KR100813265B1 - 비평면 형상의 고체 지지체를 이용하여 미생물로부터핵산을 증폭하는 방법 - Google Patents

비평면 형상의 고체 지지체를 이용하여 미생물로부터핵산을 증폭하는 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR100813265B1
KR100813265B1 KR1020060079055A KR20060079055A KR100813265B1 KR 100813265 B1 KR100813265 B1 KR 100813265B1 KR 1020060079055 A KR1020060079055 A KR 1020060079055A KR 20060079055 A KR20060079055 A KR 20060079055A KR 100813265 B1 KR100813265 B1 KR 100813265B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
solid support
nucleic acid
microorganism
sps
amplifying
Prior art date
Application number
KR1020060079055A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20080017208A (ko
Inventor
정성영
황규연
김준호
백상현
Original Assignee
삼성전자주식회사
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 삼성전자주식회사 filed Critical 삼성전자주식회사
Priority to KR1020060079055A priority Critical patent/KR100813265B1/ko
Priority to US11/841,191 priority patent/US20080044880A1/en
Priority to US11/841,089 priority patent/US20080044884A1/en
Priority to US11/841,117 priority patent/US8158411B2/en
Priority to JP2007213969A priority patent/JP2008048735A/ja
Priority to US11/841,069 priority patent/US20080070282A1/en
Priority to US11/841,107 priority patent/US7919278B2/en
Priority to DE602007006908T priority patent/DE602007006908D1/de
Priority to EP07114680.7A priority patent/EP1900807B1/en
Priority to JP2007214954A priority patent/JP4863506B2/ja
Priority to EP07114681.5A priority patent/EP1900808B1/en
Priority to DE602007006731T priority patent/DE602007006731D1/de
Priority to EP07114679A priority patent/EP1892295B1/en
Priority to EP07114674A priority patent/EP1892288B1/en
Priority to EP07114683A priority patent/EP1972688B1/en
Priority to JP2007214950A priority patent/JP5128875B2/ja
Publication of KR20080017208A publication Critical patent/KR20080017208A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100813265B1 publication Critical patent/KR100813265B1/ko
Priority to US13/325,980 priority patent/US8557564B2/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 비평면 형상의 고체 지지체와, 미생물을 포함하는 혈액 배양물을 pH 3.0 내지 6.0의 범위에서 접촉시켜 상기 미생물을 상기 고체 지지체에 부착시키는 단계, 상기 고체 지지체에 부착되지 않은 물질을 세척하여 제거하는 단계, 및 상기 고체 지지체에 부착된 상기 미생물에 대하여 PCR을 수행하여 핵산을 증폭하는 단계를 포함하는, 미생물로부터 핵산을 증폭하는 방법으로서, 상기 접촉단계, 세척 단계, 및 증폭 단계는 동일한 용기 내에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
비평면 형상, 고체 지지체, 핵산, 증폭

