JP4531888B2 - 核酸を分離する方法 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、一般に、生物学的試料中のタンパク質のような細胞破砕物から核酸を分離する方法に関する。具体的には、本発明は、正味の電荷が正である物質から核酸を分離するために低いpHにおいて電気泳動を使用することに関する。
【0002】
【従来の技術】
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のような非常に巧妙な増幅技法の開発をはじめとし、微量の核酸を検出する技術がこの20年間で急速に進歩してきた。研究者らは、このような技術の価値が、人や動物の被験体において疾患や遺伝的特徴を検出することにあることを容易に認識している。
【0003】
PCRは、当該技術分野における顕著な進歩であって、極微量の目的核酸の検出を可能ならしめるものである。PCRの詳細については、例えば、米国特許第4,683,195号(Mullisら)、同第4,683,202号(Mullisら)及び同第4,965,188号(Mullisら)に記載されているが、この分野の文献数は急速に増加しつつある。詳細には説明しないが、PCRには、重合剤(例えば、DNAポリメラーゼ)とデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートの存在下、目的とする核酸の鎖(「鋳型」とみなされる)にプライマーを適当な条件下でハイブリダイズさせる工程が含まれる。その結果、鋳型に相補的なヌクレオチドが鋳型に沿って付加されたプライマー伸長生成物が形成される。
【0004】
このプライマー伸長生成物を変性すると、鋳型の複製物が一つ調製されたことになり、このプライミング、伸長及び変性のサイクルを所望の回数実施することにより、目的核酸と同一の配列を有する核酸の量を対数増加させることができる。実際に、目的の核酸を、その検出が一層容易となるように何回も複製(又は増幅)する。
【0005】
目的の核酸を効果的に増幅し検出するためには、或いは、目的の核酸をクローニング又は配列決定するためには、その核酸を他の妨害となる生体分子の混合物から単離又は分離しなければならないことが多い(Moore D.,1977,Preparation and Analysis of DNA.Unit 2.2 In Ausubel et al.(ed.),CurrentProtocols in Molecular Biology.JohnWiley & Sons,Inc.,New York)。
【0006】
現在のところ、核酸調製物からタンパク質その他の不純物を取り除くために数種類の手順が用いられている。伝統的には、生物学的試料をプロテアーゼで消化し、不純物を有機抽出法により核酸から除去する(Moore D.,Current Protocols in Molecular Biology)。
しかしながら、この方法には、有害な有機溶媒を使用することや、水相を新しいチューブへ何回も移す必要があるため退屈で、労働集約的であり、しかも試料の交雑汚染の危険性が増す、等の多くの欠点があることが認識されている。
【0007】
最近では、カオトロピック塩においてガラスに吸着させる方法による核酸の精製法が普及してきた(Boom et al.,1990,J.Clinical Microbiol.28:495−503)。しかしながら、この分離法も、バインディング容量の非常に小さいガラスを使用すること、カオトロピック塩を使用すること、そしてガラス/核酸複合体を何度も洗浄し、その洗浄液を除去しなければならないために退屈で時間がかかること、といった多くの欠点に悩まされる。
【0008】
DNA精製のためのポリマー捕捉法であるイオン交換法を使用して核酸を単離することも行われている(米国特許第5,582,988号、同第5,434,270号及び同第5,523,368号)。残念ながら、この方法は、RNAが捕捉、解放のどちらの際にも分解するため、特に現在実施されている条件下でRNAを精製する場合には適さない。ポリマー/核酸の最適な捕捉条件下ではリボヌクレアーゼが高いためにRNAの分解をもたらし、また核酸をポリマーから解放するのに必要な高いpHが化学的加水分解をもたらす。
【0009】
