JPWO2005045023A1 - 核酸の濃縮精製方法および装置 - Google Patents

核酸の濃縮精製方法および装置 Download PDF

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Abstract

従来核酸の精製濃縮方法は、劇薬を使用するため、高度の化学設備を必要とし、利用する環境が限定される。そして、操作に手間がかかり高速遠心等が必要で自動化が困難であり、高い精製精度を得ることも困難である。さらに、カラム／フィルターを用いた精製方法は、ごみの混入が多いサンプルでは目詰まりを起こし精製効率が低くなる可能性があり、遠心もしくは吸引操作を行う必要があり自動化が困難である。 そこで、試料中に存在する夾雑物２に界面活性剤３・４を吸着させ、核酸１と異なる挙動を示させることにより、夾雑物２と核酸１とを分離させるものであり、陽イオン界面界面活性剤４と非イオン界面活性剤３で核酸１以外の夾雑物２を帯電させ、電界中におくことで、夾雑物２を含む検体より核酸１を分離精製し、核酸１の濃縮もしくは濃縮し易い状態とする。

Description

本発明は、検体の前処理を行うデバイスに関するものである。より詳しくは、核酸検査において、菌体などより検査対象となる核酸を取出すための前処理デバイスに関するものである。
近年、ヒトゲノムの解読が進み、さまざまな生命現象と遺伝子の関連が解明されてきている。そして、この成果により、医学・医療は病態から病因へ、治療から予防へと視野を広げている。ここにおいて、遺伝子検査技術は重要な基盤となっている。
遺伝子検査は、培養困難な病原微生物の同定検査、抗生物質加療中や感染初期の病原微生物の検出、移行抗体が疑われた際の抗原検出、病原微生物の感染源調査、親子鑑定などの個人識別、さらに白血病・固形腫瘍の遺伝子レベルの病型診断や遺伝病の確定診断など従来の臨床検査では困難であった検査を行うことができる。そして、結果を得るまでの時間が、菌の培養を用いる手法に比べて短く、培養に時間のかかる細菌の検出には威力を発揮する。さらにＤＮＡは保存条件によっては安定しているため、凍結生検材料、骨など過去の検体からも検査を行うことができる。
また、近年増加傾向にある性感染症の検査において、検査機会の拡大を図るべく、遺伝子検査が注目されている。
従来核酸の精製濃縮方法としては、フェノール／クロロホルム／エタノールを用いた精製方法、核酸を吸着するカラム／フィルターを用いた精製方法、磁性シリカビーズを用いた精製方法等が知られている。
さらに、平板状の電気泳動ゲルから核酸を回収する方法として、作成したゲルにおいて核酸を電気泳動し、ゲルにおいて目的とする核酸の位置に回収装置を移動し、更なる電気泳動により目的とする核酸を回収する方法が知られている（例えば、特許文献１参照）。
この他に、平板状の電気泳動ゲルにおいて、核酸を電気泳動して目的とする核酸を分離し、目的とする核酸のバンド近傍に回収チップを挿入して核酸を回収する方法が知られている（例えば、特許文献２参照）。
しかし、従来核酸の精製濃縮方法において、フェノール／クロロホルム／エタノールを用いた精製方法は、劇薬を使用するため、高度の化学設備を必要とするものであり、利用する環境が限定される。そして、操作に手間がかかるとともに、高速遠心が必要となり、自動化が困難である。また、高い精製精度を得ることが困難である。
核酸を吸着するカラム／フィルターを用いた精製方法は、溶液を流しながら行うため、ごみ等の混入量の多いサンプルでは、カラム／フィルターが目詰まりを起こしやすく、精製効率が低くなる可能性がある。そして、遠心もしくは吸引操作を行う必要があるので、自動化が困難である。
さらに、磁性シリカビーズを用いた精製方法は、磁石によるビーズの回収を失敗した場合や、シリカビーズが磁性体より剥落した場合には、サンプルにシリカが混入する可能性がある。そして、高い回収率を得ることが困難である。
さらに、平板状の電気泳動ゲルから核酸を回収する従来の技術においては、平板状の電気泳動ゲルを必要とするとともに、この平板状の電気泳動ゲルにおいて一端電気泳動を行い、目的核酸の該当位置のゲルを処理する必要がある。
電気泳動に用いられるゲルは、衝撃に弱く、生成過程により、特性が大きく異なる場合がある。このため、一般に電気泳動を行った後に、紫外線により電気泳動ゲルにおける目的核酸の位置を認識した後に、目的核酸の含有量の多い部分を処理するものである。
このため、遺伝子検査等にこの手法を利用する場合には、一回の検査にかかる時間が長くなる。また、電気泳動に用いるゲルが大きくゲルのムラによる核酸のバンドににじみにより核酸の回収率が低下する可能性がある。さらに、ゲルが大きい場合には、電気泳動に必要となる電力が大きくなる。
実開平５−８８２９６号公報 特開平８−３２７５９５号公報
解決しようとする問題点は、核酸の精製濃縮方法において、複雑かつ高度な化学設備を必要とすることである。
