JP5743704B2 - Rna検出用試薬およびrna検出方法 - Google Patents
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Description
前記リアルタイムPCR法は、通常のPCR法に比べるとRNAを高感度で検出できるものの、例えば感染初期の患者から試料を採取してRNAの検出を行った場合には、ウイルスの量が少ないため、リアルタイムPCR法を用いてもRNAを検出できない場合があり、実際には感染していたとしても陰性と判断されることがある。
さらに、RNAを検出する場合にはRNAを逆転写する工程が増えるためDNAを検出する場合に比べて試料のロスも生じやすく、RNA量が少ない試料の検出が難しい。
従って、初期においても感染しているかどうかを判断したい病原性ウイルスなど、少量のRNAウイルスのRNA検出についてはさらに高感度の検出方法が望まれている。
そこで、微量のRNAを確実に沈殿させるために、RNAの沈殿を促す共沈剤を添加することで、抽出効率を向上させることが検討されている。
共沈剤としては、デキストランの他に、アクリルアミドまたはカルボキシメチル(特許文献2)や、グリコーゲン(特許文献3および5)、あるいはセルロースやデンプン(特許文献6)、あるいはアミロペクチンアズール(特許文献7)なども各文献に記載されている。
かかる多糖類の具体例としては、食品添加物として広く用いられているプルランが挙げられる。
恒温槽:昭和電工株式会社製 SHODEX OVEN A0−30
送液ポンプ:昭和電工株式会社製 SHODEX DS−4
検出器:昭和電工株式会社製 SHODEX RI−101
デガッサー:昭和電工株式会社製 SHODEX ERC−3115α
解析ソフト:システムインスルツメンツ社製 SIC 480II データステーション
カラム:昭和電工株式会社製 SB−806MHQ + SB−804HQ 直列
溶離液:0.1M NaNO3水溶液
恒温槽温度:40℃
流量:1ml/分
GPCカラム用標準試料:昭和電工株式会社製 プルラン(商品名) P−5、P−10、P−20、P−50、P−100、P−200、P−400、P−800、
試料注入量:前記試料の1質量%水溶液を50μl注入
前記RNA検出用試薬における多糖類の濃度は、10〜2000μg/ml、好ましくは20〜1000μg/mlである。
使用可能な抗生物質としては、例えば、ペニシリンやストレプトマイシンなどが挙げられる。
さらに本実施形態のRNA検出用試薬には、抽出性を高めるために界面活性剤などが添加されていてもよい。
血液などの検査用試料を準備する。通常の検出方法と同様に必要に応じて適当な倍率に希釈してもよい。
また、検査用試料としては血液の他、咽頭ぬぐい液や気管吸引液(例インフルエンザウイルス)、血清(例:C型肝炎ウイルス)、組織、細胞の他に、尿・便(例ノロウイルス)等の排泄物、環境試料(下水、河川水等)などを検査用試料として用いることが可能である。
これらのウイルスの中でも、特に、エンベロープを有するウイルスには検出感度向上効果が高い。
前記試料からRNAを抽出する。
まず、前記試料に前記のRNA検出用試薬を添加する。
試料に対するRNA検出用試薬の添加量は、試料の濃度や、ウイルスの種類などによって適宜調整可能である。例えば、前記多糖類が、10〜2000μg/ml、好ましくは20〜1000μg/mlとなるようにRNA検出用試薬を試料に添加することが好ましい。
RNA抽出には市販のRNA抽出用試薬キット、例えば、TRIZOL試薬(インビトロジェン社製))等を添付のプロトコールに従って使用することができる。
例えば、下記のような手順でRNA抽出を行なう。
TRIZOL試薬に試料を溶解させた液を15分間静置して、クロロホルムを添加し、チューブに入れ遠心分離(12000×g、15分間、4℃)する。
遠心分離後、RNAを含む上澄みと、その他の成分(タンパク質、炭水化物など)を含む沈殿に分離し、上澄みを取り出すことでRNA成分を含む水溶液が抽出できる。
さらに、上澄みを別のチューブにいれて、イソプロパノールを添加し、10分間静置した後、遠心分離(12000×g、15分間、4℃)した上澄みを除去するとRNAの沈殿が生成する。その沈殿にエタノール(75%)を添加しさらに遠心分離(7500×g、5分間、4℃)するとRNAが洗浄できる。
沈殿・洗浄したRNA沈殿を乾燥後、DNase Waterに再溶解させることで、RNAが回収できる。
前記のように試料から抽出されたRNAを用いて、逆転写によって相補的DNA(cDNA)を合成する。
