JPH1084952A - Ｄ−乳酸脱水素酵素の精製方法 - Google Patents
Ｄ−乳酸脱水素酵素の精製方法Info
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- JPH1084952A JPH1084952A JP8244525A JP24452596A JPH1084952A JP H1084952 A JPH1084952 A JP H1084952A JP 8244525 A JP8244525 A JP 8244525A JP 24452596 A JP24452596 A JP 24452596A JP H1084952 A JPH1084952 A JP H1084952A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 簡単な工程で、かつ高い回収率で精製するこ
とのできるＤ−乳酸脱水素酵素の精製方法を提供する。 【解決手段】 Ｄ−乳酸脱水素酵素を含む溶液を、青色
色素をリガンドとするアフィニティークロマトグラフィ
ーを用いて精製することを特徴とするＤ−乳酸脱水素酵
素の精製方法。
とのできるＤ−乳酸脱水素酵素の精製方法を提供する。 【解決手段】 Ｄ−乳酸脱水素酵素を含む溶液を、青色
色素をリガンドとするアフィニティークロマトグラフィ
ーを用いて精製することを特徴とするＤ−乳酸脱水素酵
素の精製方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、Ｄ−乳酸脱水素酵
素（以下Ｄ−ＬＤＨと略記する）の精製方法に関するも
のである。
素（以下Ｄ−ＬＤＨと略記する）の精製方法に関するも
のである。
【０００２】
【従来の技術】近年、酵素は、その反応がマイルドな条
件で起こること、基質との適合が特異的であること、反
応を光学的に定量することが容易であること等の優れた
点が注目され、医療分野や食品の成分分析等に広く利用
されており、このうち、Ｄ−ＬＤＨは、臨床検査等の分
野で、血清や尿中のピルビン酸の定量、トランスアミナ
ーゼやピルビン酸キナーゼ等の活性測定に用いられてい
る。また、Ｄ−ＬＤＨはＤ−乳酸の工業的製造等にも広
く利用されている。従来、Ｄ−ＬＤＨとしては、ラクト
バチラス（Lactobacillus ）属、ロイコノストック（Le
uconostoc ）属、スタフィロコッカス（Staphylococcu
s）属等の微生物由来のものが用いられており〔マイク
ロバイオロジカル・レビューズ（Microbiological Revi
ews ）、４４巻、１０６〜１３９頁（１９８０年）〕、
これらの微生物を培養した後、菌体を破砕して得た溶液
（粗酵素液）をイオン交換クロマトグラフィー、疎水ク
ロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等によ
って精製してＤ−ＬＤＨの精製標品を得ていた。
件で起こること、基質との適合が特異的であること、反
応を光学的に定量することが容易であること等の優れた
点が注目され、医療分野や食品の成分分析等に広く利用
されており、このうち、Ｄ−ＬＤＨは、臨床検査等の分
野で、血清や尿中のピルビン酸の定量、トランスアミナ
ーゼやピルビン酸キナーゼ等の活性測定に用いられてい
る。また、Ｄ−ＬＤＨはＤ−乳酸の工業的製造等にも広
く利用されている。従来、Ｄ−ＬＤＨとしては、ラクト
バチラス（Lactobacillus ）属、ロイコノストック（Le
uconostoc ）属、スタフィロコッカス（Staphylococcu
s）属等の微生物由来のものが用いられており〔マイク
ロバイオロジカル・レビューズ（Microbiological Revi
ews ）、４４巻、１０６〜１３９頁（１９８０年）〕、
これらの微生物を培養した後、菌体を破砕して得た溶液
（粗酵素液）をイオン交換クロマトグラフィー、疎水ク
ロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等によ
って精製してＤ−ＬＤＨの精製標品を得ていた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかし、イオン交換ク
ロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過
クロマトグラフィー等を用いた精製方法は、それぞれの
カラムの精製倍率は通常数倍程度であり、単独の使用で
は分離がよくないため、純度の高い精製標品を得るため
には少なくとも３種類のカラムクロマトグラフィーを併
用することが必要であり、このため、精製工程が煩雑に
なり、かつ回収率が低く、精製のコストも高くなるとい
う問題があった。本発明は、Ｄ−ＬＤＨを簡単な工程
で、かつ高い回収率で精製することのできるＤ−ＬＤＨ
の精製方法を提供することを目的とするものである。
ロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過
クロマトグラフィー等を用いた精製方法は、それぞれの
