JPH11169170A - 植物ｄｎａの抽出精製方法 - Google Patents
植物ｄｎａの抽出精製方法Info
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- JPH11169170A JPH11169170A JP34106697A JP34106697A JPH11169170A JP H11169170 A JPH11169170 A JP H11169170A JP 34106697 A JP34106697 A JP 34106697A JP 34106697 A JP34106697 A JP 34106697A JP H11169170 A JPH11169170 A JP H11169170A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ＤＮＡを含む植物材料からＤＮＡを煩雑な操
作を必要とすることなく、短時間かつ高純度で抽出精製
する方法を提供する。 【解決手段】 下記工程（ａ）〜（ｅ）を含むことを特
徴とする植物ＤＮＡの抽出精製方法およびそのための試
薬。 （ａ）植物材料に界面活性剤および必要によりタンパク
変性剤を含む溶解液を混合して、植物材料中の細胞を溶
解し、（ｂ）得られた細胞溶解液に界面活性剤を抽出す
る有機溶媒を加えて、混合した後、水相と有機溶媒相を
分離し、（ｃ）得られた水相にカオトロピック物質を含
む吸着液および核酸結合性固相担体を中性乃至弱アルカ
リ性条件下に混合させて、植物材料中の細胞に含まれる
ＤＮＡを核酸結合性固相担体上に吸着させ、（ｄ）ＤＮ
Ａを吸着させた核酸結合性固相担体を洗浄液にて洗浄し
て、植物細胞中に含まれる糖類およびタンパク類を除去
し、次いで、（ｅ）核酸結合性固相担体に結合したＤＮ
Ａを溶出する。
作を必要とすることなく、短時間かつ高純度で抽出精製
する方法を提供する。 【解決手段】 下記工程（ａ）〜（ｅ）を含むことを特
徴とする植物ＤＮＡの抽出精製方法およびそのための試
薬。 （ａ）植物材料に界面活性剤および必要によりタンパク
変性剤を含む溶解液を混合して、植物材料中の細胞を溶
解し、（ｂ）得られた細胞溶解液に界面活性剤を抽出す
る有機溶媒を加えて、混合した後、水相と有機溶媒相を
分離し、（ｃ）得られた水相にカオトロピック物質を含
む吸着液および核酸結合性固相担体を中性乃至弱アルカ
リ性条件下に混合させて、植物材料中の細胞に含まれる
ＤＮＡを核酸結合性固相担体上に吸着させ、（ｄ）ＤＮ
Ａを吸着させた核酸結合性固相担体を洗浄液にて洗浄し
て、植物細胞中に含まれる糖類およびタンパク類を除去
し、次いで、（ｅ）核酸結合性固相担体に結合したＤＮ
Ａを溶出する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は植物の組織、種子、
根、花弁などの植物材料から、核酸結合性固相担体を用
いて、ＤＮＡを簡便かつ純度よく抽出精製する方法なら
びに該方法に用いるＤＮＡを抽出精製するための試薬に
関する。該試薬は自動核酸抽出装置にも応用しうる。
根、花弁などの植物材料から、核酸結合性固相担体を用
いて、ＤＮＡを簡便かつ純度よく抽出精製する方法なら
びに該方法に用いるＤＮＡを抽出精製するための試薬に
関する。該試薬は自動核酸抽出装置にも応用しうる。
【０００２】
【従来の技術】核酸を含有する植物組織、種子、根、花
弁などの植物材料から、核酸を抽出精製することは、こ
れらの植物の品種改良や遺伝子工学を用いた植物培養細
胞における有用物質の生産などの分野で重要なステップ
である。例えば、ある遺伝子について解析しようとする
場合や、遺伝子の導入を確認する場合などは、まず、そ
の遺伝子を保持する植物組織、種子、根、花弁などの植
物材料から、その遺伝子、特にＤＮＡを抽出することが
必要である。
弁などの植物材料から、核酸を抽出精製することは、こ
れらの植物の品種改良や遺伝子工学を用いた植物培養細
胞における有用物質の生産などの分野で重要なステップ
である。例えば、ある遺伝子について解析しようとする
場合や、遺伝子の導入を確認する場合などは、まず、そ
の遺伝子を保持する植物組織、種子、根、花弁などの植
物材料から、その遺伝子、特にＤＮＡを抽出することが
必要である。
【０００３】一般に、生物材料に含まれるＤＮＡやＲＮ
Ａなどの核酸は、遊離した状態で存在するわけでなく、
タンパク質、脂質、糖から構成される細胞膜や細胞壁等
の殻の中に存在し、ほとんどの場合、核酸自身もタンパ
クとの複合体を形成している。したがって、生物材料か
ら核酸を抽出精製する場合には、まず超音波や熱による
物理的破砕処理やプロテアーゼによる酵素処理、界面活
性剤や変性剤による処理等を施すことにより、核酸を遊
離させ、さらに、フェノール等の有機溶媒による抽出操
作や超遠心分離、イオン交換体等の担体を使用したカラ
ムクロマトグラフィー等により、破砕物中から核酸を精
製する必要がある。これらの手法は、核酸や出発材料、
さらには抽出した核酸の用途に応じて組み合わされ、そ
れぞれ最適化されて用いられている。
Ａなどの核酸は、遊離した状態で存在するわけでなく、
タンパク質、脂質、糖から構成される細胞膜や細胞壁等
の殻の中に存在し、ほとんどの場合、核酸自身もタンパ
クとの複合体を形成している。したがって、生物材料か
ら核酸を抽出精製する場合には、まず超音波や熱による
物理的破砕処理やプロテアーゼによる酵素処理、界面活
性剤や変性剤による処理等を施すことにより、核酸を遊
離させ、さらに、フェノール等の有機溶媒による抽出操
作や超遠心分離、イオン交換体等の担体を使用したカラ
ムクロマトグラフィー等により、破砕物中から核酸を精
製する必要がある。これらの手法は、核酸や出発材料、
さらには抽出した核酸の用途に応じて組み合わされ、そ
れぞれ最適化されて用いられている。
【０００４】植物組織、種子、根、花弁等の植物材料か
らＤＮＡを抽出精製する方法としては、ＣＴＡＢ（セチ
ルトリメチルアンモニウムブロミド）法［1980. Nucl.A
cid.Res. 8:4321-4325] が一般的によく用いられてい
る。このＣＴＡＢ法とは、下記工程を含む。 （１）植物組織、種子、根、花弁等の植物材料を乳鉢、
乳棒等を用いて、液体窒素中でパウダー状になるまで粉
砕した後、ＣＴＡＢ溶液を加えて、該材料中の植物細胞
を溶解し、これによりＤＮＡを抽出し、かつ、タンパ
ク、ポリサッカライドなどのＤＮＡ以外の成分をＣＴＡ
Ｂに結合させ、複合体とする。 （２）次に、クロロホルムなどの有機溶媒を用いて、Ｃ
ＴＡＢとタンパク、ポリサッカライドの複合体を有機溶
媒層へ移行させ、ＤＮＡが含まれる水相のみを分離す
る。 （３）この水相に塩濃度を下げたＣＴＡＢ溶液（沈殿バ
ッファー）を添加することにより、ＤＮＡを不溶化さ
