドテンプレートと二本鎖を形成する際に、核酸合成の開始点として作用することができ、かつ、伸長された二本鎖が形成されるよう、その3’末端からテンプレートに沿って伸長することのできる、天然または合成のオリゴヌクレオチドを意味する。「伸長する」という用語は、本明細書で使用する際、プライマー伸長酵素を使用した、ヌクレオチドの付加による、プライマーの伸長を指す。核酸にアニールされたプライマーが伸長されると、核酸は、伸長反応用のテンプレートとして働く。伸長過程中に付加されるヌクレオチドの配列は、ポリヌクレオチドテンプレートの配列によって決定される。プライマーを、DNAポリメラーゼおよび逆転写酵素などのプライマー伸長酵素によって伸長できる。逆転写酵素は、RNAテンプレートの反対側にデオキシヌクレオチドを組み込んだ、RNA依存性DNAポリメラーゼである。結果として生じるcDNA（相補的DNA）は、DNA依存性DNAポリメラーゼにより、後段のPCRにおいて、DNAテンプレートとして働くことができる。プライマーは一般に、プライマー伸長生成物の合成において、その使用に適合する長さとなっており、通常、10～75、15～60、15～40、18～30、20～40、21～50、22～45、25～40など、長さが8～100のヌクレオチドの間の範囲にあり、より一般的には18～40、20～35、21～30のヌクレオチド長さの間の範囲にあり、記載の範囲の間のいずれかの長さである。通常のプライマーは、15～45、18～40、20～30、21～25などの10～50のヌクレオチド長さの間の範囲にあってもよく、記載の範囲の間のいずれかの長さであってもよい。いくつかの実施形態では、プライマーは通常、長さが約10、12、15、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65または70のヌクレオチドよりも多くはない。

プライマーは通常、増幅で使用するための一本鎖であるが、あるいは、二本鎖の形態で混合物に対して供給されてもよい。二本鎖の場合、プライマーは通常、伸長産物を調製するために使用する前に、そのストランドを分離するために、まず処理される。このため、プライマーは、テンプレートに対して相補的であり、かつ、テンプレートとの水素結合またはハイブリダイゼーションにより複合化して、ポリメラーゼによる合成の開始のためにプライマー/テンプレート複合体を与え、これは、DNA合成の過程でテンプレートに相補的な、3’末端で連結された共有結合された塩基の付加により伸長される。「逆方向プライマー」および「順方向プライマー」という用語は、二本鎖DNA分子中の異なるストランドにハイブリタイズするプライマーを指し、その際、ポリメラーゼによるプライマーの伸長は、他のプライマーに向かう方向となる。cDNA合成は、逆転写酵素（RT）プライマーにより準備（prime）できる。例えば、一連のデオキシチミジンヌクレオチド（オリゴ（dT））を備えるオリゴヌクレオチドを、RNA転写物（RNA transcript）の3'ポリAテールにアニールすることができる。あるいは、RTプライマーを、RNA（標的特異的プライマー）内の複数の配列特異的部位にアニールすることができる。

プライマーの「対」とは、二本鎖ポリヌクレオチド標的を増幅するよう設計された、順方向および逆方向プライマーを指す。いくつかの実施形態では、本組成物、方法およびキットは、標的特異的プライマーの高度に多重化されたセット（例えば、少なくとも5対の標的特異的プライマー、あるいは少なくとも10対、または少なくとも20対、または少なくとも50対、または少なくとも100対、または少なくとも200対、または少なくとも500対、または少なくとも1,000対、または少なくとも2,000対、または少なくとも5,000対、または少なくとも10,000対、または少なくとも20,000対、またはそれ以上）を備えている。

「プライマー伸長試薬」という用語は、ポリヌクレオチド標的などのポリヌクレオチド分子上で、（ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）などの）プライマー伸長反応を行うのに必要または適切な、任意の試薬を指す。プライマー伸長試薬は一般に、プライマー、熱安定性ポリメラーゼまたは逆転写酵素、および、適切なバッファーとの混合物中のヌクレオチドを含んでいる。使用される酵素に応じて、イオン（例えばMg²⁺）も存在していてもよい。cDNA合成は、RNA転写物（オリゴ（dT））の3'ポリAテールに、または、RNA（ランダマー、標的特異的プライマー）内の複数の配列特異的部位にアニールされた、逆方向プライマーにより準備される。

本明細書で使用する際、「ユニバーサル配列」という用語は、セットまたは母集団中の2つまたはそれ以上の核酸分子に、好ましくはセットまたは母集団中の実質的にすべての核酸分子に共通している配列を指し、その際、核分子（nucleic molecule）も、（ポリヌクレオチド標的アンプリコンのセットにおける標的部分などの）互いに異なる部分を有している。ユニバーサル配列が、分子のセットまたは母集団の異なる要素中に存在してもよく、それにより、異なる分子の共通の処理が可能となる。ユニバーサル配列の非限定的な例には、フローセルのキャプチャー配列と同一または相補的な配列が含まれる。同様に、ユニバーサル配列は、ユニバーサル配列の一部（例えばユニバーサルプライマー結合部位）に相補的なユニバーサル増幅プライマーの母集団を使用する、複数の異なる核酸の増幅を可能にできる。

いくつかの実施形態では、ここに記載の標的特異的プライマーは、ユニバーサル配列を備える5’領域を有しており、その結果、ユニバーサル配列またはその補足物を、前のPCR段階において生成される標的アンプリコンに組み込むことができる。ブロック解除されていてユニバーサル配列にハイブリタイズする、ブロックされたユニバーサルプライマーを使用する、後のPCR段階における続く増幅が、PCR混合物中に存在する標的アンプリコンをユニバーサルに増幅するために使用できる。

核酸配列中の位置に関する「上流」および「の5’」という用語は交換可能に使用されて、配列の5’末端にさらに向かう核酸配列中の相対位置を指す。核酸配列中の位置に関する「下流」および「の3’」という用語は交換可能に使用されて、配列の3’末端にさらに向かう核酸配列中の相対位置を指す。

本明細書で使用する際、「ハイブリダイズする」または「ハイブリダイゼーション」という用語は、それにより、核酸のストランドが、塩基対合を通じて相補的なストランドに結合する処理を指す。「ハイブリダイズする」、「ハイブリダイゼーション」という用語は、核酸ストランドが、第2の相補的な核酸ストランドとの通常のハイブリダイゼーション条件下で、アニールして（ホモ二本鎖またはヘテロ二本鎖であれ）安定な二本鎖を形成し、かつ、同じ通常のハイブリダイゼーション条件下で、関係のない核酸分子を有する安定な二本鎖を形成しない処理をも包含する。「二本鎖」または「二本鎖の」という用語は、本明細書で使用する際、塩基対合された（すなわち、互いにハイブリダイズされた）2つの相補的なポリヌクレオチドを説明する。二本鎖の形成は、ハイブリダイゼーション反応において、2つの相補的な核酸ストランドをアニールすることにより達成される。ハイブリダイゼーション処理は、ハイブリダイゼーション反応が起きるハイブリダイゼーション条件（しばしば、ハイブリダイゼーション厳密性（hybridization stringencyと呼ばれる）の調整により、高度に特異的にすることができ、その結果、2つの核酸ストランドの間のハイブリダイゼーションは、この2つの核酸ストランドが、実質的または完全に相補的な特異的配列において、特定の数のヌクレオチドを含んでいない限り、安定な二本鎖を形成しないことになる。「通常のハイブリダイゼーション」または「通常の厳密性条件」は、所与のハイブリダイゼーション反応について、容易に決定できる。

「相補的」という用語は、高い厳密性条件下で、互いにハイブリダイズする2つの核酸を指す。「完全に相補的」という用語は、核酸のうちの1つの各塩基が、他の核酸中の相補的なヌクレオチドと塩基対合する、二本鎖を指す。多くの場合、相補的な2つの配列は、相補性の少なくとも10（例えば、少なくとも12または15）のヌクレオチドを有する。対照的に、2つの核酸が「相補的でない」場合、それらは互いにハイブリダイズしないが、2つのストランドが、本方法で使用される、上に規定した条件下で、一本鎖の形態のままであれば、いくつかの配列適合（sequence match）（すなわち、100％未満の度合いで非相補的）が許容されてもよい。