カラムの精製倍率は通常数倍程度であり、単独の使用で
は分離がよくないため、純度の高い精製標品を得るため
には少なくとも３種類のカラムクロマトグラフィーを併
用することが必要であり、このため、精製工程が煩雑に
なり、かつ回収率が低く、精製のコストも高くなるとい
う問題があった。本発明は、Ｄ−ＬＤＨを簡単な工程
で、かつ高い回収率で精製することのできるＤ−ＬＤＨ
の精製方法を提供することを目的とするものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、このよう
な課題を解決するために鋭意検討の結果、Ｄ−ＬＤＨの
精製に青色色素をリガンドとするアフィニティークロマ
トが極めて有効であるということを見出し、本発明を完
成するに至った。すなわち、本発明はＤ−ＬＤＨを含む
溶液を、青色色素をリガントとするアフィニティークロ
マトグラフィーを用いて精製することを特徴とするＤ−
ＬＤＨの精製方法を要旨とするものである。
な課題を解決するために鋭意検討の結果、Ｄ−ＬＤＨの
精製に青色色素をリガンドとするアフィニティークロマ
トが極めて有効であるということを見出し、本発明を完
成するに至った。すなわち、本発明はＤ−ＬＤＨを含む
溶液を、青色色素をリガントとするアフィニティークロ
マトグラフィーを用いて精製することを特徴とするＤ−
ＬＤＨの精製方法を要旨とするものである。
【０００５】以下、本発明を詳細に説明する。本発明
は、Ｄ−ＬＤＨを含む溶液から青色色素をリガンドとす
るアフィニティークロマトグラフィーを用いてＤ−ＬＤ
Ｈを精製する方法であり、このようなＤ−ＬＤＨを含む
溶液としては、Ｄ−ＬＤＨ産生能を有する微生物の菌体
を自己消化、超音波、フレンチプレス等による破砕、界
面活性剤処理、リゾチーム処理等した後、遠心分離によ
り、細胞片を除去する等して得られたＤ−ＬＤＨの粗酵
素液等が挙げられる。
は、Ｄ−ＬＤＨを含む溶液から青色色素をリガンドとす
るアフィニティークロマトグラフィーを用いてＤ−ＬＤ
Ｈを精製する方法であり、このようなＤ−ＬＤＨを含む
溶液としては、Ｄ−ＬＤＨ産生能を有する微生物の菌体
を自己消化、超音波、フレンチプレス等による破砕、界
面活性剤処理、リゾチーム処理等した後、遠心分離によ
り、細胞片を除去する等して得られたＤ−ＬＤＨの粗酵
素液等が挙げられる。
【０００６】上記のＤ−ＬＤＨ産生能を有する微生物と
しては、例えば、ラクトバチラス（Lactobacillus ）
属、ロイコノストック（Leuconostoc ）属、スタフィロ
コッカス（Staphylococcus）属等に属する乳酸菌が挙げ
られ、具体的には、ラクトバチラス・ファーメンタム
（Lactobacillus fermentum)ＵＫＵ−２株（ＦＥＲＭ
Ｐ−１５７７９）、ロイコノストック・ラクティス（Le
uconostoc lactis) ＳＨＯ４７株（ＦＥＲＭ Ｐ−１３
９７０）、ＳＨＯ５４株（ＦＥＲＭ Ｐ−１３９７１）
等が挙げられる。
しては、例えば、ラクトバチラス（Lactobacillus ）
属、ロイコノストック（Leuconostoc ）属、スタフィロ
コッカス（Staphylococcus）属等に属する乳酸菌が挙げ
られ、具体的には、ラクトバチラス・ファーメンタム
（Lactobacillus fermentum)ＵＫＵ−２株（ＦＥＲＭ
Ｐ−１５７７９）、ロイコノストック・ラクティス（Le
uconostoc lactis) ＳＨＯ４７株（ＦＥＲＭ Ｐ−１３
９７０）、ＳＨＯ５４株（ＦＥＲＭ Ｐ−１３９７１）
等が挙げられる。
【０００７】このような微生物を培養する際に用いられ
る栄養培地において、炭素源としては、グルコース、シ
ュークロース、マルトース等が使用でき、窒素源として
は、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、アンモニ
ア、硝酸、亜硝酸、尿素、尿酸、アミノ酸、ペプトン、
肉エキス、酵母エキス等の無機及び有機物が使用でき
る。さらに、無機塩類としては、カリウム、ナトリウ
ム、亜鉛、鉄、マグネシウム、マンガン等の各塩類、必
要に応じて微量金属塩、ビタミン類等を使用してもよ
い。
る栄養培地において、炭素源としては、グルコース、シ
ュークロース、マルトース等が使用でき、窒素源として
は、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、アンモニ
ア、硝酸、亜硝酸、尿素、尿酸、アミノ酸、ペプトン、
肉エキス、酵母エキス等の無機及び有機物が使用でき
る。さらに、無機塩類としては、カリウム、ナトリウ
ム、亜鉛、鉄、マグネシウム、マンガン等の各塩類、必
要に応じて微量金属塩、ビタミン類等を使用してもよ
い。
【０００８】培養は通常、嫌気的あるいは微好気的な条
件下で行われ、培養温度としては、２０〜４０℃が好ま
しく、さらに３０〜４０℃が好ましく、特に３５〜４０
℃が好ましい。このような条件下で３〜３０時間、好ま
しくは６〜１０時間培養することにより、菌体内にＤ−
ＬＤＨが生成、蓄積される。
件下で行われ、培養温度としては、２０〜４０℃が好ま
