JP2004500067A - 核酸の単離方法およびキット - Google Patents
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Abstract
本発明は、試験サンプルを酸化金属担体物質および結合バッファーと接触させて核酸／酸化金属担体物質複合体を形成させ、該複合体を該試験サンプルから分離し、該核酸を該酸化金属担体物質から溶出する工程を含む、試験サンプルから核酸を分離するための方法を提供する。
Description
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、核酸を単離するための方法およびキット、より詳しくは、有意な濃度の可燃性成分を使用しない、核酸を単離するための方法およびキットに関する。
【０００２】
（発明の背景）
種々の起源から核酸を単離するための幾つかの方法が良く知られている。初期の方法は、タンパク質を選択的に沈殿させ次いでそれを核酸含有溶液から除去するためにフェノールおよび／またはクロロホルムのような有機溶媒を使用するものであった。タンパク質を除去したら、ついで溶存核酸を、アルコールを使用して沈殿させ、固体表面上に集めることが可能であった。ついで、該核酸を可溶化してそれを該固体表面から取り出すために、適当なバッファーを使用するものであった。
【０００３】
前記のとおり、核酸配列を精製するための初期方法は、典型的には、起源材料中に存在するタンパク質または他の望ましくない物質から核酸配列を分別的に沈殿させるために有機溶媒を使用するものであった。核酸は、一旦沈殿すると、ガラス攪拌棒のような基体である固体上に容易に集められ、ついでそれは、精製された状態で可溶化される。また、核酸を精製するために、カオトロピック（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ）剤の存在下で固体基体に対して核酸が示すアフィニティーも利用されている。カオトロピック剤の使用も含めたこれらのサンプル精製方法は、典型的には、該核酸が該固体基体に結合すること又は洗浄操作中に該基体に結合したままであることを確認するために、アルコールのような有機溶媒を使用するものである。そのような方法では、初期の核酸単離方法（この場合、有機溶媒は、使用する唯一の試薬であった）と比較して比較的低い濃度の有機溶媒を使用するが、それでもなお、これらの方法で用いるアルコール濃度は、大容積のサンプルを加工する場合には特に、処分および安全性についての重大な懸念を招く。
【０００４】
核酸増幅反応、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼチェイン反応（ＬＣＲ）、および多コピーの標的核酸配列を合成するように設計された他の同様の方法の出現に伴い、起源材料（「サンプル調製物」または「サンプル・プレップ」と、様々に称される）からの核酸配列の単離は、益々重要な研究領域となりつつある。核酸配列の単なる精製以外にも幾つかの点を考慮すると、有用なサンプル調製方法の発見は困難なものとなる。例えば、外部核酸によるサンプルからサンプルへの汚染は、十分に立証されている重大な懸念である。また、所望の核酸配列（または「標的核酸配列」）を含有する初期サンプルは、しばしば、非常に低濃度の標的配列および比較的高濃度の外部核酸を含有する。さらに、サンプルの調製は、しばしば、使用され最終的には廃棄されうる試薬に関して厳しく管理された領域内で行われる。さらに、増幅反応に使用する目的で核酸を精製する場合には、増幅反応に一般に使用する酵素を阻害する成分を含まないバッファー中に、該核酸を最終的に存在させることが重要である。したがって、有用なサンプルの調製方法の設計においては、核酸配列の単なる精製以外にも幾つかの点を考慮しなければならない。
【０００５】
このように、最低限の扱いで核酸の定量的単離をもたらし可燃性有機溶媒を必要としないサンプル調製方法が必要とされている。
【０００６】
（発明の概要）
本発明は、試験サンプルを酸化金属担体物質および結合バッファーと接触させて核酸／酸化金属担体物質複合体を形成させ、該複合体を該試験サンプルから分離し、該核酸を該酸化金属担体物質から溶出する工程を含む、試験サンプルから核酸を分離するための方法を提供する。該結合バッファーは、一般には、カオトロピック（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ）剤および界面活性剤を含むが、有機溶媒および還元剤をも含みうる。好ましくは、該結合バッファーは、華氏１２５度より高い引火点を有する。該方法は、核酸が、異なる核酸含有起源（例えば、細菌およびウイルス）から精製されそれが後に検出されうる程度に十分に有効である。
【０００７】
（図面の簡単な記載）
図１および図２は、実施例において得たデータのコンピューター解析を示す。
【０００８】
（発明の詳細な記載）
本発明で提供する方法は、核酸を、試験サンプル中に存在する他の（必ずしも全てではない）成分から分離するために酸化金属担体物質を使用するものである。特に、該酸化金属は、試験サンプル中の他の成分から核酸を精製するために使用する。本発明で教示する酸化金属担体物質の使用は、現在利用可能なサンプル調製方法より優れた幾つかの重要な利点をもたらすことが見出された。例えば、酸化金属は核酸配列に対して高いアフィニティーを有し、したがって、サンプルからサンプルへの汚染が最小限に抑制される。なぜなら、核酸は、望ましくない領域に逃れることなく該酸化金属担体に制御可能に結合しうるからである。また、酸化金属担体は、試験サンプル中の核酸の、より定量的な精製をもたらし、したがって、該試験サンプル中に存在しうる少量の所望の核酸でさえ、集められる。さらに、他のサンプル調製方法に従い一般に使用されるが処分についての重大な懸念を招く有機溶媒（例えば、アルコール、フェノールまたはクロロホルム）を低濃度で含む（または有機溶媒の使用を有意には伴わない）試験サンプルから核酸を分離するために、酸化金属粒子を使用することができる。さらに、増幅反応に完全に適合したバッファーを使用して、核酸を酸化金属担体から溶出することができる。すなわち、該溶出バッファーを増幅反応に適したバッファーと交換することなく、本発明で提供する方法で試験サンプルから分離された核酸を増幅反応において使用することができる。
【０００９】
また、本発明で提供する方法は、ＤＮＡおよび種々の形態のＲＮＡの両方を単一の試験サンプルから分離するために使用することができる。したがって、本発明で提供する方法を用いて、同じ試験サンプル中の種々の異なる細胞および／または生物から核酸を、それが後に検出されうるように分離することができる。
【００１０】
一般には、該方法は、試験サンプルを酸化金属担体物質および結合バッファーと接触させることを含む。結合バッファーの存在下では、試験サンプル中に含有される全てのタイプの核酸、例えばＤＮＡおよび種々の形態のＲＮＡが該酸化金属担体物質に結合する。ついで該酸化金属担体物質およびそれに結合したいずれかの核酸が、該試験サンプルから分離されうる。所望により、該担体物質およびいずれかの結合核酸を、溶出バッファーを使用して、該核酸を溶出する前に洗浄することができる。ついで、溶出したいずれかの核酸を、よく知られた種々の検出技術のいずれかを用いて検出することができる。
【００１１】
本発明で用いる「試験サンプル」なる語は、核酸を含有すると疑われるいずれかのものを意味する。該試験サンプルは、例えば血液、眼レンズ液、脳脊髄液、乳、腹水液、滑液、腹膜液、羊水、組織、発酵ブロス、細胞培養、増幅反応の産物、核酸合成産物などを含む生物学的起源のような任意の起源であることが可能であり、あるいはそれらに由来するものであることが可能である。また、試験サンプルは、例えば、下水または布を含む環境的または法的起源からのものでありうる。該試験サンプルは、該起源から得られたままの状態で直接的に、あるいは該サンプルの特性を修飾するための前処理の後に使用することができる。したがって、該試験サンプルは、使用前に、例えば血液からの血漿の調製、生物学的流体からの細胞の単離、組織のホモジネーション、細胞またはウイルス粒子の破壊、固体物質からの液体の調製、粘性流体の希釈、液体の濾過、液体の蒸留、液体の濃縮、阻害成分の不活性化、試薬の添加、核酸の精製などにより前処理することができる。
【００１２】
本発明で用いる「酸化金属担体物質」は、金属元素の酸化物および水酸化物（その種々の原子価状態のいずれかのもの）を意味する。したがって、例えば、アルミニウム、マグネシウム、チタン、ジルコニウム、鉄、ケイ素、ニッケル、クロム、亜鉛および前記の組合せの酸化物は酸化金属担体物質である。酸化鉄は、好ましい酸化金属担体物質である。したがって、酸化第一鉄（Ｆｅ３Ｏ４）および酸化第二鉄（Ｆｅ２Ｏ３）は、好ましい酸化金属担体物質である。酸化金属担体物質は、例えば、プレート、粒子、コーティング、繊維、多孔性構造体（例えば、フィルター）のような任意の形態でありうる。粒子は、その大きな表面積のため、該酸化金属担体物質の好ましい形態である。
【００１３】
「結合バッファー」は、試験サンプル中に存在する核酸の、酸化金属担体物質に対する結合を促進する。核酸は、多種多様なバッファー中、該バッファーのｐＨとは無関係に、酸化金属担体物質に結合することが判明している。したがって、該結合バッファーは、酸性ｐＨ（７未満）、中性ｐＨ（７に等しい）または塩基性ｐＨ（７より大きい）を有しうる。結合バッファーは、一般には緩衝系を含む。緩衝系は良く知られており、当業者により選択される。緩衝系は、典型的には、弱酸およびその対応塩基（例えば、リン酸ナトリウムおよびリン酸）の水溶液である。結合バッファーは、好ましくは３〜１２、より好ましくは３〜１１、最も好ましくは４〜１０のｐＨを有する。該結合バッファーはまた、当業者に良く知られた界面活性剤、例えば非イオン性界面活性剤、イオン性界面活性剤、両性イオン界面活性剤を、１％〜２５％、好ましくは５％〜２０％の総濃度で含有しうる。
【００１４】
核酸を、例えば、核酸を含有する細胞またはウイルス粒子から直接的に精製する場合には、該結合バッファーは、好ましくは更に、２Ｍ〜１０Ｍ、好ましくは３Ｍ〜６Ｍの濃度のカオトロピック剤を含む。カオトロピック剤は当技術分野で良く知られており、タンパク質を分解または可溶化する物質を含む。代表的なカオトロピック試薬には、グアニジンイソチオシアナート（ＧＩＴＣ）、グアニジンＨＣｌ、ヨウ化カリウム、尿素などが含まれるが、これらに限定されるものではない。また、還元剤、例えばメルカプトエタノール、ジチオトレイトールおよび２−メルカプトエタンスルホン酸を、２５ｍＭ〜１５０ｍＭ、好ましくは５０ｍＭ〜１００ｍＭの濃度で該結合バッファーに加えることができる。
【００１５】
必ずしも必要ではないが、該結合バッファーはまた、華氏１２５°より高い引火点を有する結合バッファーを与えない濃度のアルコールまたは他の有機溶媒を含みうる。該バッファーの引火点は、液体の引火点を測定するための良く知られた方法のいずれかを用いて測定することができる。一般には、１５％未満の濃度で使用する有機溶媒は、華氏１２５°より高い引火点を有する結合バッファーを与える。該結合バッファーに溶媒を加える場合には、低級アルコール、例えばメタノール、エタノール、プロパノールおよびイソプロパノールが、好ましいアルコールである。
【００１６】
前記のとおり、該結合バッファーの存在下では、該試験サンプル中の核酸は該担体物質に結合する。該核酸と担体物質との複合体が形成したら、該担体物質を該結合バッファーおよび残りの試験サンプルから分離することができる。該担体物質の形態に応じて、分離方法が当業者により選択される。例えば、該担体物質が粒子形態である場合には、該担体物質は、例えば、沈降することが可能であり、残りの液体物質を、吸引により又は該担体物質から該液体を単に排出させることにより、該担体から除去することができる。本発明の担体物質の組成を考慮すると、粒子状担体物質の沈降または単離を促進させるために磁界を用いることが好ましい。
【００１７】