「増幅する」という用語は、ポリヌクレオチド標的などのテンプレート核酸の1つまたは両方のストランドに相補的な核酸分子を合成する処理を指す。核酸分子を増幅することは、テンプレート核酸を変性させること、プライマーの融点未満の温度で、プライマーをテンプレート核酸にアニールすること、および、プライマーから酵素的に引き伸ばして、増幅産物を生成することを含んでいてもよい。変性、アニールおよび引き伸ばしステップはそれぞれ、1度またはそれ以上の回数、行うことができる。ある場合、変性、アニールおよび引き伸ばしステップは、増幅産物の量が増加するよう（それも、しばしば急激に）、複数回行われるが、急激な増幅は本方法では要求されない。増幅には通常、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、DNAポリメラーゼ酵素、および、適切なバッファー、および/または、ポリメラーゼ酵素の最適な活性のための補因子の存在が必要である。「増幅産物」または「アンプリコン」という用語は、本明細書に規定する増幅処理により生成される、核酸配列を指す。逆転写は、デオキシリボヌクレオシド三リン酸を使用してcDNA（相補的DNA）にRNAを転写するために特殊なDNAポリメラーゼ（逆転写酵素）を用いる、直線的増幅反応である。RT-PCRが単一容器中で行われる場合、バッファーおよび補因子は、逆転写酵素およびPCR酵素の両方の最適な活性を支持しなければならない。

「識別子」という用語は、a）反応中のポリヌクレオチドの起源を識別および/または追跡するため、b）最初の分子を何度配列したかを計数するため、および、c）同じ分子の異なるストランドからの配列読み取り（sequence read）を対合するために使用できる、ヌクレオチドの配列を指す。

「アダプター」という用語は、シーケンシングに備えて、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド標的または標的アンプリコンに付着された核酸を指す。アダプターは、プライマー伸長、ライゲーションまたは他の技術により、付着させることができる。アダプターは一本鎖であっても、または二本鎖であってもよく、DNA、RNAおよび/または人工ヌクレオチドを備えていてもよい。アダプターは、ポリヌクレオチドの末端に配置されていてもよく、または、中間部または内部に配置されていてもよい。アダプターは、後段のプライマー伸長段階用もしくはシーケンシング用にプライマー結合部位を設ける、または、識別子を設けるなど、1つまたはそれ以上の機能領域をポリヌクレオチドに付加できる。例として、アダプターは、ユニバーサルプライマーおよび/もしくはシーケンシング用のプライミング部位（priming site）を含むユニバーサルプライミング部位、および/または、NGSシーケンシングシステム用の捕捉部位（capture site）を含んでいてもよい。

「ポリヌクレオチド標的」という用語は、対象となるポリヌクレオチドを指す。単離されたポリヌクレオチド標的分子とは、他のポリヌクレオチド標的分子を含まない組成物中に存在する単独の分子を指す。

「領域」という用語は、一本鎖または二本鎖であってもよいヌクレオチドの配列を指す。

他の用語の定義は、明細書全体を通じて明らかになる場合があり、または、明細書から理解できる場合がある。

標的特異的プライマーおよびユニバーサルプライマーの正確なヌクレオチド配列は一般に、本技術に対して重要でなく、本開示の教示に基づいてユーザーが選択してもよい。

特に定義されない限り、本明細書で使用する科学技術用語は、本開示の属する分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。

本明細書で参照するすべての特許および印刷物は、そうした特許および出版物に開示されたすべての配列を含めて、参照により明示的に組み込まれる。

一局面として、本開示は、容器中でプライマー伸長混合物を調製することにより、閉じた容器内で多段階プライマー伸長反応を行うための方法を提供し、混合物は、i）ポリヌクレオチド標的、ii）ブロック解除されたプライマー、および、iii）ブロックされたプライマーを備えている。混合物は一般に、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（dNTP）などの他のプライマー伸長試薬、DNAポリメラーゼまたは他のプライマー伸長酵素、および、バッファーを含むことになる。いくつかの実施形態では、ブロック解除されたプライマーまたはブロックされたプライマーは、標的特異的プライマーを備えている。標的特異的プライマーは、5’領域および3’領域を備えており、3’領域は標的特異的配列を備えており、5’領域はユニバーサル配列を備えている。ユニバーサルプライマーは、ユニバーサル配列またはその相補的な配列を、かつ、その3’末端に光開裂型保護基を備えている。いくつかの実施形態では、容器は混合物の調製後に閉じられ、前段のポリメラーゼ連鎖反応が混合物で行われて、標的アンプリコンまたは標的cDNAが生成される。ブロックされたプライマーは、ユニバーサル配列またはその相補的な配列を備えるブロック解除されたプライマーを生成するために、混合物中でブロック解除することができる。いくつかの実施形態では、ブロック解除は、容器を開くことなく行われる。後段のプライマー伸長反応は、ブロック解除されたプライマーおよび標的アンプリコンまたは標的cDNAで行うことができ、その際、ブロック解除されたプライマーは標的アンプリコンを増幅する。いくつかの実施形態では、ブロック解除および/または後段のプライマー伸長反応を、ブロックされたプライマーを閉じた容器内で紫外光に暴露するなど、ブロックされたユニバーサルプライマーから保護基を光開裂させることにより行う。

追加的な局面では、本技術は、プライマー伸長反応を行うための新規な組成物に関し、組成物は、a）ポリヌクレオチド標的、b）前段用のブロック解除されたプライマー、および、c）後段用のブロックされたプライマーを備えている。いくつかの局面では、標的特異的プライマーは、5’領域および3’領域を備えており、3’領域は標的特異的配列を備えており、5’領域はユニバーサル配列を備えている。他の局面では、ユニバーサルプライマーは、ユニバーサル配列またはその一部および光開裂型保護基を備えている。いくつかの局面では、組成物は、組成物を調製した後に閉じられる容器中で調製される。他の局面では、ユニバーサルプライマーは、紫外光への暴露または他の光開裂技術により、ブロック解除される。

他の局面では、本技術は、上述したように、本方法を実行するためのキットに関する。いくつかの実施形態では、キットは、上述したように、多段階プライマー伸長反応用の組成物を備えていてもよい。いくつかの実施形態では、キットは、標的特異的プライマーまたは逆転写酵素プライマーなどのブロック解除されたプライマーと、ユニバーサルプライマーまたは標的特異的プライマーなどのブロックされたプライマーとを備える混合物を備えていてもよい。いくつかの実施形態では、キットは、ブロック解除された標的特異的プライマーおよびブロックされたユニバーサルプライマーの混合物を収容する容器を備えている。

いくつかの実施形態では、キットは、ブロック解除されたRTプライマーおよびブロックされた標的特異的プライマーの混合物を収容する容器を備えている。

本方法および組成物のいくつかの実施形態では、前段のプライマーが、0.01～0.5μMの範囲の濃度で存在し、後段のプライマーが、0.2～1μMの範囲の濃度で存在する。マルチプレックスPCR用のいくつかの実施形態では、標的特異的プライマーが、0.01～0.5μMの範囲の濃度で存在し、ユニバーサルプライマーが、0.2～1μMの範囲の濃度で存在する。RT-PCR用のいくつかの実施形態では、RTプライマーが、0.01～0.5μMの範囲の濃度で存在し、ブロックされた標的特異的プライマーが、0.2～1μMの範囲の濃度で存在する。

組成物、方法およびキットは、ゲノムDNA、ミトコンドリアDNA、メッセンジャーRNA、マイクロRNAなどのポリヌクレオチド標的に対して、多段階プライマー伸長反応を行うために用いることができる。ポリヌクレオチド標的は、植物、動物（例えば、爬虫類、哺乳類、昆虫、蠕虫、魚類など）、組織試料、バクテリア、菌類（例えば酵母菌）、ファージ、ウイルス、死体組織、考古学/古代の試料などを含むがこれに限定されない、事実上あらゆる有機体から得ることができる。いくつかの実施形態では、試料は、ヒト、マウス、ラットまたはサル細胞などの哺乳類細胞からのポリヌクレオチド標的を含んでいてもよい。試料は、臨床試料（例えば、組織生検、掻き落とし（scrape）もしくは洗浄）の培養細胞、または、法医学試料の細胞（例えば、犯罪現場で収集された試料の細胞）から得てもよい。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド標的は、細胞、組織、体液および排泄物などの生体試料から得てもよい。対象となる体液は、血液、血清、血漿、唾液、粘液、痰、脳脊髄液（cerebral spinal fluid）、胸膜液、涙、乳管液（lactal duct fluid）、リンパ、喀痰、滑液、尿、羊水および精液を含むが、これに限定されない。特定の実施形態では、体液は、被検対象（例えばヒト）から得てもよい。

