JP3451667B2 - 核酸抽出及び特定核酸配列の検出方法 - Google Patents
核酸抽出及び特定核酸配列の検出方法Info
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、核酸を含有する試料か
ら核酸を抽出する方法に関するものであり、詳しくは、
バイオテクノロジー、臨床診断分野で利用することがで
きる核酸抽出法及び特定核酸配列の検出方法である。
ら核酸を抽出する方法に関するものであり、詳しくは、
バイオテクノロジー、臨床診断分野で利用することがで
きる核酸抽出法及び特定核酸配列の検出方法である。
【０００２】
【従来の技術】核酸を含有する試料からの核酸の抽出
は、バイオテクノロジー、臨床診断等の分野では重要な
操作である。例えば遺伝子組み換え技術ではベクターＤ
ＮＡやクローン化しようとするＤＮＡの両方を単離する
ことが必要であり、遺伝病や癌遺伝子について遺伝子検
査を行うには、血液中の白血球細胞等から核酸を抽出す
ることが必要である。
は、バイオテクノロジー、臨床診断等の分野では重要な
操作である。例えば遺伝子組み換え技術ではベクターＤ
ＮＡやクローン化しようとするＤＮＡの両方を単離する
ことが必要であり、遺伝病や癌遺伝子について遺伝子検
査を行うには、血液中の白血球細胞等から核酸を抽出す
ることが必要である。
【０００３】一般的に、核酸は遊離の分子としては存在
せず、例えば細菌、細胞、ウイルス粒子中等に存在し、
蛋白質、脂質及び糖からなる細胞膜や細胞壁で覆われ、
核酸自身ヒストン蛋白質等と複合体を形成している。こ
のような状態で存在する核酸を抽出するには、核酸を覆
う細胞膜や細胞壁を破壊し、前記複合体の蛋白質を変性
又は分解して可溶化し、核酸を遊離させ、遊離した核酸
を抽出する操作が必要である。
せず、例えば細菌、細胞、ウイルス粒子中等に存在し、
蛋白質、脂質及び糖からなる細胞膜や細胞壁で覆われ、
核酸自身ヒストン蛋白質等と複合体を形成している。こ
のような状態で存在する核酸を抽出するには、核酸を覆
う細胞膜や細胞壁を破壊し、前記複合体の蛋白質を変性
又は分解して可溶化し、核酸を遊離させ、遊離した核酸
を抽出する操作が必要である。
【０００４】核酸の抽出は、従来次のようにして行われ
ている。プロテアーゼＫ等の蛋白質分解酵素や界面活性
剤を加えて細胞膜や細胞壁を破壊し、複合体の蛋白質を
分解して核酸を遊離させ、フェノール／クロロホルムを
添加し、遠心分離して核酸を水相に分配させた後、分取
した水相にエタノールやイソプロパノール等を添加して
核酸を不溶化させる、いわゆるプロテアーゼＫ／フェノ
ール法（Molecular cloning:A Laboratory manual Appe
ndix E3 〜E4(New York:Cold Spring Harbor Laborator
y,1989) ）。
ている。プロテアーゼＫ等の蛋白質分解酵素や界面活性
剤を加えて細胞膜や細胞壁を破壊し、複合体の蛋白質を
分解して核酸を遊離させ、フェノール／クロロホルムを
添加し、遠心分離して核酸を水相に分配させた後、分取
した水相にエタノールやイソプロパノール等を添加して
核酸を不溶化させる、いわゆるプロテアーゼＫ／フェノ
ール法（Molecular cloning:A Laboratory manual Appe
ndix E3 〜E4(New York:Cold Spring Harbor Laborator
y,1989) ）。
【０００５】試料にチオシアン酸グアニジン及びフェノ
ールからなる混合液を加えて細胞膜や細胞壁を破壊し、
複合体の蛋白質を変性、可溶化して核酸を遊離させ、更
にクロロホルムを添加して核酸を水相に分配させた後、
分取した水相にエタノールやイソプロパノール等を添加
して核酸を不溶化させる、いわゆるＡＧＰＣ法（AcidGu
anidinium-thiocyanate Phenol-Chloroform method:Ana
lytical Biochemistry 162:156-159, 1987）。
ールからなる混合液を加えて細胞膜や細胞壁を破壊し、
複合体の蛋白質を変性、可溶化して核酸を遊離させ、更
にクロロホルムを添加して核酸を水相に分配させた後、
分取した水相にエタノールやイソプロパノール等を添加
して核酸を不溶化させる、いわゆるＡＧＰＣ法（AcidGu
anidinium-thiocyanate Phenol-Chloroform method:Ana
lytical Biochemistry 162:156-159, 1987）。
【０００６】試料に塩酸グアニジンやチオシアン酸グア
ニジンを加えて細胞膜や細胞壁を破壊し、複合体の蛋白
質を変性、可溶化して核酸を遊離させ、エタノール等を
添加して遊離した核酸を不溶化させる、いわゆるグアニ
ジン法（Molecular cloning:A Laboratory manual 7.23
〜7.25, New York:Cold Spring Harbor Laboratory,198
9, Analytical Biochemistry 162:463, 1987）。
ニジンを加えて細胞膜や細胞壁を破壊し、複合体の蛋白
質を変性、可溶化して核酸を遊離させ、エタノール等を
添加して遊離した核酸を不溶化させる、いわゆるグアニ
ジン法（Molecular cloning:A Laboratory manual 7.23
〜7.25, New York:Cold Spring Harbor Laboratory,198
9, Analytical Biochemistry 162:463, 1987）。
【０００７】試料に、核酸と親和性を有するグリコーゲ
ンを含むヨウ化ナトリウムを加えて細胞膜や細胞壁を破
壊し、複合体の蛋白質を変性、可溶化して核酸を遊離さ
せ、イソプロパノールを添加して遊離した核酸及びグリ
コーゲンを不溶化させるヨウ化ナトリウム法（Nucleic
Acid Res. 19(20):5792, 1991）。
ンを含むヨウ化ナトリウムを加えて細胞膜や細胞壁を破
壊し、複合体の蛋白質を変性、可溶化して核酸を遊離さ
せ、イソプロパノールを添加して遊離した核酸及びグリ
コーゲンを不溶化させるヨウ化ナトリウム法（Nucleic
Acid Res. 19(20):5792, 1991）。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】プロテアーゼＫ／フェ
ノール法は、蛋白分解酵素による分解処理に時間がかか
り、酵素反応を良好に保つために温度管理を行わなけれ
ばならない等、操作が煩雑である。しかも、フェノール
やクロロホルムは有毒な化学試薬であり（両者共に毒物
劇物取締法に指定される劇物である）、その取扱いには
保護衣、手袋及び防煙フード等の使用が必要で、更に抽
出操作後の廃液を特別処理しなければならならず、この
廃液処理に費用、時間、特別な設備が必要となる。ま
た、核酸が分配された水相の分取等に熟練を要し、安定
した核酸抽出効率を達成することが困難である。
ノール法は、蛋白分解酵素による分解処理に時間がかか
り、酵素反応を良好に保つために温度管理を行わなけれ
ばならない等、操作が煩雑である。しかも、フェノール
やクロロホルムは有毒な化学試薬であり（両者共に毒物
劇物取締法に指定される劇物である）、その取扱いには
保護衣、手袋及び防煙フード等の使用が必要で、更に抽
出操作後の廃液を特別処理しなければならならず、この
廃液処理に費用、時間、特別な設備が必要となる。ま
た、核酸が分配された水相の分取等に熟練を要し、安定
した核酸抽出効率を達成することが困難である。
【０００９】ＡＧＰＣ法においても、フェノールやクロ
ロホルムの取扱いや、核酸が分配された水相の分取等に
関する抽出効率等について、前記プロテアーゼＫ／フェ
ノール法と同様の課題がある。更にこの方法はＲＮＡを
抽出するための方法であり、ＤＮＡの抽出には不適当で
ある。
ロホルムの取扱いや、核酸が分配された水相の分取等に
関する抽出効率等について、前記プロテアーゼＫ／フェ
ノール法と同様の課題がある。更にこの方法はＲＮＡを
抽出するための方法であり、ＤＮＡの抽出には不適当で
ある。
【００１０】グアニジン法では、試料に塩酸グアニジン
等を加えた後、エタノール等を添加する際、溶液中のグ
アニジン濃度が低下するため、高濃度（６〜８Ｍ程度）
のグアニジンを使用しなければならいが、このためグア
ニジン塩が析出（特に冬場や室温が２０℃以下の場合）
しやすいという問題がある。グアニジンの析出は、それ
の添加に使用するピペッター等に目詰まりを発生させる
ことにもつながり、該操作を機械化する際の課題とな
る。更に、グアニジンに続いて添加するエタノール等
は、核酸の不溶化のため最終濃度で５０〜７０％となる
ようにしなければならないが、グアニジンの添加で試料
容量が増加しているから、高純度（約１００％）エタノ
ールを使用しても、グアニジン−試料混合液と同量以上
が必要になるという課題もある。
等を加えた後、エタノール等を添加する際、溶液中のグ
アニジン濃度が低下するため、高濃度（６〜８Ｍ程度）
のグアニジンを使用しなければならいが、このためグア
ニジン塩が析出（特に冬場や室温が２０℃以下の場合）
しやすいという問題がある。グアニジンの析出は、それ
の添加に使用するピペッター等に目詰まりを発生させる
ことにもつながり、該操作を機械化する際の課題とな
る。更に、グアニジンに続いて添加するエタノール等
は、核酸の不溶化のため最終濃度で５０〜７０％となる
ようにしなければならないが、グアニジンの添加で試料
容量が増加しているから、高純度（約１００％）エタノ
ールを使用しても、グアニジン−試料混合液と同量以上
が必要になるという課題もある。
【００１１】ヨウ化ナトリウム法では、蛋白質等を可溶
化するため６０℃のインキュベーションが必要で、ＲＮ
Ａの抽出効率が低いという課題や、不安定なヨウ素イオ
ン（Ｉ- ）が光等により酸化され、分子状のヨウ素（Ｉ
2 ）となり易いため、試薬を冷暗所で保管する必要があ
るという課題もある。
化するため６０℃のインキュベーションが必要で、ＲＮ
Ａの抽出効率が低いという課題や、不安定なヨウ素イオ
ン（Ｉ- ）が光等により酸化され、分子状のヨウ素（Ｉ
2 ）となり易いため、試薬を冷暗所で保管する必要があ
るという課題もある。
【００１２】ところで、ポリメレース連鎖反応（polyme
rase chain reaction,ＰＣＲ）とよばれるＤＮＡ増幅法
（Molecular cloning:A Laboratory manual chap14、Ne
w York:Cold Spring Harbor Laboratory, 1989）では、
超高感度の遺伝子検査（遺伝子診断）が可能である。Ｐ
ＣＲでは、ＤＮＡ増幅が良好に行われた場合には、１億
倍以上の増幅が見込める。しかし、１分子のＤＮＡであ
っても増幅が可能であるから、ＰＣＲ用核酸試料やＰＣ
Ｒ試薬に本来存在するはずのないＤＮＡ（外来ＤＮＡ）
が混入すると、検査結果に重大な影響が生じることにな
る。
rase chain reaction,ＰＣＲ）とよばれるＤＮＡ増幅法
（Molecular cloning:A Laboratory manual chap14、Ne
w York:Cold Spring Harbor Laboratory, 1989）では、
超高感度の遺伝子検査（遺伝子診断）が可能である。Ｐ
ＣＲでは、ＤＮＡ増幅が良好に行われた場合には、１億
倍以上の増幅が見込める。しかし、１分子のＤＮＡであ
っても増幅が可能であるから、ＰＣＲ用核酸試料やＰＣ
Ｒ試薬に本来存在するはずのないＤＮＡ（外来ＤＮＡ）
が混入すると、検査結果に重大な影響が生じることにな
る。
【００１３】外来ＤＮＡの混入の原因の一つは、試料か
ら核酸を抽出してＰＣＲ用核酸試料を準備する段階で発
生するが、これは核酸抽出操作で発生するエアロゾルに
も関係する。プロテアーゼＫ／フェノール法やＡＧＰＣ
法では、試薬を試料に添加して混合等する操作に加え、
水相を分取する等、時間を要する操作も必要になるた
め、前記エアロゾルが発生し易いという課題もある。エ
アロゾルの粒子は直径約20ミクロンで、容量にすればお
よそ４×１０-6μｌ程度とわずかであるが、例えばＢ型
肝炎患者の場合、血液１μｌ中に１０5 程度のウイルス
粒子が含まれ得ることから、エアロゾル１個に１個のウ
イルス粒子が含まれることになる。１分子のＤＮＡの増
幅可能なＰＣＲにおいては重大な障害が生じるのであ
る。従って、処理工程を少なくする必要がある。
ら核酸を抽出してＰＣＲ用核酸試料を準備する段階で発
生するが、これは核酸抽出操作で発生するエアロゾルに
も関係する。プロテアーゼＫ／フェノール法やＡＧＰＣ
法では、試薬を試料に添加して混合等する操作に加え、
水相を分取する等、時間を要する操作も必要になるた
め、前記エアロゾルが発生し易いという課題もある。エ
アロゾルの粒子は直径約20ミクロンで、容量にすればお
よそ４×１０-6μｌ程度とわずかであるが、例えばＢ型
肝炎患者の場合、血液１μｌ中に１０5 程度のウイルス
粒子が含まれ得ることから、エアロゾル１個に１個のウ
イルス粒子が含まれることになる。１分子のＤＮＡの増
幅可能なＰＣＲにおいては重大な障害が生じるのであ
る。従って、処理工程を少なくする必要がある。
【００１４】エアロゾルの発生を極力排除するため、例
えばヨーロッパ公開４８７２１８号公報に記載された発
明のように、インターカレーター性蛍光色素等を利用し
て、密封状態でＰＣＲ反応を実施することも知られてい
る。しかしながら、核酸の抽出工程でのエアロゾル汚染
の可能性までを排除することはできない。
えばヨーロッパ公開４８７２１８号公報に記載された発
明のように、インターカレーター性蛍光色素等を利用し
て、密封状態でＰＣＲ反応を実施することも知られてい
る。しかしながら、核酸の抽出工程でのエアロゾル汚染
の可能性までを排除することはできない。
【００１５】
【課題を解決するための手段】本発明者は、従来の核酸
抽出法に見られる改善されるべき課題を解決すべく鋭意
研究した結果、操作が容易で工程が少なく、エアロゾル
発生の可能性を減少でき、短時間で実施可能で、フェノ
ールやクロロホルムを使用せず、核酸抽出効率が安定
な、ＤＮＡ及びＲＮＡの抽出方法を完成するに至った。
また本発明者は、この核酸抽出方法に基づき、従来法に
比較してより簡便でかつエアロゾル汚染を排除し得る特
定核酸配列の検出方法を完成するに至った。
抽出法に見られる改善されるべき課題を解決すべく鋭意
研究した結果、操作が容易で工程が少なく、エアロゾル
発生の可能性を減少でき、短時間で実施可能で、フェノ
ールやクロロホルムを使用せず、核酸抽出効率が安定
な、ＤＮＡ及びＲＮＡの抽出方法を完成するに至った。
また本発明者は、この核酸抽出方法に基づき、従来法に
比較してより簡便でかつエアロゾル汚染を排除し得る特
定核酸配列の検出方法を完成するに至った。
【００１６】すなわち本発明は、（１）デキストラン、
アクリルアミド及びカルボキシメチルセルロースからな
る群から選ばれる１種以上のキャリアーを試料と混合し
て混合液を形成する工程、（２）チオシアン酸グアニジ
ン、塩酸グアニジン、チオシアン酸カリウム及びチオシ
アン酸ナトリウムからなる群から選ばれる１種以上の試
薬Ａと、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコ
ール、ｎ−ブチルアルコール、ｓｅｃ−ブチルアルコー
