CN102171369A - 存活蛋白mRNA的测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种存活蛋白基因的mRNA的扩增、检测方法，该方法包括：在RNA扩增工序中，用寡核苷酸探针经时性地测定扩增的RNA产物量；所述寡核苷酸探针设计成若形成与扩增的RNA互补的双链则信号特性发生变化；所述RNA扩增工序包括以下工序：使用由具有与存活蛋白mRNA中的一部分相同的序列的第一引物、具有互补序列的第二引物(第一引物或第二引物的任意一方在其5′末端附加有启动子序列)构成的寡核苷酸的组合，利用逆转录酶，生成含有启动子序列的双链DNA，以该双链DNA为模板，并利用RNA聚合酶生成RNA转录产物，该RNA转录产物继而成为利用所述逆转录酶的DNA合成的模板而生成所述双链DNA。

Description

存活蛋白mRNA的测定方法
技术领域
本发明涉及使用了核酸扩增方法的简便、迅速的存活蛋白mRNA的测定方法。更准确地说，本发明提供适合一定温度(40～50℃，优选43℃)下的存活蛋白mRNA的扩增、检测的寡核苷酸。本发明可用于分子生物学、生化学、医学领域等中的研究、诊疗。
背景技术
凋亡是细胞能动地导致自己死亡的现象，也称为程序性细胞死亡。已知人类这样的多细胞生物其体细胞由于病毒导致的感染、癌化等，而不断地产生不利于生命维持的细胞。除去这种细胞的系统是凋亡。除此之外，在发生的过程中，凋亡起到生命中不可缺少的作用。从昆虫到人类，凋亡以共通的机制发挥作用，其中已知胱天蛋白酶(caspase)是关键酶。抑制胱天蛋白酶、并抑制凋亡的物质是凋亡抑制因子(IAP)蛋白质。
典型的IAP蛋白质具有所谓的作为与蛋白质的结合结构域的BIR结构域、和作为一种锌指结构域的环指域的结构。近年，作为存活蛋白(survivin)已知的蛋白质被鉴定为凋亡抑制因子(IAP)基因家族的一员。存活蛋白代替单一的BIR结构域和环指具有卷曲螺旋区域，与已知的IAP家族成员相比结构特异。
作为存活蛋白的临床学上的重要性之一，报告了与其它的作为凋亡调节因子的Bcl-2、其它的IAP家族成员不同，在正常人体组织中几乎检测不到其表达，而在一般的人体的癌组织(肺、胰脏、大肠、膀胱、胸部、前列腺、胃、肝脏等)、非霍奇金淋巴瘤、白血病中显著地表达增加。这表示存活蛋白可以成为非常优异的标记基因。因此，认为存活蛋白mRNA的测定能够广泛地应用于癌症治疗等中的凋亡控制的监测、癌症的早期诊断、癌症的转移诊断、癌症的治疗效果监测等。
一般性的癌症的诊断是从病理学方面进行，但为此要求病理医生的高技术，并且根据使用的检测体而存在漏诊癌细胞的情况。近年，为了减少这样的漏诊、另外使各医院能够进行统一的诊断，提出利用核酸扩增方法的基因检查，甚或一部分被实用化。已知利用核酸扩增方法的基因检查的灵敏度高，在进行核酸扩增的基础上，与该检查的特异性高度相关的是所使用的癌标记基因的种类。如上所述，存活蛋白在广泛的癌症、淋巴瘤、白血病中能看到其高表达，另一方面，在正常细胞中几乎看不到其表达。因此，存活蛋白具有作为核酸扩增方法中的优异的癌标记的特征。即，通过调查各种组织中的存活蛋白mRNA表达的有无，能够发现癌、淋巴瘤、白血病等恶性疾病。
已知癌可以从原发部位向其它部位发生转移。即使是现在，转移也是癌症患者主要的死亡原因，与原发部位的诊断同样，转移诊断也非常重要。癌细胞从原发病灶部位放出到各种体液、血液、尿、淋巴液中。特别是如果放出到血液、淋巴液中，则随着其流动而游遍全身，引起向多个部位转移。由于这样从原发部位放出的癌细胞一般为少数，因此检测上述癌细胞需要高灵敏度的检测方法。使用了核酸扩增方法的检测方法由于一般能够进行高灵敏度的检测，因而适合上述癌细胞的检测。即，可以说使用了核酸扩增方法的存活蛋白mRNA的检测是在广范围的癌症的转移诊断中特别有用的检查方法。
作为一个例子，在胃癌、大肠癌之类的消化道癌症中，为了诊断腹膜转移，用生理盐水清洗腹腔，检查该清洗液中有无癌细胞。如果胃癌等有发展，则癌细胞剥离到腹膜中，在清洗水中确认有癌细胞则为清洗细胞诊断阳性，表示不可能通过手术完全除去癌细胞。该检查通常用显微镜从病理学上进行，但是不看漏癌细胞而将全部的细胞以目视来进行确认存在困难。另外，已知很多根据病理检查的细胞诊断即使是阴性也成为腹膜转移的病例，认为这是看漏了极少数的转移细胞的结果。因此，希望出现高灵敏度地检测清洗水中的癌细胞的方法。认为使用了核酸扩增方法的存活蛋白mRNA的检测在胃癌、大肠癌等全部消化道癌症中能够高灵敏度地进行腹膜转移诊断。
作为其它的例子，已知在膀胱癌中癌细胞剥离到尿中。怀疑是膀胱癌的情况下，一般进行利用细胞诊断和膀胱镜的检查，但是前者存在如上所述的漏诊的问题，后者由于是侵入性的检查，所以存在患者负担大的问题。因此，将尿中的细胞作为检测体的存活蛋白mRNA的测定可以说是弥补细胞诊断和膀胱镜的缺点的检查方法。另外，如果着眼于低侵入性方面，将血液作为检测体的检查也适用，但是使用了核酸扩增方法的存活蛋白mRNA的检测即便是血液检测体也可以在广泛的癌症中以高灵敏度检测癌细胞。
另外作为其它的例子，癌细胞可能剥离到肺癌中的胸水中、肝癌中的腹水中。癌细胞剥离到这样的体液中时，一般成为获知癌症进程的基准。通过使用了核酸扩增方法的存活蛋白mRNA的检测，能够高灵敏度地检测这样的胸水、腹水中有无癌细胞。
进一步作为其它例子，存活蛋白mRNA的测定还可以适用于术中的淋巴结转移诊断。现在，广泛认识了乳癌中的前哨淋巴结的转移诊断的重要性，并且正在研究在以胃癌为代表的消化道癌症中的适用。像这样，认为存活蛋白是从表达特性方面考虑非常有效的癌标记基因，因此其适用范围以及有用性高。
一般，利用核酸扩增方法检测癌标记基因mRNA时，使用RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)法作为核酸扩增方法，并报告了对存活蛋白mRNA也适用(参照Mertines，A.et al.，American journal of Pathology，164，501-510(2004)(非专利文献1)；Zhen-ning，W.et al.，Chinese Medical Journal，117，1210-1217(2004)(非专利文献2)以及Weikert，S.et al.，International Journal of Cancer，116，100-104(2005)(非专利文献3))。该扩增方法从肿瘤组织提取RNA后，需要以下两步工序(根据情况需要进一步实施其它的检测工序)：
