WO2020027096A1 - プライマー及びその使用 - Google Patents

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WO2020027096A1
WO2020027096A1 PCT/JP2019/029753 JP2019029753W WO2020027096A1 WO 2020027096 A1 WO2020027096 A1 WO 2020027096A1 JP 2019029753 W JP2019029753 W JP 2019029753W WO 2020027096 A1 WO2020027096 A1 WO 2020027096A1
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dna
region
rna
target rna
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PCT/JP2019/029753
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English (en)
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加藤　真吾
Original Assignee
学校法人慶應義塾
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes

Definitions

  • the present invention relates to a primer and its use. More specifically, the present invention relates to a primer, a method for producing cDNA, a method for detecting the presence of RNA, a kit for producing cDNA, and a kit for detecting the presence of RNA.
  • This application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2018-146892 filed on August 3, 2018, the contents of which are incorporated herein by reference.
  • RNA transcribed from a target gene obtained from cell lysate or the like is minute and unstable.
  • Methods for detecting the target RNA include Northern blotting and in situ hybridization using a probe that hybridizes to the target RNA. In addition, a method combining RT-PCR with higher sensitivity is often used.
  • RNA degrading enzyme DNase
  • RNA complementary to the RNA is synthesized by a reverse transcription reaction using a sample containing the RNA.
  • a general method is to amplify the obtained cDNA by a nucleic acid amplification reaction and detect RNA contained in a sample.
  • Non-Patent Document 1 describes a method for detecting RNA contained in a sample by a RT-PCR method from a mixture containing DNA and RNA without using DNase.
  • RT-qPCR real-time quantitative PCR
  • Non-Patent Document 1 it is necessary to prepare a primer different from the primer used in the reverse transcription reaction as the primer used in the PCR. Before performing PCR, it is necessary to remove the primers used in the reverse transcription reaction. Therefore, the method of Non-Patent Document 1 has room for improvement.
  • an object of the present invention is to provide a technique for easily detecting RNA from a mixture of DNA and RNA.
  • a primer comprising a first region and a second region, wherein the first region is located on the 5 ′ side, the second region is located on the 3 ′ side, The first region comprises a base sequence that is not complementary to the target RNA, the second region comprises a base sequence that is complementary to the target RNA, and the second region has a melting temperature of 20 to 50 ° C.
  • a method for producing a cDNA comprising soybean and performing a reverse transcription reaction to synthesize a cDNA, wherein the cDNA is a cDNA using only the target RNA as a template.
  • [3] adding the primer and reverse transcriptase according to [1] to a sample containing the target RNA and DNA, and hybridizing the primer and the target RNA at a temperature lower than the melting temperature of the second region.
  • a method for detecting the presence of the target RNA in a sample [4] A kit for producing a cDNA using the target RNA as a template from a sample containing the target RNA and DNA, comprising the primer according to [1]. [5] A kit for detecting the presence of the target RNA in a sample containing the target RNA and DNA, the kit including the primer according to [1] and a sense primer that hybridizes to cDNA synthesized using the target RNA as a template .
  • a technique for easily detecting target RNA from a mixture of DNA and RNA can be provided.
  • FIG. 1 It is a schematic diagram explaining the state where the 2nd area
  • A is a schematic diagram illustrating a process in which the second region of the primer of the present embodiment hybridizes to the target RNA, and reverse transcriptase synthesizes cDNA.
  • B is a schematic diagram illustrating that the second region of the primer of the present embodiment hybridizes to DNA, but reverse transcriptase does not synthesize cDNA.
  • (A) is a schematic diagram illustrating a state in which a sense primer has hybridized to cDNA.
  • (B) is a schematic diagram illustrating a state where an antisense primer has hybridized to a sense strand synthesized using cDNA as a template in the first cycle of PCR.
  • (C) is a schematic diagram illustrating a state where a sense primer has hybridized to DNA mixed in a sample.
  • (D) is a schematic diagram illustrating a state where the second region of the antisense primer does not hybridize to DNA mixed in the sample.
  • 4 is an amplification curve showing the relationship between the number of cycles of quantitative PCR and the amount of amplified DNA when the pNL4-3 plasmid was used as a template.
  • FIG. 4 is an amplification curve showing the relationship between the number of cycles of quantitative PCR and the amount of DNA amplified by PCR when a reverse transcription reaction and quantitative PCR are performed using RNA as a template.
  • . 5 is a graph showing the relationship between the copy number of a template RNA and the Cq value when a reverse transcription reaction and quantitative PCR were performed using gag-RA (9-18) with each copy number of RNA as a template.
  • An amplification curve showing the relationship between the number of cycles and the amount of DNA amplified by PCR when quantitative PCR was performed using gag-RA (27-0) with each copy number of pNL4-3 plasmid DNA as a template. is there.
  • An amplification curve showing the relationship between the number of cycles and the amount of DNA amplified by PCR when quantitative PCR was performed using gag-RA (9-18) with pNL4-3 plasmid DNA of each copy number as a template. is there.
  • pNL4-3 Number of cycles of quantitative PCR and amount of DNA amplified by PCR when reverse transcription reaction and quantitative PCR were performed using gag-RA (27-0) with a mixture of plasmid DNA and RNA as a template 5 is an amplification curve showing the relationship of.
  • pNL4-3 Number of cycles of quantitative PCR and amount of DNA amplified by PCR when reverse transcription reaction and quantitative PCR were performed using gag-RA (9-18) with a mixture of plasmid DNA and RNA as a template 5 is an amplification curve showing the relationship of.
  • the present invention provides a primer comprising a first region and a second region, wherein the first region is located on the 5 ′ side, and the second region is located on the 3 ′ side.
  • the first region is composed of a base sequence that is not complementary to the target RNA
  • the second region is composed of a base sequence that is complementary to the target RNA, and has a melting temperature of the second region.
  • a primer which is at 20-50 ° C.
  • a primer is a single-stranded oligonucleotide containing a sequence complementary to DNA or RNA serving as a template.
  • Tm The temperature at which the primer and DNA or RNA serving as a template form a double strand at a rate of 50% is referred to as a melting temperature (Tm).
  • Tm can be determined, for example, according to the following equation (1).
  • [Na + ] is the concentration of sodium ions in the solution containing the template and the primer
  • % GC is the percentage of the guanine base or cytosine base contained in the primer
  • Length is the base of the primer. Is a number.
  • Tm 81.5 + 16.6 ⁇ log [Na + ] + 0.41 ⁇ (% GC) ⁇ (500 / Length) (1)
  • Tm 60.8 + 0.41 ⁇ (% GC) ⁇ (500 / Length) (2)
  • the primer has a sequence that is not complementary to RNA or DNA as a template, it can form a double strand with RNA or DNA as a template.
  • the melting temperature in this case is determined by the sequence of the primer which is complementary to the RNA or DNA serving as the template.
  • the first region is a sequence that is not complementary to the target RNA
  • the second region is a sequence that is complementary to the target RNA.
  • FIG. 1 is a schematic diagram illustrating a state where the second region of the primer of the present embodiment has hybridized to the target RNA.
  • the target RNA and the primer of the present embodiment hybridize in the second region, but do not hybridize in the first region.
  • the number of bases in the sequence of the second region is preferably 6 to 12 bases, more preferably 6 to 10 bases, and further preferably 8 to 10 bases.
  • the base sequence of the second region preferably contains 20 to 70%, more preferably 30 to 60%, even more preferably 40 to 60% of G or C base.
  • the Tm of the primer of the present embodiment is calculated by considering only the base of the sequence in the second region.
  • the melting temperature of the second region is 20 to 50 ° C.
  • the melting temperature is more preferably from 20 to 40 ° C, even more preferably from 20 to 35 ° C.
  • the total number of bases in the first region and the second region is preferably 20 to 50, more preferably 20 to 40, and even more preferably 25 to 35.
  • the overall melting temperature of the primer of the present embodiment is preferably from 45 to 80 ° C, more preferably from 50 to 80 ° C, and still more preferably from 55 to 75 ° C.
  • the present invention provides a method comprising: adding the above-mentioned primer and reverse transcriptase to a sample containing target RNA and DNA; and setting the primer and the target RNA at a temperature lower than the melting temperature of the second region. And producing a cDNA by performing a reverse transcription reaction, wherein the cDNA is a cDNA using only the target RNA as a template.
  • DNA refers to DNA that is mixed in when cells are crushed to separate RNA.
