BR112019005790B1

BR112019005790B1 - Método para detectar rnas pequenos ou proteínas associadas a rnas pequenos

Info

Publication number: BR112019005790B1
Application number: BR112019005790-0A
Authority: BR
Inventors: Nam Young Hyean
Original assignee: Nuribio Co.,Ltd
Priority date: 2016-09-27
Filing date: 2017-09-27
Publication date: 2024-05-21

Abstract

MÉTODO PARA DETECTAR RNAS PEQUENOS OU PROTEÍNAS ASSOCIADAS A RNAS PEQUENOS. A presente invenção se refere a um método para detectar o RNA pequeno ou a proteína associada ao RNA pequeno e, mais particularmente, a um método para detectar RNA pequeno ou proteína associada ao RNA pequeno com o uso de um promer, que tem a estrutura X-Y-Z e compreende uma sequência de nucleotídeos com capacidade de se ligar de modo complementar à totalidade ou a uma parte do RNA pequeno a ser detectado. A presente invenção possibilita detectar rápida e precisamente o RNA pequeno ou a proteína associada ao RNA pequeno e, portanto, pode ser vantajosamente usada para diagnóstico de várias doenças e previsão de prognóstico.

Description

CAMPO DA TÉCNICA

[0001] A presente invenção se refere a um método para detectar o RNA pequeno ou a proteína associada ao RNA pequeno e, mais particularmente, a um método para detectar RNA pequeno ou proteína associada ao RNA pequeno com o uso de um promer, que tem a estrutura X-Y-Z e compreende uma sequência de nucleotídeos com capacidade de se ligar de modo complementar à totalidade ou a uma parte do RNA pequeno a ser detectado.

ANTECEDENTES DA TÉCNICA

[0002] O microRNA (miRNA), um dos RNAs pequenos presentes nas células, é conhecido por desempenhar uma função muito importante em processos biológicos, como desenvolvimento e diferenciação celular e morte celular programada, e sabe- se que uma diferença nos níveis de expressão de miRNAs particulares nas células é associada a vários cânceres, incluindo câncer. Portanto, a detecção de microRNAs particulares (miRNAs) recentemente se tornou uma parte importante no campo de pesquisa científico. Especificamente, a detecção e identificação de miRNAs particulares e proteínas associadas aos mesmos podem ser usadas como marcadores genéticos e biológicos que indicam a saúde humana. Através da detecção e identificação, tornou-se possível desenvolver kits que simplesmente usam sangue periférico, hormônios ou fluido espinhal e kits de diagnóstico que podem ser usados in vitro. Esses kits podem ser aplicados a diagnósticos de doenças de demência (doença de Alzheimer, doença de Parkinson, etc.), diabetes, câncer e similares. Entretanto, miRNAs são muito curtos quanto ao comprimento (cerca de 22 nucleotídeos) e, portanto, são difíceis de detectar e identificar, limitando seu uso como biomarcadores eficazes.

[0003] A detecção de miRNAs é geralmente baseada em um método de amplificação de ácido nucleico, e os exemplos desse método incluem PCR (reação em cadeia da polimerase), NASBA (amplificação com base em sequência de ácidos nucleicos) e similares. Um método de detecção convencional com base nessa reação de amplificação de ácido nucleico é conhecido por aqueles versados na técnica à qual a presente invenção se refere. Esse método de detecção geralmente exige processos de trabalho intensivo, como o uso de uma técnica de ensaio de blotting, eletroforese ou sonda, que pode detectar um ácido nucleico amplificado após a amplificação de ácido nucleico.

[0004] Os métodos em tempo real para detecção de miRNA, que são mais amplamente conhecidos, são realizados por RT-PCR, qRCR ou similares. Esses métodos são baseados em uma sonda de hibridização fluorescente que forma uma estrutura secundária cuja fluorescência é suprimida quando não hibridizada a um alvo, uma sonda de hidrólise cuja fluorescência aumenta devido à clivagem por Taq polimerase após a hibridização, agentes de ligação de dsDNA ou similares. Em cada ponto no tempo da medição, cada produto de amplificação é desdobrado ou cortado à medida em que a sonda hibridiza ao mesmo, aumentando, assim, a intensidade de fluorescência. Nesse caso, o amplificador é detectado a uma taxa de um amplificador por sonda. Em um dado ciclo, um amplificador mostra uma sonda (por exemplo, sinalizador molecular, sonda tipo Taqman, sonda de MGB, etc.) detectada por hibridização ou clivagem da sonda. Além disso, dentre os métodos de detecção em tempo real, um método de detecção de um produto de NASBA com o uso de um sinalizador molecular simultaneamente com a amplificação também é conhecido.

[0005] Como exemplos específicos desse método para detectar miRNA, como mostrado na Figura 1, um método que usa uma sonda tipo TaqMan e um iniciador tipo haste-alça e um método que usa um iniciador adaptador de oligo-dT e adição de cauda de poli-A são amplamente usados.

[0006] Entretanto, as técnicas descritas acima têm algumas desvantagens.

[0007] Primeiro, essas técnicas exigem extensão de oligo adicional, visto que uma sonda e iniciadores para análise de miRNA não são localizados no alvo miRNA. O iniciador tipo haste-alça, o iniciador adaptador de oligo-dT, etc., mostrados na Figura 1 são oligos estendidos. Nesse caso, o problema crucial é que o aumento na fluorescência que depende inteiramente do alvo de miRNA amplificado não é medido, porém, o aumento na fluorescência causado por amplificação do oligo estendido é medido, o que resulta em resultados imprecisos devido à amplificação e ligação não específicas.

[0008] Segundo um certo espaçamento entre o iniciador e a sonda é necessário. Por exemplo, a sonda tipo Taq-man e a sonda de MGB são identificadas com um cromóforo de doador na extremidade 5' e, quando a DNA polimerase encontra a sonda durante a extensão de iniciador, a atividade de exonuclease da polimerase irá sequencialmente degradar a sonda a partir da extremidade 5'. Nesse momento, a clivagem é possível quando o espaçamento entre o iniciador e a sonda é pelo menos 7 a 10 nucleotídeos. Além disso, o espaçamento entre o iniciador e o supressor na extremidade 3’ exige pelo menos 2 a 4 nucleotídeos. Essas limitações desempenham uma função limitada na análise de DNA ou RNA curto.

[0009] Terceiro, o método com base em NASBA exige controle preciso da temperatura de fusão do sinalizador, visto que a sonda deve formar uma estrutura secundária que suprime a intensidade de fluorescência do doador. Esse controle é difícil de se aplicar quando uma reação é realizada a uma temperatura constante, como o caso de NASBA ou RCA. Ademais, o sinalizador deve ser projetado de modo que mantenha a estrutura de grampo quando não se liga ao alvo e é desdobrado a uma temperatura de reação em que se liga ao alvo. Isso torna difícil projetar a sonda, e também causa problemas associados à razão de sinal para ruído, visto que a sonda frequentemente emite fluorescência de segundo plano quando o sinalizador é desdobrado à temperatura de reação.