(a)利用逆转录酶由提取的RNA合成cDNA的工序，以及
(b)用PCR法扩增该cDNA并检测的工序。
因此，暗示了操作的繁杂性、二次污染的危险性。另外，为了实施上述两步的工序通常需要2小时以上，并存在实施多个工序导致的再现性不良、多个检测体处理、降低检查成本方面的问题。进而，由于还担心利用PCR法的扩增由于扩增双链DNA而扩增混入的染色体DNA的可能性，因此为了严密地解析mRNA表达，需要进行利用DNase等的消化来完全除去染色体DNA。因此，导致操作的更进一步的繁杂化、再现性不良。而且，PCR法需要急剧升降反应温度，成为了自动化时的反应装置的省力化、低成本化的障碍。
另一方面，作为以一定温度仅扩增RNA的方法，报告了NASBA法(参照日本专利第2650159号公报(专利文献1)和日本专利第3152927号公报(专利文献2))、以及TMA法(参照日本专利第3241717号公报(专利文献3))等。上述RNA扩增方法是进行如下连锁反应的方法：利用对作为靶的RNA含有启动子序列的引物、逆转录酶以及根据需要的核糖核酸酶H(RNaseH)合成含有启动子序列的双链DNA，以该双链DNA为模板并利用RNA聚合酶来生成含有来自靶RNA的特定碱基序列的RNA，该RNA继而成为含有启动子序列的双链DNA合成的模板。并且，RNA扩增后，利用电泳或使用结合有可检测标记的核酸探针的杂交法等检测扩增的RNA。
上述RNA扩增方法由于以一定温度、以一步操作仅扩增RNA，所以适合简便的RNA测定，但是利用杂交法等的检测需要繁杂的操作，因此存在不仅不适合多个检测体处理、自动化，而且作为结果容易导致再现性不良、扩增核酸的二次污染的问题。另外，到出结果为止，通常NASBA法、TMA法均需要90分钟以上，不能迅速得到结果。而且，虽然扩增工序以一定温度进行，但是通常在扩增工序前需要预加热(例如65℃)，成为了反应装置的省力化、低成本化的课题。
作为简便地扩增、测定RNA的方法，可以举出Ishiguro等方法(参照日本特开2000-14400号公报(专利文献4)以及Ishiguro，T.et al.，Analytical Biochemistry，314，1247-1252(2003)(非专利文献4))。上述方法是在寡核苷酸探针存在下实施RNA扩增方法，并测定荧光特性的变化，能够以一定温度、以一步操作且在密闭容器内同时且迅速、简便地实施RNA扩增及测定，所述寡核苷酸探针设计成由插入性荧光色素标记，并且若形成与靶核酸互补的双链，则插入性荧光色素部分插入上述双链部分而使荧光特性发生变化。作为更具体的一个方式，是包括以下步骤的方法：对于存在于任意的RNA、且能够从其它RNA中区别出该RNA的特定碱基序列，
(1)使用与该特定碱基序列的3’末端侧互补的DNA引物和RNA依赖性DNA聚合酶(逆转录酶)，将RNA作为模板，生成与特定碱基序列互补的DNA，
(2)对于通过(1)的逆转录反应而产生的RNA-DNA双链，使其与具有核糖核酸酶H活性的酶作用，分解RNA，生成单链DNA，
(3)使用与(2)中生成的单链DNA的3’末端互补，并且其自身在其5’末端具有RNA聚合酶的启动子序列的DNA引物、和DNA依赖性DNA聚合酶，合成含有上述启动子序列的双链DNA，
(4)使(3)中生成的双链DNA与RNA聚合酶作用生成转录产物(特定碱基序列的RNA)的方法。
并且，由于(4)中生成的RNA转录产物是来自特定碱基序列的RNA，因此成为上述(1)的反应中的模板，与上述(1)的反应中使用的DNA引物结合，进行(1)～(4)的反应，从而引发RNA扩增的连锁反应。
该核酸扩增方法的特征在于，不需要像PCR法那样升降反应液的温度，另外不需要分成RNA的逆转录、和其后的DNA扩增反应而实施。进而，使对扩增的RNA转录产物能够进行特异性结合的、由插入性荧光色素标记的寡核苷酸探针在反应液中共存，从而扩增特定碱基序列或与该序列互补的序列的同时，能够检测(监测)该扩增的状态。因此，由于不需要像通常的RNA扩增方法那样进行另外的杂交检测等，所以能够大幅度地缩短获得结果的时间。
但是，对于适合该核酸扩增方法的存活蛋白mRNA扩增用引物序列及其组合，检测用的寡核苷酸探针序列还是未知。这是因为相比于需要在反应开始时暂设为比反应温度更高的温度、使成为靶的RNA的高级结构变性的工序的PCR法、NASBA法、TMA法等核酸扩增方法，该核酸扩增方法在一定的比较低的温度(40～50℃，优选为43℃)条件下进行mRNA的扩增、检测。即，已知一般mRNA之类的单链RNA容易形成高级结构，认为在该核酸扩增方法这样的反应条件下，成为靶的mRNA形成高级结构，从而抑制引物和探针的结合，因此，最适合的引物和探针需要设计在高级结构自由区域。作为RNA高级结构的指标，可以由碱基序列利用2级结构解析软件计算、推定2级结构，但是从计算上的2级结构推定实际的高级结构是极其困难的。
另外，像该核酸扩增方法这样在比较低的温度实施核酸扩增时，与在高温实施的PCR法相比较，容易生成被称为引物二聚体的非特异性产物，为了减少非特异性产物的生成，需要严密地选定引物的组合。但是一般使用的引物的设计方法由于以包括在高温下进行变性的工序(PCR法)为前提，以已知的引物设计技术难以设计适合该核酸扩增方法的引物。因此，为了实现利用上述一定温度RNA扩增·测定方法的迅速、简便、且高灵敏度的存活蛋白mRNA的测定，需要即便是在一定的比较低的温度(40～50℃，优选为43℃)条件下结合效率也不降低、且能够进行存活蛋白mRNA的扩增、检测的寡核苷酸及其组合。
发明内容
本发明的目的是提供对由人体细胞、组织等得到的试样，以一定温度、一步操作迅速测定存活蛋白mRNA的方法。
