KR20060058523A - 은 나노 입자를 이용한 핵산의 정제 방법 - Google Patents

은 나노 입자를 이용한 핵산의 정제 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20060058523A
KR20060058523A KR1020040097595A KR20040097595A KR20060058523A KR 20060058523 A KR20060058523 A KR 20060058523A KR 1020040097595 A KR1020040097595 A KR 1020040097595A KR 20040097595 A KR20040097595 A KR 20040097595A KR 20060058523 A KR20060058523 A KR 20060058523A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
silver nanoparticles
pcr
silver
concentration
ppm
Prior art date
Application number
KR1020040097595A
Other languages
English (en)
Other versions
KR100624447B1 (ko
Inventor
조윤경
이규상
김숙영
김진태
Original Assignee
삼성전자주식회사
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 삼성전자주식회사 filed Critical 삼성전자주식회사
Priority to KR1020040097595A priority Critical patent/KR100624447B1/ko
Priority to US11/257,833 priority patent/US7364857B2/en
Priority to JP2005341097A priority patent/JP4482517B2/ja
Publication of KR20060058523A publication Critical patent/KR20060058523A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100624447B1 publication Critical patent/KR100624447B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S977/00—Nanotechnology
    • Y10S977/902—Specified use of nanostructure
    • Y10S977/904—Specified use of nanostructure for medical, immunological, body treatment, or diagnosis
    • Y10S977/924—Specified use of nanostructure for medical, immunological, body treatment, or diagnosis using nanostructure as support of dna analysis

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 (a) 티올기를 갖는 분자가 포함된 시료와 은 나노입자를 혼합하여 상기 분자와 은 나노입자 복합체를 형성하는 단계; 및 (b) 상기 혼합물로부터 상기 복합체를 분리하여 제거하는 단계를 포함하는 은 나노입자 (silver nanoparticle)를 이용하여 표적 물질을 정제하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 기존의 핵산 정제 방법에 비해 3 단계 작업으로 신속하게 PCR 증폭이 가능한 DNA 를 정제할 수 있으므로, 랩온어칩에 매우 유용하게 이용될 수 있다.

