JP2003000248A - 改良された核酸抽出方法 - Google Patents
改良された核酸抽出方法Info
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- JP2003000248A JP2003000248A JP2001128081A JP2001128081A JP2003000248A JP 2003000248 A JP2003000248 A JP 2003000248A JP 2001128081 A JP2001128081 A JP 2001128081A JP 2001128081 A JP2001128081 A JP 2001128081A JP 2003000248 A JP2003000248 A JP 2003000248A
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】１００００ｇ以上の加速度を生ずる高速遠心が
不用で、この結果、設備的問題や、偽陽性（汚染）の原
因となり得るミストを発生させることのない、核酸抽出
法を提供する。 【解決手段】（１）該試料１００μｌに対して４０μｇ
以上の割合で、多糖をキャリアーとして添加する工程、
（２）グアニジン塩、およびキャリアーと核酸を不溶化
させるためのアルコールを添加する工程、（３）不溶化
した核酸およびキャリアーを、２０００ｇ〜１００００
ｇの加速度が得られる遠心で分離する工程からなる核酸
抽出方法。
不用で、この結果、設備的問題や、偽陽性（汚染）の原
因となり得るミストを発生させることのない、核酸抽出
法を提供する。 【解決手段】（１）該試料１００μｌに対して４０μｇ
以上の割合で、多糖をキャリアーとして添加する工程、
（２）グアニジン塩、およびキャリアーと核酸を不溶化
させるためのアルコールを添加する工程、（３）不溶化
した核酸およびキャリアーを、２０００ｇ〜１００００
ｇの加速度が得られる遠心で分離する工程からなる核酸
抽出方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、核酸を含有する試
料から核酸を抽出する方法に関するものであり、バイオ
テクノロジーおよび臨床診断分野で利用することができ
る。
料から核酸を抽出する方法に関するものであり、バイオ
テクノロジーおよび臨床診断分野で利用することができ
る。
【０００２】
【従来の技術】核酸を含有する試料からの核酸の抽出
は、バイオテクノロジーおよび臨床診断等の分野で重要
な操作である。特に、遺伝子検査においては細胞中ある
いはウイルス中の核酸を分離して、その後の核酸増幅あ
るいは検出工程に使用する必要がある。しかし、従来の
核酸抽出方法は煩雑な操作を要求するため、容器間ある
いは環境からの核酸の汚染を避けて、再現性良く抽出す
るためには熟練した技術が必要だった。そのため、核酸
抽出工程は遺伝子検査の多数検体処理の障壁のひとつと
なっており、簡便な抽出方法が望まれてきた。
は、バイオテクノロジーおよび臨床診断等の分野で重要
な操作である。特に、遺伝子検査においては細胞中ある
いはウイルス中の核酸を分離して、その後の核酸増幅あ
るいは検出工程に使用する必要がある。しかし、従来の
核酸抽出方法は煩雑な操作を要求するため、容器間ある
いは環境からの核酸の汚染を避けて、再現性良く抽出す
るためには熟練した技術が必要だった。そのため、核酸
抽出工程は遺伝子検査の多数検体処理の障壁のひとつと
なっており、簡便な抽出方法が望まれてきた。
【０００３】核酸抽出の従来法としては、劇物であるフ
ェノールおよびクロロホルムを使用するプロテアーゼＫ
／フェノール法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら， Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓ
ｓ（１９８９）７−１２〜７−１５）およびＡＧＰＣ法
（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．およびＳａｃｃｈｉ，
Ｎ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ（１９８７）１６２，１５６−１５９）がある。ま
た、特開平７−５９５７２号公報には、フェノールおよ
びクロロホルムを使用しない簡便な抽出方法が開示され
ている。すなわち、（１）デキストラン、アクリルアミ
ドおよびカルボキシメチルセルロースからなる群から選
ばれる１種以上のキャリアーを試料と混合して混合液を
形成する工程、（２）チオシアン酸グアニジン、塩酸グ
アニジン、チオシアン酸カリウムおよびチオシアン酸ナ
トリウムからなる群から選ばれる試薬Ａと、ｎ−プロピ
ルアルコール、イソプロピルアルコール、ｎ−ブチルア
ルコール、ｓｅｃ−ブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチ
ルアルコールおよびｔｅｒｔ−アミルアルコールからな
る群から選ばれる１種以上の試薬Ｂを含む試薬Ｃを工程
（１）の混合液に混合して核酸およびキャリアーを不溶
化する工程、（３）不溶化された核酸およびキャリアー
を液相と分離する工程からなる核酸抽出法である。
ェノールおよびクロロホルムを使用するプロテアーゼＫ
／フェノール法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら， Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓ
ｓ（１９８９）７−１２〜７−１５）およびＡＧＰＣ法
（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．およびＳａｃｃｈｉ，
Ｎ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ（１９８７）１６２，１５６−１５９）がある。ま
た、特開平７−５９５７２号公報には、フェノールおよ
びクロロホルムを使用しない簡便な抽出方法が開示され
ている。すなわち、（１）デキストラン、アクリルアミ
ドおよびカルボキシメチルセルロースからなる群から選
ばれる１種以上のキャリアーを試料と混合して混合液を
形成する工程、（２）チオシアン酸グアニジン、塩酸グ
アニジン、チオシアン酸カリウムおよびチオシアン酸ナ
トリウムからなる群から選ばれる試薬Ａと、ｎ−プロピ
ルアルコール、イソプロピルアルコール、ｎ−ブチルア
ルコール、ｓｅｃ−ブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチ
ルアルコールおよびｔｅｒｔ−アミルアルコールからな
る群から選ばれる１種以上の試薬Ｂを含む試薬Ｃを工程
（１）の混合液に混合して核酸およびキャリアーを不溶
化する工程、（３）不溶化された核酸およびキャリアー