[0010] Quarto, é difícil distinguir isoformas de RNAs pequenos como miRNAs. No caso de miRNAs, há muitas isoformas diferentes que têm apenas 1 a 3 nucleotídeos diferentes devido aos seus comprimentos curtos. Por exemplo, sabe-se que isoformas similares de miRNAs, como let-7, miR-18 e miR-30, são difíceis de distinguir.

[0011] Consequentemente, os presentes inventores conduziram estudos para superar as desvantagens descritas acima e para desenvolver um método para detectar rápida e precisamente os RNAs pequenos como miRNA ou siRNA, e como um resultado, constataram que o RNA pequeno em uma quantidade muito pequena de uma amostra pode ser rápida e precisamente detectada hibridizando-se um promer com capacidade de detectar, precisa e rapidamente, um ácido nucleico ou uma proteína, que é um promer descrito no Pedido de Patente Coreano n° 10-20170020238 que reivindica a prioridade da Patente Coreana n° 10-2016-0017359, para RNA pequeno ou cDNA de RNA pequeno e, então, medir a quantidade de fragmentos fluorescentes obtidos clivando-se o interior do ácido nucleico com um reagente de clivagem, completando, assim, a presente invenção.

PROBLEMA DA TÉCNICA

[0012] É um objetivo da presente invenção fornecer um método para detectar o RNA pequeno.

[0013] Outro objetivo da presente invenção é fornecer um método para detectar a proteína associada ao RNA pequeno com o uso de uma reação de amplificação em tempo real.

SOLUÇÃO DA TÉCNICA

[0014] Em um aspecto, a presente invenção fornece um promer que é usado como um iniciador e uma sonda para detecção em tempo real de RNA pequeno ou proteína associada ao RNA pequeno.

[0015] O promer é derivado de um promer descrito no Pedido de Patente Coreano n° 10-2017-0020238, que reivindica a prioridade do Pedido de Patente Coreano n° 10-2016-0017359, e os Pedidos de Patente Coreanos mencionados na presente invenção são incorporados como parte do relatório descritivo.

[0016] Especificamente, na presente invenção, o promer pode ter uma estrutura de X-Y-Z e compreender um ou mais marcadores detectáveis fixados a ambas as extremidades ou ao interior das mesmas. No presente documento, as posições dos marcadores detectáveis fixados não são limitadas a posições particulares e podem ser quaisquer posições em que os marcadores detectáveis são separados quando Y do promer é clivado por uma enzima específica.

[0017] Ademais, o promer pode formar um complexo ligando-se a uma região específica do RNA-alvo pequeno ou proteína associada ao RNA-alvo pequeno a ser detectada em tempo real. Quando a região de Y é clivada por uma enzima específica, as regiões de Y e Z do promer podem ser separadas da região específica do RNA-alvo pequeno ou da proteína associada ao RNA-alvo pequeno, porém, a região de X não é separada e retém o complexo e é usada como um iniciador para amplificação.

[0018] A estrutura de ácido nucleico desenvolvida pelos presentes inventores foi denominada “promer” na presente invenção. Doravante, exceto se especificado de outro modo, o termo “promer” se refere à estrutura de ácido nucleico que pode ser usada tanto como um iniciador quanto como uma sonda.

[0019] O promer da presente invenção tem a estrutura de X-Y-Z e, cada um dentre X, Y e Z pode ter inúmeros nucleotídeos.

[0020] Em um exemplo, a região de X do promer é um DNA ou RNA que consiste em 1 a 60 nucleotídeos, preferencialmente 1 a 30 nucleotídeos, mais preferencialmente 2 a 30 nucleotídeos, ainda mais preferencialmente 3 a 30 nucleotídeos, com ainda mais preferência, 4 a 30 nucleotídeos, com ainda mais preferência, 5 a 30 nucleotídeos, com ainda mais preferência, 6 a 30 nucleotídeos, com ainda mais preferência, 7 a 30 nucleotídeos, com ainda mais preferência 8 a 30 nucleotídeos, com ainda mais preferência 10 a 30 nucleotídeos. Se a região de X do promer compreende mais de 60 nucleotídeos, haverá um problema no sentido de que uma reação não específica ocorre durante a detecção em tempo real de ácido nucleico ou proteína.

[0021] Em um exemplo, a região de Y do promer é um DNA ou RNA que consiste em 1 a 10 nucleotídeos, preferencialmente 1 a 9 nucleotídeos, mais preferencialmente 1 a 8 nucleotídeos, ainda mais preferencialmente, 1 a 7 nucleotídeos, com ainda mais preferência, 1 a 6 nucleotídeos, com ainda mais preferência, 1 a 5 nucleotídeos, com ainda mais preferência, 1 a 4 nucleotídeos, com ainda mais preferência, 1 a 3 nucleotídeos, com ainda mais preferência, 1 a 2 nucleotídeos. Quando a região de Z do promer não compreende nenhuma sequência de nucleotídeos, a região de Y do promer consiste em pelo menos 3 nucleotídeos, preferencialmente 3 a 10 nucleotídeos, mais preferencialmente 3 a 9 nucleotídeos, ainda mais preferencialmente, 3 a 8 nucleotídeos, com ainda mais preferência, 3 a 7 nucleotídeos, com ainda mais preferência, 3 a 6 nucleotídeos, com ainda mais preferência, 3 a 5 nucleotídeos, com ainda mais preferência, 3 a 4 nucleotídeos.

[0022] Quando a região de Z do promer compreende uma sequência de nucleotídeos, a região de Y do promer consiste em pelo menos 2 nucleotídeos, preferencialmente 2 a 10 nucleotídeos, mais preferencialmente 2 a 9 nucleotídeos, ainda mais preferencialmente, 2 a 8 nucleotídeos, com ainda mais preferência, 2 a 7 nucleotídeos, com ainda mais preferência, 2 a 6 nucleotídeos, com ainda mais preferência, 2 a 5 nucleotídeos, com ainda mais preferência, 2 a 4 nucleotídeos, com ainda mais preferência 2 a 3 nucleotídeos. Se o número de nucleotídeos que formam a região de Y do promer estiver fora da faixa descrita acima, haverá um problema no sentido de que uma reação não específica ocorre durante a detecção em tempo real de ácido nucleico ou proteína para reduzir a sensibilidade.

[0023] Em um exemplo, a região de Z do promer é um DNA ou RNA que consiste em 0 a 10 nucleotídeos, preferencialmente 1 a 10 nucleotídeos, mais preferencialmente 2 a 10 nucleotídeos. Se o número de nucleotídeos que formam a região de Z estiver fora da faixa descrita acima, haverá um problema no sentido de que a região de Z ligada ao ácido nucleico-alvo ou proteína-alvo não é separada do ácido nucleico-alvo ou proteína-alvo após a clivagem da região de Y e, portanto, o ácido nucleico ou a proteína não pode ser detectada.

[0024] Nesse momento, quando qualquer um dentre X, Y e Z do promer for DNA, um ou mais dentre os outros dois são RNA. Preferencialmente, X, Y e Z são DNA, RNA e DNA, respectivamente, ou RNA, DNA e RNA, respectivamente.

[0025] Em um exemplo específico, quando a região de X é DNA, qualquer um dentre Y e Z é RNA. Por exemplo, Y é RNA e Z é DNA. Alternativamente, Y é DNA e Z é RNA. No presente documento, o número de DNA e RNA pode ser mais do que 0, e é como definido acima para X, Y e Z.