しく、さらに３０〜４０℃が好ましく、特に３５〜４０
℃が好ましい。このような条件下で３〜３０時間、好ま
しくは６〜１０時間培養することにより、菌体内にＤ−
ＬＤＨが生成、蓄積される。
【０００９】本発明において、アフィニティークロマト
グラフィーに用いる樹脂は、担体にリガンドとして青色
色素が結合したものであり、リガンドとして用いられる
青色色素としては、チバクロンブルーＦ−Ｒ、チバクロ
ンブルーニューＦ−Ｒ（チバ−ガイギー製）等が挙げら
れる。
グラフィーに用いる樹脂は、担体にリガンドとして青色
色素が結合したものであり、リガンドとして用いられる
青色色素としては、チバクロンブルーＦ−Ｒ、チバクロ
ンブルーニューＦ−Ｒ（チバ−ガイギー製）等が挙げら
れる。
【００１０】また、リガンドと結合させる担体として
は、例えば、セルロース、デキストラン、アガロース、
デンプン等の多糖類の誘導体、ポリ酢酸セルロース、ポ
リビニルアルコールの誘導体、ポリスチレン、ポリプロ
ピレン、ポリエチレン、ポリビニルクロライド、ポリ
（メチルメタクリル酸）エステル、ポリブテン、ポリペ
ンテン、ポリビニルデンクロライド、ポリアクリロニト
リル、ポリメタクリル酸、ポリアクリル酸、ポリアミノ
スチレン、ポリブタジエン、ポリイソプレン、ポリマレ
イン酸モノエステル、架橋ポリアクリルアミド、ポリメ
タクリルアミド、ポリビニルアミン、ポリ（ジアルキル
アミノエチルメタクリル酸エステル）、ポリ（ジアルキ
ルアミノメチルスチレン）、ポリ（ビニルピリジン）、
ポリ（ビニルピロリドン）、ポリアクリル酸無水物、ポ
リメタクリル酸無水物、ポリマレイン酸無水物、ポリメ
タクリロニトリル、ポリ（トリフルオロエチレン）、ポ
リ（テトラフルオロエチレン）、ポリ（ジビニルベンゼ
ン）、ポリ（α−メチルスチレン）、ポリ（Ｎ−ビニル
アミン）、ポリ（テトラメチレングリコールジビニルエ
ーテル）、ポリビニルスルホン、ポリビニルスルホキシ
ド、ポリアクロレイン、ポリメチルビニルケトン等の不
飽和炭素を含む単量体からなる重合体、ポリフェニレン
オキシド、ポリメチレンオキシド、ポリエチレンオキシ
ド、ポリテトラメチレンオキシド等のポリエーテル類、
ポリアラニン、ポリフェニルアラニン等のポリペプチド
類、ナイロン−３、ナイロン−４、ナイロン−５、ナイ
ロン−６、ナイロン−７、ナイロン−１１、ナイロン−
１２、ナイロン−６．６、ナイロン−６．１０、ポリ
（ｍ−フェニレン−イソフタラミド）、ポリ（ｐ−フェ
ニレン−テレフタラミド）等のポリアミド、テレフタル
酸、イソフタル酸、アジピン酸、マレイン酸、フマル
酸、トリメリット酸等のポリカルボン酸と、エチレング
リコール、プロピレングリコール、ブチレングリコー
ル、ペンタエリスリトール、ビスフェノールＡ等のポリ
オールとから誘導されるポリエステル類、グリコール
類、乳酸、ヒドロキシピリバリン酸等から誘導されるポ
リエステル、ジメチルポリシロキサン、メチルフェニル
ポリシロキサン、メチルビニルポリシロキサン、ジアノ
アルキルメチルポリシロキサン、フルオロアルキルメチ
ルポリシロキサン等のシリコンゴム、トルエンジイソシ
アナート、キシレンジイソシアナート、フェニレンジイ
ソシアナート、エチレンジイソシアナートジフェニルメ
タンジイソシアナート、トルエントリイソシアナート等
のポリイソシアナートと、ポリエチレングリコール、ポ
リプロピレングリコール、両末端にＯＨ基を有するポリ
エステル等のポリオールとから誘導されるポリウレタン
類、フェノール−ホルムアルデヒド樹脂、キシレン−ホ
ルムアルデヒド樹脂、尿素−ホルムアルデヒド樹脂、メ
ラミン−ホルムアルデヒド樹脂等のホルムアルデヒド樹
脂、ポリイミド、ポリベンズイミダゾール、ポリチアゾ
ール等の４員環を含むポリマー、ポリカーボナート、ポ
リスルホン等の合成ポリマー類及びガラス、アスベス
ト、クレイ、マイカ、ヒドロキシルアパタイト、活性
炭、シリカゲル、アルミナ等の無機物の誘導体及びポリ
フォスファゼンのような合成無機ポリマー等が挙げられ
る。特に好ましい具体例として、例えば市販のセファロ
ース、セファデックス（ファルマシア社製）、トーヨー
パール（東ソー社製）、セルロファイン（チッソ社製）
等が挙げられる。
は、例えば、セルロース、デキストラン、アガロース、
デンプン等の多糖類の誘導体、ポリ酢酸セルロース、ポ
リビニルアルコールの誘導体、ポリスチレン、ポリプロ
ピレン、ポリエチレン、ポリビニルクロライド、ポリ
（メチルメタクリル酸）エステル、ポリブテン、ポリペ
ンテン、ポリビニルデンクロライド、ポリアクリロニト
リル、ポリメタクリル酸、ポリアクリル酸、ポリアミノ
スチレン、ポリブタジエン、ポリイソプレン、ポリマレ
イン酸モノエステル、架橋ポリアクリルアミド、ポリメ
タクリルアミド、ポリビニルアミン、ポリ（ジアルキル
アミノエチルメタクリル酸エステル）、ポリ（ジアルキ
ルアミノメチルスチレン）、ポリ（ビニルピリジン）、
ポリ（ビニルピロリドン）、ポリアクリル酸無水物、ポ
リメタクリル酸無水物、ポリマレイン酸無水物、ポリメ
タクリロニトリル、ポリ（トリフルオロエチレン）、ポ
