JPH11146783A - リボ核酸の抽出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】従来法に比べ、簡便、迅速、かつ安全に、リボ
核酸を含有する試料からリボ核酸を抽出可能な方法を提
供する。 【解決手段】（ａ）リボ核酸を含む試料に、カオトロピ
ック物質を含む中性溶解液および核酸結合性固相担体を
添加し混合して、リボ核酸を担体上に吸着させた後、必
要に応じてカオトロピック物質を含む溶液にて洗浄し、
（ｂ）次に、上記リボ核酸が吸着した担体を水あるいは
低塩濃度緩衝液からなる洗浄液にて洗浄し、（ｃ）最後
に、上記担体を水あるいは低塩濃度緩衝液からなる溶出
液中に接触させた後、加熱することにより、リボ核酸を
上記担体から溶出液中に溶出させることを特徴とするリ
ボ核酸の抽出方法ならびに該抽出法に使用する試薬キッ
ト。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、リボ核酸の抽出方
法およびそのための試薬キットに関し、さらに詳しく
は、リボ核酸を含有する試料から、核酸結合性固相担体
を用いてリボ核酸を簡便に、かつ再現性良く抽出する方
法ならびにそのための試薬キットに関する。また、本発
明は自動核酸抽出装置にも応用しうる。

【０００２】

【従来の技術】リボ核酸（ＲＮＡ）は、デオキシリボ核
酸（ＤＮＡ）とともに、それを含んでいる細胞および生
物を特徴づける生体成分であることから、その検出、解
析は現在、最も重要な遺伝子工学技術の１つである。こ
のリボ核酸の検出、解析手段としては、従来よりノーザ
ンブロット解析が用いられてきたが、近年、ＲＮＡをＤ
ＮＡに変換後、このＤＮＡを増幅する逆転写ポリメラー
ゼ・チェイン・リアクション（ＲＴ−ＰＣＲ）法が開発
されたことにより、ノーザンブロット解析では検出でき
ない程度のごく微量のＲＮＡを迅速に、かつ比較的簡便
に検出、解析することが可能となった。これにより多数
のサンプルを一度に処理することが可能となり、今日の
臨床検査の分野においては、特にレトロウイルス（ＲＮ
Ａウイルス）の検出方法として応用され、感染症の診断
に必須の技術となっている。

【０００３】このような検出技術が進歩する中、微量の
リボ核酸を迅速にかつ簡便に、さらに再現性良く生体材
料から抽出する方法が強く望まれている。また、特に輸
血用血液中の感染性ウイルスの有無を見るような場合に
は、処理数からも、また抽出操作中の安全性の面からも
自動化が可能な抽出方法が望まれている。

【０００４】一般に、生物材料に含まれるリボ核酸を抽
出するには、まず、リボ核酸を含んでいる細胞、あるい
はウイルス粒子を破壊する必要があり、その段階でリボ
核酸は、タンパク質、脂質、糖、デオキシリボ核酸など
との混合物となる。リボ核酸は生体中に普遍的に存在す
るリボヌクレアーゼにより容易に分解されるため、この
破壊反応（溶解反応）は通常、蛋白質であるリボヌクレ
アーゼを変性失活させることができる強力なタンパク質
変性剤中にて行われる。従って、最終的に酵素反応に供
しうるリボ核酸を抽出するには、混在するタンパク質、
脂質、糖、デオキシリボ核酸などとの分離に加えて、こ
のタンパク質変性剤を完全に除くことも重要である。こ
れらの分離に用いられる方法としては、フェノール等の
有機溶媒で抽出し、その後、アルコールによって核酸を
塩析させる（アルコール沈殿）方法や、核酸結合性固相
担体を用いて核酸を特異的に固相に吸着後、回収する方
法がある。

【０００５】前者の方法としては、ＡＧＰＣ（Acid Gua
nidine Phenol Chlorohorm) 法[Analytical Biochemist
ry 162, 156-159 (1987)] が広く一般的に用いられてい
る。この方法は、（１）生体材料をグアニジンチオシア
ン酸、フェノール、クロロホルムを含む酸性溶液中で処
理することにより、生体構造の破壊及びタンパク質の変
性を行い、（２）変性したタンパク質およびデオキシリ
ボ核酸を遠心分離により有機溶媒相および有機溶媒相と
水相の中間相に分配し、（３）リボ核酸のみを分取し、
（４）この水相に対してイソプロパノールを添加するこ
とにより、リボ核酸を不溶化させ（イソプロパノール沈
殿法）、（５）最後に、遠心分離によって不溶化したリ
ボ核酸をペレットとして回収する方法である。