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド標的は、臨床試料（例えば、癌、炎症性疾患または妊娠などの疾患または状態を有する、または、有すると疑われる患者）から得るDNAまたはRNAを備えている。いくつかの実施形態では、試料は、保管された患者試料（例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋組織試料）からポリヌクレオチド標的を抽出することにより、作成してもよい。いくつかの実施形態では、患者試料は、体液（例えば末梢血）からの無細胞循環DNAの試料であってもよい。いくつかの実施形態では、本方法の前段で使用するポリヌクレオチド標的は、事前に変性されていない非増幅DNAである。他の実施形態では、試料中のポリヌクレオチド標的は、（例えば、FFPE試料および循環無細胞DNA（cfDNA）（例えばctDNA）の場合のように）一部がすでに断片化されていてもよい。いくつかの実施形態では、組成物、方法およびキットを、ポリA断片化mRNAを含むRNAからの、事実上あらゆる有機体または試料タイプからのポリヌクレオチド標的に対し、多段RT-PCRを行うために用いることができる。

ブロックされた3’末端を備える後段のプライマー
いくつかの実施形態では、後段のプライマーは、化学式Iに係る組成物であって、

式中、R1はHまたはOHである。

化学式I中の塩基は、シトシン、ウラシル、チミン、アデニンもしくはグアニン、または、それらの修飾ピリミジンおよびプリン誘導体である。塩基は、核酸中に普通に見られる種類の置換または非置換の窒素含有親芳香族複素環のいずれかであっても、かつ、適切な相補的塩基とワトソンクリックおよび/またはフーグスティーン水素結合を形成できる、天然の、置換された、修飾された、または、変更されたバリアントまたはそれらの類似体であってもよい。

化学式I中の開裂型末端部分（Cleavable Terminating Moiety）は、ポリメラーゼ終結特性（polymerase termination property）を化合物に付与する基である。いくつかの実施形態では、開裂型末端部分は、化学式

に係る部分であって、式中、R3はアルキル（C≦8）または置換アルキル（C1-8）であり、R4は、水素、ヒドロキシ、ハロー、アミノ、ニトロ、シアノ、アジドまたはメルカプトであり、アルキル（C≦6）、アシル（C≦6）、アルコキシ（C≦6）、アシルオキシ（C≦6）、アルキルアミノ（C≦6）、ジアルキルアミノ（C≦6）、アミド（C≦6）、または、これらの基のいずれかの置換型（substituted version）であり、R5およびR6はそれぞれ独立していて、水素、ヒドロキシ、ハロー、アミノ、ニトロ、シアノ、アジドまたはメルカプトであり、アルキル（C≦6）、アルケニル（C≦6）、アルキニル（C≦6）、アリール（C≦6）、アラルキル（C≦8）、ヘテロアリール（C≦6）、アシル（C≦6）、アルコキシ（C≦6）、アシルオキシ（C≦6）、アルキルアミノ（C≦6）、ジアルキルアミノ（C≦6）、アミド（C≦6）、または、これらの基のいずれかの置換型であり、化学式

または

の基であり、式中、Xは―O―、―S―もしくは―NH―、またはアルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アルキンジイル(C≦12)、またはこれらの基のいずれかの置換型であり、Yは―O―、―NH―、アルカンジイル(C≦12)または置換アルカンジイル(C≦12)であり、nは0～6の整数であり、mは0～6の整数、またはリンカーレポーター（-linker-reporter）、または塩、互変異性体、またはそれらの光学異性体である。

化学式I中の任意のリンカーは、1つまたはそれ以上の二価の基であって、―C(O)NH―、―C(O)O―、―NH―、―S―、―S(O)n（式中、nは0、1または2である）、―O―、―OP(O)(OH)O―、―OP(O)(O^-)O―、アルカンジイル、アルケンジイル、アルキンジイル、アレーンジイル、ヘテロアレーンジイル、および、それらの組み合わせなどの2つの他の基の間で共有結合された分子架橋として機能するものを指す。いくつかのリンカーは、ペンダント側鎖またはペンダント官能基（またはその両方）を有している。任意のレポーターは、検知可能な信号を直接的または間接的に生成できる化学的部分である。レポーターの例には、化学発光または生物発光手段を通じて信号を発する、蛍光染料基、放射性標識または基が含まれる。いくつかの実施形態では、レポーターは、キサンテン、フルオレセイン、ローダミン、BODIPY、シアニン、クマリン、ピレン、フタロシアニン、フィコビリタンパク質、および、それらの誘導体からなる群から選択される。

化学式I中のプライマーは、ポリヌクレオチド標的と二本鎖を形成できる、オリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、プライマーは、8～100個のヌクレオチドの長さ、あるいは10～75、15～60、15～40、18～30、20～40、21～50、22～45もしくは25～40個のヌクレオチドの長さ、または、本明細書に開示する別の範囲内の別の長さとなっている。

いくつかの実施形態では、ユニバーサルプライマーは、（a）5-[(S)-1-(5-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチルプロピルオキシ]メチル-2'-デオキシウリジン、（b）5-[(S)-1-(5-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチルプロピルオキシ]メチル-2'-デオキシアデノシン、（c）5-[(S)-1-(5-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチルプロピルオキシ]メチル-2'-デオキシグアノシン、（d）5-[(S)-1-(5-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチルプロピルオキシ]メチル-2'-デオキシシチジン、（e）5-[(S)-1-(5-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチルプロピルオキシ]メチル-2'-デオキシチミジン、および、それらの混合物からなる群から選択される3’末端ヌクレオチドを備え、式中、ヌクレオチドは、リンカーおよび/またはレポーターと任意に置換されている。例示的な混合物には、ヌクレオチド（a）および（b）、ヌクレオチド（a）、（b）および（c）、ヌクレオチド（a）、（b）、（c）および（d）、ヌクレオチド（a）、（b）、（c）、（d）および（e）、ヌクレオチド（b）および（c）、ヌクレオチド（b）、（c）および（d）、ヌクレオチド（b）、（c）、（d）および（e）、ヌクレオチド（a）および（c）、ヌクレオチド（a）および（d）、ヌクレオチド（a）および（e）、ヌクレオチド（a）、（b）および（d）、ヌクレオチド（a）、（c）および（d）、ヌクレオチド（a）、（c）、（d）および（e）、ヌクレオチド（a）、（b）、（d）および（e）、ヌクレオチド（a）、（b）、（c）および（e）、ヌクレオチド（b）および（d）、ヌクレオチド（c）および（d）、ヌクレオチド（b）および（e）、ヌクレオチド（c）および（e）、ヌクレオチド（b）、（c）および（e）、ヌクレオチド（b）、（d）および（e）、ヌクレオチド（c）、（d）および（e）、ヌクレオチド（d）および（e）、ならびに、任意の他の混合物が含まれる。
マルチプレックスおよび多段PCR用の方法、組成物およびキット
別の局面として、本開示は、マルチプレックス核酸増幅の効率を向上するための方法および組成物を提供する。本開示はまた、多段核酸増幅の効率（特に、同じ反応混合物または容器中で順に起きるよう設計された、2つまたはそれ以上の増幅反応の性能）を向上するための試薬および方法に関する。特に、プライマーダイマーおよび異常な増幅産物の形成を低減してきた組成物を提供する。ブロックされたプライマーは、UV非ブロック化（UV deblocking）前に、延長可能な二本鎖を形成しない。UV非ブロック化後に、これらはプライマー伸長可能なプライマーとなる。このようなプライマーは、前および後の増幅反応が単一の反応混合物または容器中で起きる場合に、特に有用である。これに関するマルチプレックスおよび多段PCR増幅反応および試薬に関する追加の情報は、その全体を参照により本明細書に組み込む、特許文献３中にある。

別の局面では、本技術は、前段のプライマーとしてブロック解除されたRTプライマーを、かつ、後段のプライマーとしてブロックされたプライマーを使用する、多段RT-PCRに関する。例えば、後段のプライマーは、その3’末端に光開裂型保護基を備える標的特異的プライマーを備えていてもよい。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチド標的は、前段において、逆転写酵素により、ブロック解除されたRTプライマーで逆転写されて、標的cDNAを生成する。RTプライマーの例には、オリゴ（dT）プライマー、ランダマー（N6-Nn、式中、nは7、8、9もしくは10などの整数であってもよい）、または、標的特異的RTプライマーが含まれる。次いで、標的cDNAは、後段のPCR中に、保護基の光開裂によりブロック解除されている標的特異的プライマーなどにより、増幅される。

本技術は、2つまたはそれ以上の標的配列が並行して増幅される、マルチプレックス核酸増幅に特に関係する。これは通常、単独の核酸増幅反応において、ポリヌクレオチド標的特異的プライマーの１つより多い対を含めることにより実現される。

