CN110551795A - cDNA的合成方法、靶RNA的检测方法及试剂盒 - Google Patents

cDNA的合成方法、靶RNA的检测方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及cDNA的合成方法、靶RNA的检测方法及试剂盒。本发明的课题在于，提供可以以更高的精度由靶RNA合成及扩增cDNA的手段。通过使用与靶RNA杂交的第1寡核苷酸分子、与该第1寡核苷酸分子杂交的第2寡核苷酸分子和逆转录酶且以靶RNA为模板来合成cDNA，从而解决了上述课题。

Description

cDNA的合成方法、靶RNA的检测方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及合成cDNA的方法。另外，本发明涉及检测靶RNA的方法。另外，本发明涉及用于这些方法的试剂盒。
背景技术
近年来，逐渐明确以小分子RNA(miRNA)为代表的低分子的非编码RNA在发生、分化、细胞增殖、细胞凋亡等各种生物学过程中发挥了重要作用。对这类功能性低分子RNA进行检测及定量在阐明生命现象方面非常重要。通常，在RNA的检测中常用的方法是：通过逆转录反应由RNA合成cDNA，利用PCR法对该cDNA进行扩增及检测。但是，miRNA的碱基长度为20碱基左右，较短，因此难以设计与通过逆转录反应得到的cDNA的两端杂交的引物。
作为由miRNA合成cDNA并扩增的方法，已知例如专利文献1及2中记载的方法。专利文献1中公开了：使用在5’侧具有与miRNA不杂交的区域的引物来进行miRNA的逆转录反应，由此合成比miRNA长的cDNA(参照专利文献1的图1)。另外，专利文献2公开了：使用具有作为突出部分的、与miRNA杂交的区域的茎·环结构的引物来进行miRNA的逆转录反应(参照专利文献2的图4)。专利文献2的方法通过在逆转录反应后使引物的茎部分解离而得到比miRNA长的cDNA。专利文献1及2的方法通过使用所得到的cDNA作为模板，从而容易利用PCR进行cDNA的扩增。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：欧州专利第1851336号说明书
专利文献2：美国专利第7575863号说明书
发明内容
发明要解决的课题
本发明人发现，专利文献1及2的方法在由低分子RNA合成cDNA及扩增的灵敏度及特异性方面有改善的余地。本发明的目的在于，开发可以以更高的精度由靶RNA合成及扩增cDNA的手段。
用于解决课题的手段
因此，本发明提供一种将靶RNA、第1寡核苷酸分子、第2寡核苷酸分子和逆转录酶混合并以该靶RNA为模板来合成cDNA的方法。在该方法中，第1寡核苷酸分子在3’末端具有与靶RNA杂交的第1区域、在第1区域的5’侧具有与第2寡核苷酸分子杂交的第2区域。
本发明提供检测靶RNA的方法，其包含：将靶RNA、第1寡核苷酸分子、第2寡核苷酸分子和逆转录酶混合并以该靶RNA为模板合成cDNA的工序；对该cDNA进行扩增并检测扩增产物的工序。在该方法中，第1寡核苷酸分子在3’末端具有与靶RNA杂交的第1区域、在第1区域的5’侧具有与第2寡核苷酸分子杂交的第2区域。
本发明提供一种试剂盒，其包含：与靶RNA杂交的第1寡核苷酸分子、和与该第1寡核苷酸分子杂交的第2寡核苷酸分子。在该试剂盒中，第1寡核苷酸分子在3’末端具有与靶RNA杂交的第1区域、在第1区域的5’侧具有与第2寡核苷酸分子杂交的第2区域。
【发明的效果】
根据本发明，可以以更高的精度由靶RNA合成及扩增cDNA。
附图说明
图1是示出利用本实施方式的合成方法合成及扩增cDNA的反应原理的示意图。
图2A是示出本实施方式的试剂盒的外观的一例的图。
图2B是示出本实施方式的试剂盒的外观的一例的图。
图2C是示出本实施方式的试剂盒的外观的一例的图。
图2D是示出本实施方式的试剂盒的外观的一例的图。
图3是用实时PCR扩增通过专利文献1的方法合成的cDNA时的扩增曲线。
图4是用实时PCR扩增通过专利文献2的方法合成的cDNA时的扩增曲线。
图5是用实时PCR扩增通过本实施方式的cDNA的合成方法合成cDNA时的扩增曲线。
图6A是用实时PCR扩增通过使用第2寡核苷酸分子的本实施方式的cDNA的合成方法合成的cDNA时的扩增曲线，其中，所述第2寡核苷酸分子具有与第1寡核苷酸分子的第2区域的碱基序列完全互补的碱基序列。
图6B是用实时PCR扩增通过使用第2寡核苷酸分子的本实施方式的cDNA的合成方法合成的cDNA时的扩增曲线，其中，所述第2寡核苷酸分子包含与第1寡核苷酸分子的第2区域的碱基序列不互补的碱基。
图6C是用实时PCR扩增通过使用第2寡核苷酸分子的本实施方式的cDNA的合成方法合成的cDNA时的扩增曲线，其中，所述第2寡核苷酸分子包含与第1寡核苷酸分子的第2区域的碱基序列不互补的碱基。
图6D是用实时PCR扩增通过使用第2寡核苷酸分子的本实施方式的cDNA的合成方法合成的cDNA时的扩增曲线，其中，所述第2寡核苷酸分子包含与第1寡核苷酸分子的第2区域的碱基序列不互补的碱基。
图6E是用实时PCR扩增通过使用第2寡核苷酸分子的本实施方式的cDNA的合成方法合成的cDNA时的扩增曲线，其中，所述第2寡核苷酸分子包含与第1寡核苷酸分子的第2区域的碱基序列不互补的碱基。
图7A是用实时PCR扩增通过使用第2寡核苷酸分子的本实施方式的cDNA的合成方法合成的cDNA时的扩增曲线，其中，所述第2寡核苷酸分子在3'末端导入有帽结构。
图7B是用实时PCR扩增通过使用第2寡核苷酸分子的本实施方式的cDNA的合成方法合成的cDNA时的扩增曲线，其中，所述第2寡核苷酸分子在3'末端导入有帽结构。
具体实施方式
本说明书中，“杂交”这一表述是指：规定的寡核苷酸(或多核苷酸)的全部或部分在严谨条件下介由氢键与另一寡核苷酸(或多核苷酸)的全部或部分形成双链。“严谨条件”为进行寡核苷酸(或多核苷酸)的杂交时本领域技术人员通常使用的条件即可。可列举例如：当2个寡核苷酸分子之间具有至少50％、优选至少75％、更优选至少90％的序列同一性时，一个寡核苷酸分子与另一寡核苷酸分子能够特异性杂交的条件。已知杂交中的严谨度为温度、盐浓度、寡核苷酸的碱基长度及GC含量、以及杂交缓冲液中所含的离液剂的浓度的函数。作为严谨条件，可以使用例如Sambrook,J.等,1998,Molecular Cloning:ALaboratory Manual(第2编),Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York中记载的条件等。
在本说明书中，“完全互补的碱基序列”是指：相对于规定的寡核苷酸(或多核苷酸)的全部或部分碱基序列中的全部碱基，形成沃森-克里克模型的互补碱基对的碱基序列。在本说明书中，“错配部位”是指：2个寡核苷酸分子(或多核苷酸分子)进行杂交时，由于与一个寡核苷酸分子(或多核苷酸分子)的碱基序列中的规定碱基不互补的碱基存在于另一个寡核苷酸分子(或多核苷酸分子)的碱基序列的对应位置、从而不能形成沃森-克里克模型的互补的碱基对的部位。