所望により、該担体物質と複合体形成した核酸配列を、該担体物質から該核酸を解離しない任意のバッファーで洗浄することができる。典型的には、該担体物質およびそれと複合体形成した任意の核酸を、残留する及び望ましくない任意の試験サンプル成分から取り出すために、洗浄バッファーを使用する。そのような洗浄バッファーは当技術分野において良く知られており、典型的には、既に挙げられているような界面活性剤の同様の濃度の溶液を含有する。そのような界面活性剤は、典型的には、同様に前記で示した緩衝系中に希釈される。
【００１８】
該担体物質と複合体形成した核酸は、洗浄されたか否かにかかわらず、水または溶出バッファーを使用して、該酸化金属担体物質から取り出したり又は解離させることができる。本発明の「溶出バッファー」は、該酸化金属担体物質から結合核酸を分離する任意の試薬または任意の試薬の組合せでありうる。好ましくは、そのような試薬は、該核酸に使用する検出系に適したものであり、特に、核酸増幅系において使用する試薬に適したものである。水（これは蒸留、脱イオン化または精製されうる）は、本発明の目的のための溶出バッファーとして役立ちうる。リン酸塩（ホスファート）またはビシンを含有する溶出バッファー（典型的には、前記の緩衝系を含む）はまた、適当な溶出バッファーであることが判明しており、他のバッファーは、当技術分野の通常の技術（例えば、酸化金属−核酸複合体をバッファーと接触させ、分離が生じたか否かを判定すること（後記で例示する））を用いて実験的に容易に見出されうる。該溶出バッファーは、１０ｍＭ〜３００ｍＭ、好ましくは１０ｍＭ〜１００ｍＭの濃度の、少なくとも１つのホスファート官能性を含有する有機化合物であるリン酸ナトリウムまたは有機ホスファート化合物の添加を介して無機または有機ホスファートを含有しうる。Ｏ−ホスホセリン、ホスホエタノールアミン、カルバミルホスファート、ホスホクレアチン、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）およびリンタングステン酸は、有機ホスファート化合物の典型例である。溶出バッファーのための適当なｐＨは、６〜１０、好ましくは７〜９でありうる。
【００１９】
ついで、精製された核酸を、当技術分野で良く知られたアッセイを用いて検出することができる。例えば、検出の前に増幅工程を行い又は行うことなく、サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイを用いることができる。例えばＴＭＡ、ＱＢ−レプリカーゼ、ＮＡＳＢＡ、ＳＤＡ、ＬＣＲおよびＰＣＲのような良く知られた増幅反応は、本発明に従い精製された核酸を増幅するために用いることができる増幅反応の具体例である。
【００２０】
前記増幅反応は、典型的には、広く知られた増幅試薬を使用する。本発明で用いる「増幅反応試薬」なる語は、核酸増幅反応に使用されることが良く知られた試薬を意味し、プライマー、プローブ、単一または複数の試薬、酵素、または逆転写、ポリメラーゼおよび／またはリガーゼ活性を別々に又は個々に有する酵素；酵素補因子、例えばマグネシウムまたはマンガン；塩；ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）；およびデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、例えばデオキシアデノシン三リン酸、デオキシグアノシン三リン酸、デオキシシトジン三リン酸およびチミジン三リン酸を含みうる（それらに限定されるものではない）。使用する厳密な増幅試薬は、概ね、使用する個々の増幅反応に基づき当業者により選択される。
【００２１】
前記のとおりに精製した核酸の増幅は、該酸化金属担体物質から該核酸を解離させるために使用する溶出バッファー中で行うことができる。特に、増幅試薬を該溶出バッファー中の核酸と組合せ、該核酸の増幅を直接的に行うことができる。
【００２２】
本発明は更に、本発明の核酸を単離するための適当にパッケージングされた試薬を含むキットを提供する。該キットは、酸化金属担体物質、結合バッファー（前記のとおり）および溶出バッファー（前記のとおり）を含みうる。該キットはまた、単離された核酸を個々のアッセイにおいて使用するための他の適当にパッケージングされた試薬および物質を含有しうる。例えば、該キットは更に、核酸増幅プライマーおよび／または核酸プローブ、バッファー、ヌクレオチド、酵素、コンジュゲートなどを含みうる。
【００２３】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を例示するものであり、特許請求の範囲および明細書を何ら限定するものではない。
【００２４】
（実施例）
実施例１
酸化金属担体物質を使用する放射能標識ＲＮＡの結合および溶出
本実施例では、放射能標識されたＲＮＡを種々の酸化金属担体物質に結合させ、洗浄し、ついで該担体物質から溶出した。結合ＲＮＡの量および該洗浄中に失われたＲＮＡの量、そして最終的には、溶出したＲＮＡの量を測定するための方法の経過の全体にわたり、計数／分（ＣＰＭ）をモニターした。
【００２５】
本実施例で使用する放射能標識ＲＮＡは、Ｒｉｂｏｐｒｏｂｅ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ転写系およびｐＧＥＭＥＸ−１陽性対照鋳型（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのもの）を使用して調製した。該結合および溶出実験においては、約８，０００，０００ ＣＰＭの該放射能標識プローブを、６ｍｌのグアニジンイソチオシアナート−界面活性剤溶液（６Ｍ ＧＩＴＣ，１０％ Ｔｗｅｅｎ−２０，１６ｍＭ セチルトリメチルアンモニウムブロミド，１００ｍＭ 酢酸ナトリウム，１００ｍＭ ジチオトレイトール，ｐＨ４．２，７．５％ エタノール）中の５ｍｇのＦｅ３Ｏ４またはＦｅ２Ｏ３酸化金属粒子（ＩＳＫ Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ；Ｖａｌｐａｒａｉｓｏ，ＩＮから入手される）の懸濁液に加えた。該ＲＮＡをそれぞれの粒子懸濁液に加えた後、該懸濁液を手短にボルテックスし、３７℃で３０分間インキュベートした。
【００２６】
該インキュベーションの後、該酸化金属粒子をそれぞれのミクロフュージチューブの表面に磁石で引き付け、該上清をピペットで吸引した。該上清のＣＰＭを測定した。それを、後記表１に「未結合」ＲＮＡとして示す。
【００２７】
ついで、前記のとおりに該粒子を該ミクロフュージチューブの表面に引き付け、該洗浄溶液を該ミクロフュージチューブから吸引する前に、０．５ｍｌの洗浄溶液を加え、新たに生成した懸濁液をボルテックスすることにより、該粒子を洗浄した。該粒子をグアニジニウムイソチオシアナート−界面活性剤溶液（２Ｍ ＧＩＴＣ，５％ Ｔｗｅｅｎ−２０，５０ｍＭ ＫＯＡｃ，ｐＨ６）で２回洗浄し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー，ｐＨ８．０で２回洗浄した。該洗液をプールし、該粒子から除去された標識の量を測定した。それを表１に「洗液」として示す。
【００２８】
該洗浄溶液を吸引した後、２００μｌの溶出バッファーを、該洗浄粒子を含有するチューブに加えた。該溶出バッファーは、１００ｍＭ ｏ−ホスホセリン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）および３００ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基の溶液（８．０の最終ｐＨを有する）であった。該溶出バッファーを加えた後、新たに生成した粒子懸濁液を手短にボルテックスし、該懸濁液を７０℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、該粒子を、磁気ラック（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒａｃｋ）を使用して該チューブの表面上に捕捉し、溶離液を取り出した。該ＣＰＭを測定した。それを表１に「溶離液１」として示す。新鮮な溶出バッファーを該粒子に加え、該溶出方法を繰返した。該第２溶出のＣＰＭを表１に「溶離液２」として示す。
【００２９】
該粒子を２００μｌの第３アリコートの溶出バッファーに再懸濁させ、溶出バッファーおよび再懸濁粒子を含有するサンプルを使用して、該粒子から遊離されないプローブの量を測定した。これを表１に「結合」として示す。
【００３０】
表１に示す全ての値は、全ＣＰＭに対する割合（％）として表されている。
【００３１】
【表１】
【００３２】
表１のデータにより示されるとおり、該酸化第二鉄および酸化第一鉄粒子はＲＮＡに結合し、該ＲＮＡは該リン酸バッファーでそれぞれの粒子から溶出した。
【００３３】
実施例２
種々のリン酸濃度を用いるＦｅ ３ Ｏ ４ からのＲＮＡの溶出
本実施例では、実施例１のとおりに調製した放射能標識ＲＮＡをＦｅ２Ｏ３磁気粒子に結合させ、洗浄し、種々の濃度のリン酸ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）バッファーで溶出した。該溶出バッファー濃度は１０〜５０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ９）の範囲であった。約２３，０００，０００ ＣＰＭの該放射能標識核酸を３０ｍｌのグアニジンイソチオシアナート−界面活性剤溶液（４Ｍ ＧＩＴＣ，１０％ Ｔｗｅｅｎ−２０，１６ｍＭ セチルトリメチルアンモニウムブロミド，１００ｍＭ ２−メルカプトエタンスルホン酸，１００ｍＭ 酢酸カリウム，ｐＨ６）中の２５ｍｇのＦｅ２Ｏ３酸化金属粒子の懸濁液（水中の１０％ ｗ／ｖ 粒子懸濁液０．２５ｍｌ）に加えた。ついで、５つの１ｍｌサンプルの希釈効果を刺激するために、５ｍｌの水を該懸濁液に加えた。該懸濁液を手短にボルテックスし、それぞれ７ｍｌの５つの等しいアリコートに分割し、該懸濁液の全てを３７℃で２０分間インキュベートした。
【００３４】
該インキュベーション後、該酸化金属粒子をそれぞれのミクロフュージチューブの表面に磁石で引き付け、該上清をピペットで吸引した。未結合プローブの量をガイガー計数管でモニターし、同じ様態でモニターした該粒子に結合した放射能の量と比較して非常に少量の放射能標識核酸を捕捉した。該未結合物質の厳密なＣＰＭは測定しなかった。
【００３５】
ついで、前記のとおりに該ミクロフュージチューブの表面に該粒子を引き付け該洗浄溶液を該ミクロフュージチューブから吸引する前に、０．５ｍｌの洗浄溶液を加え、新たに生成した懸濁液をボルテックスすることにより、該粒子を洗浄した。該粒子を２Ｍ ＧＩＴＣ、５％ Ｔｗｅｅｎ−２０、５０Ｍ ＫＯＡｃ（ｐＨ６）で２回洗浄し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ８．０）で２回洗浄した。該洗浄をガイガー計数管でモニターした。また、該洗浄操作中に遊離された放射能の量は無視しうるものであることが判明した。該サンプルを該溶出バッファーのそれぞれの０．２ｍｌで７３℃で１０分間にわたり溶出した。該溶離液を、該粒子の磁気捕捉後に集め、保存した。該溶出プロトコールを繰返し、該第２溶離液も保存した。また、溶出バッファーの第３アリコートを該粒子に加え、懸濁液中の粒子を使用して、結合プローブの量を測定した。該溶離液および粒子懸濁液のそれぞれの２０μｌ アリコートを５ｍｌのシンチレーション蛍光体と混合し、計数した。表２は、この実験で使用した溶出バッファー中のリン酸ナトリウムの濃度（第１欄）、第１および第２溶出後に回収された全計数に対する割合（％）（第２欄および第３欄）、ならびに両方の溶出後の磁気粒子上に残存する計数に対する割合（％）（「結合」）を示す。
【００３６】
【表２】
【００３７】
表２に示すとおり、種々の濃度のリン酸バッファーが該酸化金属粒子から該ＲＮＡを溶出した。
【００３８】
実施例３
有機ホスファート溶出バッファーの使用