本发明的发明人为了解决上述课题而进行深入研究的结果，构筑了特异性地且迅速地测定存活蛋白mRNA的方法。
第一发明是一种试样中的存活蛋白mRNA的测定方法，其特征在于，
上述测定方法使用了第一引物和第二引物，所述第一引物具有与存活蛋白mRNA中的特定碱基序列的一部分相同的序列，所述第二引物具有与特定碱基序列的一部分互补的序列，其中，第一引物或第二引物中的任意一方是其5’末端添加有RNA聚合酶的启动子序列的引物，并包括下述工序：
(1)以RNA为模板，利用具有RNA依赖性DNA聚合酶活性的酶合成与上述特定碱基序列互补的cDNA的工序；
(2)利用具有核糖核酸酶H(RNaseH)活性的酶，分解上述(1)的反应中得到的RNA-DNA双链的RNA的工序(单链DNA的生成)；
(3)以上述单链DNA为模板，利用具有DNA依赖性DNA聚合酶活性的酶，生成具有启动子序列的双链DNA的工序，所述启动子序列能够转录上述特定碱基序列、或与上述特定碱基序列互补的序列的RNA；
(4)利用具有RNA聚合酶活性的酶，以上述双链DNA为模板生成RNA转录产物的工序；
(5)通过该RNA转录产物成为上述(1)的反应中的cDNA合成的模板，从而连锁性地生成RNA转录产物的工序；以及
(6)测定上述RNA转录产物量的工序；
并且，上述第一引物和第二引物为以下的任一种：
(i)上述第一引物是由序列号1所示的碱基序列中的至少15个连续碱基构成的寡核苷酸，上述第二引物是由序列号3所示的碱基序列中的至少15个连续碱基构成的寡核苷酸，
(ii)上述第一引物是由序列号2所示的碱基序列中的至少15个连续碱基构成的寡核苷酸，上述第二引物是由序列号4所示的碱基序列中的至少15个连续碱基构成的寡核苷酸。
第二发明是根据第一发明所述的存活蛋白mRNA的测定方法，其特征在于，上述第一引物和第二引物为以下的任一种的测定方法：
(i)上述第一引物是由序列号12或13所示的碱基序列中的至少15个连续碱基构成的寡核苷酸，上述第二引物是由序列号19～22所示的任一碱基序列中的至少15个连续碱基构成的寡核苷酸，
(ii)上述第一引物是由序列号14～18所示的任一碱基序列中的至少15个连续碱基构成的寡核苷酸，上述第二引物是由序列号20～25所示的任一碱基序列中的至少15个连续碱基构成的寡核苷酸。
第三发明是根据第一发明或第二发明所述的存活蛋白mRNA的测定方法，其特征在于，上述(6)的工序(测定RNA转录产物量的工序)是通过在荧光色素标记寡核苷酸探针共存下测定上述荧光特性的变化而进行的，上述荧光色素标记寡核苷酸探针设计成若形成与靶RNA互补的双链则荧光特性发生变化。
第四发明是根据第三发明所述的测定方法，其特征在于，上述荧光色素标记寡核苷酸探针是介由连接子结合有插入性荧光色素的插入性荧光色素标记寡核苷酸探针。
第五发明是根据第四发明所述的测定方法，其特征在于，上述插入性荧光色素标记寡核苷酸探针含有由序列号28～31所示的任一碱基序列中、或其互补序列中的至少15个连续碱基构成的寡核苷酸。
第六发明是根据第一发明至第五发明所述的存活蛋白mRNA的测定方法，其特征在于，在上述(1)的工序(以RNA为模板，利用具有RNA依赖性DNA聚合酶活性的酶合成与上述特定碱基序列互补的cDNA的工序)之前，进行以下工序：以存活蛋白mRNA中的特定碱基序列为模板，利用(i)剪切用寡核苷酸和(ii)具有核糖核酸酶H(RNase H)活性的酶，在上述特定碱基序列的5’末端部位剪切上述RNA；上述(i)剪切用寡核苷酸具有对上述特定碱基序列中的、与第一引物的相同区域的5’末端部位重复的区域以及从该部位在5’侧邻接的区域互补的序列。
第七发明是根据第六发明所述的测定方法，其特征在于，上述剪切用寡核苷酸是由序列号5～11所示的任一碱基序列构成的寡核苷酸。
第八发明是上述寡核苷酸，其特征在于，是用于特异性地扩增或检测存活蛋白mRNA的寡核苷酸，含有由序列号1～4或序列号28～31所示的任一碱基序列中或其互补序列中的至少15个连续碱基构成的寡核苷酸。
第九发明是一种存活蛋白mRNA的测定试剂，其特征在于，至少含有1种第八发明所述的寡核苷酸。
附图说明
图1是存活蛋白RNA的标准曲线。(a)表1的寡核苷酸组合[7]；(b)组合[15]；(c)组合[17]；(d)组合[38]。纵轴是荧光强度比超过1.2的时间(检测时间，分钟)，横轴是将用于测定的初期的标准RNA量(拷贝数)用log表示的值。另外，记载有由各点求出的线性一次曲线的式以及R2的值。
具体实施方式
以下，详细说明本发明。
本发明中的试样是指含有RNA的核酸试样。本发明通过将人体细胞、人体组织、体液、血液、尿、便、淋巴液、乳管液、或腹腔、胸腔的清洗液、胸腔的清洗液等作为材料，并使用基于例如日本特开平7-59572号等记载的核酸提取方法制备的试样，直接测定该试样，从而进行作为该试样的来源的人体细胞、组织等中所含有的存活蛋白mRNA的测定。
本发明中的特定碱基序列是指存活蛋白mRNA中与从与第一引物相同区域的5’末端开始至与第二引物互补区域的3’末端为止的碱基序列相同的RNA或DNA的碱基序列。即，在存活蛋白mRNA上，第一引物与特定碱基序列的5’末端至3’方向的至少15个连续碱基以上相同，第二引物与特定碱基序列的3’末端至5’方向的至少15个连续碱基以上互补。因此，在本发明中来自上述特定碱基序列的RNA转录产物能够扩增。本发明中的与第一引物相同区域的5’末端部位是指由在特定碱基序列内含有该相同区域的5’末端的部分序列构成，且该部位是与剪切用寡核苷酸互补区域和与第一引物相同区域重复的部位。
就本发明中的启动子而言，已知在与RNA聚合酶结合而开始转录的部位对各种RNA聚合酶具有特异性的启动子序列，在本发明的使用中没有特别的限定，但优选分子生物学实验等中通常使用的T7启动子、SP6启动子、T3启动子。另外，上述序列还可含有与转录效率相关的附加序列。
本发明中的互补序列是指在高严谨条件中能够对成为对象的碱基序列进行杂交的序列。作为高严谨条件的一个例子，可以举出本发明的实施例所述的核酸扩增反应液组成。另外，本发明中的相同的序列是指在高严谨条件中能够对成为对象的碱基序列的完全互补序列进行杂交的序列。因此，本发明中所述的互补的或相同的序列只要是高严谨条件中在对杂交的特异性和效率不造成影响的范围内就可以任意设定长度等，这是不言而喻的。进而，在对杂交的特异性和效率不造成影响的范围，可以使用进行了1～数碱基的取代、缺失、插入的碱基序列。