在本说明书中，“反应体系”是指：存在对于逆转录反应和/或核酸扩增反应而言必需的成分、发生该反应的有限的环境。例如，作为逆转录反应的反应体系，可列举包含靶RNA、第1寡核苷酸分子、第2寡核苷酸分子和逆转录酶的收容在管等容器中的反应液或乳液之类的微小液滴。“逆转录酶”与“RNA依赖性DNA聚合酶”含义相同。
[1.cDNA的合成方法]
在本实施方式的合成cDNA的方法(以下也称为“合成方法”)中，将靶RNA、第1寡核苷酸分子、第2寡核苷酸分子和逆转录酶混合并以该靶RNA为模板合成cDNA。
参照图1对本实施方式的合成方法中的期望反应的一例进行说明。在该合成方法中，第1寡核苷酸分子作为逆转录用引物(以下也称为“RT引物”)起作用。第1寡核苷酸分子在3’末端具有与靶RNA杂交的第1区域、在第1区域的5’侧具有与第2寡核苷酸分子杂交的第2区域。如果将靶RNA、第1寡核苷酸分子、第2寡核苷酸分子和逆转录酶混合，则如图1的左侧(1)所示，第1寡核苷酸分子介由第1区域与靶RNA杂交、且介由第2区域与第2寡核苷酸分子杂交。在图1的例子中，第1区域具有与包含靶RNA的3'末端的部分的碱基序列完全互补的碱基序列。另外，在该例子中，第2寡核苷酸分子与第2区域的碱基长度相同、且具有与第2区域的碱基序列完全互补的碱基序列。
将上述混合物置于适合逆转录反应的温度条件下，从而如图1的左侧(2)所示，在逆转录酶的作用下，已与靶RNA及第2寡核苷酸分子杂交的第1寡核苷酸分子的3’末端延伸，从而合成cDNA。需要说明的是，严格来说，cDNA是靶RNA的互补链部分，但是本说明书中cDNA是指：不仅包含靶RNA的互补链、还包含第2区域的寡核苷酸。即，本说明书中，cDNA是指：以靶RNA为模板而延伸形成的第1寡核苷酸分子。有时所合成的cDNA与靶RNA和/或第2寡核苷酸分子呈杂交状态，可以利用热变性等容易地除去靶RNA及第2寡核苷酸分子。
如图1所示，第1寡核苷酸分子的第2区域为与靶RNA不杂交的区域，因此可以得到比靶RNA长的cDNA。由此，后续进行的cDNA扩增中要使用的引物的设计变得容易。本实施方式的合成方法不受理论或作用机制约束，但是可推测：在第1寡核苷酸分子的第2区域与第2寡核苷酸分子形成双链的状态下使第1寡核苷酸分子的3'末端延伸的方式，有助于提高cDNA合成及此后的cDNA扩增的精度及特异性。
在本实施方式的合成方法中，可以利用PCR法等DNA扩增法对得到的cDNA进行扩增。此时，作为模板，可以直接使用包含cDNA的逆转录反应后的混合物。在图1的例子中，利用使用与cDNA杂交的引物(以下称为“正向引物”)、与该cDNA的互补链杂交的引物(以下称为“反向引物”)及聚合酶的常规PCR法来扩增cDNA。在PCR的第1个循环中，如图1的右侧(3)所示，正向引物杂交到cDNA上。然后在聚合酶的作用下正向引物延伸，从而合成cDNA的互补链。
在第2个循环中，如图1的右侧(4)所示，正向引物杂交到cDNA上、反向引物杂交到cDNA的互补链上。然后，在聚合酶的作用下，各引物延伸而得到双链DNA。在此，在将逆转录反应后的混合物直接用于PCR时，在图1的例子中，反向引物也可与该混合物中残存的第2寡核苷酸分子杂交。但是，如果使用与第2寡核苷酸分子相比足够大量的反向引物，则对扩增反应几乎没有影响。在第3次及此后的循环中，如图1的右侧(5)所示，以双链DNA为模板以指数函数性方式得到扩增产物。
以下对本实施方式的合成方法中使用的各成分进行说明。
靶RNA没有特别限定，可以从期望合成出cDNA的任意的RNA中适当选择。在本实施方式中，为了制作作为RT引物的第1寡核苷酸分子，靶RNA优选为碱基序列已知的RNA。RNA的碱基序列的信息可以由本技术领域公知的数据库、例如GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)、miRBase(http://www.mirbase.org/search.shtml)等得到。
本实施方式的合成方法特别适合于由小分子RNA合成cDNA。小分子RNA是指碱基长度小于200的非编码RNA。作为小分子RNA，可列举例如miRNA、核内小RNA(small nuclearRNA：snRNA)、核仁小RNA(small nucleolar RNA：snoRNA)、piwi相互作用RNA(piwi-interacting RNA：piRNA)、初体miRNA(primary miRNA：pri-miRNA)、前体miRNA(precursormiRNA：pre-miRNA)、短干扰RNA(short interfering RNA：siRN)、短发夹RNA(shorthairpin RNA：shRNA)等。在优选的实施方式中，靶RNA为具有15以上且小于200的碱基长度的单链RNA。
靶RNA的来源没有特别限定，可以为从生物体或生物试样取得的RNA，也可以为人工合成的RNA。生物体只要具有靶RNA则没有特别限定，可以为真核生物，也可以为原核生物。优选的生物体是包括人的哺乳动物。作为生物试样，可列举例如收集自生物体的脏器、组织、细胞、体液等。作为体液，可列举例如血液、血浆、血清、淋巴液、唾液、尿等。另外，生物试样可以是培养细胞、细菌等微生物及病毒的培养物、培养上清、增溶物、提取物等。近年获知在外来体中包含了大量的miRNA等小分子RNA。在本实施方式中，生物试样可以是从生物体的体液等中分离出的外来体。
由生物试样提取RNA的方法本身是公知的。例如，在生物试样为细胞或组织的情况下，RNA的提取可以如下进行。首先，将生物试样与包含硫氰酸胍和表面活性剂的增溶液混合。对所得到的混合液进行物理处理(搅拌、匀浆、超声波破碎等)，从而使生物试样中所含的RNA游离到该混合液中。由此，可以从生物试样提取RNA。可以对提取出的RNA进行纯化。例如，对包含RNA的混合液进行离心分离，回收上清，对该上清进行苯酚/氯仿提取，由此可以纯化RNA。可以使用市售的RNA提取盒来进行生物试样中的RNA的提取和纯化。
第1寡核苷酸分子是在3’末端具有第1区域、在该第1区域的5’侧具有第2区域的寡核苷酸分子。如上所述，第1寡核苷酸分子在本实施方式的合成方法中发挥RT引物的作用。第1区域是与靶RNA杂交的区域，第2区域是与第2寡核苷酸分子杂交的区域。在本实施方式中，第1寡核苷酸分子只要能够通过逆转录反应而进行3'末端的延伸，则除了具有第1区域及第2区域以外也可以具有其它区域。在优选的实施方式中，第1寡核苷酸分子由第1区域及第2区域构成。以下对第1区域及第2区域进行说明。
第1区域是包含第1寡核苷酸分子的3’末端的区域。第1寡核苷酸分子通过介由第1区域与靶RNA杂交并进行3'末端的延伸，从而作为RT引物起作用。第1区域的碱基长度只要是在逆转录反应期间可以维持与靶RNA的杂交的长度则没有特别限定。第1区域例如具有3以上且15以下的碱基长度，优选具有4以上且12以下的碱基长度，更优选具有6以上且10以下的碱基长度。第1区域的碱基序列只要是可以与靶RNA杂交的碱基序列则没有特别限定。优选第1区域的碱基序列为与靶RNA的一部分碱基序列完全互补的碱基序列。靶RNA中的第1区域杂交的部分没有特别限定，优选为包含靶RNA的3'末端的部分。