ル、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール及びｔｅｒｔ−アミル
アルコールからなる群から選ばれる１種以上の試薬Ｂ、
を含む試薬Ｃを工程（１）の混合液に混合して核酸及び
キャリアーを不溶化する工程、（３）不溶化された核酸
及びキャリアーを液相と分離する工程との３つの工程か
らなる核酸抽出法である。
アクリルアミド及びカルボキシメチルセルロースからな
る群から選ばれる１種以上のキャリアーを試料と混合し
て混合液を形成する工程、（２）チオシアン酸グアニジ
ン、塩酸グアニジン、チオシアン酸カリウム及びチオシ
アン酸ナトリウムからなる群から選ばれる１種以上の試
薬Ａと、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコ
ール、ｎ−ブチルアルコール、ｓｅｃ−ブチルアルコー
ル、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール及びｔｅｒｔ−アミル
アルコールからなる群から選ばれる１種以上の試薬Ｂ、
を含む試薬Ｃを工程（１）の混合液に混合して核酸及び
キャリアーを不溶化する工程、（３）不溶化された核酸
及びキャリアーを液相と分離する工程との３つの工程か
らなる核酸抽出法である。
【００１７】また本発明は、（１）デキストラン、アク
リルアミド及びカルボキシメチルセルロースからなる群
から選ばれる１種以上のキャリアーを試料と混合して混
合液を形成する工程、（２）チオシアン酸グアニジン、
塩酸グアニジン、チオシアン酸カリウム及びチオシアン
酸ナトリウムからなる群から選ばれる１種以上の試薬Ａ
と、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコー
ル、ｎ−ブチルアルコール、ｓｅｃ−ブチルアルコー
ル、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール及びｔｅｒｔ−アミル
アルコールからなる群から選ばれる１種以上の試薬Ｂ、
とを含む試薬Ｃを、工程（１）の混合液に混合して核酸
及びキャリアーを不溶化する工程、（３）不溶化された
核酸及びキャリアーを液相と分離する工程、（４）分離
された核酸がＲＮＡである場合に逆転写反応により該Ｒ
ＮＡをＤＮＡに変換する工程、（５）工程（３）で分離
された核酸又は工程（４）で得られた核酸を、少なくと
も特定配列を増幅するのに適したオリゴヌクレオチドプ
ローブ、モノヌクレオチド三燐酸混合物、ポリメレース
及びインターカレーター性蛍光色素を含むポリメレース
チェーンリアクション反応液中でＰＣＲ反応に供する工
程、（６）ＰＣＲ反応前後の蛍光強度変化又はＰＣＲ反
応中の反応液からの蛍光強度変化を測定する工程、
（７）蛍光強度の変化から、試料中に特定配列を有する
核酸が存在していたか否かを判定する工程、からなる特
定核酸配列の検出方法である。
リルアミド及びカルボキシメチルセルロースからなる群
から選ばれる１種以上のキャリアーを試料と混合して混
合液を形成する工程、（２）チオシアン酸グアニジン、
塩酸グアニジン、チオシアン酸カリウム及びチオシアン
酸ナトリウムからなる群から選ばれる１種以上の試薬Ａ
と、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコー
ル、ｎ−ブチルアルコール、ｓｅｃ−ブチルアルコー
ル、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール及びｔｅｒｔ−アミル
アルコールからなる群から選ばれる１種以上の試薬Ｂ、
とを含む試薬Ｃを、工程（１）の混合液に混合して核酸
及びキャリアーを不溶化する工程、（３）不溶化された
核酸及びキャリアーを液相と分離する工程、（４）分離
された核酸がＲＮＡである場合に逆転写反応により該Ｒ
ＮＡをＤＮＡに変換する工程、（５）工程（３）で分離
された核酸又は工程（４）で得られた核酸を、少なくと
も特定配列を増幅するのに適したオリゴヌクレオチドプ
ローブ、モノヌクレオチド三燐酸混合物、ポリメレース
及びインターカレーター性蛍光色素を含むポリメレース
チェーンリアクション反応液中でＰＣＲ反応に供する工
程、（６）ＰＣＲ反応前後の蛍光強度変化又はＰＣＲ反
応中の反応液からの蛍光強度変化を測定する工程、
（７）蛍光強度の変化から、試料中に特定配列を有する
核酸が存在していたか否かを判定する工程、からなる特
定核酸配列の検出方法である。
【００１８】さらに本発明は、少なくとも次のキャリア
ー及び試薬を分離された状態で含む、核酸を抽出するた
めの試薬セットを提供する。（１）デキストラン、アク
リルアミド及びカルボキシメチルセルロースからなる群
から選ばれる１種以上のキャリアー、（２）チオシアン
酸グアニジン、塩酸グアニジン、チオシアン酸カリウム
及びチオシアン酸ナトリウムからなる群から選ばれる１
種以上の試薬Ａと、ｎ−プロピルアルコール、イソプロ
ピルアルコール、ｎ−ブチルアルコール、ｓｅｃ−ブチ
ルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール及びｔｅｒ
ｔ−アミルアルコールからなる群から選ばれる１種以上
の試薬Ｂ、とを含む試薬Ｃ。
ー及び試薬を分離された状態で含む、核酸を抽出するた
めの試薬セットを提供する。（１）デキストラン、アク
リルアミド及びカルボキシメチルセルロースからなる群
から選ばれる１種以上のキャリアー、（２）チオシアン
酸グアニジン、塩酸グアニジン、チオシアン酸カリウム
及びチオシアン酸ナトリウムからなる群から選ばれる１
種以上の試薬Ａと、ｎ−プロピルアルコール、イソプロ
ピルアルコール、ｎ−ブチルアルコール、ｓｅｃ−ブチ
ルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール及びｔｅｒ
ｔ−アミルアルコールからなる群から選ばれる１種以上
の試薬Ｂ、とを含む試薬Ｃ。
【００１９】以下、本発明を詳細に説明する。
【００２０】本発明は、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ、Ｒ
ＮＡ等の核酸の抽出法であり、ＤＮＡはゲノムＤＮＡの
他、ミドコンドリアや葉緑体のＤＮＡ、ＲＮＡはｍＲＮ
Ａの他、ｔＲＮＡやｒＲＮＡの抽出に適用できる。この
ような核酸を含む試料としては、例えば白血球細胞等の
生体由来試料、例えば遺伝子組み換え等で得られたベク
ター等を含む宿主細胞の培養物、ウイルスやファージの
感染細胞及び血中のウイルス、単なる微生物の培養物で
ある。培養物は、微生物等を含むものでもその上清のみ
のものでも良く、また人工的な培養物以外に自然に発生
した培養物等でも良い。微生物等を含む試料において、
微生物等が塊状になっている場合等には、必要に応じて
例えばホモジナイズや超音波処理を実施することで良好
な抽出効率を達成することができる。
ＮＡ等の核酸の抽出法であり、ＤＮＡはゲノムＤＮＡの
他、ミドコンドリアや葉緑体のＤＮＡ、ＲＮＡはｍＲＮ
Ａの他、ｔＲＮＡやｒＲＮＡの抽出に適用できる。この
ような核酸を含む試料としては、例えば白血球細胞等の
生体由来試料、例えば遺伝子組み換え等で得られたベク
ター等を含む宿主細胞の培養物、ウイルスやファージの
感染細胞及び血中のウイルス、単なる微生物の培養物で
ある。培養物は、微生物等を含むものでもその上清のみ
のものでも良く、また人工的な培養物以外に自然に発生
した培養物等でも良い。微生物等を含む試料において、
微生物等が塊状になっている場合等には、必要に応じて
例えばホモジナイズや超音波処理を実施することで良好
な抽出効率を達成することができる。
【００２１】本発明によれば、これらの試料から核酸を
抽出することができるが、それ以外にも例えば、ＰＣＲ
反応溶液から、酵素や低分子のデオキシヌクレオチドト
リフォスフェート及びプライマー等を含まない、増幅さ
れた核酸を高収率で抽出することも出来る。
抽出することができるが、それ以外にも例えば、ＰＣＲ
反応溶液から、酵素や低分子のデオキシヌクレオチドト
リフォスフェート及びプライマー等を含まない、増幅さ
れた核酸を高収率で抽出することも出来る。
【００２２】核酸を含有する試料に、まずキャリアーを
混合する。キャリアーを混合することで、後に試薬Ｃを
添加して核酸及びキャリアーを不溶化した際、不溶化さ
れた核酸とキャリアーの絡み合いにより大きな不溶化物
が形成され、結果として後の不溶化物の分離操作が簡便
化されることから、キャリアーを使用しない場合と比較
して抽出効率を向上することができる。
混合する。キャリアーを混合することで、後に試薬Ｃを
添加して核酸及びキャリアーを不溶化した際、不溶化さ
れた核酸とキャリアーの絡み合いにより大きな不溶化物
が形成され、結果として後の不溶化物の分離操作が簡便
化されることから、キャリアーを使用しない場合と比較
して抽出効率を向上することができる。
【００２３】キャリアーとは、核酸と親和性を有してお
り、試薬Ｃ中の試薬Ｂと接触した際に不溶化されるもの
である。またキャリアーは、核酸と一緒に抽出されるの
で、抽出した核酸の用途、例えば制限酵素反応、逆転写
反応又はＰＣＲ反応への使用においてこれら反応を阻害
しないものを選択する。本発明において使用されるキャ
リアーは、デキストラン、アクリルアミド及びカルボキ
シメチルセルロースからなる群から選ばれる１種又は２
種以上である。これらキャリアーは単独でも、２種以上
を混合した場合でも、十分な効果を有しており、しかも
逆転写反応、ＰＣＲ反応等を阻害しない。従来使用され
ているグリコーゲン等では、試料が血清や血液の場合、
これら試料に含有されるアミラーゼ等の酵素により分解
されてしまい、結果として核酸抽出効率が低下するが、
本発明のキャリアーは分解されず、核酸抽出効率が低下
することはない。
り、試薬Ｃ中の試薬Ｂと接触した際に不溶化されるもの
である。またキャリアーは、核酸と一緒に抽出されるの
で、抽出した核酸の用途、例えば制限酵素反応、逆転写
反応又はＰＣＲ反応への使用においてこれら反応を阻害
しないものを選択する。本発明において使用されるキャ
リアーは、デキストラン、アクリルアミド及びカルボキ
シメチルセルロースからなる群から選ばれる１種又は２
種以上である。これらキャリアーは単独でも、２種以上
を混合した場合でも、十分な効果を有しており、しかも
逆転写反応、ＰＣＲ反応等を阻害しない。従来使用され
ているグリコーゲン等では、試料が血清や血液の場合、
これら試料に含有されるアミラーゼ等の酵素により分解
されてしまい、結果として核酸抽出効率が低下するが、
本発明のキャリアーは分解されず、核酸抽出効率が低下
することはない。
【００２４】キャリアーは、試料１０μｌに対して０．
０１〜１０００μｇ程度、好ましくは０．１〜１００μ
ｇ程度を添加すると良い。なおキャリアーを予め容器に
添加しておき、該容器に試料を加えるようにしても、こ
の逆のようにしても良い。またキャリアーは、凍結乾燥
又は風乾により固形状にしておくことも出来る。
０１〜１０００μｇ程度、好ましくは０．１〜１００μ
ｇ程度を添加すると良い。なおキャリアーを予め容器に
添加しておき、該容器に試料を加えるようにしても、こ
の逆のようにしても良い。またキャリアーは、凍結乾燥
又は風乾により固形状にしておくことも出来る。
【００２５】キャリアーを混合した混合液に、次にチオ
シアン酸グアニジン、塩酸グアニジン、チオシアン酸カ
リウム及びチオシアン酸ナトリウムからなる群から選ば
れる１種以上の試薬Ａと、ｎ−プロピルアルコール、イ
ソプロピルアルコール、ｎ−ブチルアルコール、ｓｅｃ
−ブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、及
びｔｅｒｔ−アミルアルコールからなる群から選ばれる
１種以上の試薬Ｂ、を含む試薬Ｃを加えて混合し、キャ
リアー及び核酸を不溶化する。
シアン酸グアニジン、塩酸グアニジン、チオシアン酸カ
リウム及びチオシアン酸ナトリウムからなる群から選ば
れる１種以上の試薬Ａと、ｎ−プロピルアルコール、イ
ソプロピルアルコール、ｎ−ブチルアルコール、ｓｅｃ
−ブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、及
びｔｅｒｔ−アミルアルコールからなる群から選ばれる
１種以上の試薬Ｂ、を含む試薬Ｃを加えて混合し、キャ
リアー及び核酸を不溶化する。
【００２６】試薬Ｃは、例えば核酸の分解を抑えるため
の適当な緩衝剤や、核酸分解酵素（デオキシリボヌクレ
アーゼ）活性を抑制し得るクエン酸ナトリウム、ＥＤＴ
Ａ等のキレート剤や、蛋白質や脂質等をより効率的に変
性、可溶化するための、ジスルフィド結合を還元するジ
チオスレイトール、β−メルカプトエタノール等の還元
剤や、蛋白質等をより効率的に可溶化するためにサルコ
シル塩、トライトン等の界面活性剤を含んでいても良
い。試薬ＣのｐＨは、例えば適当な緩衝剤等を添加し
て、ｐＨ４〜９、より好ましくはｐＨ５〜８としておく
ことで核酸の分解を防止でき、結果として抽出効率をよ
り向上することができる。
の適当な緩衝剤や、核酸分解酵素（デオキシリボヌクレ
アーゼ）活性を抑制し得るクエン酸ナトリウム、ＥＤＴ
Ａ等のキレート剤や、蛋白質や脂質等をより効率的に変
性、可溶化するための、ジスルフィド結合を還元するジ
チオスレイトール、β−メルカプトエタノール等の還元
剤や、蛋白質等をより効率的に可溶化するためにサルコ
シル塩、トライトン等の界面活性剤を含んでいても良
い。試薬ＣのｐＨは、例えば適当な緩衝剤等を添加し
て、ｐＨ４〜９、より好ましくはｐＨ５〜８としておく
ことで核酸の分解を防止でき、結果として抽出効率をよ
り向上することができる。
【００２７】本発明では、試薬Ａとして、チオシアン酸
グアニジン、塩酸グアニジン、チオシアン酸カリウム及
びチオシアン酸ナトリウムからなる群から選ばれる１種
又は２種以上を使用する。これらの試薬Ａは、細胞膜や
細胞壁を破壊し、複合体中の蛋白質を変性し、この結果
生じる変性蛋白質等や、共存する試薬Ｂによって変性蛋
白質が生じた場合にはこれをも可溶化でき、同時に試料
中に存在し得るデオキシリボヌクレアーゼやリボヌクレ
アーゼ等の核酸分解酵素の活性をも抑制し得る。本発明
の試薬Ａは蛋白質を可溶化する能力に優れており、単独
でも、また２種以上を組み合わせて使用しても、なんら
不都合な反応を生じることなく、高い効率で核酸抽出を
行うことができる。例えばヨウ化ナトリウム、ヨウ化カ
リウム、臭化カリウム、臭化ナトリウム、尿素等の一般
に知られた蛋白質変性剤では蛋白質等を可溶化する力が
弱く、また硫酸グアニジン、炭酸グアニジン等では蛋白
質等を凝集させてしまうため、高い効率で核酸抽出を行
うことができない。
グアニジン、塩酸グアニジン、チオシアン酸カリウム及
びチオシアン酸ナトリウムからなる群から選ばれる１種
又は２種以上を使用する。これらの試薬Ａは、細胞膜や
細胞壁を破壊し、複合体中の蛋白質を変性し、この結果
生じる変性蛋白質等や、共存する試薬Ｂによって変性蛋
白質が生じた場合にはこれをも可溶化でき、同時に試料
中に存在し得るデオキシリボヌクレアーゼやリボヌクレ
アーゼ等の核酸分解酵素の活性をも抑制し得る。本発明
の試薬Ａは蛋白質を可溶化する能力に優れており、単独
でも、また２種以上を組み合わせて使用しても、なんら
不都合な反応を生じることなく、高い効率で核酸抽出を
行うことができる。例えばヨウ化ナトリウム、ヨウ化カ
