JP6364039B2 - 核酸の単離方法およびキット - Google Patents
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Description
本発明は、核酸を単離するための方法およびキット、より詳しくは、有意な濃度の可燃性成分を使用しない、核酸を単離するための方法およびキットに関する。
種々の起源から核酸を単離するための幾つかの方法が良く知られている。初期の方法は、タンパク質を選択的に沈殿させ次いでそれを核酸含有溶液から除去するためにフェノールおよび/またはクロロホルムのような有機溶媒を使用するものであった。タンパク質を除去したら、ついで溶存核酸を、アルコールを使用して沈殿させ、固体表面上に集めることが可能であった。ついで、該核酸を可溶化してそれを該固体表面から取り出すために、適当なバッファーを使用するものであった。
本発明は、試験サンプルを酸化金属担体物質および結合バッファーと接触させて核酸/酸化金属担体物質複合体を形成させ、該複合体を該試験サンプルから分離し、該核酸を該酸化金属担体物質から溶出する工程を含む、試験サンプルから核酸を分離するための方法を提供する。該結合バッファーは、一般には、カオトロピック(chaotropic)剤および界面活性剤を含むが、有機溶媒および還元剤をも含みうる。好ましくは、該結合バッファーは、華氏125度より高い引火点を有する。該方法は、核酸が、異なる核酸含有起源(例えば、細菌およびウイルス)から精製されそれが後に検出されうる程度に十分に有効である。
本発明で提供する方法は、核酸を、試験サンプル中に存在する他の(必ずしも全てではない)成分から分離するために酸化金属担体物質を使用するものである。特に、該酸化金属は、試験サンプル中の他の成分から核酸を精製するために使用する。本発明で教示する酸化金属担体物質の使用は、現在利用可能なサンプル調製方法より優れた幾つかの重要な利点をもたらすことが見出された。例えば、酸化金属は核酸配列に対して高いアフィニティーを有し、したがって、サンプルからサンプルへの汚染が最小限に抑制される。なぜなら、核酸は、望ましくない領域に逃れることなく該酸化金属担体に制御可能に結合しうるからである。また、酸化金属担体は、試験サンプル中の核酸の、より定量的な精製をもたらし、したがって、該試験サンプル中に存在しうる少量の所望の核酸でさえ、集められる。さらに、他のサンプル調製方法に従い一般に使用されるが処分についての重大な懸念を招く有機溶媒(例えば、アルコール、フェノールまたはクロロホルム)を低濃度で含む(または有機溶媒の使用を有意には伴わない)試験サンプルから核酸を分離するために、酸化金属粒子を使用することができる。さらに、増幅反応に完全に適合したバッファーを使用して、核酸を酸化金属担体から溶出することができる。すなわち、該溶出バッファーを増幅反応に適したバッファーと交換することなく、本発明で提供する方法で試験サンプルから分離された核酸を増幅反応において使用することができる。
酸化金属担体物質を使用する放射能標識RNAの結合および溶出
本実施例では、放射能標識されたRNAを種々の酸化金属担体物質に結合させ、洗浄し、ついで該担体物質から溶出した。結合RNAの量および該洗浄中に失われたRNAの量、そして最終的には、溶出したRNAの量を測定するための方法の経過の全体にわたり、計数/分(CPM)をモニターした。
種々のリン酸濃度を用いるFe 3 O 4 からのRNAの溶出