第2区域是位于第1区域的5’侧的区域。第2区域可以是包含第1寡核苷酸分子的5’末端的区域。如上所述，第1寡核苷酸分子介由第2区域与第2寡核苷酸分子杂交。在本实施方式中，可以是第2区域全部与第2寡核苷酸分子进行杂交。或者，也可以是第2区域的一部分与第2寡核苷酸分子进行杂交。因此，第2区域的全部或部分具有能够与第2寡核苷酸分子杂交的碱基序列。优选第2区域的全部或部分碱基序列为与第2寡核苷酸分子的全部碱基序列完全互补的碱基序列。第2区域的碱基长度没有特别限定，为例如10以上且40以下的碱基长度，优选为17以上且40以下的碱基长度，更优选为20以上且40以下的碱基长度。
在本实施方式的合成方法中，第2区域为对通过逆转录反应而合成的靶RNA的互补链增加长度的附加序列。因此，第2区域优选为与第2寡核苷酸分子杂交、但与靶RNA不杂交的区域。这样的第2区域的碱基序列可根据靶RNA的碱基序列适当决定。第2区域的碱基序列也可能影响后续进行的cDNA扩增的效率，因此优选在考虑Tm值、GC含量等的基础上决定碱基序列。
第1寡核苷酸分子本身可以利用本技术领域公知的寡核苷酸合成方法来制作。第1寡核苷酸分子只要能够通过逆转录反应而进行3'末端的延伸，则也可以包含桥联型核酸(Bridged Nucleic Acid：BNA)、硫代磷酸酯(PS)-寡聚物、肽核酸(Peptide Nucleic Acid：PNA)、吗啉代寡聚物、2’-O-取代RNA等现有公知的人工核酸。
第2寡核苷酸分子是与第1寡核苷酸分子的第2区域的全部或部分进行杂交的寡核苷酸分子。在本实施方式中，第2寡核苷酸分子优选与第1寡核苷酸分子的第1区域不杂交。本实施方式的合成方法不受理论或作用机制约束，但是推测第2寡核苷酸分子发挥了如下作用：通过杂交到第1寡核苷酸分子的第2区域，从而防止该第2区域上的无法预期的多核苷酸杂交及非特异性结合。
第2寡核苷酸分子的碱基长度可以与第1寡核苷酸分子的第2区域为相同长度，也可以比第2区域短。例如，第2寡核苷酸分子具有第1寡核苷酸分子的第2区域的碱基长度的35％以上且100％以下的碱基长度，优选具有35％以上且95％以下的碱基长度，更优选具有35％以上且90％以下的碱基长度。
第2寡核苷酸分子具有比第1寡核苷酸分子的第2区域短的碱基长度的情况下，可以使用多个第2寡核苷酸分子、优选为2个或3个第2寡核苷酸分子。各第2寡核苷酸分子杂交到第2区域中的彼此不同的部分。各第2寡核苷酸分子所杂交的第2区域中的部分可以相邻也可以分离。
第2寡核苷酸分子的碱基序列可以根据第1寡核苷酸分子的第2区域的碱基序列适当决定。第2寡核苷酸分子的碱基序列可以是与第1寡核苷酸分子的第2区域的全部或部分完全互补的碱基序列。或者，第2寡核苷酸分子的碱基序列可以包含在与第1寡核苷酸分子的第2区域杂交时产生错配部位的碱基(以下也称为“错配碱基”)。例如，第2寡核苷酸分子中的错配碱基的数量的比例(以下也称为“错配率”)为50％以下，优选为40％以下，更优选为12％以下。需要说明的是，错配率通过下述式子来计算。
(错配率)＝{(第2寡核苷酸分子中的错配碱基的数量)/(第2寡核苷酸分子的碱基长度)}×100
在第2寡核苷酸分子包含错配碱基的情况下，第2寡核苷酸分子的碱基长度优选具有第1寡核苷酸分子的第2区域的碱基长度的35％以上的碱基长度，更优选具有100％的碱基长度。
第2寡核苷酸分子在碱基序列中可以包含尿嘧啶。在使用包含尿嘧啶的第2寡核苷酸分子来进行本实施方式的合成方法的情况下，可以将杂交到所合成的cDNA上的第2寡核苷酸分子的部分或全部用尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG)分解、除去。
第2寡核苷酸分子本身可以通过本技术领域公知的寡核苷酸合成方法来制作。第2寡核苷酸分子可以包含BNA、PS-寡聚物、PNA、吗啉代寡聚物、2’-O-取代RNA等现有公知的人工核酸。
在本实施方式中，第2寡核苷酸分子的3’末端可以以不进行延伸的方式被修饰。作为这样的修饰，可列举例如磷酸化、生物素化等。另外，也可以在第2寡核苷酸分子的3’末端导入二脱氧核糖核苷酸、氨基接头等修饰基，而使得3’末端不进行延伸。
在本实施方式中，第2寡核苷酸分子可以被修饰，而使得与第2区域的结合稳定性提高。作为这种修饰，可列举例如向5’末端或3’末端导入帽结构。作为向5’末端导入的帽结构，可列举例如芘基、三甲氧基芪基等。作为向3’末端导入的帽结构，可列举例如2'-(蒽醌-2-基-羧酰胺)-2'-脱氧尿苷基(以下也称为“Uaq”)等。已知导入帽结构会提高Tm值，因此与互补链的结合会稳定。
逆转录酶没有特别限定，可以从公知的逆转录酶中适当选择。作为逆转录酶，可列举例如禽类成髓细胞瘤病毒(AMV)逆转录酶、莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶等。另外，可以使用市售的逆转录反应盒中所含的酶。
在本实施方式中，例如将靶RNA、第1寡核苷酸分子、第2寡核苷酸分子和逆转录酶在水(优选为无核酸酶的水)中混合，将得到的混合物(以下也称为“RT用组合物”)置于适合逆转录反应的温度条件下，由此合成cDNA。RT用组合物中可以进一步加入缓冲液(例如Tris-HCl等)、dNTP(dATP、dCTP、dGTP及dTTP的混合物)、无机盐(例如NaCl、KCl等)、RNase抑制剂等通常的逆转录反应所使用的试剂类。这样的试剂类也包含在市售的逆转录反应盒中。混合上述各成分的顺序没有特别限定。在本实施方式中，可以将第1寡核苷酸分子和第2寡核苷酸分子预先混合后使用。但是，无需使第1寡核苷酸分子与第2寡核苷酸分子预先杂交。这些寡核苷酸分子在适合逆转录反应的温度条件下会自发杂交。
第1寡核苷酸分子及第2寡核苷酸分子的添加量没有特别限定。RT用组合物中的第1寡核苷酸分子及第2寡核苷酸分子的终浓度可以分别在10nM以上且1000nM以下、优选为10nM以上且250nM以下的范围内适当决定。RT用组合物中的第2寡核苷酸分子的终浓度可以与第1寡核苷酸分子的终浓度相同，也可以不同。
本实施方式的合成方法的温度条件与通常的逆转录反应的条件没有特别变化。可根据所使用的逆转录酶的种类等从公知的逆转录反应的温度条件中适当选择。在本实施方式中，可以使用市售的热循环仪进行逆转录反应。
所合成的cDNA中，有时会杂交有第2寡核苷酸分子。在本实施方式的合成方法中，根据需要可以包含在合成cDNA后除去第2寡核苷酸分子的至少一部分的工序。例如，以90℃～99℃加热逆转录反应后的RT用组合物，则第2寡核苷酸分子通过热变性而从cDNA解离。在第2寡核苷酸分子包含尿嘧啶时，可以在合成cDNA后利用UNG将第2寡核苷酸分子的至少一部分分解。例如，向逆转录反应后的RT用组合物中添加UNG并在规定的温度(例如25℃)下孵育，由此将杂交到cDNA上的第2寡核苷酸分子的尿嘧啶除去。失去了尿嘧啶的部分结构上不稳定，因此以90℃～99℃加热RT用组合物时，第2寡核苷酸分子在失去尿嘧啶的部分处断裂。由此，将第2寡核苷酸分子的一部分或全部分解。
在本实施方式中，可以在同一反应体系中以碱基序列不同的2种以上靶RNA为模板来合成cDNA。此时，通过使用具有与各靶RNA的碱基序列相应的第1区域的多种第1寡核苷酸分子，可以进行多重逆转录反应。第2区域的碱基序列在多种第1寡核苷酸分子之间可以相同，也可以彼此不同。第2寡核苷酸分子可以根据第1寡核苷酸分子的第2区域的碱基序列适当设计。
