JP5486501B2 - 小さなｒｎａ分子の改善された検出のための方法、組成物およびキット - Google Patents

Description

本発明は、ＲＮＡ分子の検出のための改善された方法、組成物およびキットに関する。特に、本発明は、後続のｍｉＲＮＡ等の短いＲＮＡ配列の増幅ベースの検出の間の二重鎖安定性を改善するための、逆転写反応における塩基修飾、二重鎖安定化ヌクレオシド三リン酸の使用に関する。

マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、ＤＮＡから転写されるがタンパク質に翻訳されない、高度に保存された小さなＲＮＡ分子のクラスである。ｍｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれる一本鎖の約１７〜２４ヌクレオチド（ｎｔ）の分子にプロセシングされ、発生、細胞増殖、アポトーシスおよび分化の重要な制御因子として同定されている。ＲＩＳＣは、翻訳阻害、転写産物切断、または両者により、遺伝子発現のダウンレギュレーションを媒介する。ＲＩＳＣは、様々な真核生物の核における、転写サイレンシングにも関係する。

ｍｉＲＮＡおよび他の小さなＲＮＡ分子は、癌、心血管疾患、ウィルス感染および代謝異常等の、多数のヒト疾患に関係している。したがって、小さなＲＮＡがいつ、どこで、いかなるレベルで発現されるか（アップまたはダウンレギュレートされるか）を検出するために、特異的かつ高感度の分析法が利用可能であることが、この重要な新しい標的クラスの全ての診断および治療上の可能性を認識するために重要である。残念ながら、増幅ベースの技術等、従来の核酸検出方法論の、小さなＲＮＡの検出への応用は、その小さなサイズのために困難となっている。その小さなサイズにより、ハイブリダイゼーションプローブおよびプライマーを設計するために提供される配列がほとんどなく、実際、ほとんどの従来のＰＣＲプライマーは、ｍｉＲＮＡ自体と同様の長さである。

ノーザンブロット、プライマー伸長、シグナル増幅リボザイムおよびいくつかの増幅ベースの技術を含めて、ｍｉＲＮＡを検出するために様々なアプローチが用いられている。しかし、小さなＲＮＡを検出するためのこれらおよび他の従来の戦略は、特異性、感度、実施の費用および／または容易性に関する問題を伴っている。

したがって、迅速かつ強力な増幅および検出を可能にする、小さなＲＮＡ配列の検出において用いるための、用途が広く、単純で、安価な組成物、方法およびキットへのニーズが当該技術分野に存在する。本発明はこれらのニーズに対処し、他の関連する利益を提供する。

上記の如く、本発明は、一般に、後のｍｉＲＮＡ等の短いＲＮＡ配列の増幅ベースの検出の間の二重鎖安定性を改善するための、逆転写反応における塩基修飾、二重鎖安定化ヌクレオシド三リン酸の使用に関する。

したがって、本発明の一態様によれば、（ａ）ＲＮＡ標的配列を含む試料を、（ｉ）ＲＮＡ標的配列にハイブリダイズするために十分に相補的であるプライマーと、（ｉｉ）逆転写酵素活性を有するＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼとに接触させるステップと；（ｂ）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの基質である少なくとも一つの塩基修飾、二重鎖安定化ｄＮＴＰを含むｄＮＴＰの混合物の存在下で、ＲＮＡ標的配列に相補的なｃＤＮＡを合成するステップを含む、小さなＲＮＡ標的配列等の少なくとも一つのＲＮＡ標的配列の逆転写のための方法が提供される。

塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰがＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの基質であり、さらに、ｃＤＮＡに組み込まれたときに本明細書に記載されるようにハイブリダイゼーション特性の増強を生じるという条件で、基本的に任意の塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰが、本発明にしたがって使用できる。

本発明のいくつかの実施形態においては、例えば、塩基修飾、二重鎖安定化ｄＮＴＰは、５−位で置換されたピリミジンであり、それは逆転写酵素酵素の基質である。

いくつかの実施形態においては、塩基修飾、二重鎖安定化ｄＮＴＰは、以下：

の構造を有する化合物を含み、式中、Ｂは以下；

より選択され、
Ｘは、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＣＨ_３または

より選択され；
Ｙは、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉまたは

より選択され；
Ｒは、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＣＨ_３または−ＮＨ_２である。

いくつかの実施形態では、塩基修飾、二重鎖安定化ｄＮＴＰは、ｄ（２−ａｍＡ）ＴＰ、ｄ（５−ＰｒＵ）ＴＰ、ｄ（５−ＰｒＣ）ＴＰ、またはその組み合わせより選択される。

本発明は、基本的に任意のＲＮＡ標的の検出に用いられうるが、本明細書に記載されるように、本発明は、従来の技術による増幅ベースのアプローチによる検出が困難となっている小さなＲＮＡ標的配列の検出に特に適用可能性がある。ある実施形態においては、ＲＮＡ標的は、長さ約１０〜３０ヌクレオチドのＲＮＡ配列などの小さなＲＮＡ標的である。ある他の実施形態においては、小さなＲＮＡ標的配列は、ｍｉＲＮＡである。

逆転写（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｉｒｐｔｉｏｎ）の間に塩基修飾、二重鎖安定化ｄＮＴＰをｃＤＮＡに組み込むことに加え、当然のことながら、塩基修飾、二重鎖安定化ｄＮＴＰが、逆転写の間および／または後続の増幅の間に使用されるプライマーまたは他のオリゴヌクレオチドに、そのハイブリダイゼーション特性を更に増強するために組み込まれてもよく、さらに、必要または所望される場合には増幅の間に合成される増幅産物に組み込まれてもよい。

本発明のいくつかの実施形態においては、ｃＤＮＡ合成において使用されるプライマーが、後の増幅反応においてリバースプライマーとしても用いられるが、別の実施形態においては、異なるリバースプライマーが用いられる。

本発明のいくつかの実施形態においては、上述の方法には、（ａ）一本鎖ｃＤＮＡを提供するために、ステップ（ｂ）で形成されるｃＤＮＡを処理するステップと；（ｂ）二本鎖ｃＤＮＡ分子を産出するために、一本鎖ｃＤＮＡを、第二プライマー（この第二プライマーは、ｃＤＮＡにハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で伸長産物の合成を開始するのに十分にこのｃＤＮＡに対して相補的である）と接触させるステップが、さらに含まれる。

いくつかの実施形態においては、本発明は、小さなＲＮＡ標的配列およびその相補鎖（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）に十分に相補的であるためにこれにハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で増幅産物を産出する、増幅プライマーを用いて、核酸増幅反応を行うステップをさらに含む。いくつかの実施形態においては、核酸増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応法である。上記の如く、増幅反応は、修飾ｄＮＴＰが増幅産物に組み込まれるように、少なくとも一つの塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰを含むｄＮＴＰの混合物の存在下で、任意で行われうる。

本発明の別の態様では、本発明の方法を行う際に使用される反応混合物が、提供される。例えば、いくつかの実施形態においては、本発明の反応混合物は、（ａ）少なくとも一つの小さなＲＮＡ標的配列等、ＲＮＡ標的配列を含む試料と；（ｂ）ＲＮＡ標的配列とハイブリダイズするためにＲＮＡ標的配列に十分に相補的であるプライマーと、（ｃ）逆転写酵素活性を有するＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと；（ｄ）本明細書に記載される、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの基質である少なくとも一つの塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰを含むｄＮＴＰの混合物を含む。

別の態様によれば、本発明は、本発明の実行に必要または重要な構成要素を含むキットを提供する。例えば、いくつかの実施形態では、本発明は、（ａ）逆転写酵素活性を有するＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと；（ｂ）本明細書に記載される、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの基質である少なくとも一つの塩基修飾、二重鎖安定化ｄＮＴＰを含むキットを提供する。キットは、例えば一つ以上のＲＮＡ標的配列に特異的にハイブリダイズする一つ以上のプライマーを含む、ＲＮＡ標的配列の逆転写および／または増幅の間に使用するための多数の追加的な構成要素のいずれかをさらに含みうる。

本発明のこれらおよび他の特徴および利点は、以下の詳細な記載、添付の図面および請求項を参照すれば明らかとなる。本明細書に開示される全ての参考文献は、各々が組み込まれたのと同様に、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
したがって、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
長さ約１００ヌクレオチド未満の小さなＲＮＡ標的配列の逆転写のための方法であり、
（ａ）上記小さなＲＮＡ標的配列を含む試料を、
（ｉ）上記小さなＲＮＡ標的配列とハイブリダイズするのに十分に上記小さなＲＮＡ標的配列に対して相補的である、プライマー、および
（ｉｉ）逆転写酵素活性を有するＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ
と接触させるステップと；
（ｂ）上記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの基質である少なくとも一つの塩基修飾、二重鎖安定化ｄＮＴＰを含むｄＮＴＰの混合物の存在下で、上記小さなＲＮＡ標的配列に相補的なｃＤＮＡを合成するステップと
を含む、方法。
（項目２）
上記ｄＮＴＰの混合物が、上記５−位で置換されたピリミジンである、塩基修飾、二重鎖安定化ｄＮＴＰを含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
上記ｄＮＴＰの混合物が、式：

を有する塩基修飾、二重鎖安定化ｄＮＴＰを含み、
式中、Ｂは、

より選択され；
Ｘは、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＣＨ _３ または

より選択され；
Ｙは、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉまたは

より選択され；
Ｒは、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＣＨ _３ または−ＮＨ _２ である、
項目１に記載の方法。
（項目４）
上記ｄＮＴＰの混合物が、ｄ（２−ａｍＡ）ＴＰ、ｄ（５−ＰｒＵ）ＴＰおよび／またはｄ（５−ＰｒＣ）ＴＰより選択される、塩基修飾、二重鎖安定化ｄＮＴＰを含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
上記ｄＮＴＰの混合物が、（２−ａｍＡ）ＴＰ、ｄ（５−ＰｒＵ）ＴＰおよびｄ（５−ＰｒＣ）ＴＰおよび／またはｄＧＴＰの少なくとも二つを含む、項目１に記載の方法。
（項目６）
上記小さなＲＮＡ標的配列が、約１０〜３０ヌクレオチドの長さである、項目１に記載の方法。
（項目７）
上記小さなＲＮＡ標的配列が、ｍｉＲＮＡ配列である、項目１に記載の方法。
（項目８）
上記プライマーに、一つ以上の塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰが組み込まれている、項目１に記載の方法。
（項目９）
（ａ）一本鎖ｃＤＮＡを提供するために、上記ステップ（ｂ）で形成されるｃＤＮＡを処理するステップと；
（ｂ）二重鎖ｃＤＮＡ分子を産出するために、上記一本鎖ｃＤＮＡを、上記ｃＤＮＡに十分に相補的であるためにこれにハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で伸長産物の合成を開始する、第二プライマーと接触させる、ステップと
をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１０）
上記小さなＲＮＡ標的配列およびその相補鎖に十分に相補的であるためにこれにハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で増幅産物を産出する、増幅プライマーを用いて、核酸増幅反応を行うステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１１）
上記核酸増幅反応が、ポリメラーゼ連鎖反応である、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
上記増幅プライマーの一つ以上に、塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰが組み込まれている、項目１０に記載の方法。
（項目１３）
上記増幅反応が、少なくとも一つの塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰを含むデオキシヌクレオシド５’−三リン酸の混合物の存在下で行われる、項目１０に記載の方法。
（項目１４）
長さ約１００ヌクレオチド未満の小さなＲＮＡ標的配列を増幅するための方法であり、
（ａ）上記小さなＲＮＡ標的配列を含む試料を、
（ｉ）上記小さなＲＮＡ標的配列とハイブリダイズするのに十分に上記小さなＲＮＡ標的配列に対して相補的である、プライマー、および
（ｉｉ）逆転写酵素活性を有するＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ
と接触させるステップと；
（ｂ）上記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼのための基質である少なくとも一つの塩基修飾、二重鎖安定化ｄＮＴＰを含むｄＮＴＰの混合物の存在下で、上記小さなＲＮＡ標的配列に相補的なｃＤＮＡを合成するステップと、
（ｃ）上記小さなＲＮＡ標的配列およびその相補鎖に十分に相補的であるためにこれにハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で増幅産物を産出する、増幅プライマーを用いて、核酸増幅反応を行うステップ
を含む、方法。
（項目１５）
上記ｄＮＴＰの混合物が、上記５−位で置換されたピリミジンである、塩基修飾、二重鎖安定化ｄＮＴＰを含む、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
上記ｄＮＴＰの混合物が、式：