本実施例では、種々の有機ホスファートバッファーを、それらが酸化金属担体物質から核酸を溶出する能力に関して、無機ホスファートバッファーと比較して試験した。該溶出バッファー中で使用した有機ホスファート化合物の全ては、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．から入手した。表３に示す場合を除き、すべてのバッファーは５０ｍＭで調製し、１Ｍ トリス塩基で６．５〜９の最終ｐＨにｐＨ調節した。前記実施例と同様、該放射能標識ＲＮＡを実施例１のとおりに調製した。約１，０００，０００ ＣＰＭの該放射能標識ＲＮＡを１２ｍｌのグアニジンイソチオシアナート−界面活性剤溶液（６Ｍ ＧＩＴＣ，１０％ Ｔｗｅｅｎ−２０，１６ｍＭ セチルトリメチルアンモニウムブロミド，１００ｍＭ 酢酸ナトリウム，１００ｍＭ ジチオトレイトール，ｐＨ４．２，７．５％ エタノール）中の１０ｍｇのＦｅ２Ｏ３酸化金属粒子の懸濁液に加えた。サンプルの添加を刺激するために、２ｍｌの水を該懸濁液に加えた。該懸濁液を手短にボルテックスし、３７℃で２５分間インキュベートした。該粒子を磁気的に集め、該上清を除去した。ガイガー計数管で調べたところ、該上清中でシグナルの有意な喪失は観察されなかった。該粒子を６ｍｌの５０ｍＭ 酢酸カリウム（ｐＨ６．０）に再懸濁させることにより、該粒子を洗浄した。該粒子を磁気的に集め、該洗浄流体を取り出した。ガイガー計数管で調べたところ、該上清中でシグナルの有意な喪失は観察されなかった。該洗浄操作を繰返した。ついで該粒子を６ｍｌの該酢酸カリウム洗浄流体に再懸濁させ、十分に混合し、０．５ｍｌ アリコートを１０個の別々の１．５ｍｌ ミクロフージチューブ内に分注した。該チューブを磁気ラックに移し、該粒子を該チューブの表面に集め、該洗浄流体を除去した。ついで１００μｌの種々の溶出バッファーを該微粒子に加え、７０℃で１０分間インキュベートした。ついで５０μｌの該溶出サンプルをシンチレーション計数管中で計数して、遊離したプローブの量を測定した。出発物質（核酸）のおよその全計数は４０，０００ ＣＰＭ／サンプルであった。表３は、この実験の結果を示し、該溶出バッファーおよびその溶出バッファーで遊離した計数を示す。
【００３９】
【表３】
【００４０】
表３に示すとおり、有機ホスファートバッファーは、酸化金属担体物質から結合核酸を溶出するための適当なバッファーである。
【００４１】
実施例４
血漿中のＨＩＶビリオンからのＲＮＡの抽出
本実施例では、前記の酸化金属粒子を使用して、種々のレベルのＨＩＶビリオンを含有する４つの試験パネルの血漿から、ＨＩＶ核酸を抽出した。陰性血漿を陰性対照として使用した。また、商業的に入手可能なＱｉａｇｅｎウイルス核酸抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．；Ｖａｌｅｎｃｉａ ＣＡ）を使用して、該血漿サンプルからの核酸を抽出した。Ａｂｂｏｔｔ ＬＣｘ（登録商標）Ｑｕａｎｔｉｔｉａｔｉｖｅ ＨＩＶアッセイ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬから入手可能）を用いて、該サンプル中のＨＩＶ核酸を分析した。
【００４２】
それぞれのサンプル調製方法は、それらの４つの試験パネルおよび該陰性対照のそれぞれからの１ｍｌの血漿サンプルに対して行った。Ｑｉａｇｅｎ法を、該製造業者の説明に従い、該パネルに対して行い、Ａｂｂｏｔｔ ＬＣｘ（登録商標）ＨＩＶアッセイを用いて該サンプルを定量した。試験パネル１〜４は、それぞれ、２８ビリオン／ｍｌ、１１０ビリオン／ｍｌ、８００ビリオン／ｍｌおよび１０，０００ビリオン／ｍｌを含有していた。１ｍｌの試験血漿サンプルを６ｍｌの結合バッファー（５Ｍ グアニジニウムイソチオシアナート，１０％ Ｔｗｅｅｎ−２０，１６ｍＭ セチルトリメチルアンモニウムブロミド，１００ｍＭ ジチオトレイトール，１００ｍＭ 酢酸Ｎａ，ｐＨ４．１）および５ｍｇのＦｅ２Ｏ３粒子と混合することにより、該酸化金属法を行った。該ライセートを３７℃で２０分間インキュベートした。ついで、前記のとおりに該粒子を該ミクロフュージチューブの表面に引き付け該洗浄溶液を該ミクロフュージチューブから吸引する前に、０．５ｍｌの洗浄溶液を加え、新たに生成した懸濁液をボルテックスすることにより、該粒子を洗浄した。該粒子を２Ｍ ＧＩＴＣ、５％ Ｔｗｅｅｎ−２０、５０ｍＭ ＫＯＡｃ（ｐＨ６）で２回洗浄し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ８．０）で２回洗浄した。該洗浄溶液を吸引した後、２００μｌの溶出バッファーを、該洗浄粒子を含有するチューブに加えた。該溶出バッファーは、５０ｍＭ ｏ−ホスホセリンおよび１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基の溶液（８．０の最終ｐＨを有する）であった。該溶出バッファーを加えた後、新たに生成した粒子懸濁液を手短にボルテックスし、該懸濁液を７０℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、該粒子を、磁気ラック（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒａｃｋ）を使用して該チューブの表面上に捕捉し、該溶離液を取り出した。ついで、それぞれのサンプル調製方法に従い回収された５０μｌの該溶液を増幅および検出に付した。
【００４３】
それぞれのサンプル調製方法から５０μｌ アリコートを逆転写し、ＰＣＲを用いて増幅した。１×ＥＺバッファー、２．５ｍＭ 塩化マンガン、それぞれ０．１５ｍＭの最終濃度で存在するｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰ）および５単位／反応の濃度の組換えテルムス・テルモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ポリメラーゼを使用して、ＲＴ−ＰＣＲを行った。該標識プライマーは４０ｎＭの濃度で使用し、該未標識プライマー濃度は４０ｎＭの濃度で使用した。該プローブ（これは、前記のとおりに標識されており、最終的には、生じたハイブリッド複合体の検出の前に該標識プライマーの産物とハイブリダイズする）は、１０ｎＭの濃度で使用した。
【００４４】
反応混合物を逆転写し、増幅した。これはＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ４８０ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ中で行った。反応混合物を、まず、該ＲＮＡを逆転写するために６２℃で３０分間、ついで９４℃で２分間インキュベートした。ついで、増幅の初期段階における該反応のストリンジェンシーを促進するために、タッチダウン（ｔｏｕｃｈｄｏｗｎ）またはステップ・ダウン（ｓｔｅｐ−ｄｏｗｎ）プロトコールによりＰＣＲ増幅を開始した。これは、以下のとおりの８サイクルを用いるものであった：９４℃で３０秒間およびそれに続く７０℃で８０秒間の１サイクル、ついで９４℃で３０秒間およびそれに続く６９℃で８０秒間の１サイクル、ついで９４℃で３０秒間およびそれに続く６８℃で８０秒間の１サイクル、ついで９４℃で３０秒間およびそれに続く６７℃で８０秒間の１サイクル、ついで９４℃で３０秒間およびそれに続く６６℃で８０秒間の１サイクル、ついで９４℃で３０秒間およびそれに続く６５℃で８０秒間の１サイクル、ついで９４℃で３０秒間およびそれに続く６４℃で８０秒間の１サイクル、ついで９４℃で３０秒間およびそれに続く６３℃で８０秒間の１サイクル。ついで、９４℃で３０秒間およびそれに続く６２℃で８０秒間の３５サイクルで、更なる増幅を行った。該反応混合物をサーマル（熱的）サイクルに付した後、すべての複製体をプールし、サイクリングによるばらつきの排除のためにピペッティングにより混合した。ついで該混合物を分割し、９７℃で５分間変性させた。この後、温度を１５℃に５分間低下させることにより、プローブオリゴハイブリダイゼーションを行った。ついで該温度を４℃に低下させ、該反応産物が検出されるまでサンプルを４℃に維持した。
【００４５】
それらの４つの試験パネルおよび陰性対照に関して得られた結果を、後記表４にコピー／ｍｌとして示す。
【００４６】
【表４】
【００４７】
表４からの結果において示されるとおり、該酸化金属サンプル調製方法は、増幅および検出に十分な量で核酸を血漿から成功裏のうちに抽出した。
【００４８】
実施例５
血漿中のＨＩＶおよびＨＢＶビリオンからの核酸の抽出
本実施例では、前記の酸化金属粒子を使用して、ＨＩＶビリオンおよびＨＢＶビリオンの両方をそれぞれ１０００ビリオン／ｍｌの濃度で含有する１ｍｌの血漿から、ＨＩＶ核酸（ＲＮＡ）およびＨＢＶ核酸（ＤＮＡ）を抽出した。陰性血漿を陰性対照として使用した。該細胞溶解条件は、ＧＩＴＣ（３．３３〜４．６６Ｍ）、ＤＴＴ（０〜１００ｍＭ）、Ｔｗｅｅｎ−２０（１３．３〜２４％）およびＣＴＡＢ（０〜２４ｍＭ）の濃度ならびにｐＨ（４〜１０）ならびに温度（３５℃〜５５℃）の範囲に及ぶよう、様々に変化させた。４５個の異なる組合せの試薬および条件を該細胞溶解工程において使用し、３ｍｌの細胞溶解バッファーで全てのサンプルを抽出した。各抽出において５ｍｇのＦｅ２Ｏ３粒子を使用した。各条件は少なくとも３回使用し、中心（ｃｅｎｔｅｒｐｏｉｎｔ）条件は３０回使用した。該粒子を２Ｍ ＧＩＴＣ、５％ Ｔｗｅｅｎ−２０、５０Ｍ ＫＯＡｃ（ｐＨ６）で２回洗浄し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ８．０）で２回洗浄した。該洗浄溶液を吸引した後、２００μｌの溶出バッファーを、該洗浄粒子を含有するチューブに加えた。該溶出バッファーは、５０ｍＭ ｏ−ホスホセリンおよび１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基の溶液（８．０の最終ｐＨを有する）であった。該溶出バッファーを加えた後、新たに生成した粒子懸濁液を手短にボルテックスし、該懸濁液を７０℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、該粒子を、磁気ラック（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒａｃｋ）を使用して該チューブの表面上に捕捉し、該溶離液を取り出した。ついで、それぞれのサンプル調製方法に従い回収された溶液５０μｌを増幅および検出に付した。該溶出物質を分割し、ＰＣＲに基づく２つのアッセイ（１つはＨＩＶおよび１つはＨＢＶ）を用いて分析した。該アッセイは「ビーコン」アッセイであり、ハイブリダイゼーションプローブ（これは、増幅された標的物質への該プローブの結合に際して蛍光の増加を示す）を用いる。
【００４９】
該ＨＩＶアッセイのためには、それぞれのサンプル調製方法から５０μｌ アリコートを逆転写し、ＰＣＲを用いて増幅した。１×ＥＺバッファー、３ｍＭ 塩化マンガン、それぞれ０．１００ｍＭの最終濃度で存在するｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰ）および１４．４単位／反応の濃度の組換えテルムス・テルモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ポリメラーゼを使用して、ＲＴ−ＰＣＲを行った。フォワードプライマー（配列番号１）は１８８ｎＭの濃度で使用し、リバースプライマー（配列番号２）は４６９ｎＭの濃度で使用した。該ＨＩＶビーコンプローブ（配列番号３）は１００ｎＭの濃度で使用した。反応混合物を逆転写し、増幅した。これは、９６ウェル増幅トレイを使用してＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ９７００ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ中で行った。反応混合物を、まず、該ＲＮＡを逆転写するために５９℃で３０分間インキュベートした。ついで９２℃で１５秒間およびそれに続く５９℃で３０秒間およびそれに続く７２℃で１５秒間の５サイクルでＰＣＲ増幅を行った。この後、９２℃で４秒間およびそれに続く６４℃で８秒間およびそれに続く７２℃で４秒間の５５サイクルを行った。ついで該反応を９２℃に３０秒間加熱し、ついで４５℃で１５分間維持し、ついで２５℃に低下させた。Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒ Ｓｅｒｉｅｓ ４０００プレートリーダー中で該プレートを読み取ることにより、シグナルの量を測定した。
【００５０】