本实施方式的合成方法可以进一步包含对cDNA进行扩增的工序。cDNA扩增本身可以通过PCR法、实时PCR法等本技术领域公知的DNA扩增法进行。cDNA扩增例如通过将cDNA、与该cDNA杂交的正向引物、与该cDNA的互补链杂交的反向引物和聚合酶混合来进行。第1寡核苷酸分子也能够与cDNA的互补链杂交，因此为了扩增cDNA，也可以使用第1寡核苷酸分子代替反向引物。
正向引物及反向引物可以基于cDNA的碱基序列、即靶RNA及第1寡核苷酸分子的第2区域的碱基序列适当设计。各引物的碱基长度通常为5以上且50以下，优选为10以上且40以下。需要说明的是，引物本身可以通过本技术领域公知的寡核苷酸合成方法来制作。
正向引物及反向引物的添加量没有特别限定。PCR用组合物中的正向引物及反向引物的终浓度可以分别从0.1μM以上且1.5μM以下、优选为0.35μM以上且1.5μM以下的范围内适当决定。PCR用组合物中的反向引物的终浓度与正向引物的终浓度可以相同，也可以不同。
正向引物及反向引物可以包含BNA、PS-寡聚物、PNA、吗啉代寡聚物、2’-O-取代RNA等现有公知的人工核酸。另外，正向引物及反向引物可以被公知的标记物标记。作为标记物，可列举放射性同位素(例如32P、35S、3H、14C等)、荧光色素(例如FITC、Texas Red(商标)、Alexa Fluor(商标)、6-FAM、TAMRA等)、生物素、洋地黄毒苷等。
聚合酶只要是适合于DNA扩增的聚合酶则没有特别限定。这样的聚合酶可以从公知的耐热性DNA聚合酶中适当选择，可列举例如Taq、Pfu、Tth、KOD等。另外，也可以使用市售的PCR试剂盒中所含的聚合酶。
在本实施方式中，将cDNA、正向引物、反向引物和/或第1寡核苷酸分子、和聚合酶在水中混合，将得到的混合物(以下也称为“PCR用组合物”)置于适合于DNA扩增的温度条件下，由此以cDNA为模板而得到双链DNA。PCR用组合物中可以进一步加入缓冲液(例如Tris-HCl等)、dNTP、无机盐(例如NaCl、KCl等)等通常的DNA扩增反应中所使用的试剂类。这样的试剂类也包含在市售的PCR试剂盒等中。混合上述各成分的顺序没有特别限定。在本实施方式中，可以将正向引物与反向引物和/或第1寡核苷酸分子预先混合后使用。
在通过实时PCR法扩增cDNA时，PCR用组合物中可以进一步加入发出荧光的嵌入剂(例如SYBR(注册商标)Green等)、5'末端修饰有荧光物质且3'末端修饰有淬灭物质的荧光标记探针(例如TaqMan(商标)探针等)。
cDNA的扩增中的温度条件与通常的PCR法或实时PCR法的条件没有特别变化。可以根据所使用的聚合酶的种类、引物的Tm值等从公知的DNA扩增反应的温度条件中适当选择。在本实施方式中，可以使用市售的热循环仪或实时PCR装置进行cDNA的扩增。
在本实施方式中，作为成为模板的cDNA，可以直接使用逆转录反应后的RT用组合物。该组合物中的cDNA有时与第2寡核苷酸分子杂交，但由于DNA扩增中的热变性工序，第2寡核苷酸分子会从cDNA解离。在第2寡核苷酸分子包含尿嘧啶的情况下，通过向逆转录反应后的RT用组合物中添加UNG并在规定的温度(例如25℃)下孵育，然后进行DNA扩增，由此可以将杂交到cDNA上的第2寡核苷酸分子的一部分或全部分解、除去。
在本实施方式中，可以在同一反应体系中进行cDNA的合成工序和cDNA的扩增工序。此时，例如将靶RNA、第1寡核苷酸分子、第2寡核苷酸分子、逆转录酶、正向引物、反向引物和聚合酶混合。将得到的混合物首先置于适合逆转录反应的温度条件下，进行cDNA的合成。然后将该混合物置于适合于DNA的扩增反应的温度条件下，进行cDNA的扩增。在逆转录反应和cDNA的扩增反应之间，不需要将混合物移换到另一容器中。由此，可以在同一反应体系中进行逆转录反应和cDNA的扩增反应。也可以使用具有逆转录活性和DNA聚合酶活性这两者的酶(例如Tth等)来代替逆转录酶及聚合酶。上述混合物中可以进一步添加缓冲液(例如Tris-HCl等)、dNTP、无机盐(例如NaCl、KCl等)、RNase抑制剂等通常的逆转录反应及DNA扩增反应中所使用的试剂类。
[2.靶RNA的检测方法]
本发明的范围中还包含检测靶RNA的方法(以下也称为“检测方法”)。在本实施方式的检测方法中，首先将靶RNA、第1寡核苷酸分子、第2寡核苷酸分子和逆转录酶混合并以该靶RNA为模板合成cDNA。关于cDNA合成(逆转录反应)中所使用的各成分及逆转录反应的条件等的详细情况，与对于上述本实施方式的合成方法的说明相同。
然后，实施方式的检测方法中，对合成出的cDNA进行扩增，并且检测该cDNA的扩增产物。关于cDNA的扩增中所使用的各成分及扩增反应的条件等的详细情况，与对于上述本实施方式的合成方法的说明相同。在本说明书中，“检测”包括：定性判定有无扩增产物；对扩增产物进行定量；及半定量地检测扩增产物的存在量。半定量的检测是指：将扩增产物的存在量以“-”、“+”、“++”(阴性、弱阳性、强阳性)等这类阶梯方式示出。例如，在得到检测到扩增产物这一结果的情况下，该结果表示存在靶RNA。
检测扩增产物的手段没有特别限定，可以从公知的方法中适当选择。例如，可以利用电泳检测扩增产物。具体而言，可以使扩增反应后的反应液在包含溴乙锭的琼脂糖凝胶中进行电泳，并确认有无扩增产物、有扩增产物的情况下扩增产物的量。另外，也可以通过从扩增反应后的反应液取得荧光强度、浊度、吸光度等光学信息来检测扩增产物。例如，可以通过使用SYBR(商标)Green等能够与双链DNA结合的荧光物质的嵌入剂法来测定荧光强度，由此检测扩增产物。
或者，也可以通过使用5'末端修饰有荧光物质且3'末端修饰有淬灭物质的荧光标记探针(例如TaqMan(商标)探针等)的方法检测由该探针产生的荧光，从而检测扩增产物。这种探针按照在检测对象的扩增产物中杂交到与上述正向引物和/或反向引物所杂交的区域不同的区域的方式来设计。PCR用组合物中的荧光标记探针的终浓度没有特别限定，例如可以从0.1μM以上且5μM以下、优选为0.2μM以上且0.8μM以下的范围内适当决定。
[3.试剂盒]
本发明的范围中还包含试剂盒。该试剂盒可以用于实施本实施方式的合成方法及本实施方式的检测方法。本实施方式的试剂盒包含与靶RNA杂交的第1寡核苷酸分子、和与该第1寡核苷酸分子杂交的第2寡核苷酸分子。第1寡核苷酸分子及第2寡核苷酸分子的详细情况与对于上述本实施方式的合成方法的说明相同。
可以将分别收容第1寡核苷酸分子及第2寡核苷酸分子的容器收容到箱中并提供给用户。该箱子可以将上述容器全部一起捆包，也可以收容一部分容器。该箱子中可以一起捆包记载有第1寡核苷酸分子及第2寡核苷酸分子的使用方法等的附加说明书。图2A示出本实施方式的试剂盒的一例。图中，10表示试剂盒，11表示收容有第1寡核苷酸分子的第1容器，12表示收容有第2寡核苷酸分子的第2容器，13表示包装箱，14表示附加说明书。
