JPH0630774A - 固定化酵素剤 - Google Patents
固定化酵素剤Info
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- JPH0630774A JPH0630774A JP4190988A JP19098892A JPH0630774A JP H0630774 A JPH0630774 A JP H0630774A JP 4190988 A JP4190988 A JP 4190988A JP 19098892 A JP19098892 A JP 19098892A JP H0630774 A JPH0630774 A JP H0630774A
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- cftase
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- exchange resin
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- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 最頻度半径が７５〜２０００Åの細孔を有す
る陰イオン交換樹脂にサイクロフラクタノトランスフェ
ラーゼ（ＣＦＴａｓｅ）を担持させた固定化酵素剤。 【効果】 本発明の固定化酵素剤は、長時間の使用にも
活性の低下が少なく、反応中、ＣＦＴａｓｅが担体から
溶離することも少ないので、工業的に有利に反応を行う
ことが可能である。
る陰イオン交換樹脂にサイクロフラクタノトランスフェ
ラーゼ（ＣＦＴａｓｅ）を担持させた固定化酵素剤。 【効果】 本発明の固定化酵素剤は、長時間の使用にも
活性の低下が少なく、反応中、ＣＦＴａｓｅが担体から
溶離することも少ないので、工業的に有利に反応を行う
ことが可能である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、サイクロフラクタン
（ｃｙｃｌｏｉｎｕｌｏ−ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒａ
ｉｄｅ（サイクロイヌロオリゴサッカライド），以下
「ＣＦＲ」と称すこともある）の製造に有利に用いるこ
とができる固定化酵素剤に関する。
（ｃｙｃｌｏｉｎｕｌｏ−ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒａ
ｉｄｅ（サイクロイヌロオリゴサッカライド），以下
「ＣＦＲ」と称すこともある）の製造に有利に用いるこ
とができる固定化酵素剤に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする問題点】サイ
クロフラクタノトランスフェラーゼ（以下「ＣＦＴａｓ
ｅ」と称すこともある）はイヌリンよりサイクロフラク
タンを生産する酵素である。サイクロフラクタンはフラ
クトース６〜８分子が１−２′、２−１′の間で脱水縮
合した構造を持つオリゴ糖であり、川村らにより１９８
９年に単離同定されている（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９２，８３−９０，１９８
９）。ＣＦＲは、新規な環状オリゴ糖として食品用包接
化剤、フレーバー成分の保持、特異臭のマスキング、苦
みの除去、酸化の防止等の食品分野での利用や、クラウ
ンエーテル様の作用などから、化学品、医薬品、食品な
どの幅広い分野への応用が期待されている。
クロフラクタノトランスフェラーゼ（以下「ＣＦＴａｓ
ｅ」と称すこともある）はイヌリンよりサイクロフラク
タンを生産する酵素である。サイクロフラクタンはフラ
クトース６〜８分子が１−２′、２−１′の間で脱水縮
合した構造を持つオリゴ糖であり、川村らにより１９８
