JP2000245456A - 核酸回収量の評価方法 - Google Patents
核酸回収量の評価方法Info
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
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Abstract
(57)【要約】
【課題】核酸を含有すると考えられる材料から核酸を抽
出し単離する際、回収された核酸を増幅することなく直
接検出する方法を提供する。 【解決手段】核酸を含有すると考えられる試料から核酸
を抽出および単離する方法において、該方法における核
酸回収量を評価するための手段であって、テストあたり
核酸を１０6分子ないし１０14分子の範囲で含む核酸溶
液を使用して回収された核酸を直接的に評価することを
特徴とする核酸回収量の評価方法。
出し単離する際、回収された核酸を増幅することなく直
接検出する方法を提供する。 【解決手段】核酸を含有すると考えられる試料から核酸
を抽出および単離する方法において、該方法における核
酸回収量を評価するための手段であって、テストあたり
核酸を１０6分子ないし１０14分子の範囲で含む核酸溶
液を使用して回収された核酸を直接的に評価することを
特徴とする核酸回収量の評価方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、核酸を含有すると
考えられる材料から核酸を抽出し単離する方法に関す
る。より詳細には、高濃度の核酸溶液を使用し、抽出・
単離した核酸を増幅することなく直接検出する方法に関
する。
考えられる材料から核酸を抽出し単離する方法に関す
る。より詳細には、高濃度の核酸溶液を使用し、抽出・
単離した核酸を増幅することなく直接検出する方法に関
する。
【０００２】
【従来の技術】近年の遺伝子工学や分子生物学等の分野
の進歩により、感染症や遺伝子疾患などについて、ＤＮ
Ａ／ＲＮＡレベルで解析することが可能になった。特
に、ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain Reactio
n：以下、ＰＣＲ法という；Science 第２３０巻、第１
３５０〜１３５４頁、１９８５年）や、核酸配列に基づ
く増幅法（Nucleic Acid Sequence Based Amplificatio
n；以下、ＮＡＳＢＡ法という、Nature 第３５０巻、
第９１〜９２頁、１９９１年；特許第２６４８８０２号
公報および特許第２６５０１５９号公報）等に代表され
る核酸増幅方法の発明により、従来であれば検出が非常
に困難であった極微量の核酸の検出が可能となり、遺伝
子解析が飛躍的に容易なものとなった。
の進歩により、感染症や遺伝子疾患などについて、ＤＮ
Ａ／ＲＮＡレベルで解析することが可能になった。特
に、ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain Reactio
n：以下、ＰＣＲ法という；Science 第２３０巻、第１
３５０〜１３５４頁、１９８５年）や、核酸配列に基づ
く増幅法（Nucleic Acid Sequence Based Amplificatio
n；以下、ＮＡＳＢＡ法という、Nature 第３５０巻、
第９１〜９２頁、１９９１年；特許第２６４８８０２号
公報および特許第２６５０１５９号公報）等に代表され
る核酸増幅方法の発明により、従来であれば検出が非常
に困難であった極微量の核酸の検出が可能となり、遺伝
子解析が飛躍的に容易なものとなった。
【０００３】ただし、生物試料中の核酸を、必要であれ
ば増幅し、検出するためには、試料中の核酸を選択的に
取り出す必要がある。これは、通常の生物試料中には核
酸以外の夾雑物質、例えばタンパク質、脂質、糖類など
が大量に含まれており、これらが増幅や検出に悪影響を
及ぼす可能性が少なくない。そのため、あらかじめ試料
中の夾雑物質を除き、核酸を抽出し単離する操作が必要
となるのである。
ば増幅し、検出するためには、試料中の核酸を選択的に
取り出す必要がある。これは、通常の生物試料中には核
酸以外の夾雑物質、例えばタンパク質、脂質、糖類など
が大量に含まれており、これらが増幅や検出に悪影響を
及ぼす可能性が少なくない。そのため、あらかじめ試料
中の夾雑物質を除き、核酸を抽出し単離する操作が必要
となるのである。
【０００４】このような核酸の単離方法は古くから様々
な手法で行われてきた。代表的なものを示すと、フェノ
ール抽出法（Biochimica et Biophysica acta 第７２
巻、第６１９〜６２９頁、１９６３年）、アルカリ法
（Nucleic Acid Research 第７巻、第１５１３〜１５２
３頁、１９７９年）等のような液相で行う方法、核酸結
合用担体として、ガラス粒子を用いる方法（Proc. Nat
l. Acad. Sci..USA 第７６−２巻、第６１５〜６１９
頁、１９７９年）、ハイドロキシアパタイトを用いる方
法（特開昭６３−２６３０９３号公報）等がある。
な手法で行われてきた。代表的なものを示すと、フェノ
ール抽出法（Biochimica et Biophysica acta 第７２
巻、第６１９〜６２９頁、１９６３年）、アルカリ法
（Nucleic Acid Research 第７巻、第１５１３〜１５２
３頁、１９７９年）等のような液相で行う方法、核酸結
合用担体として、ガラス粒子を用いる方法（Proc. Nat
l. Acad. Sci..USA 第７６−２巻、第６１５〜６１９
頁、１９７９年）、ハイドロキシアパタイトを用いる方
法（特開昭６３−２６３０９３号公報）等がある。
【０００５】このほか、シリカ粒子とカオトロピックイ
オン溶液を用いた方法（J.ClinicalMicrobiology 第２
８−３巻、第４９５〜５０３頁、１９９０年、特許第２
６８０４６２号）、シリカ粒子を容易に混合・洗浄する
ために、粒子に磁性を持たせ、磁気により混合および撹
拌する方法（特開平９−１９２９２号公報）が近年考案
されている。
オン溶液を用いた方法（J.ClinicalMicrobiology 第２
８−３巻、第４９５〜５０３頁、１９９０年、特許第２
６８０４６２号）、シリカ粒子を容易に混合・洗浄する
ために、粒子に磁性を持たせ、磁気により混合および撹