第1容器中的第1寡核苷酸分子的浓度只要为在用于制备RT用组合物时可以调节成上述终浓度的浓度即可。因此，该容器中的第1寡核苷酸分子的浓度可以由RT用组合物的总量与第1寡核苷酸分子的添加量的体积比适当决定。在本实施方式中，第1容器中的第1寡核苷酸分子的浓度例如为0.05μM以上且100μM以下，优选为0.25μM以上且10μM以下。
第2容器中的第2寡核苷酸分子的浓度也可以与第1寡核苷酸分子的浓度同样地决定。在本实施方式中，第2容器中的第2寡核苷酸分子的浓度例如为0.05μM以上且100μM以下，优选为0.25μM以上且10μM以下。第2容器中的第2寡核苷酸分子的浓度与第1容器中的第1寡核苷酸分子的浓度可以相同，也可以不同。
本实施方式的试剂盒可以进一步具备逆转录酶。另外，本实施方式的试剂盒可以进一步具备dNTP。逆转录酶本身在本技术领域是公知的，例如可以从AMV、MMLV等源自逆转录病毒的酶等中适当选择。dNTP只要为dATP、dCTP、dGTP及dTTP的混合物即可。图2B示出进一步包含逆转录酶及dNTP的试剂盒的一例。图中，20表示试剂盒，21表示收容有第1寡核苷酸分子的第1容器，22表示收容有第2寡核苷酸分子的第2容器，23表示收容有逆转录酶的第3容器，24表示收容有dNTP的第4容器，25表示包装箱，26表示附加说明书。虽然未图示，但本实施方式的试剂盒可以进一步具备适合逆转录反应的缓冲液。
本实施方式的试剂盒可以进一步具备：与通过第1寡核苷酸分子的延伸而合成的cDNA杂交的正向引物；与该cDNA的互补链杂交的反向引物。正向引物及反向引物的详细情况与对于上述本实施方式的合成方法的说明相同。图2C示出进一步具备正向引物及反向引物的试剂盒的一例。图中，30表示试剂盒，31表示收容有第1寡核苷酸分子的第1容器，32表示收容有第2寡核苷酸分子的第2容器，33表示收容有逆转录酶的第3容器，34表示收容有dNTP的第4容器，35表示收容有正向引物的第5容器，36表示收容有反向引物的第6容器，37表示包装箱，38表示附加说明书。虽然未图示，但本实施方式的试剂盒可以进一步具备适合逆转录反应的缓冲液。
第5容器中的正向引物的浓度只要是在用于制备PCR用组合物时可以调节成上述终浓度的浓度即可。因此，该容器中的正向引物的浓度可以根据PCR用组合物的总量与正向引物的添加量的体积比适当决定。在本实施方式中，第5容器中的正向引物的浓度例如为6μM以上且100μM以下，优选为15μM以上且100μM以下。
第6容器中的反向引物的浓度也可以与正向引物的浓度同样地决定。在本实施方式中，第6容器中的反向引物的浓度为例如3μM以上且100μM以下，优选为15μM以上且100μM以下。第6容器中的反向引物的浓度与第5容器中的正向引物的浓度可以相同，也可以不同。
本实施方式的试剂盒可以进一步具备聚合酶。另外，本实施方式的试剂盒可以进一步具备荧光标记探针。聚合酶及荧光标记探针的详细情况与对于上述本实施方式的合成方法及检测方法的说明相同。图2D示出进一步具备聚合酶及荧光标记探针的试剂盒的一例。图中，40表示试剂盒，41表示收容有第1寡核苷酸分子的第1容器，42表示收容有第2寡核苷酸分子的第2容器，43表示收容有逆转录酶的第3容器，44表示收容有dNTP的第4容器，45表示收容有正向引物的第5容器，46表示收容有反向引物的第6容器，47表示收容有聚合酶的第7容器，48表示收容有荧光标记探针的第8容器，49表示包装箱，50表示附加说明书。虽然未图示，但本实施方式的试剂盒可以进一步具备适合逆转录反应的缓冲液及适合DNA扩增反应的缓冲液。
第8容器中的荧光标记探针的浓度只要为在用于制备PCR用组合物时可以调节成上述终浓度的浓度即可。因此，该容器中的荧光标记探针的浓度可以根据PCR用组合物的总量与荧光标记探针的添加量的体积比适当决定。在本实施方式中，第8容器中的荧光标记探针的浓度为例如2μM以上且25μM以下，优选为2μM以上且10μM以下。
在本实施方式中，第1寡核苷酸、第2寡核苷酸、正向引物及反向引物中的至少2种可以收容在同一容器中。优选将第1寡核苷酸和第2寡核苷酸收容到同一容器中。或者，将正向引物和反向引物收容到同一容器中。更优选将第1寡核苷酸和第2寡核苷酸收容到同一容器中、且将正向引物和反向引物收容到另外的同一容器中。
以下通过实施例更详细地说明本发明，但本发明不受这些实施例限定。
实施例
实施例1
在实施例1中，通过专利文献1的方法、专利文献2的方法及本实施方式的合成方法由靶RNA(miRNA)合成cDNA，利用实时PCR扩增及检测该cDNA。然后对扩增产物的检测下限及定量下限进行比较。
实施例1中，一式三份地(トリプリケート)进行实验。
(1)cDNA的合成
(1.1)靶RNA及逆转录用引物
作为靶RNA，使用序列号1所示的碱基序列的寡核苷酸。该碱基序列为miR302a的碱基序列。作为逆转录用引物(以下称为“RT引物”)，使用序列号2所示的碱基序列的寡核苷酸。该寡核苷酸为专利文献1的方法中使用的RT引物，并且也是本实施方式的合成方法中使用的第1寡核苷酸分子。在序列号2所示的碱基序列中，5'侧起第1位至第24位的碱基序列为与靶RNA不杂交的区域(第2区域)，第25位至第34位的碱基序列为与靶RNA杂交的区域(第1区域)。作为专利文献2的方法中使用的茎·环型RT引物，使用了序列号3所示的碱基序列的寡核苷酸。作为本实施方式的合成方法中使用的第2寡核苷酸分子，使用序列号4所示的碱基序列的寡核苷酸。该碱基序列与序列号2所示的碱基序列的5'侧起第1位至第24位的碱基序列完全互补。将各寡核苷酸的碱基序列示于以下。需要说明的是，下划线部表示靶RNA与各RT引物进行杂交的区域。
·靶RNA(miR302a)：5'-UAAGUGCUUCCAUGUUUUGGUGA-3'(序列号1)
·RT引物：5'-CGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCACCAAAAC-3'(序列号2)
·茎·环型RT引物：5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCAC CAAAAC-3'(序列号3)
·第2寡核苷酸分子：5'-GTCGTATCCAGTGCGAATACCTCG-3'(序列号4)
(1.2)逆转录反应
使用上述寡核苷酸及TaqMan(商标)小分子RNA逆转录反应试剂盒(AppliedBiosystems公司、产品编号4366597)制备下述组成的混合物。该试剂盒中包含100mM dNTP、10×buffer、RNase抑制剂及逆转录酶。在本实施方式的合成方法中，将序列号2的RT引物及第2寡核苷酸分子预先混合而制备250nM的RT引物。用无核酸酶的水调整靶RNA的浓度，得到每1μL包含500、103、104、105、106或107拷贝的miRNA的溶液。在本实施方式的合成方法及专利文献1的方法中，作为靶RNA，使用每1μL包含103、105及107拷贝的miRNA的溶液。在专利文献2的方法中，作为靶RNA，使用每1μL包含500、103、104、105及106拷贝的miRNA的溶液。另外，使用酵母tRNA来代替靶RNA，除此以外同样地制备混合物，由此得到阴性对照。
＜每孔的组成＞
将制备的混合物设置于GeneAmp PCRSystem 9700(Applied Biosystems公司)，在16℃下30分钟、42℃下30分钟、85℃下5分钟的温度条件下进行逆转录反应。