リウム、臭化カリウム、臭化ナトリウム、尿素等の一般
に知られた蛋白質変性剤では蛋白質等を可溶化する力が
弱く、また硫酸グアニジン、炭酸グアニジン等では蛋白
質等を凝集させてしまうため、高い効率で核酸抽出を行
うことができない。
【００２８】本発明では、試薬Ｂとして、ｎ−プロピル
アルコール、イソプロピルアルコール、ｎ−ブチルアル
コール、ｓｅｃ−ブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチル
アルコール及びｔｅｒｔ−アミルアルコールからなる群
から選ばれる１種又は２種以上を使用する。ここで、２
種以上を使用する場合には、予め予備的な実験を行い、
混合する割合などを決定することが好ましい。本発明の
試薬Ｂは、水に対する溶解度が高く水と相分離を生じ難
いため、これを使用することで不溶化された核酸及びキ
ャリアーを水相から分離する操作を簡便化できる。この
ことは結果的に、本発明の最終工程において不溶化され
た核酸の回収率を向上し得ることを意味する。
アルコール、イソプロピルアルコール、ｎ−ブチルアル
コール、ｓｅｃ−ブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチル
アルコール及びｔｅｒｔ−アミルアルコールからなる群
から選ばれる１種又は２種以上を使用する。ここで、２
種以上を使用する場合には、予め予備的な実験を行い、
混合する割合などを決定することが好ましい。本発明の
試薬Ｂは、水に対する溶解度が高く水と相分離を生じ難
いため、これを使用することで不溶化された核酸及びキ
ャリアーを水相から分離する操作を簡便化できる。この
ことは結果的に、本発明の最終工程において不溶化され
た核酸の回収率を向上し得ることを意味する。
【００２９】試薬Ｃ中の、試薬Ａ及び試薬Ｂのそれぞれ
の濃度は、キャリアーを混合した試料に試薬Ｃを添加し
た際、蛋白質や脂質等は可溶化された状態にあるが核酸
及びキャリアーは不溶化されるように調整すれば良い。
特に抽出効率を向上するうえで好ましい濃度は、試料に
添加した場合の濃度（最終濃度）で、試薬Ａが１．５〜
４．５Ｍ、試薬Ｂが４０〜８０％程度である。
の濃度は、キャリアーを混合した試料に試薬Ｃを添加し
た際、蛋白質や脂質等は可溶化された状態にあるが核酸
及びキャリアーは不溶化されるように調整すれば良い。
特に抽出効率を向上するうえで好ましい濃度は、試料に
添加した場合の濃度（最終濃度）で、試薬Ａが１．５〜
４．５Ｍ、試薬Ｂが４０〜８０％程度である。
【００３０】例えば、試薬Ｃを構成する試薬Ａとしてチ
オシアン酸グアニジンを、試薬Ｂとしてイソプロピルア
ルコールを使用した場合の、特に高い効率で核酸を抽出
するための試薬濃度は、試料を混合した際のチオシアン
酸グアニジン最終濃度が２〜３Ｍで、試料に混合した際
のイソプロピルアルコール最終濃度が４５〜５５％程度
である。チオシアン酸グアニジン最終濃度が１．５Ｍ以
下では、試料に含まれる蛋白質や脂質等を十分に可溶化
することが出来ず、また４．５Ｍ以上にするには試薬Ｃ
中の試薬Ａの濃度を高めなければならないが、そうする
と試薬Ａが析出しやすくなり調製が困難である。またイ
ソプロピルアルコール最終濃度が４０％以下ではキャリ
アー及び核酸を十分不溶化することが出来ず、またイソ
プロピルアルコール最終濃度が８０％以上では、蛋白質
や脂質等を十分可溶化出来るだけの、チオシアン酸グア
ニジン濃度を調製するのが困難であり、さらにイソプロ
ピルアルコールの蒸発が問題となるため、本発明では前
記濃度範囲の試薬を使用することが好ましい。
オシアン酸グアニジンを、試薬Ｂとしてイソプロピルア
ルコールを使用した場合の、特に高い効率で核酸を抽出
するための試薬濃度は、試料を混合した際のチオシアン
酸グアニジン最終濃度が２〜３Ｍで、試料に混合した際
のイソプロピルアルコール最終濃度が４５〜５５％程度
である。チオシアン酸グアニジン最終濃度が１．５Ｍ以
下では、試料に含まれる蛋白質や脂質等を十分に可溶化
することが出来ず、また４．５Ｍ以上にするには試薬Ｃ
中の試薬Ａの濃度を高めなければならないが、そうする
と試薬Ａが析出しやすくなり調製が困難である。またイ
ソプロピルアルコール最終濃度が４０％以下ではキャリ
アー及び核酸を十分不溶化することが出来ず、またイソ
プロピルアルコール最終濃度が８０％以上では、蛋白質
や脂質等を十分可溶化出来るだけの、チオシアン酸グア
ニジン濃度を調製するのが困難であり、さらにイソプロ
ピルアルコールの蒸発が問題となるため、本発明では前
記濃度範囲の試薬を使用することが好ましい。
【００３１】試薬Ｃの添加量は、例えば試料が血清等の
場合は試料容量の２〜１０倍量とすることが適当である
が、試料が高濃度の蛋白質や脂質等を含む場合は十分に
可溶化するために試料容量の１０倍以上添加すると良
い。
場合は試料容量の２〜１０倍量とすることが適当である
が、試料が高濃度の蛋白質や脂質等を含む場合は十分に
可溶化するために試料容量の１０倍以上添加すると良
い。
【００３２】以上の工程で試料中の核酸及びキャリアー
は不溶化されるから、続いて蛋白質等を含む水相から不
溶化された核酸及びキャリアーを遠心分離や濾過等の通
常の分離操作を実施して分離する。遠心分離を行った場
合には、核酸をペレットとして容器底に得ることがで
き、瀘過を行った場合、瀘過膜上に得ることができる。
なお濾過膜としては、０．１〜１０μｍ程度の孔を有す
るものが使用できる。
は不溶化されるから、続いて蛋白質等を含む水相から不
溶化された核酸及びキャリアーを遠心分離や濾過等の通
常の分離操作を実施して分離する。遠心分離を行った場
合には、核酸をペレットとして容器底に得ることがで
き、瀘過を行った場合、瀘過膜上に得ることができる。
なお濾過膜としては、０．１〜１０μｍ程度の孔を有す
るものが使用できる。
【００３３】分離された核酸は、そのままで種々の検査
や遺伝子組み換えに使用することができるが、それに先
立って洗浄することが好ましい。特に、例えば分離され
た核酸について酵素反応（例えば制限酵素反応、逆転写
反応、ＰＣＲ反応等）を行う等、沈殿物中にわずかに含
まれる試薬Ａ等が反応主体である酵素活性を阻害する恐
れがある場合等に有効である。具体的には、例えば遠心
分離又は濾過で取得された沈殿物について塩及びアルコ
ールを含む溶液を添加混合し、再度遠心分離又は濾過に
供することが例示できる。この場合、単に蒸留水等で洗
浄した場合に比較して、試薬Ａやペレット表面の残存蛋
白質等を効率良く除去できる。塩としては塩化カリウ
ム、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム等を０．０５〜
０．５Ｍ程度を含有し、アルコールとしては例えばエタ
ノールなら５０％以上、好ましくは６０〜８０％、ｎ−
プロピルアルコールやイソ−プロピルアルコールであれ
ば３０％以上、好ましくは４０〜６０％が良い。
や遺伝子組み換えに使用することができるが、それに先
立って洗浄することが好ましい。特に、例えば分離され
た核酸について酵素反応（例えば制限酵素反応、逆転写
反応、ＰＣＲ反応等）を行う等、沈殿物中にわずかに含
まれる試薬Ａ等が反応主体である酵素活性を阻害する恐
れがある場合等に有効である。具体的には、例えば遠心
分離又は濾過で取得された沈殿物について塩及びアルコ
ールを含む溶液を添加混合し、再度遠心分離又は濾過に
供することが例示できる。この場合、単に蒸留水等で洗
浄した場合に比較して、試薬Ａやペレット表面の残存蛋
白質等を効率良く除去できる。塩としては塩化カリウ
ム、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム等を０．０５〜
０．５Ｍ程度を含有し、アルコールとしては例えばエタ
ノールなら５０％以上、好ましくは６０〜８０％、ｎ−
プロピルアルコールやイソ−プロピルアルコールであれ
ば３０％以上、好ましくは４０〜６０％が良い。
【００３４】この他、特に沈殿物中に残存する蛋白質を
除去する必要がある場合には、まず沈殿物に本発明の試
薬Ａを含む溶液を再添加し、該蛋白質を溶解し、本発明
の試薬Ｂを含む溶液を添加し、再度遠心分離又は濾過を
行えば良い。むろん、本発明の（２）以降の工程をその
まま繰り返しても良い。なお、極微量の核酸を抽出する
場合には、操作全体を低温室中で行う等して、試料温度
が低い状態で本発明を実施することが好ましい。
除去する必要がある場合には、まず沈殿物に本発明の試
薬Ａを含む溶液を再添加し、該蛋白質を溶解し、本発明
の試薬Ｂを含む溶液を添加し、再度遠心分離又は濾過を
行えば良い。むろん、本発明の（２）以降の工程をその
まま繰り返しても良い。なお、極微量の核酸を抽出する
場合には、操作全体を低温室中で行う等して、試料温度
が低い状態で本発明を実施することが好ましい。
【００３５】本発明は更に、以上のようにして抽出され
た核酸について、それが例えばＢ型肝炎ウイルス、Ｃ型
肝炎ウイルス等の核酸中に見出だされる、他の核酸と識
別し得る特定配列を含むか否かを判定するための、一般
にＰＣＲ反応と呼ばれるＤＮＡ増幅方法を利用した検出
方法をも提供する。なお本明細書においては、ヨーロッ
パ公開特許第４８７２１８号明細書の開示事項を引用す
る。
た核酸について、それが例えばＢ型肝炎ウイルス、Ｃ型
肝炎ウイルス等の核酸中に見出だされる、他の核酸と識
別し得る特定配列を含むか否かを判定するための、一般
にＰＣＲ反応と呼ばれるＤＮＡ増幅方法を利用した検出
方法をも提供する。なお本明細書においては、ヨーロッ
パ公開特許第４８７２１８号明細書の開示事項を引用す
る。
【００３６】この方法においては、前述のように分離さ
れ、好ましくは洗浄された核酸について、まず分離され
た核酸がＲＮＡである場合には、逆転写反応により該Ｒ
ＮＡをＤＮＡに変換する。例えばＣ型肝炎ウイルス等で
は、遺伝子としてＲＮＡを有している。一方本発明で
は、ＤＮＡを増幅するためのＰＣＲ反応を利用するた
め、以下に述べる増幅工程に先立ち、ＲＮＡを増幅し得
るＤＮＡに変換する。この工程は、通常の逆転写反応に
より、分離したＲＮＡを鋳型としてＤＮＡを合成するこ
とにより達成できる。
れ、好ましくは洗浄された核酸について、まず分離され
た核酸がＲＮＡである場合には、逆転写反応により該Ｒ
ＮＡをＤＮＡに変換する。例えばＣ型肝炎ウイルス等で
は、遺伝子としてＲＮＡを有している。一方本発明で
は、ＤＮＡを増幅するためのＰＣＲ反応を利用するた
め、以下に述べる増幅工程に先立ち、ＲＮＡを増幅し得
るＤＮＡに変換する。この工程は、通常の逆転写反応に
より、分離したＲＮＡを鋳型としてＤＮＡを合成するこ
とにより達成できる。
【００３７】次に、分離された核酸又は前記工程で逆転
写反応により得られた核酸を、少なくとも特定配列を増
幅するのに適したオリゴヌクレオチドプローブ、モノヌ
クレオチド三燐酸混合物、ポリメレース及びインターカ
レーター性蛍光色素を含むポリメレースチェーンリアク
ション反応液中でＰＣＲ反応に供する。ここでオリゴヌ
クレオチドプローブは、適当な塩基長を有し、ＰＣＲ反
応が進行した場合に、特定配列を含むＤＮＡ断片を産出
するために必要な、最終的に産出されるＤＮＡ断片の
５′末端に位置すべき２種以上のオリゴヌクレオチドで
あり、検出しようとする特定配列に応じて、適宜選択す
ることができる。
写反応により得られた核酸を、少なくとも特定配列を増
幅するのに適したオリゴヌクレオチドプローブ、モノヌ
クレオチド三燐酸混合物、ポリメレース及びインターカ
レーター性蛍光色素を含むポリメレースチェーンリアク
ション反応液中でＰＣＲ反応に供する。ここでオリゴヌ
クレオチドプローブは、適当な塩基長を有し、ＰＣＲ反
応が進行した場合に、特定配列を含むＤＮＡ断片を産出
するために必要な、最終的に産出されるＤＮＡ断片の
５′末端に位置すべき２種以上のオリゴヌクレオチドで
あり、検出しようとする特定配列に応じて、適宜選択す
ることができる。
【００３８】本発明で使用するインターカレーター性蛍
光色素としては、例えばエチジュームブロマイド、アク
リジンオレンジ、ビスベンチミド、ジアミノフェニルイ
ンドール、アクチノマイシン、チアゾール、クロモマイ
シン並びにこれらの誘導体等を例示できる。ＰＣＲ反応
それ自体は、特定配列及び該配列に相補的配列のそれぞ
れの３′末端側部分に、それぞれ相補的なオリゴヌクレ
オチドプライマーをハイブリダイズさせた状態でポリメ
レースによる５′末端から３′末端への伸長反応を行
い、産生する二重鎖を解離させる操作を１サイクルと
し、これを適当回数繰り返せば良い。
光色素としては、例えばエチジュームブロマイド、アク
リジンオレンジ、ビスベンチミド、ジアミノフェニルイ
ンドール、アクチノマイシン、チアゾール、クロモマイ
シン並びにこれらの誘導体等を例示できる。ＰＣＲ反応
それ自体は、特定配列及び該配列に相補的配列のそれぞ
れの３′末端側部分に、それぞれ相補的なオリゴヌクレ
オチドプライマーをハイブリダイズさせた状態でポリメ
レースによる５′末端から３′末端への伸長反応を行
い、産生する二重鎖を解離させる操作を１サイクルと
し、これを適当回数繰り返せば良い。
【００３９】蛍光強度変化は、ＰＣＲ反応前後又はＰＣ
Ｒ反応中のＰＣＲ反応液について測定する。インターカ
レーター性蛍光色素は、二重鎖ＤＮＡに取り込まれるこ
とで蛍光特性が変化するため、ＰＣＲ前後又はＰＣＲ反
応中の蛍光強度は、分離されたＤＮＡ又はＲＮＡが特定
配列を有しているか否かを示すのである。
Ｒ反応中のＰＣＲ反応液について測定する。インターカ
レーター性蛍光色素は、二重鎖ＤＮＡに取り込まれるこ
とで蛍光特性が変化するため、ＰＣＲ前後又はＰＣＲ反
応中の蛍光強度は、分離されたＤＮＡ又はＲＮＡが特定
配列を有しているか否かを示すのである。
【００４０】以上の特定配列の検出方法においては、Ｐ
ＣＲ反応を開始した後は試薬を追加する必要がない。従
って、例えばＰＣＲ反応液を添加した容器を用意し、こ
れに抽出した核酸又はそれを逆転写反応することで得ら
れた核酸を該容器に添加した後は、容器を完全に密封
し、密封状態でＰＣＲ反応工程及び蛍光強度測定工程を
実施すれば、エアロゾルの発生確率をより減少させるこ
とができる。
ＣＲ反応を開始した後は試薬を追加する必要がない。従
って、例えばＰＣＲ反応液を添加した容器を用意し、こ
れに抽出した核酸又はそれを逆転写反応することで得ら
れた核酸を該容器に添加した後は、容器を完全に密封
し、密封状態でＰＣＲ反応工程及び蛍光強度測定工程を
実施すれば、エアロゾルの発生確率をより減少させるこ
とができる。
【００４１】そして本発明は、上記で説明してきた核酸
抽出を実施するための試薬セットをも提供する。該試薬
セットは、先に説明したキャリアー及び試薬Ｃを含むも
ので、これらは、実際に使用されるまで分離された状態
に維持される。例えば、キャリアーは固体状で、そして
試薬Ｃは液体状で、それぞれ別の容器に封入されている
ような形態が例示できる。
抽出を実施するための試薬セットをも提供する。該試薬
セットは、先に説明したキャリアー及び試薬Ｃを含むも
ので、これらは、実際に使用されるまで分離された状態
に維持される。例えば、キャリアーは固体状で、そして
試薬Ｃは液体状で、それぞれ別の容器に封入されている
ような形態が例示できる。
【００４２】本発明の試薬セットは、本発明の核酸抽出
法や、核酸の特定配列の検出方法において反応空間を提
供しうる、適当なプラスチック材料で構成された反応管
などを含んでいてもよい。特に核酸の特定配列の検出を