を液相と分離する工程からなる核酸抽出法である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】プロテアーゼＫ／フェ
ノール法およびＡＧＰＣ法は劇物であるフェノールおよ
びクロロホルムを使用することから、操作の際の安全性
および使用済試薬の廃棄に課題がある。
ノール法およびＡＧＰＣ法は劇物であるフェノールおよ
びクロロホルムを使用することから、操作の際の安全性
および使用済試薬の廃棄に課題がある。
【０００５】特開平７−５９５７２号公報に開示された
方法では不溶化された核酸およびキャリアーと液相の分
離にろ過あるいは遠心を使用する。一般的に、得られた
不溶化物を少量の溶液に溶解して高濃度な抽出物を得た
い場合、ろ過は適当でないため遠心分離が用いられる。
しかし、特開平７−５９５７２号公報には遠心条件に関
する詳細な記述なく、通常は１００００ｇ以上の加速度
を生ずる高速遠心を実施する（前述のプロテアーゼＫ／
フェノール法およびＡＧＰＣ法も同様の遠心を必要とす
る）。このことは、設備的問題だけでなく、偽陽性（汚
染）の原因となり得るミストを発生させる危険性を有し
ている。また、これらの操作を自動化する場合の大きな
障害ともなっている。
方法では不溶化された核酸およびキャリアーと液相の分
離にろ過あるいは遠心を使用する。一般的に、得られた
不溶化物を少量の溶液に溶解して高濃度な抽出物を得た
い場合、ろ過は適当でないため遠心分離が用いられる。
しかし、特開平７−５９５７２号公報には遠心条件に関
する詳細な記述なく、通常は１００００ｇ以上の加速度
を生ずる高速遠心を実施する（前述のプロテアーゼＫ／
フェノール法およびＡＧＰＣ法も同様の遠心を必要とす
る）。このことは、設備的問題だけでなく、偽陽性（汚
染）の原因となり得るミストを発生させる危険性を有し
ている。また、これらの操作を自動化する場合の大きな
障害ともなっている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、従来の核酸抽
出法の課題を解決した核酸抽出の改良法であって、フェ
ノールやクロロホルムのような劇物を使用せず、卓上小
型遠心機でも達成可能な比較的低速度の遠心で抽出でき
る簡便な核酸抽出方法を提供する。請求項１に記載した
本発明は、核酸を含有する試料から核酸を抽出する方法
であって、（１）該試料１００μｌに対して４０μｇ以
上の割合で、多糖をキャリアーとして添加する工程、
（２）グアニジン塩、およびキャリアーと核酸を不溶化
させるためのアルコールを添加する工程、（３）不溶化
した核酸およびキャリアーを、２０００ｇ〜１００００
ｇの加速度が得られる遠心で分離する工程からなること
を特徴とする。請求項２に記載した本発明は請求項１の
発明に係り、前記キャリアーが分子量４０万〜２００万
のデキストランであることを特徴とする。請求項３に記
載した本発明は請求項１の発明に係り、前記グアニジン
塩がチオシアン酸グアニジンであることを特徴とする。
そして請求項４に記載した本発明は請求項１の発明に係
り、前記核酸およびキャリアーを不溶化させるためのア
ルコールがイソプロピルアルコールであることを特徴と
する。以下に本発明を詳細に説明する。
出法の課題を解決した核酸抽出の改良法であって、フェ
ノールやクロロホルムのような劇物を使用せず、卓上小
型遠心機でも達成可能な比較的低速度の遠心で抽出でき
る簡便な核酸抽出方法を提供する。請求項１に記載した
本発明は、核酸を含有する試料から核酸を抽出する方法
であって、（１）該試料１００μｌに対して４０μｇ以
上の割合で、多糖をキャリアーとして添加する工程、
（２）グアニジン塩、およびキャリアーと核酸を不溶化
させるためのアルコールを添加する工程、（３）不溶化
した核酸およびキャリアーを、２０００ｇ〜１００００
ｇの加速度が得られる遠心で分離する工程からなること
を特徴とする。請求項２に記載した本発明は請求項１の
発明に係り、前記キャリアーが分子量４０万〜２００万
のデキストランであることを特徴とする。請求項３に記
載した本発明は請求項１の発明に係り、前記グアニジン
塩がチオシアン酸グアニジンであることを特徴とする。
そして請求項４に記載した本発明は請求項１の発明に係
り、前記核酸およびキャリアーを不溶化させるためのア
ルコールがイソプロピルアルコールであることを特徴と
する。以下に本発明を詳細に説明する。
【０００７】本発明中の、核酸とは１本鎖あるいは２本
鎖のＲＮＡまたはＤＮＡで、染色体（ウイルスゲノムを
含む）ＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスミドＤＮ
Ａ、メッセンジャーＲＮＡ、リボゾームＲＮＡ、トラン
スファーＲＮＡ、ウイルスゲノムＲＮＡ、核酸増幅産物
などがあげられる。核酸を含有する試料とは、前記核酸
溶液、前記核酸を有する細胞（細菌）、ウイルス、また
はこれらを含む生体成分（血液、血漿、血清、喀痰、糞
尿など）に由来する試料である。
鎖のＲＮＡまたはＤＮＡで、染色体（ウイルスゲノムを
含む）ＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスミドＤＮ
Ａ、メッセンジャーＲＮＡ、リボゾームＲＮＡ、トラン
スファーＲＮＡ、ウイルスゲノムＲＮＡ、核酸増幅産物
などがあげられる。核酸を含有する試料とは、前記核酸
溶液、前記核酸を有する細胞（細菌）、ウイルス、また
はこれらを含む生体成分（血液、血漿、血清、喀痰、糞
尿など）に由来する試料である。
【０００８】本発明では、前記核酸を含有する試料１０
０μｌに対して４０μｇ以上の割合で、多糖をキャリア
ーとして添加する。キャリアー添加量は４０μｇ以上な
らば特に限定されるものではなく、溶解度などを考慮し
て任意に設定することができるが、さらに好適には４０
μｇ〜１６０μｇの範囲で選ぶのが望ましい。キャリア
ーはアルコール（後述）を添加した場合に核酸とともに
不溶化し、核酸を絡めて大きな不溶物を形成する性質を
有する。キャリアーとしては各種分子量のデキストラン
あるいはグリコーゲンから少なくとも１種を選ぶことが
できるが、分子量４０万〜２００万のデキストランが望
ましい。
０μｌに対して４０μｇ以上の割合で、多糖をキャリア
ーとして添加する。キャリアー添加量は４０μｇ以上な
らば特に限定されるものではなく、溶解度などを考慮し
て任意に設定することができるが、さらに好適には４０
μｇ〜１６０μｇの範囲で選ぶのが望ましい。キャリア
ーはアルコール（後述）を添加した場合に核酸とともに
不溶化し、核酸を絡めて大きな不溶物を形成する性質を
有する。キャリアーとしては各種分子量のデキストラン
あるいはグリコーゲンから少なくとも１種を選ぶことが
できるが、分子量４０万〜２００万のデキストランが望
ましい。
【０００９】引き続き、キャリアーを添加した試料にグ
アニジン塩、およびキャリアーと核酸を不溶化させるた