上記の課題を解決すべく、様々の試験が行われ、検体中に存在する夾雑物に界面活性剤を吸着させ、核酸と異なる挙動を示させることにより、夾雑物と核酸とを分離させることが見出されたものである。
そして、陽イオン界面界面活性剤と非イオン界面活性剤で核酸以外の夾雑物を帯電させ、電界中におくことで、夾雑物を含む検体より核酸を分離精製し、核酸の濃縮もしくは濃縮しやすい状態とするものである。
図１は界面活性剤存在下における電気泳動による核酸濃縮構成を示す模式図である。
検体中には、核酸１とともに夾雑物２が含まれるものである。この検体中に、界面活性剤を混合する。界面活性剤としては非イオン界面活性剤３と陽イオン界面活性剤４とを用いるものである。
検体中に混合された界面活性剤は夾雑物２に吸着する。非イオン性界面活性剤による家電量の調整や、塩化ナトリウムなどの塩類やポリアニオン性物質（ヘパリン、デキストラン硫酸、ＤＮＡ）の添加によっても核酸と陽イオン界面活性剤の吸着を調整することができる。
陽イオン界面活性剤４が吸着した夾雑物２は、正電荷に帯電することとなる。そして、界面活性剤の吸着した夾雑物２と、界面活性剤の吸着していない、もしくは吸着量の少ない核酸１とを電気泳動により分離することができるものである。これにより、検体から夾雑物２を容易に取り除くことができ、核酸１を濃縮できるものである。
次に、核酸濃縮の手法について説明する。
この核酸濃縮の手法において、電気泳動を２回行うことにより、核酸の濃縮を確実に行うものである。第一の電気泳動においては検体中の余分なイオンを除き、第二の電気泳動においては検体中の核酸の濃縮を行うものである。
核酸を含む検体に添加する非イオン界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェニル エーテル（Ｔｒｉｔｏｎ系界面活性剤等）、ポリオキシエチレン ソルビタン アルキル エステル（Ｔｗｅｅｎ系界面活性剤等）、ポリオキシエチレンアルキル エーテル（Ｂｒｉｊ系界面活性剤等）等の非イオン性界面活性剤が使用でき、具体的には、例えば、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｂｒｉｊ３５等があげられる。好ましくは１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００が望ましい。当該界面活性剤の添加により細胞膜、核膜が溶解されない場合には、非イオン界面活性剤を加えた後、９６℃で１０分間加熱処理を行う。
検体に陽イオン界面活性剤として、ゼフィラミン、セチルトリメチルアンモニウムクロライド、セチルピリニジウムメチルアンモニウムクロライド、デシルピリジニウムクロライド（ＤＰＣ）があげられる。好ましくは０．２％ＤＰＣを１００μＬ加える。
なお、検体には、非イオン界面活性剤と陽イオン界面活性剤を同時に加えた後に、加熱処理を行うことも可能である。
検体に界面活性剤を加えて前処理を行うため、核酸が大腸菌などの原核細胞内に存在する場合においても、細胞壁が界面活性剤により破壊されることから、大腸菌の培養液などを検体として用いることができ、検体前処理の操作を容易に行うことができるものである。
このように検体の前処理を行い、１００Ｖの直流電圧を加え１０分間電気泳動を行い、検体中の余分なイオンを除去する。
この後に、１２５〜１５０Ｖの直流電圧を加え、１２０分間電気泳動を行い、正極側において核酸を採取するものである。
検体の電気泳動を行う電気泳動槽の構成について説明する。
まず、第一の電気泳動について説明する。
図２は第一電気泳動の泳動槽構成を示す図である。
電気泳動槽５内にはサンプル槽６、正極側と負極側とを分ける隔壁９が設けられている。サンプル槽６は隔壁９に貫通しており、一端が正極側に、他端が負極側に突出した構成となっている。サンプル槽６の両端は開口しており、両端の開口部はそれぞれゲル８・８により閉じられている。これにより、サンプル槽６内に電位差を発生させて核酸および界面活性剤が吸着した夾雑物の電気泳動を行うものである。
検体に非イオン界面活性剤と陽イオン界面活性剤を加え、加熱処理を行った後に、検体をサンプル槽６に注入する。
そして、電極間に１００Ｖの電圧を加えて、１０分間の電気泳動を行うものである。
これにより、検体中に含まれる余分なイオンを除くものである。
検体中に含まれる余分なイオンを除いた後に、第二の電気泳動により核酸の濃縮を行うものである。
第二電気泳動について説明する。
第二の電気泳動においては、第一の電気泳動で検体を注入したサンプル槽に、核酸の回収槽を接続していたものを電気泳動槽内に配置して電気泳動を行うものである。
図３は第二電気泳動の泳動槽構成を示す図である。
電気泳動槽５内にはサンプル槽６、回収槽７、正極側と負極側とを分ける隔壁９が設けられている。サンプル槽６は隔壁９に挿入され、負極側に突出した構成となっている。回収槽７は隔壁９に挿入され、正極側に突出した構成となっている。サンプル槽６と回収槽７とは隔壁９配設部において接続されており、ゲル８を介して接続されている。