も行う場合には、密封可能な前記反応管を含むことが好
ましい。
法や、核酸の特定配列の検出方法において反応空間を提
供しうる、適当なプラスチック材料で構成された反応管
などを含んでいてもよい。特に核酸の特定配列の検出を
も行う場合には、密封可能な前記反応管を含むことが好
ましい。
【００４３】このように、試薬セット中に反応管が含ま
れる場合には、例えばキャリアーを該管中に凍結乾燥等
して添加しておくことで、単に試料を添加し、後に試薬
Ｃを添加するのみで核酸抽出などが可能な試薬セットが
提供される。
れる場合には、例えばキャリアーを該管中に凍結乾燥等
して添加しておくことで、単に試料を添加し、後に試薬
Ｃを添加するのみで核酸抽出などが可能な試薬セットが
提供される。
【００４４】
【実施例】以下、本発明を更に詳細に説明するために実
施例を記載するが、本発明はこれら実施例に限定される
わけではない。 実施例１ 培養細胞からの核酸の抽出 マウスの骨髄腫細胞とＣＥＡ（癌胎児性抗原）で感作し
たマウスのリンパ球細胞とのハイブリドーマ細胞をＤＭ
ＥＭ培地で培養した。培養液１ｍｌ当たりＣＥＬ細胞が
４０万となった時点で、１００μｌの培養液を容量０．
５ｍｌのサンプリングチューブに取得し、７０００ｒｐ
ｍで１分間遠心分離し上清を除去後、培地２０μｌで懸
濁した。懸濁液に対してデキストラン（分子量５０万）
１μｌ（１０μｇ）を添加し混合後、試薬Ｃ（２．４Ｍ
チオシアン酸グアニジン、１５ｍＭクエン酸ナトリウ
ム、０．３％Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム、６
０％イソプロピルアルコール）を１００μｌ添加後、２
０秒程攪拌し、続いて１５０００ｒｐｍで２分間遠心分
離して沈殿物に核酸を抽出した。上清を捨て、沈殿物に
２００ｍＭ塩化カリウムを含む４０％イソプロピルアル
コールを１００μｌ添加し、２０秒程攪拌し、続いて１
５０００ｒｐｍで１分間遠心分離して上清を捨て沈殿物
に核酸を抽出した。またこの沈殿物について Kissaneと
Robinsの蛍光法（J.Biol.Chem. 233:184, 1958）により
ＤＮＡ量を測定した。さらに沈殿物を灰化処理した後、
リン定量（Anal. Chem. 28:1756, 1956）により沈殿物
中の総核酸量（ＤＮＡ＋ＲＮＡ量）を測定した。ＲＮＡ
量は、総核酸量（ＤＮＡ＋ＲＮＡ量）からＤＮＡ量を減
じて算出した。
施例を記載するが、本発明はこれら実施例に限定される
わけではない。 実施例１ 培養細胞からの核酸の抽出 マウスの骨髄腫細胞とＣＥＡ（癌胎児性抗原）で感作し
たマウスのリンパ球細胞とのハイブリドーマ細胞をＤＭ
ＥＭ培地で培養した。培養液１ｍｌ当たりＣＥＬ細胞が
４０万となった時点で、１００μｌの培養液を容量０．
５ｍｌのサンプリングチューブに取得し、７０００ｒｐ
ｍで１分間遠心分離し上清を除去後、培地２０μｌで懸
濁した。懸濁液に対してデキストラン（分子量５０万）
１μｌ（１０μｇ）を添加し混合後、試薬Ｃ（２．４Ｍ
チオシアン酸グアニジン、１５ｍＭクエン酸ナトリウ
ム、０．３％Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム、６
０％イソプロピルアルコール）を１００μｌ添加後、２
０秒程攪拌し、続いて１５０００ｒｐｍで２分間遠心分
離して沈殿物に核酸を抽出した。上清を捨て、沈殿物に
２００ｍＭ塩化カリウムを含む４０％イソプロピルアル
コールを１００μｌ添加し、２０秒程攪拌し、続いて１
５０００ｒｐｍで１分間遠心分離して上清を捨て沈殿物
に核酸を抽出した。またこの沈殿物について Kissaneと
Robinsの蛍光法（J.Biol.Chem. 233:184, 1958）により
ＤＮＡ量を測定した。さらに沈殿物を灰化処理した後、
リン定量（Anal. Chem. 28:1756, 1956）により沈殿物
中の総核酸量（ＤＮＡ＋ＲＮＡ量）を測定した。ＲＮＡ
量は、総核酸量（ＤＮＡ＋ＲＮＡ量）からＤＮＡ量を減
じて算出した。
【００４５】比較のためプロテアーゼＫ／フェノール法
およびＡＧＰＣ法で同一試料から核酸を抽出した。
およびＡＧＰＣ法で同一試料から核酸を抽出した。
【００４６】プロテアーゼＫ／フェノール法は、Kelle
r,G.Hらによる方法（Anal. Biochem.170:441-450, 198
8）に従った。まず容量０．５ｍｌサンプリングチュー
ブ中の細胞懸濁液２０μｌに、試薬（１５０ｍＭ塩化ナ
トリウム、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭトリスｐＨ
８、２％ＳＤＳ、２５０μｇ／ｍｌプロテアーゼＫ）を
４０μｌ添加し２０秒程攪拌し、５０℃で１時間インキ
ュベーションした。次に溶液（フェノール：クロロホル
ム：イソアミルアルコール＝２５：２４：１）を６０μ
ｌ添加し２０秒程攪拌する。１０分間、１５０００ｒｐ
ｍで遠心分離した。上清（水相）を４０μｌ分取し、４
Ｍ酢酸カリウムを８μｌ添加し、さらにグリコーゲン１
０μｇ（１μｌ）とイソプロピルアルコールを５０μｌ
添加し攪拌した後、−２０℃で３０分間冷却した後、上
清を捨て、沈殿物に７５％エタノールを１００μｌ添加
し攪拌した。４℃で２０分間遠心分離して上清を捨て沈
殿物に核酸を抽出した。
r,G.Hらによる方法（Anal. Biochem.170:441-450, 198
8）に従った。まず容量０．５ｍｌサンプリングチュー
ブ中の細胞懸濁液２０μｌに、試薬（１５０ｍＭ塩化ナ
トリウム、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭトリスｐＨ
８、２％ＳＤＳ、２５０μｇ／ｍｌプロテアーゼＫ）を
４０μｌ添加し２０秒程攪拌し、５０℃で１時間インキ
ュベーションした。次に溶液（フェノール：クロロホル
ム：イソアミルアルコール＝２５：２４：１）を６０μ
ｌ添加し２０秒程攪拌する。１０分間、１５０００ｒｐ
ｍで遠心分離した。上清（水相）を４０μｌ分取し、４
Ｍ酢酸カリウムを８μｌ添加し、さらにグリコーゲン１
０μｇ（１μｌ）とイソプロピルアルコールを５０μｌ
添加し攪拌した後、−２０℃で３０分間冷却した後、上
清を捨て、沈殿物に７５％エタノールを１００μｌ添加
し攪拌した。４℃で２０分間遠心分離して上清を捨て沈
殿物に核酸を抽出した。
【００４７】ＡＧＰＣ法は、Chomczymski.P らによる方
法（Anal. Biochem. 162:156-159,1987 ）に従った。ま
ず容量０．５ｍｌサンプリングチューブ中の細胞懸濁液
２０μｌに、試薬（６Ｍチオシアン酸グアニジン、３
７．５ｍＭクエン酸ナトリウム、０．７５％Ｎ−ラウロ
イルサルコシンナトリウム、０．１５Ｍ ２−メルカプ
トエタノール）を４０μｌ添加し２０秒程攪拌し、さら
に２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４）を６μｌ添加し２０秒
程攪拌した。次に水で飽和したフェノールを６μｌ添加
し２０秒程攪拌した。次に溶液（クロロホルム：イソア
ミルアルコール＝４９：１）を１２μｌ添加し２０秒程
攪拌した。次に混合溶液を１５分間氷水中で冷却した
後、４℃で２０分間、１５０００ｒｐｍで遠心分離し
た。上清（水相）を６０μｌ分取しイソプロピルアルコ
ールを６０μｌ添加し攪拌した後、−２０℃で１時間冷
却した。冷却後、上清を捨て、沈殿物に７５％エタノー
ルを１００μｌ添加し攪拌した。最後に４℃で２０分間
遠心分離して上清を捨て沈殿物に核酸を抽出した。沈殿
物を上記と同様に分析した。結果を表１に示す。表１に
よれば本発明の方法は、抽出効率の面において優位性を
示した。
法（Anal. Biochem. 162:156-159,1987 ）に従った。ま
ず容量０．５ｍｌサンプリングチューブ中の細胞懸濁液
２０μｌに、試薬（６Ｍチオシアン酸グアニジン、３
７．５ｍＭクエン酸ナトリウム、０．７５％Ｎ−ラウロ
イルサルコシンナトリウム、０．１５Ｍ ２−メルカプ
トエタノール）を４０μｌ添加し２０秒程攪拌し、さら
に２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４）を６μｌ添加し２０秒
程攪拌した。次に水で飽和したフェノールを６μｌ添加
し２０秒程攪拌した。次に溶液（クロロホルム：イソア
ミルアルコール＝４９：１）を１２μｌ添加し２０秒程
攪拌した。次に混合溶液を１５分間氷水中で冷却した
後、４℃で２０分間、１５０００ｒｐｍで遠心分離し
た。上清（水相）を６０μｌ分取しイソプロピルアルコ
ールを６０μｌ添加し攪拌した後、−２０℃で１時間冷
却した。冷却後、上清を捨て、沈殿物に７５％エタノー
ルを１００μｌ添加し攪拌した。最後に４℃で２０分間
遠心分離して上清を捨て沈殿物に核酸を抽出した。沈殿
物を上記と同様に分析した。結果を表１に示す。表１に
よれば本発明の方法は、抽出効率の面において優位性を
示した。
【００４８】
【表１】
実施例２ 大腸菌からの抽出
大腸菌（ＪＭ１０９）をＬ−Ｂｒｏｔｈ培地で培養し
た。培養液１ｍｌ当たり大腸菌２×１０8となった時点
で、１ｍｌの培養液を容量１．５ｍｌのサンプリングチ
ューブに取得し、７０００ｒｐｍで１分間遠心分離し上
清を除去後、培地５０μｌで懸濁した。懸濁液に対して
デキストラン２μｌ（分子量５０万、２０μｇ）を添加
し混合後、試薬Ｃ（２．４Ｍチオシアン酸グアニジン、
１５ｍＭクエン酸ナトリウム、０．３％Ｎ−ラウロイル
サルコシンナトリウム、６０％イソプロピルアルコー
ル）を２５０μｌ添加後、２０秒程攪拌し、続いて１５
０００ｒｐｍで２分間遠心分離して沈殿物に核酸を抽出
した。上清を捨て、沈殿物に２００ｍＭ塩化カリウムを
含む４０％イソプロピルアルコールを２５０μｌ添加
後、２０秒程攪拌し、続いて１５０００ｒｐｍで１分間
遠心分離して上清を捨て沈殿物に核酸を抽出した。実施
例１と同様にＤＮＡ量および総核酸量（ＤＮＡ＋ＲＮＡ
量）を測定し、ＲＮＡ量を算出した。結果を表２に示
す。
た。培養液１ｍｌ当たり大腸菌２×１０8となった時点
で、１ｍｌの培養液を容量１．５ｍｌのサンプリングチ
ューブに取得し、７０００ｒｐｍで１分間遠心分離し上
清を除去後、培地５０μｌで懸濁した。懸濁液に対して
デキストラン２μｌ（分子量５０万、２０μｇ）を添加
し混合後、試薬Ｃ（２．４Ｍチオシアン酸グアニジン、
１５ｍＭクエン酸ナトリウム、０．３％Ｎ−ラウロイル
サルコシンナトリウム、６０％イソプロピルアルコー
ル）を２５０μｌ添加後、２０秒程攪拌し、続いて１５
０００ｒｐｍで２分間遠心分離して沈殿物に核酸を抽出
した。上清を捨て、沈殿物に２００ｍＭ塩化カリウムを
含む４０％イソプロピルアルコールを２５０μｌ添加
後、２０秒程攪拌し、続いて１５０００ｒｐｍで１分間
遠心分離して上清を捨て沈殿物に核酸を抽出した。実施
例１と同様にＤＮＡ量および総核酸量（ＤＮＡ＋ＲＮＡ
量）を測定し、ＲＮＡ量を算出した。結果を表２に示
す。
【００４９】
【表２】
実施例３ Ｂ型肝炎ウイルスＤＮＡの抽出
デキストラン１μｌ（分子量５０万、１０μｇ）を分注
した容量０．５ｍｌのサンプリングチューブにＢ型肝炎
患者血清２０μｌを分注し、試薬Ｃ（２．４Ｍチオシア
ン酸グアニジン、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、６０％
イソプロピルアルコール）を１００μｌ添加後、２０秒
程攪拌し、１５０００ｒｐｍで２分間遠心分離して沈殿
物に核酸を抽出した。上清を捨て、２００ｍＭ塩化カリ
ウムを含む４０％イソプロピルアルコールを１００μｌ
を添加後、２０秒程攪拌し、１５０００ｒｐｍで１分間
遠心分離して上清を捨て、沈殿物に核酸を抽出した。
した容量０．５ｍｌのサンプリングチューブにＢ型肝炎
患者血清２０μｌを分注し、試薬Ｃ（２．４Ｍチオシア
ン酸グアニジン、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、６０％
イソプロピルアルコール）を１００μｌ添加後、２０秒
程攪拌し、１５０００ｒｐｍで２分間遠心分離して沈殿
物に核酸を抽出した。上清を捨て、２００ｍＭ塩化カリ
ウムを含む４０％イソプロピルアルコールを１００μｌ
を添加後、２０秒程攪拌し、１５０００ｒｐｍで１分間
遠心分離して上清を捨て、沈殿物に核酸を抽出した。
【００５０】この沈殿物に対し、ＰＣＲ試薬（宝酒造
（株）製）を２５μｌ分注し、ＤＮＡＴｈｅｒｍａｌ
Ｃｙｃｌｅｒ（Perkin-Elmer-Cetus社製）でを用いて４
０サイクルのＰＣＲを行った。なおその条件は以下の通
りである（以下のプライマーはＢ型肝炎ウイルス（ＨＢ
Ｖ）の核酸を特異的に増幅するためのプライマーであ
る）。
（株）製）を２５μｌ分注し、ＤＮＡＴｈｅｒｍａｌ
Ｃｙｃｌｅｒ（Perkin-Elmer-Cetus社製）でを用いて４
０サイクルのＰＣＲを行った。なおその条件は以下の通
りである（以下のプライマーはＢ型肝炎ウイルス（ＨＢ
Ｖ）の核酸を特異的に増幅するためのプライマーであ
る）。
【００５１】各サイクルの時間
変性 ９４℃ １分
アニーリング ５５℃ ４５秒
合成 ７２℃ １分
プライマーの塩基配列
５′−ＧＧＡＣＴＴＣＴＣＴＣＡＡＴＴＴＴＣＴＡＧＧ
Ｇ−３′ ５′−ＣＡＡＡＴＧＧＣＡＣＴＡＧＴＡＡＡＣＴＧＡＧ
Ｃ−３′ ＰＣＲ反応終了後電気泳動し、エチジウムブロマイド染
色によりバンドの濃さを確認した。結果を図１に示す。 実施例４ Ｃ型肝炎ウイルスＲＮＡの抽出 デキストラン１μｌ（分子量５０万、１０μｇ）を分注
した容量０．５ｍｌのサンプリングチューブにＣ型肝炎
患者血清２０μｌを分注し、試薬Ｃ（２．４Ｍチオシア
ン酸グアニジン、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、６０％
イソプロピルアルコール）を１００μｌ添加後、２０秒
程攪拌し、１５０００ｒｐｍで２分間遠心分離して沈殿
物に核酸を抽出した。上清を捨て、２００ｍＭ塩化カリ
ウムを含む４０％イソプロピルアルコールを１００μｌ
を添加後、２０秒程攪拌し、１５０００ｒｐｍで１分間
遠心分離して上清を捨て、沈殿物に核酸を抽出した。
Ｇ−３′ ５′−ＣＡＡＡＴＧＧＣＡＣＴＡＧＴＡＡＡＣＴＧＡＧ
Ｃ−３′ ＰＣＲ反応終了後電気泳動し、エチジウムブロマイド染
色によりバンドの濃さを確認した。結果を図１に示す。 実施例４ Ｃ型肝炎ウイルスＲＮＡの抽出 デキストラン１μｌ（分子量５０万、１０μｇ）を分注
した容量０．５ｍｌのサンプリングチューブにＣ型肝炎
患者血清２０μｌを分注し、試薬Ｃ（２．４Ｍチオシア
ン酸グアニジン、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、６０％
イソプロピルアルコール）を１００μｌ添加後、２０秒
程攪拌し、１５０００ｒｐｍで２分間遠心分離して沈殿
物に核酸を抽出した。上清を捨て、２００ｍＭ塩化カリ
ウムを含む４０％イソプロピルアルコールを１００μｌ
を添加後、２０秒程攪拌し、１５０００ｒｐｍで１分間
遠心分離して上清を捨て、沈殿物に核酸を抽出した。
【００５２】この沈殿物に対し、逆転写試薬（宝酒造
（株）製）を１０μｌ分注し溶解後、ＤＮＡ Ｔｈｅｒ
ｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（Perkin-Elmer-Cetus社製）で逆
転写反応を行った。なお、その条件は以下のとおりであ
る。