めのアルコールを添加する。グアニジン塩は細胞膜（細
胞壁）、ウイルス粒子などのタンパク質を変性、可溶化
する性質を有する。これによって核酸は溶液中に露出さ
れ、アルコールによって不溶化される。グアニジン塩は
チオシアン酸グアニジンあるいは塩酸グアニジンから選
ぶことができるが、チオシアン酸グアニジンを終濃度
１．５Ｍ〜４．５Ｍになるように添加することが望まし
く、さらに好適には終濃度２Ｍ〜３Ｍになるように添加
することが望ましい。
アニジン塩、およびキャリアーと核酸を不溶化させるた
めのアルコールを添加する。グアニジン塩は細胞膜（細
胞壁）、ウイルス粒子などのタンパク質を変性、可溶化
する性質を有する。これによって核酸は溶液中に露出さ
れ、アルコールによって不溶化される。グアニジン塩は
チオシアン酸グアニジンあるいは塩酸グアニジンから選
ぶことができるが、チオシアン酸グアニジンを終濃度
１．５Ｍ〜４．５Ｍになるように添加することが望まし
く、さらに好適には終濃度２Ｍ〜３Ｍになるように添加
することが望ましい。
【００１０】キャリアーおよび核酸を不溶化させるため
のアルコールは核酸、キャリアーを不溶化するとともに
塩など核酸以外の不要な共存物質を不溶化しないものが
適切である。該アルコールとしてはｎ−プロピルアルコ
ール、イソプロピルアルコール、ｎ−ブチルアルコー
ル、ｓｅｃ−ブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアル
コールおよびｔｅｒｔ−アミルアルコールから少なくと
も１種を選ぶことができるが、イソプロピルアルコール
を終濃度４０％〜８０％となるように添加することが望
ましく、さらに好適には終濃度４５％〜５５％となるよ
うに添加することが望ましい。さらに、前記チオシアン
酸グアニジンおよび前記イソプロピルアルコールはあら
かじめ混合しておいても良い。また、ここで核酸分解酵
素を抑制し得るクエン酸ナトリウム、ＥＤＴＡ等のキレ
ート剤やジチオスレイトール（ＤＴＴ）、βメルカプト
エタノール等の還元剤を添加しても良い。
のアルコールは核酸、キャリアーを不溶化するとともに
塩など核酸以外の不要な共存物質を不溶化しないものが
適切である。該アルコールとしてはｎ−プロピルアルコ
ール、イソプロピルアルコール、ｎ−ブチルアルコー
ル、ｓｅｃ−ブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアル
コールおよびｔｅｒｔ−アミルアルコールから少なくと
も１種を選ぶことができるが、イソプロピルアルコール
を終濃度４０％〜８０％となるように添加することが望
ましく、さらに好適には終濃度４５％〜５５％となるよ
うに添加することが望ましい。さらに、前記チオシアン
酸グアニジンおよび前記イソプロピルアルコールはあら
かじめ混合しておいても良い。また、ここで核酸分解酵
素を抑制し得るクエン酸ナトリウム、ＥＤＴＡ等のキレ
ート剤やジチオスレイトール（ＤＴＴ）、βメルカプト
エタノール等の還元剤を添加しても良い。
【００１１】次に、不溶化した核酸およびキャリアー
を、２０００ｇ〜１００００ｇの加速度が得られる遠心
で液相と分離する。遠心分離の際の加速度は２０００ｇ
以上が得られれば十分であるが、卓上小型遠心機を用い
ても容易に達成できる加速度２０００ｇ〜１００００ｇ
が望ましく、さらに好適には２３００ｇ〜６０００ｇの
加速度の遠心が望ましい。遠心時間は、使用するチュー
ブなどの条件から任意に設定することができるが、３分
間以上ならば十分であり、時間節約のためには３〜５分
間が望ましい。
を、２０００ｇ〜１００００ｇの加速度が得られる遠心
で液相と分離する。遠心分離の際の加速度は２０００ｇ
以上が得られれば十分であるが、卓上小型遠心機を用い
ても容易に達成できる加速度２０００ｇ〜１００００ｇ
が望ましく、さらに好適には２３００ｇ〜６０００ｇの
加速度の遠心が望ましい。遠心時間は、使用するチュー
ブなどの条件から任意に設定することができるが、３分
間以上ならば十分であり、時間節約のためには３〜５分
間が望ましい。
【００１２】なお、不溶化した核酸およびキャリアーは
必要に応じて洗浄液で少なくとも１回洗浄しても良い。
該洗浄液は不溶化した核酸およびキャリアーが溶解しな
い程度のアルコールを含み、必要に応じて塩や界面活性
剤を添加するここもできる。得られた核酸は、所望の溶
液に溶解して、ポリメレース・チェイン・リアクション
（ＰＣＲ）をはじめとする既知の核酸増幅法あるいはハ
イブリダイゼーション法などの核酸検出法に適用でき
る。
必要に応じて洗浄液で少なくとも１回洗浄しても良い。
該洗浄液は不溶化した核酸およびキャリアーが溶解しな
い程度のアルコールを含み、必要に応じて塩や界面活性
剤を添加するここもできる。得られた核酸は、所望の溶
液に溶解して、ポリメレース・チェイン・リアクション
（ＰＣＲ）をはじめとする既知の核酸増幅法あるいはハ
イブリダイゼーション法などの核酸検出法に適用でき
る。
【００１３】
【発明の実施形態】以下に本発明を実施例により更に詳
細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定され
るものではない。
細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定され
るものではない。
【００１４】実施例１ 低加速度遠心（２２７０ｇ）に
おける核酸回収率の評価 （１）ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）ｃＤＮＡ由来の塩基
番号１〜１８６５（配列および塩基番号はＫａｔｏ，
Ｎ．ら Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ（１９９０），８７，９５２４−９５２８に従う）を
含む２本鎖ＤＮＡの希釈系列、３７コピー、１．１×１
０2コピー、３．３×１０2コピー、１０3コピー、１０4
コピー／１００μｌ希釈液を調製した。希釈液の組成を
以下に示した。
おける核酸回収率の評価 （１）ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）ｃＤＮＡ由来の塩基
番号１〜１８６５（配列および塩基番号はＫａｔｏ，
Ｎ．ら Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ（１９９０），８７，９５２４−９５２８に従う）を
含む２本鎖ＤＮＡの希釈系列、３７コピー、１．１×１
０2コピー、３．３×１０2コピー、１０3コピー、１０4
コピー／１００μｌ希釈液を調製した。希釈液の組成を
以下に示した。
【００１５】希釈液の組成
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．９）
０．１５Ｍ ＮａＣｌ
５％ ウシ血清アルブミン
０．５ｍＭ ＥＤＴＡ
