JP2005253464A - 簡易的核酸抽出法 - Google Patents
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Abstract
核酸を含む試料から核酸を精製するために、従来の複雑な操作や大型または特殊な装置を必要とせずに、簡便かつ迅速に核酸を抽出する方法を提供することを目的とする。また、本発明により、精製した核酸を瞬時に核酸増幅等の核酸分析に供することができる。
【解決手段】
核酸を含有する試料について、予め不溶化した核酸を担体に付着または担体上の核酸を不溶化することによって核酸を担体に付着させ、付着した核酸以外の成分を除去した後、核酸が付着した担体と核酸増幅用試薬と接触させることを特徴とする核酸抽出法およびこれを利用した核酸増幅法。
【選択図】 なし
Description
(1)核酸を含有する試料について、以下の工程を含むことを特徴とする核酸抽出法。
(a)予め不溶化した核酸を担体に付着させる工程、
および(b)核酸が付着した担体と核酸増幅用試薬とを接触させる工程。
(2)核酸を含有する試料について、以下の工程を含むことを特徴とする核酸抽出法。
(a)担体上の核酸を不溶化することによって核酸を担体に付着させる工程、
および(b)核酸が付着した担体と核酸増幅用試薬とを接触させる工程。
(3)担体に付着した核酸以外の成分を除去する(1)〜(2)記載の方法。
(4)担体に付着した核酸を、担体からの分離操作なしに、核酸増幅用試薬と接触させる(1)〜(3)記載の方法。
(5)担体が、ろ紙、メンブレンフィルター、綿、糸、不織布およびプラスチック焼結体から成る群から選ばれる少なくとも1種である(1)〜(4)記載の方法。
(6)核酸を含有する試料について、以下の工程を含むことを特徴とする核酸増幅法。
(a)予め不溶化した核酸を担体に付着させる工程、
(b)核酸が付着した担体と核酸増幅用試薬とを接触させる工程、
および(c)前記担体に付着した核酸を増幅させる工程。
(7)核酸を含有する試料について、以下の工程を含むことを特徴とする核酸増幅法。
(a)担体上の核酸を不溶化することによって核酸を担体に付着させる工程、
(b)核酸が付着した担体と核酸増幅用試薬とを接触させる工程、
および(c)前記担体に付着した核酸を増幅させる工程。
(8)付着した核酸以外の成分を除去する(6)〜(7)記載の方法。
(9)担体に付着した核酸を、担体からの分離操作なしに、核酸増幅用試薬と接触させる(6)〜(8)記載の方法。
(10)担体が、ろ紙、メンブレンフィルター、綿、糸、不織布およびプラスチック焼結体から成る群から選ばれる少なくとも1種である(6)〜(9)記載の方法。
(11)核酸増幅法が、LAMP法である(6)〜(10)記載の方法。
A.前処理法
1)試薬調製
核酸共沈剤として40mg/mLアミロペクチン溶液(以下「共沈剤A」)、蛋白質変性剤として0.06mol/L水酸化ナトリウム水溶液(以下「変性剤」)、不溶化剤として60%イソプロパノールおよび34mmol/Lクエン酸ナトリウムを含む混合液(以下「不溶化剤A」)、および70%エタノール(以下「洗浄液A」)を用意した。また、担体としては、定性ろ紙No.1( ADVANTEC社製 )を用いた。
牛胚培養細胞懸濁液100μL(1細胞/μL)と変性剤100μLを混合し、次いで、共沈剤A1μLおよび不溶化剤A250μLを添加し、よく混合した。この混合液全量を、ピペット(またはマイクロシリンジ)を用いて、2mm角ろ紙上に少しずつ滴下した。このとき2mm角ろ紙の下に吸水用の大型のろ紙を配置した。大型のろ紙を新しいものに替え、さらに洗浄液B(100μL)を滴下しながら、2mm角ろ紙を洗浄した。(不溶化した核酸以外の成分が)十分に大型のろ紙に吸水したことを確認後、ピンセット等で2mm角ろ紙を取り出した。また、細胞懸濁液の代わりに、蒸留水を使用して、同様の操作を行ったものを陰性対照とした。
1)試薬調製