(2)利用实时PCR扩增及检测cDNA
(2.1)PCR用引物组及探针
作为正向引物、反向引物及探针，分别使用序列号5、6及7所示的碱基序列的寡核苷酸。将各寡核苷酸的碱基序列示于以下。将正向引物和反向引物混合，由此制备引物混合物。引物混合物中的正向引物的浓度为30μM，反向引物的浓度为15μM。探针是5'末端修饰有荧光物质且3'末端修饰有淬灭物质的TaqMan(商标)探针。
·正向引物：5'-TAAGTGCTTCCATGTTT-3'(序列号5)
·反向引物：5'-CGAGGTATTCGCA-3'(序列号6)
·TaqMan(商标)探针：5'-ATACGACTCACCA-3'(序列号7)
(2.2)实时PCR
使用上述逆转录产物、引物混合物及探针、以及TaqMan(商标)Universal MasterMix II,with UNG(Applied Biosystems公司、制品编号4440038)来制备下述组成的混合物。
＜每孔的组成＞
将制备的混合物设置到7500Fast Real-Time PCR System(Applied Biosystems公司)中，在下述的温度条件下进行PCR。需要说明的是，加热及冷却以1.6℃/秒的速度进行。
＜温度条件＞
95℃下10分钟、
95℃下15秒、55℃下60秒进行40个循环。
(3)分析及结果
将通过专利文献1的方法、专利文献2的方法及本实施方式的合成方法得到的扩增曲线分别示于图3～5。在这些曲线中，横轴表示循环数，纵轴表示荧光强度的变化(ΔRn)。图中，“10^3”、“10^5”、“10^6”及“10^7”分别表示来自包含103、105、106及107拷贝的靶RNA的被检体的cDNA扩增产物。“NC”表示阴性对照。在通过专利文献1及专利文献2的方法得到的扩增曲线中，将ΔRn的阈值设为0.1，在通过本实施方式的合成方法得到的扩增曲线中，将ΔRn的阈值设为0.03，由与各扩增曲线的切点取得Ct(Threshold Cycle)值。将上述(1.2)的混合物中的靶RNA的拷贝数设为初始模板量，由Ct值及初始模板量的对数制作标准曲线(未图示)。
基于标准曲线求出各方法的检测下限及定量下限。将结果示于表1。需要说明的是，定量下限(1)由标准曲线的相关系数(R2)的值大于0.98的范围来决定。定量下限(2)由标准曲线的斜率达到-3.91以上且-2.92以下的范围(扩增效率±20％以内)来决定。检测下限为相对于阴性对照(酵母tRNA)的Ct值进行T检验(双边检验)时、p值小于0.01小的值。需要说明的是，T检验使用Excel(商标)的函数T.TEST进行。
【表1】
定量下限(1) 定量下限(2) 检测下限
专利文献1 10<sup>5</sup> 10<sup>5</sup> 10<sup>5</sup>
专利文献2 10<sup>3</sup> 10<sup>5</sup> 10<sup>3</sup>
本实施方式 10<sup>3</sup> 10<sup>3</sup> 10<sup>3</sup>
如表1所示，可知：本实施方式的合成方法与作为现有技术的专利文献1及2的方法相比，扩增产物的检测及定量的性能高。另外，根据图4，专利文献2的方法中阴性对照也发生了扩增，确认到非特异性扩增。与此相对地，由图5可知，本实施方式的合成方法中几乎看不到非特异性扩增。因此表明，本实施方式的合成方法与现有技术相比，由小分子RNA来合成及扩增cDNA的灵敏度及特异性高。
实施例2
在实施例2中，利用使用了碱基长度不同的第2寡核苷酸分子的本实施方式的合成方法由靶RNA合成cDNA、通过实时PCR对该cDNA进行了扩增及检测。然后对扩增产物的检测下限及定量下限进行比较。
实施例2中，一式三份地进行实验。
(1)靶RNA及逆转录用引物
作为靶RNA及RT引物，分别使用序列号1及2所示的碱基序列的寡核苷酸。作为第2寡核苷酸分子，使用以下所示的碱基序列的寡核苷酸。以下也将这些第2寡核苷酸分子分别称为“Lid”、“Lid-S1”、“Lid-S2”及“Lid-S3”。将各第2寡核苷酸分子的碱基序列示于以下。另外，将各第2寡核苷酸分子的碱基长度相对于RT引物的第2区域的碱基长度(24碱基)的比率示于表2。
·Lid：5′-GTCGTATCCAGTGCGAATACCTCG-3′(序列号4)
·Lid-S1：5′-GTCGTATCCAGTGCGAATACC-3′(序列号8)
·Lid-S2：5′-GTCGTATCCAGTGCGAAT-3′(序列号9)
·Lid-S3：5′-GTCGTATCC-3′
【表2】
(2)cDNA的合成、扩增及检测
使用上述第2寡核苷酸分子，除此以外与实施例1同样地进行逆转录反应而合成cDNA。另外，与实施例1同样地通过实时PCR对所得到的cDNA进行扩增及检测，得到扩增曲线(未图示)。
(3)分析及结果
将ΔRn的阈值设为0.05，由各扩增曲线制作标准曲线。基于得到的标准曲线，与实施例1同样地求出检测下限及定量下限。将结果示于表3。
【表3】
定量下限(1) 定量下限(2) 检测下限
Lid 10<sup>3</sup> 10<sup>3</sup> 10<sup>3</sup>
Lid-S1 10<sup>3</sup> 10<sup>3</sup> 10<sup>3</sup>
Lid-S2 10<sup>3</sup> 10<sup>3</sup> 10<sup>3</sup>
Lid-S3 10<sup>3</sup> 10<sup>3</sup> 10<sup>3</sup>
如表3所示，可知即使使用任一碱基长度的第2寡核苷酸分子，扩增产物的检测及定量的性能也高。另外，根据扩增曲线，即使使用任一碱基长度的第2寡核苷酸分子，也几乎看不到非特异性扩增。
实施例3
在实施例3中，通过使用在与RT引物的第2区域杂交时会产生错配部位的第2寡核苷酸分子的本实施方式的合成方法，由靶RNA合成cDNA，利用实时PCR扩增及检测该cDNA。然后对扩增产物的检测下限及定量下限进行比较。实施例3中，一式三份地进行实验。
(1)靶RNA及逆转录用引物
作为靶RNA及RT引物，分别使用序列号1及2所示的碱基序列的寡核苷酸。作为第2寡核苷酸分子，使用序列号4及10～13所示的碱基序列的寡核苷酸。也将序列号10～13所示的碱基序列的寡核苷酸分别称为“Lid-M1”、“Lid-M2”、“Lid-M3”及“Lid-M4”。将各第2寡核苷酸分子的碱基序列示于以下。下划线部表示第2寡核苷酸分子中的错配碱基。另外，将第2寡核苷酸分子的错配率示于表4。
·Lid：5′-GTCGTATCCAGTGCGAATACCTCG-3′(序列号4)
·Lid-M1：5′-GTCGTATCCATTGCTAATACCTCG-3′(序列号10)
·Lid-M2：5′-GTCGTATCCATTACTAATACCTCG-3′(序列号11)
·Lid-M3：5′-GTTGTGTTCGGTGTGGATGCTTTG-3′(序列号12)
·Lid-M4：5′-GTTGTGTTTGGTGTGGGTGTTTTG-3′(序列号13)
【表4】
错配碱基的数量 错配率(％)
Lid 0 0