  • examples of the contaminating DNA include genomic DNA having a sequence complementary to the second region of the above-mentioned primer, other genomic DNA, mitochondrial DNA, and the like.
  • sample containing the target RNA and DNA examples include those obtained from tissues of single-celled organisms, multicellular organisms, blood of animals, and the like, using the AGPC (Acid ⁇ Guanidine ⁇ thiocyanate-Phenol-Chloroform) method.
  • a reverse transcriptase having a reverse transcription activity at around the melting temperature of the second region, that is, 20 to 40 ° C. can be used.
  • the reverse transcriptase for example, Moloney Murine Leukemia Virus Reversal Transcriptase (M-MLV RT), Avian Myeloblastosis Virus Reverse Transcriptase (AMV RT), mutant M-MLV An RT such as SuperScript TM IV Reverse Transcriptase (SS RT) (Thermo Fisher Scientific) may be used.
  • M-MLV RT Moloney Murine Leukemia Virus Reversal Transcriptase
  • AMV RT Avian Myeloblastosis Virus Reverse Transcriptase
  • mutant M-MLV An RT such as SuperScript TM IV Reverse Transcriptase (SS RT) (Thermo Fisher Scientific) may be used.
  • RNA of the RNA: DNA hybrid is degraded by the RNase H activity, so that the yield of the reverse transcript decreases.
  • the above-mentioned primer is added to the sample containing the target RNA and DNA, and the primer is hybridized to the target RNA by leaving it at a temperature lower than the melting temperature of the second region.
  • the reaction temperature for reverse transcription is set in a temperature range in which reverse transcriptase has reverse transcription activity. For example, it is preferable to set the temperature to 20 to 60 ° C. When M-MLV @ RT is used, the reverse transcription reaction can be easily performed at room temperature of about 20 to 37 ° C.
  • the second region of the above-mentioned primer contains two of the target RNA and DNA. Keep the chains.
  • FIG. 2 (a) is a schematic diagram illustrating the process in which the second region of the above-mentioned primer hybridizes to the target RNA and reverse transcriptase synthesizes cDNA.
  • FIG. 2 (b) is a schematic diagram illustrating that the second region of the primer described above hybridizes to DNA, but reverse transcriptase does not synthesize cDNA.
  • RT indicates reverse transcriptase.
  • reverse transcriptase has RNA-dependent DNA polymerase activity, but has low DNA-dependent DNA polymerase activity. Therefore, a general reverse transcriptase uses RNA as a template, but does not use DNA as a template. As a result, cDNA is synthesized using only the target RNA as a template.
  • the added reverse transcriptase uses the target RNA as a template to synthesize complementary DNA (cDNA) specific to the target RNA only from the 3 ′ end of the above-mentioned primer in the 3 ′ direction.
  • cDNA complementary DNA
  • the present invention provides a method comprising: adding the above-mentioned primer and reverse transcriptase to a sample containing target RNA and DNA; and setting the primer and the target RNA at a temperature lower than the melting temperature of the second region. And performing a reverse transcription reaction to synthesize cDNA and performing a nucleic acid amplification reaction using the cDNA as a template and an antisense primer comprising the above-described primer and a sense primer hybridizing to the cDNA. And detecting nucleic acid amplification by the nucleic acid amplification reaction, wherein the nucleic acid amplification reaction is performed at a temperature higher than the melting temperature of the second region, in a sample containing target RNA and DNA.
  • a method is provided for detecting the presence of the subject RNA.
  • antisense strand refers to a polynucleotide strand complementary to a target RNA.
  • the sense strand refers to a polynucleotide strand having a sequence complementary to the antisense strand.
  • a sense primer and an antisense primer are used as a primer set.
  • the sense primer for example, a sequence at a position 50 to 2000 bases away from the position where the antisense primer hybridizes on the sense strand complementary to the cDNA sequence, for example, on the 5 'side can be used.
  • a primer used for reverse transcription of the target RNA that is, a primer composed of the first region and the second region can be used as the antisense primer.
  • DNA is exponentially amplified by PCR.
  • DNA mixed in the sample is used as a template, the DNA is not exponentially amplified by PCR, or even if amplified, it is limited.
  • the number of bases of the antisense primer and the sense primer is preferably 20 to 50, more preferably 20 to 40, and still more preferably 25 to 35.
  • the melting temperature of the antisense primer and the sense primer is preferably from 45 to 80 ° C, more preferably from 50 to 80 ° C, even more preferably from 55 to 75 ° C.
  • the nucleic acid amplification reaction includes a Polymerase Chain Reaction (PCR) method, a Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method, and the like.
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • LAMP Loop-mediated isothermal amplification
  • a primer and a heat-resistant DNA polymerase are used.
  • the DNA polymerase for example, a known thermostable DNA polymerase such as a DNA polymerase of Thermos aquaticus which is a kind of thermophile (Taq DNA polymerase) can be used.
  • the double-stranded DNA is dissociated into single-stranded DNA (reaction 1)
  • the primer forms a double-strand with the dissociated single-stranded DNA (reaction 2)
  • 3 ′ of the primer bound with DNA polymerase The three reactions of extending the DNA strand in the 3 ′ direction from the end (reaction 3) are defined as one cycle, and this cycle is repeated to advance the nucleic acid amplification reaction.
  • the number of cycles is preferably from 20 to 60, more preferably from 20 to 40, even more preferably from 25 to 35.
  • the temperature of the reaction 2 is preferably ⁇ 20 ° C. to + 20 ° C., more preferably ⁇ 10 ° C. to + 10 ° C., based on the Tm values of the sequences of the first and second regions of the antisense primer. -5 ° C to + 5 ° C.
  • the temperature of reaction 2 is set to a temperature equal to or lower than the Tm of the sense primer and the antisense primer.
  • the temperature of the reaction 2 is preferably from 50 to 70 ° C, more preferably from 50 to 65 ° C, even more preferably from 55 to 65 ° C.
  • FIG. 3A is a schematic diagram illustrating a state in which a sense primer has hybridized to cDNA synthesized in the reverse transcription reaction of the present embodiment.
  • FIG. 3B is a schematic diagram illustrating a state where an antisense primer has hybridized to a sense strand synthesized using cDNA as a template in the first cycle of PCR.
  • the double-stranded DNA synthesized using the aforementioned cDNA as a template has sequences complementary to the sense primer and the antisense primer. By repeating the PCR reaction cycle, the double-stranded DNA is exponentially amplified.
  • FIG. 3 (c) is a schematic diagram illustrating a state where the sense primer has hybridized to the DNA mixed in the sample.
  • the DNA mixed into the sample has a sequence complementary to the second region of the antisense primer, but does not have a sequence complementary to the first region.
  • the above-described reaction 2 is performed at a temperature higher than the Tm of the second region of the antisense primer.
  • the temperature of Reaction 2 is preferably higher by 10 to 50 ° C, more preferably higher by 15 to 40 ° C, even more preferably higher by 20 to 40 ° C, than the Tm of the second region of the antisense primer.
  • the sense DNA synthesized using the cDNA as a template has a sequence complementary to the sequence of the entire antisense primer. Therefore, the antisense primer hybridizes to the sense DNA synthesized using the cDNA as a template in the reaction 2 set in the above temperature range.
  • the DNA mixed in the sample has a sequence complementary to the second region of the antisense primer, but does not have a sequence complementary to the first region of the antisense primer. Therefore, the antisense primer cannot hybridize to the contaminated DNA in reaction 2 set in the above-mentioned temperature range.
  • FIG. 3 (d) is a schematic diagram illustrating a state where the second region of the antisense primer does not hybridize to DNA mixed in the sample.
  • the DNA using the mixed DNA as a template will not be amplified exponentially or will be amplified. Is also limited. As a result, DNA using the target RNA as a template is specifically amplified from the sample containing the target RNA and DNA.
  • the presence of the amplified DNA can be detected by using a known probe such as a probe having a sequence complementary to the DNA or a primer labeled with a detectable probe.
  • the presence of the target RNA can be detected by detecting the amplified DNA. Furthermore, since the copy number of the target RNA shows a correlation with the amount of the amplified DNA, the amount of the target RNA can be calculated from the amount of the amplified DNA.
  • the present invention provides a kit for producing a cDNA using the target RNA as a template from a sample containing the target RNA and DNA, comprising the above-described antisense primer.
  • the second region is a sequence complementary to the target RNA.
  • the number of bases may be 8 to 10 bases.
  • the reverse transcriptase for example, M-MLV can be used, but is not limited thereto.