を有する塩基修飾、二重鎖安定化ｄＮＴＰを含み、式中、Ｂは、

より選択され；
Ｘは、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＣＨ _３ または

より選択され；
Ｙは、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉまたは

より選択され；
Ｒは、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＣＨ _３ または−ＮＨ _２ である、
項目１４に記載の方法。
（項目１７）
上記ｄＮＴＰの混合物が、ｄ（２−ａｍＡ）ＴＰ、ｄ（５−ＰｒＵ）ＴＰおよび／またはｄ（５−ＰｒＣ）ＴＰより選択される、塩基修飾、二重鎖安定化ｄＮＴＰを含む、項目１４に記載の方法。
（項目１８）
上記ｄＮＴＰの混合物が、（２−ａｍＡ）ＴＰ、ｄ（５−ＰｒＵ）ＴＰおよびｄ（５−ＰｒＣ）ＴＰおよび／またはｄＧＴＰの少なくとも二つを含む、項目１４に記載の方法。
（項目１９）
上記小さなＲＮＡ標的配列が、約１０〜３０ヌクレオチドの長さである、項目１４に記載の方法。
（項目２０）
上記小さなＲＮＡ標的配列が、ｍｉＲＮＡ配列である、項目１４に記載の方法。
（項目２１）
上記プライマーに、一つ以上の塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰが組み込まれている、項目１４に記載の方法。
（項目２２）
（ａ）一本鎖ｃＤＮＡを提供するために、上記ステップ（ｂ）で形成されるｃＤＮＡを処理するステップと；
（ｂ）二重鎖ｃＤＮＡ分子を産出するために、上記一本鎖ｃＤＮＡを、上記ｃＤＮＡに十分に相補的であるためにこれにハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で伸長産物の合成を開始する、第二プライマーと接触させる、ステップと
をさらに含む、項目１４に記載の方法。
（項目２３）
上記核酸増幅反応が、ポリメラーゼ連鎖反応である、項目１４に記載の方法。
（項目２４）
上記増幅プライマーの一つ以上に、塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰが組み込まれている、項目１４に記載の方法。
（項目２５）
上記増幅反応が、少なくとも一つの塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰを含むデオキシヌクレオシド５’−三リン酸の混合物の存在下で行われる、項目１４に記載の方法。
（項目２６）
（ａ）小さなＲＮＡ標的配列を含む試料と；
（ｂ）上記小さなＲＮＡ標的配列とハイブリダイズするのに十分に上記小さなＲＮＡ標的配列に対して相補的である、プライマーと；
（ｃ）逆転写酵素活性を有するＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと；
（ｄ）上記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの基質である少なくとも一つの塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰを含むデオキシヌクレオシド５’−三リン酸の混合物と
を含む、反応混合物。
（項目２７）
上記ｄＮＴＰの混合物が、上記５−位で置換されたピリミジンである塩基修飾、二重鎖安定化ｄＮＴＰを含む、項目２６に記載の反応混合物。
（項目２８）
上記ｄＮＴＰの混合物が、式

を有する塩基修飾、二重鎖安定化ｄＮＴＰを含み、
式中、Ｂは、

より選択され；
Ｘは、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＣＨ _３ または

より選択され；
Ｙは、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉまたは

より選択され；
Ｒは、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＣＨ _３ または−ＮＨ _２ である、
項目２６に記載の反応混合物。
（項目２９）
上記ｄＮＴＰの混合物が、ｄ（２−ａｍＡ）ＴＰ、ｄ（５−ＰｒＵ）ＴＰおよび／またはｄ（５−ＰｒＣ）ＴＰより選択される、塩基修飾、二重鎖安定化ｄＮＴＰを含む、項目２６に記載の反応混合物。
（項目３０）
（ａ）逆転写酵素活性を有するＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと；
（ｂ）上記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの基質である少なくとも一つの塩基修飾、二重鎖安定化デオキシリボヌクレオチド三リン酸
を含む、キット。
（項目３１）
上記ｄＮＴＰの混合物が、上記５−位で置換されたピリミジンである塩基修飾、二重鎖安定化ｄＮＴＰを含む、項目３０に記載のキット。
（項目３２）
上記ｄＮＴＰの混合物が、式

を有する塩基修飾、二重鎖安定化ｄＮＴＰを含み、
式中、Ｂは、

より選択され；
Ｘは、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＣＨ _３ または

より選択され；
Ｙは、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉまたは

より選択され；
Ｒは、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＣＨ _３ または−ＮＨ _２ である、
項目３０に記載のキット。
（項目３３）
上記ｄＮＴＰの混合物が、ｄ（２−ａｍＡ）ＴＰ、ｄ（５−ＰｒＵ）ＴＰおよび／またはｄ（５−ＰｒＣ）ＴＰより選択される、塩基修飾、二重鎖安定化ｄＮＴＰを含む、項目３０に記載のキット。
（項目３４）
第二プライマーであって、上記小さなＲＮＡ標的配列とハイブリダイズするのに十分に上記小さなＲＮＡ標的配列に対して相補的である第二プライマーをさらに含む、項目３０に記載のキット。
（項目３５）
小さなＲＮＡ標的配列を増幅するために有効な増幅プライマー対をさらに含む、項目３０に記載のキット。

逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）による、ｍｉＲ−１５５の検出のために設計された、例示的なフォワードおよびリバースプライマーを示す。 ＰＣＲ増幅の前にｃＤＮＡ鎖に塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰを組み込むことにより達成される、改善された検出効率および感度を示す。

上記の如く、本発明は一般に、ＲＮＡ標的、特にｍｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ等の小さなＲＮＡ標的の、増幅および検出の改善に関する。特に、本発明は、塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰがＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより合成されるｃＤＮＡに組み込まれる条件下における塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰの存在下での、ＲＮＡ標的配列の逆転写によるＲＮＡ標的配列の検出方法の改善に関する。逆転写の間のｃＤＮＡへの塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰの組み込みにより修飾ｃＤＮＡを産出することにより、後の操作の間（例えば後の増幅の間）にポリヌクレオチド成分が修飾ｃＤＮＡにハイブリダイズしたときに、安定性が改善されたハイブリダイゼーション複合体を形成する。その結果、本明細書の方法を実施することにより、例えば、後の増幅反応の間に収率および感度の改善が達成されうる。任意で一つ以上の塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰを逆転写の後の増幅反応および／または逆転写および／または増幅の間に用いられるプライマーまたは他の補助的なオリゴヌクレオチドに組み込むことにより、本発明によるさらなる改善が実現されうる。

一般に、少なくとも一つのオリゴヌクレオチド成分（例えばオリゴヌクレオチドプライマー（単数または複数）および／またはプローブ（単数または複数））が、本明細書に記載されるように、ＤＮＡがそのように修飾されない場合に生じたであろうよりも高い安定性で修飾ＤＮＡにハイブリダイズするという条件で、本明細書に開示される本発明の態様は、合成、増幅および／または検出ＲＮＡ分子に基づく事実上任意のアッセイの利益のために使用されうる。当業者にはさらに当然のことながら、本発明は、例えば増幅および／または検出のためのオリゴヌクレオチド成分の設計を拡張および単純化することにより、従来のアプローチを用いては困難となっているＲＮＡ配列（例えば小さなＲＮＡ配列）の増幅および検出を許容することにより、増幅および／または検出ステージを加速すること（例えばアッセイ時間の短縮）等により、様々な方法でＲＮＡ検出アッセイの利益となりうる。

本発明の実行、ならびに生化学、核酸化学、分子生物学および分子遺伝学の用語および記号は、特に明記しない限り、文献中により十分に説明されている、従来技術の範囲内で理解されるものにしたがう。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｓａｍｂｒｏｏｋ等編，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：（１９８９）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，第ＩおよびＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編，１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編，１９８４）；Ｍｕｌｌｉｓ等，米国特許第４，６８３，１９５号；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編．１９８４）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ａｕｓｕｂｅｌ等，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）；Ｋｏｒｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｂａｋｅｒ，ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２）； Ｇａｉｔｓ編，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８４）；Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７５）；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１）；等を参照。

定義
以下の用語は、特に反対の明示がなければ、本明細書に記載される意義を有する。「ａ（一つの）」または「ａｎ（一つの）」実体という語は、その実体の一つ以上をさす点に留意されたい。例えば、「核酸（ａ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）」は、一つ以上の核酸を表すと理解されるものとする。そのようなものとして、「ａ」（または「ａｎ」）、「一つ以上」、および「少なくとも一つ」という用語は、本明細書において互換可能に用いられうる。

本明細書で用いられるところの「試料」という用語は、目的の核酸を含む、または含むと推定される任意の物質をさし、したがって、核酸、細胞、生物、組織、流体（例えば脊髄液またはリンパ液）の試料、および、血漿、血清、尿、涙、大便、気道および尿生殖路、唾液、様々な臓器の断片、組織、血液細胞を含むこれに限定されない試料、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養の試料、自然のソースからの単離物、核酸分子を含むと思われる目的物または標本を含む。試料は、正常組織、患部組織および／または疾患を有すると疑われる対象の組織から得られる。

「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、本明細書において互換可能に使用され、それぞれ、ヌクレオチドモノマーの線状ポリマーを意味する。ポリヌクレオチドは、典型的に、サイズが通常「オリゴヌクレオチド」と呼ばれる場合の数モノマー単位、例えば５〜４０から、数千モノマー単位の範囲である。厳密なサイズは、多くのファクターに依存し、そのファクターは、オリゴヌクレオチドの最終的機能または使用に依存する。オリゴヌクレオチドは、化学合成、ＤＮＡ複製、逆転写、またはその組み合わせを含む任意の方法で生成されうる。ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが文字の配列、例えば「ＣＣＧＴＡＴＧ」により表されるときは常に、本明細書においては、文中に特段の断りがない限り、ヌクレオチドは、左から右に５’→３’の順序であり、そうでないことが特に明記され、または文脈から明らかでない限り、「Ａ」がデオキシアデノシン、「Ｃ」がデオキシシチジン、「Ｇ」がデオキシグアノシン、「Ｔ」がデオキシチミジンを表すものと理解されるものとする。通常は、ＤＮＡポリヌクレオチドは、ホスホジエステル結合により連結されたこれらの四つのデオキシリボヌクレオシドを含み、ＲＮＡは、「Ｔ」の代わりにウリジン（「Ｕ」）を伴うそれらの四つのリボース対応物を含む。

本明細書において使用されるところの「オリゴヌクレオチドプライマー」または「プライマー」という用語は、標的配列に十分に相補的であるためにこれにハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で核酸鎖の酵素的合成をプライミングする、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子をさす。標的核酸は、オリゴヌクレオチドプライマーのテンプレートとして役立つ。プライマーは、本明細書に記載されるように、逆転写および増幅反応の両方において用いられる。オリゴヌクレオチドプライマーは、精製された制限消化物のように自然に生じ、または合成的に生産されうる。特定の態様においては、プライマーは、その３’末端にテンプレートの特定の配列の鎖に実質的に相補的である領域を有するように選択される。プライマー伸長が生じるためには、プライマーがテンプレート鎖にハイブリダイズするために十分に相補的でなければならない。オリゴヌクレオチドプライマー配列は、テンプレートにハイブリダイズするためにその正確な配列を反映する必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチドフラグメントがプライマーの５’末端に結合し、プライマー配列の残部が鎖に実質的に相補的でありうる。例えば、５’テール配列は、逆転写および／または増幅反応の効率、収率、検出性等の改善のような所望の目的に役立つ（ｓｅｒｖｉｅ）、または利用される増幅または検出技術の選択により所望されまたは必要な、特殊フラグメントまたは特殊フラグメントの組み合わせを組み込みうる。例えば、本明細書に記載の方法にしたがって使用されるプライマーのハイブリダイゼーション特性を改善するために、５’テール配列が加えられうる。特殊配列の他の例には、公知技術のプローブ結合部位を含むフラグメント、分離配列、標的伸長配列、抗−プライマー−ダイマー配列等が含まれるがこれに限定されない。さらに、プライマー配列がテンプレートの配列とハイブリダイズし、これによりオリゴヌクレオチドプライマーの伸長産物の合成のためのテンプレート−プライマー複合体を形成するために十分な相補性を保持するという条件で、非相補的塩基またはより長い配列がプライマー内に散在しうる。代替的または追加的に、塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰの存在が、標的配列へのハイブリダイゼーションまたはそこから伸長産物を合成する能力を妨げないという条件で、塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰが、本発明に従って使用される一つ以上のプライマーに、その結合特性を改善するために組み込まれうる。ある実施形態では、比較的短いプライマー（例えば８、９または１０ヌクレオチドくらい小さい）が、本発明の修飾ｄＮＴＰが組み込まれたときのそのようなプライマーのハイブリゼーション（ｈｙｂｒｉｚａｔｉｏｎ）特性の改善の結果、逆転写および／または増幅の間に都合よく用いられうる。