本发明中的核苷酸或核酸是指由天然存在的碱基、糖和糖之间键合构成的核苷酸或核苷(包括RNA和DNA双方)，是包括其低聚物(寡核苷酸，例如2～100碱基程度)以及多聚物(多核苷酸，例如100碱基以上)的总称。本发明中的核苷酸或核酸还包括起到相同功能的不是天然存在的单体，用荧光分子等、放射性同位素标记的单体，或含有它们的低聚物或多聚物。
本发明中的引物是指在核酸扩增反应中与模板杂交，用于引发核酸扩增反应所必需的核苷酸，在核酸扩增反应中将扩增进行如下设计：基于所需要的模板，与该模板杂交，并通过所谓的PCR法、LAMP法、ICAN法、NASBA法、TMA法、3SR法、TRC法(参照专利文献4和非专利文献4)之类的核酸扩增反应，能够得到链长或在序列中特异性的生成物，优选引物自身含有该模板中特异性的序列。
引物的长度被设计成具有通常为15～100碱基、优选15～35碱基的链长，但是不限于该链长。因此，本发明的第一引物和第二引物可以在本发明记载的碱基序列的范围内，在至少15个连续碱基以上的任意序列中选定。即，用于本发明中的存活蛋白mRNA检测的第一引物和第二引物是：
(i)第一引物是对于与存活蛋白mRNA的一部分相同的序列号1记载的序列相同的序列中的至少15个连续碱基构成的寡核苷酸，第二引物是对于与存活蛋白mRNA的一部分互补的序列号3所述的序列相同的序列中的至少15个连续碱基构成的寡核苷酸，或
(ii)第一引物是对于与存活蛋白mRNA的一部分相同的序列号2中记载的序列相同的序列中的至少15个连续碱基构成的寡核苷酸，第二引物是对于与存活蛋白mRNA的一部分互补的序列号4记载的序列相同的序列中的至少15个连续碱基构成的寡核苷酸。
应予说明，(ii)的情况下，由于序列号2的3’末端侧与序列号4的3’末端侧重复，因此第一引物与第二引物需要设计成第一引物的3’末端与第二引物的3’末端至少相隔15碱基以上的位置。
本发明中的用于检测存活蛋白mRNA的第一引物和第二引物的更优选的方式是：
(i)第一引物是对于与存活蛋白mRNA的一部分相同的的序列号12或13记载的序列相同的序列中的至少15个连续碱基构成的寡核苷酸，第二引物是对于与存活蛋白mRNA的一部分互补的序列号19～22记载的任一序列相同的序列中的至少15个连续碱基构成的寡核苷酸，或
(ii)第一引物是对于与存活蛋白mRNA的一部分相同的序列号14～18记载的任一序列相同的序列中的至少15个连续碱基构成的寡核苷酸，第二引物是对于与存活蛋白mRNA的一部分互补的序列号20～25记载的任一序列相同的序列中的至少15个连续碱基构成的寡核苷酸。
作为本发明中的用于检测存活蛋白mRNA的第一引物和第二引物的优选方式，可以举出：
(i)第一引物是选自序列号12或13记载的序列中的一种寡核苷酸，第二引物是选自序列号19～22记载的序列中的一种寡核苷酸，或
(ii)第一引物是选自序列号14～18记载的序列中的一种寡核苷酸，第二引物是选自序列号20～25记载的序列中的一种寡核苷酸。
进一步，作为本发明的一个方式，存活蛋白mRNA在成为cDNA合成的模板之前在该RNA内的特定核酸序列的上述5’末端部位被剪切。通过在特定核酸序列的5’末端部位被剪切，在cDNA合成后，可以通过延伸上述cDNA的3’末端来有效地合成与cDNA杂交的第一引物的启动子序列互补的DNA链，结果形成功能性的双链DNA启动子结构。作为这样的剪切方法，可以举出如下方法：将通过添加与存活蛋白mRNA内的特定碱基序列的5’末端部位(含有该特定碱基序列内的5’末端部位的部分序列)重复、并且对于向5’方向邻接的区域具有互补序列的寡核苷酸(以下称为剪切用寡核苷酸)而形成的RNA-DNA双链的RNA部分利用具有核糖核酸酶H(RNaseH)活性的酶等来进行剪切的方法。该剪切用寡核苷酸的3’末端的羟基是为了防止延伸反应而进行了适当修饰的羟基，优选使用例如进行了氨基化等的羟基。
在本发明的优选的一个方式中，作为剪切用寡核苷酸，可以举出对于与存活蛋白mRNA的一部分互补的序列号5～11记载的序列相同的序列构成的寡核苷酸。
本发明中的靶RNA是指在RNA转录产物上的特定碱基序列中，与上述引物相同或互补的区域以外的序列，具有能够与插入性荧光色素标记寡核苷酸探针互补性地结合的序列。因此，插入性荧光色素标记寡核苷酸探针成为与本发明中的特定碱基序列的一部分互补的、或相同的序列。作为本发明的一个方式，作为插入性荧光色素标记寡核苷酸探针，可以举出含有对于与存活蛋白mRNA的一部分互补的序列号28～31相同的、或互补的序列中的至少15个碱基构成的寡核苷酸的探针。
作为本发明中的用于存活蛋白mRNA检测的寡核苷酸的组合的一个方式，可以举出：
(i)剪切用寡核苷酸是由与序列号5或6分别相同的序列构成的寡核苷酸，第一引物是由与序列号1记载的序列相同的序列中的至少15个连续碱基构成的寡核苷酸(应予说明，第一引物在其5’末端具有启动子序列，并且特定核酸序列中的与该引物相同区域的5’末端部位与序列号5或6的互补区域重复)，第二引物是与序列号3相同的序列中的至少15个连续碱基的寡核苷酸，插入性荧光色素标记寡核苷酸探针是含有由与序列号28或29相同的序列中的至少15个连续碱基构成的寡核苷酸的探针、或
(ii)剪切用寡核苷酸是由与序列号7～11分别相同的序列构成的寡核苷酸，第一引物是由与序列号2记载的序列相同的序列中的至少15个连续碱基构成的寡核苷酸(应予说明，第一引物在其5’末端具有启动子序列，并且特定核酸序列中的与该引物相同区域的5’末端部位与序列号7～11中的任一的互补区域重复)，第二引物是与序列号4相同的序列中的至少15个连续碱基的寡核苷酸，插入性荧光色素标记寡核苷酸探针是含有由与序列号29～31相同的序列中的至少15个连续碱基构成的寡核苷酸的探针。
作为在本发明中用于存活蛋白mRNA检测的寡核苷酸组合的更优选方式，可以举出：