Description

비평면 형상의 고체 지지체를 이용하여 미생물로부터 핵산을 증폭하는 방법{A method of amplifying a nucleic acid from a microorgansim using a nonplanar solid substrate}
도 1과 2는 SPS를 포함하는 용액을 고체 지지체를 포함하는 유동 장치 내로 흘려주고, 상기 유동장치 통과 전 (도 1)과 후 (도 2)에 상기 용액에 대하여 분광분석한 결과를 나타내는 도면이다.
도 3은 SPS를 포함하는 혈액 배양물과 SPS를 포함하지 않은 혈액 배양물을, 본 발명의 고체 지지체를 포함하는 유동장치를 이용하여 대장균 세포를 분리 및 파쇄하고, 그 파쇄물 중의 DNA를 주형으로 하여 PCR한 결과로서, 실시간으로 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 4는 SPS를 포함하는 혈액 배양물과 SPS를 포함하지 않은 혈액 배양물을, 본 발명의 고체 지지체를 포함하는 유동장치를 이용하여 대장균 세포를 분리 및 파쇄하고, 그 파쇄물 중의 DNA를 주형으로 하여 PCR한 결과로서, PCR 완료 후 증폭 산물을 전기영동한 결과를 나타내는 도면이다.
도 5는 SPS를 포함하거나 포함하지 않는 다양한 DNA 시료를 주형으로 하여 PCR하고, 그 증폭 산물을 전기영동한 결과를 나타내는 도면이다.
본 발명은 비평면 형상의 고체 지지체를 이용하여 미생물로부터 핵산을 증폭하는 방법에 관한 것이다.
종래 미생물로부터 핵산을 증폭하는 방법은 미생물 분리, 핵산 분리 및 핵산 증폭 단계가 별도로 독립된 단계로 이루어진다. 미생물의 분리는 원심분리 및 여과법이 사용되어 왔다.
핵산분리 방법으로, 예를 들면 고상 물질을 이용한 핵산의 정제 방법이 알려져 있었다. 예를 들면, 미국특허 제5,234,809호에는 핵산에 결합하는 고상물질을 이용한 핵산의 정제 방법이 개시되어 있다. 그러나, 상기 방법은 시간이 오래 소요되기 때문에 복잡하며, 랩온어 칩에 부적합하다. 또한, 상기 방법은 반드시 카오트로픽 물질을 사용하여야 하는 문제점이 있었다. 즉, 상기 카오트로픽 물질을 사용하지 않는 경우에는 고상 물질에 핵산이 결합하지 않는다.
또한, 미국특허 제6,291,166호에는 고상 매트릭스를 이용한 핵산의 집적 (archiving) 방법이 개시되어 있다. 상기 방법은 핵산이 고상 매트릭스에 비가역적으로 결합하기 때문에, 상기 핵산 고상 매트릭스 복합체를 보관한 후 나중에 분석 (delayed analysis)하거나 반복 분석 (repeated analysis)하는 것이 가능하다는 장점이 있다. 그러나, 이 방법에 의하면, 알루미나와 같은 표면에 양전하를 띠는 물질을 NaOH와 같은 염기성 물질로 활성화하여야 하고, 핵산은 이렇게 활성화된 알루미나에는 비가역적으로 결합하기 때문에 알루미나로부터 분리할 수 없게 된다.
미국 특허 제5,705,628호에는 DNA를 포함하는 용액을 염 및 폴리에틸렌 글리콜과 혼합하여 카르복실기로 코팅된 표면을 갖는 자성 마이크로입자를 결합시켜 가역적 및 비특이적으로 DNA를 결합시키는 방법이 기재되어 있다. 상기 방법은 DNA를 분리하기 위해 카르복실기 표면을 갖는 자성 입자, 염 및 폴리에틸렌 글리콜을 이용하고 있다.
상기한 바와 같은, 기존의 핵산의 분리 및 정제 방법은 핵산을 결합시키기 위해 별도로 고농도의 시약을 첨가해야 하는데 이는 PCR과 같은 후속 공정에 영향을 줄 수 있으며, 또한 랩온어칩 (LOC) 상에 적용하기 힘들다는 문제점이 있었다. 또한, 종래의 핵산 분리 및 정제 방법은 미생물의 정제 또는 농축과는 별개의 독립된 단계로서 구성되어 있으며, 상기 미생물을 분리하는 단계와 상기 미생물로부터 핵산을 증폭하는 단계가 하나의 용기 내에서 수행되는 방법은 알려진 바 없다.
따라서, 기판과 같은 고체 표면상에 미생물을 부착시켜 미생물을 분리 또는 농축할 수 있는 동시에, 핵산에 대한 친화성이 높아 상기 미생물로부터 유래하는 핵산을 정제 또는 농축할 수 있는 고체 지지체를 이용한, 미생물로부터 핵산을 증폭하는 방법이 요구되고 있었다.
또한, 종래 혈액 중의 미생물을 검출하는 방법에 있어서, 상기 미생물의 농도는 아주 낮은 경우가 많아 직접적으로 상기 미생물을 검출할 수 없는 경우가 많다. 이를 해결하기 위한 방법으로, 상기 혈액을 배양하여 상기 미생물을 증식시키는 방법이 이용되어 왔다. 상기 혈액 배양에는 일반적으로 소듐 폴리아네톨 술포네이트 (sodium polyanethol sulfonate: 이하 SPS라고도 함)가 포함된 배지가 사용되 어 있고 있다 (예를 들면, Blood Culture Bottle (BC). http://www.hylabs.co.il/SiteFiles/1/36/180.asp). 소듐 폴리아네톨 술포네이트는 혈액 배양에서 박테리아 세포의 생존을 위하여 사용되는 폴리 음이온 항응고제이다, SPS는 핵산의 염기와 유사한 구조를 가지고 있어, 인터칼레이터로서 작용하여, PCR을 저해하는 것으로 알려져 있다. 또한, 상기 SPS는 상업적으로 알려진 핵산 분리 키트 (예를 들면, QIAgen 키트)에 의하여 제거되지 않는 것으로 알려져 있다. 따라서, 종래 SPS를 포함하는 시료, 예를 들면 SPS를 포함하는 혈액 배양물로부터 PCR을 통하여 핵산을 증폭하고자 하는 경우, 상기 시료를 높은 약 5,000 배 이상으로 희석한다. 또는, 종래 상업적으로 구입가능한 핵산 분리 키트를 이용하여 분리된 핵산으로부터 별도의 SPS 제거 과정을 거쳐야 하는 문제점이 있었다.
본 발명의 목적은 비평면 형상의 표면을 갖는 고체 지지체를 이용하여 SPS를 포함하는 미생물 시료로부터 핵산을 증폭하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 비평면 형상의 고체 지지체와, 미생물을 포함하는 혈액 배양물을 pH 3.0 내지 6.0의 범위에서 접촉시켜 상기 미생물을 상기 고체 지지체에 부착시키는 단계,
상기 고체 지지체에 부착되지 않은 물질을 세척하여 제거하는 단계, 및
상기 고체 지지체에 부착된 상기 미생물에 대하여 PCR을 수행하여 핵산을 증폭하는 단계를 포함하는, 미생물로부터 핵산을 증폭하는 방법으로서,
상기 접촉단계, 세척 단계, 및 증폭 단계는 동일한 용기 내에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
본 발명의 미생물로부터 핵산을 증폭하는 방법은, 비평면 형상의 고체 지지체와, 미생물을 포함하는 시료를 pH 3.0 내지 6.0의 범위에서 접촉시켜 상기 미생물을 상기 고체 지지체에 부착시키는 단계를 포함한다. 상기 접촉에 의하여 상기 미생물은 상기 고체 지지체에 부착하게 된다.
본 명세서에 있어서, "핵산"에는 DNA, RNA 및 PNA가 포함되며, 바람직하게는 DNA이다.
고체 지지체가 포함되어 있는 액체 매질 중에서, 미생물은 액체 매질 중에 존재하거나 고체 지지체에 부착할 수 있다. 이러한 액체 매질과 고체 지지체 사이의 분포는, 액체 매질의 표면 장력과 박테리아의 표면 장력의 차이에 의하여 결정되는 것으로 알려져 있다. 즉, 액체 매질의 표면 장력이 박테리아의 표면 장력보다 큰 경우, 상기 박테리아는 표면장력이 작은 고체 지지체, 즉 소수성 고체 지지체에 더 잘 부착하고, 박테리아의 표면 장력이 액체 매질의 표면 장력보다 큰 경우, 상기 박테리아는 표면장력이 큰 고체 지지체, 즉 친수성 고체 지지체에 더 잘 부착하고, 박테리아의 표면 장력이 액체 매질의 표면 장력과 동일한 경우에는, 박테리아 세포의 고체 지지체 부착에는 표면 장력의 영향이 없고 정전기적 상호작용과 같은 다른 상호작용이 영향을 미치는 것으로 보고된 바 있다 (Applied and Environmental Microbiology, July 1983, p.90-97). 또한, 상기의 표면 장력에 근거한 열역학적 접근을 통하여, 박테리아 세포가 부착할 뿐만 아니라 정전기적 인력 특성을 통하여서도 박테리아 세포가 표면에 부착할 수 있다는 것도 알려져 있다. 그러나, 이러한 현상들은 그 부착 속도가 매우 느리다는 문제점이 있었다.