「標的核酸」または「標的配列」または「目的の核酸」という用語は、本発明の一つ以上の方法を用いて逆転写、増幅および／または検出される核酸または核のフラグメントをさす。いくつかの実施形態においては、標的配列は、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ等の小さなＲＮＡ配列である。標的核酸は、任意の生物または原核生物、真核生物、植物、動物およびウィルスを含むがこれに限定されない他のソースから得られ、合成核酸であってもよい。標的核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および／またはその変異体または誘導体を含みうる。標的核酸は、一本鎖または二本鎖であり得、目的の核酸が二本鎖であるか、二本鎖と推定されるときには、「標的核酸」という用語は、二本鎖核酸のいずれかの鎖の特定の配列をさす。したがって、任意の目的の一本鎖核酸に対する完全補体は、本明細書の特定の実施形態では、同じ標的核酸として扱われる。

いくつかの実施形態においては、本発明の方法を適用する前に、目的の核酸が試料源から単離および精製されうる。標的核酸が、タンパク質および／または逆転写、増幅および／または検出反応を妨げる任意の他の物質を十分に含まないことが好ましい。市販キットおよび専門機器を含めて、標的核酸の単離および精製のために、当分野で認められた多くの方法が利用可能である。例えば、フェノール／クロロホルム有機試薬による有機抽出の後、エタノール沈殿を用いて、核酸が単離されうる（Ａｕｓｕｂｅｌ等，編，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１，Ｃｈａｐｔｅｒ ２，Ｓｅｃｔｉｏｎ Ｉ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）。固相吸着法（Ｗａｌｓｈ等．（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１０：５０６−５１３，Ｂｏｏｍ等，米国特許第５，２３４，８０９号）および塩−誘導沈殿（Ｍｉｌｌｅｒ等（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６：１２１５）は、核酸を精製するための、さらに別の公知のアプローチである。

「小さなＲＮＡ配列」は、一般に、約１５〜１００、１５〜７５、１５〜５０、１５〜３０、または１５〜２５ヌクレオチドの長さを有するＲＮＡ配列をさす。より特定の実施形態においては、本発明に従って検出される小さなＲＮＡ配列は、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９ ７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００、またはそれ以上のヌクレオチド、または前述の任意の長さを境界とする任意の範囲である。ある実施形態においては、小さなＲＮＡは、マイクロＲＮＡ（ｍｉ）、短鎖干渉（ｓｉ）ＲＮＡ、低分子一過性（ｓｔ）ＲＮＡ、異質染色性ｓｉＲＮＡ、小さな非コードＲＮＡ等を含む、短い非コードＲＮＡ配列をさす。小さなＲＮＡは、例えばｍＲＮＡ安定性または翻訳の制御において機能でき、および／またはゲノムの特異的な領域を後成的修飾の標的とすることができる。上述のように、本発明は、ある態様においては、それらの短さに起因する従来の増幅ベースのアプローチによるこれらの配列の検出に伴う困難に対処する。

本明細書で用いられるところの「ｍｉＲＮＡ」は、動植物のゲノムにコードされる小さなＲＮＡ分子を含むマイクロＲＮＡ配列をさす。ｍｉＲＮＡは、遺伝子の発現を調節する、典型的に約１７〜２４ヌクレオチドの長さ（例えば２４ヌクレオチドの１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３）の天然のＲＮＡであり、その多くがヒトの病態または他の状態との関連を有する。現在までに同定されるｍｉＲＮＡ配列の数は大きく、増加しており、その代表例は、例えば、“ｍｉＲＢａｓｅ：ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，ｔａｒｇｅｔｓ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ”Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ Ｓ，Ｇｒｏｃｏｃｋ ＲＪ，ｖａｎ Ｄｏｎｇｅｎ Ｓ，Ｂａｔｅｍａｎ Ａ，Ｅｎｒｉｇｈｔ ＡＪ．ＮＡＲ，２００６，３４，Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ，Ｄ１４０−Ｄ１４４；”Ｔｈｅ ｍｉｃｒｏＲＮＡ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ”Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ Ｓ．ＮＡＲ，２００４，３２，Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ，Ｄ１０９−Ｄ１１１に；および、ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ／でも見つけられる。

本明細書で用いられるところの「ハイブリダイズ」、「ハイブリダイゼーション」または「アニーリング」は、Ｍａｒｍｕｒ Ｊ．，Ｌａｎｅ Ｄ．（１９６０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，４６：４５３−４６１およびＤｏｔｙ Ｐ．等（１９６０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，４６：４６１−４７６に最初に記載されるように、最も一般的には二重鎖または二本鎖複合体である塩基対合により相補複合体を形成する二つ以上のポリヌクレオチドの間の相互作用のプロセスをさす。核酸二重鎖の安定性は、融解温度すなわち「Ｔ_ｍ」により測定されうる。指定の条件下での特定の核酸二重鎖のＴ_ｍは、平均して塩基対の半分が解離している温度である。

ポリヌクレオチドの「ハイブリダイゼーション特性」とは、別の相補ポリヌクレオチドまたはそのフラグメントと配列特異的複合体を形成する、このポリヌクレオチドまたはそのフラグメントの能力をいう。「ハイブリダイゼーション特性」は、本明細書においては一般に相補複合体の安定性もさす。この点に関して、「ハイブリダイゼーション特性」が、「融解温度」または「Ｔｍ」と同様に使用される。

本明細書で使用されるところの「修飾ＤＮＡ」は、本明細書に記載のように、少なくとも一つの塩基修飾二重鎖安定化ヌクレオチドを組み込んだＤＮＡをさす。ある好ましい実施例においては、修飾ＤＮＡは、本明細書に記載のように、少なくとも一つの塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰを含むデオキシヌクレオシド５’−三リン酸（ｄＮＴＰ）混合物の存在下においてＲＮＡ標的配列の逆転写により産出される修飾ｃＤＮＡである。

本明細書で用いられるところの「塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰ」という用語は、非天然塩基（塩基修飾）を含み、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、他のｄＮＴＰを伴うポリマーに組み込まれたときに、それが天然であっても塩基修飾であっても、ハイブリダイゼーション特性が増強された修飾ＤＮＡを提供する（二重鎖安定化）、デオキシヌクレオシド５’−トリホシェート（ｔｒｉｐｈｏｓｈａｔｅ）をさす。塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰは、それぞれの天然ｄＮＴＰのアナログでありうる。例えば、ｄ（５−ＭｅＣ）ＴＰ（５−メチルシトシン）は、ｄＣＴＰ（シトシン）のアナログであり、ｄ（２−ａｍＡ）ＴＰ（２−アミノアデノシン、２，６−ジアミノプリンとも呼ばれる）は、ｄＡＴＰ（アデノシン）のアナログである。塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰの代表例は、本明細書にさらに記載される。塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰは、それぞれの天然ｄＮＴＰを完全に置換しうる。これは、例えば、ｄ（５−ＭｅＣ）ＴＰが増幅反応において用いられる場合には、反応がｄＣＴＰを含まないことを意味する。あるいは、塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰは、それぞれの天然ｄＮＴＰの画分でありうる。これは、天然ｄＮＴＰおよびそのアナログの両方が反応混合物中に存在し、典型的には、塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰがそれぞれの天然ｄＮＴＰのモル量の少なくともある割合（例えば５％、２５％、５０％または７５％）を表すことを意味する。したがって、本発明に従って使用または合成されるプライマーまたはｃＤＮＡまたはアンプリコンは、任意の適切または所望の数の塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰを組み込みうる（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２５、５０、７５、１００等、およびその間の全ての整数）。

本明細書で使用されるところの、「逆転写」という句は、天然または修飾デオキシヌクレオシド５’−三リン酸（ｄＮＴＰ）の存在下で、逆転写酵素活性を有するＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが、ＲＮＡテンプレートにハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプライマーを伸長し、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の合成が生じるプロセスをさす。

「ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ」または「逆転写酵素」（「ＲＴ」）は、逆転写と呼ばれるプロセスにおいて、ＲＮＡテンプレートから相補ＤＮＡコピーを合成する酵素である。プライマーは、ＲＮＡおよびＤＮＡテンプレートの両者による合成を開始するために必要とされる。

「増幅」または「核酸増幅」とは、目的の特定の標的核酸配列の少なくとも一部を含む標的核酸の複数のコピーの産出を意味する。複数のコピーは、アンプリコンまたは増幅産物と呼ばれうる。典型的に、増幅された部分は、様々な周知の方法のいずれかを用いて検出されうる検出可能な標的配列を含む。最も一般的な核酸増幅技術の一つ、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）は、二本鎖核酸を交互に変性させ、プライマーをハイブリダイズするために、サーモサイクリングを必要とする。しかし、他の周知の核酸増幅の方法は、等温である。ＰＣＲと一般に呼ばれるポリメラーゼ連鎖反応法（Ｍｕｌｌｉｓ等，米国特許第４，６８３，１９５号；Ｍｕｌｌｉｓ， 米国特許第４，６８３，２０２号；およびＭｕｌｌｉｓ等， 米国特許第４，８００，１５９号）は、変性、対向する鎖に対するプライマー対のアニーリング、およびプライマー伸長の複数のサイクルを用いて、標的配列のコピー数を指数的に増加させる。本明細書においてさらに詳述される多くの他の核酸増幅技術も記載されており、本発明の文脈で適用できる。

本明細書で用いられるところの「逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応法」または「ＲＴ−ＰＣＲ」とは、逆転写酵素（ＲＴ）活性を有するＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡ標的配列から相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）が作成され、そしてｃＤＮＡがＰＣＲにより増幅されて、ＤＮＡの複数のコピーが作成される、標的ＲＮＡ配列の増幅および検出のための公知の技術をさす（例えば、Ｇｅｌｆａｎｄ等，”Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ−Ｈｉｇｈ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ，”米国特許第５，３２２，７７０号および第５，３１０，６５２号）。

「検出可能な増幅」とは、増幅反応混合物中の増幅産物に伴う検出可能シグナルが、所定のバックグラウンドまたは閾値レベルを上回り（エンドポイント増幅）、またはある時間内にバックグラウンドまたは閾値を上回ること（実時間増幅）を意味する。例えば、Ｌｉｇｈｔ等、“Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｔｈｅ Ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ａｎ Ａｎａｌｙｔｅ ｉｎ ａ Ｓａｍｐｌｅ，”米国特許出願公開第２００６−０２７６９７２号，５０６−５４９段落を参照。増幅産物は、標的核酸配列またはその補体と配列同一性を有する配列を含み、例えば、標的核酸配列またはその補体の領域に対する特異性を有するインターカレーティング色素または検出プローブにより検出されうる。

「増幅条件」とは、核酸増幅を可能にする条件を意味する。本発明の逆転写および／または増幅反応において使用されるオリゴヌクレオチドは、増幅条件下で意図した標的にハイブリダイズするが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズしてもしなくてもよい。下の実施例のセクションは、本発明による標的核酸配列の逆転写および増幅のための例示的な増幅条件を提供するが、当然のことながら、他の許容可能な条件が使用されてもよく、そのような条件は、検出される特定の配列および／または用いられる増幅の方法に応じて、通常の技術を有する当業者により容易に確認されうる。

「オリゴヌクレオチド成分」という用語は、本発明の逆転写、増幅および／または検出反応を行うのに必要または有用な任意のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをさす。オリゴヌクレオチド成分は、オリゴヌクレオチドプライマー、プローブ、ハイブリダイゼーションおよび切断促進剤、エフェクター等を含むがこれに限定されない。オリゴヌクレオチド成分は、標識され、またはオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブ設計において用いられるものを含む構造修飾を有しうる。

本明細書で使用されるところの「オリゴヌクレオチドプローブ」という用語は、プローブ中の少なくとも一つの配列の標的核酸中の配列との相補性に基づいて、二重鎖構造を形成する標的核酸または標的核酸との他の複合体を検出する際に使用される、オリゴマーまたはポリマーをさす。本発明のオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブは、「修飾」され、または「構造修飾」を有しうる。

