JP2000146911A - 核酸を分離する方法 - Google Patents
核酸を分離する方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は、核酸をその他の細胞破砕物、特に
低いｐＨにおいて正味の電荷が正である物質から、酸性
条件下での電気泳動により分離するための方法に関す
る。 【解決手段】 本発明の精製法では、試料を電気泳動ゲ
ルにアプライしその試料を酸性条件下で電気泳動させる
ことにより、核酸が同一の生物学的試料中のタンパク質
から分離される。至適ｐＨは、試料の種類によって異な
る可能性があるが、当業者であれば容易に求めることが
できる。当該分離を約２〜約４のｐＨ範囲で行うことが
好ましい。より好ましくは電気泳動をｐＨ＝２．５で実
施する。
低いｐＨにおいて正味の電荷が正である物質から、酸性
条件下での電気泳動により分離するための方法に関す
る。 【解決手段】 本発明の精製法では、試料を電気泳動ゲ
ルにアプライしその試料を酸性条件下で電気泳動させる
ことにより、核酸が同一の生物学的試料中のタンパク質
から分離される。至適ｐＨは、試料の種類によって異な
る可能性があるが、当業者であれば容易に求めることが
できる。当該分離を約２〜約４のｐＨ範囲で行うことが
好ましい。より好ましくは電気泳動をｐＨ＝２．５で実
施する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、一般に、生物学的
試料中のタンパク質のような細胞破砕物から核酸を分離
する方法に関する。具体的には、本発明は、正味の電荷
が正である物質から核酸を分離するために低いｐＨにお
いて電気泳動を使用することに関する。
試料中のタンパク質のような細胞破砕物から核酸を分離
する方法に関する。具体的には、本発明は、正味の電荷
が正である物質から核酸を分離するために低いｐＨにお
いて電気泳動を使用することに関する。
【０００２】
【従来の技術】ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のよう
な非常に巧妙な増幅技法の開発をはじめとし、微量の核
酸を検出する技術がこの２０年間で急速に進歩してき
た。研究者らは、このような技術の価値が、人や動物の
被験体において疾患や遺伝的特徴を検出することにある
ことを容易に認識している。
な非常に巧妙な増幅技法の開発をはじめとし、微量の核
酸を検出する技術がこの２０年間で急速に進歩してき
た。研究者らは、このような技術の価値が、人や動物の
被験体において疾患や遺伝的特徴を検出することにある
ことを容易に認識している。
【０００３】ＰＣＲは、当該技術分野における顕著な進
歩であって、極微量の目的核酸の検出を可能ならしめる
ものである。ＰＣＲの詳細については、例えば、米国特
許第４，６８３，１９５号（Ｍｕｌｌｉｓら）、同第
４，６８３，２０２号（Ｍｕｌｌｉｓら）及び同第４，
９６５，１８８号（Ｍｕｌｌｉｓら）に記載されている
が、この分野の文献数は急速に増加しつつある。詳細に
は説明しないが、ＰＣＲには、重合剤（例えば、ＤＮＡ
ポリメラーゼ）とデオキシリボヌクレオシドトリホスフ
ェートの存在下、目的とする核酸の鎖（「鋳型」とみな
される）にプライマーを適当な条件下でハイブリダイズ
させる工程が含まれる。その結果、鋳型に相補的なヌク
レオチドが鋳型に沿って付加されたプライマー伸長生成
物が形成される。
歩であって、極微量の目的核酸の検出を可能ならしめる
ものである。ＰＣＲの詳細については、例えば、米国特
許第４，６８３，１９５号（Ｍｕｌｌｉｓら）、同第
４，６８３，２０２号（Ｍｕｌｌｉｓら）及び同第４，
９６５，１８８号（Ｍｕｌｌｉｓら）に記載されている
が、この分野の文献数は急速に増加しつつある。詳細に
は説明しないが、ＰＣＲには、重合剤（例えば、ＤＮＡ
ポリメラーゼ）とデオキシリボヌクレオシドトリホスフ
ェートの存在下、目的とする核酸の鎖（「鋳型」とみな
される）にプライマーを適当な条件下でハイブリダイズ
させる工程が含まれる。その結果、鋳型に相補的なヌク
レオチドが鋳型に沿って付加されたプライマー伸長生成
物が形成される。
【０００４】このプライマー伸長生成物を変性すると、
鋳型の複製物が一つ調製されたことになり、このプライ
ミング、伸長及び変性のサイクルを所望の回数実施する
ことにより、目的核酸と同一の配列を有する核酸の量を
対数増加させることができる。実際に、目的の核酸を、
その検出が一層容易となるように何回も複製（又は増
幅）する。
鋳型の複製物が一つ調製されたことになり、このプライ
ミング、伸長及び変性のサイクルを所望の回数実施する
ことにより、目的核酸と同一の配列を有する核酸の量を
対数増加させることができる。実際に、目的の核酸を、
その検出が一層容易となるように何回も複製（又は増
幅）する。
【０００５】目的の核酸を効果的に増幅し検出するため
には、或いは、目的の核酸をクローニング又は配列決定
するためには、その核酸を他の妨害となる生体分子の混
合物から単離又は分離しなければならないことが多い
（Ｍｏｏｒｅ Ｄ．，１９７７，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏ
ｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ．Ｕｎｉ
ｔ ２．２ Ｉｎ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅ
ｄ．），ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．ＪｏｈｎＷｉｌｅ
ｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。
には、或いは、目的の核酸をクローニング又は配列決定
するためには、その核酸を他の妨害となる生体分子の混
合物から単離又は分離しなければならないことが多い
（Ｍｏｏｒｅ Ｄ．，１９７７，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏ
ｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ．Ｕｎｉ
ｔ ２．２ Ｉｎ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅ
ｄ．），ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．ＪｏｈｎＷｉｌｅ
ｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。
【０００６】現在のところ、核酸調製物からタンパク質
その他の不純物を取り除くために数種類の手順が用いら
れている。伝統的には、生物学的試料をプロテアーゼで