９年に単離同定されている（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９２，８３−９０，１９８
９）。ＣＦＲは、新規な環状オリゴ糖として食品用包接
化剤、フレーバー成分の保持、特異臭のマスキング、苦
みの除去、酸化の防止等の食品分野での利用や、クラウ
ンエーテル様の作用などから、化学品、医薬品、食品な
どの幅広い分野への応用が期待されている。
【０００３】従来ＣＦＴａｓｅ生産菌としては、例え
ば、バチルス・サーキュランス（Ｂａｔｉｌｌｕｓ ｃ
ｉｒｃｕｒａｎｓ）ＭＺ Ｎｏ．３１（微工研菌寄第９
９４３号）が知られている。また、更に本発明者らは、
先にバチルス・サーキュランス（Ｂａｔｉｌｌｕｓ ｃ
ｉｒｃｕｒａｎｓ）ＭＣＩ−２５５４（微工研菌寄第１
１９４０号）でもＣＦＴａｓｅｓが生産されていること
を見出だしている（特願平３−３９８３号）。
ば、バチルス・サーキュランス（Ｂａｔｉｌｌｕｓ ｃ
ｉｒｃｕｒａｎｓ）ＭＺ Ｎｏ．３１（微工研菌寄第９
９４３号）が知られている。また、更に本発明者らは、
先にバチルス・サーキュランス（Ｂａｔｉｌｌｕｓ ｃ
ｉｒｃｕｒａｎｓ）ＭＣＩ−２５５４（微工研菌寄第１
１９４０号）でもＣＦＴａｓｅｓが生産されていること
を見出だしている（特願平３−３９８３号）。
【０００４】従来、この種の酵素を利用して酵素反応を
行う場合、酵素を水に溶解した状態で使用すると、反応
終了後、工業的に反応生成物を取得するためには、酵素
の変性または除去等をせざるを得ない。従って、酵素が
未だ活性を有していても、１回の反応毎にこれを廃棄し
なければならず、経済的に不利である。また、あえて酵
素を回収しようとした場合、限外濾過膜等による処理が
必要となり、酵素の分離に多大の設備と時間を要し、や
はり経済的に不利である。
行う場合、酵素を水に溶解した状態で使用すると、反応
終了後、工業的に反応生成物を取得するためには、酵素
の変性または除去等をせざるを得ない。従って、酵素が
未だ活性を有していても、１回の反応毎にこれを廃棄し
なければならず、経済的に不利である。また、あえて酵
素を回収しようとした場合、限外濾過膜等による処理が
必要となり、酵素の分離に多大の設備と時間を要し、や
はり経済的に不利である。
【０００５】
【問題点を解決するための手段】本発明者らは、上記の
ごとき欠点を克服し、工業的に有利な種々の方法につい
て鋭意研究した結果、酵素を前もって特定の陰イオン交
換樹脂に担持した固定化酵素剤（固定化ＣＦＴａｓｅ
剤）は、再利用等の面で経済的に有利に利用できるばか
りでなく、酵素吸着量、酵素活性あるいは酵素と担体と
の結合力などの点において優れており、かつ担持された
酵素の活性が非常に高くて安定であるという驚くべき現
象を見出だし、本発明を完成するに至った。
ごとき欠点を克服し、工業的に有利な種々の方法につい
て鋭意研究した結果、酵素を前もって特定の陰イオン交
換樹脂に担持した固定化酵素剤（固定化ＣＦＴａｓｅ
剤）は、再利用等の面で経済的に有利に利用できるばか
りでなく、酵素吸着量、酵素活性あるいは酵素と担体と
の結合力などの点において優れており、かつ担持された
酵素の活性が非常に高くて安定であるという驚くべき現
象を見出だし、本発明を完成するに至った。
【０００６】即ち、本発明の目的は、最頻度半径が約７
５〜２０００Åの細孔を有する陰イオン交換樹脂にサイ
クロフラクタノトランスフェラーゼを担持して成る固定
化酵素剤に存する。本発明を詳細に説明するに、本発明
において前記の陰イオン交換樹脂に担持させる酵素ＣＦ
Ｔａｓｅは、イヌリンからＣＦＲを生成し得るものであ
ればいずれのものでも使用できる。
５〜２０００Åの細孔を有する陰イオン交換樹脂にサイ
クロフラクタノトランスフェラーゼを担持して成る固定
化酵素剤に存する。本発明を詳細に説明するに、本発明
において前記の陰イオン交換樹脂に担持させる酵素ＣＦ
Ｔａｓｅは、イヌリンからＣＦＲを生成し得るものであ
ればいずれのものでも使用できる。
【０００７】かかる酵素を生産する菌としては、例えば