【０００６】このＡＧＰＣ法は、他の超遠心分離法を利
用するリボ核酸抽出法と比較して、特殊な設備が不要で
あり、デオキシリボ核酸をほとんど含まない純度の高い
リボ核酸が得られるという長所がある。しかし、その一
方で毒劇物であるフェノールやクロロホルムを使用しな
ければならず、また、遠心分離や水相の移し替えという
煩雑な操作や、イソプロパノール沈殿法という長時間を
要するステップが必要である。そのため、臨床診断など
多サンプルを迅速に解析する必要のある場合には、より
簡便かつ短時間でリボ核酸が抽出できる方法が要求され
る。

【０００７】一方、これらの問題を解決する方法とし
て、シリカ粒子等の核酸結合性固相担体とカオトロピッ
ク剤を用いて、生体材料からより簡便に核酸を抽出する
方法が、Boomらにより報告されている。[J.Clin.Microb
iol.,28(3),495-503(1990)] 。この方法は、（１）生体
材料にグアニジンチオシアン酸塩、ＥＤＴＡ、トリトン
Ｘ−１００よりなる溶解液および核酸結合性固相（シリ
カ粒子）を混合し、該固相に核酸を吸着させたのち、
（２）核酸が結合した固相を液相から分離し、（３）該
固相をグアニジンチオシアン酸塩を含む洗浄液で洗浄
し、（４）次に７０％エタノ−ル水溶液にて該固相を洗
浄し、（５）さらにアセトンにて該固相を洗浄した後、
固相を加熱により乾燥し、（６）最後に溶出液にて核酸
を該固相から溶出し、核酸を回収する方法である。この
方法は、フェノールなどの毒性の強い試薬を用いること
なく、また、遠心分離による有機溶媒相と水相の分離、
水相の移し替え等の煩雑な操作を行うことなく核酸の抽
出が行える点が特徴である。さらに、核酸は最終的に少
量の水あるいは低塩濃度緩衝液からなる溶出液中に回収
されるため、アルコール沈殿等による脱塩、遠心濃縮操
作を行うことなく、回収液（抽出液）を直接次の酵素反
応に用いることができる。

【０００８】しかしながら、このBoomらの方法に限ら
ず、シリカ等の核酸結合性固相担体とカオトロピック剤
を用いて核酸を担体に吸着させ、抽出する方法は、一般
に以下のような欠点、問題点が存在する。この方法によ
る抽出工程は、主に、（１）カオトロピック剤存在下、
シリカ粒子に核酸を吸着させる工程（吸着工程）、
（２）非特異的に結合した夾雑物及びカオトロピック剤
を除くため、洗浄液にて核酸の吸着したシリカを洗浄す
る工程（洗浄工程）、および（３）水あるいは低塩濃度
緩衝液にて核酸をシリカ粒子から溶出させる工程（溶出
工程）の３工程からなる。ここで（２）の洗浄液として
は、カオトロピック剤を溶かし込み、さらに、洗浄時に
おける核酸のシリカ粒子からの溶出を防ぐため、従来か
ら、水溶性有機溶媒、特にエタノールを５０〜８０％程
度の割合で含む水あるいは低塩濃度緩衝液が用いられて
いる。