（２）ＤＮＡ非添加の希釈液（以後、Ｎｅｇ希釈液とす
る）および前記希釈系列のそれぞれ１００μｌを１．５
ｍｌチューブ（エッペンドルフ）にとり、それぞれに試
薬１を２μｌ（デキストラン量２０μｇ）添加し、混合
した。試薬１の組成を以下に示す。
る）および前記希釈系列のそれぞれ１００μｌを１．５
ｍｌチューブ（エッペンドルフ）にとり、それぞれに試
薬１を２μｌ（デキストラン量２０μｇ）添加し、混合
した。試薬１の組成を以下に示す。
【００１６】試薬１の組成
１０ｍｇ／ｍｌデキストラン（分子量４８万）
３ｍＭ ＮａＮ3
（３）各チューブに試薬２を５００μｌ添加し、混合し
た。試薬２の組成を以下に示す。
た。試薬２の組成を以下に示す。
【００１７】試薬２の組成
２．４Ｍ チオシアン酸グアニジン
１５ｍＭ クエン酸三ナトリウム
６０％ イソプロピルアルコール
（４）引き続き、各希釈系列のチューブをそれぞれ２２
７０ｇ（トミー工業（株）のＭＣ−１５０型遠心機で５
５００ｒｐｍ）、あるいは１６８６０ｇ（トミー工業
（株）のＭＣ−１５０型遠心機で１５０００ｒｐｍ）の
加速度で３分間遠心した。
７０ｇ（トミー工業（株）のＭＣ−１５０型遠心機で５
５００ｒｐｍ）、あるいは１６８６０ｇ（トミー工業
（株）のＭＣ−１５０型遠心機で１５０００ｒｐｍ）の
加速度で３分間遠心した。
【００１８】（５）上清をアスピレーターで除いた後、
試薬３を３００μｌ添加し、攪拌した。試薬３の組成を
以下に示す。
試薬３を３００μｌ添加し、攪拌した。試薬３の組成を
以下に示す。
【００１９】試薬３の組成
１３３ｍＭ ＫＣｌ
６０％ イソプロピルアルコール
（６）操作（４）に対応させて、それぞれを２２７０ｇ
あるいは１６８６０ｇの加速度で３分間遠心した。
あるいは１６８６０ｇの加速度で３分間遠心した。
【００２０】（７）上清をアスピレーターで吸引、除去
した後、沈殿を１０μｌのＴＥに溶解した。ＴＥの組成
を以下に示す。
した後、沈殿を１０μｌのＴＥに溶解した。ＴＥの組成
を以下に示す。
【００２１】ＴＥの組成
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
０．１ｍＭ ＥＤＴＡ
（８）各チューブから１０μｌをとり、０．５ｍｌ Ｐ
ＣＲチューブ（ＧｅｎｅＡｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅ
ｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、（株）パーキンエ
ルマージャパン）に移した。
ＣＲチューブ（ＧｅｎｅＡｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅ
ｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、（株）パーキンエ
ルマージャパン）に移した。
【００２２】（９）引き続いて、６５μｌのＰＣＲミッ
クス（組成を以下に示した）を添加した後、６０μｌの
ミネラルオイルを重層した。サーマルサイクラー（Ｇｅ
ｎｅＡｍｐ ９６００ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ、（株）
パーキンエルマージャパン）でＰＣＲを以下の条件で実
施した。
クス（組成を以下に示した）を添加した後、６０μｌの
ミネラルオイルを重層した。サーマルサイクラー（Ｇｅ
ｎｅＡｍｐ ９６００ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ、（株）
パーキンエルマージャパン）でＰＣＲを以下の条件で実
施した。
【００２３】ＰＣＲミックスの組成
１１．５ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．３）
５７．７ｍＭ ＫＣｌ
２．６ｍＭ ＭｇＣｌ２
０．３ｍＭ ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴ
Ｐ、ＴＴＰそれぞれ０．３ｍＭ） ０．２８ｍＭ プライマー（Ｒ）（配列番号１）（ＨＣ
Ｖ ｃＤＮＡ塩基番号２４８〜２６７（Ｋａｔｏ，Ｎ．
ら）に相補的） ０．２８ｍＭ プライマー（Ｆ）（配列番号２） （ＨＣＶ ｃＤＮＡ塩基番号１０〜３１（Ｋａｔｏ，
Ｎ．ら）と相同） ０．０２３％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ ０．０３５Ｕ／μｌ ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ
（（株）パーキンエルマージャパン製） ＰＣＲ条件 ９５℃、９分間 ９５℃、３０秒間 ６２℃、３０秒間 ７２℃、１分間 〜を４０サイクル。
Ｐ、ＴＴＰそれぞれ０．３ｍＭ） ０．２８ｍＭ プライマー（Ｒ）（配列番号１）（ＨＣ
Ｖ ｃＤＮＡ塩基番号２４８〜２６７（Ｋａｔｏ，Ｎ．
ら）に相補的） ０．２８ｍＭ プライマー（Ｆ）（配列番号２） （ＨＣＶ ｃＤＮＡ塩基番号１０〜３１（Ｋａｔｏ，
Ｎ．ら）と相同） ０．０２３％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ ０．０３５Ｕ／μｌ ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ
（（株）パーキンエルマージャパン製） ＰＣＲ条件 ９５℃、９分間 ９５℃、３０秒間 ６２℃、３０秒間 ７２℃、１分間 〜を４０サイクル。
【００２４】（１０）ＰＣＲ産物１０μｌを３％アガロ
ースで電気泳動した後、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩＩ（宝酒
造）で染色した。電気泳動のバンドをデンシトメーター
（デンシトグラフ、アトー（株）製）で確認、定量し
た。
ースで電気泳動した後、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩＩ（宝酒
造）で染色した。電気泳動のバンドをデンシトメーター
（デンシトグラフ、アトー（株）製）で確認、定量し
た。
【００２５】電気泳動の結果 を図１、電気泳動のバン
ド濃さをデンシトメーターで測定した結果を図２に示し
た。キャリアーとして２０μｇのデキストランを添加し
た場合、２２７０ｇの遠心によるＤＮＡの回収率は１６
８６０ｇの場合の約１／３であった（図２）。デキスト
ランの添加量２０μｇは１６８６０ｇで遠心する場合で
は十分量であるが、この条件で遠心加速度を小さくする
（２２７０ｇ）と核酸の回収率が低下することが示され
た。
ド濃さをデンシトメーターで測定した結果を図２に示し
た。キャリアーとして２０μｇのデキストランを添加し
た場合、２２７０ｇの遠心によるＤＮＡの回収率は１６
８６０ｇの場合の約１／３であった（図２）。デキスト
ランの添加量２０μｇは１６８６０ｇで遠心する場合で