消化し、不純物を有機抽出法により核酸から除去する
（Ｍｏｏｒｅ Ｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏ
ｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）。
しかしながら、この方法には、有害な有機溶媒を使用す
ることや、水相を新しいチューブへ何回も移す必要があ
るため退屈で、労働集約的であり、しかも試料の交雑汚
染の危険性が増す、等の多くの欠点があることが認識さ
れている。
その他の不純物を取り除くために数種類の手順が用いら
れている。伝統的には、生物学的試料をプロテアーゼで
消化し、不純物を有機抽出法により核酸から除去する
（Ｍｏｏｒｅ Ｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏ
ｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）。
しかしながら、この方法には、有害な有機溶媒を使用す
ることや、水相を新しいチューブへ何回も移す必要があ
るため退屈で、労働集約的であり、しかも試料の交雑汚
染の危険性が増す、等の多くの欠点があることが認識さ
れている。
【０００７】最近では、カオトロピック塩においてガラ
スに吸着させる方法による核酸の精製法が普及してきた
（Ｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｃｌｉｎｉ
ｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２８：４９５−５０
３）。しかしながら、この分離法も、バインディング容
量の非常に小さいガラスを使用すること、カオトロピッ
ク塩を使用すること、そしてガラス／核酸複合体を何度
も洗浄し、その洗浄液を除去しなければならないために
退屈で時間がかかること、といった多くの欠点に悩まさ
れる。
スに吸着させる方法による核酸の精製法が普及してきた
（Ｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｃｌｉｎｉ
ｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２８：４９５−５０
３）。しかしながら、この分離法も、バインディング容
量の非常に小さいガラスを使用すること、カオトロピッ
ク塩を使用すること、そしてガラス／核酸複合体を何度
も洗浄し、その洗浄液を除去しなければならないために
退屈で時間がかかること、といった多くの欠点に悩まさ
れる。
【０００８】ＤＮＡ精製のためのポリマー捕捉法である
イオン交換法を使用して核酸を単離することも行われて
いる（米国特許第５，５８２，９８８号、同第５，４３
４，２７０号及び同第５，５２３，３６８号）。残念な
がら、この方法は、ＲＮＡが捕捉、解放のどちらの際に
も分解するため、特に現在実施されている条件下でＲＮ
Ａを精製する場合には適さない。ポリマー／核酸の最適
な捕捉条件下ではリボヌクレアーゼが高いためにＲＮＡ
の分解をもたらし、また核酸をポリマーから解放するの
に必要な高いｐＨが化学的加水分解をもたらす。
イオン交換法を使用して核酸を単離することも行われて
いる（米国特許第５，５８２，９８８号、同第５，４３
４，２７０号及び同第５，５２３，３６８号）。残念な
がら、この方法は、ＲＮＡが捕捉、解放のどちらの際に
も分解するため、特に現在実施されている条件下でＲＮ
Ａを精製する場合には適さない。ポリマー／核酸の最適
な捕捉条件下ではリボヌクレアーゼが高いためにＲＮＡ
の分解をもたらし、また核酸をポリマーから解放するの
に必要な高いｐＨが化学的加水分解をもたらす。
【０００９】電気泳動による分離法は、有害な物質、高
いｐＨ及び退屈な操作を回避するように設計できるた
め、魅力的な技法である。さらに、電気泳動による分離
法は自動化されたフォーマットに適合しやすい。電気泳
動法はほとんどが分析的規模で採用されているが、小規
模の調製手順もまた数多く開発されている（Ａｎｄｒｅ
ｗｓ，Ａ．Ｔ．，１９８６，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅ
ｓｉｓ： Ｔｈｅｏｒｙａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ
ｓ，ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄＣｌｉｎ
ｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２ｎｄ ｅｄｉ
ｔｉｏｎ．Ｃｌａｒｅｎｄｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏ
ｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）。ポリビニルピロリドン／アガ
ロースゲル上での電気泳動により腐植物質その他のＰＣ
Ｒを阻害する不純物からＤＮＡを分離する方法も報告さ
れている（Ｈｅｒｒｉｃｋｅｔ ａｌ．，１９９３，Ａ
ｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５９：
６８７−６９４及びＹｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９
３，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．
５９：１９７２−１９７４）。さらに、Ｓｈｅｌｄｏｎ
とその共同研究者は、核酸の電気泳動による精製のため
の装置を開発した。細胞又は血液試料をプロテアーゼで
溶解し、その溶解物を当該装置に装填する。核酸は、ポ
リマー層中の電気泳動により不純物から分離され且つ、
分子量で仕切る膜によりコレクションチャンバーに保持
される一方、分解されたタンパク質その他低分子量物質
は当該膜を通過する（Ｓｈｅｌｄｏｎ Ｅ．Ｌ．，１９
９７．Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｓａｍｐｌｅ Ｈａｎｄ
ｌｉｎｇ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｕｓｉｎｅ
ｓｓ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｗｏｒｋｓｈｏｐにて
発表、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．，Ｊｕｎｅ ９，１
９９７）。
いｐＨ及び退屈な操作を回避するように設計できるた
め、魅力的な技法である。さらに、電気泳動による分離
法は自動化されたフォーマットに適合しやすい。電気泳