拌する方法（特開平９−１９２９２号公報）が近年考案
されている。
【０００６】これら核酸の抽出および単離方法を構築す
るに当たって、得られた核酸の回収量を評価するために
は、核酸の２６０ｎｍの吸光度を測定し、算出する方法
が一般的であった。しかしこの方法は、遺伝子診断のよ
うな核酸配列に特異的な解析を行う際には、必要な配列
の核酸が得られているか否か判定できないという最大の
問題点を有する。そのため、通常は得られた核酸をハイ
ブリダイゼーション法により評価することで、目的の核
酸配列の有無を判定していた。ただし、検体や組織、細
胞などのサンプルから抽出した核酸は、目的の配列以外
の領域を多量に含んでおり、目的の配列を持った核酸の
量は相対的に極微量となるため、そのままハイブリダイ
ゼーション法により評価することは困難である。従って
目的配列周辺を増幅することにより、検出可能な量に増
強していた。
るに当たって、得られた核酸の回収量を評価するために
は、核酸の２６０ｎｍの吸光度を測定し、算出する方法
が一般的であった。しかしこの方法は、遺伝子診断のよ
うな核酸配列に特異的な解析を行う際には、必要な配列
の核酸が得られているか否か判定できないという最大の
問題点を有する。そのため、通常は得られた核酸をハイ
ブリダイゼーション法により評価することで、目的の核
酸配列の有無を判定していた。ただし、検体や組織、細
胞などのサンプルから抽出した核酸は、目的の配列以外
の領域を多量に含んでおり、目的の配列を持った核酸の
量は相対的に極微量となるため、そのままハイブリダイ
ゼーション法により評価することは困難である。従って
目的配列周辺を増幅することにより、検出可能な量に増
強していた。
【０００７】ここで核酸の増幅反応は、必ずしも増幅前
の核酸量と増幅後の核酸量とが直線的に比例するわけで
はない。その理由は、増幅反応を経ることで核酸量は対
数的に増加し、その増幅曲線が非線形となるためであ
る。それゆえ、核酸の抽出・単離法の構築は、その能力
を厳密に比較できないことから、非常に労力を必要と
し、また技術的に困難を伴うものであった。
の核酸量と増幅後の核酸量とが直線的に比例するわけで
はない。その理由は、増幅反応を経ることで核酸量は対
数的に増加し、その増幅曲線が非線形となるためであ
る。それゆえ、核酸の抽出・単離法の構築は、その能力
を厳密に比較できないことから、非常に労力を必要と
し、また技術的に困難を伴うものであった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記の問題
点を解決して、核酸を含有すると考えられる材料から核
酸を抽出し単離する際、回収された核酸を増幅すること
なく直接検出する方法を提供することを目的とする。
点を解決して、核酸を含有すると考えられる材料から核
酸を抽出し単離する際、回収された核酸を増幅すること
なく直接検出する方法を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、これらの
課題を解決するべく鋭意研究を進めた結果、核酸を含有
すると考えられる材料から核酸を抽出し単離する際、回
収された核酸を増幅することなく直接検出する方法を見
出した。すなわち、本発明は、核酸を含有すると考えら
れる試料から核酸を抽出および単離する方法において、
テストあたりの核酸量が１０6分子ないし１０14分子の
範囲である高濃度の核酸溶液を使用することにより、回
収した核酸の量を直接的に評価することを特徴とする核
酸回収量の評価方法である。
課題を解決するべく鋭意研究を進めた結果、核酸を含有
すると考えられる材料から核酸を抽出し単離する際、回
収された核酸を増幅することなく直接検出する方法を見
出した。すなわち、本発明は、核酸を含有すると考えら
れる試料から核酸を抽出および単離する方法において、
テストあたりの核酸量が１０6分子ないし１０14分子の
範囲である高濃度の核酸溶液を使用することにより、回
収した核酸の量を直接的に評価することを特徴とする核
酸回収量の評価方法である。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明においては、テストあたり
使用する核酸量としては、１０6分子ないし１０14分子
の範囲であり、より好ましくは１０8ないし１０13分子
の範囲である。その理由としては、１０6分子未満の分
子数では、直接的な評価が困難であり、また１０14分子
よりも多い分子数では、検出時に飽和してしまう可能性
があり評価方法としては適当でない。すなわち、本発明
の核酸回収量の評価方法は、高濃度の核酸溶液を使用す
ることで、回収した核酸の回収量を直接的に評価する。
通常このような高濃度の核酸溶液は、核酸の増幅反応に
より得ることができる。また、必要な鎖長を持ったオリ
ゴ／ポリクレオチドを化学合成し、高濃度で使用するこ
とによっても評価可能である。
使用する核酸量としては、１０6分子ないし１０14分子
の範囲であり、より好ましくは１０8ないし１０13分子
の範囲である。その理由としては、１０6分子未満の分
子数では、直接的な評価が困難であり、また１０14分子
よりも多い分子数では、検出時に飽和してしまう可能性
があり評価方法としては適当でない。すなわち、本発明
の核酸回収量の評価方法は、高濃度の核酸溶液を使用す
ることで、回収した核酸の回収量を直接的に評価する。
通常このような高濃度の核酸溶液は、核酸の増幅反応に
より得ることができる。また、必要な鎖長を持ったオリ
ゴ／ポリクレオチドを化学合成し、高濃度で使用するこ
とによっても評価可能である。
【００１１】ここで核酸増幅反応とは、試料中の核酸の
分子数を酵素反応などにより対数的に増加させるもので
ある。好ましくは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）
や核酸配列に基づく増幅法（ＮＡＳＢＡ法）を使用する
ことができる。さらには、ＤＮＡを評価する際にはＰＣ
Ｒ法を利用し、ＲＮＡを評価する際にはＮＡＳＢＡ法を
選択することが望ましいが、これに限定されるものでは
ない。
分子数を酵素反応などにより対数的に増加させるもので
ある。好ましくは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）
や核酸配列に基づく増幅法（ＮＡＳＢＡ法）を使用する
ことができる。さらには、ＤＮＡを評価する際にはＰＣ