せ、ＣＴＡＢ−ＤＮＡ複合体を沈殿させる。 （４）そして、イソプロパノール沈殿もしくは必要に応
じて、塩化セシウム密度勾配遠心法（超遠心）によりＤ
ＮＡを精製する。
らＤＮＡを抽出精製する方法としては、ＣＴＡＢ（セチ
ルトリメチルアンモニウムブロミド）法［1980. Nucl.A
cid.Res. 8:4321-4325] が一般的によく用いられてい
る。このＣＴＡＢ法とは、下記工程を含む。 （１）植物組織、種子、根、花弁等の植物材料を乳鉢、
乳棒等を用いて、液体窒素中でパウダー状になるまで粉
砕した後、ＣＴＡＢ溶液を加えて、該材料中の植物細胞
を溶解し、これによりＤＮＡを抽出し、かつ、タンパ
ク、ポリサッカライドなどのＤＮＡ以外の成分をＣＴＡ
Ｂに結合させ、複合体とする。 （２）次に、クロロホルムなどの有機溶媒を用いて、Ｃ
ＴＡＢとタンパク、ポリサッカライドの複合体を有機溶
媒層へ移行させ、ＤＮＡが含まれる水相のみを分離す
る。 （３）この水相に塩濃度を下げたＣＴＡＢ溶液（沈殿バ
ッファー）を添加することにより、ＤＮＡを不溶化さ
せ、ＣＴＡＢ−ＤＮＡ複合体を沈殿させる。 （４）そして、イソプロパノール沈殿もしくは必要に応
じて、塩化セシウム密度勾配遠心法（超遠心）によりＤ
ＮＡを精製する。
【０００５】この方法は数１０μｇものＤＮＡが抽出可
能であるという利点をもつが、ＣＴＡＢによるＤＮＡの
沈殿、ならびにイソプロパノール沈殿、あるいは超遠心
分離という長時間を要するステップが必要なため、多数
のサンプルを迅速に解析する必要のある場合には、より
簡便かつ短時間でＤＮＡが抽出精製できる方法が要求さ
れる。
能であるという利点をもつが、ＣＴＡＢによるＤＮＡの
沈殿、ならびにイソプロパノール沈殿、あるいは超遠心
分離という長時間を要するステップが必要なため、多数
のサンプルを迅速に解析する必要のある場合には、より
簡便かつ短時間でＤＮＡが抽出精製できる方法が要求さ
れる。
【０００６】一方、簡便な核酸抽出法として、シリカ粒
子を核酸結合性固相担体として使用する方法がある（特
開平2-289596号公報）。この方法は、細胞などの生物材
料にカオトロピック溶液、核酸結合性固相担体を添加す
ることで、核酸を一段階で抽出する手法である。さら
に、溶出液に水またはＴＥバッファーなど低濃度の緩衝
液を使用するため、エタノール沈殿法などの脱塩、濃縮
のための操作を経ることなく、抽出した核酸を直ちに後
の解析に直接使用することができるという利点がある。
しかしながら、この方法により植物組織、種子、根、花
弁等の植物材料からＤＮＡの抽出を試みた場合、植物細
胞のもつ、セルロースを主体とした強固な細胞壁によ
り、カオトロピック溶液による細胞の溶解が不十分であ
ったり、植物細胞に豊富に含まれるポリサッカライドや
ポリフェノールなどの二次代謝産物が、ＤＮＡの核酸結
合性固相担体への吸着を阻害するため、動物細胞などと
比較して、ＤＮＡの収量が非常に少ないという欠点を有
する。
子を核酸結合性固相担体として使用する方法がある（特
開平2-289596号公報）。この方法は、細胞などの生物材
料にカオトロピック溶液、核酸結合性固相担体を添加す
ることで、核酸を一段階で抽出する手法である。さら
に、溶出液に水またはＴＥバッファーなど低濃度の緩衝
液を使用するため、エタノール沈殿法などの脱塩、濃縮
のための操作を経ることなく、抽出した核酸を直ちに後
の解析に直接使用することができるという利点がある。
しかしながら、この方法により植物組織、種子、根、花
弁等の植物材料からＤＮＡの抽出を試みた場合、植物細
胞のもつ、セルロースを主体とした強固な細胞壁によ
り、カオトロピック溶液による細胞の溶解が不十分であ
ったり、植物細胞に豊富に含まれるポリサッカライドや
ポリフェノールなどの二次代謝産物が、ＤＮＡの核酸結
合性固相担体への吸着を阻害するため、動物細胞などと
比較して、ＤＮＡの収量が非常に少ないという欠点を有
する。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、上記
問題点を解決することにあり、植物組織、種子、根、花
弁等の植物材料からＤＮＡを煩雑な操作を必要とするこ
となく、短時間でを抽出し、精製する方法を提供するこ
とである。
問題点を解決することにあり、植物組織、種子、根、花
弁等の植物材料からＤＮＡを煩雑な操作を必要とするこ
となく、短時間でを抽出し、精製する方法を提供するこ
とである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために種々、鋭意検討した結果、植物材料に
まず、界面活性剤を用いた前処理を行い、次いで、カオ
トロピック剤の存在下に、核酸結合性固相担体により、
植物材料からＤＮＡを簡便に抽出精製し得ることを見い
出し、本発明に到達した。
を解決するために種々、鋭意検討した結果、植物材料に
まず、界面活性剤を用いた前処理を行い、次いで、カオ
トロピック剤の存在下に、核酸結合性固相担体により、
植物材料からＤＮＡを簡便に抽出精製し得ることを見い
出し、本発明に到達した。
【０００９】すなわち、本発明は、下記工程（ａ）〜
（ｅ）を含むことを特徴とする植物ＤＮＡの抽出精製方
法。 （ａ）植物材料に界面活性剤および必要によりタンパク
変性剤を含む溶解液を混合して、植物材料中の細胞を溶
解し、（ｂ）得られた細胞溶解液に界面活性剤を抽出す
る有機溶媒を加えて、混合した後、水相と有機溶媒相を
分離し、（ｃ）得られた水相にカオトロピック物質を含
む吸着液および核酸結合性固相担体を中性乃至弱アルカ
リ性条件下に混合させて、植物材料中の細胞に含まれる
ＤＮＡを核酸結合性固相担体上に吸着させ、（ｄ）ＤＮ
Ａを吸着させた核酸結合性固相担体を洗浄液にて洗浄し
て、植物細胞中に含まれる糖類およびタンパク類を除去
し、次いで、（ｅ）核酸結合性固相担体に結合したＤＮ
Ａを溶出する。
（ｅ）を含むことを特徴とする植物ＤＮＡの抽出精製方
法。 （ａ）植物材料に界面活性剤および必要によりタンパク
変性剤を含む溶解液を混合して、植物材料中の細胞を溶
解し、（ｂ）得られた細胞溶解液に界面活性剤を抽出す
る有機溶媒を加えて、混合した後、水相と有機溶媒相を
分離し、（ｃ）得られた水相にカオトロピック物質を含
む吸着液および核酸結合性固相担体を中性乃至弱アルカ
リ性条件下に混合させて、植物材料中の細胞に含まれる
ＤＮＡを核酸結合性固相担体上に吸着させ、（ｄ）ＤＮ
Ａを吸着させた核酸結合性固相担体を洗浄液にて洗浄し
て、植物細胞中に含まれる糖類およびタンパク類を除去
し、次いで、（ｅ）核酸結合性固相担体に結合したＤＮ
Ａを溶出する。
【００１０】また、本発明は（１）界面活性剤および必
要によりタンパク変性剤を含む溶解液、（２）界面活性
剤を抽出する有機溶媒、（３）カオトロピック物質を含