Description

은 나노 입자를 이용한 핵산의 정제 방법{Purification method of nucleic acids using silver nanoparticles}
도 1 은 본 발명의 일예의 전체적인 과정을 보여주는 흐름도이다.
도 2 는 은 나노입자 농도에 따른 PCR 결과를 Ct 로 나타낸 것이다.
도 3 은 대장균 세포, 바실러스 메가테리움 세포 및 rHBV 로부터 각각의 핵산 정제 방법에 따른 PCR 결과를 최종 생성물 농도(ng/㎕) 로 나타낸 것이다.
본 발명은 은 나노 입자를 이용한 핵산의 정제 방법에 관한 것이다.
고순도 이중가닥 플라스미드 DNA, 단일가닥 파아지 DNA, 염색체 DNA 및 아가로스 겔 정제된 DNA 단편의 제조는 분자 생물학에서 매우 중요하다. 이상적으로, DNA 를 정제하는 방법은 간단하고, 신속하고, 존재하더라도 부가적인 시료 조작 단계가 거의 없어야 한다. 상기 방법에 의해 수득된 DNA 는 즉시 형질전환, 제한효소 분석, 라이게이션 또는 서열결정이 가능하다. 상기 특징의 모두를 구비한 방법은 연구 및 진단 실험실의 목적인 DNA 시료 제조의 자동화에 매우 매력적이다. 통상적으로, 알코올 침전물로부터 플라스미드 DNA 의 제조는 힘들고, 종종 CsCl 구 배, 겔 여과, 이온교환 크로마토그래피, 또는 RNA 분해효소, 단백질 분해효소 K, 및 반복된 알코올 침전 단계를 이용한다. 상기 방법은 또한 CsCl 및 기타 염, EtBr 및 알코올을 제거하기 위해 상당한 후처리 단계가 필요하다. 상기 방법의 추가의 문제는 작은 음전하의 세포 성분이 DNA 와 함께 침전될 수 있다는 것이다. 그리하여, DNA 는 바람직하지 못한 수준의 오염을 가질 수 있다.
종래 고상 물질을 이용한 핵산의 정제 방법이 알려져 있었다. 예를 들면, 미국특허 제5,234,809호에는 핵산에 결합하는 고상물질을 이용한 핵산의 정제 방법이 개시되어 있다. 구체적으로, 상기 방법은 출발물질, 카오트로픽 물질 (chaotropic material), 및 핵산 결합 고상물질을 혼합하는 단계, 상기 결합된 핵산을 갖는 상기 고상물질을 액체로부터 분리하는 단계 및 상기 고상물질 핵산 복합체를 세척하는 단계를 포함한다. 상기 카오트로픽 물질 (chaotropic material)은 예를 들면, 구아니디늄 티오시아네이트(GuSCN), 구아니딘 히드로클로라이드(GuHCl), 소듐 아이오다이드(NaI), 포타슘 아이오다이드(KI), 소듐 티오시아네이트(NaSCN), 요소 또는 그들의 조합 등이 포함된다. 고상 물질에는 실리카 입자가 포함된다.
그러나, 상기 방법은 시간이 오래 소요되기 때문에 복잡하며, 랩온어칩에 부적합하다. 또한, 상기 방법은 반드시 카오트로픽 물질을 사용하여야 하는 문제점이 있었다. 즉, 상기 카오트로픽 물질을 사용하지 않는 경우에는 고상 물질에 핵산이 결합하지 않는다. 또한, 상기 카오트로픽 물질은 인체 유해한 물질이므로 주의하여 다루어야 하며, PCR 등의 후속 공정에 방해 물질로 작용하므로, 정제과정 중 또는 정제가 완료된 다음 정제된 핵산으로부터 제거하여야 한다.
또한, 고상 물질에 핵산의 효율적인 결합을 위해 높은 표면적을 갖는 고상 물질을 개발하는 연구가 진행되었으나, 여전히 많은 처리 단계가 필요하고, 시간이 소요되며, 카오트로픽 염이 필요한 단점이 있었다.
또한, 문헌 [Hawkins, 등, Nucleic Acids Res. 1995; 23:22]에는 고체상 가역적인 고정화가 기재되어 있다. 이 방법은 자동화를 위한 간단하고 용이한 방법이나, 아직까지 병원균 검출에 대한 예가 없고, 랩온어칩 시료 제조에 적용하기에는 문제가 있다.
또한, GeneReleaser (Bioventures 사), ReleaseIT (CPG Inc. 사) 및 Lyse-N-GoTM RCR Reagent (Pierce 사)에서 시판하는 단일 튜브 시료 제조 키트가 있다. 이는 2 단계만으로 시료 제조가 가능하고, 10∼15분 내에 PCR 시료 준비가 완료된다는 장점이 있으나, 백색 중합체 시약으로 인해 실시간 PCR 이 가능하지 않고, 세포 용해 후에 시약 및 PCR 혼합물을 첨가해야 하므로, 불편하고 오염의 가능성의 문제가 있다.