サンプル槽６の両端は開口しており、両端の開口部はそれぞれゲル８・８により閉ざされている。そして、回収槽７の両端は開口しており、負極側はゲル８により閉じられており、正極側は限外ろ過膜１１により閉じられている。
このように構成された電気泳動槽において、電極間に１２０Ｖの電圧を加え、１２０分間の電気泳動を行うものである。
このように、電気泳動槽において第二の電気泳動を行うことにより、余分なイオンを除いた検体を電気泳動することができ、回収槽７において核酸を効率的に回収できるものである。また、回収槽７の正極側には限外ろ過膜１１を設けており、核酸は回収槽７より排出されることなく、回収槽７内にとどまる。このため、核酸の回収効率を向上することができるものである。
なお、検体の状態によっては、第一の電気泳動を行うことなく、第二の電気泳動を行うことも可能である。回収槽７に接続したサンプル槽６に前処理を行った検体を注入して電気泳動することにより、容易に核酸の濃縮を行うことができるものである。検体中に存在する余分なイオンは限外ろ過膜を透過できるので、核酸の回収に影響をあたえない。
すなわち、本発明は第１に、電気泳動を用いた核酸の濃縮精製方法であって、核酸を含む試料中の夾雑物に対して、荷電量の調節を行った後に、試料を電界中におき、核酸の濃縮精製を行う。
第２に、電気泳動による核酸の濃縮精製方法であって、核酸を含む試料に陽イオン界面活性剤を加えて、試料中夾雑物への荷電量を調節し、該試料を電界中におき、電気泳動することにより、核酸の濃縮精製を行う。
第３に、電気泳動による核酸の濃縮精製方法であって、核酸を含む試料中に陽イオン界面活性剤および非イオン界面活性剤を加えて、試料中夾雑物への荷電量を調節し、該試料を電界中におき、電気泳動することにより、核酸の濃縮精製を行う。
第４に、核酸以外への荷電量調節を、陽イオン界面活性剤の吸着により行うとともに、陽イオン界面活性剤の吸着量を非イオン界面活性剤の添加量により調節する。
第５に、試料に非イオン界面活性剤および陽イオン界面活性剤を添加し、該試料を電気泳動し、陽極側において核酸の濃縮精製を行う装置を構成する。
第６に、電気泳動を行う核酸の濃縮精製装置であって、側面を絶縁体により構成した容器内を、拡散を抑制する導電性の分離体により仕切り、該容器内に試料投入室および核酸回収室を構成し、該容器の端部がそれぞれバッファ槽を介して、電極に接続している装置を構成する。
本発明は、第１に、電気泳動を用いた核酸の濃縮精製方法であって、核酸を含む試料中の夾雑物に対して、荷電量の調節を行った後に、試料を電界中におき、核酸の濃縮精製を行う方法をとるので、電気泳動における核酸と夾雑物の挙動に相違をあたえ、核酸を効率的に分離できる。夾雑物と核酸との挙動における差異を荷電により調節可能であり、挙動の制御を容易に行える。
遠心分離装置などを利用する必要がなく、核酸濃縮を行う機構をコンパクトに構成することができる。
第２に、電気泳動による核酸の濃縮精製方法であって、核酸を含む試料に陽イオン界面活性剤を加えて、試料中夾雑物への荷電量を調節し、該試料を電界中におき、電気泳動することにより、核酸の濃縮精製を行うことができ、陽イオン界面活性剤を用いるので、操作容易であり、作業の安全を容易に確保できる。
そして、夾雑物への吸着量を増大させることにより、電気泳動における核酸と夾雑物との挙動差を大きくすることができ、核酸を効率的に分離できる。さらに、夾雑物が核酸とは反対方向に泳動されるので、夾雑物による精製の阻害を防止でき、核酸の精製を容易に行うことができる。
第３に、電気泳動による核酸の濃縮精製方法であって、核酸を含む試料中に陽イオン界面活性剤および非イオン界面活性剤を加えて、試料中夾雑物への荷電量を調節し、該試料を電界中におき、電気泳動することにより、核酸の濃縮精製を行うので、陽イオン界面活性剤と非イオン界面活性剤との割合により陽イオン界面活性剤の吸着量を調節可能であり、電気泳動における夾雑物の挙動を容易に調節できるものである。
また、核酸に非イオン界面活性剤を吸着させることにより、核酸への陽イオン界面活性剤の吸着を阻害することも可能である。
第４に、核酸以外への荷電量調節を、陽イオン界面活性剤の吸着により行うとともに、陽イオン界面活性剤の吸着量を非イオン界面活性剤の添加量により調節するので、容易な操作により、夾雑物への陽イオン界面活性剤と非イオン界面活性剤の吸着割合を操作することができる。さらに、夾雑物帯電量の調節を容易な操作により行うことができる。また、核酸に非イオン界面活性剤を吸着させることにより、核酸への陽イオン界面活性剤の吸着を阻害することも可能である。
第５に、試料に非イオン界面活性剤および陽イオン界面活性剤を添加し、該試料を電気泳動し、陽極側において核酸の濃縮精製を行う装置を構成するので、簡便な構成により、試料中の核酸を精製することができるとともに、核酸の挙動を制御可能であるため、安全性を維持しながら、濃縮精製装置をコンパクトに構成できる。