Lid-M1 2 8.3
Lid-M2 3 12.5
Lid-M3 9 37.5
Lid-M4 12 50.0
(2)cDNA的合成、扩增及检测
使用上述第2寡核苷酸分子，除此以外与实施例1同样地进行逆转录反应而合成cDNA。另外，与实施例1同样地通过实时PCR对所得到的cDNA进行扩增及检测。将得到的扩增曲线示于图6A～图6E。
(3)分析及结果
将ΔRn的阈值设为0.05，由各扩增曲线制作标准曲线。基于得到的标准曲线与实施例1同样地求出检测下限及定量下限。将结果示于表5。
【表5】
定量下限(1) 定量下限(2) 检测下限
Lid 10<sup>3</sup> 10<sup>3</sup> 10<sup>3</sup>
Lid-M1 10<sup>3</sup> 10<sup>3</sup> 10<sup>3</sup>
Lid-M2 10<sup>3</sup> 10<sup>3</sup> 10<sup>3</sup>
Lid-M3 10<sup>3</sup> 10<sup>3</sup> 10<sup>3</sup>
Lid-M4 10<sup>3</sup> 10<sup>3</sup> 10<sup>3</sup>
如表5所示，可知即使使用具有错配碱基的第2寡核苷酸分子，扩增产物的检测及定量的性能也高。另外，根据图6A～图6E，即使RT引物的第2区域与第2寡核苷酸分子之间存在50％程度的错配，也几乎未见非特异性扩增。
实施例4
在实施例4中，通过使用在3′末端附加有CAP结构的第2寡核苷酸分子的本实施方式的合成方法，由靶RNA合成cDNA，利用实时PCR扩增及检测该cDNA。然后对扩增产物的检测下限及定量下限进行比较。实施例4中，一式三份地进行实验。
(1)靶RNA及逆转录用引物
作为靶RNA，使用序列号1所示的碱基序列的寡核苷酸。作为RT引物，使用序列号2及14所示的碱基序列的寡核苷酸。以下也将这些RT引物分别称为“RT-primer 1”及“RT-primer 2”。作为第2寡核苷酸分子，使用序列号4及15所示的碱基序列的寡核苷酸。在实施例4中，在这些寡核苷酸的3′末端附加有Uaq作为帽结构。通过附加3′-Uaq CAP而提高Tm值，可期待与互补链的结合稳定性提高。以下，也将附加有3'-Uaq CAP的第2寡核苷酸分子分别称为“Lid-Cap1”及“Lid-Cap2”。将3'-Uaq CAP的化学结构示于以下。另外，将RT引物及第2寡核苷酸分子的碱基序列示于以下。
【化1】
·RT引物1：5’-CGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCACCAAAAC-3’(序列号2)
·RT引物2：5’-GTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCACCAAAAC-3’(序列号14)
·Lid：5'-GTCGTATCCAGTGCGAATACCTCG-3'(序列号4)
·Lid-Cap 1：5'-GTCGTATCCAGTGCGAATACCTCG-Uaq-3'(序列号4)
·Lid-Cap 2：5'-GTCGTATCCAGTGCGAATACCTCGGAC-Uaq-3'(序列号15)
(2)cDNA的合成、扩增及检测
使用上述RT引物及第2寡核苷酸分子，除此以外与实施例1同样地进行逆转录反应而合成cDNA。作为针对RT引物1的第2寡核苷酸分子，使用Lid或Lid-Cap 1，作为针对RT引物2的第2寡核苷酸分子，使用Lid-Cap 2。另外，与实施例1同样地通过实时PCR对所得到的cDNA进行扩增及检测。需要说明的是，在使用RT引物2而合成的cDNA的扩增中，使用下述的序列号16所示的碱基序列的反向引物来代替序列号6所示的碱基序列的反向引物。将使用Lid-Cap 1及Lid-Cap2的情况下的扩增曲线分别示于图7A及图7B。
·反向引物：5′-CCGAGGTATTCGCACTG-3′(序列号16)
(3)分析及结果
将ΔRn的阈值设为0.1，由各扩增曲线制作标准曲线。基于得到的标准曲线，与实施例1同样地求出检测下限及定量下限。将结果示于表6。
【表6】
定量下限(1) 定量下限(2) 检测下限
Lid 10<sup>3</sup> 10<sup>3</sup> 10<sup>3</sup>
Lid-Cap 1 10<sup>3</sup> 10<sup>3</sup> 10<sup>3</sup>
Lid-Cap 2 10<sup>3</sup> 10<sup>3</sup> 10<sup>3</sup>
如表6所示，可知：在使用在3′末端附加有CAP结构的第2寡核苷酸分子的情况下，也与使用未修饰的第2寡核苷酸分子时同样，扩增产物的检测及定量的性能高。另外，图7A及图7B表明，使用在3′末端附加有CAP结构的第2寡核苷酸分子的情况下，非特异性扩增得到抑制。由此表明，对第2寡核苷酸分子的3′末端附加CAP结构具有抑制非特异性扩增的效果。
符号说明
10、20、30、40：试剂盒
11、21、31、41：第1容器
12、22、32、42：第2容器
23、33、43：第3容器
24、34、44：第4容器
35、45：第5容器
36、46：第6容器
47：第7容器
48：第8容器
13、25、37、49：包装箱
14、26、38、50：附加说明书
序列表
<110> 希森美康株式会社
<120> cDNA的合成方法、靶RNA的检测方法及试剂盒
<130> 18-003CN
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人
<400> 1
uaagugcuuc cauguuuugg uga 23
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 2
cgaggtattc gcactggata cgactcacca aaac 34
<210> 3
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 3
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgactcacca aaac 54
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 第2寡核苷酸分子
<400> 4
gtcgtatcca gtgcgaatac ctcg 24
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 5
taagtgcttc catgttt 17
<210> 6
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 6
cgaggtattc gca 13
<210> 7
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针
<400> 7
atacgactca cca 13
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 第2寡核苷酸分子