이에 본 발명자들은 상기한 바와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하고자, 비평면 형상의 고체 지지체를 사용하는 동시에, 미생물을 포함하는 시료를 pH 3.0 내지 6.0의 범위에서 상기 고체 지지체와 접촉시킴으로써, 높은 수율로 미생물을 분리할 수 있음을 확인하였다. 이는 고체 지지체의 표면적이 증가하는 동시에, pH 3.0 내지 6.0의 액체 매질을 사용함으로써 미생물의 세포막이 변성되어 용액에 대한 용해도가 저하되어 고체 표면에 부착하는 비율이 상대적으로 높아지는 것으로 여겨지나, 본 발명의 범위가 이러한 특정한 기작에 한정되는 것은 아니다.
상기 접촉 단계에 있어서, 상기 시료는 상기 시료는 소듐 폴리아네톨 술포네이트 (sodium polyanethol sulfonate: 이하 SPS라고도 함)를 포함하는 생물학적 시료일 수 있다. 본 발명에 있어서, "생물학적 시료 (biological sample)"란 개체로부터 분리된 세포 또는 생물학적 액체와 같은, 세포 또는 조직물을 포함하거나 그들로 구성된 시료를 의미한다. 상기 개체는 사람을 포함한 동물일 수 있다. 생물학적 시료의 예에는, 타액, 가래, 혈액, 혈액 세포 (예, 백혈구, 적혈구), 혈액 배양물, 양막액, 혈청, 정액, 골수, 조직 또는 미세 바늘 생검 시료, 뇨, 복막액, 늑막액 및 세포 배양물이 포함된다. 생물학적 시료에는 조직학적 목적을 위하여 취하여진 냉동 절편과 같은 조직 절편이 포함된다. 바람직하게는, 상기 생물학적 시료는, 인간 환자로부터 유래된 시료인 "임상 시료 (clinical sample)"이고, 더욱 바람직하게는, 상기 시료는 혈액, 뇨, 타액, 또는 가래이다.
소듐 폴리아네톨 술포네이트 (sodium polyanethol sulfonate: 이하 SPS라고도 함)는 혈액 배양에서 박테리아 세포의 생존을 위하여 사용되는 폴리 음이온 항응고제이다, SPS는 핵산의 염기와 유사한 구조를 가지고 있어, 인터칼레이터로서 작용하여, PCR을 저해하는 것으로 알려져 있다. 또한, 상기 SPS는 상업적으로 알려진 핵산 분리 키트 (예를 들면, QIAgen 키트)에 의하여 제거되지 않는 것으로 알려져 있다.
본 발명에 있어서, 분리의 대상이 되는 미생물에는 박테리아 세포, 곰팡이 및 바이러스가 포함된다.
상기 접촉 단계에 있어서, 상기 시료는 상기 미생물을 낮은 pH에서 완충 역할을 할 수 있는 용액 또는 버퍼에 의하여 희석될 수 있다. 바람직하게는, 상기 버퍼는 포스페이트 버퍼 (예, 소듐 포스페이트, pH 3.0 내지 6.0) 또는 아세테이트 버퍼 (소듐 아세테이트, pH 3.0 내지 6.0)로 희석된 것일 수 있다. 상기 희석의 정도는 특별히 한정되지는 않으나, 바람직하게는, 1:1 내지 1:1,000의 배율, 더욱 바람직하게는, 1:1 내지 1:10의 배율로 희석되는 것일 수 있다.
상기 접촉 단계에 있어서, 상기 시료는 10 mM 내지 500 mM, 바람직하게는, 50 mM 내지 300 mM의 염 농도를 갖는 것이다. 상기 시료는, 10 mM 내지 500 mM, 바람직하게는, 50 mM 내지 300 mM의 아세테이트 및 포스페이트로 구성된 군으로부터 선택된 이온 농도를 갖는 것이다
상기 접촉 단계에 있어서, 상기 고체 지지체는 비평면 형상을 가지고 있어, 표면적이 평면에 비하여 증가되어 있는 표면을 갖는 것이다. 상기 고체 지지체는 표면에 요철 구조가 형성되어 있는 것일 수 있다. 본 발명에 있어서, "요철 구조"란 표면이 부드럽지 않고 오목함과 볼록함이 있는 구조를 말한다. 이러한 요철 구조에는 복수 개의 기둥이 형성되어 있는 기둥 구조를 갖는 표면 또는 복수 개의 공극 (pore)이 형성되어 있는 망상 구조를 갖는 표면이 포함되나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
상기 접촉 단계에 있어서, 상기 비평면 형상의 고체 지지체는 임의의 형상을 가질 수 있다. 예를 들면, 표면에 복수 개의 기둥 (pillar)이 형성되어 있는 기둥 구조를 갖는 고체 지지체, 비드 형상을 갖는 고체 지지체, 및 표면에 복수 개의 공극 (pore)이 형성되어 있는 체 (sieve) 구조를 갖는 고체 지지체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 있다. 상기 고제 지지체는, 단독으로 또는 복수 개의 상기 고체 지지체의 집합 (예를 들면, 관 또는 용기 내에 충진된 집합체)으로 사용될 수 있다.
상기 접촉 단계에 있어서, 상기 고체 지지체는 미세유동장치 내의 마이크로채널 또는 마이크로챔버의 내벽의 형태인 것일 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 하나 이상의 입구 및 출구가 구비되어 있고, 상기 입구 및 출구가 채널 또는 마이크로채널을 통하여 연통되어 있는 유동 장치 (fluidic device) 또는 미세유동장치 (microfluidic device) 내에서 수행될 수 있다.
본 발명의 방법의 제1 구체예는, 본 발명의 방법에 있어서 상기 접촉 단계에 있어서, 상기 고체 지지체는 그 표면에 복수 개의 기둥이 형성되어 있는 기둥 구조를 갖는 것일 수 있다. 고체 지지체 상에 기둥 (pillar)을 제조하는 것은 당업계에 널리 알려져 있다. 예를 들면, 반도체 제조 공정에 사용되는 포토리소그래피 공정 등을 사용하여 미세 기둥을 높은 밀도로 형성시킬 수 있다. 상기 기둥은 어스팩 비 (aspect ratio)가 1:1 내지 20:1인 것이 바람직하나, 상기 범위에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, "어스팩 비 (aspect ratio)" 란 기둥의 단편 직경 대 높이의 비율을 의미한다. 상기 기둥 구조는 기둥 높이 대 기둥 사이의 거리의 비율이 1:1 내지 25:1인 것일 수 있다. 상기 기둥 구조는 기둥 사이의 거리가 5 ㎛ 내지 100 ㎛의 범위를 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서 상기 접촉 단계에 있어서, 상기 비평면 형상의 고체 지지체는 물 접촉각이 70°내지 95°인 소수성을 갖는 것일 수 있다. 상기 물 접촉각이 70°내지 95°인 소수성은 고체 지지체의 표면을 옥타데실디메틸(3-트리메톡시실릴 프로필)암모늄 (OTC) 및 트리데카플루오로테트라히드로옥틸트리메톡시실란 (DFS)으로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물이 코팅되어, 부여되는 것일 수 있다. 상기 물 접촉각이 70°내지 95°인 표면은 바람직하게는, 고체 지지체의 SiO2 층에 옥타데실디메틸(3-트리메톡시실릴 프로필)암모늄 (OTC) 및 트리데카플루오로테트라히드로옥틸트리메톡시실란 (DFS)으로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물이 자가조립단분자 (SAM) 코팅되어 있는 것일 수 있다.
본 발명의 방법에서, 상기 접촉 단계에 있어서, 상기 비평면 형상의 고체 지지체는 표면에 아민계의 관능기를 하나 이상 갖는 것일 수 있다. 상기 아민계의 관능기를 하나 이상 갖는 표면은 상기 고체 지지체의 표면에 폴리에틸렌이민트리메톡 시실란 (PEIM)이 코팅되어 있는 것일 수 있다. 상기 코팅된 표면은 바람직하게는, 고체 지지체의 SiO2 층에 폴리에틸렌이민트리메톡시실란 (PEIM)이 자기조립단분자 (SAM) 코팅되어 있는 것일 수 있다. 상기 아민계의 관능기는 pH 3.0 내지 6.0의 범위에서 양전하를 띤다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 접촉 단계에 있어서, 상기 고제 지지체는 상기한 바와 같은 물 접촉각 특성을 갖는 것 또는 그 표면에 하나 이상의 아민계 관능기를 갖는 것이면 어떠한 재질의 지지체도 포함된다. 예를 들면, 유리, 실리콘 웨이퍼, 및 플라스틱 물질 등이 포함되나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 상기 물 접촉각이 70°내지 95°인 표면 또는 그 표면에 하나 이상의 아민계 관능기를 갖는 표면은, 상기 표면을 가진 고체 지지체에 미생물을 포함하는 시료가 접촉되는 경우, 미생물이 부착하는 것으로 여겨지나, 본 발명이 특정한 기작에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 방법은, 상기 접촉 단계 후에 상기 고체 지지체에 부착되지 않은 물질을 세척하여 제거하는 단계를 포함한다. 상기 세척에는 상기 고체 지지체 표면에 부착된 목적 미생물은 상기 고체 지지체로부터 이탈시키지 않으면서, 후속 공정에 악영향을 미칠 수 있는 불순물 등을 제거할 수 있는 임의의 용액이 사용될 수 있다. 예를 들면, 결합 버퍼로 사용된 아세테이트 버퍼 및 포스페이트 버퍼 등이 사용될 수 있다. 상기 세척 용액은 바람직하게는, pH 3.0 내지 6.0의 범위에 포함되는 pH를 갖는 버퍼이다.