（株）製）を１０μｌ分注し溶解後、ＤＮＡ Ｔｈｅｒ
ｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（Perkin-Elmer-Cetus社製）で逆
転写反応を行った。なお、その条件は以下のとおりであ
る。
【００５３】
アニーリング ２５℃ １０分
合成 ４２℃ ３０分
逆転写酵素失活 ９９℃ ５分
保存 ２５℃
次に上記逆転写反応溶液５μｌにＰＣＲ試薬２０μｌを
分注し、ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（Perk
in-Elmer-Cetus社製）で４０サイクルのＰＣＲを行っ
た。その条件は以下のとおりである（以下のプライマー
は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の核酸を特異的に増幅
するためのプライマーである）。
分注し、ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（Perk
in-Elmer-Cetus社製）で４０サイクルのＰＣＲを行っ
た。その条件は以下のとおりである（以下のプライマー
は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の核酸を特異的に増幅
するためのプライマーである）。
【００５４】
各サイクルの時間
変性 ９５℃ ３０秒
アニーリング ６５℃ ３０秒
合成 ７２℃ １分
プライマーの塩基配列
５′−ＣＴＣＣＡＣＣＡＴＡＧＡＴＣＡＣＴＣＣＣＣ−
３′ ５′−ＧＣＡＣＴＣＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴ −
３′ ＰＣＲ反応終了後電気泳動を行い、エチジウムブロマイ
ド染色によりバンドの濃さを確認した。結果を図２に示
す。 実施例５ Ｃ型肝炎ウイルスＲＮＡの抽出 デキストラン２μｌ（分子量５０万、２０μｇ）を分注
した容量１．５ｍｌのサンプリングチューブにＣ型肝炎
患者血清１００μｌを分注し、試薬Ｃ（２．４Ｍチオシ
アン酸グアニジン、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、６０
％イソプロピルアルコール）を５００μｌ添加後、２０
秒程攪拌し、１５０００ｒｐｍで３分間遠心分離して沈
殿物に核酸を抽出した。上清を捨て、２００ｍＭ塩化カ
リウムを含む４０％イソプロピルアルコールを２００μ
ｌを添加後、２０秒程攪拌し、１５０００ｒｐｍで１分
間遠心分離して上清を捨て、沈殿物に核酸を抽出した。
３′ ５′−ＧＣＡＣＴＣＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴ −
３′ ＰＣＲ反応終了後電気泳動を行い、エチジウムブロマイ
ド染色によりバンドの濃さを確認した。結果を図２に示
す。 実施例５ Ｃ型肝炎ウイルスＲＮＡの抽出 デキストラン２μｌ（分子量５０万、２０μｇ）を分注
した容量１．５ｍｌのサンプリングチューブにＣ型肝炎
患者血清１００μｌを分注し、試薬Ｃ（２．４Ｍチオシ
アン酸グアニジン、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、６０
％イソプロピルアルコール）を５００μｌ添加後、２０
秒程攪拌し、１５０００ｒｐｍで３分間遠心分離して沈
殿物に核酸を抽出した。上清を捨て、２００ｍＭ塩化カ
リウムを含む４０％イソプロピルアルコールを２００μ
ｌを添加後、２０秒程攪拌し、１５０００ｒｐｍで１分
間遠心分離して上清を捨て、沈殿物に核酸を抽出した。
【００５５】この沈殿に対し、逆転写試薬２０μｌ分注
し溶解後、実施例４と同じ条件で逆転写反応を行った。
次に上記逆転写反応溶液１０μｌにＰＣＲ試薬４０μｌ
を分注し実施例４と同じ条件でＰＣＲ反応をおこなっ
た。
し溶解後、実施例４と同じ条件で逆転写反応を行った。
次に上記逆転写反応溶液１０μｌにＰＣＲ試薬４０μｌ
を分注し実施例４と同じ条件でＰＣＲ反応をおこなっ
た。
【００５６】比較のため、ヨウ化ナトリウム法（Ishiza
wa.Mらによる方法、Nucleic Acid Res. 19(20):5792, 1
991）で抽出した。先ず容量１．５ｍｌのサンプリング
チューブにＣ型肝炎患者血清１００μｌを分注し、試薬
（６Ｍ ＮａＩ、１３ｍＭＥＤＴＡ、０．５％ Ｎ−ラ
ウロイルサルコシンナトリウム、１０μｇ グリコーゲ
ン、Tris-HCl p11A）を３００μｌ添加後、２０秒程攪
拌し、６０℃で１５分間インキュベーションした。イン
キュベーション後、イソプロピルアルコールを４００μ
ｌ添加後、２０秒程攪拌し１５分間静置した。静置後、
１５０００ｒｐｍで５分間遠心分離して上清を捨てた。
次に４０％イソプロピルアルコールを１０００μｌを添
加後、２０秒程攪拌し、１５０００ｒｐｍで５分間遠心
分離して上清を捨て、沈殿物に核酸を抽出した。この沈
殿に対し上記と同様に逆転写反応及びＰＣＲを行った。
ＰＣＲ反応終了後、ＰＣＲ反応溶液１０μｌを高速液体
クロマトグラフィー（東ソー（株）製）で分析した。カ
ラムには、ゲル濾過クロマトグラフィー用ＴＳＫｇｅ
ｌ、Ｇ４０００ＳＷを用い、２６０ｎｍの紫外吸収（Ｕ
Ｖ８０００、東ソー（株）製）にて検出した。溶離液に
はリン酸カリウム緩衝液（０．１Ｍ，ｐＨ６．８）、流
量１ｍｌ／ｍｉｎを用いた。結果を表３に示す。本発明
の方法ではＰＣＲ反応溶液１０μｌ当たりＰＣＲ増幅産
物は平均２６ｎｇであったのに対し、ヨウ化ナトリウム
法では３ｎｇであった。
wa.Mらによる方法、Nucleic Acid Res. 19(20):5792, 1
991）で抽出した。先ず容量１．５ｍｌのサンプリング
チューブにＣ型肝炎患者血清１００μｌを分注し、試薬
（６Ｍ ＮａＩ、１３ｍＭＥＤＴＡ、０．５％ Ｎ−ラ
ウロイルサルコシンナトリウム、１０μｇ グリコーゲ
ン、Tris-HCl p11A）を３００μｌ添加後、２０秒程攪
拌し、６０℃で１５分間インキュベーションした。イン
キュベーション後、イソプロピルアルコールを４００μ
ｌ添加後、２０秒程攪拌し１５分間静置した。静置後、
１５０００ｒｐｍで５分間遠心分離して上清を捨てた。
次に４０％イソプロピルアルコールを１０００μｌを添
加後、２０秒程攪拌し、１５０００ｒｐｍで５分間遠心
分離して上清を捨て、沈殿物に核酸を抽出した。この沈
殿に対し上記と同様に逆転写反応及びＰＣＲを行った。
ＰＣＲ反応終了後、ＰＣＲ反応溶液１０μｌを高速液体
クロマトグラフィー（東ソー（株）製）で分析した。カ
ラムには、ゲル濾過クロマトグラフィー用ＴＳＫｇｅ
ｌ、Ｇ４０００ＳＷを用い、２６０ｎｍの紫外吸収（Ｕ
Ｖ８０００、東ソー（株）製）にて検出した。溶離液に
はリン酸カリウム緩衝液（０．１Ｍ，ｐＨ６．８）、流
量１ｍｌ／ｍｉｎを用いた。結果を表３に示す。本発明
の方法ではＰＣＲ反応溶液１０μｌ当たりＰＣＲ増幅産
物は平均２６ｎｇであったのに対し、ヨウ化ナトリウム
法では３ｎｇであった。
【００５７】
【表３】
実施例６ Ｂ型肝炎ウイルスＤＮＡの抽出
デキストラン１μｌ（分子量５０万、１０μｇ）を分注
した容量０．５ｍｌのサンプリングチューブにＢ型肝炎
患者血清２０μｌを分注し、以下に示した試薬Ｃをそれ
ぞれのサンプルに添加混合した。
した容量０．５ｍｌのサンプリングチューブにＢ型肝炎
患者血清２０μｌを分注し、以下に示した試薬Ｃをそれ
ぞれのサンプルに添加混合した。
【００５８】２．４Ｍチオシアン酸グアニジン、１５
ｍＭクエン酸ナトリウム及び６０％イソプロピルアルコ
ールを含む試薬Ｃを１００μｌ、 ２．４Ｍチオシアン酸カリウム、１５ｍＭクエン酸ナ
トリウム及び６０％イソプロピルアルコールを含む試薬
Ｃを１００μｌ、 ３．２Ｍ塩酸グアニジン、１５ｍＭクエン酸ナトリウ
ム及び６０％イソプロピルアルコールを含む試薬Ｃを１
００μｌ、 試薬Ｃを添加混合後、１５０００ｒｐｍで２分間遠心分
離して沈殿物に核酸を抽出した。上清を捨て、２００ｍ
Ｍ塩化カリウムを含む４０％イソプロパノールを１００
μｌを添加後、２０秒程攪拌し、１５０００ｒｐｍで１
分間遠心分離して上清を捨て、沈殿物に核酸を抽出し
た。以上の溶液を使用して抽出した核酸について、実施
例３と同じ条件でＰＣＲを行い、反応終了後、電気泳動
でバンドの濃さを比較した。結果を図３に示す。その結
果、これら試薬Ｃを用いた場合、〜についてバンド
の濃さはほぼ同等であった。 実施例７ Ｂ型肝炎ウイルスＤＮＡの抽出 デキストラン１μｌ（分子量５０万、１０μｇ）を分注
した容量０．５ｍｌのサンプリングチューブにＢ型肝炎
患者血清２０μｌを分注し、以下に示した試薬Ｃをそれ
ぞれのサンプルに添加混合した。
ｍＭクエン酸ナトリウム及び６０％イソプロピルアルコ
ールを含む試薬Ｃを１００μｌ、 ２．４Ｍチオシアン酸カリウム、１５ｍＭクエン酸ナ
トリウム及び６０％イソプロピルアルコールを含む試薬
Ｃを１００μｌ、 ３．２Ｍ塩酸グアニジン、１５ｍＭクエン酸ナトリウ
ム及び６０％イソプロピルアルコールを含む試薬Ｃを１
００μｌ、 試薬Ｃを添加混合後、１５０００ｒｐｍで２分間遠心分
離して沈殿物に核酸を抽出した。上清を捨て、２００ｍ
Ｍ塩化カリウムを含む４０％イソプロパノールを１００
μｌを添加後、２０秒程攪拌し、１５０００ｒｐｍで１
分間遠心分離して上清を捨て、沈殿物に核酸を抽出し
た。以上の溶液を使用して抽出した核酸について、実施
例３と同じ条件でＰＣＲを行い、反応終了後、電気泳動
でバンドの濃さを比較した。結果を図３に示す。その結
果、これら試薬Ｃを用いた場合、〜についてバンド
の濃さはほぼ同等であった。 実施例７ Ｂ型肝炎ウイルスＤＮＡの抽出 デキストラン１μｌ（分子量５０万、１０μｇ）を分注
した容量０．５ｍｌのサンプリングチューブにＢ型肝炎
患者血清２０μｌを分注し、以下に示した試薬Ｃをそれ
ぞれのサンプルに添加混合した。
【００５９】２．４Ｍチオシアン酸グアニジン、１５
ｍＭクエン酸ナトリウム、６０ｍＭ２−メルカプトエタ
ノール、０．３％Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム
及び６０％ｎ−プロピルアルコールを含む試薬Ｃを１０
０μｌ、 ２．４Ｍチオシアン酸グアニジン、１５ｍＭクエン酸
ナトリウム、６０ｍＭ２−メルカプトエタノール、０．
３％Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム及び６０％イ
ソプロピルアルコールを含む試薬Ｃを１００μｌ、 ３Ｍチオシアン酸グアニジン、１９ｍＭクエン酸ナト
リウム、７５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．３
８％Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム及び５０％ｎ
−ブチルアルコールを含む試薬Ｃを８０μｌ、 ２．４Ｍチオシアン酸グアニジン、１５ｍＭクエン酸
ナトリウム、６０ｍＭ２−メルカプトエタノール、０．
３％Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム及び６０％ｎ
−ブチルアルコールを含む試薬Ｃを１００μｌ、 ３Ｍチオシアン酸グアニジン、１９ｍＭクエン酸ナト
リウム、７５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．３
８％Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム及び５０％ｓ
ｅｃ−ブチルアルコールを含む試薬Ｃを８０μｌ、 ２．４Ｍチオシアン酸グアニジン、１５ｍＭクエン酸
ナトリウム、６０ｍＭ２−メルカプトエタノール、０．
３％Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム及び６０％ｓ
ｅｃ−ブチルアルコールを含む試薬Ｃを１００μｌ。
ｍＭクエン酸ナトリウム、６０ｍＭ２−メルカプトエタ
ノール、０．３％Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム
及び６０％ｎ−プロピルアルコールを含む試薬Ｃを１０
０μｌ、 ２．４Ｍチオシアン酸グアニジン、１５ｍＭクエン酸
ナトリウム、６０ｍＭ２−メルカプトエタノール、０．
３％Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム及び６０％イ
ソプロピルアルコールを含む試薬Ｃを１００μｌ、 ３Ｍチオシアン酸グアニジン、１９ｍＭクエン酸ナト
リウム、７５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．３
８％Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム及び５０％ｎ
−ブチルアルコールを含む試薬Ｃを８０μｌ、 ２．４Ｍチオシアン酸グアニジン、１５ｍＭクエン酸
ナトリウム、６０ｍＭ２−メルカプトエタノール、０．
３％Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム及び６０％ｎ
−ブチルアルコールを含む試薬Ｃを１００μｌ、 ３Ｍチオシアン酸グアニジン、１９ｍＭクエン酸ナト
リウム、７５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．３
８％Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム及び５０％ｓ
ｅｃ−ブチルアルコールを含む試薬Ｃを８０μｌ、 ２．４Ｍチオシアン酸グアニジン、１５ｍＭクエン酸
ナトリウム、６０ｍＭ２−メルカプトエタノール、０．
３％Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム及び６０％ｓ
ｅｃ−ブチルアルコールを含む試薬Ｃを１００μｌ。
【００６０】試薬Ｃを添加混合後、１５０００ｒｐｍで
２分間遠心分離して沈殿物に核酸を抽出した。上清を捨
て、２００ｍＭ塩化カリウムを含む４０％イソプロパノ
ールを１００μｌを添加後、２０秒程攪拌し、１５００
０ｒｐｍで１分間遠心分離して上清を捨て、沈殿物に核
酸を抽出した。以上の溶液を使用して抽出した核酸につ
いて、実施例３と同じ条件でＰＣＲを行い、反応終了
後、電気泳動でバンドの濃さを比較した。結果を図４に
示す。その結果、これら試薬Ｃを用いた場合、〜に
ついてバンドの濃さは同等であった。 実施例８ Ｂ型肝炎ウイルスＤＮＡの抽出 デキストラン１μｌ（分子量５０万、１０μｇ）を分注
した容量０．５ｍｌのサンプリングチューブにＢ型肝炎
患者血清２０μｌを分注し、以下に示した試薬Ｃをそれ
ぞれのサンプルに添加混合した。
２分間遠心分離して沈殿物に核酸を抽出した。上清を捨
て、２００ｍＭ塩化カリウムを含む４０％イソプロパノ
ールを１００μｌを添加後、２０秒程攪拌し、１５００
０ｒｐｍで１分間遠心分離して上清を捨て、沈殿物に核
酸を抽出した。以上の溶液を使用して抽出した核酸につ
いて、実施例３と同じ条件でＰＣＲを行い、反応終了
後、電気泳動でバンドの濃さを比較した。結果を図４に
示す。その結果、これら試薬Ｃを用いた場合、〜に
ついてバンドの濃さは同等であった。 実施例８ Ｂ型肝炎ウイルスＤＮＡの抽出 デキストラン１μｌ（分子量５０万、１０μｇ）を分注
した容量０．５ｍｌのサンプリングチューブにＢ型肝炎
