KR20000029942A - 바이오리엑터의제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 계면활성제, 특히 양이온성 게면활성제를 사용하여 오염 효소, 특히 데아세틸라아제를 선택적으로 응집 및 침전시키는 것을 특징으로하는, 효소, 특히 아실라아제의 정제 방법; 효소를 담체에 결합시킨 뒤, 임의로는 가교시킴으로써 제조된 고정화 효소를 프로테아제로 처리함으로써 고정화 효소 담체, 특히 합성 흡착제 또는 이온 교환 수지로부터 제조된 담체를 재생시키는 방법; 담체가 기공성인 상기 언급한 바의 담체의 재생 방법; 및 효소가 세팔로스포린 C 아실라아제인 상기 언급한 바의 담체의 재생 방법에 관한 것이다. 본 발명의 효소 정제 방법에 따라서, 종래의 정제 방법으로는 제거할 수 없었던, 목표 효소에 대해 바람직하지 않은 오염 효소를 선택적으로 제거할 수 있다. 따라서, 이러한 방법이 고순도의 효소 표본 제조에 유용하다. 종래 방법과 비교하여, 상기 언급한 고정화 효소 담체의 재생 방법은 프로테아제에 의한 분해에 따라 담체, 특히 기공성 담체로부터 효소를 매우 효율적으로 제거할 수 있게 한다. 따라서, 담체를 반복적으로 사용할 수 있으므로, 이러한 방법이 환경적 및 경제적인 관점에서 유용하다.

Description

바이오리엑터의 제조 방법{Methods for Preparing Bioreactors}

바이오리엑터는 인공 콘테이너에서 생화학적 반응을 재현시키는 시스템 기술이며, 이 용어의 의미는 점차로 확대되고 있다. 그러나, 본 명세서에서 사용되는 바의 바이오리엑터는 효소 자체가 촉매로서 사용되는 리엑터를 의미한다. 때문에, 효소는 촉매의 경제적인 사용을 위해 어떠한 방식으로든 고정화되어야 한다. 따라서, 고정화 효소는 바이오리엑터의 주요 부분이 된다. 고정화 효소의 우수성을 결정하는 중요한 요인 중 하나는 사용되는 효소의 순도이다.

효소 단백질은 목표 효소 및 오염 단백질의 특성에 따라 종래에 공지된 다양한 단백질 분리 기술을 적절하게 병용함으로써 생물학적 시료 또는 세포 배양 상등액으로부터 정제된다. 최근에 널리 행해지는 분리 기술에는, 예를 들어 염석, 용매 침전 방법 등과 같이 용해도 차이를 이용하는 방법; 투석, 한외 여과, 겔 여과, 폴리아크릴아미드 전기영동 등과 같이 분자량 차이를 이용하는 방법; 이온 교환 크로마토그래피 등과 같이 전하를 이용하는 방법; 친화도 크로마토그래피 등과 같이 특이적 친화성을 이용하는 방법; 역상 고성능 액체 크로마토그래피 등과 같이 소수도 차이를 이용하는 방법; 및 등전점 전기영동 등과 같이 등전점 차이를 이용하는 방법이 있다.

그러나, 실제로 적지않은 경우에서, 오염 단백질을 목표 효소로부터 완벽하게 제거할 수 없었다. 이는 종래의 단백질 분리 방법에서 사용하는 각종 물리-화학적 특성에 있어 목표 효소와 오염 단백질 간에 뚜렷한 차이가 없기 때문이다. 예를 들어, 슈도모나스 (Pseudomonas)로부터 유도된 세팔로스포린 C 아실라아제 [세팔로스포린 C 및 글루타릴 7-아미노세팔로스포라닌산 (GL7-ACA)를 7-아미노세팔로스포라닌산 (7-ACA)로 전환시키는 효소; 이하 CC 아실라아제로 약칭함]은 투석, 황산 암모늄 분획, 음이온 교환 크로마토스래피 등의 단계에 의해 출발 물질로서의 조 세포 추출 용액을 반복적으로 분리함으로써 거의 95 %의 순도까지 정제할 수 있다 (예를 들어, 일본 특허 공고 제5-84078호). 그러나, 오염원인 데아세틸라아제는 음이온 교환 수지 칼럼상에서 CC 아실라아제와 거의 동일한 거동을 보이기 때문에 종래의 방법으로는 제거할 수 없다. 데아세틸라아제는 7-ACA의 아세틸기를 이탈시켜 데아세틸 7-ACA를 생성하므로, 7-ACA의 수율이 감소된다. 따라서, 이러한 바람직하지 않은 단백질을 분리 및 제거할 수 있는 신규한 효소 정제 방법에 대한 강한 요구가 있다.