【０００９】しかしながら、この水溶性有機溶媒が
（３）の工程に残留した場合、抽出液を酵素処理する際
に酵素反応が阻害されるため、通常、エタノールを含む
水溶液での洗浄後は、必要に応じて１００％エタノー
ル、あるいは、さらに揮発性の高いアセトン等で洗浄
し、その後、加熱乾燥によりその有機溶媒を系から完全
に取り除くことが行われている。この乾燥は長時間を要
するのみでなく、乾燥時間が不十分であればエタノール
の残留につながり、過度の場合には、核酸が強固に担体
に結合しすぎるために溶出が困難になり、結果的に核酸
回収量の低下や再現性の低下に繋がることが知られてい
る。このように有機溶媒の使用は、その乾燥の程度を見
極めにくいのみならず、エタノールやアセトンといった
有機溶媒は引火性及び揮発性を有するため、特に操作の
自動化を考えた場合には、出火等の危険性も考えられ
る。そこで、これらの問題点を克服した方法が必要とさ
れている。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、生物
材料から有機溶媒を使用することなく、簡便に、短時間
に、さらに安全に、かつ再現性よくリボ核酸を抽出する
方法並びにそのための試薬を提供することである。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、リボ核酸
の抽出方法として核酸結合性固相担体を用いた核酸の抽
出方法に着目し、上記問題点を解決するために鋭意検討
した結果、リボ核酸の場合、デオキシリボ核酸とは異な
り、担体に吸着させた後、エタノール等の有機溶媒を全
く含まない低塩濃度緩衝液にて洗浄しても、容易には担
体から溶離せず、加熱することによって初めて溶離が促
進されることを見いだした。本発明は、この新しい知見
に基づいて完成されたものである。

【００１２】すなわち、本発明は（ａ）リボ核酸を含む
試料に、カオトロピック物質を含む中性溶解液および核
酸結合性固相担体を混合して、リボ核酸を担体上に吸着
させた後、必要に応じてカオトロピック物質を含む溶液
にて洗浄し、（ｂ）リボ核酸が吸着した担体を水あるい
は低塩濃度緩衝液からなる洗浄液にて洗浄し、（ｃ）該
担体を水あるいは低塩濃度緩衝液からなる溶出液中に接
触させた後、加熱することにより、リボ核酸を該担体か
ら溶出液中に溶出させることを特徴とするリボ核酸の抽
出方法である。

【００１３】さらに、本発明は、４〜７Ｍのグアニジン
塩、０〜５％の非イオン性界面活性剤、０〜０．２ｍＭ
のＥＤＴＡ、０〜０．２Ｍの還元剤を含有する中性溶解
液、核酸結合性固相担体、４〜７Ｍのグアニジン塩、０
〜５％の非イオン性界面活性剤を含む第１の洗浄液、水
あるいは１００ｍＭ以下の低塩濃度緩衝液からなる第２
の洗浄液、及び水あるいは１００ｍＭ以下の低塩濃度緩
衝液からなる溶出液を含むリボ核酸の抽出用試薬キット
である。

【００１４】

【発明の実施態様】本発明におけるリボ核酸を含む試料
とは、血清、血漿、血液、尿、唾液、体液などの生体材
料である。また、リボ核酸とは、ウイルス、細菌あるい
は真菌等の外来性寄生生物由来のリボ核酸に加えて、こ
れらの生体材料を産する生物に由来する内在性のリボ核
酸をも含みうる。

【００１５】本発明では、まず、第１工程において、リ
ボ核酸を含む試料に、カオトロピック物質を含む中性溶
解吸着液および核酸結合性固相担体を添加、混合し、リ
ボ核酸を担体上に吸着させる。

【００１６】本発明において用いる溶解吸着液には、カ
オトロピック物質を含むｐＨ６〜８の中性溶液を用い
る。ここでカオトロピック物質としては、一般にカオト
ロピック物質として知られているような、水溶液中でカ
オトロピックイオン（イオン半径の大きな１価の陰イオ
ン）を生成し、疎水性分子の水溶性を増加させる作用を
有しており、核酸の固相担体への吸着に寄与するもので
あれば、特に限定されない。具体的には、グアニジンチ
オシアン酸塩、グアニジン塩酸塩、ヨウ化ナトリウム、
ヨウ化カリウム、過塩素酸ナトリウム等が挙げられる
が、これらのうち、リボ核酸を分解するリボヌクレアー
ゼに対する阻害効果の大きいグアニジンチオシアン酸塩
あるいはグアニジン塩酸塩の使用が最も好ましい。これ
らのカオトロピック物質の使用濃度は、用いられるカオ
トロピック物質により異なり、例えば、グアニジンチオ
シアン酸塩を使用する場合には、３〜５．５Ｍの範囲
で、グアニジン塩酸塩を使用する場合は、５Ｍ以上で使
用するのが好ましい。