本実施例では、実施例1のとおりに調製した放射能標識RNAをFe2O3磁気粒子に結合させ、洗浄し、種々の濃度のリン酸ナトリウム(Na2HPO4)バッファーで溶出した。該溶出バッファー濃度は10〜50mM Na2HPO4(pH9)の範囲であった。約23,000,000 CPMの該放射能標識核酸を30mlのグアニジンイソチオシアナート−界面活性剤溶液(4M GITC,10% Tween−20,16mM セチルトリメチルアンモニウムブロミド,100mM 2−メルカプトエタンスルホン酸,100mM 酢酸カリウム,pH6)中の25mgのFe2O3酸化金属粒子の懸濁液(水中の10% w/v 粒子懸濁液0.25ml)に加えた。ついで、5つの1mlサンプルの希釈効果を刺激するために、5mlの水を該懸濁液に加えた。該懸濁液を手短にボルテックスし、それぞれ7mlの5つの等しいアリコートに分割し、該懸濁液の全てを37℃で20分間インキュベートした。
有機ホスファート溶出バッファーの使用
本実施例では、種々の有機ホスファートバッファーを、それらが酸化金属担体物質から核酸を溶出する能力に関して、無機ホスファートバッファーと比較して試験した。該溶出バッファー中で使用した有機ホスファート化合物の全ては、Sigma Chemical Co.から入手した。表3に示す場合を除き、すべてのバッファーは50mMで調製し、1M トリス塩基で6.5〜9の最終pHにpH調節した。前記実施例と同様、該放射能標識RNAを実施例1のとおりに調製した。約1,000,000 CPMの該放射能標識RNAを12mlのグアニジンイソチオシアナート−界面活性剤溶液(6M GITC,10% Tween−20,16mM セチルトリメチルアンモニウムブロミド,100mM 酢酸ナトリウム,100mM ジチオトレイトール,pH4.2,7.5% エタノール)中の10mgのFe2O3酸化金属粒子の懸濁液に加えた。サンプルの添加を刺激するために、2mlの水を該懸濁液に加えた。該懸濁液を手短にボルテックスし、37℃で25分間インキュベートした。該粒子を磁気的に集め、該上清を除去した。ガイガー計数管で調べたところ、該上清中でシグナルの有意な喪失は観察されなかった。該粒子を6mlの50mM 酢酸カリウム(pH6.0)に再懸濁させることにより、該粒子を洗浄した。該粒子を磁気的に集め、該洗浄流体を取り出した。ガイガー計数管で調べたところ、該上清中でシグナルの有意な喪失は観察されなかった。該洗浄操作を繰返した。ついで該粒子を6mlの該酢酸カリウム洗浄流体に再懸濁させ、十分に混合し、0.5ml アリコートを10個の別々の1.5ml ミクロフージチューブ内に分注した。該チューブを磁気ラックに移し、該粒子を該チューブの表面に集め、該洗浄流体を除去した。ついで100μlの種々の溶出バッファーを該微粒子に加え、70℃で10分間インキュベートした。ついで50μlの該溶出サンプルをシンチレーション計数管中で計数して、遊離したプローブの量を測定した。出発物質(核酸)のおよその全計数は40,000 CPM/サンプルであった。表3は、この実験の結果を示し、該溶出バッファーおよびその溶出バッファーで遊離した計数を示す。
血漿中のHIVビリオンからのRNAの抽出
本実施例では、前記の酸化金属粒子を使用して、種々のレベルのHIVビリオンを含有する4つの試験パネルの血漿から、HIV核酸を抽出した。陰性血漿を陰性対照として使用した。また、商業的に入手可能なQiagenウイルス核酸抽出キット(Qiagen Inc.;Valencia CA)を使用して、該血漿サンプルからの核酸を抽出した。Abbott LCx(登録商標)Quantitiative HIVアッセイ(Abbott Laboratories;Abbott Park,ILから入手可能)を用いて、該サンプル中のHIV核酸を分析した。
血漿中のHIVおよびHBVビリオンからの核酸の抽出