第６に、電気泳動を行う核酸の濃縮精製装置であって、側面を絶縁体により構成した容器内を、拡散を抑制する導電性の分離体により仕切り、該容器内に試料投入室および核酸回収室を構成し、該容器の端部がそれぞれバッファ槽を介して、電極に接続している装置を構成するので、簡便な構成により、濃縮精製装置を構成可能であり、製作にかかるコストを低減するとともに、制御が容易かつ安全性の高い装置を構成することが可能である。
界面活性剤存在下における電気泳動による核酸濃縮構成を示す模式図。 第一電気泳動の泳動槽構成を示す図。 第二電気泳動の泳動槽構成を示す図。 第一電気泳動槽の構成を示す図。 第二電気泳動槽の構成を示す図。 サンプリングユニットの構成を示す斜視図。 サンプリングユニットの平面図。 サンプリングユニットの側面図。 サンプリングユニットの側面断面図。 接続部の斜視図。 接続部の側面断面図。 ろ過部の側面断面図。 分離ユニットの組立て構成を示す図。 回収された液のＵＶスペクトル。 電気泳動装置の全体構成を示す図。 電気泳動ユニットの斜視図。 電気泳動ユニットの側面断面図。 電気泳動ユニットによる精製過程の前期を示す模式図。 同じく精製過程の後期を示す模式図。 電気泳動ユニットの組み付け構成を示す側面断面図。 同じく斜視図。 第１ブロックの構成を示す図。 第２ブロックの構成を示す図。 パッキンの正面図。 淋菌ゲノムの精製における比較結果を示す図。 ＤＮＡの濃縮結果を示すサンプルを電気泳動したゲルを示す図。
符号の説明
１ 核酸
２ 夾雑物
３ 非イオン界面活性剤
４ 陽イオン界面活性剤
５ 電気泳動槽
６ サンプル槽
９ 隔壁
危険な薬品を使うことなく、精製率の高い核酸濃縮装置を構成するという目的を、界面活性剤と電気泳動を用いた手法により実現した。
次に、本発明の実施例について説明する。
まず、電気泳動に用いる電気泳動槽の構成について説明する。
図４は第一電気泳動槽の構成を示す図である。
電気泳動槽２１は隔壁２４・２５により、負極側槽２２と正極側槽２３とに分けられている。隔壁２４・２５は電気泳動槽２１の中央部に配設されており、隔壁２４・２５にサンプルユニット２６が装着されている。サンプルユニット２６は一端を負極側槽２２に、他端を正極側槽２３に突出した構成となっている。サンプルユニット２６の負極側にはゲルが詰められており、側面にサンプル注入用の注入孔が開けられている。注入孔は電気泳動時には栓により閉じられるものである。
そして、負極側槽２２に負極が挿入され、正極側槽２３に正極が挿入され、電気泳動槽２１に電圧がかけられるものである。
次に、電気泳動槽の他の構成例について説明する。
図５は第二電気泳動槽の構成を示す図である。
第二電気泳動において、電気泳動槽２１は隔壁２４・２５により、負極側槽２２と正極側槽２３とに分けられている。隔壁２４・２５は電気泳動槽２１の中央部に配設されており、隔壁２４・２５に分離ユニット３２が装着されている。分離ユニット３２は一端を負極側槽２２に、他端を正極側槽２３に突出した構成となっている。そして、負極側槽２２に負極が挿入され、正極側槽２３に正極が挿入され、電気泳動槽２１に電圧がかけられるものである。
分離ユニット３２は、３つの部材を接続して構成するものであり、サンプリングユニット２６、接続部３３、ろ過部３４とにより構成される。サンプリングユニット２６と接続部３３との間、および接続部３３とろ過部３４との間にはＯリングが装着され接続を確保するとともに、緩衝液の流出を防止しているものである。
なお、サンプリングユニット２６の負極側にはゲルが詰められており、接続部３３の正極側にもゲルが詰められている。そして、ろ過部３４には限外ろ過膜が装着されている。
このような電気泳動槽を用いて、核酸の濃縮を行うものである。
まず、第一電気泳動において、前処理したサンプルを注入孔より入れ栓をする。そして、電気泳動槽２１にサンプルユニット２６を上面が少し液から出るように設置する。この後、１００Ｖの直流電圧をかけ、２０分間電気泳動を行うものである。これによりサンプル中の余分なイオンを取り除くものである。なお、緩衝液は１ｘＴＡＥ溶液、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ、４０ｍＭ 氷酢酸、１ｍＭ ＥＤＴＡにより調製し、ｐＨ８．０とした。
そして、第一電気泳動槽２１において余分なイオンを取り除いた後に、サンプルユニット２６に接続部３３およびろ過部３４を接続するものである。各接続個所にはＯリングを装着し、液漏れを防ぐものである。
接続部３３内には、１００％エタノールと１ｘＴＡＥを６：４で混合した液を入れ、サンプリングユニット２６内にはＴＥ−１（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を入れておくものである。ろ過部３４にはＴＥ−１を入れておく。
次に、サンプリングユニット２６、接続部３３、ろ過部３４の構成について説明する。
まず、サンプリングユニット２６の構成について説明する。