患者血清２０μｌを分注し、以下に示した試薬Ｃをそれ
ぞれのサンプルに添加混合した。
【００６１】３Ｍチオシアン酸グアニジン、１９ｍＭ
クエン酸ナトリウム、７５ｍＭ ２−メルカプトエタノ
ール、０．３８％Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム
及び５０％ｔｅｒｔ−アミルアルコールを含む試薬Ｃを
８０μｌ、 ２．４Ｍチオシアン酸グアニジン、１５ｍＭクエン酸
ナトリウム、６０ｍＭ２−メルカプトエタノール、０．
３％Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム及び６０％ｔ
ｅｒｔ−アミルアルコールを含む試薬Ｃを１００μｌ、 ２．４Ｍチオシアン酸グアニジン、１５ｍＭクエン酸
ナトリウム、６０ｍＭ２−メルカプトエタノール、０．
３％Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム及び６０％ｔ
ｅｒｔ−ブチルアルコールを含む試薬Ｃを１００μｌ、 ２．４Ｍチオシアン酸グアニジン、１５ｍＭクエン酸
ナトリウム、６０ｍＭ２−メルカプトエタノール、０．
３％Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム及び６０％イ
ソプロピルアルコールを含む試薬Ｃを１００μｌ。
クエン酸ナトリウム、７５ｍＭ ２−メルカプトエタノ
ール、０．３８％Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム
及び５０％ｔｅｒｔ−アミルアルコールを含む試薬Ｃを
８０μｌ、 ２．４Ｍチオシアン酸グアニジン、１５ｍＭクエン酸
ナトリウム、６０ｍＭ２−メルカプトエタノール、０．
３％Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム及び６０％ｔ
ｅｒｔ−アミルアルコールを含む試薬Ｃを１００μｌ、 ２．４Ｍチオシアン酸グアニジン、１５ｍＭクエン酸
ナトリウム、６０ｍＭ２−メルカプトエタノール、０．
３％Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム及び６０％ｔ
ｅｒｔ−ブチルアルコールを含む試薬Ｃを１００μｌ、 ２．４Ｍチオシアン酸グアニジン、１５ｍＭクエン酸
ナトリウム、６０ｍＭ２−メルカプトエタノール、０．
３％Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム及び６０％イ
ソプロピルアルコールを含む試薬Ｃを１００μｌ。
【００６２】試薬Ｃを添加混合後、１５０００ｒｐｍで
２分間遠心分離して沈殿物に核酸を抽出した。上清を捨
て、２００ｍＭ塩化カリウムを含む４０％イソプロパノ
ールを１００μｌを添加後、２０秒程攪拌し、１５００
０ｒｐｍで１分間遠心分離して上清を捨て、沈殿物に核
酸を抽出した。以上の溶液を使用して抽出した核酸につ
いて、実施例３と同じ条件でＰＣＲを行い、反応終了
後、電気泳動でバンドの濃さを比較した結果を図５に示
す。その結果、これら試薬Ｃを用いた場合、バンドの濃
さは同等であった。 実施例９ Ｃ型肝炎ウイルスＲＮＡの抽出 容量１．５ｍｌのサンプリングチューブにアクリルアミ
ド（分子量約７０万）溶液０、０．５、１、２、５μｌ
（０、５、１０、２０、５０μｇ）およびデキストラン
（分子量５０万）２μｌ（２０μｇ）をそれぞれ分注
し、さらにＣ型肝炎患者血清１００μｌを分注後、５秒
程攪拌する。次に試薬Ｃ（２．４Ｍチオシアン酸グアニ
ジン、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、６０％イソプロピ
ルアルコール）を５００μｌ添加後、２０秒程攪拌す
る。１５０００ ｒｐｍで３分間遠心分離して沈殿物に
核酸を抽出した。上清を捨て、沈殿物に２００ｍＭ塩化
カリウムを含む４０％イソプロピルアルコールを２００
μｌ添加後、２０秒程攪拌し、１５０００ｒｐｍで３分
間遠心分離して上清を捨て沈殿物に核酸を抽出した。
２分間遠心分離して沈殿物に核酸を抽出した。上清を捨
て、２００ｍＭ塩化カリウムを含む４０％イソプロパノ
ールを１００μｌを添加後、２０秒程攪拌し、１５００
０ｒｐｍで１分間遠心分離して上清を捨て、沈殿物に核
酸を抽出した。以上の溶液を使用して抽出した核酸につ
いて、実施例３と同じ条件でＰＣＲを行い、反応終了
後、電気泳動でバンドの濃さを比較した結果を図５に示
す。その結果、これら試薬Ｃを用いた場合、バンドの濃
さは同等であった。 実施例９ Ｃ型肝炎ウイルスＲＮＡの抽出 容量１．５ｍｌのサンプリングチューブにアクリルアミ
ド（分子量約７０万）溶液０、０．５、１、２、５μｌ
（０、５、１０、２０、５０μｇ）およびデキストラン
（分子量５０万）２μｌ（２０μｇ）をそれぞれ分注
し、さらにＣ型肝炎患者血清１００μｌを分注後、５秒
程攪拌する。次に試薬Ｃ（２．４Ｍチオシアン酸グアニ
ジン、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、６０％イソプロピ
ルアルコール）を５００μｌ添加後、２０秒程攪拌す
る。１５０００ ｒｐｍで３分間遠心分離して沈殿物に
核酸を抽出した。上清を捨て、沈殿物に２００ｍＭ塩化
カリウムを含む４０％イソプロピルアルコールを２００
μｌ添加後、２０秒程攪拌し、１５０００ｒｐｍで３分
間遠心分離して上清を捨て沈殿物に核酸を抽出した。
【００６３】この沈殿に対し、逆転写試薬２０μｌ分注
し溶解後実施例４と同じ条件で逆転写反応を行った。次
に上記逆転写反応溶液１０μｌにＰＣＲ試薬４０μｌを
分注し実施例４と同じ条件でＰＣＲ反応をおこなった。
ＰＣＲ反応終了後、実施例５と同様にＰＣＲ反応溶液１
０μｌを高速液体クロマトグラフィー（東ソー（株）
製）で分析した。分析結果を表４に示す。
し溶解後実施例４と同じ条件で逆転写反応を行った。次
に上記逆転写反応溶液１０μｌにＰＣＲ試薬４０μｌを
分注し実施例４と同じ条件でＰＣＲ反応をおこなった。
ＰＣＲ反応終了後、実施例５と同様にＰＣＲ反応溶液１
０μｌを高速液体クロマトグラフィー（東ソー（株）
製）で分析した。分析結果を表４に示す。
【００６４】核酸共沈物質であるアクリルアミドが無い
場合は、Ｃ型肝炎ウイルスＲＮＡが抽出されないため、
ＰＣＲ反応による増幅産物が検出されなかった。アクリ
ルアミドを２０μｇ以上添加した場合は、ＰＣＲ反応に
よる増幅産物が約３５ナノグラム検出された。デキスト
ランを２０μｇ添加した場合は、ＰＣＲ反応による増幅
産物が約４４ナノグラム検出された。
場合は、Ｃ型肝炎ウイルスＲＮＡが抽出されないため、
ＰＣＲ反応による増幅産物が検出されなかった。アクリ
ルアミドを２０μｇ以上添加した場合は、ＰＣＲ反応に
よる増幅産物が約３５ナノグラム検出された。デキスト
ランを２０μｇ添加した場合は、ＰＣＲ反応による増幅
産物が約４４ナノグラム検出された。
【００６５】
【表４】
実施例１０ Ｂ型肝炎ウイルスＤＮＡの抽出
デキストラン（分子量５０万）を、０、０．２、０．
４、０．８、１．６、３．２、６．４μｌ（０、２、
４、８、１６，３２、６４μｇ）を分注し、実施例４と
同様に抽出操作およびＰＣＲ反応を行い、ＰＣＲ反応終
了後電気泳し、エチジウムブロマイド染色によりバンド
の濃さを比較した。結果を図６に示す。その結果、核酸
共沈物質であるデキストランが無い場合は、Ｂ型肝炎ウ
イルスＤＮＡが抽出されないため、バンドが検出されな
かった。デキストランを１６μｇ以上添加した場合は、
バンドの濃さはほぼ同等であった。 実施例１１ Ｂ型肝炎ウイルスＤＮＡの抽出 デキストランに代えてカルボキシメチルセルロース（Ｓ
ＩＧＭＡ製：Ｌｏｗｖｉｓｃｏｓｉｔｙ）を１μｌ（１
０μｇ）使用した以外は実施例３と同様の抽出操作およ
びＰＣＲ反応を行い、ＰＣＲ反応終了後電気泳動し、エ
チジウムブロマイド染色によりバンドの濃さを比較し
た。結果を図７に示す。その結果、デキストランとカル
ボキシメチルセルロースのバンドの濃さはほぼ同等であ
った（参照のため、同時にデキストランを使用して抽出
操作を行った場合の結果を合わせて図７に示す）。 実施例１２ ＰＣＲ反応産物への応用 容量１．５ｍｌのサンプリングチューブにデキストラン
（分子量５０万）溶液２μｌ（２０μｇ）を分注し、Ｈ
ＢＶ−ＰＣＲ反応溶液２０μｌおよび水８０μｌを添加
し混合した。次に試薬Ｃ（２．４Ｍチオシアン酸グアニ
ジン、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、６０ｍＭ β−メ
ルカプトエタノール、６０％イソプロピルアルコール）
を５００μｌ添加後、２０秒程攪拌し、１５０００ ｒ
ｐｍで３分間遠心分離して沈殿物に核酸を抽出した。上
清を捨て、沈殿物に２００ｍＭ塩化カリウムを含む４０
％イソプロピルアルコールを１００μｌ添加後、２０秒
程攪拌し、１５０００ｒｐｍで３分間遠心分離して上清
を捨て沈殿物に核酸を抽出した。水２０μｌを沈殿物に
添加し溶解した。
４、０．８、１．６、３．２、６．４μｌ（０、２、
４、８、１６，３２、６４μｇ）を分注し、実施例４と
同様に抽出操作およびＰＣＲ反応を行い、ＰＣＲ反応終
了後電気泳し、エチジウムブロマイド染色によりバンド
の濃さを比較した。結果を図６に示す。その結果、核酸
共沈物質であるデキストランが無い場合は、Ｂ型肝炎ウ
イルスＤＮＡが抽出されないため、バンドが検出されな
かった。デキストランを１６μｇ以上添加した場合は、
バンドの濃さはほぼ同等であった。 実施例１１ Ｂ型肝炎ウイルスＤＮＡの抽出 デキストランに代えてカルボキシメチルセルロース（Ｓ
ＩＧＭＡ製：Ｌｏｗｖｉｓｃｏｓｉｔｙ）を１μｌ（１
０μｇ）使用した以外は実施例３と同様の抽出操作およ
びＰＣＲ反応を行い、ＰＣＲ反応終了後電気泳動し、エ
チジウムブロマイド染色によりバンドの濃さを比較し
た。結果を図７に示す。その結果、デキストランとカル
ボキシメチルセルロースのバンドの濃さはほぼ同等であ
った（参照のため、同時にデキストランを使用して抽出
操作を行った場合の結果を合わせて図７に示す）。 実施例１２ ＰＣＲ反応産物への応用 容量１．５ｍｌのサンプリングチューブにデキストラン
（分子量５０万）溶液２μｌ（２０μｇ）を分注し、Ｈ
ＢＶ−ＰＣＲ反応溶液２０μｌおよび水８０μｌを添加
し混合した。次に試薬Ｃ（２．４Ｍチオシアン酸グアニ
ジン、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、６０ｍＭ β−メ
ルカプトエタノール、６０％イソプロピルアルコール）
を５００μｌ添加後、２０秒程攪拌し、１５０００ ｒ
ｐｍで３分間遠心分離して沈殿物に核酸を抽出した。上
清を捨て、沈殿物に２００ｍＭ塩化カリウムを含む４０
％イソプロピルアルコールを１００μｌ添加後、２０秒
程攪拌し、１５０００ｒｐｍで３分間遠心分離して上清
を捨て沈殿物に核酸を抽出した。水２０μｌを沈殿物に
添加し溶解した。
【００６６】抽出前および抽出後のＰＣＲ反応溶液１０
μｌを、実施例５と同様に高速液体クロマトグラフィー
（東ソー（株）製）で分析した。なお、カラムには、ゲ
ル濾過クロマトグラフィー用ＴＳＫｇｅｌ、Ｇ３０００
ＳＷを用いた。結果を図８に示す。図８によりＰＣＲ増
幅産物およびプライマーオリゴマーがほぼ１００％回収
されていることが判明した。またプライマー、デオキシ
ヌクレオチドトリホスフェートが除去されていることが
判明した。 実施例１３ 抽出した核酸を用いたＰＣＲ反応 デキストラン（分子量５０万）２μｌ（２０μｇ）を分
注した容量１．５ｍｌのサンプリングチューブにＢ型肝
炎患者血清１００μｌを分注し、試薬Ｃ（２．４Ｍチオ
シアン酸グアニジン、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、６
０％イソプロピルアルコール）を５００μｌ添加後、２
０秒程攪拌し、１５０００ｒｐｍで３分間遠心分離して
沈殿物に核酸を抽出した。上清を捨て、２００ｍＭ塩化
カリウムを含む４０％イソプロピルアルコールを２００
μｌを添加後、２０秒程攪拌し、１５０００ｒｐｍで１
分間遠心分離して上清を捨て、沈殿物に核酸を抽出し
た。この沈殿に対し、ＰＣＲ試薬５０μｌを分注し実施
例３と同じ条件でＰＣＲ反応をおこなった。
μｌを、実施例５と同様に高速液体クロマトグラフィー
（東ソー（株）製）で分析した。なお、カラムには、ゲ
ル濾過クロマトグラフィー用ＴＳＫｇｅｌ、Ｇ３０００
ＳＷを用いた。結果を図８に示す。図８によりＰＣＲ増
幅産物およびプライマーオリゴマーがほぼ１００％回収
されていることが判明した。またプライマー、デオキシ
ヌクレオチドトリホスフェートが除去されていることが
判明した。 実施例１３ 抽出した核酸を用いたＰＣＲ反応 デキストラン（分子量５０万）２μｌ（２０μｇ）を分
注した容量１．５ｍｌのサンプリングチューブにＢ型肝
炎患者血清１００μｌを分注し、試薬Ｃ（２．４Ｍチオ
シアン酸グアニジン、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、６
０％イソプロピルアルコール）を５００μｌ添加後、２
０秒程攪拌し、１５０００ｒｐｍで３分間遠心分離して
沈殿物に核酸を抽出した。上清を捨て、２００ｍＭ塩化
カリウムを含む４０％イソプロピルアルコールを２００
μｌを添加後、２０秒程攪拌し、１５０００ｒｐｍで１
分間遠心分離して上清を捨て、沈殿物に核酸を抽出し
た。この沈殿に対し、ＰＣＲ試薬５０μｌを分注し実施
例３と同じ条件でＰＣＲ反応をおこなった。
【００６７】比較のため、実施例５と同様にヨウ化ナト
リウム法（Ishizawa.Mらによる方法、Nucleic Acid Re
s. 19(20):5792, 1991）で核酸を抽出し、上記と同様に
ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応終了後、ＰＣＲ反応溶
液を１０μｌを実施例５と同様に、高速液体クロマトグ
ラフィー（東ソー（株）製）で分析した。分析結果を表
５に示す。本発明の方法の場合ＰＣＲ反応溶液１０μｌ
当たりＰＣＲ増幅産物は平均７．５ｎｇに対し、ヨウ化
ナトリウム法では４．３ｎｇであった。なお、表中には
各方法につき、４サンプルずつ行った平均値を記載し
た。
リウム法（Ishizawa.Mらによる方法、Nucleic Acid Re
s. 19(20):5792, 1991）で核酸を抽出し、上記と同様に
ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応終了後、ＰＣＲ反応溶
液を１０μｌを実施例５と同様に、高速液体クロマトグ
ラフィー（東ソー（株）製）で分析した。分析結果を表
５に示す。本発明の方法の場合ＰＣＲ反応溶液１０μｌ
当たりＰＣＲ増幅産物は平均７．５ｎｇに対し、ヨウ化
ナトリウム法では４．３ｎｇであった。なお、表中には
各方法につき、４サンプルずつ行った平均値を記載し
た。
【００６８】
【表５】
実施例１４
容量１．５ｍｌの各サンプリングチューブに以下に示し
たキャリアーを分注した。
たキャリアーを分注した。
【００６９】デキストラン２μｌ（分子量５０万、２
０μｇ）、 デキストラン１μｌ（分子量５０万、１０μｇ）及び
アクリルアミド１μｌ（分子量７０万、１０μｇ）、 アクリルアミド１μｌ（分子量７０万、１０μｇ）及
びカルボキシメチルセルロース１μｌ（１０μｇ、ＳＩ
ＧＭＡ製、Ｌｏｗ ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ）。