본 발명의 발명자들은 상기와 같은 종래 기술을 바탕으로 핵산의 정제 방법을 연구하던 중 은 나노입자가 시료 중의 티올기를 갖는 분자와 결합한 후, SH 개질된 막에 의해 제거될 수 있다는 특성을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명의 목적은 은 나노 입자를 이용하여 핵산을 단시간 내에 효율적으로 정제하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(a) 티올기를 갖는 분자가 포함된 시료와 은 나노입자를 혼합하여 상기 분자와 은 나노입자 복합체를 형성하는 단계; 및
(b) 상기 혼합물로부터 상기 복합체를 분리하여 제거하는 단계
를 포함하는 은 나노입자(silver nanoparticle)를 이용하여 표적 물질을 정제하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 시료는 세포 또는 바이러스를 포함하며, 상기 세포 또는 바이러스를 용해하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 표적 물질은 핵산 또는 당일 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 세포 용해 방법은 기계적인 분쇄, 화학 반응을 이용한 세포 용해 방법, 전기화학 반응을 이용한 세포 용해 방법, 효소 등 생화학 물질을 이용한 세포 용해 방법, 초음파, 음파, 극초단파(microwave), 가열, 레이저, 전기장, 전기분해 등을 이용한 세포 용해 방법을 포함할 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 복합체의 제거가 SH 기를 갖는 구조물을 통해 수행될 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 SH 기를 갖는 구조물이 3-(메르캅토프로필)트리메톡시실란으로 개질된 유리섬유 막, 또는 티올기를 가지도록 개질된 임의의 구조물일 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 은 나노입자의 크기가 1nm ∼ 100nm 일 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 첨가되는 은 나노입자의 농도가 10ppm ∼ 1000ppm 일 수 있으며, 바람직하게는 100ppm ∼ 1000ppm 일 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 은 나노입자는 직접 첨가되거나 은 전극을 통해서 전기분해에 의해 생성될 수 있다.
이하, 본 발명을 단계별로 보다 구체적으로 설명한다.
본 발명은
(a) 티올기를 갖는 분자가 포함된 시료와 은 나노입자를 혼합하여 상기 분자와 은 나노입자 복합체를 형성하는 단계; 및
(b) 상기 혼합물로부터 상기 복합체를 분리하여 제거하는 단계
를 포함하는 은 나노입자(silver nanoparticle)를 이용하여 표적 물질을 정제하는 방법에 관한 것이다.
도 1 은 본 발명의 일예의 전체적인 과정을 보여주는 흐름도이다. 먼저, 세포와 은 나노입자를 용기 내에 혼합한다. 이어서, 보일링, 초음파 처리 등의 방법을 통해 세포를 용해(lysis)한다. 세포가 용해되면, 용기 내에 포함된 은 나노입자가 단백질과 결합한다. 단백질과 은 나노입자의 결합은 단백질을 이루는 아미노산 중에 시스테인과 메티오닌의 티올기를 통해서 이루어진다고 추정된다. 세포의 용해 과정에서 단백질이 변성되어 티올기가 외부로 드러나면, 은 나노입자가 단백질의 티올기와 결합하는 것이다. 티올과 은 나노입자간의 결합은 매우 강하며, 비 가역적이고, 공유 결합이다. 다음으로, 단백질-은 나노입자 복합체를 SH 개질된 막으로 여과하는 것이다. SH 개질된 막으로 단백질-은 나노입자 복합체를 여과하면, 세포 용해물에서 단백질의 대부분이 제거된 DNA 가 용액에 남게 되어 PCR 증폭이 가능해지는 것이다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 표적 물질은 핵산 또는 당일 수 있다. 표적 물질은 기타 티올기를 갖는 분자 이외의 것이면 어느 것이라도 가능하며, 바람직하게는 LOC 구현을 위한 핵산이다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 세포 용해 방법은 기계적인 분쇄, 화학 반응을 이용한 세포 용해 방법, 전기화학 반응을 이용한 세포 용해 방법, 효소 등 생화학 물질을 이용한 세포 용해 방법, 초음파, 음파, 극초단파(microwave), 가열, 레이저, 전기장, 전기분해 등을 이용한 세포 용해 방법을 포함할 수 있다. 