該ＨＢＶアッセイのためには、それぞれのサンプル調製方法から５０μｌ アリコートを、ＰＣＲを用いて増幅した。１×ＰＣＲバッファー、３．５ｍＭ 塩化マグネシウム、それぞれ０．１００ｍＭの最終濃度で存在するｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰ）および７単位／反応の濃度のＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄを使用して、ＲＴ−ＰＣＲを行った。フォワードプライマー（配列番号４）は２００ｎＭの濃度で使用し、リバースプライマー（配列番号５）は３００ｎＭの濃度で使用した。該ＨＢＶビーコンプローブ（配列番号６）は５０ｎＭの濃度で使用した。反応混合物を、９６ウェル増幅トレイを使用してＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ９７００ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ中で増幅した。反応混合物を、まず、該酵素を活性化するために９４℃で１０分間インキュベートした。ついで９４℃で６０秒間およびそれに続く５８℃で３０秒間の４５サイクルでＰＣＲ増幅を行った。ついで該反応を５８℃で１０分間維持し、該温度を９４℃に５分間上昇させ、ついで５５℃で１５分間維持し、ついで２５℃に低下させた。Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒ Ｓｅｒｉｅｓ ４０００プレートリーダー中で該プレートを読み取ることにより、シグナルの量を測定した。
【００５１】
該研究において種々のサンプルから生じたシグナルを、該ＨＩＶサンプルに関しては表５に、該ＨＢＶサンプルに関しては表６に示す。これらの表は、該サンプルに用いた細胞溶解条件、該サンプルで加工された内部対照（ｉｎｔ Ｃｔｒｌ）から生じたシグナル、および該サンプルからのＨＩＶまたはＨＢＶシグナルを示す。陰性（Ｎｅｇ）サンプルからのシグナルに対する陽性（Ｐｏｓ）サンプルからのシグナルの比率をプロットし、ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．からのＪＭＰソフトウェアを使用して解析した。該ＨＩＶ抽出物および該ＨＢＶ抽出物の両方からの結果（それぞれ図１および２）は、ＨＩＶおよびＨＢＶの両方に関する方法において、広範囲の条件を使用することが可能であること、および多数の条件がＨＩＶおよびＨＢＶの両方に関する同時抽出を可能にすることを示している。
【００５２】
【表５】
【００５３】
【表６】
【００５４】
実施例６
尿中のクラミジア・トラコマチスおよびナイセリア・ゴノレエからの核酸の抽出
本実施例では、前記の酸化金属方法を用いて、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）およびナイセリア・ゴノレエ（Ｎｅｉｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）の両方を含有する１ｍｌの尿から核酸を抽出した。また、ＬＣｘ（登録商標）Ｕｒｉｎｅ Ｓｐｅｃｉｍｅｎ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して、該尿サンプルからの核酸を抽出した。Ａｂｂｏｔｔ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからのＬＣｘ（登録商標）を使用して、該抽出サンプルをクラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）およびナイセリア・ゴノレエ（Ｎｅｉｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）の両方に関して試験した。
【００５５】
クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）およびナイセリア・ゴノレエ（Ｎｅｉｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）の両方に関して陰性であると試験判定されたプールされた尿を使用して、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからの（登録商標）アッセイを使用して該サンプルパネルを作製した。クラミジア・トラコマチス（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）およびナイセリア・ゴノレエ（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）の陽性ストックを該陰性尿に加えることにより、陽性尿パネルを作製した。「低陽性」パネルは、尿１ｍｌ当たり０．５基本小体（ＥＢ）のクラミジア・トラコマチス（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）および０．５コロニー形成単位（ｃｆｕ）のナイセリア・ゴノレエ（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）を含有していた。「高陽性」パネルは、尿１ｍｌ当たり１０ ＥＢのクラミジア・トラコマチス（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）および１０ ｃｆｕのナイセリア・ゴノレエ（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）を含有していた。
【００５６】
それぞれのサンプル調製方法は、それらの２つの試験パネルおよび該陰性対照のそれぞれからの１ｍｌの尿サンプルに対して行った。１ｍｌの試験尿サンプルを３ｍｌの細胞溶解バッファー（４．３Ｍ グアニジニウムイソチオシアナート，１８％ Ｔｗｅｅｎ−２０，１２ｍＭ セチルトリメチルアンモニウムブロミド，５０ｍＭ ジチオトレイトール，１００ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．６）および５ｍｇのＦｅ２Ｏ３粒子（Ｍ−２０３８，ＩＳＫ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）と混合することにより、該酸化金属法を行った。該抽出混合物はまた、７．５μｇのポリＡ ＲＮアーゼを担体として含有していた。該ライセートを４５℃で２０分間インキュベートした。該粒子を磁気的に捕捉し、該ライセートを吸引により除去した。該粒子を２Ｍ ＧＩＴＣ、５％ ｔｗｅｅｎ−２０、５０ｍＭ 酢酸Ｋ（ｐＨ６）で２回洗浄し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ８．０）、０．４５％ アジ化Ｎａで２回洗浄した。該洗浄溶液を吸引した後、１００μｌの溶出バッファーを、該洗浄粒子を含有するチューブに加えた。該溶出バッファーは、保存剤として０．０４５％ アジ化Ｎａを含有する水であった。該溶出バッファーを加えた後、該粒子をピペッティングにより再懸濁させ、該懸濁液を７０℃で２０分間インキュベートした。インキュベーション後、該粒子を、磁気ラック（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒａｃｋ）を使用して該チューブの表面上に捕捉し、該溶離液を取り出した。ついで、該サンプルから回収された１００μｌを９００μｌのＬＣｘ（登録商標）Ｕｒｉｎｅ Ｓｐｅｃｉｍｅｎ Ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ ＭｇＣｌ２および界面活性剤）で希釈した。該アッセイにおいて必要なＭｇＣｌ２を加えるためには、該抽出サンプルに該再懸濁バッファーを加えなければならない。ついで５０μｌの該サンプルを、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからのクラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）およびナイセリア・ゴノレエ（Ｎｅｉｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）ＬＣｘ（登録商標）アッセイにおいて使用した。
【００５７】
また、ＬＣｘ（登録商標）Ｕｒｉｎｅ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して、該サンプルを調製した。１ｍｌの尿サンプルを９，０００×ｇで１５分間にわたり遠心分離し、該上清を除去した。９００μｌのＬＣｘ（登録商標）Ｕｒｉｎｅ Ｓｐｅｃｉｍｅｎ Ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを該ペレットに加え、該サンプルをボルテックスして該サンプルを再懸濁させた。ついで該サンプルを９７℃で１５分間加熱して、該ＤＮＡを遊離させた。冷却後、該酸化金属法に使用した１００μｌの該溶出バッファー（水および０．０４５％ アジ化Ｎａ）を該抽出サンプルに加えて、該酸化金属抽出サンプルに対する成分の濃度を平衡化した。ついで５０μｌの該サンプルを、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからのクラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）およびナイセリア・ゴノレエ（Ｎｅｉｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）（登録商標）アッセイにおいて使用した。また、陰性および陽性対照を該アッセイにおいて使用した。クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）アッセイに関する結果は、０ 比率（ｒａｔｅ）シグナルを有する陰性対照、および１６００の比率シグナルを有する陽性対照を含んでいた。クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）アッセイに関する残りの結果を表７に示す。ナイセリア・ゴノレエ（Ｎｅｉｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）アッセイに関する結果は、０の比率シグナルを有する陰性対照、および９５０の比率シグナルを有する陽性対照を含んでいた。ナイセリア・ゴノレエ（Ｎｅｉｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）アッセイに関する残りの結果を表８に示す。両方の細胞型に関するＬＣｘ（登録商標）アッセイのための標準的抽出方法および該酸化金属法を行った。
【００５８】
【表７】
【００５９】
【表８】
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
実施例において得たデータのコンピューター解析を示す。
【図１Ｂ】
実施例において得たデータのコンピューター解析を示す。
【図１Ｃ】
実施例において得たデータのコンピューター解析を示す。
【図１Ｄ】
実施例において得たデータのコンピューター解析を示す。
【図１Ｅ】
実施例において得たデータのコンピューター解析を示す。
【図１Ｆ】
実施例において得たデータのコンピューター解析を示す。
【図２Ａ】
実施例において得たデータのコンピューター解析を示す。
【図２Ｂ】
実施例において得たデータのコンピューター解析を示す。
【図２Ｃ】
実施例において得たデータのコンピューター解析を示す。
【図２Ｄ】
実施例において得たデータのコンピューター解析を示す。
【図２Ｅ】
実施例において得たデータのコンピューター解析を示す。
【図２Ｆ】
実施例において得たデータのコンピューター解析を示す。
（発明の分野）
本発明は、核酸を単離するための方法およびキット、より詳しくは、有意な濃度の可燃性成分を使用しない、核酸を単離するための方法およびキットに関する。
【０００２】
（発明の背景）
種々の起源から核酸を単離するための幾つかの方法が良く知られている。初期の方法は、タンパク質を選択的に沈殿させ次いでそれを核酸含有溶液から除去するためにフェノールおよび／またはクロロホルムのような有機溶媒を使用するものであった。タンパク質を除去したら、ついで溶存核酸を、アルコールを使用して沈殿させ、固体表面上に集めることが可能であった。ついで、該核酸を可溶化してそれを該固体表面から取り出すために、適当なバッファーを使用するものであった。