  • the temperature of the reverse transcription reaction is set within a temperature range in which the reverse transcription activity of the reverse transcriptase is present.
  • a primer comprising the first region and the second region and a reverse transcriptase are added to a sample containing the target RNA and DNA, and a reverse transcription reaction is performed. Can be manufactured. The sequence of the first region is added to the 5 'end of the produced cDNA.
  • the present invention relates to the present invention, wherein the presence of the target RNA in a sample containing the target RNA and DNA includes the antisense primer described above and a sense primer that hybridizes to cDNA synthesized using the target RNA as a template.
  • the present invention provides a kit for detection.
  • a primer comprising a first region and a second region and a reverse transcriptase are added to a sample containing the target RNA and DNA and a reverse transcription reaction is performed, the sequence of the first region is added to the 5 ′ end.
  • CDNA can be produced.
  • double-stranded DNA may be amplified by a nucleic acid amplification reaction using cDNA as a template.
  • the nucleic acid amplification reaction is the same as that described above, and examples thereof include a PCR method and a LAMP method.
  • the sense primer and the antisense primer are the same as those described above in the embodiment of [Detection method].
  • the presence of DNA amplified by the nucleic acid amplification reaction can be detected using a known probe and a quantitative PCR device. This makes it possible to detect the presence of RNA contained in the sample.
  • a pNL4-3 plasmid into which the gag gene of HIV-1 was inserted was prepared.
  • the NCBI accession number for the sequence of this plasmid DNA is AF3244493.2.
  • the absorbance at 260 nm of DNA at a concentration of 50 ng / mL is 1.
  • the plasmid DNA concentration was calculated from the absorbance at 260 nm of the prepared plasmid DNA. From this concentration, the copy number of the plasmid DNA used as a template was calculated.
  • gag-RA (XY) indicates that the primer is composed of the first region and the second region.
  • the X bases at the 3 ′ end are complementary to gag @ mRNA and correspond to the second region described above, and the Y bases at the 5 ′ end are sequences that are not complementary to gag @ mRNA, and It represents that it corresponds to the first area.
  • the reaction conditions were as follows: After the first heat denaturation at 97 ° C. for 2 minutes, 60 cycles of (94 ° C. for 5 seconds, 60 ° C. for 20 seconds) were performed. For the detection, a real-time PCR device (Model Light @ Cycler96, Nippon Genetics) was used. The number of cycles when the fluorescence intensity of the probe reached 0.05 was defined as Cq. The results are shown in FIG.
  • FIG. 4 is an amplification curve showing the relationship between the number of cycles of quantitative PCR and the amount of amplified DNA when the pNL4-3 plasmid was used as a template.
  • each amplification curve corresponds to the gag-RA (XY) primer used in the PCR.
  • the value of Cq indicates the number of cycles when the amplified DNA reaches the threshold.
  • the value of Cq tended to increase. It was also found that when the number of bases in the second region became 12 or less, the amount of amplified DNA did not reach the threshold.
  • gag-RA (XY) primer and M-MLV reverse transcriptase were added, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 10 minutes. Synthesized.
  • FIG. 5 is an amplification curve showing the relationship between the number of cycles of quantitative PCR and the amount of DNA amplified by PCR when a reverse transcription reaction and quantitative PCR were performed using RNA as a template.
  • each amplification curve shows the gag-RA primer used in the PCR.
  • the value of Cq indicates the number of cycles when the amplified DNA reaches the threshold.
  • the number of bases in the second region was 10 or more, it became clear that the value of Cq hardly changed.
  • the value of the number of bases in the second region was 7 to 10, the amount of DNA amplified by PCR reached the threshold value.
  • a DNA product using the target RNA as a template can be obtained from a mixture of DNA and RNA by reverse transcription reaction and PCR. it can.
  • gag-RA (XY) primer and M-MLV reverse transcriptase were added to a sample containing 10,000, 1000, 100, 10, and 0 copies of RNA, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 10 minutes. And cDNA was synthesized by a reverse transcription reaction.
  • FIG. 6 shows the relationship between the number of cycles and the amount of DNA amplified by PCR when reverse transcription reaction and quantitative PCR were performed using gag-RA (27-0) with each copy number of RNA as a template. It is an amplification curve shown. As a result, it was revealed that when gag-RA (27-0) was used, DNA could be amplified by PCR with good reproducibility even when the template was RNA of 10 copies. In addition, since each curve was separable, it became clear that the RNA copy number could be quantitatively analyzed.
  • FIG. 7 shows the relationship between the number of cycles and the amount of DNA amplified by PCR when reverse transcription reaction and quantitative PCR were performed using gag-RA (9-18) using RNA of each copy number as a template. It is an amplification curve shown. As a result, it was revealed that when gag-RA (9-18) was used, DNA could be amplified by PCR with good reproducibility even when the template was RNA of 10 copies. In addition, since each curve was separable, it became clear that the RNA copy number could be quantitatively analyzed.
  • FIG. 8 shows the relationship between the copy number of the template RNA and the Cq value when the reverse transcription reaction and the quantitative PCR were performed using the gag-RA (27-0) primer with the RNA of each copy number as a template. It is a graph shown.
  • FIG. 9 shows the relationship between the copy number of the template RNA and the Cq value when a reverse transcription reaction and quantitative PCR were performed using gag-RA (9-18) using RNA of each copy number as a template. It is a graph.
  • Quantitative PCR was performed on samples containing 10,000, 1000, 100, 10, and 0 copies of the pNL4-3 plasmid DNA using the gag-FA primer and the gag-RA (27-0) primer.
  • the reaction conditions were as follows: after the first heat denaturation at 97 ° C for 2 minutes, (5 seconds, 60 ° C., 20 seconds) was defined as 60 cycles. The results are shown in FIG.
  • FIG. 10 shows the relationship between the number of cycles and the amount of DNA amplified by PCR when quantitative PCR was performed using gag-RA (27-0) with each copy number of pNL4-3 plasmid DNA as a template. It is an amplification curve shown. As a result, it was found that when the gag-RA (27-0) primer was used, the DNA was amplified by PCR even when the template pNL4-3 plasmid DNA was 10 copies.
  • FIG. 11 shows the relationship between the cycle number and the amount of DNA amplified by PCR when quantitative PCR was performed using gag-RA (9-18) with each copy number of pNL4-3 plasmid DNA as a template. It is an amplification curve shown. As a result, it was revealed that when gag-FA and gag-RA (9-18) were used as primers, the DNA was hardly amplified by PCR.
  • gag-RA 27-0
  • gag-RA (9-18) primer and M-MLV reverse transcriptase (Thermo Fisher Scientific) were added, and the mixture was added at 37 ° C. After standing for 10 minutes, cDNA was synthesized by a reverse transcription reaction.
  • the copy number of the template was (1000 copies of DNA, 0 copies of RNA), (960 copies of DNA, 40 copies of RNA), (800 copies of DNA, 200 copies of RNA), (0 copies of DNA, (1000 copies) and (0 copies of DNA and 0 copies of RNA).
  • FIG. 12 shows the number of cycles of quantitative PCR and amplification by PCR when a reverse transcription reaction and quantitative PCR were performed using a mixture of pNL4-3 plasmid DNA and RNA as a template and gag-RA (27-0).
  • 5 is an amplification curve showing the relationship between the determined DNA amounts.
  • FIG. 13 shows the number of cycles of quantitative PCR and amplification by PCR when a reverse transcription reaction and quantitative PCR were performed using a mixture of pNL4-3) plasmid DNA and RNA as a template and gag-RA (9-18).
  • 5 is an amplification curve showing the relationship between the determined DNA amounts.
  • a technique for easily detecting target RNA from a mixture of DNA and RNA can be provided.