은 나노입자를 첨가하여 상기 세포 용해 방법을 이용하여 세포를 용해할 경우에, 세포 용해 방법에 따른 PCR 결과에는 별로 차이가 없었다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 단백질-은 나노입자 복합체의 분리가 SH 개질된 막을 통해 수행될 수 있다. SH 개질된 막은 티올기로 개질된 물질은 어떤 것이든 가능할 수 있으나, 3-(메르캅토프로필)트리메톡시실란으로 개질된 유리섬유 막이 특히 바람직할 수 있다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 은 나노입자의 크기가 1nm ∼ 100nm 의 범위일 수 있다. 은 나노입자의 크기가 100nm 를 초과하는 경우에는 나노 입자가 단백질과의 결합의 효율성에 문제가 있을 수 있으며, 1nm 미만인 경우에는 나노 입 자 제작에 문제가 발생하기 때문이다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 첨가되는 은 나노입자의 농도가 10ppm ∼ 1000ppm 일 수 있으며, 바람직하게는 100ppm ∼ 1000ppm 일 수 있다. 은 나노입자의 농도가 100ppm 미만인 경우에는 단백질이 거의 제거되지 않으며, 1000ppm 을 초과하는 경우에는 SH 여과를 수행한 경우에도 PCR 증폭이 잘 되지 않는 문제가 있었다. 따라서, 은 나노입자의 농도가 높으면 변성 단백질을 많이 제거할 수 있지만, PCR 증폭이 불가능하기 때문에 농도에 한계가 있는 것이다. 또한, 은 나노입자의 농도가 100ppm 이하일 경우에는 SH 여과에 무관하게 PCR 저해가 일어나지 않는다. 또한, 은 나노입자의 농도가 10ppm 이하일 경우에는 PCR 에 전혀 영향을 주지 않는 것으로 나타났다. 더욱이, 이러한 결과는 SH 여과 장치에서, 막을 여러 층 사용하거나 막의 표면적을 넓힘으로써 PCR 증폭에 영향을 주지 않고 사용할 수 있는 은 나노입자의 농도는 증가할 것이다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 은 나노입자는 직접 첨가되거나 은 전극을 통해서 전기분해에 의해 생성될 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: 은 나노입자에 의한 PCR 저해 효과
은 나노입자의 PCR 증폭에 대한 저해 효과를 알아보기 위해, 은 나노입자의 농도를 변화시켜 PCR 저해 작용이 발생하지 않는 농도를 조사하였다.
HBV 플라스미드 DNA는 농도별로 준비된 은 나노입자를 이용하여 2배로 희석하여(세포:은 나노입자= 250ul:250ul) 준비하였다. 이때 사용된 은나노 입자 농도는 각각 0.1, 1, 10, 100, 1000ppm (초순수 물을 이용하여 연속 희석을 실시함)이었으며, HBV 플라스미드 DNA 는 105 카피/㎕를 사용하였다. 상기 준비된 시료는 하기의 두가지 방법으로 실시간 PCR (TMC1000)을 실시하였다. 하나의 방법은 정제 과정을 거치지 않고 직접 PCR을 하였고, 다른 하나의 방법은 SH 여과를 이용하여 은 나노입자를 제거한 후 PCR을 실시하였다.
SH 여과를 이용한 은 나노 입자 정제는 상기에서 미리 준비된 500㎕의 HBV 플라스미드 DNA와 은 나노 입자 혼합 용액을 SH 필터에 분주한 후 1분 이내에 원심분리기를 이용하여 13,000 rpm으로 3분 동안 원심분리하여 모았다.
위의 실험 결과는 Ct 및 PCR 산물 농도(ng/㎕)로 확인하였는데, Ct (Cycle of threshold)란 실시간 PCR 반응에서 검출 가능한 형광 신호가 나타나는 사이클 수를 말한다. 즉 초기 DNA 농도가 클수록 낮은 Ct에서 증폭량이 많아서 형광 신호가 검출가능하고, 초기 DNA 농도가 작을수록 Ct가 크다. Ct는 또한, DNA 정제와도 관련 있는데, DNA 의 순도가 높을수록 Ct는 낮고, DNA 의 순도가 낮을수록 Ct는 높다. 따라서, Ct가 낮을수록 용액 속의 DNA 는 더욱 정제된 형태라는 것을 알 수 있다.