Ｒ法を利用し、ＲＮＡを評価する際にはＮＡＳＢＡ法を
選択することが望ましいが、これに限定されるものでは
ない。
【００１２】本発明における核酸とは、例えば、ＤＮ
Ａ、ＲＮＡが挙げられる。ＤＮＡとしては、二本鎖ＤＮ
Ａ、一本鎖ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、
ｃＤＮＡなどを含む。またＲＮＡとしては、ウイルスや
細菌等の外来性生物由来のＲＮＡに加えて、これらの生
物が持つ内在性のＲＮＡである、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、
ｒＲＮＡ等をも含む。
Ａ、ＲＮＡが挙げられる。ＤＮＡとしては、二本鎖ＤＮ
Ａ、一本鎖ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、
ｃＤＮＡなどを含む。またＲＮＡとしては、ウイルスや
細菌等の外来性生物由来のＲＮＡに加えて、これらの生
物が持つ内在性のＲＮＡである、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、
ｒＲＮＡ等をも含む。
【００１３】本発明において、核酸を含有すると考えら
れる試料としては特に限定されるものではないが、例え
ば生物材料である。ここで生物材料とは、生体より採取
した種々の試料をいうものであり、具体的には、血液、
組織、尿、喀痰、胃液、気管支洗浄液、脳脊髄液、膿
汁、咽頭ぬぐい液、糞便等が例示される。
れる試料としては特に限定されるものではないが、例え
ば生物材料である。ここで生物材料とは、生体より採取
した種々の試料をいうものであり、具体的には、血液、
組織、尿、喀痰、胃液、気管支洗浄液、脳脊髄液、膿
汁、咽頭ぬぐい液、糞便等が例示される。
【００１４】ここで核酸抽出用溶液は、試料中の核酸を
露出させ、さらに核酸を粒子担体上に固定する能力を持
つものが望ましく、カオトロピック物質を含有すること
が好ましい。ここで、カオトロピック物質とは、水を加
えることで疎水性分子の水溶性を増加させ、疎水結合を
弱める働きの物質をいうものであり、具体的には、例え
ば、グアニジン塩、ヨウ化カリウム、ヨウ化ナトリウ
ム、（イソ）チオシアン酸塩、尿素などが挙げられる。
露出させ、さらに核酸を粒子担体上に固定する能力を持
つものが望ましく、カオトロピック物質を含有すること
が好ましい。ここで、カオトロピック物質とは、水を加
えることで疎水性分子の水溶性を増加させ、疎水結合を
弱める働きの物質をいうものであり、具体的には、例え
ば、グアニジン塩、ヨウ化カリウム、ヨウ化ナトリウ
ム、（イソ）チオシアン酸塩、尿素などが挙げられる。
【００１５】さらに、核酸を抽出・単離する際に、核酸
以外のものを除去するための洗浄液としては、カオトロ
ピック物質を含む第一の洗浄液およびアルコールを含む
第二の洗浄液を用いることが好ましい。カオトロピック
物質を含む第一の洗浄液としては、グアニジンチオシア
ン酸塩、グアニジン塩酸塩および／またはチオシアン酸
ナトリウム塩を含む溶液が好適に使用できる。そしてア
ルコールを含む第二の洗浄液としては、６０〜１００％
濃度のアルコールが好適に使用できる。該アルコールと
しては、エタノール、メタノール、プロパノール、イソプ
ロパノールなどが挙げられる。さらに、該第二の洗浄液
とはアルコール濃度が異なる第三の洗浄液を用いること
がより好ましい。特に７０％濃度のエタノール及び９９
％濃度のエタノールを第二及び第三の洗浄液として使用
することが望ましい。
以外のものを除去するための洗浄液としては、カオトロ
ピック物質を含む第一の洗浄液およびアルコールを含む
第二の洗浄液を用いることが好ましい。カオトロピック
物質を含む第一の洗浄液としては、グアニジンチオシア
ン酸塩、グアニジン塩酸塩および／またはチオシアン酸
ナトリウム塩を含む溶液が好適に使用できる。そしてア
ルコールを含む第二の洗浄液としては、６０〜１００％
濃度のアルコールが好適に使用できる。該アルコールと
しては、エタノール、メタノール、プロパノール、イソプ
ロパノールなどが挙げられる。さらに、該第二の洗浄液
とはアルコール濃度が異なる第三の洗浄液を用いること
がより好ましい。特に７０％濃度のエタノール及び９９
％濃度のエタノールを第二及び第三の洗浄液として使用
することが望ましい。
【００１６】また、核酸の抽出に用いる担体としては核
酸を結合する能力を持つ物質であれば特に限定されるも
のではないが、シリカを含有する粒子担体またはその誘
導体が好適である。シリカ粒子は、溶液中の塩濃度、ｐ
Ｈおよび温度などによって核酸の吸着と放出を制御でき
るため好適に使用できる。
酸を結合する能力を持つ物質であれば特に限定されるも
のではないが、シリカを含有する粒子担体またはその誘
導体が好適である。シリカ粒子は、溶液中の塩濃度、ｐ
Ｈおよび温度などによって核酸の吸着と放出を制御でき
るため好適に使用できる。
【００１７】さらに粒子担体を使用して核酸を抽出する
際、該粒子担体に磁性を持たせることにより、磁気によ
り攪拌および凝集でき、自動化が可能となる。例えば、
特開平９−１９２９２号公報に示されているような磁性
粒子、特に酸化鉄を含有する超常磁性粒子が挙げられ
る。さらに該磁性粒子は、酸化鉄を１０〜５０％の範囲
で含有することが好ましく、２０〜４０％の範囲で含有
することがより好ましい。また、表面積が１０ｍ2／ｇ
以上、好ましくは２０〜３５０ｍ2／ｇ、および／また
は比表面積が１０〜８００ｍ2／ｇ、好ましくは２０〜
４００ｍ2／ｇである粒子を使用することがさらに好ま
しい。
際、該粒子担体に磁性を持たせることにより、磁気によ
り攪拌および凝集でき、自動化が可能となる。例えば、
特開平９−１９２９２号公報に示されているような磁性
粒子、特に酸化鉄を含有する超常磁性粒子が挙げられ
る。さらに該磁性粒子は、酸化鉄を１０〜５０％の範囲
で含有することが好ましく、２０〜４０％の範囲で含有
することがより好ましい。また、表面積が１０ｍ2／ｇ
以上、好ましくは２０〜３５０ｍ2／ｇ、および／また
は比表面積が１０〜８００ｍ2／ｇ、好ましくは２０〜
４００ｍ2／ｇである粒子を使用することがさらに好ま
しい。
【００１８】また本発明は、下記（ａ）〜（ｄ）の工程
を有する核酸の検出方法である。 （ａ）テストあたりの核酸量が１０6分子ないし１０14
分子の範囲である高濃度の核酸を含んだ材料と、核酸を