「二重鎖安定化修飾」は、核酸中に存在するときに、通常Ｔｍとして測定される熱安定性に関して、構造修飾を有しない、例えば天然ヌクレオチドからなるそれぞれの核酸複合体と比較して、二重鎖安定化効果を提供する構造修飾をさす。

本明細書で使用されるところの「天然ヌクレオシド」という用語は、天然のソースから単離されたＤＮＡに一般に見られる四つのデオキシヌクレオシドをさす。天然ヌクレオシドは、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、およびデオキシチミジンである。この用語は、チミジンの代わりにウリジンを伴う、そのリボース対応物も含む。

本明細書で使用されるところの「非天然ヌクレオシド」という用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡポリマーにつき天然のヌクレオシドと構造が異なるヌクレオシドアナログを指す。目的の天然核酸のいくつかは、上に定義される天然ヌクレオシドと構造的に異なるヌクレオシドを含みうる。例えば、真核生物のＤＮＡは、５−メチル−シトシンを組み込むことができ、ｔＲＮＡは一定のヌクレオシドアナログをもつ。しかし、本明細書で特定の態様において使用されるところの「非天然ヌクレオシド」という用語は、これらのヌクレオシド修飾物を、天然のソースに見られるとしても、なお含む。例えば、リボチミジンは、本明細書において、非天然ヌクレオシドとして扱われる。

本明細書で用いられるところの、ポリヌクレオチドの「改善された」または「増強されたハイブリダイゼーション特性」は、本発明の実施から生じる増強されたハイブリダイゼーション特性をさす。例えば、本発明のアッセイにおける塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰの使用は、修飾ｃＤＮＡの合成をもたらし、この修飾ｃＤＮＡが増強されたハイブリダイゼーション特性を有すると言われる。これは、例えばオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーとの、この修飾ＤＮＡの相補複合体の熱安定性またはＴｍが、それぞれの天然塩基を含むＤＮＡのものより大きいことを意味する。

「融解温度」または「Ｔｍ」は、通常は二本鎖である核酸の相補複合体が、一本鎖に半分に解離される温度をさす。これらの用語は、同じポリヌクレオチドの二つ以上のフラグメントが相補的様式で互いに相互作用して、複合体、例えばヘアピン様構造等を形成する、ポリヌクレオチド二次構造の安定性を表す際にも使用される。Ｔｍ値の単純な推定値は、核酸が１ＭのＮａＣｌの水溶液中にあるとき、式Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）を用いて計算されうる。「隣接」アプローチの塩基対熱力学を用いて、より正確な計算は行われうる（Ｂｒｅｓｌａｕｅｒ Ｋ．Ｊ．等（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：３７４６−３７５０；ＳａｎｔａＬｕｃｉａ Ｊ．Ｊｒ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：１４６０−１４６５）。

「標識」という用語は、検出可能なシグナルを提供するために使用でき、核酸またはオリゴヌクレオチドに結合できる、任意の原子または分子をいう。標識には、同位体、^３２Ｐ等の放射標識；ビオチン等の結合部分；ジオキシゲニン等のハプテン；発光性、質量タグ；リン光または蛍光部分、単独またはＦＲＥＴ効果によって発光スペクトルを抑制またはシフトできる他の色素または部分と組み合わせた蛍光色素が含まれるがこれに限られない。標識は、蛍光、放射能、比色法、重量測定、Ｘ線回折または吸収、磁気、酵素活性、質量分析、結合能などにより検出可能なシグナルを提供しうる。標識は、帯電部分であり、あるいは中性の電荷でありうる。標識は、標識を含む配列が検出可能な限り、核酸またはタンパク質配列を含みまたはそれから成りうる。

「反応混合物」は、一般に、逆転写反応、増幅反応および／または検出反応を実行するために必要な反応物を含む溶液をさし、これには、標的核酸、ＤＮＡポリメラーゼ、オリゴヌクレオチドプライマー、プローブまたは他のオリゴヌクレオチド成分等の主成分に加えて、検出薬剤、特殊酵素、修飾されたものを含むヌクレオシド５’−三リン酸、反応の間にｐＨを選択されたレベルに維持するための緩衝剤、塩類、補因子および添加剤、例えば１−メチル−２−ピロリドン、グリセロール、ポリ（エチレングリコール）、ジメチルスルホキシドまたはホルムアミド等も任意で含みうる。

本明細書において使用される「キット」という用語は、材料を送達するための任意のシステムを指す。反応アッセイの文脈においては、このような送達システムは、一般にアッセイを実行するための書面の指示を伴って提供される、一つの場所から他の場所への、適切な容器内におけるオリゴヌクレオチド、緩衝成分、添加剤、反応促進剤、酵素等の反応成分の貯蔵、輸送および／または送達を可能にする要素を含む。キットは、関連の反応試薬および支持材料を含む、一つ以上の封入物またはボックスを含みうる。キットは、容器の各々が全てのキットの構成要素の一部を含む、二つ以上の別々の容器を含みうる。容器は、意図されたレシピエントに一緒または別々に送達されうる。

逆転写を介した修飾ｃＤＮＡの合成
上記の如く、本発明の重要な態様は、ＲＮＡ標的配列の逆転写による、修飾ｃＤＮＡの合成に関する。逆転写は、逆転写酵素活性を有するＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ酵素が相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）のテンプレートに依存した合成を触媒する、周知のプロセスである。例えば中で説明されるものとして、例えばＳｉｍｐｓｏｎ Ｄ．等（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１５１：４８７−４９２；Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ Ａ．等（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１７：２９１９−２９３２、および多くの他の参考文献に記載のように、目的のＲＮＡ標的配列が、逆転写反応において、ｃＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ二重鎖または二重鎖ｃＤＮＡに転換されうる。これらの方法は、デオキシヌクレオシド５’−三リン酸（ｄＮＴＰ）の存在下で、ＲＮＡテンプレートにハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプライマーを伸長する逆転写酵素に依存する。

本発明によれば、逆転写酵素酵素が、塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰを基質として採用および使用できること、さらに、そのような塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰの逆転写の間のｃＤＮＡへの組み込みが、ハイブリダイゼーション特性の改善、その結果、後続の標的配列の増幅ベースの検出における効率および感度の改善を提供することが分かっている。したがって、本発明によれば、塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰを含む修飾ｃＤＮＡを合成することによる、ＲＮＡ配列、特に小さなＲＮＡ配列（例えばｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ）の増幅ベースの検出のための、改善された方法が提供される。

増強されたハイブリダイゼーション特性を有する本発明の修飾ｃＤＮＡは、逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼ（例えば逆転写酵素）および少なくとも一つ、多くの場合には二つ以上の塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰを含むｄＮＴＰの混合物の存在下で、逆転写反応を行うことにより生成される。天然のｄＮＴＰの一つ以上がそれぞれの塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰで部分的または完全に置換されるという条件で、本発明の逆転写反応は、四つの天然ｄＮＴＰ（ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰおよびｄＧＴＰ）の全てを含みうる。

本明細書に方法において有用な塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰは、逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼ酵素の基質として働き、ｄＮＴＰアナログが組み込まれた結果増強された二重鎖安定性を有するｃＤＮＡ配列の合成を触媒する、ｄＮＴＰアナログを含むがこれに限定されない。

本発明のある例示的な塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰは、ヌクレオチド塩基が修飾された２−デオキシ−Ｄ−リボースを含む。そのようなヌクレオシドアナログは、例えばＴｏｗｎｓｅｎｄ Ｌ．Ｂ．編（１９８８）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹに例示される有機化学の周知の技術を適用して合成されうる。それぞれの５’−三リン酸は、例えばＶａｇｈｅｆｉ Ｍ．編（２００５）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ Ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ａｎａｌｏｇｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓに記載されるプロトコルを用いて得られる。本発明の塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰは、市販のソースから得られる一定のｄＮＴＰ、例えばＴｒｉｌｉｎｋ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を含む。

本発明で使用される他の例示的な塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰは、例えば、５−位で置換され、逆転写酵素酵素の基質であるピリミジンを含む。

他の実施態様においては、本発明で使用される塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰは、以下

の化学式を有し、式中、Ｂは、

より選択され；
Ｘは、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＣＨ_３または

より選択され；
Ｙは、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉまたは

より選択され；
Ｒは、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＣＨ_３または−ＮＨ_２である。

より特定の実施形態においては、本明細書の方法で使用される塩基修飾、二重鎖安定化ｄＮＴＰは、ｄ（２−ａｍＡ）ＴＰ、ｄ（５−ＰｒＵ）ＴＰ、ｄ（５−ＰｒＣ）ＴＰ、またはその組み合わせより選択される。

当業者には当然のことながら、特定の増幅反応の性質に応じて、特にＤＮＡポリメラーゼ以外の酵素（制限エンドヌクレアーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ等）を含むものでは、方法の一定の調整および変更が、塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰの使用において行われうる。塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰは、反応またはＤＮＡ合成の重要な成分である他の酵素活性を妨げないのが好ましい。これは特定の増幅スキームにおいて使用される塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰの選択を左右し得、これらの酵素の特性に基づいて選択が行われうるが、これは公知技術である。

修飾ｃＤＮＡの核酸増幅
上述のように合成される修飾ｃＤＮＡは、後の操作（例えば増幅反応）の間に少なくとも一つおよび好ましくは二つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブと相互作用して、増強されたハイブリダイゼーション特性を有する本発明の修飾ｃＤＮＡのおかげで、二重鎖安定化塩基アナログにより修飾されていないｃＤＮＡと比較して増強された安定性を有するハイブリダイゼーション複合体を形成しうる。その結果、後の増幅反応の間に修飾ｃＤＮＡにハイブリダイズするプライマーまたはプローブは、例えば、その増強されたハイブリダイゼーション特性の結果として、改善された感度、効率、収率等を提供する。

したがって、本発明の別の態様によれば（ａｃｃｏｅｒｄｉｎｇ ｔｏ）、修飾ｃＤＮＡを生成するための標的配列の逆転写の後、上述のように、標的配列のコピー数を増加させるために核酸増幅反応が行われる。一つの好ましい実施形態では、標的核酸の増幅は、「ポリメラーゼ連鎖反応法」（「ＰＣＲ」）（Ｍｕｌｌｉｓ Ｋ．Ｂ．等、米国特許第４，６８３，１９５号； Ｍｕｌｌｉｓ Ｋ．Ｂ．，米国特許第４，６８３，２０２号）を用いて達成される。最も一般的に使用されるＰＣＲプロフィールは、一つのプライマーの伸長が次のＰＣＲサイクルにおいて他方のプライマーのテンプレートを提供するように設計される、各鎖につき一つの、二つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いる。一般に、ＰＣＲは、（ｉ）標的配列を含む二本鎖核酸の鎖を分離する変性ステップと、これに続く（ｉｉ）プライマーを標的配列に隣接する位置にアニーリングさせるアニーリングステップと；（ｉｉｉ）５’から３’の方向にプライマーを伸長し、これにより標的配列に相補的な配列を有する『アンプリコン』核酸を形成する、伸長ステップの、反復（またはサイクル）からなる。上の三つのステップの各々は、自動サーモサイクラを用いて、異なる温度で行われうる。ＰＣＲサイクルは、必要な回数反復されてよく、少なくとも理論的には、使用されるプライマーの５’末端により末端が規定される標的ＤＮＡフラグメントの指数的蓄積が生じる。具体的温度、各ステップのインキュベーション時間、およびステップ間の変化率は、関連技術の当業者に周知の多くの要素に依存し、関連の例は、多数の公開されたプロトコル、例えばＭｃＰｈｅｒｓｏｎ Ｍ．Ｊ．等（１９９１および１９９５）等に見つけることができる。ＰＣＲの条件は多様でありうるが、従来のＰＣＲでは、二本鎖標的核酸は一般に＞９０℃の温度で変性され、プライマーは５０〜７５℃の範囲の温度でアニールされ、伸長は一般に７２〜７８℃の範囲で行われる。アニーリングおよび伸長が単一のステップに組み合わされたＰＣＲ反応が行われうることも周知である。