<400> 8
gtcgtatcca gtgcgaatac c 21
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 第2寡核苷酸分子
<400> 9
gtcgtatcca gtgcgaat 18
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 第2寡核苷酸分子
<400> 10
gtcgtatcca ttgctaatac ctcg 24
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 第2寡核苷酸分子
<400> 11
gtcgtatcca ttactaatac ctcg 24
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 第2寡核苷酸分子
<400> 12
gttgtgttcg gtgtggatgc tttg 24
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 第2寡核苷酸分子
<400> 13
gttgtgtttg gtgtgggtgt tttg 24
<210> 14
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 14
gtccgaggta ttcgcactgg atacgactca ccaaaac 37
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 第2寡核苷酸分子
<400> 15
gtcgtatcca gtgcgaatac ctcggac 27
<210> 16
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 16
ccgaggtatt cgcactg 17

Claims (25)

1.一种cDNA的合成方法，其为将靶RNA、第1寡核苷酸分子、第2寡核苷酸分子和逆转录酶混合并以所述靶RNA为模板合成cDNA的方法，其中，
所述第1寡核苷酸分子在3’末端具有与所述靶RNA杂交的第1区域、在所述第1区域的5’侧具有与所述第2寡核苷酸分子杂交的第2区域。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第1寡核苷酸分子介由所述第1区域与所述靶RNA杂交、且介由所述第2区域与所述第2寡核苷酸分子杂交，
所述逆转录酶将与所述靶RNA及所述第2寡核苷酸分子杂交后的所述第1寡核苷酸分子的3’末端延伸而合成cDNA。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述靶RNA为小分子RNA。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述小分子RNA为选自miRNA、snRNA、snoRNA、piRNA、pri-miRNA、pre-miRNA、siRNA及shRNA中的任一种。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第1寡核苷酸分子的第1区域的碱基长度为3以上且15以下。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第1寡核苷酸分子的第2区域的碱基长度为10以上且40以下。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第2寡核苷酸分子的碱基长度为所述第1寡核苷酸分子的第2区域的碱基长度的35％以上且100％以下。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第2寡核苷酸分子中的、与所述第1寡核苷酸分子的第2区域杂交时产生错配部位的碱基数量的比例为50％以内。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第2寡核苷酸分子的3’末端被修饰，使得不进行延伸。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，还包含对所述cDNA进行扩增的工序。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述cDNA的扩增工序包含：将所述cDNA、与所述cDNA杂交的正向引物、与所述cDNA的互补链杂交的反向引物和/或第1寡核苷酸分子、和聚合酶混合。
12.根据权利要求10所述的方法，其中，所述cDNA的扩增工序通过实时PCR进行。
13.根据权利要求1所述的方法，其中，还包含下述工序：在合成所述cDNA后，将所述第2寡核苷酸分子的至少一部分除去。
14.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第2寡核苷酸分子包含尿嘧啶。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，还包含下述工序：在合成所述cDNA后，利用尿嘧啶N糖基化酶将所述第2寡核苷酸分子的至少一部分分解。
16.根据权利要求1～15中任一项所述的方法，其中，在同一反应体系中进行所述cDNA合成工序和所述扩增工序。
17.一种靶RNA的检测方法，其包含：
将靶RNA、第1寡核苷酸分子、第2寡核苷酸分子和逆转录酶混合并以所述靶RNA为模板合成cDNA的工序；和
对所述cDNA进行扩增并检测扩增产物的工序；其中，
所述第1寡核苷酸分子在3’末端具有与所述靶RNA杂交的第1区域、在所述第1区域的5’侧具有与所述第2寡核苷酸分子杂交的第2区域。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，在所述检测工序中，所述扩增及检测利用实时PCR来实行，对所述靶RNA进行定量。
19.一种试剂盒，其包含与靶RNA杂交的第1寡核苷酸分子、和与所述第1寡核苷酸分子杂交的第2寡核苷酸分子，
所述第1寡核苷酸分子在3’末端具有与所述靶RNA杂交的第1区域、在所述第1区域的5’侧具有与所述第2寡核苷酸分子杂交的第2区域。
20.根据权利要求19所述的试剂盒，其还包含逆转录酶。
21.根据权利要求19所述的试剂盒，其还包含dNTP。
22.根据权利要求19所述的试剂盒，其还包含：与通过第1寡核苷酸分子的延伸而合成的cDNA杂交的正向引物；与所述cDNA的互补链杂交的反向引物。
23.根据权利要求19所述的试剂盒，其还包含聚合酶。
24.根据权利要求19所述的试剂盒，其还包含荧光标记探针。
25.一种寡核苷酸分子，其为与靶RNA杂交的寡核苷酸分子，
所述寡核苷酸分子在3'末端具有第1区域、在所述第1区域的5'侧具有第2区域，
所述第1区域与所述靶RNA杂交，
所述第2区域与不同于所述寡核苷酸分子及所述靶RNA的寡核苷酸分子杂交。
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