KR20190132155A - 등온핵산 증폭을 이용한 생체조직의 3차원 핵산영상 진단 방법 - Google Patents

등온핵산 증폭을 이용한 생체조직의 3차원 핵산영상 진단 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 등온핵산 증폭을 이용한 생체조직의 3차원 핵산영상 진단 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 생체조직의 3차원 핵산영상 진단 방법은 조직을 투명화시키는 단계를 통해 특정 분자 바이오마커를 조직에서 정확하게 볼 수 있도록 하고, 생체조직 내부 전체를 시각화하면서 입체적으로 조직을 재구성할 수 있어 진단의 정확성을 향상시키며, 생체조직 내에서 등온핵산 증폭 단계를 통해 인체 내 유전 정보를 담고 있는 DNA 또는 RNA와 같은 분자 바이오마커를 3차원으로 쉽게 이미징하여, 암을 비롯한 여러 질병을 진단하는데 유용하게 사용할 수 있다.

Description

등온핵산 증폭을 이용한 생체조직의 3차원 핵산영상 진단 방법{Method of 3-dimensional nucleic acid imaging diagnosis of biological tissue using isothermal nucleic acid amplification}
본 발명은 등온핵산 증폭을 이용한 생체조직의 3차원 핵산영상 진단 방법 등에 관한 것이다.
질병의 진단에 사용되는 검사 방법 중 단백질을 이용한 면역화학적진단 또는 영상진단은 항체 등의 특이적 반응이 낮고, 증폭을 할 수가 없어 소량의 바이오 마커를 이용한 진단에 어려움이 있다.
따라서, 이를 극복하기 위해 암을 비롯한 여러 질병 진단에서 인체 내 유전 정보를 담고 있는 DNA와 RNA로 질병을 확인하는 분자 바이오마커 연구가 많이 사용되고 있다. DNA 및 RNA 바이오마커들은 PCR, microchip, NGS 등의 방법으로 여러 질병의 진단에 이용되고 있는데, 이 경우 상기 PCR(Polymerase chain reaction)은 소량의 핵산을 검출하고 분석하는 방법인 핵산증폭 기술 중에서 가장 넓게 사용되는 기술이며, 높은 온도조건에서 이중가닥 DNA를 단일가닥 DNA로 변성시킨 후, 온도를 낮추어 단일가닥에 프라이머(primer)가 결합하고 Taq polymerase(thermostable enzyme)가 이중가닥 DNA로 연장시키는 과정이 반복되는 방법이다(한국공개특허 10-2017-0064454 참조). 그러나, 상기와 같은 DNA 및 RNA 바이오마커들은 조직 내에서 발현되는 세포 및 위치를 알 수 없는 단점이 존재한다.
이를 해결하기 위해, FISH 등의 hybridization 방법으로 조직 내 DNA 및 RNA 바이오마커의 존재 및 위치 등을 알 수 있으나, 상기 방법을 사용할 경우 증폭이 안되어 진단에 어려움이 있을 뿐만 아니라, 조직의 투과성이 낮아 결과 관찰에 제한이 많다.
한편, 등온증폭방법(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)은 2000년 Notomi 등에 의해 고안된 검출방법으로, 기존의 PCR법과 유사하지만 PCR이나 real-time PCR 반응 시에 DNA 변성(denaturation), 프라이머의 접합 (annealing), 중합효소의 신장(extension)에 필요했던 온도 변화가 필요 없으며, 60℃에 가까운 한 온도에서 증폭반응이 가능한 검출 방법이다.
LAMP의 가장 큰 특징은 등온에서 유전자의 증폭이 이루어진다는 점으로, 온도의 구배가 필요한 PCR에 비해서 온도 조절이 필요 없기 때문에 상대적으로 반응 시간이 짧아진다. 따라서, 좀 더 빠른 시간 내에 유전자 증폭을 가능하게 하며, LAMP를 이용할 경우 전기영동 시간을 제외하고 한 시간 내에 유전자 증폭이 가능함이 이미 보고되었다. 또한, 온도 변화에 따른 DNA 손실 및 손상이 없기 때문에 증폭 효율이 매우 높으며, 등온 조건에서의 증폭은 LAMP가 다른 검출 방법들과 달리 현장성을 가질 수 있다는 근거가 된다. 일정한 온도만 유지하면 되기 때문에 고가의 장비가 필요없고 항온수조 등 간단한 장비만을 가지고도 반응이 가능하다. 따라서, LAMP를 이용한다면 굳이 실험실 내에서의 환경이 아니더라도 현장에서 특정 유전자의 검출이 가능해진다.