【００１７】また、溶解吸着液には、細胞膜の破壊ある
いは細胞中に含まれるタンパク質を変性させる目的で界
面活性剤を含有させてもよい。この界面活性剤として
は、一般に細胞等からの核酸抽出に使用されるものであ
れば特に限定されないが、具体的には、トリトン系界面
活性剤及び、ツイーン系界面活性剤などの非イオン性界
面活性剤、Ｎ‐ラウロイルサルコシンナトリウム等の陰
イオン界面活性剤が挙げられる。本発明においては、特
に非イオン性界面活性剤を、０．１〜２％の範囲となる
ように使用するのが好ましい。さらに、溶解吸着液に
は、サンプル中に含まれる蛋白質、特にリボヌクレアー
ゼを変性・失活させる目的で、２−メルカプトエタノー
ルあるいはジチオスレイトール等の還元剤を含有させる
ことが好ましい。

【００１８】本発明において用いられる核酸結合性固相
としては、カオトロピックイオンの存在下で、核酸を吸
着すなわち可逆的な物理的結合により保持することがで
きる親水性表面を有する固体であれば、特に限定されな
い。具体的には、二酸化珪素、すなわちシリカが好まし
く用いられる。さらに、二酸化珪素を主成分とする他の
物質、例えばガラス、珪藻土、あるいはこれらを化学的
修飾により表面処理を施したものや、超常磁性金属酸化
物等の他の物質との複合体も含まれる。化学的修飾によ
り表面処理を施す場合は、核酸との可逆的な結合を妨げ
ない程度に、適度な陽性電荷を帯びさせてもよい。

【００１９】また、これらの核酸結合性固相の形態とし
ては、粒子、フィルター、反応容器等が具体的に挙げら
れるが、特に限定されない。これらのうち、吸着と溶出
の効率を考慮すると粒子の形態がより好ましい。さら
に、その場合の粒径は、０．０５〜５００μｍ、好まし
くは１〜１００μｍ、特に１〜１０μｍがより好適であ
る。

【００２０】本発明では、核酸を固相担体上に吸着させ
る工程において、担体が粒子の場合は、ボルテックスミ
キサーなどにて攪拌し、溶液と担体とを均一に分布させ
ることが好ましい。ここで、試料中にリボ核酸とともに
デオキシリボ核酸が含まれている場合、両核酸がともに
担体に結合する条件であってもよい。また結合させた後
には、必要に応じて、核酸の結合した担体をカオトロピ
ック物質を含む溶液にて洗浄することが好ましい。これ
によって非特異的に担体に吸着した核酸以外の夾雑物
を、核酸−担体複合体から完全に洗い去ることが可能で
ある。

【００２１】本発明における第２の工程は、第１の吸着
工程によりリボ核酸が吸着した担体を、カオトロピック
物質等を除く目的で、低塩濃度緩衝液からなる洗浄液に
て洗浄する工程である。ここでいう低塩濃度緩衝液から
なる洗浄液とは、エタノール等の有機溶媒およびカオト
ロピック物質を全く含まない緩衝液を指し、緩衝液とし
てはトリス系緩衝液が好ましいが、特に限定されない。

【００２２】また、低塩濃度とは、この緩衝液が第３の
溶出工程に残留した場合においても、ＲＴ−ＰＣＲ反応
などの酵素反応に影響を与えない程度の塩濃度を指し、
単なる水も含まれる。本発明においては、１００ｍＭ以
下の緩衝液が好ましい。また、この溶液は界面活性剤を
含有しても良く、ｐＨは特に限定されない。

【００２３】また、ここでいう洗浄とは、リボ核酸の結
合した担体を洗浄液と接触させ、再び分離することによ
り、生物材料、溶解液、核酸結合性固相の混合物から、
リボ核酸が吸着した核酸結合性固相以外の物質を可能な
限り除去する操作である。本発明における具体的な分離
手段としては、使用する核酸結合性固相担体の形態によ
り異なり、核酸結合性固相担体が粒子の形態である場合
には、遠心分離、ろ過分離及びカラム操作等が好まし
い。さらには、粒子内に超常磁性金属酸化物を含ませて
おいたものを担体として使用すれば、磁石等を用いた簡
便な磁気分離法が可能となり、より好適である。