む吸着液、（４）核酸結合性固相担体、（５）洗浄液お
よび（６）溶出液を含むことを特徴とする植物ＤＮＡ抽
出精製用試薬である。
要によりタンパク変性剤を含む溶解液、（２）界面活性
剤を抽出する有機溶媒、（３）カオトロピック物質を含
む吸着液、（４）核酸結合性固相担体、（５）洗浄液お
よび（６）溶出液を含むことを特徴とする植物ＤＮＡ抽
出精製用試薬である。
【００１１】
【発明の実施態様】本発明において用いられる植物材料
としては、例えば、植物の組織や培養細胞のほかに、種
子、根、花弁などが挙げられる。植物としては、単子葉
植物、双子葉植物などがあり、単子葉植物としては、イ
ネ、トウモロコシ、ムラサキツユクサ、パイナップル、
コムギ、エンバク、サトイモなどが挙げられる。また、
双子葉植物としては、タバコ、シロイヌナズナ、ケナ
フ、ジャガイモ、サツマイモ、アサガオ、メロン、ナ
ス、ニンジン、ナタネ、ワタ等の草本性植物、ユーカ
リ、アカシア、コーヒー等の常緑広葉樹、ポプラ、クヌ
ギ、ヤナギ、シラカバ、コナラ等の落葉樹などの木本性
植物などが挙げられる。
としては、例えば、植物の組織や培養細胞のほかに、種
子、根、花弁などが挙げられる。植物としては、単子葉
植物、双子葉植物などがあり、単子葉植物としては、イ
ネ、トウモロコシ、ムラサキツユクサ、パイナップル、
コムギ、エンバク、サトイモなどが挙げられる。また、
双子葉植物としては、タバコ、シロイヌナズナ、ケナ
フ、ジャガイモ、サツマイモ、アサガオ、メロン、ナ
ス、ニンジン、ナタネ、ワタ等の草本性植物、ユーカ
リ、アカシア、コーヒー等の常緑広葉樹、ポプラ、クヌ
ギ、ヤナギ、シラカバ、コナラ等の落葉樹などの木本性
植物などが挙げられる。
【００１２】本発明に使用する溶解液とは、細胞膜の破
壊あるいは細胞中に含まれるタンパク質を変性させる目
的で使用する液体であり、界面活性剤を含有する。必要
により、タンパク変性剤を添加してもよい。界面活性剤
としては、一般に細胞等から核酸を抽出する際に使用さ
れるものであれば、特に限定されないが、具体例として
は、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ドデシ
ルトリメチルアンモニウムクロリド、セチルトリメチル
アンモニウムブロミド等の陽イオン界面活性剤、ドデシ
ル硫酸ナトリウム、Ｎ‐ラウロイルサルコシンナトリウ
ム、コール酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、サ
ルコシン等の陰イオン界面活性剤、トウイーン系界面活
性剤、トリトン系界面活性剤などの非イオン界面活性
剤、ホスファチジルエタノールアミン等の両性界面活性
剤が挙げられる。特に、陽イオン界面活性剤が好まし
く、さらにセチルトリメチルアンモニウムブロミドが好
ましい。これらの界面活性剤は単独で、あるいは２種以
上併用してもよい。これらの界面活性剤の使用濃度は、
界面活性剤の種類により異なり、通常、０．１〜１０容
量％であり、例えば、セチルトリメチルアンモニウムブ
ロミドを使用する場合には、０．１〜５容量％の範囲と
なることが好ましい。
壊あるいは細胞中に含まれるタンパク質を変性させる目
的で使用する液体であり、界面活性剤を含有する。必要
により、タンパク変性剤を添加してもよい。界面活性剤
としては、一般に細胞等から核酸を抽出する際に使用さ
れるものであれば、特に限定されないが、具体例として
は、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ドデシ
ルトリメチルアンモニウムクロリド、セチルトリメチル
アンモニウムブロミド等の陽イオン界面活性剤、ドデシ
ル硫酸ナトリウム、Ｎ‐ラウロイルサルコシンナトリウ
ム、コール酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、サ
ルコシン等の陰イオン界面活性剤、トウイーン系界面活
性剤、トリトン系界面活性剤などの非イオン界面活性
剤、ホスファチジルエタノールアミン等の両性界面活性
剤が挙げられる。特に、陽イオン界面活性剤が好まし
く、さらにセチルトリメチルアンモニウムブロミドが好
ましい。これらの界面活性剤は単独で、あるいは２種以
上併用してもよい。これらの界面活性剤の使用濃度は、
界面活性剤の種類により異なり、通常、０．１〜１０容
量％であり、例えば、セチルトリメチルアンモニウムブ
ロミドを使用する場合には、０．１〜５容量％の範囲と
なることが好ましい。
【００１３】タンパク変性剤としては、グアニジン塩酸
塩、グアニジンチオシアン酸塩、グアニジン炭酸塩など
のグアニジン塩、尿素などを含むカオトロピック物質な
どを挙げられる。特にグアニジン塩酸塩、グアニジンチ
オシアン酸塩などが好ましい。タンパク変性剤の使用濃
度は、用いられる物質により異なり、通常、１０〜８０
容量％、好ましくは４０〜７５容量％である。
塩、グアニジンチオシアン酸塩、グアニジン炭酸塩など
のグアニジン塩、尿素などを含むカオトロピック物質な
どを挙げられる。特にグアニジン塩酸塩、グアニジンチ
オシアン酸塩などが好ましい。タンパク変性剤の使用濃
度は、用いられる物質により異なり、通常、１０〜８０
容量％、好ましくは４０〜７５容量％である。
【００１４】本発明において使用する上記界面活性剤を
抽出する有機溶媒とは、ＤＮＡの固相への結合を妨げる
ものでなく、かつ、溶解液中の界面活性剤を溶媒中に抽
出しうるものであれば、特に限定されない。本発明にお
いて用いられる有機溶媒の具体例としては、水飽和フェ
ノール、緩衝液飽和フェノール、クロロホルム、メタノ
ール、1-ブタノール、3-メチル-1- プロパノール、アセ
トン等が挙げられる。これらのうち、有機溶媒を 2種以
上混合したものが好ましく、さらにクロロホルムと3-メ
チル-1- プロパノールを適当な割合で混合したものが好
ましい。混合比は、有機溶媒の種類により選択される
が、例えばクロロホルム：3-メチル-1- プロパノール＝
２４：１〜４８：１（容量比）である。
抽出する有機溶媒とは、ＤＮＡの固相への結合を妨げる
ものでなく、かつ、溶解液中の界面活性剤を溶媒中に抽
出しうるものであれば、特に限定されない。本発明にお
いて用いられる有機溶媒の具体例としては、水飽和フェ
ノール、緩衝液飽和フェノール、クロロホルム、メタノ
ール、1-ブタノール、3-メチル-1- プロパノール、アセ
トン等が挙げられる。これらのうち、有機溶媒を 2種以
上混合したものが好ましく、さらにクロロホルムと3-メ
チル-1- プロパノールを適当な割合で混合したものが好
ましい。混合比は、有機溶媒の種類により選択される
が、例えばクロロホルム：3-メチル-1- プロパノール＝
２４：１〜４８：１（容量比）である。