고정화 효소의 우수성을 결정하는 또 다른 요인은 고정화 효소 담체의 수명이다. 일반적으로, 효소는 열, 강산, 강알칼리, 유기 용매 등에 불안정하고, 효소 반응에 양호한 조건하에서 조차 쉽게 활성을 소실하는 경향이 있다. 고정화 효소는 반복적인 사용으로 인해 효소 활성이 저하되어, 목표 물질의 생산 효율이 떨어지게된다. 변성된 고정화 효소는 대개 폐기되나, 담체로서 이온 교환 수지를 사용하는 경우에는 경제적 및 환경적 관점을 고려하여 담체를 재사용하는 것이 바람직하다.

고정화 효소 담체를 재생하는 종래의 방법은 강산 및 강알칼리를 사용하여 담체로부터 효소를 유리시키고, 제거하는 것이다. 그러나, 이러한 방법으로는 담체로부터 효소를 완벽하게 제거할 수 없어, 담체의 반복 재생 및 효소 재고정시에 고정화 효소의 활성을 크게 저하시킨다. 특히, 담체가 미세 기공을 갖는 경우, 효소가 미세 기공을 막아 재생 및 재고정화로 인한 상당한 변성을 초래한다.

〈발명의 개시〉

따라서, 본 발명의 목적은, 목표 효소에 대해 바람직하지 않으며 종래의 분리 기술로는 제거할 없는 오염 효소를 선택적으로 분리 및 제거하여 고순도의 목표 효소를 생성할 수 있는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 담체로부터 효소를 효율적으로 제거할 수 있는 고정화 효소 담체의 재생 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 발명자들은 상기 언급한 목적을 달성하기 위한 시도에 집중적인 연구를 수행하여, 계면활성제에 의한 단백질의 선택적인 응집 및 침전을 이용하기로 하였다. 따라서, 본 발명의 발명자들은 데아세틸라아제로 오염된 CC 아실라아제 용액계를 사용하는 다양한 측면으로부터 연구하였다. 계면활성제, 특히 양이온성 계면활성제를 첨가하는 것이 데아세틸라아제의 선택적인 응집 및 침전을 발생시킨다는 결과가 나타났고, 이러한 작용을 사용하여 본 발명의 발명자들은 7-ACA의 고순도 및 높은 생산 효율을 갖는 표준 CC 아실라아제 생성물을 제조하는데 성공하였다.

또한, 본 발명의 발명자들은 이온 교환 수지 담체 상에 CC 아실라아제를 흡착시키고, 글루타르알데히드로 CC 아실라아제를 가교시킴으로써 얻어진 고정화 효소에 프로테아제를 작용시켜 CC 아실라아제를 효율적으로 제거하는데 성공하였다. 더우기, 본 발명의 발명자들은 상기 언급한 효소 및 가교제를 사용하는 고정화 효소의 경우에서 산성 프로테아제를 사용하는 것이 효소를 제거하는데 특히 효과적이며, 본 발명을 완수하는 것임을 밝혀내었다.

따라서, 본 발명은 계면활성제를 사용하여 오염 효소를 선택적으로 응집 및 침전시키는 것을 포함하는, 효소의 정제 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 계면활성제가 양이온성인 경우의, 효소, 특히 아실라이제의 상기 언급한 정제 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 아실라아제가 세팔로스포린 C 아실라아제이고, 오염 효소가 데아세틸라아제인, 상기 언급한 아실라아제의 정제 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 계면활성제가 메틸계 또는 벤질계 양이온성 계면활성제, 특히 알킬(팜)디메틸벤질 암모늄 클로라이드인, 상기 언급한 아실라아제의 정제 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 양이온성 계면활성제를 0.1 내지 0.6 % 농도로 사용하는, 상기 언급한 아실라아제의 정제 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 효소를 담체, 예를 들어 합성 흡착제 및 이온 교환 수지에 결합시키고, 임의로는 결합 후에 가교제를 사용하여 효소를 가교시킴으로써 제조한 고정화 효소에 프로테아제를 작용시켜 담체로부터 효소를 제거하는 것을 포함하는, 고정화 효소 담체의 재생 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 상기 담체가 미세 기공을 갖는 것인, 상기 언급한 담체의 재생 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 효소가 CC 아실라아제인, 상기 언급한 담체의 재생 방법을 제공한다. 추가로, 본 발명은 상기 프로테아제가 산성 프로테아제인, 상기 언급한 담체의 재생 방법을 제공한다.