【００２４】本発明における第３の工程は溶出工程であ
る。溶出工程は、リボ核酸が吸着した核酸結合性固相か
ら該リボ核酸を溶離させる工程である。従って、本発明
において用いられる溶出液としては、固相からのリボ核
酸の溶離を促進するものであれば、特に限定されない。
例えば、水あるいはトリス−ＥＤＴＡ緩衝液［１０ｍＭ
トリス塩酸緩衝液、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０］が
好ましい。

【００２５】また、本発明では加熱により溶出を促進さ
せることが必要である。加熱温度は、リボ核酸に悪影響
を及ぼさない程度であれば、特に限定されないが、５０
〜７０℃が好ましい。加熱時間は、３０秒〜１０分間程
度である。このようにして溶出したリボ核酸は、透析や
エタノール沈殿法等の脱塩、濃縮操作を施すことなく、
逆転写酵素等を使用した酵素反応に直接使用することが
できる。

【００２６】本発明の一実施態様は、（ａ）リボ核酸を
含む試料に、４〜７Ｍのグアニジン塩、０〜５％の非イ
オン性界面活性剤、０〜０．２ｍＭのＥＤＴＡ、０〜
０．２Ｍの還元剤を含有する中性溶解液および核酸結合
性固相担体を混合して、リボ核酸を担体上に吸着させ、
（ｂ）次いで、４〜７Ｍのグアニジン塩、０〜５％の非
イオン性界面活性剤を含む第１の洗浄液にてリボ核酸−
担体複合体を洗浄し、（ｃ）さらに、リボ核酸−担体複
合体を水あるいは１００ｍＭ以下の低塩濃度緩衝液から
なる第２の洗浄液にて洗浄し、（ｄ）最後に、上記担体
を水あるいは１００ｍＭ以下の低塩濃度緩衝液からなる
溶出液中に接触させた後、加熱することにより、リボ核
酸を上記担体から溶出液中に溶出させることを特徴とす
るリボ核酸の抽出方法である。

【００２７】本発明の試薬キットは、４〜７Ｍのグアニ
ジン塩、０〜５％の非イオン性界面活性剤、０〜０．２
ｍＭのＥＤＴＡ、０〜０．２Ｍの還元剤、例えば２−メ
ルカプトエタノールを含有する中性溶解液、核酸結合性
固相担体、４〜７Ｍのグアニジン塩、０〜５％の非イオ
ン性界面活性剤を含む第１の洗浄液、水あるいは１００
ｍＭ以下の低塩濃度緩衝液からなる第２の洗浄液、及び
水あるいは１００ｍＭ以下の低塩濃度緩衝液からなる溶
出液を含む。

【００２８】上記のように、本発明によるリボ核酸の抽
出方法は、フェノール等の危険な有機溶媒および揮発
性、引火性を有するエタノール、アセトン等の水溶性有
機溶媒を全く必要とせず、かつ単純なステップから構成
されるため、リボ核酸抽出キットや、固相の分離操作や
試薬分注操作を自動化した核酸抽出装置へ容易に応用し
うることは明らかである。また、本発明の方法により得
られたリボ核酸はＲＴ−ＰＣＲまたはＮＡＳＢＡ (例え
ば、EP0329822 号明細書記載) などの核酸増幅法の鋳型
として使用可能である。

【００２９】本発明の特徴は、リボ核酸の結合した核酸
結合性固相担体の洗浄液として、エタノール等の有機溶
媒を全く含まない低塩濃度緩衝液を用いることにある。
従来、このような洗浄液としては、洗浄時における核酸
の担体からの溶離を防ぐために、エタノール等の水溶性
有機溶媒を５０〜８０％含む、溶液の極性を下げた水あ
るいは低塩濃度緩衝液が用いられている。しかし、本発
明では、洗浄液としてエタノール等の有機溶媒を全く含
まない低塩濃度緩衝液を用いても、リボ核酸は、デオキ
シリボ核酸に比べて、固相担体から溶離しにくいため、
リボ核酸を固相担体上に保持することができる。さら
に、この洗浄により、デオキシリボ核酸が担体より溶出
されるため、デオキシリボ核酸の混入のより少ないリボ
核酸サンプルの調製が可能となる。