吸着できる担体と、核酸を該担体に吸着させるための核
酸抽出用溶液とを混合する工程 （ｂ）核酸以外のものを、核酸と担体との複合体より洗
浄することで除去する工程 （ｃ）核酸と担体との複合体より核酸を溶出し回収する
工程 （ｄ）得られた核酸を検出する工程 上記のように、本発明における核酸の検出方法は、テス
トあたりの核酸量が１０6分子ないし１０14分子の範囲
である高濃度の核酸を含んだ材料と、核酸を吸着できる
担体と、核酸を該担体に吸着させるための核酸抽出用溶
液とを混合する工程を経ることにより、定量的な評価を
可能とし、また増幅反応を必要としないため、短時間且
つ活低コストな評価が実施できるという点で優れるもの
である。
を有する核酸の検出方法である。 （ａ）テストあたりの核酸量が１０6分子ないし１０14
分子の範囲である高濃度の核酸を含んだ材料と、核酸を
吸着できる担体と、核酸を該担体に吸着させるための核
酸抽出用溶液とを混合する工程 （ｂ）核酸以外のものを、核酸と担体との複合体より洗
浄することで除去する工程 （ｃ）核酸と担体との複合体より核酸を溶出し回収する
工程 （ｄ）得られた核酸を検出する工程 上記のように、本発明における核酸の検出方法は、テス
トあたりの核酸量が１０6分子ないし１０14分子の範囲
である高濃度の核酸を含んだ材料と、核酸を吸着できる
担体と、核酸を該担体に吸着させるための核酸抽出用溶
液とを混合する工程を経ることにより、定量的な評価を
可能とし、また増幅反応を必要としないため、短時間且
つ活低コストな評価が実施できるという点で優れるもの
である。
【００１９】また本発明は、上述したような高濃度核
酸、核酸吸着性担体および核酸抽出用溶液を含むことを
特徴とする核酸回収量の評価用テストキットである。上
記のような構成を有することにより、本発明における核
酸回収量の評価用テストキットは、定量的な評価を可能
とし、また増幅反応を必要としないため、短時間且つ活
低コストな評価が実施できる点で優れるものである。
酸、核酸吸着性担体および核酸抽出用溶液を含むことを
特徴とする核酸回収量の評価用テストキットである。上
記のような構成を有することにより、本発明における核
酸回収量の評価用テストキットは、定量的な評価を可能
とし、また増幅反応を必要としないため、短時間且つ活
低コストな評価が実施できる点で優れるものである。
【００２０】
【実施例】以下、実施例を挙げることにより、本発明の
効果をより一層明瞭なものとする。ただし、これらの実
施例によって本発明が限定されるものではない。
効果をより一層明瞭なものとする。ただし、これらの実
施例によって本発明が限定されるものではない。
【００２１】実施例１（腸炎ビブリオＴＤＨ遺伝子の高
濃度核酸溶液の調製） 本実施例中に使用した核酸（遺伝子）溶液は、腸炎ビブ
リオＴＤＨ（Thermostable Direct Haemolysin）遺伝子
を、核酸配列に基づく増幅法（以下、ＮＡＳＢＡ法と示
す）によって増幅した核酸溶液を用いた。ここで用いた
増幅用プライマーは、５'側プライマーの塩基配列が、
5'-CCCCGGTTCT GATGAGATAT TGTT-3'（配列番号１）、
３'側プライマーの塩基配列が、5'-AATTCTAATA CGACTCA
CTA TAGGGAGACC AATATATTAC CACTACCACT A-3'（配列番
号２、Ｔ７−ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を
含む）である。これらのプライマー配列は特開平４−２
０２９９号公報およびGene 第９３巻、第９〜１５頁
（１９９３年）に開示されたものである。またＮＡＳＢ
Ａ法は、Ｔ７−ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素および
ＲＮａｓｅＨ（一重鎖または二重鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ
を加水分解することなくＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの
ＲＮＡを加水分解するリボヌクレアーゼ）を用いた。
濃度核酸溶液の調製） 本実施例中に使用した核酸（遺伝子）溶液は、腸炎ビブ
リオＴＤＨ（Thermostable Direct Haemolysin）遺伝子
を、核酸配列に基づく増幅法（以下、ＮＡＳＢＡ法と示
す）によって増幅した核酸溶液を用いた。ここで用いた
増幅用プライマーは、５'側プライマーの塩基配列が、
5'-CCCCGGTTCT GATGAGATAT TGTT-3'（配列番号１）、
３'側プライマーの塩基配列が、5'-AATTCTAATA CGACTCA
CTA TAGGGAGACC AATATATTAC CACTACCACT A-3'（配列番
号２、Ｔ７−ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を
含む）である。これらのプライマー配列は特開平４−２
０２９９号公報およびGene 第９３巻、第９〜１５頁
（１９９３年）に開示されたものである。またＮＡＳＢ
Ａ法は、Ｔ７−ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素および
ＲＮａｓｅＨ（一重鎖または二重鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ
を加水分解することなくＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの
ＲＮＡを加水分解するリボヌクレアーゼ）を用いた。
【００２２】ＮＡＳＢＡ増幅法による高濃度核酸配列の
調製は、まず下記の増幅反応液１０．０μｌに、あらか
じめ単離したＴＤＨ遺伝子核酸溶液５．０μｌを加え、
６５℃で５分間静置した。そして４１℃に反応温度を下
げ、その後下記の酵素溶液５．０μlを加えた。その
後、４１℃で９０分間静置した。
調製は、まず下記の増幅反応液１０．０μｌに、あらか
じめ単離したＴＤＨ遺伝子核酸溶液５．０μｌを加え、
６５℃で５分間静置した。そして４１℃に反応温度を下
げ、その後下記の酵素溶液５．０μlを加えた。その
後、４１℃で９０分間静置した。