動法はほとんどが分析的規模で採用されているが、小規
模の調製手順もまた数多く開発されている（Ａｎｄｒｅ
ｗｓ，Ａ．Ｔ．，１９８６，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅ
ｓｉｓ： Ｔｈｅｏｒｙａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ
ｓ，ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄＣｌｉｎ
ｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２ｎｄ ｅｄｉ
ｔｉｏｎ．Ｃｌａｒｅｎｄｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏ
ｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）。ポリビニルピロリドン／アガ
ロースゲル上での電気泳動により腐植物質その他のＰＣ
Ｒを阻害する不純物からＤＮＡを分離する方法も報告さ
れている（Ｈｅｒｒｉｃｋｅｔ ａｌ．，１９９３，Ａ
ｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５９：
６８７−６９４及びＹｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９
３，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．
５９：１９７２−１９７４）。さらに、Ｓｈｅｌｄｏｎ
とその共同研究者は、核酸の電気泳動による精製のため
の装置を開発した。細胞又は血液試料をプロテアーゼで
溶解し、その溶解物を当該装置に装填する。核酸は、ポ
リマー層中の電気泳動により不純物から分離され且つ、
分子量で仕切る膜によりコレクションチャンバーに保持
される一方、分解されたタンパク質その他低分子量物質
は当該膜を通過する（Ｓｈｅｌｄｏｎ Ｅ．Ｌ．，１９
９７．Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｓａｍｐｌｅ Ｈａｎｄ
ｌｉｎｇ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｕｓｉｎｅ
ｓｓ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｗｏｒｋｓｈｏｐにて
発表、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．，Ｊｕｎｅ ９，１
９９７）。
【００１０】電気泳動による分離法は、上記の例をはじ
めとし、ほとんどが中性に近いｐＨで行われているが、
低いｐＨでの電気泳動が有利な場合もある。例えば、巨
大分子の中には低いｐＨの方が分離効率が高くなるもの
がある。ヌクレオチド又は低分子量ポリヌクレオチドの
混合物は低いｐＨの方が分離性が良くなる。これは、ヌ
クレオチドの電荷が、ｐＨ＝２〜５の範囲では−１〜０
の変動を示すが、ｐＨ＝６〜８の範囲ではほとんどが同
一の電荷（−２）を示すからである（Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．
Ｄ．，１９７６，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１
２：３５０−３６１）。同様に、等電点電気泳動法で
は、酸性タンパク質がｐＨ勾配中のｐＫａにおいて単離
される（Ａｎｄｒｅｗｓ，Ａ．Ｔ．，１９８６）。さら
に、低いｐＨの方が安定性が高くなる構造もある。Ｔｅ
ｒｗｉｌｌｉｎｇｅｒとＣｌａｒｋｅは、酸性条件（ｐ
Ｈ＝２．５）が電気泳動時のタンパク質メチルエステル
の加水分解を最小限に抑えるのに役立つことを報告して
いる（Ｔｅｒｗｉｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９
８１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：３０６７−７
５）。同様に、温和な酸性条件（ｐＨ＝４．５）でＢ−
ＤＮＡのトリプルヘリックス構造が安定化される（Ｍｉ
ｒｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２３４：１５１２−１６）。
めとし、ほとんどが中性に近いｐＨで行われているが、
低いｐＨでの電気泳動が有利な場合もある。例えば、巨
大分子の中には低いｐＨの方が分離効率が高くなるもの
がある。ヌクレオチド又は低分子量ポリヌクレオチドの
混合物は低いｐＨの方が分離性が良くなる。これは、ヌ
クレオチドの電荷が、ｐＨ＝２〜５の範囲では−１〜０
の変動を示すが、ｐＨ＝６〜８の範囲ではほとんどが同
一の電荷（−２）を示すからである（Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．
Ｄ．，１９７６，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１
２：３５０−３６１）。同様に、等電点電気泳動法で
は、酸性タンパク質がｐＨ勾配中のｐＫａにおいて単離
される（Ａｎｄｒｅｗｓ，Ａ．Ｔ．，１９８６）。さら
に、低いｐＨの方が安定性が高くなる構造もある。Ｔｅ
ｒｗｉｌｌｉｎｇｅｒとＣｌａｒｋｅは、酸性条件（ｐ
Ｈ＝２．５）が電気泳動時のタンパク質メチルエステル
の加水分解を最小限に抑えるのに役立つことを報告して
いる（Ｔｅｒｗｉｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９
８１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：３０６７−７
５）。同様に、温和な酸性条件（ｐＨ＝４．５）でＢ−
ＤＮＡのトリプルヘリックス構造が安定化される（Ｍｉ
ｒｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２３４：１５１２−１６）。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】したがって、核酸、特
に血液や血漿のようなタンパク質の豊富な源に由来する
核酸を調製するための電気泳動に低いｐＨ条件を採用で
きれば望ましく且つ有利であろう。遍在し且つ電気泳動
中に核酸を分解するヌクレアーゼ、特にリボヌクレアー
ゼは、低いｐＨにおいて不活化される（Ｋａｌｎｉｔｓ
ｋｙ ｅｔ ａｌ．，１９５９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２３４：１５１２−１６）。その上、ほとんどの核