ＰＣＲを実行するためのその他の手引きは、例えば、Ｃｌｅｍｅｎｔｉ Ｍ．等（１９９３）ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ．，２：１９１−１９６；Ｃｌｅｇｇ Ｒ．Ｍ．（１９９２）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２１１：３５３−３８８；Ｃｌｅｍｅｎｔｉ Ｍ．等（１９９３）ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ．，２：１９１−１９６；Ｌｉｅ Ｙ．Ｓ．およびＰｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ Ｃ．Ｊ．（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，９：４３−４８；Ｌｉｖａｋ Ｋ．Ｊ．等（１９９５）ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，４：３５７−３６２；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ Ｍ．Ｊ．等編（１９９１）ＰＣＲ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ．ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ Ｍ．Ｊ．等編（１９９５）ＰＣＲ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ．ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ、および本明細書において参照される多くの他の原稿に見つけることができる。

ＰＣＲに加え、多数の核酸増幅技術があり、それは当該技術分野で公知かつ利用可能であり、その多くは本発明の用途に容易に適用されうる。

一つの増幅方法は、ＳＤＡと一般に呼ばれる鎖置換型増幅（Ｗａｌｋｅｒ，Ｇ．等（１９９２），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９，３９２−３９６；Ｗａｌｋｅｒ等，“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔａｒｇｅｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，”米国特許第５，２７０，１８４号；Ｗａｌｋｅｒ，“Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，”米国特許第５，４５５，１６６号；およびＷａｌｋｅｒ等（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０，１６９１−１６９６）であり、標的配列の対向する鎖に対するプライマー配列対のアニーリングと、二重鎖ヘミホスホロチオエート化プライマー伸長産物を生成するための、ｄＮＴＰの存在下でのプライマー伸長と、ヘミ修飾制限エンドヌクレアーゼ認識部位のエンドヌクレアーゼを介したニッキングと、既存の鎖を置換し、プライマーアニーリング、ニッキングおよび鎖置換の次のラウンドのための鎖を生成するための、ニックの３’末端からのポリメラーゼを介したプライマー伸長のサイクルを用い、産物の幾何学的増幅が生じる。好熱性ＳＤＡ（ｔＳＤＡ）は、基本的に同じ方法において、好熱性エンドヌクレアーゼおよびポリメラーゼをより高温で使用する（欧州特許第０６８４３１５号）。

他の例示的な増幅方法には、一般にＮＡＳＢＡと呼ばれる、核酸配列ベースの増幅（Ｍａｌｅｋ等、米国特許第５，１３０，２３８号）；一般にＱβレプリカーゼと呼ばれる、プローブ分子自体を増幅するためにＲＮＡレプリカーゼを使用するもの（Ｌｉｚａｒｄｉ，Ｐ．等（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌ．６，１１９７−１２０２）；転写ベースの増幅法（Ｋｗｏｈ，Ｄ．等（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，１１７３−１１７７）；自家持続配列複製法（Ｇｕａｔｅｌｌｉ，Ｊ．等（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，１８７４−１８７８；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ（１９９３）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ９，１９９−２０２；およびＬｅｅ，Ｈ．等，ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＡＭＰＬＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ（１９９７））；および、一般にＴＭＡと呼ばれる、転写媒介増幅法（Ｋａｃｉａｎ等，“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ，”米国特許第５，４８０，７８４号；およびＫａｃｉａｎ等，米国特許第５，３９９，４９１号）が含まれる。公知の増幅方法に関するさらなる議論については、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｐｅｒｓｉｎｇ等編），ｐｐ．５１−８７（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）中の、Ｐｅｒｓｉｎｇ，Ｄａｖｉｄ Ｈ．，１９９３，“Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”を参照。さらに他の例示的増幅方法には、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）（Ｌｉｚａｒｄｉ，“Ｒｏｌｌｉｎｇ Ｃｉｒｃｌｅ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，”米国特許第５，８５４，０３３号）；ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）（Ｋｏｎｇ等，“Ｈｅｌｉｃａｓｅ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，”米国特許出願公開第２００４−００５８３７８ Ａ１号）；およびループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）（Ｎｏｔｏｍｉ等，“Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ，”米国特許第６，４１０，２７８号）が含まれる。

ＤＮＡポリメラーゼは、本発明の核酸増幅を行う上で明らかに重要な成分である。本発明で有用なＤＮＡポリメラーゼは、天然ポリメラーゼならびに５’〜３’および／または３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くポリメラーゼ変異体の両方を含む。核酸ポリメラーゼは、様々な程度の耐熱性を有しうる。ＤＮＡポリメラーゼの選択は、本発明において適用される増幅および検出反応の選択に通常関係する多くのファクターにより決定される。ある実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼが、オリゴヌクレオチドプライマーを伸長できる温度で、鎖置換型活性を呈するのが好ましい。ＤＮＡ増幅がＤＮＡ鎖の一つの置換に基づく多くの等温増幅、例えばＳＤＡおよびローリングサークル増幅のケースにおいては、ＤＮＡポリメラーゼが、５’〜３’のエキソヌクレアーゼ活性を欠くのが好ましい。ＤＮＡポリメラーゼは、バクテリオファージ、古細菌、真正細菌、および真核生物酵素を含む様々な天然のソースから単離されうる。

５’〜３’および３’ 〜５’のエキソヌクレアーゼ活性の両方を欠く市販の酵素には、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（ｅｘｏ−Ｔ７；ＵＳＢ）、Ｐｆｕ ｅｘｏ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｅｘｏ−Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）、ｅｘｏ−ＤｅｅｐＶｅｎｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）、ｅｘｏ−Ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、Ｂｓｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、Ｉｓｏｔｈｅｒｍ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）、Ｓｔｏｆｆｅｌ ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ（ＵＳＢ）、およびＴａｑＦＳ（Ｈｏｆｆｉｎａｎ−ＬａＲｏｃｈｅ）が含まれる。検出ＰＣＲアッセイに有用な熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの例には、Ｐｆｕ、Ｔａｑ、Ｖｅｎｔ、Ｄｅｅｐ ＶｅｎｔおよびＵｌＴｍａ ＤＮＡポリメラーゼ、ならびにＴｈｅｒｍｕｓ属またはＴｈｅｒｍａｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａからの他のポリメラーゼが含まれるがこれに限定されない。検出ＰＣＲのための熱安定性ポリメラーゼは、好ましくは＞９０℃、より好ましくは＞１００℃の温度で活性を山。ある検出反応、例えばＴａｑＭａｎアッセイは、５’〜３’エキソヌクレアーゼ活性を発現するＤＮＡポリメラーゼの使用を要する。本明細書に提供される実施例では、ＳｉｇｍａからのＪｕｍｐＳｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼが使用された。

本発明の反応成分は、ＤＮＡ増幅反応の選択により変動しうる。主成分に加えて、本発明の反応物および反応混合物は、検出剤、特殊酵素（例えばヌクレアーゼ、ＦＥＮエンドヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、ＲＮアーゼＨを含むＲＮアーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ヘリカーゼ等）、反応中にｐＨを選択されたレベルで維持するための緩衝剤、塩類、補因子および添加剤、例えば１−メチル−２−ピロリジノン、グリセロール、ポリ（エチレングリコール）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはホルムアルデヒド等を含むがこれに限定されない。

オリゴヌクレオチドプライマーは、本発明の増幅反応において、修飾ｃＤＮＡの合成および増幅を開始させる。オリゴヌクレオチドプライマーは、精製された制限消化物の場合のように自然に生じても、または合成生産されてもよい。ＤＮＡポリメラーゼの存在下でプライマー伸長が生じるためには、本発明のオリゴヌクレオチドプライマーが、テンプレート鎖とハイブリダイズするために十分に相補的でなければならない。オリゴヌクレオチドプライマーの配列は、ハイブリダイズしてプライマー伸長に関与するために十分に相補的であれば、それらがハイブリダイズするように設計される標的核酸の正確な配列を反映する必要はない。例えば、プライマーの５’末端に非相補的ヌクレオチドフラグメントが結合され、プライマー配列の残部が鎖に対して実質的に相補的でありうる。プライマー配列がテンプレートの配列とハイブリダイズするために十分な相補性を有し、これによりオリゴヌクレオチドプライマーの伸長産物の合成のためのテンプレート−プライマー複合体を形成することを条件として、非相補的塩基またはより長い配列がプライマー内に散在しうる。プライマー設計は、用いられる具体的な増幅反応により誘導されうる。例えば、ＳＤＡ増幅のために設計されるプライマーは、増幅反応を支持する制限エンドヌクレアーゼの配列を組み込む。例えば、Ｗａｌｋｅｒ Ｇ．Ｔ．等，米国特許第５，２７０，１８４号；Ｄａｔｔａｇｕｐｔａ Ｎ．等，米国特許第６，２１４，５８７号；Ｗａｌｋｅｒ Ｇ．Ｔ．等，（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２４：３８４−３５３；Ｗａｌｋｅｒ Ｇ．Ｔ．等，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：３９２−３９６；Ｓｐａｒｇｏ Ｃ．Ａ．等，（１９９６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，１０：２４７−２５６。

オリゴヌクレオチドプライマーは、通常は合成の性質であり、天然核酸には一般に存在しない、原子、部分、残基、ポリマー、リンカー等の構造修飾物を含みうる。オリゴヌクレオチドプライマーは、検出可能標識、例えば同位体、^３２Ｐ等の放射性標識、ビオチン等の結合部分、ジオキシゲニン等のハプテン、発光性、質量タグ、リン光または蛍光部分、蛍光色素等を組み込みうる。プライマーは通常、ＤＮＡ増幅の間に組み込まれるため、標識を用いて本発明の修飾ＤＮＡを検出しうる。オリゴヌクレオチドプライマーは、イノシン（ヒポキサンチン）、５−ブロモウラシル、５−メチルシトシン、５−ヨードウラシル、２−アミノアデノシン、６−メチルアデノシン、シュードウリジン等を含むがこれに限定されない、天然核酸にはめったに存在しないヌクレオシドまたはヌクレオチドアナログも組み込みうる。

ある実施形態においては、オリゴヌクレオチドプライマーは、二重鎖安定化効果をもたらす構造修飾物を組み込む。しかし、本発明のすべての態様において、プライマーの３’末端が、ＤＮＡ合成の開始を妨げる様式でブロックされてはならない。オリゴヌクレオチドプライマーの設計に使用されうる構造修飾物の例には、通常は５’末端に連結される副溝バインダー（ＭＧＢ）（Ａｆｏｎｉｎａ Ｉ．等（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：２６５７−２６６０）および一定のヌクレオチドアナログが含まれるがこれに限定されない。ヌクレオチドアナログの例には、「ユニバーサル」塩基（Ｂｕｒｇｎｅｒ Ｄ．等（２００４）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，２３：７５５−７６５）および「ロックド核酸」（「ＬＮＡ」）（Ｌａｔｏｒｒａ Ｄ．等（２００３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ，１７：２５３−２５９；Ｌａｔｏｒｒａ Ｄ．等（２００３）Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．，２２：７９−８５；Ｄｉ Ｇｉｕｓｔｏ Ｄ．Ａ．およびＫｉｎｇ Ｇ．Ｃ．（２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３２：ｅ３２）が含まれる。多数の塩基修飾ヌクレオチドアナログが、ＤＮＡポリメラーゼにより十分に耐容され、これらのアナログがプライマー設計において使用されうる。そのような塩基修飾ヌクレオチドアナログの例には、５−メチルシトシンおよび２，６−ジアミノプリンが含まれるがこれに限定されない（Ｌｅｂｅｄｅｖ Ｙ．等（１９９６）Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．，１３：１５−２１）。

オリゴヌクレオチドプライマーは、標識され、標識された修飾ＤＮＡを増幅するために使用されうる。標識は、核酸検出段階で使用される。好ましい標識は、蛍光標識である。一態様においては、オリゴヌクレオチドプライマーが、オリゴヌクレオチドプローブ、例えば、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプライマーと連結されうる（Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅ Ｄ．等（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１７：８０４−８０７；Ｔｈｅｌｗｅｌｌ Ｎ．等（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２８：３７５２−２７６１）。