図６はサンプリングユニットの構成を示す斜視図であり、図７はサンプリングユニットの平面図であり、図８はサンプリングユニットの側面図であり、図９はサンプリングユニットの側面断面図である。
サンプリングユニット２６は、容器にゲルを保持させて構成するものであり、ミリポア社製のマイクロコン（登録商標）ＹＭ−３ マイクロコン 遠心式フィルタユニットを加工して利用するものであり、内部の限外ろ過膜をはずし、内部に直径５ｍｍの孔を開けたものである。なお、同様の効果を得られるものであれば、これに限らず用いることが出来るものである。
サンプリングユニット２６は筒体４１と台座４３とにより構成されている。筒体４１は台座４３に接続しており、サンプルを注入するための注入孔４２が設けられている。台座４３は段付き円柱状に構成されており、台座４３には上下面に連通する孔４４が構成されている。
筒体４１内にはゲル４８が配設されている。ゲル４８の厚みは数ｍｍ程度であり、筒体４１の開口部をふさぐ構成となっている。これにより、注入孔４２より供給された検体がゲル４８の内側に供給されるものである。
接続部３３の構成について説明する。
図１０は接続部の斜視図であり、図１１は接続部の側面断面図である。
接続部３３もサンプリングユニット２６と同様に、ミリポア社製の遠心式フィルタユニットを加工して利用するものであり、内部の限外ろ過膜をはずし、内部に直径５ｍｍの孔を開けたものである。
接続部３３は筒体４１と台座４３とにより構成されている。筒体４１は台座４３に接続している。台座４３は段付き円柱状に構成されており、台座４３には上下面に連通する孔４４が構成されている。
筒体４１内には、厚み数ｍｍ程度ゲル４８を配設している。ゲル４８は、筒体４１内において、台座４３の上面に位置しており、サンプリングユニット２６との間の液体の流動を防止するものである。
ろ過部３４について説明する。
図１２はろ過部の側面断面図である。
ろ過部３５もミリポア社製の遠心式フィルタユニットを加工して利用するものである。
ろ過部３５は筒体４１と台座４３とにより構成されている。筒体４１は台座４３に接続しており、筒体４１の長さはサンプリングユニット２６や接続部３３よりも短く構成されており、約５ｍｍ短く構成されているものである。台座４３は段付き円柱状に構成されており、台座４３には上下面に連通する孔４４が構成されている。
そして、筒体４１内において、台座４３の上面に限外ろ過膜４９が配設されている。これにより核酸の流出を防ぎ、核酸の濃縮を行うことが可能となる。
次に、核酸の濃縮操作例について説明する。
検体として、大腸菌培養液を用いて、上記の第一電気泳動および第二電気泳動により核酸の濃縮を行い、回収された核酸濃度を吸光度測定により調べた。
検体は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α）培養液１００μＬをを用いた。
検体に、１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００溶液１００μＬを加え、９６℃で１０分間加熱処理した。
この後に０．２％ＤＰＣを１００μＬ加え、電気泳動用の試料を調製した。
電気泳動用のバッファとしては０．５ｘＴＡＥを使用した。
アガロースの溶解には１ｘＴＡＥを使用した。
なお、１ｘＴＡＥ溶液は、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ、４０ｍＭ 氷酢酸、１ｍＭ ＥＤＴＡにより調製し、ｐＨ８．０とした。
接続部３３を筒体４１の開口側を上方にして静置し、筒体４１の開口側より、１％アガロースゲル（ＳｅａＫｅｍ Ｇｏｌｄ ａｇａｒｏｓｅ：ＴａＫａＲａ）をゲルの厚さが３〜７ｍｍ程度になるように流し込み、ゲルを固めた。
サンプリングユニット２６も接続部３３と同様に、筒体４１の開口側を上方にしてに静置し、筒体４１の開口側より、１％アガロースゲル（ＳｅａＫｅｍ Ｇｏｌｄ ａｇａｒｏｓｅ：ＴａＫａＲａから購入）をゲルの厚さが数ｍｍ程度になるようした。そして、ゲルが固まった後に、サンプリングユニット２６をひっくり返し、筒体４１の開口側に固まったゲルを流し込んだ。
電気泳動槽はＨＵ−６（エアブラウン社製）を用い、電源はＭＰＳＵ−２００（エアブラウン社製）を用いた。
サンプリングユニット２６の注入孔４２より、調製した電気泳動用試料を入れて栓をした。
電気泳動槽をパテにより正極側と負極側とに分離し正極側と負極側に０．５ｘＴＡＥを入れた。
そして、パテにサンプリングユニット２６の上面が少しバッファ液から出るように設置した。
この後に、直流電圧１００Ｖをかけ、２０分間第一の電気泳動を行った。
次に、第一の電気泳動を行った後のサンプリングユニット２６に接続部３３と、ろ過部３４とを接続して、分離ユニットを構成し、第二の電気泳動を行うものである。
第二電気泳動の操作例を説明する。
１００％エタノールと１ｘＴＡＥとを６対４で混合した溶液を接続部３３内に入れた。
ＴＥ−１（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）溶液をろ過部３４内に入れた。
