JP7306722B2 - プライマー及びその使用 - Google Patents
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Description
他にも、より高感度である、RT-PCRを組み合わせた方法がよく用いられる。
[1]第1の領域と第2の領域からなるプライマーであって、5’側に前記第1の領域が位置しており、3’側に前記第2の領域が位置しており、前記第1の領域は、対象RNAと相補的でない塩基配列からなり、前記第2の領域は、前記対象RNAに相補的な塩基配列からなり、前記第2の領域の融解温度は20~50℃である、プライマー。
[2]対象RNA及びDNAを含む試料に[1]に記載のプライマー及び逆転写酵素を添加することと、前記プライマー及び前記対象RNAを、前記第2の領域の融解温度よりも低い温度でハイブリダイズさせることと、逆転写反応を行いcDNAを合成することと、を含み、前記cDNAは、前記対象RNAのみを鋳型としたcDNAである、cDNAの製造方法。
[3]対象RNA及びDNAを含む試料に[1]に記載のプライマー及び逆転写酵素を添加することと、前記プライマー及び前記対象RNAを、前記第2の領域の融解温度よりも低い温度でハイブリダイズさせることと、逆転写反応を行いcDNAを合成することと、前記cDNAを鋳型として、[1]に記載のプライマーからなるアンチセンスプライマー及び前記cDNAにハイブリダイズするセンスプライマーを用いた核酸増幅反応を行うことと、前記核酸増幅反応による核酸の増幅を検出することと、を含み、前記核酸増幅反応は、前記第2の領域の融解温度よりも高い温度で行われる、対象RNA及びDNAを含む試料中の前記対象RNAの存在を検出する方法。
[4][1]に記載のプライマーを含む、対象RNA及びDNAを含む試料から対象RNAを鋳型としたcDNAを製造するためのキット。
[5][1]に記載のプライマーと、対象RNAを鋳型として合成されたcDNAにハイブリダイズするセンスプライマーと、を含む、対象RNA及びDNAを含む試料中の前記対象RNAの存在の検出用キット。
1実施形態において、本発明は、第1の領域と第2の領域からなるプライマーであって、5’側に前記第1の領域が位置しており、3’側に前記第2の領域が位置しており、前記第1の領域は、対象RNAと相補的でない塩基配列からなり、前記第2の領域は、前記対象RNAに相補的な塩基配列からなり、前記第2の領域の融解温度は20~50℃である、プライマーを提供する。
Tm=81.5+16.6×log[Na+]+0.41×(%GC)-(500/Length) (1)
Tm=60.8+0.41×(%GC)-(500/Length) (2)
1実施形態において、本発明は、対象RNA及びDNAを含む試料に上述のプライマー及び逆転写酵素を添加することと、前記プライマー及び前記対象RNAを、前記第2の領域の融解温度よりも低い温度でハイブリダイズさせることと、逆転写反応を行いcDNAを合成することと、を含み、前記cDNAは、前記対象RNAのみを鋳型としたcDNAである、cDNAの製造方法を提供する。
Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase(M-MLV RT)、Avian Myeloblastosis Virus
Reverse Transcriptase(AMV RT)、変異型M-MLV
RTであるSuperScriptTM IV Reverse Transcriptase(SS RT)(Thermo Fisher Scientific社)等を用いてもよい。
このcDNAの5’端には、第1の領域の配列が付加される。
1実施形態において、本発明は、対象RNA及びDNAを含む試料に上述のプライマー及び逆転写酵素を添加することと、前記プライマー及び前記対象RNAを、前記第2の領域の融解温度よりも低い温度でハイブリダイズさせることと、逆転写反応を行いcDNAを合成することと、前記cDNAを鋳型として、上述のプライマーからなるアンチセンスプライマー及び前記cDNAにハイブリダイズするセンスプライマーを用いた核酸増幅反応を行うことと、前記核酸増幅反応による核酸の増幅を検出することと、を含み、前記核酸増幅反応を、前記第2の領域の融解温度よりも高い温度で行う、対象RNA及びDNAを含む試料中の前記対象RNAの存在を検出する方法を提供する。
(第1実施形態)
1実施形態において、本発明は、上述のアンチセンスプライマーを含む、対象RNA及びDNAを含む試料から対象RNAを鋳型としたcDNAを製造するためのキットを提供する。
1実施形態において、本発明は、上述のアンチセンスプライマーと、対象RNAを鋳型として合成されたcDNAにハイブリダイズするセンスプライマーと、を含む、対象RNA及びDNAを含む試料中の前記対象RNAの存在の検出用キットを提供する。
(鋳型DNAおよびRNAの調製)
逆転写反応と定量PCRに用いる鋳型DNAとRNAを調整した。
このプラスミドDNAの配列のNCBIアクセッション番号はAF324493.2である。
この濃度から、鋳型として用いるプラスミドDNAのコピー数を算出した。
(プラスミドDNAを鋳型とした定量PCR)
《プライマーの作製》