逆転写は、市販の逆転写酵素用試薬キット、例えば、High Capacity cDNA逆転写キット(アプライドバイオシステムズ社製)等を、添付のプロトコールに従って使用することができる。
例えば、逆転写酵素、ランダムプライマー、デオキシヌクレオチド三リン酸(dNTP)、RNA分解酵素阻害剤(RNase inhibitor)、付属のバッファーおよびRNase−free水をプロトコールに従って調製し(1試料あたり全量で10μlとなるように調製)、前記回収されたRNAを調製した試薬に同量の10μl添加してピペッティングで混合する。
混合後、10分間室温で静置し、37℃で2時間逆転写を行い、cDNAを合成する。
逆転写反応後のcDNAは、85℃で10秒保温させることで、酵素を不活化させておく。
次に、前記逆転写によって生成されたcDNAをPCR反応によって増幅させて検出を行う。
PCR反応によるcDNAの検出は、公知のPCR法を用いたPCR装置を適宜用いて行うことができる。
PCR装置で検出されるデータはcDNAの量であるため、これを元の試料中に含まれるRNA量に換算することで、試料中に含まれていたRNA量およびRNAウイルスの検出が可能となる。
尚、RNA量とcDNA量は同量であるが、生データとして得られるcDNA量は、最終的にPCR反応させたcDNA量であるため、元の試料中に含まれるRNA量に換算する場合には、希釈を考慮して換算する。
また、本発明のRNA検出用試薬は前記のようにRNAの抽出前の試料に添加し、その後試料を抽出工程、逆転写工程、PCR反応工程において各処理を実施するため、各工程における残存物質の阻害作用を低下させて、RNA検出感度を向上させているとも考えられる。
(RNA検出用試薬)
RNA検出用試薬として、下記に記載の各多糖類(プルランA〜H)、単糖類のグルコース、2糖類のマルトース、多糖類のデンプン、エチルセルロースおよびメチルセルロースを試薬成分として、各試薬成分の濃度が1000μg/mlとなるように水(超純水)に溶解させたものを準備した。
尚、プルランGについては、100mg/mlとなるように水(超純水)に溶解させたものも準備した。
また、下記の分子量は、前記装置および条件でGPC(ゲル浸透クロマトグラフィー)法により測定した重量平均分子量であって、測定値の有効数値を2桁または1桁で示した。
プルランA:商品名:プルランP−10 (昭和電工株式会社製、分子量10000)
プルランB:商品名:プルランP−20 (昭和電工株式会社製、分子量20000)
プルランC:商品名:プルランP−50 (昭和電工株式会社製、分子量50000)
プルランD:商品名:プルランP−100 (昭和電工株式会社製分子量100000)
プルランE:商品名:プルランP−200 (昭和電工株式会社製分子量200000)
プルランF:商品名:プルランP−400 (昭和電工株式会社製分子量400000)
プルランG:商品名:プルランP−800 (昭和電工株式会社製分子量800000)
プルランH:商品名:プルランP−2500 (昭和電工株式会社製、分子量2500000)
グルコース:(和光純薬工業社製 試薬特級)
マルトース:マルトース1水和物(和光純薬工業社製 和光1級)
デンプン:でんぷん(とうもろこし由来)(和光純薬工業社製 試薬特級)
メチルセルロース(和光純薬工業社製)
エチルセルロース(和光純薬工業社製)
ウイルスとしてA型インフルエンザウイルス(株:A/PR/8/34)を用い、ウイルス液の濃度が250μl中に1×104PFUとなるように調整した。
培養液として、MEM培地、L−グリタミン、非必須アミノ酸、炭酸水素ナトリウム(pH調整用)からなる培養液を用いた。
尚、試験例25については、プルランGを使用したRNA検出用試薬であって1000μg/mlとなるように調製したものをさらに1000倍希釈したものを用い、試験例26については同試薬を100倍希釈したものを用いた。
また、試験例31〜33については、プルランGを使用したRNA検出用試薬であって100mg/mlの濃度に調整したRNA検出用試薬を用いて、表1の含有量になるように調整して用いた。
抽出用の試薬としては、TRIZOL(商品名、invitrogen社製)を用いた。
各液250μlに対し、前記TRIZOLを750μl添加した。
この溶液をよく混和し、15分間室温で静置した後、200μlのクロロホルムを添加して、遠心分離(12000×g、15分間、4℃)する。
その後、水層を回収した。
回収した水層約700μlあたり500μlのイソプロパノールを添加して、10分間室温で静置し、遠心分離(12000×g、15分間、4℃)して、RNA成分を沈殿させ、上澄みを除去する。