オリゴヌクレオチドプローブは、プローブ中の少なくとも一つの配列の修飾ＤＮＡ中のそれぞれの配列との相補性により、逆転写および／または増幅の産物と二重鎖構造または他の複合体を形成できる、オリゴマーまたはポリマーである。本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、修飾され、または構造修飾物を含みうる。一定の修飾物がオリゴヌクレオチドプローブ中に一般に存在し、これらは通常、ＤＮＡの検出において使用される標識に関係する。蛍光標識オリゴヌクレオチド、および、特にＦＲＥＴプローブが、有用な検出成分である。オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーは、本発明の修飾ＤＮＡにハイブリダイズすると、修飾ＤＮＡの増強されたハイブリダイゼーション特性により、安定化した相補複合体を形成する。オリゴヌクレオチドプライマーとは異なり、オリゴヌクレオチドプローブには、構造修飾に関する制限がほとんどない。これは、ハイブリダイゼーション誘発ＦＲＥＴプローブ技術に特にあてはまる。例えば、オリゴヌクレオチドプローブは、完全に非天然ＰＮＡモノマーで作られうる。例えば、Ｏｒｔｉｚ Ｅ．等（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ，１２：２１９−２２６。ＬＮＡなどのプローブ設計における他の塩基修飾または糖修飾ヌクレオチドアナログの使用も、幅広く適用できる（Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｍ．Ｐ．等（２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３２：ｅ５５；Ｓｉｍｅｏｎｏｖ Ａ．およびＮｉｋｉｆｏｒｏｖ Ｔ．Ｔ．（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３０：ｅ９１）。オリゴヌクレオチドプローブは、いずれかの末端に接合されたＭＧＢ部分を担持しうる。例えば、５’−ＭＧＢ−接合ＦＲＥＴプローブは、検出ＰＣＲにおいて切断されず、これらのプローブは、Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ Ｎ．等（２００２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌｉｇａｎｄ Ａｓｓａｙ，２５：２６８−２７５に記載されるように、ハイブリダイゼーションにより誘発される作用機序によりシグナルを提供する。３’−ＭＧＢ−接合ＦＲＥＴプローブは、５’−ヌクレアーゼ分解からブロックされず、これらのプローブは、Ｋｕｔｙａｖｉｎ Ｉ．Ｖ．等（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２８：６５５−６６１に例示されるように、Ｔａｑポリメラーゼによる切断により蛍光シグナルを生成する。

オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブは、当該技術分野において周知の技術を用いて合成されうる。プライマーは、例えば適切な配列のクローニングおよび制限消化分析により調製されうるが、直接的な化学合成が好ましいアプローチである。オリゴヌクレオチドは、例えば、Ｂｒｏｗｎ Ｅ．Ｌ．等（１９７９）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，６８：１０９−１５１に開示されるホスホジエステル法、Ｎａｒａｎｇ Ｓ．Ａ．等（１９７９）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，６８：９０−９８に記載されるホスホトリエステル法を含む、適切な化学合成法により調製されうる。別のアプローチは、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ Ｍ．Ｈ．，Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ Ｍ．Ｄ．（１９８４）米国特許第４，４５８，０６６号に開示される固体担体法と組み合わせて使用され、市販の自動オリゴヌクレオチド合成装置の一つを用いて行われうる、Ｂｅａｕｃａｇｅ Ｓ．Ｌ．，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ Ｍ．Ｈ．（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，２２：１８５９−１８６２に開示されるジエチルホスホラミデート法である。

一般に、オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブは、上に開示され、引用される技術を含む、当該技術分野において公知の特定の増幅または検出技術のルールおよび規格にしたがって設計される。オリゴヌクレオチド成分には一定の一般的必要条件があり、例えば、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性は、融解温度（Ｔｍ）と通常呼ばれる特定の反応の温度に対応する必要がある。Ｔｍは、オリゴヌクレオチド成分の標的核酸との相補複合体が、一本鎖に半分に解離した状態になる温度を表す。Ｔｍ値の簡単な推定値は、核酸が１Ｍ ＮａＣｌの水溶液中にあるときに、式Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）を用いて計算されうる。「隣接」アプローチの塩基対熱力学を用いて、より正確な計算がなされうる（Ｂｒｅｓｌａｕｅｒ Ｋ．Ｊ．等（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：３７４６−３７５０；ＳａｎｔａＬｕｃｉａ Ｊ．Ｊｒ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：１４６０−１４６５）。Ｏｌｉｇｏ（商標）を含む市販のプログラム、Ｐｒｉｍｅｒ３およびＯｌｉｇｏ Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒを含むインターネット上で利用できるＰｒｉｍｅｒ Ｄｅｓｉｇｎおよびプログラムも、本発明により有用な核酸配列のＴｍを計算するために用いられうる。市販のプログラム、例えばＶｉｓｕａｌ ＯＭＰ（ＤＮＡ ｓｏｆｔｗａｒｅ）、Ｂｅａｃｏｎ ｄｅｓｉｇｎｅｒ ７．００（Ｐｒｅｍｉｅｒ Ｂｉｏｓｏｆｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）が、ＰＣＲベースおよびＮＡＳＢＡ増幅反応のためのＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ、ＴａｑＭａｎおよびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ検出システムでの実時間アッセイの設計において使用されうる。一般に、オリゴヌクレオチドプローブのＴｍ値は、対応する増幅プライマーのＴｍより５〜７℃高い。

さらに、一定の増幅スキームにより必要とされる場合には、本発明の反応混合物は、塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰ以外のｄＮＴＰアナログも組み込みうる。例えば、Ｗａｌｋｅｒ Ｇ．Ｔ．等（１９９３）米国特許第５，２７０，１８４号に記載されるＳＤＡ増幅は、二本鎖ＤＮＡの一方の鎖のニッキングを促進するために、α−チオｄＮＴＰアナログの使用を要する。デオキシウリジン５’−三リン酸（ｄＵＴＰ）は、さらに別の例である。この塩基修飾物は、ＤＮＡ二重鎖を不安定化することが知られているが、そのような修飾ＤＮＡの選択的使用も、本発明の範囲内である。ここでのｄＵＴＰの主な目的は、Ｇｅｌｆａｎｄ Ｄ．Ｈ．等（１９９５）米国特許第５，４１８，１４９号に記載されるように、試料から試料への汚染のキャリーオーバーの防止である。

増幅産物の検出
本発明の増幅されたＤＮＡは、電気的力（例えば電気泳動）、重力（例えば沈降）、分光法（例えば放射線分光法、ＵＶ、質量分析、蛍光、化学発光、化学蛍光等）、吸収、磁気、クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ、逆相、イオン交換、体積排除等）、タンパク質との反応（制限酵素、エンドヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、キナーゼおよび他の酵素活性）、結合親和性等を含むがこれに限定されない、任意の物理的、化学的または生物学的手段により検出されうる。ある実施形態においては、増幅産物が、増幅段階の間または直後に標識され、標識が増幅産物の検出に使用される。例示的な標識には、同位体、^３２Ｐ等の放射性標識、ビオチン等の結合部分、発光性および質量タグ、リン光または蛍光部分、単独またはＦＲＥＴ効果により発光スペクトルを抑制またはシフトできる他の色素もしくは部分と組み合わせた蛍光色素が含まれるがこれに限定されない。

他の実施形態においては、増幅反応の間（実時間）または後に、検出剤を用いて増幅産物が検出されうる。ある好ましい検出剤は、インターカレーティング色素および蛍光剤、例えば臭化エチジウムである。例えば、Ｗｉｔｔｗｅｒ Ｃ．Ｔ．等により米国特許第６，１７４，６７０号および第６，５６９，６２７号に、ならびにＨｉｇｕｃｈｉ Ｒ．等（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：４１３−４１７；Ｈｉｇｕｃｈｉ Ｒ．等（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１：１０２６−１０３０に記載されるように、インターカレーティング色素を用いて、ＰＣＲにおける増幅産物を検出できる。ある例示的な蛍光剤は、核酸と相互作用するとその蛍光特性を変化させ、これにより検出可能シグナルを提供する分子を含む。Ｓｃｈｎｅｅｂｅｒｇｅｒ Ｃ．等（１９９５）ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ．，４：２３４−２３８およびＭａｃｋａｙ Ｊ．，Ｌａｎｄｔ Ｏ．（２００７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３５３：２３７−２６２に記載のように、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩおよびＩＩは、そのような蛍光剤の例である。

ある態様においては、増幅産物の検出は、「実時間」で行われる。標的増幅中にすべての検出成分が利用可能であり、反応条件（例えば温度、緩衝剤、塩類、補因子、スカベンジャー等）が反応の両段階−増幅および検出−を支持し、これにより増幅反応の進行とともに標的核酸を測定でき、増幅物質の検出に必要な後続の処理ステップの数が減少するとき、実時間検出が可能である。従って、本明細書において使用されるところの、「実時間ＰＣＲ」という用語は、反応生成物、例えば増幅された標的核酸の量が、反応の進行と同時にモニタリングされるＰＣＲをさす。実時間ＰＣＲは主に、反応において標的核酸の増幅をモニタリングするための検出化学において異なる。例えば、Ｇｅｌｆａｎｄ等、米国特許第５，２１０，０１５号は、５’−ヌクレアーゼ切断可能ＦＲＥＴプローブ（「ＴａｑＭａｎ」）の使用を記載し；Ｔｙａｇｉ等、米国特許第５，９２５，５１７号は、ハイブリダイゼーション誘発ＦＲＥＴプローブ（「Ｂｅａｃｏｎｓ」）の使用を記載する。実時間ＰＣＲの検出化学の概論は、Ｄｉｄｅｎｋｏ Ｖ．Ｖ．（２００１）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３１：１１０６−１１２１；Ｍａｃｋａｙ Ｉ．Ｍ．等（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３０ １２９２−１３０５，およびＭａｃｋａｙ Ｊ．，Ｌａｎｄｔ Ｏ．（２００７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３５３ ２３７−２６２にも見られる。

増幅産物は、オリゴヌクレオチドプローブを使用して検出することもできる。オリゴヌクレオチドプローブは、ＤＮＡと配列特異的様式で相互作用して複合体（例えば、相補二重鎖）を形成し、この複合体は、本明細書の方法により必要に応じてより安定化されうる。一般に、複合体の安定性が検出の感度を決定する。したがって、オリゴヌクレオチドプローブと修飾ＤＮＡの間の複合体の安定化は、検出アッセイに様々な方法で恩恵をもたらし得る。

別の実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは標識を組み込み、この標識が、本発明の修飾ＤＮＡの検出に使用される。一実施形態においては、この標識は蛍光標識であり、蛍光偏光技術による修飾ＤＮＡの検出に使用される。別の実施形態においては、オリゴヌクレオチドプローブは、ＦＲＥＴプローブである。修飾ＤＮＡの検出におけるＦＲＥＴプローブの適用は、例えば、検出アッセイを実時間で行い、試料中の標的核酸の量を測定する上で、利点を提供しうる。増幅反応がＰＣＲであるとき、このタイプのアッセイは、「定量的ＰＣＲ」と呼ばれる。ＦＲＥＴプローブは、一般に二つの発色団を含む。「アクセプター」発色団は、「レポーティング」発色団の蛍光を消光するために選択される非蛍光色素でありうる（Ｅｆｔｉｎｋ Ｍ．Ｒ．（１９９１）Ｉｎ Ｌａｋｏｗｉｃｚ Ｊ．Ｒ．（編），Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ．Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｖ．２：５３−１２６）。標的核酸とプローブの間の配列特異的ハイブリッドの形成は、プローブの蛍光特性の変化をもたらし、核酸標的の検出を提供する。実時間ＦＲＥＴ−ベースのアッセイは、特に臨床診断に適する。インターカレーティング色素および蛍光剤（例えば臭化エチジウム、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ）とは異なり、この検出は配列特異的であり、偽陽性結果を事実上除去する。

ＦＲＥＴ効果を利用する多くの検出戦略が、報告されている。一つのＦＲＥＴ戦略は、ハイブリダイゼーション誘発ＦＲＥＴプローブアプローチであり、これは、標的核酸と蛍光オリゴヌクレオチドプローブの間の配列特異的複合体形成の結果としての、ドナー色素とアクセプター色素の間の距離変化に基づく。例えば、Ａｄｊａｃｅｎｔ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｂｅ法は、例えばＥｆｔｉｎｋ Ｍ．Ｒ．（１９９１）Ｉｎ Ｌａｋｏｗｉｃｚ Ｊ．Ｒ．（編），Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ．Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｖ．２：５３−１２６；Ｈｅｌｌｅｒ Ｍ．Ｊ．およびＭｏｒｒｉｓｏｎ Ｌ．Ｅ．（１９８５）Ｉｎ Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ，Ｄ．Ｔ．およびＦａｌｋｏｗ，Ｓ．（編），Ｒａｐｉｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ａｇｅｎｔｓ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２４５−２５６；Ｃａｒｄｕｌｌｏ Ｒ．Ａ．等（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：８７９０−８７９４に記載されるように、隣接する標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズする二つのオリゴヌクレオチドプローブを利用する。両方のプローブが標的ＤＮＡにハイブリダイズしたときに、ドナーおよびアクセプターフルオロフォアが十分に空間的に近づけられて検出可能ＦＲＥＴを可能にするように、プローブの各々が適切なプローブ末端でＦＲＥＴ−対色素で標識される。