リ（テトラフルオロエチレン）、ポリ（ジビニルベンゼ
ン）、ポリ（α−メチルスチレン）、ポリ（Ｎ−ビニル
アミン）、ポリ（テトラメチレングリコールジビニルエ
ーテル）、ポリビニルスルホン、ポリビニルスルホキシ
ド、ポリアクロレイン、ポリメチルビニルケトン等の不
飽和炭素を含む単量体からなる重合体、ポリフェニレン
オキシド、ポリメチレンオキシド、ポリエチレンオキシ
ド、ポリテトラメチレンオキシド等のポリエーテル類、
ポリアラニン、ポリフェニルアラニン等のポリペプチド
類、ナイロン−３、ナイロン−４、ナイロン−５、ナイ
ロン−６、ナイロン−７、ナイロン−１１、ナイロン−
１２、ナイロン−６．６、ナイロン−６．１０、ポリ
（ｍ−フェニレン−イソフタラミド）、ポリ（ｐ−フェ
ニレン−テレフタラミド）等のポリアミド、テレフタル
酸、イソフタル酸、アジピン酸、マレイン酸、フマル
酸、トリメリット酸等のポリカルボン酸と、エチレング
リコール、プロピレングリコール、ブチレングリコー
ル、ペンタエリスリトール、ビスフェノールＡ等のポリ
オールとから誘導されるポリエステル類、グリコール
類、乳酸、ヒドロキシピリバリン酸等から誘導されるポ
リエステル、ジメチルポリシロキサン、メチルフェニル
ポリシロキサン、メチルビニルポリシロキサン、ジアノ
アルキルメチルポリシロキサン、フルオロアルキルメチ
ルポリシロキサン等のシリコンゴム、トルエンジイソシ
アナート、キシレンジイソシアナート、フェニレンジイ
ソシアナート、エチレンジイソシアナートジフェニルメ
タンジイソシアナート、トルエントリイソシアナート等
のポリイソシアナートと、ポリエチレングリコール、ポ
リプロピレングリコール、両末端にＯＨ基を有するポリ
エステル等のポリオールとから誘導されるポリウレタン
類、フェノール−ホルムアルデヒド樹脂、キシレン−ホ
ルムアルデヒド樹脂、尿素−ホルムアルデヒド樹脂、メ
ラミン−ホルムアルデヒド樹脂等のホルムアルデヒド樹
脂、ポリイミド、ポリベンズイミダゾール、ポリチアゾ
ール等の４員環を含むポリマー、ポリカーボナート、ポ
リスルホン等の合成ポリマー類及びガラス、アスベス
ト、クレイ、マイカ、ヒドロキシルアパタイト、活性
炭、シリカゲル、アルミナ等の無機物の誘導体及びポリ
フォスファゼンのような合成無機ポリマー等が挙げられ
る。特に好ましい具体例として、例えば市販のセファロ
ース、セファデックス（ファルマシア社製）、トーヨー
パール（東ソー社製）、セルロファイン（チッソ社製）
等が挙げられる。
【００１１】リガンドと担体とを結合させる方法として
は、両者を混合するだけでも結合させることができる
が、水酸化ナトリウムや水酸化カリウムの溶液中で両者
を結合させることにより、さらに強固に結合させること
ができる。
は、両者を混合するだけでも結合させることができる
が、水酸化ナトリウムや水酸化カリウムの溶液中で両者
を結合させることにより、さらに強固に結合させること
ができる。
【００１２】本発明においては、まず、Ｄ−ＬＤＨを含
む溶液を上記のような樹脂に接触させてＤ−ＬＤＨを吸
着させる。接触方法としては、特に限定されるものでは
なく、カラム法、バッチ法のいずれの方法でもよい。こ
のときの溶液の量としては、特に限定されるものではな
いが、樹脂の吸着能以上であると樹脂に吸着されずに漏
出してしまうため、カラム体積の０．００１〜１０００
０倍量が好ましく、さらに１〜１００倍量が好ましい。
また、カラム法で接触させる場合の通液速度としては、
０．００１〜１０００カラム体積／時が好ましい。
む溶液を上記のような樹脂に接触させてＤ−ＬＤＨを吸
着させる。接触方法としては、特に限定されるものでは
なく、カラム法、バッチ法のいずれの方法でもよい。こ
のときの溶液の量としては、特に限定されるものではな
いが、樹脂の吸着能以上であると樹脂に吸着されずに漏
出してしまうため、カラム体積の０．００１〜１０００
０倍量が好ましく、さらに１〜１００倍量が好ましい。
また、カラム法で接触させる場合の通液速度としては、
０．００１〜１０００カラム体積／時が好ましい。
【００１３】担体からＤ−ＬＤＨを溶出する際の溶出液
としては、水及び酢酸、クエン酸、リン酸、イミダゾー
ル、グッド等の緩衝液を用いることができ、ＮａＣｌや
ＫＣｌ等の塩を加えてもよい。溶出液の塩濃度として
は、０．００１〜４Ｍが好ましく、さらに０．１〜１Ｍ
が好ましく、溶出液のｐＨとしては、１〜１３が好まし
く、さらに４〜１０が好ましい。また、溶出液の量とし
ては、カラム体積の０．１〜１０００倍量が好ましく、
さらに４〜１０倍量が好ましい。
としては、水及び酢酸、クエン酸、リン酸、イミダゾー
ル、グッド等の緩衝液を用いることができ、ＮａＣｌや
ＫＣｌ等の塩を加えてもよい。溶出液の塩濃度として
は、０．００１〜４Ｍが好ましく、さらに０．１〜１Ｍ
が好ましく、溶出液のｐＨとしては、１〜１３が好まし
く、さらに４〜１０が好ましい。また、溶出液の量とし
ては、カラム体積の０．１〜１０００倍量が好ましく、
さらに４〜１０倍量が好ましい。
【００１４】本発明においては、上記のような青色色素
をリガンドとするアフィニティークロマトグラフィーに