は十分量であるが、この条件で遠心加速度を小さくする
（２２７０ｇ）と核酸の回収率が低下することが示され
た。
【００２６】実施例２ キャリアーとしてのデキストラ
ン添加量の検討。
ン添加量の検討。
【００２７】（１）ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）ｃＤＮ
Ａ由来の塩基番号１〜１８６５を含む（実施例１参照）
２本鎖ＤＮＡ、３７コピー／１００μｌ 希釈液（Ｐｏ
ｓ希釈液とする）を調製した。希釈液の組成を以下に示
した。
Ａ由来の塩基番号１〜１８６５を含む（実施例１参照）
２本鎖ＤＮＡ、３７コピー／１００μｌ 希釈液（Ｐｏ
ｓ希釈液とする）を調製した。希釈液の組成を以下に示
した。
【００２８】希釈液の組成
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．９）
０．１５Ｍ ＮａＣｌ
５％ ウシ血清アルブミン
０．５ｍＭ ＥＤＴＡ
（２）Ｐｏｓ希釈液１００μｌを１．５ｍｌチューブ
（エッペンドルフ）にとり、試薬１を２μｌ（デキスト
ラン量２０μｇ）、４μｌ（デキストラン量４０μ
ｇ）、８μｌ（デキストラン量８０μｇ）、１２μｌ
（デキストラン量１２０μｇ）、１６μｌ（デキストラ
ン量１６０μｇ）、添加し、混合した。
（エッペンドルフ）にとり、試薬１を２μｌ（デキスト
ラン量２０μｇ）、４μｌ（デキストラン量４０μ
ｇ）、８μｌ（デキストラン量８０μｇ）、１２μｌ
（デキストラン量１２０μｇ）、１６μｌ（デキストラ
ン量１６０μｇ）、添加し、混合した。
【００２９】試薬１の組成
１０ｍｇ／ｍｌデキストラン（分子量４８万）
３ｍＭ ＮａＮ3
（３）各チューブに試薬２を５００μｌ添加し、混合し
た。試薬２の組成を以下に示す。
た。試薬２の組成を以下に示す。
【００３０】試薬２の組成
２．４Ｍ チオシアン酸グアニジン
１５ｍＭ クエン酸三ナトリウム
６０％ イソプロピルアルコール
（４）各チューブを２２７０ｇ（実施例１に従う）の加
速度で３分間遠心した。同時に、デキストラン添加量２
０μｇで加速度１６８６０ｇ（実施例１に従う）の場合
も実施した。
速度で３分間遠心した。同時に、デキストラン添加量２
０μｇで加速度１６８６０ｇ（実施例１に従う）の場合
も実施した。
【００３１】（５）上清をアスピレーターで除いた後、
試薬３を３００μｌ添加し、攪拌した。試薬３の組成を
以下に示す。
試薬３を３００μｌ添加し、攪拌した。試薬３の組成を
以下に示す。
【００３２】試薬３の組成
１３３ｍＭ ＫＣｌ
６０％ イソプロピルアルコール
（６）操作（４）に対応させて、それぞれを２２７０ｇ
あるいは１６８６０ｇの加速度で３分間遠心した。
あるいは１６８６０ｇの加速度で３分間遠心した。
【００３３】（７）上清をアスピレーターで吸引、除去
した後、沈殿を１０μｌのＴＥに溶解した。ＴＥの組成
を以下に示す。
した後、沈殿を１０μｌのＴＥに溶解した。ＴＥの組成
を以下に示す。
【００３４】ＴＥの組成
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
０．１ｍＭ ＥＤＴＡ
（８）各チューブから１０μｌをとり、０．５ｍｌ Ｐ
ＣＲチューブ（ＧｅｎｅＡｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅ
ｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、（株）パーキンエ
ルマージャパン）に移した。
ＣＲチューブ（ＧｅｎｅＡｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅ
ｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、（株）パーキンエ
ルマージャパン）に移した。
【００３５】（９）引き続いて、６５μｌのＰＣＲミッ
クス（組成を以下に示した）を添加した後、６０μｌの
ミネラルオイルを重層した。サーマルサイクラー（Ｇｅ
ｎｅＡｍｐ ９６００ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ、（株）
パーキンエルマージャパン）でＰＣＲを以下の条件で実
施した。
クス（組成を以下に示した）を添加した後、６０μｌの
ミネラルオイルを重層した。サーマルサイクラー（Ｇｅ
ｎｅＡｍｐ ９６００ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ、（株）
パーキンエルマージャパン）でＰＣＲを以下の条件で実
施した。
【００３６】ＰＣＲミックスの組成
１１．５ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．３）
５７．７ｍＭ ＫＣｌ
２．６ｍＭ ＭｇＣｌ２
０．３ｍＭ ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴ
Ｐ、ＴＴＰそれぞれ０．３ｍＭ） ０．２８ｍＭ プライマー（Ｒ）（配列番号３） ０．２８ｍＭ プライマー（Ｆ）（配列番号４） ０．０２３％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ ０．０３５Ｕ／μｌ ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ
（（株）パーキンエルマージャパン製） ＰＣＲ条件 ９５℃、９分間 ９５℃、３０秒間 ６２℃、３０秒間 ７２℃、１分間 〜を４０サイクル。
Ｐ、ＴＴＰそれぞれ０．３ｍＭ） ０．２８ｍＭ プライマー（Ｒ）（配列番号３） ０．２８ｍＭ プライマー（Ｆ）（配列番号４） ０．０２３％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ ０．０３５Ｕ／μｌ ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ
（（株）パーキンエルマージャパン製） ＰＣＲ条件 ９５℃、９分間 ９５℃、３０秒間 ６２℃、３０秒間 ７２℃、１分間 〜を４０サイクル。
【００３７】（１０）ＰＣＲ産物１０μｌを３％アガロ
ースで電気泳動した後、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩＩ（宝酒
造）で染色した。電気泳動のバンドをデンシトメーター
（デンシトグラフ、アトー（株））で確認、定量した。
ースで電気泳動した後、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩＩ（宝酒
造）で染色した。電気泳動のバンドをデンシトメーター
（デンシトグラフ、アトー（株））で確認、定量した。
【００３８】電気泳動の結果 を図３、電気泳動のバン
ド濃さをデンシトメーターで測定した結果を図４に示し
た。遠心加速度２２７０ｇにおいて、デキストラン添加