(i)剪切用寡核苷酸是由序列号5构成的寡核苷酸，第一引物是由序列号12构成的寡核苷酸(应予说明，第一引物在其5’末端具有启动子序列)，第二引物是选自序列号19～22中的一种的寡核苷酸，插入性荧光色素标记寡核苷酸探针是由序列号28或29构成的寡核苷酸；
(ii)剪切用寡核苷酸是由序列号6构成的寡核苷酸，第一引物是由序列号13构成的寡核苷酸(应予说明，第一引物在其5’末端具有启动子序列)，第二引物是选自序列号19～22中的一种寡核苷酸，插入性荧光色素标记寡核苷酸探针是由序列号28或29构成的寡核苷酸；
(iii)剪切用寡核苷酸是由序列号7构成的寡核苷酸，第一引物是由序列号14构成的寡核苷酸(应予说明，第一引物在其5’末端具有启动子序列)，第二引物是选自序列号20～25中的一种寡核苷酸，插入性荧光色素标记寡核苷酸探针是选自序列号29～31中的一种寡核苷酸；
(iv)剪切用寡核苷酸是由序列号8构成的寡核苷酸，第一引物是由序列号15构成的寡核苷酸(应予说明，第一引物在其5’末端具有启动子序列)，第二引物是选自序列号20～25中的一种寡核苷酸，插入性荧光色素标记寡核苷酸探针是选自序列号29～31中的一种寡核苷酸；
(v)剪切用寡核苷酸是由序列号9构成的寡核苷酸，第一引物是由序列号16构成的寡核苷酸(应予说明，第一引物在其5’末端具有启动子序列)，第二引物是选自序列号20～25中的一种寡核苷酸，插入性荧光色素标记寡核苷酸探针是选自序列号29～31中的一种寡核苷酸；
(vi)剪切用寡核苷酸是由序列号10构成的寡核苷酸，第一引物是由序列号17构成的寡核苷酸(应予说明，第一引物在其5’末端具有启动子序列)，第二引物是选自序列号23～25中的一种寡核苷酸，插入性荧光色素标记寡核苷酸探针是由序列号30或31构成的寡核苷酸；
(vii)剪切用寡核苷酸是由序列号11构成的寡核苷酸，第一引物是由序列号18构成的寡核苷酸(应予说明，第一引物在其5’末端具有启动子序列)，第二引物是选自序列号23～25中的一种寡核苷酸，插入性荧光色素标记寡核苷酸探针是由序列号30或31构成的寡核苷酸。
在本发明的存活蛋白mRNA的测定方法中，需要各种酶(具有以单链RNA为模板的RNA依赖DNA聚合酶活性的酶(逆转录酶)、具有RNaseH活性的酶、具有以单链DNA为模板的DNA依赖DNA聚合酶活性的酶、以及具有RNA聚合酶活性的酶)。各种酶可以使用同时具有几种活性的酶，也可以使用具有各种活性的多种酶。另外，不仅可以在具有以单链RNA为模板的RNA依赖DNA聚合酶活性、RNaseH活性、以及以单链DNA为模板的DNA依赖DNA聚合酶活性这三种活性的逆转录酶中添加具有RNA聚合酶活性的酶，而且可以根据需要进一步添加具有RNaseH活性的酶。上述逆转录酶优选分子生物学实验等中通用的AMV逆转录酶、MMLV逆转录酶、HIV逆转录酶、或这些的衍生物，最优选AMV逆转录酶及其衍生物。另外，作为上述具有RNA聚合酶活性的酶，可以例示分子生物学实验等中通用的来自噬菌体的T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶、以及它们的衍生物。
在本发明的一个方式中，在试样中的存活蛋白mRNA中添加上述剪切用寡核苷酸，通过上述逆转录酶的RNase H活性在上述特定碱基序列的5’末端部位剪切上述RNA。以被剪切的上述RNA为模板，在上述第一引物和第二引物的存在下实施利用上述逆转录酶的逆转录反应，则第二引物与存活蛋白mRNA内的特定碱基序列结合，利用上述逆转录酶的RNA依赖DNA聚合酶活性可以进行cDNA合成。得到的RNA-DNA双链通过利用上述逆转录酶的RNase H活性而RNA部分分解、解离，从而第一引物与上述cDNA结合。接着，利用上述逆转录酶的DNA依赖DNA聚合酶活性生成来自特定碱基序列、并且在5’末端具有启动子序列的双链DNA。该双链DNA在启动子序列下游含有特定碱基序列，利用上述RNA聚合酶产生来自特定碱基序列的RNA转录产物。该RNA转录产物成为用于利用上述第一引物和第二引物合成上述双链DNA的模板，一系列的反应连锁性地进行，从而上述RNA转录产物持续扩增。
为了进行这样的连锁反应，作为上述各种酶所必须的已知的要素，至少含有缓冲剂(例如Tris)、镁盐、钾盐、核苷-三磷酸、核糖核苷-三磷酸是不言而喻的。另外，作为用于调节反应效率的添加剂，还可以添加二甲基亚砜(DMSO)、二硫苏糖醇(DTT)、牛血清白蛋白(BSA)、糖等。
例如，利用AMV逆转录酶和T7RNA聚合酶的情况下，优选在35～65℃的范围设定反应温度，特别优选在40～50℃的范围进行设定。上述RNA扩增工序在一定温度进行，可以将反应温度设定在逆转录酶和RNA聚合酶显示活性的任意温度。
扩增的RNA转录产物量可以通过已知的核酸测定方法来测定。作为上述测定方法，可以举出利用了电泳、液相色谱的方法，利用以可检测的标记进行了标记的核酸探针的杂交法等。但是，由于这些操作工序多，并且将扩增产物拿到体系外进行分析，因此成为二次污染原因的扩增产物飞散到环境中的危险性大。为了克服这些课题，优选使用设计成通过与靶核酸互补结合而荧光特性发生变化的寡核苷酸探针。作为该寡核苷酸探针可以使用利用了被称为分子信标的FRET的已知的探针，但是从探针设计的容易性、探针合成的容易性考虑，作为更优选的方法，可以举出以下方法：在寡核苷酸探针的存在下，实施上述核酸扩增工序，测定荧光特性的变化，所述寡核苷酸探针被设计成由插入性荧光色素标记、并且通过若形成与靶核酸互补的双链，则插入性荧光色素部分插入到上述互补的双链部分，从而荧光特性发生变化(参照专利文献4和非专利文献4)。
作为上述插入性荧光色素，并无特别的限定，可以利用通用的
Figure BPA00001346449400141
唑黄、噻唑橙、溴化乙锭、以及这些的衍生物等。作为上述荧光特性的变化，可以举出荧光强度的变化。例如
Figure BPA00001346449400142
唑黄的情况，已知通过插入到双链DNA中，从而510nm的荧光(激发波长490nm)显著增加。上述插入性荧光色素标记寡核苷酸探针是对于上述RNA转录产物上的靶RNA互补的寡核苷酸，在末端、磷酸二酯部或碱基部分介由适当的连接子结合有插入性荧光色素，进而，以防止自3’末端的羟基的延伸为目的，该3’末端的羟基具有适当修饰的结构(参照专利文献4和非专利文献4)。