[0026] Em outro exemplo específico, quando X é RNA, qualquer um dentre Y e Z é RNA. Por exemplo, Y é RNA e Z é DNA. Alternativamente, Y é DNA e Z é RNA. No presente documento, o número de DNA e RNA pode ser mais do que 0, e é como definido acima para X, Y e Z.

[0027] Em ainda outro exemplo específico, quando Z é nulo, qualquer um dentre X e Y é DNA, e o outro é RNA. No presente documento, o número de DNA e RNA pode ser mais do que 1, e é como definido acima para X e Y.

[0028] Ademais, X, Y e Z do promer pode, ser sintetizados de modo que sejam total ou parcialmente metilados para impedir a clivagem não específica.

[0029] Na presente invenção, o termo “ácido nucleico” se refere a DNA ou RNA a ser detectado em tempo real em uma amostra.

[0030] Na presente invenção, o marcador detectável pode ser uma identificação fluorescente que se liga ao promer por ligação covalente ou ligação não covalente, ou um par fluorescente da identificação fluorescente e um supressor.

[0031] A identificação fluorescente pode ser, por exemplo, qualquer uma selecionada a partir do grupo que consiste em Cy3, Cy5, Cy5.5, Bodipy, Alexa 488, Alexa 532, Alexa 546, Alexa 568, Alexa 594, Alexa 660, rodamina, TAMRA, FAM, FITC, Flúor X, ROX, Vermelho Texas, ORNAge verde 488X, ORNAge verde 514X, HEX, TET, JOE, Oyster 556, Oyster 645, Bodipy 630/650, Bodipy 650/665, Calfluor ORNAge 546, Calfluor vermelho 610, Quasar 670 e biotina, porém, não é necessariamente limitado à mesma. Ademais, o supressor pode ser, por exemplo, qualquer um selecionado a partir do grupo que consiste em DDQ-1, Dabcila, Eclipase, 6-TAMRA, BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3, Preto lowa RQ-Sp, QSY-7, QSY-2 e MGBNFQ, mas não é necessariamente limitado aos mesmos.

[0032] Quando um par fluorescente é usado como o marcador detectável na presente invenção, a identificação fluorescente e o supressor podem ser localizados no X ou na região de Z ou localizados na região de Y, e a localização dos mesmos não é limitada a qualquer localização. Em um exemplo, a identificação fluorescente pode ser localizada na região de X, e o supressor pode ser localizado na região de Y ou de Z.

[0033] O promer da presente invenção pode ser usado na detecção de RNA pequeno ou de proteína associada ao RNA pequeno. Especificamente, o mesmo pode ser usado como: i) um iniciador de RT para sintetizar cDNA a partir de RNA pequeno; ii) um iniciador direto para amplificar o cDNA sintetizado a partir de RNA pequeno; iii) um iniciador inverso para amplificar o cDNA sintetizado a partir do RNA pequeno; iv) um iniciador direto e um iniciador inverso para amplificar o cDNA sintetizado a partir do RNA pequeno; ou v) uma sonda para detecção em tempo real de um RNA pequeno a ser detectado, ou uma proteína associada ao mesmo.

[0034] Nesse conjunto de modalidades, o promer da presente invenção pode detectar mais precisamente o RNA pequeno ou a proteína associada ao RNA pequeno do que uma sonda que é degradada por DNA polimerase convencional, visto que a região de Y do promer é clivada por uma enzima que cliva a região de Y do promer e, então, as regiões de Y e Z são separadas, e a região de X pode manter um complexo com um RNA-alvo pequeno ou uma proteína associada ao mesmo e pode ser usado como um iniciador para sintetizar e amplificar o RNA pequeno e apenas a região de Y do promer é clivada pela enzima que cliva a região de Y do promer.

[0035] Em particular, quando um fluoróforo ou um supressor é ligado à extremidade 3’ da região de Y ou Z do promer da presente invenção, os erros causados por amplificação não específica podem ser reduzidos, visto que o ácido nucleico-alvo ou o ácido nucleico específico da proteína-alvo pode ser prevenido de ser amplificado por polimerase, desde que a região de Y do promer não seja clivada.

[0036] Consequentemente, quando o promer da presente invenção é usado para detectar o RNA pequeno ou a proteína associada ao RNA pequeno, o tempo e o custo de análise podem ser reduzidos, e o RNA pequeno ou a proteína associada ao RNA pequeno a ser detectado pode ser mais precisa e especificamente detectada em comparação com um método convencional. Portanto, o promer da presente invenção pode ser usado como um kit para detecção em tempo real de RNA pequeno ou proteína associada ao RNA pequeno.

[0037] Onde o promer da presente invenção é usado como um kit para detecção em tempo real de RNA pequeno ou proteína associada ao RNA pequeno, o kit preferencialmente compreende adicionalmente, além do promer da presente invenção, uma enzima com capacidade de clivar a região de Y do promer.

[0038] Na presente invenção, a enzima com capacidade de clivar a região de Y do promer pode ser qualquer enzima com capacidade de clivar especificamente a região de Y do promer. Por exemplo, quando a região de Y é DNA, a enzima com capacidade de clivar a região de Y é preferencialmente DNA nuclease (DNase), especificamente DNase I, DNase II, S1 nuclease, nuclease P1, AP endonuclease ou UvrABC nuclease. Quando a região de Y é RNA, a enzima com capacidade de clivar a região de Y é preferencialmente ribonuclease (RNase), especificamente RNase II, RNase III, RNase IV, RNase H, ou RNase T2.

[0039] Onde o promer da presente invenção é usado como um kit para detecção em tempo real de RNA pequeno ou proteína associada ao RNA pequeno, o kit pode compreender adicionalmente, além do promer da presente invenção e da enzima com capacidade de clivar a região de Y do promer, reagentes necessários para a amplificação de DNA.

[0040] Os reagentes necessários para a amplificação incluem, por exemplo, quantidades adequadas de DNA polimerase (por exemplo, DNA polimerase termoestável derivada de Thermus aquatiucs (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis ou Phyrococcus furiosis (Pfu)), cofator de DNA polimerase (Mg2+), tampão, dNTPs (dATP, dCTP, dGTP e dTTP) e água (dH2O). Além disso, o tampão inclui, porém, sem limitações, quantidades adequadas de Triton X-100, dimetilsulfóxido (DMSO), Tween 20, nonidet P40, PEG 6000, formamida e albumina do soro bovino (BSA).

[0041] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para detectar o RNA pequeno.

[0042] Doravante, cada etapa do método para detectar o RNA pequeno de acordo com a presente invenção será descrita em detalhes.

[0043] A etapa (a) é uma etapa para obter o ácido nucleico-modelo a partir da amostra biológica.

[0044] Na presente invenção, o ácido nucleico-modelo se refere a um RNA que inclui um RNA pequeno a ser detectado em uma amostra biológica. O RNA pequeno é expressado para produzir uma proteína ou produção de proteína de controle em uma situação em que o fenômeno de vida do corpo vivo precisa ser mantido ou controlado.