【００２３】以下に増幅反応液の組成を示す。 ４０．０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ １２．０ｍＭ ＭｇＣｌ2 ７０．０ｍＭ ＫＣｌ ５．０ｍＭ ＤＴＴ １５％（ｖ／ｖ） ＤＭＳＯ １．０ｍＭ ｄＮＴＰ ２．０ｍＭ ｒＮＴＰ ０．２μM プライマー×２
【００２４】以下に酵素液の組成を示す。 ０．１Ｕ ＲＮａｓｅＨ ４０．０U Ｔ７−ＲＮＡポリメラーゼ ８．０Ｕ 逆転写酵素 ０．１ｇ／ｌ ＢＳＡ 以上の手順により得られた核酸溶液を、回収量の直接評
価のために用いた。
価のために用いた。
【００２５】実施例２（高濃度核酸溶液の抽出および単
離方法） (１)１．５ｍｌ容のエッペンドルフチューブに、下記の
組成を持つ核酸抽出用試薬０．９ｍｌを入れ、次に実施
例1で得られた核酸溶液０．１ｍｌを添加し、よく混合
した。 ５０ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ５．０ｍｏｌ／ｌ グアニジンチオシアン酸塩 ２０ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ １．０％ ホ゜リエチレンク゛リコール−モノ−ｐ−イソオクチルフェニルエーテル (２)次に、５．０ｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ溶液に懸濁した
シリカ粒子担体（シグマ社製、１．０ｇ／ｍｌ）５０．
０μｌを加え、よく混合し室温で１０分間放置した。こ
の間２分おきに混合した。 (３)遠心分離機を使用し、１２０００rpmで１分間遠心
することにより、粒子をチューブ底部に集めた。 (４)フィルターチップ又はディスポーザブルスポイトを
用いて、溶液相を静かに吸引排出した。 (５)ここに、洗浄液として５．０ｍｏｌ／ｌのグアニジ
ンチオシアン酸塩を含むトリス／塩酸緩衝液１．０ｍｌ
を加え、混合した後、上記(３)と同様にして遠心分離し
た。 (６)上記(４)と同様にして溶液を排出し、洗浄液による
洗浄操作をもう一度繰り返した。 (７)１．０ｍｌの７０％エタノール溶液により上記(５)
から(６)と同様に、核酸の吸着したシリカ粒子を洗浄
し、高濃度の塩溶液を除去した。 (８)再度１．０ｍｌの７０％エタノール溶液で洗浄した
後、１．０ｍｌの９９％エタノールで同様に洗浄した。 (９)５６．０℃のヒートブロック上に上記のチューブを
設置し、約３０分間静置することにより、チューブ内お
よびシリカ粒子中のエタノールを完全に蒸発させて除去
した。 (10)０．１ｍｌの滅菌水を加え、５６．０℃のヒートブ
ロック上に上記チューブを静置し１０分間静置した。 (11)１２０００rpmで５分間遠心分離することにより粒
子をチューブ底部に集め、次いで溶液相をフィルターチ
ップで吸引し、別の新しいチューブに回収した。回収液
量は通常６０〜７０μｌ程度である。
離方法） (１)１．５ｍｌ容のエッペンドルフチューブに、下記の
組成を持つ核酸抽出用試薬０．９ｍｌを入れ、次に実施
例1で得られた核酸溶液０．１ｍｌを添加し、よく混合
した。 ５０ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ５．０ｍｏｌ／ｌ グアニジンチオシアン酸塩 ２０ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ １．０％ ホ゜リエチレンク゛リコール−モノ−ｐ−イソオクチルフェニルエーテル (２)次に、５．０ｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ溶液に懸濁した
シリカ粒子担体（シグマ社製、１．０ｇ／ｍｌ）５０．
０μｌを加え、よく混合し室温で１０分間放置した。こ
の間２分おきに混合した。 (３)遠心分離機を使用し、１２０００rpmで１分間遠心
することにより、粒子をチューブ底部に集めた。 (４)フィルターチップ又はディスポーザブルスポイトを
用いて、溶液相を静かに吸引排出した。 (５)ここに、洗浄液として５．０ｍｏｌ／ｌのグアニジ
ンチオシアン酸塩を含むトリス／塩酸緩衝液１．０ｍｌ
を加え、混合した後、上記(３)と同様にして遠心分離し
た。 (６)上記(４)と同様にして溶液を排出し、洗浄液による
洗浄操作をもう一度繰り返した。 (７)１．０ｍｌの７０％エタノール溶液により上記(５)
から(６)と同様に、核酸の吸着したシリカ粒子を洗浄
し、高濃度の塩溶液を除去した。 (８)再度１．０ｍｌの７０％エタノール溶液で洗浄した
後、１．０ｍｌの９９％エタノールで同様に洗浄した。 (９)５６．０℃のヒートブロック上に上記のチューブを
設置し、約３０分間静置することにより、チューブ内お
よびシリカ粒子中のエタノールを完全に蒸発させて除去
した。 (10)０．１ｍｌの滅菌水を加え、５６．０℃のヒートブ
ロック上に上記チューブを静置し１０分間静置した。 (11)１２０００rpmで５分間遠心分離することにより粒
子をチューブ底部に集め、次いで溶液相をフィルターチ
ップで吸引し、別の新しいチューブに回収した。回収液
量は通常６０〜７０μｌ程度である。
【００２６】実施例３（抽出した核酸溶液の検出） 核酸のサンドイッチハイブリダイゼーション法により、
腸炎ビブリオＴＤＨ遺伝子の検出を行った。
腸炎ビブリオＴＤＨ遺伝子の検出を行った。
【００２７】〔TDH遺伝子検出用捕捉プローブおよび標
識プローブの合成〕捕捉プローブおよび標識プローブ
は、ＤＮＡシンセサイザー３９１型（アプライドバイオ
システムズ社製）を用いて、ホスホアミダイト法により
合成した。捕捉プローブの塩基配列は、5'-CGGTCATTCT
GCTGTGTTCG TAAAAT-3'（配列番号３）、標識プローブの
塩基配列は、5'-CAGGTACTAA AXGGTTCACA TCCTA（配列番
号４）である。標識プローブの配列中Ｘは、５'位にリ
ンカーアームを有するウリジンを示す。これらのプロー
ブは特開平４−２０２９９号公報およびGene 第９３
巻、第９〜１５頁（１９９３年）に開示されたものであ
る。
識プローブの合成〕捕捉プローブおよび標識プローブ
は、ＤＮＡシンセサイザー３９１型（アプライドバイオ
システムズ社製）を用いて、ホスホアミダイト法により
合成した。捕捉プローブの塩基配列は、5'-CGGTCATTCT
GCTGTGTTCG TAAAAT-3'（配列番号３）、標識プローブの
塩基配列は、5'-CAGGTACTAA AXGGTTCACA TCCTA（配列番