バチルス・サーキュランス（Ｂａｔｉｌｌｕｓ ｃｉｒ
ｃｕｒａｎｓ）等のバチルス属に属する菌等が挙げられ
る。具体的には、バチルス・サーキュランス（Ｂａｔｉ
ｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｒａｎｓ）ＭＺ Ｎｏ．３１（微
工研菌寄第９９４３号）、バチルス・サーキュランス
（Ｂａｔｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｒａｎｓ）ＭＣＩ−２
５５４（微工研菌寄第１１９４０号）等が挙げられる。
バチルス・サーキュランス（Ｂａｔｉｌｌｕｓ ｃｉｒ
ｃｕｒａｎｓ）等のバチルス属に属する菌等が挙げられ
る。具体的には、バチルス・サーキュランス（Ｂａｔｉ
ｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｒａｎｓ）ＭＺ Ｎｏ．３１（微
工研菌寄第９９４３号）、バチルス・サーキュランス
（Ｂａｔｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｒａｎｓ）ＭＣＩ−２
５５４（微工研菌寄第１１９４０号）等が挙げられる。
【０００８】上記ＣＦＴａｓｅ生産菌は、それぞれ常法
に従い培養することができる。培養液中の菌体外に酵素
が生産される場合は、遠心分離、フィルタープレス等に
より菌体を分離すれば良く、また菌体内に酵素が存在す
る場合は、上記菌体内から超音波処理、加圧処理などの
機械的方法または菌体の自己消化作用を利用する方法
（菌体自身が保有する細胞溶解酵素によって菌体を溶解
する）などの公知の方法によりＣＦＴａｓｅを得ること
ができる。
に従い培養することができる。培養液中の菌体外に酵素
が生産される場合は、遠心分離、フィルタープレス等に
より菌体を分離すれば良く、また菌体内に酵素が存在す
る場合は、上記菌体内から超音波処理、加圧処理などの
機械的方法または菌体の自己消化作用を利用する方法
（菌体自身が保有する細胞溶解酵素によって菌体を溶解
する）などの公知の方法によりＣＦＴａｓｅを得ること
ができる。
【０００９】本発明において使用される陰イオン交換樹
脂は、細孔の最頻度半径が７５〜２０００Åであること
が必要であり、好ましくは、７５〜１０００Å、更に好
ましくは１００〜８００Åの範囲のものである。更に本
発明の陰イオン交換樹脂は、細孔半径が７５〜３０００
Åの細孔容積が０．１ｍｌ／ｇ以上、特に０．３〜２．
５ｍｌ／ｇであり、また比表面積が０．１ｍ2 ／ｇ以
上、特に１０〜１００ｍ2 ／ｇの多孔性のものがＣＦＴ
ａｓｅを良好に吸着し、担持させることができるので有
利に使用できる。
脂は、細孔の最頻度半径が７５〜２０００Åであること
が必要であり、好ましくは、７５〜１０００Å、更に好
ましくは１００〜８００Åの範囲のものである。更に本
発明の陰イオン交換樹脂は、細孔半径が７５〜３０００
Åの細孔容積が０．１ｍｌ／ｇ以上、特に０．３〜２．
５ｍｌ／ｇであり、また比表面積が０．１ｍ2 ／ｇ以
上、特に１０〜１００ｍ2 ／ｇの多孔性のものがＣＦＴ
ａｓｅを良好に吸着し、担持させることができるので有
利に使用できる。
【００１０】なお、本発明のＣＦＴａｓｅ剤の製造に使
用される陰イオン交換樹脂の物理的特性である比表面積
及び細孔容積は、５０℃で１０時間、数ｍｍＨｇ下で真
空乾燥した多孔性陰イオン交換樹脂を試料とし、それぞ
れＢ．Ｅ．Ｔ法及び水銀圧入法（マイクロメトリック社
製オートポア２００で測定）により測定される。本発明
で使用する上記の多孔性陰イオン交換樹脂は公知の各種
方法により製造することができる。一般にイオン交換樹
脂の母体は、モノビニル単量体とポリビニル単量体を共
重合させることにより製造され、モノビニル単量体とし
ては、スチレンのような芳香族モノビニル化合物、アク
リル酸またはメタクリル酸もしくはそのエステルのよう
な脂肪族モノマー等が、またポリビニル単量体としては
ジビニルベンゼンのような芳香族ジビニル化合物、エチ