よりＤ−ＬＤＨをポリアクリルアミドゲル電気泳動で単
一なバンドを示す精製標品として得ることができるが、
さらに、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティ
ークロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル
濾過クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーを組み
合わせて精製することもできる。
をリガンドとするアフィニティークロマトグラフィーに
よりＤ−ＬＤＨをポリアクリルアミドゲル電気泳動で単
一なバンドを示す精製標品として得ることができるが、
さらに、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティ
ークロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル
濾過クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーを組み
合わせて精製することもできる。
【００１５】組み合わせる樹脂としては、Ｑ−セファロ
ースＦＦ（ファルマシア社製）、ＤＥＡＥ−セファロー
ス（ファルマシア社製）等のイオン交換樹脂、ブルーセ
ファロースＣＬ−６Ｂ、レッドセファロースＣＬ−６Ｂ
（ファルマシア社製）等のアフィニティークロマト用樹
脂、フェニルセファロースＦＦ（ファルマシア社製）、
ブチルトーヨーパール（東ソー）等の疎水クロマト用樹
脂、ウルトロゲルＡｃＡ−３４、セファデックスＧ−１
００（ファルマシア社製）等のゲル濾過用担体又は樹脂
が挙げられる。
ースＦＦ（ファルマシア社製）、ＤＥＡＥ−セファロー
ス（ファルマシア社製）等のイオン交換樹脂、ブルーセ
ファロースＣＬ−６Ｂ、レッドセファロースＣＬ−６Ｂ
（ファルマシア社製）等のアフィニティークロマト用樹
脂、フェニルセファロースＦＦ（ファルマシア社製）、
ブチルトーヨーパール（東ソー）等の疎水クロマト用樹
脂、ウルトロゲルＡｃＡ−３４、セファデックスＧ−１
００（ファルマシア社製）等のゲル濾過用担体又は樹脂
が挙げられる。
【００１６】また、硫酸アンモニウム等の添加によるタ
ンパク質の塩析を組み合わせて行ってもよい。
ンパク質の塩析を組み合わせて行ってもよい。
【００１７】
【実施例】次に、本発明を実施例によって具体的に説明
する。なお、Ｄ−ＬＤＨの活性測定は３．０ｍＭのピル
ビン酸及び０．２５ｍＭのＮＡＤＨを含むトリス緩衝液
（ｐＨ７．７）に酵素溶液を加えて緩やかに混和した
後、分光光度計（日立製作所製）で３４０ｎｍにおける
吸光度変化を測定することによって行った。測定は、３
０℃で行ない、１分間に１マイクロモルのＮＡＤＨをＮ
ＡＤ+ に変換する酵素量を１単位（Ｕ）とした。
する。なお、Ｄ−ＬＤＨの活性測定は３．０ｍＭのピル
ビン酸及び０．２５ｍＭのＮＡＤＨを含むトリス緩衝液
（ｐＨ７．７）に酵素溶液を加えて緩やかに混和した
後、分光光度計（日立製作所製）で３４０ｎｍにおける
吸光度変化を測定することによって行った。測定は、３
０℃で行ない、１分間に１マイクロモルのＮＡＤＨをＮ
ＡＤ+ に変換する酵素量を１単位（Ｕ）とした。
【００１８】参考例１ グルコース３．０重量％、酵母エキス１．０重量％、ペ
プトン０．５重量％、クエン酸三ナトリウム・二水和物
０．５重量％、酢酸ナトリウム０．２重量％、硫酸マグ
ネシウム・七水和物０．０２重量％、硫酸マンガン・四
〜五水和物０．００５重量％、ツイン８０ ０．１容量
％よりなる培地２５リットル（ｐＨ６．４となるように
４ＮのＮａＯＨで調整）を３０リットル容のジャーファ
ーメンターに仕込み、１２１℃で１５分間滅菌した後、
ラクトバチラス・ファーメンタム（Lactobacillus ferm
entum)ＵＫＵ−２株（ＦＥＲＭ Ｐ−１５７７９）を接
種し、１４０ｒｐｍで撹拌し、通気しない条件下、４Ｎ
のＮａＯＨでｐＨを６．４に調整しながら３７℃で６時
間培養した。培養終了後、遠心分離により菌体を採取し
て約２５０ｇの湿菌体を得た。得られた湿菌体のうちの
約５０ｇを２ｍＭのＥＤＴＡ及び２ｍＭの２−メルカプ
トエタノールを含む２５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．
０）に懸濁して２５０ミリリットルとした。これを圧破
砕器（８００ｂａｒ：大日本製薬社製）に通液して破砕
して破砕液を得た。得られた破砕液２５０ミリリットル
に、除核酸を目的として高分子凝集剤であるユニフロッ
カーＵＦ３０５（ユニチカ社製）の１重量％の水溶液３
８ミリリットルをゆっくりと添加して約３０分程度攪拌
した後、遠心分離して沈澱物を除去し、Ｄ−ＬＤＨの粗
酵素液３００ミリリットルを得た。
プトン０．５重量％、クエン酸三ナトリウム・二水和物
０．５重量％、酢酸ナトリウム０．２重量％、硫酸マグ
ネシウム・七水和物０．０２重量％、硫酸マンガン・四
〜五水和物０．００５重量％、ツイン８０ ０．１容量