量を４０μｇ以上とすると、１６８６０ｇの場合に匹敵
するＰＣＲ産物が得られた（図４）。デキストラン添加
量４０μｇ以上とすることで、２２７０ｇという低加速
度の遠心でも高収率な核酸抽出が可能となった。
ド濃さをデンシトメーターで測定した結果を図４に示し
た。遠心加速度２２７０ｇにおいて、デキストラン添加
量を４０μｇ以上とすると、１６８６０ｇの場合に匹敵
するＰＣＲ産物が得られた（図４）。デキストラン添加
量４０μｇ以上とすることで、２２７０ｇという低加速
度の遠心でも高収率な核酸抽出が可能となった。
【００３９】実施例３ ＨＣＶ陽性血清からのウイルス
ＲＮＡの抽出。
ＲＮＡの抽出。
【００４０】（１）ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）陽性血
清（５×１０5コピー／１００μｌ）を正常人血清（以
後、Ｎｅｇ血清とする）で希釈して、１０4コピー／１
００μｌ 血清（以後、Ｐｏｓ血清とする）を調製し
た。
清（５×１０5コピー／１００μｌ）を正常人血清（以
後、Ｎｅｇ血清とする）で希釈して、１０4コピー／１
００μｌ 血清（以後、Ｐｏｓ血清とする）を調製し
た。
【００４１】（２）ＮｅｇおよびＰｏｓ血清１００μｌ
を１．５ｍｌチューブ（エッペンドルフ）にとり、それ
ぞれに試薬１を２μｌ（デキストラン量２０μｇ）ある
いは１０μｌ（デキストラン量１００μｇ）添加し、混
合した。試薬１の組成を以下に示す。
を１．５ｍｌチューブ（エッペンドルフ）にとり、それ
ぞれに試薬１を２μｌ（デキストラン量２０μｇ）ある
いは１０μｌ（デキストラン量１００μｇ）添加し、混
合した。試薬１の組成を以下に示す。
【００４２】試薬１の組成
１０ｍｇ／ｍｌデキストラン（分子量４８万）
３ｍＭ ＮａＮ3
（３）各チューブに試薬２を５００μｌ添加し、混合し
た。試薬２の組成を以下に示す。
た。試薬２の組成を以下に示す。
【００４３】試薬２の組成
２．４Ｍ チオシアン酸グアニジン
１５ｍＭ クエン酸三ナトリウム
６０％ イソプロピルアルコール
（４）デキストラン１００μｇを添加したものについて
は２２７０ｇ（実施例１に従う）、デキストラン２０μ
ｇを添加したものについては１６８６０ｇ（実施例１に
従う）の加速度で３分間遠心した。
は２２７０ｇ（実施例１に従う）、デキストラン２０μ
ｇを添加したものについては１６８６０ｇ（実施例１に
従う）の加速度で３分間遠心した。
【００４４】（５）上清をアスピレーターで除いた後、
試薬３を３００μｌ添加し、攪拌した。試薬３の組成を
以下に示す。
試薬３を３００μｌ添加し、攪拌した。試薬３の組成を
以下に示す。
【００４５】試薬３の組成
１３３ｍＭ ＫＣｌ
６０％ イソプロピルアルコール
（６）操作（４）に対応させて、それぞれを２２７０ｇ
あるいは１６８６０ｇの加速度で３分間遠心した。
あるいは１６８６０ｇの加速度で３分間遠心した。
【００４６】（７）上清をアスピレーターで除いた後、
沈殿を１０μｌのサンプル希釈液に溶解した。サンプル
希釈液の組成を以下に示す。
沈殿を１０μｌのサンプル希釈液に溶解した。サンプル
希釈液の組成を以下に示す。
【００４７】サンプル希釈液の組成
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
５ｍＭ ＤＴＴ
０．２５Ｕ／μｌ リボヌクレエースインヒビター（宝
酒造） （８）各チューブから５μｌをとり、０．５ｍｌ ＰＣ
Ｒチューブ（ＧｅｎｅＡｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ
Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、（株）パーキンエル
マージャパン製）に移した。
酒造） （８）各チューブから５μｌをとり、０．５ｍｌ ＰＣ
Ｒチューブ（ＧｅｎｅＡｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ
Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、（株）パーキンエル
マージャパン製）に移した。
【００４８】（９）１０μｌのＲＴミックスを添加し、
６０μｌのミネラルオイルを重層した後、サーマルサイ
クラー（ＧｅｎｅＡｍｐ ９６００ ＰＣＲ ｓｙｓｔ
ｅｍ、（株）パーキンエルマージャパン製）を用いて、
逆転写反応を行った。ＲＴミックスと逆転写反応条件を
以下に示す。
６０μｌのミネラルオイルを重層した後、サーマルサイ
クラー（ＧｅｎｅＡｍｐ ９６００ ＰＣＲ ｓｙｓｔ
ｅｍ、（株）パーキンエルマージャパン製）を用いて、
逆転写反応を行った。ＲＴミックスと逆転写反応条件を
以下に示す。
【００４９】ＲＴミックスの組成
１５ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．３）
７５ｍＭ ＫＣｌ
６．８ｍＭ ＭｇＣｌ２
２．０ｍＭ ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴ
Ｐ、ＴＴＰそれぞれ０．３ｍＭ） １．８ｍＭ プライマー（Ｒ）（配列番号５） ３Ｕ／μｌ ＭＭＬＶ逆転写酵素（ＬＩＦＥ ＴＥＣＨ
ＮＯＬＯＧＩＥＳ） 逆転写反応条件 ４２℃、１０分間 ９９℃、６分間 （１０）各チューブに６０μｌのＰＣＲミックスを添加
した後、サーマルサイクラー（（株）パーキンエルマー
ジャパン）でＰＣＲを実施した。ＰＣＲミックスおよび
ＰＣＲ条件を以下に示す。
Ｐ、ＴＴＰそれぞれ０．３ｍＭ） １．８ｍＭ プライマー（Ｒ）（配列番号５） ３Ｕ／μｌ ＭＭＬＶ逆転写酵素（ＬＩＦＥ ＴＥＣＨ
ＮＯＬＯＧＩＥＳ） 逆転写反応条件 ４２℃、１０分間 ９９℃、６分間 （１０）各チューブに６０μｌのＰＣＲミックスを添加
した後、サーマルサイクラー（（株）パーキンエルマー
ジャパン）でＰＣＲを実施した。ＰＣＲミックスおよび
ＰＣＲ条件を以下に示す。
【００５０】ＰＣＲミックスの組成
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．３）
５０ｍＭ ＫＣｌ
１．６ｍＭ ＭｇＣｌ２
０．３ｍＭ プライマー（Ｆ）（配列番号６）
０．０２５％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００
０．０３８Ｕ／μｌ ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ
（（株）パーキンエルマージャパン製） ＰＣＲ条件 ９５℃、９分間 ９５℃、３０秒間 ６２℃、３０秒間 ７２℃、１分間 〜を４０サイクル。
（（株）パーキンエルマージャパン製） ＰＣＲ条件 ９５℃、９分間 ９５℃、３０秒間 ６２℃、３０秒間 ７２℃、１分間 〜を４０サイクル。
【００５１】（１１）ＰＣＲ産物１０μｌを３％アガロ