レングリコールジメタクリレートのような脂肪族化合物
等が好適に使用されている。樹脂母体を多孔質にするに
は、例えば前記モノマーの重合系に、溶媒による抽出除
去が可能で、かつ重合反応に関与しない材料、例えばポ
リスチレンなどを共存させながら重合反応を行い、反応
終了後、得られた樹脂を溶媒で処理してポリスチレンを
抽出除去することにより行うことができる。
用される陰イオン交換樹脂の物理的特性である比表面積
及び細孔容積は、５０℃で１０時間、数ｍｍＨｇ下で真
空乾燥した多孔性陰イオン交換樹脂を試料とし、それぞ
れＢ．Ｅ．Ｔ法及び水銀圧入法（マイクロメトリック社
製オートポア２００で測定）により測定される。本発明
で使用する上記の多孔性陰イオン交換樹脂は公知の各種
方法により製造することができる。一般にイオン交換樹
脂の母体は、モノビニル単量体とポリビニル単量体を共
重合させることにより製造され、モノビニル単量体とし
ては、スチレンのような芳香族モノビニル化合物、アク
リル酸またはメタクリル酸もしくはそのエステルのよう
な脂肪族モノマー等が、またポリビニル単量体としては
ジビニルベンゼンのような芳香族ジビニル化合物、エチ
レングリコールジメタクリレートのような脂肪族化合物
等が好適に使用されている。樹脂母体を多孔質にするに
は、例えば前記モノマーの重合系に、溶媒による抽出除
去が可能で、かつ重合反応に関与しない材料、例えばポ
リスチレンなどを共存させながら重合反応を行い、反応
終了後、得られた樹脂を溶媒で処理してポリスチレンを
抽出除去することにより行うことができる。
【００１１】多孔性樹脂の比表面積、細孔の大きさ、半
径７５Å以上の細孔容積などに関する物理的特性は、樹
脂の製造条件を種々選択することにより変更することが
できる。物理的諸特性と樹脂の製造条件との関係は一義
的には定め難いが、例えば上記樹脂の製造方法におい
て、樹脂母体原料としてスチレンとジビニルベンゼンを
使用するとき、ポリビニル単量体のジビニルベンゼンの
量が多いほど一般に多孔性の程度が大となり、即ち、比
表面積、細孔容積あるいは細孔の半径が大きくなる傾向
があり、また上記の重合反応に関与しない材料、例えば
ポリスチレンの量を多くすると細孔容積あるいは細孔半
径が大きくなる傾向がある。
径７５Å以上の細孔容積などに関する物理的特性は、樹
脂の製造条件を種々選択することにより変更することが
できる。物理的諸特性と樹脂の製造条件との関係は一義
的には定め難いが、例えば上記樹脂の製造方法におい
て、樹脂母体原料としてスチレンとジビニルベンゼンを
使用するとき、ポリビニル単量体のジビニルベンゼンの
量が多いほど一般に多孔性の程度が大となり、即ち、比
表面積、細孔容積あるいは細孔の半径が大きくなる傾向
があり、また上記の重合反応に関与しない材料、例えば
ポリスチレンの量を多くすると細孔容積あるいは細孔半
径が大きくなる傾向がある。
【００１２】陰イオン交換基の導入方法としては、樹脂
母体にクロロメチル基を導入した後、トリメチルアミ
ン、ジメチルエタノールアミン、エチレンジアミン、ジ
エチレントリアミン、トリエチレンテトラミン等の脂肪
族アミンあるいはピロリジン、モルホリン、ピペリジン
等の環状アミンの各種アミン、好ましくは脂肪族アミン
で処理する方法や、あらかじめ反応性の高い官能基をも
つビニル単量体、例えばグリシジル（メタ）アクリレー
トやビニルベンジルグリシジルエーテル等を共重合体の
成分として樹脂母体を合成し、そのグリシジル基に塩基
性下で各種アミンを開環付加する方法などが適当であ
り、前記樹脂母体の特性とこれらアミンの種類を選択す
ることにより、酵素を吸着した際に好適な活性を発揮さ
せる陰イオン交換樹脂とすることができる。
母体にクロロメチル基を導入した後、トリメチルアミ
ン、ジメチルエタノールアミン、エチレンジアミン、ジ
エチレントリアミン、トリエチレンテトラミン等の脂肪
族アミンあるいはピロリジン、モルホリン、ピペリジン
等の環状アミンの各種アミン、好ましくは脂肪族アミン