〈도면의 간단한 설명〉

도 1은 재생 및 재고정화 후에 고정화 CC 아실라아제의 활성에 대한 재생 조건의 효과를 보여준다.

본 발명은 바이오리엑터 (bioreactor)의 제조 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 계면활성제 사용에 의한 효소의 정제 방법 및 프로테아제 사용에 의한 고정화 효소 담체의 재생 방법에 관한 것이다.

본 발명의 정제 방법에 적용할 수 있는 효소는 1종 이상의 계면활성제에 대해 다른 오염 효소 보다 응집 및 침전을 적게 나타내는 것이라면 어떠한 특별한 제한을 두지않는다. 바람직하게는, 적어도 95 %의 오염 효소가 응집되고 침전되는 조건하에서 적어도 70 %의 효소가 용액 중에 잔류하는 것이다. 바람직한 효소의 예로는 아실라아제, 특히 CC 아실라아제가 있다.

본 발명의 정제 방법으로 제거하고자 하는 오염 효소는 1종 이상의 계면활성제에 대해 목표 단백질 보다 쉽게 응집 및 침전할 수 있는 특성을 가져야 한다. 예를 들어, 목표 단백질이 아실라아제인 경우, 오염 효소의 예로는 데아세틸라아제 등이 있다. 오염 효소가 다수 함유될 수도 있다. 각각의 오염 효소가 상이한 유형의 계면활성제에 의해 응집 및 침전되는 경우, 우선 한가지 계면활성제를 첨가하여 첫 번째 오염 효소를 응집 및 침전시키고, 이어서 원심분리 또는 여과에 의해 침전물을 제거한 뒤, 다른 계면활성제를 첨가하여 또 다른 오염 효소를 응집 및 침전시킨다.

본 발명에서 사용되는 계면활성제는 특별한 제한이 없으며, 목표 효소 및 오염 효소의 특성에 따라 양이온성, 음이온성 및 비이온성 계면활성제 중에서 선택할 수 있다. 예를 들어, 아실라아제 용액을 오염시키는 데아세틸라아제를 제거하고자 하는 경우, 바람직하게는 양이온성 계면활성제, 보다 바람직하게는 메틸계 및 벤질계 양이온성 계면활성제, 특히 메틸 및 벤질계 양이온성 계면활성제 [예를 들어, 알킬(팜)디메틸벤질 암모늄 클로라이드 등]을 사용한다.

계면활성제는 계면활성제의 종류 및 목표 효소화 오염 효소의 조합에 따라 가변적인 농도로 사용할 수 있다. 바람직한 농도는 오염 효소의 95 % 이상이 응집 및 침전되고, 목표 효소의 70 % 이상이 용액 중에 잔존하는 정도이다. 예를 들어, 목표 효소가 아실라아제이고, 오염 효소가 데아세틸라아제인 경우, 계면활성제는 0.1 내지 0.6 % 농도로 첨가한다.

담체 재생을 위해 본 발명의 방법에 적용될 수 있는 담체는 통상의 담체 결합 방법에 의해 효소 고정화에 사용될 수 있는 것이라면 특별한 제한을 두지 않는다. 그 예로는 천연 흡착제 (예를 들어, 목탄, 산성 점토, 카올리나이트, 셀라이트, 알루미나, 벤토나이트, 실리카겔, 산화 티탄, 키틴, 탄닌 등); 합성 흡착제 (예를 들어, 소수성 잔기 (예를 들어, 프로필, 부틸, 헥실, 페닐 등)이 도입된 폴리스티렌 수지, 폴리아크릴아미드 겔 등); 이온 교환기를 갖는 폴리사카라이드 겔; 이온 교환 수지 등이 있다. 합성 흡착제 및 이온 교환 수지가 바람직하다. 담체의 유형은 고정화시키고자하는 효소의 특성 등에 따라 적절하게 변할 수 있다.