[0045] A amostra biológica pode ser selecionada dentre vários tipos de amostras obtidas a partir de um indivíduo, especificamente, amostras de tecido sólido, amostras de tecido líquido, líquidos biológicos, aspirações bronquiais, células e fragmentos celulares. Os exemplos específicos da amostra biológica incluem, porém, sem limitações, amostras de tecido sólido removidas de um indivíduo durante uma cirurgia, amostras patológicas, amostras preservadas, amostras de biópsia, culturas de tecido ou células derivadas das mesmas e fragmentos preparados a partir da progênie das mesmas.

[0046] A amostra biológica armazenada pode ser uma armazenada por qualquer método convencional conhecido na técnica. A amostra pode ser uma armazenada por mais de 1 semana ou mais de um 1 ano, por exemplo, 1 a 10 anos.

[0047] Alternativamente, a amostra pode ser uma derivada de tecido armazenado em congelamento ou a partir de tecido fixo por formalina armazenado à temperatura ambiente.

[0048] Na presente invenção, a extração de RNA da amostra pode ser realizada com o uso de vários métodos conhecidos na técnica. Em um exemplo, pode ser realizada com o uso de trizol ou Triton X-100.

[0049] A etapa (b) é uma etapa de sintetização de cDNA a partir de RNA pequeno.

[0050] Especificamente, a etapa (b) no método da presente invenção é uma etapa de adicionar um iniciador de RT ao RNA pequeno, extraído na etapa (a), para sintetizar o cDNA.

[0051] Na presente invenção, o iniciador de RT é um ácido nucleico, que pode se ligar, de modo complementar, a uma porção da sequência de nucleotídeos do RNA a ser detectado. No presente documento, o iniciador de RT pode ser um iniciador de RT geralmente conhecido na técnica, ou o promer da presente invenção.

[0052] A etapa (c) é uma etapa de amplificar o cDNA.

[0053] Especificamente, a etapa (c) do método da presente invenção é uma etapa de adicionar o promer ou um kit que compreende o promer da presente invenção, e/ou um iniciador direto ou iniciador inverso que tem uma sequência de nucleotídeos complementar ao cDNA, ao cDNA sintetizado na etapa (b), e amplificar o cDNA por extensão.

[0054] O kit que compreende o promer se refere a um kit que compreende o promer da presente invenção e uma enzima com capacidade de clivar a região de Y do promer.

[0055] A enzima com capacidade de clivar a região de Y do promer pode ser qualquer enzima com capacidade de clivar especificamente a região de Y do promer.

[0056] Por exemplo, quando a região de Y é DNA, a enzima com capacidade de clivar a região de Y é preferencialmente DNA nuclease (DNase), especificamente DNase I, DNase II, S1 nuclease, nuclease P1, AP endonuclease ou UvrABSC nuclease. Quando a região de Y é RNA, a enzima com capacidade de clivar a região de Y é preferencialmente ribonuclease (RNase), especificamente RNase II, RNase III, RNase IV, RNase H, ou RNase T2.

[0057] Na presente invenção, o promer compreende uma sequência de nucleotídeos que pode se ligar, de modo complementar a uma porção da sequência de nucleotídeos do cDNA sintetizado na etapa (b). Para amplificar o cDNA, o promer pode ser usado como: i) um iniciador direto e uma sonda; ou ii) um iniciador inverso ou uma sonda; ou iii) um iniciador direto, um iniciador inverso e uma sonda. Ademais, o promer da presente invenção tem uma estrutura de X-Y-Z e compreende um ou mais marcadores detectáveis fixados a ambas as extremidades ou ao interior da mesma. Quando a região de Y do promer é clivada por uma enzima específica, as regiões de Y e Z são separadas do modelo e a região de X serve como um iniciador sem separação do modelo. A estrutura de tal promer é como descrito acima.

[0058] O marcador detectável acima pode ser uma identificação fluorescente que se liga ao promer por ligação covalente ou ligação não covalente, ou um par fluorescente da identificação fluorescente e um supressor.

[0059] A identificação fluorescente pode ser, por exemplo, qualquer uma selecionada a partir do grupo que consiste em Cy3, Cy5, Cy5.5, Bodipy, Alexa 488, Alexa 532, Alexa 546, Alexa 568, Alexa 594, Alexa 660, rodamina, TAMRA, FAM, FITC, Flúor X, ROX, Vermelho Texas, ORNAge verde 488X, ORNAge verde 514X, HEX, TET, JOE, Oyster 556, Oyster 645, Bodipy 630/650, Bodipy 650/665, Calfluor ORNAge 546, Calfluor vermelho 610, Quasar 670 e biotina, porém, não é necessariamente limitado à mesma. Ademais, o supressor pode ser, por exemplo, qualquer um selecionado a partir do grupo que consiste em DDQ-1, Dabcila, Eclipase, 6-TAMRA, BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3, Preto lowa RQ-Sp, QSY-7, QSY-2 e MGBNFQ, mas não é necessariamente limitado aos mesmos.

[0060] Em um exemplo específico, em que o promer da presente invenção deve ser usado como um iniciador direto e uma sonda ou como um iniciador inverso e uma sonda, o promer pode compreender uma sequência de nucleotídeos com capacidade de se ligar de modo complementar a uma porção da sequência de nucleotídeos do cDNA sintetizado na etapa (b).

[0061] Em outro exemplo específico, em que o promer da presente invenção é usado como um iniciador direto e uma sonda ou como um iniciador inverso ou uma sonda, um iniciador inverso ou iniciador direto separado pode ser usado além do promer. No presente documento, o iniciador inverso ou iniciador direto separado é um DNA que pode se ligar de modo complementar ao cDNA sintetizado na etapa (b) e que compreende 5 a 30 nucleotídeos, preferencialmente 10 a 30 nucleotídeos. No presente documento, o iniciador inverso pode ser igual ao iniciador de RT usado na etapa (b).

[0062] Em ainda outro exemplo específico, em que o promer da presente invenção é usado como um iniciador direto, um iniciador inverso e uma sonda, o promer que é usado como o iniciador inverso pode ser igual ao promer usado na etapa (b), e os marcadores detectáveis fixados a ambas as extremidades ou ao interior do promer podem ser iguais ou diferentes daqueles do promer usado na etapa b).

[0063] Na presente invenção, a amplificação do cDNA é realizada a uma temperatura isotérmica, em que o cDNA é recozido com (A) o promer da presente invenção, que é usado como um iniciador direto e uma sonda ou como um iniciador inverso e uma sonda, e um iniciador direto ou iniciador inverso, que é geralmente usado na técnica, ou (B) o promer da presente invenção, que é usado como um iniciador direto, um iniciador inverso e uma sonda, e em que a atividade da enzima usada não é substancialmente inibida. Como usado no presente documento, o termo “temperatura isotérmica” significa que não há ciclagem térmica, e o termo não significa necessariamente temperatura equivalente de modo físico.

[0064] Em um exemplo específico, a temperatura isotérmica em que a amplificação na presente invenção é realizada pode ser 40 °C a 80 °C, preferencialmente 55 °C a 75 °C, mais preferencialmente 60 °C a 75 °C.