도 2 는 은 나노입자 농도에 따른 PCR 결과를 Ct 로 나타낸 것이다. 은 나 노입자 사용시에, 10ppm 이하는 PCR 에 영향을 주지 않았으며, SH 여과를 하지 않은 경우에는, 은 나노입자의 농도가 100ppm 이상일 때 PCR 이 되지 않았으나, SH 여과를 한 경우에는, 은 나노입자의 농도가 1000ppm 이상일 때 PCR 이 되지 않았다는 것을 알 수 있다. 이는, SH 여과를 사용하는 경우에는 100ppm 의 은 나노입자의 농도가 SH 여과에 의해 10ppm 이하로 감소된다는 것을 의미하는 것이다. 따라서, 은 나노입자를 이용하여 실험할 경우에, SH 여과를 사용하지 않을 경우에는 은 나노입자 농도를 10ppm 으로 사용해야 하며, SH 여과를 사용할 경우에는 은 나노입자 농도를 100ppm 으로 사용할 수 있다.
더욱이, 이러한 결과는 SH 여과 장치에서, 막을 여러 층 사용하거나 막의 표면적을 넓힘으로써 PCR 증폭에 영향을 주지 않고 사용되는 은 나노입자의 농도를 1000ppm 으로 증가시킬 수 있다.
실시예 2: SH 개질된 막에 의한 은 나노입자 복합체의 제거
SH 개질된 막이 은 나노입자 복합체를 제거하는지를 알아보기 위해, SH 여과 전후의 은 나노입자의 농도를 측정하였다. SH 개질된 유리 섬유막은 실온에서 이소프로판올 중의 MPTS (3-(머캅토프로필)트리메톡시실란) 53.8mM 을 막에 결합시키고, 이소프로판올로 2회 세정하고, 80℃ 오븐에서 5분 동안 건조한 후, 증류수로 세정함으로써 제조하였다. 100ppm 의 은 나노입자(NANOVERTM 콜로이드 용액의 1/10 희석액)를 이용하여 SH 필터 여과 전후의 은 나노입자의 농도를 ICP(유도결합플라스마 원자방출분광기)를 이용하여 측정한 결과, 여과 전의 은 나노입자의 농도는 24.1ppm 인 반면에, 여과 후의 은 나노입자의 농도는 0.0022ppm 이었다. 이로부터, 100ppm 의 은 나노입자는 SH 필터에 의해 거의 완전히 제거된다는 것을 알 수 있었다.
실시예 3: 은 나노입자와 음파를 이용한 대장균 세포의 핵산 정제
본 발명의 방법을 대장균 검출을 위한 시료 제조 방법에 적용할 수 있는지를 알아보기 위해, 대장균 (E. coli) 세포로부터 본 발명의 방법을 이용하여 핵산을 정제하여 PCR 을 수행하였다.
rHBV 가 포함된 대장균 균주 BL2 세포(STRATAGENE)를 37℃에서 대수기까지(OD600=1.5) LB 배지(Sambrook 등, 1989)에서 호기 조건하에 배양하였다. 박테리아 세포를 원심분리로 수합하고, 3 ml의 인산염 완충액(PBS)으로 2회 세정하였다. 세포를 PBS 에서 재현탁하였다 (세포 밀도: 1 x 106 세포/ml).
세포 용해를 모니터링하고, 용해된 세포로부터 방출된 DNA 를 검출하기 위해, 하기 쌍의 PCR 프라이머를 사용하였다: 프라이머 A (서열번호 1); 및 프라이머 B (서열번호 2). 이 프라이머 쌍은 HBV 핵산을 코딩하는 유전자의 각 말단에 상보적이다. PCR은 하기를 포함하는 총 부피 1㎕의 반응 혼합물을 이용하여 실리콘-유리 마이크로 PCR 칩에서 수행하였다: 1X SYBR Green PCR 완충액 (PE Biosystems), 각각 1 mM 의 정방향 및 역방향 프라이머 (Genotech, Korea), 각각 200μM의 dNTPs(Sigma), 5mM MgCl2(Sigma), 5% 글리세롤(Sigma), 500mM 포름아미드(Promega), 0.2ng/㎕ BSA(Sigma), 및 0.1 유닛/㎕ Taq 중합효소(SolGent. Co, Ltd, Korea).
PCR 증폭의 실시간 모니터링을 새로 개발된 GenSpector
Figure 112004055364393-PAT00001
TMC-1000 시스템을 이용하여 수행하였다. PCR 증폭은 91℃에서 1분 동안 예비변성 후, 40 사이클(92℃에서 1초 동안 변성 및 62℃에서 15초 동안 어닐링-신장)을 수행하였다. 증폭 사이클을 완료한 후에, 융해 곡선(melting curve)은 시료를 60℃에서 90℃로 천천히 가열(0.1℃/초)하여 수득하였다. 증폭의 40 사이클 및 융해 분석에 소요되는 총 시간은 25분 미만이었다. 실시간 PCR 의 성공을 확인하기 위해, 증폭된 PCR 산물의 전기영동을 DNA 500 분석 규모의 시약 세트를 이용하여 Agilent 2100 Bioanalyzer (Palo Alto, CA)를 이용하여 수행하였다.