【００１５】本発明に使用する吸着液には、カオトロピ
ック物質が含まれる。カオトロピック物質としては、一
般にカオトロピック物質として知られているような、疎
水性分子の水溶性を増加させる作用を有しており、さら
にＤＮＡの固相への結合に寄与するものであれば、特に
限定されない。具体的には、グアニジンチオシアン酸
塩、グアニジン塩酸塩、沃化ナトリウム、沃化カリウ
ム、過塩素酸ナトリウム等が挙げられる。カオトロピッ
ク物質の使用濃度は、用いられるカオトロピック物質に
より異なり、通常、約１〜８Ｍ、好ましくは３〜５Ｍで
あり、例えば、グアニジン塩酸塩を使用する場合には、
４〜７．５Ｍの範囲である。
ック物質が含まれる。カオトロピック物質としては、一
般にカオトロピック物質として知られているような、疎
水性分子の水溶性を増加させる作用を有しており、さら
にＤＮＡの固相への結合に寄与するものであれば、特に
限定されない。具体的には、グアニジンチオシアン酸
塩、グアニジン塩酸塩、沃化ナトリウム、沃化カリウ
ム、過塩素酸ナトリウム等が挙げられる。カオトロピッ
ク物質の使用濃度は、用いられるカオトロピック物質に
より異なり、通常、約１〜８Ｍ、好ましくは３〜５Ｍで
あり、例えば、グアニジン塩酸塩を使用する場合には、
４〜７．５Ｍの範囲である。
【００１６】本発明において使用するカオトロピック物
質を含む吸着液には、緩衝剤を含有させることが好まし
い。これは、予め吸着液に含まれていても、また、細胞
を溶解した後に緩衝液として添加してもよい。この緩衝
剤としては、一般に使用されるものであれば、特に限定
されないが、中性乃至弱アルカリ性条件、すなわち、ｐ
Ｈ７〜９において緩衝能を有するものがより好ましい。
例えば、トリス−塩酸、四ホウ酸ナトリウム−塩酸、リ
ン酸二水素カリウム−四ホウ酸ナトリウム緩衝液等が挙
げられ、その使用濃度としては１〜５００ｍＭ、ｐＨは
７〜９の範囲が好適である。
質を含む吸着液には、緩衝剤を含有させることが好まし
い。これは、予め吸着液に含まれていても、また、細胞
を溶解した後に緩衝液として添加してもよい。この緩衝
剤としては、一般に使用されるものであれば、特に限定
されないが、中性乃至弱アルカリ性条件、すなわち、ｐ
Ｈ７〜９において緩衝能を有するものがより好ましい。
例えば、トリス−塩酸、四ホウ酸ナトリウム−塩酸、リ
ン酸二水素カリウム−四ホウ酸ナトリウム緩衝液等が挙
げられ、その使用濃度としては１〜５００ｍＭ、ｐＨは
７〜９の範囲が好適である。
【００１７】本発明において用いられる核酸結合性固相
担体としては、カオトロピックイオンの存在下で、核酸
を吸着、すなわち可逆的な結合により保持することがで
きる親水性表面を有する担体であれば、特に限定されな
い。具体例としては、二酸化ケイ素、すなわち、シリカ
が好ましく用いられる。また、核酸との可逆的な結合を
妨げるようなものでなければ、シリカから構成される他
の物質、例えばガラス、ケイソウ土、あるいはこれらを
化学的修飾により表面処理を施したものや、超常磁性金
属酸化物等の他の物質との複合体も含まれる。また、こ
の核酸結合性固相担体の形態としては、粒子、フィルタ
ー、反応容器等が具体的に挙げられるが特に限定されな
い。これらのうち、吸着と溶出の効率を考慮すると粒子
の形態がより好ましく、この際、粒径は０．０５〜５０
０μｍがより好適である。
担体としては、カオトロピックイオンの存在下で、核酸
を吸着、すなわち可逆的な結合により保持することがで
きる親水性表面を有する担体であれば、特に限定されな
い。具体例としては、二酸化ケイ素、すなわち、シリカ
が好ましく用いられる。また、核酸との可逆的な結合を
妨げるようなものでなければ、シリカから構成される他
の物質、例えばガラス、ケイソウ土、あるいはこれらを
化学的修飾により表面処理を施したものや、超常磁性金
属酸化物等の他の物質との複合体も含まれる。また、こ
の核酸結合性固相担体の形態としては、粒子、フィルタ
ー、反応容器等が具体的に挙げられるが特に限定されな
い。これらのうち、吸着と溶出の効率を考慮すると粒子
の形態がより好ましく、この際、粒径は０．０５〜５０
０μｍがより好適である。
【００１８】本発明において用いられる洗浄液として
は、固相担体からのＤＮＡの溶離を促進するものでな
く、かつ、ＲＮＡ、タンパク類、糖類の固相への結合を
妨げるものであれば、特に限定されない。具体的には、
４〜７．５Ｍグアニジン塩酸塩溶液あるいは４０〜７０
％エタノールが好ましく、これらの洗浄液を併用すると
より好適である。つまり、まず、グアニジン塩酸塩溶液
で洗浄した後、さらに４０〜７０％エタノールで洗浄す
るのが好ましい。また、初めに溶解・吸着工程にて使用
した吸着液を洗浄液として使用すると、ゲノムＤＮＡと
タンパクの除去により有効である。このとき、続いて４
０〜７０％エタノールで洗浄するのが好ましい。
は、固相担体からのＤＮＡの溶離を促進するものでな
く、かつ、ＲＮＡ、タンパク類、糖類の固相への結合を
妨げるものであれば、特に限定されない。具体的には、
４〜７．５Ｍグアニジン塩酸塩溶液あるいは４０〜７０
％エタノールが好ましく、これらの洗浄液を併用すると
より好適である。つまり、まず、グアニジン塩酸塩溶液
で洗浄した後、さらに４０〜７０％エタノールで洗浄す
るのが好ましい。また、初めに溶解・吸着工程にて使用
した吸着液を洗浄液として使用すると、ゲノムＤＮＡと
タンパクの除去により有効である。このとき、続いて４
０〜７０％エタノールで洗浄するのが好ましい。
【００１９】本発明において用いられる溶出液として
は、固相からのＤＮＡの溶離を促進するものであれば、
特に限定されない。具体的には、水あるいはＴＥバッフ
ァー（１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、ｐＨ８．０）が好ましい。
は、固相からのＤＮＡの溶離を促進するものであれば、
特に限定されない。具体的には、水あるいはＴＥバッフ
ァー（１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、ｐＨ８．０）が好ましい。
【００２０】本発明によるＤＮＡの抽出精製方法は、
（ａ）植物材料中の細胞を界面活性剤および必要により
タンパク変性剤を含む溶解液で植物細胞を溶解する工
程、（ｂ）上記（ａ）にて使用した有機溶媒を除去する
工程、（ｃ）溶解された細胞中のＤＮＡをカオトロピッ
ク物質の存在下に核酸結合性担体に吸着させる工程、
（ｄ）吸着されたＤＮＡと糖類およびタンパク類を分離
するために、核酸結合性担体を洗浄する工程および
（ｅ）該核酸結合性担体から吸着されたＤＮＡを溶出す
る工程の５段階に大きく分けられる。本発明では、核酸
結合性固相担体が超常磁性金属酸化物を含む粒子であっ