본 발명의 담체 재생 방법은 담체가 미세 기공 (본 발명에서 미세 기공은 100 nm 이하의 직경을 갖는 것을 의미함)을 갖는 경우에 특히 효과적이다. 예를 들어, 효소를 담체 결합 방법 및 가교 방법을 병용하여 담체 상에 고정화시키는 경우, 강산 또는 강알칼리를 사용하는 종래의 방법으로는 가교를 형성함으로써 불용성화된 효소를 용해시킬 수 없다. 또한, 효소가 미세 기공을 막아 담체의 현저한 변성을 초래한다. 반대로, 프로테아제를 사용하는 본 발명의 재생 방법은 불용성화된 효소가 프로테아제의 작용에 의해 변성되어 효소가 재용해되기 때문에 담체로부터 불용성화된 효소를 효율적으로 제거한다.

담체 상에 고정화되는 효소는 물리적 흡착, 이온 결합 등에 의해 효소 활성이 소실되지 않으면서 담체와 결합할 수 있는 것이라면 특별한 제한을 두지 않으며, 미생물, 식물 및 동물로부터 유래된 다양한 효소를 사용할 수 있다. 공업용 효소에는 아실라아제, 아미노 아실라아제, 인버타아제, 니트릴 히드라타아제, 당 이소머라아제 등이 있다.

효소는 종래의 담체 결합 방법 (본 발명에서의 물리적 흡착에 의한 결합 방법을 비롯하여 효소를 수불용성 담체와 결합시키는 고정화 방법)에 의해 담체 상에 고정화시킬 수 있다. 특히, 효소를 이온 결합, 소수성 결합 또는 물리적 흡착에 의해 담체와 결합시키는 것이 바람직하다. 예를 들어, 이온 교환 수지를 담체로서 사용하는 경우, 평형화된 수지를 칼럼에 충전시키고, 효소 (400 내지 1000 단위/칼럼 ㎖)을 함유하는 적당한 완충액을 칼럼에 통액시켜, 효소를 수지에 결합시킨다.

담체 결합만으로 효소의 누출을 방지하기에 충분치 않은 경우에는, 담체와의 결합후의 효소를 가교제로 가교시키고, 고정화시킨다. 가교제의 예에는 글루타르알데히드, 헥사메틸렌 디이소시아네이트 등이 있다. 가교 반응은 상기 언급된 방법에 의해 얻어진 고정화 효소를 세척하고, 적당한 완충액 중에 용해된 가교제를 대략 0.5 내지 2 시간 동안 칼럼을 통해 순환시킴으로써 수행한다. 가교제 중 미반응된 관능기는 불활성제, 예를 들어 글리신으로 대략 0.5 내지 1 시간 동안 칼럼을 통해 순환시켜 불활성시켜야 한다.

고정화 효소 담체는 다음과 같이 재생시킬 수 있다. 상기 언급한 고정화 방법에 따라 제조된 고정화 효소가 절반의 효소 활성을 소실할 때까지 소정의 효소 반응을 반복적으로 수행하고, 산성 프로테아제 (또는 알칼리 프로테아제) 3 내지 50 단위/㎖를 함유하는 용액 (pH 3 내지 5 또는 pH 9 내지 11)을 상기 고정화 효소를 함유하는 칼럼에, 칼럼의 약 5 내지 15배의 용량으로, 시간 당 5 내지 10 칼럼 용량 유속 (이하 SV 5-20으로 나타냄)으로 약 1 내지 5시간 동안 통액시킨다. 재생 반응 온도는 20 내지 60 ℃, 바람직하게는 30 내지 50 ℃이다.

효소는 첫번째 고정화와 동일한 방식으로, 재생된 고정화 담체에 재고정화될 수 있다.

본 발명을 하기 실시예의 방법에 따라 보다 상세히 설명할 것이며, 이러한 실시예는 오직 예시를 위한 것이지 본 발명을 제한하려는 것은 아니다.