で処理する方法や、あらかじめ反応性の高い官能基をも
つビニル単量体、例えばグリシジル（メタ）アクリレー
トやビニルベンジルグリシジルエーテル等を共重合体の
成分として樹脂母体を合成し、そのグリシジル基に塩基
性下で各種アミンを開環付加する方法などが適当であ
り、前記樹脂母体の特性とこれらアミンの種類を選択す
ることにより、酵素を吸着した際に好適な活性を発揮さ
せる陰イオン交換樹脂とすることができる。
【００１３】樹脂母体の架橋度も余り高くなると酵素の
吸着率も十分でなく、更に吸着した酵素の活性も減少す
る傾向が見られるので、前記樹脂の細孔特性や陰イオン
交換基の種類等の要因と組み合わせて適当な値を選択す
ることが好ましい。例えば樹脂がスチレンとジビニルベ
ンゼン等の架橋性モノマーとの共重合で製造される場
合、架橋性モノマーの使用量は通常５０モル％以下、好
ましくは２５モル％以下である。
吸着率も十分でなく、更に吸着した酵素の活性も減少す
る傾向が見られるので、前記樹脂の細孔特性や陰イオン
交換基の種類等の要因と組み合わせて適当な値を選択す
ることが好ましい。例えば樹脂がスチレンとジビニルベ
ンゼン等の架橋性モノマーとの共重合で製造される場
合、架橋性モノマーの使用量は通常５０モル％以下、好
ましくは２５モル％以下である。
【００１４】なお、多孔性樹脂の基体としては、常法に
よって製造されるポリ（メタ）アクリル酸を主体とする
アクリル系のものも好適に使用される。本発明において
は、上記の多孔性陰イオン交換樹脂としては、通常２０
〜４００メッシュ程度の粒径のものが使用されるが、粒
径が小さいほど活性発現率が若干向上する傾向が見られ
る。
よって製造されるポリ（メタ）アクリル酸を主体とする
アクリル系のものも好適に使用される。本発明において
は、上記の多孔性陰イオン交換樹脂としては、通常２０
〜４００メッシュ程度の粒径のものが使用されるが、粒
径が小さいほど活性発現率が若干向上する傾向が見られ
る。
【００１５】上記の陰イオン交換樹脂にＣＦＴａｓｅを
吸着させるには、イオン交換樹脂処理において一般に知
られた種々の方法を採用することができ、最も簡便に
は、培養液中から菌体を除去したＣＦＴａｓｅ含有溶液
にイオン交換樹脂を浸漬し、必要に応じて攪拌し、適当
な吸着時間の経過後、樹脂を取り出して水洗すれば良
い。この時、ＣＦＴａｓｅ含有液のｐＨは通常３．０〜
１０．０の範囲内であり、吸着温度は０〜６０℃、吸着
に要する時間は１〜２０時間程度である。
吸着させるには、イオン交換樹脂処理において一般に知
られた種々の方法を採用することができ、最も簡便に
は、培養液中から菌体を除去したＣＦＴａｓｅ含有溶液
にイオン交換樹脂を浸漬し、必要に応じて攪拌し、適当
な吸着時間の経過後、樹脂を取り出して水洗すれば良
い。この時、ＣＦＴａｓｅ含有液のｐＨは通常３．０〜
１０．０の範囲内であり、吸着温度は０〜６０℃、吸着
に要する時間は１〜２０時間程度である。
【００１６】担体である上記の陰イオン交換樹脂は種々
の塩として用いることができ、例えば上記のイオン交換
樹脂を硫酸、塩酸、水酸化ナトリウム、燐酸、酢酸など
の水溶液で処理して、それぞれＨＳＯ4 - ，ＳＯ4 2-，
Ｃｌ- ，ＯＨ- ，ＨＰＯ4 -，ＰＯ4 2-，ＣＨ3 ＣＯＯ
- などの塩、好ましくはＳＯ4 2-，Ｃｌ- ，ＯＨ- ，Ｐ
Ｏ4 2-などの塩とすることにより有効にＣＦＴａｓｅを
吸着させることができる。
の塩として用いることができ、例えば上記のイオン交換
樹脂を硫酸、塩酸、水酸化ナトリウム、燐酸、酢酸など
の水溶液で処理して、それぞれＨＳＯ4 - ，ＳＯ4 2-，
Ｃｌ- ，ＯＨ- ，ＨＰＯ4 -，ＰＯ4 2-，ＣＨ3 ＣＯＯ
- などの塩、好ましくはＳＯ4 2-，Ｃｌ- ，ＯＨ- ，Ｐ
Ｏ4 2-などの塩とすることにより有効にＣＦＴａｓｅを
吸着させることができる。
【００１７】担体に対する酵素の吸着量としては、１ｍ
ｌの樹脂（湿潤状態で）当たり０．０５〜３０ｍｇの蛋
白量が適当であるが、好ましくは０．１〜１０ｍｇが適