電気泳動による分離法は、有害な物質、高いpH及び退屈な操作を回避するように設計できるため、魅力的な技法である。さらに、電気泳動による分離法は自動化されたフォーマットに適合しやすい。電気泳動法はほとんどが分析的規模で採用されているが、小規模の調製手順もまた数多く開発されている(Andrews,A.T.,1986,Electrophoresis: Theoryand Techniques,and Biochemical andClinical Applications,2nd edition.Clarendon Press,Oxford,England)。ポリビニルピロリドン/アガロースゲル上での電気泳動により腐植物質その他のPCRを阻害する不純物からDNAを分離する方法も報告されている(Herricket al.,1993,Appl.Environ.Microbiol.59:687−694及びYoung et al.,1993,Appl.Environ.Microbiol.59:1972−1974)。さらに、Sheldonとその共同研究者は、核酸の電気泳動による精製のための装置を開発した。細胞又は血液試料をプロテアーゼで溶解し、その溶解物を当該装置に装填する。核酸は、ポリマー層中の電気泳動により不純物から分離され且つ、分子量で仕切る膜によりコレクションチャンバーに保持される一方、分解されたタンパク質その他低分子量物質は当該膜を通過する(Sheldon E.L.,1997.Electronic Sample Handling.International Business Preparation Workshopにて発表、San Diego,CA.,June 9,1997)。
【0010】
電気泳動による分離法は、上記の例をはじめとし、ほとんどが中性に近いpHで行われているが、低いpHでの電気泳動が有利な場合もある。例えば、巨大分子の中には低いpHの方が分離効率が高くなるものがある。ヌクレオチド又は低分子量ポリヌクレオチドの混合物は低いpHの方が分離性が良くなる。これは、ヌクレオチドの電荷が、pH=2〜5の範囲では−1〜0の変動を示すが、pH=6〜8の範囲ではほとんどが同一の電荷(−2)を示すからである(Smith,J.D.,1976,Methods Enzymol.12:350−361)。同様に、等電点電気泳動法では、酸性タンパク質がpH勾配中のpKaにおいて単離される(Andrews,A.T.,1986)。さらに、低いpHの方が安定性が高くなる構造もある。TerwillingerとClarkeは、酸性条件(pH=2.5)が電気泳動時のタンパク質メチルエステルの加水分解を最小限に抑えるのに役立つことを報告している(Terwillinger et al.,1981,J.Biol.Chem.256:3067−75)。同様に、温和な酸性条件(pH=4.5)でB−DNAのトリプルヘリックス構造が安定化される(Mirkin et al.,1987,J.Biol.Chem.234:1512−16)。
【0011】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、核酸、特に血液や血漿のようなタンパク質の豊富な源に由来する核酸を調製するための電気泳動に低いpH条件を採用できれば望ましく且つ有利であろう。遍在し且つ電気泳動中に核酸を分解するヌクレアーゼ、特にリボヌクレアーゼは、低いpHにおいて不活化される(Kalnitsky et al.,1959,J.Biol.Chem.234:1512−16)。その上、ほとんどの核酸とタンパク質は、酸性条件下では反対の電荷を有するため、電界の中で逆方向に移動する。pH=2において、第一ホスフェート基のpKaは2未満であるがアミン基のpKaは2〜5の範囲にあるため、核酸はなおも負に帯電する(Smith,J.D.,1976)。他方、ほとんどのタンパク質は、そのすべてのアミン基及び大部分のカルボキシル基のpKaが2よりもはるかに高いため、完全にプロトン化し、よって正に帯電する。
【0012】
【課題を解決するための手段】
したがって、本発明は上記課題を解決すべく、低いpHにおいて正味の電荷が正である物質から酸性条件下での電気泳動により核酸を分離するのに必要な手段を提供する。低いpHにおける電気泳動は、核酸精製のための現行法にまつわる問題の多くを解決することにもなる。上述のように、低いpHではヌクレアーゼ活性が低くなるため、核酸は中性pHにおけるよりも安定性が高くなる。その上、試料を装填してしまえば、電気泳動は手がかからない方法である。最後に、有害な材料を必要とすることもまったくない。
本発明の様々な目的、利点については本発明の詳細な説明で明らかとなる。
【0013】
【発明の実施の形態】
本発明は、核酸をその他の細胞破砕物、特に低いpHにおいて正味の電荷が正である物質から、酸性条件下での電気泳動により分離するための方法に関する。本発明の精製法では、試料を電気泳動ゲルにアプライしその試料を酸性条件下で電気泳動させることにより、核酸が同一の生物学的試料中のタンパク質から分離される。至適pHは、試料の種類によって異なる可能性があるが、当業者であれば容易に求めることができる。当該分離を約2〜約4のpH範囲で行うことが好ましい。より好ましくは、電気泳動をpH=2.5で実施する。
【0014】