本実施例では、前記の酸化金属粒子を使用して、HIVビリオンおよびHBVビリオンの両方をそれぞれ1000ビリオン/mlの濃度で含有する1mlの血漿から、HIV核酸(RNA)およびHBV核酸(DNA)を抽出した。陰性血漿を陰性対照として使用した。該細胞溶解条件は、GITC(3.33〜4.66M)、DTT(0〜100mM)、Tween−20(13.3〜24%)およびCTAB(0〜24mM)の濃度ならびにpH(4〜10)ならびに温度(35℃〜55℃)の範囲に及ぶよう、様々に変化させた。45個の異なる組合せの試薬および条件を該細胞溶解工程において使用し、3mlの細胞溶解バッファーで全てのサンプルを抽出した。各抽出において5mgのFe2O3粒子を使用した。各条件は少なくとも3回使用し、中心(centerpoint)条件は30回使用した。該粒子を2M GITC、5% Tween−20、50M KOAc(pH6)で2回洗浄し、50mM Trisバッファー(pH8.0)で2回洗浄した。該洗浄溶液を吸引した後、200μlの溶出バッファーを、該洗浄粒子を含有するチューブに加えた。該溶出バッファーは、50mM o−ホスホセリンおよび150mM Tris塩基の溶液(8.0の最終pHを有する)であった。該溶出バッファーを加えた後、新たに生成した粒子懸濁液を手短にボルテックスし、該懸濁液を70℃で30分間インキュベートした。インキュベーション後、該粒子を、磁気ラック(magnetic rack)を使用して該チューブの表面上に捕捉し、該溶離液を取り出した。ついで、それぞれのサンプル調製方法に従い回収された溶液50μlを増幅および検出に付した。該溶出物質を分割し、PCRに基づく2つのアッセイ(1つはHIVおよび1つはHBV)を用いて分析した。該アッセイは「ビーコン」アッセイであり、ハイブリダイゼーションプローブ(これは、増幅された標的物質への該プローブの結合に際して蛍光の増加を示す)を用いる。
尿中のクラミジア・トラコマチスおよびナイセリア・ゴノレエからの核酸の抽出
本実施例では、前記の酸化金属方法を用いて、クラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)およびナイセリア・ゴノレエ(Neiseria gonorrhoeae)の両方を含有する1mlの尿から核酸を抽出した。また、LCx(登録商標)Urine Specimen Preparation Kitを使用して、該尿サンプルからの核酸を抽出した。Abbott LaboratoriesからのLCx(登録商標)を使用して、該抽出サンプルをクラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)およびナイセリア・ゴノレエ(Neiseria gonorrhoeae)の両方に関して試験した。
Claims (7)
- 試験サンプルからRNAを分離するための方法であって、
a)試験サンプルを酸化鉄担体物質および結合バッファーと接触させて、RNA/酸化鉄担体物質複合体を形成させ(該結合バッファーはカオトロピック剤、15%未満の濃度の有機溶媒、および界面活性剤を含み、該結合バッファーは4〜10のpHを有し、該結合バッファーの引火点は54.4℃(華氏130度)より高く、および該有機溶媒はエタノール、メタノール、プロパノールおよびイソプロパノールからなる群から選択される)、
b)該複合体を該試験サンプルから分離し、ならびに
c)該RNAを該酸化鉄担体物質から溶出することを含み、該RNAを該酸化鉄担体物質から溶出することが、該複合体を6.5〜9のpHを有するホスファート含有バッファーと接触させることを含み、
ここで、該方法によって溶出バッファーを交換することなく該RNAを増幅反応において直接使用することが可能となる該方法。 - 該結合バッファーが更に還元剤を含む、請求項1に記載の方法。
- 該RNAを該酸化鉄担体物質から溶出した後、該RNAを検出する工程を更に含む、請求項1に記載の方法。
- 該RNAを該酸化鉄担体物質から溶出した後で且つ該RNAを検出する前に、該RNAを増幅する工程を更に含む、請求項3に記載の方法。
- 該RNAが、異なる起源に由来するRNAを含む、請求項3に記載の方法。
- 該結合バッファーが7.5%の濃度の有機溶媒を含む、請求項1に記載の方法。
- 該酸化鉄担体が酸化第一鉄第二鉄または酸化第二鉄である、請求項1に記載の方法。
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