그러나, 등온 증폭 방법을 이용한 진단방법에 대한 관련연구는 아직 미비한 실정이다.
본 발명자들은 상기와 같은 바이오마커를 이용한 진단방법의 문제점을 해결할 수 있는 방법을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 생체조직의 투명화를 통해 빛이 투과해 특정 분자 바이오마커를 조직에서 정확하게 볼 수 있도록 하여 진단의 정확성을 향상시킬 수 있고, 생체조직 내에서 등온 증폭 방법을 이용해 바이오마커를 3차원으로 쉽게 이미징 할 수 있는 생체조직의 3차원 핵산영상 진단 방법을 발명하여 본 발명을 완성하였다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 생체조직 시료를 투명화 시키는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 투명화 시킨 생체조직 시료에 효소 반응 혼합액 및 프라이머(primer)를 첨가하여 검출하고자 하는 바이오마커를 등온에서 증폭시키는 단계;
(c) 상기 (b) 단계에서 증폭시킨 바이오마커를 검출하는 단계를 포함하는, 생체조직의 3차원 핵산영상 진단 방법을 제공한다.
본 발명의 일구현예로서, 상기 (b) 단계에서 사용된 프라이머(primer)는 증폭시키고자 하는 바이오마커의 프라이머일 수 있다.
본 발명의 다른 일구현예로서, 상기 프라이머(primer)는 프로브(probe)를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일구현예로서, 상기 생체조직은 뇌, 간, 폐, 신장, 장, 심장, 근육, 또는 혈관일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일구현예로서, 상기 (a)에서 투명화 시키는 단계는 (ⅰ) 생체조직 시료를 고정 용액에 넣고 고정시키는 단계;
(ⅱ) 상기 고정된 시료를 조직 클리어링 용액에 넣고 반응시키는 단계; 및
(ⅲ) 상기 조직 클리어링 용액에 반응시킨 시료를 세척 용액에 넣어 시료에 부착되어 있는 유기물을 씻어내는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일구현예로서, 상기 고정 용액은 수크로오스(sucrose)를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일구현예로서, 상기 수크로오스(sucrose)는 농도가 20%(w/v) 내지 100%(w/v)일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일구현예로서, 상기 조직 클리어링 용액은 CHAPS(3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트), 우레아(urea), 및 염화나트륨(NaCl)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일구현예로서, 상기 염화나트륨(NaCl)은 농도가 0.001 내지 1.0%(w/v)일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일구현예로서, 상기 세척 용액은 인산완충식염수(phosphate buffer saline; PBS) 및 아지드화나트륨(sodium azide)을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일구현예로서, 상기 아지드화나트륨(sodium azide)은 농도가 0.001 내지 0.5%(w/v)일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일구현예로서, 상기 바이오마커는 분자 바이오마커일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일구현예로서, 상기 분자 바이오마커는 DNA 또는 RNA일 수 있다.
본 발명에 따른 등온핵산 증폭을 이용한 생체조직의 3차원 핵산영상 진단 방법은 조직을 투명화시키는 단계를 통해 특정 분자 바이오마커를 조직에서 정확하게 볼 수 있도록 하고, 생체조직 내부 전체를 시각화하면서 입체적으로 조직을 재구성할 수 있어 진단의 정확성을 향상시키며, 생체조직 내에서 등온핵산 증폭 단계를 통해 인체 내 유전 정보를 담고 있는 DNA 또는 RNA와 같은 분자 바이오마커를 3차원으로 쉽게 이미징하여, 암을 비롯한 여러 질병을 진단하는데 유용하게 사용할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 일구현예에 따른 mouse brain 조직에서 Thy-1 mRNA의 등온핵산 증폭 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일구현예에 따른 mouse brain 조직에서 GAD-67 mRNA의 등온핵산 증폭 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명에 따른 3차원 핵산영상 진단 방법의 특징을 간략하게 도식화하여 나타낸 도면이다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 (a) 생체조직 시료를 투명화 시키는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 투명화 시킨 생체조직 시료에 효소 반응 혼합액 및 프라이머(primer)를 첨가하여 검출하고자 하는 바이오마커를 등온에서 증폭시키는 단계;
(c) 상기 (b) 단계에서 증폭시킨 바이오마커를 검출하는 단계를 포함하는, 생체조직의 3차원 핵산영상 진단 방법을 제공한다.