約2〜4のpH範囲では、ホスフェート基のpKaが低いためにほとんどの核酸は正味の電荷が負となるが、ほとんどのタンパク質は、その官能基(アミノ基及びカルボキシル基)がはるかに高いpKaを有するために、正味の電荷が正となる。その結果、ほとんどの核酸とタンパク質は、約2〜4のpH範囲での電気泳動に際して反対方向に移動する。この方法は、核酸を調製するための現行の電気泳動法、すなわち核酸とタンパク質とが同一方向(アノード方向)に移動するようなpHにおいて実施される方法とは相違する。分子が反対方向に移動すると、分離は完全性、効率共に一層高くなる。
【0015】
試料のpHは、pHシフトによりRNAase活性を迅速且つ効率的に阻害する必要があるため、試料をゲルにアプライする前に調整すべきである。本発明において酸性pHを達成するために使用するのに適した試薬として、HCl、グリシン−HCl、硫酸又はリン酸、その他のホスフェート、フタレート、フマレート、タルトレート、シトレート、グリシルグリシン、フロエート又はホルメートのような緩衝剤が挙げられるが、これらに限定はされない。
【0016】
本発明を実施するために各種の装置及びフォーマットを使用することができる。後述の実施例ではGeneCAPSULE(商標)を使用するが、その他の予め組み立てられた直接注入装置でも好適である。その上、目的の分子を、均質マトリックス中の電気泳動で得られるよりも不純物からきれいに分離するために、調製用の等電点電気泳動法、特にpH勾配を固定した方式を使用することができる(Righetti及びWenisch,1997,PreparativeIsoelectric Focusing Using Immobilized Membranes: Theory and History.IsoPrime Application Note;No.1 Hoefer Scientific Instruments)。
【0017】
本発明の分離法により、有害材料、退屈な移し替え又は抽出が無いなど、従来の核酸精製法よりも有利な点が数多く得られる。さらに、中性付近のpHの代わりに酸性条件下(pH≦3)で電気泳動を行うので、ヌクレアーゼは実質的に不活性であり、RNAの化学的安定性が高くなる。その上、pH=2.5のような酸性条件下では、核酸とほとんどのタンパク質とは反対の電極に向かって移動するので、分離の効率、完全性共に高くなる。
【0018】
核酸が、生物学的試料中に存在するタンパク質から分離されたら、電界を取り除き、そして分離された核酸を当該技術分野で周知の技法によりゲルから取り出すことができる。その後、このように精製された核酸は、PCRやリガーゼ連鎖反応等の標準的な増幅法及び/又は検出法に用いるのに適したものとなる。
【0019】
PCRによる核酸の増幅、検出のための一般原理及び条件については周知であり、その詳細については米国特許第4,683,195号(Mullisら)、同第4,683,202号(Mullisら)及び同第4,965,188号(Mullisら)をはじめとする多数の文献に記載されており、本明細書ではこれらを参照することにより明細書の一部とする。このように、当該技術分野の教示及びその中の具体的な教示に照らして、当業者であれば、増幅アッセイにおいて完全なRNAもしくはDNAの回収効率が低いことによるか又は増幅インヒビターの存在による偽陰性の結果を排除するために本発明を実施することに何ら困難を伴うことはないはずである。
用語「生物学的試料」には、細胞材料、ウイルス材料、毛髪、体液又は検出できる核酸を含む細胞材料が包含されるが、これらに限定はされない。
【0020】
本明細書に記載した方法を用いて、感染疾患、遺伝病もしくは細胞病、例えばガン、又はその他のこれらのカテゴリーに具体的に含まれない何らかの疾患状態に関連する特異的な核酸配列を検出することができる。また、法医学的調査やDNAタイピングにも使用することができる。本発明の目的に関し、遺伝病にはすべての生物に由来するゲノムDNAの特異的欠失又は変異、例えば、鎌型赤血球貧血、嚢性線維症、α−地中海貧血、β−地中海貧血その他当業者に自明なものが包含される。ヒト白血球抗原(HLA)を本発明で分類することができる。検出可能なバクテリアとして、血液中に存在し得るバクテリア、サルモネラ、連鎖球菌種、クラミジア種、淋菌種、マイコバクテリア種(例、ヒト結核菌及び鳥結核菌の複合体)、マイコプラズマ種(例、インフルエンザ菌及び肺炎マイコプラズマ)、レジュネラ・ニューモフィラ菌、ボレリア症菌(Borrelia burgdorferei)、ニューモシスティス・カリニ、クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)、キャンピロバクター種、エルジニア種、赤痢菌種及びリステリア種が挙げられるが、これらに限定はされない。検出可能なウイルスとして、単純性庖疹ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、呼吸性合胞体ウイルス、肝炎ウイルス及びレトロウイルス、合胞体ウイルス、肝炎ウイルス及びレトロウイルス(例、HTLV−I、HTLV−II、HIV−I及びHIV−II)が挙げられるが、これらに限定はされない。さらに、原生動物寄生体及び菌類(酵母やカビを含む)も検出可能である。その他の検出可能な種については当業者であれば自明である。本発明は、各種バクテリア又はウイルスに関連するRNAの有無を検出する場合に特に有用である。