本技術はまた、2つまたはそれ以上の別個の増幅反応が起きる、多段核酸増幅に関係する。通常、前の増幅反応では、ポリヌクレオチド標的分子を増幅する標的特異的プライマーを利用する。標的特異的プライマーは、5’領域および3’領域を含んでおり、3’領域は標的特異的配列を備えており、5’領域はユニバーサル配列を備えている。ユニバーサル配列は、反応が進む際に、増幅産物に組み込まれる。後の増幅反応では、ユニバーサル配列の補足物とハイブリダイズするのに十分なユニバーサル配列またはその一部を備えるユニバーサルプライマーを使用して、前の増幅の増幅産物を増幅する。

本方法は通常、各段階内に、複数のプライマー伸長サイクルを備えることになる。例えば、前段は、少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10もしくはそれ以上のプライマー伸長サイクル、および/または、最大20、18、16、14、12またはそれ以下のPCRサイクルを備えていてもよい。同様に、後段は、少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10もしくはそれ以上のプライマー伸長サイクル、および/または、最大20、18、16、14、12またはそれ以下のプライマー伸長サイクルを備えていてもよい。本方法はまた、追加のプライマー伸長段階を、前段および/または後段の前または後に備えていてもよい。例えば、より高い品質の入力ポリヌクレオチドを前段用に供給するために、前段に、プライマー伸長段階を先行させてもよく、かつ、より高い品質の出力ポリヌクレオチドをシーケンシングまたは他の用途のために供給するために、PCR段階を後段に続けてもよい。

いくつかの実施形態では、この後の増幅には、さらなる下流の処理および識別目的のために必要となる可能性があるため、追加の配列を組み込むユニバーサルプライマーが含まれる。ゆえに、ユニバーサル増幅は、後の増幅が、増幅される最初の標的分子の特異的標的配列から独立して行われるという事実に支配される。ユニバーサル増幅は、後の増幅でプライマー結合部位として作用できる追加の配列（本明細書に記載されるように、ユニバーサル配列）の前の増幅反応からの増幅産物への組み込みに依存している。ゆえに、後の増幅におけるプライマーのプライマー領域は、ユニバーサル配列に対応する。このようなプライマー領域を含むプライマーを、本明細書において「ユニバーサルプライマー」と呼ぶ。

本技術のユニバーサルプライマーは、その3’末端に光開裂型保護基を備えている。ブロックされたユニバーサルプライマーは、PCR増幅段階中に存在していたとしても、PCR増幅に関して不活性である。本技術の3’保護基は光開裂型であるため、ブロックされたユニバーサルプライマーを紫外光に暴露することまたは他の光開裂技術により除去できる。紫外光暴露により、保護基が除去され、PCR増幅に関して活性のユニバーサルプライマーが生成される。ゆえに、本技術のユニバーサルプライマーは、標的特異的PCR増幅の前段中、存在していてもブロックされていて実質的に不活性の状態とすることができ、次いで、ユニバーサルPCR増幅の後段の前に紫外光に暴露することにより活性化できる。

本技術により増幅されることになるポリヌクレオチド標的は、一般に限定されない。いずれの適切なポリヌクレオチド標的分子を、本技術の試薬および方法を使用して、増幅してもよい。複数の異なるポリヌクレオチド標的分子を標的としてもよい。これは、複数のポリヌクレオチド標的特異的プライマー対の使用を含んでいてもよい。ゆえに、ポリヌクレオチド標的という用語は一般に、増幅が始まる前に存在する最初のポリヌクレオチド標的分子の一部としてであれ、または、増幅中に生成されるポリヌクレオチド標的アンプリコン分子としてであれ、増幅されることになる核酸分子の所望の配列を指す。

ポリヌクレオチド標的は、DNA分子またはRNA分子を備える、または、DNA分子またはRNA分子から派生した分子である。RNAは、上述したように、DNAと同じ試料タイプから得ていてもよい。RNAは、メッセンジャーRNA（mRNA）、マイクロRNA（miRNA）などであってもよい。いくつかの実施形態では、RNAは、逆転写酵素を使用して逆転写され、次いで本技術を使用して増幅できる相補的DNA（cDNA）分子を形成する。

本技術の標的特異的プライマー対は、ポリヌクレオチド標的を増幅するよう設計されており、一般にユニバーサル配列を組み込んでいる。ユニバーサル配列は、最初のポリヌクレオチド標的分子とハイブリダイズしない。この機能は、標的特異的プライマーの標的特異的3’領域により提供される。しかし、ユニバーサル配列が増幅産物に組み込まれてしまうと、次いでそれら（または、それらの補足物）は、ユニバーサルプライマーが後の増幅ステップでハイブリダイズするプライマー結合部位として作用できる。

いくつかの実施形態によれば、ユニバーサル増幅用の後のPCR段階を、後のアンプリコンに1つまたはそれ以上のアダプター配列を含めるためにも使用してもよい。アダプター配列は、下流の処理にとって適切ないずれの配列であってもよい。下流の処理は、そのポリヌクレオチド標的またはアンプリコンが試料から検知および/または定量化されることを可能にする。例えば、適切な固体表面に固定されたオリゴヌクレオチドに対して相補的なアダプター配列により、このようなアダプターを固定されるように組み込む配列が可能となる。他の用途は、液体中のオリゴヌクレオチドにハイブリタイズするアダプターに依存している。アダプターは、配列ベースまたはシーケンシングベースの分析に有用な場合がある。いくつかの実施形態では、アダプター配列は、高処理量の核酸シーケンシングに適した、いずれかのアダプター配列であってもよい。このようなシーケンシングは通常かつ好ましくは、次世代シーケンシング（NGS）プラットフォームを使用して行われる。

いくつかの実施形態では、ユニバーサルプライマーは、1つまたはそれ以上のプライマー結合部位をさらに備えている。例えば、第1の（または順方向）ユニバーサルプライマーは、第1のプライマー結合部位を備えていてもよく、第2の（または逆方向）ユニバーサルプライマーは、第2のプライマー結合部位を備えていてもよく、第1および第2のプライマー結合部位は、異なるプライマーと結合するよう構成されている（例えば、第1および第2のプライマー結合部位は、実質的に同じ配列を有しておらず、実質的に相補的である）。第1および/または第2のプライマー結合部位は、シーケンシングプライマー結合部位、キャプチャープライマー結合部位（capture primer binding site）、または、それらの組み合わせであってもよい。例えば、第1のユニバーサルプライマーは、第1のフローセル増幅プライマー結合部位を備えていてもよく、第2のユニバーサルプライマーは、第2のフローセル増幅プライマー結合部位を備えていてもよい。第1のプライマー結合部位がシーケンシングプライマー結合部位であるときに、いくつかの実施形態では、第1のユニバーサルプライマーは、第1のプライマー結合部位の上流に、識別子をさらに備えている。例えば、第1のユニバーサルプライマーは、識別子の上流にユニバーサルキャプチャー配列を備えていてもよい。第2のプライマー結合部位がシーケンシングプライマー結合部位であるときに、いくつかの実施形態では、第2のユニバーサルプライマーは、第2のプライマー結合部位の下流に、インデックスをさらに備えている。例えば、第2のユニバーサルプライマーは、識別子の下流にユニバーサルキャプチャー配列またはその補足物を備えていてもよい。第1のユニバーサルプライマーがインデックスを備えていないときに、いくつかの実施形態では、ユニバーサル捕捉部位（universal capture site）は、第1のプライマー結合部位の上流にある。

いくつかの実施形態では、本技術のさまざまなプライマーを、増幅産物に1つまたはそれ以上の識別子（インデックスまたはバーコードとも呼ばれる）を付加するためにも使用してもよい。前の増幅で使用する標的特異的プライマーに関係する本技術のいくつかの局所に関し、試料識別子および/または分子識別子がプライマー中に好適に含まれる。特定の実施形態では、識別子は、2～36個のヌクレオチド、または6～30個のヌクレオチド、または8～20個のヌクレオチドの範囲の長さを有していてもよい。いくつかの実施形態では、識別子は、「縮重塩基領域（degenerate base region）」すなわち「DBR」を含んでいてもよく、その際、「縮重塩基領域」および「DBR」とは、DBRが付加されている断片同士を区別するのを助けるのに十分な複合性を有する種類の分子識別子を指す。