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Abstract

第１の領域と第２の領域からなるプライマーであって、５'側に前記第１の領域が位置しており、３'側に前記第２の領域が位置しており、前記第１の領域は、対象ＲＮＡと相補的でない塩基配列を有しており、前記第２の領域は、前記対象ＲＮＡに相補的な塩基配列を有しており、前記第２の領域の融解温度は２０～５０℃である、プライマー。

Description

プライマー及びその使用
　本発明は、プライマー及びその使用に関する。より詳細には、プライマー、ｃＤＮＡの製造方法、ＲＮＡの存在を検出する方法、ｃＤＮＡを製造するためのキット、ＲＮＡの存在の検出用キットに関する。本願は、２０１８年８月３日に日本に出願された特願２０１８－１４６８９２号に基づき優先権を主張し、それらの内容をここに援用する。
　対象遺伝子の発現量を解析するために、対象遺伝子から転写されたＲＮＡの量を定量することが頻繁に行われる。細胞破砕物等から得られる対象遺伝子から転写されたＲＮＡは、微量かつ不安定である。
　対象ＲＮＡを検出する方法としては、対象ＲＮＡにハイブリダイズするプローブを用いる、ノーザンブロッティングやｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション等が挙げられる。
他にも、より高感度である、ＲＴ－ＰＣＲを組み合わせた方法がよく用いられる。
　ＲＴ－ＰＣＲ法では、まず、細胞を破砕してＲＮＡとＤＮＡを含む試料を得て、この試料に対してＤＮＡ分解酵素（ＤＮａｓｅ）を添加し、ＤＮＡを分解する。これにより、試料からＤＮＡが除去される。
　引き続いて、ＤＮａｓｅを失活させた後、ＲＮＡを含む試料を用いて、逆転写反応によりＲＮＡに相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成する。得られたｃＤＮＡを核酸増幅反応により増幅させ、試料に含まれていたＲＮＡを検出する方法が一般的である。
　従来、ＤＮＡとＲＮＡの混合物から、ＲＮＡを検出する場合には、ＤＮａｓｅでＤＮＡのみを分解する必要があり、煩雑であった。このため、より簡便にＲＮＡを検出する方法が検討されている。例えば、非特許文献１には、ＤＮａｓｅを使用せずに、ＤＮＡとＲＮＡを含む混合物から、ＲＴ－ＰＣＲ法により、試料に含まれていたＲＮＡを検出する方法が記載されている。
Gadkar VJ and Filion M., Development of a versatile TaqMan real-time quantitative PCR (RT-qPCR) compliant anchor sequence to quantify bacterial gene transcripts from RNA samples containing carryover genomic DNA., BMC Biotechnol. 13:7, 2013.
　しかしながら、非特許文献１の方法では、ＰＣＲにおいて用いるプライマーとして、逆転写反応において用いるプライマーとは異なるプライマーを準備する必要がある。また、ＰＣＲを行う前に、逆転写反応において用いたプライマーを除去する必要がある。したがって、非特許文献１の方法には改良の余地がある。
　そこで、本発明は、ＤＮＡとＲＮＡの混合物から、ＲＮＡを簡便に検出する技術を提供することを目的とする。
　本発明は以下の態様を含む。
［１］第１の領域と第２の領域からなるプライマーであって、５’側に前記第１の領域が位置しており、３’側に前記第２の領域が位置しており、前記第１の領域は、対象ＲＮＡと相補的でない塩基配列からなり、前記第２の領域は、前記対象ＲＮＡに相補的な塩基配列からなり、前記第２の領域の融解温度は２０～５０℃である、プライマー。
［２］対象ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料に［１］に記載のプライマー及び逆転写酵素を添加することと、前記プライマー及び前記対象ＲＮＡを、前記第２の領域の融解温度よりも低い温度でハイブリダイズさせることと、逆転写反応を行いｃＤＮＡを合成することと、を含み、前記ｃＤＮＡは、前記対象ＲＮＡのみを鋳型としたｃＤＮＡである、ｃＤＮＡの製造方法。
［３］対象ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料に［１］に記載のプライマー及び逆転写酵素を添加することと、前記プライマー及び前記対象ＲＮＡを、前記第２の領域の融解温度よりも低い温度でハイブリダイズさせることと、逆転写反応を行いｃＤＮＡを合成することと、前記ｃＤＮＡを鋳型として、［１］に記載のプライマーからなるアンチセンスプライマー及び前記ｃＤＮＡにハイブリダイズするセンスプライマーを用いた核酸増幅反応を行うことと、前記核酸増幅反応による核酸の増幅を検出することと、を含み、前記核酸増幅反応は、前記第２の領域の融解温度よりも高い温度で行われる、対象ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料中の前記対象ＲＮＡの存在を検出する方法。
［４］［１］に記載のプライマーを含む、対象ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料から対象ＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡを製造するためのキット。
［５］［１］に記載のプライマーと、対象ＲＮＡを鋳型として合成されたｃＤＮＡにハイブリダイズするセンスプライマーと、を含む、対象ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料中の前記対象ＲＮＡの存在の検出用キット。
　本発明によれば、ＤＮＡとＲＮＡの混合物から、対象ＲＮＡを簡便に検出する技術を提供することができる。
第１の領域と第２の領域からなるプライマーの第２の領域が、対象ＲＮＡにハイブリダイズした状態を説明する模式図である。 （ａ）は、本実施形態のプライマーの第２の領域が、対象ＲＮＡにハイブリダイズし、逆転写酵素がｃＤＮＡを合成する過程を説明する模式図である。（ｂ）は、本実施形態のプライマーの第２の領域が、ＤＮＡにハイブリダイズするが、逆転写酵素がｃＤＮＡを合成しないことを説明する模式図である。 （ａ）は、ｃＤＮＡにセンスプライマーがハイブリダイズした状態を説明する模式図である。（ｂ）は、ＰＣＲの１サイクル目でｃＤＮＡを鋳型として合成されたセンス鎖に、アンチセンスプライマーがハイブリダイズした状態を説明する模式図である。（ｃ）は、試料中に混入したＤＮＡにセンスプライマーがハイブリダイズした状態を説明する模式図である。（ｄ）は、試料中に混入したＤＮＡにアンチセンスプライマーの第２の領域がハイブリダイズしない状態を説明する模式図である。 ｐＮＬ４－３　プラスミドを鋳型とした場合の、定量ＰＣＲのサイクル数と増幅されたＤＮＡ量の関係を示す増幅曲線である。 ＲＮＡを鋳型として逆転写反応と定量ＰＣＲを行った場合の、定量ＰＣＲのサイクル数とＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ量の関係を示す増幅曲線である。 各コピー数のＲＮＡを鋳型とし、ｇａｇ－ＲＡ（２７－０）を用いて、逆転写反応と定量ＰＣＲを行った場合の、サイクル数とＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ量の関係を示す増幅曲線である。 各コピー数のＲＮＡを鋳型とし、ｇａｇ－ＲＡ（９－１８）を用いて、逆転写反応と定量ＰＣＲを行った場合の、サイクル数とＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ量の関係を示す増幅曲線である。 各コピー数のＲＮＡを鋳型とし、ｇａｇ－ＲＡ（２７－０）プライマーを用いて、逆転写反応と定量ＰＣＲを行った場合の、鋳型ＲＮＡのコピー数と、Ｃｑ値の関係を示すグラフである。 各コピー数のＲＮＡを鋳型とし、ｇａｇ－ＲＡ（９－１８）を用いて、逆転写反応と定量ＰＣＲを行った場合の、鋳型ＲＮＡのコピー数と、Ｃｑ値の関係を示すグラフである。 各コピー数のｐＮＬ４－３　プラスミドＤＮＡを鋳型とし、ｇａｇ－ＲＡ（２７－０）を用いて、定量ＰＣＲを行った場合の、サイクル数とＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ量の関係を示す増幅曲線である。 各コピー数のｐＮＬ４－３　プラスミドＤＮＡを鋳型とし、ｇａｇ－ＲＡ（９－１８）を用いて、定量ＰＣＲを行った場合の、サイクル数とＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ量の関係を示す増幅曲線である。 ｐＮＬ４－３　プラスミドＤＮＡとＲＮＡの混合物を鋳型とし、ｇａｇ－ＲＡ（２７－０）を用いて、逆転写反応と定量ＰＣＲを行った場合の、定量ＰＣＲのサイクル数とＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ量の関係を示す増幅曲線である。 ｐＮＬ４－３　プラスミドＤＮＡとＲＮＡの混合物を鋳型とし、ｇａｇ－ＲＡ（９－１８）を用いて、逆転写反応と定量ＰＣＲを行った場合の、定量ＰＣＲのサイクル数とＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ量の関係を示す増幅曲線である。