酸とタンパク質は、酸性条件下では反対の電荷を有する
ため、電界の中で逆方向に移動する。ｐＨ＝２におい
て、第一ホスフェート基のｐＫａは２未満であるがアミ
ン基のｐＫａは２〜５の範囲にあるため、核酸はなおも
負に帯電する（Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｄ．，１９７６）。他
方、ほとんどのタンパク質は、そのすべてのアミン基及
び大部分のカルボキシル基のｐＫａが２よりもはるかに
高いため、完全にプロトン化し、よって正に帯電する。
に血液や血漿のようなタンパク質の豊富な源に由来する
核酸を調製するための電気泳動に低いｐＨ条件を採用で
きれば望ましく且つ有利であろう。遍在し且つ電気泳動
中に核酸を分解するヌクレアーゼ、特にリボヌクレアー
ゼは、低いｐＨにおいて不活化される（Ｋａｌｎｉｔｓ
ｋｙ ｅｔ ａｌ．，１９５９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２３４：１５１２−１６）。その上、ほとんどの核
酸とタンパク質は、酸性条件下では反対の電荷を有する
ため、電界の中で逆方向に移動する。ｐＨ＝２におい
て、第一ホスフェート基のｐＫａは２未満であるがアミ
ン基のｐＫａは２〜５の範囲にあるため、核酸はなおも
負に帯電する（Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｄ．，１９７６）。他
方、ほとんどのタンパク質は、そのすべてのアミン基及
び大部分のカルボキシル基のｐＫａが２よりもはるかに
高いため、完全にプロトン化し、よって正に帯電する。
【００１２】
【課題を解決するための手段】したがって、本発明は上
記課題を解決すべく、低いｐＨにおいて正味の電荷が正
である物質から酸性条件下での電気泳動により核酸を分
離するのに必要な手段を提供する。低いｐＨにおける電
気泳動は、核酸精製のための現行法にまつわる問題の多
くを解決することにもなる。上述のように、低いｐＨで
はヌクレアーゼ活性が低くなるため、核酸は中性ｐＨに
おけるよりも安定性が高くなる。その上、試料を装填し
てしまえば、電気泳動は手がかからない方法である。最
後に、有害な材料を必要とすることもまったくない。本
発明の様々な目的、利点については本発明の詳細な説明
で明らかとなる。
記課題を解決すべく、低いｐＨにおいて正味の電荷が正
である物質から酸性条件下での電気泳動により核酸を分
離するのに必要な手段を提供する。低いｐＨにおける電
気泳動は、核酸精製のための現行法にまつわる問題の多
くを解決することにもなる。上述のように、低いｐＨで
はヌクレアーゼ活性が低くなるため、核酸は中性ｐＨに
おけるよりも安定性が高くなる。その上、試料を装填し
てしまえば、電気泳動は手がかからない方法である。最
後に、有害な材料を必要とすることもまったくない。本
発明の様々な目的、利点については本発明の詳細な説明
で明らかとなる。
【００１３】
【発明の実施の形態】本発明は、核酸をその他の細胞破
砕物、特に低いｐＨにおいて正味の電荷が正である物質
から、酸性条件下での電気泳動により分離するための方
法に関する。本発明の精製法では、試料を電気泳動ゲル
にアプライしその試料を酸性条件下で電気泳動させるこ
とにより、核酸が同一の生物学的試料中のタンパク質か
ら分離される。至適ｐＨは、試料の種類によって異なる
可能性があるが、当業者であれば容易に求めることがで
きる。当該分離を約２〜約４のｐＨ範囲で行うことが好
ましい。より好ましくは、電気泳動をｐＨ＝２．５で実
施する。
砕物、特に低いｐＨにおいて正味の電荷が正である物質
から、酸性条件下での電気泳動により分離するための方
法に関する。本発明の精製法では、試料を電気泳動ゲル
にアプライしその試料を酸性条件下で電気泳動させるこ
とにより、核酸が同一の生物学的試料中のタンパク質か
ら分離される。至適ｐＨは、試料の種類によって異なる
可能性があるが、当業者であれば容易に求めることがで
きる。当該分離を約２〜約４のｐＨ範囲で行うことが好
ましい。より好ましくは、電気泳動をｐＨ＝２．５で実
施する。
【００１４】約２〜４のｐＨ範囲では、ホスフェート基
のｐＫａが低いためにほとんどの核酸は正味の電荷が負
となるが、ほとんどのタンパク質は、その官能基（アミ
ノ基及びカルボキシル基）がはるかに高いｐＫａを有す
るために、正味の電荷が正となる。その結果、ほとんど
の核酸とタンパク質は、約２〜４のｐＨ範囲での電気泳
動に際して反対方向に移動する。この方法は、核酸を調
製するための現行の電気泳動法、すなわち核酸とタンパ
ク質とが同一方向（アノード方向）に移動するようなｐ
Ｈにおいて実施される方法とは相違する。分子が反対方
向に移動すると、分離は完全性、効率共に一層高くな
る。
のｐＫａが低いためにほとんどの核酸は正味の電荷が負
となるが、ほとんどのタンパク質は、その官能基（アミ
ノ基及びカルボキシル基）がはるかに高いｐＫａを有す
るために、正味の電荷が正となる。その結果、ほとんど
の核酸とタンパク質は、約２〜４のｐＨ範囲での電気泳
動に際して反対方向に移動する。この方法は、核酸を調
製するための現行の電気泳動法、すなわち核酸とタンパ
ク質とが同一方向（アノード方向）に移動するようなｐ
Ｈにおいて実施される方法とは相違する。分子が反対方
向に移動すると、分離は完全性、効率共に一層高くな
る。
【００１５】試料のｐＨは、ｐＨシフトによりＲＮＡａ
ｓｅ活性を迅速且つ効率的に阻害する必要があるため、
試料をゲルにアプライする前に調整すべきである。本発
明において酸性ｐＨを達成するために使用するのに適し
た試薬として、ＨＣｌ、グリシン−ＨＣｌ、硫酸又はリ
ン酸、その他のホスフェート、フタレート、フマレー
ト、タルトレート、シトレート、グリシルグリシン、フ
ロエート又はホルメートのような緩衝剤が挙げられる
が、これらに限定はされない。
ｓｅ活性を迅速且つ効率的に阻害する必要があるため、
試料をゲルにアプライする前に調整すべきである。本発
明において酸性ｐＨを達成するために使用するのに適し
た試薬として、ＨＣｌ、グリシン−ＨＣｌ、硫酸又はリ
ン酸、その他のホスフェート、フタレート、フマレー
ト、タルトレート、シトレート、グリシルグリシン、フ
ロエート又はホルメートのような緩衝剤が挙げられる
が、これらに限定はされない。
【００１６】本発明を実施するために各種の装置及びフ
ォーマットを使用することができる。後述の実施例では
ＧｅｎｅＣＡＰＳＵＬＥ（商標）を使用するが、その他
の予め組み立てられた直接注入装置でも好適である。そ
の上、目的の分子を、均質マトリックス中の電気泳動で
得られるよりも不純物からきれいに分離するために、調
製用の等電点電気泳動法、特にｐＨ勾配を固定した方式
を使用することができる（Ｒｉｇｈｅｔｔｉ及びＷｅｎ
ｉｓｃｈ，１９９７，ＰｒｅｐａｒａｔｉｖｅＩｓｏｅ