て、さらに磁力を利用して核酸結合性固相担体と液相を
分離する工程を含むことがある。
（ａ）植物材料中の細胞を界面活性剤および必要により
タンパク変性剤を含む溶解液で植物細胞を溶解する工
程、（ｂ）上記（ａ）にて使用した有機溶媒を除去する
工程、（ｃ）溶解された細胞中のＤＮＡをカオトロピッ
ク物質の存在下に核酸結合性担体に吸着させる工程、
（ｄ）吸着されたＤＮＡと糖類およびタンパク類を分離
するために、核酸結合性担体を洗浄する工程および
（ｅ）該核酸結合性担体から吸着されたＤＮＡを溶出す
る工程の５段階に大きく分けられる。本発明では、核酸
結合性固相担体が超常磁性金属酸化物を含む粒子であっ
て、さらに磁力を利用して核酸結合性固相担体と液相を
分離する工程を含むことがある。
【００２１】（ａ）細胞溶解工程では、植物組織、種
子、根、花弁などの植物材料を乳鉢、乳棒等を用いて、
液体窒素中でパウダー状になるまで粉砕、または液体窒
素を用いずに上記試料を適当な方法ですりつぶした後、
界面活性剤および必要によりタンパク変性剤を含む溶解
液を加え、細胞を溶解する。
子、根、花弁などの植物材料を乳鉢、乳棒等を用いて、
液体窒素中でパウダー状になるまで粉砕、または液体窒
素を用いずに上記試料を適当な方法ですりつぶした後、
界面活性剤および必要によりタンパク変性剤を含む溶解
液を加え、細胞を溶解する。
【００２２】（ｂ）有機溶媒を除去する工程では、
（ａ）細胞溶解工程で使用した溶解液をクロロホルムな
どの上記有機溶媒で抽出する。具体的には、得られた細
胞溶解液に界面活性剤を抽出する有機溶媒を加えて、混
合した後、水相と有機溶媒相を分離する。
（ａ）細胞溶解工程で使用した溶解液をクロロホルムな
どの上記有機溶媒で抽出する。具体的には、得られた細
胞溶解液に界面活性剤を抽出する有機溶媒を加えて、混
合した後、水相と有機溶媒相を分離する。
【００２３】（ｃ）次いで、吸着工程では、水相にカオ
トロピック物質を含む溶液および核酸結合性固相担体を
中性乃至弱アルカリ性条件下、好ましくはｐＨ７〜９付
近にて添加する。このカオトロピック溶液、核酸結合性
固相担体は別々に添加しても、あるいは同時に添加して
も良い。
トロピック物質を含む溶液および核酸結合性固相担体を
中性乃至弱アルカリ性条件下、好ましくはｐＨ７〜９付
近にて添加する。このカオトロピック溶液、核酸結合性
固相担体は別々に添加しても、あるいは同時に添加して
も良い。
【００２４】（ｄ）洗浄工程は、上記（ａ）〜（ｃ）工
程を経て得られた植物材料、溶解液、吸着液、核酸結合
性固相担体の混合物から、ＤＮＡを吸着した核酸結合性
固相担体のみを可能な限り分離する工程である。このと
き、洗浄液を使用して、約２〜３回程度、繰り返し洗浄
することが好ましい。
程を経て得られた植物材料、溶解液、吸着液、核酸結合
性固相担体の混合物から、ＤＮＡを吸着した核酸結合性
固相担体のみを可能な限り分離する工程である。このと
き、洗浄液を使用して、約２〜３回程度、繰り返し洗浄
することが好ましい。
【００２５】本発明における液相と固相との具体的な分
離手段としては、使用する核酸結合性固相担体の形態に
より異なり、核酸結合性固相担体が粒子の形態である場
合には、遠心分離、ろ過、カラム操作等が好ましい。さ
らには、粒子内に超常磁性金属酸化物を含ませておいた
ものを固相担体として使用すれば、磁石等を用いた簡便
な磁気分離法が可能となり、より好適である。
離手段としては、使用する核酸結合性固相担体の形態に
より異なり、核酸結合性固相担体が粒子の形態である場
合には、遠心分離、ろ過、カラム操作等が好ましい。さ
らには、粒子内に超常磁性金属酸化物を含ませておいた
ものを固相担体として使用すれば、磁石等を用いた簡便
な磁気分離法が可能となり、より好適である。
【００２６】（ｅ）溶出工程は、上記（ｄ）工程におけ
るＤＮＡが吸着した核酸結合性固相担体から該ＤＮＡを
溶離させる工程である。このとき回収したＤＮＡは、透
析やエタノール沈殿法等の脱塩、濃縮操作を施すことな
く、制限酵素やＤＮＡポリメラーゼ等を使用した酵素反
応に直接使用することができる。
るＤＮＡが吸着した核酸結合性固相担体から該ＤＮＡを
溶離させる工程である。このとき回収したＤＮＡは、透
析やエタノール沈殿法等の脱塩、濃縮操作を施すことな
く、制限酵素やＤＮＡポリメラーゼ等を使用した酵素反
応に直接使用することができる。
【００２７】本発明によるＤＮＡの抽出精製方法は、単
純な工程から構成されるため、固相の分離操作や試薬分
注操作を自動化した核酸抽出装置へ容易に応用しうる。
純な工程から構成されるため、固相の分離操作や試薬分
注操作を自動化した核酸抽出装置へ容易に応用しうる。
【００２８】本発明のＤＮＡの抽出精製試薬は、（１）
界面活性剤および必要によりタンパク変性剤を含む溶解
液、（２）界面活性剤を抽出する有機溶媒、（３）カオ
トロピック物質を含む吸着液、（４）核酸結合性固相担
体、（５）洗浄液および（６）溶出液を含む。試薬キッ
トとしては、上記（１）〜（６）を任意に組み合わせ
る。その組成比は、使用目的に応じて種々選択される
が、その一例としては、（１）界面活性剤および必要に
よりタンパク変性剤を含む溶解液、約１００〜４００μ
ｌ、（２）界面活性剤を抽出する有機溶媒、約１００〜
４００μｌ、（３）カオトロピック物質を含む吸着液、
約４００〜８００μｌ、（４）核酸結合性固相担体、約
１０〜１００μ、（５）洗浄液、約５００〜１０００μ
ｌおよび（６）溶出液、約５０〜２００μｌがある。
界面活性剤および必要によりタンパク変性剤を含む溶解
液、（２）界面活性剤を抽出する有機溶媒、（３）カオ
トロピック物質を含む吸着液、（４）核酸結合性固相担
体、（５）洗浄液および（６）溶出液を含む。試薬キッ
トとしては、上記（１）〜（６）を任意に組み合わせ
る。その組成比は、使用目的に応じて種々選択される
が、その一例としては、（１）界面活性剤および必要に
よりタンパク変性剤を含む溶解液、約１００〜４００μ
ｌ、（２）界面活性剤を抽出する有機溶媒、約１００〜
４００μｌ、（３）カオトロピック物質を含む吸着液、
約４００〜８００μｌ、（４）核酸結合性固相担体、約
１０〜１００μ、（５）洗浄液、約５００〜１０００μ
ｌおよび（６）溶出液、約５０〜２００μｌがある。
【００２９】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもの
ではない。実施例１ タバコ緑葉からのＤＮＡの抽出 核酸抽出試料として、タバコ緑葉を用い、（ｉ）下記Ｃ
ＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド）溶液
（本発明）、（ii）カオトロピック物質だけを含む溶液
（従来法）の２種類の溶解液で、ＤＮＡ抽出の比較を行