不溶化剤として60%イソプロパノール、2.4mol/Lグアニジン、0.5% N−ラウロイルサルコシンナトリウムおよび15mmol/Lクエン酸ナトリウムを含む混合液(以下「不溶化剤B」)、および40%イソプロパノールと塩化カリウム200mmol/Lの混合液(以下「洗浄液B」)を用意した。共沈剤および担体は、A法で使用したものと同じものを使用した。
ピペットを用いて牛胚培養細胞懸濁液1μL(100細胞/μL)および共沈剤A1μLを順次2mm角ろ紙上に滴下し、次いでろ紙の下に大型ろ紙を敷き、さらに不溶化剤B500μLを2mm角ろ紙上に滴下した。それ以降の操作は、洗浄液Bを用いて前記前処理法と同様に行った。また、陰性対照も、同様に蒸留水を使用した。
本発明の回収効率を調べるために、0.01mol/L NaOH水溶液4μLと牛胚培養細胞懸濁液1μL(100細胞/μL)を混合したものを用意し、これを比較対照とした。
牛胚培養細胞懸濁液(100細胞/μL)そのままを用い、未処理法とした。
〔反応液組成〕
LAMP用反応液組成(25μL中)
20mM Tris−HCl(pH8.8)
10mM KCl
10mM (NH4)2SO4
8mM MgSO4
80nM オキサゾールイエロー
0.1% Tween20
0.8M Betaine
1.4mM dNTPs
8U BstDNAポリメラーゼ( New England Biolab社製 )
1.6μM FIプライマー
1.6μM RIプライマー
0.2μM F3プライマー
0.2μM R3プライマー
0.8μM ループプライマーF
0.8μM ループプライマーR
・FIプライマー
5'-AGCTATGTGG CATGTGGGAT CCTTCCCTGG AAATGTTTAA GTG-3'(配列番号1)
・RIプライマー
5'-TAAAGCCAGA CACAGAGGTC ACTTTTGCTT CTCTTTCCTG CTTC-3'(配列番号2)
・F3プライマー
5'-AGCCAAGAAG TGGATGAATC-3'(配列番号3)
・R3プライマー
5'-GCAGTGCATT TCCTCCTC-3'(配列番号4)
・ループプライマーF
5'-GGGATGGAAA CTGTGCAT-3'(配列番号5)
・ループプライマーR
5'-ATTGCATGTG GAAGAACTGT AG-3'(配列番号6)
実施例1のA.前処理法に準じて実施した。担体としては、プラスチック(ポリエチレン製)焼結体(フィルタレン社製)(以下「焼結体」)を用いた。すなわち、プラスミドHBV溶液5μL(1×106copy/5μL)に、変性剤40μLおよび34mmol/Lクエン酸ナトリウム12μLを加え蒸留水で400μLとし、さらに100%イソプロパノールを400μL添加し、よく混合した。この混合液全量を、ピペット(またはマイクロシリンジ)を用いて、大型のろ紙の上に配置した焼結体(3mmφ×1mm、孔径10μm)上に少しずつ滴下した。この後、実施例1.のA法2)同様に、焼結体を洗浄した。また、このような前処理を行わなかったプラスミドHBV溶液そのものを、陽性対照とした。
〔反応液組成〕
LAMP用反応液組成(25μL中)
BstDNAポリメラーゼおよびプライマーの濃度を以下に変更し、そしてオキザソールイエローを除いた以外、他の成分および濃度は、実施例2.と同様の組成とした。
12U BstDNAポリメラーゼ( New England Biolab社製 )
1.6μM FIプライマー
1.6μM RIプライマー
0.4μM F3プライマー
0.4μM R3プライマー
・FIプライマー
5'-GATAAAACGC CGCAGACACA TCCTTCCAAC CTCTTGTCCT CCAA-3'(配列番号7)
・RIプライマー
5'-CCTGCTGCTA TGCCTCATCT TCTTTGACAA ACGGGCAACA TACCTT-3'(配列番号8)
・F3プライマー
5'-CAAAATTCGC AGTCCCCAAC-3'(配列番号9)
・R3プライマー
5'-CGTGCTGGTG GTTGATGTTC-3'(配列番号10)
1)試薬調製