「試料識別子」という用語は、ポリヌクレオチドに付加できる種類の分子識別子を指し、その際、配列は、ポリヌクレオチドの起源（すなわち、ポリヌクレオチドが派生する試料からの試料）を識別する。使用に際し、各試料は、異なる試料識別子配列でタグ付けされ（例えば、1つの配列が各試料に追加され、その際、異なる試料が異なる配列に追加され）、タグ付けされた試料は貯留される。貯留された試料を配列したのち、試料識別子配列を使用して、配列の起源を識別できる。「分子識別子」という用語は、ポリヌクレオチドに付加できる種類の識別子を指し、その際、配列により個々のポリヌクレオチドまたはそのアンプリコンが識別される。

いくつかの実施形態では、ユニバーサルプライマーは、第1および第2のユニバーサルプライマーを備えており、その際、第1のユニバーサルプライマーは、5’～3’オーダーで、（i）第1のアダプター配列、（ii）分子識別子、（iii）第1のユニバーサル配列の少なくとも一部と（5’から3’の方向において）同一のユニバーサルプライマー領域を備えており、かつ、第2のユニバーサルプライマーは、5’～3’オーダーで、（i）第2のアダプター配列、（ii）試料識別子、（iii）第2のユニバーサル配列の少なくとも一部と（5’から3’の方向において）同一のユニバーサルプライマー領域を備えている。

いくつかの実施形態では、本技術により、単一の反応混合物中でマルチプレックスおよび多段PCR反応を行うための方法が提供される。いくつかの実施形態では、PCR混合物中において、ポリヌクレオチド標的で開始し、ユニバーサル配列を含む関連する増幅産物を生成するまでの、かつ、ユニバーサル配列を含む関連する増幅産物を生成することを含む、すべての増幅ステップ（すなわち、前および後のPCR段階）が、成分を分離、除去または付加する必要なしに行われる。いくつかの実施形態では、ユニバーサルプライマーのない混合物中で標的特異的増幅段階を行う必要がなく、または、前段と後段との間でユニバーサルプライマーを付加する必要がなく、または、ユニバーサル増幅の前に、前の増幅産物を精製する必要がない。いくつかの実施形態では、本方法のために（すなわち、さらなる増幅産物を生成するために）必要なPCR試薬すべてが、先の増幅段階が行われる前に組み合わされる。ゆえに、本方法は、単一の反応容器中で、PCR反応混合物成分すべてが加えられた後に容器を開くことなく行うことができる。反応混合物が形成されてしまうと（増幅自体（例えば熱サイクリング）を行うことは別として）、ユニバーサル増幅産物が生成されてしまうまでは、反応容器を、さらに操作し、または開く必要はない。ゆえに、本方法は、「閉じた容器」の方法であるとみなすことができる。本方法は、前および後段の間にユーザーがユニバーサルプライマーを加える必要がない点で、極めて好適である。

いくつかの実施形態では、プライマー伸長段階すべてが、混合物中のポリヌクレオチド標的で始めて、ユニバーサル配列を含む関係する標的増幅産物を生成するまでの、かつ、ユニバーサル配列を含む関係する標的増幅産物を生成することを含め（すなわち、前および後段のプライマー伸長段階の両方）、成分を分離、除去または付加する必要なしに行われる。いくつかの実施形態では、ユニバーサルプライマーのない混合物中で標的特異的増幅段階を行う必要がなく、または、前段と後段との間でユニバーサルプライマーを付加する必要がなく、または、ユニバーサル増幅の前に、前の標的増幅産物を精製する必要がない。いくつかの実施形態では、本方法のために（すなわち、さらなる増幅産物を生成するために）必要なプライマー伸長試薬すべてが、先の増幅段階が行われる前に、組み合わされる。ゆえに、本方法は、単一の反応容器中で、反応混合物成分の成分すべてが加えられた後に容器を開くことなく行うことができる。反応混合物が形成されてしまうと（増幅自体（例えば熱サイクリング）を行うことは別として）ユニバーサル増幅産物が生成されてしまうまでは、反応容器を、さらに操作し、または開く必要はない。ゆえに、本方法は、「閉じた容器」の方法であるとみなすことができる。本方法は、前および後段の間にユーザーが後段のプライマーを加える必要がない点で、極めて好適である。

本方法は、ユニバーサル増幅産物の生成後（すなわち、ユニバーサルまたは後段の増幅後）に追加のステップを行うことをも包含している。このような方法は、同じ反応混合物または反応容器に限定されない。このような方法は、ポリヌクレオチド標的分子を任意で定量化することを検知することを含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、本技術の方法を使用して、特定のポリヌクレオチド標的分子を識別し、かつ任意で定量化する。他の実施形態では、本方法は、さらなる増幅産物を配列することをさらに備えている。シーケンシングは通常、次世代シークエンシング（NGS）技術を使用することによるなど、多分に並行して行われる。シーケンシングは、本技術の増幅反応の反応混合物とは異なる反応混合物中で行われてもよい。

本技術は、2つまたはそれ以上の別個の増幅反応が単一の容器中で起きる、多段階RT-PCR反応にも関係する。cDNA合成が、標的特異的PCRプライマーの3’末端を光開裂型保護基でブロックすることにより、PCRから独立して行われる。cDNA合成は、逆転写酵素にとって最適な定温で、さもなくば非特異的に相互反応をしてプライマーダイマーおよび他の人工産物（artifact）を生成するPCRプライマーの干渉なしに行われる。ゆえに、本技術の標的特異的PCRプライマーは、cDNA合成中に存在し得るが実質的に不活性であってもよく、次いで、（PCRなどの）後段のプライマー伸長反応の前に紫外光に暴露することにより活性化してもよい。多段階mPCR反応について上述したように、RT-PCR方法は、単一の容器中で、さらなる操作なしに行うことができる。

本開示により、本明細書で説明するように、本方法を実行するためのキットも提供される。いくつかの実施形態では、キットは、上述したように、多段階PCR用の組成物を備えていてもよい。いくつかの実施形態では、キットは、標的特異的プライマーと、その3’末端に光開裂型保護基を有するブロックされたユニバーサルプライマーとを備えるPCR混合物を備えていてもよい。標的特異的プライマーおよびブロックされたユニバーサルプライマーは、単一の容器内の混合物中にあってもよい。本技術のキットは、多段階PCRを行うための適切な試薬（例えばバッファーなど）を追加で備えていてもよい。キットのさまざまな成分が別個の入れ物中に存在していてもよく、または、特定の適合した成分を、所望のとおり、単一の入れ物へと事前に組み合わせてもよい。上述した試薬に加えて、キットは上述した方法で使用される追加の成分のいずれか（例えば、1つまたはそれ以上の酵素および/またはバッファーなど）を含んでいてもよい。

いくつかの実施形態では、キットは、上述したように、多段階RT-PCR用の組成物を備えていてもよい。いくつかの実施形態では、キットは、cDNA合成プライマー（オリゴ（dT）またはランダマー）と、その3’末端に光開裂型保護基を有する標的特異的プライマーとを備えるRT-PCR混合物を備えていてもよい。cDNA合成およびブロックされた標的特異的プライマーは、単一の容器内の混合物中にあってもよい。本技術のキットは、多段階RT-PCRを行うための適切な試薬を追加で備えていてもよく、それらは上述したいずれかの形式で提供されてもよい。

上記の成分に加えて、キットは、本方法を実行するためにキットの成分を使用するための指示（すなわち、ポリヌクレオチド標的の多段階増幅用の指示）をさらに含んでいてもよい。本方法を実行するための指示は、適切な記録媒体に記録されていてもよい。例えば、指示は、紙またはプラスチックなどの基板に印刷されてもよい。そのようにして、指示は、添付文書としてキット中に、キットの入れ物のラベル付けまたはキットの部品（すなわち、包装もしくはサブパッケージに関連して）中などにあってもよい。他の実施形態では、指示は、適切なコンピューター可読記憶媒体（例えばCD-ROM、ディスケットなど）に存在する電子記憶データファイル（electronic storage data file）として存在する。さらに他の実施形態では、実際の指示はキット中に存在せず、例えばインターネットを介して、遠方の情報源から指示を得るための手段を提供する。この実施形態の例が、指示を閲覧できる、かつ/または、指示をダウンロードできるウェブアドレスを含むキットである。指示に関し、指示を得るためのこの手段は、適切な基板に記録される。