った。タバコの葉を採取後、直ちに液体窒素にて凍結
し、予め液体窒素で冷却した乳鉢、乳棒を用いてパウダ
ー状になるまで粉砕し、これをＤＮＡ抽出試料とした。
説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもの
ではない。実施例１ タバコ緑葉からのＤＮＡの抽出 核酸抽出試料として、タバコ緑葉を用い、（ｉ）下記Ｃ
ＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド）溶液
（本発明）、（ii）カオトロピック物質だけを含む溶液
（従来法）の２種類の溶解液で、ＤＮＡ抽出の比較を行
った。タバコの葉を採取後、直ちに液体窒素にて凍結
し、予め液体窒素で冷却した乳鉢、乳棒を用いてパウダ
ー状になるまで粉砕し、これをＤＮＡ抽出試料とした。
【００３０】この抽出試料１００ｍｇに３００μｌの下
記溶解液本発明： ３％ ＣＴＡＢ １．５Ｍ 塩化ナトリウム １００ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．９） ２０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）従来法： ７Ｍ グアニジン塩酸塩 ５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５） を加えて、１０秒間ボルテックスミキサーで攪拌した
後、６５℃の湯浴で１０分間加熱し、細胞を溶解させる
とともに、ポリサッカライド、タンパクのＣＴＡＢとの
結合を促進した。この１０分間の間に５秒間の攪拌を２
回行った。
記溶解液本発明： ３％ ＣＴＡＢ １．５Ｍ 塩化ナトリウム １００ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．９） ２０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）従来法： ７Ｍ グアニジン塩酸塩 ５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５） を加えて、１０秒間ボルテックスミキサーで攪拌した
後、６５℃の湯浴で１０分間加熱し、細胞を溶解させる
とともに、ポリサッカライド、タンパクのＣＴＡＢとの
結合を促進した。この１０分間の間に５秒間の攪拌を２
回行った。
【００３１】続いて、３００μｌのクロロホルム溶液
(クロロホルム：イソアミルアルコール =２４：１ )を
加えて、よく攪拌した後、12,000回転で１分間遠心分離
を行い、水層を回収した。これを７Ｍグアニジン塩酸塩
で、８５０μｌにボリュームアップし、４０μｌの０．
５ｇ／ｍｌ磁性シリカ粒子 (粒径１〜１０μｍ、四三酸
化鉄粒子３０％含有、比表面積２８０ｍ2/ｇ、細孔容積
０．０２５ｍｌ／ｇ、表面細孔直径２〜６ｎｍ：鈴木油
脂社製 )の懸濁液を添加し、室温で１０分間攪拌した。
(クロロホルム：イソアミルアルコール =２４：１ )を
加えて、よく攪拌した後、12,000回転で１分間遠心分離
を行い、水層を回収した。これを７Ｍグアニジン塩酸塩
で、８５０μｌにボリュームアップし、４０μｌの０．
５ｇ／ｍｌ磁性シリカ粒子 (粒径１〜１０μｍ、四三酸
化鉄粒子３０％含有、比表面積２８０ｍ2/ｇ、細孔容積
０．０２５ｍｌ／ｇ、表面細孔直径２〜６ｎｍ：鈴木油
脂社製 )の懸濁液を添加し、室温で１０分間攪拌した。
【００３２】次に、マイクロチューブを磁気スタンド
（ＭＰＣ−Ｍ：ダイナル社製 )に設置して磁性シリカ粒
子を集め、上清を除去した。さらに、マイクロチューブ
を磁気スタンドから外し、９００μｌの洗浄液（7Mグア
ニジン塩酸塩、50 mM トリス−塩酸 (pH 7.5) ）を加え
て十分に攪拌した後、同様に磁気スタンドに設置して上
清を除去することにより、粒子を洗浄した。同様にし
て、９００μｌの洗浄液にて再度、粒子を洗浄し、続い
て９００μｌの７０％エタノールで２回粒子を洗浄し
た。上清を除去した後、１００μｌのＴＥバッファーを
添加し、室温で１０分間攪拌した後、磁気スタンドに設
置して磁性シリカ粒子を集め、上清を回収した。回収液
量はおよそ１００μｌであった。
（ＭＰＣ−Ｍ：ダイナル社製 )に設置して磁性シリカ粒
子を集め、上清を除去した。さらに、マイクロチューブ
を磁気スタンドから外し、９００μｌの洗浄液（7Mグア
ニジン塩酸塩、50 mM トリス−塩酸 (pH 7.5) ）を加え
て十分に攪拌した後、同様に磁気スタンドに設置して上
清を除去することにより、粒子を洗浄した。同様にし
て、９００μｌの洗浄液にて再度、粒子を洗浄し、続い
て９００μｌの７０％エタノールで２回粒子を洗浄し
た。上清を除去した後、１００μｌのＴＥバッファーを
添加し、室温で１０分間攪拌した後、磁気スタンドに設
置して磁性シリカ粒子を集め、上清を回収した。回収液
量はおよそ１００μｌであった。
【００３３】抽出精製は各溶解液について、ｎ＝２で行
い、抽出精製液のうち、５μｌをアガロースゲル電気泳
動に供し、エチジウムブロミド染色後、写真撮影した結
果を図１に示す。レーン１はラムダファージＤＮＡの H
indIII消化物からなるサイズマーカー、レーン２、３は
本発明法で抽出したもの、レーン４、５はカオトロピッ
ク物質を含む溶液だけで抽出したもの (従来法 )を示し
ている。図１から、本発明方法による抽出精製物が、従
来法の抽出精製物と比較して、収量が大幅に改善されて
いることが確認できた。
い、抽出精製液のうち、５μｌをアガロースゲル電気泳
動に供し、エチジウムブロミド染色後、写真撮影した結
果を図１に示す。レーン１はラムダファージＤＮＡの H
indIII消化物からなるサイズマーカー、レーン２、３は
本発明法で抽出したもの、レーン４、５はカオトロピッ
ク物質を含む溶液だけで抽出したもの (従来法 )を示し
ている。図１から、本発明方法による抽出精製物が、従
来法の抽出精製物と比較して、収量が大幅に改善されて
いることが確認できた。
【００３４】参考例１ ＰＣＲによるｒｂｃＬ遺伝子の検出 上記実施例 1にて得られた抽出精製液（本発明）に対し
て、ｒｂｃＬ遺伝子 (Ribulose-1,5-bisphosphate carb
oxylase/oxygenase large subunit gene、葉緑体ゲノム
上に存在 )をターゲットとして、ＰＣＲを行うことによ
り、該抽出精製液中の葉緑体由来ＤＮＡの検出を試み
た。設計したプライマーの増幅断片は約１．３ｋｂであ
る。ＰＣＲには、ＫＯＤＤａｓｈ ＤＮＡポリメラーゼ
（東洋紡績社製）を用いた。鋳型には実施例１で抽出精
製したＤＮＡを１００ｎｇ用いた。反応は全量を１００
μｌとし、９４℃で１分間ホットスタートを行った後、
９８℃、２０秒間、６２℃、２秒間、７４℃、９０秒間