【0021】
【実施例】
材料
塩酸はBaker社の試薬級とした。グリシン(分子生物学級)、子牛胸腺DNA、E.Coli由来の5S rRNA及びE.Coli由来の16S+23S rRNAはSigma Chemical社(St.Louis,MO)のものとした。pTRI−Xef1転写体は、製造業者の指示に従いインビトロ転写系でAmbionのMegascriptを含むAmbion社(Austin,TX)のpTRI−Xef1プラスミドから合成した。アガロースは、FMC Bioproducts(Rockland,ME)のSeaKem LEとした。GenoTechnology社(St.Louis,MO)のGeneCAPSULE(商標)電気溶離装置を使用し、製造業者の指示を下記実施例2に記載したように変更することにより、RNAをタンパク質から分離した。タンパク質の水準については、Pierce社(Rockford,IL)のBCAタンパク質アッセイ用試薬キットを製造業者の指示に従い使用して測定した。
【0022】
実施例1
酸性条件下での電気泳動に際して核酸がアノードの方向へ移動することを確かめるため、1%アガロースゲルを調製し、どちらもpH=2.5の3mMのHCl又は50mMのグリシン−HClにおいて実験した。子牛胸腺DNA(図1中第1レーン)、1.9kb mRNA(pTRI−Xef1転写体;第2レーン)、E.Coli由来の16S+23S rRNA(第3レーン)及びE.Coli由来の5S rRNA(第4レーン)の試料各0.5μgを、上記ゲルのカソード端におけるウェルに添加し、100Vを15分間印加した。そのゲルをエチジウムブロミドで染色し、そしてUV透照により撮影した。
図1に示したように、pH=2.5のHCl(パネルA)又はグリシン−HCl(パネルB)においてDNA及び三種類のRNAのいずれもカソードから離れてアノードの方向に移動した。したがって、これらの核酸はpH=2.5において正味の負電荷を維持している。
【0023】
実施例2
酸性条件下での電気泳動に際して核酸とタンパク質が反対方向に移動することを例証するため、変更したGeneCAPSULE(商標)装置(図2)においてrRNAを血漿タンパク質から分離した。これらの装置は、アガロース又はポリアクリルアミドのゲル片から電気泳動によりDNA、RNA又はタンパク質を溶離するように設計した。製造業者の所期の使用法に従い、目的の核酸又はタンパク質のバンドを含むゲル片をピックアップしてGel PICK(商標)に入れ、その後そのGel PICK(商標)をアガロースゲルで満たし、GeneTRAP(商標)を組み合わせた。Gene TRAP(商標)の一端には、電子は通過させるが巨大分子は捕捉するような膜(おそらくは透析膜)がある。組み合わせたGeneCAPSULE(商標)を電気泳動用緩衝液に浸し、トラップをアノードの方向に向け、そして膜に隣接するトラップ中の残留緩衝液(25〜40μL)の中へ電気泳動により核酸又はタンパク質を溶離した。
【0024】
本実験の目的のため、血漿とrRNAの混合物をGel PICK(商標)中のアガロースにおいて流延し、そしてGel PICK(商標)の両端にGene TRAP(商標)を組み合わせてどちらかの方向に移動する巨大分子を捕捉した。これを達成するため、Gel PICK(商標)の一端をパラフィンでふさいだ。アガロースを110mMのグリシン−HCl(pH=2.5)に2.2%で煮沸により溶解し、そしてアガロースが固化しないように250μLのアリコートを50〜60℃に置いた。溶解したアガロースに、100μLの血漿と、200μLの80mMのHClと、各20μgのE.Coli由来の5S、16S及び23S rRNAを添加して、pH=2.5において1%アガロース及び50mMのグリシン−HClの最終濃度を得た。この混合物をボルテックス攪拌し、すぐに上記のふさいだGel PICK(商標)にピペットで入れた。両方のトラップに100μLの50mMのグリシン−HClを添加し、そしてこれらをピックと組み合わせて気泡が駆逐されるように傾けて保持した。1%アガロース水溶液を使用してトラップをピックに封止した。組み合わせたGeneCAPSULE(商標)を水平型電気泳動チャンバーにおいて50mMのグリシン−HClに浸し、そして100Vを1時間印加した。