光開裂型保護基
本技術は、3’末端で光開裂型保護基により可逆的にブロックされているプライマーを含んでいる。これらのブロックされたプライマーは、前段のプライマー伸長反応中に存在していてもよいが、この段階中には伸長からブロックされる。ブロック解除されたのち、それらは、後段のプライマー伸長反応中に伸長可能となる。本技術の光開裂型保護基は、後段のプライマーの3’末端に付着されるヌクレオチドをふくんでおり、そこでこれらはPCR増幅をブロックする。ブロックされたプライマーは、紫外光への暴露または他の光開裂技術によりブロック解除されて活性化されるまで、PCR増幅に対して実質的に不活性である。多種多様な光開裂型保護基を、その全体を参照により本明細書に組み込む特許文献４、特許文献５および特許文献６に記載されたものなど、後段のプライマー中に含めることができる。本後段のプライマーは、ブロック解除されるまでPCR増幅に対して実質的に不活性となるよう、その3’末端にいずれかの光開裂型保護基を備えていてもよい。いくつかの実施形態では、光開裂型保護基は、約90％～約100％のブロッキング効率を有している。

光開裂型保護基は、DNA合成を可逆的にブロックおよび終了し、次いで紫外光への暴露により効率的に開裂され、それによりプライマーを始動させるよう設計されている。いくつかの実施形態では、光開裂型保護基は、塩基アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、または、7-ヒドロキシル-7-デアザ-アデニン/グアニン（7-Hydroxyl-7-deaza-adenine/guanine）などのそれらの修飾ピリミジンおよびプリン誘導体を含む、ヌクレオチド化合物の形態である。他の実施形態では、開裂型の基は誘導体化されて、染料などのレポーターを含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、塩基アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、または、それらの修飾ピリミジンおよびプリン誘導体は、2-ニトロベンジル基などの光開裂型防護基（photocleavable protecting group）へと共有結合していてもよい。いくつかの実施形態では、2-ニトロベンジル基は、そのDNA合成の終結を促進するために、誘導体化されている。2-ニトロベンジル基などの光開裂型保護基も、いくつかの実施形態では、蛍光染料で、光開裂型保護基への共有結合により、誘導体化できる。

いくつかの実施形態では、光開裂型保護基は、2-ニトロベンジル基と共有結合したヌクレオチドの塩基を備えており、2-ニトロベンジル基のアルファ炭素位置が、1つのアルキルまたはアリール基で任意に置換されている。他の実施形態では、2-ニトロベンジル基を、終結および保護特性ならびに光触媒脱保護率（light catalyzed deprotection rate）を高めるために、官能化してもよい。他の実施形態では、2-ニトロベンジルの、かつ、塩基に付着した、アルファ炭素置換された2-ニトロベンジル基の終結および保護特性は、リボース糖上の3'-OH基がブロック解除されている場合であっても生じる。いくつかの実施形態では、光開裂型保護基は、複数の市販のDNAポリメラーゼによって忍容性が良く（well-tolerated）なるよう選択される。いくつかの実施形態では、アルファ炭素置換された2-ニトロベンジル基も、選択された蛍光染料または他のレポーターを含むよう、誘導体化されていてもよい。

光開裂型保護基を調製する方法
光開裂型保護基は、DNA合成および開裂を速やかに終結するよう設計された光開裂型防護基を含むヌクレオチド化合物の形態である。これらは、DNAポリメラーゼでテンプレートにアニールされたプライマー前駆体の一塩基伸長、あるいは、末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（TdT）でのテンプレート非依存性のプライマー前駆体の一塩基伸長などにより、プライマー前駆体の3’末端に結合および付加されている。したがって、光開裂型保護基を備えるユニバーサルプライマーは、さらなる伸長に関して不活性である。

別の実施形態では、光開裂型保護基を備えるヌクレオチドは、ユニバーサルプライマーの3’末端に付着できる化学式に係る化合物であり、

式中、R1はHまたはOHであり、R2は、H、一リン酸塩、二リン酸塩、三リン酸塩またはチオ三リン酸塩（thiotriphosphate）であり、塩基は、シトシン、ウラシル、チミン、アデニンもしくはグアニン、または、それらの修飾ピリミジンおよびプリン誘導体であり、開裂型末端部分は、化合物にポリメラーゼ終結特性を付与する基であり、任意のリンカーは二官能性基（bifunctional group）である。化学式II中の塩基は、シトシン、ウラシル、チミン、アデニンもしくはグアニン、または、それらの修飾ピリミジンおよびプリン誘導体である。上述したように、塩基は、核酸中に普通に見られる種類の置換または非置換の窒素含有親芳香族複素環のいずれかであっても、かつ、適切な相補的塩基とワトソンクリックおよび/またはフーグスティーン水素結合を形成できる、それらの天然の、置換された、修飾された、または、変更されたバリアントまたは類似体であってもよい。

化学式II中の開裂型末端部分は、化合物にポリメラーゼ終結特性を付与する基である。化学式I中の任意のリンカーは、2つの他の基の間で共有結合された分子架橋として機能する1つまたはそれ以上の二価の基である。任意のレポーターは、検知可能な信号を直接的または間接的に生成できる化学的部分である。開裂型末端部分、任意のリンカーおよび任意のレポーターの例は、化学式Iに関して上に述べており、これらの例示的な開裂型末端部分、任意のリンカーおよび任意のレポーターも化学式IIに組み込むことができる。

実施例
実施例1：光開裂型の3’ブロックされたプライマーの生成
この実施例では、プライマーを、その3’末端に保護基がある状態で合成した。光開裂型のブロックされたプライマーを、プライマー前駆体の一塩基伸長を行うことにより生成した。プライマー前駆体（番号1-1）をDNAテンプレートにアニールし、光開裂型保護基（LT-dG）を備えるヌクレオチドを、一塩基伸長により、プライマー前駆体の3’末端に組み込んだ。生成物を精製し、逆相高速液体クロマトグラフィー（HPLC）により分析した。図2では、LT-dGを付加する前のアニールされたプライマーおよびテンプレートの生成物を左端のピークに、付加されたLT-dGを有するプライマーの一塩基伸長産物を真ん中のピークに、かつ、過剰な、組み込まれなかったLT-dGを右端のピークに示す。

実施例2：光開裂型のブロックされたプライマーを紫外光によりブロック解除できる
この実施例では、保護基をその3’末端に有するプライマーをブロック解除する能力を評価した。図4は、3’末端に光開裂型保護基を有するHPLCユニバーサル精製プライマー（右側の主なピーク）と、10秒の365nmUV光暴露後のユニバーサルプライマー（左側のピーク）とを示す、HPLCトレースを示している。HPLC移動性（HPLC mobility）の増加は、紫外光による、プライマーの3’末端からの、光開裂型保護基の開裂のためである。これは、本技術の光開裂型のブロックされたプライマーが、紫外光により効率的にブロック解除でき、次いで、DNAポリメラーゼにより伸長される能力のあることを実証している。

実施例3：光開裂型のブロックされたプライマーは紫外光への暴露後にのみPCRにおいて伸長され得る
この実施例では、ブロックされたプライマーをPCR増幅用に使用することを評価した。図5は、3つのPCR産物のバイオアナライザー2100画像を示している。「ブロック解除されたプライマーでのPCR」と記したレーンは陽性対照（positive control）のためのものであり、ブロック解除されたプライマー（番号1-FPおよび番号1-RP）でのgDNAの305bp断片の増幅産物を示している。「ブロックされたプライマーでのPCR」と記したレーンは、ブロック解除された逆方向プライマー（番号1-RP）および光開裂型のブロックされた順方向プライマー（番号1-F^＊）により試みるPCRのためのものである。このレーンは、拡張されたPCR増幅となることができないブロックされたプライマーゆえの、最小のPCR増幅を示している。「UV暴露されたブロックされたプライマーでのPCR」と記したレーンは、順方向プライマー（番号1-F^＊）上の保護基を紫外光への暴露により開裂した後の、ブロック解除されたプライマーおよび光開裂型のブロックされた順方向プライマーでのPCRのためのものである。このレーンは、順方向プライマーがブロック解除されてPCR増幅中に伸長され得るようにされてからのPCR産物の増幅を示している。これらの結果は、本技術のブロックされたプライマーが、PCR増幅中に伸長されないものの、紫外光への暴露により、ブロック解除することができ、拡張されたPCR増幅となるよう活性化することができることを実証している。