본 발명의 방법은 또한, 상기 고체 지지체에 부착된 상기 미생물에 대하여 PCR을 수행하여 핵산을 증폭하는 단계를 포함한다.
상기 증폭 단계에 있어서, 상기 핵산 증폭에는 당업계에 알려진 임의의 증폭 방법이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 PCR에 의하여 수행되는 것이다. "PCR"이란 중합효소 연쇄반응을 의미하는 것으로, 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. PCR에는 일반적으로 주형, 프라이머, DNA 중합효소, DNA 단량체로서 4가지 종류의 dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) 및 버퍼가 포함된다. 본 발명의 증폭 단계에서는, 상기 주형 DNA는, PCR 중의 열순환 (thermal cycling)에 의하여 상기 고체 지지체 중에 부착된 미생물로부터 노출되는 핵산이 사용된다. 따라서, 상기 PCR은 예를 들면, 상기 주형 DNA를 제외한 PCR 반응 성분을 상기 미생물이 부착된 고체 지지체가 포함되어 있는 용기에 첨가하고, PCR을 수행함으로써 표적 핵산을 증폭할 수 있다. 상기 PCR을 위한 열 순환 중에서 세포가 파쇄되는 단계는, 전 변성 및/또는 변성 단계로 여겨지나, 본 발명이 특정한 기작에 한정되는 것은 아니다. 따라서, 상기 증폭 단계에 있어서, 상기 주형 DNA는 별도의 분리과정을 거치지 않고, 상기 고체 지지체에 부착된 미생물 중에 포함되어 있는 상태로서 PCR 반응에 사용된다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 접촉단계, 세척 단계, 및 증폭 단계는 동일한 용기 내에서 수행된다. 상기 용기는 예를 들면, 마이크로채널, 마이크로챔버 및 튜브 등이 될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 미세유동장치에 형성되어 있는, 마이크로챔버로서, PCR 장치가 구비되어 있는 것이다. 상 기 PCR 장치는 히터, 냉각기 및 온도 조절기를 포함하는 것이다. 따라서, 본 발명의 방법은, 상기 핵산 추출이 마이크로챔버에서 수행되고, 상기 핵산 증폭이 동일한 상기 마이크로챔버에서 수행되는 것일 수 있다.
실시예
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 기둥 구조를 갖는 고체 지지체에 소듐 폴리아네톨 술포네이트가 결합하는지 여부의 확인
본 실시예에서는 입구와 출구가 구비되어 있고, 크기 7.5 mm x 15 mm인 칩 (칩 1) 및 10 mm x 23 mm인 칩 (칩 2) 상에 기둥의 어레이가 형성되어 있는 고체 지지체를 포함하는 챔버를 갖는 유동 장치에 소듐 폴리아네톨 술포네이트 (sodium polyanethol sulfonate : SPS)를 포함하는 용액을 흘려주였다. 상기 용액에 대하여, 상기 유동 장치 통과 전 후에 분광 분석을 수행하여, SPS가 고체 지지체에 부착하는지를 확인하였다.
상기 기둥 어레이에 있어서, 기둥 사이의 거리가 15 ㎛이고, 기둥 높이가 100 ㎛이고, 각 기둥의 단면은 한 변의 길이가 25 ㎛이 정사각형이다. 상기 기둥 어레이가 형성된 영역의 표면은 Si02 층으로 되어 있다.
상기 SPS를 포함하는 용액은 혈액 배양 배지 용액 중 0.05% SPS 용액을 사용 하였다. 상기 시료를 입구로 주입하여 상기 챔버를 통하여 출구로 흘러나가도록 하였다. 유속은 200 ㎕/분이었으며, 500 ㎕를 흘려보냈다.
도 1과 2는 SPS를 포함하는 용액을 고체 지지체를 포함하는 유동 장치 내로 흘려주고, 상기 유동장치 통과 전 (도 1)과 후 (도 2)에 상기 용액에 대하여 분광분석한 결과를 나타내는 도면이다. 도 1과 2에 나타낸 바와 같이, 상기 유동장치 통과 전후의 분광곡선은 거의 동일하였다. 이는 상기 SPS는 본 실시예에 사용된 고체 지지체에는 전혀 부착하지 않는다는 것을 나타낸다. 상기 칩 1과 2에서, 비슷한 결과가 관찰되었으며, 도 1과 2는 상기 칩 1을 사용한 실험한 결과이다.
실시예 2 : 기둥 구조를 갖는 고체 지지체를 이용한 혈액 배양물로부터 핵산의 증폭 : SPS 의 영향
본 실시예에서는 입구와 출구가 구비되어 있고, 크기 10 mm x 23 mm인 칩 상에 기둥의 어레이가 형성되어 있는 고체 지지체를 포함하는 챔버를 갖는 유동 장치에 대장균과 SPS를 포함하는 혈액 배양물 흘려주어, 대장균 세포를 상기 고체 지지체에 부착시켰다. 다음으로, 상기 고체 지지체를 세척하여 상기 고체 지지체에 부착되지 않은 물질을 제거하고, 상기 고체 지지체에 부착되어 있는 세포를 용액 중에서 열에 의하여 파쇄하였다. 다음으로, 상기 파쇄물 중의 DNA를 주형으로 PCR을 수행하였다.
상기 기둥 어레이에 있어서, 기둥 사이의 거리가 15 ㎛이고, 기둥 높이가 100 ㎛이고, 각 기둥의 단면은 한 변의 길이가 25 ㎛이 정사각형이다. 상기 기둥 어레이가 형성된 영역의 표면은 Si02 층으로 되어 있다.
상기 유동장치에 흘려진 혈액 배양물 시료는, 0.01 OD의 대장균을 포함하는 SPS가 포함되어 있는 혈액 배양물을 100 mM 소듐 아세테이트 버퍼 (pH 3.0)과 1:1로 혼합하여 얻어진 시료 (pH 4.7)이었다. 상기 혈액 배양물은 SPS를 0.05% 및 혈액 10 %를 포함하는 BHI 배지에 특정한 농도의 대장균을 첨가하여, 혈액 배양물과 유사하게 한 것을 사용하였다. 상기 대장균은 실험을 위하여, 설정된 농도로 첨가하였다. 대조군으로는, SPS를 포함하지 않은 일반 혈액 배양물을 사용한 것을 제외하고, 동일하게 실험하였다. 상기 일반 혈액 배양물은 SPS 및 혈액을 포함하지 않은 BHI 배지를 사용하였다.
상기 혈액 배양물 시료를 입구로 주입하여 상기 챔버를 통하여 출구로 흘러나가도록 하였다. 유속은 200 ㎕/분이었으며, 500 ㎕를 흘려보냈다. 다음으로, 아세테이트 버퍼 (pH 4.0)를 입구로 주입하여 상기 챔버를 통하여 출구로 흘러나가도록 하였다. 유속은 500 ㎕/분이었으며, 500 ㎕를 흘려보냈다. 그런 다음, 상기 유동 장치를 원심분리하여 챔버에 남아 있는 용액을 제거하고, PCR 반응 용액 3.5 ㎕를 주입하였다. 상기 PCR 반응 용액은, 총 부피 3.5 ㎕에 1x PCR 버퍼, 200 μM dNTP, 각 프라이머 200 nM, MgCl2 2.5 mM, BSA 1 mg, 5% PEG, 400 nM Taqman probe (서열번호 3), 및 0.1 유니트의 Taq 폴리머라제를 포함하는 PCR 반응용액을 상기 챔버에 첨가하였다. 상기 프라이머는 각각 서열번호 1과 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것이다.
상기 챔버를 포함하는 유동장치를 TMC-1000 (삼성테크원, 한국)에 장착하고, 95℃에서 10초 및 65℃에서 10초을 3회 반복하여, 대장균 세포를 열에 의하여 파쇄시켰다. 본 실시예에서 사용된 상기 유동 장치는, TMC-1000에 모듈의 형태로 장착되어, PCR 반응이 수행될 수 있도록 되어 있는 것이다.