도 3 은 대장균 세포, 바실러스 메가테리움 세포 및 rHBV 로부터 각각의 핵산 정제 방법에 따른 PCR 결과를 최종 생성물 농도(ng/㎕) 로 나타낸 것이다. 막대기는 증폭된 DNA 농도(ng/㎕)를 나타낸다. rHBV 가 포함된 대장균 세포(8×102∼8×103 세포/㎕)를 음파 처리(>500Hz, 1분)하고, 은 나노입자를 100ppm 첨가하고, Qiagen 정제 키트에서 용해 단계를 제외하고 정제 단계만 사용하여 정제한 방법, 정제 없이 직접 PCR 한 방법 및 SH 여과에 의한 정제 방법에 따라 핵산을 정제하였다. 대장균 세포의 경우, 본 발명의 방법으로도 PCR 은 되었으나, 정제 방법에 무관하게 모두 PCR 이 잘 되므로, 시료 정제 방법의 변별력을 주지 못하였다. 그러나, 본 발명의 방법이 다른 방법에 비해 정제 단계 및 정제 시간이 적게 소요되므로, 랩온어칩의 구현을 위해 대장균 세포에도 효율적으로 적용할 수 있다는 것을 알 수 있다.
실시예 4: 은 나노입자와 음파를 이용한 바실러스 메가테리움 세포의 핵산 정제
본 발명의 방법을 그람양성 박테리아 검출을 위한 시료 제조 방법에 적용할 수 있는지를 알아보기 위해, 바실러스 메가테리움 (Bacillus megaterium) 세포로부터 핵산을 정제하여 PCR 을 수행하였다.
바실러스 메가테리움 (6.5×102 ∼ 6.5×103 세포/㎕)을 음파 처리(1분)하고, 은 나노입자를 100ppm 첨가하고, Qiagen 정제 키트로 정제한 방법, 정제 없이 직접 PCR 한 방법 및 SH 여과에 의한 정제 방법에 따라 핵산을 정제하였다.
PCR은 하기 프라이머를 제외하고는 상기 실시예 3의 것과 동일하게 수행하였다: 프라이머 C (서열번호 3); 및 프라이머 D (서열번호 4).
도 3 에서 알 수 있는 바와 같이, 그람 양성 박테리아인 바실러스 메가테리움 세포의 경우, 음파 용해 후 직접 PCR 한 경우에는 PCR 이 되지 않았고, 본 발명의 방법은 PCR 이 되었다. 그러나, 음파 1분 용해 후 Qiagen 정제 키트로 정제한 방법이 가장 PCR 수율이 높았다. 상기로부터, 본 발명은 PCR 저해제 역할을 하는 물질인 단백질을 제거하는 효과가 있지만, 카오트로픽 염을 사용하는 정제 방법보다는 정제 효율이 낮다는 것을 알 수 있다. 그러나, 본 발명의 방법이 시료 정제 시간이 훨씬 짧고, 정제 단계가 간단하므로 고도의 정제가 필요하지 않는 랩온어칩 분야에는 활용할 수 있다.
실시예 5: 은 나노입자와 음파를 이용한 rHBV의 핵산 정제
본 발명의 방법을 바이러스 검출을 위한 시료 제조 방법에 적용할 수 있는지를 알아보기 위해, 재조합 B형 간염 바이러스 (rHBV)로부터 핵산을 정제하여 PCR 을 수행하였다. PCR은 실시예 3의 것과 동일하게 수행하였다.
도 3 에서 알 수 있는 바와 같이, 음파 용해(1분) 후 Qiagen 정제 키트로 정제(15분)하여 PCR 한 경우 이합체 없이 PCR 결과가 아주 우수하였다. 그러나, 음파 용해(1분) 후 직접 PCR 한 경우에는 PCR 이 안되었다. 음파 용해(1분) 후 SH 여과(2분)한 경우 PCR이 되었다. 따라서, 은 나노입자(100ppm)을 첨가하여 음파 용해한 후 SH 필터를 이용하여 여과한 결과, 양성 대조군인 Qiagen 정제 키트를 이용한 경우보다 정제 면에서는 다소 떨어지나 시간에서 우수한 결과를 보인다는 것을 알 수 있다.
본 발명의 은 나노입자를 통한 핵산 정제 방법은 기존의 핵산 정제 방법에 비해 3 단계 작업으로 신속하게 PCR 증폭이 가능한 DNA 를 정제할 수 있으므로, 랩온어칩에 매우 유용하게 이용될 수 있다.
<110> Samsung Electronics Co. Ltd. <120> Purification method of nucleic acids using silver nanoparticles <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 1 agtgtggatt cgcactcct 19 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 2 gagttcttct tctaggggac ctg 23 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 3 yccakactcc atacgggagg c 21 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 4 gatttaccgc rrctggcac 19