次に、サンプリングユニット２６に接続部３３と、ろ過部３４とを接続して、分離ユニットを組み立てた。
図１３は分離ユニットの組立て構成を示す図である。
分離ユニットは、サンプリングユニット２６、接続部３３、ろ過部３４を同一方向に向けて組み立てるものであり、接続部３３とろ過部３４との間、および接続部３３とろ過部３４との間にＯリング５１をそれぞれ装着して、分離ユニットよりの液漏れを防ぐものである。
電気泳動槽をパテにより正極側と負極側とに分離し正極側と負極側に０．５ｘＴＡＥを入れた。
組み立てた分離ユニットのサンプリングユニット２６側端を負極側に、ろ過部３４を正極側にしてパテに配置した。
この後に、直流電圧２００Ｖをかけ、２４０分間、第二の電気泳動を行った。
次に、ろ過部３４において核酸溶液を回収して、吸光度の測定を行い、ＵＶスペクトルより回収された核酸濃度を算出した。
図１４は回収された液のＵＶスペクトルである。
算出された核酸濃度は、３２．３ｎｇ（６．７×１０６コピー／μＬ）であった。
核酸濃度の算出は、２６０ｎｍにおける吸光度（Ａ２６０）に、核酸の性状固有の係数をかけ、さらに、セルの光路長（ｍｍ）をかけて、１０で割ったものである。
また、回収された核酸の純度を、ＵＶスペクトルより算出した。
算出された核酸の純度は、１．９１であった。
純度の算出は、２６０ｎｍにおける吸光度（Ａ２６０）を、２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ２８０）で割ることにより、行うものである。サンプルが純度１００％のＤＮＡの場合、この値は約１．８となる。また、純度１００％のＲＮＡの場合には２．０となる。Ａ２８０の値は、被測定物に混入しているタンパク質やフェノールの量を反映し、吸光度比が１．５を大きく下回るような場合は、タンパク質などの低分子物質の混入が考えられるものである。
次に、第２の実施例における電気泳動装置について説明する。
図１５は電気泳動装置の全体構成を示す図である。
電気泳動装置５０は、電気泳動槽５０ｂ内に配置する電気泳動ユニット５１により検体中に含まれる核酸の濃縮を行うものである。電気泳動槽５０ｂは、バッファ槽５５・５８および冷却水槽５７を有し、バッファ槽５５・５６には電気泳動のためのバッファ溶液が満たされ、冷却水槽５７には電気泳動ユニット５１を冷却するために、氷水などの冷却水が満たされる。バッファ槽５５には正極５３が配設されており、バッファ槽５６には負極５４が配設されている。電気泳動ユニット５１の端部は、それぞれバッファ槽５５・５６内に露出しており、この電気泳動ユニット５１内に検体を導入して、正極５３と負極５４との間に電圧をかけることにより、検体中の核酸の濃縮を行う。
バッファ槽５５・５６と冷却水槽５７とは隔壁５２により区切られており、隔壁５２および電気泳動槽５０ｂは絶縁性のあるものを用い、隔壁５２としてはシリコーン系充填材やエポキシ樹脂系のパテを用いることができる。隔壁５２により電気泳動ユニット５１の側部は冷却水に接して、冷却されることとなる。これにより、電気泳動時の発熱を解消して、安定した温度環境で検体の精製を行うことができる。
次に、電気泳動ユニット５１について説明する。
図１６は電気泳動ユニットの斜視図であり、図１７は電気泳動ユニットの側面断面図であり、図１８は電気泳動ユニットによる精製過程の前期を示す模式図であり、図１９は同じく精製過程の後期を示す模式図である。
電気泳動ユニット５１は主にアクリル樹脂などの絶縁素材により構成されるものであり、複数の部材をボルトなどにより固定して、１つの電気泳動ユニット５１として構成される。電気泳動ユニット５１は、内部に延出方向に沿った円柱上の空間５１ｂが設けられており、この空間５１ｂの延出方向と直交するように孔が２つ設けられている。１つは空間５１ｂ内に検体を導入するための導入孔６７であり、もう１つは空間５１ｂより濃縮した検体を採取するための採取孔６６である。導入孔６７および採取孔６６はそれぞれ空間５１ｂに連通している。
電気泳動ユニット５１の内部には、回収槽７１およびサンプル槽７２が設けられており、導入孔６７がサンプル槽７２に採取孔６６が回収槽７１にそれぞれ接続している。サンプル槽７２と回収槽７１との間には、ゲル壁６４が設けられており、サンプル槽７２の負極側にもゲル壁６４が設けられている。そして、回収槽７１の正極側には限外ろ過膜６５が配設されている。すなわち、サンプル槽７２は２つのゲル壁６４・６４間に構成されており、回収槽７１はゲル壁６４と限外ろ過膜６５との間に構成されている。
次に、電気泳動ユニット５１による精製過程について説明する。
検体の精製を行う場合には、電気泳動ユニット５１内の空間５１ｂは電気泳動用のバッファで満たされるものであり、サンプル槽７２およびと回収槽７１もバッファで満たされる。図１８（ａ）に示すごとく、サンプル槽７２に検体を導入した後に電気泳動ユニット５１の両端に電圧を加える。なお、検体には精製を目的とする核酸と夾雑物、目的とする核酸よりも小さな核酸が含まれる。