ｌｅｃｔｒｉｃ Ｆｏｃｕｓｉｎｇ Ｕｓｉｎｇ Ｉｍ
ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ： Ｔｈｅｏ
ｒｙ ａｎｄ Ｈｉｓｔｏｒｙ．ＩｓｏＰｒｉｍｅ Ａ
ｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏｔｅ；Ｎｏ．１ Ｈｏｅｆ
ｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ
ｓ）。
ォーマットを使用することができる。後述の実施例では
ＧｅｎｅＣＡＰＳＵＬＥ（商標）を使用するが、その他
の予め組み立てられた直接注入装置でも好適である。そ
の上、目的の分子を、均質マトリックス中の電気泳動で
得られるよりも不純物からきれいに分離するために、調
製用の等電点電気泳動法、特にｐＨ勾配を固定した方式
を使用することができる（Ｒｉｇｈｅｔｔｉ及びＷｅｎ
ｉｓｃｈ，１９９７，ＰｒｅｐａｒａｔｉｖｅＩｓｏｅ
ｌｅｃｔｒｉｃ Ｆｏｃｕｓｉｎｇ Ｕｓｉｎｇ Ｉｍ
ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ： Ｔｈｅｏ
ｒｙ ａｎｄ Ｈｉｓｔｏｒｙ．ＩｓｏＰｒｉｍｅ Ａ
ｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏｔｅ；Ｎｏ．１ Ｈｏｅｆ
ｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ
ｓ）。
【００１７】本発明の分離法により、有害材料、退屈な
移し替え又は抽出が無いなど、従来の核酸精製法よりも
有利な点が数多く得られる。さらに、中性付近のｐＨの
代わりに酸性条件下（ｐＨ≦３）で電気泳動を行うの
で、ヌクレアーゼは実質的に不活性であり、ＲＮＡの化
学的安定性が高くなる。その上、ｐＨ＝２．５のような
酸性条件下では、核酸とほとんどのタンパク質とは反対
の電極に向かって移動するので、分離の効率、完全性共
に高くなる。
移し替え又は抽出が無いなど、従来の核酸精製法よりも
有利な点が数多く得られる。さらに、中性付近のｐＨの
代わりに酸性条件下（ｐＨ≦３）で電気泳動を行うの
で、ヌクレアーゼは実質的に不活性であり、ＲＮＡの化
学的安定性が高くなる。その上、ｐＨ＝２．５のような
酸性条件下では、核酸とほとんどのタンパク質とは反対
の電極に向かって移動するので、分離の効率、完全性共
に高くなる。
【００１８】核酸が、生物学的試料中に存在するタンパ
ク質から分離されたら、電界を取り除き、そして分離さ
れた核酸を当該技術分野で周知の技法によりゲルから取
り出すことができる。その後、このように精製された核
酸は、ＰＣＲやリガーゼ連鎖反応等の標準的な増幅法及
び／又は検出法に用いるのに適したものとなる。
ク質から分離されたら、電界を取り除き、そして分離さ
れた核酸を当該技術分野で周知の技法によりゲルから取
り出すことができる。その後、このように精製された核
酸は、ＰＣＲやリガーゼ連鎖反応等の標準的な増幅法及
び／又は検出法に用いるのに適したものとなる。
【００１９】ＰＣＲによる核酸の増幅、検出のための一
般原理及び条件については周知であり、その詳細につい
ては米国特許第４，６８３，１９５号（Ｍｕｌｌｉｓ
ら）、同第４，６８３，２０２号（Ｍｕｌｌｉｓら）及
び同第４，９６５，１８８号（Ｍｕｌｌｉｓら）をはじ
めとする多数の文献に記載されており、本明細書ではこ
れらを参照することにより明細書の一部とする。このよ
うに、当該技術分野の教示及びその中の具体的な教示に
照らして、当業者であれば、増幅アッセイにおいて完全
なＲＮＡもしくはＤＮＡの回収効率が低いことによるか
又は増幅インヒビターの存在による偽陰性の結果を排除
するために本発明を実施することに何ら困難を伴うこと
はないはずである。用語「生物学的試料」には、細胞材
料、ウイルス材料、毛髪、体液又は検出できる核酸を含
む細胞材料が包含されるが、これらに限定はされない。
般原理及び条件については周知であり、その詳細につい
ては米国特許第４，６８３，１９５号（Ｍｕｌｌｉｓ
ら）、同第４，６８３，２０２号（Ｍｕｌｌｉｓら）及
び同第４，９６５，１８８号（Ｍｕｌｌｉｓら）をはじ
めとする多数の文献に記載されており、本明細書ではこ
れらを参照することにより明細書の一部とする。このよ
うに、当該技術分野の教示及びその中の具体的な教示に
照らして、当業者であれば、増幅アッセイにおいて完全
なＲＮＡもしくはＤＮＡの回収効率が低いことによるか
又は増幅インヒビターの存在による偽陰性の結果を排除
するために本発明を実施することに何ら困難を伴うこと
はないはずである。用語「生物学的試料」には、細胞材
料、ウイルス材料、毛髪、体液又は検出できる核酸を含
む細胞材料が包含されるが、これらに限定はされない。
【００２０】本明細書に記載した方法を用いて、感染疾
患、遺伝病もしくは細胞病、例えばガン、又はその他の
これらのカテゴリーに具体的に含まれない何らかの疾患
状態に関連する特異的な核酸配列を検出することができ
る。また、法医学的調査やＤＮＡタイピングにも使用す
ることができる。本発明の目的に関し、遺伝病にはすべ
ての生物に由来するゲノムＤＮＡの特異的欠失又は変
異、例えば、鎌型赤血球貧血、嚢性線維症、α−地中海
貧血、β−地中海貧血その他当業者に自明なものが包含
される。ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）を本発明で分類する
ことができる。検出可能なバクテリアとして、血液中に
存在し得るバクテリア、サルモネラ、連鎖球菌種、クラ
ミジア種、淋菌種、マイコバクテリア種（例、ヒト結核
菌及び鳥結核菌の複合体）、マイコプラズマ種（例、イ
ンフルエンザ菌及び肺炎マイコプラズマ）、レジュネラ
・ニューモフィラ菌、ボレリア症菌（Ｂｏｒｒｅｌｉａ
ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｅｉ）、ニューモシスティス・
カリニ、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔ
ｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、キャンピロバク
ター種、エルジニア種、赤痢菌種及びリステリア種が挙
げられるが、これらに限定はされない。検出可能なウイ
ルスとして、単純性庖疹ウイルス、エプスタイン−バー
ウイルス、呼吸性合胞体ウイルス、肝炎ウイルス及びレ
トロウイルス、合胞体ウイルス、肝炎ウイルス及びレト
ロウイルス（例、ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、ＨＩ
Ｖ−Ｉ及びＨＩＶ−ＩＩ）が挙げられるが、これらに限
定はされない。さらに、原生動物寄生体及び菌類（酵母