Claims (10)

  1. (a) 티올기를 갖는 분자가 포함된 시료와 은 나노입자를 혼합하여 상기 분자와 은 나노입자 복합체를 형성하는 단계; 및
    (b) 상기 혼합물로부터 상기 복합체를 분리하여 제거하는 단계
    를 포함하는 은 나노입자(silver nanoparticle)를 이용하여 표적 물질을 정 제하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 시료는 세포 또는 바이러스를 포함하며, 상기 세포 또는 바이러스를 용해하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 표적 물질은 핵산 또는 당인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 2 항에 있어서, 상기 세포 용해 방법은 기계적인 분쇄, 화학 반응, 전기화학 반응, 생화학 물질, 초음파, 음파, 극초단파(microwave), 가열, 레이저, 전기장 및 전기분해를 이용한 세포 용해 방법으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 복합체의 제거가 SH 기를 갖는 구조물을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 SH 기를 갖는 구조물이 3-(메르캅토프로필)트리메톡시실란으로 개질된 유리섬유 막인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 은 나노입자의 크기가 1nm ∼ 100nm 인 것을 특징으로 하 는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 첨가되는 은 나노입자의 농도가 10ppm ∼ 1000ppm 인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 첨가되는 은 나노입자의 농도가 100ppm ∼ 1000ppm 인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 은 나노입자는 직접 첨가되거나 은 전극을 통한 전기분해에 의해 생성되는 것을 특징으로 하는 방법.
KR1020040097595A 2004-11-25 2004-11-25 은 나노 입자를 이용한 핵산의 정제 방법 KR100624447B1 (ko)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020040097595A KR100624447B1 (ko) 2004-11-25 2004-11-25 은 나노 입자를 이용한 핵산의 정제 방법
US11/257,833 US7364857B2 (en) 2004-11-25 2005-10-25 Method of purifying nucleic acid using silver nanoparticles
JP2005341097A JP4482517B2 (ja) 2004-11-25 2005-11-25 銀ナノ粒子を利用した標的物質の精製方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020040097595A KR100624447B1 (ko) 2004-11-25 2004-11-25 은 나노 입자를 이용한 핵산의 정제 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20060058523A true KR20060058523A (ko) 2006-05-30
KR100624447B1 KR100624447B1 (ko) 2006-09-18