[0065] Na presente invenção, a amplificação do cDNA pode ser realizada por um método selecionado a partir do grupo que consiste em reação em cadeia da polimerase, amplificação de círculo de rolamento, amplificação de deslocamento de filamento e amplificação com base em sequência de ácidos nucleicos, porém, não é necessariamente limitada ao mesmo.

[0066] Na presente invenção, a amplificação do cDNA pode ser realizada com o uso de reagentes necessários para a amplificação, além de um kit que compreende o promer da presente invenção. Os reagentes necessários para a amplificação podem incluir, por exemplo, quantidades adequadas de DNA polimerase (por exemplo, DNA polimerase termoestável derivada de Thermus aquatiucs (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis ou Phyrococcus furiosis (Pfu)), cofator de DNA polimerase (Mg2+), tampão, dNTPs (dATP, dCTP, dGTP e dTTP) e água (dH2O). Além disso, o tampão pode incluir, porém, sem limitações, quantidades adequadas de Triton X-100, dimetilsulfóxido (DMSO), Tween 20, nonidet P40, PEG 6000, formamida e albumina do soro bovino (BSA).

[0067] A etapa (d) é uma etapa de medir a quantidade de fragmentos do iniciador clivado pela enzima com capacidade de clivar a região de Y do promer.

[0068] Na presente invenção, a medição da quantidade de fragmentos do promer pode ser realizada com o uso de vários métodos de detecção. Especificamente, a quantidade de fragmentos do promer clivado de acordo com a presente invenção é preferencialmente medida após a conclusão da RT-PCR ou amplificação, e pode ser determinada medindo-se uma alteração na intensidade de fluorescência ou medindose a quimioluminescência.

[0069] A medição da alteração na intensidade de fluorescência ou quimioluminescência pode ser realizada com o uso de qualquer sistema de medição com capacidade de detectar uma identificação fluorescente, conhecido na técnica.

[0070] Por exemplo, a medição pode ser realizada com o uso de uma máquina de PCR em tempo real, um detector de múltiplos modos de TRIAD, um leitor de placa de fluorescência de Wallac/Victor, um espectrômetro de luminescência Perkin-Elmer LB50B, LightCycler 96, Applied Biosystems 7500 ou termociclador de PCR em tempo real Biorad CFX96, porém, sem limitações.

[0071] O método para medição e detecção da quantidade de fragmentos do promer clivado de acordo com a presente invenção pode variar dependendo do tipo de identificação ou marcador detectável introduzido no promer ou uma solução de reação.

[0072] Por exemplo, em que o promer, em que uma identificação fluorescente é fixada à extremidade da região de X e um supressor é fixado à extremidade da região de Z, hibridizado com o RNA-alvo pequeno ou cDNA, a fluorescência da identificação fluorescente fixada à extremidade da região de X é amplamente reduzida pelo supressor fixado à extremidade da região de Z antes que as regiões de Y e Z sejam clivadas pela enzima com capacidade de clivar a região de Y.

[0073] Entretanto, quando a região de X não é separada pela enzima com capacidade de clivar a região de Y, e apenas as regiões de Y e Z são separadas do RNA-alvo pequeno ou cDNA e dispersadas nas solução de reação, a fluorescência da identificação fluorescente fixada à extremidade da região de X é aumentada sem ser afetada pelo supressor fixado à extremidade da região de Z. Nesse momento, é possível detectar o RNA-alvo pequeno ou cDNA em tempo real medindo-se a emissão de fluorescência aumentada da identificação fluorescente fixada à extremidade da região de X com o uso do aparelho descrito acima.

[0074] Em um exemplo específico, o cDNA foi sintetizado com o uso de um iniciador de RT que se liga de modo complementar ao RNA pequeno e, então, o cDNA foi amplificado com o uso do promer da presente invenção, que, de modo complementar, se liga ao cDNA e tem FAM fixado ao mesmo, como um iniciador direto ou um iniciador inverso. Como um resultado, foi mostrado que uma curva de amplificação apareceu durante a amplificação do cDNA, diferente do caso de um cDNA amplificado com o uso de um iniciador direto convencional ao qual um marcador detectável não foi fixado.

[0075] O método para detectar o RNA pequeno de acordo com a presente invenção possibilita amplificar precisamente um RNA pequeno, visto que usa o ácido nucleico que tem a estrutura X-Y-Z tanto como uma sonda quanto como um iniciador, diferente de um método convencional que usa agentes de ligação de dsDNA tipo intercalador, como uma sonda tipo Taqman, uma sonda de MGB ou Verde Sybr.

[0076] Além disso, o mesmo tem uma vantagem no sentido de que pode detectar precisamente o RNA pequeno em uma quantidade muito pequena de uma amostra em comparação com uma técnica convencional, na qual a quantidade de sonda degradada por DNA polimerase é medida enquanto o ácido nucleico-modelo é amplificado.

[0077] Em um exemplo específico, o método para detectar o RNA pequeno de acordo com a presente invenção foi usado para analisar o miRNA humano e, como um resultado, a análise precisa foi possível mesmo quando a concentração do miRNA foi diluída 1/10.000 vezes (consultar os Exemplos 1 e 2).

[0078] Em outro exemplo específico, o método para detectar o RNA pequeno de acordo com a presente invenção foi usado para a análise em tempo real de miRNA de let-7 e, como um resultado, o miRNA de let-7 pode ser analisado de uma maneira estável, rápida e precisa, mesmo quando miRNA de let-7 está presente em quantidades muito pequenas, por exemplo, a uma concentração de 1 aM (consultar os Exemplos 3 e 4).

[0079] Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece um método para detectar uma molécula de proteína associada ao RNA pequeno com o uso do ácido nucleico.

[0080] Especificamente, a presente invenção fornece um método para detectar uma molécula de proteína associada ao RNA pequeno caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a) produzir um anticorpo que tem, fixado ao mesmo, um ácido nucleico que tem uma sequência de nucleotídeos complementar a um promer que tem a estrutura X-Y-Z; b) combinar o anticorpo produzido na etapa a) com uma proteína associada ao RNA pequeno obtida a partir de uma amostra biológica, formando, assim, um complexo de proteína-anticorpo; c) hibridizar o promer que tem a estrutura X-Y-Z ao complexo, formando, assim, um complexo proteína-anticorpo- promer; e d) tratar o complexo proteína-anticorpo-promer com um reagente de clivagem, separando, assim, um fragmento do promer do anticorpo e, então, medindo a quantidade do fragmento de promer separado, detectando, assim, a proteína associada ao RNA pequeno.

[0081] Doravante, cada etapa do método para detectar uma molécula de proteína associada ao RNA pequeno de acordo com a presente invenção será descrita em detalhes.

[0082] A etapa a) é uma etapa de produzir um anticorpo que tem fixado ao mesmo, um ácido nucleico que tem uma sequência de nucleotídeos complementar a um promer que tem a estrutura X-Y-Z.

[0083] Na presente invenção, a estrutura, os recursos e similares do promer que tem a estrutura X-Y-Z são como descrito acima e, portanto, a descrição detalhada do mesmo será omitida abaixo.

[0084] Na presente invenção, o ácido nucleico que tem a sequência complementar ao promer que tem a estrutura X-Y-Z é sintetizada com o uso da sequência de nucleotídeos do promer que tem a estrutura X-Y-Z através de uma reação de amplificação que é geralmente usada na técnica.