〈실시예 1〉

다양한 계면활성제에 의한 CC 아실라아제로부터 데아세틸라아제의 분리 및 제거

(1) CC 아실라아제 생산 세균의 배양 및 조 추출 용액의 정제

CC 아실라아제 N-176을 생산하는 변이주 이. 콜리 (E. Coli) JM 109 (PCCN 176-2) FERM BP-3047을 일본 특허 공고 제5-84078호의 실시예 3에 개시된 방법에 따라 배양하고, 세포를 원심분리로 수집하였다. 수득된 세포 펠릿을 균질기로 파쇄하고, 가용성 단백질 성분을 물로 추출하고, 원심분리로 잔해물을 제거하여 조 추출 용액을 수득하였다.

(2) 계면활성제에 의한 오염 데아세틸라아제의 제거

폴리에틸렌이민을 상기 언급한 (1)에서 수득된 조 추출 용액에 첨가하여 핵산을 침전시키고, 이를 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 이 상등액을 인산 완충액 (pH 7.0)으로 평형화된 DEAE 칼럼에 가하고, 물로 세척하고, 0.2M-NaCl로 용리시켰다 (이 단계에서, 다른 오염 효소인 β-락타마아제를 비흡착된 분획에서 선택적으로 회수하고, 제거함). 수득된 용출액에 양이온성 계면활성제, 예를 들어 알킬(팜)디메틸벤질 암모늄 클로라이드 [등록 상표 : 캐티온 F2-50; 노프 코포레이션 (NOF Corporation)에서 제조함; 이하 동일], 알킬(팜)트리메틸 암모늄 클로라이드 (등록 상표 : 캐티온 FB) 또는 도데실트리메틸 암모늄 클로라이드 (등록 상표 : 캐티온 BB), 음이온성 계면활성제, 예를 들어 알킬 글리신 (등록상표 : 니산 아논 LG) 또는 비이온성 계면활성제, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 옥틸페닐 에테르 (등록 상표 : 논이온 HS-210) 또는 폴리옥시에틸렌소르비탄 모노올레에이트 (등록상표 : 논이온 OT-221)을 0.1, 0.3 및 0.5 %의 최종 농도로 첨가하고, 혼합물을 실온에서 16시간 동안 정치하였다. 계면활성제를 첨가하기 전후에 각 시료 중의 CC 아실라아제 및 데아세틸라아제의 활성을 측정하고, 변화를 검사하였다. 효소 활성은 기질로서 GL7-ACA로부터 생성된 7-ACA 및 데아세틸 7-ACA를 정량적으로 결정함으로써 계산하였다. 결과를 표 1에 나타내었다. 캐티온 F2-50은 0.1 내지 0.3 % 농도에서 90 % 이상의 CC 아실라아제 잔류 활성을 나타내었고, 오염 데아세틸라아제의 활성을 5 % 미만으로 감소시켰다. 0.5 % 농도에서, 데아세틸라아제는 거의 완벽하게 제거되었다. 다른 두가지 양이온성 계면활성제도 0.5 % 농도에서 데아세틸라아제를 선택적으로 제거하는 것으로 나타났다. 음이온성 또는 비이온성 계면활성제를 사용하는 경우에, 데아세틸라아제는 시험된 농도 범위에서 완벽하게 제거할 수는 없었으나, 데아세틸라아제 활성이 CC 아실라아제 활성의 저하 없이 거의 절반 이하로 감소되었다.

각종 계면활성제 첨가에 의한 오염 데아세틸라아제의 선택적 제거 효과

계면활성제(등록상표)	잔류 활성1)(CC 아실라아제/데아세틸라아제)
	첨가 농도 (%)
	0	0.1	0.3	0.5
캐티온 F2-50	100/100	95/5	92/1	70/0
캐티온 FB	100/100	100/55	100/40	80/1
캐티온 BB	100/100	100/55	100/45	85/5
니산 아논 LG	100/100	100/60	100/50	95/30
논이온 HS-210	100/100	100/50	100/50	100/45
논이온 OT-221	100/100	100/50	100/50	100/45
1) 잔류 활성은 계면활성제 첨가 전 (0 % 농도 첨가)의 효소 활성 100에 대한 상대 활성으로 표현함