定量PCRに用いるセンスプライマーと14種類のアンチセンスプライマーを作成した。使用したプライマーの配列を表1に示す。「gag-FA」はセンスプライマーの名称であり、「gag-RA」はアンチセンスプライマーの名称である。プライマーの配列及び上記式(2)に基づいて計算したTm値を表1に示す。
1000コピーのpNL4-3 プラスミドを鋳型として、表1に示されるgag-FAプライマーと14種類のgag-RA(X-Y)プライマーを用いて、それぞれ定量PCRを行った。
(RNAを鋳型とした逆転写反応と定量PCR)
鋳型RNAとgag-RA(X-Y)プライマーを用いて、逆転写反応と定量PCRを行い、DNAの増幅効率を解析した。
(RNAのコピー数と増幅曲線の関係)
鋳型とするRNAのコピー数及びgag-RA(X-Y)プライマーと、定量PCRによるDNAの増幅効率の関係性について解析した。
(鋳型DNAコピー数と増幅曲線の関係)
鋳型とするプラスミドDNAのコピー数及びgag-RA(X-Y)プライマーと、定量PCRによるDNAの増幅効率の関係性について解析した。
5秒、60℃ 20秒)を60サイクルとした。結果を図10に示す。
(DNAとRNAの混合物を鋳型としたRT-PCR)
DNAとRNAを含む試料と、gag-RA(27-0)又はgag-RA(9-18)を用いて、逆転写反応とPCRを行い、RNAの量を定量した。
Claims (6)
- 第1の領域と第2の領域からなるプライマーであって、
前記プライマーは、対象RNA及びDNAを含む試料中の前記対象RNAの存在を検出する方法において用いるためのものであり、
5’側に前記第1の領域が位置しており、3’側に前記第2の領域が位置しており、
前記第1の領域は、対象RNAと相補的でない塩基配列からなり、
前記第2の領域は、前記対象RNAに相補的な塩基配列からなり、
前記第2の領域の配列の塩基数は、6塩基~12塩基であり、
前記第2の領域の配列は、G又はCの塩基を20~70%含み、
前記第2の領域の融解温度は20~50℃であり、
前記第1の領域と前記第2の領域の塩基数の合計は、20塩基~50塩基であり、
前記プライマーの全体の融解温度は、45~80℃であり、
前記対象RNAの存在を検出する方法は、
対象RNA及びDNAを含む試料に前記プライマー及び逆転写酵素を添加することと、
前記プライマー及び前記対象RNAを、前記第2の領域の融解温度よりも低い温度でハイブリダイズさせることと、
逆転写反応を行いcDNAを合成することと、
前記cDNAを鋳型として、前記プライマーからなるアンチセンスプライマー及び前記cDNAにハイブリダイズするセンスプライマーを用いた核酸増幅反応を行うことと、
前記核酸増幅反応による核酸の増幅を検出することと、を含み、
前記核酸増幅反応は、前記第2の領域の融解温度よりも高い温度で行われるものである、プライマー。 - 配列番号10~13のいずれかに記載された配列からなる、請求項1に記載のプライマー。
- 対象RNA及びDNAを含む試料に請求項1又は2に記載のプライマー及び逆転写酵素を添加することと、
前記プライマー及び前記対象RNAを、前記第2の領域の融解温度よりも低い温度でハイブリダイズさせることと、
逆転写反応を行いcDNAを合成することと、を含み、
前記cDNAは、前記対象RNAのみを鋳型としたcDNAである、cDNAの製造方法。 - 対象RNA及びDNAを含む試料に請求項1又は2に記載のプライマー及び逆転写酵素を添加することと、
前記プライマー及び前記対象RNAを、前記第2の領域の融解温度よりも低い温度でハイブリダイズさせることと、
逆転写反応を行いcDNAを合成することと、
前記cDNAを鋳型として、請求項1に記載のプライマーからなるアンチセンスプライマー及び前記cDNAにハイブリダイズするセンスプライマーを用いた核酸増幅反応を行うことと、
前記核酸増幅反応による核酸の増幅を検出することと、を含み、
前記核酸増幅反応は、前記第2の領域の融解温度よりも高い温度で行われる、
対象RNA及びDNAを含む試料中の前記対象RNAの存在を検出する方法。 - 請求項1又は2に記載のプライマーを含む、対象RNA及びDNAを含む試料から対象RNAを鋳型としたcDNAを製造するためのキット。
- 請求項1又は2に記載のプライマーと、
対象RNAを鋳型として合成されたcDNAにハイブリダイズするセンスプライマーと、
を含む、
対象RNA及びDNAを含む試料中の前記対象RNAの存在の検出用キット。
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2019
- 2019-07-30 JP JP2020534651A patent/JP7306722B2/ja active Active
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Non-Patent Citations (1)
Title |
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BMC Biotechnol.,2013年,vol.13, No.7,p.1-11 |
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