％よりなる培地２５リットル（ｐＨ６．４となるように
４ＮのＮａＯＨで調整）を３０リットル容のジャーファ
ーメンターに仕込み、１２１℃で１５分間滅菌した後、
ラクトバチラス・ファーメンタム（Lactobacillus ferm
entum)ＵＫＵ−２株（ＦＥＲＭ Ｐ−１５７７９）を接
種し、１４０ｒｐｍで撹拌し、通気しない条件下、４Ｎ
のＮａＯＨでｐＨを６．４に調整しながら３７℃で６時
間培養した。培養終了後、遠心分離により菌体を採取し
て約２５０ｇの湿菌体を得た。得られた湿菌体のうちの
約５０ｇを２ｍＭのＥＤＴＡ及び２ｍＭの２−メルカプ
トエタノールを含む２５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．
０）に懸濁して２５０ミリリットルとした。これを圧破
砕器（８００ｂａｒ：大日本製薬社製）に通液して破砕
して破砕液を得た。得られた破砕液２５０ミリリットル
に、除核酸を目的として高分子凝集剤であるユニフロッ
カーＵＦ３０５（ユニチカ社製）の１重量％の水溶液３
８ミリリットルをゆっくりと添加して約３０分程度攪拌
した後、遠心分離して沈澱物を除去し、Ｄ−ＬＤＨの粗
酵素液３００ミリリットルを得た。
【００１９】参考例２ チバクロンブルーＦ−Ｒ（チバ−ガイギー社製）を０．
５容量％含む０．１Ｎの水酸化ナトリウム溶液２００ミ
リリットルに、セファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア
社製）１００ミリリットルを添加し、室温（約２５℃）
で２日間放置した後、蒸留水で充分に洗浄してリガンド
としてチバクロンブルーＦ−Ｒが結合した樹脂（以下ブ
ルーＦ−Ｒと略記する）を得た。
５容量％含む０．１Ｎの水酸化ナトリウム溶液２００ミ
リリットルに、セファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア
社製）１００ミリリットルを添加し、室温（約２５℃）
で２日間放置した後、蒸留水で充分に洗浄してリガンド
としてチバクロンブルーＦ−Ｒが結合した樹脂（以下ブ
ルーＦ−Ｒと略記する）を得た。
【００２０】実施例１ 参考例１で得たＤ−ＬＤＨの粗酵素液３００ミリリット
ルに酢酸を加えてｐＨを５．５に調整し、これを予め２
ｍＭのＥＤＴＡ及び２ｍＭの２−メルカプトエタノール
を含む２５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５．５）で平衡化
したブルーＦ−Ｒカラム１００ミリリットルに通液して
Ｄ−ＬＤＨを吸着させた後、同緩衝液で洗浄し、２ｍＭ
のＮＡＤＨを含む同緩衝液２５０ミリリットル（カラム
体積の約２．５倍量）で溶出を行った。なお、溶出画分
は、予め２ｍＭのＥＤＴＡ及び２ｍＭの２−メルカプト
エタノールを含む２５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．
０）５０ミリリットルを添加しておいた容器に回収し
た。このようにして得られたＤ−ＬＤＨのポリアクリル
アミドゲル電気泳動の結果は、単一なバンドであった。
さらに、濃縮を目的として、得られた溶出画分を予め２
ｍＭのＥＤＴＡ及び２ｍＭの２−メルカプトエタノール
を含む２５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化
しておいたＤＥＡＥセファロースＦＦ（ファルマシア社
製）カラム５ミリリットルに通液してＤ−ＬＤＨを吸着
させた後、０．１Ｍの塩化カリウムを含む同緩衝液で洗
浄し、１Ｍの塩化カリウムを含む同緩衝液１２．５ミリ
リットルで溶出を行って、Ｄ−ＬＤＨの精製標品を得
た。以上の精製の結果を表１に示す。
ルに酢酸を加えてｐＨを５．５に調整し、これを予め２
ｍＭのＥＤＴＡ及び２ｍＭの２−メルカプトエタノール
を含む２５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５．５）で平衡化
したブルーＦ−Ｒカラム１００ミリリットルに通液して
Ｄ−ＬＤＨを吸着させた後、同緩衝液で洗浄し、２ｍＭ
のＮＡＤＨを含む同緩衝液２５０ミリリットル（カラム
体積の約２．５倍量）で溶出を行った。なお、溶出画分
は、予め２ｍＭのＥＤＴＡ及び２ｍＭの２−メルカプト
エタノールを含む２５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．
０）５０ミリリットルを添加しておいた容器に回収し
た。このようにして得られたＤ−ＬＤＨのポリアクリル
アミドゲル電気泳動の結果は、単一なバンドであった。
さらに、濃縮を目的として、得られた溶出画分を予め２
ｍＭのＥＤＴＡ及び２ｍＭの２−メルカプトエタノール
を含む２５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化
しておいたＤＥＡＥセファロースＦＦ（ファルマシア社
製）カラム５ミリリットルに通液してＤ−ＬＤＨを吸着
させた後、０．１Ｍの塩化カリウムを含む同緩衝液で洗
浄し、１Ｍの塩化カリウムを含む同緩衝液１２．５ミリ