号４）である。標識プローブの配列中Ｘは、５'位にリ
ンカーアームを有するウリジンを示す。これらのプロー
ブは特開平４−２０２９９号公報およびGene 第９３
巻、第９〜１５頁（１９９３年）に開示されたものであ
る。
【００２８】［標識プローブの酵素（アルカリフォスフ
ァターゼ）標識〕合成標識プローブと、そのリンカーア
ームを介してのアルカリフォスファターゼとの結合を、
Nucleic Acids Research 第１４巻、第６１５５頁（１
９８６年）に従って行った。
ァターゼ）標識〕合成標識プローブと、そのリンカーア
ームを介してのアルカリフォスファターゼとの結合を、
Nucleic Acids Research 第１４巻、第６１５５頁（１
９８６年）に従って行った。
【００２９】〔捕捉プローブ−固相の調製法〕固相はポ
リスチレン製のマイクロタイタープレート（マイクロラ
イト２、ダイナテック社製）を用い、上記方法で得られ
た捕捉プローブを、マイクロタイタープレートのウェル
に１００μｌずつ分注し、２５℃で一夜インキュベート
し、捕捉プローブをプレートに結合させた後、デオキシ
リボヌクレオチド三リン酸によりブロックを行った。
リスチレン製のマイクロタイタープレート（マイクロラ
イト２、ダイナテック社製）を用い、上記方法で得られ
た捕捉プローブを、マイクロタイタープレートのウェル
に１００μｌずつ分注し、２５℃で一夜インキュベート
し、捕捉プローブをプレートに結合させた後、デオキシ
リボヌクレオチド三リン酸によりブロックを行った。
【００３０】〔サンドイッチハイブリダイゼーション法
による核酸の検出〕以上の方法で調製した試薬および試
料を用いて、核酸溶液の検出を以下に述べる方法で行っ
た。得られた核酸溶液をＮａＯＨ溶液で処理し変性させ
た。そして上記プレートに変性させた試料を２．０μ
ｌ、ハイブリダイゼーション緩衝液を５０．０μｌ、ア
ルカリフォスファターゼ標識プローブ溶液を５０．０μ
ｌ加え、５０℃で３０分間ハイブリダイゼーションを行
った。ウェルから液を除き、１．０％ラウリル硫酸ナト
リウムを含む洗浄液１を２００μｌ加え、５０℃で５分
間洗浄し、次に０．５％ホ゜リエチレンク゛リコール−モノ−ｐ−イソオクチ
ルフェニルエーテルを含む洗浄液２を２００μｌ加え室温で５分
間洗浄、さらに１×ＳＳＣ溶液２００μｌで洗浄した。
そして、アルカリフォスファターゼの基質であるLumiph
os 480（和光純薬社製）を１００μｌ加え、３７℃で
１５分間酵素反応を行った後、発光量をマイクロライト
1000（ダイナテック社製）で測定した。
による核酸の検出〕以上の方法で調製した試薬および試
料を用いて、核酸溶液の検出を以下に述べる方法で行っ
た。得られた核酸溶液をＮａＯＨ溶液で処理し変性させ
た。そして上記プレートに変性させた試料を２．０μ
ｌ、ハイブリダイゼーション緩衝液を５０．０μｌ、ア
ルカリフォスファターゼ標識プローブ溶液を５０．０μ
ｌ加え、５０℃で３０分間ハイブリダイゼーションを行
った。ウェルから液を除き、１．０％ラウリル硫酸ナト
リウムを含む洗浄液１を２００μｌ加え、５０℃で５分
間洗浄し、次に０．５％ホ゜リエチレンク゛リコール−モノ−ｐ−イソオクチ
ルフェニルエーテルを含む洗浄液２を２００μｌ加え室温で５分
間洗浄、さらに１×ＳＳＣ溶液２００μｌで洗浄した。
そして、アルカリフォスファターゼの基質であるLumiph
os 480（和光純薬社製）を１００μｌ加え、３７℃で
１５分間酵素反応を行った後、発光量をマイクロライト
1000（ダイナテック社製）で測定した。
【００３１】比較例１（核酸増幅による核酸回収量の評
価法） 比較例として、従来実施していた核酸増幅による核酸回
収量の評価法を示す。具体的な方法としては、１０3分
子ないし１０5分子の核酸を含む試料を準備し、実施例
２と同様にして核酸抽出を行った。その後、実施例１と
同様にして核酸増幅を行い、次に実施例３と同様に得ら
れた核酸量を評価した。
価法） 比較例として、従来実施していた核酸増幅による核酸回
収量の評価法を示す。具体的な方法としては、１０3分
子ないし１０5分子の核酸を含む試料を準備し、実施例
２と同様にして核酸抽出を行った。その後、実施例１と
同様にして核酸増幅を行い、次に実施例３と同様に得ら
れた核酸量を評価した。
【００３２】比較例２ 本発明において、使用する核酸量が１０14分子よりも多
い分子数では、検出する際に飽和してしまう可能性があ
る。具体的には、実施例２と同様にして核酸抽出を行っ
た際に検出値の差を比較できず、そのため評価法として
は適当でない。また、非常に高濃度の核酸溶液を使用す
ることはコンタミネーションの危険性を増大させ、その
後の評価に影響を及ぼす恐れがある。したがって、本発
明の方法においては、１０6分子ないし１０14分子の範
囲の核酸を含む溶液を用いる必要がある。
い分子数では、検出する際に飽和してしまう可能性があ
る。具体的には、実施例２と同様にして核酸抽出を行っ
た際に検出値の差を比較できず、そのため評価法として
は適当でない。また、非常に高濃度の核酸溶液を使用す
ることはコンタミネーションの危険性を増大させ、その
後の評価に影響を及ぼす恐れがある。したがって、本発
明の方法においては、１０6分子ないし１０14分子の範
囲の核酸を含む溶液を用いる必要がある。
【００３３】実施例４（粒子担体量と核酸回収量との比
較） 本発明による評価法（上記実施例１〜３の方法）と、比
較例１の方法とを比較するために、粒子担体量による核
酸回収量の違いをテストした。ここで粒子担体は、実施
例２中で示した粒子を２５ｍｇ、５０ｍｇおよび１００
ｍｇ使用した。本発明による評価法では、１０8分子な
いし１０10分子の核酸を含む試料を用いた。それ以外の
条件については、すべて実施例１から３および比較例に
基づいて行った。すべての実験は２回繰り返して実施し
た。実施例と比較例の結果を以下の表１に示す。
較） 本発明による評価法（上記実施例１〜３の方法）と、比
較例１の方法とを比較するために、粒子担体量による核
酸回収量の違いをテストした。ここで粒子担体は、実施
例２中で示した粒子を２５ｍｇ、５０ｍｇおよび１００
ｍｇ使用した。本発明による評価法では、１０8分子な
いし１０10分子の核酸を含む試料を用いた。それ以外の
条件については、すべて実施例１から３および比較例に
基づいて行った。すべての実験は２回繰り返して実施し