［プライマー］
　１実施形態において、本発明は、第１の領域と第２の領域からなるプライマーであって、５’側に前記第１の領域が位置しており、３’側に前記第２の領域が位置しており、前記第１の領域は、対象ＲＮＡと相補的でない塩基配列からなり、前記第２の領域は、前記対象ＲＮＡに相補的な塩基配列からなり、前記第２の領域の融解温度は２０～５０℃である、プライマーを提供する。
　プライマーとは、鋳型となるＤＮＡ又はＲＮＡに相補的な配列を含む１本鎖オリゴヌクレオチドである。
　プライマーと、鋳型となるＤＮＡ又はＲＮＡが、５０％の割合で２本鎖を形成する温度を融解温度（Ｔｍ）と呼ぶ。Ｔｍは、例えば、下記式（１）にしたがって求めることができる。ここで、［Ｎａ+］は鋳型とプライマーを含む溶液のナトリウムイオンの濃度であり、％ＧＣはプライマーに含まれるグアニン塩基又はシトシン塩基の割合を百分率で算出したものであり、Ｌｅｎｇｔｈはプライマーの塩基数である。
　Ｔｍ＝８１．５＋１６．６×ｌｏｇ［Ｎａ+］＋０．４１×（％ＧＣ）－（５００／Ｌｅｎｇｔｈ）　（１）
　また、一般的なＰＣＲ反応液は、５０ｍＭ　ＫＣｌ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを含む。これを考慮して、Ｔｍを下記式（２）に従って求めることもできる。
　Ｔｍ＝６０．８＋０．４１×（％ＧＣ）－（５００／Ｌｅｎｇｔｈ）　（２）
　Ｔｍより高い温度下では、鋳型となるＤＮＡ又はＲＮＡと２本鎖を形成するプライマーの割合は減少し、Ｔｍより低い温度下では、ＤＮＡ又はＲＮＡと２本鎖を形成するプライマーの割合は増加する。
　プライマーは、鋳型となるＲＮＡ又はＤＮＡと相補的でない配列を有していても、鋳型となるＲＮＡ又はＤＮＡと２本鎖を形成することができる。この場合の融解温度は、プライマーが有する、鋳型となるＲＮＡ又はＤＮＡと相補的な配列によって決まる。
　本実施形態において、第１の領域は対象ＲＮＡと相補的でない配列であり、第２の領域は対象ＲＮＡと相補的な配列である。図１は、本実施形態のプライマーの第２の領域が、対象ＲＮＡにハイブリダイズした状態を説明する模式図である。
　図１に示すように、対象ＲＮＡと本実施形態のプライマーは第２の領域でハイブリダイズし、第１の領域はハイブリダイズしない。
　実施例において詳述するように、第２の領域の配列の塩基数は、６塩基～１２塩基が好ましく、６塩基～１０塩基がより好ましく、８塩基～１０塩基が更に好ましい。
　第２の領域の塩基配列は、Ｇ又はＣの塩基を２０～７０％含むことが好ましく、３０～６０％含むことがより好ましく、４０～６０％含むことが更に好ましい。本実施形態のプライマーのＴｍは、第２の領域の配列の塩基のみを考慮して算出する。
　上述のように第２の領域の塩基配列を決めると、第２の領域の融解温度は、２０～５０℃となる。融解温度は、２０～４０℃であることがより好ましく、２０～３５℃であることが更に好ましい。
　第１の領域と第２の領域の塩基数の合計は、２０～５０が好ましく、２０～４０がより好ましく、２５～３５が更に好ましい。上記式（２）で算出した場合、本実施形態のプライマーの全体の融解温度は、４５～８０℃が好ましく、５０～８０℃がより好ましく、５５～７５℃が更に好ましい。
［製造方法］
　１実施形態において、本発明は、対象ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料に上述のプライマー及び逆転写酵素を添加することと、前記プライマー及び前記対象ＲＮＡを、前記第２の領域の融解温度よりも低い温度でハイブリダイズさせることと、逆転写反応を行いｃＤＮＡを合成することと、を含み、前記ｃＤＮＡは、前記対象ＲＮＡのみを鋳型としたｃＤＮＡである、ｃＤＮＡの製造方法を提供する。
　本実施形態において、ＤＮＡとは、細胞を破砕してＲＮＡを分離する際に、混入するＤＮＡのことを指す。混入するＤＮＡとしては、上述のプライマーの第２の領域に相補的な配列を持つゲノムＤＮＡ、その他のゲノムＤＮＡ、及びミトコンドリアＤＮＡ等が挙げられる。
　対象ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料としては、単細胞生物、多細胞生物の組織、動物の血液等から、ＡＧＰＣ（Ａｃｉｄ　Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ　ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ－Ｐｈｅｎｏｌ－Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）法等を用いて得られたものが挙げられる。
　逆転写酵素としては、第２の領域の融解温度付近、すなわち、２０～４０℃で逆転写活性を有するものを用いることができる。逆転写酵素としては、例えば、Ｍｏｌｏｎｅｙ　
Ｍｕｒｉｎｅ　Ｌｅｕｋｅｍｉａ　Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｍ－ＭＬＶ　ＲＴ）、Ａｖｉａｎ　Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ　Ｖｉｒｕｓ
　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＡＭＶ　ＲＴ）、変異型Ｍ－ＭＬＶ　
ＲＴであるＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ　ＩＶ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＳＳ　ＲＴ）（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）等を用いてもよい。
　逆転写酵素としては、ＲＮａｓｅ　Ｈ活性を喪失した、公知の変異体を用いることが好ましい。ＲＮａｓｅ　Ｈ活性を有する逆転写酵素を用いた場合、そのＲＮａｓｅ　Ｈ活性によりＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡを分解するため、逆転写産物の収量が低下する。
　対象ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料に、上述のプライマーを加え、これを上述の第２の領域の融解温度よりも低い温度で静置することにより、上述のプライマーを対象ＲＮＡにハイブリダイズさせる。
　引き続いて、試料に逆転写酵素を加える。逆転写の反応温度は、逆転写酵素が逆転写の活性を持つ温度範囲に設定する。例えば、２０～６０℃に設定することが好ましい。Ｍ－ＭＬＶ　ＲＴを用いる場合には、逆転写反応を２０～３７℃の室温付近で簡便に行うこともできる。
　対象ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料に対し、上述したプライマーと逆転写酵素を添加すると、２０～６０℃の温度範囲においては、上述したプライマーの第２の領域は、対象ＲＮＡとＤＮＡの両者と２本鎖を維持する。
　図２（ａ）は、上述したプライマーの第２の領域が、対象ＲＮＡにハイブリダイズし、逆転写酵素がｃＤＮＡを合成する過程を説明する模式図である。図２（ｂ）は、上述したプライマーの第２の領域が、ＤＮＡにハイブリダイズするが、逆転写酵素がｃＤＮＡを合成しないことを説明する模式図である。図２中、ＲＴは逆転写酵素を示す。
　一般的に、逆転写酵素は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するが、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性は低い。そのため、一般的な逆転写酵素は、ＲＮＡを鋳型とするが、ＤＮＡを鋳型としない。この結果、対象ＲＮＡのみを鋳型としたｃＤＮＡが合成される。
　そのため、添加された逆転写酵素は、対象ＲＮＡを鋳型として、上述のプライマーの３’端から３’方向へ、対象ＲＮＡのみに特異的な相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成する。
このｃＤＮＡの５’端には、第１の領域の配列が付加される。
［検出方法］