代替的アプローチは、ＰＣＲの間除去される消光性蛍光プローブを利用する（例えば米国特許第５，８０４，３７５号）。これらのプローブは、同じプローブに接合された蛍光レポーターおよび消光部分を含む。ランダムオリゴヌクレオチドコイリングにより、消光部分が、レポーター色素の蛍光を消光するために十分に近くにある。プローブが相補ポリヌクレオチド標的にハイブリダイズされると、消光部分とレポーター部分が分離され、したがってレポーター色素の蛍光発光が可能になる。このアプローチに伴うことが多いバックグラウンドの問題は、柔軟なＰＮＡ骨格を伴うオリゴヌクレオチドを合成することにより解決できる。例えば、Ｏｒｔｉｚ Ｅ．等（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ，１２：２１９−２２６。

あるいは、分子間のステム形成によりＦＲＥＴ色素が近づけられるヘアピン形のオリゴヌクレオチドプローブ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎｓを使用して、効率的なＦＲＥＴ検出が達成されうる。例えば、Ｔｙａｇｉ Ｓ．およびＫｒａｍｅｒ Ｆ．Ｒ．（１９９６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１４：３０３−３０８；Ｂｏｎｎｅｔ Ｇ．等（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：６１７１−６１７６；Ｔｙａｇｉ Ｓ．等（２０００）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１８：１１９１−１１９６；Ｍａｒｒａｓ Ｓ．Ａ．Ｅ．等（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３０：ｅ１２２。分子ビーコン法は、著しく低い蛍光バックグラウンドを有する。これらのプローブは、例えばＰｉａｔｅｋ Ａ．Ｓ．等（１９９８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：３５９−３６３；Ｌｅｗｉｎ Ｓ．Ｒ．等（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３：６０９９−６１０３に記載のように、実時間ＰＣＲにおける使用に良く適している。

ＰＣＲプライマーに対する分子ビーコンプローブの共有結合は、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプライマーのユニークな特性である。例えばＷｈｉｔｃｏｍｂｅ Ｄ．等（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１７：８０４−８０７；Ｔｈｅｌｗｅｌｌ Ｎ．等（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２８：３７５２−３７６１。「Ｓｃｏｒｐｉｏｎ」においては、ＰＣＲプライマーの５’末端が、長い柔軟なリンカーにより分子ビーコンの３’末端に接合される。このリンカーは、ＤＮＡポリメラーゼのテンプレートではなく、従ってビーコン配列を超える伸長を排除する。分子ビーコンのゲノム部分は、プローブが共有結合されるプライマーの標的伸長産物に結合するように設計される。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎとは異なり、ＳｃｏｒｐｉｏｎにおけるＤＮＡ検出段階は、分子間反応となる。これは、ハイブリダイゼーションの遅いキネティクスに関連したＢｅａｃｏｎ技術のさらに別の問題を克服するのに役立つ。

Ｅｃｌｉｐｓｅプローブは、低い蛍光バックグラウンドを有する、ハイブリダイゼーションベースのＦＲＥＴプローブのさらに別の例である（Ａｆｏｎｉｎａ Ｉ．Ａ．等（２００２）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３２：９４０−９４９）。Ｅｃｌｉｐｓｅプローブ設計は、一方が非蛍光またはダーククエンチャーである二つのＦＲＥＴ色素に加えて、５’末端に副溝結合（ＭＧＢ）部分を含む。Ｋｕｔｙａｖｉｎ Ｉ．Ｖ．等（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３７１８−３７２３に記載のように、ＭＧＢ−部分の強い、ＤＮＡ−二重鎖−安定化効果のため、プローブは、実時間ＰＣＲ検出に必要なハイブリダイゼーション特性をなお維持しながら、わずか１２〜２０マーの短さで設計されうる。プローブの５’末端のＭＧＢ−テールの配置は、５’−ヌクレアーゼ切断を完全に遮断し、ハイブリダイゼーションにより誘発される色素分離のみにより蛍光シグナルが生成される。

ＦＲＥＴ色素を遠ざけることによるＦＲＥＴ分裂のメカニズムには一定の制限がある。例えば、ＦＲＥＴ効果を完全になくすことは困難であり、プローブは、少なくとも２０〜２４マーでなければならない。短い８〜１２ｂｐプローブ−標的二重鎖においては、「残余の」クエンチングが２０〜５０％にも達しうる（Ｃａｒｄｕｌｌｏ Ｒ．Ａ．等（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：８７９０−８７９４）。さらに、レポーター色素が、隣接塩基、特にグアニンにより、スペクトルのオーバーラップがほとんどないに関わらず、部分的に消光されうる。この効果は周知であり、自己消光蛍光プライマー、またはＬＵＸプライマー（Ｌｉｇｈｔ Ｕｐｏｎ ｅＸｔｅｎｓｉｏｎの略）の名でも知られるＤＮＡ検出技術において用いられている。例えば、Ｎａｚａｒｅｎｋｏ Ｉ．等（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３０：ｅ３７；Ｎａｚａｒｅｎｋｏ Ｉ．等（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３０：２０８９−２１９５。この技術は、フルオレセイン（ＦＡＭ）のような「緑色」色素で最もパフォーマンスが良い。しかし、ＬＵＸプライマーは配列特異的ではない。プライマー−二量体を含む、ＬＵＸプライマー伸長の任意の産物が蛍光シグナルを生成する。

切断可能ＦＲＥＴプローブ。ＦＲＥＴを無効にするための効果的な戦略は、標的核酸へのその結合時のオリゴヌクレオチドプローブの切断に基づく。ＴａｑＭａｎ（商標）技術は、実時間核酸検出法として開発され、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を利用する。例えば、Ｌｉｅ Ｙ．Ｓ．およびＰｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ Ｃ．Ｊ．（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，９：４３−４８。二つのＰＣＲプライマー結合部位の間に位置する標的配列にアニールするように、二重標識ＦＲＥＴプローブが設計される。鎖の伸長の間に、Ｔａｑポリメラーゼが、プライマー部位から下流にハイブリダイズされたプローブを切断し、クエンチャーからレポーター色素を放出させ、こうしてＦＲＥＴを永久かつ不可逆的に分裂する。例えば、Ｌｉｖａｋ Ｋ．Ｊ．等（１９９５）ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，４：３５７−３６２。ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ切断は不可逆的であり、所与のＰＣＲサイクルで生成されるシグナルは、その特定のサイクルで生成されるシグナルと全ての以前のものの合計である。しかし、「古典的」ＴａｑＭａｎ（商標）プローブの高い蛍光バックグラウンドは、この利点に影を落とす。３’−末端でのＭＧＢ部分との接合は、このパラメータの有意な改善をもたらす（Ｋｕｔｙａｖｉｎ Ｉ．Ｖ．等（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２８：６５５−６６１）。比較的短い１２〜１８マーのＭＧＢ−ＴａｑＭａｎ（商標）プローブは、改善されたＳＮＰ識別特性を有する。しかし、ＴａｑＭａｎ（商標）技術は、なおＰＣＲ性能に密接に結びついている一方で、サイクリングプローブ技術（Ｃｙｃｌｉｎｇ Ｐｒｏｂｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ＣＰＴ）は比較的独立している。

サイクリングプローブ技術（ＣＰＴ）。サイクリングプローブ技術（ＣＰＴ）は、使用されうる追加的な検出システムである。これらの反応は、配列特異的な様式で標的核酸に結合するオリゴヌクレオチドプローブの連続的切断に基づく。適切なエンドヌクレアーゼが複合体を認識し、プローブを切断するが、標的鎖は無傷で残され、次の切断ラウンドにリサイクルされる。ハイブリダイズされたプローブが内部的に切断されると、切断産物は、もとのプローブより弱いハイブリッドを形成し、これらのプローブフラグメントが標的鎖から解離し、それを追加的な切断反応ラウンドに利用できる。標的のリサイクルは、標的分子につき二つ以上のプローブが切断されうることを意味する。ＣＰＴ反応においては、シグナルは二つの主変数、標的濃度と時間の関数である。標的濃度が固定されるとき、シグナルは線形に増大する。反応の進行を反映して、切断は減速し、基本的に全てのＣＰＴプローブが切断されると最終的に停止する。いくつかのシステム設計が報告されている。一つのアプローチは、Ｆｏｎｇ Ｗ．等（２０００）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３８：２５２５−２５２９；Ｍｏｄｒｕｚａｎ Ｚ．等（２０００）Ｄｉａｇｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，３７：４５−５０に記載されるように、標的ＤＮＡに結合時にＲＮアーゼＨにより切断されるキメラＤＮＡ−ＲＮＡプローブの使用に基づく。これらのＤＮＡプローブは、オリゴヌクレオチド鎖の途中に少なくとも４〜５のリボヌクレオチドを有するように設計される。ＲＮアーゼＨは、ハイブリダイズされたプローブのＲＮＡ部分のみを切断し、標的ポリヌクレオチドはリサイクルされて、別の未切断のプローブ分子にハイブリダイズする。これにより、適切な条件下で、プローブ切断反応のサイクリングが生じる。例えばＨａｒｖｅｙ Ｊ．Ｊ．等（２００４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３３３：２４６−２５５に記載のように、最近のＲＮアーゼＨの熱安定性アナログの発見および単離により、このＤＮＡ検出技術をＰＣＲと組み合わせることが可能になっている。それぞれのＦＲＥＴプローブは、Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏから入手できる。

別のＣＰＴアプローチは、ＤＮＡにおける脱塩基部位および他の関連の損傷の修復を開始させるＡＰエンドヌクレアーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉからのエンドヌクレアーゼＩＶの、基質特異性に基づく。ＦＲＥＴプローブおよびエンハンサーは、部分的に分解された脱塩基部位を擬態するＡＰエンドヌクレアーゼの基質を共同で形成しうる。酵素はこの人工基質を認識し、プローブの３’−テールを「クリップ」し、これによりレポーター色素を放出させ、ＦＲＥＴを分裂させる。Ｋｕｔｙａｖｉｎ Ｉ．Ｖ．等（２００４）米国特許出願第２００４／０１０１８９３号に記載のように、この反応は、ナノモルまたはナノモル以下の標的ＤＮＡ濃度でも切断プローブの高い収率が達成されるサイクリングモードで行われうる。

別の実施形態では、ＩＮＶＡＤＥＲ（商標）検出アッセイが用いられうる。これは、一定のポリメラーゼのフラップまたは５’−エンドヌクレアーゼ活性を利用して、二つの部分的にオーバーラップするオリゴヌクレオチドを、標的ＤＮＡへのそれらの結合時に切断する。ＩＮＶＡＤＥＲ（商標）アッセイは典型的に、二つの連続したサイクリング切断反応からなる。切断反応を提供するために使用される酵素は、合成能力が実質的に低減または完全に除去されたＤＮＡポリメラーゼ、ＣＬＥＡＶＡＳＥである。例えば、Ｄａｈｌｂｅｒｇ Ｊ．Ｅ．等（１９９７）米国特許第５，６９１，１４２号；第５，８３７，４５０号；第５，８４６，７１７号；第５，９８５，５５７号；第５，９９４，０６９号；第６，００１，５６７号；第６，０９０，５４３号；第６，３４８，３１４号；第６，８７５，５７２号；第６，９１３，８８１号；ならびにＳｃｈｗｅｉｔｚｅｒ Ｂ．およびＫｉｎｇｓｍｏｒｅ Ｓ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１２：２１−２７。検出システムは、事前の標的ＤＮＡ増幅を要しない場合もある、非常に効率的なシグナル増幅アッセイである。しかし、核酸の事前増幅は、ＩＮＶＡＤＥＲアッセイを適用するのに好ましいアプローチである。カセットプローブの非特異的切断の結果、バックグラウンド蛍光が時間とともに線形に増加する。さらに、アッセイは、増幅を行わないときには、相当の標的ＤＮＡ負荷量を要する。例えば、Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ Ｂ．およびＫｉｎｇｓｍｏｒｅ Ｓ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１２：２１−２７。ＣＰＴと核酸増幅技術の組み合わせは、例えば二次構造を有するオリゴヌクレオチドプローブにつきＳｏｒｇｅ Ｊ．Ａ．（２００１）米国特許第６，５８９，７４３号に記載されるように、利点を提供する。