〈실시예 2〉

프로테아제에 의한 가교된 CC 아실라아제 침전물의 용해

CC 아실라아제 N 176 (이 효소를 얻는 방법은 일본 특허 공고 제5-84078호에 개시되어 있음) 67 단위/㎖을 함유하는 10 mM 트리스 HCl 완충액 (pH 8.0, 5 ㎖)에 2 % 글루타르알데히드를 함유하는 150 mM 트리스 HCl 완충액 (pH 8.7, 5 ㎖)을 첨가하고, 혼합물을 1시간 동안 교반하여 반응시키고, 이로써 가교된 생성물이 침전되었다. 상등액을 원심분리로 제거하고, 침전물을 회수하였다. 침전물에 2N-NaOH, 0.1N-NaOH, 0.1N-NaOH + 알칼리성 프로테아제 [바이오프라아제 (Bioprase) AL-15 (30 단위); 나가제 바이오케미칼스 리미티드 (Nagase Biochemicals Ltd,) 제조], 2N-HCl, 0.1N-HCl 또는 0.1N-HCl + 산성 프로테아제 [데납신 (Denapsin) (30 단위); 나가제 바이오케미칼스 리미티드 제조] 3 ㎖을 첨가하고, 침전물을 40 ℃에서 2시간 동안 첨가한 용액에 침지시켰다. 그 결과로써, NaOH 또는 HCl을 단독으로 첨가하면 침전물을 변화시키지 않았으나, HCl + 산성 프로테아제를 첨가하면 침전물을 완전하게 용해시켜, 투명한 용액을 수득하였다. NaOH + 알칼리성 프로테아제를 첨가하여서도 침전물을 거의 완전하게 용해시켰으나, 용액이 탁하고, 완전한 용해를 달성하지는 못했다. 상기 결과로부터, 가교 처리에 의해 불용성화된 CC 아실라아제가 프로테아제, 특히 산성 프로테아제를 사용함으로써 효과적으로 재용해되는 것을 보여준다.

〈실시예 3〉

프로테아제에 의한 고정화 CC 아실라아제의 재생

(1) 고정화 담체의 제조

신규 상품인 스티렌-디비닐 벤젠의 고다공성 강 염기성 이온 교환 수지 [80 ㎖, HPA 25 (10 내지 100 nm 직경의 미세 기공을 갖음); 미쯔비시 케미칼 코포레이션 (Mitsubishi Chemical Corporation) 제조]를 1N-NaOH : 메탄올 = 1:1에 1일 동안 침지시키고, 칼럼 (350 ㎜ × 15 ㎝)에 충전시켰다. 이어서, 3배 용량의 2N-HCl을 SV3으로 칼럼에 통액시키고, 칼럼을 5배 용량의 물 (SV3)로 세척한 뒤, 5배 용량의 0.1N-HCl을 SV3으로 칼럼에 통액시키고, 칼럼 출구에서의 pH가 4 이상이 될 때까지 SV3으로 물로 세척하였다.

(2) CC 아실라아제의 고정화

상기 언급한 (1)로 제조된 HPA 25 (80 ㎖)을 칼럼에 충전시키고, CC 아실라아제 N176 (67 단위/㎖)을 함유하는 10mM 트리스 HCl 완충액 (pH 8.0, 240 ㎖)을 SV3으로 칼럼에 통액시켰다. 칼럼을 물 240 ㎖로 세척 (SV3)한 후에, 2 % 글루타르알데히드를 함유하는 60mM 인산 완충액 (pH 8.0, 300 ㎖)을 pH를 7.5로 조정하면서 1시간 동안 SV20으로 순환시켰다. 가교후에, 칼럼을 물 400 ㎖로 세척 (SV3)하였다. 이어서, 0.2M 글리신을 함유하는 60mM 인산 완충액 (pH 8.0, 300 ㎖)을 1시간 동안 SV10으로 순환시켜, 미반응된 알데히드기를 불활성화시켰다. 물 (400 ㎖ 이상)을 사용하여, 칼럼을 S5로 세척하여 HPA 25 상에 고정화된 아실라아제 82 ㎖를 수득하였다.

(3) 고정화된 CC 아실라아제에 의한 7-ACA의 생성

상기 언급한 (2)에 따라 제조되고 HPA 25 (20 ㎖) 상에 고정화된 CC 아실라아제를 재킷으로 칼럼에 충전시키고, 6.0 ㎎/㎖ 글루타릴 7-아미노세팔로스포라닌산 (GL7-ACA) 용액 (100 ㎖)을 NaOH로 pH를 7.75로 조정하면서 약 70 ㎖/분의 순환 유속으로 20 ℃에서 1시간 동안 순환시켜, 7-ACA를 수득하였다. 반응후에, 칼럼 중의 반응 혼합물을 물로 밀어내어, 7-ACA를 회수하였다. 상기 언급한 반응을 100회 반복 (연속 회분식 반응)하고, 이를 1 싸이클로 하였다.