상기 세포 파쇄 단계 후, PCR을 위한 열 순환을 수행하였다. 열순환 조건은 다음과 같다. 95℃에서 1분 동안 전 변성시키고, 변성 94℃에서 5초, 어닐링 45℃에서 20초 및 연장 72℃에서 20초를 40회 반복하였다.
PCR 중 증폭된 핵산의 농도는 Tagman probe를 검출함으로써, 확인하였다. 도 3은 SPS를 포함하는 혈액 배양물 (곡선 3과 4)과 SPS를 포함하지 않은 혈액 배양물(곡선 1과 2)을, 본 발명의 고체 지지체를 포함하는 유동장치를 이용하여 대장균 세포를 분리 및 파쇄하고, 그 파쇄물 중의 DNA를 주형으로 하여 PCR한 결과로서, 실시간으로 측정한 결과를 나타내는 도면이다. 도 3에서, 곡선 1과 2, 곡선 3과 4는 각각 2반복 실험을 나타내며, 수직 점선은 Ct 값을 나타내는 것으로, Ct 값 1과 2는 곡선 1과 2에 대한 Ct 값이고, Ct 값 3과 4는 곡선 3과 4에 대한 Ct 값이다. 도 4는 SPS를 포함하는 혈액 배양물 (레인 3과 4)과 SPS를 포함하지 않은 혈액 배양물 (레인 1과 2)을, 본 발명의 고체 지지체를 포함하는 유동장치를 이용하여 대장균 세포를 분리 및 파쇄하고, 그 파쇄물 중의 DNA를 주형으로 하여 PCR한 결과로서, PCR 완료 후 증폭 산물을 전기영동한 결과를 나타내는 도면이다. 도 4에서 레인 1은 DNA 래더이며, 표적산물의 추정 크기는 90bp이다. 도 3과 4에 나타낸 바와 같이, SPS를 포함하고 있는 혈액 배양물을 시료로 한 경우에도, 그렇지 않은 시료에 비하여 유사한 농도로 표적 핵산이 증폭되었다. 이는 본 발명의 방법에 의하여, SPS를 포함하는 시료로부터, 별도의 SPS 제거 단계를 거치지 않고서도, 표적 핵산을 증폭할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 3 : 기둥 구조를 갖는 고체 지지체를 이용한 SPS 를 포함한 시료로부 터 핵산 증폭 : SPS 의 영향
본 실시예에서는 입구와 출구가 구비되어 있고, 크기 10 mm x 23 mm인 칩 상에 기둥의 어레이가 형성되어 있는 고체 지지체를 포함하는 챔버를 갖는 유동 장치에 대장균과 SPS를 포함하는 혈액 배양물 흘려주어, 대장균 세포를 상기 고체 지지체에 부착시켰다. 다음으로, 상기 고체 지지체를 세척하여 상기 고체 지지체에 부착되지 않은 물질을 제거하고, 상기 고체 지지체에 부착되어 있는 세포를 용액 중에서 알칼리 및 열에 의하여 파쇄하였다. 다음으로, 상기 파쇄물 중의 DNA를 주형으로 PCR을 수행하였다.
상기 기둥 어레이에 있어서, 기둥 사이의 거리가 15 ㎛이고, 기둥 높이가 100 ㎛이고, 각 기둥의 단면은 한 변의 길이가 25 ㎛이 정사각형이다. 상기 기둥 어레이가 형성된 영역의 표면은 Si02 층으로 되어 있다.
상기 유동장치에 흘려진 혈액 배양물 시료는, 0.01 OD의 대장균을 포함하는 SPS가 포함되어 있는 혈액 배양물을 100 mM 소듐 아세테이트 버퍼 (pH 3.0)과 1:1로 혼합하여 얻어진 시료 (pH 4.7)이었다. 상기 혈액 배양물은 SPS를 0.05% 및 혈액 10 %를 포함하는 BHI 배지에 대장균을 첨가하여 혈액 배양물과 유사하게 하여 사용하였다. 상기 대장균은 실험을 위하여, 설정된 농도로 첨가하였다. 대조군1로는, SPS를 포함하지 않은 일반 혈액 배양물을 사용한 것을 제외하고, 동일하게 실험하였다. 상기 일반 혈액 배양물은 SPS 및 혈액을 포함하지 않은 BHI 배지이다.
상기 혈액 배양물 시료를 입구로 주입하여 상기 챔버를 통하여 출구로 흘러나가도록 하였다. 유속은 200 ㎕/분이었으며, 500 ㎕를 흘려보냈다. 다음으로, 아세테이트 버퍼 (pH 4.0)를 입구로 주입하여 상기 챔버를 통하여 출구로 흘러나가도록 하였다. 유속은 500 ㎕/분이었으며, 500 ㎕를 흘려보냈다. 그런 다음, 상기 유동 장치를 원심분리하여 챔버에 남아 있는 용액을 제거하고, 0.01 N NaOH 용액을 주입한 후 95℃에서 5분 동안 방치하여 대장균 세포를 파쇄하였다. 상기 유동장치를 원심분리하여 대장균 파쇄물 2 ml를 얻었다. 비교 실험 3 및 4로서, 상기 0.05% SPS 및 10% 혈액 및 0.005 OD600 대장균을 포함하는 배지 및 상기 0.05% SPS 및 10% 혈액을 포함하지 않고 0.005 OD600 대장균을 포함한 배양배지를 QiAgen mini kit를 이용하여 DNA를 분리하여, 최종 50㎕의 DNA 용액을 얻었다. 또한, 비교 실험 1과 2로서, DNA 5ng/㎕ 용액 및 0.05 %SPS와 DNA를 포함하는 용액을 사용하였고, 비교 실험 5 및 6으로서, 상기 0.05% SPS 및 10% 혈액 및 0.005 OD600 대장균을 포함하는 배지, 및 상기 0.05% SPS 및 10% 혈액 및 0.005 OD600 대장균을 포함하지 않은 배지를 핵산 분리과정을 거치지 않고, 직접적으로 PCR하였다.
PCR을 위하여, 먼저 총 부피 50 ㎕의 1x PCR 버퍼 중에서 200 μM dNTP, 각 프라이머 200 nM, MgCl2 2.5 mM, 상기 각 주형 1㎕, 및 2.5 유니트의 Taq 폴리머라제를 포함하는 PCR 반응용액을 PCT 튜브에 첨가하였다 . 상기 프라이머는 각각 서열번호 1과 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것이다. PCR을 위한 열 순환을 수행하였다. 열순환 조건은 다음과 같다. 95℃에서 1분 동안 전 변성시키고, 변성 95℃에서 5초, 어닐링 62℃에서 13초 및 연장 72℃에서 15초를 25회 반복하였다.
도 5는 SPS를 포함하거나 포함하지 않는 다양한 DNA 시료를 주형으로 하여 PCR하고, 그 증폭 산물을 전기영동한 결과를 나타내는 도면이다. 도 5에서, 레인 1: DNA (비교 실험 1), 2: DNA + 0.05% SPS (비교 실험 2), 3: 0.05% SPS 및 10% 혈액 및 0.005 OD600 대장균을 포함하는 배양 배지를 QIAgen mini kit를 사용하여 핵산을 분리한 시료를 사용하여 PCR한 결과 (비교 실험 3), 4: 0.05% SPS 및 10 % 혈액을 포함하지 않고 0.005 OD600 대장균을 포함한 배양 배지를 QIAgen mini kit를 사용하여 핵산을 분리한 시료를 사용하여 PCR 결과 (비교 실험 4), 5: 0.05% SPS 및 10% 혈액 및 0.005 OD600 대장균을 포함하는 배양 배지를 본 발명의 고체 지지체를 포함하는 유동장치에 통과시키고, 대장균을 파쇄하고 용출한 시료를 사용하여 PCR 한 결과 (실험군), 6: SPS 및 혈액을 포함하지 않고 0.005 OD600 대장균을 포함한 배양 배지를 본 발명의 고체 지지체를 포함하는 유동장치에 통과시키고, 대장균을 파쇄하고 용출한 시료를 PCR 한 결과 (대조군 1), 7: 0.05% SPS 및 10% 혈액 및 0.005 OD600 대장균을 포함하는 배양 배지를 직접적 PCR한 결과 (비교 실험 5), 8: 0.05% SPS 및 10% 혈액 및 0.005 OD600 대장균을 포함하지 않은 배양 배지를 직접적 PCR한 결과, 9: 음성대조군 (표적 DNA 없음). 도 5에 나타낸 바와 같이, SPS는 PCR 저해제임을 알 수 있다 (레인 2). 그러나, 본 발명의 고체 지지체를 이용하여 대장균을 분리하는 경우에는, 핵산 증폭이 효율적으로 이루어졌다. 이는 본 발명의 고체 지지체를 이용하여 대장균을 분리하는 과정에서, SPS는 상기 고체 지지체에 부착되지 않아 제거된다는 것을 나타낸다.
본 발명에 따른 미생물로부터 핵산을 증폭하는 방법에 의하면, 하나의 용기에서 미생물 분리, 세포 파쇄 및 핵산 증폭이 수행됨으로써, 편리하고, 빠르고, 높은 민간도로 핵산을 증폭할 수 있다. 또한, 미생물로부터 핵산 증폭까지의 단계가 단일 용기에서 이루어지기 때문에 자동화가 용이하게 이루어질 수 있다. 또한, 미생물을 고체 지지체에 부착시키기 위하여 높은 유속으로 고체 지지체와 접촉시킬 수 있기 때문에, 많은 양의 초기 시료를 사용할 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (15)