Family

ID=36661038

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020040097595A KR100624447B1 (ko) 2004-11-25 2004-11-25 은 나노 입자를 이용한 핵산의 정제 방법

Country Status (3)

Country Link
US (1) US7364857B2 (ko)
JP (1) JP4482517B2 (ko)
KR (1) KR100624447B1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220101878A (ko) * 2021-01-12 2022-07-19 서울대학교산학협력단 나노필터를 이용한 바이오 분자 추출 장치

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2979353C (en) * 2008-06-05 2020-06-30 Ventana Medical Systems, Inc. Compositions comprising nanomaterials and method for using such compositions for histochemical processes
US9512468B2 (en) 2012-11-06 2016-12-06 Industrial Technology Research Institute Detection method uses magnetic and detectable nanoparticles with oligonucleotides attached thereto

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5234809A (en) 1989-03-23 1993-08-10 Akzo N.V. Process for isolating nucleic acid
US7147687B2 (en) 2001-05-25 2006-12-12 Nanosphere, Inc. Non-alloying core shell nanoparticles
AU2003234196A1 (en) 2002-04-22 2003-11-03 University Of Florida Functionalized nanoparticles and methods of use
CN1245625C (zh) * 2003-04-30 2006-03-15 陕西西大北美基因股份有限公司 一种核/壳型超顺磁性复合微粒及其制备方法与应用

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220101878A (ko) * 2021-01-12 2022-07-19 서울대학교산학협력단 나노필터를 이용한 바이오 분자 추출 장치

Also Published As

Publication number Publication date
JP2006158393A (ja) 2006-06-22
KR100624447B1 (ko) 2006-09-18
US20060240408A1 (en) 2006-10-26
US7364857B2 (en) 2008-04-29
JP4482517B2 (ja) 2010-06-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Emaus et al. Nucleic acid extraction: fundamentals of sample preparation methodologies, current advancements, and future endeavors
EP0988307B1 (en) Solid-phase nucleic acid isolation
Tan et al. DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present
EP2872523B1 (en) Microorganism nucleic acid purification from host samples
AU746005B2 (en) Electrical integrated nucleic acid isolation, purification and detection
Sun et al. Efficient purification and concentration of viruses from a large body of high turbidity seawater
JPH09327291A (ja) Ｒｎａの抽出精製方法
US20100280233A1 (en) Method for sample preparation
EP0979868B1 (en) Electrophoretic separation of nucleic acids from biological samples at low pH
JP6525001B2 (ja) 短鎖核酸の回収方法
JP4482517B2 (ja) 銀ナノ粒子を利用した標的物質の精製方法
CN115103908A (zh) 一种核酸提取方法以及应用
WO2001062976A1 (en) Rapid nucleic acid separation, isolation and purification methods
JP2003062401A (ja) 生体物質の精製方法および精製装置
Thatcher Nucleic acid isolation
JP3644641B2 (ja) 核酸回収方法
KR101077603B1 (ko) 카르복실기 또는 아미노기로 코팅된 고체상 물질을 이용한핵산의 증폭 방법
EP1462520A1 (en) DNA isolation method
JP4073430B2 (ja) 核酸回収方法
JPH11178571A (ja) 核酸抽出方法およびそのための試薬
KR20050061767A (ko) 알루미나를 이용한 핵산의 정제 방법
JP2001083050A (ja) 核酸の回収方法及び試薬キット

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20120814

Year of fee payment: 7

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20130822

Year of fee payment: 8

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20140822

Year of fee payment: 9

LAPS Lapse due to unpaid annual fee