(4) 고정화 담체의 재생

재생제로서 2N-NaOH, 0.1N-NaOH + 바이오프라아제 (3000 ppm, 10 단위/㎖) 또는 0.1-HCl + 데납신 (3000 ppm, 10 단위/㎖)을 사용하여, HPA25를 1회 싸이클 마다 재생시켰다. 재생제 (담체의 10배 용량)을 SV 약 20으로, 40 ℃에서 5시간 동안 순환시켰다.

재생 반응후에, 상기 언급한 단계 (1)-(4)를 2 내지 4회 반복하고, 재고정화 (2) 후의 CC 아실라아제 활성을 결정하였다. 활성의 변화를 비교하였다.

결과를 도 1에 나타내었다. 2N-NaOH를 재생제로서 사용한 경우, 고정화된 CC 아실라아제의 활성은 매 싸이클마다 거의 절반으로 저하된 반면, 0.1N-HCl 및 데납신 (산성 프로테아제)를 사용한 경우에는 3회 싸이클 후 조차도 효소 활성이 저하되지 않았다. 0.1N-NaOH 및 바이오프라아제 (알칼리성 프로테아제)를 사용한 경우에는, NaOH를 단독 사용한 경우에 비해 적은 정도로 매 싸이클마다 CC 아실라아제의 활성이 저하되었으나, 적어도 초기 활성의 50 % 활성을 4회 싸이클 후에서 조차도 나타내었다.

본 발명의 효소 정제 방법은 종래의 정제 방법으로는 제거할 수 없었던, 목표 효소에 대해 바람직하지 않은 오염 효소를 계면활성제에 의해 단백질의 선택적인 응집 및 침전을 이용하여 분리하고 제거하는 것을 특징으로 한다. 따라서, 본 발명에 따라, 종래의 생성물보다 고순도를 갖는 표준 효소 생성물을 제조할 수 있다. 또한, 효소에 대한 프로테아제의 작용에 근거하는 본 발명의 고정화 효소 담체의 재생 방법은 담체로부터 효소를 매우 효율적으로 제거할 수 있어, 장기간 동안 담체의 연속적인 재사용을 가능케한다. 결과적으로, 본 발명은 바이오리엑터 제조 비용의 절감 및 담체 폐기물로 인한 환경 파괴의 예방에 크게 기여한다.

본 발명의 출원은 일본에서 출원된 출원 번호 제212383호/1996 및 동 제212387호/1996에 근거하며, 그의 내용을 본 명세서에서 참고로 인용하였다. 본 명세서에서의 모든 문헌은 각 문헌이 구체적으로 기재하는 바와 동일한 정도로 본 명세서에서 참고로 인용하였다.

Claims (12)

1. 계면활성제를 사용하여 오염 효소를 선택적으로 응집 및 침전시키는 것을 포함하는, 효소의 정제 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 계면활성제가 양이온성 계면활성제인 방법.
3. 양이온성 계면활성제를 사용하여 오염 효소를 선택적으로 응집 및 침전시키는 것을 포함하는, 아실라아제의 정제 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 아실라아제가 세팔로스포린 C 아실라아제이고, 오염 효소가 데아세틸라아제인 방법.
5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 양이온성 계면활성제가 메틸계 또는 벤질계인 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 양이온성 계면활성제가 알킬(팜)디메틸벤질 암모늄 클로라이드인 방법.
7. 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양이온성 계면활성제를 0.1 내지 0.6 % 농도로 사용하는 방법.
8. 효소를 담체에 결합시키고, 임의로는 결합후에 가교제를 사용하여 효소를 가교시킴으로써 제조된 고정화 효소에 프로테아제를 작용시켜 담체로부터 효소를 제거하는 것을 포함하는, 고정화 효소 담체의 재생 방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 담체가 합성 흡착제 또는 이온 교환 수지인 방법.
10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 담체가 미세 기공을 갖는 것인 방법.
11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소가 세팔로스포린 C 아실라아제인 방법.
12. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로테아제가 산성 프로테아제인 것인 방법.