ースで電気泳動した後、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩＩ（宝酒
造）で染色した。電気泳動のバンドをデンシトメーター
（デンシトグラフ、アトー（株））で確認、定量した。
ースで電気泳動した後、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩＩ（宝酒
造）で染色した。電気泳動のバンドをデンシトメーター
（デンシトグラフ、アトー（株））で確認、定量した。
【００５２】電気泳動の結果を図５、電気泳動のバンド
濃さをデンシトメーターで測定した結果を図６に示し
た。遠心加速度２２７０ｇでもデキストランを１００μ
ｇ添加した場合、１６８６０ｇの場合に匹敵するＰＣＲ
産物が得られた（図６）。血清中のＨＣＶ粒子からのＲ
ＮＡ抽出についても、デキストランを１００μｇ添加す
ることで２２７０ｇという低加速度でも高収率に抽出で
きることが示された。
濃さをデンシトメーターで測定した結果を図６に示し
た。遠心加速度２２７０ｇでもデキストランを１００μ
ｇ添加した場合、１６８６０ｇの場合に匹敵するＰＣＲ
産物が得られた（図６）。血清中のＨＣＶ粒子からのＲ
ＮＡ抽出についても、デキストランを１００μｇ添加す
ることで２２７０ｇという低加速度でも高収率に抽出で
きることが示された。
【００５３】
【発明の効果】以上の説明のように、本発明は、フェノ
ールやクロロホルムなどの劇物を使用せずに、簡易な卓
上小型遠心機で容易に発生し得る２０００ｇ〜１０００
０ｇの加速度の遠心によって分離できる簡便な核酸抽出
方法を提供する。
ールやクロロホルムなどの劇物を使用せずに、簡易な卓
上小型遠心機で容易に発生し得る２０００ｇ〜１０００
０ｇの加速度の遠心によって分離できる簡便な核酸抽出
方法を提供する。
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> Tosoh Corporation
<120> 改良された核酸抽出方法
<130> 211-0457
<160> 6
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> プライマー（Ｒ）
<400> 1
gcctttcgcg acccaacact 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> プライマー（Ｆ）
<400> 2
acactccacc atagatcact cc 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> プライマー（Ｒ）
<400> 3
gcctttcgcg acccaacact 20
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> プライマー（Ｆ）
<400> 4
acactccacc atagatcact cc 22
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> プライマー（Ｒ）
<400> 5
gcctttcgcg acccaacact 20
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> プライマー（Ｆ）
<400> 6
acactccacc atagatcact cc 22
【図１】ＰＣＲ産物１０μｌを３％アガロースで電気泳
動し、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩＩで染色した結果を示し
た（写真は白黒反転画像）。φＸ１７４／ＨａｅＩＩＩ
は分子量マーカー。図中の矢印がＰＣＲ産物のバンドの
位置。１０4コピー／１００μｌ（加速度１６８６０
ｇ）の場合のＰＣＲ産物を、バンド濃さ測定のためのマ
ーカー（以後、電気泳動マーカーとする）としてレーン
１４、２７に泳動した。
動し、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩＩで染色した結果を示し
た（写真は白黒反転画像）。φＸ１７４／ＨａｅＩＩＩ
は分子量マーカー。図中の矢印がＰＣＲ産物のバンドの
位置。１０4コピー／１００μｌ（加速度１６８６０
ｇ）の場合のＰＣＲ産物を、バンド濃さ測定のためのマ
ーカー（以後、電気泳動マーカーとする）としてレーン
１４、２７に泳動した。
【図２】図２は、図１の電気泳動のバンド濃さをデンシ
トメーターで測定した結果である。電気泳動マーカーの
バンド濃さに対する各産物のバンド濃さの比率（以後、
相対黒化度とする）を示した。
トメーターで測定した結果である。電気泳動マーカーの
バンド濃さに対する各産物のバンド濃さの比率（以後、
相対黒化度とする）を示した。
【図３】ＰＣＲ産物１０μｌを３％アガロースで電気泳
動し、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩＩで染色した結果を示し
た（写真は白黒反転画像）。φＸ１７４／ＨａｅＩＩＩ
は分子量マーカー。図中の矢印がＰＣＲ産物のバンドの
位置。レーン１２、１８に電気泳動マーカー（図１の電
気泳動で用いたもの）を泳動した。
動し、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩＩで染色した結果を示し
た（写真は白黒反転画像）。φＸ１７４／ＨａｅＩＩＩ
は分子量マーカー。図中の矢印がＰＣＲ産物のバンドの
位置。レーン１２、１８に電気泳動マーカー（図１の電
気泳動で用いたもの）を泳動した。
【図４】図３の電気泳動で得られたバンドの相対黒化度
（図２の説明参照）をデンシトメーターで測定した結果
を示した。黒抜きは加速度１６８６０ｇ、白抜きは加速
度２２７０ｇの場合を表す。
（図２の説明参照）をデンシトメーターで測定した結果
を示した。黒抜きは加速度１６８６０ｇ、白抜きは加速
度２２７０ｇの場合を表す。
【図５】ＲＴ−ＰＣＲ産物１０μｌを３％アガロースで
電気泳動し、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩＩで染色した結果
を示した（写真は白黒反転画像）。φＸ１７４／Ｈａｅ
ＩＩＩは分子量マーカー。図中の矢印がＰＣＲ産物のバ
ンドの位置。レーン１０に電気泳動マーカー（図１の電
気泳動で用いたもの）を泳動した。
電気泳動し、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩＩで染色した結果
を示した（写真は白黒反転画像）。φＸ１７４／Ｈａｅ
ＩＩＩは分子量マーカー。図中の矢印がＰＣＲ産物のバ
ンドの位置。レーン１０に電気泳動マーカー（図１の電
気泳動で用いたもの）を泳動した。
【図６】図５の電気泳動で得られたバンドの相対黒化度
（図２の説明参照）をデンシトメーターで測定した結果
を示した。