当である。なお、本発明におけるＣＦＴａｓｅの上記陰
イオン交換樹脂への吸着およびＣＦＴａｓｅの活性発現
の作用機構の詳細については未だ明かではないが、樹脂
の細孔における物理的吸着および陰イオン交換基とＣＦ
Ｔａｓｅとの何らかの化学的結合力が相乗的に関与して
いるものと推察される。この事は、比表面積が小さく、
半径７５Å以上の細孔容積の小さい通常のゲル状イオン
交換樹脂はＣＦＴａｓｅをほとんど吸着せず、一方、比
表面積が大きく、半径７５Å以上細孔容積の値が大きい
多孔性樹脂でも、陰イオン交換基を導入していない樹脂
は同様にＣＦＴａｓｅの活性が低い事から推察される。
ｌの樹脂（湿潤状態で）当たり０．０５〜３０ｍｇの蛋
白量が適当であるが、好ましくは０．１〜１０ｍｇが適
当である。なお、本発明におけるＣＦＴａｓｅの上記陰
イオン交換樹脂への吸着およびＣＦＴａｓｅの活性発現
の作用機構の詳細については未だ明かではないが、樹脂
の細孔における物理的吸着および陰イオン交換基とＣＦ
Ｔａｓｅとの何らかの化学的結合力が相乗的に関与して
いるものと推察される。この事は、比表面積が小さく、
半径７５Å以上の細孔容積の小さい通常のゲル状イオン
交換樹脂はＣＦＴａｓｅをほとんど吸着せず、一方、比
表面積が大きく、半径７５Å以上細孔容積の値が大きい
多孔性樹脂でも、陰イオン交換基を導入していない樹脂
は同様にＣＦＴａｓｅの活性が低い事から推察される。
【００１８】本発明において使用される陰イオン交換樹
脂は水溶液中で膨潤して、乾燥状態よりもさらに巨大な
網目構造を形成すると考えられるが、乾燥状態において
細孔半径が大きく、その細孔容積が大きいものは、ＣＦ
Ｔａｓｅ吸着率および活性発現率が良好である。かくし
て得られた不溶化ＣＦＴａｓｅ剤は高いＣＦＴａｓｅ活
性を保持する。
脂は水溶液中で膨潤して、乾燥状態よりもさらに巨大な
網目構造を形成すると考えられるが、乾燥状態において
細孔半径が大きく、その細孔容積が大きいものは、ＣＦ
Ｔａｓｅ吸着率および活性発現率が良好である。かくし
て得られた不溶化ＣＦＴａｓｅ剤は高いＣＦＴａｓｅ活
性を保持する。
【００１９】
【発明の効果】本発明の固定化ＣＦＴａｓｅ剤は長時間
にわたる使用にも活性の低下が少なく、反応中、酵素が
単体から溶離することもないので、工業的に有利に反応
を行うことが可能である。工業的に固定化ＣＦＴａｓｅ
剤を使用する場合は、充填塔および攪拌槽等のいずれの
形式の反応器においても利用できる。
にわたる使用にも活性の低下が少なく、反応中、酵素が
単体から溶離することもないので、工業的に有利に反応
を行うことが可能である。工業的に固定化ＣＦＴａｓｅ
剤を使用する場合は、充填塔および攪拌槽等のいずれの
形式の反応器においても利用できる。
【００２０】本発明の固定化ＣＦＴａｓｅ剤は、長期間
使用後の活性が低下したものでも塩化ナトリウムあるい
は塩化カリウムなどの水溶液で処理することにより、Ｃ
ＦＴａｓｅが容易に溶離するので簡単に再生することが
できる。再生後、ＣＦＴａｓｅが溶離した樹脂は再び新
しいＣＦＴａｓｅを吸着担持させることにより、活性の
高い固定化ＣＦＴａｓｅ剤として使用することができ
る。
使用後の活性が低下したものでも塩化ナトリウムあるい
は塩化カリウムなどの水溶液で処理することにより、Ｃ
ＦＴａｓｅが容易に溶離するので簡単に再生することが
できる。再生後、ＣＦＴａｓｅが溶離した樹脂は再び新
しいＣＦＴａｓｅを吸着担持させることにより、活性の
高い固定化ＣＦＴａｓｅ剤として使用することができ
る。
【００２１】
【実施例】次に、本発明を実施例によってさらに詳細に
説明するが、本発明はその要旨を越えない限り、下記実
施例により限定されるものではない。 実施例１ 下記組成の培地１００ｍｌの入った５００ｍｌひだ付き
フラスコを用いて、バチルス・サーキュランス ＭＣＩ
−２５５４号菌（微工研菌寄第１１９４０号）を３０℃
で３０時間培養した。
説明するが、本発明はその要旨を越えない限り、下記実