を３０サイクル実施して、ＰＣＲを行った。なお、ＰＣ
ＲはＤＮＡサーマルサイクラーＰＪ２０００ (Perkin E
lmer社製 )で実施した。反応液のうち、５μｌをアガロ
ースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロミド染色後、
写真撮影した結果を図２に示す。
て、ｒｂｃＬ遺伝子 (Ribulose-1,5-bisphosphate carb
oxylase/oxygenase large subunit gene、葉緑体ゲノム
上に存在 )をターゲットとして、ＰＣＲを行うことによ
り、該抽出精製液中の葉緑体由来ＤＮＡの検出を試み
た。設計したプライマーの増幅断片は約１．３ｋｂであ
る。ＰＣＲには、ＫＯＤＤａｓｈ ＤＮＡポリメラーゼ
（東洋紡績社製）を用いた。鋳型には実施例１で抽出精
製したＤＮＡを１００ｎｇ用いた。反応は全量を１００
μｌとし、９４℃で１分間ホットスタートを行った後、
９８℃、２０秒間、６２℃、２秒間、７４℃、９０秒間
を３０サイクル実施して、ＰＣＲを行った。なお、ＰＣ
ＲはＤＮＡサーマルサイクラーＰＪ２０００ (Perkin E
lmer社製 )で実施した。反応液のうち、５μｌをアガロ
ースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロミド染色後、
写真撮影した結果を図２に示す。
【００３５】図中、レーン１、８はラムダファージＤＮ
Ａの HindIII消化物からなるサイズマーカー、レーン
２、３は実施例１に示す方法により抽出精製したＤＮＡ
のＰＣＲ増幅産物の泳動パターンを示している。約１．
３ｋｂの目的の増幅断片が得られ、葉緑体ＤＮＡの抽出
精製ならびに抽出精製したＤＮＡがそのまま、ＰＣＲに
用いることができることが確認できた。
Ａの HindIII消化物からなるサイズマーカー、レーン
２、３は実施例１に示す方法により抽出精製したＤＮＡ
のＰＣＲ増幅産物の泳動パターンを示している。約１．
３ｋｂの目的の増幅断片が得られ、葉緑体ＤＮＡの抽出
精製ならびに抽出精製したＤＮＡがそのまま、ＰＣＲに
用いることができることが確認できた。
【００３６】参考例２ ｒｂｃＬ−ＭＴ(Ribulose-1,5-bisphosphate carboxyla
se/oxygenase large subunit N-methyltransferase gen
e 、核ゲノム上に存在 )をターゲットとして、ＰＣＲを
行うことにより、実施例１にて得られた抽出精製液（本
発明）中の核由来ＤＮＡの検出を試みた。プライマーは
２組設計し、それぞれの増幅断片は、約 2.2kb、約
4.6kbである。ＰＣＲには、ＫＯＤ Ｄａｓｈ ＤＮＡ
ポリメラーゼ（東洋紡績社製）を用いた。鋳型には実施
例 1で抽出精製したＤＮＡを１００ｎｇ用いた。反応は
全量を１００μｌとし、９４℃で１分間ホットスタート
を行った後、 ２．２ｋｂ断片 ９８℃、２０秒間、６５℃、２秒間、７４℃、２分間を
３０サイクル ４．６ｋｂ断片 ９８℃、２０秒間、６６℃、２秒間、７４℃、４分間を
３５サイクル 実施し、ＰＣＲを行った。なお、ＰＣＲはＤＮＡサーマ
ルサイクラーＰＪ２０００ (Perkin Elmer社製)で実施
した。
se/oxygenase large subunit N-methyltransferase gen
e 、核ゲノム上に存在 )をターゲットとして、ＰＣＲを
行うことにより、実施例１にて得られた抽出精製液（本
発明）中の核由来ＤＮＡの検出を試みた。プライマーは
２組設計し、それぞれの増幅断片は、約 2.2kb、約
4.6kbである。ＰＣＲには、ＫＯＤ Ｄａｓｈ ＤＮＡ
ポリメラーゼ（東洋紡績社製）を用いた。鋳型には実施
例 1で抽出精製したＤＮＡを１００ｎｇ用いた。反応は
全量を１００μｌとし、９４℃で１分間ホットスタート
を行った後、 ２．２ｋｂ断片 ９８℃、２０秒間、６５℃、２秒間、７４℃、２分間を
３０サイクル ４．６ｋｂ断片 ９８℃、２０秒間、６６℃、２秒間、７４℃、４分間を
３５サイクル 実施し、ＰＣＲを行った。なお、ＰＣＲはＤＮＡサーマ
ルサイクラーＰＪ２０００ (Perkin Elmer社製)で実施
した。
【００３７】反応液のうち、７μｌをアガロースゲル電
気泳動に供し、エチジウムブロミド染色後、写真撮影し
た結果を図２に示す。図中、レーン１、８はラムダファ
ージＤＮＡの HindIII消化物からなるサイズマーカー、
レーン４、５は実施例１にて抽出精製したＤＮＡの２．
２ｋｂのＰＣＲ増幅産物の泳動パターン、レーン６、７
は実施例１にて抽出精製したＤＮＡの４．６ｋｂのＰＣ
Ｒ増幅産物の泳動パターンを示している。それぞれ約
２．２ｋｂ、４．６ｋｂの目的の増幅断片が得られ、核
ＤＮＡ抽出ならびに抽出したＤＮＡがそのまま、ＰＣ
Ｒ、さらにはｌｏｎｇ ＰＣＲに用いることができるこ
とが確認できた。
気泳動に供し、エチジウムブロミド染色後、写真撮影し
た結果を図２に示す。図中、レーン１、８はラムダファ
ージＤＮＡの HindIII消化物からなるサイズマーカー、
レーン４、５は実施例１にて抽出精製したＤＮＡの２．
２ｋｂのＰＣＲ増幅産物の泳動パターン、レーン６、７
は実施例１にて抽出精製したＤＮＡの４．６ｋｂのＰＣ
Ｒ増幅産物の泳動パターンを示している。それぞれ約
２．２ｋｂ、４．６ｋｂの目的の増幅断片が得られ、核
ＤＮＡ抽出ならびに抽出したＤＮＡがそのまま、ＰＣ
Ｒ、さらにはｌｏｎｇ ＰＣＲに用いることができるこ
とが確認できた。
【００３８】実施例２ タバコ緑葉からのＤＮＡの抽出 核酸抽出試料として、タバコ緑葉を用い、（ｉ）下記Ｃ
ＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド）およ
びグアニジン塩酸塩を含む溶液（本発明）、（ii）グア
ニジン塩酸塩だけを含む溶液（従来法）の２種類の溶解
液で、ＤＮＡ抽出の比較を実施例１と同様にして行っ
た。
ＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド）およ
びグアニジン塩酸塩を含む溶液（本発明）、（ii）グア
ニジン塩酸塩だけを含む溶液（従来法）の２種類の溶解
液で、ＤＮＡ抽出の比較を実施例１と同様にして行っ
た。
【００３９】下記溶解液本発明： ３％ ＣＴＡＢ ３Ｍ グアニジン塩酸塩 １．５Ｍ 塩化ナトリウム １００ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．９） ２０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０） 従来法： ７Ｍ グアニジン塩酸塩 ５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