実施例4：光開裂型のブロックされたプライマーは紫外光への暴露後にのみRT-PCRにおいて伸長され得る
この実施例では、ブロックされた標的特異的プライマーの使用を、多段階プライマー伸長反応の別の実施形態として、RT-PCRにおいて評価した。図6は、光開裂型のブロックされたβ-アクチン逆方向プライマー（パネルA、R^＊）または光開裂型のブロックされた番号1順方向プライマー（パネルB、F^＊）で行われる、単一容器でのRT-PCR反応の生成物の、バイオアナライザー2100画像を示している。閉じた管を、cDNA合成と熱サイクリングとの間に3分間、UVに暴露した。UV暴露のない状態で、標的特異的産物はいずれのアッセイにおいても生成されず、β-アクチンR^＊および番号1 F^＊が、cDNA合成およびPCRステップの両方の間、不活性のままであることが示唆される。β-アクチンについて、さらなる制御により、UV暴露と最初のPCR変性ステップ（図示せず）との間の期間中に、β-アクチンR^＊から逆転写が準備され（prime）たことが示された。高温でUV暴露を行うことにより、非特異的な相互作用を、この短い期間中に防止できた。結果は、ブロックされた標的特異的プライマーが、紫外光への暴露後のRT-PCRにおいてのみ伸長されることを示している。

例示的な実施形態
本願の開示された主題に従って提示される例示的な実施形態は以下を含むが、これに限定されない。

実施形態1。閉じた容器内で多段階プライマー伸長反応を行うための方法。本方法は、a）容器中でプライマー伸長混合物を調製するステップを備えており、前記混合物は、i）ポリヌクレオチド標的、ii）プライマー伸長可能な前段のプライマー、iii）3’末端に光開裂型保護基を備える後段のプライマー、iV）プライマー伸長酵素、および、v）プライマー伸長試薬を備えている。前記容器は前記混合物の調製後に閉じられる。本方法は、b）前記前段のプライマーで前段のプライマー伸長反応を行い、標的アンプリコンまたは標的cDNAを生成するステップをも備えている。本方法は、c）前記後段のプライマーをブロック解除して、ブロック解除された後段のプライマーを生成するステップであって、当該ブロック解除ステップは前記容器を開くことなく行われるステップを備えている。本方法は、d）前記ブロック解除された後段のプライマーおよび前記標的アンプリコンまたは標的cDNAで後段のプライマー伸長反応を行うステップをも備えている。前記ブロック解除された後段のプライマーは、前記標的アンプリコンまたは標的cDNAとハイブリダイズして伸長される。

実施形態2。前記前段のプライマーは、5’領域および3’領域を備える標的特異的プライマーを備えており、前記3’領域は標的特異的配列を備えており、前記5’領域はユニバーサル配列を備えている、実施形態1に記載の方法。

実施形態3。前記後段のプライマーは、前記ユニバーサル配列またはその一部を備えるユニバーサルプライマーを備えている、実施形態2に記載の方法。

実施形態4。前記前段のプライマーは逆転写酵素（RT）プライマーを備えている、実施形態1～3に記載の方法。

実施形態5。前記後段のプライマーは標的特異的プライマーを備えている、実施形態4に記載の方法。

実施形態6。前記ブロック解除ステップ（c）は、前記後段のプライマーを前記閉じた容器内で紫外光にさらすステップを備えている、実施形態1～5のいずれかに記載の方法。

実施形態7。前記ブロックされたプライマーは、化学式Iに係る化合物であって、

式中、R1はHまたはOHであり、塩基は、シトシン、ウラシル、チミン、アデニンもしくはグアニン、または、それらの修飾ピリミジンおよびプリン誘導体であり、開裂型末端部分は、ポリメラーゼ終結特性を前記化合物に付与する基であり、任意のリンカーは二価の基であり、任意のレポーターは、検知可能な信号を直接的または間接的に生成できる化学的部分であり、プライマーは、ポリヌクレオチド標的と二本鎖を形成できる、オリゴヌクレオチドである、実施形態1～6のいずれかに記載の方法。

実施形態8。前記開裂型末端部分は、下記の化学式に係る部分であって、

式中、
R3はアルキル（C≦8）または置換アルキル（C1-8）であり、
R4は、水素、ヒドロキシ、ハロー、アミノ、ニトロ、シアノ、アジド、またはメルカプトであり、アルキル（C≦6）、アシル（C≦6）、アルコキシ（C≦6）、アシルオキシ（C≦6）、アルキルアミノ（C≦6）、ジアルキルアミノ（C≦6）、アミド（C≦6）、または、これらの基のいずれかの置換型であり、
R5およびR6はそれぞれ独立していて、水素、ヒドロキシ、ハロー、アミノ、ニトロ、シアノ、アジド、またはメルカプトであり、アルキル（C≦6）、アルケニル（C≦6）、アルキニル（C≦6）、アリール（C≦6）、アラルキル（C≦8）、ヘテロアリール（C≦6）、アシル（C≦6）、アルコキシ（C≦6）、アシルオキシ（C≦6）、アルキルアミノ（C≦6）、ジアルキルアミノ（C≦6）、アミド（C≦6）、または、これらの基のいずれかの置換型であり、化学式

または

の基であり、
Xは―O―、―S―もしくは―NH―、またはアルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アルキンジイル(C≦12)、またはこれらの基のいずれかの置換型であり、
Yは―O―、―NH―、アルケンジイル(C≦12)または置換アルカンジイル(C≦12)であり、nは0～6の整数であり、
mは0～6の整数、またはリンカーレポーター、
または塩、互変異性体、またはそれらの光学異性体である、実施形態7に記載の方法。

実施形態9。前記開裂型末端部分は、2-ニトロベンジル置換基を備えている、実施形態7に記載の方法。

実施形態10。前記プライマーは、8～100のヌクレオチドの間の長さを有するオリゴヌクレオチドから選択される、実施形態7～9のいずれかに記載の方法。

実施形態11。前記塩基は、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、それらの修飾ピリミジンおよびプリン誘導体、ならびに、それらの混合物からなる群から選択される、実施形態7～10のいずれかに記載の方法。

実施形態12。多段階プライマー伸長反応を行うための組成物であって、a）ポリヌクレオチド標的と、b）プライマー伸長可能な前段のプライマーと、c）3’末端に光開裂型保護基を備える後段のプライマーとを備え、当該組成物は、当該組成物の調製に際して閉じられる容器中にある、組成物。

実施形態13。前記後段のプライマーは、紫外光への暴露によりブロック解除されるよう構成されている、請求項12に記載の組成物。

実施形態14。前記光開裂型保護基は、約90％～約100％のブロッキング効率を有している、実施形態12または13に記載の組成物。

実施形態15。少なくとも5対の標的特異的プライマー、あるいは少なくとも5対の標的特異的プライマー、あるいは少なくとも10対、または少なくとも20対、または少なくとも50対、または少なくとも100対、または少なくとも200対、または少なくとも500対、または少なくとも1,000対、または少なくとも2,000対、または少なくとも5,000対、または少なくとも10,000対、または少なくとも20,000対、の標的特異的プライマーを備える、実施形態12～14のいずれかに記載の組成物。

実施形態16。前記前段のプライマーは、0.01～0.5μMの濃度で存在し、前記後段のプライマーは、0.2～1μMの濃度で存在する、実施形態12～15のいずれかにに記載の組成物。

実施形態17。前記後段のプライマーは、
5-[(S)-1-(5-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチルプロピルオキシ]メチル-2'-デオキシウリジン、
5-[(S)-1-(5-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチルプロピルオキシ]メチル-2'-デオキシアデノシン、
5-[(S)-1-(5-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチルプロピルオキシ]メチル-2'-デオキシグアノシン、
5-[(S)-1-(5-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチルプロピルオキシ]メチル-2'-デオキシシチジン、
5-[(S)-1-(5-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチルプロピルオキシ]メチル-2'-デオキシチミジン、
および、上記ヌクレオチドのいずれか2つ、3つ、4つまたは5つの混合物を含む、それらの混合物からなる群から選択される3’末端ヌクレオチドを備えている、実施形態12～16のいずれかに記載の組成物。

実施形態18。光開裂型のブロックされたプライマーを調製する方法であって、 a）3’末端を有するプライマー前駆体を供給するステップと、b）i）テンプレートにハイブリダイズされた、前記プライマー前駆体の二本鎖を形成するステップであって、前記テンプレートは、前記プライマー前駆体の前記3’末端の少なくとも1つのヌクレオチドに対して、5’オーバーハングを有しているステップと、DNAポリメラーゼを有する光開裂型保護基を備えるヌクレオチドを組み込むことにより、前記プライマー前駆体をその3’末端で伸長するステップと、またはii）テンプレート非依存性DNAポリメラーゼを有する光開裂型保護基を備えるヌクレオチドを組み込むことにより、前記プライマー前駆体をその3’末端で伸長するステップとを備える、方法。