電気泳動ユニット５１に電圧をかけると、図１８（ｂ）に示すごとく、核酸１および余分な電解物２ｂが正極側に移動し、夾雑物２が負極側に移動する。そして、一定時間電圧をかけることにより、図１９（ｃ）に示すごとく、核酸１および余分な電解物２ｂがゲル壁６４を通り回収槽７１に到達する。さらに、継続して電圧をかけると、図１９（ｄ）に示すごとく、分子量の小さい余分な電解物２ｂは限外ろ過膜６５を通り、回収槽７１より排出される。そして、目的物である核酸１が回収槽７１内にとどまることとなる。
このように、電気泳動ユニット５１において、電気泳動および限外ろ過膜を用いることにより、検体中より目的の核酸１の分離を容易に行うことができる。
次に、電気泳動ユニット５１の各部の構成について説明する。
図２０は電気泳動ユニットの組み付け構成を示す側面断面図であり、図２１は同じく斜視図である。図２２は第１ブロックの構成を示す図であり、図２３は第２ブロックの構成を示す図であり、図２４はパッキンの正面図である。
電気泳動ユニット５１は、第１ブロック６１、第２ブロック６２、第３ブロック６３とパッキン７３および限外ろ過膜６５とを組み合わせることにより構成される。第１ブロック６１、第２ブロック６２、第３ブロック６３には、電気泳動ユニット５１の空間５１ｂを構成するための前後面に連通する孔が中央に設けられており、各ブロックをボルト止めするための前後面に連通する孔が四隅に設けられている。
第１ブロック６１は電気泳動ユニット５１の端部を構成するものであり、第２ブロック６２はサンプル槽７２および回収槽７１を構成するものであり、第３ブロック６３はゲル壁６４を保持するものである。各ブロック間にはパッキン７３が配設されてブロック間のにおける冷却水の電気泳動ユニット５１内への流入を防止する。電気泳動ユニット５１の一端側に置いては、パッキン７３・７３により限外ろ過膜６５が挟持される。
第１ブロック６１の中央部には、図２２に示すごとく、孔６１ｂが設けられており、これが電気泳動ユニット５１の空間５１ｂの一部を構成する。そして、第１ブロック６１の四隅にはボルトを挿入するための孔６１ｃが設けられている。
第２ブロック６２の中央部には、図２３に示すごとく、孔６２ｂが設けられており、これが電気泳動ユニット５１の空間５１ｂの一部を構成する。第２ブロック６２の四隅にもボルトを挿入するための孔６２ｃが設けられている。そして、第２ブロック６２には孔６２ｂに連通する上下方向に設けた孔６２ｄが設けられている。この孔６２ｄが電気泳動ユニット５１の導入孔６７および採取孔６６となる。
なお、第３ブロック６３の形状は、第１ブロック６１の前後方向の厚みを小さくしたものであり、中央に設けた孔にゲル壁６４を保持するものである。
パッキン７３は、正面視十字形のシートにより構成されている。中央部には孔７３ｂが設けられており、本実施例においては厚さ０．５ｍｍのシリコーンシートにより構成されるものである。パッキン７３は図２４に示すごとく、四隅を切り欠いた構成となっており、ブロックを締結するためのボルトと接触しない形状となっている。なお、孔７３ｂの径は第１ブロック６１の孔６１ｂや、第２ブロック６２の孔６２ｂの径と一致するものである。
限外ろ過膜６５としては、孔７３ｂより大きいものを用い、パッキン７３・７３により挟持可能とする構成となっている。
次に、本実施例における電気泳動装置を用いた核酸の濃縮精製分離の試験について説明する。
［比較試験１］
比較試験１は、培養淋菌添加尿からの淋菌ゲノムの精製において、本実施例における電気泳動装置を用いたものと、磁性シリカビーズ法を用いたものとを比較したものである。
まず、本実施例における電気泳動装置を用いた操作について説明する。
チョコレート培地ＥＸ（日水製薬株式会社）で淋菌（Ｎｅｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）を３７℃で２日間培養した。
得られたコロニーを生理食塩水に懸濁し、吸光度がＯＤ５３０＝０．１８となるように調整した後に、生理食塩水で１００倍に希釈し、菌体希釈液を得た。
そして、健常人混合尿６０μＬに菌体希釈液１．２μＬを添加した。これに、表１に示す組成の溶解バッファＡを６０μＬ加えて混合した。
混合液を９６℃で１０分間加熱した。混合液より１００μＬを採りサンプルとして、本実施例の電気泳動装置に導入し、電圧１５０Ｖで６０分間の電気泳動を行った。
回収サンプル１００μＬのうち５μＬについてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）処理を行い、蛍光強度を測定した。
ＰＣＲ処理の処方は表２に示すものであった。
なお、第１ブロック６１のサイズは幅２０ｍｍ、高さ２０ｍｍ、厚み５ｍｍ、孔６１ｂの直径は５ｍｍであり、第２ブロック６２も同様であり孔６２ｄの直径は２ｍｍであった。第３ブロック６３のサイズ、幅と高さにおいて第１ブロック６１と同様であり厚みは２．５ｍｍであり、ゲル壁はアガロースゲルを用い、アガロースはＳｅａＫｅｍ Ｇｏｌｄ ａｇａｒｏｓｅ（ＴａＫａＲａ）を用い、溶解液は１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を用いた。限外ろ過膜としては、ＹＭ−１００（ミリポア）を用いた。また、パッキン７３の厚みは０．５ｍｍであった。