やカビを含む）も検出可能である。その他の検出可能な
種については当業者であれば自明である。本発明は、各
種バクテリア又はウイルスに関連するＲＮＡの有無を検
出する場合に特に有用である。
患、遺伝病もしくは細胞病、例えばガン、又はその他の
これらのカテゴリーに具体的に含まれない何らかの疾患
状態に関連する特異的な核酸配列を検出することができ
る。また、法医学的調査やＤＮＡタイピングにも使用す
ることができる。本発明の目的に関し、遺伝病にはすべ
ての生物に由来するゲノムＤＮＡの特異的欠失又は変
異、例えば、鎌型赤血球貧血、嚢性線維症、α−地中海
貧血、β−地中海貧血その他当業者に自明なものが包含
される。ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）を本発明で分類する
ことができる。検出可能なバクテリアとして、血液中に
存在し得るバクテリア、サルモネラ、連鎖球菌種、クラ
ミジア種、淋菌種、マイコバクテリア種（例、ヒト結核
菌及び鳥結核菌の複合体）、マイコプラズマ種（例、イ
ンフルエンザ菌及び肺炎マイコプラズマ）、レジュネラ
・ニューモフィラ菌、ボレリア症菌（Ｂｏｒｒｅｌｉａ
ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｅｉ）、ニューモシスティス・
カリニ、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔ
ｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、キャンピロバク
ター種、エルジニア種、赤痢菌種及びリステリア種が挙
げられるが、これらに限定はされない。検出可能なウイ
ルスとして、単純性庖疹ウイルス、エプスタイン−バー
ウイルス、呼吸性合胞体ウイルス、肝炎ウイルス及びレ
トロウイルス、合胞体ウイルス、肝炎ウイルス及びレト
ロウイルス（例、ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、ＨＩ
Ｖ−Ｉ及びＨＩＶ−ＩＩ）が挙げられるが、これらに限
定はされない。さらに、原生動物寄生体及び菌類（酵母
やカビを含む）も検出可能である。その他の検出可能な
種については当業者であれば自明である。本発明は、各
種バクテリア又はウイルスに関連するＲＮＡの有無を検
出する場合に特に有用である。
【００２１】
【実施例】材料 塩酸はＢａｋｅｒ社の試薬級とした。グリシン（分子生
物学級）、子牛胸腺ＤＮＡ、Ｅ．Ｃｏｌｉ由来の５Ｓ
ｒＲＮＡ及びＥ．Ｃｏｌｉ由来の１６Ｓ＋２３Ｓ ｒＲ
ＮＡはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（Ｓｔ．Ｌｏｕ
ｉｓ，ＭＯ）のものとした。ｐＴＲＩ−Ｘｅｆ１転写体
は、製造業者の指示に従いインビトロ転写系でＡｍｂｉ
ｏｎのＭｅｇａｓｃｒｉｐｔを含むＡｍｂｉｏｎ社（Ａ
ｕｓｔｉｎ，ＴＸ）のｐＴＲＩ−Ｘｅｆ１プラスミドか
ら合成した。アガロースは、ＦＭＣ Ｂｉｏｐｒｏｄｕ
ｃｔｓ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＥ）のＳｅａＫｅｍ Ｌ
Ｅとした。ＧｅｎｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（Ｓｔ．Ｌ
ｏｕｉｓ，ＭＯ）のＧｅｎｅＣＡＰＳＵＬＥ（商標）電
気溶離装置を使用し、製造業者の指示を下記実施例２に
記載したように変更することにより、ＲＮＡをタンパク
質から分離した。タンパク質の水準については、Ｐｉｅ
ｒｃｅ社（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）のＢＣＡタンパク
質アッセイ用試薬キットを製造業者の指示に従い使用し
て測定した。
物学級）、子牛胸腺ＤＮＡ、Ｅ．Ｃｏｌｉ由来の５Ｓ
ｒＲＮＡ及びＥ．Ｃｏｌｉ由来の１６Ｓ＋２３Ｓ ｒＲ
ＮＡはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（Ｓｔ．Ｌｏｕ
ｉｓ，ＭＯ）のものとした。ｐＴＲＩ−Ｘｅｆ１転写体
は、製造業者の指示に従いインビトロ転写系でＡｍｂｉ
ｏｎのＭｅｇａｓｃｒｉｐｔを含むＡｍｂｉｏｎ社（Ａ
ｕｓｔｉｎ，ＴＸ）のｐＴＲＩ−Ｘｅｆ１プラスミドか
ら合成した。アガロースは、ＦＭＣ Ｂｉｏｐｒｏｄｕ
ｃｔｓ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＥ）のＳｅａＫｅｍ Ｌ
Ｅとした。ＧｅｎｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（Ｓｔ．Ｌ
ｏｕｉｓ，ＭＯ）のＧｅｎｅＣＡＰＳＵＬＥ（商標）電
気溶離装置を使用し、製造業者の指示を下記実施例２に
記載したように変更することにより、ＲＮＡをタンパク
質から分離した。タンパク質の水準については、Ｐｉｅ
ｒｃｅ社（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）のＢＣＡタンパク
質アッセイ用試薬キットを製造業者の指示に従い使用し
て測定した。
【００２２】実施例１ 酸性条件下での電気泳動に際して核酸がアノードの方向
へ移動することを確かめるため、１％アガロースゲルを
調製し、どちらもｐＨ＝２．５の３ｍＭのＨＣｌ又は５
０ｍＭのグリシン−ＨＣｌにおいて実験した。子牛胸腺
ＤＮＡ（図１中第１レーン）、１．９ｋｂ ｍＲＮＡ
（ｐＴＲＩ−Ｘｅｆ１転写体；第２レーン）、Ｅ．Ｃｏ
ｌｉ由来の１６Ｓ＋２３Ｓ ｒＲＮＡ（第３レーン）及
びＥ．Ｃｏｌｉ由来の５Ｓ ｒＲＮＡ（第４レーン）の
試料各０．５μｇを、上記ゲルのカソード端におけるウ
ェルに添加し、１００Ｖを１５分間印加した。そのゲル
をエチジウムブロミドで染色し、そしてＵＶ透照により
撮影した。図１に示したように、ｐＨ＝２．５のＨＣｌ
（パネルＡ）又はグリシン−ＨＣｌ（パネルＢ）におい
てＤＮＡ及び三種類のＲＮＡのいずれもカソードから離
れてアノードの方向に移動した。したがって、これらの
核酸はｐＨ＝２．５において正味の負電荷を維持してい
る。
へ移動することを確かめるため、１％アガロースゲルを
調製し、どちらもｐＨ＝２．５の３ｍＭのＨＣｌ又は５
０ｍＭのグリシン−ＨＣｌにおいて実験した。子牛胸腺
ＤＮＡ（図１中第１レーン）、１．９ｋｂ ｍＲＮＡ
（ｐＴＲＩ−Ｘｅｆ１転写体；第２レーン）、Ｅ．Ｃｏ
ｌｉ由来の１６Ｓ＋２３Ｓ ｒＲＮＡ（第３レーン）及
びＥ．Ｃｏｌｉ由来の５Ｓ ｒＲＮＡ（第４レーン）の
試料各０．５μｇを、上記ゲルのカソード端におけるウ
ェルに添加し、１００Ｖを１５分間印加した。そのゲル
をエチジウムブロミドで染色し、そしてＵＶ透照により
撮影した。図１に示したように、ｐＨ＝２．５のＨＣｌ
（パネルＡ）又はグリシン−ＨＣｌ（パネルＢ）におい