상기 (b) 단계에서 사용된 프라이머(primer)는 증폭시키고자 하는 바이오마커의 프라이머일 수 있으며, 프로브(probe)를 포함할 수 있다.
상기 (a) 단계의 생체조직은 뇌, 간, 폐, 신장, 장, 심장, 근육, 또는 혈관일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 (a) 단계에서 투명화 시키는 단계는 (ⅰ) 생체조직 시료를 고정 용액에 넣고 고정시키는 단계;
(ⅱ) 상기 고정된 시료를 조직 클리어링 용액에 넣고 반응시키는 단계; 및
(ⅲ) 상기 조직 클리어링 용액에 반응시킨 시료를 세척 용액에 넣어 시료에 부착되어 있는 유기물을 씻어내는 단계를 포함할 수 있다.
상기 고정용액은 수크로오스(sucrose)를 포함할 수 있으며 이 때, 수크로오스의 농도는 20%(w/v) 내지 100%(w/v)일 수 있으나, 상기 농도에 제한되는 것은 아니다.
상기 조직 클리어링 용액은 CHAPS(3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트), 우레아(urea), 및 염화나트륨(NaCl)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있으며 이 때, 상기 염화나트륨(NaCl)은 농도는 0.001 내지 1.0%(w/v)일 수 있으나, 상기 농도에 제한되지는 않는다.
상기 세척 용액은 인산완충식염수(phosphate buffer saline; PBS) 및 아지드화나트륨(sodium azide)을 포함할 수 있다. 이 때, 상기 아지드화나트륨(sodium azide)의 농도는 0.001 내지 0.5%(w/v)일 수 있으나, 상기 농도에 제한되지는 않는다.
상기 (b) 단계에서 "바이오마커"는 DNA, RNA, 대사 물질, 단백질 및 단백질 조각 등에서 유래된 분자적 정보로서 질병의 발생 등으로 유발된 신체의 변화를 감지할 수 있는 지표로, 질병의 발생 및 진행과 관련되어 새로운 약물의 개발과 체외에서 질병을 조기 발견하고 그 예후를 관찰하는 체외 분자진단 기술, 특정 약물에 반응하는 바이오마커의 개인별 특성을 규정하는 개인별 맞춤 의료 기술, 환자 편의적인 진료환경을 구축하기 위한 유비쿼터스 헬스 케어 시스템 등의 개발에 폭넓게 이용되고 있다. 바이오마커는 생명체에서 질병의 종류 및 발생과 진행에 따라 다르게 나타나기 때문에 특정 질환 여부나 약물반응 상태 등을 객관적으로 측정할 수 있게 해주는 혈액이나 체액 내에 있는 지표가 되는 물질이며, 이 혈액이나 체액을 분석하는 것만으로 질병을 조기에 판단할 수 있도록 해주는 역할을 한다.
본 발명에서 상기 바이오마커는 분자 바이오마커일 수 있으며, 구체적으로는 DNA 또는 RNA일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 일실시예에서는 생체조직 시료를 투명화 한 다음(실시예 1 참조), 등온 핵산 증폭을 이용하여 생체조직의 3차원 핵산영상을 확인하였다(실시예 2 참조).
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 생체조직 시료 투명화
Mouse로부터 brain을 적출하여 3mm 크기로 조각낸 후, 조각낸 brain 시료를 고정 용액(Fixing solution)에 넣고 4℃에서 12시간 동안 반응시켰다.
그 후 시료를 조직 클리어링 용액 (Tissue clearing solution)에서 37℃에서 6시간 동안 반응시켰다.
상기 조직 클리어링 용액에서 반응시킨 시료는 세척 용액(Washing solution)에 넣고 상온에서 6시간 동안 반응시켜 투명화 시켰다.