[0085] Na presente invenção, o anticorpo que tem, fixado ao mesmo, o ácido nucleico que tem a sequência de nucleotídeos complementar ao promer que tem a estrutura X-Y-Z, tem uma estrutura na qual o ácido nucleico que tem a sequência de nucleotídeos complementar ao promer que tem a estrutura X-Y-Z é conectado à região de Fc do anticorpo por meio de um ligante. No presente documento, o ligante é geralmente um DNA que consiste em 1 a 10 nucleotídeos.

[0086] Para conectar ao ácido nucleico que tem a sequência de nucleotídeos complementar ao promer que tem a estrutura X-Y-Z ao anticorpo, dois métodos podem ser geralmente usados. No primeiro método, um DNA que tem uma 5’ extremidade modificada por tiol é ligado aos grupos amino livres do anticorpo através do uso de um reagente selecionado a partir do grupo que consiste em succinimidil-4- (N-maleimidometil)ciclo-hexano-1-carboxilato (SMMCC), Sulfo-succinimidil-4-(N- maleimidometil)ciclo-hexano-1-carboxilato (Sulfo-SMCC), n-succinimidil-3-(2- piridiltio)pripionato (SPDP), N-succinimidil-6-(3'-(2-piridilditio)- propionamido)hexanoato (NHS-Ic-SPDP) e sulfo-succinimidil-6-(3'-(2-piridilditio)- propiona-amido)hexanoato (Sulfo-NHS-Ic-SPDP). Tais reagentes têm diferentes comprimentos de espaçador e solubilidades em água. Se for necessário, para uma operação adicional, a região de ligação pode ser clivada com o uso de um reagente de tiolação que libera DNA.

[0087] No segundo método, uma região de ligação é fornecida entre o anticorpo e DNA pela proteína tetramérica, estreptavidina, em que a proteína forma suficientemente uma ligação irreversível com biotina. Os grupos amino livres do anticorpo são identificados com biotina através da reação com biotina-N- hidroxissuccinimida. A biotinilação do DNA pode ser realizada pelo uso de fosforamidita de 5'-biotina ou a reação de biotina-n-hidroxissuccinimida após um grupo amino na 5’-extremidade. Um conjugado de DNA, estreptavidina e o anticorpo podem ser preparados adicionando-se 1 molar equivalente de um conjugado de DNA-estreptavidina.

[0088] De acordo com o método descrito acima, o anticorpo que tem, fixado ao mesmo, o ácido nucleico, pode reagir a 4 °C por 1 hora, seguido pela purificação com uma coluna de gel de Superdex 200, obtendo, assim, um conjugado de anticorpo-ácido nucleico.

[0089] O anticorpo preparado de acordo com a presente invenção pode reconhecer especificamente a proteína a ser detectada, enquanto o promer da presente invenção pode se hibridizar ao anticorpo. Portanto, o anticorpo pode ser facilmente usado para a detecção em tempo real da proteína a ser detectada.

[0090] A etapa b) é uma etapa de fixar o anticorpo produzido na etapa a) a uma molécula de proteína associada ao RNA pequeno obtida a partir de uma amostra biológica, formando, assim, um complexo de proteína-anticorpo.

[0091] Na presente invenção, a proteína associada ao RNA pequeno pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em anticorpos, aglutinantes, compostos naturais, extratos, peptídeos sintéticos e novos candidatos a fármacos, porém, sem limitações.

[0092] Na presente invenção, a combinação da proteína associada ao RNA pequeno com o anticorpo pode ser alcançada misturando-se a proteína-alvo como o anticorpo produzido na etapa a).

[0093] A etapa c) é uma etapa de hibridizar o promer que tem a estrutura X-Y-Z ao complexo de proteína-anticorpo, formando, assim, um complexo proteína-anticorpo- promer.

[0094] Na presente invenção, a hibridização do promer ao complexo de proteína- anticorpo pode ser alcançada adicionando-se o promer ao complexo de proteína- anticorpo.

[0095] A etapa d) é uma etapa de tratar o complexo proteína-anticorpo-promer com um reagente de clivagem, separando, assim, um fragmento do promer do anticorpo e, então, medindo a quantidade do fragmento de promer separado, detectando, assim, a proteína associada ao RNA pequeno.

[0096] Na presente invenção, o reagente de clivagem usado pode ser qualquer reagente que tem capacidade de clivar especificamente apenas a região de Y do promer por uma enzima. Por exemplo, o reagente de clivagem usado pode ser um selecionado a partir do grupo que consiste em desoxirribonuclease (DNase), ribonuclease (RNase), helicase, exonuclease e endonuclease. Preferencialmente, o mesmo pode ser ribonuclease (RNase).

[0097] Na presente invenção, a medição da quantidade do promer pode ser realizada com o uso de vários métodos de detecção. Especificamente, a quantidade de fragmento de promer separado de acordo com o método da presente invenção é preferencialmente medida após a conclusão da amplificação ou reação em tempo real, e pode ser determinada medindo-se uma alteração na intensidade de fluorescência ou na quimioluminescência.

[0098] A medição de uma alteração na intensidade de fluorescência ou a medição de quimioluminescência pode ser realizada com o uso de qualquer dispositivo de medição conhecido na técnica, que pode detectar uma identificação fluorescente. Por exemplo, pode ser realizada com o uso de um detector de múltiplos modos de TRIAD, um leitor de fluorescência de Wallac/Victor, um espectrômetro de luminescência Perkin-Elmer LB50B, ou similares, porém, sem limitações.

[0099] A medição da quantidade do promer separado e o método de detecção conforme descrito acima podem variar amplamente dependendo do tipo de identificação ou marcador de detecção introduzido no promer ou na solução de reação.

[00100] O método para detectar a proteína-alvo de acordo com a presente invenção tem uma vantagem no sentido de que a taxa de detecção e a precisão da proteína associada ao RNA pequeno a ser detectado podem ser aumentadas com o uso do promer que tem a estrutura X-Y-Z e o anticorpo que tem a sequência complementar ao promer que tem a estrutura X-Y-Z.

EFEITOS VANTAJOSOS

[00101] Para analisar o RNA pequeno de acordo com uma técnica convencional, a detecção é realizada dependendo de um oligo opcionalmente estendido sintetizando- se o cDNA com o uso do oligo estendido. Entretanto, o promer que tem a estrutura X-Y-Z de acordo com a presente invenção possibilita amplificar e detectar precisamente o RNA pequeno sem depender de uma sequência de oligos opcionalmente estendida. Isso pode impedir que uma amplificação e uma detecção errôneas sejam causadas pelo método que realiza a detecção dependente da sequência opcionalmente estendida. Além disso, o promer é clivado apenas por um reagente de clivagem e, portanto, tem uma vantagem no sentido de que pode medir mais precisamente a quantidade do promer a ser detectado, em comparação com uma sonda convencional que é degradada pela DNA polimerase.