次に、磁性シリカビーズ法を用いた操作について説明する。
磁性シリカビーズとしてはＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ（東洋紡績株式会社）を用いた。
混合液の９６℃で１０分間加熱までは、前記の電気泳動装置を用いた操作と同様に行った。混合液より１００μＬを採りサンプルとして、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒのプロトコール通りに処理した。得られた回収サンプル１００μＬのうち５μＬについてＰＣＲ処理を行い、蛍光強度を測定した。
なお、ＰＣＲ処理の熱サイクルとしては、表３に示すごとく、５０℃で２分間保持したのちに、９５℃で２分間保持した後に、９５℃で１０秒間保持と５６℃で６０秒間保持とを５０サイクルまで行った。
Figure 2005045023
Figure 2005045023
Figure 2005045023
図２５は淋菌ゲノムの精製における比較結果を示す図である。図２５において太線は本実施例を用いたものであり、細線は磁性シリカビーズ法を用いたものである。なお、点線は標準である。
結果、本実施例を用いたものにおいて、磁性シリカビーズを用いたものより早く検出することができた。これは磁性シリカビーズ法よりも本発明の方が核酸の精製、分離の効率が高いことを示すものである。
［濃縮試験］
次に、本実施例における電気泳動装置を用いたＤＮＡの濃縮操作について説明する。
本実施例における電気泳動装置において、サンプル槽の容積を２００μＬとし、回収槽の容積を５０μＬとしたものを用いた。
２．７ｎｇ／μＬのλ／ＨｉｎｄＩＩＩ ＤＮＡを１００μＬとし、１００μＬの溶解液バッファＡと混合して、サンプルを調整した。サンプルを電気泳動装置のサンプル槽に導入し、電圧１００Ｖで３０分間にわたり電気泳動を行い、濃縮した。
この後、濃縮前のサンプルおよび濃縮後の回収サンプルについてそれぞれ、２μＬ、４μＬ、６μＬ、８μＬを採り、ゲル電気泳動を行った。また、濃縮後の回収サンプルについてはサンプル量を１０μＬとした電気泳動も行った。
図２６はＤＮＡの濃縮結果を示すサンプルを電気泳動したゲルを示す図である。
図２６において、Ａは濃縮前のサンプルであり、Ｂは濃縮後に回収されたサンプルである。図２６に示すごとく、各サンプル量に対して、濃縮前のサンプルよりも濃縮後に回収されたサンプルにおいて、よりはっきりとしたバンドを得た。
図２６において、回収サンプル２μＬのバンドの状態は、濃縮前の６μＬのバンド状態に相当するとおもわれる。
このことより、本実施例による電気泳動装置を用いてＤＮＡの濃縮を行うことができた。
本発明は、操作が簡便であるとともに、装置構成が簡易であるので、自動で核酸の濃縮および検査を行う検査装置などの用途にも適用できる。

Claims (6)

  1. 電気泳動を用いた核酸の濃縮精製方法であって、
    核酸を含む試料中の夾雑物に対して、
    荷電量の調節を行った後に、試料を電界中におき、
    核酸の濃縮精製を行うことを特徴とする核酸の濃縮精製方法。
  2. 電気泳動による核酸の濃縮精製方法であって、
    核酸を含む試料に陽イオン界面活性剤加えて、
    試料中夾雑物への荷電量を調節し、該試料を電界中におき、
    電気泳動することにより、
    核酸の濃縮精製を行うことを特徴とする核酸の濃縮精製方法。
  3. 電気泳動による核酸の濃縮精製方法であって、
    核酸を含む試料中に陽イオン界面活性剤および非イオン界面活性剤を加えて、
    試料中夾雑物への荷電量を調節し、該試料を電界中におき、
    電気泳動することにより、
    核酸の濃縮精製を行うことを特徴とする核酸の濃縮精製方法。
  4. 核酸以外への荷電量調節を、陽イオン界面活性剤の吸着により行うとともに、陽イオン界面活性剤の吸着量を非イオン界面活性剤の添加量により調節することを特徴とする請求項３に記載の核酸の濃縮精製方法。
  5. 試料に非イオン界面活性剤および陽イオン界面活性剤を添加し、
    該試料を電気泳動し、
    陽極側において核酸の濃縮精製を行うことを特徴とする核酸の濃縮精製装置。
  6. 電気泳動を行う核酸の濃縮精製装置であって、
    側面を絶縁体により構成した容器内を、
    拡散を抑制する導電性の分離体により仕切り、
    該容器内に試料投入室および核酸回収室を構成し、
    該容器の端部がそれぞれバッファ槽を介して、
    電極に接続していることを特徴とする核酸の濃縮精製装置。
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