製造業者が推奨するように、RNAを膜から解放するために、電流を逆にして60秒間流した。GeneCAPSULE(商標)を電気泳動用緩衝液から取り出し、製造業者の指示に従い、膜に隣接する残留緩衝液を両方のトラップから取り出した。予備実験において、残ったRNA及びタンパク質の一部が電流を逆にして60秒間流した後にも捕捉膜に吸着していたことが発見された。それゆえ、この膜をトラップから取り出し、100μLの50mMのグリシン−HCl(pH=2.5)において37℃で1時間溶離した。また、アガロースゲルをトラップから取り出し、溶融し、そして残留するRNAとタンパク質についても分析した。各画分を、1×TBE(89mMのトリス−ホウ酸塩、2mMのEDTA)における標準の1%アガロースゲル上で等比率で流すことによって、RNAの有無についてチェックした。さらに、各画分のアリコートをタンパク質含有量についてアッセイした。
【0025】
表1に示したように、タンパク質は、アガロースゲル(第4列)において又はGeneCAPSULE(商標)のカソードもしくは負極端において、トラップ中(第2列)又は膜上(第5列)のいずれかにおいて検出された。アノード又は正極端においては、回収された全タンパク質の5%しか認められなかった(第3列及び第6列)。一方、図3のアガロースゲル上に示したように、RNAは、トラップ中(第3列)又は膜上(第6列)のいずれかにおいて、GeneCAPSULE(商標)のアノードもしくは正極端においてのみ検出された。第1レーンの全RNAとの強度比較により求められるように、RNAの一部しか回収されなかった。RNAのバルクは、GeneCAPSULE(商標)の上又は正極膜上の左側に吸着したようである。しかしながら、タンパク質が見つかったカソード端又は負極端においては何も検出されなかった(第2レーン及び第5レーン)。
したがって、これらの核酸とタンパク質は、実際にpH=2.5での電気泳動の際に反対方向に移動した。
【0026】
本発明をその好適な具体的態様を特に参照しながら詳説したが、当業者であれば、本発明の精神、範囲内での変更、バリエーションが可能であることは理解される。
本明細書中で参照した刊行物は、これらをすべて本明細書の一部とする。
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、pH=2.5におけるアガロースゲル上での核酸の電気泳動の結果を示す図面代用写真である。1%のアガロースゲルを調製し、pH=2.5において、A.3mMのHCl又はB.50mMのグリシン−HClにおいて流した。第1レーン=子牛胸腺DNA、第2レーン=pTRl−Xef転写体、第3レーン=16S+23S rRNA、第4レーン=5S rRNA。1レーン当たり核酸0.5μg。
【図2】図2は、核酸及びタンパク質をアガロースゲル及びアクリルアミドゲルから電気溶離するためのGeneCAPSULE(商標)の使用を示す。GenoTechnology(St.Louis,MO)の販促用文献から転載。
【図3】図3は、GeneCAPSULE(商標)におけるpH=2.5での電気泳動後のrRNAの回収を示す図面代用写真である。実施例に記載したように、1%アガロースゲルを調製し、TBEにおいて流した。第1レーン=各1μgの23S、16S及び5SのrRNA、第2〜6レーン=表1に列挙したように、GeneCAPSULE(商標)由来の等比率画分。
Claims (5)
- 試料中の細胞破砕物から核酸を分離する方法であって、
(a)前記試料を2〜4のpHを有する酸媒体に適用することにより、試料の核酸が正味の負電荷を帯びている混合物を製造する工程と、
(b)工程(a)で製造された混合物をゲルに注入する工程と、
(c)前記混合物を有する前記ゲルを電気泳動にかけることにより、正味の電荷を有していない細胞破砕物及び正味の正電荷を帯びている細胞破砕物から前記混合物中の前記核酸を分離する工程と
を含んでなる方法。 - 前記細胞破砕物がタンパク質である、請求項1に記載の方法。
- 電気泳動が2.5のpHで行なわれる、請求項1に記載の方法。
- 前記核酸がRNAである、請求項1に記載の方法。
- 生物学的試料中の細胞破砕物からRNAを精製する方法であって、
(a)前記試料を2〜4のpHを有する酸媒体に適用することにより、試料のRNAが正味の負電荷を帯びている混合物を製造する工程と、
(b)工程(a)で製造された混合物をゲルに注入する工程と、
(c)前記混合物を有する前記ゲルを電気泳動にかけることによって、正味の電荷を有していない細胞破砕物及び正味の正電荷を帯びている細胞破砕物から前記試料中のRNAを分離して、それにより前記RNAを精製する工程と、
を含んでなる方法。
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