　１実施形態において、本発明は、対象ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料に上述のプライマー及び逆転写酵素を添加することと、前記プライマー及び前記対象ＲＮＡを、前記第２の領域の融解温度よりも低い温度でハイブリダイズさせることと、逆転写反応を行いｃＤＮＡを合成することと、前記ｃＤＮＡを鋳型として、上述のプライマーからなるアンチセンスプライマー及び前記ｃＤＮＡにハイブリダイズするセンスプライマーを用いた核酸増幅反応を行うことと、前記核酸増幅反応による核酸の増幅を検出することと、を含み、前記核酸増幅反応を、前記第２の領域の融解温度よりも高い温度で行う、対象ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料中の前記対象ＲＮＡの存在を検出する方法を提供する。
　本明細書において、アンチセンス鎖とは、対象ＲＮＡに相補的なポリヌクレオチド鎖を指す。センス鎖とは、アンチセンス鎖と相補的な配列をもつポリヌクレオチド鎖を指す。
　［製造方法］の実施形態で上述したように、第１の領域の塩基配列を含むアンチセンスプライマーと逆転写酵素を用いて逆転写反応を行うと、対象ＲＮＡに相補的な、第１の領域の配列が付加されたｃＤＮＡが合成される。
　本実施形態の核酸増幅反応においては、プライマーセットとして、センスプライマーとアンチセンスプライマーを用いる。センスプライマーとしては、ｃＤＮＡの配列に相補的なセンス鎖において、アンチセンスプライマーがハイブリダイズする位置から、例えば、５’側に５０～２０００塩基離れた位置の配列を使用することができる。
　本実施形態の核酸増幅反応においては、アンチセンスプライマーとして、対象ＲＮＡの逆転写に用いたプライマー、すなわち、第１の領域と第２の領域からなるプライマーを用いることができる。この結果、未反応の逆転写用プライマーを除去する必要がなく、核酸増幅反応に新たなアンチセンスプライマーを用意する必要もなくなる。
　ｃＤＮＡを鋳型とした場合には、ＰＣＲにより、ＤＮＡが指数関数的に増幅する。試料中に混入したＤＮＡを鋳型とした場合には、ＰＣＲにより、ＤＮＡは指数関数的に増幅しないか、増幅したとしても限定的である。
　アンチセンスプライマー及びセンスプライマーの塩基数は、２０～５０が好ましく、２０～４０がより好ましく、２５～３５が更に好ましい。アンチセンスプライマー及びセンスプライマーの融解温度としては、４５～８０℃が好ましく、５０～８０℃がより好ましく、５５～７５℃が更に好ましい。
　核酸増幅反応としては、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）法、又はＬｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法等が挙げられる。
　ＰＣＲ法では、プライマーと耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いる。ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、好熱菌の一種であるＴｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓのＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ）等の公知の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いることができる。
　ＰＣＲ法では、２本鎖ＤＮＡが１本鎖ＤＮＡに解離し（反応１）、プライマーが解離した１本鎖ＤＮＡと２本鎖を形成し（反応２）、ＤＮＡポリメラーゼが結合したプライマーの３’端から３’方向へＤＮＡ鎖を伸長させる（反応３）、という３個の反応を１サイクルとして、このサイクルを繰り返して核酸増幅反応が進む。
　サイクル数としては、２０～６０回が好ましく、２０～４０回がより好ましく、２５～３５回が更に好ましい。
　反応２の温度は、アンチセンスプライマーの第１の領域と第２の領域の配列のＴｍ値より、－２０℃～＋２０℃にすることが好ましく、－１０℃～＋１０℃にすることがより好ましく、－５℃～＋５℃にすることが更に好ましい。
　また、反応２の温度は、センスプライマーとアンチセンスプライマーのＴｍ以下の温度に設定する。反応２の温度としては、５０～７０℃が好ましく、５０～６５℃がより好ましく、５５～６５℃が更に好ましい。
　続いて、１サイクル目の反応３において、反応液中のＤＮＡポリメラーゼは、合成されたｃＤＮＡを鋳型として、センスプライマーの３’端から３’方向へＤＮＡを伸長させて、２本鎖ＤＮＡを合成する。図３（ａ）は、本実施形態の逆転写反応において合成されたｃＤＮＡにセンスプライマーがハイブリダイズした状態を説明する模式図である。
　ｃＤＮＡを鋳型として合成されたＤＮＡは、アンチセンスプライマーの第１と第２の領域に相補的な配列を有する。図３（ｂ）は、ＰＣＲの１サイクル目でｃＤＮＡを鋳型として合成されたセンス鎖に、アンチセンスプライマーがハイブリダイズした状態を説明する模式図である。
　図３（ｂ）に示すように、アンチセンスプライマーがハイブリダイズした後、上述した反応３により、２本鎖ＤＮＡが合成される。
　前述のｃＤＮＡを鋳型として合成された２本鎖ＤＮＡは、センスプライマーとアンチセンスプライマーにそれぞれ相補的な配列を有する。ＰＣＲの反応サイクルを繰り返すことにより、２本鎖ＤＮＡが指数関数的に増幅する。
　図３（ｃ）は、試料中に混入したＤＮＡにセンスプライマーがハイブリダイズした状態を説明する模式図である。
　試料中に混入したＤＮＡは、アンチセンスプライマーの第２の領域に相補的な配列を有するが、第１の領域に相補的な配列は有していない。また、上述した反応２は、アンチセンスプライマーの第２の領域のＴｍよりも高い温度で行う。
　反応２の温度は、アンチセンスプライマーの第２の領域のＴｍよりも、１０～５０℃高いことが好ましく、１５～４０℃高いことがより好ましく、２０～４０℃高いことが更に好ましい。
　ｃＤＮＡを鋳型として合成されたセンスＤＮＡは、アンチセンスプライマー全体の配列と相補的な配列を持つ。そのため、アンチセンスプライマーは、上述の温度範囲に設定された反応２において、ｃＤＮＡを鋳型として合成されたセンスＤＮＡにハイブリダイズする。
　一方、試料中に混入したＤＮＡは、アンチセンスプライマーの第２の領域と相補的な配列を持つが、アンチセンスプライマーの第１の領域と相補的な配列は持たない。そのため、アンチセンスプライマーは、上述の温度範囲に設定された反応２において、混入したＤＮＡにハイブリダイズすることができない。
　図３（ｄ）は、試料中に混入したＤＮＡにアンチセンスプライマーの第２の領域がハイブリダイズしない状態を説明する模式図である。
　図３（ｄ）に示すように、アンチセンスプライマーは、試料中に混入したＤＮＡと２本鎖を形成しないため、混入したＤＮＡを鋳型とするＤＮＡは、指数関数的に増幅しないか、増幅したとしても限定的である。その結果、対象ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料から、対象ＲＮＡを鋳型とするＤＮＡが特異的に増幅される。
　増幅したＤＮＡの存在は、このＤＮＡと相補的な配列を有するプローブ、又は検出可能なプローブで標識したプライマー等の公知のプローブを用いることにより、検出できる。
　実施例において詳述するように、増幅したＤＮＡを検出することにより、対象ＲＮＡの存在を検出することができる。さらに、対象ＲＮＡのコピー数は、増幅したＤＮＡの量と相関を示すため、増幅したＤＮＡの量から対象ＲＮＡの量を算出することができる。
［キット］
（第１実施形態）
　１実施形態において、本発明は、上述のアンチセンスプライマーを含む、対象ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料から対象ＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡを製造するためのキットを提供する。
　第２の領域は、対象ＲＮＡと相補的な配列である。塩基数としては８～１０塩基であってもよい。対象ＲＮＡと第１の領域と第２の領域からなるプライマーを混合すると、第２の領域は、対象ＲＮＡと２本鎖を形成することができる。
　逆転写酵素としては、例えば、Ｍ－ＭＬＶを用いることができるが、これに限定されない。また、逆転写反応の温度としては、逆転写酵素の逆転写の活性がある温度範囲内に設定する。
　前述のように、対象ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料に、第１の領域と第２の領域からなるプライマー及び逆転写酵素を添加し、逆転写反応を行うと、対象ＲＮＡのみに特異的なｃＤＮＡを製造することができる。製造されたｃＤＮＡの５’端には、第１の領域の配列が付加される。
（第２実施形態）
　１実施形態において、本発明は、上述のアンチセンスプライマーと、対象ＲＮＡを鋳型として合成されたｃＤＮＡにハイブリダイズするセンスプライマーと、を含む、対象ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料中の前記対象ＲＮＡの存在の検出用キットを提供する。