  1. 비평면 형상의 고체 지지체와, 미생물 및 소듐 폴리아네톨 술포네이트를 포함하는 혈액 배양물을 pH 3.0 내지 6.0의 범위에서 접촉시켜 상기 미생물을 상기 고체 지지체에 부착시키는 단계,
    상기 고체 지지체에 부착되지 않은 물질을 세척하여 제거하는 단계, 및
    상기 고체 지지체에 부착된 상기 미생물에 대하여 PCR을 수행하여 핵산을 증폭하는 단계를 포함하는, 미생물로부터 핵산을 증폭하는 방법으로서,
    상기 접촉단계, 세척 단계, 및 증폭 단계는 동일한 용기 내에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 박테리아, 곰팡이 또는 바이러스인 것인 방법.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 시료는 포스페이트 버퍼 또는 아세테이트 버퍼로 희석된 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 희석은 1:1 내지 1:10의 비율로 수행되는 것을 특징으 로 하는 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 시료는 10 mM 내지 500 mM의 염 농도를 갖는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 시료는 50 mM 내지 300 mM의 염 농도를 갖는 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 비평면 형상의 고체 지지체는 표면에 복수 개의 기둥 (pillar)이 형성되어 있는 기둥 구조를 갖는 고체 지지체, 비드 형상을 갖는 고체 지지체 및 표면에 복수 개의 공극이 형성되어 있는 체 (sieve) 구조를 갖는 고체 지지체로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 기둥은 어스팩 비가 1:1 내지 20:1인 것인 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 기둥 구조는 기둥 높이 대 기둥 사이의 거리의 비율이 1:1 내지 25:1인 것인 방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 기둥 구조는 기둥 사이의 거리가 5 ㎛ 내지 100 ㎛의 범위를 갖는 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 비평면 형상의 고체 지지체는 물 접촉각이 70°내지 95°인 소수성을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 소수성은 상기 고체 지지체의 표면을 옥타데실디메틸(3-트리메톡시실릴 프로필)암모늄 (OTC) 또는 트리데카플루오로테트라히드로옥틸트리메톡시실란 (DFS)의 화합물로 코팅하여 부여되는 성질인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 삭제
  15. 삭제
KR1020060079055A 2006-08-21 2006-08-21 비평면 형상의 고체 지지체를 이용하여 미생물로부터핵산을 증폭하는 방법 KR100813265B1 (ko)