０μｇ）、 デキストラン１μｌ（分子量５０万、１０μｇ）及び
アクリルアミド１μｌ（分子量７０万、１０μｇ）、 アクリルアミド１μｌ（分子量７０万、１０μｇ）及
びカルボキシメチルセルロース１μｌ（１０μｇ、ＳＩ
ＧＭＡ製、Ｌｏｗ ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ）。
【００７０】分注後、各サンプリングチューブにＢ型肝
炎患者血清１００μｌを分注し、試薬Ｃ（２．４Ｍチオ
シアン酸グアニジン、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、６
０％イソプロピルアルコール）を５００μｌ添加後、２
０秒程撹拌し、１５０００ｒｐｍで３分間遠心分離して
沈殿物に核酸を抽出した。上清を捨て、２００ｍＭ塩化
カリウムを含む４０％イソプロピルアルコール２００μ
ｌを添加後、２０秒程撹拌し、１５０００ｒｐｍで１分
間遠心分離して上清を捨て、沈殿物に核酸を抽出した。
炎患者血清１００μｌを分注し、試薬Ｃ（２．４Ｍチオ
シアン酸グアニジン、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、６
０％イソプロピルアルコール）を５００μｌ添加後、２
０秒程撹拌し、１５０００ｒｐｍで３分間遠心分離して
沈殿物に核酸を抽出した。上清を捨て、２００ｍＭ塩化
カリウムを含む４０％イソプロピルアルコール２００μ
ｌを添加後、２０秒程撹拌し、１５０００ｒｐｍで１分
間遠心分離して上清を捨て、沈殿物に核酸を抽出した。
【００７１】この沈殿に対し、ＰＣＲ試薬５０μｌを分
注し実施例３と同じ条件でＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ
反応終了後、ＰＣＲ反応溶液を実施例５と同様に高速液
体クロマトグラフィー（東ソー（株）製）で分析した。
分析結果を表６に示す。キャリアーは単独でも、２種混
合しても同程度にＰＣＲ増幅されていた。なお、表には
各方法につき、４サンプルずつ行った平均値を記載し
た。
注し実施例３と同じ条件でＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ
反応終了後、ＰＣＲ反応溶液を実施例５と同様に高速液
体クロマトグラフィー（東ソー（株）製）で分析した。
分析結果を表６に示す。キャリアーは単独でも、２種混
合しても同程度にＰＣＲ増幅されていた。なお、表には
各方法につき、４サンプルずつ行った平均値を記載し
た。
【００７２】
【表６】
実施例１５
デキストラン２μｌ（分子量５０万、２０μｇ）を分注
した容量０．５ｍｌのサンプリングチューブにＢ型肝炎
患者血清１００μｌを分注し、以下に示す試薬Ｃをそれ
ぞれのサンプルに添加混合した。
した容量０．５ｍｌのサンプリングチューブにＢ型肝炎
患者血清１００μｌを分注し、以下に示す試薬Ｃをそれ
ぞれのサンプルに添加混合した。
【００７３】２．４Ｍチオシアン酸グアニジン、１５
ｍＭクエン酸ナトリウム、６０％イソプロピルアルコー
ルを含む試薬Ｃを５００μｌ、 ２．４Ｍチオシアン酸グアニジン、１５ｍＭクエン酸
ナトリウム、３０％イソプロピルアルコール、３０％ｔ
ｅｒｔ−ブチルアルコールを含む試薬Ｃを５００μｌ。
ｍＭクエン酸ナトリウム、６０％イソプロピルアルコー
ルを含む試薬Ｃを５００μｌ、 ２．４Ｍチオシアン酸グアニジン、１５ｍＭクエン酸
ナトリウム、３０％イソプロピルアルコール、３０％ｔ
ｅｒｔ−ブチルアルコールを含む試薬Ｃを５００μｌ。
【００７４】試薬Ｃを添加後、１５０００ｒｐｍで３分
間遠心分離して沈殿物に核酸を抽出した。上清を捨て、
２００ｍＭ塩化カリウムを含む４０％イソプロピルアル
コール２００μｌを添加後、２０秒程撹拌し、１５００
０ｒｐｍで１分間遠心分離して上清を捨て、沈殿物に核
酸を抽出した。
間遠心分離して沈殿物に核酸を抽出した。上清を捨て、
２００ｍＭ塩化カリウムを含む４０％イソプロピルアル
コール２００μｌを添加後、２０秒程撹拌し、１５００
０ｒｐｍで１分間遠心分離して上清を捨て、沈殿物に核
酸を抽出した。
【００７５】この沈殿に対し、ＰＣＲ試薬５０μｌを分
注し実施例３と同じ条件でＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ
反応終了後、ＰＣＲ反応溶液を実施例５と同様に高速液
体クロマトグラフィー（東ソー（株）製）で分析した。
分析結果を表７に示す。試薬Ｃに含まれるアルコールが
イソプロピルアルコール１種の場合、ＰＣＲ反応溶液１
０μｌ当たりのＰＣＲ増幅産物は平均４２ｎｇであるの
に対し、イソプロピルアルコール及びｔｅｒｔ−ブチル
アルコールの２種を混合した場合、平均３３ｎｇであっ
た。なお、表には各方法につき、２サンプルずつ行った
平均値を記載した。
注し実施例３と同じ条件でＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ
反応終了後、ＰＣＲ反応溶液を実施例５と同様に高速液
体クロマトグラフィー（東ソー（株）製）で分析した。
分析結果を表７に示す。試薬Ｃに含まれるアルコールが
イソプロピルアルコール１種の場合、ＰＣＲ反応溶液１
０μｌ当たりのＰＣＲ増幅産物は平均４２ｎｇであるの
に対し、イソプロピルアルコール及びｔｅｒｔ−ブチル
アルコールの２種を混合した場合、平均３３ｎｇであっ
た。なお、表には各方法につき、２サンプルずつ行った
平均値を記載した。
【００７６】
【表７】
【発明の効果】本発明では、チオシアン酸グアニジン、
塩酸グアニジン、チオシアン酸カリウム及びチオシアン
酸ナトリウムからなる群から選ばれる１種又は２種以上
の試薬Ａと、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルア
ルコール、ｎ−ブチルアルコール、ｓｅｃ−ブチルアル
コール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、及びｔｅｒｔ−
アミルアルコールからなる群から選ばれる１種又は２種
以上の試薬Ｂを最初から混合しておくことでこれら試薬
の使用量を減少させることができる。例えば試料が１０
μｌで、最終的に２Ｍの蛋白質変性剤と５０％程度のイ
ソプロパノールが含有された状態にするならば、グアニ
ジン法では、例えば、６Ｍのグアニジン溶液を２０μｌ
添加し、続いて１００％程度のイソプロパノールを３０
μｌ添加する必要がある。これに対して本発明では、３
Ｍのチオシアン酸グアニジンを含む７５％程度のイソプ
ロパノールからなる核酸抽出試薬を２０μｌ添加すれば
済むのである。この結果、グアニジン法では、試料、２
Ｍチオシアン酸グアニジン及び５０％程度のイソプロパ
ノールを含む６０μｌの溶液が出現するのに対し、本願
発明では同濃度の溶液が３０μｌ出現するだけである。
従って、操作後に処理しなければならない廃液量も、本
願発明では少なくすることができる。加えて、本発明で
はフェノールやクロロホルム等を使用する必要がないか
ら、その取扱い等が従来技術に比較して簡便である。
塩酸グアニジン、チオシアン酸カリウム及びチオシアン
酸ナトリウムからなる群から選ばれる１種又は２種以上
の試薬Ａと、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルア
ルコール、ｎ−ブチルアルコール、ｓｅｃ−ブチルアル
コール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、及びｔｅｒｔ−
アミルアルコールからなる群から選ばれる１種又は２種
以上の試薬Ｂを最初から混合しておくことでこれら試薬
の使用量を減少させることができる。例えば試料が１０
μｌで、最終的に２Ｍの蛋白質変性剤と５０％程度のイ
ソプロパノールが含有された状態にするならば、グアニ
ジン法では、例えば、６Ｍのグアニジン溶液を２０μｌ
添加し、続いて１００％程度のイソプロパノールを３０
μｌ添加する必要がある。これに対して本発明では、３
Ｍのチオシアン酸グアニジンを含む７５％程度のイソプ
ロパノールからなる核酸抽出試薬を２０μｌ添加すれば
済むのである。この結果、グアニジン法では、試料、２
Ｍチオシアン酸グアニジン及び５０％程度のイソプロパ
ノールを含む６０μｌの溶液が出現するのに対し、本願
発明では同濃度の溶液が３０μｌ出現するだけである。
従って、操作後に処理しなければならない廃液量も、本
願発明では少なくすることができる。加えて、本発明で
はフェノールやクロロホルム等を使用する必要がないか
ら、その取扱い等が従来技術に比較して簡便である。
【００７７】本発明では核酸を沈殿として得ることがで
き、従来のように互いに混合しない２種類の液体への核
酸の溶解度の差に基づいて、核酸が溶解している液相を
他方の液相から分離することによって核酸を抽出してく
る方法に比べて、極めて簡単な操作で実施できる。従っ
てその実施には熟練を必要とせず、かつ常に安定して、
高い効率で核酸を抽出することができる。
き、従来のように互いに混合しない２種類の液体への核
酸の溶解度の差に基づいて、核酸が溶解している液相を
他方の液相から分離することによって核酸を抽出してく
る方法に比べて、極めて簡単な操作で実施できる。従っ
てその実施には熟練を必要とせず、かつ常に安定して、
高い効率で核酸を抽出することができる。
【００７８】また本発明では、前記したように試料に添
加する試薬Ｃ中の試薬Ａの濃度を低下できるから、試薬
Ａの析出も防止でき、更には試薬Ｂの濃度を下げること
ができるからその揮発も防止できる。従って、本発明は
機械を用いてこれを実施するのに都合が良い。一般に試
薬Ａや試薬Ｂは、単独では分注精度を向上することが難
しいが、本発明の核酸抽出試薬では分注精度の向上を期
待出来る。
加する試薬Ｃ中の試薬Ａの濃度を低下できるから、試薬
Ａの析出も防止でき、更には試薬Ｂの濃度を下げること
ができるからその揮発も防止できる。従って、本発明は
機械を用いてこれを実施するのに都合が良い。一般に試
薬Ａや試薬Ｂは、単独では分注精度を向上することが難
しいが、本発明の核酸抽出試薬では分注精度の向上を期
待出来る。
【００７９】本発明は、キャリアー、試薬Ａ及びＢを含
む試薬Ｃを用いることで、上記効果に加え、従来方法に
比較して高い抽出効率を達成し得る方法である。
む試薬Ｃを用いることで、上記効果に加え、従来方法に
比較して高い抽出効率を達成し得る方法である。
【００８０】また、本発明が提供する特定配列の検出方
法は、ＰＣＲ反応及び蛍光強度測定を密封容器内で実施
し得るものである。従って、単なるＰＣＲ法により核酸
を増幅し、増幅した核酸を検出する方法等に比較して、
操作も簡便であり、しかもエアロゾル発生確率を減少す
ることも可能である。
法は、ＰＣＲ反応及び蛍光強度測定を密封容器内で実施
し得るものである。従って、単なるＰＣＲ法により核酸
を増幅し、増幅した核酸を検出する方法等に比較して、
操作も簡便であり、しかもエアロゾル発生確率を減少す
ることも可能である。
【図１】 本発明の方法により抽出したＢ型肝炎ウイル
ス（ＨＢＶ）ＤＮＡをＰＣＲにより増幅した場合の電気
泳動の結果を示す図である。レーン１、２：ＨＢＶを多
量に含む血清；レーン３、４：ＨＢＶを少量含む血清；
レーン５：ＨＢＶを含まない血清。なお、図１〜図７に
おいて、下の写真は電気泳動の結果を示す写真であり、
上はその模式図である。
ス（ＨＢＶ）ＤＮＡをＰＣＲにより増幅した場合の電気
泳動の結果を示す図である。レーン１、２：ＨＢＶを多
量に含む血清；レーン３、４：ＨＢＶを少量含む血清；
レーン５：ＨＢＶを含まない血清。なお、図１〜図７に
おいて、下の写真は電気泳動の結果を示す写真であり、
上はその模式図である。
【図２】 本発明の方法により抽出したＣ型肝炎ウイル
ス（ＨＣＶ）ＲＮＡから調製したＤＮＡをＰＣＲにより
増幅した場合の電気泳動の結果を示す図である。レーン
１、２：ＨＣＶを多量に含む血清；レーン３、４：ＨＣ
Ｖを少量含む血清；レーン５：ＨＣＶを含まない血清。
ス（ＨＣＶ）ＲＮＡから調製したＤＮＡをＰＣＲにより
増幅した場合の電気泳動の結果を示す図である。レーン
１、２：ＨＣＶを多量に含む血清；レーン３、４：ＨＣ
Ｖを少量含む血清；レーン５：ＨＣＶを含まない血清。
【図３】 以下に示す各種試薬Ｃを用いて、本発明の方
法によりＢ型肝炎ウイルスＤＮＡを抽出し、ＰＣＲによ
り増幅した場合の電気泳動の結果を示す図である。レー
ン１、２：２．４Ｍチオシアン酸グアニジン、１５ｍ
Ｍクエン酸ナトリウム及び６０％イソプロピルアルコー
ルを含む試薬Ｃ；レーン３、４：２．４Ｍチオシアン
酸カリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム及び６０％イ
ソプロピルアルコールを含む試薬Ｃ；レーン５、６：
３．２Ｍ塩酸グアニジン、１５ｍＭクエン酸ナトリウム
及び６０％イソプロピルアルコールを含む試薬Ｃ。
法によりＢ型肝炎ウイルスＤＮＡを抽出し、ＰＣＲによ
り増幅した場合の電気泳動の結果を示す図である。レー
ン１、２：２．４Ｍチオシアン酸グアニジン、１５ｍ
Ｍクエン酸ナトリウム及び６０％イソプロピルアルコー
ルを含む試薬Ｃ；レーン３、４：２．４Ｍチオシアン
酸カリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム及び６０％イ
ソプロピルアルコールを含む試薬Ｃ；レーン５、６：
３．２Ｍ塩酸グアニジン、１５ｍＭクエン酸ナトリウム
及び６０％イソプロピルアルコールを含む試薬Ｃ。
【図４】 実施例７に示す試薬Ｃを用いて、本発明の方
法によりＢ型肝炎ウイルスＤＮＡを抽出し、ＰＣＲによ
り増幅した場合の電気泳動の結果を示す図である。な
お、試薬Ｃに使用した試薬Ｂを以下に列記する。レーン
１、２：６０％ｎ−プロピルアルコール；レーン３、
４：６０％イソプロピルアルコール；レーン５、６：
５０％ｎ−ブチルアルコール；レーン７、８：６０
％ｎ−ブチルアルコール；レーン９、１０：５０％ｓ
ｅｃ−ブチルアルコール；レーン１１、１２：６０％
ｓｅｃ−ブチルアルコール。
法によりＢ型肝炎ウイルスＤＮＡを抽出し、ＰＣＲによ
り増幅した場合の電気泳動の結果を示す図である。な
お、試薬Ｃに使用した試薬Ｂを以下に列記する。レーン
１、２：６０％ｎ−プロピルアルコール；レーン３、
４：６０％イソプロピルアルコール；レーン５、６：
５０％ｎ−ブチルアルコール；レーン７、８：６０
％ｎ−ブチルアルコール；レーン９、１０：５０％ｓ
ｅｃ−ブチルアルコール；レーン１１、１２：６０％
ｓｅｃ−ブチルアルコール。
【図５】 実施例８に示す試薬Ｃを用いて、本発明の方
法によりＢ型肝炎ウイルスＤＮＡを抽出し、ＰＣＲによ
り増幅した場合の電気泳動の結果を示す図である。な
お、試薬Ｃに使用した試薬Ｂを以下に列記する。レーン
１、２：５０％ｔｅｒｔ−アミルアルコール；レーン
３、４：６０％ｔｅｒｔ−アミルアルコール；レーン
５、６：６０％ｔｅｒｔ−ブチルアルコール；レーン
７、８：６０％イソプロピルアルコール。
法によりＢ型肝炎ウイルスＤＮＡを抽出し、ＰＣＲによ
り増幅した場合の電気泳動の結果を示す図である。な
お、試薬Ｃに使用した試薬Ｂを以下に列記する。レーン
１、２：５０％ｔｅｒｔ−アミルアルコール；レーン
３、４：６０％ｔｅｒｔ−アミルアルコール；レーン
５、６：６０％ｔｅｒｔ−ブチルアルコール；レーン