（図２の説明参照）をデンシトメーターで測定した結果
を示した。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
Ｆターム(参考） 2G045 BA11 BA13 BB02 BB03 BB10
BB29 BB32 CA25 CA26 CB03
CB04 CB07 FB05
2G052 AA28 AA30 AA32 AA33 AA36
AD34 ED16 ED17 FB05 FD01
FD09 FD20 GA11 GA22 JA04
JA09 JA24
4B024 AA11 AA20 CA04 CA11 HA12
4B063 QA01 QA18 QQ42 QQ52 QR42
QR55 QR62 QS13 QS25 QS34
Claims (4)
- 【請求項１】核酸を含有する試料から核酸を抽出する方
法であって、（１）該試料１００μｌに対して４０μｇ
以上の割合で、多糖をキャリアーとして添加する工程、
（２）グアニジン塩、およびキャリアーと核酸を不溶化
させるためのアルコールを添加する工程、（３）不溶化
した核酸およびキャリアーを、２０００ｇ〜１００００
ｇの加速度が得られる遠心で分離する工程からなること
を特徴とする核酸抽出方法。 - 【請求項２】前記キャリアーが、分子量４０万〜２００
万のデキストランであることを特徴とする請求項１に記
載の核酸抽出方法。 - 【請求項３】前記グアニジン塩がチオシアン酸グアニジ
ンであることを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出方
法。 - 【請求項４】前記核酸およびキャリアーを不溶化させる
ためのアルコールがイソプロピルアルコールであること
を特徴とする請求項１に記載の核酸抽出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001128081A JP2003000248A (ja) | 2001-04-25 | 2001-04-25 | 改良された核酸抽出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001128081A JP2003000248A (ja) | 2001-04-25 | 2001-04-25 | 改良された核酸抽出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003000248A true JP2003000248A (ja) | 2003-01-07 |
Family
ID=18976840
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001128081A Pending JP2003000248A (ja) | 2001-04-25 | 2001-04-25 | 改良された核酸抽出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003000248A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005083414A1 (ja) * | 2004-02-27 | 2005-09-09 | Hitachi High-Technologies Corporation | 試料の分析方法ならびに分析装置及び導入方法 |
| JP2005253464A (ja) * | 2004-02-13 | 2005-09-22 | Eiken Chem Co Ltd | 簡易的核酸抽出法 |
| WO2009090991A1 (ja) * | 2008-01-15 | 2009-07-23 | Kyowa Medex Co., Ltd. | 遠心分離装置及び該装置を用いる測定用サンプルの調製方法 |
| JP2012235716A (ja) * | 2011-05-10 | 2012-12-06 | Eiji Konishi | Ｒｎａ検出用試薬およびｒｎａ検出方法 |
| JP2012235743A (ja) * | 2011-05-12 | 2012-12-06 | Sumitomo Osaka Cement Co Ltd | Ｒｎａ検出用試薬およびｒｎａ検出方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0759572A (ja) * | 1993-08-24 | 1995-03-07 | Tosoh Corp | 核酸抽出及び特定核酸配列の検出方法 |
| JPH11253158A (ja) * | 1998-03-12 | 1999-09-21 | Kurabo Ind Ltd | 核酸抽出法 |
-
2001
- 2001-04-25 JP JP2001128081A patent/JP2003000248A/ja active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0759572A (ja) * | 1993-08-24 | 1995-03-07 | Tosoh Corp | 核酸抽出及び特定核酸配列の検出方法 |
| JPH11253158A (ja) * | 1998-03-12 | 1999-09-21 | Kurabo Ind Ltd | 核酸抽出法 |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005253464A (ja) * | 2004-02-13 | 2005-09-22 | Eiken Chem Co Ltd | 簡易的核酸抽出法 |
| WO2005083414A1 (ja) * | 2004-02-27 | 2005-09-09 | Hitachi High-Technologies Corporation | 試料の分析方法ならびに分析装置及び導入方法 |
| WO2009090991A1 (ja) * | 2008-01-15 | 2009-07-23 | Kyowa Medex Co., Ltd. | 遠心分離装置及び該装置を用いる測定用サンプルの調製方法 |
| JP4944970B2 (ja) * | 2008-01-15 | 2012-06-06 | 協和メデックス株式会社 | 遠心分離装置及び該装置を用いる測定用サンプルの調製方法 |
| JP2012235716A (ja) * | 2011-05-10 | 2012-12-06 | Eiji Konishi | Ｒｎａ検出用試薬およびｒｎａ検出方法 |
| JP2012235743A (ja) * | 2011-05-12 | 2012-12-06 | Sumitomo Osaka Cement Co Ltd | Ｒｎａ検出用試薬およびｒｎａ検出方法 |
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