Priority Applications (17)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020060079055A KR100813265B1 (ko) 2006-08-21 2006-08-21 비평면 형상의 고체 지지체를 이용하여 미생물로부터핵산을 증폭하는 방법
US11/841,089 US20080044884A1 (en) 2006-08-21 2007-08-20 Method and device for separating cells from a sample using a nonplanar solid substrate
US11/841,117 US8158411B2 (en) 2006-08-21 2007-08-20 Method of separating microorganism using nonplanar solid substrate and device for separating microorganism using the same
JP2007213969A JP2008048735A (ja) 2006-08-21 2007-08-20 非平面状の固体支持体を用いた微生物の分離方法及び分離装置
US11/841,069 US20080070282A1 (en) 2006-08-21 2007-08-20 Method and device for obtaining or amplifying nucleic acid from a cell using a nonplanar solid substrate
US11/841,107 US7919278B2 (en) 2006-08-21 2007-08-20 Method of amplifying nucleic acid from a cell using a nonplanar solid substrate
US11/841,191 US20080044880A1 (en) 2006-08-21 2007-08-20 Method of and apparatus for separating microorganisms from sample using electrodialysis and microorganism capturing means
EP07114680.7A EP1900807B1 (en) 2006-08-21 2007-08-21 Method of separating microorganism using nonplanar solid substrate and device for separating microorganism
DE602007006908T DE602007006908D1 (de) 2006-08-21 2007-08-21 Verfahren zur Verstärkung von Nukleinsäure aus Zellen von Mikroorganismen mittels eines nonplanaren festen Substrats
JP2007214954A JP4863506B2 (ja) 2006-08-21 2007-08-21 イオン交換反応及び微生物閉じ込め手段を利用して試料から微生物を分離する方法、微生物試料の前処理用容器、及び微生物分離装置
EP07114681.5A EP1900808B1 (en) 2006-08-21 2007-08-21 Method of and apparatus for separating microorganisms from sample using electrodialysis and microorganism capturing means
DE602007006731T DE602007006731D1 (de) 2006-08-21 2007-08-21 Verfahren zur Separierung von Mikroorganismen durch Ionenaustausch und Mittel zur Erfassung von Mikroorganismen, Behälter zur Vorbehandlung von Proben mit Mikroorganismen und Vorrichtung zur Separierung von Mikroorganismen
EP07114679A EP1892295B1 (en) 2006-08-21 2007-08-21 Method and device of isolating and amplifying nucleic acid from microorganism cell using nonplanar solid substrate
EP07114674A EP1892288B1 (en) 2006-08-21 2007-08-21 Method of separating microorganisms using ion exchange and means for capturing microorganisms, container for pretreatment of sample containing microorganisms and device for separating microorganisms
EP07114683A EP1972688B1 (en) 2006-08-21 2007-08-21 Method of amplifying nucleic acid from microorganism using nonplanar solid substrate
JP2007214950A JP5128875B2 (ja) 2006-08-21 2007-08-21 電気透析及び微生物捕獲手段を利用して試料から微生物を分離する方法及びそのための微生物分離装置
US13/325,980 US8557564B2 (en) 2006-08-21 2011-12-14 Method of separating microorganism using nonplanar solid substrate and device for separating microorganism using the same