てＤＮＡ及び三種類のＲＮＡのいずれもカソードから離
れてアノードの方向に移動した。したがって、これらの
核酸はｐＨ＝２．５において正味の負電荷を維持してい
る。
【００２３】実施例２ 酸性条件下での電気泳動に際して核酸とタンパク質が反
対方向に移動することを例証するため、変更したＧｅｎ
ｅＣＡＰＳＵＬＥ（商標）装置（図２）においてｒＲＮ
Ａを血漿タンパク質から分離した。これらの装置は、ア
ガロース又はポリアクリルアミドのゲル片から電気泳動
によりＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質を溶離するように
設計した。製造業者の所期の使用法に従い、目的の核酸
又はタンパク質のバンドを含むゲル片をピックアップし
てＧｅｌ ＰＩＣＫ（商標）に入れ、その後そのＧｅｌ
ＰＩＣＫ（商標）をアガロースゲルで満たし、Ｇｅｎ
ｅＴＲＡＰ（商標）を組み合わせた。Ｇｅｎｅ ＴＲＡ
Ｐ（商標）の一端には、電子は通過させるが巨大分子は
捕捉するような膜（おそらくは透析膜）がある。組み合
わせたＧｅｎｅＣＡＰＳＵＬＥ（商標）を電気泳動用緩
衝液に浸し、トラップをアノードの方向に向け、そして
膜に隣接するトラップ中の残留緩衝液（２５〜４０μ
Ｌ）の中へ電気泳動により核酸又はタンパク質を溶離し
た。
対方向に移動することを例証するため、変更したＧｅｎ
ｅＣＡＰＳＵＬＥ（商標）装置（図２）においてｒＲＮ
Ａを血漿タンパク質から分離した。これらの装置は、ア
ガロース又はポリアクリルアミドのゲル片から電気泳動
によりＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質を溶離するように
設計した。製造業者の所期の使用法に従い、目的の核酸
又はタンパク質のバンドを含むゲル片をピックアップし
てＧｅｌ ＰＩＣＫ（商標）に入れ、その後そのＧｅｌ
ＰＩＣＫ（商標）をアガロースゲルで満たし、Ｇｅｎ
ｅＴＲＡＰ（商標）を組み合わせた。Ｇｅｎｅ ＴＲＡ
Ｐ（商標）の一端には、電子は通過させるが巨大分子は
捕捉するような膜（おそらくは透析膜）がある。組み合
わせたＧｅｎｅＣＡＰＳＵＬＥ（商標）を電気泳動用緩
衝液に浸し、トラップをアノードの方向に向け、そして
膜に隣接するトラップ中の残留緩衝液（２５〜４０μ
Ｌ）の中へ電気泳動により核酸又はタンパク質を溶離し
た。
【００２４】本実験の目的のため、血漿とｒＲＮＡの混
合物をＧｅｌ ＰＩＣＫ（商標）中のアガロースにおい
て流延し、そしてＧｅｌ ＰＩＣＫ（商標）の両端にＧ
ｅｎｅ ＴＲＡＰ（商標）を組み合わせてどちらかの方
向に移動する巨大分子を捕捉した。これを達成するた
め、Ｇｅｌ ＰＩＣＫ（商標）の一端をパラフィンでふ
さいだ。アガロースを１１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌ
（ｐＨ＝２．５）に２．２％で煮沸により溶解し、そし
てアガロースが固化しないように２５０μＬのアリコー
トを５０〜６０℃に置いた。溶解したアガロースに、１
００μＬの血漿と、２００μＬの８０ｍＭのＨＣｌと、
各２０μｇのＥ．Ｃｏｌｉ由来の５Ｓ、１６Ｓ及び２３
Ｓ ｒＲＮＡを添加して、ｐＨ＝２．５において１％ア
ガロース及び５０ｍＭのグリシン−ＨＣｌの最終濃度を
得た。この混合物をボルテックス攪拌し、すぐに上記の
ふさいだＧｅｌ ＰＩＣＫ（商標）にピペットで入れ
た。両方のトラップに１００μＬの５０ｍＭのグリシン
−ＨＣｌを添加し、そしてこれらをピックと組み合わせ
て気泡が駆逐されるように傾けて保持した。１％アガロ
ース水溶液を使用してトラップをピックに封止した。組
み合わせたＧｅｎｅＣＡＰＳＵＬＥ（商標）を水平型電
気泳動チャンバーにおいて５０ｍＭのグリシン−ＨＣｌ
に浸し、そして１００Ｖを１時間印加した。製造業者が
推奨するように、ＲＮＡを膜から解放するために、電流
を逆にして６０秒間流した。ＧｅｎｅＣＡＰＳＵＬＥ
（商標）を電気泳動用緩衝液から取り出し、製造業者の
指示に従い、膜に隣接する残留緩衝液を両方のトラップ
から取り出した。予備実験において、残ったＲＮＡ及び
タンパク質の一部が電流を逆にして６０秒間流した後に
も捕捉膜に吸着していたことが発見された。それゆえ、
この膜をトラップから取り出し、１００μＬの５０ｍＭ
のグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ＝２．５）において３７℃で
１時間溶離した。また、アガロースゲルをトラップから
取り出し、溶融し、そして残留するＲＮＡとタンパク質
についても分析した。各画分を、１×ＴＢＥ（８９ｍＭ
のトリス−ホウ酸塩、２ｍＭのＥＤＴＡ）における標準
の１％アガロースゲル上で等比率で流すことによって、
ＲＮＡの有無についてチェックした。さらに、各画分の
アリコートをタンパク質含有量についてアッセイした。
合物をＧｅｌ ＰＩＣＫ（商標）中のアガロースにおい
て流延し、そしてＧｅｌ ＰＩＣＫ（商標）の両端にＧ
ｅｎｅ ＴＲＡＰ（商標）を組み合わせてどちらかの方
向に移動する巨大分子を捕捉した。これを達成するた
め、Ｇｅｌ ＰＩＣＫ（商標）の一端をパラフィンでふ
さいだ。アガロースを１１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌ
（ｐＨ＝２．５）に２．２％で煮沸により溶解し、そし
てアガロースが固化しないように２５０μＬのアリコー
トを５０〜６０℃に置いた。溶解したアガロースに、１
００μＬの血漿と、２００μＬの８０ｍＭのＨＣｌと、
各２０μｇのＥ．Ｃｏｌｉ由来の５Ｓ、１６Ｓ及び２３
Ｓ ｒＲＮＡを添加して、ｐＨ＝２．５において１％ア
ガロース及び５０ｍＭのグリシン−ＨＣｌの最終濃度を
得た。この混合物をボルテックス攪拌し、すぐに上記の
ふさいだＧｅｌ ＰＩＣＫ（商標）にピペットで入れ
た。両方のトラップに１００μＬの５０ｍＭのグリシン
−ＨＣｌを添加し、そしてこれらをピックと組み合わせ
て気泡が駆逐されるように傾けて保持した。１％アガロ
ース水溶液を使用してトラップをピックに封止した。組
み合わせたＧｅｎｅＣＡＰＳＵＬＥ（商標）を水平型電
気泳動チャンバーにおいて５０ｍＭのグリシン−ＨＣｌ
に浸し、そして１００Ｖを１時間印加した。製造業者が
推奨するように、ＲＮＡを膜から解放するために、電流
を逆にして６０秒間流した。ＧｅｎｅＣＡＰＳＵＬＥ
（商標）を電気泳動用緩衝液から取り出し、製造業者の
指示に従い、膜に隣接する残留緩衝液を両方のトラップ
から取り出した。予備実験において、残ったＲＮＡ及び
タンパク質の一部が電流を逆にして６０秒間流した後に
も捕捉膜に吸着していたことが発見された。それゆえ、
この膜をトラップから取り出し、１００μＬの５０ｍＭ
のグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ＝２．５）において３７℃で