リットルで溶出を行って、Ｄ−ＬＤＨの精製標品を得
た。以上の精製の結果を表１に示す。
【００２１】
【表１】
【００２２】このようにして得られたＤ−ＬＤＨの理化
学的性質を以下に示す。 （１）作用 以下の反応式に示す反応を触媒する。
学的性質を以下に示す。 （１）作用 以下の反応式に示す反応を触媒する。
【００２３】
【化１】
【００２４】（２）基質特異性 Ｄ−乳酸に対するＫｍ値：１８．５ｍＭ ピルビン酸に対するＫｍ値：０．６９ｍＭ ＮＡＤに対するＫｍ値：０．３６ｍＭ ＮＡＤＨに対するＫｍ値：０．１２ｍＭ （３）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲 ｐＨ８付近に至適ｐＨを有し（測定温度３０℃）、ｐＨ
４〜８で安定である（測定温度４℃）。 （４）作用適温の範囲 ４０℃まで（１００ｍＭのリン酸緩衝液中、ｐＨ７．５
で測定）。 （５）分子量 ゲルろ過法による測定で約９０，０００であり、ＳＤＳ
電気泳動法による測定で３８，０００である。
４〜８で安定である（測定温度４℃）。 （４）作用適温の範囲 ４０℃まで（１００ｍＭのリン酸緩衝液中、ｐＨ７．５
で測定）。 （５）分子量 ゲルろ過法による測定で約９０，０００であり、ＳＤＳ
電気泳動法による測定で３８，０００である。
【００２５】比較例１ 参考例１で得た粗酵素液３００ミリリットルにリン酸二
カリウムを加えてｐＨを８．０に調整し、これを予め２
ｍＭのＥＤＴＡ及び２ｍＭの２−メルカプトエタノール
を含む２５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化
したＤＥＡＥセファロースＦＦ（ファルマシア社製）カ
ラム３５ミリリットルに通液してＤ−ＬＤＨを吸着させ
た後、同緩衝液で洗浄し、同緩衝液を用い、塩化カリウ
ムの濃度を徐々に上げて（０〜０．４Ｍ）溶出を行った
ところ、塩化カリウム濃度０．３Ｍ付近にＤ−ＬＤＨが
溶出した。
カリウムを加えてｐＨを８．０に調整し、これを予め２
ｍＭのＥＤＴＡ及び２ｍＭの２−メルカプトエタノール
を含む２５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化
したＤＥＡＥセファロースＦＦ（ファルマシア社製）カ
ラム３５ミリリットルに通液してＤ−ＬＤＨを吸着させ
た後、同緩衝液で洗浄し、同緩衝液を用い、塩化カリウ
ムの濃度を徐々に上げて（０〜０．４Ｍ）溶出を行った
ところ、塩化カリウム濃度０．３Ｍ付近にＤ−ＬＤＨが
溶出した。
【００２６】この溶出画分に２５重量％となるように硫
酸アンモニウムを加え、これを予め２５重量％の硫酸ア
ンモニウム、２ｍＭのＥＤＴＡ及び２ｍＭの２−メルカ
プトエタノールを含む２５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ
８．０）で平衡化したフェニルセファロースＦＦ（ファ
ルマシア社製）カラム１０ミリリットルに通液してＤ−
ＬＤＨを吸着させた後、同緩衝液で洗浄し、同緩衝液を
用い、硫酸アンモニウム濃度を徐々に下げて（２５〜０
重量％）溶出を行ったところ、硫酸アンモニウム濃度１
０〜２０重量％付近にＤ−ＬＤＨが溶出した。
酸アンモニウムを加え、これを予め２５重量％の硫酸ア
ンモニウム、２ｍＭのＥＤＴＡ及び２ｍＭの２−メルカ
プトエタノールを含む２５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ
８．０）で平衡化したフェニルセファロースＦＦ（ファ
ルマシア社製）カラム１０ミリリットルに通液してＤ−
ＬＤＨを吸着させた後、同緩衝液で洗浄し、同緩衝液を
用い、硫酸アンモニウム濃度を徐々に下げて（２５〜０
重量％）溶出を行ったところ、硫酸アンモニウム濃度１
０〜２０重量％付近にＤ−ＬＤＨが溶出した。
【００２７】この溶出画分を回収し、透析により脱塩し
た後、予め２ｍＭのＥＤＴＡ及び２ｍＭの２−メルカプ
トエタノールを含む２５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．
０）で平衡化したＤＥＡＥトリスアクリル（ファルマシ
アＬＫＢ社製）カラム５ミリリットルに通液してＤ−Ｌ
ＤＨを吸着させた。このカラムを同緩衝液で洗浄し、同
緩衝液を用い、塩化カリウム濃度を徐々に上げて（０〜
０．３Ｍ）溶出を行ったところ、塩化カリウム濃度０．
１５Ｍ付近にＤ−ＬＤＨが溶出した。
た後、予め２ｍＭのＥＤＴＡ及び２ｍＭの２−メルカプ
トエタノールを含む２５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．
０）で平衡化したＤＥＡＥトリスアクリル（ファルマシ
アＬＫＢ社製）カラム５ミリリットルに通液してＤ−Ｌ
ＤＨを吸着させた。このカラムを同緩衝液で洗浄し、同
緩衝液を用い、塩化カリウム濃度を徐々に上げて（０〜
０．３Ｍ）溶出を行ったところ、塩化カリウム濃度０．
１５Ｍ付近にＤ−ＬＤＨが溶出した。
【００２８】この溶出画分に硫酸アンモニウムを２５重
量％となるように加え、予め２５重量％の硫酸アンモニ