　対象ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料中に、第１の領域と第２の領域からなるプライマー及び逆転写酵素を添加し、逆転写反応を行うと、５’端に第１の領域の配列が付加されたｃＤＮＡを製造することができる。
　対象ＲＮＡの存在を検出するために、ｃＤＮＡを鋳型として、核酸増幅反応により２本鎖ＤＮＡを増幅させてもよい。核酸増幅反応としては、上述したものと同様であり、例えば、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法等が挙げられる。センスプライマー、アンチセンスプライマーについては、［検出方法］の実施形態において上述したものと同様である。
　上述したように、核酸増幅反応により増幅されたＤＮＡの存在は、公知のプローブ及び定量ＰＣＲ装置を用いて、検出することができる。これにより、試料中に含まれるＲＮＡの存在を検出することができる。
　以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実験例１］
（鋳型ＤＮＡおよびＲＮＡの調製）
　逆転写反応と定量ＰＣＲに用いる鋳型ＤＮＡとＲＮＡを調整した。
　まず、ＨＩＶ－１のｇａｇ遺伝子が挿入されたｐＮＬ４－３　プラスミドを調製した。
このプラスミドＤＮＡの配列のＮＣＢＩアクセッション番号はＡＦ３２４４９３．２である。
　５０ｎｇ／ｍＬの濃度のＤＮＡの、２６０ｎｍにおける吸光度は１である。調製したプラスミドＤＮＡの２６０ｎｍにおける吸光度から、プラスミドＤＮＡの濃度を算出した。
この濃度から、鋳型として用いるプラスミドＤＮＡのコピー数を算出した。
　また、ＨＩＶ－１が感染した８Ｅ５細胞の培養液の上清から、ＭｉｎＥｌｕｔｅ　Ｖｉｒｕｓ　Ｓｐｉｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、ＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡを用いて、逆転写反応とｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲを行った。得られた結果についてポワソン分布式を用いて解析し、抽出したＲＮＡのコピー数を計算した。
［実験例２］
（プラスミドＤＮＡを鋳型とした定量ＰＣＲ）
《プライマーの作製》
　定量ＰＣＲに用いるセンスプライマーと１４種類のアンチセンスプライマーを作成した。使用したプライマーの配列を表１に示す。「ｇａｇ－ＦＡ」はセンスプライマーの名称であり、「ｇａｇ－ＲＡ」はアンチセンスプライマーの名称である。プライマーの配列及び上記式（２）に基づいて計算したＴｍ値を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１中、「ｇａｇ－ＲＡ（Ｘ－Ｙ）」は、第１の領域と第２の領域からなるプライマーであることを表す。３’端のＸ個の塩基はｇａｇ　ｍＲＮＡに相補的であり、上述の第２の領域に相当し、５’端のＹ個の塩基は、ｇａｇ　ｍＲＮＡと相補的ではない配列であり、上述の第１の領域に相当することを表す。
《ＤＮＡを鋳型とした定量ＰＣＲ》
　１０００コピーのｐＮＬ４－３　プラスミドを鋳型として、表１に示されるｇａｇ－ＦＡプライマーと１４種類のｇａｇ－ＲＡ（Ｘ－Ｙ）プライマーを用いて、それぞれ定量ＰＣＲを行った。
　反応条件は、９７℃　２分で最初の熱変性を行った後、（９４℃　５秒、６０℃　２０秒）を６０サイクルとした。検出にはリアルタイムＰＣＲ装置（型式Ｌｉｇｈｔ　Ｃｙｃｌｅｒ９６、日本ジェネティクス社）を用いた。また、プローブの蛍光強度が０．０５に達した時のサイクル数をＣｑとした。結果を図４と表２に示す。
　図４は、ｐＮＬ４－３　プラスミドを鋳型とした場合の、定量ＰＣＲのサイクル数と増幅されたＤＮＡ量の関係を示す増幅曲線である。図４中、各増幅曲線は、それぞれＰＣＲで用いたｇａｇ－ＲＡ（Ｘ－Ｙ）プライマーに対応する。
　その結果、プライマーに含まれる、第２の領域の塩基数が２０以下になると、増幅曲線が右へシフトすることが明らかになった。すなわち、核酸増幅速度が低下することが明らかになった。また、第２の領域の塩基数が１２以下になると、ＰＣＲによりＤＮＡはほとんど増幅しないことが分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２中、Ｃｑの値は、増幅されたＤＮＡが閾値に達した時の、サイクル数を示す。第２の領域の塩基数が２０以下になると、Ｃｑの値が大きくなる傾向が確認された。また、第２の領域の塩基数が１２以下になると、増幅したＤＮＡの量は閾値に達しないことが明らかになった。
　また、プライマーの第２の領域のＴｍが５２℃以下になるとＤＮＡの増幅効率が低下し、３６℃以下になるとＤＮＡは増幅しないことが明らかになった。これは、第２の領域のＴｍが低くなると、ｇａｇ－ＲＡ（Ｘ－Ｙ）プライマーがセンスＤＮＡと２本鎖を形成しにくくなるためであると考えられた。
［実験例３］
（ＲＮＡを鋳型とした逆転写反応と定量ＰＣＲ）
　鋳型ＲＮＡとｇａｇ－ＲＡ（Ｘ－Ｙ）プライマーを用いて、逆転写反応と定量ＰＣＲを行い、ＤＮＡの増幅効率を解析した。
　１０００コピーのＲＮＡを含む試料に、ｇａｇ－ＲＡ（Ｘ－Ｙ）プライマーとＭ－ＭＬＶ逆転写酵素（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を加え、３７℃で１０分間静置し、逆転写反応により、ｃＤＮＡを合成した。
　続いて、合成したｃＤＮＡと、表１に示されるｇａｇ－ＦＡプライマーとｇａｇ－ＲＡ（Ｘ－Ｙ）プライマーを用いて、定量ＰＣＲを行った。反応条件は、９７℃　２分で最初の熱変性を行った後、（９４℃　５秒、６０℃　２０秒）を６０サイクルとした。結果を図５と表３に示す。
　図５は、ＲＮＡを鋳型として逆転写反応と定量ＰＣＲを行った場合の、定量ＰＣＲのサイクル数とＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ量の関係を示す増幅曲線である。図５中、各増幅曲線は、ＰＣＲで用いたｇａｇ－ＲＡプライマーを示す。
　その結果、プライマーに含まれる、第２の領域の塩基数が７であっても、ＰＣＲによりＤＮＡが指数関数的に増幅することが明らかになった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３中、Ｃｑの値は、増幅されたＤＮＡが閾値に達した時のサイクル数を示す。第２の領域の塩基数が１０以上であれば、Ｃｑの値はほとんど変わらないことが明らかになった。また、第２の領域の塩基数の値が７～１０であっても、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ量は閾値に達することが明らかになった。
　これらの結果を小括すると、第２の領域のＴｍが７～３６℃であるプライマーを用いた場合、逆転写反応とＰＣＲにより、プラスミドＤＮＡを鋳型としたＤＮＡはほとんど増幅せず、ＲＮＡが鋳型の場合には、産物ＤＮＡ量は指数関数的に増幅することが明らかになった。
　すなわち、第２の領域のＴｍが７～３６℃であるプライマーを用いた場合には、ＤＮＡとＲＮＡの混合物中から、逆転写反応とＰＣＲにより、対象ＲＮＡを鋳型としたＤＮＡ産物を得ることができる。
　［実験例４］
（ＲＮＡのコピー数と増幅曲線の関係）
　鋳型とするＲＮＡのコピー数及びｇａｇ－ＲＡ（Ｘ－Ｙ）プライマーと、定量ＰＣＲによるＤＮＡの増幅効率の関係性について解析した。
　１００００、１０００、１００、１０、０コピーのＲＮＡを含む試料に、ｇａｇ－ＲＡ（Ｘ－Ｙ）プライマーとＭ－ＭＬＶ逆転写酵素（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を加え、３７℃で１０分間静置し、逆転写反応により、ｃＤＮＡを合成した。
　続いて、合成したｃＤＮＡを鋳型として、ｇａｇ－ＦＡプライマーとｇａｇ－ＲＡ（２７－０）プライマーを用いて、定量ＰＣＲを行った。反応条件は、９７℃　２分で最初の熱変性を行った後、（９４℃　５秒、６０℃　２０秒）を６０サイクルとした。各実験を３回繰り返した。結果を図６と図８に示す。
　図６は、各コピー数のＲＮＡを鋳型とし、ｇａｇ－ＲＡ（２７－０）を用いて、逆転写反応と定量ＰＣＲを行った場合の、サイクル数とＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ量の関係を示す増幅曲線である。その結果、ｇａｇ－ＲＡ（２７－０）を用いた場合、鋳型が１０コピーのＲＮＡであっても、再現性良くＰＣＲによりＤＮＡが増幅できることが明らかになった。また、それぞれの曲線は、分離可能であることから、ＲＮＡのコピー数を定量的に分析できることが明らかになった。
　次に、合成したｃＤＮＡを鋳型として、ｇａｇ－ＦＡプライマーとｇａｇ－ＲＡ（９－１８）プライマーを用いて、定量ＰＣＲを行った。反応条件は、９７℃　２分で最初の熱変性を行った後、（９４℃　５秒、６０℃　２０秒）を６０サイクルとした。結果を図７と図９に示す。