た。実施例と比較例の結果を以下の表１に示す。
【００３４】
【表１】
【００３５】
【表２】
【００３６】表１および表２から明白なように、本発明
による評価方法は比較例の方法に比べて核酸回収量の差
が明瞭である。すなわち表１においては、粒子量の変化
による核酸回収量の違いが、増幅工程を経ることによる
バラツキ中に吸収され、粒子使用量ごとの核酸回収効率
が不明瞭であるのに対し、表２においては、添加した核
酸量に対し検出した数値が直線的に現れる。そして、粒
子担体量５０ｍｇの時が最も効率が良く、次いで２５ｍ
ｇ、１００ｍｇの順になることが明確である。
による評価方法は比較例の方法に比べて核酸回収量の差
が明瞭である。すなわち表１においては、粒子量の変化
による核酸回収量の違いが、増幅工程を経ることによる
バラツキ中に吸収され、粒子使用量ごとの核酸回収効率
が不明瞭であるのに対し、表２においては、添加した核
酸量に対し検出した数値が直線的に現れる。そして、粒
子担体量５０ｍｇの時が最も効率が良く、次いで２５ｍ
ｇ、１００ｍｇの順になることが明確である。
【００３７】このように本発明の、高濃度の核酸溶液に
よる回収核酸量の直接評価法は、核酸の増幅反応を経る
ことなしに評価を行えるため、定量的な評価が可能であ
る。また、増幅反応を実施する際に生じる、時間や費用
等を必要としないため、短時間かつ低コストな評価が実
施できる。さらに増幅反応に起因するバラツキも回避で
きるため、再現性の高い結果が得られる。
よる回収核酸量の直接評価法は、核酸の増幅反応を経る
ことなしに評価を行えるため、定量的な評価が可能であ
る。また、増幅反応を実施する際に生じる、時間や費用
等を必要としないため、短時間かつ低コストな評価が実
施できる。さらに増幅反応に起因するバラツキも回避で
きるため、再現性の高い結果が得られる。
【００３８】
【発明の効果】本発明の、高濃度の核酸溶液を使用する
ことにより、回収した核酸の回収量を直接的に評価する
方法は、核酸の増幅反応を経ることなしに評価を行える
ため、定量的な評価が可能である。また、増幅反応を実
施する際に生じる、時間や費用等を必要としないため、
短時間かつ低コストな評価が実施できる。さらに増幅反
応に起因するバラツキも回避できるため、再現性の高い
結果が得られるという利点も有する。
ことにより、回収した核酸の回収量を直接的に評価する
方法は、核酸の増幅反応を経ることなしに評価を行える
ため、定量的な評価が可能である。また、増幅反応を実
施する際に生じる、時間や費用等を必要としないため、
短時間かつ低コストな評価が実施できる。さらに増幅反
応に起因するバラツキも回避できるため、再現性の高い
結果が得られるという利点も有する。
【００３９】
【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：24 配列の形：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１..24 特徴を決定した方法：Ｓ 他の特徴：腸炎ビブリオTDH（Thermostable Direct Haemolysin）遺伝子の102番 目から125番目のヌクレオチド配列と相同的な配列を有する。 配列 CCCCGGTTCT GATGAGATAT TGTT 24
【００４０】 配列番号：２ 配列の長さ：51 配列の形：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１..51 特徴を決定した方法：Ｓ 他の特徴：腸炎ビブリオTDH（Thermostable Direct Haemolysin）遺伝子の495番 目から518番目のヌクレオチド配列と相補的な配列を有する。またT7-RNAポリメ ラーゼのプロモーター配列を持つ。 配列 AATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGAGACC AATATATTAC CACTACCACT A 51
【００４１】 配列番号：３ 配列の長さ：26 配列の形：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１..26 特徴を決定した方法：Ｓ 他の特徴：腸炎ビブリオTDH（Thermostable Direct Haemolysin）遺伝子の339番 目から364番目のヌクレオチド配列と相同的な配列を有する。 配列 CGGTCATTCT GCTGTGTTCG TAAAAT 26
【００４２】 配列番号：４ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：1..24 特徴を決定した方法：Ｓ 他の特徴：腸炎ビブリオTDH（Thermostable Direct Haemolysin）遺伝子の254番 目から277番目のヌクレオチド配列と相同的な配列を有する。 配列 CAGGTACTAA AXGGTTGACA TCCT 2 4
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA20 CA01 CA04 CA09 CA11 HA12 HA20 4B063 QA01 QQ42 QQ52 QR32 QR35 QR62 QS14 QS15 QS24 QS25
Claims (24)
- 【請求項１】 核酸を含有すると考えられる試料から核
酸を抽出および単離する方法において、該方法における
核酸回収量を評価するための手段であって、テストあた
り核酸を１０6分子ないし１０14分子の範囲で含む核酸
溶液を使用して回収された核酸を直接的に評価すること
を特徴とする核酸回収量の評価方法。 - 【請求項２】 核酸回収量を評価するための手段が核酸
の増幅反応を経ることなしに行われる請求項１記載の核
酸回収量の評価方法。 - 【請求項３】 あらかじめ核酸増幅反応により核酸の分
子数が増加した核酸溶液を使用することにより核酸の抽
出および単離を行う請求項１または２に記載の核酸回収
量の評価方法。 - 【請求項４】 核酸増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応で
ある請求項３記載の核酸回収量の評価方法。 - 【請求項５】 核酸増幅反応が核酸配列に基づく増幅法
である請求項３記載の核酸回収量の評価方法。 - 【請求項６】 核酸がＤＮＡおよび／またはＲＮＡであ