【０００３】
前記のとおり、核酸配列を精製するための初期方法は、典型的には、起源材料中に存在するタンパク質または他の望ましくない物質から核酸配列を分別的に沈殿させるために有機溶媒を使用するものであった。核酸は、一旦沈殿すると、ガラス攪拌棒のような基体である固体上に容易に集められ、ついでそれは、精製された状態で可溶化される。また、核酸を精製するために、カオトロピック（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ）剤の存在下で固体基体に対して核酸が示すアフィニティーも利用されている。カオトロピック剤の使用も含めたこれらのサンプル精製方法は、典型的には、該核酸が該固体基体に結合すること又は洗浄操作中に該基体に結合したままであることを確認するために、アルコールのような有機溶媒を使用するものである。そのような方法では、初期の核酸単離方法（この場合、有機溶媒は、使用する唯一の試薬であった）と比較して比較的低い濃度の有機溶媒を使用するが、それでもなお、これらの方法で用いるアルコール濃度は、大容積のサンプルを加工する場合には特に、処分および安全性についての重大な懸念を招く。
【０００４】
核酸増幅反応、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼチェイン反応（ＬＣＲ）、および多コピーの標的核酸配列を合成するように設計された他の同様の方法の出現に伴い、起源材料（「サンプル調製物」または「サンプル・プレップ」と、様々に称される）からの核酸配列の単離は、益々重要な研究領域となりつつある。核酸配列の単なる精製以外にも幾つかの点を考慮すると、有用なサンプル調製方法の発見は困難なものとなる。例えば、外部核酸によるサンプルからサンプルへの汚染は、十分に立証されている重大な懸念である。また、所望の核酸配列（または「標的核酸配列」）を含有する初期サンプルは、しばしば、非常に低濃度の標的配列および比較的高濃度の外部核酸を含有する。さらに、サンプルの調製は、しばしば、使用され最終的には廃棄されうる試薬に関して厳しく管理された領域内で行われる。さらに、増幅反応に使用する目的で核酸を精製する場合には、増幅反応に一般に使用する酵素を阻害する成分を含まないバッファー中に、該核酸を最終的に存在させることが重要である。したがって、有用なサンプルの調製方法の設計においては、核酸配列の単なる精製以外にも幾つかの点を考慮しなければならない。
【０００５】
このように、最低限の扱いで核酸の定量的単離をもたらし可燃性有機溶媒を必要としないサンプル調製方法が必要とされている。
【０００６】
（発明の概要）
本発明は、試験サンプルを酸化金属担体物質および結合バッファーと接触させて核酸／酸化金属担体物質複合体を形成させ、該複合体を該試験サンプルから分離し、該核酸を該酸化金属担体物質から溶出する工程を含む、試験サンプルから核酸を分離するための方法を提供する。該結合バッファーは、一般には、カオトロピック（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ）剤および界面活性剤を含むが、有機溶媒および還元剤をも含みうる。好ましくは、該結合バッファーは、華氏１２５度より高い引火点を有する。該方法は、核酸が、異なる核酸含有起源（例えば、細菌およびウイルス）から精製されそれが後に検出されうる程度に十分に有効である。
【０００７】
（図面の簡単な記載）
図１および図２は、実施例において得たデータのコンピューター解析を示す。
【０００８】
（発明の詳細な記載）
本発明で提供する方法は、核酸を、試験サンプル中に存在する他の（必ずしも全てではない）成分から分離するために酸化金属担体物質を使用するものである。特に、該酸化金属は、試験サンプル中の他の成分から核酸を精製するために使用する。本発明で教示する酸化金属担体物質の使用は、現在利用可能なサンプル調製方法より優れた幾つかの重要な利点をもたらすことが見出された。例えば、酸化金属は核酸配列に対して高いアフィニティーを有し、したがって、サンプルからサンプルへの汚染が最小限に抑制される。なぜなら、核酸は、望ましくない領域に逃れることなく該酸化金属担体に制御可能に結合しうるからである。また、酸化金属担体は、試験サンプル中の核酸の、より定量的な精製をもたらし、したがって、該試験サンプル中に存在しうる少量の所望の核酸でさえ、集められる。さらに、他のサンプル調製方法に従い一般に使用されるが処分についての重大な懸念を招く有機溶媒（例えば、アルコール、フェノールまたはクロロホルム）を低濃度で含む（または有機溶媒の使用を有意には伴わない）試験サンプルから核酸を分離するために、酸化金属粒子を使用することができる。さらに、増幅反応に完全に適合したバッファーを使用して、核酸を酸化金属担体から溶出することができる。すなわち、該溶出バッファーを増幅反応に適したバッファーと交換することなく、本発明で提供する方法で試験サンプルから分離された核酸を増幅反応において使用することができる。
【０００９】
また、本発明で提供する方法は、ＤＮＡおよび種々の形態のＲＮＡの両方を単一の試験サンプルから分離するために使用することができる。したがって、本発明で提供する方法を用いて、同じ試験サンプル中の種々の異なる細胞および／または生物から核酸を、それが後に検出されうるように分離することができる。
【００１０】
一般には、該方法は、試験サンプルを酸化金属担体物質および結合バッファーと接触させることを含む。結合バッファーの存在下では、試験サンプル中に含有される全てのタイプの核酸、例えばＤＮＡおよび種々の形態のＲＮＡが該酸化金属担体物質に結合する。ついで該酸化金属担体物質およびそれに結合したいずれかの核酸が、該試験サンプルから分離されうる。所望により、該担体物質およびいずれかの結合核酸を、溶出バッファーを使用して、該核酸を溶出する前に洗浄することができる。ついで、溶出したいずれかの核酸を、よく知られた種々の検出技術のいずれかを用いて検出することができる。
【００１１】
本発明で用いる「試験サンプル」なる語は、核酸を含有すると疑われるいずれかのものを意味する。該試験サンプルは、例えば血液、眼レンズ液、脳脊髄液、乳、腹水液、滑液、腹膜液、羊水、組織、発酵ブロス、細胞培養、増幅反応の産物、核酸合成産物などを含む生物学的起源のような任意の起源であることが可能であり、あるいはそれらに由来するものであることが可能である。また、試験サンプルは、例えば、下水または布を含む環境的または法的起源からのものでありうる。該試験サンプルは、該起源から得られたままの状態で直接的に、あるいは該サンプルの特性を修飾するための前処理の後に使用することができる。したがって、該試験サンプルは、使用前に、例えば血液からの血漿の調製、生物学的流体からの細胞の単離、組織のホモジネーション、細胞またはウイルス粒子の破壊、固体物質からの液体の調製、粘性流体の希釈、液体の濾過、液体の蒸留、液体の濃縮、阻害成分の不活性化、試薬の添加、核酸の精製などにより前処理することができる。
【００１２】
本発明で用いる「酸化金属担体物質」は、金属元素の酸化物および水酸化物（その種々の原子価状態のいずれかのもの）を意味する。したがって、例えば、アルミニウム、マグネシウム、チタン、ジルコニウム、鉄、ケイ素、ニッケル、クロム、亜鉛および前記の組合せの酸化物は酸化金属担体物質である。酸化鉄は、好ましい酸化金属担体物質である。したがって、酸化第一鉄（Ｆｅ３Ｏ４）および酸化第二鉄（Ｆｅ２Ｏ３）は、好ましい酸化金属担体物質である。酸化金属担体物質は、例えば、プレート、粒子、コーティング、繊維、多孔性構造体（例えば、フィルター）のような任意の形態でありうる。粒子は、その大きな表面積のため、該酸化金属担体物質の好ましい形態である。
【００１３】
「結合バッファー」は、試験サンプル中に存在する核酸の、酸化金属担体物質に対する結合を促進する。核酸は、多種多様なバッファー中、該バッファーのｐＨとは無関係に、酸化金属担体物質に結合することが判明している。したがって、該結合バッファーは、酸性ｐＨ（７未満）、中性ｐＨ（７に等しい）または塩基性ｐＨ（７より大きい）を有しうる。結合バッファーは、一般には緩衝系を含む。緩衝系は良く知られており、当業者により選択される。緩衝系は、典型的には、弱酸およびその対応塩基（例えば、リン酸ナトリウムおよびリン酸）の水溶液である。結合バッファーは、好ましくは３〜１２、より好ましくは３〜１１、最も好ましくは４〜１０のｐＨを有する。該結合バッファーはまた、当業者に良く知られた界面活性剤、例えば非イオン性界面活性剤、イオン性界面活性剤、両性イオン界面活性剤を、１％〜２５％、好ましくは５％〜２０％の総濃度で含有しうる。
【００１４】
核酸を、例えば、核酸を含有する細胞またはウイルス粒子から直接的に精製する場合には、該結合バッファーは、好ましくは更に、２Ｍ〜１０Ｍ、好ましくは３Ｍ〜６Ｍの濃度のカオトロピック剤を含む。カオトロピック剤は当技術分野で良く知られており、タンパク質を分解または可溶化する物質を含む。代表的なカオトロピック試薬には、グアニジンイソチオシアナート（ＧＩＴＣ）、グアニジンＨＣｌ、ヨウ化カリウム、尿素などが含まれるが、これらに限定されるものではない。また、還元剤、例えばメルカプトエタノール、ジチオトレイトールおよび２−メルカプトエタンスルホン酸を、２５ｍＭ〜１５０ｍＭ、好ましくは５０ｍＭ〜１００ｍＭの濃度で該結合バッファーに加えることができる。
【００１５】
必ずしも必要ではないが、該結合バッファーはまた、華氏１２５°より高い引火点を有する結合バッファーを与えない濃度のアルコールまたは他の有機溶媒を含みうる。該バッファーの引火点は、液体の引火点を測定するための良く知られた方法のいずれかを用いて測定することができる。一般には、１５％未満の濃度で使用する有機溶媒は、華氏１２５°より高い引火点を有する結合バッファーを与える。該結合バッファーに溶媒を加える場合には、低級アルコール、例えばメタノール、エタノール、プロパノールおよびイソプロパノールが、好ましいアルコールである。
【００１６】
前記のとおり、該結合バッファーの存在下では、該試験サンプル中の核酸は該担体物質に結合する。該核酸と担体物質との複合体が形成したら、該担体物質を該結合バッファーおよび残りの試験サンプルから分離することができる。該担体物質の形態に応じて、分離方法が当業者により選択される。例えば、該担体物質が粒子形態である場合には、該担体物質は、例えば、沈降することが可能であり、残りの液体物質を、吸引により又は該担体物質から該液体を単に排出させることにより、該担体から除去することができる。本発明の担体物質の組成を考慮すると、粒子状担体物質の沈降または単離を促進させるために磁界を用いることが好ましい。
【００１７】
所望により、該担体物質と複合体形成した核酸配列を、該担体物質から該核酸を解離しない任意のバッファーで洗浄することができる。典型的には、該担体物質およびそれと複合体形成した任意の核酸を、残留する及び望ましくない任意の試験サンプル成分から取り出すために、洗浄バッファーを使用する。そのような洗浄バッファーは当技術分野において良く知られており、典型的には、既に挙げられているような界面活性剤の同様の濃度の溶液を含有する。そのような界面活性剤は、典型的には、同様に前記で示した緩衝系中に希釈される。
【００１８】
該担体物質と複合体形成した核酸は、洗浄されたか否かにかかわらず、水または溶出バッファーを使用して、該酸化金属担体物質から取り出したり又は解離させることができる。本発明の「溶出バッファー」は、該酸化金属担体物質から結合核酸を分離する任意の試薬または任意の試薬の組合せでありうる。好ましくは、そのような試薬は、該核酸に使用する検出系に適したものであり、特に、核酸増幅系において使用する試薬に適したものである。水（これは蒸留、脱イオン化または精製されうる）は、本発明の目的のための溶出バッファーとして役立ちうる。リン酸塩（ホスファート）またはビシンを含有する溶出バッファー（典型的には、前記の緩衝系を含む）はまた、適当な溶出バッファーであることが判明しており、他のバッファーは、当技術分野の通常の技術（例えば、酸化金属−核酸複合体をバッファーと接触させ、分離が生じたか否かを判定すること（後記で例示する））を用いて実験的に容易に見出されうる。該溶出バッファーは、１０ｍＭ〜３００ｍＭ、好ましくは１０ｍＭ〜１００ｍＭの濃度の、少なくとも１つのホスファート官能性を含有する有機化合物であるリン酸ナトリウムまたは有機ホスファート化合物の添加を介して無機または有機ホスファートを含有しうる。Ｏ−ホスホセリン、ホスホエタノールアミン、カルバミルホスファート、ホスホクレアチン、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）およびリンタングステン酸は、有機ホスファート化合物の典型例である。溶出バッファーのための適当なｐＨは、６〜１０、好ましくは７〜９でありうる。