상기 생체조직 시료의 투명화를 위해 사용한 용액들의 구성성분은 하기 표 1에 나타내었다.
구성 성분
Fixing solution Sucrose(20%(w/v)이상)
Tissue clearing solution CHAPS(20%(w/v)), Urea(50%(w/v)), NaCl(0.1 내지 0.5%(w/v))
Washing solution PBS, sodium azied(0.1%(w/v))
실시예 2. 등온 핵산 증폭을 이용한 생체조직의 3차원 핵산영상 확인
2-1. 마우스 뇌(Mouse brain)에서 Thy-1 mRNA 등온 핵산 증폭 결과 확인
상기 실시예 1에서 투명화 시킨 mouse brain 시료에 Bst DNA polymerase 및 Reverse transcriptase를 포함하는 효소 반응 혼합액을 첨가하여 4℃에서 24시간 동안 shaking하고, 조직에서 등온증폭이 가능한지 판단하기 위해 neurons, thymocyte, T cells, 및 stem cell 마커로서 마우스 뇌조직 신경에서 많이 발현되는Thy-1(Thymocyte differentiation antigen 1) mRNA를 등온에서 증폭시켰다.
구체적으로, 상기 mouse brain 시료에 Thy1 primer(probe 포함)를 첨가하여 4℃에서 12시간 동안 shaking하고, 2x 버퍼(2x buffer)로 상온에서 6시간 동안 세척하였다. 이 때 사용한 Thy1 primer(probe 포함)는 하기 표 2에 나타내었다.
상기 세척 후, dNTP(deoxynucleoside triphosphate)를 포함하는 2x buffer인 반응 버퍼(reaction buffer)에서 4℃, 1시간 동안 반응시킨 후 58℃에서 5-20분간 배양하였다.
배양 후, 세척 용액(Washing solution)에서 상온, 6시간 동안 반응시켰으며, 마운팅 용액 (Mounting solution)에서 37℃, 6시간 동안 반응시킨 후 light sheet에서 Thy-1 mRNA를 검출하였다.
상기 Thy-1 mRNA의 등온 핵산 증폭을 위해 사용한 용액들의 구성성분은 하기 표 3에 나타내었다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, Thy-1 mRNA를 등온 핵산 증폭 시킴으로써 mouse brain에서의 Thy-1 mRNA 위치가 녹색 형광으로 선명하게 표시된 것을 확인할 수 있었다.
oligo name primer sequence 서열번호
Thy1-A F3 GGG AGT CCA GAA TCC AAG 1
Thy1-B B3 CGT GTG CTC GGG TAT C 2
Thy1-C FIP TGG TCA CCT TCT GCC CTC CTT GGC ACC ATG AAC CC 3
Thy1-D BIP CTT CGC CTG GAC TGC C TGC TTC CTC TTC TCT CGG 4
Thy1-E LF CAA GAC TGA GAG CAG GAG AGC G 5
Thy1-F LB TCC ATC CAG CAT GAG TTC AGC C 6
Thy1-HEX Fluorescent CAC CAC CCT CCC GTG GGC GGC AAG ACT GAG AGC AGG AGA GCG 7
Thy-1-BHQ1 quencher CCG CCC ACG GGA GGG TGG TG 8
구성 성분
2x buffer (-dNTP) 20mM Tris-HCl(pH 8.8), 10mM KCl, 4mM MgSO4, 10mM(NH4)2SO4, 0.1% Triton X-100
2x reaction buffer 20mM Tris-HCl(pH 8.8), 10mM KCl, 4mM MgSO4, 10mM(NH4)2SO4, 0.1% Triton X-100, 1.6mM dNTPs
Washing solution PBS, sodium azied(0.1%(w/v))
Mounting solution CHAPS(40%(w/v)), Urea(30%(w/v)), NaCl(0.1 내지 1%(w/v))
2-2. Mouse brain에서 GAD-67 mRNA 등온 핵산 증폭 결과 확인
상기 실시예 2-1의 방법과 동일한 방법으로 mouse brain 시료의 GAD-67(Glutamic acid decarboxylase 67) mRNA를 등온에서 증폭시켰다. 이 때 사용한GAD67 primer(probe 포함)는 하기 표 4에 나타내었다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, GAD-67 mRNA를 등온 핵산 증폭 시킴으로써 mouse brain에서의 GAD-67 mRNA 위치가 적색으로 선명하게 표시된 것을 확인할 수 있었다.