【００３０】

【実施例】以下に、本発明を実施例により、具体的に説
明する。実施例１ 大腸菌を含むサンプルからのリボ核酸の抽出 （１）大腸菌サンプルの調製 大腸菌ＪＭ１０９株をＬＢ寒天培地（１％ポリペプト
ン、０．５％イーストエキストラクト、１％塩化ナトリ
ウム）にて３７℃で１昼夜培養し、次に、そのシングル
コロニーをＬＢ液体培地にて３７℃、１２時間培養し
た。吸光度、ＯＤ６６０を測定後、大腸菌を遠心にて回
収し、７％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含んだリン酸
緩衝液（ＰＢＳ）（−）〔１３７ｍＭ塩化ナトリウム、
２．７ｍＭ塩化カリウム、４．３ｍＭリン酸水素二ナト
リウム、１．４ｍＭリン酸二水素カリウム（ｐＨ７．
４）〕にて、吸光度、ＯＤ６６０が０．５になるように
再度、大腸菌を懸濁し、サンプルとした。

【００３１】（２）リボ核酸の抽出 上記（１）にて調製した大腸菌サンプルに７００μｌの
溶解吸着液〔５．０Ｍグアニジンチオシアン酸塩、２％
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１
Ｍ ２−メルカプトエタノール、５０ｍＭ トリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ７．０）］を加えて溶解した。これに
０．４ｇ／ｍｌに調製した磁性シリカ（粒径１〜１０μ
ｍ、四三酸化鉄粒子３０％含有、比表面積２８０ｍ² ／
ｇ、細孔容積０．０２５ｍｌ／ｇ、表面細孔直径２〜６
ｎｍ：鈴木油脂社製）懸濁液を５０μｌ添加し、室温で
１０分間ボルテックスミキサーにて混合した。その後、
マイクロチューブを磁気スタンド（MPC-M：ダイナル社
製）に設置して、磁性シリカ粒子を集め、上清を除去し
た。

【００３２】次に、マイクロチューブを磁気スタンドか
らはずし、１ｍｌの洗浄液Ｉ［６．５Ｍ グアニジンチ
オシアン酸塩、５０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ６．
４）］を加えて十分に混合した後、同様に、磁気スタン
ドに設置して、上清を除去することにより、粒子を洗浄
した。この洗浄操作をもう一度繰り返した後、同様に、
１ｍｌの洗浄液II〔５ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ６．
４）〕にて２回粒子を洗浄した。最後に、これに６０μ
ｌの溶出液〔ジエチルピロカーボネイト処理をした滅菌
水〕を添加し、粒子を懸濁した後、６５℃で５分間加熱
し、磁気スタンドに設置して磁性シリカ粒子を集め、上
清を回収した。回収液量はおよそ５０μｌであった。

【００３３】（３）核酸の抽出（比較例） また、本願発明と従来法を比較するため、Boomらの方法
を用いて、同じサンプルを処理し、核酸の抽出を行っ
た。すなわち、（１）にて調製した大腸菌サンプルに９
００μｌの溶解吸着液［４．７Ｍ グアニジンチオシア
ン酸塩、１．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、２０ｍＭ
ＥＤＴＡ、５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ６．
４）］を加えて溶解した。これに０．４ｇ／ｍｌに調製
した磁性シリカ（粒型１〜１０μｍ、四三酸化鉄粒子３
０％含有、比表面積２８０ｍ² ／ｇ、細孔容積０．０２
５ｍｌ／ｇ、表面細孔直径２〜６ｎｍ：鈴木油脂社製）
懸濁液を５０μｌ添加し、室温で10分間混合した。次
に、マイクロチューブを磁気スタンド（MPC-M：ダイナ
ル社製）に設置して磁性シリカ粒子を集め、上清を除去
した。次いで、マイクロチューブを磁気スタンドからは
ずし、１ｍｌの洗浄液［５．３Ｍ グアニジンチオシア
ン酸塩、５０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ６．４）］で２
回、１ｍｌの７０％エタノールで２回、アセトンで１回
粒子を洗浄した。上清を除去した後、マイクロチューブ
を５５℃にて加熱し、残ったアセトンを完全に蒸発除去
させ、粒子を乾燥させた。最後に、これに１００μｌの
溶出液〔ジエチルピロカーボネイト処理をした滅菌水〕
を添加し、粒子を懸濁した後に、５５℃で１０分間加熱
し、磁気スタンドに設置して磁性シリカ粒子を集め、上
清を回収した。回収液量はおよそ８０μｌであった。