【００４０】抽出精製は各溶解液について、ｎ＝２で行
い、抽出精製液のうち、５μｌをアガロースゲル電気泳
動に供し、エチジウムブロミド染色後、写真撮影した結
果を図３に示す。レーン１はラムダファージＤＮＡの H
indIII消化物からなるサイズマーカー、レーン２、３は
本発明法で抽出したもの、レーン４、５はカオトロピッ
ク物質を含む溶液だけで抽出したもの (従来法 )を示し
ている。図３から、本発明方法による抽出精製物が、従
来法の抽出精製物と比較して、収量が大幅に改善されて
いることが確認できた。
い、抽出精製液のうち、５μｌをアガロースゲル電気泳
動に供し、エチジウムブロミド染色後、写真撮影した結
果を図３に示す。レーン１はラムダファージＤＮＡの H
indIII消化物からなるサイズマーカー、レーン２、３は
本発明法で抽出したもの、レーン４、５はカオトロピッ
ク物質を含む溶液だけで抽出したもの (従来法 )を示し
ている。図３から、本発明方法による抽出精製物が、従
来法の抽出精製物と比較して、収量が大幅に改善されて
いることが確認できた。
【００４１】
【発明の効果】本発明によれば、界面活性剤および必要
によりタンパク変性剤を含む溶解液を使用し、界面活性
剤を除去した後、カオトピック物質を含む吸着液および
核酸結合性固相を中性乃至弱アルカリ性条件下に使用す
ることにより、植物材料に含まれるＤＮＡを特異的に該
固相に吸着させ、さらに溶出液を使用して、洗浄液にて
糖類およびタンパク類を除去して、煩雑な後処理操作を
必要とすることなく、植物ＤＮＡを簡便に回収し、抽出
精製することができる。さらに、本発明では植物細胞の
もつセルロースを主体とした強固な細胞壁によるカオト
ロピックを含む溶液による細胞の不十分な溶解、植物細
胞に豊富に含まれるポリサッカライドやポリフェノール
などの二次代謝産物による、ＤＮＡの核酸結合性固相担
体への吸着阻害などの問題点を解決することができる。
によりタンパク変性剤を含む溶解液を使用し、界面活性
剤を除去した後、カオトピック物質を含む吸着液および
核酸結合性固相を中性乃至弱アルカリ性条件下に使用す
ることにより、植物材料に含まれるＤＮＡを特異的に該
固相に吸着させ、さらに溶出液を使用して、洗浄液にて
糖類およびタンパク類を除去して、煩雑な後処理操作を
必要とすることなく、植物ＤＮＡを簡便に回収し、抽出
精製することができる。さらに、本発明では植物細胞の
もつセルロースを主体とした強固な細胞壁によるカオト
ロピックを含む溶液による細胞の不十分な溶解、植物細
胞に豊富に含まれるポリサッカライドやポリフェノール
などの二次代謝産物による、ＤＮＡの核酸結合性固相担
体への吸着阻害などの問題点を解決することができる。
【図１】 本発明方法または従来法により、タバコ緑葉
から抽出精製されたＤＮＡのアガロースゲル電気泳動パ
ターンを示す図面に代える写真である。
から抽出精製されたＤＮＡのアガロースゲル電気泳動パ
ターンを示す図面に代える写真である。
【図２】 本発明方法により、タバコ緑葉から抽出精製
された葉緑体ＤＮＡおよび核由来ＤＮＡのＰＣＲ増幅産
物のアガロースゲル電気泳動パターンを示す図面に代え
る写真である。
された葉緑体ＤＮＡおよび核由来ＤＮＡのＰＣＲ増幅産
物のアガロースゲル電気泳動パターンを示す図面に代え
る写真である。
【図３】 本発明方法または従来法により、タバコ緑葉
から抽出精製されたＤＮＡのアガロースゲル電気泳動パ
ターンを示す図面に代える写真である。
から抽出精製されたＤＮＡのアガロースゲル電気泳動パ
ターンを示す図面に代える写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 川上 文清 福井県敦賀市東洋町10番24号 東洋紡績株 式会社敦賀バイオ研究所内 (72)発明者 川村 良久 福井県敦賀市東洋町10番24号 東洋紡績株 式会社敦賀バイオ研究所内
Claims (9)
- 【請求項１】 下記工程（ａ）〜（ｅ）を含むことを特
徴とする植物ＤＮＡの抽出精製方法。 （ａ）植物材料に界面活性剤および必要によりタンパク
変性剤を含む溶解液を混合して、植物材料中の細胞を溶
解し、 （ｂ）得られた細胞溶解液に界面活性剤を抽出する有機
溶媒を加えて、混合した後、水相と有機溶媒相を分離
し、 （ｃ）得られた水相にカオトロピック物質を含む吸着液
および核酸結合性固相担体を中性乃至弱アルカリ性条件
下に混合させて、植物材料中の細胞に含まれるＤＮＡを
核酸結合性固相担体上に吸着させ、 （ｄ）ＤＮＡを吸着させた核酸結合性固相担体を洗浄液
にて洗浄して、植物細胞中に含まれる糖類およびタンパ
ク類を除去し、次いで、 （ｅ）核酸結合性固相担体に結合したＤＮＡを溶出す
る。 - 【請求項２】 界面活性剤が陽イオン界面活性剤である
請求項１記載のＤＮＡ抽出精製方法。 - 【請求項３】 界面活性剤がセチルトリメチルアンモニ
ウムブロミドである請求項１記載のＤＮＡの抽出精製方
法。 - 【請求項４】 タンパク変性剤がカオトロピック物質で
ある請求項１記載のＤＮＡ抽出精製方法。 - 【請求項５】 有機溶媒がクロロホルムまたはクロロホ
ルムとイソアミルアルコールの混合物である請求項１記
載のＤＮＡ抽出精製方法。 - 【請求項６】 核酸結合性固相担体が粒子である請求項
１記載のＤＮＡの抽出精製方法。 - 【請求項７】 核酸結合性固相担体に結合したＤＮＡを
溶出する溶出液が、水あるいはＴＥバッファーである請
求項１記載のＤＮＡの抽出精製方法。 - 【請求項８】 核酸結合性固相担体が超常磁性金属酸化
物を含む担体であって、さらに、磁力を利用して核酸結
合性固相担体と液相を分離する工程を含むことを特徴と
する請求項１記載のＤＮＡの抽出精製方法。 - 【請求項９】 （１）界面活性剤および必要によりタン
パク変性剤を含む溶解液、（２）界面活性剤を抽出する
有機溶媒、（３）カオトロピック物質を含む吸着液、
（４）核酸結合性固相担体、（５）洗浄液および（６）
溶出液を含むことを特徴とする植物ＤＮＡ抽出精製用試
薬。
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| JP34106697A JP3856174B2 (ja) | 1997-12-11 | 1997-12-11 | 植物ｄｎａの抽出精製方法 |
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1997
- 1997-12-11 JP JP34106697A patent/JP3856174B2/ja not_active Expired - Lifetime
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