【００１９】
ついで、精製された核酸を、当技術分野で良く知られたアッセイを用いて検出することができる。例えば、検出の前に増幅工程を行い又は行うことなく、サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイを用いることができる。例えばＴＭＡ、ＱＢ−レプリカーゼ、ＮＡＳＢＡ、ＳＤＡ、ＬＣＲおよびＰＣＲのような良く知られた増幅反応は、本発明に従い精製された核酸を増幅するために用いることができる増幅反応の具体例である。
【００２０】
前記増幅反応は、典型的には、広く知られた増幅試薬を使用する。本発明で用いる「増幅反応試薬」なる語は、核酸増幅反応に使用されることが良く知られた試薬を意味し、プライマー、プローブ、単一または複数の試薬、酵素、または逆転写、ポリメラーゼおよび／またはリガーゼ活性を別々に又は個々に有する酵素；酵素補因子、例えばマグネシウムまたはマンガン；塩；ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）；およびデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、例えばデオキシアデノシン三リン酸、デオキシグアノシン三リン酸、デオキシシトジン三リン酸およびチミジン三リン酸を含みうる（それらに限定されるものではない）。使用する厳密な増幅試薬は、概ね、使用する個々の増幅反応に基づき当業者により選択される。
【００２１】
前記のとおりに精製した核酸の増幅は、該酸化金属担体物質から該核酸を解離させるために使用する溶出バッファー中で行うことができる。特に、増幅試薬を該溶出バッファー中の核酸と組合せ、該核酸の増幅を直接的に行うことができる。
【００２２】
本発明は更に、本発明の核酸を単離するための適当にパッケージングされた試薬を含むキットを提供する。該キットは、酸化金属担体物質、結合バッファー（前記のとおり）および溶出バッファー（前記のとおり）を含みうる。該キットはまた、単離された核酸を個々のアッセイにおいて使用するための他の適当にパッケージングされた試薬および物質を含有しうる。例えば、該キットは更に、核酸増幅プライマーおよび／または核酸プローブ、バッファー、ヌクレオチド、酵素、コンジュゲートなどを含みうる。
【００２３】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を例示するものであり、特許請求の範囲および明細書を何ら限定するものではない。
【００２４】
（実施例）
実施例１
酸化金属担体物質を使用する放射能標識ＲＮＡの結合および溶出
本実施例では、放射能標識されたＲＮＡを種々の酸化金属担体物質に結合させ、洗浄し、ついで該担体物質から溶出した。結合ＲＮＡの量および該洗浄中に失われたＲＮＡの量、そして最終的には、溶出したＲＮＡの量を測定するための方法の経過の全体にわたり、計数／分（ＣＰＭ）をモニターした。
【００２５】
本実施例で使用する放射能標識ＲＮＡは、Ｒｉｂｏｐｒｏｂｅ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ転写系およびｐＧＥＭＥＸ−１陽性対照鋳型（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのもの）を使用して調製した。該結合および溶出実験においては、約８，０００，０００ ＣＰＭの該放射能標識プローブを、６ｍｌのグアニジンイソチオシアナート−界面活性剤溶液（６Ｍ ＧＩＴＣ，１０％ Ｔｗｅｅｎ−２０，１６ｍＭ セチルトリメチルアンモニウムブロミド，１００ｍＭ 酢酸ナトリウム，１００ｍＭ ジチオトレイトール，ｐＨ４．２，７．５％ エタノール）中の５ｍｇのＦｅ３Ｏ４またはＦｅ２Ｏ３酸化金属粒子（ＩＳＫ Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ；Ｖａｌｐａｒａｉｓｏ，ＩＮから入手される）の懸濁液に加えた。該ＲＮＡをそれぞれの粒子懸濁液に加えた後、該懸濁液を手短にボルテックスし、３７℃で３０分間インキュベートした。
【００２６】
該インキュベーションの後、該酸化金属粒子をそれぞれのミクロフュージチューブの表面に磁石で引き付け、該上清をピペットで吸引した。該上清のＣＰＭを測定した。それを、後記表１に「未結合」ＲＮＡとして示す。
【００２７】
ついで、前記のとおりに該粒子を該ミクロフュージチューブの表面に引き付け、該洗浄溶液を該ミクロフュージチューブから吸引する前に、０．５ｍｌの洗浄溶液を加え、新たに生成した懸濁液をボルテックスすることにより、該粒子を洗浄した。該粒子をグアニジニウムイソチオシアナート−界面活性剤溶液（２Ｍ ＧＩＴＣ，５％ Ｔｗｅｅｎ−２０，５０ｍＭ ＫＯＡｃ，ｐＨ６）で２回洗浄し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー，ｐＨ８．０で２回洗浄した。該洗液をプールし、該粒子から除去された標識の量を測定した。それを表１に「洗液」として示す。
【００２８】
該洗浄溶液を吸引した後、２００μｌの溶出バッファーを、該洗浄粒子を含有するチューブに加えた。該溶出バッファーは、１００ｍＭ ｏ−ホスホセリン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）および３００ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基の溶液（８．０の最終ｐＨを有する）であった。該溶出バッファーを加えた後、新たに生成した粒子懸濁液を手短にボルテックスし、該懸濁液を７０℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、該粒子を、磁気ラック（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒａｃｋ）を使用して該チューブの表面上に捕捉し、溶離液を取り出した。該ＣＰＭを測定した。それを表１に「溶離液１」として示す。新鮮な溶出バッファーを該粒子に加え、該溶出方法を繰返した。該第２溶出のＣＰＭを表１に「溶離液２」として示す。
【００２９】
該粒子を２００μｌの第３アリコートの溶出バッファーに再懸濁させ、溶出バッファーおよび再懸濁粒子を含有するサンプルを使用して、該粒子から遊離されないプローブの量を測定した。これを表１に「結合」として示す。
【００３０】
表１に示す全ての値は、全ＣＰＭに対する割合（％）として表されている。
【００３１】
【表１】
表１のデータにより示されるとおり、該酸化第二鉄および酸化第一鉄粒子はＲＮＡに結合し、該ＲＮＡは該リン酸バッファーでそれぞれの粒子から溶出した。
【００３３】
実施例２
種々のリン酸濃度を用いるＦｅ ３ Ｏ ４ からのＲＮＡの溶出
本実施例では、実施例１のとおりに調製した放射能標識ＲＮＡをＦｅ２Ｏ３磁気粒子に結合させ、洗浄し、種々の濃度のリン酸ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）バッファーで溶出した。該溶出バッファー濃度は１０〜５０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ９）の範囲であった。約２３，０００，０００ ＣＰＭの該放射能標識核酸を３０ｍｌのグアニジンイソチオシアナート−界面活性剤溶液（４Ｍ ＧＩＴＣ，１０％ Ｔｗｅｅｎ−２０，１６ｍＭ セチルトリメチルアンモニウムブロミド，１００ｍＭ ２−メルカプトエタンスルホン酸，１００ｍＭ 酢酸カリウム，ｐＨ６）中の２５ｍｇのＦｅ２Ｏ３酸化金属粒子の懸濁液（水中の１０％ ｗ／ｖ 粒子懸濁液０．２５ｍｌ）に加えた。ついで、５つの１ｍｌサンプルの希釈効果を刺激するために、５ｍｌの水を該懸濁液に加えた。該懸濁液を手短にボルテックスし、それぞれ７ｍｌの５つの等しいアリコートに分割し、該懸濁液の全てを３７℃で２０分間インキュベートした。
【００３４】
該インキュベーション後、該酸化金属粒子をそれぞれのミクロフュージチューブの表面に磁石で引き付け、該上清をピペットで吸引した。未結合プローブの量をガイガー計数管でモニターし、同じ様態でモニターした該粒子に結合した放射能の量と比較して非常に少量の放射能標識核酸を捕捉した。該未結合物質の厳密なＣＰＭは測定しなかった。
【００３５】
ついで、前記のとおりに該ミクロフュージチューブの表面に該粒子を引き付け該洗浄溶液を該ミクロフュージチューブから吸引する前に、０．５ｍｌの洗浄溶液を加え、新たに生成した懸濁液をボルテックスすることにより、該粒子を洗浄した。該粒子を２Ｍ ＧＩＴＣ、５％ Ｔｗｅｅｎ−２０、５０Ｍ ＫＯＡｃ（ｐＨ６）で２回洗浄し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ８．０）で２回洗浄した。該洗浄をガイガー計数管でモニターした。また、該洗浄操作中に遊離された放射能の量は無視しうるものであることが判明した。該サンプルを該溶出バッファーのそれぞれの０．２ｍｌで７３℃で１０分間にわたり溶出した。該溶離液を、該粒子の磁気捕捉後に集め、保存した。該溶出プロトコールを繰返し、該第２溶離液も保存した。また、溶出バッファーの第３アリコートを該粒子に加え、懸濁液中の粒子を使用して、結合プローブの量を測定した。該溶離液および粒子懸濁液のそれぞれの２０μｌ アリコートを５ｍｌのシンチレーション蛍光体と混合し、計数した。表２は、この実験で使用した溶出バッファー中のリン酸ナトリウムの濃度（第１欄）、第１および第２溶出後に回収された全計数に対する割合（％）（第２欄および第３欄）、ならびに両方の溶出後の磁気粒子上に残存する計数に対する割合（％）（「結合」）を示す。
【００３６】
【表２】
表２に示すとおり、種々の濃度のリン酸バッファーが該酸化金属粒子から該ＲＮＡを溶出した。
【００３８】
実施例３
有機ホスファート溶出バッファーの使用
本実施例では、種々の有機ホスファートバッファーを、それらが酸化金属担体物質から核酸を溶出する能力に関して、無機ホスファートバッファーと比較して試験した。該溶出バッファー中で使用した有機ホスファート化合物の全ては、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．から入手した。表３に示す場合を除き、すべてのバッファーは５０ｍＭで調製し、１Ｍ トリス塩基で６．５〜９の最終ｐＨにｐＨ調節した。前記実施例と同様、該放射能標識ＲＮＡを実施例１のとおりに調製した。約１，０００，０００ ＣＰＭの該放射能標識ＲＮＡを１２ｍｌのグアニジンイソチオシアナート−界面活性剤溶液（６Ｍ ＧＩＴＣ，１０％ Ｔｗｅｅｎ−２０，１６ｍＭ セチルトリメチルアンモニウムブロミド，１００ｍＭ 酢酸ナトリウム，１００ｍＭ ジチオトレイトール，ｐＨ４．２，７．５％ エタノール）中の１０ｍｇのＦｅ２Ｏ３酸化金属粒子の懸濁液に加えた。サンプルの添加を刺激するために、２ｍｌの水を該懸濁液に加えた。該懸濁液を手短にボルテックスし、３７℃で２５分間インキュベートした。該粒子を磁気的に集め、該上清を除去した。ガイガー計数管で調べたところ、該上清中でシグナルの有意な喪失は観察されなかった。該粒子を６ｍｌの５０ｍＭ 酢酸カリウム（ｐＨ６．０）に再懸濁させることにより、該粒子を洗浄した。該粒子を磁気的に集め、該洗浄流体を取り出した。ガイガー計数管で調べたところ、該上清中でシグナルの有意な喪失は観察されなかった。該洗浄操作を繰返した。ついで該粒子を６ｍｌの該酢酸カリウム洗浄流体に再懸濁させ、十分に混合し、０．５ｍｌ アリコートを１０個の別々の１．５ｍｌ ミクロフージチューブ内に分注した。該チューブを磁気ラックに移し、該粒子を該チューブの表面に集め、該洗浄流体を除去した。ついで１００μｌの種々の溶出バッファーを該微粒子に加え、７０℃で１０分間インキュベートした。ついで５０μｌの該溶出サンプルをシンチレーション計数管中で計数して、遊離したプローブの量を測定した。出発物質（核酸）のおよその全計数は４０，０００ ＣＰＭ／サンプルであった。表３は、この実験の結果を示し、該溶出バッファーおよびその溶出バッファーで遊離した計数を示す。