对寡核苷酸的插入性荧光色素的标记可以用已知的方法在寡核苷酸中导入官能团，从而结合插入性荧光色素(参照专利文献4和非专利文献4)。另外，作为上述官能团的导入方法，可以使用市售的Label-ON Reagents(Clontech公司制)等。
作为本发明的一个方式，提供以下方法：在试样中添加至少含有5’末端具有T7启动子序列(序列号34)的第一引物、第二引物、插入性荧光色素标记寡核苷酸探针、剪切用寡核苷酸、AMV逆转录酶、T7RNA聚合酶、缓冲剂、镁盐、钾盐、核苷-三磷酸、核糖核苷-三磷酸、二甲基亚砜(DMSO)的扩增试剂，在反应温度35～65℃(优选为40～50℃)的一定温度下进行反应，并且经时性地测定反应液的荧光强度。
在上述方式中，由于经时性地测定荧光强度，所以能够在发现有意义的荧光增加的任意时间结束测定，并能够将核酸扩增和测定在通常20分钟以内结束。
作为本发明的一个方式，测定上述试样中的存活蛋白mRNA，通过比较得到的荧光强度比的信息、和测定已知浓度的存活蛋白RNA时的荧光强度比信息，能够算出试样中存在的特定碱基序列的量(成为对象的RNA拷贝数)。特定碱基序列的检测可以适用例如对进行了一定时间上述反应的反应液使用对特定碱基序列互补地结合而得到的固定化以及标记化探针的夹心法，但是如上所述，优选使用与特定碱基序列特异性地结合的插入性荧光色素标记寡核苷酸探针的方法。另外，由于该探针不抑制上述RNA扩增反应，因此，特别优选在其存在下实施上述特定核酸序列的扩增，并监测特定核酸序列的扩增状态的方法。另外，在插入性荧光色素标记寡核苷酸探针共存下进行特定核酸序列的扩增的情况下，为了使该探针部分不起到延伸反应的引物的作用，优选例如在其3’末端添加乙醇酸、生物素等。并且，可以利用荧光检测器测定在扩增反应中该插入性荧光色素标记寡核苷酸探针与特定核酸序列结合而发出的荧光信号，将从该谱图得到的信息(例如荧光色素发出的荧光强度达到一定强度所需要的反应时间等)与从已知量的标准RNA相关的谱图得到的信息进行比较，由此确认特定核酸序列是否存在，或可以从扩增的特定核酸序列的量(RNA拷贝数)推定试样中存在的特定核酸序列的量(成为对象的RNA拷贝数)。
另外，可以将上述测定试剂所含有的全部试样封入单一容器这一点是应该特别写出的。即，只要实施将一定量的试样分别注入相应的单一容器的操作，此后就可以自动测定存活蛋白mRNA。为了例如能够在外部测定荧光色素发出的信号，该容器只要至少其一部分由透明材料构成即可，从防止污染方面考虑，特别优选分别注入试样后能够密封的容器。
上述方式的RNA扩增、测定方法由于能够以一步操作、在一定温度下实施，可以说是比RT-PCR简便且适合自动化的方法。根据本发明，使存活蛋白mRNA的高特异性、高灵敏度、迅速、简便、一定温度且一步的测定首次成为可能。
在本发明中，在通过以试样中的靶RNA(存活蛋白基因的mRNA)为基础合成在5’末端具有DNA依赖性RNA聚合酶的启动子区域的双链DNA，并以上述DNA为模板生成大量的单链RNA，进而，所生成的单链RNA量飞跃性地增大，以插入性荧光色素标记的寡核苷酸探针与生成的单链RNA互补结合，从而测定荧光增加的工序中，通过解析荧光强度增加的过程，能够简便、且迅速地确定初期RNA量。本发明的存活蛋白mRNA的测定方法的核酸扩增以及测定时间在30分钟以内，这比利用作为现有技术的RT-PCR法(通常为2小时以上)、NASBA法(90分钟以上)、以及TMA法(90分钟以上)进行测定更迅速。
进而，通过提供用于以一步操作扩增、检测存活蛋白基因的mRNA的寡核苷酸，即，用于扩增存活蛋白mRNA的寡核苷酸、以及用于检测存活蛋白mRNA的寡核苷酸，从而可以向生化学、分子生物学、医疗领域提供利用该寡核苷酸的简便、迅速且高灵敏度的存活蛋白mRNA表达细胞的测定方法、以及测定试剂。
实施例
以下，通过实施例更具体地说明本发明，但这些只是例子，本发明不被这些实施例所限定。
实施例1 标准RNA的制备
后述的实施例中使用的存活蛋白RNA(以后表示为标准RNA)按照(1)～(2)所示的方法实施。
(1)克隆GenBank登记的存活蛋白的碱基序列(GenBank Accession No.NM_001012271，2724碱基)中第68～1328号的碱基(1261碱基)的双链DNA。
(2)以(1)中制备的双链DNA为模板，实施体外转录，接着通过DNaseI处理完全消化该双链DNA后，精制RNA来进行制备。测定该RNA的260nm下的吸光度来进行定量。
实施例2 插入性荧光色素标记寡核苷酸探针的制备
制作用插入性荧光色素标记的寡核苷酸探针。在序列号28记载的序列的5’末端起第11位的C、序列号29记载的序列的5’末端起第11位的G、序列号30记载的序列的5’末端起第11位的A、序列号31记载的序列的5’末端起第11位的A、序列号32记载的序列的5’末端起第11位的C、序列号33记载的序列的5’末端起第11位的A的位置分别使用Label-ON Reagents(Clontech公司制)导入氨基，进一步将3’末端用生物素进行修饰。在上述氨基上标记作为插入性荧光色素的
Figure BPA00001346449400171
唑黄，从而制备
Figure BPA00001346449400172
唑黄标记寡核苷酸探针(序列号28～33)(参照Ishiguro，T et al.，Nucleic Acids Res.，24，4992-4997(1996)(非专利文献5))。
实施例3 存活蛋白RNA的测定(其1)
使用表1所示的组合中的组合[1]～[38]所示的第一引物、第二引物、插入性荧光色素标记寡核苷酸探针(以后表示为INAF探针)、剪切用寡核苷酸，以(1)～(4)所示的方法进行标准RNA的测定。应予说明，表1中的序列号12和13是序列号1的部分序列、序列号14～18是序列号2的部分序列、序列号19～22是序列号3的部分序列、序列号20～25是序列号4的部分序列。
[表1]
表1