実施形態19。光開裂型保護基を備える前記ヌクレオチドは、化学式IIに係る化合物であって、

式中、
R1はHまたはOHであり、
R2は、H、一リン酸塩、二リン酸塩、三リン酸塩またはα-チオ三リン酸塩であり、
塩基は、シトシン、ウラシル、チミン、アデニンもしくはグアニン、または、それらの修飾ピリミジンおよびプリン誘導体であり、
開裂型末端部分は、ポリメラーゼ終結特性を前記化合物に付与する基であり、
任意のリンカーは二価の基であり、
任意のレポーターは、検知可能な信号を直接的または間接的に生成できる化学的部分である、請求項18に記載の方法。

Claims (19)

1. 閉じた容器内で多段階プライマー伸長反応を行うための方法であって、
   a）容器中でプライマー伸長混合物を調製するステップであって、前記混合物は
   i）ポリヌクレオチド標的、
   ii）プライマー伸長可能な前段のプライマー、
   iii）3’末端に光開裂型保護基を備える後段のプライマー、
   iV）プライマー伸長酵素、および、
   v）プライマー伸長試薬
   を備え、前記容器は前記混合物の調製後に閉じられるステップと、
   b）前記前段のプライマーで前段のプライマー伸長反応を行い、標的アンプリコンまたは標的cDNAを生成するステップと、
   c）前記後段のプライマーをブロック解除して、ブロック解除された後段のプライマーを生成するステップであって、当該ブロック解除ステップは前記容器を開くことなく行われるステップと、
   d）前記ブロック解除された後段のプライマーおよび前記標的アンプリコンまたは標的cDNAで後段のプライマー伸長反応を行うステップとを備え、
   前記ブロック解除された後段のプライマーは、前記標的アンプリコンまたは標的cDNAとハイブリダイズして伸長される、方法。
2. 前記前段のプライマーは、5’領域および3’領域を備える標的特異的プライマーを備えており、前記3’領域は標的特異的配列を備えており、前記5’領域はユニバーサル配列を備えている、請求項1に記載の方法。
3. 前記後段のプライマーは、前記ユニバーサル配列またはその一部を備えるユニバーサルプライマーを備えている、請求項2に記載の方法。
4. 前記前段のプライマーは逆転写酵素（RT）プライマーを備えている、請求項1に記載の方法。
5. 前記後段のプライマーは標的特異的プライマーを備えている、請求項4に記載の方法。
6. 前記ブロック解除ステップ（c）は、前記後段のプライマーを前記閉じた容器内で紫外光にさらすステップを備えている、請求項1に記載の方法。
7. 前記ブロックされたプライマーは、化学式Iに係る化合物であって、
   化学式I
   

   

   式中、
   R1はHまたはOHであり、
   塩基は、シトシン、ウラシル、チミン、アデニンもしくはグアニン、または、それらの修飾ピリミジンおよびプリン誘導体であり、
   開裂型末端部分は、ポリメラーゼ終結特性を前記化合物に付与する基であり、
   任意のリンカーは二価の基であり、
   任意のレポーターは、検知可能な信号を直接的または間接的に生成できる化学的部分であり、
   プライマーは、ポリヌクレオチド標的と二本鎖を形成できる、オリゴヌクレオチドである、請求項1に記載の方法。
8. 前記開裂型末端部分は、下記の化学式に係る部分であって、
   

   

   式中、
   R3はアルキル（C≦8）または置換アルキル（C1-8）であり、
   R4は、水素、ヒドロキシ、ハロー、アミノ、ニトロ、シアノ、アジド、またはメルカプトであり、アルキル（C≦6）、アシル（C≦6）、アルコキシ（C≦6）、アシルオキシ（C≦6）、アルキルアミノ（C≦6）、ジアルキルアミノ（C≦6）、アミド（C≦6）、または、これらの基のいずれかの置換型であり、
   R5およびR6はそれぞれ独立していて、水素、ヒドロキシ、ハロー、アミノ、ニトロ、シアノ、アジド、またはメルカプトであり、アルキル（C≦6）、アルケニル（C≦6）、アルキニル（C≦6）、アリール（C≦6）、アラルキル（C≦8）、ヘテロアリール（C≦6）、アシル（C≦6）、アルコキシ（C≦6）、アシルオキシ（C≦6）、アルキルアミノ（C≦6）、ジアルキルアミノ（C≦6）、アミド（C≦6）、または、これらの基のいずれかの置換型であり、化学式
   

   

   または
   

   

   の基であり、
   Xは―O―、―S―もしくは―NH―、またはアルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アルキンジイル(C≦12)、またはこれらの基のいずれかの置換型であり、
   Yは―O―、―NH―、アルケンジイル(C≦12)または置換アルカンジイル(C≦12)であり、nは0～6の整数であり、
   mは0～6の整数、またはリンカーレポーター、
   または塩、互変異性体、またはそれらの光学異性体である、請求項7に記載の方法。
9. 前記開裂型末端部分は、2-ニトロベンジル置換基を備えている、請求項7に記載の方法。
10. 前記プライマーは、8～100のヌクレオチドの間の長さを有するオリゴヌクレオチドから選択される、請求項7に記載の方法。
11. 前記塩基は、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、それらの修飾ピリミジンおよびプリン誘導体、ならびに、それらの混合物からなる群から選択される、請求項7に記載の方法。
12. 多段階プライマー伸長反応を行うための組成物であって、
    a）ポリヌクレオチド標的と、
    b）プライマー伸長可能な前段のプライマーと、
    c）3’末端に光開裂型保護基を備える後段のプライマーとを備え、
    当該組成物は、当該組成物の調製に際して閉じられる容器中にある、組成物。
13. 前記後段のプライマーは、紫外光への暴露によりブロック解除されるよう構成されている、請求項12に記載の組成物。
14. 前記光開裂型保護基は、約90％～約100％のブロッキング効率を有している、請求項12に記載の組成物。
15. 少なくとも5対の標的特異的プライマー、あるいは少なくとも5対の標的特異的プライマー、あるいは少なくとも10対、または少なくとも20対、または少なくとも50対、または少なくとも100対、または少なくとも200対、または少なくとも500対、または少なくとも1,000対、または少なくとも2,000対、または少なくとも5,000対、または少なくとも10,000対、または少なくとも20,000対、の標的特異的プライマーを備える、請求項12に記載の組成物。
16. 前記前段のプライマーは、0.01～0.5μMの濃度で存在し、前記後段のプライマーは、0.2～1μMの濃度で存在する、請求項12に記載の組成物。
17. 前記後段のプライマーは、
    5-[(S)-1-(5-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチルプロピルオキシ]メチル-2'-デオキシウリジン、
    5-[(S)-1-(5-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチルプロピルオキシ]メチル-2'-デオキシアデノシン、
    5-[(S)-1-(5-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチルプロピルオキシ]メチル-2'-デオキシグアノシン、
    5-[(S)-1-(5-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチルプロピルオキシ]メチル-2'-デオキシシチジン、
    5-[(S)-1-(5-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチルプロピルオキシ]メチル-2'-デオキシチミジン、
    および、それらの混合物からなる群から選択される3’末端ヌクレオチドを備えている、請求項16に記載の組成物。
18. 光開裂型のブロックされたプライマーを調製する方法であって、
    a）3’末端を有するプライマー前駆体を供給するステップと、
    b）i）テンプレートにハイブリダイズされた、前記プライマー前駆体の二本鎖を形成するステップであって、前記テンプレートは、前記プライマー前駆体の前記3’末端の少なくとも1つのヌクレオチドに対して、5’オーバーハングを有しているステップと、DNAポリメラーゼを有する光開裂型保護基を備えるヌクレオチドを組み込むことにより、前記プライマー前駆体をその3’末端で伸長するステップと、または
    ii）テンプレート非依存性DNAポリメラーゼを有する光開裂型保護基を備えるヌクレオチドを組み込むことにより、前記プライマー前駆体をその3’末端で伸長するステップとを備える、方法。
19. 光開裂型保護基を備える前記ヌクレオチドは、化学式IIに係る化合物であって、
    

    

    式中、
    R1はHまたはOHであり、
    R2は、H、一リン酸塩、二リン酸塩、三リン酸塩またはα-チオ三リン酸塩であり、
    塩基は、シトシン、ウラシル、チミン、アデニンもしくはグアニン、または、それらの修飾ピリミジンおよびプリン誘導体であり、
    開裂型末端部分は、ポリメラーゼ終結特性を前記化合物に付与する基であり、
    任意のリンカーは二価の基であり、
    任意のレポーターは、検知可能な信号を直接的または間接的に生成できる化学的部分である、請求項18に記載の方法。

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