【００３９】
【表３】
表３に示すとおり、有機ホスファートバッファーは、酸化金属担体物質から結合核酸を溶出するための適当なバッファーである。
【００４１】
実施例４
血漿中のＨＩＶビリオンからのＲＮＡの抽出
本実施例では、前記の酸化金属粒子を使用して、種々のレベルのＨＩＶビリオンを含有する４つの試験パネルの血漿から、ＨＩＶ核酸を抽出した。陰性血漿を陰性対照として使用した。また、商業的に入手可能なＱｉａｇｅｎウイルス核酸抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．；Ｖａｌｅｎｃｉａ ＣＡ）を使用して、該血漿サンプルからの核酸を抽出した。Ａｂｂｏｔｔ ＬＣｘ（登録商標）Ｑｕａｎｔｉｔｉａｔｉｖｅ ＨＩＶアッセイ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬから入手可能）を用いて、該サンプル中のＨＩＶ核酸を分析した。
【００４２】
それぞれのサンプル調製方法は、それらの４つの試験パネルおよび該陰性対照のそれぞれからの１ｍｌの血漿サンプルに対して行った。Ｑｉａｇｅｎ法を、該製造業者の説明に従い、該パネルに対して行い、Ａｂｂｏｔｔ ＬＣｘ（登録商標）ＨＩＶアッセイを用いて該サンプルを定量した。試験パネル１〜４は、それぞれ、２８ビリオン／ｍｌ、１１０ビリオン／ｍｌ、８００ビリオン／ｍｌおよび１０，０００ビリオン／ｍｌを含有していた。１ｍｌの試験血漿サンプルを６ｍｌの結合バッファー（５Ｍ グアニジニウムイソチオシアナート，１０％ Ｔｗｅｅｎ−２０，１６ｍＭ セチルトリメチルアンモニウムブロミド，１００ｍＭ ジチオトレイトール，１００ｍＭ 酢酸Ｎａ，ｐＨ４．１）および５ｍｇのＦｅ２Ｏ３粒子と混合することにより、該酸化金属法を行った。該ライセートを３７℃で２０分間インキュベートした。ついで、前記のとおりに該粒子を該ミクロフュージチューブの表面に引き付け該洗浄溶液を該ミクロフュージチューブから吸引する前に、０．５ｍｌの洗浄溶液を加え、新たに生成した懸濁液をボルテックスすることにより、該粒子を洗浄した。該粒子を２Ｍ ＧＩＴＣ、５％ Ｔｗｅｅｎ−２０、５０ｍＭ ＫＯＡｃ（ｐＨ６）で２回洗浄し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ８．０）で２回洗浄した。該洗浄溶液を吸引した後、２００μｌの溶出バッファーを、該洗浄粒子を含有するチューブに加えた。該溶出バッファーは、５０ｍＭ ｏ−ホスホセリンおよび１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基の溶液（８．０の最終ｐＨを有する）であった。該溶出バッファーを加えた後、新たに生成した粒子懸濁液を手短にボルテックスし、該懸濁液を７０℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、該粒子を、磁気ラック（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒａｃｋ）を使用して該チューブの表面上に捕捉し、該溶離液を取り出した。ついで、それぞれのサンプル調製方法に従い回収された５０μｌの該溶液を増幅および検出に付した。
【００４３】
それぞれのサンプル調製方法から５０μｌ アリコートを逆転写し、ＰＣＲを用いて増幅した。１×ＥＺバッファー、２．５ｍＭ 塩化マンガン、それぞれ０．１５ｍＭの最終濃度で存在するｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰ）および５単位／反応の濃度の組換えテルムス・テルモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ポリメラーゼを使用して、ＲＴ−ＰＣＲを行った。該標識プライマーは４０ｎＭの濃度で使用し、該未標識プライマー濃度は４０ｎＭの濃度で使用した。該プローブ（これは、前記のとおりに標識されており、最終的には、生じたハイブリッド複合体の検出の前に該標識プライマーの産物とハイブリダイズする）は、１０ｎＭの濃度で使用した。
【００４４】
反応混合物を逆転写し、増幅した。これはＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ４８０ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ中で行った。反応混合物を、まず、該ＲＮＡを逆転写するために６２℃で３０分間、ついで９４℃で２分間インキュベートした。ついで、増幅の初期段階における該反応のストリンジェンシーを促進するために、タッチダウン（ｔｏｕｃｈｄｏｗｎ）またはステップ・ダウン（ｓｔｅｐ−ｄｏｗｎ）プロトコールによりＰＣＲ増幅を開始した。これは、以下のとおりの８サイクルを用いるものであった：９４℃で３０秒間およびそれに続く７０℃で８０秒間の１サイクル、ついで９４℃で３０秒間およびそれに続く６９℃で８０秒間の１サイクル、ついで９４℃で３０秒間およびそれに続く６８℃で８０秒間の１サイクル、ついで９４℃で３０秒間およびそれに続く６７℃で８０秒間の１サイクル、ついで９４℃で３０秒間およびそれに続く６６℃で８０秒間の１サイクル、ついで９４℃で３０秒間およびそれに続く６５℃で８０秒間の１サイクル、ついで９４℃で３０秒間およびそれに続く６４℃で８０秒間の１サイクル、ついで９４℃で３０秒間およびそれに続く６３℃で８０秒間の１サイクル。ついで、９４℃で３０秒間およびそれに続く６２℃で８０秒間の３５サイクルで、更なる増幅を行った。該反応混合物をサーマル（熱的）サイクルに付した後、すべての複製体をプールし、サイクリングによるばらつきの排除のためにピペッティングにより混合した。ついで該混合物を分割し、９７℃で５分間変性させた。この後、温度を１５℃に５分間低下させることにより、プローブオリゴハイブリダイゼーションを行った。ついで該温度を４℃に低下させ、該反応産物が検出されるまでサンプルを４℃に維持した。
【００４５】
それらの４つの試験パネルおよび陰性対照に関して得られた結果を、後記表４にコピー／ｍｌとして示す。
【００４６】
【表４】
表４からの結果において示されるとおり、該酸化金属サンプル調製方法は、増幅および検出に十分な量で核酸を血漿から成功裏のうちに抽出した。
【００４８】
実施例５
血漿中のＨＩＶおよびＨＢＶビリオンからの核酸の抽出
本実施例では、前記の酸化金属粒子を使用して、ＨＩＶビリオンおよびＨＢＶビリオンの両方をそれぞれ１０００ビリオン／ｍｌの濃度で含有する１ｍｌの血漿から、ＨＩＶ核酸（ＲＮＡ）およびＨＢＶ核酸（ＤＮＡ）を抽出した。陰性血漿を陰性対照として使用した。該細胞溶解条件は、ＧＩＴＣ（３．３３〜４．６６Ｍ）、ＤＴＴ（０〜１００ｍＭ）、Ｔｗｅｅｎ−２０（１３．３〜２４％）およびＣＴＡＢ（０〜２４ｍＭ）の濃度ならびにｐＨ（４〜１０）ならびに温度（３５℃〜５５℃）の範囲に及ぶよう、様々に変化させた。４５個の異なる組合せの試薬および条件を該細胞溶解工程において使用し、３ｍｌの細胞溶解バッファーで全てのサンプルを抽出した。各抽出において５ｍｇのＦｅ２Ｏ３粒子を使用した。各条件は少なくとも３回使用し、中心（ｃｅｎｔｅｒｐｏｉｎｔ）条件は３０回使用した。該粒子を２Ｍ ＧＩＴＣ、５％ Ｔｗｅｅｎ−２０、５０Ｍ ＫＯＡｃ（ｐＨ６）で２回洗浄し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ８．０）で２回洗浄した。該洗浄溶液を吸引した後、２００μｌの溶出バッファーを、該洗浄粒子を含有するチューブに加えた。該溶出バッファーは、５０ｍＭ ｏ−ホスホセリンおよび１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基の溶液（８．０の最終ｐＨを有する）であった。該溶出バッファーを加えた後、新たに生成した粒子懸濁液を手短にボルテックスし、該懸濁液を７０℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、該粒子を、磁気ラック（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒａｃｋ）を使用して該チューブの表面上に捕捉し、該溶離液を取り出した。ついで、それぞれのサンプル調製方法に従い回収された溶液５０μｌを増幅および検出に付した。該溶出物質を分割し、ＰＣＲに基づく２つのアッセイ（１つはＨＩＶおよび１つはＨＢＶ）を用いて分析した。該アッセイは「ビーコン」アッセイであり、ハイブリダイゼーションプローブ（これは、増幅された標的物質への該プローブの結合に際して蛍光の増加を示す）を用いる。
【００４９】
該ＨＩＶアッセイのためには、それぞれのサンプル調製方法から５０μｌ アリコートを逆転写し、ＰＣＲを用いて増幅した。１×ＥＺバッファー、３ｍＭ 塩化マンガン、それぞれ０．１００ｍＭの最終濃度で存在するｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰ）および１４．４単位／反応の濃度の組換えテルムス・テルモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ポリメラーゼを使用して、ＲＴ−ＰＣＲを行った。フォワードプライマー（配列番号１）は１８８ｎＭの濃度で使用し、リバースプライマー（配列番号２）は４６９ｎＭの濃度で使用した。該ＨＩＶビーコンプローブ（配列番号３）は１００ｎＭの濃度で使用した。反応混合物を逆転写し、増幅した。これは、９６ウェル増幅トレイを使用してＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ９７００ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ中で行った。反応混合物を、まず、該ＲＮＡを逆転写するために５９℃で３０分間インキュベートした。ついで９２℃で１５秒間およびそれに続く５９℃で３０秒間およびそれに続く７２℃で１５秒間の５サイクルでＰＣＲ増幅を行った。この後、９２℃で４秒間およびそれに続く６４℃で８秒間およびそれに続く７２℃で４秒間の５５サイクルを行った。ついで該反応を９２℃に３０秒間加熱し、ついで４５℃で１５分間維持し、ついで２５℃に低下させた。Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒ Ｓｅｒｉｅｓ ４０００プレートリーダー中で該プレートを読み取ることにより、シグナルの量を測定した。
【００５０】
該ＨＢＶアッセイのためには、それぞれのサンプル調製方法から５０μｌ アリコートを、ＰＣＲを用いて増幅した。１×ＰＣＲバッファー、３．５ｍＭ 塩化マグネシウム、それぞれ０．１００ｍＭの最終濃度で存在するｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰ）および７単位／反応の濃度のＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄを使用して、ＲＴ−ＰＣＲを行った。フォワードプライマー（配列番号４）は２００ｎＭの濃度で使用し、リバースプライマー（配列番号５）は３００ｎＭの濃度で使用した。該ＨＢＶビーコンプローブ（配列番号６）は５０ｎＭの濃度で使用した。反応混合物を、９６ウェル増幅トレイを使用してＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ９７００ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ中で増幅した。反応混合物を、まず、該酵素を活性化するために９４℃で１０分間インキュベートした。ついで９４℃で６０秒間およびそれに続く５８℃で３０秒間の４５サイクルでＰＣＲ増幅を行った。ついで該反応を５８℃で１０分間維持し、該温度を９４℃に５分間上昇させ、ついで５５℃で１５分間維持し、ついで２５℃に低下させた。Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒ Ｓｅｒｉｅｓ ４０００プレートリーダー中で該プレートを読み取ることにより、シグナルの量を測定した。