核酸共沈剤として10mg/mLアミロペクチン溶液(以下「共沈剤B」)、不溶化剤として60%イソプロパノール、2.4mol/Lグアニジンおよび15mmol/Lクエン酸ナトリウムを含む混合液(以下「不溶化剤C」)、および洗浄液Aを用意した。また、担体としては、実施例.1で使用したろ紙と同様のものを用いた。
実施例1.のA.前処理法に準じて実施した。HCV陽性血漿(1×106copy/100μL)を、PBSで各々103、104および105倍に希釈した試料100μLと、共沈剤B4μLおよび不溶化剤C500μL混合し、室温で10分間放置した。この混合物全量をシリンジを用いて、大型ろ紙の上に配置いた2.5mm角ろ紙上に滴下した。次いで、大型ろ紙を交換し、さらに洗浄液Aを2.5mm角ろ紙上に滴下した。再度、大型ろ紙を交換し、2.5mm角ろ紙の洗浄液を除去後、5分間乾燥させた。また、市販の Xtragen Kit および QIAamp viral RNA Mini Kitを使用して、核酸抽出を行ったものを、比較対照とした。
〔反応液組成〕
LAMP用反応液組成(25μL中)
20mM Tris−HCl(pH8.8)
10mM KCl
10mM (NH4)2SO4
8mM MgSO4
80nM オキサゾールイエロー
0.1% Tween20
0.6M Betaine
1.9mM dNTPs
8U BstDNAポリメラーゼ( New England Biolab社製 )
3.2μM FIプライマー
3.2μM RIプライマー
0.8μM F3プライマー
0.8μM R3プライマー
1.6μM ループプライマーR
・FIプライマー
5'-GGTTKATCCA AGAAAGGACC CAGTCGCCAT AGTGGTCTGC GGA-3'(配列番号11)
・RIプライマー
5'-CCGCAAGACT GCTAGCCGAG GCAAGCACCC TATCAGGC-3'(配列番号12)
・F3プライマー
5'-GGCGTTAGTA TGAGTGTCGT AC-3'(配列番号13)
・R3プライマー
5'-CATGGTGCAC GGTCTACG-3'(配列番号14)
・ループプライマーR
5'-TTGGGTTGCG AAAGG-3'(配列番号15)
Claims (11)
- 核酸を含有する試料について、以下の工程を含むことを特徴とする核酸抽出法。
(a)予め不溶化した核酸を担体に付着させる工程、
および(b)核酸が付着した担体と核酸増幅用試薬とを接触させる工程。 - 核酸を含有する試料について、以下の工程を含むことを特徴とする核酸抽出法。
(a)担体上の核酸を不溶化することによって核酸を担体に付着させる工程、
および(b)核酸が付着した担体と核酸増幅用試薬とを接触させる工程。 - 担体に付着した核酸以外の成分を除去する請求項1〜2記載の方法。
- 担体に付着した核酸を、担体からの分離操作なしに、核酸増幅用試薬と接触させる請求項1〜3記載の方法。
- 担体が、ろ紙、メンブレンフィルター、綿、糸、不織布およびプラスチック焼結体から成る群から選ばれる少なくとも1種である請求項1〜4記載の方法。
- 核酸を含有する試料について、以下の工程を含むことを特徴とする核酸増幅法。
(a)予め不溶化した核酸を担体に付着させる工程、
(b)核酸が付着した担体と核酸増幅用試薬とを接触させる工程、
および(c)前記担体に付着した核酸を増幅させる工程。 - 核酸を含有する試料について、以下の工程を含むことを特徴とする核酸増幅法。
(a)担体上の核酸を不溶化することによって核酸を担体に付着させる工程、
(b)核酸が付着した担体と核酸増幅用試薬とを接触させる工程、
および(c)前記担体に付着した核酸を増幅させる工程。 - 担体に付着した核酸以外の成分を除去する請求項6〜7記載の方法。
- 担体に付着した核酸を、担体からの分離操作なしに、核酸増幅用試薬と接触させる請求項6〜8記載の方法。
- 担体が、ろ紙、メンブレンフィルター、綿、糸、不織布およびプラスチック焼結体から成る群から選ばれる少なくとも1種である請求項6〜9記載の方法。
- 核酸増幅法が、LAMP法である請求項6〜10記載の方法。
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