[00102] Portanto, o método para detectar o RNA pequeno ou a proteína associada ao RNA pequeno com o uso do promer que tem a estrutura X-Y-Z de acordo com a presente invenção pode detectar rápida e precisamente o RNA pequeno ou a proteína associada ao RNA pequeno, e pode ser vantajosamente usada para diagnósticos de várias doenças e previsão de prognóstico.

[00103] DESCRIÇÃO DOS DESENHOS Figura 1 é uma vista esquemática que mostra um método que usa uma sonda tipo TaqMan e um iniciador tipo haste-alça e um método que usa um iniciador adaptador de oligo-dT e adição de cauda de poli-A, dentre métodos convencionais que são usados para detectar o RNA pequeno; Figura 2 é uma vista esquemática que mostra um método no qual o cDNA é sintetizado com o uso de um iniciador de oligo dT alongado após a adição de caudas de poli-(A) de miRNA e o RNA pequeno é detectado com o uso de um promer de acordo com a presente invenção; Figura 3 é uma vista esquemática que mostra um método no qual o miRNA é detectado com o uso de um promer de acordo com a presente invenção após sintetizar o cDNA com o uso de um iniciador de RT sem adição de caudas de poli-(A) do miRNA; Figura 4 é um gráfico que mostra os resultados de observar a expressão do gene de miRNA-21 com o uso de um promer de acordo com a presente invenção; Figura 5 é um gráfico que mostra os resultados de observar a expressão do gene de miRNA-155 com o uso de um promer de acordo com a presente invenção; Figura 6 mostra os resultados de observar a expressão de cDNA de miRNA- 21 com o uso de um promer de acordo com a presente invenção após diluir o cDNA de miRNA-21 a várias concentrações; Figura 7 mostra os resultados de observar a expressão de cDNA de miRNA- 155 com o uso de um promer de acordo com a presente invenção após diluir o cDNA de miRNA-21 a várias concentrações; Figura 8 é um gráfico que mostra os resultados de observar a expressão do gene de miRNA de let-7a com o uso de um promer de acordo com a presente invenção; Figura 9 é um gráfico que mostra os resultados de observar a expressão do gene de miRNA de let-7d com o uso de um promer de acordo com a presente invenção; Figura 10 mostra os resultados de observar a expressão de cDNA de miRNA de let-7a com o uso de um promer de acordo com a presente invenção após diluir o cDNA de miRNA de let-7a a várias concentrações na presença de 1 pM let-7d. MELHOR MODO

[00104] Doravante, a presente invenção será descrita em detalhes com referência aos exemplos. Ficará evidente àqueles versados na técnica que esses exemplos são meramente destinados a explicar a presente invenção em maiores detalhes e o escopo da presente invenção de acordo com a essência da presente invenção não é limitado por esses exemplos.

EXEMPLO 1: ANÁLISE DE MIRNA HUMANO COM O USO DO PROMER DE ACORDO COM A PRESENTE INVENÇÃO

[00105] Para medir a expressão do gene de miRNA-21 (5' - uag cuu auc aga cug aug uug a) e gene de miRNA-155 (5' - uua aug cua auc gug aua ggg gu), os promers de acordo com a presente invenção, iniciadores e iniciadores de RT foram sintetizados por Tecnologias de DNA Integradas (IDT, EUA) (consultar a Tabela 1). No presente documento, os promers de acordo com a presente invenção tinham FAM (éster de succinimidila de fluoresceína) fixados à extremidade 5’ e 3IABkFG fixada à extremidade 3’ e ribonucleotídeos (RNA) foram indicados pelo "r" subscrito em frente às sequências para distinguir os mesmos de desoxirribonucleotídeos (DNA).TABELA 1:

[00106] Com o uso de um kit de purificação de miRNA exossomal (Genolution Co., Ltd.), 11,9 ng/μl de miRNA foram extraídos de 200 μl de soro de sangue normal. Cada um dentre 1 μl, 0,1 μl e 0,01 μl do miRNA extraído pôde reagir a 45 °C na presença de 1 μl de 10 μM de cada iniciador de RT (mostrado na Tabela 1 acima) em um kit de adição de caudas de poli-(A) (Ambion) e um kit de RT de Nxtscript (total 20 μl, Roche), sintetizando, assim, os cDNAs. Na presença de 0,5 μl de cada um dentre 10 μM de promer e 10 μM de iniciador como mostrado na Tabela 1 acima, 1 μl de cada um dentre os cDNAs sintetizados, unidades de 10 M de RNase H resistente ao calor e 4 μl de AptaTaq DNA Master (fabricado junto à Roche) foram adicionados e o volume total foi ajustado a 20 μl com água triplamente destilada, em que, em seguida, uma reação em cadeia da polimerase (PCR) foi realizada. Nesse momento, a reação tipo PCR foi realizada mediante as seguintes condições: 5 min a 95 °C e, então, 45 ciclos, em que cada um consiste em 60 s a 63 a 64 °C e 10 a 95 °C. Os resultados são mostrados nas Figuras 4 e 5.

[00107] Como um resultado, foi confirmado que é possível realizar uma análise estável com o uso de apenas uma quantidade muito pequena (5,95 pg) de miRNA total, que corresponde a 1/20 de cDNA sintetizado com o uso de apenas 119 pg de miRNA total.

EXEMPLO 2: ANÁLISE DE MIRNA HUMANO COM O USO DO PROMER DE ACORDO COM A PRESENTE INVENÇÃO

[00108] O cDNA sintetizado de 1 μl de 11,9 ng/μl de miRNA no Exemplo 1 foi diluído 1/10 vezes, 1/100 vezes, 1/1.000 vezes, 1/10.000 vezes e 1/100.000 vezes.

[00109] Na presença de 0,5 μl de cada um dentre 10 μM de promer e 10 μM de iniciador como mostrado na Tabela 1 acima, 1 μl de cada um dentre os cDNAs diluídos, unidades de 10 M de RNase H resistente ao calor e 4 μl de AptaTaq DNA Master (fabricado junto à Roche) foram adicionados e o volume total foi ajustado a 20 μl com água triplamente destilada, em que, em seguida, uma reação em cadeia da polimerase (PCR) foi realizada. Nesse momento, a reação tipo PCR foi realizada mediante as seguintes condições: 5 min a 95 °C e, então, 55 ciclos, em que cada um consiste em 60 s a 63 a 64 °C e 10 a 95 °C. Os resultados são mostrados em 6 e 7.

[00110] Como um resultado, a curva de amplificação foi plotada para o cDNA diluído até 1/1.000, e a curva de amplificação não apareceu no cDNA adicionalmente diluído. Isso indica que não houve amplificação não específica em uma quantidade muito pequena do alvo, sugerindo que seria possível analisar menos do que 10 cópias de um miRNA particular com o uso de apenas uma quantidade muito pequena de miRNA.