Figure BPA00001346449400181
(1)将实施例1中制备的标准RNA用RNA稀释液(10mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)、0.1mM EDTA、0.5U/μL核糖核酸酶抑制剂、5.0mM DTT)稀释至103拷贝/5μL，将此作为RNA试样来使用。
(2)将以下组成的反应液20μL分别注入到容积为0.5mL的PCR用管(Individual PCR tube with dome cap，SSI公司制)，向其中添加上述RNA试样5μL。
反应液的组成(浓度是添加酶溶液后(30μL中)的最终浓度)
60mM Tris-盐酸缓冲液(pH8.6)
18mM氯化镁
100mM氯化钾
1.0mM DTT
各0.25mM dATP、dCTP、dGTP、dTTP
各3.0mM ATP、CTP、UTP、GTP
3.6mM ITP
1.0μM第一引物(该引物在各序列号记载的碱基序列的5’末端添加有T7启动子序列(序列号34))
1.0μM第二引物
0.16μM剪切用寡核苷酸(该寡核苷酸的3’末端的羟基由氨基修饰)
20nM INAF探针(该探针是实施例2中制备的探针)
6.0U核糖核酸酶抑制剂(Takara BIO公司制)
13％DMSO
容量调整用蒸馏水
(3)将上述反应液在43℃保温5分钟后，在以下组成中预先添加在43℃保温2分钟的酶液5.0μL。
酶液的组成(反应时(30μL中)的最终浓度)
2.0％山梨糖醇
6.4U AMV逆转录酶(LIFE SCIENCE公司制)
142U T7 RNA聚合酶(Invitrogen公司制)
3.6μg牛血清白蛋白(Takara BIO公司制)
容量调整用蒸馏水
(4)接着，使用能够直接测定PCR管的带有温度调节功能的荧光分光光度计，在43℃反应同时经时性地测定反应溶液的荧光强度(激发波长470nm，荧光波长510nm)20分钟。
将酶添加时的时刻作为0分钟，将反应液的荧光强度比(规定时刻的荧光强度值÷背景的荧光强度值)超过1.2的情况判定为阳性，将此时的时间作为检测时间，将结果示于表2。应予说明，在表2中所谓的N.D.是指酶添加20分钟后的荧光强度比小于1.2(判定为阴性)的试样。
[表2]
Figure BPA00001346449400201
表1的组合中，(i)第一引物由序列号1的部分序列构成、第二引物由序列号3的部分序列构成的组合(组合[1]～[10])，以及(ii)第一引物由序列号2的部分序列构成、第二引物由序列号4的部分序列构成的组合(组合[11]～[28])中，均在20分钟以内检测到了103拷贝/5μL的标准RNA。另一方面，(i)、(ii)以外的组合(组合[29]～[37])中均判定为阴性。另外，在对照试验区(代替标准RNA将RNA稀释液添加到反应液中进行测定)中，从反应开始至30分钟后荧光强度比也没有超过1.2。
根据该结果显示，与利用现有技术(非专利文献1～3)RT-PCR法的存活蛋白mRNA的检测方法(通常为2小时以上)相比，通过使用(i)第一引物是由序列号1所示的碱基序列中的至少15个连续碱基构成的寡核苷酸、第二引物是由序列号3所示的碱基序列中的至少15个连续碱基构成的寡核苷酸的组合，或(ii)第一引物是由序列号2所示的碱基序列中的至少15个连续碱基构成的寡核苷酸、第二引物是由序列号4所示的碱基序列中的至少15个连续碱基构成的寡核苷酸的组合进行RNA扩增反应，可以迅速地检测存活蛋白RNA。
实施例4 存活蛋白RNA的测定(其2)
使用本发明的寡核苷酸的组合测定各种浓度的标准RNA，并确认检测时间与初期标准RNA量的关系。
(1)实验方法
除了将寡核苷酸的组合、以及RNA试样变更为下述内容以外，按照与实施例3相同的方法进行测定。
寡核苷酸的组合：
在表1所示的组合中使用组合[7]、[15]、[17]和[38]
RNA试样：
在各组合中使用将实施例1中制备的标准RNA用实施例3(1)中使用的RNA稀释液进行如下稀释的试样：
组合[7]中稀释成3×102拷贝/5μL、3×103拷贝/5μL、3×104拷贝/5μL、以及3×105拷贝/5μL，
其它组合中稀释成102拷贝/5μL、103拷贝/5μL、104拷贝/5μL、以及105拷贝/5μL。
(2)实验结果
将酶添加时的时刻作为0分钟，将反应液的荧光强度比(规定时刻的荧光强度值÷背景的荧光强度值)超过1.2的情况判定为阳性，将此时的时间作为检测时间，将结果示于表3和4，将基于表3和4的结果作成的标准曲线的结果示于图1。
[表3]
Figure BPA00001346449400221
[表4]
Figure BPA00001346449400222
在此次研究的全部的寡核苷酸组合中，检测了酶添加后15分以内测定的全部浓度的标准RNA。另外，将检测时间作为纵轴，初期的标准RNA量(将拷贝数用log表示的值)作为横轴而进行标绘，结果此次研究的全部组合中，从3×102拷贝以下的低拷贝区域起检测时间是初期RNA量依赖性，标准曲线可以近似于线性一次曲线。即表明，通过对未知试样进行本发明的存活蛋白mRNA的测定，并将得到的检测时间代入图1所示的标准曲线，从而能够推测未知试样中所含有的存活蛋白mRNA的量。
实施例5 存活蛋白RNA的测定(其3)
使用本发明的寡核苷酸的组合测定市售的人膀胱癌提取物，并进行提取物中的存活蛋白mRNA的定量。
(1)实验方法
除了将寡核苷酸的组合、以及RNA试样变更为下述内容以外，按照与实施例3相同的方法进行测定。
寡核苷酸的组合：
在表1所示的组合中，使用组合[7]、[15]、[17]和[38]。
RNA试样：
使用将市售的人膀胱癌提取物(FirstChoice Tumor RNA：Human Bladder Tumor RNA(Ambion公司制))用实施例3(1)中使用的RNA稀释液稀释至以总RNA的浓度计为0.005ng/5μL～50ng/5μL的试样。
(2)实验结果