【００５１】
該研究において種々のサンプルから生じたシグナルを、該ＨＩＶサンプルに関しては表５に、該ＨＢＶサンプルに関しては表６に示す。これらの表は、該サンプルに用いた細胞溶解条件、該サンプルで加工された内部対照（ｉｎｔ Ｃｔｒｌ）から生じたシグナル、および該サンプルからのＨＩＶまたはＨＢＶシグナルを示す。陰性（Ｎｅｇ）サンプルからのシグナルに対する陽性（Ｐｏｓ）サンプルからのシグナルの比率をプロットし、ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．からのＪＭＰソフトウェアを使用して解析した。該ＨＩＶ抽出物および該ＨＢＶ抽出物の両方からの結果（それぞれ図１および２）は、ＨＩＶおよびＨＢＶの両方に関する方法において、広範囲の条件を使用することが可能であること、および多数の条件がＨＩＶおよびＨＢＶの両方に関する同時抽出を可能にすることを示している。
【００５２】
【表５】
【表６】
実施例６
尿中のクラミジア・トラコマチスおよびナイセリア・ゴノレエからの核酸の抽出
本実施例では、前記の酸化金属方法を用いて、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）およびナイセリア・ゴノレエ（Ｎｅｉｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）の両方を含有する１ｍｌの尿から核酸を抽出した。また、ＬＣｘ（登録商標）Ｕｒｉｎｅ Ｓｐｅｃｉｍｅｎ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して、該尿サンプルからの核酸を抽出した。Ａｂｂｏｔｔ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからのＬＣｘ（登録商標）を使用して、該抽出サンプルをクラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）およびナイセリア・ゴノレエ（Ｎｅｉｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）の両方に関して試験した。
【００５５】
クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）およびナイセリア・ゴノレエ（Ｎｅｉｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）の両方に関して陰性であると試験判定されたプールされた尿を使用して、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからの（登録商標）アッセイを使用して該サンプルパネルを作製した。クラミジア・トラコマチス（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）およびナイセリア・ゴノレエ（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）の陽性ストックを該陰性尿に加えることにより、陽性尿パネルを作製した。「低陽性」パネルは、尿１ｍｌ当たり０．５基本小体（ＥＢ）のクラミジア・トラコマチス（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）および０．５コロニー形成単位（ｃｆｕ）のナイセリア・ゴノレエ（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）を含有していた。「高陽性」パネルは、尿１ｍｌ当たり１０ ＥＢのクラミジア・トラコマチス（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）および１０ ｃｆｕのナイセリア・ゴノレエ（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）を含有していた。
【００５６】
それぞれのサンプル調製方法は、それらの２つの試験パネルおよび該陰性対照のそれぞれからの１ｍｌの尿サンプルに対して行った。１ｍｌの試験尿サンプルを３ｍｌの細胞溶解バッファー（４．３Ｍ グアニジニウムイソチオシアナート，１８％ Ｔｗｅｅｎ−２０，１２ｍＭ セチルトリメチルアンモニウムブロミド，５０ｍＭ ジチオトレイトール，１００ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．６）および５ｍｇのＦｅ２Ｏ３粒子（Ｍ−２０３８，ＩＳＫ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）と混合することにより、該酸化金属法を行った。該抽出混合物はまた、７．５μｇのポリＡ ＲＮアーゼを担体として含有していた。該ライセートを４５℃で２０分間インキュベートした。該粒子を磁気的に捕捉し、該ライセートを吸引により除去した。該粒子を２Ｍ ＧＩＴＣ、５％ ｔｗｅｅｎ−２０、５０ｍＭ 酢酸Ｋ（ｐＨ６）で２回洗浄し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ８．０）、０．４５％ アジ化Ｎａで２回洗浄した。該洗浄溶液を吸引した後、１００μｌの溶出バッファーを、該洗浄粒子を含有するチューブに加えた。該溶出バッファーは、保存剤として０．０４５％ アジ化Ｎａを含有する水であった。該溶出バッファーを加えた後、該粒子をピペッティングにより再懸濁させ、該懸濁液を７０℃で２０分間インキュベートした。インキュベーション後、該粒子を、磁気ラック（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒａｃｋ）を使用して該チューブの表面上に捕捉し、該溶離液を取り出した。ついで、該サンプルから回収された１００μｌを９００μｌのＬＣｘ（登録商標）Ｕｒｉｎｅ Ｓｐｅｃｉｍｅｎ Ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ ＭｇＣｌ２および界面活性剤）で希釈した。該アッセイにおいて必要なＭｇＣｌ２を加えるためには、該抽出サンプルに該再懸濁バッファーを加えなければならない。ついで５０μｌの該サンプルを、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからのクラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）およびナイセリア・ゴノレエ（Ｎｅｉｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）ＬＣｘ（登録商標）アッセイにおいて使用した。
【００５７】
また、ＬＣｘ（登録商標）Ｕｒｉｎｅ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して、該サンプルを調製した。１ｍｌの尿サンプルを９，０００×ｇで１５分間にわたり遠心分離し、該上清を除去した。９００μｌのＬＣｘ（登録商標）Ｕｒｉｎｅ Ｓｐｅｃｉｍｅｎ Ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを該ペレットに加え、該サンプルをボルテックスして該サンプルを再懸濁させた。ついで該サンプルを９７℃で１５分間加熱して、該ＤＮＡを遊離させた。冷却後、該酸化金属法に使用した１００μｌの該溶出バッファー（水および０．０４５％ アジ化Ｎａ）を該抽出サンプルに加えて、該酸化金属抽出サンプルに対する成分の濃度を平衡化した。ついで５０μｌの該サンプルを、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからのクラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）およびナイセリア・ゴノレエ（Ｎｅｉｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）（登録商標）アッセイにおいて使用した。また、陰性および陽性対照を該アッセイにおいて使用した。クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）アッセイに関する結果は、０ 比率（ｒａｔｅ）シグナルを有する陰性対照、および１６００の比率シグナルを有する陽性対照を含んでいた。クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）アッセイに関する残りの結果を表７に示す。ナイセリア・ゴノレエ（Ｎｅｉｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）アッセイに関する結果は、０の比率シグナルを有する陰性対照、および９５０の比率シグナルを有する陽性対照を含んでいた。ナイセリア・ゴノレエ（Ｎｅｉｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）アッセイに関する残りの結果を表８に示す。両方の細胞型に関するＬＣｘ（登録商標）アッセイのための標準的抽出方法および該酸化金属法を行った。
【００５８】
【表７】
【表８】
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
実施例において得たデータのコンピューター解析を示す。
【図１Ｂ】
実施例において得たデータのコンピューター解析を示す。
【図１Ｃ】
実施例において得たデータのコンピューター解析を示す。
【図１Ｄ】
実施例において得たデータのコンピューター解析を示す。
【図１Ｅ】
実施例において得たデータのコンピューター解析を示す。
【図１Ｆ】
実施例において得たデータのコンピューター解析を示す。
【図２Ａ】
実施例において得たデータのコンピューター解析を示す。
【図２Ｂ】
実施例において得たデータのコンピューター解析を示す。
【図２Ｃ】
実施例において得たデータのコンピューター解析を示す。
【図２Ｄ】
実施例において得たデータのコンピューター解析を示す。
【図２Ｅ】
実施例において得たデータのコンピューター解析を示す。
【図２Ｆ】
実施例において得たデータのコンピューター解析を示す。
Claims (11)
- ａ）試験サンプルを酸化金属担体物質および結合バッファーと接触させて、核酸／酸化金属担体物質複合体を形成させ（該結合バッファーはカオトロピック剤および界面活性剤を含む）、
ｂ）該複合体を該試験サンプルから分離し、
ｃ）該核酸を該酸化金属担体物質から溶出することを含んでなる、試験サンプルから核酸を分離するための方法。 - 該結合バッファーが更に還元剤を含む、請求項１記載の方法。
- 該結合バッファーが更に有機溶媒を含み、該結合バッファーの引火点が華氏１３０度より高い、請求項１記載の方法。
- 該結合バッファーが更に有機溶媒を含み、該結合バッファーの引火点が華氏１３０度より高い、請求項２記載の方法。
- 該複合体を該試験サンプルから分離した後で且つ該核酸を該酸化金属担体物質から溶出する前に、洗浄工程を更に含む、請求項１記載の方法。
- 該核酸を該酸化金属担体物質から溶出することが、該複合体を、水またはホスファート含有バッファーから選ばれる試薬と接触させることを含む、請求項１記載の方法。
- 該核酸を該酸化金属担体物質から溶出した後、該核酸を検出する工程を更に含む、請求項６記載の方法。
- 該核酸を該酸化金属担体物質から溶出した後で且つ該核酸を検出する前に、該核酸を増幅する工程を更に含む、請求項７記載の方法。
- 該核酸が、異なる起源に由来する核酸を含む、請求項７記載の方法。
- 該核酸がＲＮＡおよびＤＮＡである、請求項９記載の方法。
- ａ）酸化金属粒子、
ｂ）（ｉ）カオトロピック試薬と
（ｉｉ）界面活性剤とを含む結合バッファー、および
ｃ）水を含む溶出バッファーを含んでなる、試験サンプルから核酸を分離するためのキット。
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