【００３４】（４）アガロースゲル電気泳動による抽出
した核酸の解析 本発明方法またはBoomらの方法によって大腸菌ＪＭ１０
９より抽出した核酸溶液９μｌと色素液（５０％グリセ
ロール、０．２５％ブロモフェノールブルー）１μｌを
混合し、１％アガロースゲル電気泳動に供した。泳動は
１×ＴＢＥ緩衝液にて１００Ｖ、３０分間行った。電気
泳動終了後、ゲルをエチジウムブロミド溶液に１５分間
浸せきし、紫外線照射下、写真撮影を行った。

【００３５】図１にその電気泳動の結果を示す。図１
中、レーン１は、サイズマーカー（ラムダファージＤＮ
Ａを制限酵素ＨｉｎｄIII で消化したもの）、レーン２
は、本発明方法により調製された核酸抽出物、レーン３
はBoomらの方法により調製された核酸抽出物の電気泳動
像を示す。図１から明らかなように、本発明方法により
得られた抽出液は、Boomらの方法により調製された核酸
抽出物に比べて、ゲノムＤＮＡの混入がきわめて少な
く、かつＲＮＡの収量はBoomらの方法とほとんど差がな
いことがわかる。

【００３６】実施例２ Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）Ｒ
ＮＡのＲＴ−ＰＣＲによる検出 （１）血清サンプルの調製およびＨＣＶ−ＲＮＡの抽出 １０⁶ コピー／ｍｌのＨＣＶが含まれているＣ型肝炎患
者血清を正常陰性血清を用いて順次１０倍希釈し、１０
〜１０⁶ コピー／ｍｌの希釈系列をつくり、これらを抽
出材料とした。各希釈系列の血清サンプル１００μｌ
（１〜１０⁵ コピー相当）を使用して、実施例１と同様
の方法によりＲＮＡの抽出を行った。

【００３７】（２）ＲＴ−ＰＣＲによるＨＣＶ−ＲＮＡ
の増幅 上記（１）にて得られた回収液に対して、ＨＣＶ−ＲＮ
Ａの非翻訳領域をターゲットにＲＴ−ＰＣＲをおこなう
ことにより、回収液中のＨＣＶ−ＲＮＡの検出を試み
た。ＲＴ−ＰＣＲは、岡本等の方法〔Ｊ. Exp. Med., 6
0, 215-222(1990)〕に従い、市販の試薬キット、ＲＴ−
ＰＣＲ ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）を用いて実施した。
まず、上記（１）にて得られた回収液のうち、５μｌに
Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素、逆転写用プライマー、リボヌク
レオチドインヒビターおよび反応用緩衝液を含む逆転写
用試薬を加え、最終液量を２０μｌとし、これを４２
℃、６０分間保温して逆転写反応をおこなった。次に、
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含むＰＣＲ用試薬に逆転写
反応後の反応液２．５μｌを加え、最終液量を２５μｌ
とした後、ＤＮＡ サーマルサイクラー（Perkin Elmer
Cetus社製）にて、９４℃３０秒間、５３℃３０秒間、
７２℃１分間の温度サイクルを３８サイクル実施した。
次に、この反応にて得られた増幅産物１μｌを、さらに
内側のプライマーを含むＰＣＲ用反応試薬に加え、最終
液量３０μｌにて、９４℃３０秒間、５０℃１分間、７
２℃１分間を２８サイクル実施し、二段階のＰＣＲをお
こなった。

【００３８】（３）アガロースゲル電気泳動による増幅
産物の検出 ＰＣＲ増幅産物９μｌに色素液（５０％グリセロール、
０．２５％ブロモフェノールブルー）１μｌを混合し、
１％アガロースゲル電気泳動に供した。泳動は１×ＴＢ
Ｅ緩衝液にて１００Ｖ、２０分間行った。電気泳動終了
後、ゲルをエチジウムブロミド溶液に１５分間浸せき
し、紫外線照射下、写真撮影を行った。写真撮影した結
果を図２に示す。