１時間溶離した。また、アガロースゲルをトラップから
取り出し、溶融し、そして残留するＲＮＡとタンパク質
についても分析した。各画分を、１×ＴＢＥ（８９ｍＭ
のトリス−ホウ酸塩、２ｍＭのＥＤＴＡ）における標準
の１％アガロースゲル上で等比率で流すことによって、
ＲＮＡの有無についてチェックした。さらに、各画分の
アリコートをタンパク質含有量についてアッセイした。
【００２５】表１に示したように、タンパク質は、アガ
ロースゲル（第４列）において又はＧｅｎｅＣＡＰＳＵ
ＬＥ（商標）のカソードもしくは負極端において、トラ
ップ中（第２列）又は膜上（第５列）のいずれかにおい
て検出された。アノード又は正極端においては、回収さ
れた全タンパク質の５％しか認められなかった（第３列
及び第６列）。一方、図３のアガロースゲル上に示した
ように、ＲＮＡは、トラップ中（第３列）又は膜上（第
６列）のいずれかにおいて、ＧｅｎｅＣＡＰＳＵＬＥ
（商標）のアノードもしくは正極端においてのみ検出さ
れた。第１レーンの全ＲＮＡとの強度比較により求めら
れるように、ＲＮＡの一部しか回収されなかった。ＲＮ
Ａのバルクは、ＧｅｎｅＣＡＰＳＵＬＥ（商標）の上又
は正極膜上の左側に吸着したようである。しかしなが
ら、タンパク質が見つかったカソード端又は負極端にお
いては何も検出されなかった（第２レーン及び第５レー
ン）。したがって、これらの核酸とタンパク質は、実際
にｐＨ＝２．５での電気泳動の際に反対方向に移動し
た。
ロースゲル（第４列）において又はＧｅｎｅＣＡＰＳＵ
ＬＥ（商標）のカソードもしくは負極端において、トラ
ップ中（第２列）又は膜上（第５列）のいずれかにおい
て検出された。アノード又は正極端においては、回収さ
れた全タンパク質の５％しか認められなかった（第３列
及び第６列）。一方、図３のアガロースゲル上に示した
ように、ＲＮＡは、トラップ中（第３列）又は膜上（第
６列）のいずれかにおいて、ＧｅｎｅＣＡＰＳＵＬＥ
（商標）のアノードもしくは正極端においてのみ検出さ
れた。第１レーンの全ＲＮＡとの強度比較により求めら
れるように、ＲＮＡの一部しか回収されなかった。ＲＮ
Ａのバルクは、ＧｅｎｅＣＡＰＳＵＬＥ（商標）の上又
は正極膜上の左側に吸着したようである。しかしなが
ら、タンパク質が見つかったカソード端又は負極端にお
いては何も検出されなかった（第２レーン及び第５レー
ン）。したがって、これらの核酸とタンパク質は、実際
にｐＨ＝２．５での電気泳動の際に反対方向に移動し
た。
【００２６】本発明をその好適な具体的態様を特に参照
しながら詳説したが、当業者であれば、本発明の精神、
範囲内での変更、バリエーションが可能であることは理
解される。本明細書中で参照した刊行物は、これらをす
べて本明細書の一部とする。
しながら詳説したが、当業者であれば、本発明の精神、
範囲内での変更、バリエーションが可能であることは理
解される。本明細書中で参照した刊行物は、これらをす
べて本明細書の一部とする。
【図１】図１は、ｐＨ＝２．５におけるアガロースゲル
上での核酸の電気泳動の結果を示す図面代用写真であ
る。１％のアガロースゲルを調製し、ｐＨ＝２．５にお
いて、Ａ．３ｍＭのＨＣｌ又はＢ．５０ｍＭのグリシン
−ＨＣｌにおいて流した。第１レーン＝子牛胸腺ＤＮ
Ａ、第２レーン＝ｐＴＲｌ−Ｘｅｆ転写体、第３レーン
＝１６Ｓ＋２３Ｓ ｒＲＮＡ、第４レーン＝５Ｓ ｒＲ
ＮＡ。１レーン当たり核酸０．５μｇ。
上での核酸の電気泳動の結果を示す図面代用写真であ
る。１％のアガロースゲルを調製し、ｐＨ＝２．５にお
いて、Ａ．３ｍＭのＨＣｌ又はＢ．５０ｍＭのグリシン
−ＨＣｌにおいて流した。第１レーン＝子牛胸腺ＤＮ
Ａ、第２レーン＝ｐＴＲｌ−Ｘｅｆ転写体、第３レーン
＝１６Ｓ＋２３Ｓ ｒＲＮＡ、第４レーン＝５Ｓ ｒＲ
ＮＡ。１レーン当たり核酸０．５μｇ。
【図２】図２は、核酸及びタンパク質をアガロースゲル
及びアクリルアミドゲルから電気溶離するためのＧｅｎ
ｅＣＡＰＳＵＬＥ（商標）の使用を示す。ＧｅｎｏＴｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の販促用
文献から転載。
及びアクリルアミドゲルから電気溶離するためのＧｅｎ
ｅＣＡＰＳＵＬＥ（商標）の使用を示す。ＧｅｎｏＴｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の販促用
文献から転載。
【図３】図３は、ＧｅｎｅＣＡＰＳＵＬＥ（商標）にお
けるｐＨ＝２．５での電気泳動後のｒＲＮＡの回収を示
す図面代用写真である。実施例に記載したように、１％
アガロースゲルを調製し、ＴＢＥにおいて流した。第１
レーン＝各１μｇの２３Ｓ、１６Ｓ及び５ＳのｒＲＮ
Ａ、第２〜６レーン＝表１に列挙したように、Ｇｅｎｅ
ＣＡＰＳＵＬＥ（商標）由来の等比率画分。
けるｐＨ＝２．５での電気泳動後のｒＲＮＡの回収を示
す図面代用写真である。実施例に記載したように、１％
アガロースゲルを調製し、ＴＢＥにおいて流した。第１
レーン＝各１μｇの２３Ｓ、１６Ｓ及び５ＳのｒＲＮ
Ａ、第２〜６レーン＝表１に列挙したように、Ｇｅｎｅ
ＣＡＰＳＵＬＥ（商標）由来の等比率画分。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｐ // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 27/26 ３２５Ｅ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 ジョン ウェズリー バッカス アメリカ合衆国，ミズーリ 63021，ボー ルウィン，キャリッジ ブリッジ トレイ ルズ 1438
Claims (6)
- 【請求項１】 試料中の細胞破砕物から核酸を分離する
方法であって、 （ａ）前記試料をｐＨの低い酸媒体に適用する工程と、 （ｂ）前記試料に電界手段を施す工程と、 （ｃ）前記酸媒体中の前記核酸を前記細胞破砕物から分
離する工程とを含んでなる方法。 - 【請求項２】 前記電気泳動を約２〜約４のｐＨで行
う、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 前記細胞破砕物がタンパク質である、請
求項１に記載の方法。 - 【請求項４】 前記電界手段が電気泳動である、請求項
１に記載の方法。 - 【請求項５】 前記細胞破砕物の正味の電荷が正であ
る、請求項１に記載の方法。 - 【請求項６】 生物学的試料から核酸を精製する方法で
あって、 （ａ）前記試料をｐＨの低い酸媒体に適用する工程と、 （ｂ）前記試料に電界手段を施す工程と、 （ｃ）前記媒体中の前記核酸を前記細胞破砕物から分離
する工程とを含んでなる方法。
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