残ったRNA沈殿物に、75%エタノールを 1ml添加し、ボルテックス後、5分間室温で静置し、さらに遠心分離(9000×g、5分間、4℃)することによってRNA沈殿を洗浄した。
一度、上清を除去した後、さらに遠心分離(9000×g、2分間、4℃)し、残存している上清を除去した。上清除去後のRNA沈殿物を、15分間風乾させ、エタノールを除去した。風乾後のRNA沈殿物に、DEPC処理水を15μl加え、ピペッティングし、RNA溶解液を得た。
前記抽出されたRNAを、DEPC処理水15μlで溶解し、そのうちの10μlのRNAを用いて、20μlのcDNAを合成した(逆転写工程)。
合成したcDNAのうち5μlを使用し、下記のPCR装置を用いてRNA量を測定した。
(PCR反応工程)
前記逆転写工程および、PCR反応の手順は、以下の試薬またはキットの方法に準拠した。
尚、ウイルスのプライマーおよびプローブは、ウイルス株の遺伝子配列を基に、遺伝子解析ソフトウエアPrimer Express 3.0(アプライドバイオシステム社製)を用いて設計した。
本実施例のウイルスのプライマーおよびプローブは、A型インフルエンザウイルス株を141株抽出し、その中で相同性の高い共通プライマー、プローブとなるプライマーおよびプローブを選定した。
PCR反応キット:イーグルタックマスターミックス(ROX)(ロシュ・ダイアグノスティックス社製)
PCR装置(リアルタイムPCR):アプライドバイオシステムズ 7300リアルタイムPCRシステム(アプライドバイオシステムズ社製)
尚、換算値は、生データを0.167で除した数値である。その理由は、前記抽出したRNA15μlのうち、10μlをcDNA合成に使い、合成したcDNA20μlのうち、5μlをPCR装置にかけてPCR反応させたため、生データ(cDNA数)を0.167で除した値が250μlの検査用試料に含まれるRNA量となるためである。
すなわち、換算値が検出されたRNA量となる。
この標準液に対して、各プルランを添加した試験例1〜37では、前記標準液と同等以上のRNA量(copy数)が検出された。
特に、プルランの分子量が高くなると、プルランの含有量が少なくても、前記標準液よりも、多くのRNA量(copy数)が検出された。
一方、試験例38〜57では、特に標準液と比べても有意な差は見られなかった。
実施例2では、前記実施例1のRNA検出用試薬の中から、プルランGを用いたRNA検出用試薬を準備し、ウイルスとして、ネコカリシウイルス(株:FCV−2280)を用いた。
前記実施例1と同様に、濃度が1.0×104PFU/250μlとなるように調整したウイルス液を各5μlずつ準備し、これに対して前記RNA検出用試薬を50μl、培養液を195μl準備した。比較として、培養液242.5μlのみのものを準備した。
前記以外の条件は実施例1と同様に、RNA抽出工程、逆転写工程およびPCR反応工程を実施し、RNA検出量を測定した(250μl中のウイルス量換算値copy)。
結果を表2に示す。
実施例3では、前記実施例1のRNA検出用試薬の中から、プルランGを用いたRNA検出用試薬を準備し、ウイルスとして、デングウイルス(株:NEW Guinea C)を用い、前記実施例1と同様に、濃度が1.0×104PFU/250μlとなるように調整したウイルス液を各5μlずつ準備し、これに対して前記RNA検出用試薬を50μl、培養液を195μl準備した。比較として、培養液242.5μlのみのものを準備した。
前記以外の条件は実施例1と同様に、RNA抽出工程、逆転写工程およびPCR反応工程を実施し、RNA検出量を測定した(250μl中のウイルス量換算値copy)。
結果を表3に示す。
Claims (6)
- 前記RNAウイルスがインフルエンザウイルス、ネコカリシウイルス、ノロウイルス及びデングウイルスからなる群から選択される一種または二種以上である請求項1に記載のRNA検出用試薬。
- 前記抽出工程の前に、前記試料に前記試薬を添加する請求項3に記載のRNA検出方法。
- 前記抽出工程では、前記試料にフェノールを含む液を接触させることで試料からRNAを抽出することを実施する請求項3または4に記載のRNA検出方法。
- 前記RNAウイルスがインフルエンザウイルス、ネコカリシウイルス、ノロウイルス及びデングウイルスからなる群から選択される一種または二種以上である請求項3乃至5のいずれか一項に記載のRNA検出方法。
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