７、８：６０％イソプロピルアルコール。
【図６】 本発明の方法によりＢ型肝炎ウイルスＤＮＡ
を抽出しＰＣＲにより増幅した場合の電気泳動の結果を
示す図である。なお、それぞれの試験で添加したデキス
トランの量（μｇ）を以下に列記する。レーン１、２：
０μｇ；レーン３、４：２μｇ；レーン５、６：４μ
ｇ；レーン７、８：８μｇ；レーン９、１０：１６μ
ｇ；レーン１１、１２：３２μｇ；レーン１３、１４：
６４μｇ。
を抽出しＰＣＲにより増幅した場合の電気泳動の結果を
示す図である。なお、それぞれの試験で添加したデキス
トランの量（μｇ）を以下に列記する。レーン１、２：
０μｇ；レーン３、４：２μｇ；レーン５、６：４μ
ｇ；レーン７、８：８μｇ；レーン９、１０：１６μ
ｇ；レーン１１、１２：３２μｇ；レーン１３、１４：
６４μｇ。
【図７】 キャリアーとしてデキストランまたはカルボ
キシメチルセルロースを用いて実施例３と同様にＢ型肝
炎ウイルスＤＮＡを抽出し、ＰＣＲにより増幅を行った
場合の電気泳動の結果を示す図である。レーン１、２：
デキストラン；レーン３、４：カルボキシメチルセルロ
ース。
キシメチルセルロースを用いて実施例３と同様にＢ型肝
炎ウイルスＤＮＡを抽出し、ＰＣＲにより増幅を行った
場合の電気泳動の結果を示す図である。レーン１、２：
デキストラン；レーン３、４：カルボキシメチルセルロ
ース。
【図８】 実施例１２における、高速液体クロマトグラ
フィーの結果（チャート図）を示す。図中、（ａ）は核
酸抽出を行う前のＰＣＲ反応溶液についての、（ｂ）は
核酸抽出後のＰＣＲ反応液についての結果を示し、図
中、横軸は溶出時間（分）を、縦軸は相対的吸光度を示
す。
フィーの結果（チャート図）を示す。図中、（ａ）は核
酸抽出を行う前のＰＣＲ反応溶液についての、（ｂ）は
核酸抽出後のＰＣＲ反応液についての結果を示し、図
中、横軸は溶出時間（分）を、縦軸は相対的吸光度を示
す。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/00 - 15/90
C12Q 1/00 - 1/70
C07H 21/00 - 21/04
G01N 27/447
G01N 33/50
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＪＳＴＰｌｕｓ（ＪＯＩＳ)
ＰｕｂＭｅｄ
Claims (4)
- 【請求項１】 以下の工程からなる、核酸を含有する試
料からの核酸抽出法： （１）デキストラン、アクリルアミド及びカルボキシメ
チルセルロースからなる群から選ばれる１種以上のキャ
リアーを試料と混合して混合液を形成する工程、（２）
チオシアン酸グアニジン、塩酸グアニジン、チオシアン
酸カリウム及びチオシアン酸ナトリウムからなる群から
選ばれる１種以上の試薬Ａと、ｎ−プロピルアルコー
ル、イソプロピルアルコール、ｎ−ブチルアルコール、
ｓｅｃ−ブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコー
ル及びｔｅｒｔ−アミルアルコールからなる群から選ば
れる１種以上の試薬Ｂ、とを含む試薬Ｃを、工程（１）
の混合液に混合して核酸及びキャリアーを不溶化する工
程、（３）不溶化された核酸及びキャリアーを液相と分
離する工程。 - 【請求項２】 以下の工程からなる、試料中の核酸の特
定配列の検出方法： （１）デキストラン、アクリルアミド及びカルボキシメ
チルセルロースからなる群から選ばれる１種以上のキャ
リアーを試料と混合して混合液を形成する工程、（２）
チオシアン酸グアニジン、塩酸グアニジン、チオシアン
酸カリウム及びチオシアン酸ナトリウムからなる群から
選ばれる１種以上の試薬Ａと、ｎ−プロピルアルコー
ル、イソプロピルアルコール、ｎ−ブチルアルコール、
ｓｅｃ−ブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコー
ル及びｔｅｒｔ−アミルアルコールからなる群から選ば
れる１種以上の試薬Ｂ、とを含む試薬Ｃを、工程（１）
の混合液に混合して核酸及びキャリアーを不溶化する工
程、（３）不溶化された核酸及びキャリアーを液相と分
離する工程、（４）分離された核酸がＲＮＡである場合
に逆転写反応により該ＲＮＡをＤＮＡに変換する工程、
（５）工程（３）で分離された核酸又は工程（４）で得
られた核酸を、少なくとも特定配列を増幅するのに適し
たオリゴヌクレオチドプローブ、モノヌクレオチド三燐
酸混合物、ポリメレース及びインターカレーター性蛍光
色素を含むポリメレースチェーンリアクション反応液中
でＰＣＲ反応に供する工程、（６）ＰＣＲ反応前後の蛍
光強度変化又はＰＣＲ反応中の反応液からの蛍光強度変
化を測定する工程、（７）蛍光強度の変化から、試料中
に特定配列を有する核酸が存在していたか否かを判定す
る工程。 - 【請求項３】 ＰＣＲ反応及び蛍光強度変化の測定が、
分離された核酸及びＰＣＲ反応液が密封された状態で実
施されることを特徴とする請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】 少なくとも次のキャリアー及び試薬を分
離された状態で含む、核酸を抽出するための試薬セッ
ト。（１）デキストラン、アクリルアミド及びカルボキ
シメチルセルロースからなる群から選ばれる１種以上の
キャリアー、（２）チオシアン酸グアニジン、塩酸グア
ニジン、チオシアン酸カリウム及びチオシアン酸ナトリ
ウムからなる群から選ばれる１種以上の試薬Ａと、ｎ−
プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ｎ−ブ
チルアルコール、ｓｅｃ−ブチルアルコール、ｔｅｒｔ
−ブチルアルコール及びｔｅｒｔ−アミルアルコールか
らなる群から選ばれる１種以上の試薬Ｂ、とを含む試薬
Ｃ。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23087093A JP3451667B2 (ja) | 1993-08-24 | 1993-08-24 | 核酸抽出及び特定核酸配列の検出方法 |
| DE19934333805 DE4333805C2 (de) | 1993-08-24 | 1993-10-04 | Verfahren zur Extraktion von Nucleinsäuren und Verfahren zum Nachweis spezifizierter Nucleinsäuresequenzen |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23087093A JP3451667B2 (ja) | 1993-08-24 | 1993-08-24 | 核酸抽出及び特定核酸配列の検出方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0759572A JPH0759572A (ja) | 1995-03-07 |
| JP3451667B2 true JP3451667B2 (ja) | 2003-09-29 |
Family
ID=16914603
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP23087093A Expired - Fee Related JP3451667B2 (ja) | 1993-08-24 | 1993-08-24 | 核酸抽出及び特定核酸配列の検出方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3451667B2 (ja) |
| DE (1) | DE4333805C2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11739382B2 (en) | 2019-08-27 | 2023-08-29 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for amplification and detection of hepatitis B virus RNA, including HBV RNA transcribed from cccDNA |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69632904T2 (de) * | 1995-08-21 | 2004-11-18 | Palma Bee'z Research Institute Co., Ltd. | Kopräzipitat und methode zur extraktion von nukleinsäuren |
| ATE263254T1 (de) * | 1995-10-02 | 2004-04-15 | Emd Biosciences Inc | Verfahren zur fällung von nukleinsäuren mit einem sichtbaren träger |
| DE10033583A1 (de) | 2000-07-11 | 2002-01-24 | Bayer Ag | Superparamagnetische Perlpolymerisate |
| EP1306446A4 (en) * | 2000-08-02 | 2004-10-20 | Oriental Yeast Co Ltd | TEST SETS FOR THE EXTRACTION OF NUCLEIC ACIDS AND METHODS FOR THE EXTRACTION OF NUCLEIC ACIDS BY USING THE TEST SETS |
| JP2003000248A (ja) * | 2001-04-25 | 2003-01-07 | Tosoh Corp | 改良された核酸抽出方法 |
| CA2465961A1 (en) | 2001-11-06 | 2003-05-15 | Cortex Biochem, Inc. | Isolation and purification of nucleic acids |
| US8426126B2 (en) | 2004-03-18 | 2013-04-23 | Applied Biosystems, Llc | Modified surfaces as solid supports for nucleic acid purification |
| AT501380B1 (de) * | 2005-02-07 | 2007-11-15 | Vitali Dipl Ing Dshemelinski | Verfahren zur reinigung der dna/rna von proteinen und zellulären reststoffen im zellenlysat |
| JP2008092835A (ja) * | 2006-10-10 | 2008-04-24 | Ebara Jitsugyo Co Ltd | 核酸抽出方法 |
| JP5428272B2 (ja) | 2008-10-06 | 2014-02-26 | 東ソー株式会社 | サバイビンｍＲＮＡの測定方法 |
| US8222397B2 (en) | 2009-08-28 | 2012-07-17 | Promega Corporation | Methods of optimal purification of nucleic acids and kit for use in performing such methods |
| US8039613B2 (en) | 2009-08-28 | 2011-10-18 | Promega Corporation | Methods of purifying a nucleic acid and formulation and kit for use in performing such methods |
| JP5743666B2 (ja) * | 2011-04-15 | 2015-07-01 | 英二 小西 | Ｒｎａ検出用試薬およびｒｎａ検出方法 |
| JP5743701B2 (ja) * | 2011-05-10 | 2015-07-01 | 英二 小西 | Ｒｎａ検出用試薬およびｒｎａ検出方法 |
| JP5743704B2 (ja) * | 2011-05-12 | 2015-07-01 | 住友大阪セメント株式会社 | Ｒｎａ検出用試薬およびｒｎａ検出方法 |
| WO2015146737A1 (ja) * | 2014-03-26 | 2015-10-01 | ユニバーサル・バイオ・リサーチ株式会社 | 核酸抽出方法及び試薬 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4843155A (en) * | 1987-11-19 | 1989-06-27 | Piotr Chomczynski | Product and process for isolating RNA |
| NL8900725A (nl) * | 1989-03-23 | 1990-10-16 | Az Univ Amsterdam | Werkwijze en combinatie van middelen voor het isoleren van nucleinezuur. |
| US5334499A (en) * | 1989-04-17 | 1994-08-02 | Eastman Kodak Company | Methods of extracting, amplifying and detecting a nucleic acid from whole blood or PBMC fraction |
| DE69128520T2 (de) * | 1990-10-31 | 1998-07-09 | Tosoh Corp | Verfahren zum Nachweis oder Quantifizierung von Zielnukleinsäuren |
-
1993
- 1993-08-24 JP JP23087093A patent/JP3451667B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1993-10-04 DE DE19934333805 patent/DE4333805C2/de not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11739382B2 (en) | 2019-08-27 | 2023-08-29 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for amplification and detection of hepatitis B virus RNA, including HBV RNA transcribed from cccDNA |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0759572A (ja) | 1995-03-07 |
| DE4333805A1 (de) | 1995-03-02 |
| DE4333805C2 (de) | 2003-08-07 |
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