当業者には当然のことながら、本明細書に記載される方法、組成物、反応混合物およびキットに対する他の適切な変形および改変物が、通常の技術を有する技術者に知られる情報を考慮して、本明細書に含まれる本発明の記載から直ちに明らかであり、本発明の範囲またはその任意の実施形態を逸脱することなく、作成されうる。本発明を詳述してきたが、本発明の制限ではなく説明の目的で本明細書に共に含まれる以下の実施例を参照することにより、同がより明確に理解される。

以下に、本発明のある態様および実施形態を図示する実施例が提供される。熟練の技術者には当然のことながら、これらの実施例は、本発明を、本明細書に記載される特定の実施形態に制限することを意図しない。さらに、当業者は、本明細書に記載される技術、材料および方法を用いて、本発明の精神および範囲内にとどまりながら、これらおよび関連の方法を実行するための代替的な逆転写および／または増幅システムを容易に考案および最適化しうる。

本実施例では、逆転写酵素酵素が、塩基修飾ｄＮＴＰを採用および使用しうること、および、修飾ｃＤＮＡへのこれらの塩基修飾ｄＮＴＰの組み込みが、後続の核酸増幅の間の感度、効率、および収率の改善をもたらすことが示される。したがって、本発明によれば、逆転写の間に修飾ｃＤＮＡが合成され、修飾ｃＤＮＡに塩基修飾ｄＮＴＰが組み込まれることによる、改善されたＲＮＡ配列の増幅ベースの検出のための方法が提供される。

１．逆転写
逆転写を実行するために使用される実験プロトコルが以下に記載される。実験は、天然または塩基修飾ｄＮＴＰのいずれかを用いて、並行して行われた。塩基修飾ｄＮＴＰを用いた実験においては、２，６−ジアミノプリンデオキシヌクレオシド５’−Ｏ−三リン酸（ｄ（２−ａｍＡ）ＴＰとも呼ばれる）、５−プロピニルデオキシウリジン５’−Ｏ−三リン酸（ｄ（５−ＰｒＵ）ＴＰとも呼ばれる）、５−プロピニルデオキシシトシン５’−Ｏ−三リン酸（ｄ（５−ＰｒＣ）ＴＰとも呼ばれる）およびｄＧＴＰを含む混合物が使用された。以下に示される量の適切なストック溶液を混合することにより、反応混合物が調製された。フォワードおよびリバースプライマー、ならびに標的ｍｉＲＮＡ配列が、図１に示される。

反応混合物は、５分間６５℃に加熱され、氷上で冷やされた。それから、以下が加えられた：
５× Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ） ４μｌ
０．１ Ｍ ＤＴＴ ２μｌ
水 １μｌ
（５× Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒは、３７５ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１Ｍ ＤＴＴ、２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）を含む） 。

反応混合物が２分間４５℃に加熱されてから、１μｌのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ ＩＩ ＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が加えられた。

ＲＴ反応において使用された温度プロフィールは、６０分間４２℃で加熱；２分間９５０℃で加熱、および１分間４℃に冷却である。

２．増幅
以下に記載される実験プロトコルを用い、ポリメラーゼ連鎖反応法を用いて、逆転写反応から生じたｃＤＮＡ産物が増幅された。天然ｄＮＴＰが、増幅反応において使用された。

（１０×Ｂｕｆｆｅｒは、５００ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ＭｇＣ１２、２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を含んだ）
ＰＣＲ反応で使用された温度プロフィールは：９５℃２’→（９５℃１０’’→５６℃４５’’）_５５
図１に示すように、プライマーは、ｍｉＲ−１５５と称されるｍｉＲＮＡ標的配列に特異的であるように設計された。ｍｉＲ−１５５に相補的なｃＤＮＡテンプレートを生成するための逆転写（ＲＴ）反応において使用するためにリバースプライマーが設計された。リバースプライマーは、８つの塩基に沿ってｍｉＲ−１５５配列と重複し、＞４５℃の予測Ｔｍを有する二重鎖を形成した。

しかし、図１にみられるように、フォワードＰＣＲプライマーは、１２の塩基に沿ってｃＤＮＡと重複する。標的ｍｉＲ−１５５の小さなサイズを前提とすれば、このプライマーが標的配列とより大きな重複を有するように設計すれば、リバースプライマーとの重複が生じ、したがって後続のＰＣＲの間にプライマー−ダイマーの形成が促進される。本実施例におけるプライマー配列は、標的ｍｉＲ−１５５配列とのオーバーラップ領域に四つの修飾ｄ（２−ａｍＡ）ＴＰ塩基を含んだが、プライマーは、Ｔｍ＝約４０℃でｃＤＮＡと重複二重鎖を形成すると予測される。ＰＣＲ反応において使用される典型的なアニーリング温度は、約６０〜６５℃の範囲である。記載の実験においては、５６℃のアニーリング温度が使用された。したがって、ＰＣＲアニーリング温度の間のこの１６℃のギャップとｃＤＮＡにハイブリダイズされるフォワードプライマーの二重鎖安定性から、逆転写により生成されたｃＤＮＡがその後ＰＣＲ反応に関与したときのＰＣＲ収率の減少がもたらされるであろう。

しかし、逆転写反応の間の塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰの使用は、ｃＤＮＡ合成ならびに後続のＰＣＲ増幅の収率を改善することが分かった。逆転写の間に使用される二重鎖安定化ｄＮＴＰ混合物は、ｄ（２−ａｍＡ）ＴＰ、ｄ（５−ＰｒＵ）ＴＰ、ｄ（５−ＰｒＣ）ＴＰおよびｄＧＴＰを含んだ。後続のＰＣＲ増幅は、天然ｄＮＴＰの存在下で行われた。これらの実験の結果が図２に示され、ｍｉＲ−１５５の逆転写の間の塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰの組み込みが、この短いＲＮＡ標的配列の増幅ベースの検出における後の効率および感度を実質的に改善したことが示される。

本発明が一定の好ましい実施形態に関してかなり詳細に記載され、示されているが、当業者は、本発明の他の実施形態を容易に理解するだろう。したがって、本発明は、以下の添付の請求の範囲の精神および範囲内に含まれる全ての修正および変更を含むとみなされる。

Claims (16)

1. 長さ１００ヌクレオチド未満の小さなＲＮＡ標的配列の逆転写のための方法であり、
   （ａ）前記小さなＲＮＡ標的配列を含む試料を、
   （ｉ）前記小さなＲＮＡ標的配列とハイブリダイズするのに十分に前記小さなＲＮＡ標的配列に対して相補的である、プライマー、および
   （ｉｉ）逆転写酵素活性を有するＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ
   と接触させるステップと；
   （ｂ）前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの基質である少なくとも一つの塩基修飾、二重鎖安定化ｄＮＴＰを含むｄＮＴＰの混合物の存在下で、前記小さなＲＮＡ標的配列に相補的なｃＤＮＡを合成するステップと
   を含む、方法。
2. 前記小さなＲＮＡ標的配列およびその相補鎖に十分に相補的であるためにこれにハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で増幅産物を産出する、増幅プライマーを用いて、核酸増幅反応を行うステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 長さ１００ヌクレオチド未満の小さなＲＮＡ標的配列を増幅するための方法であり、
   （ａ）前記小さなＲＮＡ標的配列を含む試料を、
   （ｉ）前記小さなＲＮＡ標的配列とハイブリダイズするのに十分に前記小さなＲＮＡ標的配列に対して相補的である、プライマー、および
   （ｉｉ）逆転写酵素活性を有するＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ
   と接触させるステップと；
   （ｂ）前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼのための基質である少なくとも一つの塩基修飾、二重鎖安定化ｄＮＴＰを含むｄＮＴＰの混合物の存在下で、前記小さなＲＮＡ標的配列に相補的なｃＤＮＡを合成するステップと、
   （ｃ）前記小さなＲＮＡ標的配列およびその相補鎖に十分に相補的であるためにこれにハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で増幅産物を産出する、増幅プライマーを用いて、核酸増幅反応を行うステップと
   を含む、方法。
4. 前記ｄＮＴＰの混合物が、
   （１）５−位で置換されたピリミジンである、塩基修飾、二重鎖安定化ｄＮＴＰ；
   （２）式：
   

   

   を有する塩基修飾、二重鎖安定化ｄＮＴＰであって、式中、Ｂは、
   

   

   より選択され；
   Ｘは、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＣＨ_３または
   

   

   より選択され；
   Ｙは、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉまたは
   

   

   より選択され；
   Ｒは、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＣＨ_３または−ＮＨ_２である、塩基修飾、二重鎖安定化ｄＮＴＰ；ならびに／あるいは
   （３）ｄ（２−ａｍＡ）ＴＰ、ｄ（５−ＰｒＵ）ＴＰおよび／またはｄ（５−ＰｒＣ）ＴＰより選択される、塩基修飾、二重鎖安定化ｄＮＴＰ
   を含む、請求項１または３に記載の方法。
5. 前記ｄＮＴＰの混合物が、ｄ（２−ａｍＡ）ＴＰ、ｄ（５−ＰｒＵ）ＴＰおよびｄ（５−ＰｒＣ）ＴＰおよび／またはｄＧＴＰの少なくとも二つを含む、請求項１または３に記載の方法。
6. 前記小さなＲＮＡ標的配列が、１０〜３０ヌクレオチドの長さである、請求項１または３に記載の方法。
7. 前記小さなＲＮＡ標的配列が、ｍｉＲＮＡ配列である、請求項１または３に記載の方法。
8. 前記プライマーに、一つ以上の塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰが組み込まれている、請求項１または３に記載の方法。
9. （ｃ）一本鎖ｃＤＮＡを提供するために、前記ステップ（ｂ）で形成されるｃＤＮＡを処理するステップと；
   （ｄ）二重鎖ｃＤＮＡ分子を産出するために、前記一本鎖ｃＤＮＡを、前記ｃＤＮＡに十分に相補的であるためにこれにハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で伸長産物の合成を開始する、第二プライマーと接触させる、ステップと
   をさらに含む、請求項１に記載の方法。
10. 前記核酸増幅反応が、ポリメラーゼ連鎖反応である、請求項２または３に記載の方法。
11. 前記増幅プライマーの一つ以上に、塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰが組み込まれている、請求項２または３に記載の方法。
12. 前記増幅反応が、少なくとも一つの塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰを含むデオキシヌクレオシド５’−三リン酸の混合物の存在下で行われる、請求項２または３に記載の方法。
13. （Ａ）小さなＲＮＡ標的配列を含む試料と；
    （Ｂ）前記小さなＲＮＡ標的配列とハイブリダイズするのに十分に前記小さなＲＮＡ標的配列に対して相補的である、プライマーと；
    （Ｃ）逆転写酵素活性を有するＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと；
    （Ｄ）前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの基質である少なくとも一つの塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰを含むデオキシヌクレオシド５’−三リン酸の混合物と
    を含む、反応混合物。
14. （Ａ）逆転写酵素活性を有するＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと；
    （Ｂ）前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの基質である少なくとも一つの塩基修飾、二重鎖安定化デオキシリボヌクレオチド三リン酸と
    を含む、キット。
15. 前記塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰが、
    （１）５−位で置換されたピリミジンである塩基修飾、二重鎖安定化ｄＮＴＰ；
    （２）式：
    

    

    を有する塩基修飾、二重鎖安定化ｄＮＴＰであって、式中、Ｂは、
    

    

    より選択され；
    Ｘは、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＣＨ_３または
    

    

    より選択され；
    Ｙは、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉまたは
    

    

    より選択され；
    Ｒは、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＣＨ_３または−ＮＨ_２である、塩基修飾、二重鎖安定化ｄＮＴＰ；あるいは
    （３）ｄ（２−ａｍＡ）ＴＰ、ｄ（５−ＰｒＵ）ＴＰおよび／またはｄ（５−ＰｒＣ）ＴＰより選択される、塩基修飾、二重鎖安定化ｄＮＴＰ
    である、請求項１３に記載の反応混合物または請求項１４に記載のキット。
16. （Ｃ）第二プライマーであって、小さなＲＮＡ標的配列とハイブリダイズするのに十分に前記小さなＲＮＡ標的配列に対して相補的である第二プライマー；および／または
    （Ｄ）小さなＲＮＡ標的配列を増幅するために有効な増幅プライマー対、
    をさらに含む、請求項１４に記載のキット。

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