EXEMPLO 3: ANÁLISE EM TEMPO REAL DE MIRNA DE LET-7 COM O USO DE PROMER DE ACORDO COM A PRESENTE INVENÇÃO

[00111] Os miRNAs de let-7 são conhecidos por terem o meio número de isoformas dentre os miRNAs. Sabe-se que distinguir essas isoformas de let-7 é uma análise muito difícil, e se sabe, de modo geral, que a distinção de uma especificidade menor do que 1% é particularmente difícil. Nesse Exemplo, para medir a expressão do gene de let-7a (5' - uga ggu agu agg uug uau agu u) e o gene de let-7d (5' - aga ggu agu agg uug cau agu u), que são as mais difíceis dentre essas isoformas, os promers de acordo com a presente invenção, os iniciadores e os iniciadores de RT foram preparados por Tecnologias de DNA Integradas (IDT, EUA) como mostrado na Tabela 2 abaixo (consultar a Tabela 2). Além disso, para quantificação precisa, os miRNAs de let-7 foram preparados por IDT. No presente documento, os promers tinham FAM (éster de succinimidila de fluoresceína) fixados à extremidade 5’ e 3IABkFG fixada à extremidade 3’ e ribonucleotídeos (RNA) foram indicados pelo "r" subscrito em frente às sequências para distinguir os mesmos de desoxirribonucleotídeos (DNA).TABELA 2

[00112] Com o uso de 1 μl de 20 pM, cada miRNA sintetizado, um kit de adição de caudas de poli-(A) (Ambion) e um kit de RT de Nxtscript (Roche) (total de 20 μl), uma reação foi realizada a 45 °C por 30 minutos na presença de 1 μl de 10 μM de cada iniciador de RT mostrado na Tabela 2 acima, sintetizando, assim, cDNAs.

[00113] Os cDNAs sintetizados foram diluídos a partir de uma concentração de 100 fM a uma concentração de 1 aM.

[00114] Na presença de 0,5 μl de cada um dentre 10 μM de promer e 10 μM de iniciador como mostrado na Tabela 2 acima, 2 μl de cada um dentre os cDNAs sintetizados e diluídos, unidades de 10 M de RNase H resistente ao calor e 4 μl de AptaTaq DNA Master (produzido junto à Roche) foram adicionados e o volume total foi ajustado a 20 μl com água triplamente destilada, em que, em seguida, uma reação em cadeia da polimerase (PCR) foi realizada. Nesse momento, a reação tipo PCR foi realizada mediante as seguintes condições: 5 min a 95 °C e, então, 45 ciclos, em que cada um consiste em 60 s a 63 a 64 °C e 10 a 95 °C. Os resultados são mostrados nas Figuras 8 e 9.

[00115] Como um resultado, foi confirmado que é possível analisar cada miRNA com o uso de apenas 2 μl (cerca de 1 cópia) de cDNA diluída a uma concentração de 1 aM.

EXEMPLO 4: DETECÇÃO EM TEMPO REAL DE ESPECIFICIDADE DE MIRNA DE LET-7 COM O USO DE PROMER DE ACORDO COM A PRESENTE INVENÇÃO

[00116] Na presença de 0,5 μl de cada um dentre 10 μM de promer e 10 μM de iniciador conforme mostrado na Tabela 2 acima, 2 μl de cada cDNA de let-7a diluído a 1/10 (de uma concentração de 100 fM a 1 aM) foi adicionado a 2 μl de 1 pM, cada cDNA de let-7a construído no Exemplo 3 acima, e unidades de 10 M de RNase H e 4 μl de AptaTaq DNA Master (produzido junto à Roche) foram adicionados. O volume total foi ajustado a 20 μl com água triplamente destilada, sendo que, em seguida, uma reação em cadeia da polimerase (PCR) foi realizada. Nesse momento, a reação tipo PCR foi realizada mediante as seguintes condições: 5 min a 95 °C e, então, 45 ciclos, em que cada um consiste em 60 s a 63 a 64 °C e 10 a 95 °C. Os resultados são mostrados na Figura 10.

[00117] Como um resultado, foi confirmado que a análise estável foi possível a uma concentração que varia de 100 Fm a 1 fM no grupo de teste em que 2 μl de cada cDNA de let-7a diluído a 1/10 (de uma concentração de 100 fM a 1 aM) foi adicionado a 2 μl de 1 pM, cada cDNA de let-7a, porém, o gráfico sofreu uma queda a 100 aM. Isso sugere que as isoformas de miRNA podem ser analisadas enquanto a especificidade é mantida até 0,1%.

Claims

1. Método para detectar RNA pequeno usando um promer, caracterizado pelo fato de que o promer compreende: uma sequência de nucleotídeos capaz de se ligar complementarmente a uma porção da sequência de nucleotídeos de um cDNA e é capaz de ser usado como (i) um iniciador direto e uma sonda, ou (ii) um iniciador inverso e uma sonda, ou (iii) um primer direto, um primer inverso e uma sonda; em que o promer possui a estrutura X-Y-Z, possuindo um ou mais marcadores detectáveis fixados em ambas as extremidades, ou dentro do promer, e formando um complexo por ligação a uma região específica de um ácido nucleico alvo a ser detectado em tempo real; em que X é um DNA consistindo em 10 a 30 nucleotídeos; em que Y é um RNA consistindo em 1 a 10 nucleotídeos; em que Z é um DNA consistindo em 2 ou 3 nucleotídeos; e em que a região Y pode ser clivada por uma enzima específica; em que, quando a região Y é clivada por uma enzima específica, a região Y e a região Z são separadas da região específica do ácido nucleico alvo, e, em seguida, a região X atua como um iniciador, enquanto mantém o complexo com o ácido nucleico alvo; o método compreendendo as etapas de: a-1) obter um RNA que inclui o RNA pequeno a ser detectado a partir de uma amostra biológica; b-1) sintetizar um cDNA do RNA obtido na etapa a-1); c-1) adicionar, ao cDNA da etapa b-1), o promer; em que o promer se liga complementarmente a uma porção da sequência de nucleotídeos do cDNA, a região Y é clivada pela enzima específica, a região Y e a região Z do promer são separadas do cDNA, e um marcador detectável permanece em um fragmento do promer complexado com o cDNA, e então a região X atua como primer, mantendo o complexo com o ácido nucléico alvo, amplificando o cDNA; d-1) medir a quantidade do fragmento do promer clivado por uma enzima com capacidade de clivar a região de Y do promer da etapa c-1).

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o marcador detectável é um fluoróforo que se liga de modo covalente ou de modo não covalente ao promer, ou um par fluorescente que consiste no fluoróforo e um supressor.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que X, Y e Z do promer são sintetizados para que sejam completa ou parcialmente metilados para prevenir clivagem não específica.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que, quando a região de Y é DNA, então, a enzima é pelo menos um DNA nuclease (DNase), selecionado de DNase I, DNase II, S1 nuclease, nuclease P1, AP endonuclease ou UvrABC nuclease e, quando a região de X é RNA, então, a enzima é pelo menos uma RNA ribonuclease (RNase), selecionada de RNase II, RNase III, RNase IV, RNase H ou RNase T2.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que, na etapa c-1), quando (i) o promer é usado como o iniciador direto e a sonda, o promer compreende adicionalmente um iniciador inverso que compreende uma sequência de nucleotídeos com capacidade de se ligar, de modo complementar, a uma porção da sequência de nucleotídeos do cDNA e quando (ii) o promer é usado como o iniciador inverso e a sonda, o promer compreende adicionalmente um iniciador direto que compreende uma sequência de nucleotídeos com capacidade de se ligar de modo complementar a uma porção da sequência de nucleotídeos do cDNA.