る請求項１〜５のいずれかに記載の核酸回収量の評価方
法。 - 【請求項７】 核酸を含有すると考えられる材料が生物
材料である請求項１〜６のいずれかに記載の核酸回収量
の評価方法。 - 【請求項８】生物材料が血液、組織、尿、喀痰、胃液、
気管支洗浄液、脳脊髄液、膿汁、咽頭ぬぐい液、糞便よ
りなる群から選ばれた少なくとも１種である請求項７に
記載の核酸回収量の評価方法。 - 【請求項９】 核酸抽出用溶液がカオトロピック物質を
含有する請求項１〜８のいずれかに記載の核酸回収量の
評価方法。 - 【請求項１０】 カオトロピック物質がグアニジン塩、
ヨウ化カリウム、ヨウ化ナトリウム、（イソ）チオシア
ン酸塩、尿素よりなる群から選ばれた少なくとも１種の
物質を含んで成る請求項９記載の核酸回収量の評価方
法。 - 【請求項１１】 カオトロピック物質がグアニジン（イ
ソ）チオシアン酸塩およびグアニジン塩酸塩よりなる群
から選ばれた少なくとも１種である請求項９記載の核酸
回収量の評価方法。 - 【請求項１２】 核酸を含有すると考えられる試料から
核酸を抽出および単離する方法において、核酸以外のも
のを洗浄により除去するに際して、洗浄液として、カオ
トロピック物質を含む第一の洗浄液およびアルコールを
含む第二の洗浄液を使用する請求項１〜１１のいずれか
に記載の核酸回収量の評価方法。 - 【請求項１３】 第一の洗浄液に含まれるカオトロピッ
ク物質が、グアニジンチオシアン酸塩、グアニジン塩酸
塩およびチオシアン酸ナトリウム塩よりなる群から選ば
れた少なくとも１種を含有する請求項１２記載の核酸回
収量の評価方法。 - 【請求項１４】 第二の洗浄液が６０〜１００％濃度の
アルコールが含有されている請求項１２または１３に記
載の核酸回収量の評価方法。 - 【請求項１５】 第二の洗浄液とは異なる濃度のアルコ
ールが含有される第三の洗浄液を使用する請求項１２〜
１４のいずれかに記載の核酸回収量の評価方法。 - 【請求項１６】 ７０％濃度のエタノールを含む第二の
洗浄液および９９％濃度のエタノールを含む第三の洗浄
液を使用する請求項１５記載の核酸回収量の評価方法。 - 【請求項１７】 核酸を含有すると考えられる試料から
核酸を抽出および単離する方法において、シリカを含有
する粒子担体またはその誘導体を担体として用いる請求
項１〜１６のいずれかに記載の核酸回収量の評価方法。 - 【請求項１８】 シリカ含有粒子担体として、磁性を有
する粒子を使用する請求項１７記載の核酸回収量の評価
方法。 - 【請求項１９】 磁性粒子として、超常磁性であり、か
つ酸化鉄を含有する粒子を使用する請求項１７または１
８に記載の核酸回収量の評価方法。 - 【請求項２０】 磁性粒子が１０〜５０％の酸化鉄を含
有する粒子を使用する請求項１７〜１９のいずれかに記
載の核酸回収量の評価方法。 - 【請求項２１】 磁性粒子が１０ｍ2／ｇ以上の外部表
面積を有する粒子を使用する請求項１７〜２０のいずれ
かに記載の核酸回収量の評価方法。 - 【請求項２２】 磁性粒子が１０〜８００ｍ2／ｇの比
表面積を有する粒子を使用する請求項１７〜２１に記載
の核酸回収量の評価方法。 - 【請求項２３】 核酸を検出するための方法であって、
該方法が、 （ａ）テストあたりの核酸量が１０6分子ないし１０14
分子の範囲の高濃度核酸を含んだ材料と、核酸を吸着で
きる担体と、核酸を該担体に吸着させるための核酸抽出
用溶液とを混合する工程、 （ｂ）核酸以外のものを、核酸と担体との複合体より洗
浄することで除去する工程、 （ｃ）核酸と担体との複合体より核酸を溶出し回収する
工程、 （ｄ）得られた核酸を検出する工程、を含むことを特徴
とする、核酸の検出方法。 - 【請求項２４】 高濃度核酸、核酸吸着性担体および核
酸抽出用溶液を含むことを特徴とする核酸回収量の評価
用テストキット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11050648A JP2000245456A (ja) | 1999-02-26 | 1999-02-26 | 核酸回収量の評価方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11050648A JP2000245456A (ja) | 1999-02-26 | 1999-02-26 | 核酸回収量の評価方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000245456A true JP2000245456A (ja) | 2000-09-12 |
Family
ID=12864772
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11050648A Pending JP2000245456A (ja) | 1999-02-26 | 1999-02-26 | 核酸回収量の評価方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000245456A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010193814A (ja) * | 2009-02-26 | 2010-09-09 | Marcom:Kk | 核酸抽出用試薬、核酸抽出用試薬キットおよび核酸抽出方法 |
| CN105242037A (zh) * | 2015-09-09 | 2016-01-13 | 上海市疾病预防控制中心 | 富集tdh致病性副溶血性弧菌免疫磁珠制备方法及应用 |
-
1999
- 1999-02-26 JP JP11050648A patent/JP2000245456A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010193814A (ja) * | 2009-02-26 | 2010-09-09 | Marcom:Kk | 核酸抽出用試薬、核酸抽出用試薬キットおよび核酸抽出方法 |
| CN105242037A (zh) * | 2015-09-09 | 2016-01-13 | 上海市疾病预防控制中心 | 富集tdh致病性副溶血性弧菌免疫磁珠制备方法及应用 |
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