将酶添加时的时刻作为0分钟，将反应液的荧光强度比(规定时刻的荧光强度值÷背景的荧光强度值)超过1.2的情况判定为阳性，将此时的时间作为检测时间，将结果示于表5，并且将基于表5的检测时间与实施例4中得到的标准曲线来计算各RNA试样中所含有的存活蛋白mRNA量的结果示于表6。应予说明，在表5中所谓的N.D.是指酶添加20分钟后的荧光强度比小于1.2(判定为阴性)的试样。
[表5]
Figure BPA00001346449400231
[表6]
Figure BPA00001346449400241
根据标准曲线求出的各RNA试样中的存活蛋白mRNA量与使用的总RNA量大致成比例，表明本发明的存活蛋白RNA测定方法为浓度依赖性。应予说明，在此次研究的寡核苷酸的组合中，组合[17]检测了最低浓度的RNA试样。
实施例6 存活蛋白RNA扩增产物的碱基序列解析
实施实施例5中得到的核酸扩增反应后的试样中含有的双链DNA的碱基序列解析。碱基序列解析的结果，使用任意寡核苷酸的组合进行了扩增的试样均确认了与引发存活蛋白mRNA的扩增时相当的碱基序列。
即表明，在本发明中测定的是存活蛋白RNA，没有测定其它的非特异性的RNA。在实施例4中使用的市售的提取物中，除了存活蛋白RNA以外混入有很多其它混杂的RNA，但是本发明的测定方法只测定了存活蛋白mRNA，可以说特异性非常高。
以上表明，本发明的存活蛋白mRNA的测定方法能够特异性地、且迅速、高灵敏度地测定未知试样中含有的存活蛋白mRNA，进而，通过使用标准曲线，还能够进行定量。
产业上的利用可能性
根据本发明，可以在比较低的温度且一定温度(40～50℃，优选43℃)条件下，以一步的操作、特异性地、且迅速、高灵敏度地测定存活蛋白RNA。
Figure IPA00001346448800011
Figure IPA00001346448800021
Figure IPA00001346448800031
Figure IPA00001346448800041
Figure IPA00001346448800051
Figure IPA00001346448800061

Claims (9)

1.一种试样中的存活蛋白mRNA的测定方法，其特征在于，
所述测定方法使用了第一引物和第二引物，所述第一引物具有与存活蛋白mRNA中的特定碱基序列的一部分相同的序列，所述第二引物具有与特定碱基序列的一部分互补的序列，其中，第一引物或第二引物的任意一方是其5’末端添加有RNA聚合酶的启动子序列的引物，
并且，所述测定方法包括下述工序：
(1)以RNA为模板，利用具有RNA依赖性DNA聚合酶活性的酶合成与特定碱基序列互补的cDNA的工序，
(2)利用具有核糖核酸酶H(RNaseH)活性的酶，分解所述(1)的反应中得到的RNA-DNA双链的RNA的工序，即，生成单链DNA，
(3)以所述单链DNA为模板，利用具有DNA依赖性DNA聚合酶活性的酶，生成具有启动子序列的双链DNA的工序，所述启动子序列能够转录所述特定碱基序列、或与所述特定碱基序列互补的序列的RNA，
(4)利用具有RNA聚合酶活性的酶，以所述双链DNA为模板生成RNA转录产物的工序，
(5)通过该RNA转录产物成为所述(1)的反应中的cDNA合成的模板，从而连锁性地生成RNA转录产物的工序，以及
(6)测定所述RNA转录产物量的工序；
并且，所述第一引物和第二引物为以下的任一种：
(i)所述第一引物是由序列号1所示的碱基序列中的至少15个连续碱基构成的寡核苷酸，所述第二引物是由序列号3所示的碱基序列中的至少15个连续碱基构成的寡核苷酸，
(ii)所述第一引物是由序列号2所示的碱基序列中的至少15个连续碱基构成的寡核苷酸，所述第二引物是由序列号4所示的碱基序列中的至少15个连续碱基构成的寡核苷酸。
2.根据权利要求1所述的存活蛋白mRNA的测定方法，其中，所述第一引物和第二引物为以下的任一种：
(i)所述第一引物是由序列号12或13所示的碱基序列中的至少15个连续碱基构成的寡核苷酸，所述第二引物是由序列号19～22所示的任一碱基序列中的至少15个连续碱基构成的寡核苷酸，
(ii)所述第一引物是由序列号14～18所示的任一碱基序列中的至少15个连续碱基构成的寡核苷酸，所述第二引物是由序列号20～25所示的任一碱基序列中的至少15个连续碱基构成的寡核苷酸。
3.根据权利要求1或2所述的存活蛋白mRNA的测定方法，其中，所述(6)的工序，即，测定RNA转录产物量的工序，是通过在荧光色素标记寡核苷酸探针共存下测定所述荧光特性的变化而进行的，所述荧光色素标记寡核苷酸探针设计成若形成与靶RNA互补的双链则荧光特性发生变化。
4.根据权利要3所述的测定方法，其中，所述荧光色素标记寡核苷酸探针是介由连接子结合有插入性荧光色素的插入性荧光色素标记寡核苷酸探针。
5.根据权利要求4所述的测定方法，其中，所述插入性荧光色素标记寡核苷酸探针含有由序列号28～31所示的任一碱基序列中、或其互补序列中的至少15个连续碱基构成的寡核苷酸。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的存活蛋白mRNA的测定方法，其中，在所述(1)的工序之前，即，以RNA为模板，利用具有RNA依赖性DNA聚合酶活性的酶合成与特定碱基序列互补的cDNA的工序之前，进行以下工序：以存活蛋白mRNA中的特定碱基序列为模板，利用(i)剪切用寡核苷酸和(ii)具有核糖核酸酶H(RNase H)活性的酶，在所述特定碱基序列的5’末端部位剪切所述RNA；所述剪切用寡核苷酸具有对所述特定碱基序列中的、与第一引物的相同区域的5’末端部位重复的区域以及从该部位在5’侧邻接的区域互补的序列。
7.根据权利要求6所述的测定方法，其中，所述剪切用寡核苷酸是由序列号5～11所示的任一碱基序列构成的寡核苷酸。
8.一种寡核苷酸，其特征在于，是用于特异性地扩增或检测存活蛋白mRNA的寡核苷酸，含有由序列号1～4或序列号28～31所示的任一碱基序列中或其互补序列中的至少15个连续碱基构成的寡核苷酸。
9.一种存活蛋白mRNA的测定试剂，其特征在于，至少含有1种权利要求8所述的寡核苷酸。
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