ウム、２ｍＭのＥＤＴＡ及び２ｍＭの２−メルカプトエ
タノールを含む２５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）
で平衡化したブチルトーヨーパール（東ソー社製）カラ
ム５ミリリットルに通液してＤ−ＬＤＨを吸着させた
後、同緩衝液で洗浄し、同緩衝液を用い、硫酸アンモニ
ウム濃度を徐々に下げて（２５〜０重量％）溶出を行っ
たところ、硫酸アンモニウム濃度１２〜２０重量％付近
にＤ−ＬＤＨが溶出した。このようにして得られたＤ−
ＬＤＨ精製標品のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結
果は、単一なバンドであった。以上の精製の結果を表２
に示す。
量％となるように加え、予め２５重量％の硫酸アンモニ
ウム、２ｍＭのＥＤＴＡ及び２ｍＭの２−メルカプトエ
タノールを含む２５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）
で平衡化したブチルトーヨーパール（東ソー社製）カラ
ム５ミリリットルに通液してＤ−ＬＤＨを吸着させた
後、同緩衝液で洗浄し、同緩衝液を用い、硫酸アンモニ
ウム濃度を徐々に下げて（２５〜０重量％）溶出を行っ
たところ、硫酸アンモニウム濃度１２〜２０重量％付近
にＤ−ＬＤＨが溶出した。このようにして得られたＤ−
ＬＤＨ精製標品のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結
果は、単一なバンドであった。以上の精製の結果を表２
に示す。
【００２９】
【表２】
【００３０】表１及び表２からわかるように、青色色素
をリガンドとするアフィニティークロマトグラフィーを
用いてＤ−ＬＤＨを精製すると、従来の精製方法（比較
例１）と比較して約５倍の回収率で精製標品を得ること
ができた。さらに、精製工程も簡略化できたことから、
コストも大幅に低減することができた。
をリガンドとするアフィニティークロマトグラフィーを
用いてＤ−ＬＤＨを精製すると、従来の精製方法（比較
例１）と比較して約５倍の回収率で精製標品を得ること
ができた。さらに、精製工程も簡略化できたことから、
コストも大幅に低減することができた。
【００３１】
【発明の効果】本発明によれば、簡単な工程で、かつ高
い回収率でＤ−ＬＤＨの精製標品を得ることができる。
このため、用途の多いＤ−ＬＤＨをより安価に供給する
ことができる。
い回収率でＤ−ＬＤＨの精製標品を得ることができる。
このため、用途の多いＤ−ＬＤＨをより安価に供給する
ことができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 鈍寳 宗彦 京都府宇治市宇治小桜23番地 ユニチカ株 式会社中央研究所内
Claims (1)
- 【請求項１】 Ｄ−乳酸脱水素酵素を含む溶液を、青色
色素をリガンドとするアフィニティークロマトグラフィ
ーを用いて精製することを特徴とするＤ−乳酸脱水素酵
素の精製方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8244525A JPH1084952A (ja) | 1996-09-17 | 1996-09-17 | Ｄ−乳酸脱水素酵素の精製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8244525A JPH1084952A (ja) | 1996-09-17 | 1996-09-17 | Ｄ−乳酸脱水素酵素の精製方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1084952A true JPH1084952A (ja) | 1998-04-07 |
Family
ID=17119992
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8244525A Pending JPH1084952A (ja) | 1996-09-17 | 1996-09-17 | Ｄ−乳酸脱水素酵素の精製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1084952A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113373124A (zh) * | 2021-06-10 | 2021-09-10 | 吉林基蛋生物科技有限公司 | 一种乳酸脱氢酶的提取方法及其应用 |
-
1996
- 1996-09-17 JP JP8244525A patent/JPH1084952A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113373124A (zh) * | 2021-06-10 | 2021-09-10 | 吉林基蛋生物科技有限公司 | 一种乳酸脱氢酶的提取方法及其应用 |
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