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020060079055A KR100813265B1 (ko) 2006-08-21 2006-08-21 비평면 형상의 고체 지지체를 이용하여 미생물로부터핵산을 증폭하는 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20080017208A KR20080017208A (ko) 2008-02-26
KR100813265B1 true KR100813265B1 (ko) 2008-03-13

Family

ID=39384754

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020060079055A KR100813265B1 (ko) 2006-08-21 2006-08-21 비평면 형상의 고체 지지체를 이용하여 미생물로부터핵산을 증폭하는 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR100813265B1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201805479D0 (en) * 2018-04-03 2018-05-16 Momentum Bioscience Ltd Microorganism separation and detection

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4110077A (en) 1976-10-08 1978-08-29 Hoffmann-La Roche Inc. Determination of β-lipoproteins in blood serum with polyanethole sulfonate
JPH023A (ja) * 1987-10-23 1990-01-05 Nippon Telegr & Teleph Corp <Ntt> 光ファイバ回線のアクセス方法及びそのコネクタプラグ
US5234809A (en) 1989-03-23 1993-08-10 Akzo N.V. Process for isolating nucleic acid
KR20010032806A (ko) * 1997-12-06 2001-04-25 매튜 존 베이커 핵산 분리방법
US6498007B1 (en) 1999-03-17 2002-12-24 Japan Immunoresearch Laboratories Co., Ltd. Methods of treatment of disease using adsorbent carriers
US6936414B2 (en) 1999-12-22 2005-08-30 Abbott Laboratories Nucleic acid isolation method and kit
KR100601936B1 (ko) 2003-12-17 2006-07-14 삼성전자주식회사 접착부 지지체와 2이상의 접착물질을 갖는 마이크로어레이반응 챔버용 패취

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4110077A (en) 1976-10-08 1978-08-29 Hoffmann-La Roche Inc. Determination of β-lipoproteins in blood serum with polyanethole sulfonate
JPH023A (ja) * 1987-10-23 1990-01-05 Nippon Telegr & Teleph Corp <Ntt> 光ファイバ回線のアクセス方法及びそのコネクタプラグ
US5234809A (en) 1989-03-23 1993-08-10 Akzo N.V. Process for isolating nucleic acid
KR20010032806A (ko) * 1997-12-06 2001-04-25 매튜 존 베이커 핵산 분리방법
US6498007B1 (en) 1999-03-17 2002-12-24 Japan Immunoresearch Laboratories Co., Ltd. Methods of treatment of disease using adsorbent carriers
US6936414B2 (en) 1999-12-22 2005-08-30 Abbott Laboratories Nucleic acid isolation method and kit
KR100601936B1 (ko) 2003-12-17 2006-07-14 삼성전자주식회사 접착부 지지체와 2이상의 접착물질을 갖는 마이크로어레이반응 챔버용 패취

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
논문(2003)

Also Published As

Publication number Publication date
KR20080017208A (ko) 2008-02-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1972688B1 (en) Method of amplifying nucleic acid from microorganism using nonplanar solid substrate
US10947528B2 (en) Microfluidic device for extracting, isolating, and analyzing DNA from cells
US7361471B2 (en) Nucleic acid archiving
US20180126383A1 (en) Microorganism nucleic acid purification from host samples
EP1860198B1 (en) Method and apparatus for concentrating and amplifying nucleic acid in single micro chamber
JP2006501805A (ja) 有機分子を除去するための方法およびデバイス
WO2011020011A2 (en) Droplet actuator and droplet-based techniques
EP2997166B1 (en) Analyte enrichment methods
WO2005012518A1 (ja) 核酸検出用キット
US20230285967A1 (en) Multifunctional microfluidic device for capturing target cells and analyzing genomic dna isolated from the target cells while under flow conditions
WO2019109092A1 (en) Rapid nucleic acids separation and sample preparation via hollow-centered silica microsphere
KR100813265B1 (ko) 비평면 형상의 고체 지지체를 이용하여 미생물로부터핵산을 증폭하는 방법
KR100813264B1 (ko) 비평면 형상의 고체 지지체를 이용하여 미생물로부터핵산을 증폭하는 방법
US7364857B2 (en) Method of purifying nucleic acid using silver nanoparticles
KR100837401B1 (ko) 비평면 형상의 고체 지지체를 이용하여 미생물로부터핵산을 분리하는 방법,상기 분리된 핵산을 주형으로 하여핵산을 증폭하는 방법 및 상기 고체 지지체를 포함하는핵산 분리 및 증폭 장치
KR101206039B1 (ko) 비평면 형상의 고체 지지체를 이용하여 미생물로부터핵산을 분리하는 방법,상기 분리된 핵산을 주형으로 하여핵산을 증폭하는 방법 및 상기 고체 지지체를 포함하는핵산 분리 및 증폭 장치
US20220154173A1 (en) Compositions and Methods for Preparing Nucleic Acid Sequencing Libraries Using CRISPR/CAS9 Immobilized on a Solid Support
AU2002323198A1 (en) Nucleic acid archiving

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20130221

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20140221

Year of fee payment: 7

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20150212

Year of fee payment: 8

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160219

Year of fee payment: 9

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170221

Year of fee payment: 10

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180220

Year of fee payment: 11

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190221

Year of fee payment: 12

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20200225

Year of fee payment: 13