oligo name primer sequence 서열번호
gad67-A F3 GCA AGA CAT TTG ATC GCT CC 9
gad67-B B3 GAG AAC AAA CAC GGG TGC 10
gad67-C FIP TGC TCC AGA GAC TCG GGG ATT TCC ACC ACC CAC ACC 11
gad67-D BIP CGC ACA GGT CAC CCT CG ATG TCA GCC ATT CAC CAG C 12
gad67-E LF GCC TTC CAT GCC TTC CAG 13
gad67-F LB ACC AGC TCT CTA CTG GTT TGG 14
gad67-Cy5 Fluorescent GCC ACA GCC CTC TCC CGC CGG CCT TCC ATG CCT TCC AG 15
gad67-BHQ3 quencher CGG CGG GAG AGG GCT GTG GC 16
상기 실시예의 결과로부터, 본 발명에 따른 3차원 핵산영상 진단 방법을 사용할 경우 조직 투명화 및 등온 증폭 방법을 통해 생체조직 내 바이오마커의 위치 확인으로 인한 정확한 진단이 가능함을 확인하였다.
상기와 같은 본 발명의 특징은 도 3에 간략하게 도식화하여 나타내었다.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
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Claims (13)

  1. (a) 생체조직 시료를 투명화 시키는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서 투명화 시킨 생체조직 시료에 효소 반응 혼합액 및 프라이머(primer)를 첨가하여 검출하고자 하는 바이오마커를 등온에서 증폭시키는 단계;
    (c) 상기 (b) 단계에서 증폭시킨 바이오마커를 검출하는 단계를 포함하는, 생체조직의 3차원 핵산영상 진단 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계에서 사용된 프라이머(primer)는 증폭시키고자 하는 바이오마커의 프라이머인 것을 특징으로 하는, 생체조직의 3차원 핵산영상 진단 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 프라이머(primer)는 프로브(probe)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 생체조직의 3차원 핵산영상 진단 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 생체조직은 뇌, 간, 폐, 신장, 장, 심장, 근육, 또는 혈관인 것을 특징으로 하는, 생체조직의 3차원 핵산영상 진단 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 (a)에서 투명화 시키는 단계는 (ⅰ) 생체조직 시료를 고정 용액에 넣고 고정시키는 단계;
    (ⅱ) 상기 고정된 시료를 조직 클리어링 용액에 넣고 반응시키는 단계; 및
    (ⅲ) 상기 조직 클리어링 용액에 반응시킨 시료를 세척 용액에 넣어 시료에 부착되어 있는 유기물을 씻어내는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 생체조직의 3차원 핵산영상 진단 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 고정 용액은 수크로오스(sucrose)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 생체조직의 3차원 핵산영상 진단 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 수크로오스(sucrose)는 농도가 20%(w/v) 내지 100%(w/v)인 것을 특징으로 하는, 생체조직의 3차원 핵산영상 진단 방법.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 조직 클리어링 용액은 CHAPS(3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트), 우레아(urea), 및 염화나트륨(NaCl)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 생체조직의 3차원 핵산영상 진단 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 염화나트륨(NaCl)은 농도가 0.001 내지 1.0%(w/v)인 것을 특징으로 하는, 생체조직의 3차원 핵산영상 진단 방법.
  10. 제5항에 있어서,
    상기 세척 용액은 인산완충식염수(phosphate buffer saline; PBS) 및 아지드화나트륨(sodium azide)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 생체조직의 3차원 핵산영상 진단 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 아지드화나트륨(sodium azide)은 농도가 0.001 내지 0.5%(w/v)인 것을 특징으로 하는, 생체조직의 3차원 핵산영상 진단 방법.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 바이오마커는 분자 바이오마커인 것을 특징으로 하는, 생체조직의 3차원 핵산영상 진단 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 분자 바이오마커는 DNA 또는 RNA인 것을 특징으로 하는, 생체조직의 3차원 핵산영상 진단 방법.

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