【００３９】図２中、レーン１は、ΦΧ１７４ファージ
ＤＮＡのＨｉｎｃII消化物からなるサイズマーカー、レ
ーン２〜４は本実施例に示す方法により抽出精製された
ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ増幅産物の泳動パターンであり、
レーン２は１×１０⁴ コピー、レーン３は１×１０³ コ
ピー、レーン４は１×１０² コピー相当のＨＣＶを含む
血清サンプルを使用したときの結果を示す。図２から１
０³ コピー相当のＨＣＶを含む血清サンプルについて増
幅産物が見られ、本発明の方法により血清サンプルから
ＨＣＶ−ＲＮＡの抽出が可能で、直ちにＲＴ−ＰＣＲに
よる解析に使用できることが確認できた。

【００４０】

【発明の効果】本発明方法によれば、血清、血漿等の生
物材料から迅速、簡便かつ安全にリボ核酸の抽出が可能
となる。該抽出法によって抽出したリボ核酸は直ちに、
ＲＴ−ＰＣＲ等の核酸増幅法に使用できる。該抽出法で
は、有機溶媒を一切使用せず、また担体を加熱乾燥させ
る必要もないのため、従来法に比べ、安全かつ簡便で、
抽出処理に要する時間も大幅に短縮することができ、か
つ再現性の高い確実な結果が得られる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明の方法およびBoomらの方法により、大
腸菌サンプルから抽出されたリボ核酸のアガロースゲル
電気泳動パターンを示す図面に代わる写真である。

【図２】 本発明の方法によってＨＣＶ陽性血清から抽
出されたリボ核酸を、ＲＴ−ＰＣＲによって増幅した増
幅産物のアガロースゲル電気泳動結果を示す図面に代わ
る写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 川村 良久 福井県敦賀市東洋町10番24号 東洋紡績株 式会社敦賀バイオ研究所内

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （ａ）リボ核酸を含む試料に、カオトロ
   ピック物質を含む中性溶解液および核酸結合性固相担体
   を混合して、リボ核酸を担体上に吸着させた後、必要に
   応じてカオトロピック物質を含む溶液にて洗浄し、
   （ｂ）リボ核酸が吸着した担体を水あるいは低塩濃度緩
   衝液からなる洗浄液にて洗浄し、（ｃ）該担体を水ある
   いは低塩濃度緩衝液からなる溶出液中に接触させた後、
   加熱することにより、リボ核酸を該担体から溶出液中に
   溶出させることを特徴とするリボ核酸の抽出方法。
2. 【請求項２】 核酸結合性固相担体が超常磁性金属酸化
   物を含む担体であって、さらに、磁力を利用して核酸結
   合性固相担体と液相を分離する工程を含むことを特徴と
   する請求項１記載のリボ核酸の抽出方法。
3. 【請求項３】 （ａ）リボ核酸を含む試料に、４〜７Ｍ
   のグアニジン塩、０〜５％の非イオン性界面活性剤、０
   〜０．２ｍＭのＥＤＴＡ、０〜０．２Ｍの還元剤を含有
   する中性溶解液、及び核酸結合性固相担体を混合して、
   リボ核酸を担体上に吸着させ、（ｂ）次いで、４〜７Ｍ
   のグアニジン塩、０〜５％の非イオン性界面活性剤を含
   む第１の洗浄液にてリボ核酸−担体複合体を洗浄し、
   （ｃ）さらに、リボ核酸−担体複合体を水あるいは１０
   ０ｍＭ以下の低塩濃度緩衝液からなる第２の洗浄液にて
   洗浄し、（ｄ）最後に、上記担体を水あるいは１００ｍ
   Ｍ以下の低塩濃度緩衝液からなる溶出液中に接触させた
   後、加熱することにより、リボ核酸を上記担体から溶出
   液中に溶出させることを特徴とするリボ核酸の抽出方
   法。
4. 【請求項４】 ４〜７Ｍのグアニジン塩、０〜５％の非
   イオン性界面活性剤、０〜０．２ｍＭのＥＤＴＡ、０〜
   ０．２Ｍの還元剤を含有する中性溶解液、核酸結合性固
   相担体、４〜７Ｍのグアニジン塩、０〜５％の非イオン
   性界面活性剤を含む第１の洗浄液、水あるいは１００ｍ
   Ｍ以下の低塩濃度緩衝液からなる第２の洗浄液、及び水
   あるいは１００ｍＭ以下の低塩濃度緩衝液からなる溶出
   液を含むリボ核酸の抽出用試薬キット。