　図７は、各コピー数のＲＮＡを鋳型とし、ｇａｇ－ＲＡ（９－１８）を用いて、逆転写反応と定量ＰＣＲを行った場合の、サイクル数とＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ量の関係を示す増幅曲線である。その結果、ｇａｇ－ＲＡ（９－１８）を用いた場合、鋳型が１０コピーのＲＮＡであっても、再現性良くＰＣＲによりＤＮＡが増幅できることが明らかになった。また、それぞれの曲線は、分離可能であることから、ＲＮＡのコピー数を定量的に分析できることが明らかになった。
　図８は、各コピー数のＲＮＡを鋳型とし、ｇａｇ－ＲＡ（２７－０）プライマーを用いて、逆転写反応と定量ＰＣＲを行った場合の、鋳型ＲＮＡのコピー数と、Ｃｑ値の関係を示すグラフである。図９は、各コピー数のＲＮＡを鋳型とし、ｇａｇ－ＲＡ（９－１８）を用いて、逆転写反応と定量ＰＣＲを行った場合の、鋳型ＲＮＡのコピー数と、Ｃｑ値の関係を示すグラフである。
　その結果、ｇａｇ－ＲＡ（２７－０）をプライマー用いた場合と、ｇａｇ－ＲＡ（９－１８）プライマーを用いた場合とで、検量線の傾きはほぼ一致することが明らかになった。この結果は、ふたつの場合で、増幅効率が同レベルであることを示す。
　［実験例５］
（鋳型ＤＮＡコピー数と増幅曲線の関係）
　鋳型とするプラスミドＤＮＡのコピー数及びｇａｇ－ＲＡ（Ｘ－Ｙ）プライマーと、定量ＰＣＲによるＤＮＡの増幅効率の関係性について解析した。
　１００００、１０００、１００、１０、０コピーのｐＮＬ４－３　プラスミドＤＮＡを含む試料に、ｇａｇ－ＦＡプライマーとｇａｇ－ＲＡ（２７－０）プライマーを用いて、定量ＰＣＲを行った。反応条件は、９７℃　２分で最初の熱変性を行った後、（９４℃　
５秒、６０℃　２０秒）を６０サイクルとした。結果を図１０に示す。
　図１０は、各コピー数のｐＮＬ４－３　プラスミドＤＮＡを鋳型とし、ｇａｇ－ＲＡ（２７－０）を用いて、定量ＰＣＲを行った場合の、サイクル数とＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ量の関係を示す増幅曲線である。その結果、ｇａｇ－ＲＡ（２７－０）プライマーを用いた場合には、鋳型のｐＮＬ４－３　プラスミドＤＮＡが１０コピーであっても、ＰＣＲによりＤＮＡが増幅することが明らかになった。
　次に、１００００、１０００、１００、１０、０コピーのｐＮＬ４－３　プラスミドＤＮＡを含む試料に、ｇａｇ－ＦＡプライマーとｇａｇ－ＲＡ（９－１８）プライマーを用いて、定量ＰＣＲを行った。反応条件は、９７℃　２分で最初の熱変性を行った後、（９４℃　５秒、６０℃　２０秒）を６０サイクルとした。結果を図１１に示す。
　図１１は、各コピー数のｐＮＬ４－３　プラスミドＤＮＡを鋳型とし、ｇａｇ－ＲＡ（９－１８）を用いて、定量ＰＣＲを行った場合の、サイクル数とＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ量の関係を示す増幅曲線である。その結果、プライマーとしてｇａｇ－ＦＡとｇａｇ－ＲＡ（９－１８）を用いた場合には、ＰＣＲによりＤＮＡはほとんど増幅しないことが明らかになった。
　［実験例６］
（ＤＮＡとＲＮＡの混合物を鋳型としたＲＴ－ＰＣＲ）
　ＤＮＡとＲＮＡを含む試料と、ｇａｇ－ＲＡ（２７－０）又はｇａｇ－ＲＡ（９－１８）を用いて、逆転写反応とＰＣＲを行い、ＲＮＡの量を定量した。
　ｐＮＬ４－３　プラスミドＤＮＡとＲＮＡの混合物に、ｇａｇ－ＲＡ（２７－０）又はｇａｇ－ＲＡ（９－１８）プライマーとＭ－ＭＬＶ逆転写酵素（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を加え、３７℃で１０分間静置し、逆転写反応により、ｃＤＮＡを合成した。鋳型のコピー数は、（ＤＮＡが１０００コピー、ＲＮＡが０コピー）、（ＤＮＡが９６０コピー、ＲＮＡが４０コピー）、（ＤＮＡが８００コピー、ＲＮＡが２００コピー）、（ＤＮＡが０コピー、ＲＮＡが１０００コピー）、（ＤＮＡが０コピー、ＲＮＡが０コピー）であった。
　続いて、合成したｃＤＮＡと、ｇａｇ－ＦＡプライマーとｇａｇ－ＲＡ（２７－０）プライマーを用いて、定量ＰＣＲを行った。反応条件は、９７℃　２分で最初の熱変性を行った後、（９４℃　５秒、６０℃　２０秒）の６０サイクルとした。結果を図１２に示す。
　図１２は、ｐＮＬ４－３　プラスミドＤＮＡとＲＮＡの混合物を鋳型とし、ｇａｇ－ＲＡ（２７－０）を用いて、逆転写反応と定量ＰＣＲを行った場合の、定量ＰＣＲのサイクル数とＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ量の関係を示す増幅曲線である。
　その結果、ｇａｇ－ＲＡ（２７－０）プライマーを用いた場合には、いずれの鋳型の組み合わせにおいても、同様の増幅曲線が得られた。
　次に、合成したｃＤＮＡと、ｇａｇ－ＦＡプライマーとｇａｇ－ＲＡ（９－１８）プライマーを用いて、定量ＰＣＲを行った。反応条件は、９７℃　２分で最初の熱変性を行った後、（９４℃　５秒、６０℃　２０秒）の６０サイクルとした。結果を図１３に示す。
　図１３は、ｐＮＬ４－３　プラスミドＤＮＡとＲＮＡの混合物を鋳型とし、ｇａｇ－ＲＡ（９－１８）を用いて、逆転写反応と定量ＰＣＲを行った場合の、定量ＰＣＲのサイクル数とＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ量の関係を示す増幅曲線である。
　その結果、ｇａｇ－ＲＡ（９－１８）プライマーを用いた場合には、ＤＮＡの増幅効率は、鋳型ＤＮＡには依存せず、鋳型ＲＮＡの量に依存することが明らかになった。
　以上の結果を小括すると、ｇａｇ－ＲＡ（９－１８）プライマーを用いて、逆転写反応と定量ＰＣＲを行うと、ＤＮＡとＲＮＡの混合物からＲＮＡの量を定量することが可能であることが明らかになった。
　本発明によれば、ＤＮＡとＲＮＡの混合物から、対象ＲＮＡを簡便に検出する技術を提供することができる。

Claims (5)

  1. 　第１の領域と第２の領域からなるプライマーであって、
    　５’側に前記第１の領域が位置しており、３’側に前記第２の領域が位置しており、
    　前記第１の領域は、対象ＲＮＡと相補的でない塩基配列からなり、
    　前記第２の領域は、前記対象ＲＮＡに相補的な塩基配列からなり、
    　前記第２の領域の融解温度は２０～５０℃である、プライマー。
  2. 　対象ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料に請求項１に記載のプライマー及び逆転写酵素を添加することと、
    　前記プライマー及び前記対象ＲＮＡを、前記第２の領域の融解温度よりも低い温度でハイブリダイズさせることと、
    　逆転写反応を行いｃＤＮＡを合成することと、を含み、
    　前記ｃＤＮＡは、前記対象ＲＮＡのみを鋳型としたｃＤＮＡである、ｃＤＮＡの製造方法。
  3. 　対象ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料に請求項１に記載のプライマー及び逆転写酵素を添加することと、
    　前記プライマー及び前記対象ＲＮＡを、前記第２の領域の融解温度よりも低い温度でハイブリダイズさせることと、
    　逆転写反応を行いｃＤＮＡを合成することと、
    　前記ｃＤＮＡを鋳型として、請求項１に記載のプライマーからなるアンチセンスプライマー及び前記ｃＤＮＡにハイブリダイズするセンスプライマーを用いた核酸増幅反応を行うことと、
    　前記核酸増幅反応による核酸の増幅を検出することと、を含み、
    　前記核酸増幅反応は、前記第２の領域の融解温度よりも高い温度で行われる、
    　対象ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料中の前記対象ＲＮＡの存在を検出する方法。
  4. 　請求項１に記載のプライマーを含む、対象ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料から対象ＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡを製造するためのキット。
  5. 　請求項１に記載のプライマーと、
    　対象ＲＮＡを鋳型として合成されたｃＤＮＡにハイブリダイズするセンスプライマーと、
    を含む、
    　対象ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料中の前記対象ＲＮＡの存在の検出用キット。
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JP2016536981A (ja) * 2013-10-17 2016-12-01 タカラ バイオ ユーエスエー， インコーポレイテッド アダプタを核酸に追加する方法、及びこの方法を実行するための組成物

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