施例により限定されるものではない。 実施例１ 下記組成の培地１００ｍｌの入った５００ｍｌひだ付き
フラスコを用いて、バチルス・サーキュランス ＭＣＩ
−２５５４号菌（微工研菌寄第１１９４０号）を３０℃
で３０時間培養した。
【００２２】
【表１】 培地１Ｌあたりの組成（ｐＨ７．０）：イヌリン ２０ｇ ＮａＮＯ3 ２ｇ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．５ｇ ＫＣｌ ０．５ｇ ＫＨ2 ＰＯ4 ０．５ｇ ＫＣｌ ０．５ｇ ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ １０ｍｇ 酵母エキス ０．２ｇ 培養後、遠心分離により除菌し、ＣＦＴａｓｅ含有液
（酵素液）を得た。
（酵素液）を得た。
【００２３】ついでこの酵素液２００ｍｌ（酵素活性：
２１０Ｕ）を採取し、これを表１に示す物性を有するイ
オン交換樹脂１５ｍｌ（湿潤状態）に添加し、３０℃で
２時間振盪攪拌し、酵素を樹脂に吸着させて、固定化Ｃ
ＦＴａｓｅ剤を得た。次に得られた固定化ＣＦＴａｓｅ
剤を水洗後反応液（１０％イヌリン／６７ｍＭ ｐＨ
６．９燐酸緩衝液）３０ｍｌで２回洗浄後、新しい反応
液５００ｍｌを加えて、３７℃で１時間振盪攪拌して反
応させた。
２１０Ｕ）を採取し、これを表１に示す物性を有するイ
オン交換樹脂１５ｍｌ（湿潤状態）に添加し、３０℃で
２時間振盪攪拌し、酵素を樹脂に吸着させて、固定化Ｃ
ＦＴａｓｅ剤を得た。次に得られた固定化ＣＦＴａｓｅ
剤を水洗後反応液（１０％イヌリン／６７ｍＭ ｐＨ
６．９燐酸緩衝液）３０ｍｌで２回洗浄後、新しい反応
液５００ｍｌを加えて、３７℃で１時間振盪攪拌して反
応させた。
【００２４】固定化ＣＦＴａｓｅ剤の活性を表１に示す
（高速液体クロマトグラフィーで測定）。反応液中に
９．２のＣＦＲ６（フラクトース６分子からなるサイク
ロフラクタン）と４．８ｇのＣＦＲ７（フラクトース７
分子からなるサイクロフラクタン）が生産された。次に
新しい反応液１０ｍｌで１回洗浄後、再び新しい反応液
５００ｍｌを加えて同様に１時間反応させたところ、液
中に９．２ｇのＣＦＲ６と４．６ｇのＣＦＲ７が生産さ
れた。同様に３回目の反応を行ったところ９．１ｇのＣ
ＦＲ６と４．７ｇのＣＦＲ７が生産された。
（高速液体クロマトグラフィーで測定）。反応液中に
９．２のＣＦＲ６（フラクトース６分子からなるサイク
ロフラクタン）と４．８ｇのＣＦＲ７（フラクトース７
分子からなるサイクロフラクタン）が生産された。次に
新しい反応液１０ｍｌで１回洗浄後、再び新しい反応液
５００ｍｌを加えて同様に１時間反応させたところ、液
中に９．２ｇのＣＦＲ６と４．６ｇのＣＦＲ７が生産さ
れた。同様に３回目の反応を行ったところ９．１ｇのＣ
ＦＲ６と４．７ｇのＣＦＲ７が生産された。
【００２５】なお、これらの酵素活性（酵素液の活性力
価）は以下の方法にしたがって測定した。１０％イヌリ
ン溶液（６７ｍＭ ｐＨ６．９燐酸緩衝液）２００μｌ
に酵素液を５０〜２００μｌ加え３７℃で３０分間反応
させ、１０分１００℃処理により反応をストップさせ
た。生成したＣＦＲを高速液体クロマトグラフィー（Ｍ
ＣＩゲルＣＫ０４Ｓ，溶離液：水、）により分析した。
酵素活性力価１Ｕは１分間に１μＭのＣＦＲ６を生産す
る酵素量とする。
価）は以下の方法にしたがって測定した。１０％イヌリ
ン溶液（６７ｍＭ ｐＨ６．９燐酸緩衝液）２００μｌ
に酵素液を５０〜２００μｌ加え３７℃で３０分間反応
させ、１０分１００℃処理により反応をストップさせ
た。生成したＣＦＲを高速液体クロマトグラフィー（Ｍ
ＣＩゲルＣＫ０４Ｓ，溶離液：水、）により分析した。
酵素活性力価１Ｕは１分間に１μＭのＣＦＲ６を生産す
る酵素量とする。
【００２６】
【数１】
【００２７】また用いたイオン交換樹脂の物理的特性
は、Ｂ．Ｅ．Ｔ法及び水銀圧入法（マイクロメトリック
社製オートポア２００）で測定した。
は、Ｂ．Ｅ．Ｔ法及び水銀圧入法（マイクロメトリック
社製オートポア２００）で測定した。
【００２８】実施例２〜６及び比較例１〜８ 用いる樹脂の種類及びイオン型を変える以外は、実施例
１に記載したと同様にＣＦＴａｓｅを吸着させて固定化
ＣＦＴａｓｅ剤を得た。得られた固定化ＣＦＴａｓｅ剤
の活性を表１に示す。
１に記載したと同様にＣＦＴａｓｅを吸着させて固定化
ＣＦＴａｓｅ剤を得た。得られた固定化ＣＦＴａｓｅ剤
の活性を表１に示す。
【００２９】
【表２】
【００３０】
【表３】
Claims (1)
- 【請求項１】 最頻度半径が７５〜２０００Åの細孔を
有する陰イオン交換樹脂にサイクロフラクタノトランス
フェラーゼを担持して成る固定化酵素剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4190988A JPH0630774A (ja) | 1992-07-17 | 1992-07-17 | 固定化酵素剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4190988A JPH0630774A (ja) | 1992-07-17 | 1992-07-17 | 固定化酵素剤 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0630774A true JPH0630774A (ja) | 1994-02-08 |
Family
ID=16266999
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4190988A Pending JPH0630774A (ja) | 1992-07-17 | 1992-07-17 | 固定化酵素剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0630774A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1316610A1 (en) * | 2001-09-03 | 2003-06-04 | Sumitomo Chemical Company, Limited | Preparation comprising an enzyme for asymmetrical hydrolysis of N-substituted C3-C4 cyclic imino-2-carboxylic acid ester and method of using the same |
| US6869791B2 (en) | 2000-12-04 | 2005-03-22 | Sumitomo Chemical Company, Ltd. | Method for sterilizing transformed cells |
-
1992
- 1992-07-17 JP JP4190988A patent/JPH0630774A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6869791B2 (en) | 2000-12-04 | 2005-03-22 | Sumitomo Chemical Company, Ltd. | Method for sterilizing transformed cells |
| EP1316610A1 (en) * | 2001-09-03 | 2003-06-04 | Sumitomo Chemical Company, Limited | Preparation comprising an enzyme for asymmetrical hydrolysis of N-substituted C3-C4 cyclic imino-2-carboxylic acid ester and method of using the same |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |